ES2283759T3

ES2283759T3 - Anticuerpos anti-igf-ir y sus aplicaciones.

Info

Publication number: ES2283759T3
Application number: ES03712270T
Authority: ES
Inventors: Liliane Goetsch; Nathalie Corvaia; Olivier Leger
Original assignee: Pierre Fabre Medicament SA
Current assignee: Pierre Fabre Medicament SA
Priority date: 2002-01-18
Filing date: 2003-01-20
Publication date: 2007-11-01
Anticipated expiration: 2023-01-20
Also published as: ES2427964T3; CA2473039C; HK1078590A1; JP2010233575A; AU2009201674A1; EP1806364A3; DE60312639D1; ZA200405402B; AU2003216748B2; CA2473039A1; CN100410275C; CN1620468A; WO2003059951A3; CY1106662T1; BRPI0306973B8; EP1798242A3; MXPA04006980A; AU2009201674B2; EP1798242B1; EP1798242A2

Abstract

Anticuerpo aislado, o uno de sus fragmentos funcionales, siendo dicho anticuerpo o dichos fragmentos funcionales capaces de unirse al receptor del factor de crecimiento 1 tipo insulina IGF-IR de humano, caracterizado porque: - dicho anticuerpo comprende una cadena pesada que comprende los tres CDR de secuencia SEC ID nº 8, 10 y 12, y una cadena ligera que comprende los tres CDR de secuencia SEC ID nº 2, 4 y 6; y - dicho fragmento funcional se selecciona de entre los fragmentos Fv, Fab, (Fab¿)2, Fab¿, scFv, scFv-Fc y los dianticuerpos, y porque dicho fragmento comprende los tres CDR de secuencia SEC ID nº 8, 10 y 12, y los tres CDR de secuencia SEC ID nº 2, 4 y 6.

Description

Anticuerpos anti-IGF-IR y sus aplicaciones.

La presente invención se refiere a nuevos anticuerpos capaces de unirse específicamente al receptor humano del factor de crecimiento I de tipo insulina IGF-IR, y/o capaces de inhibir específicamente la actividad de tirosina quinasa de dicho receptor de IGF-IR, especialmente anticuerpos monoclonales murinos, quiméricos y humanizados, así como a las secuencias de aminoácidos y nucleicas que codifican estos anticuerpos. La invención comprende igualmente el uso de estos anticuerpos como un medicamento para el tratamiento profiláctico y/o terapéutico de cánceres que sobreexpresan el IGF-IR, o cualquier patología relacionada con la sobreexpresión de dicho receptor, así como a proce-
dimientos o equipos para el diagnóstico de enfermedades relacionadas con la sobreexpresión del receptor IGF-IR.

El receptor del factor de crecimiento I de tipo insulina, denominado IGF-IR, es un receptor con actividad de tirosina quinasa que tiene 70% de homología con el receptor de insulina IR. El IGF-IR es una glucoproteína de peso molecular de aproximadamente 350.000. Es un receptor heterotetramérico del cual cada mitad - enlazada por puentes de disulfuro - comprende una subunidad \alpha extracelular y una subunidad \beta transmembránica (véase la figura 1). El IGF-IR se une al IGF I e IGF II con una afinidad muy alta (Kd # 1 nM), pero es igualmente capaz de unirse a la insulina con una afinidad 100 a 1000 veces menor. A la inversa, el IR se une a la insulina con una afinidad muy alta, aunque los IGF se unen sólo al receptor de insulina con una afinidad 100 veces menor. El dominio de tirosina quinasa del IGF-IR y del IR tiene una homología de secuencia muy alta, mientras que las zonas de homología más débil se refieren respectivamente a la región rica en cisteína, situada en la subunidad \alpha, y la parte C-terminal de la subunidad \beta. Las diferencias de secuencias observadas en la subunidad \alpha se sitúan en la zona de unión de los ligandos, y están por lo tanto en el origen de las afinidades relativas del IGF-IR y del IR para los IGF y la insulina, respectivamente. Las diferencias en la parte C-terminal de la subunidad \delta dan como resultado una divergencia en las vías de señalización de los dos receptores; mediando el IGF-IR efectos mitogénicos, de diferenciación y de antiapoptosis, mientras que la activación del IR implica principalmente efectos a nivel de las vías metabólicas (Baserga et al., Biochim. Biophys. Acta, 1332: F105-126, 1997; Baserga R., Exp. Cell. Res., 253: 1-6, 1999).

Las proteínas de tirosina quinasas citoplásmicas son activadas mediante la unión del ligando al dominio extracelular del receptor. La activación de las quinasas, a su vez, implica la estimulación de diferentes sustratos intracelulares, incluyendo IRS-1, IRS-2, Shc y Grb 10 (Peruzzi F. et al., J. Cancer Res. Clin. Oncol., 125: 166-173, 1999). Los dos sustratos principales del IGF-IR son IRS y Shc que median, mediante la activación de numerosos efectores en dirección 3', la mayoría de los efectos de crecimiento y de diferenciación relacionados con la unión de los IGF a este receptor (figura 2). La disponibilidad de sustratos puede determinar, en consecuencia, el efecto biológico final relacionado con la activación del IGF-IR. Cuando predomina IRS-1, las células tienden a proliferar y a transformarse. Cuando domina Shc, las células tienden a diferenciarse (Valentinis B. et al., J. Biol. Chem. 274: 12423-12430, 1999). Parecer ser que la vía que interviene principalmente en los efectos de protección contra la apoptosis es la vía de fosfatidilinositol 3-quinasas (PI 3-quinasas) (Prisco M. et al., Horm. Metab. Res., 31: 80-89, 1999; Peruzzi F. et al., J. Cancer Res. Clin. Oncol., 125: 166-173, 1999).

La función del sistema de IGF en carcinogénesis ha sido el tema de investigaciones intensas en los últimos diez años. Este interés siguió al descubrimiento del hecho de que, además de sus propiedades mitogénicas y antiapoptóticas, parece que se requiere el IGF-IR para el establecimiento y el mantenimiento de un fenotipo transformado. En efecto, se ha establecido bien que una sobreexpresión o una activación constitutiva del IGF-IR lleva, en una gran variedad de células, a un crecimiento de las células independientes del soporte en medios que carecen de suero de ternera fetal, y a la formación de tumores en ratones atímicos. Esta no es en sí misma una propiedad única, puesto que una gran variedad de productos de genes sobreexpresados puede transformar células, incluyendo un buen número de receptores de factores de crecimiento. Sin embargo, el descubrimiento crucial que ha demostrado claramente la importante función desempeñada por el IGF-IR en la transformación, ha sido la demostración de que las células R-, en las cuales el gen que codifica el IGF-IR ha sido desactivado, son totalmente refractarias a la transformación por diferentes agentes que son usualmente capaces de transformar las células, tales como la proteína E5 del virus del papiloma bovino, una sobreexpresión del EGFR o del PDGFR, el antígeno T de SV 40, ras activado, o la combinación de estos dos últimos factores (Sell C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90: 11217-11221, 1993; Sell C. et al., Mol. Cell. Biol., 14: 3604-3612, 1994; Morrione A. J., Virol., 69: 5300-5303, 1995; Coppola D. et al., Mol. Cell. Biol., 14: 4588-4595, 1994; DeAngelis T et al., J. Cell. Physiol., 164: 214-221, 1995).

El IGF-IR se expresa en una gran variedad de tumores y de líneas tumorales, y los IGF amplifican el crecimiento del tumor vía su unión al IGF-IR. Otros argumentos a favor de la función del IGF-IR en carcinogénesis provienen de estudios que usan anticuerpos monoclonales murinos dirigidos contra el receptor, o el uso de dominantes negativos del IGF-IR. En efecto, los anticuerpos monoclonales murinos dirigidos contra el IGF-IR inhiben la proliferación de numerosas líneas celulares en cultivo, y el crecimiento de células tumorales in vivo (Arteaga C. et al., Cancer Res., 49: 6237-6241, 1989; Li et al., Biochem. Biophys. Res. Com., 196: 92-98, 1993; Zia F et al., J. Cell. Biol., 24: 269-275, 1996; Scotlandi K et al., Cancer Res., 58: 4127-4131, 1998). Se ha mostrado igualmente, en los trabajos de Jiang et al. (Oncogene, 18: 6071-6077, 1999), que un dominante negativo del IGF-IR es capaz de inhibir la proliferación tumoral.

La presente invención tiene por objeto poder disponer de un anticuerpo monoclonal murino, preferentemente un anticuerpo quimerizado o humanizado, que reconocerá específicamente y con gran afinidad al IGF-IR. Este anticuerpo interactuará poco o nada con el receptor IR de insulina. Su unión será capaz de inhibir in vitro el crecimiento de tumores que expresan el IGF-IR, interactuando principalmente con las vías de transducción de señales activadas durante las interacciones IGF1/IGF-IR e IGF2/IGF-IR. Este anticuerpo será capaz de ser activo in vivo en todos los tipos de tumores que expresan el IGF-IR, incluyendo los tumores de mama y de próstata dependientes de estrógeno, que no es el caso para los anticuerpos monoclonales anti-IGF-IR (escritos como AcM o ACM) disponibles actualmente. En efecto, el \alphalR3, que hace referencia al dominio del IGF-IR, inhibe totalmente in vitro el crecimiento de tumores de mama dependiente de estrógeno (MCF-7), pero carece de efecto sobre el modelo correspondiente in vivo (Arteaga C. et al., J. Clin. Invest. 84: 1418-1423, 1989). Además, el fragmento scFv-Fc, derivado del anticuerpo monoclonal murino 1H7, es sólo débilmente activo en el tumor de mama MCF-7, y totalmente inactivo sobre un tumor de próstata independiente de andrógenos (Li S. L. et al., Cancer Immunol. Immunother., 49: 243-252,
2000).

De manera sorprendente, se ha demostrado un anticuerpo quimérico (denominado C7C10), y dos anticuerpos humanizados, denominados respectivamente forma humanizada 1 de h7C10 y forma humanizada 2 de h7C10, derivados del anticuerpo monoclonal murino 7C10, que reconoce el IGF-IR y que responde a todos los criterios enunciados aquí arriba, es decir, a un no reconocimiento del receptor de insulina, a un bloqueo in vitro de la proliferación inducida por IGF1 y/o IGF2, pero igualmente a la inhibición in vivo del crecimiento de diferentes tumores que expresan el IGF-IR, entre los cuales están un osteosarcoma y un tumor pulmonar de células no pequeñas, pero igualmente, y más particularmente, el tumor de mama MCF-7 dependiente de estrógeno, y un tumor de próstata DU-145 independiente de andrógenos. Además, y de manera sorprendente, la intensidad de inhibición del crecimiento de tumores de las células MCF-7 in vivo por el anticuerpo 7C10 es comparable, incluso significativamente superior, a la observada con tamoxifeno, uno de los compuestos de referencia en el tratamiento de tumores de mama dependientes de estrógeno. Por otra parte, se ha demostrado que estos anticuerpos inhiben la fosforilación de la tirosina de la cadena beta del IGF-IR y de IRS1, el primer sustrato del receptor. Además, se ha establecido igualmente que estos anticuerpos provocan la incorporación de dicho receptor y su degradación de forma contraria a lo que se observa usualmente con los ligandos naturales que permiten la recirculación rápida del receptor sobre la superficie de las células. Se ha podido caracterizar estos anticuerpos mediante su secuencia peptídica y nucleica, especialmente por la secuencia de sus regiones que determinan su complementariedad (CDR) por el IGF-IR.

De esta manera, según una primera forma de realización, la presente invención tiene por objeto un anticuerpo aislado, o uno de sus fragmentos funcionales, siendo dicho anticuerpo o uno de sus fragmentos capaz de unirse específicamente al receptor del factor de crecimiento humano I de tipo insulina IGF-IR, caracterizado porque comprende una cadena ligera que comprende las tres CDR de secuencia de aminoácidos SEC ID nº 2, 4 y 6, y porque comprende una cadena pesada que comprende las tres CDR de secuencia de aminoácidos SEC ID nº 8, 10 y 12.

En la presente descripción, los términos "unirse" y "fijarse" tienen el mismo significado y son intercambiables.

En la presente descripción, los términos polipéptidos, secuencias polipeptídicas, péptidos y proteínas unidos a compuestos de anticuerpos o a su secuencia, son intercambiables.

Se debe de entender aquí que la invención no se refiere a los anticuerpos en forma natural, es decir, no están en su ambiente natural, pero se ha podido aislarlos u obtenerlos mediante purificación de fuentes naturales, o se han podido obtener también mediante recombinación genética, o mediante síntesis química, y pueden contener entonces aminoácidos no naturales tal como se describirá más adelante.

Por región CDR o CDR, se pretende indicar las regiones hipervariables de las cadenas pesadas y ligeras de las inmunoglobulinas, tal como se define por Kabat et al. (Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 5ª. ed., U. S. Department of Health and Human Services, NIH, 1991, y últimas ediciones). Existen 3 CDR de cadena pesada y 3 CDR de cadena ligera. El término "CDR" o "los CDR" se usa aquí para designar, según los casos, una de estas regiones o varias regiones, o incluso el conjunto de estas regiones, que contienen la mayoría de los restos de aminoácido responsables de la unión por afinidad del anticuerpo al antígeno o al epítopo al cual reconoce.

Los anticuerpos según la presente invención son, preferentemente, anticuerpos monoclonales específicos, especialmente murino, quiméricos o humanizados, los cuales se pueden obtener según los métodos estándares bien conocidos por los expertos en la técnica.

Generalmente, para la preparación de anticuerpos monoclonales o sus fragmentos funcionales, especialmente murino, es posible referirse a técnicas que se describen, en particular, en el manual "Antibodies" (Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY, p. 726, 1988), o a la técnica de preparación a partir de hibridomas descrita por Kohler y Milstein (Nature, 256: 495-497, 1975).

Los anticuerpos monoclonales según la invención se pueden obtener, por ejemplo, a partir de una célula animal inmunizada contra el receptor IGF-IR, o uno de sus fragmentos que contiene el epítopo reconocido específicamente por dichos anticuerpos monoclonales según la invención. Dicho receptor IGF-IR, o uno de sus fragmentos, se puede producir especialmente según los métodos de realización usuales, mediante recombinación genética a partir de una secuencia de ácido nucleico contenida en la secuencia de ADNc que codifica el receptor IGF-IR, o mediante síntesis peptídica a partir de una secuencia de aminoácidos comprendida en la secuencia peptídica del receptor IGF-IR.

Los anticuerpos monoclonales según la invención se pueden purificar, por ejemplo, sobre una columna de afinidad sobre la cual, previamente, se inmovilizó el receptor IGF-IR o uno de sus fragmentos que comprende el epítopo reconocido específicamente mediante dichos anticuerpos monoclonales según la invención. Más particularmente, dichos anticuerpos monoclonales se pueden purificar mediante cromatografía sobre proteína A y/o G, seguida o no de una cromatografía de intercambio iónico, que tiene por objetivo eliminar los contaminantes proteicos residuales, así como el ADN y los LPS, ella misma seguida o no de una cromatografía de exclusión sobre gel de Sefarosa, a fin de eliminar los agregados potenciales debido a la presencia de dímeros o de otros multímeros. De manera todavía más preferida, el conjunto de estas técnicas se puede usar simultánea o sucesivamente.

Mediante la expresión "anticuerpos según la invención", se incluyen igualmente anticuerpos quiméricos o humanizados.

Mediante la expresión "anticuerpo quimérico", se pretende designar un anticuerpo que contiene una región variable natural (cadena ligera y cadena pesada) derivada de un anticuerpo de una especie determinada, en combinación con las regiones constantes de cadena ligera y cadena pesada de un anticuerpo de una especie heteróloga a dicha especie determinada.

Los anticuerpos o sus fragmentos de tipo quimérico según la invención se pueden preparar usando las técnicas de recombinación genética. Por ejemplo, el anticuerpo quimérico se puede producir clonando un ADN recombinante que contiene un promotor y una secuencia que codifica la región variable de un anticuerpo monoclonal no humano, especialmente murino, según la invención, y una secuencia que codifica la región constante del anticuerpo humano. Un anticuerpo quimérico de la invención codificado por tal gen recombinante será, por ejemplo, una quimera de ratón-hombre, estando la especificidad de este anticuerpo determinada por la región variable derivada del ADN murino, y estando su isotipo determinado por la región constante derivada del ADN humano. Para los métodos de preparación de anticuerpos quiméricos es posible, por ejemplo, referirse al documento de Verhoeyn et al. (BioEssays, 8: 74,
1988).

Mediante la expresión "anticuerpos humanizados", se pretende designar un anticuerpo que contiene regiones CDR derivadas de un anticuerpo de origen no humano, siendo las otras partes de la molécula de anticuerpo derivadas de uno (o varios) anticuerpos humanos. Además, algunos de los restos de los segmentos del esqueleto (denominados FR) se pueden modificar para conservar la afinidad de la unión (Jones et al., Nature, 321: 522-525, 1986; Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536, 1988; Riechmann et al., Nature, 332: 323-327, 1988).

Los anticuerpos humanizados según la invención, o sus fragmentos, se pueden preparar mediante técnicas conocidas por los expertos en la técnica (tales como, por ejemplo, las descritas en los documentos Singer et al., J. Immun. 150: 2844-2857, 1992; Mountain et al., Biotechnol. Genet. Eng. Rev., 10: 1-142, 1992; o Bebbington et al., Bio/Technology, 10: 169-175, 1992). Se prefieren tales anticuerpos humanizados según la invención para su uso en métodos de diagnóstico in vitro, o en tratamiento profiláctico y/o terapéutico in vivo.

Mediante la expresión "fragmento funcional de un anticuerpo según la invención", se pretende designar, en particular, un fragmento de anticuerpo, tales como los fragmentos Fv, scFv (sc para cadena sencilla), Fab, F(ab')2, Fab', scFv-Fc, o pequeños fragmentos de anticuerpos bivalentes y específicos, o cualquier fragmento cuya semivida habría sido incrementada mediante modificación química, tal como la adición de poli(alquilen)glicol, tal como poli(etilen)glicol ("PEGilación") (fragmentos pegilados denominados Fv-PEG, scFv-PEG, Fab-PEG, F(ab')_{2}-PEG o Fab'-PEG) ("PEG" por poli(etilen)glicol), o por incorporación en un liposoma, presentando dichos fragmentos las tres CDR de secuencia SEC ID nº 2, 4 y 6, y las tres CDR de secuencia SEC ID nº 8, 10 y 12 según la invención, y, especialmente, porque es capaz de ejercer de manera general una actividad incluso parcial del anticuerpo del cual procede, tal como en particular la capacidad para reconocer y unirse al receptor IGF-IR y, cuando sea apropiado, para inhibir la actividad del receptor IGF-IR.

Preferentemente, dichos fragmentos funcionales estarán constituidos o comprenderán una secuencia parcial de la cadena variable pesada o ligera del anticuerpo del cual derivan, siendo dicha secuencia parcial suficiente para retener la misma especificidad de unión que el anticuerpo del cual deriva, y una afinidad suficiente, preferentemente por lo menos igual a 1/100, de manera más preferida a por lo menos 1/10, de la del anticuerpo del cual deriva, con respecto al receptor IGF-IR.

Tal fragmento funcional contendrá como mínimo 5 aminoácidos, preferentemente 10, 15, 25, 50 y 100 aminoácidos consecutivos de la secuencia del anticuerpo del cual deriva.

