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JP2005514409A - Ｍｕｃ１８抗原に対する抗体の使用 - Google Patents

Ｍｕｃ１８抗原に対する抗体の使用 Download PDF

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JP2005514409A
JP2005514409A JP2003557374A JP2003557374A JP2005514409A JP 2005514409 A JP2005514409 A JP 2005514409A JP 2003557374 A JP2003557374 A JP 2003557374A JP 2003557374 A JP2003557374 A JP 2003557374A JP 2005514409 A JP2005514409 A JP 2005514409A
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antibody
muc18
seq
cells
tumor
Prior art date
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JP2003557374A
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ジーン・グダス
メナシェ・バー・エリ
Original Assignee
アブジェニックス・インコーポレーテッド
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Abstract

本発明は、一般的に抗MUC18モノクローナル抗体の生成および特定に関する。本発明はさらに、MUC18の活性増加に伴う障害、特に黒色腫などの腫瘍の診断および治療における該抗MUC18抗体の使用に関する。

Description

本発明の実施形態は、抗体結合MUC18抗原ならびにそのような抗体を調製および使用する方法および手段に関する。
MUC18は、その発現が腫瘍の進行と転移能の発生に関連する黒色腫細胞接着分子(MCAM)である黒色腫抗原として最初に同定された細胞表面糖タンパク質である。MUC18は、シグナルペプチド、5つの免疫グロブリン様ドメイン、トランスメンブラン領域および短細胞質末端から構成されている113kDAの細胞表面内在性膜糖タンパク質である(Lehmann et al.、Proc Natl Acad Sci USA、86(24)、9891〜5頁(1989))。
MUC18は、免疫グロブリンスーパーファミリーの1員であり、BEN(Pourquie et al.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、89、5261〜5265頁(1992)、神経細胞接着分子(N-CAM)(Owens et al.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、84、294〜298頁(1987)、ミエリン結合糖タンパク質(MAG)(Lai et al.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、84、4337〜4341頁(1987)、DCC(deleted in colorectal cancer)(Hedrick et al.、Genes Devel.、8(10)、1174〜83頁(1994)およびギセリン(Taira et al.、Neuron、12、861〜872頁(1994)を含むIgスーパーファミリー(Lehmann et al.、Proc Natl Acad Sci USA、86、9891〜9895頁(1989))の多くの細胞接着分子と有意な配列相同性を有する。MUC18の発現は、比較的に限られたスペクトルの正常ヒト組織および種々の悪性腫瘍に検出された。正常成人組織では、MUC18は内皮細胞、平滑筋細胞(Shih et al.、Lab.Invest.、75、377〜388頁(1996)、Sers et al.、Cancer Res.、54(21)、5689〜94頁(1994))、活性化Tリンパ球の亜集団(Pickl et al.、J.Immunol.、158、2107〜2115頁(1997)および中間栄養膜(Shih et al.、Lab.Invest.、75、377〜388頁(1996))で発現する。MUC18はまた、平滑筋腫瘍(平滑筋腫および平滑筋肉腫)、血管起源の腫瘍(血管肉腫およびカポシ肉腫)、胎盤部位栄養膜腫瘍、絨毛癌および黒色腫を含む種々の悪性腫瘍で発現する(Shih et al.、Clinical Cancer Res.、2、569〜575頁(1996)、Holzmann et al.、Int.J.Cancer、39、466〜471頁(1987))。MUC18の発現は、ヒト黒色腫細胞の転移能と直接相関する(Bar-Eli M.、Cancer Metastasis、18(3)、377〜85頁(1999))。
多くの研究でMUC18は黒色腫における腫瘍の進行と転移のマーカーとして同定された。MUC18の発現は、正常メラニン形成細胞および良性母斑においては存在しないが、多くの原発性黒色腫およびほとんどの転移性病変で顕著である(Lehmann et al.、Proc Natl Acad Sci USA、86、9891〜5頁(1989)、Lehmann et al.、Cancer Res.、47、841〜845頁(1987)、Shih et al.、Cancer Res.、54、2514〜2520頁(1994))。重要なことに、MUC18の発現は、腫瘍の垂直方向の厚さと転移巣形成とよく相関し、80%を超える転移性病変がMUC18を発現する(Lehmann et al.、Proc Natl Acad Sci USA、86、9891〜9895頁(1989)、Xie et al.、Cancer Res.、57、2295〜2303頁(1997)、Sers et al.、Proc Natl Acad Sci USA、90、8514〜8518頁(1993)、Lehmann et al.、Cancer Res.、47、841〜845頁(1987)、Shih et al.、Cancer Res.、54、2514〜2520頁(1994))。ヒト黒色腫における他の既知の分子病変に関連するMUC18の発現を示す線図を図1に示す。
転移性黒色腫細胞における転写因子ATF-1およびCREBの発現はアップレギュレートされている。しかし、ATF-1/CREBの過剰発現がどのように転移の獲得に寄与しているかは不明である。CREB/ATF-1は、接着分子MUC18、ならびに癌に寄与し、腫瘍浸潤、血管新生および転移に役割を有することが知られているMMPファミリーに属するメタロプロテイナーゼMMP-2(Jean et al.、Mol.Cell Biochem.、212(1-2)、19〜28頁(2000))のCRE依存的発現を調節することにより浸潤に本質的な役割を果たしている可能性がある。腫瘍細胞は遠隔部位に広がるためにMMPsのマトリックス分解能力を利用すると考えられており、腫瘍細胞がいったん転移したならば、MMPsはこれらの腫瘍細胞の増殖を促進すると考えられている。黒色腫腫瘍の進行におけるMUC18の役割は、完全には理解されていないが、おそらくMMP-2の活性化または細胞移動に影響を及ぼすことにより、転移過程における1つまたは複数の段階における役割を含む可能性がある。
ヒト黒色腫細胞系の分析により、ヌードマウスにおけるMUC18発現と転移をもたらす細胞の能力との正の相関が示された(Johnson et al.、Cancer Metastasis Rev.、18、345〜357頁(1999))。非腫瘍形成性黒色腫細胞系からの腫瘍形成性変異型の発生は、MUC18発現の誘導により達成されると報告された(Luca et al.、Melanoma Res.、3、35〜41頁(1993))。MUC18陰性ヒト黒色腫細胞系におけるMUC18の発現は、実験的腫瘍モデルにおけるそれらの腫瘍形成性を増大させ、それらの転移能力を増大させた(Xie et al.、Cancer Res.、57、2295〜2303頁(1997)、Bani et al.、Cancer Res.、56、3075〜3086頁(1996))。最後に、MUC18 cDNAの遺伝抑制要素を用いた転移巣におけるMUC18発現の阻害は、ヌードマウスにおける腫瘍形成表現型の減少をもたらした(Styamoorthy et al.、Oncogene、20、4676頁(2001))。
MUC18の機能は十分には理解されていないが、いくつかの試験で未同定のリガンドに結合することによる細胞-細胞および細胞-マトリックス相互作用の媒介におけるこのタンパク質に対する役割が示された(Shih et al.、Cancer Res.、57、3835〜3840頁(1997)、Johnson et al.、Int.J.Cancer、73、769〜774頁(1997))。細胞-細胞または細胞-マトリックス相互作用を媒介する細胞接着分子の発現は、転移に必須の腫瘍細胞の特性である。したがって、MUC18をトランスフェクトした黒色腫細胞は同型接着の増加、ヒト内皮細胞への付着の増加およびMatrigel被覆フィルタを通しての侵入の増加を示したことから、腫瘍浸潤および経内皮移動における役割が示唆された(Xie et al.、Cancer Res.、57、2295〜2303頁(1997))。重要なことに、抗MUC18抗体はMUC18トランスフェクト細胞におけるこれらの機能を阻害することができた(Xie et al.、Cancer Res.、57、2295〜2303頁(1997))。
したがって、MUC18の生物学的機能、最も重要なことに、腫瘍の進行と転移に必須である細胞増殖および増殖を阻害することができる抗MUC18抗体が非常に必要である。そのような抗体は、細胞-細胞および細胞-マトリックス相互作用を媒介するMUC18の固有の能力を妨げる可能性があると思われる。そのような活性の阻害は、MUC18を標的とするモノクローナル抗体によって可能であると思われる。細胞表面にMUC18を発現する腫瘍細胞の進行に影響を及ぼす能力は、腫瘍を有する患者に対する、またはそのような腫瘍を有する患者における転移性疾患の予防のための使用による療法となることが証明されると思われる。
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本発明は、MUC18に結合し、MUC18の機能に影響を及ぼすことが認められたモノクローナル抗体の開発に基づいている。本願書は、MUC18に対する強い結合親和力、in vivoで腫瘍の増殖および転移を阻害する能力、細胞の生存を促進する能力ならびにin vitroで腫瘍浸潤を阻害する能力などの治療上の観点から望ましい特性を有するヒト抗MUC18抗体および抗MUC18抗体製剤を記載する。
一態様において、本発明は、少なくともヒトMUC18に結合し、その生物学的活性を中和する、あるいはこのタンパク質の細胞内取り込みおよび下方制御を刺激する抗ヒトMUC18モノクローナル抗体を提供する。この抗体は、問題のヒトMUC18の生物学的活性を有意に低下または消失させることができる。
本発明の一実施形態は、腫瘍の治療を必要とする動物を選択する段階と、配列番号1、5、9、13、17、21、25、29、33および37からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖アミノ酸を含み、MUC18に結合するモノクローナル抗体を用意する段階と、前記細胞の増殖の阻害をもたらす、腫瘍を有効な量の抗体と接触させる段階とを含む動物における腫瘍の増殖を阻害する方法である。
本発明の他の実施形態は、黒色腫の治療を必要とする動物を選択する段階と、配列番号1、5、9、13、17、21、25、29、33および37からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖アミノ酸を含み、MUC18に結合するモノクローナル抗体を用意する段階と、細胞浸潤の阻害をもたらす、黒色腫を有効な量の前記抗体と接触させる段階とを含む黒色腫に伴う細胞浸潤を阻害する方法である。
本発明の他の実施形態は、転移性腫瘍を有する動物の生存率を増加させる方法である。この方法は、転移性腫瘍の治療を必要とする動物を選択する段階と、配列番号1、5、9、13、17、21、25、29、33および37からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖アミノ酸を含み、MUC18に結合するモノクローナル抗体を用意する段階と、前記動物の生存率の増加をもたらす前記腫瘍の転移の阻害をもたらす、前記動物を有効な量の前記抗体と接触させる段階とを含む。
対象ヒトMUC18の生物学的活性は、細胞増殖であってよい。さらに、生物学的活性は、原発腫瘍の増殖と転移にとって重要な血管新生と細胞増殖、細胞浸潤および/または移動、ならびにメタロプロテイナーゼMMP-2の活性化を含んでいてよい。さらに、生物学的活性は、腫瘍、例えば、黒色腫を有する患者における腫瘍細胞の増殖と転移を含んでいてよい。
