KR102846903B1 - 단일 도메인 결합 단백질을 생산하는 비-인간 동물 - Google Patents
단일 도메인 결합 단백질을 생산하는 비-인간 동물Info
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Abstract
유전학적으로 변형된 비-인간 동물 및 이를 생산하고 사용하기 위한 방법 및 조성물이 제공되고, 상기 유전학적 변형은 (a) 중쇄 불변 영역 유전자 서열이 면역글로불린 불변 영역 CH1 유전자에서 결실(임의로 힌지 영역에서 결실)되고 (b) 하나 또는 모든 내인성 VH, DH 및 JH 유전자 분절이, 재조합하여 CH1 유전자에서 결실 및/또는 유전학적으로 가공된 단일의 재배열된 경쇄의 삽입을 포함하는 중쇄 불변 영역 유전자 서열에 작동적으로 연결된 재배열된 경쇄 가변 영역(VL/JL) 뉴클레오타이드 서열을 형성할 수 있는 적어도 하나의 재배열되지 않은 경쇄 가변(VL) 유전자 분절 및 적어도 하나의 재배열되지 않은 경쇄 연결(JL) 유전자 분절로 대체됨을 포함하고, 상기 마우스는 기능성 IgM, 단일 도메인 항원 결합 단백질, 예를 들어, VL 단일 도메인 결합 단백질 및 유전학적으로 가공된 재배열된 경쇄를 발현할 수 있다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 35 U.S.C. § 119(e) 하에 2014년 3월 21일자로 출원된 미국 가출원 번호 제61/968,986호 및 2014년 3월 21일자로 출원된 미국 가출원 번호 제61/968,905호의 우선권을 주장하고, 상기 출원 둘 다 본원에 참조로 인용된다.
기술 분야
본원에서는 면역글로불린 중쇄 유전자좌에서 높은 다양성을 나타내고 면역글로불린 경쇄 유전자좌에서는 바람직하게 매우 낮은 다양성을 나타내어 항원에 결합하는, VH-단일 도메인 결합 단백질 및 VL 단일 도메인 결합 단백질을 포함하는 단일 도메인 항원 결합 단백질을 선택 가능하게 하는 비-인간 동물이 제공된다.
대부분의 동물에서, 정상 면역글로불린 중쇄는 이들의 동족 경쇄와 커플링되는 경우에만 잘 발현된다. 인간에서, 단독의 중쇄는 가변 중쇄, CH1, 또는 가변 중쇄 및 CH1 도메인의 서열이 없는 기능부전 중쇄에 의해 나타나는 중쇄 질환에서 발견된다. 경쇄가 없는 중쇄는 어류 및 낙타의 특정 종에서 접하게 된다. 상기 중쇄는 기능성 CH1 도메인이 없고 이들의 중쇄 가변 도메인에 비-인간 특징을 갖는다. 부분적으로 IgM 및 IgG CH1 도메인을 제거함에 의해 낙타 또는 특정 종의 어류에서 발견되는 VHH 도메인과 유사한 낙타화된 유전자를 발현하게 마우스를 변형시키고 중쇄 가변 영역이 낙타 및/또는 특정 종의 어류의 영역과 유사한지를 확인함에 의해 낙타화된 항체를 생산하기 위한 시도가 있어왔다. 불행하게도, 낙타화된 항체는 비-낙타과 동물에서 면역 반응을 유도할 것으로 예상된다. 불활성화된 CH1 도메인을 포함하게 유전학적으로 변형된 비-인간 동물의 이전 버젼을 사용한 또 다른 과제는 통상적인 항체에 비해 감소된 발현 수준의 항원 특이적 단일 도메인 항원 결합 단백질이다. 상기 감소는 중쇄 가변 영역이 VL 도메인의 부재를 보충하게 하는 비-낙타과 중쇄 가변 영역에 가용한 메카니즘의 부재 때문일 수 있다. 예를 들어, 중쇄만 결합하는 단백질에서 발견되는 낙타과 VHH 도메인은 평균적으로 비-낙타과 항체에서 발견되는 것들 보다 더 긴 CDRH3을 포함하고 이는 전체 항원 친화성 및 특이성에 대한 주요 영향인 것으로 고려되고 낙타과 중쇄만의 항체에서 VL 도메인의 부재를 보충하는 것으로 사료된다.
따라서, 당업계에서는 비-낙타과 VH 도메인을 갖는 다양한 단일 도메인 결합 단백질을 생산하는 유전학적으로 변형된 비-인간 동물이 필요하다.
요약
본원에 기재된 바와 같은 경쇄 가변 영역 및 중쇄 불변 영역을 포함하는 면역글로불린 폴리펩타이드는 비-인간 동물에 의해 발현될 수 있고 VL-단일 도메인 항원 결합 단백질, 예를 들어, 중쇄 불변 도메인에 작동적으로 연결된 경쇄 가변 도메인을 포함하는 단일 도메인 항원 결합 단백질을 형성하고, 상기 중쇄 불변 도메인(들)은, 예를 들어, IgG, IgA, IgE, IgD, 또는 이의 조합체로부터 선택되는 면역글로불린 중쇄 불변 영역의 기능성 CH1 도메인이 없다. 상기 VL-단일 도메인 항원 결합 단백질은 기능성 CH1 도메인이 부재인 중쇄 불변 도메인에 작동적으로 연결된 중쇄 가변 도메인을 포함하는 VH 단일 도메인 항원 결합 단백질과 비교하여 증가된 안정성을 나타낼 수 있다. 따라서, 본원에서는 경쇄 가변 도메인 및 중쇄 불변 영역을 포함하는 VL-단일 도메인 항원 결합 단백질을 발현할 수 있는 비-인간 동물(상기 중쇄 불변 영역은 기능성 CH1 도메인이 부재이고, 또한 임의로 기능성 힌지 영역이 부재일 수 있다) 및 VL-단일 도메인 항원 결합 단백질을 발현하는 비-인간 동물을 생산하고 사용하는 방법이 제공된다. 또한, 본원에서는 VL-단일 도메인 항원 결합 단백질을 발현하는 비-인간 동물로부터 유래된 세포, 단백질 및 핵산, 및 상기 단리된 세포, 단백질 및 핵산의 용도가 제공된다.