Preferentemente, estos fragmentos funcionales serán fragmentos de tipo Fv, scFv, Fab, F(ab')2, F(ab'), scFv-Fc o pequeños fragmentos de anticuerpos bivalentes y específicos, los cuales tienen generalmente la misma especificidad de unión que el anticuerpo del cual derivan. Los fragmentos de anticuerpo de la invención se pueden obtener a partir de anticuerpos tales como los descritos anteriormente, mediante métodos tales como la digestión por enzimas, tales como pepsina o papaína, y/o mediante ruptura de los puentes de disulfuro mediante reducción química. De otra manera, los fragmentos de anticuerpos abarcados en la presente invención se pueden obtener mediante técnicas de recombinación genética bien conocidas por los expertos en la técnica, o también mediante síntesis peptídica mediante, por ejemplo, sintetizadores automáticos de péptidos, tales como los provistos por la compañía Applied Biosystems, etc.

De manera más preferida, los anticuerpos, o sus fragmentos funcionales, según la presente invención, son anticuerpos quiméricos o humanizados. Se pueden obtener mediante recombinación genética o mediante síntesis química.

Entre las seis secuencias de CDR cortas, la tercera CDR de la cadena pesada (CDRH3) tiene una mayor variabilidad de tamaño (mayor diversidad, esencialmente debida a los mecanismos de disposición de los genes que darán lugar a la misma). Puede ser también tan corta como 2 aminoácidos, mientras que el tamaño más largo conocido es 26. Funcionalmente, la CDRH3 desempeña una función en parte en la determinación de la especificidad del anticuerpo (Segal et al., PNAS, 71: 4298-4302, 1974; Amit et al., Science, 233: 747-753, 1986; Chothia et al., J. Mol. Biol., 196: 901-917, 1987; Chothia et al., Nature, 342: 877-883, 1989; Caton et al., J. Immunol., 144: 1965-1968, 1990; Sharon et al., PNAS, 87: 4814-4817, 1990; Sharon et al., J. Immunol., 144: 4863-4869, 1990; Kabat et al., J. Immunol., 147: 1709-1719, 1991).

Se sabe que sólo un bajo porcentaje de los aminoácidos de las CDR contribuye a la construcción de un sitio de unión al anticuerpo, pero estos restos deben mantenerse en una conformación tridimensional muy específica.

Según otro aspecto, la invención se refiere a un hibridoma murino capaz de segregar un anticuerpo monoclonal según la presente invención, especialmente el hibridoma murino tal como el depositado en el Centre National de Culture De Microorganisme (CNCM) (Instituto Pasteur, París, Francia) el 19 de septiembre de 2001, con el número 1-2717.

El anticuerpo monoclonal denominado aquí 7C10, o uno de sus fragmentos funcionales, caracterizado porque dicho anticuerpo es segregado por el hibridoma depositado en el CNCM el 19 de septiembre de 2001 bajo el número 1-2717 es, por supuesto, parte de la presente invención.

En un modo de realización particular, la presente invención se refiere a un anticuerpo murino, o uno de sus fragmentos funcionales, según la invención, caracterizado porque dicho anticuerpo comprende una cadena ligera de secuencia que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 54, y porque comprende una cadena pesada de secuencia que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 69.

Según un aspecto igualmente particular, la presente invención se refiere a un anticuerpo quimérico, o uno de sus fragmentos funcionales, según la invención, caracterizado porque dicho anticuerpo comprende además las regiones constantes de cadena ligera y cadena pesada derivadas de un anticuerpo de una especie heteróloga al ratón, especialmente del ser humano, y, preferentemente, porque las regiones constantes de cadena ligera y de cadena pesada derivadas de un anticuerpo humano son, respectivamente, la región kappa y gamma-1, gamma-2 o gamma-4.

Según un aspecto igualmente particular, la presente invención se refiere a un anticuerpo humanizado o uno de sus fragmentos funcionales, según la invención, caracterizado porque dicho anticuerpo comprende una cadena ligera y/o una cadena pesada, en las cuales los segmentos del esqueleto FR1 a FR4 (tales como se definen más adelante en los ejemplos 12 y 13, en las tablas 5 y 6) de dicha cadena ligera y/o cadena pesada derivan, respectivamente, de los segmentos del esqueleto FR1 a FR4 de cadena ligera y/o cadena pesada de anticuerpos humanos.

Según un modo de realización preferido, el anticuerpo humanizado o uno de sus fragmentos funcionales, según la presente invención, se caracteriza porque dicho anticuerpo humanizado comprende una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 61 ó 65, o porque comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 75, 79 u 83.

Preferentemente, el anticuerpo humanizado, o uno de sus fragmentos funcionales, según la invención, se caracteriza porque dicho anticuerpo humanizado comprende una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 65, y porque comprende una cadena pesada de secuencia que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 79 u 83, preferentemente SEC ID nº 83.

Según un nuevo aspecto, la presente invención se refiere a un ácido nucleico aislado, caracterizado porque se selecciona de los siguientes ácidos nucleicos:

a): un ácido nucleico, ADN o ARN, que codifica un anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, según la invención;

b): un ácido nucleico complementario de un ácido nucleico tal como se define en a); y

c): un ácido nucleico de al menos 18 nucleótidos capaz de hibridarse bajo condiciones muy restrictivas con, por lo menos, una de las CDR de secuencia de ácido nucleico SEC ID nº 1, 3, 5, 7, 9 u 11.

Mediante las expresiones "ácido nucleico", "secuencia nucleica" o "ácido nucleico", "polinucleótido", "oligonucleótido", "secuencia de polinucleótidos", "secuencia de nucleótidos", términos que se usarán indistintamente en la presente descripción, se pretende designar un enlace preciso de nucleótidos, modificados o no modificados, que permiten definir un fragmento o una región de un ácido nucleico, que contiene o no nucleótidos no naturales, y pudiendo corresponder tanto a un ADN bicaternario, un ADN monocatenario, como a productos de transcripción de dichas moléculas de ADN.

Se debe de entender también aquí que la presente invención no se refiere a las secuencias nucleotídicas en su ambiente cromosómico natural, es decir, en el estado natural. Se trata de secuencias que se han aislado y/o purificado, es decir, que se han seleccionado directamente o indirectamente, por ejemplo, mediante copia, modificándose al menos parcialmente su entorno. Así, se pretende designar aquí los ácidos nucleicos aislados obtenidos mediante recombinación genética mediante, por ejemplo, células hospedantes, u obtenidos mediante síntesis química.

Una hibridación bajo condiciones muy restrictivas significa que las condiciones de temperatura y de fuerza iónica se seleccionan de tal manera que permiten el mantenimiento de la hibridación entre dos fragmentos de ADN complementarios. A título ilustrativo, condiciones muy restrictivas de la etapa de hibridación con el fin de definir los fragmentos polinucleotídicos descritos aquí arriba son, ventajosamente, las siguientes.

La hibridación de ADN-ADN o ADN-ARN se lleva a cabo en dos etapas: (1) prehibridación a 42ºC durante 3 horas en un tampón de fosfato (20 mM, pH 7,5), que contiene 5 x SSC (1 x SSC corresponde a una disolución de 0,15 M de NaCl + 0,015 M de citrato de sodio), 50% de formamida, 7% de dodecilsulfato de sodio (SDS), 10 x de disolución de Denhardt, 5% de sulfato de dextrano y 1% de ADN de esperma de salmón; (2) hibridación real durante 20 horas a una temperatura que depende del tamaño de la sonda (es decir: 42ºC, para un tamaño de sonda > 100 nucleótidos), seguida de 2 lavados de 20 minutos a 20ºC en 2 x SSC + 2% de SDS, 1 lavado de 20 minutos a 20ºC en 0,1 x SSC + 0,1% de SDS. El último lavado se lleva a cabo en 0,1 x SSC + 0,1% de SDS durante 30 minutos a 60ºC, para un tamaño de sonda > 100 nucleótidos. Las condiciones de hibridación muy restrictivas descritas aquí arriba para un polinucleótido de tamaño definido se pueden adaptar por los expertos en la técnica para oligonucleótidos de tamaño más grande o más pequeño, según las enseñanzas de Sambrook et al., (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2ª ed. Cold Spring Harbor).

La invención se refiere igualmente a un vector que comprende un ácido nucleico según la presente invención.

La invención tiene especialmente por objeto vectores de clonación y/o expresión que contienen una secuencia nucleotídica según la invención.

Los vectores según la invención comprenden, preferentemente, elementos que permiten la expresión y/o la secreción de las secuencias nucleotídicas en una célula hospedante determinada. El vector debe contener por lo tanto un promotor, señales de inicio y terminación de la traducción, así como regiones apropiadas de regulación de la transcripción. Debe ser capaz de poderse mantener de manera estable en la célula hospedante, y puede tener, eventualmente, señales particulares que especifiquen la secreción de la proteína traducida. Estos elementos diferentes se eligen y optimizan por los expertos en la técnica en función de la célula hospedante usada. Para este fin, las secuencias nucleotídicas según la invención se pueden insertar en vectores de replicación autónoma en el hospedante elegido, o pueden ser vectores integrantes del hospedante elegido.

Tales vectores se preparan mediante métodos usados comúnmente por los expertos en la técnica, y los clones resultantes se pueden introducir en un hospedante apropiado mediante métodos estándares, tales como lipofección, electroporación, choque térmico o métodos químicos.

Los vectores según la invención son, por ejemplo, vectores de origen plasmídico o vírico. Son útiles para transformar células hospedantes a fin de clonar o expresar las secuencias nucleotídicas según la invención.

La invención comprende igualmente las células hospedantes que comprenden un vector según la invención.

El hospedante celular se puede seleccionar de sistemas procariotas o eucariotas, por ejemplo, células bacterianas, pero igualmente células de levadura o células de animales, en particular células de mamíferos. También es posible usar células de insectos o células vegetales.

En otro aspecto, la invención tiene por objeto un procedimiento para la producción de un anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales según la invención, caracterizado porque comprende las siguientes etapas:

a): cultivar en un medio y condiciones de cultivo adecuados una célula hospedante según la invención; y

b): recuperar dichos anticuerpos, o uno de sus fragmentos funcionales, así producidos a partir del medio de cultivo o de dichas células cultivadas.

Las células transformadas según la invención se pueden usar en procedimientos para la preparación de polipéptidos recombinantes según la invención. Los procedimientos para la preparación de un polipéptido según la invención en una forma recombinante, caracterizado porque usan un vector y/o una célula transformada por un vector según la invención, están por sí mismos abarcados en la presente invención. Preferentemente, se cultiva una célula transformada mediante un vector según la invención bajo condiciones que permiten la expresión de dicho polipéptido, y se recupera dicho péptido recombinante.

Tal como se ha dicho, el hospedante celular se puede seleccionar de sistemas procariotas o eucariotas. En particular, es posible identificar secuencias de nucleótidos según la invención, facilitando la secreción en tal sistema procariota o eucariota. Un vector según la invención que posee tal secuencia se puede usar, por lo tanto, ventajosamente, para la producción de proteínas recombinantes, destinadas a ser segregadas. En efecto, la purificación de estas proteínas recombinantes de interés se facilitará por el hecho de que están presentes en el sobrenadante del cultivo celular, más que en el interior de las células hospedantes.

Igualmente, es posible preparar los polipéptidos según la invención mediante síntesis química. Tal procedimiento de preparación es igualmente un objeto de la invención. El experto en la técnica conoce los procedimientos de síntesis química, por ejemplo, las técnicas que usan fases sólidas (véase especialmente Steward et al., 1984, Solid phase peptide synthesis, Pierce Chem. Company, Rockford, 111, 2ª ed., (1984)), o técnicas que usan fases sólidas parciales, mediante condensación de fragmentos o mediante una síntesis clásica en disolución. Los polipéptidos obtenidos mediante síntesis química, y que pueden comprender aminoácidos no naturales correspondientes, están abarcados igualmente en la invención.

Los anticuerpos, o uno de sus fragmentos funcionales, susceptibles de ser obtenidos mediante un procedimiento según la invención, están igualmente abarcados en la presente invención.

Según otro aspecto, la invención tiene por objeto un anticuerpo humanizado, o uno de sus fragmentos funcionales, según la invención, como un medicamento, preferentemente un anticuerpo humanizado tal como se define anteriormente. Por término anticuerpo, para el resto de la presente descripción, se debe de entender un anticuerpo anti-IGF-IR, así como un anticuerpo anti-IGF-IR/EGFR biespecífico.

La invención se refiere igualmente a una composición farmacéutica que comprende como principio activo un compuesto que consiste en un anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales según la invención, al que se le añade, preferentemente, un excipiente y/o un vehículo farmacéuticamente aceptable.

La presente invención comprende además el uso de la composición según la invención, para la preparación de un medicamento.

Más particularmente, se describe el uso de un anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, y/o de una composición, para la preparación de un medicamento destinado a la prevención o al tratamiento de una enfermedad inducida por una sobreexpresión y/o una activación anormal del receptor IGF-IR y/o relacionada con una hiperactivación de la vía de transducción de señales mediada por la interacción del 1-IGF1 o IGF2 con IGF-IR.

Preferentemente, la administración de dicho medicamento no induce, o induce poco, efectos secundarios relacionados con la inhibición del receptor de insulina IR, es decir, inhibición de la interacción del receptor IR con sus ligandos naturales debido a la presencia de dicho medicamento, especialmente mediante una inhibición competitiva relacionada con la unión de dicho medicamento al IR.

La presente invención describe el uso de un anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, preferentemente humanizado, y/o de una composición según la invención, para la preparación de un medicamento destinado a inhibir la transformación de células normales en células con carácter tumoral, preferentemente células dependientes del IGF, especialmente células dependientes del IGF1 y/o el IGF2.

La presente invención describe igualmente el uso de un anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, preferentemente humanizado, y/o de una composición según la invención, para la preparación de un medicamento destinado a inhibir el crecimiento y/o la proliferación de células tumorales, preferentemente células dependientes del IGF, especialmente células dependientes del IGF1 y/o el IGF2.

De manera general, la presente invención tiene por objeto el uso de un anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, preferentemente humanizados, y/o de una composición según la invención, para la preparación de un medicamento destinado a la prevención o al tratamiento de cáncer. Preferentemente, se describen los cánceres que expresan el IGF-IR y/o que presentan una hiperactivación de la vía de transducción de señales mediada por la interacción del IGF1 o el IGF2 con el IGF-IR, tal como, por ejemplo, la sobreexpresión de IRS1.

Se describe igualmente aquí el uso de un anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, preferentemente humanizado, y/o de una composición según la invención, para la preparación de un medicamento destinado a la prevención o al tratamiento de psoriasis, psoriasis cuya hiperproliferación epidérmica se puede relacionar con la expresión o la sobreexpresión del IGF-IR, y/o con la hiperactivación de la vía de transducción de señales mediada por la interacción del IGF-IR con sus ligandos naturales (Wraight C. J. et al. Nat. Biotechnol., 2000, 18(5): 521-526. Reversal of epidermal hyperproliferation in psoriasis by insulin-like growth factor I receptor antisense oligonucleo-
tides).

Entre los cánceres que se pueden prevenir y/o tratar, se prefiere el cáncer de próstata, los osteosarcomas, el cáncer del pulmón, el cáncer de mama. Se puede igualmente citar el cáncer endometrial o el cáncer de colon, o cualquier otro cáncer que sobreexpresa el IGF-IR.

Según aún otro aspecto, la presente invención tiene por objeto un método de diagnóstico, preferiblemente in vitro, de enfermedades relacionadas con una sobreexpresión o una subexpresión, preferiblemente una sobreexpresión, del receptor IGF-IR, a partir de una muestra biológica en la cual se sospeche la presencia anormal del receptor IGF-IR, caracterizado porque dicha muestra biológica se pone en contacto con un anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, según la invención, pudiendo ser marcado dicho anticuerpo, cuando sea apropiado.

Preferentemente, dichas enfermedades relacionadas con la sobreexpresión del receptor IGF-IR en dicho método de diagnóstico serán cánceres.

Dicho anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, se puede presentar en forma de un inmunoconjugado o de un anticuerpo marcado, a fin de obtener una señal detectable y/o cuantificable.

Los anticuerpos marcados según la invención, o sus fragmentos funcionales incluyen, por ejemplo, anticuerpos denominados inmunoconjugados que se pueden conjugar, por ejemplo, con enzimas tales como peroxidasa, fosfatasa alcalina, \alpha-D-galactosidasa, glucosa oxidasa, glucosa amilasa, anhidrasa carbónica, acetilcolinesterasa, lisozima, malato deshidrogenasa o glucosa 6-fosfato deshidrogenasa, o mediante una molécula tal como biotina, digoxigenina, o 5-bromodesoxiuridina. Se pueden igualmente conjugar marcadores fluorescentes con los anticuerpos o con sus fragmentos funcionales según la invención, e incluyen especialmente fluoresceína y sus derivados, fluorocromo, rodamina y sus derivados, GFP (GFP por "proteína fluorescente verde"), dansilo, umbeliferona, etc. En tales conjugados, los anticuerpos de la invención o sus fragmentos funcionales se pueden preparar mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica. Se pueden acoplar a las enzimas o a los marcadores fluorescentes directamente o mediante el intermedio de un grupo espaciador o de un grupo de unión tal como un polialdehído, tal como glutaraldehído, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido dietilentriaminopentaacético (DPTA), o en presencia de agentes de acoplamiento tales como los citados anteriormente para los conjugados terapéuticos. Los conjugados que contienen marcadores de tipo fluoresceína se pueden preparar mediante reacción con un isotiocianato.

Otros conjugados pueden incluir igualmente marcadores quimioluminiscentes tales como luminol y los dioxetanos, marcadores bioluminiscentes tales como luciferasa y luciferina, o también marcadores radiactivos tales como yodo^{123}, yodo^{125}, yodo^{126}, yodo^{133}, bromo^{77}, tecnecio^{99m}, indio^{111}, indio^{113m}, galio^{67}, galio^{68}, rutenio^{95}, rutenio^{97}, rutenio^{103} rutenio^{105}, mercurio^{107}, mercurio^{203}, renio^{99m}, renio^{101}, renio^{105}, escandio^{47}, telurio^{121m}, telurio^{122m}, telurio^{125m}, tulio^{165}, tulio^{167}, tulio^{168}, flúor^{18}, itrio^{199} y yodo^{131}. Los métodos conocidos por los expertos en la técnica que existen para el acoplamiento de los radioisótopos terapéuticos a los anticuerpos, directamente o mediante un agente quelante tal como EDTA o DTPA mencionados anteriormente, se pueden usar para los radioelementos que se pueden usar en diagnóstico. Se puede igualmente citar el marcado con N_{a}[I^{125}] mediante el método de cloramina T [Hunter W. M. y Greenwood F. C. (1962) Nature 194: 495], o también con tecnecio^{99m} mediante la técnica de Crockford et al. (Patente US 4.424.200), o unidos mediante DTPA como se describe por Hnatowich (patente US 4.479.930).

De esta manera, los anticuerpos, o sus fragmentos funcionales, según la invención, se pueden usar en un procedimiento para la detección y/o la cuantificación de una sobreexpresión o de una subexpresión, preferentemente una sobreexpresión, del receptor IGF-IR y/o EGFR en una muestra biológica, caracterizado porque comprende las siguientes etapas:

a): poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, según la invención; y

b): demostrar el complejo IGF-IR y/o EGFR/anticuerpo eventualmente formado.