また、本明細書に記載する抗体のいずれかをコードする分離核酸分子、その分離核酸分子を含むベクター、その核酸分子で形質転換した宿主細胞、および抗体を産生させ、場合によって宿主細胞から抗体を回収するために核酸分子を発現させる条件下で宿主細胞を培養することを含む抗体を産生させる方法を提供する。抗体は、IgGクラスのものであってよい。分離核酸分子は、好ましくは、モノクローナル抗体の重鎖可変領域をコードし、c3.19.1(配列番号3)、c6.11.3(配列番号7)、C3.10(配列番号11)、C3.22((配列番号15)、C3.27(配列番号19)、C3.45(配列番号23)、C3.65(配列番号27)、C6.1(配列番号31)、C6.9(配列番号35)またはC6.2((配列番号39)の重鎖可変ドメインのヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列、あるいはモノクローナル抗体の軽鎖可変領域をコードし、3.19.1(配列番号4)、6.11.3(配列番号8)、C3.10(配列番号12)、C3.22((配列番号16)、C3.27(配列番号20)、C3.45(配列番号24)、C3.65(配列番号28)、C6.1(配列番号32)、C6.9(配列番号36)またはC6.2((配列番号40)の軽鎖可変ドメインのヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
異なる態様において、本発明は、患者に有効な量の抗MUC18抗体を投与することを含む患者におけるMUC18の発現に伴う疾患または状態を治療する方法を提供する。患者は、哺乳動物患者、好ましくはヒト患者である。疾患は、黒色腫のような腫瘍である。
A.定義
特に定義しない限り、本明細書で用いる技術および科学用語は、本発明が属する分野の技術者により一般的に理解されているのと同じ意味を有する。例えば、Singleton et al.、Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed、J.Wiley & Sons(New York、NY 1994)、Sambrook et al.、Molucular Cloning、A Laboratory Manual、Cold Springs Harbor Press(Cold Springs Harbor、NY 1989)を参照のこと。本発明の目的のために、以下の用語を以下に定義する。
本明細書で用いているように、「MUC18」という用語は、多くの細胞接着分子と配列類似性を有する免疫グロブリンスーパーファミリーの1員である細胞表面ポリペプチドを指す。MUC18は、当技術分野で「MCAM」、「Mel-CAM」または「CD146」としても知られている。本発明の目的のために、以後、「MUC18」は「MCAM」、「Mel-CAM」および「CD146」を表すために用いる。
本明細書で用いている「c3.19.1」は、MUC18抗原に対して誘導された完全なヒトIgG2モノクローナル抗体を指す。この抗体は、XenoMouse(登録商標)technology(Abgenix Inc.、Fremont、CA)を用いて生成させたものであり、約150kDaの分子量を有するヒトγ2重およびκ軽鎖からなる。C3.19.1はまた本明細書においてABX-MA1と称し、ヒトMUC18に高い親和力(Kd=6×10-10M)で特異的に結合する。
MUC18に関する「生物学的活性」および「生物学的に活性な」という用語は、腫瘍の進行に特異的に影響を及ぼす分子の能力を指す。好ましい生物学的活性は、腫瘍細胞の増殖および転移を誘発する能力を含む。腫瘍細胞の転移に対するMUC18の影響は、MMP-2活性化および/または細胞移動を誘発する能力を含むと思われる。さらなる好ましい生物学的活性は、腫瘍負荷に起因する動物の死亡を誘発する能力である。
抗MUC18抗体に関する「生物学的活性」および「生物学的に活性な」という用語は、しばしばMUC18の発現に伴う腫瘍細胞の増殖および転移を阻害する分子の能力を指す。さらに、抗MUC18抗体の作用または活性の他の機構は、MUC18の細胞内取り込みを刺激する能力および細胞表面発現の結果として生ずる消失を含む。特に、腫瘍細胞は、腫瘍を有する患者における腫瘍細胞を含む。
「ポリメラーゼ連鎖反応」または「PCR」は、1987年7月28日に発行された米国特許第4683195号に記載されているように核酸、RNAおよび/またはDNAの少量の特定の断片を増幅する手順または技術を指す。一般的に、オリゴヌクレオチドプライマーを設計することができるように、問題の、またはそれを越える領域の末端の配列情報を得る必要がある。これらのプライマーは、増幅する鋳型の対側鎖と配列が同一または類似している。2つのプライマーの5'末端ヌクレオチドは、増幅された物質の末端と一致することができる。PCRは、特定のRNA配列、全ゲノムDNAからの特定のDNAおよび全細胞RNA、バクテリオファージまたはプラスミド配列等から転写されたcDNAを増幅するために用いることができる。一般的にMullis et al.、Cold Springs Harbor Symp.Quant.Biol.51、263頁(1987)、Erlich ed.、PCR Technology(Stockton Press、NY、1989)を参照のこと。本明細書で用いているように、PCRは、プライマーとしての既知の核酸と核酸の特定の断片を増幅または生成するための核酸プライマーの使用を含む、核酸試験試料を増幅するための核酸ポリメラーゼ反応法の1つの例であるが、唯一の例ではないとみなされる。
「腫瘍」は、本明細書で用いているように、悪性または良性をとわず、すべての新生物形成細胞増殖および増殖、ならびにすべての前癌および癌性細胞および組織を指す。
「癌」または「癌性」という用語は、一般的に無秩序な細胞増殖によって特徴付けられる哺乳動物における生理学的状態を指す、または記述する。癌の例は、黒色腫、癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫および白血病またはリンパ様悪性腫瘍を含むが、これらに限定されない。そのような癌のより特定の例としては、扁平上皮細胞癌(例えば、上皮扁平上皮細胞癌)、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌および肺の扁平上皮癌を含む肺癌、腹膜の癌、肝細胞癌、胃腸癌を含む胃癌、膵臓癌、神経膠芽腫、子宮頚癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝腫、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓または腎癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌、肛門癌、陰茎癌ならびに頭部および頚部の癌などがある。
「抗体」(Abs)および「免疫グロブリン」(Igs)は、同じ構造特性を有する糖タンパク質である。抗体は特定の抗原に対して結合特異性を示すが、免疫グロブリンは抗体と抗原特異性を欠く他の抗体様分子とを含む。後者の種類のポリペプチドは、例えば、リンパ系により低レベルで、骨髄腫により高レベルで産生される。
「天然抗体および免疫グロブリン」は、通常、2つの同じ軽(L)鎖と2つの同じ重(H)鎖とからなる約150000ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は、1つの共有結合ジスルフィド結合により重鎖に結合しているが、ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンイソ型間で異なっている。各重および軽鎖はまた、規則的な間隔のジスルフィド架橋を有する。各重鎖は、1つの末端に可変領域(VH)とそれに続く多くの定常領域を有する。各軽鎖は、1つの末端に可変領域(VL)と他の末端に定常領域を有する。軽鎖の定常領域は重鎖の第1の定常領域と整列し、軽鎖の可変領域は重鎖の可変領域と整列している。特定のアミノ酸残基が軽および重鎖可変領域間の界面を形成していると考えられている(Chothia et al.、J.Mol.Biol.、186、651頁(1985)、Novotny and Haber、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A、82、4592頁(1985)、Chothia et al.、Nature、342、877〜883頁(1989))。
本明細書における「抗体」という用語は、広い意味で用い、完全なモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも2つの完全な抗体から形成されている多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)、および望ましい生物学的活性を示す限り、抗体断片を対象として含む。
脊椎動物種の抗体(免疫グロブリン)の「軽鎖」は、それらの定常領域のアミノ酸配列に基づきκおよびλと呼ばれている2つの明らかに異なる種類の1つに帰属させることができる。
重鎖の定常領域のアミノ酸配列によって、完全な抗体は、異なる「クラス」に帰属させることができる。完全な抗体の5つの主要なクラス、すなわち、IgA、IgD、IgE、IgGおよびIgMが存在し、これらのうちのいくつかはさらに「サブクラス」(イソ型)、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgAおよびIgA2に分けることができる。異なるクラスの抗体に対応する重鎖定常領域は、それぞれα、δ、ε、γおよびμと呼ばれている。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および3次元配置はよく知られている。
「抗体」という用語は、すべてのクラスおよびサブクラスの免疫グロブリンを含む。「抗体」という用語は、抗体断片も対象として含む。「抗体」という用語は、特に、抗体断片クローンを含むモノクローナル抗体を対象として含む。
本明細書で用いる「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体集団から得られる抗体を指す。すなわち、集団を構成する個々の抗体が、わずかな量で存在することがある天然に存在する突然変異体を除いて、同じである。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一抗原部位に対して誘導される。さらに、異なる決定基(エピトープ)に対して誘導された異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物と異なり、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一決定基に対して誘導される。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は他の抗体によって汚染されずに合成される可能性がある点が有利である。修飾成句「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体の特性を示し、特定の方法による抗体の生産を必要とすると解釈すべきではない。例えば、本発明により用いられるモノクローナル抗体は、Kohler et al.、Nature、256、469頁(1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法により調製することができ、あるいは、組換えDNA法(例えば、米国特許第4816567号を参照)により調製することができる。「モノクローナル抗体」は、例えば、Clackson et al.、Nature、352、624〜628頁(1991)およびMarks et al.、J.Mol.Biol.、222、581〜597頁(1991)に記載されている技術を用いてファージ抗体ライブラリーから分離することもできる。
「分離」抗体は、その天然環境の構成要素から同定され、分離かつ/または回収されたものである。その天然環境の汚染構成要素は、抗体の診断上または治療上の使用を妨げると思われる物質であり、酵素、ホルモンおよび他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含む。好ましい実施形態において、抗体は、(1)ローリー法、およびスピニングカップシークエネーターを用いて末端または内部アミノ酸配列により測定したとき95重量%以上の抗体まで、または(3)クーマシーブルーまたは好ましくは銀染色を用いた還元または非還元条件下でのSDS-PAGEによる均一性を有するまで精製する。分離抗体は、抗体の天然環境の少なくとも1つの構成要素は存在しないので、組換え細胞内のin situでの抗体を含む。しかしながら、通常、分離抗体は、少なくとも1つの精製段階により調製される。