본원에 기재된 것은 단일 도메인 항원 결합 단백질, 예를 들어, VL- 또는 VH-단일 도메인 항원 결합 단백질을 생산할 수 있는 비-인간 동물에 의한 단일 재배열된 경쇄의 발현이 단일 재배열된 경쇄를 발현하지 않는, 단일 도메인 항원 결합 단백질을 생산할 수 있는 유사한 비-인간 동물과 비교하여 항원 유발반응에 응답하여 항원 특이적 단일 도메인 항원 결합 단백질의 역가를 증가시킨다는 것이다. 도 5. 상기 데이터는 비-인간 동물에 의한 단일 재배열된 경쇄의 존재가 항원-특이적 단일 도메인 항원 결합 단백질을 생성할 가능성을 증가시킴을 시사한다. 따라서, 본원에서는 단일 도메인 항원 결합 단백질(예를 들어, VH- 및/또는 VL-단일 도메인 항원 결합 단백질) 및 단일 재배열된 경쇄를 발현할 수 있는 비-인간 동물 및 VL-단일 도메인 항원 결합 단백질을 발현하는 비-인간 동물을 생산하고 사용하는 방법이 제공된다. 또한, 본원에서는 단일 도메인 항원 결합 단백질 및 단일 재배열된 경쇄를 발현하는 비-인간 동물로부터 유래된 세포, 단백질 및 핵산 및 상기 단리된 세포, 단백질 및 핵산의 용도가 제공된다.
또한 본원에서는 VL-단일 도메인 항원 결합 단백질 및 단일 재배열된 경쇄를 포함하는 비-인간 동물, 고역가의 단일 도메인 항원 결합 단백질을 생산할 수 있는 비-인간 동물을 생산하고/하거나 상기 결합 단백질을 생산할 수 있는 비-인간 동물에 의해 단일 도메인 결합 단백질의 생산을 증가시킬 수 있는 방법, 상기 비-인간 동물을 사용하여 항원-특이적 단일 도메인 항원 결합 단백질을 생산하는 방법 및 상기와 같이 생산된 단일 도메인 항원 결합 단백질이 제공된다.
유전학적으로 변형된 세포, 비-인간 배아, 비-인간 동물 및 이들을 생산하고 사용하기 위한 방법 및 조성물이 제공되고, 상기 동물은 유전학적으로 변형되어 단일 도메인 항원 결합 단백질, 예를 들어, 기능성 CH1 서열이 부재이고 또한 임의로 기능성 힌지 영역 서열이 부재인 중쇄 불변 영역을 포함하는 결합 단백질을 생산하고, 상기 동물은 추가로 유전학적으로 변형되어 VL-단일 도메인 항원 결합 단백질(예를 들어, CH1 도메인 암호화 서열을 불활성화시키거나 결실하게 변형된 중쇄 불변 영역 핵산 서열에 작동적으로 연결된 재배열된 경쇄 가변 영역 뉴클레오타이드 서열로부터 암호화된) 및/또는 단일 재배열된 경쇄(예를 들어, 동물의 생식선에서 경쇄 불변 영역에 작동적으로 연결된 단일 재배열된 VL:JL 서열로부터 암호화된)로서 단일 도메인 항원 결합 단백질을 발현한다.
본원에 기재된 바와 같은 동물은, 하나의 측면에서, 예를 들어, IgG1 이소형과 같은 IgG 이소형을 포함하는 단일 도메인 결합 단백질을 생산할 수 있다. 일부 구현예에서, 단일 도메인 항원 결합 단백질은 VH-단일 도메인 항원 결합 단백질이고, 예를 들어, 기능성 CH1이 부재인 중쇄 불변 영역에 작동적으로 연결된 중쇄 가변 영역을 포함한다. 다른 구현예에서, 단일 도메인 항원 결합 단백질은 VL-단일 도메인 항원 결합 단백질이고, 예를 들어, 기능성 CH1이 부재인 중쇄 불변 영역, 예를 들어, 힌지, CH2, CH3, CH4, 또는 이의 조합체를 포함하는 중쇄 불변 영역에 작동적으로 연결된 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
따라서, 일부 측면에서, 본원에 기재된 바와 같은 단일 도메인 항원 결합 단백질은 중쇄 불변 영역(예를 들어, CH1, 힌지, CH2, CH3, CH4 및 이의 조합체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 중쇄 불변 영역 도메인)에 작동적으로 연결된, 하나 이상의 재배열되지 않은 면역글로불린 경쇄 V 분절 및 하나 이상의 재배열되지 않은 면역글로불린 경쇄 J 분절로부터 유래된 핵산 서열에 의해 암호화되어 있고, 상기 중쇄 불변 영역은 CH1 영역 서열내 결실 또는 불활성화 돌연변이를 포함한다. 하나의 구현예에서, 재배열되지 않은 경쇄 V 및 J 분절은 내인성 비-인간 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 하나 이상의, 실질적으로 모든 또는 모든 기능적 내인성 비-인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자 분절을 대체한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 CH1 영역 서열에서 결실 또는 불활성화 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역에 작동적으로 연결된 경쇄 가변 영역 유전자 분절을 포함하게 변형된 중쇄 유전자좌는 비-인간 동물의 생식선에서 발견될 수 있다. 상기 변형된 유전자좌는 내인성 중쇄 유전자좌에 있거나 상기 내인성 중쇄 유전자좌 이외의 다른 유전자좌에서 전이유전자(예를 들어, 게놈내 무작위 위치에 삽입)에 존재할 수 있다.
하나의 측면에서, VL-단일 도메인 항원 결합 단백질을 암호화하는 핵산 서열(예를 들어, CH1 영역 서열에서 결실 또는 불활성화 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역에 작동적으로 연결된, 하나 이상의 재배열되지 않은 면역글로불린 경쇄 V 분절 및 하나 이상의 재배열되지 않은 면역글로불린 경쇄 J 분절로부터 유래된 핵산 서열)을 포함하는 본원에 기재된 동물은 경쇄 불변 영역에 작동적으로 연결된, 인간 경쇄 V 분절 및 인간 경쇄 J 분절을 포함하는 제2 핵산 서열에 의해 암호화될 수 있는, 경쇄 가변 영역 및 경쇄 불변 영역을 포함하는 제2 면역글로불린 폴리펩타이드 쇄를 추가로 포함할 수 있다. 상기 제2 핵산 서열은 또한 비-인간 동물의 생식선에서 발견될 수 있다. 상기 핵산 서열은 내인성 경쇄 유전자좌에 존재하거나, 내인성 경쇄 유전자좌 이외의 다른 유전자좌에서 전이유전자(예를 들어, 게놈내 무작위 위치에 삽입)에 존재할 수 있다.