Los anticuerpos, o sus fragmentos funcionales, según la invención, se podrán usar en un procedimiento para la detección y/o la cuantificación del receptor IGF-IR y/o EGFR en una muestra biológica, para el monitoreo de la eficacia de un tratamiento profiláctico y/o terapéutico de cáncer dependiente del IGF, o también de psoriasis.

Más generalmente, los anticuerpos, o sus fragmentos funcionales, descritos aquí se pueden usar en forma ventajosa en cualquier situación en la que la expresión de receptor IGF-IR se debe de observar de manera cualitativa y/o cuantitativa.

Preferentemente, la muestra biológica está constituida por un fluido biológico, tal como suero, sangre entera, células, una muestra de tejido o biopsias de origen humano.

Cualquier procedimiento o ensayo convencional se puede usar para llevar a cabo dicha detección y/o dosificación. Dicho ensayo puede ser un ensayo de competencia o en sándwich, o cualquier ensayo conocido por los expertos en la técnica que dependa de la formación de un complejo inmune de tipo anticuerpo-antígeno. Siguiendo las aplicaciones según la invención, el anticuerpo o uno de sus fragmentos funcionales se puede inmovilizar o marcar. Esta inmovilización se puede realizar sobre numerosos soportes conocidos por los expertos en la técnica. Estos soportes pueden incluir especialmente vidrio, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrano, nylon, o células naturales o modificadas. Estos soportes pueden ser solubles o insolubles.

A título de ejemplo, un método preferido usa procedimientos inmunoenzimáticos según la técnica de ELISA, mediante inmunofluorescencia, o técnica de radioinmunoensayo (RIA), o su equivalente.

De esta manera, la presente invención comprende igualmente los kits o estuches necesarios para llevar a cabo un método de diagnóstico de enfermedades inducidas por una sobreexpresión o una subexpresión del receptor IGF-IR, o para llevar a cabo un procedimiento para la detección y/o la cuantificación de una sobreexpresión o de una subexpresión del receptor IGF-IR en una muestra biológica, preferentemente una sobreexpresión, de dicho receptor, caracterizado porque dicho kit o estuche comprende los siguientes elementos:

a): un anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, según la invención;

b): eventualmente, los reactivos para la constitución del medio favorable para la reacción inmunológica;

c): eventualmente, los reactivos que permiten la demostración de los complejos de IGF-IR/anticuerpo producidos mediante la reacción inmunológica.

La invención describe igualmente el uso de un anticuerpo según la invención, para la preparación de un medicamento destinado a la detección de diana específica de un compuesto biológicamente activo a células que expresan o sobreexpresan el receptor IGF-IR.

Se pretende designar aquí mediante la expresión "compuesto biológicamente activo" cualquier compuesto capaz de modular, especialmente de inhibir, la actividad celular, en particular su crecimiento, su proliferación, transcripción o traducción de genes.

La invención describe también un reactivo de diagnóstico in vivo que comprende un anticuerpo según la invención, o uno de sus fragmentos funcionales, preferentemente marcado, especialmente radiomarcado, y su uso en formación de imágenes médicas, en particular para la detección de cáncer relacionado con la expresión o la sobreexpresión, por una célula, del receptor IGF-IR.

En la presente descripción, se pretende que la expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" designe un compuesto o una combinación de compuestos que entran en una composición farmacéutica sin provocar reacciones secundarias, y que permite, por ejemplo, facilitar la administración del o de los compuestos activos, un aumento de su vida y/o de su eficacia en el organismo, el aumento de su solubilidad en disolución, o también la mejora de su conservación. Estos vehículos farmacéuticamente aceptables son bien conocidos, y se adaptaron por los expertos en la técnica en función de la naturaleza y del modo de administración del o de los compuestos activos elegidos.

Preferentemente, estos compuestos se administrarán mediante la vía sistémica, en particular por vía intravenosa, por vía intramuscular, intradérmica, intraperitoneal o subcutánea, o mediante vía oral. De manera más preferida, la composición que comprende los anticuerpos según la invención se administrará varias veces, de forma secuencial.

Sus modos de administración, dosificaciones y formas galénicas óptimas, se pueden determinar según los criterios considerados generalmente en el establecimiento de un tratamiento adaptado para un paciente tales como, por ejemplo, la edad o el peso corporal del paciente, la gravedad de su estado general, la tolerancia al tratamiento, y los efectos secundarios observados.

Otras características y ventajas de la invención aparecen a continuación en la descripción con los ejemplos y las figuras, cuyas leyendas se representan a continuación:

Leyenda de las figuras

Figura 1: Representación esquemática del IGF-IR.

Figura 2: Esquema de la transducción de señales mediada por el IGF-IR durante la unión a IGF.

Figuras 3A, 3B y 3C: Reconocimiento del IGF-IR nativo expresado sobre la superficie de las células MCF-7 por el anticuerpo monoclonal 7C10.

Para este experimento, las células MCF-7 se incuban con el anticuerpo 7C10, o con un anticuerpo de control negativo, y después se recuperan con la ayuda de un anticuerpo secundario anti-especie fluorescente. El marcado se lee en un FACS. El primer histograma (figura 3A) corresponde a las células MCF-7 solas. En el segundo histograma (figura 3B), la curva no sombreada corresponde al marcado no específico por un anticuerpo murino isotipo de control. En el tercer histograma (figura 3C), la curva no sombreada muestra el reconocimiento del IGF-IR por el ACM 7C10.

Figuras 4A, 4B y 4C: Marcado de células de insectos Sf9 que expresan respectivamente el IGF-IR o el IR.

La figura 4A muestra el marcado de células no transfectadas solas (1), o células marcadas con anticuerpos monoclonales comerciales de control, que reconocen respectivamente el IGF-IR (2) o el IR (3). En la figura 4B, las células Sf9 que expresan únicamente el IGF-IR, se marcan con \alphalR3 (2) o anti-IR (3), el valor máximo (1) representa las células individuales. En la figura 4C, las células Sf9 que expresan únicamente el IR, se marcan con un anti-IR (3) o \alphalR3 (2), el valor máximo (1) representa las células individuales.

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Figura 5: Efecto inhibidor del anticuerpo 7C10 sobre la proliferación de células MCF-7 inducida por el IGF-1.

Las células MCF-7 se incuban en presencia de concentraciones crecientes de IGF1 en presencia o en ausencia del ACM que se va a ensayar. La proliferación celular se evalúa siguiendo la incorporación de ^{3}H-timidina. El anticuerpo comercial \alphalR3 se usa como un control positivo del experimento. La 7G3 es una IgG1 anti-IGF-IR murino sin actividad sobre la proliferación, se usa como un isotipo de control.

Figuras 6A, 6B y 6C:

-: figura 6A: efecto in vivo del anticuerpo monoclonal 7C10 sobre el crecimiento de tumores MCF-7 establecidos en ratones atímicos;

-: figuras 6B y 6C: figuras que proceden, respectivamente, de publicaciones de Arteaga et al. (J. Clin. Invest., 84, 1418-1423, 1989) y de Li et al. (Cancer Immunol. Immunother., 49, 243-252), y mostrando para la figura 6B el efecto de \alphalR3 murino (igualmente denominado alR3), y para la figura 6C, el efecto de un scFv-Fc recombinante derivado del anticuerpo 1H7 sobre el crecimiento tumoral.

Figura 7: Estudio comparativo del efecto del AcM 7C10 y del tamoxifeno sobre el crecimiento in vivo del tumor MCF-7.

Figuras 8A, 8B y 8C: Estudio de la actividad antitumoral del anticuerpo murino 7C10 en diferentes modelos de xenoinjerto de células tumorales in vivo.

La figura 8A muestra los resultados obtenidos en un modelo de osteosarcoma SK-ES-1, la figura 8B se refiere a un tumor de próstata DU-145 independiente de andrógenos, y la figura 8C se refiere a un modelo de tumor pulmonar A549 de células no pequeñas. En estos tres modelos, el tratamiento se llevó a cabo dos veces por semana i.p. a razón de 250 \mug/dosis/ratón. Las curvas 7G3, EC2 y 9G4 corresponden, respectivamente, a tres IgG1 murinos usadas como un isotipo de control del experimento en cada uno de los modelos.

Figura 9: Estudio del efecto antitumoral del AcM 7C10 en comparación con navelbina (vinorelbina), así como la sinergia de los dos compuestos sobre el crecimiento in vivo de la línea A549.

Figura 10: Actividad comparativa de los AcM \alphalR3, 7C10 y 1H7 sobre la proliferación de células MCF-7 inducida por el IGF-2.

Figura 11: Comparación de los AcM 7C10 murino y el C7C10 quimérico para la inhibición de la proliferación de células MCF-7 inducida por el IGF1 in vitro. El anticuerpo 9G4 es una IgG1 murino usada como un isotipo control del experimento.

Figura 12: Efecto comparativo de los AcM 7C10 y h7C10 (humanizado 1, denominado aquí como 7H2HM) sobre el modelo in vitro de la proliferación de células MCF-7 inducida por el IGF1.

Figura 13: Efecto de los AcM 7C10 y h7C10 (humanizado 1, denominado aquí como 7H2HM) sobre la transducción de la señal inducida por el IGF1. La primera línea de puntos corresponde a la revelación, mediante un anticuerpo antifosfotirosina, de la fosforilación de la cadena \beta inmunoprecipitada a partir de células incubadas en presencia del IGF1 solo, o del IGF1 al que se le ha añadido anticuerpos que se van a ensayar. El 9G4 y el hIgG1 son, respectivamente, los isotipos de control de las formas 7C10 y h7C10 (denominadas igualmente como 7H2HM). La segunda línea de puntos corresponde a la revelación de la cadena \beta, y muestra que la cantidad depositada en todos los pocillos es perfectamente equivalente.

Figura 14: Secuencia del ADNc (SEC ID nº 48), de su hebra complementaria (SEC ID nº 50), y su traducción en aminoácidos (SEC ID nº 49), del fragmento de PCR amplificado a partir del hibridoma de ratón 7C10 con los cebadores MKV-1 y MKC, y que codifica el extremo 3' del péptido líder y 7C10 VL.

Figura 15: Secuencia del ADNc (SEC ID nº 51), de su hebra complementaria (SEC ID nº 53), y su traducción en aminoácidos (SEC ID nº 52), del fragmento de PCR amplificado a partir del hibridoma de ratón 7C10 con los cebadores MHV-12 y MHC-1, o MHV-8 y MHC-1, y que codifica el extremo 3' del péptido líder y 7C10 VH.

Figura 16: Reconocimiento del receptor IGF-1 por el anticuerpo quimérico 7C10, denominado igualmente C7C10 (sobrenadante del cultivo de células cos7 transfectadas).

Figura 17: Comparación de la secuencia de aminoácidos de 7C10 VL de ratón (SEC ID nº 54), con células de otros anticuerpos de ratón que tienen la homología más alta de secuencias.

La numeración de los aminoácidos, es la de Kabat et al. (1991). Los restos en las regiones de la estructura (CDR exteriores) que difieren entre 7C10 VL y el subgrupo II de ratón de Kabat (SEC ID nº 57), están subrayados. Un punto indica que el resto es idéntico en esta posición en comparación con la secuencia de 7C10 VL. DRB1-4.3 (SEC ID nº 55) representa la secuencia de la cadena ligera de una cadena B clase II del MHC de anticuerpo de ratón anti-humano (el número de acceso en el banco de datos de Kabat es N011794). C94-5B11'CL (SEC ID nº 56) representa la secuencia de la cadena ligera de un anticuerpo de ratón (el número de acceso en el banco de datos de Kabat es P019314).

Figura 18: Comparación de las secuencias de aminoácidos de 7C10 VL de ratón (SEC ID nº 54), con células de las cadenas ligeras humanas que pertenecen al subgrupo II de humano de Kabat (SEC ID nº 60), y que tiene la homología más alta de secuencias.

Las secuencias de aminoácidos están alineadas y se comparan con las del 7C10 VL de ratón. Un punto indica que el resto es idéntico en esta posición en comparación con la secuencia de 7C10 VL. GM607 (SEC ID nº 58) representa la secuencia de la cadena ligera kappa segregada por la línea linfoblastoide GM607 humana (Klobeck et al., Nucleic Acids Res., 12: 6995-7006, 1984a, y Klobeck et al., Nature, 309: 73-76, 1984b; el número de acceso en el banco de datos de Kabat es N011606). DPK15/A19 (SEC ID nº 59) representa la secuencia de la línea germinal V kappa II humana.

Figura 19: Comparación de las secuencias de aminoácidos de regiones variables de las cadenas ligeras (VL) de 7C10 de ratón (SEC ID nº 54), del anticuerpo GM 607 humano (SEC ID nº 58), y de dos versiones de 7C10 1 y 2 humanizadas (SEC ID nº 61 y 65).

Las secuencias de aminoácidos están alineadas y se comparan con las de 7C10 VL de ratón. Un punto indica que el resto es idéntico en esta posición en comparación con la secuencia de 7C10 VL. GM607 representa la secuencia de la cadena ligera kappa segregada por la línea linfoblastoide GM607 humana (Klobeck et al., 1984a y 1984b; el número de acceso en la base de datos de Kabat es N011606).

Figura 20: Secuencia de ADNc (SEC ID nº 62), su hebra complementaria (SEC ID nº 64) y su traducción en aminoácidos (SEC ID nº 63), del gen construido mediante ensamble de novo que codifica el péptido líder y la versión humanizada 1 de 7C10 VL.

Figura 21: Secuencia de ADNc (SEC ID nº 66), su hebra complementaria (SEC ID nº 68) y su traducción en aminoácidos (SEC ID nº 67), del gen construido mediante ensamble de novo que codifica el péptido líder y la versión humanizada 2 de 7C10 VL.

Figura 22: Comparación de las secuencias de aminoácidos de 7C10 VH de ratón (SEC ID nº 69) con las de las cadenas pesadas de ratón-humano que pertenecen al subgrupo I(A) de ratón de Kabat, y que tienen la homología más alta de secuencias.

La numeración de los aminoácidos es la de Kabat et al. (1991). Los restos en las regiones de la estructura (CDR exteriores) que difieren entre 7C10 VH y el subgrupo I(A) de ratón de Kabat (SEC ID nº 71), están subrayados. Un punto indica que el resto es idéntico en esta posición en comparación con la secuencia de 7C10 VH de ratón. ANO3'CL (SEC ID nº 70) representa la secuencia de la cadena pesada de un anticuerpo de ratón (el número de acceso en la base de datos de Kabat es P001289).

Figura 23: Comparación de las secuencias de aminoácidos de 7C10 VH de ratón (SEC ID nº 69) con las de las cadenas pesadas humanas que pertenecen al subgrupo II humano de Kabat (SEC ID nº 72), y que tiene la homología más alta de secuencias.

Los restos subrayados forman parte de las estructuras canónicas definidas por Chothia et al. (1989). Un punto indica que el resto es idéntico en esta posición en comparación con la secuencia de 7C10 VH de ratón. VH FUR1'CL humano (SEC ID nº 73) representa la secuencia de la cadena pesada de un anticuerpo anti-lamina B humano IgM/K de origen autoinmune (Mariette et al., Arthritis and Rheumatism, 36: 1315-1324, 1993; número de acceso en Kabat: N020619). La línea germinal humana (SEC ID nº 74) representa la secuencia de la línea germinal humana 4.22 VH IV (Sanz et al., EMBO. J. 8: 3741-3748, 1989).

Figura 24: Comparación de las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de las cadenas pesadas (VH) de 7C10 de ratón (SEC ID nº 69), y de las tres versiones humanizadas, mediante injerto de CDR, VH humanizada 1, 2 y 3 (respectivamente, SEC ID nº 75, 79 y 83).

La numeración de los restos corresponde a la de Kabat. Las secuencias están alineadas, y se comparan con las de 7C10 VH de ratón. Un punto indica que el resto es idéntico en esta posición en comparación con la secuencia de 7C10 VH de ratón.

Figura 25: Secuencia de ADNc (SEC ID nº 76), su hebra complementaria (SEC ID nº 78) y su traducción en aminoácidos (SEC ID nº 77), del gen construido mediante ensamble de novo que codifica el péptido líder y la versión humanizada 1 de 7C10 VH.

Figura 26: Secuencia de ADNc (SEC ID nº 80), su hebra complementaria (SEC ID No. 82) y su traducción en aminoácidos (SEC ID nº 81), del gen construido mediante ensamble de novo que codifica el péptido líder y la versión humanizada 2 de 7C10 VH.

Figura 27: Secuencia de ADNc (SEC ID nº 84), su hebra complementaria (SEC ID nº 86) y su traducción en aminoácidos (SEC ID nº 85), del gen construido mediante ensamble de novo que codifica el péptido líder y la versión humanizada 3 de 7C10 VH.

Figura 28: Comparación de la actividad de reconocimiento del receptor IGF-1 por el anticuerpo quimérico 7C10 (denominado "C7C10") y su versión humanizada 1 (7C10 hum 1) en ELISA.

Figura 29: Influencia sobre la actividad de reconocimiento del receptor IGF-1 de las versiones humanizadas 1 y 2 de la cadena ligera del anticuerpo 7C10 en ELISA.

Figura 30: Comparación de la actividad de reconocimiento del receptor IGF-1 por el anticuerpo quimérico 7C10 y tres versiones humanizadas de la cadena pesada (7C10 hum 1, 2 y 3) en asociación con 7C10 VL 2 humanizado en ELISA.

Figura 31: Actividad antitumoral del anticuerpo 7C10 en un modelo ortotópico A549.

Figuras 32A, 32B, 32C y 32D: Estudio de la ADCC observada a nivel de células A549 y MCF-7 cultivadas durante 4 horas en presencia del anticuerpo 7H2HM (respectivamente, figuras 32C y 32D). El anticuerpo h4D5 se usa en paralelo como un control positivo del experimento para las células A549 y MCF-7 (respectivamente, figuras 32A y 32B).

Figuras 33A, 33B y 33C: Efecto de los anticuerpos 7C10 y 7H2HM sobre el ciclo celular de las células MCF-7.

La figura 33A representa la proporción de células MCF-7 en la fase G0/G1, S y G2/M en ausencia del IGF1, expresada como un porcentaje significativo del total de células MCF-7 observadas.

La figura 33B representa la proporción de células MCF-7 en la fase G0/G1, S y G2/M en presencia del IGF1, expresada como un porcentaje del total de células MCF-7 observadas.

La figura 33C representa la proporción de células MCF-7 en la fase S (\blacksquare) y G2/M (\square), expresada como un porcentaje del total de células MCF-7 observadas, en presencia de los compuestos indicados en la figura, en comparación con una muestra de control en ausencia del IGF1 ("0").

Figuras 34A y 34B: Efecto comparativo de los anticuerpos 7C10 y 7H2HM sobre el crecimiento de células A549 in vitro (figura 34A) y sobre el crecimiento de células MCF-7 in vivo (figura 34B).