「中和抗体」は、結合する標的抗原のエフェクター機能を消失または有意に低下させることができる抗体分子を意味する。したがって、「中和」抗MUC18抗体は、細胞接着、移動またはMMP活性化のMUC18依存的調節を含むエフェクター機能を消失または有意に低下させることができる。抗体は、分子の細胞内取り込みおよび分解を刺激し、それにより、抗原の細胞表面発現を効果的に除去することにより、MUC18の機能に影響を及ぼすことができる。
「可変」という用語は、可変領域の特定の部分の配列が抗体間で広範に異なることを指し、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合および特異性に用いる。しかし、可変性は、抗体の可変領域全体にわたって一様に分布しているわけではない。それは、軽鎖および重鎖可変両領域の相補性決定領域(CDR)または超可変領域と呼ばれている3つのセグメントに集中している。可変領域のより高度に保存されている部分は、フレームワーク(FR)と呼ばれる。天然重および軽鎖の可変領域は、ループ結合を形成し、場合によってβシート構造の一部を形成する3つのCDRによって結合されている主としてβシート配置をとる4つのFR領域をそれぞれ含む。各鎖におけるCDRはFR領域によって互いに極めて近接して保持され、他の鎖のCDRとともに抗体の抗原結合部位の形成に寄与する(Kabat et al.(1991)を参照)。定常領域は、抗原への抗体の結合に直接関与しないが、抗体依存性細胞毒性における抗体の関与のような様々なエフェクター機能を示す。
「Fv」は、完全な抗原認識および結合部位を含む最小限の抗体断片である。2鎖Fv種では、この領域は、強固な非共有結合で会合した1つの重鎖可変領域と1つの軽鎖可変領域の2量体からなる。単鎖Fv種では、1つの重鎖可変領域と1つの軽鎖可変領域が、軽鎖と重鎖が2鎖Fv種と同様な「2量体」構造で会合することができるように、可変性ペプチドリンカーにより共有結合することができる。この立体配置では、各可変領域の3つのCDRが相互作用して、VH-VL2量体の表面上の抗原結合部位を定めている。一括して、6つのCDRが抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一可変領域(または抗原に対して特異的な3つのCDRのみを含むFvの半分)でさえも、完全な結合部位よりも低い親和力でではあるが、抗原を認識し、結合する能力を有する。
「超可変領域」という用語は、本明細書で用いるとき、抗原結合を担っている抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は一般的に、「相補性決定領域」または「CDR」のアミノ酸残基(例えば、軽鎖可変領域における残基24〜34(L1)、50〜62(L2)および89〜97(L3)ならびに重鎖可変領域における残基31〜55(H1)、50〜65(H2)および95〜102(H3)、Kabat et al.、Sequences of Proteins of Immunological Interest、5th Ed.、Public Health Service、National Institutes of Health、Bethesda、MD.(1991))および/または「超可変ループ」の残基(例えば、軽鎖可変領域における残基26〜32(L1)、50〜52(L2)および91〜96(L3)ならびに重鎖可変領域における残基26〜32(H1)、53〜55(H2)および96〜101(H3)、Chothia and Lesk、J.Mol.Biol.、196、901〜917頁(1987))を含む。「フレームワーク領域」または「FR」残基は、本明細書で定義した超可変領域残基以外の可変領域残基である。
「相補性決定領域」または「CDR」という用語は、本明細書で用いるとき、特定のリガンドと接触し、その特異性を決定する免疫学的受容体の部分を指す。免疫学的受容体のCDRは、受容体に多様性を与える受容体タンパク質の最も可変性の部分であり、受容体の可変領域の遠位端の6つのループ(受容体の2つの可変領域のそれぞれからの3ループ)上にある。
「エピトープ」という用語は、タンパク質抗原上の(モノクローナルまたはポリクローナル)抗体の結合部位を指すために用いる。
アミノ酸またはアミノ酸残基という用語は、本明細書で用いているように、天然に存在するLアミノ酸、または変異体について下でさらに述べるDアミノ酸を指す。一般的に用いられているアミノ酸の1文字または3文字略記法を本明細書で用いる(Bruce Alberts et al.、Molecular Biology of the Cell、Garland Publishing,Inc.、New York(3d ed.1994))。
「疾患状態」という用語は、細胞または身体機能、系または器官の中断、停止または障害が発生した細胞または哺乳動物の全身の生理学的状態を指す。
「治療する」または「治療」という用語は、癌の発生または広がりのような望ましくない生理学的変化または障害を予防または減速(軽減)することを目的とする治療的処置および予防処置の両方を指す。本発明の目的のために、有用または望ましい臨床的結果は、検出可能か、検出不能かを問わず、症状の緩和、疾患の程度の減少、疾患の状態の安定化(すなわち、悪化しない)、疾患の進行の遅延または緩徐化、疾患状態の改善または緩和および寛解(部分的か、完全かを問わず)を含むが、これらに限定されない。「治療」は、治療を受けない場合に予想される生存期間と比較して平均生存期間を延長させることも意味し得る。治療を必要とする者は、状態もしくは障害を既に有する者ならびに状態もしくは障害を有する傾向を有する者または状態もしくは障害を予防しなければならない者などである。
「障害」は、本発明の治療から利益を得ると思われるあらゆる状態である。これは、哺乳動物を問題の障害を受けやすくする病理学的状態を含む慢性または急性障害または疾患を含む。本明細書における治療すべき障害の非限定的な例としては、良性および悪性腫瘍、白血病およびリンパ様悪性腫瘍、特に、前立腺、腎、卵巣、胃、子宮内膜、唾液腺、腎臓、結腸、甲状腺、膵臓、前立腺または膀胱癌、ならびに、子宮頚癌および子宮頚部上皮内扁平上皮および腺新形成、腎細胞癌(RCC)、食道腫瘍、および癌由来細胞系のような悪性腫瘍などがある。本発明により治療される好ましい障害は、腎および前立腺癌である。治療されるさらなる好ましい障害は、黒色腫である。
治療のための「哺乳動物」は、ヒトと、イヌ、ウマ、ネコ、ウシ等のような家畜および酪農動物、ならびに動物園、スポーツ用または愛玩動物を含む哺乳動物と分類されるあらゆる動物を指す。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
「リポフェクション」は、遺伝情報を標的組織に導入するための実際的な非ウイルス法を指す。非ウイルス法としては、化学的または物理的方法などがある。リポフェクションでは、細胞膜と融合し、DNAを細胞質内に送達するベクターとして、正に荷電した脂質と負に荷電したDNAとの電気的に結合した複合体を用いる。リポフェクションは、リポフェクションによる遺伝情報の伝達の効率がウイルスベクターよりも低く、遺伝子の発現が一時的である点がウイルス法と異なる。あるいは、脂質とDNAとの複合体は、ウイルスベクターと比較して安定で、取り扱いやすい。
B.本発明の一実施形態を実施する方法
1.抗MUC18抗体の生成
以下の記述は、本発明により使用される抗体の生成のための具体例としての技術に関するものである。
(a)モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、Kohler et al.、Nature、256、469頁(1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法により調製することができ、あるいは、組換えDNA法(米国特許第4816567号)により調製することができる。
ハイブリドーマ法では、マウス、またはハムスターもしくはマカークザルのような他の適切な宿主動物を上述のように免疫化して、免疫化のために用いるタンパク質に特異的に結合する抗体を産生する、または産生することができるリンパ球を誘発する。別法として、問題の抗原を発現する細胞を免疫化に用いてもよい。さらなる別法として、リンパ球をin vitroで免疫化してもよい。1mgまたは1μgの複合体(それぞれウサギまたはマウスについて)を3容積のフロイントの完全アジュバントと混合し、溶液を複数の部位に皮内注射して、動物を免疫原性複合体または誘導体に対して免疫化する。1カ月後にフロイントの完全アジュバント中最初の量の1/5〜1/10の複合体の複数の部位への皮内注射により動物を追加抗原刺激した。7〜14日後に、動物から採血し、血清を抗MUC18抗体価について分析した。力価がプラトーになるまで、抗体を増強させる。好ましくは、動物を同じMUC18抗原の複合体で追加抗原刺激するが、異なるタンパク質に、かつ/または異なる架橋剤により結合させる。複合体は、組換え細胞培養中でタンパク質融合としても調製することもできる。また、ミョウバンのような凝集剤を用いて免疫応答を増強する。
そのような免疫化動物から分離したリンパ球、またはより好ましくはB細胞を富化したリンパ球を電気セル融合法により、またはポリエチレングリコールのような適切な融合剤を用いて骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞を生成させる(Goding Monoclonal Antibodies:Principles and Practice、59〜109頁、[Academic Press、1996])。
そのようにして調製したハイブリドーマ細胞を好ましくは未融合の親骨髄腫細胞の増殖または生存を阻害する1つまたは複数の物質を含む適切な培地に播種し、増殖させる。例えば、親骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRTまたはHPRT)を欠いている場合、ハイブリドーマ用培地には一般的に、HGPRT欠損細胞の増殖を妨げる物質である、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン(HAT培地)を含める。
好ましい骨髄腫細胞は、効率よく融合し、選択される抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの産生を支持し、HAT培地のような培地に対する感受性を有する細胞である。これらのうち、好ましい骨髄腫細胞系は、Salk Institute Cell Distribution Center、San Diego、California USAから入手可能なMOP-21およびMC-11マウス腫瘍、ならびにAmerican Type Culture Collection、Rockville、Maryland USAから入手可能なSP-2またはX63-Ag8-653細胞のようなマウス骨髄腫系である。ヒト骨髄腫およびマウス-ヒト異種骨髄腫細胞系もヒトモノクローナル抗体の生産用に記載された(Kozbor、J.Immunol.、133、3001頁(1984)、Brodeur et al.、Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications、51〜63頁、Marcel Dekker,Inc.、New York[1987])。
ハイブリドーマ細胞が成育中の培地を抗原に対して誘導されたモノクローナル抗体の産生について分析する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって産生されたモノクローナル抗体の結合特異性を、免疫沈降法により、または放射免疫検定法(RIA)もしくは酵素結合イムノソルベント検定法(ELISA)のようなin vitro結合検定法により検討する。
モノクローナル抗体の結合親和力は、例えば、Munson et al.、Anal.Biochem.、107、220頁(1980)のスキャッチャード(Scatchard)分析により測定することができる。
所望の特異性、親和力および/または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が特定された後に、細胞を限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法により増殖させる(Goding Monoclonal Antibodies:Principles and Practice、59〜109頁、Academic Press、1996)。この目的のための適切な培地は、例えば、DMEMまたはRPMI-1640培地などである。さらに、ハイブリドーマ細胞は、動物における腹水腫瘍としてin vivoで増殖させることができる。
サブクローニングにより分泌されるモノクローナル抗体を、培地、腹水または血清から、例えば、プロテインA-セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析またはアフィニティークロマトグラフィーのような従来の免疫グロブリン精製法により適宜分離する。