또 다른 측면에서, CH1 영역 서열에서 결실 또는 불활성화 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역에 작동적으로 연결된, 하나 이상의 재배열되지 않은 면역글로불린 경쇄 V 분절 및 하나 이상의 재배열되지 않는 면역글로불린 경쇄 J 분절로부터 유래된 핵산 서열을 포함하게 변형된 동물은 단일의 재배열된 경쇄, 예를 들어, 통상의 경쇄(ULC)를 발현하게 추가로 변형될 수 있다.
일부 구현예에서, 다음에 한정되지 않지만, VL-단일 도메인 항원 결합 단백질과 같은 단일 도메인 항원 결합 단백질 및/또는 단일 재배열된 경쇄는 인간 유전자형을 포함한다. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 단일 도메인 항원 결합 단백질 및/또는 유전학적으로 가공된 단일 재배열된 경쇄는 인간 가변 도메인 및 하나의 구현예에서 비-인간 불변 도메인을 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 비-인간 불변 도메인은 내인성 비-인간 불변 도메인이다. 하나의 구현예에서, 비-인간 불변 도메인은 설치류 불변 도메인, 예를 들어, 뮤린 불변 도메인, 예를 들어, 마우스 불변 도메인이다. 또 다른 구현예에서, 상기 불변 도메인은 인간 불변 도메인이다. 하나의 측면에서, 단일 도메인 항원 결합 단백질은 인간 경쇄 가변 도메인 및 비-인간 중쇄 불변 도메인을 포함하는 VL-단일 도메인 항원 결합 단백질이다. 하나의 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 VL-단일 도메인 항원 결합 단백질을 암호화하는 재배열되지 않은 경쇄 V 및/또는 J 분절은 인간 분절이다.
본원에 기재된 바와 같은 단일 도메인 항원 결합 단백질을 생산하게 유전학적으로 변형된 동물은 하나 이상의, 또는 모든, 내인성 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자 분절이 하나 이상의 재배열되지 않는 인간 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자 분절, 또는 하나 이상의 재배열되지 않는 인간 면역글로불린 경쇄 V 분절 및 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 경쇄 J 분절로 대체된 중쇄 유전자좌를 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 모든 내인성 VH, DH, 및 JH 유전자 분절은 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 VH, 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 DH 및 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 JH 유전자 분절로 대체된다. 다른 측면에서, 모든 내인성 VH, DH, 및 JH 유전자 분절은 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 경쇄 VL 유전자 분절 및 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 면역글로불린 경쇄 JL 유전자 분절, 예를 들어, 인간 카파(κ) Vκ 및/및 Jκ 유전자 분절 및/또는 인간 람다(λ) Vλ 및/및 Jλ 유전자 분절로 대체된다.
CH1 영역 및/또는 힌지 영역의 결실을 포함하는 중쇄 불변 영역과 관련하여 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역을 포함하는 단일 도메인 결합 단백질을 생산하게 유전학적으로 변형된 동물은 내인성 중쇄 유전자좌에서 변형(및/또는 본원에 기재된 불변 유전자 유전자좌의 다른 변형)을 포함할 수 있거나, 전이유전자에 대한 변형을 포함할 수 있고, 상기 전이유전자는 게놈 중에 임의의 위치에 위치하고, 예를 들어, 무작위 삽입에 의해 게놈으로 도입된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같이 변형된 중쇄 유전자좌는 동물의 생식선에서 발견될 수 있다. 또한 단일의 재배열된 경쇄를 발현하게 변형된 동물에서, 단일의 재배열된 경쇄 가변 영역은 내인성 경쇄 유전자좌에서 경쇄 불변 영역에 작동적으로 연결될 수 있거나, 동종(예를 들어, 자가성; 비-인간 동물과 관련하여) 또는 이종 경쇄 불변 영역과 작동적으로 연결된 단일의 재배열된 경쇄 가변 영역을 포함하는 전이유전자에 존재하고, 내인성 경쇄 유전자좌 이외의 다른 유전자좌, 예를 들어, 게놈으로 무작위로 삽입된 유전자좌에 존재할 수 있다.
추가의 구현예에서, 본원에 기재된 동물의 중쇄 유전자좌는 힌지 영역(들)에서 결실 또는 불활성화 돌연변이를 포함할 수 있다.
추가로, 본원에 기재된 동물은 단일의 재배열된 VL:JL 유전자 서열을 포함하는 경쇄 유전자좌에 의해 암호화될 수 있는 통상적 또는 범용 경쇄(ULC)로서도 언급되는, 경쇄 불변 영역에 작동적으로 연결된 단일의 재배열된 경쇄 가변 유전자 서열을 포함하고/하거나 발현하게 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, 경쇄 유전자좌는, VL 서열이 Vκ 유전자 서열인 단일의 재배열된 VL:JL 유전자 서열을 포함한다. 일부 측면에서, Vκ 서열은 Vκ1-39 또는 Vκ3-20으로부터 선택된다. 일부 측면에서, JL 서열은 Jκ 유전자 서열, 예를 들어, Jκ1 서열, Jκ2 서열, Jκ3 서열, Jκ4 서열 또는 Jκ5 서열 등이다. 일부 구현예에서, 경쇄 유전자좌는 Vκ1-39Jκ5 및 Vκ3-20Jκ1로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 단일의 재배열된 Vκ:Jκ 서열을 포함한다. 하나의 구현예에서, 경쇄 유전자좌는 Vκ1-39Jκ5의 단일의 재배열된 Vκ:Jκ 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 경쇄 유전자좌는 Vκ3-20Jκ1의 단일의 재배열된 Vκ:Jκ 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 단일의 재배열된 가변 유전자 서열은 비-인간 경쇄 불변 영역 유전자, 예를 들어, 내인성 비-인간 경쇄 불변 영역 유전자에 작동적으로 연결된다. 또 다른 구현예에서, 단일 재배열된 가변 유전자 서열은 인간 경쇄 불변 영역 유전자에 작동적으로 연결된다. 일부 측면에서, 단일 재배열된 가변 유전자 서열은 내인성 면역글로불린 경쇄 유전자좌에 삽입된 인간 V:J 서열이고, 상기 수득한 비-인간 동물은 하나 이상의 경쇄 유전자좌에서 기능성의 재배열되지 않은 V 및/또는 J 유전자 분절을 포함하지 않는다.