Figuras 35A y 35B: Estudio de la sinergia del anticuerpo 7H2HM asociado con navelbina (NA) sobre el modelo A549 in vivo, en comparación con las muestras de control. La figura 35A representa el desarrollo del volumen del tumor implantado en función del tratamiento llevado a cabo a partir del comienzo del tratamiento y durante aproximadamente 50 días (figura 35A). La Figura 35B representa, de manera particular, los resultados obtenidos para este desarrollo comparado en aproximadamente 48 días. En esta figura, los resultados obtenidos con el anticuerpo 7C10 se han introducido a título comparativo (los asteriscos (*) corresponden al grupo de control de comparación/grupo (7C10 + Na) o grupo de control/grupo (7H2HM + Na) en un ensayo t).

Figura 36: Estudio del efecto de los anticuerpos 7C10 y 7H2HM sobre la apoptosis.

Esta figura representa la potenciación del efecto de la doxorrubicina por los anticuerpos 7C10 y 7H2HM (doxorrubicina, 2 \mug/ml).

Figuras 37A a 37D: Demostración mediante un marcado de FACS, de la presencia del EGFR y del IGF-IR sobre la superficie de células A549.

Figura 38: Efecto de una coadministración de los ACM 7C10 y 225 sobre el crecimiento in vivo del tumor A549.

Figura 39: Efecto de una coadministración de los ACM 7C10 y 225 sobre la supervivencia de ratones implantados ortotópicamente con células A549.

Figuras 40A y 40B: Demostración de la inhibición de la fosforilación de tirosina de la cadena beta del IGF-IR y de IRS-1 por los ACM 7C10 y 7H2HM.

Figura 41: Demostración de la inducción de la incorporación del IGF-IR por los ACM 7C10 y 7H2HM.

Figuras 42A a 42C: Demostración de la degradación del IGF-IR por los ACM 7C10 y 7H2HM.

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Ejemplo 1

Generación y selección del anticuerpo monoclonal (AcM) murino

A fin de generar AcM dirigidos específicamente contra el IGF-IR, y que no reconocen al IR, se concibió un protocolo que comprendía 6 etapas de detección sistemática:

El protocolo consistía en:

-: inmunizar ratones con IGF-IR recombinante, para generar hibridomas,

-: seleccionar los sobrenadantes de cultivo mediante ELISA sobre la proteína recombinante que sirvió para la inmunización,

-: ensayar todos los sobrenadantes de hibridomas positivos mediante ELISA sobre el receptor nativo sobreexpresado sobre la superficie de células tumorales MCF-7,

-: evaluar los sobrenadantes de hibridomas positivos en las dos primeras detecciones sistémicas en términos de reconocimiento diferencial del IGF-IR y del IR sobre células de insecto infectadas con baculovirus que expresan respectivamente al IGF-IR o al IR,

-: verificar que los anticuerpos seleccionados en esta etapa fueran capaces de inhibir in vitro la proliferación de las células MCF-7 inducida por el IGF1,

-: garantizar la actividad in vivo, en ratones atímicos, del candidato retenido en términos de impacto sobre el crecimiento del tumor MCF-7.

El conjunto de estos diferentes resultados y de los resultados obtenidos se describirán brevemente a continuación en el ejemplo 1.

Para la etapa de inmunización, se inyectaron dos veces los ratones, mediante la vía subcutánea, con 8 \mug del IGF-IR recombinante. Tres días antes de la fusión de las células de la rata hembra con las células del mieloma murino Sp2OAg14, se estimularon los ratones mediante una inyección intravenosa de 3 \mug del receptor recombinante. Catorce días después de la fusión, los sobrenadantes de hibridomas se seleccionaron mediante ELISA, sobre placas sensibilizadas por el IGF-IR recombinante. Los hibridomas cuyos sobrenadantes se encontraron positivos, se conservaron y se amplificaron antes de ser ensayados sobre el FACScan a fin de verificar que los anticuerpos producidos fueran igualmente capaces de reconocer al IGF-IR nativo. Para eso, se incubaron células MCF-7 de un tumor de mama dependiente de estrógeno que sobreexpresa al IGF-IR, con cada uno de los sobrenadantes de cultivo producidos por los hibridomas seleccionados en ELISA. Los complejos del receptor nativo/AcM sobre la superficie de la célula, fueron revelados mediante un anticuerpo anti-especie secundario acoplado a un fluorocromo. Las figuras 3A a 3C muestran un histograma tipo obtenido con el sobrenadante del hibridoma 7C10 (figura 3C) comparado con un marcado de células solas + anticuerpo secundario (figura 3A), o con un marcado usando un isotipo de control
(figura 3B).

En esta etapa de la selección, sólo los hibridomas que segregan AcM y que reconocen al mismo tiempo al receptor recombinante y el receptor nativo, fueron seleccionados y clonados. Los AcM segregados por estos hibridomas se obtuvieron y se purificaron antes de ser ensayados sobre el FACScan, según el método descrito anteriormente, sobre células de insectos Sf9 que expresan al IGF-IR o al IR, a fin de eliminar los hibridomas que reconocen al mismo tiempo a los dos receptores. La figura 4A muestra una recuperación total de los histogramas 1, 2, y 3 que corresponden, respectivamente, a las células no infectadas + anticuerpos secundarios (1), a las células no infectadas marcadas por \alphalR3 + anticuerpos secundarios (2), y a las células no infectadas marcadas por un anticuerpo anti-IR + anticuerpos secundarios (3). Este primer resultado muestra bien la ausencia del IGF-IR y del IR detectables sobre la superficie de estas células de insecto no infectadas. La figura 4B muestra un marcado de células infectadas mediante un baculovirus que expresa al IGF-IR. En esta segunda figura, el \alphalR3, usado como control positivo, marca bien, como era de esperar, a las células (valor máximo 2), mientras que el anti-IR (valor máximo 3) se superpone sobre el valor máximo de células individuales. Finalmente, en la figura 4C, se muestra que el anti-IR marca bien, como era de esperar, a las células Sf9 que expresan al IR (valor máximo 3), pero de manera inesperada, el \alphalR3, descrito en la bibliografía como específico para el IGF-IR, parece reconocer igualmente al IR (valor máximo 2).

Los resultados obtenidos en este tercer sistema de detección sistemática se resumen en la tabla 1, y muestran la generación de un AcM: el 7-C-10, satisfaciendo los criterios de reconocimiento del FIGF-BRT, y de falta de reconocimiento del IR. El isotipaje del AcM 7C10 mostró que se trataba de una IgG1.

TABLA 1 Reactividad comparativa del AcM 7C10 sobre células de insectos Sf9 que expresan al IGF-IR o al IR

1

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Las dos últimas detecciones sistemáticas provistas por la selección del AcM, consistieron en verificar que esta última fuera capaz de inhibir la proliferación celular inducida por el IGF-1 in vitro e in vivo sobre la línea celular MCF-7.

Para la selección in vitro, las células MCF-7 fueron inoculadas, privadas de suero de ternera fetal, y después incubadas en presencia de concentraciones crecientes de IGF-1 (de 1 a 50 ng/ml) en presencia o en ausencia del anticuerpo 7C10 a ensayar añadido de una concentración final de 10 \mug/ml. En este experimento, el AcM \alphalR3 comercial se introdujo como un control positivo, y el AcM 7G3 (aislado en paralelo al 7C10, y que reconoce débilmente al receptor nativo (MFI en el FACS de 50 en comparación con 200 para el AcM 7C10)) como un isotipo de control. La proliferación celular se calcula siguiendo en el contador \beta la incorporación de timidina tritiada por las células. Los resultados se expresan como un índice proliferativo. Los datos presentados en la figura 5 muestran que el IGF1 es capaz de estimular de manera dependiente de la dosis, la proliferación de las células MCF-7. El AcM \alphalR3, usado como un control positivo, inhibe completamente la proliferación de las células MCF-7 inducidas por el IGF-1. De la misma manera, el AcM 7C10 es capaz de inhibir significativamente el crecimiento de las células MCF-7 inducidas por el IGF-1. Finalmente, el AcM 7G3 usado como un isotipo de control resulta, como era de esperar, sin efecto alguno sobre el crecimiento celular tumoral in vitro en la célula MCF-7.

La selección in vivo se llevó a cabo en un modelo de tumor establecido. Para eso, ratones atímicos recibieron un implante subcutáneo de estrógeno de liberación lenta, indispensable para la absorción del tumor en un modelo murino. Veinticuatro horas después de la implantación de los estrógenos, se injertan subcutáneamente 5.10^{6} células MCF-7 en el flanco derecho del ratón. Cinco días después de este injerto celular, los tumores se pueden medir, y se forman al azar lotes de 6 ratones. El tratamiento de los ratones se lleva a cabo dos veces por semana, durante 5 a 6 semanas, con una dosis de 250 \mug/dosis/ratón. En el grupo de control, los ratones se tratan de la misma manera con un isotipo de control murino. Los resultados presentados en la figura 6A muestran una inhibición muy significativa del crecimiento tumoral inducido por el anticuerpo 7C10. Esta actividad es particularmente inesperada si se hace referencia a los datos disponibles respecto al \alphalR3, usado siempre como una referencia en el dominio del receptor para el IGF1, y conocido por carecer de actividad in vivo sobre el crecimiento de tumores dependiente de estrógeno (véase la figura 6B). Además, en comparación con los resultados obtenidos con el anticuerpo recombinante scFv-Fc derivado del AcM 1H7 murino (véase la figura 6C), el AcM 7C10 es mucho más eficaz en la inhibición in vivo del crecimiento de las células MCF-7.

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Ejemplo 2

Comparación del efecto de 7C10 y del tamoxifeno sobre el crecimiento in vivo del tumor MCF-7

Con el propósito de determinar la potencia del tratamiento mediante el anticuerpo 7C10 en el ámbito del cáncer de mama dependiente de estrógeno, se comparó el 7C10 con el compuesto tamoxifeno usado comúnmente para el tratamiento de carcinoma de mama en el ámbito de formas evolucionadas con progresión local y/o metastásicas, y en el ámbito de la prevención de recidivas (véase VIDAL 2000, páginas 1975-1976).

En cánceres de mama dependientes de hormonas, existe una correlación significativa entre la expresión de los receptores a los estrógenos (ER) y la del IGF-IR (Surmacz E. et al., Breast Cancer Res. Treat., Feb., 47(3): 255-267, 1998). Por otra parte, parece ser que los estrógenos (E2) actúan en sinergia con el IGF1 (escrito a veces como IGF-I o IGFI), para estimular la proliferación celular. En efecto, se ha mostrado que un tratamiento con E2 incrementa de aproximadamente 10 veces el nivel del ARNm del IGF-IR, así como el nivel de expresión de la proteína (Lee A.V. et al., Mol. Endocrinol., mayo, 13(5): 787-796, 1999). Este incremento se traduce por un aumento significativo de la fosforilación del IGF-IR. Además, los E2 estimulan significativamente la expresión del IRS-1 ("IRS-1" para "sustrato receptor de insulina-1"), que es uno de los sustratos del IGF-IR fosforilado.

El tamoxifeno se usa ampliamente desde hace muchos años en terapia hormonal para el tratamiento de pacientes que sufren de cánceres de mama dependientes de E2 (Forbes J. F., Semin. Oncol., Feb., 24 (1. Supl. 1): S1-5-S1-19, 1997). Esta molécula entra en competencia con el estradiol, e inhibe la unión de éste a su receptor (Jordan V.C., Breast Cancer Res. Treat., 31(1): 41-52, 1994). Además, se ha demostrado que el tamoxifeno es capaz de inhibir la proliferación dependiente del IGF-IR, inhibiendo la expresión del receptor y su fosforilacion (Guvakova M. A. et al., Cancer Res., 1 de julio, 57(13): 2606-2610, 1997). El conjunto de estos datos parecen indicar que el IGF-IR es un mediador importante de la proliferación inducida por la interacción E2/ER.

Siendo el uso de tamoxifeno a largo plazo asociado con un incremento significativo en el riesgo de cáncer endometrial (Fisher et al., J. of National Cancer Institute, 86, 7: 527-537, 1994; VIDAL 2000, 1975-1976), y de recidiva colateral de cáncer de mama independiente de E2 (Li C. I. et al., J. Natl. Cancer Inst. 4 de julio, 93(13): 1008-1013, 2001). En este contexto, se efectuó una comparación del efecto antitumoral in vivo del anticuerpo 7C10 y del tamoxifeno en el modelo de MCF-7, a fin de determinar la parte de la actividad relacionada con el IGF-IR en la proliferación mediada por ER. Para eso, se implantaron 7.10^{6} células MCF-7 en sc (subcutáneamente) en ratones atímicos, 24 horas después de la implantación, en estos mismos ratones, de un gránulo de estradiol con liberación prolongada (0,72 mg/tableta liberada durante 60 días), indispensable para el establecimiento de cualquier tumor humano dependiente de E2 en esta especie animal. Cinco días después de esta implantación, los tumores se miden, y se forman grupos de 6 ratones. Estos grupos se tratan respectivamente con 1) el anticuerpo 7C10 inyectado ip (intraperitonealmente) a razón de 250 \mug/ratón, dos veces por semana, 2) 10 \mug de tamoxifeno administrado en PBS que contiene 3% de hidroxipropilcelulosa (HPC) ip, o 3) el solvente en el cual el tamoxifeno se absorbe (hidroxipropilcelulosa). El tamoxifeno se administra diariamente durante 4 semanas, salvo el fin de semana. Los ratones tratados con el AcM 7C10 reciben igualmente, cada día, una inyección de 3% de PBS con HPC. Se llevó a cabo previamente un estudio para verificar que el solvente solo carece de efecto sobre el crecimiento tumoral.

Los resultados presentados en la figura 7 muestran que el AcM 7C10 es capaz de inhibir significativamente el crecimiento del tumor MCF-7 in vivo (los asteriscos (*) corresponden a la comparación del grupo de control/grupo de 7C10 en un ensayo t). De manera sorprendente, el anticuerpo 7C10 parece ser significativamente más eficaz que el tamoxifeno para la inhibición del crecimiento tumoral (los círculos (º) corresponden a la comparación del grupo de tamoxifeno/grupo de 7C10 en un ensayo t), sugiriendo que este tipo de tratamiento mediante AcM podría sustituir al tratamiento con tamoxifeno.

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Ejemplo 3

Demostración de la actividad antitumoral del AcM 7C10 in vivo sobre tumores humanos de diferentes orígenes a) Actividad in vivo del anticuerpo 7C10 en tres modelos de tumor

A fin de generalizar la actividad del anticuerpo 7C10 hacia otros tumores que expresan al receptor para IGF1, se ensayó el 7C10 in vivo en un modelo de tumor de próstata DU145 independiente de andrógenos (escrito igualmente como DU-145), en un modelo de osteosarcoma SKES-1 y en un modelo de tumor pulmonar de células no pequeñas A549. El protocolo es comparable al descrito anteriormente para MCF-7, y los resultados presentados en las figuras 8A a 8C muestran una actividad significativa de este ACM en los tres modelos de tumor. La actividad observada en el modelo de tumor de próstata se observará muy particularmente en la medida en la que la cadena sencilla scFv del ACM 1H7 carece de actividad en un modelo de tumor de la próstata independiente de andrógenos (Li et al., 2000).

b) Actividad in vivo del anticuerpo 7C10 en un modelo ortotópico de A549

Los modelos de xenoinjerto convencionales descritos anteriormente no permiten el estudio de profármacos sobre la diseminación metastásica. En efecto, los tumores implantados s.c. (subcutáneamente) siguen siendo localizados al sitio de inyección, y no son, por lo tanto, realmente una reflexión de la situación en el ser humano. A fin de evaluar el anticuerpo en cuestión en un modelo más cercano a la realidad, se implantaron las células A549 en un sitio intrapleural. Este modelo, el cual está bien descrito (Clin. Cancer. Res. Enero de 2000; 6(1): 297-304), permite observar una diseminación metastásica cercana a la observada en el ser humano, con metástasis mediastinales, pulmonares, cardiacas y vertebrales. En el estudio que se llevó a cabo, se inyectaron de forma intrapleural 10^{6} células A549 en ratones atímicos hembras. Siete días después de la implantación, se dividió a los ratones en dos lotes de 22. Uno de estos lotes recibió una dosis de desafío de 500 \mug/ratón, y se trató después dos veces por semana a razón de 250 \mug de 7C10/dosis. El segundo lote se trató según el mismo esquema con el isotipo de control 9G4. La figura 31 muestra una extensión de supervivencia significativa en los ratones tratados con el ACM 7C10, indicando que este anticuerpo es capaz de tener una acción sobre la diseminación metastásica.

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Ejemplo 4

Comparación del AcM 7C10 con navelbina in vivo; efecto de una coadministración de los dos tratamientos

La navelbina es un compuesto de quimioterapia indicado en cáncer pulmonar de células no pequeñas y en cáncer de mama metastásico. Se hizo un estudio comparativo de 7C10 y de navelbina de la sinergia eventual entre los dos productos sobre el modelo tumoral A549. Para este estudio, se insertaron subcutáneamente 5.10^{6} células A549 en el flanco derecho del ratón. Cinco días después del injerto celular, se pueden medir los tumores, y se inician los tratamientos con AcM y/o navelbina. La dosis de AcM es siempre de 250 \mug/dosis/ratón, dos veces por semana, intraperitonealmente. Respecto a la navelbina, se administrará a la dosis máxima tolerada por el ratón o sea 10 mg/kg, intraperitonealmente. Para este tratamiento, se aplicarán tres inyecciones a intervalos de 7 días. Durante las coadministraciones, se mezclan los dos productos antes de la inyección.

Los resultados presentados en la figura 9 muestran de manera sorprendente que, en este modelo, el anticuerpo 7C10 es tan activo como el tratamiento convencional con navelbina. Una sinergia muy significativa de los dos productos se observa igualmente con cinco de siete ratones que no tienen tumores medibles en el día 72.

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Ejemplo 5

Estudio de la inhibición in vitro del crecimiento de los tumores MCF-7 inducido por el IGF2

Como se indicó anteriormente, el IGF-IR es sobreexpresado por numerosos tumores, pero se ha descrito además que en una buena parte de los cánceres de mama y de colon especialmente, la señal de proliferación se da para este receptor vía el IGF2 (escrito a veces como IGF-II o IGFII). Por lo tanto, es esencial asegurarse de que el AcM 7C10 sea capaz igualmente de inhibir el crecimiento del tumor MCF-7 in vitro inducido por el IGF2. Para eso, se inocularon células en placas de 96 pocillos, en ausencia privados de suero de ternera fetal, y se estimularon mediante la adición de 200 ng de IGF2 por ml final de medio, en presencia y en ausencia de AcM a ensayar introducidos con una concentración de 10 \mug/ml. Los resultados presentados en la figura 10 muestran que el IGF2, al igual que el IGF1, estimula significativamente el crecimiento de células MCF-7. La adición de un isotipo de control, el 9G4, continúa careciendo de efecto sobre esta estimulación. Como se describe por De Léon et al. (Growth Factors, 6: 327-334, 1992), no se observa efecto alguno durante la adición del AcM \alphalR3. En cambio, el 7C10 inhibe totalmente el crecimiento inducido por el IGF2. Su actividad es significativamente mejor que la de 1H7.

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Ejemplo 6 Actividad biológica de los anticuerpos 7C10 quiméricos (C7C10) y 7C10 humanizados (h7C10) a) Comparación de 7C10/C7C10 y 7C10/h7C10 en el modelo de MCF-7 in vitro

Se ensayaron in vitro la forma quimérica del AcM 7C10 y la forma humanizada 1 purificada (escrita aquí como 7H2HM) en el modelo de MCF-7 tal como se describió anteriormente. Los resultados presentados respectivamente en las figuras 11 y 12, muestran que estas dos formas tienen perfectamente preservadas sus propiedades para inhibir el crecimiento del tumor MCF-7 inducido por el IGF1.