モノクローナル抗体をコードするDNAは、従来の方法を用いて(例えば、モノクローナル抗体の重および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いて)容易に分離され、配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、そのようなDNAの好ましい源となる。分離されたならば、DNAを発現ベクターに入れ、次いで、さもなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない、大腸菌細胞、サルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞または骨髄腫細胞のような宿主細胞にトランスフェクトして、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を得ることができる。DNAはまた、例えば、免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列のすべてまたは一部を共有結合により結合させることによって修飾することができる。そのようにして、本明細書における抗MUC18モノクローナル抗体の結合特異性を有する「キメラ」または「ハイブリッド」抗体が調製される。
一般的に、MUC18に対する特異性を有する1つの抗原結合部位と異なる抗原に対する特異性を有する他の抗原結合部位を含むキメラ2価抗体を調製するために、そのような非免疫グロブリンポリペプチドで本発明の抗体の定常領域を置換するか、またはそれらで本発明の抗体の1つの抗原結合部位の可変領域を置換する。
キメラまたはハイブリッド抗体は、架橋剤を用いる方法を含む合成たんぱく質化学における既知の方法を用いてin vitroで調製することもできる。例えば、免疫毒素は、ジスルフィド交換反応を用いるか、またはチオエーテル結合を形成させることにより、構成することができる。この目的のための適切な試薬の例は、イミノチオレートおよびメチル-4-メルカプトブチルイミデートなどである。
(b)ヒト抗体
ヒトmAbsを生成させるための同じ技術を用いる試みは、適切なヒト骨髄腫細胞系の欠如によって阻まれていた。最善の結果は、異種骨髄腫(マウス×ヒトハイブリッド骨髄腫)を融合相手として用いて得られた(Kozbor、J.Immunol.、133、3001頁(1984)、Brodeur et al.、Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications、51〜63頁、Marcel Dekker,Inc.、New York、1987)。あるいは、ヒト抗体分泌細胞は、エプスタイン-バーウイルス(EBV)による感染により不死化することができる。しかし、EBV感染細胞は、クローニングすることが困難であり、通常、比較的低い収率の免疫グロブリンを産生するにすぎない(James and Bell、J,Immunol.Methods、100、5〜40頁[1987])。将来、ヒトB細胞の不死化がおそらく形質転換遺伝子の規定された組合せを導入することにより達成されると思われる。そのような可能性は、テロメラーゼ触媒サブユニットならびにSV40大T腫瘍性タンパク質およびH-rasの発癌対立遺伝子の発現が正常ヒト上皮および線維芽細胞の腫瘍形成転換をもたらしたという最近の実証により強調される(Hahn et al.、Nature、400、464〜468[1999])。
免疫化により、内因性免疫グロブリン産生の非存在下で一団のヒト抗体を産生することができるトランスジェニック動物(例えば、マウス)を造ることが現在可能である(Jakobovits et al.、Nature、362、255〜258頁[1993]、Lonberg and Huszar、Int.Rev.Immunol.、13、65〜93[1995]、Fishwild et al.、Nat.Biotechnol.、14、845〜851頁[1996]、Mendez et al.、Nat.Genet.、15、146〜156頁[1997]、Green、J.Immunol.Methods、231、11〜23頁[1999]、Tomizuka et al.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、97、722〜727頁[2000]、Little et al.、Immunol.Today、21、364〜370頁[2000]における総説)。例えば、キメラおよび生殖系列突然変異マウスにおける抗体重鎖連結領域(JH)遺伝子の同型接合欠失が内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載された(Jakobovits et al.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90、2551〜2555頁[1993])。そのような生殖系列突然変異マウスへのヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイの移入は、抗原誘発によりヒト抗体の産生をもたらす(Jakobovits et al.、Nature、362、255〜258頁[1993])。
Mendez et al.、Nature Genetics、15、146〜156頁[1997])は、抗原で誘発したとき高親和性の完全なヒト抗体を産生する「XenoMouse(登録商標)II」と称されたトランスジェニックマウスの系統を発生させた。これは、上記のように内因性JHセグメントの欠失を有するマウスへのメガベースのヒト重鎖および軽鎖遺伝子座の生殖系列の組込みにより達成された。XenoMouse(登録商標)IIは、約66のVH遺伝子、完全なDHおよびJH領域ならびに3種の定常領域(μ、δおよびγ)を含む1020kbのヒト重鎖遺伝子座を有し、また、32のVκ遺伝子、JκセグメントおよびCκ遺伝子を含む800kbのヒトκ遺伝子座を有する。これらのマウスで産生される抗体は、遺伝子の再配列、構成および範囲を含むすべての点でヒトに認められるものと極めて類似している。ヒト抗体は、マウス遺伝子座における遺伝子の再配列を妨げる内因性JHセグメントの欠失のため、内因性抗体よりも優先的に発現する。
AbgenixのXenoMouse(登録商標)技術を用いて抗体を生成する技術としては、そのようなマウスへの問題の特定の抗原の注射が挙げられる。そのような免疫化動物の血清を最初の抗原に対する抗体反応性についてスクリーニングすることができる。リンパ節または脾臓細胞からリンパ球を分離し、CD138陰性およびCD19+細胞を選択することにより、B細胞をさらに選択する。B細胞培養(BCCs)を上述のように骨髄腫細胞に融合してハイブリドーマを生成させるか、またはさらに最初の抗原に対する反応性についてスクリーニングしてもよい。そのようなスクリーニングはELISAなどである。
トランスフェクションは、コード配列が実際に発現しているか否かにかかわりなく、宿主細胞による発現ベクターの取り込みを指す。例えば、CaPO4沈殿およびエレクトロポレーションのようなトランスフェクションの多くの方法が当業者に知られている。このベクターの作用の徴候が宿主細胞内で発生するときに、トランスフェクションの成功が一般的に認識される。
好ましい実施形態において、本発明の抗体は、次のCDR's(Kabat et al.、Sequence of Proteins of Immunological Interest、Fifth Edition、NIH Publication 91-3242、Bethesda MD(1991)、vols 1-3)により定義されている)、すなわち、(a)CDR1、(b)CDR2および(c)CDR3を含む抗ヒトMUC18モノクローナル抗体重鎖またはその断片を含む。本発明の一実施形態における抗体の重鎖は以下の配列を含む。すなわち、配列番号1、配列番号5、配列番号9、配列番号13、配列番号17、配列番号21、配列番号25、配列番号29、配列番号33または配列番号37。
他の実施形態において、本発明は、次のCDR'sすなわち、(a)CDR1、(b)CDR2および(c)CDR3を含む抗ヒトMUC18モノクローナル抗体軽鎖またはその断片を提供する。本発明の一実施形態における抗体の軽鎖は以下の配列を含む。すなわち、配列番号2、配列番号6、配列番号10、配列番号14、配列番号18、配列番号22、配列番号26、配列番号30、配列番号34または配列番号38。
一態様において、本発明は、c3.19.1およびc6.11.3のような抗MUC18抗体を含む。c3.19.1の重鎖アミノ酸およびヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号1および3によりコードされ、c6.11.3の重鎖アミノ酸およびヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号5および7によりコードされる。c3.19.1の軽鎖アミノ酸およびヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号2および4によりコードされ、c6.11.3の軽鎖アミノ酸およびヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号6および8によりコードされる。
2.所望の特性を有する抗体のスクリーニング
抗体を生成させる技術は上で述べた。所望の特定の生物学的特性を有する抗体をさらに選択することができる。
本発明の一実施形態において、黒色腫細胞を抗MUC18抗体機能の分析に用いた。黒色腫細胞が多くの源から得られ、転移性表現型に寄与する可能性がある様々な特性を有していた。それらの表現型を表1に示す。
Figure 2005514409
(a)MUC18抗原への結合
例えば、ヒトMUC18に対する高い親和力を有する抗MUC18抗体を特定するために、Biacore実験から抗MUC18抗体の速度的尺度と結合親和力を求めた。Biacore実験で標識MUC18抗原に対するプロテインA表面に捕捉された抗MUC18抗体の親和力を測定したが、詳細は以下の実施例でさらに述べる。6×10-10MのKdを有する抗MUC18抗体が高親和性抗MUC18抗体とみなされた。
さらなる例において、本発明の抗MUC18抗体がヒト黒色腫細胞における変性MUC18を認識することができるかどうかを検討するために、転移性黒色腫細胞および非転移性黒色腫細胞(対照)のイムノブロットに抗体を用いた。転移性黒色腫細胞を検出することができた抗体を対象とする抗MUC18抗体として選択した。
さらに、細胞表面上の天然形のMUC18タンパク質を認識する抗MUC18抗体を特定するために、フローサイトメトリーを実施した。この検定法に従って、対象とする抗原を発現する細胞を細胞培養プレートから分離し、イソ型合致対照ヒト抗体または抗MUC18抗体とともに4℃で20分間インキュベートした。洗浄後、すべての試料をヤギ抗ヒトIgG(H+L)(Jackson)のフィコエリトリン結合F(ab')2断片とともに暗所で4℃で20分間インキュベートした。数回洗浄した後、細胞をFACS緩衝液に再懸濁し、細胞蛍光測定法により分析した。対照抗体と比較して蛍光強度を変化させる抗体を対象とする抗MUC18抗体として選択した。
(b)腫瘍増殖の阻害
さらに、腫瘍増殖阻害性抗MUC18抗体を選択するために、抗体を、動物モデルにおける腫瘍の増殖を阻害するそれらの能力について、スクリーニングした。一実施形態において、えり抜きの腫瘍増殖阻害性抗体は、皮下で増殖させた場合、WM-2664腫瘍細胞の増殖を阻害することができた。皮下腫瘍の増殖に対する抗MUC18抗体投与の効果を評価するために、指数増殖期のWM-2664細胞を収集し、再懸濁し、雄BALB/cヌードマウスの側腹部に注射した。植込み後3日目から開始して、動物に0.1mgもしくは1mgの抗MUC18抗体または0.1mgの対照ヒト抗体を週1回投与した。腫瘍増殖を週1回モニターした。WM-2664腫瘍細胞の増殖をin vivoで阻害した抗体を腫瘍増殖阻害性抗体として選択した。
腫瘍増殖阻害性抗MUC18抗体を選択するために、抗体を培養腫瘍細胞の増殖を阻害する能力についてスクリーニングした。そのような抗体をスクリーニングするために、種々のレベルのMUC18を発現する細胞を抗MUC18の存在下で4〜5日間インキュベートした。実験中毎日、3つのウエル中の細胞数をジメチルチアゾールジフェニルテトラゾリウムブロミド(MTT)検定を用いて測定した。MTT中でのインキュベーション後、細胞を溶解した。代謝的生細胞によるMTTのホルマザンへの変換を570nmでモニターした。この検定では細胞増殖または生存に影響を及ぼす抗MUC18抗体の能力を測定した。
MUC18活性の阻害はin vivoでの黒色腫細胞の3次元増殖に対して重要なものであるが、細胞培養ではそうでないことはよく知られている(Satyamoorthy et al.、Oncogene、20、4676頁(2001))。黒色腫細胞のin vitroでの増殖に対する影響を有するかどうかを判断するために、本発明の抗MUC18抗体を試験した。種々のレベルのMUC18を発現する細胞を抗MUC18の存在下で4〜5日間インキュベートした。実験中毎日、3つずつのウエル中の細胞数をジメチルチアゾールジフェニルテトラゾリウムブロミド(MTT)検定を用いて測定した。MTTを含む培地中での2時間のインキュベーションの後に、培地を除去し、細胞を溶解した。代謝的生細胞によるMTTのホルマザンへの変換をモニターした。抗MUC18抗体(c3.19.1)は、当技術により支持されている特性である細胞増殖または生存に影響を及ぼさなかった。