따라서, 본원에서는 CH1 암호화 영역에서 결실 또는 불활성화 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역 및 (a) CH1 영역에서 결실 또는 불활성화 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역과 관련된 경쇄 불변 영역 및 (b) 단일의 재배열된 경쇄 중 하나 또는 둘 다 포함하는 비-인간 동물이 제공된다. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물은 본원에 기재된 바와 같은 CH1 영역 서열에서 결실 또는 불활성화 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역에 작동적으로 연결된, 하나 이상의 재배열되지 않은 면역글로불린 경쇄 V 분절 및 하나 이상의 재배열되지 않은 면역글로불린 경쇄 J 분절로부터 유래된 핵산 서열을 포함할 수 있다. 하나의 측면에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물은 본원에 기재된 바와 같은 경쇄 불변 영역에 작동적으로 연결된, 면역글로불린 CH1 도메인을 암호화하는 핵산 서열 및 단일의 재배열된 경쇄 가변 유전자 서열에서 결실 또는 불활성화 돌연변이를 포함한다. 또 다른 측면에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물은 경쇄 불변 영역에 작동적으로 연결된, CH1 영역 서열 및 단일 재배열된 경쇄 가변 유전자 서열에서 결실 또는 불활성화 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역에 작동적으로 연결된 하나 이상의 재배열되지 않은 면역글로불린 경쇄 V 분절 및 하나 이상의 재배열되지 않은 면역글로불린 경쇄 J 분절로부터 유래된 핵산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 중쇄 불변 영역은 비-인간 불변 영역, 예를 들어, 내인성 비-인간 불변 영역이다. 다른 구현예에서, 상기 중쇄 불변 영역은 인간 불변 영역이다.
일부 측면에서, 비-인간 동물은 이의 생식선에서 본원에 기재된 바와 같이 변형된 중쇄 유전자좌 및/또는 유전학적으로 가공된 재배열된 경쇄 유전자좌를 포함한다. 비-인간 동물은 또한 하기의 면역글로불린 유전자: IgD, IgG3, IgG2a, IgG2b, IgG2c, IgE, IgA, 및 이의 조합체 중 하나 이상에서 결실 또는 불활성화 돌연변이를 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 비-인간 동물은 IgG2a 및 IgG2b 면역글로불린 유전자에서 결실 또는 불활성화 돌연변이를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 비-인간 동물은 IgG3, IgD, IgA, 및 IgE 면역글로불린 유전자에서 결실 또는 불활성화 돌연변이를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 비-인간 동물은 IgG3, IgD, IgG2a, IgG2b, IgA 및 IgE 면역글로불린 유전자에서 결실 또는 불활성화 돌연변이를 포함한다.
일부 측면에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물은 수컷 비-인간 동물의 생식력을 보유할 수 있는 Adam6a 유전자(또는 이의 단편) 및/또는 Adam6b 유전자(또는 이의 단편)를 추가로 포함할 수 있다. Adam6a 유전자, Adam6b 유전자, 또는 둘 다 이소성으로 위치할 수 있거나, 비-인간 동물에서 Adam6 유전자(들)의 위치에 근접한 위치에 존재할 수 있다. Adam6a 유전자, Adam6b 유전자, 또는 둘 다 수컷 비-인간 동물에서 기능성이다. 예를 들어, 비-인간 동물은 설치류(예를 들어, 마우스 또는 랫트)이고, 상기 Adam6a 유전자, Adam6b 유전자 또는 둘 다 각각 마우스 또는 랫트 유전자이다. 다양한 구현예에서, Adam6 유전자(들)의 유지 또는 삽입은 수컷 비-인간 동물에 대한(예를 들어, 수컷 마우스 또는 랫트에 대한) 생식력을 유지하거나 부여한다.
하나의 측면에서, 본원에 기재된 비-인간 동물은 동족 경쇄, 예를 들어, 유전학적으로 가공된 단일 재배열된 경쇄와 연합될 수 있는, 기능성 CH1 도메인 암호화 서열을 포함하는 IgM 유전자 서열에 의해 암호화된 IgM 면역글로불린을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 비-인간 동물은 IgM 및 IgG1 이소형을 갖는 중쇄만을 생산하고, 상기 IgM 중쇄는 기능성 CH1 도메인을 포함하고 상기 IgG1 중쇄는 기능성 CH1 도메인이 없다. 하나의 측면에서, IgM 중쇄와 연합된 상기 동족 경쇄는 경쇄 불변 영역과 작동적으로 연결된 단일의 재배열된 경쇄 가변 유전자 서열에 의해 암호화되거나 이로부터 유래된다.
본원에 기재된 바와 같은 유전학적으로 가공된 단일 재배열된 경쇄의 발현은 항원이 비-인간 동물에 의해 유발반응된 후 고역가의 항원 특이적 단일 도메인 항원 결합 단백질을 생성시킨다. 역가, 예를 들어, ELISA에 의한 측정시 적어도 1 x 102 ㎍/mL, 적어도 1 x 103 ㎍/mL, 적어도 1 x 104 ㎍/mL, 또는 적어도 1 x 105 ㎍/mL의 항체 또는 결합 단백질 농도는 고역가로 간주될 수 있다. 대안적으로, 비-인간 동물은 상기 결합 단백질 농도가 유전학적으로 가공된 재배열된 경쇄를 포함하지 않는 상응하는 대조군 동물의 적어도 2배, 적어도 5배, 적어도 10배 또는 적어도 100배인 경우 고역가의 결합 단백질을 생산한다.
본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물을 생산하는 방법이 또한 제공된다. 상기 방법은 비-인간 동물의 비-인간 중쇄 불변 영역을 변형시킴을 포함하고 상기 중쇄 불변 영역은 CH1 도메인, 예를 들어, IgG1 CH1 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 결실 또는 불활성화 돌연변이를 포함한다.