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b) Efecto comparativo de los AcM 7C10 y h7C10 sobre la transducción de la señal inducida por la unión del IGF1 a su receptor

La actividad de la inhibición del crecimiento inducido in vitro por el IGF1 sobre la línea MCF-7 debería de ser la traducción de una inhibición de la transducción de la señal mediada por el IGF1 durante la unión del AcM 7C10 al receptor. A fin de verificar esta hipótesis, se incubaron células MCF-7 con o sin IGF1, en presencia o en ausencia de los anticuerpos que se van a ensayar. Después de un tiempo de incubación breve, las células se lisaron, la cadena \beta se inmunoprecipitó, y se calculó la fosforilación de esta subunidad con la ayuda de un anticuerpo antifosfotirosina quinasa. Los resultados presentados en la figura 13 muestran que la unión del 7C10 o del h7C10 inhibe significativamente la fosforilación de la subunidad \beta del IGF-IR, al opuesto de un anticuerpo irrelevante murino (9G4) o humano (escrito como IgG1 en el esquema).

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c) Implicación del anticuerpo 7H2HM en los mecanismos de ADCC

La inhibición de la transducción de la señal descrita anteriormente en el párrafo b), es el mecanismo de acción principal implicado en la actividad biológica de los anticuerpos 7C10 y 7H2HM. Sin embargo, es probable que durante su administración en el ser humano, el anticuerpo 7H2HM, de isotipo IgG1, sea capaz de inducir una lisis celular mediante un mecanismo de tipo ADCC (citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo). A fin de verificar este punto, se ponen células NK (células asesinas naturales) que provienen de la sangre periférica de donantes humanos en presencia de células A549 o MCF-7 incubadas previamente durante 4 horas con 10 \mug de anticuerpo 7H2HM por 5.10^{5} células y marcadas con ^{51}Cr (50 \mug). En este experimento, se usa la herceptina (escrita como h4D5 en las figuras 32A y 32B), como un control positivo del experimento. Las figuras 32A a 32D muestran que, como era de esperar, la herceptina induce una ADCC significativa sobre las dos células A549 y MCF-7 (véase, respectivamente, las figuras 32A y 32B). El 7H2HM es igualmente capaz de inducir una ADCC sobre las células A549 (véase 32C), pero este fenómeno es de amplitud menor sobre las células MCF-7 (véase la figura 32D).

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d) Efecto de los anticuerpos 7C10 y 7H2HM sobre el ciclo celular

La inhibición del crecimiento celular observado in vitro sobre la línea MCF-7, debería de traducirse mediante un efecto sobre el ciclo celular. A fin de responder a esta cuestión, se inoculan 4.10^{5} células en placas de 6 pocillos. Veinticuatro horas después de la inoculación, se quita el suero de ternera, y se añade IGF1 en presencia o en ausencia de los anticuerpos que se van a ensayar. Después de incubar durante 24 horas, las células se recuperan para el estudio del ciclo celular. La figura 33B muestra el efecto del IGF1 sobre la entrada en el ciclo y en el crecimiento de las células MCF-7, en comparación con la entrada en el ciclo y en el crecimiento de las células MCF-7 en ausencia del IGF1 (véase la figura 33A). Después de la adición del factor de crecimiento, se observa una disminución significativa en la fase G0/G1 (de 88,2% a 56,3%) para el beneficio de las fases S (de 7,8% a 31%) y G2/M (de 4% a 12,7%). Durante la adición de los anticuerpos 7C10 y 7H2HM (véase la figura 33C), se observa una inhibición significativa de la entrada en el ciclo. Se observará que el anticuerpo murino y su homólogo humanizado tienen una actividad comparable sobre el ciclo celular. El \alphalR3, introducido como control positivo parece ser ligeramente menos activo que el 7C10 y 7H2HM en este ensayo. El anticuerpo 9G4 usado como isotipo de control, carece de efecto sobre el ciclo celular.

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e) Actividad comparada in vivo de los anticuerpos 7C10 v 7H2HM sobre el modelo A549

A fin de confirmar la actividad del anticuerpo humanizado 7H2HM in vivo, este último se comparó al 7C10 en el modelo de tumor pulmonar de células no pequeñas A549. Este ensayo se llevó a cabo exactamente como se describió anteriormente, salvo por la dosis de anticuerpo que es de 125 \mug/dosis dos veces por semana en lugar de 250 \mug/dosis dos veces por semana, eso por la falta de disponibilidad de mayores cantidades de 7H2HM. El anticuerpo 9G4 se usó como isotipo de control para 7C10, y una inmunoglobulina humana irrelevante de isotipo IgG1 (denominada más adelante como HIgG1) se usó como control para el anticuerpo humanizado 7H2HM.

La figura 34A muestra que no existen diferencias significativas entre las curvas de control de 9G4 y HIgG1. Como era de esperar, se observa una inhibición significativa del crecimiento del tumor con el anticuerpo murino 7C10. Respecto al anticuerpo humanizado 7H2HM, la actividad observada es de exactamente la misma intensidad que la observada con su contraparte murino. Este dato, añadido a las observaciones descritas anteriormente in vitro, indica que la humanización no modificó las propiedades del anticuerpo generado. Por otra parte, en los modelos de xenoinjerto en el ratón, la actividad del anticuerpo humanizado parece estar relacionada integralmente con un mecanismo de inhibición de la transducción de la señal. En efecto si una parte de ADCC estaba en juego en el crecimiento tumoral en el ratón atímico, tendría que observarse una diferencia entre la actividad de los anticuerpos murinos y humanizados.

Asimismo, se llevó a cabo un experimento in vivo sobre el modelo de tumor de mama MCF-7 y muestra que, como era de esperar, el anticuerpo 7H2HM es perfectamente comparable con el anticuerpo murino 7C10 para la inhibición del crecimiento de este tumor in vivo (figura 34B).

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f) Demostración de una sinergia entre 7H2HM y navelbina

El protocolo descrito en el ejemplo 4 se repitió con el propósito de reproducir los resultados obtenidos con 7C10 con su homólogo humanizado: el anticuerpo 7H2HM.

Los resultados presentados en las figuras 35A y 35B muestran que, tal como en el caso de 7C10, se demuestra una sinergia significativa entre el anticuerpo humanizado 7H2HM y navelbina.

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g) Efecto de los anticuerpos 7C10 y 7H2HM sobre la apoptosis de células MCF-7 in vitro

Como se indicó anteriormente, el IGF-IR es capaz de conferir una protección contra la apoptosis cuando se sobreexpresa sobre la superficie de las células. Por otra parte, se ha demostrado, en estos ejemplos, que los anticuerpos 7C10 y 7H2HM fueron capaces de potenciar un compuesto activo en quimioterapia. A fin de ensayar la potencia de los anticuerpos 7C10 y 7H2HM para inducir la apoptosis, y para explicar en parte su potencial de sinergia con la quimioterapia, se realizaron experimentos en las células MCF-7 en presencia o en ausencia de doxorrubicina, un medicamento conocido por inducir la apoptosis de esta línea celular in vitro. En estos experimentos, las células MCF-7 se inoculan a 2.10^{4}/cm^{2} en cajas de Petri, y se cultivan durante 24 horas en RPMI sin rojo de fenol, complementado con 10% de suero de ternera fetal (SVF). Después, las células se lavan 2 veces con PBS, y se ponen de nuevo en cultivo en un medio con 0% de FCS. Se les permite un tiempo de adaptación de 10 minutos a 37ºC antes de la adición de los anticuerpos a 10 \mug/ml. Después de otros 10 minutos a 37ºC, se añade al medio de cultivo IGF-I recombinante (Sigma), hasta una concentración final de 50 ng/ml. Las células se dejan de nuevo a 37ºC durante 1 hora, para permitir la unión de los anticuerpos y del IGF-I. Finalmente, se añade la doxorrubicina (Sigma) al medio de cultivo a 2 \mug/ml, y las células se incuban durante 24 horas a 37ºC.

Los experimentos se llevaron a cabo igualmente con navelbina a una concentración de 10 \mug/ml.

El análisis de la viabilidad celular se realiza mediante análisis de citometría de flujo después de marcar con la anexina V-FITC (20 minutos, 4ºC) y DAPI (2 \mug/ml). El porcentaje de células muertas consideradas, es la población marcada con anexina +/DAPI +. Se usa el anticuerpo 5C2 como isotipo de control.

Los resultados representados en la figura 36, muestran que la doxorrubicina induce una apoptosis en 8% de las células MCF-7. Cuando las células se tratan conjuntamente con el anticuerpo 7C10 y la doxorubicina se observa un incremento significativo en la muerte celular. Se muestra el mismo efecto con el anticuerpo 7H2HM. El mismo tipo de resultados se observó cuando el anticuerpo se asocia con navelbina.

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Ejemplo 7 Estrategia de clonación de genes que codifican las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo monoclonal (AcM) 7C10

Se extrajo el ARN total de 10^{7} células de hibridomas que segregan el anticuerpo 7C10 usando el TRI REAGENT^{TM} (según las instrucciones dadas por el proveedor, SIGMA, T9424). Se sintetizó la primera hebra de ADNc usando el kit de "síntesis de la primera hebra de ADNc" de Amersham-Pharmacia (#27-9621-01, según las instrucciones dadas por el proveedor).

Para las dos cadenas, la reacción fue cebada con el oligonucleótido Not I-d(T)18, incluido en el equipo.

El híbrido de ADNc: ARNm obtenido de esta manera, se usó para la amplificación, mediante PCR, de los genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras del AcM 7C10. Los PCR se llevaron a cabo usando una combinación de oligonucleótidos específicos para las cadenas pesadas y ligeras (kappa) de inmunoglobulinas de ratón. Los cebadores que corresponden a los extremos 5' se hibridan en la región que corresponde a los péptidos de señal (Tabla 2 para cadenas pesadas, Tabla 3 para cadenas ligeras). Estos iniciadores se compilaron a partir de un gran número de secuencias de anticuerpos de ratón encontradas en los bancos de datos (Jones S. T. et al., Bio/Technology 9: 88-89, 1991). Los cebadores que corresponden a los extremos 3' se hibridan en las regiones constantes de las cadenas pesadas (dominio CH1 de la subclase de IgG1, no lejos de la unión V-C, cebador MHC-1, Tabla 4) y cadenas ligeras (dominio kappa no lejos de la unión V-C, cebador MKC, Tabla 4).

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TABLA 2 Cebadores oligonucleotídicos para la región 5' de los dominios variables de las cadenas pesadas de inmunoglobulina de ratón (MHV) ("MHV" para "variable pesada de ratón")

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TABLA 3 Cebadores oligonucleotídicos para la región 5' de los dominios variables de las cadenas kappa (ligeras) de inmunoglobulina de ratón (MKV) ("MKV" para "variable kappa de ratón")

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TABLA 4 Cebadores oligonucleotídicos para los extremos 3' de los genes de V_{H} y V_{L} de ratón

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Ejemplo 8

Secuencias de inmunoglobulinas clonadas a partir del hibridoma de ratón 7C10

Siguiendo la estrategia de amplificación descrita anteriormente, se clonaron productos de PCR que corresponden a las regiones variables de las cadenas pesada (VH) y ligera (VL), usando los "sistemas de vector pGME®-T Easy" (Promega). Para 7C10 VL, se obtuvieron productos de PCR con el cebador MKC en combinación con los cebadores MKV1 y MKV2. Para 7C10 VH, se obtuvieron productos de PCR con el cebador MHC-1 en asociación con los cebadores MHV8 y MHV12. Una secuenciación completa de los productos de PCR clonados en los vectores pGem-T easy, reveló dos secuencias diferentes para la cadena ligera, y una secuencia única para la cadena pesada.

a) Región variable aislada a partir del oligonucleótido MKV1

La secuencia de ADN obtenida es característica de una región variable de Ig funcional. Se presume por lo tanto que esta nueva secuencia es la que codifica 7C10 VL. Las secuencias de ADN (SEC ID nº 48 y 50) y de aminoácidos (SEC ID nº 49) del ADNc que codifica 7C10 VL, se representan en la figura 14.

b) Región variable aislada del oligonucleótido MKV2

El gen que codifica esta cadena ligera proviene de un transcrito de ARNm aberrante que está presente en todos los miembros de fusión estándares derivados del tumor MOPC-21 original del cual forma parte el mieloma de ratón Sp2/Oag14, el cual se usó para producir el hibridoma 7C10. Esta secuencia contiene una recombinación aberrante entre los genes V y J (supresión de cuatro bases nucleotídicas que conlleva a un cambio en el marco de lectura) y una mutación de la cisteína invariable en la posición 23 a tirosina. Estos cambios sugieren que esta cadena ligera sería no funcional, aunque, sin embargo, transcrita a ARNm. No se muestra la secuencia de ADN de esta pseudocadena ligera.

c) Región variable aislada de los oligonucleótidos MHV8 y MHV12

Las secuencias de ADN obtenidas con estos dos oligonucleótidos son idénticas, salvo la secuencia codificada por el oligonucleótido mismo. Esta secuencia es una nueva secuencia que codifica una cadena pesada funcional que se presume es la del anticuerpo monoclonal 7C10. Las secuencias de ADN (SEC ID nº 51 y 53) y de aminoácidos (SEC ID nº 52) del ADNc que codifica 7C10 VH, se representan en la figura 15.

Ejemplo 9 Construcción de genes quiméricos de ratón-ser humano

Se construyó el anticuerpo quimérico 7C10 de manera a obtener las regiones VL y VH de 7C10 de ratón unidas a las regiones constantes kappa y gamma-1 de humano, respectivamente. Se usaron oligonucleótidos para modificar los extremos 5' y 3' de las secuencias que flanquean al ADN que codifica 7C10 VL y VH, a fin de permitir su clonación en vectores para expresión en células de mamífero. Estos vectores usan el promotor fuerte HCMV para transcribir efectivamente las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo quimérico 7C10. Por otra parte, estos vectores contienen igualmente el origen de replicación de SV40, que permite una replicación eficaz del ADN y, como consecuencia, una expresión transitoria de las proteínas en células cos.

Ejemplo 10

Expresión y evaluación de la actividad de reconocimiento del receptor IGF-1 del anticuerpo quimérico 7C10

Los dos plásmidos que contienen al ADN que codifica el anticuerpo 7C10 quimérico fueron cotransfectados en células cos-7 (número de ATCC CRL-1651), para estudiar la expresión transitoria del anticuerpo recombinante. Después de incubar durante 72 horas, el medio de cultivo se recogió, se centrifugó para eliminar los restos celulares, y se analizó mediante la técnica de ELISA para la producción de IgG1 de humano (véase el ejemplo 16) y el reconocimiento del receptor para el IGF-1 (véase el ejemplo 17).

Los ensayos de ELISA para medir las concentraciones de IgG1/kappa de humano, mostraron que la expresión del anticuerpo quimérico 7C10 en las células cos7, estaba comprendida entre 300 y 500 ng/mm, lo que es comparable con los valores obtenidos con la mayoría de los anticuerpos.

Los ensayos de ELISA para el reconocimiento del receptor para IGF-1 muestran que el anticuerpo quimérico lo reconoce específicamente, y con una buena avidez relativa (véase las figuras 3A, 3B y 3C). Esto demuestra funcionalmente de que se ha identificado la buena VH y VL del anticuerpo 7C10. Además, esta forma quimérica de 7C10 parece ser una herramienta indispensable en la evaluación de la afinidad de las formas humanizadas.

Ejemplo 11

Elaboración de modelos moleculares de las regiones variables del anticuerpo 7C10 de ratón

A fin de facilitar y refinar el procedimiento de humanización mediante "injerto de CDR", se construyó un modelo molecular de las regiones VL y VH del anticuerpo 7C10 de ratón. Este modelo se basa en la estructura cristalográfica de la cadena pesada 1AY1 y de la cadena ligera 2 PCP.

Ejemplo 12

Procedimiento de humanización, mediante injerto de CDR, de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo 7C10 (7C10 VL) a) Comparación de la secuencia de aminoácidos de 7C10 VL con todas las secuencias de VL conocidas de ratón

Como etapa preliminar a la humanización mediante injerto de CDR, se comparó primero la secuencia de aminoácidos de 7010 VL con todas las secuencias de VL de ratón presentes en el banco de datos de Kabat (dirección Internet ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/database/kabat/fasta_format/, la última actualización de datos data de 1999). De esta manera, se ha identificado que 7C10 VL pertenece al subgrupo II de las cadenas ligeras kappa, como se define por Kabat et al. (en Sequences of proteins of immunological interest (5ª ed.), publicación de los NIH No. 91-3242, US Department of Health and Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, 1991). Se han identificado las regiones de VL de los anticuerpos monoclonales de ratón que tienen una identidad de secuencias que varía hasta 95% (DRB1-4.3 (SEC ID nº 55): 95%, y C94-5B11'CL (SEC ID nº 56): 95%, véase la figura 17). Para intentar identificar los restos ordinarios en la secuencia de 7C10 VL, se alineó la secuencia de aminoácidos de 7C10 VL (SEC ID nº 54) con la secuencia consenso del subgrupo II de las cadenas kappa de ratón (SEC ID nº 57), tal como se define por Kabat (véase la figura 17).

En la posición número 3 de Kabat, la valina (V) presente normalmente en el subgrupo II de las cadenas ligeras kappa según Kabat (71%), se sustituye por una leucina (L). Una leucina en esta posición no es raro, puesto que se encuentra, por ejemplo, en DRB1-4.3 y C94-5B11'CL. Según el modelo molecular, este resto no parece desempeñar una función particular. En consecuencia, no se contemplará la conservación de este resto en la forma humani-
zada.

En la posición número 7 de Kabat, la treonina (T) presente normalmente en el subgrupo II de las cadenas ligeras kappa según Kabat (66%), se sustituye por una isoleucina (I). Una isoleucina en esta posición es relativamente raro, puesto que sólo se encuentra 15 veces entre todas las secuencias de VL de ratón conocidas, y nunca entre las secuencias de VL de humano. El modelo molecular muestra que este resto (17) señala hacia la superficie de la molécula, pero no entra en contacto con las CDR (resto de una CDR más cercano sería la arginina en la posición número 42 de Kabat). Además, no parece muy probable que este resto 17 entre en contacto directamente con el antígeno. En consecuencia, no se contemplará la conservación de este resto en la forma humanizada, por lo menos al principio.