(c)転移の阻害
転移阻害性抗MUC18抗体を選択するために、動物モデルにおける転移を阻害する能力について、抗体をスクリーニングした。一実施形態において、えり抜きの転移阻害性抗体は、黒色腫A375-SMおよびWM-2664細胞のin vivoでの肺転移巣の形成を阻害することができた。ヌードマウスに注射した黒色腫細胞の転移に対する抗MUC18抗体投与の効果を評価するために、指数増殖期のA375-SMおよびWM-2664細胞を収集し、再懸濁して、マウスの側尾静脈に注射した。マウスに抗MUC18抗体を3日目から開始して、その後週1回投与した。マウスを6〜8週後に屠殺した。ブアン液で固定し、染色した後、肺小結節を解剖顕微鏡により数えた。腫瘍細胞を注射した動物における肺転移を阻害した抗体を転移阻害性抗体として選択した。
より広範な実験において、指数増殖期のA375SM細胞を0日目に収集し、再懸濁して、雌ヌードマウスの側尾静脈に注射した。動物に腫瘍細胞の注射の1日前とその後週1回特定の用量の抗MUC18抗体を投与した。6週後にすべての動物を屠殺し、肺を摘出し、腫瘍結節を解剖顕微鏡により数えた。肺への黒色腫の転移を用量依存的に阻害した抗体を転移阻害性抗体として選択した。
(d)動物の生存の促進
転移性黒色腫腫瘍を有する動物の生存期間を延長させる抗体を選択するために、腫瘍を有するマウスの生存期間を延長させる能力について、抗体をスクリーニングした。指数増殖期のWM-2664ヒト黒色腫腫瘍細胞を収集し、適切な緩衝液に再懸濁し、雄BALB/cヌードマウスの側尾静脈に注射した。抗MUC18抗体または対照抗体をマウスにつき1mgまたは0.2mgで週1回腹腔内投与した後、マウスの生存を毎日モニターした。マウスの生存期間の用量依存的延長を示した抗体を生存延長性抗体として選択した。
(e)黒色腫細胞浸潤の阻害
黒色腫の転移は、MUC18の発現と密接に関連している。転移にしばしば関連する表現型の変化の1つは、細胞外マトリックスを通して移動し、浸潤する細胞の能力である。
細胞外マトリックスを通して浸潤し、移動するMUC18発現細胞の能力に影響を及ぼす抗体を選択するために、抗体を、Matrigel被覆膜を通して移動し、浸潤する細胞の能力を阻害するそれらの能力についてスクリーニングした。そのような抗体を特定するために、MUC18を発現する細胞をプレートに播種し、付着させた。増殖培地を除去し、対照抗体または抗MUC18抗体を含む新鮮な増殖培地で置換した。5日間の期間をおいた後、細胞をプレートから分離し、対照抗体または抗MUC18抗体を含む無血清培地中のMatrigel被覆膜の上室に入れた。インキュベーション期間の後に、上室に残存していた細胞をかきとって除去し、底のフィルタを染色した。次いで、マトリックスをスライドに載せ、膜を通して移動した細胞を数えた。細胞外マトリックスを消化し、反対側の化学誘引物質に向かって移動する黒色腫細胞の能力に対する阻害作用を示した抗体を浸潤阻害性抗体として選択した。
3.抗MUC18抗体の治療用組成物および投与方法
本発明の抗MUC18抗体の治療用製剤は、所望の純度を有する抗体を自由選択の生理的に許容できる担体、添加剤または安定剤(Remington:The Science and Practice of Pharmacy、19th Edition、Alfonso R.ed.、Mack Publishing Co.(Easton、PA、1995))と混合して、凍結乾燥ケーキまたは水溶液の形態で保存用に調製する。許容できる担体、添加剤または安定剤は、用いる用量および濃度で受容者に対して無毒性であり、リン酸、くえんさんおよび他の有機酸のような緩衝剤、アスコルビン酸などの抗酸化物質、低分子量(約10残基未満)ポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンのようなタンパク質、ポリビニルピロリドンのような親水性高分子、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリシンのようなアミノ酸、グルコース、マンノースまたはデキストリンなどの単糖、二糖および他の炭水化物、EDTAのようなキレート化剤、マンニトールまたはソルビトールのような糖アルコール、ナトリウムのような塩形成対イオン、および/またはTween、Pluronicsもしくはポリエチレングリコール(PEG)のような非イオン界面活性剤などである。
In vivo投与に用いる抗MUC18抗体は、無菌性でなければならない。これは、凍結乾燥または再構成の前または後に滅菌したろ過膜を通してのろ過により容易に達成される。抗MUC18抗体は、通常、凍結乾燥した形態または液剤として保存する。
治療用抗MUC18抗体組成物は、一般的に、無菌の取出し口を有する容器、例えば、皮下注射針で貫通可能な栓の付いた静脈内液剤用のバッグまたはバイアルに入れる。
抗MUC18抗体の投与経路は、既知の方法、例えば、静脈内、腹腔内、大脳内、皮下、筋肉内、大動脈内、動脈内、脳脊髄内、または病変内経路による注射または注入、あるいは下記のような徐放性システムによるものである。抗体は全身投与することが好ましい。
徐放性製剤の適切な例としては、成形物の形態の半透過性高分子マトリックス、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルなどがある。徐放性マトリックスは、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクリド(米国特許第3773919号、欧州特許第58481号)、L-グルタミン酸とγ-エチル-L-グルタミン酸との共重合体(Sidman et al.、Biopolymers、22、547〜556(1983))、ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリレート)(Langer et al.、J.Biomed.Mater.Res.、15、167〜277頁(1981)およびLanger、Chem.Tech.、12、98〜105(1982))、エチレン酢酸ビニル(Langer et al.、前出)またはポリ-D-(-)-3-ヒドロキシ酪酸(欧州特許第133988号)などである。徐放性抗MUC18抗体組成物は、リポソームにより封じ込まれた抗体も含む。抗体を含むリポソームは、本質的に既知の方法、すなわち、ドイツ特許第3218121号、Epstein et al.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、82、3688〜3692頁(1985年)、Hwang et al.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、77、4030〜4034頁(1980)、欧州特許第52322号、欧州特許第36676号、欧州特許第88046号、欧州特許第143949号、欧州特許第142641号、日本特許出願第83-118008号、米国特許第4485045号および第4544545号ならびに欧州特許第102324号により調製される。通常、リポソームは、脂質含量がコレステロールで約30モル%より大きい小さな(約200〜800Å)単膜型のものであり、選択される割合は最適抗体療法のために調整される。
抗MUC18抗体は、吸入によっても投与することができる。ジェット吸入器および超音波吸入器などの液体製剤用の市販の吸入器は、投与に有用である。液体製剤は、直接噴霧することができ、凍結乾燥粉末は、再構成後に噴霧することができる。あるいは、抗MUC18抗体は、過フッ化炭化水素製剤と定量噴霧器を用いてエアゾール化するか、または凍結乾燥し、粉砕した散剤として吸入させることができる。
治療に用いる抗MUC18抗体の「有効量」は、例えば、治療目的、投与経路、抗MUC18抗体の種類および患者の状態に依存する。したがって、最適な治療効果を得るために、療法士が必要に応じて用量を調節し、投与経路を変更することが必要であろう。一般的に、臨床医は、所望の効果を達成する用量に到達するまで抗MUC18抗体を投与するであろう。この治療の経過は、従来の検定により容易にモニターされる。
抗MUC18のような腫瘍抗原に特異的な抗体は、腫瘍細胞を破壊のための標的にする際に有用である。例えば、植物から得られる細胞毒素であるリシンは、特有な適用分野、特に、腫瘍および癌に対する闘いにおける適用分野を提供している。腫瘍の治療におけるリシンの使用に関する意味が発見されつつある。リシンは、正常細胞よりも癌性細胞に対して大きい親和力を有することが示唆され(Montfort et al.1987)、しばしば悪性腫瘍を標的にするための「魔法の弾丸」と呼ばれている。リシンのような毒素は、毒素のB鎖が除去されたとしても活性なままである。したがって、孤立性A鎖を抗MUC18抗体のような腫瘍特異抗体に結合させるならば、毒素は、正常細胞よりも癌性細胞に対して特異的親和性を有する(Taylorson 1996)。例えば、T細胞およびB細胞悪性腫瘍にしばしば認められるCD5 T細胞抗原に標的を定めるためのリシン免疫毒素が開発された(Kreitman et al.1998)。さらに、放射性同位体へのそのような抗MUC18抗体の結合は、腫瘍の治療に利益をもたらす。化学療法および他の形の癌療法と異なり、放射免疫療法または放射性同位体-抗体複合体の投与は癌細胞を直接標的とするもので、周囲の正常な健常組織に対する損傷は最小限である。この「魔法の弾丸」を用いることにより、患者は、今日利用可能な他の形の療法よりもはるかに少量の放射性同位体を用いて治療することができる。最も一般的には、腫瘍への送達のために抗体をマイタンシン、ゲルダナマイシンまたはカリカエマイシンのような強力な化学療法薬と結合させる(Frankel et al.、Cancer Biotherapy and Radiopharmaceuticals、15、459〜476頁(2000)、Knoll et al.、Cancer Res.、60、6089〜6094頁(2000)、Liu et al.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、93、8618〜8623頁(1996)、Mandler et al.、J.Natl.Cancer Inst.、92、1573〜1581頁(2000)、Ota et al.、Int.J.Clin.Oncol.、4、236〜240(1999))。これらの薬剤は、それら自体、投与するには毒性が強すぎる。MUC18のような治療用抗体と結合させるとき、それらの生物学的活性を腫瘍細胞に対して特異的に向けることができる。したがって、MUC18抗体のような抗体は、当技術分野でよく知られている技術を用いて免疫毒素として作用するように修飾することができる。例えば、Vitetta et al.、Immunol.Today、14、252頁(1993)および米国特許第5194594号を参照のこと。放射性標識抗体の調製に関しては、そのような修飾抗体も当技術分野でよく知られている技術を用いて容易に調製することができる。例えば、Junghans et al.、Cancer Chemotherapy and Biotherapy、655〜686頁(second edition、Chafner and Longo、eds.、Lippincott Raven(1996))ならびに米国特許第4681581号、第4735210号、第5101827号、5102990号、第5648471号および第5697901号を参照のこと。免疫毒素および放射性標識分子は、MUC18を発現する抗体および特に、本発明の抗体が有効である細胞を殺滅する可能性があると思われる。
本発明の抗MUC18抗体で治療すべき患者は、腫瘍、好ましくは黒色腫および/または前立腺もしくは腎臓癌を有する患者を含む。他の腫瘍としては、食道、膵臓、結腸直腸腫瘍、腎細胞癌(RCC)のような癌、子宮頚癌および子宮頚部上皮内扁平上皮および腺新形成、ならびに結腸直腸癌、乳癌、肺癌および他の悪性腫瘍のような癌などがある。患者は、腫瘍の進行から防護すべき健常組織が残ることがないような時点まで、本発明による治療の候補である。腫瘍の発生におけるできる限り早期に抗MUC18抗体を投与し、必要な期間治療を継続することが望ましい。
腫瘍に関連する障害の抗MUC18抗体による治療または予防において、抗体組成物は適正医療規範に合致した方法で処方し、用量を調節し、投与されるであろう。これに関連して考慮すべき因子としては、治療する特定の障害、治療する特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、抗体の送達部位、抗体の特定の種類、投与方法、投与計画および医療従事者に知られている他の因子などがある。投与する抗体の「治療上有効な量」は、そのような考慮すべき事項により支配され、慢性自己免疫状態の治療および移植受容者における免疫抑制維持を含む、障害を予防し、改善し、治療するために必要な最小限の量である。そのような量は、宿主に対して有毒な量、または宿主の感染に対する感受性を有意により高くする量よりも低いことが好ましい。