본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물을 생산하는 방법은 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌에서 하나 이상, 모든 또는 실질적으로 모든 내인성 비-인간 중쇄 가변 영역 유전자 분절을 하나 이상의 재배열되지 않은 경쇄 V 및/또는 하나 이상의 재배열되지 않은 경쇄 J 유전자 분절로 대체하여 경쇄 V 및 J 유전자 분절들이 CH1 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 결실 또는 불활성화 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역에 작동적으로 연결되게 하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 재배열되지 않은 경쇄 V 및 J 유전자 분절은 생산적 재배열을 진행할 수 있고, 예를 들어, 재배열되지 않은 경쇄 V 및 J 유전자 분절들이 재조합하여 변형된 비-인간 동물이 중쇄 불변 영역 핵산 서열에 작동적으로 연결된 재배열된 면역글로불린 경쇄 가변 영역(VL/JL) 뉴클레오타이드 서열을 포함하게 하는 재조합 신호 서열(RSS)을 포함하고, 상기 중쇄 불변 영역 핵산 서열은 CH1 도메인을 암호화화는 서열에서 불활성화 돌연변이 또는 결실을 포함한다. 하나의 구현예에서, 재배열되지 않은 경쇄 V 및 J 유전자 분절들은 재조합하여 변형된 비-인간 동물은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 N 부가물을 포함하고 중쇄 불변 영역 핵산 서열에 작동적으로 연결된 재배열된 면역글로불린 경쇄 가변 영역(VL/JL) 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 중쇄 불변 영역 핵산 서열은 CH1 도메인을 암호화하는 서열에 불활성화 돌연변이 또는 결실을 포함한다. 하나의 구현예에서, 재배열되지 않은 경쇄 V 및 J 유전자 분절들은 인간 V 및 J 분절들이다. 상기 방법은 또한 동물이 재배열되지 않는 경쇄 V 유전자 분절, 재배열되지 않은 경쇄 J 유전자 분절 및 불활성화되거나 결실된 CH1 도메인을 갖는 중쇄 불변 영역으로부터 유래된 VL-단일 도메인 결합 단백질을 발현하게 하는 것을 포함할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물을 생산하는 방법은 단일 재배열된 경쇄, 예를 들어, 범용 경쇄(ULC)를 암호화하는 핵산을 포함하는 유전학적으로 가공된 단일 재배열된 경쇄 유전자좌를 도입하고, 임의로 동물이 불활성화된 CH1 도메인을 갖는 중쇄 면역글로불린 유전자좌 및 단일 재배열된 경쇄 유전자좌를 발현하게 하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
하나의 측면에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물을 생산하는 방법은 (a) 상기 비-인간 동물의 비-인간 중쇄 불변 영역을 변형시켜 상기 중쇄 불변 영역이 CH1 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 결실 또는 불활성화 돌연변이를 포함하게 하고, (b) 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌에서 하나 이상, 모든 또는 실질적으로 모든 내인성 비-인간 중쇄 가변 영역 유전자 분절을 하나 이상의 재배열되지 않은 경쇄 V 및/또는 하나 이상의 재배열되지 않은 경쇄 J 분절로 대체하여 상기 경쇄 V 및 J 유전자 분절이 CH1 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 결실 또는 불활성화 돌연변이를 포함하는 비-인간 중쇄 불변 영역에 작동적으로 연결되게 하고/하거나 (c) 유전학적으로 가공된 단일 재배열된 경쇄 유전자좌를 암호화하는 핵산을 도입하는 것 중 어느 하나 또는 둘 다 포함한다. 본원에 기재된 방법의 단계는 임의의 순서로, 연속적으로 또는 동시에 수행될 수 있다.
예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 방법은 (a) 비-인간 동물의 비-인간 중쇄 불변 영역을 변형시켜 상기 중쇄 불변 영역이 CH1 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 결실 또는 불활성화 돌연변이를 포함하게 하고, (b) 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌에서 하나 이상, 모든 또는 실질적으로 모든 내인성 비-인간 중쇄 가변 영역 유전자 분절을 하나 이상의 재배열되지 않은 경쇄 V 및/또는 하나 이상의 재배열되지 않은 경쇄 J 유전자 분절로 대체하여 상기 경쇄 V 및 J 유전자 분절이 CH1 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 결실 또는 불활성화 돌연변이를 포함하는 비-인간 중쇄 불변 영역에 작동적으로 연결되게 하는 것을 포함할 수 있다. 하나의 측면에서, 본원에 기재된 바와 같은 방법은 (a) 비-인간 동물의 비-인간 중쇄 불변 영역을 변형시켜 상기 중쇄 불변 영역이 CH1 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 결실 또는 불활성화 돌연변이를 포함하게 하고, (b) 유전학적으로 가공된 단일 재배열된 경쇄 유전자좌를 암호화하는 핵산을 도입하는 것을 포함한다. 또 다른 측면에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물을 생산하는 방법은 (a) 상기 비-인간 동물의 비-인간 중쇄 불변 영역을 변형시켜 상기 중쇄 불변 영역이 CH1 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 결실 또는 불활성화 돌연변이를 포함하게 하고, (b) 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌에서 하나 이상, 모든 또는 실질적으로 모든 내인성 비-인간 중쇄 가변 영역 유전자 분절을 하나 이상의 재배열되지 않은 경쇄 V 및/또는 하나 이상의 재배열되지 않은 경쇄 J 유전자 분절로 대체하여 상기 경쇄 V 및 J 유전자 분절이 CH1 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 결실 또는 불활성화 돌연변이를 포함하는 비-인간 중쇄 불변 영역에 작동적으로 연결되게 하고, (c) 유전학적으로 가공된 단일 재배열된 경쇄 유전자좌를 암호화하는 핵산을 도입하는 것을 포함한다. 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물을 생산하는 방법은 Adam6a 유전자, Adam6b 유전자 또는 둘 다 비-인간 동물의 게놈으로, 예를 들어, 동물의 생식선으로 도입하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 하나의 측면에서, 상기 방법은, 예를 들어, 동물을 면역화시킴에 의해 동물이 불활성화된 CH1 도메인을 갖는 중쇄 면역글로불린 유전자좌 및/또는 유전학적으로 재배열된 경쇄 유전자좌(단일 재배열된 경쇄 유전자좌)를 발현하게 하는 것을 추가로 포함한다.