En la posición número 77 de Kabat, la arginina (R) presente normalmente en el subgrupo II de las cadenas ligeras kappa según Kabat (95,5%), se sustituye por una serina (S). Una serina en esta posición, no es raro.

b) Comparación de la secuencia de aminoácidos de 7C10 VL con todas las secuencias de VL de humano conocidas

A fin de identificar el mejor candidato de humano para el "injerto de CDR", se buscó la región de VL kappa de origen humano que tuviera la mayor homología posible con 7C10 VL. Para este fin, se comparó la secuencia de aminoácidos de 7C10 VL kappa de ratón con todas las secuencias de VL kappa de humano presentes en la base de datos de Kabat. El 7C10 VL de ratón tuvo la mayor homología de secuencias con las regiones de VL kappa de humano del subgrupo II, tal como se define por Kabat et al. (1991). Se identificaron regiones de VH de anticuerpos monoclonales de origen humano que tienen una identidad de secuencias que varía hasta 75,9% (GM607 (SEC ID nº 58), véase la figura 18), sobre el total de los 112 aminoácidos que forman la región variable. Se identificó también una línea germinal de origen humano, DPK15/A19 (SEC ID nº 59), que tiene una identidad de secuencias de 76% (véase la figura 18), GM607 (Klobeck et al., 1984). Por lo tanto, se seleccionó a GM607 como una secuencia de humano receptora de CDR (según la definición de Rabat) de 7C10 VL de ratón. Comparando las secuencias de GM607 con las de la secuencia consenso del subgrupo II de humano (SEC ID nº 60) (figura 18), no se pudo identificar ningún resto particular en las regiones de estructura (Rch), indicando así que GM607 era un buen candidato para injertos de
CDR.

c) Versiones humanizadas de 7C10 VL

La siguiente etapa en el procedimiento de humanización, consistió en unir las CDR de 7C10 VL de ratón a las regiones de estructura (Rch) de la cadena ligera de humano seleccionada, GM607 (Klobeck et al., 1984). En esta etapa del procedimiento, el modelo molecular de las regiones Fv de 7C10 de ratón es particularmente útil en la elección de los restos de ratón que serán conservados por ser capaces de desempeñar una función en el mantenimiento de la estructura tridimensional de la molécula (estructura canónica de las CDR, interfaz VH/VL, etc.), o en la unión al antígeno. En las Rch, se examinó escrupulosamente cada diferencia entre los aminoácidos de ratón (7C10 VL) y de humano (GM607) (véase la Tabla 5). Además, los restos particulares en la secuencia de 7C10 VL de ratón que se identificaron (véase el Ejemplo 12.a) se tomaron en cuenta, si era necesario.

En la primera versión humanizada mediante "injerto de CDR" de 7010 VL, humana 1, se realizó un solo cambio en las regiones de estructura (Rch) de GM607. Este cambio se refiere al resto 2 (nomenclatura de Kabat) situado en la Rch 1. Este resto entra en efecto en la composición de la estructura canónica de la CDR 1 de 7010 VL, y por lo tanto, podría ser crítico para mantener esta asa en su conformación adecuada. La valina presente en esta posición en la secuencia de 7C10 VL de ratón se conserva por lo tanto en esta misma posición en la forma humanizada (véase la Tabla 5 y la Figura 19 para la secuencia de aminoácidos (SEC ID nº 61), y la figura 20 para la secuencia de ADN (SEC ID nº 62 y 64) y la secuencia de aminoácidos que comprende el péptido de señal (SEC ID nº 63)).

En la segunda versión humanizada mediante "injerto de CDR" de 7C10 VL, humana 2, no se ha hecho ningún cambio en las Rch de la cadena ligera GM607 de humano. Todos los restos de las Rch son, por lo tanto, de origen humano, incluyendo el resto 2 que ha sido mutado, por lo tanto, para sustituir la valina presente en 7C10 VL de ratón por una isoleucina encontrada en esta misma posición en la cadena ligera GM607 de humano (véase la Tabla 5 y la figura 19 para secuencia de aminoácidos (SEC ID nº 65), y la figura 21 para la secuencia de ADN (SEC ID nº 66 y 68) y la secuencia de aminoácidos que comprende el péptido de señal (SEC ID nº 67)). Esta forma 2 de humano está, por lo tanto, totalmente humanizada (aparte, por supuesto, de las CDR en sí), puesto que todos los restos de las Rch son los de la cadena ligera de origen humano, GM607.

TABLA 5 Alineación de las secuencias de aminoácidos que llevan al diseño de las regiones de 7C10 V_{L} de humano remodeladas

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Ejemplo 13

Procedimiento de humanización, mediante injerto de CDR, de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo 7C10 (7C10 VH) a) Comparación de la secuencia de aminoácidos de 7C10 VH con todas las secuencias de VH de ratón conocidas

Como etapa preliminar a la humanización mediante injerto de CDR, se comparó primero la secuencia de aminoácidos de 7C10 VH con todas las secuencias de VH de ratón presentes en el banco de datos de Kabat (dirección Internet: ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/database/kabat/fasta_format/, la última actualización de datos data de 1999). De esta manera, se ha identificado que 7C10 VH pertenece al subgrupo I(A) de las cadenas pesadas tal como se define por Kabat et al. (1991). Se identificaron regiones de VH de anticuerpos monoclonales de ratón que tienen una identidad de secuencias que varía hasta 90,5% (AN013'CL (SEC ID nº 70), véase la figura 22). A fin de intentar identificar los restos fuera de lo común en la secuencia de 7C10 VH, se alineó la secuencia de aminoácidos de 7C10 VH (SEC ID nº 69) con la secuencia consenso (SEC ID nº 71) del subgrupo I(A) de las cadenas pesadas de ratón, tal como se define por Kabat (véase la figura 22).

El resto 17 (numeración de Kabat), Thr para la secuencia consenso del subgrupo I(A) y Ser en 7C10 VH, está localizado sobre la superficie de la molécula del lado del interfaz con la región constante. Este resto no parece ser importante.

El resto 27 (numeración de Kabat), Asp para la secuencia consenso del subgrupo I(A) y Tyr en 7C10 VH, es un resto canónico para la CDR 1. Tyr en esta posición no es rara, y es probablemente crítica para mantener la CDR 1 en su conformación adecuada.

El resto 84 (numeración de Kabat), Thr para la secuencia consenso del subgrupo I(A) y Asn en 7C10 VH. Se encontró Asn 93 veces en VH de ratón, y 3 veces en VH de humano. Según el modelo molecular, es un resto de superficie remoto del paratopo.

La numeración de los aminoácidos es la de Kabat et al. (1991). Los restos en las regiones de estructura (aparte de las CDR) que difieren entre 7C10 VH y el subgrupo I(A) de ratón de Kabat, está subrayados. AN03'CL representa la secuencia de la cadena pesada de un anticuerpo de ratón (el número de acceso en el banco de datos de Kabat, es P001289).

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b) Comparación de la secuencia de aminoácidos de 7C10 VH con todas las secuencias de VH de humano conocidas

A fin de identificar el mejor candidato de humano para el "injerto de CDR", se buscó la región de VH de origen humano que tuviera la mayor homología posible con 7C10 VH. Para este fin, se comparó la secuencia de aminoácidos de 7C10 VH de ratón con todas las secuencias de VH de humano presentes en la base de datos de Kabat. El 7C10 VH de ratón tenía la mayor homología de secuencias con las regiones de VH del subgrupo II de humano, tal como se define por Kabat et al. (1991). Se identificaron regiones de VH de anticuerpos monoclonales de origen humano que tenían una identidad de secuencias que varía hasta 67,3% (VH FUR1'CL de humano (SEC ID nº 73, véase la figura 23), sobre la totalidad de los 98 aminoácidos codificados por el gen variable (es decir, aparte de la CDR3 y la región J). Se identificó también una línea germinal de origen humano, 4.22 VH IV (Sanz et al., 1989), que tenía una identidad de secuencias de 68,4%, según los mismos criterios que para VH FUR1'CL (línea germinal de humano (SEC ID nº 74), véase la figura 23). La secuencia codificada por la línea germinal 4.22 VH IV se seleccionó como una secuencia de humano receptora de las CDR (según la definición de Kabat) de 7C10 VH de ratón, más que VH FUR1'CL, debido a que comparativamente, las secuencias de 4.22 VH IV y VH FUR1'CL con la de la secuencia consenso del subgrupo II de humano (sg II de humano de Kabat (SEC ID nº 72), véase la figura 23 y la tabla 6), no se pudo identificar ningún resto atípico en las regiones de estructura (Rch) para 4.22 VH IV, mientras que se identificó la presencia de dos restos atípicos (Gln y Arg en las posiciones 81 y 82A según la nomenclatura de Kabat, respectivamente) en la secuencia codificada por VH FUR1'CL.

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c) Versiones humanizadas de 7C10 VH

La siguiente etapa en el procedimiento de humanización, consistió en unir las CDR de 7C10 VH de ratón a las regiones de estructura (Rch) de la línea germinal 4.22 VH IV de humano (Sanz et al., 1989). En esta etapa del procedimiento, el modelo molecular de las regiones Fv de 7C10 de ratón, es particularmente útil en la elección de los restos de ratón que serán conservados por ser capaces de desempeñar una función en el mantenimiento de la estructura tridimensional de la molécula (estructura canónica de las CDR, interfaz VH/VL, etc.) o en la unión al antígeno (perteneciendo al paratopo). En las Rch, se examinó escrupulosamente cada diferencia entre las secuencias de aminoácidos de ratón (7C10 VH) y de humano (4.22 VH IV) (véase la Tabla 6). Además, los restos particulares en la secuencia de 7C10 VH de ratón que se habían identificado (véase el Ejemplo 8.a), se tomaron en cuenta, si fuese necesario.

En la primera versión de 7C10 VH humanizado mediante "injerto de CDR", humanizada 1, se hicieron cuatro cambios en las regiones de estructura (Rch) de 4.22 VH IV (véase la Tabla 6, la figura 24 para la secuencia de aminoácidos (SEC ID nº 75), y la figura 25 para la secuencia de ADN (SEC ID nº 76 y 78) y la secuencia de aminoácidos que comprende el péptido de señal (SEC ID nº 77)). Estos cuatro cambios se refieren:

\bullet: Al resto 30 (nomenclatura de Kabat) situado en Rch 1. Este resto entra efectivamente en la composición estructural de la CDR1 de 7C10 VH (como se define por Chothia et al., 1989) y, por lo tanto, podría ser crítico para mantener esta asa en su conformación correcta. La Thr presente en esta posición en la secuencia de 7C10 VH de ratón, se conserva por lo tanto en esta misma posición en la forma humani- zada.

\bullet: Al resto 48 (nomenclatura de Kabat) situado en Rch 2. Este resto está cerca de las CDR, aunque de acuerdo al modelo molecular, no está en contacto directo con estas últimas, y podría influir sobre su conformación final. La metionina presente en esta posición en la secuencia 7C10 VH de ratón se conserva por lo tanto en esta misma posición en la forma humanizada 1.

\bullet: Al resto 67 (nomenclatura de Kabat) situado en Rch 3. Este resto está cerca de las CDR, y según el modelo molecular, podría entrar en contacto con la lisina 60 (nomenclatura de Kabat) en la CDR 2. La isoleucina presente en esta posición en la secuencia 7C10 VH de ratón, se conserva por lo tanto en esta posición en la forma humanizada 1.

\bullet: Al resto (nomenclatura de Kabat) situado en Rch 3. Este resto forma parte de la estructura canónica de la CDR2 y, por lo tanto, debe ser crítico para mantener esta asa en su conformación correcta. La arginina presente en esta posición en la secuencia 7C10 VH de ratón se conserva por lo tanto en esta posición en la forma humanizada 1.

En la segunda versión de 7C10 VH humanizado mediante "injerto de CDR", humanizada 2, se realizaron dos cambios en las regiones de estructura (Rch) de 4.22 VH IV. Estos dos cambios se refieren a los restos 30 y 71 (nomenclatura de Kabat), ya descritos en la forma humanizada 1 (véase la Tabla 6, figura 24 para la secuencia de aminoácidos (SEC ID nº 79), y figura 26 para la secuencia de ADN (SEC ID nº 80 y 82) y la secuencia de aminoácidos que comprende el péptido de señal (SEC ID nº 81)).

En la tercera forma de 7C10 VH humanizado mediante "injerto de CDR", humanizada 3, no se realizó ningún cambio en las regiones de estructura (Rch) de 4.22 VH IV. Todos los restos de las Rch son, por lo tanto, de origen humano, incluyendo los restos 30, 48, 67 y 71 (nomenclatura de Kabat), que se han conservado (véase la Tabla 6, la figura 24 para la secuencia de aminoácidos (SEC ID nº 83) y la figura 27 para la secuencia de ADN (SEC ID nº 84 y 86), y la secuencia de aminoácidos que comprende el péptido de señal (SEC ID nº 85)). Esta forma humanizada 3 está, por lo tanto, totalmente humanizada (aparte, por supuesto, de las CDR mismas tal como se define por Kabat), puesto que todos los restos de las Rch, son los codificados por el gen de VH de la línea germinal 4.22 VH
IV.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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Ejemplo 14 Construcción de los genes que codifican las versiones humanizadas 1 de 7C10 VL y VH mediante ensamble de oligonucleótidos a) Principio

Se sintetizaron los genes (péptido líder + regiones variables VDJ para VH o VJ para VK) que codifican las regiones variables humanizadas, mediante ensamble de fase sólida sobre perlas magnéticas revestidas con estreptavidina. Los genes que codifican 7C10 VH humanizado (445 pares de bases) y 7C10 VL humanizado (433 pares de bases), se construyen fusionando dos fragmentos de ADN gracias a la presencia de un sitio de restricción Kpnl presente en las dos secuencias, y situado casi a la mitad del gen (a 200 y 245 nucleótidos con relación al extremo 5' del gen para VL y VH, respectivamente). Los dos fragmentos que se fusionan entre sí se ensamblan por sí mismos mediante una técnica de ensamble que consiste en usar oligonucleótidos fosforilados (de aproximadamente 30 a 35 elementos) hibridados dos por dos (un oligonucleótido sentido y el otro antisentido, con una homología de aproximadamente 50%), de manera que se solapen durante la elongación. Un primer oligonucleótido biotinilado en la posición 5' se fija a las perlas magnéticas, y entonces los pares de oligonucleótidos fosforilados se añaden uno por uno. El enlace fosfodiéster entre los oligonucleótidos fosforilados yuxtapuestos se realiza mediante la enzima ADN
ligasa T4.

Los genes así sintetizados de novo se pueden clonar directamente (mediante digestión con enzimas de restricción compatibles con el vector de expresión seleccionado), o se puede amplificar mediante PCR para obtener más material como preámbulo a la clonación direccional mediante digestión enzimática. La secuencia del gen construido de esta manera mediante ensamble de novo, se verifica entonces mediante secuenciación automática del ADN.

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b) Protocolo experimental de la técnica de ensamble de novo

Se ordenaron oligonucleótidos fosforilados en la posición 5' o biotinilados en la posición 5', cuya concentración se ajustó a 100 \muM en MWG Biotech (véase las secuencias de los oligonucleótidos usados en la Tabla 7 para la construcción de 7010 VL humanizado, y la Tabla 8 para la construcción de 7C10 VH humanizado). Los oligonucleótidos fueron hibridados en pares (una mezcla equimolar, 500 pmoles, de un oligonucleótido sentido y de un oligonucleótido antisentido en el tampón de ADN ligasa T4, se calienta a 95ºC durante 5 minutos, y después se deja enfriar sobre la mesa de trabajo hasta temperatura ambiente), según un esquema descrito en la Tabla 9.

El primer oligonucleótido biotinilado se fija sobre perlas magnéticas revestidas con estreptavidina (estreptavidina Dynabeads M-280, producto Nº 112-05 de Dynal). Para eso, se añaden 500 pmoles del oligonucleótido biotinilado en una disolución de 15 mM de NaCl a 50 mM a 50 \mul de perlas decantadas (se usa un portaimán) lavadas previamente dos veces con 100 \muI de tampón TE 1X (tampón de 100X de Tris-EDTA: Tris-HCl a 1M, pH 8, 0,1M de EDTA, Sigma T-9285). Después de incubar a 37ºC durante 15 minutos, las perlas se lavan dos veces con tampón de lavado (10 mM de Tris-HCl, pH 7,6, 10 mM de EDTA y 50 mM de NaCl), y los pares de oligonucleótidos hibridados se añaden entonces uno por uno. En cada adición nueva de un par de oligonucleótidos, la mezcla se calienta hasta 95ºC durante 5 minutos, y se deja entonces enfriando sobre la mesa de trabajo hasta temperatura ambiente. Una vez que se alcanza la temperatura ambiente, se añaden 2 \mul de 10 U/\mul de ADN ligasa T4 (Biolabs), y la mezcla se incuba durante 20 minutos a 37ºC. Las perlas se lavan entonces (tampón de lavado), y los siguientes pares de oligonucleótidos se añaden entonces en sucesión.

El último oligonucleótido no apareado (antisentido) se ensambla de la siguiente manera. Se añaden 5 \mul de oligonucleótido (500 pmoles) y 43 \mul de tampón de ADN ligasa T4 a las perlas decantadas, y entonces la mezcla se calienta a 95ºC durante 5 minutos, y se deja enfriar sobre la mesa de trabajo hasta temperatura ambiente. Una vez que se alcanza la temperatura ambiente, se añaden 2 \mul de ADN ligasa T4, y la mezcla se incuba a 37ºC durante 20 minutos. Después, las perlas se lavan dos veces con el tampón de lavado, y después dos veces con el tampón
TE 1X.

Las perlas se pueden conservar entonces a 4ºC antes de proceder a la clonación y secuenciación del gen ensamblado de novo.

TABLA 7 Secuencia de ADN de oligonucleótidos usados para la construcción de 7C10 VL 1 humanizado mediante ensamble de novo

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TABLA 8 Secuencia de ADN de oligonucleótidos usados para la construcción de 7C10 VH 1 humanizado mediante ensamble de novo

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TABLA 9 Protocolo de apareamiento de oligonucleótidos para el ensamble de novo de genes que codifican las formas humanizadas de 7C10 VH y VL

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Ejemplo 15 Construcción de los genes que codifican las versiones humanizadas 2 de 7C10 VL y 7C10 VH y 3 de 7C10 VH mediante mutagénesis dirigida

Se obtuvo la versión humanizada 2 de 7C10 VH mediante mutagénesis dirigida de los restos 48 y 67 (según la nomenclatura de Kabat) de la versión 1. Esta mutagénesis dirigida se llevó a cabo con la ayuda del sistema de mutagénesis dirigida a sitio QuickChangeTM de Stratagene (kit #200518) según el protocolo descrito por el fabricante. La construcción se lleva a cabo en dos etapas, en una primera etapa el resto 48 en la versión 1 fue mutado con la ayuda del par de cebadores 7C10humanizado1QCM48 sentido y antisentido (véase la Tabla 10), y en una segunda etapa esta versión fue mutada en el resto 48 que fue por sí mismo mutado en el resto 67 con la ayuda del par de cebadores 7C10humanizado1QC167 sentido y antisentido (véase la Tabla 10).

Se obtuvo la versión humanizada 3 de 7C10 VH mediante mutagénesis dirigida de los restos 30 y 71 (según la nomenclatura de Kabat) de la versión 2, usando igualmente el sistema QuickChangeTM. Esta construcción se lleva a cabo en dos etapas. En un primer tiempo, el resto 30 en la versión 2 fue mutado con la ayuda de los cebadores 7C10humanizadoQCT30 sentido y antisentido (véase la Tabla 10). En un segundo tiempo, esta versión mutada en el resto 30 fue mutada por sí misma en el resto 71 usando el par de cebadores 7C10humanizado1V67QCR71 sentido y antisentido (véase la Tabla 10).