一般的な提案として、非経口投与する抗体の最初の薬理学的に有効な量は、1日当たり、患者の体重1kg当たり約0.1〜50mgの範囲であり、用いる抗体の一般的な最初の範囲は0.3〜20mg/kg/日、より好ましくは0.3〜15mg/kg/日である。所望の用量は、開業医が望む薬物動態学的減衰のパターンによって、抗体の1回ボーラス投与、多回ボーラス投与、または持続注入投与により送達することができる。
しかし、上記のように、これらの提案される抗体の量は、ほとんど治療上の判断に委ねられる。適切な用量の選択および投与計画における重要な因子は、上記のように得られる結果である。例えば、抗体を場合によって、標準または高用量化学療法および造血幹細胞移植のような腫瘍を予防または治療するために現在使用されている1つまたは複数の薬剤とともに処方してもよい。そのような他の薬剤の有効な量は、製剤中に存在する抗MUC181抗体の量、障害または治療の種類および上記の他の因子に依存する。これらは一般的に、上で用いたのと同じ用量および投与経路で、または以前に用いた用量の約1〜99%で用いられる。
本発明のさらなる詳細は、本発明の範囲をさらに規定する以下の実施例に見いだすことができる。すべての参考文献を本明細書を通して引用し、また参考文献はその時点に引用する。
MUC18抗原の調製
本試験では、組換えMUC18タンパク質を調製した。ヒトMUC18の細胞外ドメイン(ECD)(aa#1-559)を、公表されたNCBI配列(受入れ番号#NM_006500)に基づき、前進プライマーにEcoRI部位を、逆プライマーにNheI部位を組込んだプライマーを用いた逆転写酵素PCR(RT-PCR)によりSK-MEL-28細胞(ATCC HTB-72)からクローニングした。
MUC18のECDの増幅に用いたプライマーは、以下のとおりであった。前進プライマーは、5'-ATATTACGAATTCACTTGCGTCTCGCCCTCCGG-3'(配列番号10)であり、
逆プライマーは、5'-CAGCTTAGAGCTAGCCGGCTCTCCGGCTCCGGCA-3'(配列番号11)である。
MUC18 cDNAは、SK-MEL-28細胞(ATCC HTB-72)からのRNA(RNAzol、Tel Test、INC)から増幅した(Gene Amp XL PCR kit、Perkin Elmer)。V5-HISまたはHuIgG2融合タンパク質を構築するために、アミノ酸1〜559をコードする1700bpのPCR生成物をEcoRIおよびNheIで消化し、EcoRIおよびNheIで消化したCD147HuIgG2DHFRベクター(ABGX)、またはEcoRIおよびXbaIで消化したpcDNA3.1V5HISBベクター(Invitrogen)に連結させた。得られたプラスミドをCaPO4法により293細胞にトランスフェクトし、次いで、融合タンパク質を、収集したならし培地からプロテインAクロマトグラフィー(MUC18-HuIgG2)またはNi-NTAクロマトグラフィー(MUC18-V5HIS)により精製した。
MUC18 ECDは、公表されているNCBI配列と異なる4つのアミノ酸、すなわち、#383 D>G、#390 P>L、#424 K>Nおよび#425 L>Vを含んでいた。
抗MUC18抗体
A.抗体の生成
1.免疫化およびELISAによる収集のための動物の選択
XenoMouseマウス(XenoMouse G2、Abgenix,Inc.、Fremont、CA)を逐次的に免疫化することにより、MUC18に対するモノクローナル抗体を発生させた。最初の免疫化には、フロイントの完全アジュバント(CFA)と1:1の容積比で混合した5×106個のSK-MEL-28細胞を用いた。その後の追加抗原刺激は、フロイントの不完全アジュバント(IFA)と1:1の容積比で混合した5×106個のSK-MEL-28細胞を最初に用い、続いて、IFAと1:1の容積比で混合した5μgの可溶性MUC18-ヒトIgG2 Fc融合タンパク質を用い、次いで、アジュバントを含まない10μgの可溶性MUC18-ヒトIgG2 Fc融合タンパク質の最終追加抗原刺激により行った。詳細には、各マウスを尾の基部に、続いて、MUC18組換え抗原の腹腔内注射または後足底部注射により免疫化した後、多数の候補mAbsを生成させ、結合および活性について抗体をスクリーニングした。
マウスに最初にMUC18抗原を1〜5μg/マウスの濃度で注射した。各マウスを、各後足底部へのさらに6回(3〜4日間隔で)の可溶性抗原、具体的にはIFAと1:1の容積比で混合したDPBS中5μgの可溶性MUC18-ヒトIgG2 Fc融合タンパク質の注射と、次いで、アジュバントを含まないDPBS中10μgの可溶性MUC18-ヒトIgG2 Fc融合タンパク質の最終追加抗原刺激によりさらに免疫化した。動物は、0、4、7、10、14、17および20日目ならびに融合を実施した4日後の4日目に免疫化した。融合のために、マウスを安楽死させ、鼠径部および膝窩リンパ節を回収した。
組織粉砕機を用いたリンパ節の機械的破壊とその後のCD90陰性選択によるT細胞の枯渇により、免疫化したXenoMouseマウスからのリンパ球を放出させた。融合は、洗浄済み富化B細胞とATCCから購入した非分泌性骨髄腫P2X63Ag8.653細胞(カタログ番号CRL 1580)とを1:1の比率で混合して行った(Kearney et al.、J.Immunol.、123、1548〜1550頁(1979))。細胞混合物を800gの遠心分離に緩やかにかけた。上清を完全に除去した後、細胞を2〜4mLのプロナーゼ溶液(CalBiochem、カタログ番号53702、PBS中0.5mg/mL)で2分間以下処理した。3〜5mlのFBSを加えて、酵素活性を停止させ、懸濁液を電気的細胞融合用溶液、すなわちECFS(0.3Mショ糖[Sigma、カタログ番号S7903]、0.1mM酢酸マグネシウム[Sigma、カタログ番号M2545]、0.1mM酢酸カルシウム[Sigma、カタログ番号C4705])を用いて40mLの総容積に調整した。遠心分離の後に上清を除去し、細胞を40mLのECFSに再懸濁した。この洗浄段階を繰り返し、細胞を2×106細胞/mLの濃度にECFSに再懸濁した。電気的細胞融合を融合生成装置(model ECM2001、Genetronic,Inc.、San Diego、CA)を用いて行った。
融合の後、細胞を空気中10%CO2で37℃で培養するためにHATを含み、L-グルタミン、pen/strep、OPI(オキサロ酢酸、ピルビン酸、ウシインスリン)(すべてSigmaから入手)およびIL-6(Boehringer Mannheim)を添加したDMEM(JRH Biosciences)、15%FCSに再懸濁した。細胞をウエル当たり4×104細胞で平底96ウエル組織プレートで平板培養した。培養をHAT(ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジン)を添加した培地中で2週間維持した後、HT(ヒポキサンチンおよびチミジン)を添加した培地に移した。HAT培地中での生存によりハイブリドーマを選択し、ハイブリドーマを含むウエルの上清における抗原活性をELISAによりスクリーニングした。ELISA法は、抗原被覆プレート上での上清のインキュベーションと西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)標識マウス抗ヒトIgG2を用いるヒト抗MUC18結合の検出を必要とするものであった。
クローニングは、限界希釈平板培養を用いて選択した抗原陽性ウエルについて行った。プレートを単一コロニー増殖の存在について目視検査し、次いで、単一コロニーウエルの上清を上記の抗原特異的ELISAによりスクリーニングした。Luminex機器を用いた多重ELISAによりヒトγおよびκ鎖の純度を確認するために、高度に反応性のクローンを検定した。
検定結果に基づいて、以下のクローンが抗MUC18抗体として特定された。すなわち、c3.19.1、c6.11.3、c3.10、c3.22、c3.27、c3.45、c3.65、c6.1、c6.9、c6.2およびc6.12。c6.9とc.6.12は、別個に特定された同じクローンであった。本発明の抗体は、生殖系列VHおよびVK遺伝子との配列類似性について分析した。そのような分析を表2および図36に要約する。本発明のMUC18の重および軽鎖可変領域のアミノ酸配列をさらに、それぞれ生殖系列VHおよびVK配列と整列させた。これらの整列を図16〜17(c3.10)、図18〜19(C3.22)、図20〜21(C.3.27)、図22〜23(c3.45)、図24〜25(c3.65)、図26〜27(c6.1)、図28〜29(c6.12)、図30〜31(c6.2)、図32〜33(c6.9)および図34〜35(c6.11)に示す。c3.19.1は、さらなる特定のために選択した。
Figure 2005514409
B.MUC18抗体の特定
1.MUC18抗原に対する抗MUC18抗体の結合
(a)MUC18抗原に対する抗MUC18抗体の結合のイムノブロット分析
抗MUC18抗体が黒色腫細胞系で発現したMUC18を認識するかどうかを検討するために、黒色腫細胞系A375SM、SB2、TXM-13、WM-2664およびヌードマウス内皮細胞(NME)を10mLの完全増殖培地を入れた100mm組織培養プレート(Falcon)に播種した(1×106)。一夜インキュベートした後、プレートをPBSで2回洗浄し、プロテアーゼ阻害剤とDTTとのカクテルを含む400μlのトリトン溶解緩衝液中で削り落とした。遠心分離後、BioRad製キットを用いてタンパク質濃度を測定した。40μgのタンパク質を10% SDS-PAGE上に載せ、電気泳動により0.45μmニトロセルロース膜(Millipore)に移した。膜を抗MUC18抗体を含む緩衝液中で一夜インキュベートし、複合体化した第2抗体(抗ヒトIgG)と1時間反応させ、その後、製造業者のプロトコールに従ってECL(Amersham Corp)によりタンパク質を検出した。
抗MUC18抗体は転移性A375SM、TXM-13およびWM-2664細胞における高レベルのMUC18を検出し、非転移性細胞系SB-2および正常マウス内皮細胞(NME2)細胞における無シグナルはMUC18であった(図2)。この実験におけるNME2におけるシグナルの欠如の理由は、抗MUC18抗体がマウスMUC18タンパク質とおそらく交差反応しないことに起因すると思われる。
さらに、これらの結果は、MUC18発現と黒色腫細胞の転移能との間の正の相関に関する他の研究者らの所見(Shih et al.、Clinical Cancer Res.、2、569〜575頁(1996)、Johnson et al.、Cancer Metastasis Rev.、18、345〜357頁(1999)、Xie et al.、Oncogene、15(17)、2069〜75頁(1997)、Xie et al.、Cancer Res.、57、2295〜303頁(1997)、Schlagbauer-Wadl et al.、Int J Cancer、81(6)、951〜5頁(1999))の確証となるものである。
(b)MUC18に対する抗MUC18抗体の結合のフローサイトメトリー分析
抗MUC18抗体が細胞の表面上の天然形のMUC18タンパク質を認識するかどうかを検討するために、フローサイトメトリー分析を実施した。
A375-SMおよびWM-2664細胞(4×105)をPBS-EDTAを用いて分離し、FACS緩衝液(PBS、2% FBSおよび0.02%アジ化ナトリウム)中でイソ型一致対照ヒトIgG2抗体または抗MUC18抗体とともに4℃で20分間インキュベートした。FACS緩衝液で洗浄した後、すべての試料をヤギ抗ヒトIgG(H+L)(Jackson)のフィコエリトリン複合化F(ab')2断片とともに暗所で4℃で20分間インキュベートした。数回洗浄した後、細胞をFACS緩衝液に再懸濁し、細胞蛍光測定法により分析した。
図3に示すように、対照IgG2 Abの存在下(太線)でインキュベートしたとき、A375-SM細胞もWM-2664細胞も蛍光移動を示さなかった。しかし、抗MUC18の存在下(点線)でインキュベートしたとき、抗原の細胞表面発現を示す蛍光強度の強い移動が認められた。これらの結果は、抗MUC18抗体がヒト黒色腫細胞の表面上に発現した天然MUC18抗原を認識することができることを示している。
(c)抗MUC18抗体に対するMUC18の結合速度および親和力
HBS-P(ヘペス緩衝食塩水、0.005%ポリソルベート20)緩衝液を用いたすべての速度的測定にはBiacore 3000機器を用いた。測定は、3つのB1センサーチップ(低い量のカルボキシル化を伴うカルボキシメチルデキストラン)を用いて行った。実験は、1500〜3000RU(共鳴単位)のレベルでの標準アミン結合によりプロテインAをB1チップの4つのフローセルの表面に共有結合により固定化して実施した。MAb 3.19.1は、110〜250RUの捕捉レベルをもたらす、プロテインA表面への20〜30秒間にわたる60μL/分の流速の3.19.1の1μg/ml溶液の流動により捕捉した。対照プロテインA表面は、その上に捕捉されたMAbを有さなかった。0.5nM〜100nMの範囲の種々の濃度のMUC18-V5-His抗原を表面に100μL/分で2.5分間にわたり3回ずつ流し、続いて10分間の解離相をおいた。データを「Scrubber」、バージョン1.10により処理し、処理済みセンサーグラムを2分子1:1速度モデルを用いて「Clamp」、バージョン3.40により非線形に適合させた(表3)。