하나의 측면에서, 중쇄 면역글로불린 유전자좌의 CH1 도메인(들) 및 임의로 힌지 영역(들)을 불활성화시키는 단계는 비-인간 동물이 본원에 기재된 바와 같은 단일 도메인 항원 결합 단백질을 생산하게 한다. 하나의 구현예에서, 중쇄 면역글로불린 유전자좌의 CH1 도메인(들) 및 임의로 힌지 영역(들)을 불활성화시키는 것은 중쇄 유전자좌, 예를 들어, IgG 중쇄 유전자좌의 CH1 도메인(들) 및 임의로 힌지 영역을 결실시키거나 이것 내로 불활성화 돌연변이를 도입하는 표적화 벡터로 내인성 중쇄 면역글로불린 유전자좌를 표적화하는 것을 포함한다. 하나의 구현예에서, 중쇄 면역글로불린 유전자좌의 CH1 도메인(들) 및 임의로 힌지 영역(들)을 불활성화시키는 것은 상동성 재조합을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 불활성화 단계는 중쇄 유전자좌의 하나 이상, 실질적으로 모든 또는 모든 내인성 가변 영역 유전자 분절들의 하기 중 하나 이상으로의 대체를 추가로 포함할 수 있다: 하나 이상의 중쇄 가변 영역 유전자 분절, 하나 이상의 경쇄 가변 영역 유전자 분절, 하나 이상의 인간 가변 영역 유전자 분절 및 하나 이상의 재배열되지 않은 가변 영역 유전자 분절. 중쇄 유전자좌의 CH1 도메인(들) 및 임의로 힌지 영역(들)을 불활성화시키는 단계는 비-인간 동물의 생식선에서 일어날 수 있다.
하나의 측면에서, 상기 방법은 유전학적으로 가공된 재배열된 경쇄 유전자좌, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 유전학적으로 가공된 범용 경쇄를 암호화하는 핵산을 도입하는 것을 포함한다. 하나의 측면에서, 유전학적으로 가공된 재배열된 경쇄 유전자좌를 암호화하는 핵산을 도입하는 단계는 비-인간 동물의 모든 또는 실질적으로 모든 내인성 면역글로불린 경쇄 유전자좌를 대체하는 것을 추가로 포함한다. 하나의 측면에서, 유전학적으로 가공된 재배열된 경쇄 유전자좌를 암호화하는 핵산을 도입하는 단계는 비-인간 동물의 모든 또는 실질적으로 모든 내인성 면역글로불린 경쇄 유전자좌를 기능적으로 불활성화시키는 것을 추가로 포함한다. 또 다른 측면에서, 유전학적으로 가공된 재배열된 경쇄를 암호화하는 핵산은 동물의 생식선으로 도입된다.
하나의 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물을 생산하는 방법은 (a) 결실되거나 불활성화된 CH1 도메인을 갖는 중쇄 유전자좌 (및 임의로, 결실되거나 불활성화된 CH1 도메인을 갖는 중쇄 불변 영역 서열에 작동적으로 연결된 경쇄 가변 영역 뉴클레오타이드 서열) 및 임의로, 결실되거나 불활성화된 힌지 영역을 포함하는 제1 비-인간 동물을 수득하여 상기 비-인간 동물이 본원에 기재된 바와 같은 상기 비-인간 동물이 단일 도메인 항원 결합 단백질(예를 들어, VL 단일 도메인 결합 단백질)을 생산하게 하고, (b) (a)의 제1 비-인간 동물을, 하나의 측면에서 제1 비-인간 동물과 상이한 균주일 수 있는 제2 비-인간 동물과 교배시키는 것을 포함하고, 상기 제2 비-인간 동물은 범용 경쇄를 발현하고, 상기 교배는 단일 도메인 항원 결합 단백질 및 유전학적으로 가공된 재배열된 경쇄(단일 재배열된 경쇄; ULC)를 생산하고, 예를 들어, 포함하는 자손을 유도한다.
일부 측면에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물을 생산하는 방법은 IgD, IgG3, IgG2a, IgG2b, IgG2c, IgE 및 IgA로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 면역글로불린 유전자를 불활성화시키거나 결실시킴을 추가로 포함한다. 하나의 구현예에서, IgG2b 및 IgG2a/IgG2c 면역글로불린 유전자들은 결실된다. 또 다른 구현예에서, IgD, IgG3, IgG2b, IgG2a/IgG2c, IgE, 및 IgA 유전자들은 결실되어 상기 비-인간 동물은 IgM 또는 IgG1 이소형을 갖는 면역글로불린 중쇄를 생산하고, 상기 IgG1 이소형은 CH1 도메인 및 임의로 힌지 영역에서 결실 또는 불활성화 돌연변이를 갖는다.
하나의 측면에서, 비-인간 동물은 이미 단일 도메인 항원 결합 단백질을 생산할 수 있고 본원에서는 비-인간 동물에 의해 단일 도메인 항원 결합 단백질의 생산을 증가시키는 방법이 제공된다. 상기 방법은 비-인간 동물의 B 세포가 유전학적으로 가공된 단일 재배열된 경쇄, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 유전학적으로 가공된 범용 경쇄를 암호화하는 핵산을 발현하게 하는 것을 포함한다. B 세포가 상기 핵산을 발현하게 하는 것은 또한 B 세포에 의한 내인성 경쇄 유전자의 발현을 불활성화시키거나 예방하는 단계를 포함할 수 있다.
하나의 측면에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물은 랫트 또는 마우스이다. 또 다른 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물은 마우스이다. 따라서, 본원에서는 유전학적으로 변형된 마우스가 제공되고, (a) 마우스 중쇄 유전자좌에서 모든 또는 실질적으로 모든 내인성 면역글로불린 중쇄 V, D 및 J 유전자 분절들의 하나 이상의 인간 중쇄 V, D 및 J 유전자 분절로의 대체(여기서, 하나 이상의 인간 중쇄 V, D 및 J 유전자 분절은 마우스 중쇄 불변 영역(예를 들어, 내인성 마우스 중쇄 불변 영역)으로 작동적으로 연결되고, 상기 마우스 중쇄 불변 영역은 전장 IgM 유전자를 포함하고; IgG 유전자는 IgG1, IgG2a, IgG2c, IgG2b, 및 이의 조합체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 IgG 유전자에서 CH1 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에서 결실 또는 불활성화 돌연변이를 포함하고, 상기 마우스는 CH1 영역과 함께 IgM을 포함하는 B 세포 수용체를 발현하고, 상기 IgM은 동족 경쇄와 연합된 중쇄를 포함한다); 및 (b) 모든 또는 실질적으로 모든 내인성 면역글로불린 경쇄 V 및 J 유전자 분절의 단일 재배열된 가변 Vκ:Jκ 유전자 서열로의 대체를 포함한다. 일부 구현예에서, 동종 경쇄는 단일 재배열된 가변 Vκ:Jκ 유전자 서열로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 상기 단일 재배열된 가변 Vκ:Jκ 유전자 서열은 마우스 경쇄 불변 서열, 예를 들어, 내인성 마우스 경쇄 불변 서열에 작동적으로 연결된다.