Se obtuvo la versión humanizada 2 de 7C10 VL mediante mutagénesis dirigida del resto 2 (según la nomenclatura de Kabat) de la versión 1, usando el sistema QuickChangeTM. El resto 2 en la versión 1 fue mutado usando el par de cebadores 7C10humanizado1QCV2 sentido y antisentido (véase la Tabla 10).

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Ejemplo 16 Transfección de las células cos7 mediante electroporación

Se ensayaron los vectores de expresión de mamífero que contienen las versiones quimérica o humanizada de las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo 7C10 en células cos7 para la expresión transitoria de los anticuerpos recombinantes 7C10. Se introdujo el ADN en las células cos mediante electroporación con la ayuda de un instrumento de BioRad (Gene Pulsar). Se añade el ADN (10 \mug de cada vector) a alícuotas de 0,8 ml de células cos a una concentración de 1 x 10^{7} células por ml en un tampón de PBS (sin Ca++ y Mg++). Se suministró una pulsación de 1900 voltios y una capacidad de 25 \muF. Se añaden entonces las células cos transfectadas a 8 ml de medio DMEM que contiene 5% de suero de ternera, y se incuban a 37ºC durante 72 horas. Entonces, el sobrenadante se colecta, se centrifuga para eliminar los restos celulares, y se ensaya mediante ELISA para la medir su concentración de anticuerpo recombinante 7C10 de tipo kappa IgG1/humano.

Ejemplo 17 Método de ELISA para medir las concentraciones de anticuerpos recombinantes kappa de IgG1/humano presentes en el sobrenadante de los transfectantes de células cos

Los sobrenadantes producidos mediante expresión transitoria en células cos7, se ensayaron para la presencia de anticuerpo 7C10 de tipo kappa de IgG1/humano. Para la detección de la inmunoglobulina kappa de IgG1/humano, se revistieron placas de ELISA de 96 pocillos (Maxisorb, Nunc) con un anticuerpo policlonal de IgG anti-humano de cabra (específico para el fragmento Fc gamma, Jackson Immuno-Research Laboratories Inc., #109-005-098). Los sobrenadantes de células cos se diluyeron en serie, y se añadieron a los pocillos revestidos. Después de incubar durante 1 hora a 37ºC y lavar, se añadió un anticuerpo policlonal de cadena ligera kappa anti-humano de cabra conjugado con peroxidasa (HRP, Sigma, A-7164). Después de incubar durante 45 minutos a 37ºC y lavar, se añadió el sustrato de TMB (KPL #50-76-04). Después de incubar durante 10 minutos, la reacción se detuvo mediante adición de 1M de ácido sulfúrico, y se leyó la densidad óptica a 450 nm. Se usó una inmunoglobulina kappa de IgG1/humano purificada de humano (Sigma, 1-3889) de concentración conocida, como anticuerpo de referencia estándar.

Ejemplo 18 Método de ELISA para determinar la actividad de reconocimiento de anticuerpos recombinantes 7C10 de tipo IgG1/ kappa de humano sobre el receptor para IGF-1 (IGF-IR)

Se ensayaron los sobrenadantes de cultivo cos7 para determinar su capacidad para reconocer el IGF-1 R mediante un método de ELISA. Se revistieron placas de ELISA de 96 pocillos (Dynex Immulon 2HB) con 100 \mul por pocillo de una disolución de PBS que contenía 0,31 ng/\mul de IGF-1R (receptor soluble del factor de crecimiento I tipo insulina de humano, R&D Systems, #391-GR), mediante incubación durante una noche a 4ºC. Después de lavar con PBS que contenía 0,05% de Tween 20, las placas se saturaron mediante la adición de una disolución de PBS que contenía 0,5% de gelatina, y se incubaron a 37ºC durante 1 hora. Después de tres lavados con PBS, se añadieron a las placas las muestras de sobrenadantes cos que se van a ensayar, diluidas previamente en serie en PBS que contenía 0,1% de gelatina y 0,05% de Tween 20. Después de incubar a 37ºC durante 1 hora, seguido de tres lavados (PBS que contenía 0,05% de Tween 20), se añadió un anticuerpo IgG anti-humano (específico para el fragmento Fc) conjugado con peroxidasa (HRP, Jackson Immuno-Research Laboratories Inc., #109-035-098) (dilución a 1/5000 en PBS que contenía 0,1% de gelatina y 0,05% de Tween 20). Después de incubar durante 45 minutos a 37ºC y lavar tres veces (PBS que contenía 0,05% de Tween 20), se añadió el sustrato de TMB (KPL #50-76-04). Después de incubar durante 10 minutos, la reacción se detuvo mediante adición de 1M de ácido sulfúrico, y se leyó la densidad óptica a 450 nm.

Ejemplo 19 Determinación de la actividad de reconocimiento del IGF1-R para las diferentes versiones del anticuerpo 7C10 humanizado mediante "injerto de CDR"

En un primer tiempo, se comparó la actividad de reconocimiento de las formas humanizadas 1 de las cadenas pesadas y ligeras de 7C10 para el receptor IGF-1, con relación a la forma quimérica. La figura 28 muestra los resultados de un ensayo de ELISA de reconocimiento del IGF-1R (véase el Ejemplo 18) a partir del sobrenadantes de las células cos7, cuya concentración de kappa de IgG1/humano se había determinado previamente mediante ELISA (véase el Ejemplo 17). Las curvas de calibración de los cuatro anticuerpos recombinantes ensayados se solapan perfectamente, indicando que sus afinidades relativas para el IGF-IR son muy similares. Se concluye por lo tanto que la forma humanizada 1 de 7C10, compuesta de la cadena ligera humanizada 1 (un solo resto de ratón presente en las regiones de estructura) en combinación con la cadena pesada humanizada 1 (4 restos de ratón presentes en las regiones de estructura), reconoce específicamente al receptor IGF-1, y tiene una afinidad muy similar a la del anticuerpo quimérico (regiones variables de ratón).

En un segundo tiempo, se observaron la influencia del resto 2 (según la nomenclatura de Kabat) de la cadena ligera humanizada de 7C10 (versión humanizada 1 contra humanizada 2, véase la figura 19), sobre el reconocimiento del IGF-IR. La figura 29 muestra los resultados del ensayo de ELISA para reconocimiento del IGF-IR (véase el Ejemplo 18) a partir de sobrenadantes de células cos7 cuya concentración de kappa de IgG1/humano se había determinado previamente mediante ELISA (véase el Ejemplo 17). Las dos versiones humanizadas 1 y 2 de la cadena ligera, se habían combinado exitosamente con 7C10 VH 1 humanizado. Las curvas de titulación de las dos combinaciones se superponen, indicando que la mutación del resto 2 de la cadena ligera, que ha sido cambiada de una valina en la versión humanizada 1 para una isoleucina en la forma humanizada 2, aparentemente, no tiene ninguna influencia sobre la afinidad de reconocimiento del receptor IGF1. La forma humanizada 2 de la cadena ligera de 7C10 constituye de esta manera una versión en la que no se ha conservado ningún resto de ratón (aparte de las CDR). Esta versión, totalmente humanizada, representa la versión preferida de 7C10 VL.

Se ensayó la versión totalmente humanizada de la cadena ligera de 7C10 (versión humanizada 2, véase anteriormente), en combinación con las tres versiones humanizadas de la cadena pesada de 7C10. La figura 30 muestra los resultados del ensayo de ELISA para reconocimiento del IGF-1R de sobrenadantes de células cos7, cuya concentración de kappa de IgG1/humano se había determinado previamente mediante ELISA (véase el Ejemplo 17). Las curvas de titulación son muy similares, y se solapan prácticamente con la curva de referencia que corresponde al anticuerpo quimérico, indicando que las tres versiones humanizadas 1, 2 y 3 de 7C10 VH dan una misma afinidad relativa para el IGF-1R cuando se combinan con 7C10 VL 2 humanizado. Otros ensayos de ELISA realizados en paralelo (resultados no mostrados), han revelado sin embargo que una mutación puntual del resto 71 (nomenclatura de Kabat) de una arginina (ratón) a una valina (humano), llevaba a una pequeña pérdida de afinidad del anticuerpo correspondiente, por el IGF-1 R. De esta manera, es razonable pensar que el 7C10 VH 2 humanizado tiene la misma afinidad relativa por el IGF-1R que el 7C10 VH 1 humanizado. Esta forma humanizada 2 se preferirá por lo tanto con relación a la forma 1, puesto que tiene sólo dos aminoácidos de ratón (restos 30 y 71, véase la figura 24). La forma humanizada 3, que no tiene más restos de ratón (aparte de las CDR), se preferirá también, puesto que sólo parece incluir una pérdida mínima de afinidad.

En conclusión, aparece que se prefieren particularmente dos formas humanizadas del anticuerpo 7C10 según la presente invención. Una forma constituida por la combinación de 7C10 VH 2 humanizado (2 restos conservados de ratón) con 7C10 VL 2 humanizado (sin resto conservado de ratón), y otra forma constituida por la combinación de 7C10 VH 3 humanizado (sin resto conservado de ratón) con 7C10 VL 2 humanizado (sin resto conservado de ratón). Esta última forma constituye la última versión humanizada, puesto que ningún resto de ratón está presente al mismo tiempo en las cadenas pesadas y ligeras.

Ejemplo 20 Expresión del EGFR y del IGF-IR sobre la superficie de células A549

Se estudió la sinergia de acción obtenida mediante la coadministración de dos ACM dirigidos respectivamente contra el IGF-IR y el EGFR en ratones atímicos que poseen un tumor pulmonar de células no pequeñas establecido mediante inyección subcutánea (s.c.) de células A549 (línea celular de carcinoma pulmonar).

En un primer tiempo, y a fin de asegurar la presencia de los dos receptores IGF-IR y EGFR sobre la superficie de la célula A549 antes de inyectar ésta en el ratón, se llevó a cabo un marcado para lectura de FACS de estas células con, respectivamente, el ACM anti-IGF-IR 7C10 murino (figura 37B) y el ACM anti-EGFR 225 murino (figura 37D). Para eso, las células se saturaron durante 30 minutos a 4ºC con una disolución de 10% de PBS y SVF (suero de ternera fetal), se lavaron, y después se incubaron durante 30 minutos a 4ºC con el ACM de interés. Después de otros 3 nuevos lavados, se añadió el anticuerpo anti-especie secundario acoplado a FITC (isotiocianato de fluoresceína). Después de incubar durante 30 minutos, se realiza la lectura en el FACS (distribuidor de células activado por fluorescencia) a 520 nm (excitación a 488 nm).

Los resultados presentados en las figuras 37A a 37D, muestran que las células A549 tienen sobre su superficie un número comparable de receptores para EGF e IGF1. En los dos casos, la población es homogénea con relación a la distribución de cada uno de los receptores. La especificidad del marcado se confirma mediante el uso de un isotipo de control (figura 37C). Estos resultados validan el uso de las células A549 como un modelo para el estudio de una sinergia de acción sobre dos receptores IGF-IR y EGFR, y para el estudio de una colaboración de estos dos receptores.

Ejemplo 21 Sinergia de acción de un ACM anti-IGF-IR y de un ACM anti-EGFR coadministrados in vivo, en el ratón atímico en el contexto de un tratamiento antitumoral

Para este estudio, se injertan s.c. 5.10^{6} células A549 en ratones atímicos. Cinco días después del injerto de las células, se miden los tumores, y se constituye un lote homogéneo de ratones en términos de volumen del tumor. A partir de este lote, se generan al azar grupos de 6 ratones. Estos ratones se trataran intraperitonealmente (i.p.), dos veces por semana con cada uno de los ACM 7C10 y 225 individualmente con una dosis de 250 \mug/ratón, o con los dos ACM en coadministración. El ACM 9G4 se administra como un isotipo de control del experimento.

Los resultados presentados en la figura 38 muestran que cada uno de los anticuerpos 7C10 y 225 administrados solos, es capaz de inducir una disminución significativa en el crecimiento del tumor in vivo. Se puede observar que los dos ACM ensayados tienen una actividad comparable sobre el crecimiento del tumor A549. De manera sorprendente con relación a la bibliografía, se observa una sinergia significativa durante la administración simultánea de los dos ACM (p < ó = a 0,01 en cada uno de los tiempos de la cinética en un ensayo t), sugiriendo que existe una colaboración de los dos receptores para el crecimiento óptimo de un tumor in vivo y que, contrariamente a los datos en la bibliografía, el bloqueo de uno de los dos ejes no basta para inhibir totalmente el crecimiento mediado por el segundo.

Ejemplo 22 Estudio de la actividad antitumoral de los anticuerpos murinos 7C10 y 225 coadministrados en ratones implantados ortotópicamente con células A549

El uso de modelos ortótopicos para la evaluación de la actividad antitumoral presenta un interés particular con relación al procedimiento de diseminación metastásica de un tumor. A fin de evaluar la actividad antitumoral de una mezcla de anticuerpos dirigidos respectivamente contra el IGF-IR y el EGFR, se implantaron 10^{6} células A549 (cáncer pulmonar de células no pequeñas) en la cavidad intrapleural de ratones atímicos. Se observará que la consecuencia de este tipo de implantación del tumor es una diseminación metastásica similar a la observada en el ser humano, y lleva a la muerte de los animales. La figura 39 muestra que la administración de los anticuerpos 225 y 7C10 solos, permite observar una ganancia comparable y significativa en la supervivencia. De manera sorprendente, la coadministración de estos dos anticuerpos aumenta en una manera considerable la supervivencia de los animales, sugiriendo que este tratamiento podría tener un impacto sobre la diseminación metastásica de las células tumorales.

Ejemplo 23 7C10 y 7H2HM inhiben la fosforilación de la tirosina de la cadena \beta del IGF-IR y del IRS-I

Se cultivan células MCF7 durante 24 horas a 5.10^{4} células/cm^{2} (placas de 75 cm^{2}, COSTAR) en 20 ml de RPMI sin rojo de fenol, adicionado con 5 mM de glutamina, penicilina/estreptomicina (respectivamente, 100 U/100 \mug/ml) y 10% de suero de ternera fetal. Después de tres lavados en PBS, las células se incubaron durante 12 horas en medio (RPMI) sin rojo de fenol, desprovisto de suero de ternera fetal, y se añadió 5 mM de glutamina, penicilina/estreptomicina, 0,5 \mug/ml de albúmina de suero bovino (Sigma A-8022) y 5 \mug/ml de transferrina (Sigma T8158).

Para la activación, las células se incubaron primero a 37ºC durante 2 minutos con anticuerpos de bloqueo (10 \mug/ml), y después se añadió IGF-I (Sigma 13769, 50 ng/ml) por otros dos minutos más. La reacción se detuvo mediante la aspiración del medio de incubación, y las placas se colocaron sobre hielo. Las células se solubilizaron mediante adición de 0,5 ml de tampón de lisis (50 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM de NaCl, 1% de Nonidet P40, 0,5% de desoxicolato de sodio), se añadieron inhibidores de proteasa (1 tableta por 50 ml, Boehringer, Ref.: 1697 498) e inhibidores de fosfatasa (Calbiochem., Ref.: 524625 (1/100)). Las células se raederaron, y la suspensión se recuperó y se colocó sobre un agitador a 4ºC durante 1,5 horas. Las disoluciones se centrifugaron a 12.000 rpm durante diez minutos (4ºC), y las concentraciones de proteína de los sobrenadantes se cuantificaron mediante BCA.

Se mezclaron 500 \mug de proteínas del lisado celular con el anti-IGF-IR (Santa Cruz, Ref.: sc-713) para inmunoprecipitación, y se incubaron sobre el agitador a 4ºC durante 1,5 horas. Los inmunoprecipitados se recuperaron mediante la adición de proteína A-agarosa (Boehringer, Ref.: 1 134 515), y se incubaron durante la noche sobre el agitador a 4ºC. Para la inmunoprecipitación de IRS-1, se usaron anticuerpos anti-IRS-1 acoplados con perlas de agarosa (Santa Cruz, Ref.: 559Ac). Las perlas de agarosa se lavaron dos veces con 1 ml de tampón de lisis, dos veces con un tampón de lavado 1 (50 mM de Tris-HCl, pH 7,5; 500 mM de NaCl; 0,1% de Nonidet P40; 0,05% de desoxicolato de sodio (Boehringer, Ref.:1 332 597)), adicionado de inhibidores de proteasa e inhibidores de fosfatasa, y una vez con un tampón de lavado 2 (50 mM de Tris-HCl; 0,1% de Nonidet P40; 0,05% de desoxicolato de sodio (Boehringer, Ref.: 1 332 597), y se añadieron inhibidores de proteasa e inhibidores de fosfatasa 1/100). Los inmunoprecipitados se resuspendieron en un tampón de Laemmli, y se calentaron a 100ºC durante 5 minutos. Los sobrenadantes se analizaron mediante electroforesis sobre gel de poliacrilamida-SDS (8% de Novex EC6015). Las proteínas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa, seguido de una immunotransferencia con anticuerpos anti-fosfotirosina conjugados con HRP (Upstate Biotechnology 4G10) o anti-cadena beta del IGF-IR o anti-IRS-1 (Santa Cruz, Ref.: sc 8038), seguido de un anticuerpo anti-conejo conjugado con HRP. Las impresiones se revelaron mediante quimioluminiscencia (Amersham, RPN 2209), seguida de una autorradiografía sobre películas Kodak X-mat AR.

La figura 40A representa células MCF7 no estimuladas (0) o estimuladas con IGF-1 (50 ng/ml) solo (0+IGF-1), o combinadas con anticuerpos anti-IGF-IR monoclonales o humanizados (10 \mug/ml) 7C10, 1H7, 7H2HM. Los anticuerpos 9G4 o hIgG1 son inmunoglobulinas murinas o de humano de isotipo IgG1 usados como control negativo del experimento. Las cadenas beta del IGF-IR fueron inmunoprecipitadas y transferidas con anticuerpos anti-tirosina fosforilada. Los resultados obtenidos muestran que los anticuerpos 7C10, 1H7 y 7H2HM anti-IGF-IR monoclonales o humanizados, inhiben la fosforilación de la tirosina de la cadena beta del IGF-IR.

La figura 40B representa células MCF7 no estimuladas (0) o estimuladas con IGF-1 (50 ng/ml) solo (0+IGF-1), o combinadas con anticuerpos anti-IGF-IR monoclonales o humanizados (10 \mug/ml) 7C10, 1H7, 7H2HM. Como se describió anteriormente, los anticuerpos 9G4 o hIgG1 son inmunoglobulinas murinas o de humano de isotipo IgG1 usadas como control negativo del experimento. El IRS-1 fue inmunoprecipitado y transferido con anticuerpos anti-tirosina fosforilada. Los resultados obtenidos muestran que los anticuerpos monoclonales 7C10, 7H2HM y 1H7 inhiben la fosforilación de la tirosina del IRS-1.

Ejemplo 24 7C10 y 7H2HM inducen la incorporación del IGF-IR

Se suspendieron células MCF7 y A549 a 1.10^{7} células/ml en PBS con 10% de suero de ternera fetal (tampón FACS). Se incubaron 1.10^{6} células durante 30 minutos a 37ºC con 10 \mug/ml de anticuerpos monoclonales (7C10, 7G3, 9G4) o 20 \mug/ml para 7H2HM. Después del lavado, las células se marcaron a 4ºC durante 30 minutos con un anti-IGF-IR biotinilado (anticuerpo monoclonal 12B1), y se incubaron finalmente a 4ºC durante 30 minutos con un conjugado de estreptavidina 488 alexa Fluor®. Las células se analizaron usando FACScan (Becton-Dickinson, Enembogegem, Bélgica) con el programa Cellquest después de la eliminación de los restos.