Figure 2005514409
Figure 2005514409
2.黒色腫腫瘍異種移植片の増殖に対する抗MUC18抗体の効果
皮下腫瘍の増殖に対する抗MUC18抗体(c3.19.1)の効果を評価するために、指数増殖期のWM-2664細胞を収集し、0.2mLのハンクスの平衡塩類溶液(HBSS)に再懸濁した。2.5×105個の細胞を雄BALB/cヌードマウスの側腹部に注射して腫瘍を形成させた。移植後3日目から開始して、動物に0.1mg(n=5)もしくは1.0mg(n=5)のc3.19.1または0.1mg(n=5)の対照IgG2(Jackson Laboratories)を週1回投与した。腫瘍の増殖を週1回モニターし、結果を平均値±SDとして表した(図4)。
図4に示した結果は、抗MUC18抗体がWM-2664細胞のin vivoでの皮下増殖を阻害することができることを示している。1週当たり0.1mgと低い濃度の抗MUC18抗体がこの腫瘍モデルにおいて有効であった。
3.黒色腫細胞のin vivoでの転移に対する抗MUC18抗体の効果
MUC18発現は黒色腫患者における転移性表現型と非常に密接に関連しているので、ヌードマウスの尾静脈に静脈内注射したときの肺転移巣の形成を阻害する抗MUC18抗体(c3.19.1)の能力を検討した。A375-SMおよびWM-2664黒色腫細胞を指数増殖期に収集し、ハンクスの平衡塩類溶液(HBSS)に再懸濁し、2.5×105個の生腫瘍細胞を側尾静脈に注射した。マウスに示した濃度の抗MUC18抗体(c3.19.1)を3日目に開始して、その後は週1回投与した。6〜8週後にマウスを屠殺した。ブアン液で固定し、染色した後、肺の小結節を解剖顕微鏡により数えた。
Figure 2005514409
表4に示すように、抗MUC18抗体(c3.19.1)の投与は、A375-SM腫瘍細胞を注射した動物における肺転移巣の数および発生率の有意な低下をもたらした。肺転移の阻害は、高および低用量投与群で認められた。肺転移巣の数が低下する傾向は、WM-2664細胞についても認められた。
これらのデータをさらに補強するために、より広範な実験を実施した。指数増殖期のA375-SM細胞を0日目に収集し、ハンクスの平衡塩類溶液(HBSS)に再懸濁し、4×105個の生腫瘍細胞をHarlan Laboratoriesから入手した雌ヌードマウスの側尾静脈に注射した。動物に腫瘍細胞注射の1日前とその後は週1回、示した用量の抗MUC18抗体を投与した。すべての動物を6週後に屠殺し、肺を摘出し、腫瘍結節を解剖顕微鏡により数えた。この実験の結果は、表5に示すが、抗MUC18抗体は肺腫瘍形成を用量依存的に阻害することを示している。肺転移巣の総数は、すべての投与動物で少なかった。マウス当たり1.0mgの用量の抗MUC18抗体(c3.19.1)を投与したマウスでは、腫瘍負荷は非常に低く、どの動物も50個を超える結節をそれらの肺に有していなかった。
Figure 2005514409
転移性黒色腫腫瘍を有するマウスの生存率を増加させる抗MUC18抗体(c3.19.1)の能力を評価するために、in vivoで1つの追加試験を実施した。指数増殖期のWM-2664ヒト黒色腫腫瘍細胞を収集し、PBSに再懸濁した。0日目に生腫瘍細胞(0.2mL PBS中106個)を雄BALB/cヌードマウスの側尾静脈に注射した。同じ日に、動物にPBS(n=21)、c3.19.1(n=12)またはイソ型一致対照IgG2抗体(n=12)をマウス当たり1mgまたは0.2mgを投与し、そしてその後は週1回投与した。マウスを毎日生存についてモニターした。腫瘍の転移の存在を確認するために各種群の死亡動物について剖検を実施した。データは、次のように計算した生存率(%)として表した。すなわち、100 - [100×(死亡したマウスの数/マウスの総数)]
図5に抗MUC18抗体(c3.19.1)の投与は転移性黒色腫腫瘍を有するマウスの生存を延長させることを示した。生存率の用量依存的な増加が認められ、現在までのところ、高用量の抗MUC18抗体を投与した群のどの動物も腫瘍負荷のために死亡していない。
4.in vitroでの黒色腫細胞浸潤に対する抗MUC18抗体の効果
黒色腫の転移は、MUC18の発現と密接に関連している。転移にしばしば関連する表現型の変化の1つは、細胞外マトリックスを通して移動し、浸潤する細胞の能力である。したがって、抗MUC18抗体を、Matrigel被覆膜を通して移動し、浸潤するMUC18発現細胞の能力に影響を及ぼすそれらの能力について試験した。5×103個の細胞を6ウエルプレートに播種し、24時間にわたり付着させた。この時点に培地を除去し、非特異的IgG、抗MUC18抗体を含む、または無添加の新鮮な増殖培地で置換した。5日後に、トリプシン-EDTAを用いてプレートから細胞を分離し、数えた。5×104個の細胞を100μg/mLの抗MUC18抗体(c3.19.1)または非特異的IgGを含む無血清培地あるいは無血清培地単独中でMatrigel被覆膜の上室に入れた。37℃で22時間のインキュベーションの後に、上室に残存していた細胞をかきとって除去し、底のフィルタを製造業者の指示に従ってDiff-Quikで染色した。マトリックスをスライド上に載せ、膜を通して移動した細胞を数えた。
表6に示すデータは、抗MUC18抗体(c3.19.1)への転移性黒色腫細胞の曝露は、細胞外マトリックスを消化し、反対側に置いた化学誘引物質に向かって移動するそれらの能力を阻害したことを示している。
Figure 2005514409
黒色腫腫瘍の進行におけるMUC18の役割とこの標的に対する抗MUC18抗体(c3.19.1)の作用機序は完全には理解されていない。抗MUC18抗体は、細胞培養における黒色腫腫瘍細胞の増殖を阻害しないが、皮下および転移性腫瘍細胞のin vivoでの増殖を阻害する。蓄積証拠は、MUC18が、おそらくMMP-2活性化または細胞移動に影響を及ぼすことにより、転移過程における1つまたは複数の段階において役割を果たしていることを示している。合わせて考えると、これらのデータは、抗MUC18抗体がこれらの疾患を有する患者におけるヒト黒色腫細胞の増殖および転移を阻害するための有望な治療用抗体であるという証拠を提供している。
抗体複合体
抗MUC18のような抗原に特異的な抗体は、そのような抗原を発現する腫瘍細胞に除去のために標的を定めるうえで有用である。
A.リシンに対する抗MUC18抗体の結合
細胞毒素であるリシンは、特に、腫瘍および癌との闘いにおける特有の適用分野を見いだしている。腫瘍の治療におけるリシンの使用に関する意味が発見されつつある。リシンは、正常細胞よりも癌性細胞に対して大きい親和力を有することが示唆され(Montfort et al.1987)、しばしば悪性腫瘍を標的にするための「魔法の弾丸」と呼ばれている。リシンのような毒素は、有毒な副作用につながる毒素の非特異的なレクチン活性を担っているB鎖が除去されたとしても活性なままである。したがって、孤立性A鎖を腫瘍特異抗体に結合させるならば、毒素は、正常細胞よりも癌性細胞に対して特異的親和性を有する(Taylorson 1996)。例えば、T細胞およびB細胞悪性腫瘍にしばしば認められるCD5 T細胞抗原に標的を定めるためのリシン免疫毒素が開発された(Kreitman et al.1998)。
丸ごとの完全なリシンをモノクローナル抗体に結合させる新規の方法は、Pietersz et al.(Cancer Res、48(16)、4469〜76頁(1998))に記載されており、リシンB鎖の非特異的結合の遮断を含む。本発明の抗MUC18抗体へのリシンの結合は、抗体に対する二官能性試薬S-アセチルメルカプトコハク酸無水物およびリシンに対するコハク酸イミジル3-(2-ピリジルジチオ)プロピオン酸を用いて行うことができる。結合は、A鎖の毒性能力も抗体の活性も損なうことなく、B鎖の結合活性の消失をもたらすはずである。この方法で生成させた全リシン-抗体複合体は、標的細胞に非特異的に結合せず、最も重要な意味は、そのような免疫毒素はより強力であるので、リシンA鎖複合体はin vivoで用いることができることである。
B.放射性同位体との結合
そのような抗MUC18抗体の放射性同位体への結合は、腫瘍の治療に利益をもたらす。化学療法および他の形の癌療法と異なり、放射免疫療法または放射性同位体-抗体複合体の投与は癌細胞を直接標的とするもので、周囲の正常な健常組織に対する損傷は最小限である。この「魔法の弾丸」を用いることにより、患者は、今日利用可能な他の形の療法よりもはるかに少量の放射性同位体を用いて治療することができる。好ましい放射性同位体としては、イットリウム90(90Y)、インジウム111(111In)、131I、99mTc、放射性銀-111、放射性銀-199およびビスマス213などがある。
抗体への放射性同位体の結合は、従来の二官能性キレート化剤を用いて行うことができる。銀は1価であるので、放射性銀-111および放射性銀-199結合のために、硫黄を主成分とするリンカーを用いることができる(Hazra et al.、Cell Biophys、24-25、1〜7頁(1994)。銀放射性同位体の結合は、アスコルビン酸による免疫グロブリンの還元を必要とすることがある。他の態様において、チウキセタンはイブリツモマブに結合して、イブリツモマブチウキセタン(Zevatin)を生成するMX-DTPAリンカーキレート化剤である(Witzig T.E.、Cancer Chemother Pharmacol、48 Suppl 1、S91〜5頁(2001)。イブリツモマブチウキセタンは、インジウム111(111In)または90Yのような放射性同位体と反応して、それぞれ111In-イブリツモマブチウキセタンおよび90Y-イブリツモマブチウキセタンを生成する。
C.有毒な化学療法薬への抗MUC18抗体の結合
最も一般的には、癌を治療するための抗体をマイタンシン、ゲルダナマイシンまたはカリカエマイシンのような有毒な化学療法薬と結合させる。酸性または還元条件下で、あるいは特異的なプロテアーゼへの曝露により薬剤を放出する種々のリンカーをこの技術により用いる。
抗MUC18抗体および抗体複合体の使用
A.抗MUC18抗体によるヒトの治療
腫瘍を有するヒト患者における抗MUC18抗体治療のin vivo効果を検討するために、そのようなヒト患者に有効な量の抗MUC18抗体を特定の時間にわたり注入する。治療中の定期的な時点に、腫瘍が進行するかどうか、特に、腫瘍が増殖し、転移するかどうかを検討するためにヒト患者をモニターする。
抗MUC18抗体を投与した腫瘍患者は、対照抗体を投与した腫瘍患者における腫瘍の増殖と腫瘍の転移のレベルと比較して低いレベルの腫瘍増殖および転移を有している。用いることができる対照抗体は、試験する抗MUC18抗体と同じイソ型の抗体を含み、さらに、MUC18腫瘍抗原に結合する能力を有さなくてよい。
B.抗MUC18抗体複合体による治療
抗MUC18抗体複合体のin vivo効果を検討するために、腫瘍を示すヒト患者または動物に有効な量の抗MUC18抗体複合体を特定の時間にわたり注入する。一実施形態において、投与した抗MUC18抗体複合体は、マイタンシン-抗MUC18抗体複合体または放射性同位体-抗MUC18抗体複合体である。治療中の定期的な時点に、腫瘍が進行するかどうか、特に、腫瘍が増殖し、転移するかどうかを検討するためにヒト患者または動物をモニターする。
腫瘍を示し、マイタンシン-抗MUC18抗体複合体または放射性同位体-抗MUC18抗体複合体による治療を受けたヒト患者または動物は、腫瘍を示し、対照マイタンシン抗体または対照放射性同位体抗体のような対照抗体複合体による治療を受けたヒト患者または動物と比較して、低いレベルの腫瘍の増殖および転移を有する。用いることができる対照のマイタンシン抗体は、抗MUC18抗体の同じイソ型の抗体、より具体的には、MUC18腫瘍抗原に結合する能力を有さない抗体に結合されているマイタンシンを含む複合体などである。用いることができる対照放射性同位体抗体は、抗MUC18抗体の同じイソ型の抗体、より具体的にはMUC18腫瘍抗原に結合する能力を有さない抗体に結合されている放射性同位体を含む複合体などである。
前記の明細書は、当業者が本発明を実施することを可能にするに十分なものであると考えられる。寄託された実施形態は本発明の特定の態様の単一の実例とすることを意図するものでなく、機能的に同等である構成物は本発明の範囲内にあるので、本発明は寄託された構成物により範囲を限定されるものではない。本明細書における資料の寄託は、本明細書に含まれる書面による説明が最良の態様を含む本発明の態様の実施を可能にするのに不十分であるという容認を構成せず、また、それが示す特定の実例に特許請求の範囲を限定すると解釈すべきではない。