또 다른 측면에서, 본원에서는 비-인간 동물, 예를 들어, 랫트 또는 마우스가 제공되고, (a) 마우스 중쇄 유전자좌에서 모든 또는 실질적으로 모든 내인성 면역글로불린 중쇄 V, D 및 J 유전자 분절의 결실 또는 기능적 불활성화 및 하나 이상의 인간 중쇄 V, D 및 J 유전자 분절의 도입(여기서, 하나 이상의 인간 중쇄 V, D 및 J 유전자 분절은 마우스 중쇄 불변 영역(예를 들어, 내인성 마우스 중쇄 불변 영역)에 작동적으로 연결되고, 상기 마우스 중쇄 불변 영역은 전장 IgM 유전자를 포함하고; IgG 유전자는 IgG1, IgG2a, IgG2c, IgG2b, 및 이의 조합체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 IgG 유전자에서 CH1 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에서 결실 또는 불활성화 돌연변이를 포함하고, 마우스는 CH1 영역과 함께 IgM을 포함하는 B 세포 수용체를 발현하고, 상기 IgM은 동족 경쇄와 연합된 중쇄를 포함한다); 및/또는 (b) 모든 또는 실질적으로 모든 내인성 면역글로불린 경쇄 V 및 J 유전자 분절의 결실 또는 기능성 불활성화 및 단일 재배열된 가변 Vκ:Jκ 유전자 서열을 포함한다.
또한, 본원에서는 유전학적으로 변형된 마우스가 제공되고, (a) 마우스 중쇄 유전자좌에서 모든 또는 실질적으로 모든 내인성 면역글로불린 중쇄 V, D 및 J 유전자 분절의 하나 이상의 인간 경쇄 V 및 J 유전자 분절로의 대체(여기서, 하나 이상의 인간 경쇄 V 및 J 유전자 분절은 마우스 중쇄 불변 영역에 작동적으로 연결되어 있고, 상기 마우스 중쇄 불변 영역은 전장 IgM 유전자를 포함하고; IgG 유전자는 IgG1, IgG2a, IgG2c, IgG2b, IgG3, 및 이의 조합체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 IgG 유전자에서 CH1 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에서 결실 또는 불활성화 돌연변이를 포함하고, 상기 마우스는 CH1 영역과 함께 IgM을 포함하는 B 세포 수용체를 발현하고, 상기 IgM은 동족 경쇄와 연합된 중쇄를 포함한다); 및 (b) 모든 또는 실질적으로 모든 내인성 면역글로불린 경쇄 V 및 J 유전자 분절의 단일 가변 Vκ:Jκ 유전자 서열로의 대체를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 동족 경쇄는 단일 재배열된 가변 Vκ:Jκ 유전자 서열로부터 유래한다.
하나의 측면에서, CH1 도메인이 없는 결합 단백질을 생산하기 위한 방법이 제공되고, (a) 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물로부터 결합 단백질, 상기 결합 단백질을 생산하는 세포 또는 상기 결합 단백질의 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 단리시킴을 포함한다. 하나의 측면에서, 상기 단리시키는 단계는 하기의 단계 중 하나 이상을 포함할 수 있다: (a) 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물을 항원으로 면역화시키는 단계; (b) 비-인간 동물이 결합 단백질을 생산하기에 충분한 조건하에 상기 비-인간 동물을 유지시키는 단계 및/또는 (c) 기능성 CH1 도메인이 부재이고/부재이거나 기능성 힌지 영역이 부재인 비-인간 동물에 의해 생산된 결합 단백질을 동정하는 단계. 일부 측면에서, 상기 단리된 결합 단백질은 단일 도메인 항원 결합 단백질이다. 하나의 측면에서, 단일 도메인 항원 결합 단백질은 단량체성이다.
하나의 측면에서, 항원 결합 단백질을 생산하기 위한 방법이 제공되고, (a) 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물을 항원으로 면역화시키고; (b) 상기 비-인간 동물을 결합 단백질을 생산하기에 충분한 조건하에 유지시키고; (c) 상기 비-인간 동물에 의해 생산된 결합 단백질을 동정하고(상기 결합 단백질은 기능성 CH1 도메인이 부재이거나 기능성 CH1 도메인이 부재이고 힌지 영역이 부재이다); (d) CH1 도메인이 부재이거나 힌지 영역 및 CH1 도메인이 부재인 면역글로불린 폴리펩타이드 상의 가변 도메인을 암호화하는 가변 영역을 동정하고(상기 가변 도메인은 항원에 특이적으로 결합한다); (e) 적합한 발현 시스템에서 (d)의 가변 영역 서열과 동일하거나 실질적으로 동일한 서열에 의해 암호화된 단백질을 발현하고/하거나(여기서, (d)의 가변 영역 서열은 CH1 영역이 부재이거나 CH1 영역 및 힌지가 부재인 중쇄 가변 서열의 핵산 서열과 연결되어 있다) (f) (e)의 발현된 단백질을 단리시킴을 포함한다. 일부 구현예에서, 가변 영역 서열에 의해 암호화된 단백질을 발현하고/하거나 (f) 상기 발현된 단백질을 단리시키는 단계는 세포, 예를 들어, 가변 영역 서열로 형질감염된 세포, 본원에 기재된 동물로부터 단리된 세포로부터 형성된 하이브리도마를 배양하고/하거나 배양된 세포로부터 상등액을 수거하는 것을 포함한다.
하나의 측면에서, 항원 결합 단백질을 생산하기 위한 방법이 제공되고, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물을 항원으로 면역화시키고, 항원에 특이적으로 결합하는 가변 도메인을 암호화하는 가변 영역 핵산 서열을 동정하고, 적합한 발현 시스템에서 가변 영역 핵산 서열을 사용하는 것을 포함하고, 상기 가변 영역 핵산 서열은 CH1이 부재이거나 CH1 및 힌지가 부재인 중쇄 불변 유전자와 작동적으로 연결되어 있고; 상기 발현 시스템은 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 단백질을 발현한다.