La figura 41 muestra las células A549 sin coloración (primer valor máximo), las células A549 incubadas con 7C10 o 7H2HM (segundo valor máximo) y las células A549 incubadas con una IgG1 irrelevante de ratón o rata (tercer valor máximo). Se observa una disminución doble de la expresión de superficie del IGF-IR por las células, cuando las células han sido incubadas previamente con 7C10 o 7H2HM.

Ejemplo 25 7C10 y 7H2HM inducen la degradación del IGF-IR

Se cultivaron células MCF-7 durante 24 horas a 10.10^{4} células/cm^{2} (75 cm^{2}, Costar) en 15 ml de medio completo. Después, los cultivos se lavaron tres veces con PBS y se incubaron durante 12 horas con un medio que carece de suero. Después, las células se incubaron con cicloheximida a 25 \mug/ml sola, o con 10 \mug/ml de anticuerpo monoclonal 7C10, 9G4, 7G3 o del IGF-I (50 ng/ml). En ciertos experimentos, antes de la incubación con los anticuerpos monoclonales, las células se trataron durante 1 hora a 37ºC con MG-132 (10 \muM, Calbiochem 474791) para inhibir las actividades de proteasoma. Después de la incubación, las células se lavaron y se solubilizaron mediante la adición de un tampón de lisis. Se analizaron 20 \mug de proteínas mediante electroforesis sobre 8% de gel de poliacrilamida de SDS, y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa, seguido de un immunotransferencia anti-cadena beta del IGF-IR, tal como se describió anteriormente.

El análisis mediante transferencia Western (figura 42A) de la integridad del IGF-IR, muestra que 7C10 y 7H2HM inducen la degradación del receptor, mientras que el ligando natural no causa ninguna degradación de este último. No se observa ninguna degradación del receptor con el 9G4, un anticuerpo irrelevante usado como isotipo de control. La figura 42B demuestra, que la degradación se inhibe mediante un inhibidor de proteasoma MG132 (período de incubación de 2 horas).

Se obtuvieron resultados comparables con el anticuerpo humanizado 7H2HM (figura 42C).

<110> Pierre Fabre Médicament

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<120> Nuevos anticuerpos anti-IGF-IR y sus aplicaciones

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<130> D19 919 - PCT

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<150> FR 02/00 653

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<151> 18-01-2002

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<150> FR 02/00 654

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<151> 18-01-2002

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<150> FR 02/05 753

<151 > 07-05-2002

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<160> 156

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 48

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<212> ADN

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<213> Mus musculus

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(48)

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<400> 1

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100

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<210> 2

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<211> 16

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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<400> 2

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\sa{Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Gln}

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<210> 3

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<211> 21

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<212> ADN

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<213> Mus musculus

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(21)

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<400> 3

101

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<210> 4

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<211> 7

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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<400> 4

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\sa{Lys Val Ser Asn Arg Leu Tyr}

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<210> 5

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<211> 27

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<212> ADN

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<213> Mus musculus

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(27)

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<400> 5

102

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<210> 6

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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<400> 6

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\sa{Phe Gln Gly Ser His Val Pro Trp Thr}

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<210> 7

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<211> 18

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<212> ADN

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<213> Mus musculus

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1).. (18)

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<400> 7

103

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<210> 8

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<211> 6

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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<400> 8

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\sa{Gly Gly Tyr Leu Trp Asn}

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<210> 9

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<211> 48

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<212> ADN

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<213> Mus musculus

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(48)

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<400> 9

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104

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<210> 10

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<211> 16

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<212> PRT

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<213> Mus musculus

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<400> 10

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\sa{Tyr Ile Ser Tyr Asp Gly Thr Asn Asn Tyr Lys Pro Ser Leu Lys Asp}

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<210> 11

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<211> 24

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<212> ADN

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<213> Mus musculus

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(24)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

105

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Gly Arg Val Phe Phe Asp Tyr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atgaaatgca gctgggtcat sttctt

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atgggatgga gctrtatcat sytctt

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atgaagwtgt ggttaaactg ggtttt

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atgractttg ggytcagctt grt

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atggactcca ggctcaattt agtttt

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atggctgtcy trgsgctrct cttctg

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atggratgga gckggrtctt tmtctt

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atgagagtgc tgattctttt gtg

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atggmttggg tgtggamctt gctatt

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atgggcagac ttacattctc attcct

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atggattttg ggctgatttt ttttattg

\hfill

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atgatggtgt taagtcttct gtacct

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atgaagttgc ctgttaggct gttggtgct

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atggagwcag acacactcct gytatgggt

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atgagtgtgc tcactcaggt cct

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atgaggrccc ctgctcagwt tyttgg

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atggatttwc aggtgcagat twtcagctt

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atggatttwc argtgcagat twtcagctt

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atgaggtkcy ytgytsagyt yctgrg

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atgggcwtca agatggagtc aca

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atgtggggay ctktttycmm tttttcaat

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atggtrtccw casctcagtt cctt

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atgtatatat gtttgttgtc tatttc

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atggaagccc cagctcagct tctctt

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atgragtywc agacccaggt cttyrt

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atggagacac attctcaggt ctttgt

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atggattcac aggcccaggt tcttat

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

actggatggt gggaagatgg

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(42)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

106

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccatcttccc accatccagt

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccagtggata gacagatg

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(33)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

107

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cccccatctg tctatccact g

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 438

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (28)..(393)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\vskip1.000000\baselineskip

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 122

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\vskip1.000000\baselineskip

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 438

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\vskip1.000000\baselineskip

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 438

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (25)..(405)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

\vskip1.000000\baselineskip

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 127

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

\vskip1.000000\baselineskip

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 438

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

\vskip1.000000\baselineskip

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 112

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

24

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 112

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

25

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 112

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

\vskip1.000000\baselineskip

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 112

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

\vskip1.000000\baselineskip

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 112

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 58

\vskip1.000000\baselineskip

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 100

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 59

\vskip1.000000\baselineskip

29

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 112

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (35)..(36)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> XAA corresponde a cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (39)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> XAA corresponde a cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (99)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> XAA corresponde a cualquier aminoácido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 60

30

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 112

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 61

31

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 433

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (22)..(414)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 62

\vskip1.000000\baselineskip

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 131

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 63

\vskip1.000000\baselineskip

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 433

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 64

\vskip1.000000\baselineskip

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 112

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 65

\vskip1.000000\baselineskip

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 433

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (22)..(414)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 66

\vskip1.000000\baselineskip

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 67

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 131

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 67

\vskip1.000000\baselineskip

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 68

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 433

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 68

\vskip1.000000\baselineskip

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 117

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 69

\vskip1.000000\baselineskip

39

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 70

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 118

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 70

40

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 71

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 118

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Mus musculus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 71

41

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 72

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 117

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 72

42

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 73

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 123

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 73

\vskip1.000000\baselineskip

43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 74

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 98

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 74

\vskip1.000000\baselineskip

44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 75

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 117

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 75

\vskip1.000000\baselineskip

45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 76

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 445

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (22)..(926)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 76

\vskip1.000000\baselineskip

46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 77

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 135

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 77

\vskip1.000000\baselineskip

47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 78

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 445

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 78

\vskip1.000000\baselineskip

48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 79

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 117

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 79

\vskip1.000000\baselineskip

49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 80

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 445

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (22)..(426)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 80

\vskip1.000000\baselineskip

50

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 81

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 135

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

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<400> 81

\vskip1.000000\baselineskip

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 82

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 445

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 82

\vskip1.000000\baselineskip

52

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 83

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 117

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 83

\vskip1.000000\baselineskip

53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 84

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 445

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (22)..(426)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 84

\vskip1.000000\baselineskip

54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 85

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 135

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 85

55

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 86

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 445

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 86

56

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 87

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 87

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtcagaacgc gtgccgcc

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 88

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 88

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

accatgaagt tgcctgttag gctgttggtg ct

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 89

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 89

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatgttctgg tttcctgctt ccagcagtga tg

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 90

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 90

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttgtgatgac tcagtctcca ctctccctgc cc

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 91

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 91

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtcacccctg gagagccggc ctccatctcc tg

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 92

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

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<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 92

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

caggtctagt cagaccatta tacatagtaa tg

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 93

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 93

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaaacaccta tttggaatgg tacctgcaga

\hfill

30

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 94

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido

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<400> 94

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggcaacttca tggtggcggc acgcgttctg ac

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 95

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido

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<400> 95

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaaaccagaa catcagcacc aacagcctaa ca

\hfill

32

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 96

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 96

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctgagtcatc acaacatcac tgctggaagc ag

\hfill

32

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\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido

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<400> 97

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tctccagggg tgacgggcag ggagagtgga ga

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 98

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido

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<400> 98

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tctgactaga cctgcaggag atggaggccg gc

\hfill

32

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 99

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<211> 31

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 99

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaataggtgt ttccattact atgtacaatg c

\hfill

31

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 100

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido

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<400> 100

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cagggcagtc tccacagctc ctgatctata aa

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 101

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 101

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtttctaatc ggctttatgg ggtccctgac ag

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 102

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 102

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gttcagtggc agtggatcag gcacagattt ta

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 103

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 103

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cactgaaaat cagcagagtg gaggctgagg at

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 104

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 104

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gttggggttt attactgctt tcaaggttca ca

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 105

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

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<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 105

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgttccgtgg acgttcggcc aagggaccaa gg

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 106

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 106

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tggaaatcaa acgtgagtgg atcctctgcg

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 107

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 107

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tctgcaggta ccattgc

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 108

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 108

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgcaatggta cctgcagaag c

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 109

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 109

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agactgccct ggcttctgca ggtaccattg ca

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 110

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 110

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgattagaaa ctttatagat caggagctgt gg

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 111

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 111

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgccactgaa cctgtcaggg accccataaa gc

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 112

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 112

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gattttcagt gtaaaatctg tgcctgatcc ac

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 113

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 113

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

taaaccccaa catcctcagc ctccactctg ct

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 114

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 114

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tccacggaac atgtgaacct tgaaagcagt aa

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 115

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 115

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tttgatttcc accttggtcc cttggccgaa c

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 116

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 116

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgcagaggat ccactcacg

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 117

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 117

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtcagaacgc gtgccgcc

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 118

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 118

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

accatgaaag tgttgagtct gttgtacctc ttga

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 119

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 119

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cagccattcc tggtatcctg tctcaggtgc agct

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 120

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 120

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcaggagtcg ggcccaggac tggtgaagcc ttcg

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 121

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 121

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gagaccctgt ccctcacctg cactgtctct ggt

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 122

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 122

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tactccatca ccggtggtta tttatggaac tgg

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 123

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 123

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atacggcagc ccccagggaa gggactggag tgg

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 124

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 124

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atggggtata tcagctacga cggtaccaat aac

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 125

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

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<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 125

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcaacacttt catggtggcg gcacgcgttc tgac

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 126

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

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<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 126

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ataccaggaa tggctgtcaa gaggtacaac agac

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 127

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

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<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 127

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgggcccgac tcctgaagct gcacctgaga cagg

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 128

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 128

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgagggacag ggtctccgaa ggcttcacca gtcc

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 129

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

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<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 129

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccaccggtga tggagtaacc agagacagtg cagg

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 130

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

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<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 130

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccctgggggc tgccgtatcc agttccataa ataa

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 131

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 131

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tagctgatat accccatcca ctccagtccc tt

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 132

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 132

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gttattggta ccgtcg

\hfill

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 133

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 133

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tacgacggta ccaataacta c

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 134

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 134

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaaccctccc tcaaggatcg aatcaccata tc

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 135

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 135

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acgtgacacg tccaagaacc agttctccct ga

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 136

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 136

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agctgagctc tgtgaccgct gcggacactg ca

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 137

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 137

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtgtattact gtgcgagata cggtagggtc tt

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 138

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 138

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctttgactac tggggccagg gaaccctggt ca

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 139

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 139

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccgtctcctc aggtgagtgg atcctctgcg

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 140

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 140

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agggagggtt tgtagttatt ggtaccgtcg ta

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 141

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 141

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acgtgtcacg tgatatggtg attcgatcct tg

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 142

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 142

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agagctcagc ttcagggaga actggttctt gg

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 143

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 143

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cagtaataca ctgcagtgtc cgcagcggtc ac

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 144

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 144

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agtagtcaaa gaagacccta ccgtatctcg ca

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 145

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 145

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctgaggagac ggtgaccagg gttccctggc ccc

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 146

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Descripción de la secuencia artificial: Oligonucleótido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 146

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgcagaggat ccactcac

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 147

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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<400> 197

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ctggttactc catcagcggt ggttatttat g

\hfill

31

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 148

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<211> 31

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 148

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cataaataac caccgctgat ggagtaacca g

\hfill

31

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<210> 149

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<211> 31

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 149

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gggactggag tggatcgggt atatcagcta c

\hfill

31

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 150

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<211> 31

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 150

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gtagctgata tacccgatcc actccagtcc c

\hfill

31

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 151

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<211> 31

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 151

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\hskip-.1em\dddseqskip

tccctcaagg atcgagtcac catatcacgt g

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 152

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 31

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 152

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\vskip0.400000\baselineskip

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cacgtgatat ggtgactcga tccttgaggg a

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 153

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<211> 39

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<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 153

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatcgagtca ccatatcagt ggacacgtcc aagaaccag

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 154

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 154

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctggttcttg gacgtgtcca ctgatatggt gactcgatc

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 155

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<211> 31

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<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 155

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gcttccagca gtgatattgt gatgactcag t

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 156

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<211> 31

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 156

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actgagtcat cacaatatca ctgctggaag c

\hfill

31

Claims

1. Anticuerpo aislado, o uno de sus fragmentos funcionales, siendo dicho anticuerpo o dichos fragmentos funcionales capaces de unirse al receptor del factor de crecimiento 1 tipo insulina IGF-IR de humano, caracterizado porque:

- dicho anticuerpo comprende una cadena pesada que comprende los tres CDR de secuencia SEC ID nº 8, 10 y 12, y una cadena ligera que comprende los tres CDR de secuencia SEC ID nº 2, 4 y 6; y

- dicho fragmento funcional se selecciona de entre los fragmentos Fv, Fab, (Fab')_{2}, Fab', scFv, scFv-Fc y los dianticuerpos, y porque dicho fragmento comprende los tres CDR de secuencia SEC ID nº 8, 10 y 12, y los tres CDR de secuencia SEC ID nº 2, 4 y 6.

2. Hibridoma murino según la reivindicación 1, depositado en el CNCM, Instituto Pasteur, París, el 19 de septiembre de 2001, bajo el número 1-2717.

3. Anticuerpo caracterizado porque está segregado por el hibridoma según la reivindicación 2.

4. Anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque dicho anticuerpo comprende una cadena ligera de secuencia que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 54, y porque comprende una cadena pesada de secuencia que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 69.

5. Anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, según la reivindicación 4, caracterizado porque dicho anticuerpo es un anticuerpo quimérico y comprende además las regiones constantes de cadena ligera y cadena pesada derivadas de un anticuerpo de una especie heteróloga al ratón.

6. Anticuerpo quimérico, o uno de sus fragmentos funcionales, según la reivindicación 5, caracterizado porque dicha especie heteróloga es el ser humano.

7. Anticuerpo quimérico, o uno de sus fragmentos funcionales, según la reivindicación 6, caracterizado porque las regiones constantes de cadena ligera y cadena pesada derivadas de un anticuerpo humano son, respectivamente, la región kappa y gamma-1, gamma-2 o gamma-4.

8. Anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, según la reivindicación 1, caracterizado porque dicho anticuerpo es un anticuerpo humanizado y comprende una cadena ligera y/o una cadena pesada, en la cual los segmentos del esqueleto FR1 a FR4 de dicha cadena ligera y/o cadena pesada, derivan respectivamente de segmentos del esqueleto FR1 a FR4 de cadena ligera y/o cadena pesada de anticuerpo humano.

9. Anticuerpo humanizado o uno de sus fragmentos funcionales, según la reivindicación 8, caracterizado porque dicho anticuerpo comprende una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 61 ó 65, y porque comprende una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 75, 79 u 83.

10. Anticuerpo humanizado, o uno de sus fragmentos funcionales, según la reivindicación 9, caracterizado porque dicho anticuerpo comprende una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 65, y porque comprende una cadena pesada de secuencia que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 83.

11. Ácido nucleico aislado, caracterizado porque se selecciona entre los siguientes ácidos nucleicos:

a): un ácido nucleico, ADN o ARN, que codifica un anticuerpo según una de las reivindicaciones 1 y 3 a 10;

c): un ácido nucleico de por lo menos 18 nucleótidos capaz de hibridar bajo condiciones muy restrictivas, con al menos una de las CDR de secuencia SEC ID nº 1, 3, 5, 7, 9 u 11.

12. Vector que comprende un ácido nucleico según la reivindicación 11.

13. Célula hospedante que comprende un vector según la reivindicación 12.

14. Procedimiento para la producción de un anticuerpo, caracterizado porque comprende las siguientes etapas:

a): cultivar en un medio y condiciones de cultivo adecuados una célula según la reivindicación 13; y

b): recuperar dichos anticuerpos así producidos a partir del medio de cultivo o dichas células cultivadas.

15. Anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, según una de las reivindicaciones 1 y 3 a 10, como un medicamento.

16. Composición que comprende, a título de principio activo, un compuesto que consiste de un anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, según una de las reivindicaciones 1, 3 a 10 y 15.

17. Composición según la reivindicación 16, como un medicamento.

18. Uso de un anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, según una de las reivindicaciones 1, 3 a 10 y 15, o de una composición según una de las reivindicaciones 16 y 17, para la preparación de un medicamento destinado para la prevención y/o para el tratamiento de cáncer.

19. Uso según la reivindicación 18, caracterizado porque dicho cáncer se elige entre el cáncer de la próstata, las osteosarcomas, el cáncer del pulmón y el cáncer de mama.

20. Uso según una de las reivindicaciones 18 ó 19, caracterizado porque dicho cáncer consiste en el cáncer de la próstata dependiente de andrógeno.

21. Método de diagnóstico in vitro de enfermedades inducidas por una sobreexpresión o una subexpresión del receptor IGF-IR, a partir de una muestra biológica en la cual se sospecha la presencia anormal del receptor IGF-IR, caracterizado porque dicha muestra biológica se pone en contacto con un anticuerpo según una de las reivindicaciones 1 y 3 a 10, pudiendo ser, llegado el caso, marcado.

22. Kit o juego para llevar a cabo un método de diagnóstico de enfermedades inducidas por una sobreexpresión o una subexpresión del receptor IGF-IR, o para llevar a cabo un procedimiento para la detección y/o la cuantificación de una sobreexpresión o de una subexpresión del receptor IGF-IR en una muestra biológica, preferentemente una sobreexpresión de dicho receptor, caracterizado porque dicho kit o juego comprende los siguientes elementos:

a): un anticuerpo, o uno de sus fragmentos funcionales, según una de las reivindicaciones 1 y 3 a 10;

b): opcionalmente, los reactivos para la formación del medio favorable para la reacción inmunológica;

c): opcionalmente, los reactivos que permitan la demostración de complejos de IGF-IR/anticuerpo producidos mediante la reacción inmunológica.