MUC18ならびに黒色腫腫瘍進行に関与する他の癌遺伝子および増殖因子の発現パターンを示す図である。 抗MUC18抗体に関するイムノブロット分析ならびにMUC18発現とヒト黒色腫細胞の転移能との間の正の相関を示す図である。ヒト転移性黒色腫細胞系(A375SM、TXM-13およびWM2664)、非転移性細胞系SB-2および正常マウス内皮(NMEs)細胞におけるMUC18の発現を示す。 対照IgG2 Abの存在下(太い線)でインキュベートしたとき、A375-SM細胞が蛍光移動を示さないことを示す線グラフである。しかし、抗MUC18の存在下(点線)でインキュベートしたとき、抗原の細胞表面発現を示す蛍光強度の強い移動が認められた。 対照IgG2 Abの存在下(太い線)でインキュベートしたとき、WM-2664細胞が蛍光移動を示さないことを示す線グラフである。しかし、抗MUC18の存在下(点線)でインキュベートしたとき、抗原の細胞表面発現を示す蛍光強度の強い移動が認められた。 抗MUC18抗体c3.19.1がin vivoでWM-2264腫瘍細胞の皮下増殖を阻害することを示す図である。 抗MUC18抗体c3.19.1の投与が転移性黒色腫腫瘍を有するWM-2664マウスの生存期間を延長することを示す図である。 抗MUC18抗体c3.19.1の重(配列番号1)および軽鎖(配列番号2)の可変領域のアミノ酸配列ならびに重(配列番号3)および軽(配列番号4)鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を示す図である。 抗MUC18抗体c6.11.3の重(配列番号5)および軽鎖(配列番号6)の可変領域のアミノ酸配列ならびに重(配列番号7)および軽(配列番号8)鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を示す図である。 抗MUC18抗体c3.10の重(配列番号9)および軽鎖(配列番号10)の可変領域のアミノ酸配列ならびに重(配列番号11)および軽(配列番号12)鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を示す図である。 抗MUC18抗体c3.22の重(配列番号13)および軽鎖(配列番号14)の可変領域のアミノ酸配列ならびに重(配列番号15)および軽(配列番号16)鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を示す図である。 抗MUC18抗体c3.27の重(配列番号17)および軽鎖(配列番号18)の可変領域のアミノ酸配列ならびに重(配列番号19)および軽(配列番号20)鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を示す図である。 抗MUC18抗体c3.45の重(配列番号21)および軽鎖(配列番号22)の可変領域のアミノ酸配列ならびに重(配列番号23)および軽(配列番号24)鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を示す図である。 抗MUC18抗体c3.65の重(配列番号25)および軽鎖(配列番号26)の可変領域のアミノ酸配列ならびに重(配列番号27)および軽(配列番号28)鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を示す図である。 抗MUC18抗体c6.1の重(配列番号29)および軽鎖(配列番号30)の可変領域のアミノ酸配列ならびに重(配列番号31)および軽(配列番号32)鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を示す図である。 抗MUC18抗体c6.9(c6.12としても独立にクローン化)の重(配列番号33)および軽鎖(配列番号34)の可変領域のアミノ酸配列ならびに重(配列番号35)および軽(配列番号36)鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を示す図である。 抗MUC18抗体c6.2の重(配列番号37)および軽鎖(配列番号38)の可変領域のアミノ酸配列ならびに重(配列番号39)および軽(配列番号40)鎖の可変領域をコードするヌクレオチド配列を示す図である。 抗MUC18抗体c3.10(配列番号9)の重鎖の可変領域のアミノ酸配列と用いた生殖系列VH遺伝子のV4-59領域(配列番号41)をコードするアミノ酸配列との整列を示す図である。共通配列(配列番号42)は下の整列を示す。 抗MUC18抗体c3.10の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列(配列番号10)と用いた生殖系列VK遺伝子のO2領域をコードするアミノ酸配列(配列番号43)との整列を示す図である。共通配列(配列番号44)は下の整列を示す。 抗MUC18抗体c3.22の重鎖の可変領域のアミノ酸配列(配列番号13)と用いた生殖系列VH遺伝子のV4-31領域をコードするアミノ酸配列(配列番号45)との整列を示す図である。共通配列(配列番号46)は下の整列を示す。 抗MUC18抗体c3.22の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列(配列番号14)と用いた生殖系列VK遺伝子のA-30領域をコードするアミノ酸配列(配列番号47)との整列を示す図である。共通配列(配列番号48)は下の整列を示す。 抗MUC18抗体c3.27の重鎖の可変領域のアミノ酸配列(配列番号17)と用いた生殖系列VH遺伝子のV4-59領域をコードするアミノ酸配列(配列番号49)との整列を示す図である。共通配列(配列番号50)は下の整列を示す。 抗MUC18抗体c3.27の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列(配列番号18)と用いた生殖系列VK遺伝子のA30領域をコードするアミノ酸配列(配列番号51)との整列を示す図である。共通配列(配列番号52)は下の整列を示す。 抗MUC18抗体c3.45の重鎖の可変領域のアミノ酸配列(配列番号21)と用いた生殖系列VH遺伝子のV1-18領域をコードするアミノ酸配列(配列番号53)との整列を示す図である。共通配列(配列番号54)は下の整列を示す。 抗MUC18抗体c3.45の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列(配列番号22)と用いた生殖系列VK遺伝子のB3領域をコードするアミノ酸配列(配列番号55)との整列を示す図である。共通配列(配列番号56)は下の整列を示す。 抗MUC18抗体c3.65の重鎖の可変領域のアミノ酸配列(配列番号25)と用いた生殖系列VH遺伝子の4-31領域をコードするアミノ酸配列(配列番号57)との整列を示す図である。共通配列(配列番号58)は下の整列を示す。 抗MUC18抗体c3.65の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列(配列番号26)と用いた生殖系列VK遺伝子のO8領域をコードするアミノ酸配列(配列番号59)との整列を示す図である。共通配列(配列番号60)は下の整列を示す。 抗MUC18抗体c6.1の重鎖の可変領域のアミノ酸配列(配列番号29)と用いた生殖系列VH遺伝子のV3-30領域をコードするアミノ酸配列(配列番号61)との整列を示す図である。共通配列(配列番号62)は下の整列を示す。 抗MUC18抗体c6.1の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列(配列番号30)と用いた生殖系列VK遺伝子のA20領域をコードするアミノ酸配列(配列番号63)との整列を示す図である。共通配列(配列番号64)は下の整列を示す。 抗MUC18抗体c6.12の重鎖の可変領域のアミノ酸配列と用いた生殖系列VH遺伝子のV4-31領域をコードするアミノ酸配列(配列番号65)との整列を示す図である。共通配列(配列番号66)は下の整列を示す。 抗MUC18抗体c6.12の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列と用いた生殖系列VK遺伝子のL2領域をコードするアミノ酸配列(配列番号67)との整列を示す図である。共通配列(配列番号68)は下の整列を示す。 抗MUC18抗体c6.2の重鎖の可変領域のアミノ酸配列(配列番号37)と用いた生殖系列VH遺伝子のV4-59領域をコードするアミノ酸配列(配列番号69)との整列を示す図である。共通配列(配列番号70)は下の整列を示す。 抗MUC18抗体c6.2の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列(配列番号38)と用いた生殖系列VK遺伝子のA19領域をコードするアミノ酸配列(配列番号71)との整列を示す図である。共通配列(配列番号72)は下の整列を示す。 抗MUC18抗体c6.9の重鎖の可変領域のアミノ酸配列(配列番号33)と用いた生殖系列VH遺伝子のV4-31領域をコードするアミノ酸配列(配列番号73)との整列を示す図である。共通配列(配列番号74)は下の整列を示す。 抗MUC18抗体c6.9の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列(配列番号34)と用いた生殖系列VK遺伝子のL2領域をコードするアミノ酸配列(配列番号75)との整列を示す図である。共通配列(配列番号76)は下の整列を示す。 抗MUC18抗体c6.11.3の重鎖の可変領域のアミノ酸配列(配列番号5)と用いた生殖系列VH遺伝子のV4-31領域をコードするアミノ酸配列(配列番号77)との整列を示す図である。共通配列(配列番号78)は下の整列を示す。 抗MUC18抗体c6.11.3の軽鎖の可変領域のアミノ酸配列(配列番号6)と用いた生殖系列VK遺伝子のL2領域をコードするアミノ酸配列(配列番号79)との整列を示す図である。共通配列(配列番号80)は下の整列を示す。 本発明で同定されたMUC18抗体のV、D、Jおよび得られるN組換え領域を含む配列の要約を示す図である。

Claims (19)

  1. 腫瘍の治療を必要とする動物を選択する段階と、
    配列番号1、5、9、13、17、21、25、29、33および37からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖アミノ酸を含み、MUC18に結合するモノクローナル抗体を用意する段階と、
    前記細胞の増殖の阻害をもたらす、前記腫瘍を有効な量の前記抗体と接触させる段階とを含む動物における腫瘍の増殖を阻害する方法。
  2. 前記抗体が完全にヒト抗体である請求項1に記載の方法。
  3. 前記抗体がさらに、配列番号2、6、10、14、18、22、26、30、34および38からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖アミノ酸を含む請求項1に記載の方法。
  4. 前記抗体が治療薬または細胞毒性物質に結合している請求項1に記載の方法。
  5. 細胞毒性物質がリシンである請求項4に記載の方法。
  6. さらなる治療薬が放射性同位体である請求項4に記載の方法。
  7. 前記腫瘍が黒色腫である請求項1に記載の方法。
  8. 前記腫瘍が肺腫瘍である請求項1に記載の方法。
  9. 腫瘍増殖が腫瘍転移である請求項1に記載の方法。
  10. 黒色腫の治療を必要とする動物を選択する段階と、
    配列番号1、5、9、13、17、21、25、29、33および37からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖アミノ酸を含み、MUC18に結合するモノクローナル抗体を用意する段階と、
    細胞浸潤を阻害するために、前記黒色腫を有効な量の前記抗体と接触させる段階とを含む前記黒色腫に伴う細胞浸潤を阻害する方法。
  11. 前記抗体が完全にヒト抗体である請求項10に記載の方法。
  12. 前記抗体が治療薬または細胞毒性物質に結合している請求項10に記載の方法。
  13. 細胞毒性物質がリシンである請求項12に記載の方法。
  14. さらなる治療薬が放射性同位体である請求項12に記載の方法。
  15. 転移性腫瘍の治療を必要とする動物を選択する段階と、
    配列番号1、5、9、13、17、21、25、29、33および37からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖アミノ酸を含み、MUC18に結合するモノクローナル抗体を用意する段階と、
    前記腫瘍の転移を阻害し、前記動物の生存を延ばすために、前記動物を有効な量の前記抗体と接触させる段階と
    を含む転移性腫瘍を有する動物の生存を延ばす方法。
  16. 前記抗体が完全にヒト抗体である請求項15に記載の方法。
  17. 前記抗体が治療薬または細胞毒性物質に結合している請求項15に記載の方法。
  18. 細胞毒性物質がリシンである請求項17に記載の方法。
  19. さらなる治療薬が放射性同位体である請求項17に記載の方法。

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