따라서, 또한 본원에서는 상기 단리된 결합 단백질, 세포 및 핵산 서열이 제공된다.
다른 구현예가 기재되어 있고 계속되는 발명의 상세한 설명의 검토로부터 당업자에게 자명할 것이다.
도 1a는 CH1 도메인이 부재인 IgG1을 발현하는 유전학적으로 변형된 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 생산하기 위해 마우스 IgG1 유전자, IgG2b 및 IgG2a 유전자(비례축척이 아님)를 표적화하는 것을 설명하고; 빈공간 삼각형으로 나타낸 인간 면역글로불린 중쇄 V, D 및 J 분절은 마우스 불변 유전자좌(여기서, IgG1 CH1 엑손* 및 IgG2a/ 2b**은 결실되어 있다)로 삽입되고, 타원형은 인핸서를 나타낸다.
도 1b는 단일 재배열된 인간 VL/JL 유전자 서열을 포함하는 마우스 면역글로불린 경쇄 유전자좌(비례축척이 아님)를 설명한다***.
도 1c는 도 1b 및 1c의 Ig 유전자좌를 갖는 마우스에 의해 발현된 IgM을 도시하고, 상기 IgM은 온전한 CH1 도메인을 포함한다. 도 1c는 또한 클래스 전환시 도 1a 및 1c의 Ig 유전자좌를 갖는 마우스에 의해 발현되는 IgG1이 CH1 도메인 부재인 단일 도메인 중쇄 항원 결합 단백질임을 도시한다.
도 2는 2개의 범용 경쇄의 게놈 구조(비례축척이 아님)를 도시하고 상기 2개의 범용 경쇄 중 하나는 Vκ1-39Jκ5를 포함하는 단일 재배열된 인간 가변 영역을 포함하고 이중 다른 하나는 Vκ3-20Jκ1을 포함하는 단일 재배열된 인간 가변 영역을 포함한다.
도 3은 마우스에서 야생형 IgG1 유전자좌(IgG1, 상부)를 도시하고, 이는 CH1 유전자 분절에 융합된 JH 영역 유전자 분절, 이어서, 힌지 영역, CH2 유전자 분절 및 CH3 유전자 분절; CH1 도메인을 결실시키는 작제물로 표적화된 IgG1 유전자좌(IgG1△CH1; I); CH1 도메인 및 힌지 영역 둘 다 결실시키는 작제물로 표적화된 IgG1 유전자좌(IgG1△CH1-힌지; II); IgG1CH1 도메인, IgG2b 및 IgG2a를 결실시키는 작제물로 표적화된 불변 영역 유전자좌(IgG1△CH1△IgG2b/2a; III); IgG1 CH1 도메인, 힌지 영역, IgG2b 및 IgG2a를 결실시키는 작제물로 표적화된 불변 영역 유전자좌(IgG1△CH1&△힌지△IgG2b/2a; IV); 또는 IgG1CH1 도메인, IgG2b, IgG2a, IgG3, IgD, IgA, 및 IgE, 및 임의로 힌지 영역을 결실시키는 작제물로 표적화된 불변 영역 유전자좌(IgG1△CH1△IgG2b/2a△IgG3△IgD/A/E (임의로 힌지) ; V)를 보여준다. 유전자좌의 개략도적 개략도는 비례축적으로 제공되지 않는다. IgG2a/c는 마우스가 이의 종에 의존하여 IgG2a 대립형질유전자 또는 IgG2c 대립형질유전자를 가질 수 있기 때문에 IgG2a 또는 IgG2c 유전자좌를 지정한다.
도 4a는 인간 중쇄 가변 유전자 분절(빈 공간 삼각형)을 포함하고 기능성 IgG1CH1 도메인이 부재일 뿐만 아니라 IgG2a 및 IgG2b 유전자좌가 부재인 유전학적으로 변형된 유전자좌(일부 구현예에서 1673으로서 언급됨)를 생산하기 위해 마우스 중쇄 서열(비례축척이 아님)을 표적화하는 것을 도시한다.
도 4b는 CH1 도메인 및 힌지가 부재인 IgG1을 발현하는 유전학적으로 변형된 유전자좌(비례축척이 아님)(일부 구현예에서 1576으로서 언급됨)를 생산하기 위해 마우스 IgG1 유전자(모든 가변 유전자 분절은 마우스이고 채워진 삼각형에 의해 나타낸다)를 표적화하는 것을 도시한다.
도 4c는 IgM, IgD, IgG3, IgG1, IgG2b, IgG2a, IgE 및 IgA 유전자 분절(도 4d에서 계속되는 복제 IgG1△CH1△IgG2b/IgG2a, △IgG3, △IgD/A/E의 제1 부분)이 부재인 유전학적으로 변형된 유전자좌를 생산하기 위해 마우스 중쇄 불변 영역(비례축척이 아님)을 표적화하는 것을 도시한다. 인간 가변 유전자 분절은 빈 공간 삼각형으로 나타낸다.
도 4d는 인간 중쇄 가변 유전자 분절, 완전하고 기능적인 뮤린 IgM 유전자 영역 및 기능적 CH1 도메인이 부재이고 임의로 기능적 힌지 영역이 부재인 IgG1 유전자 영역을 포함하는 유전학적으로 변형된 유전자좌(비례축척이 아님)(마우스는 또한 IgG2b/IgG2a, IgG3, 및 IgD/A/E가 부재이고; 일부 구현예에서 6180으로서 언급됨)를 생산하기 위해 도 4c의 마우스 불변 영역을 표적화하는 것을 도시한다. 인간 가변 유전자 분절은 빈 공간 삼각형으로 나타낸다.
도 5a는 β-갈락토시다제(βgal)로 면역화시키기 전후 하기의 다양한 단일 도메인 IgG1 마우스간에 비교되는 총 혈청 IgG1 역가를 보여준다: 마우스 카파 쇄를 갖는 mVHIgG1△CH1 & 힌지에 대해 동종접합성 마우스(1576); 단일 재배열된 경쇄 Vκ3-20Jκ1 ULC인 카파 쇄를 갖는 mVHIgG1△CH1 & 힌지에 대해 동종접합성 마우스(1576/1635); 또는 동일한 유전학적 배경을 갖는 야생형(WT) 마우스. HO는 유전학적 변형을 위해 동종접합성이다.
도 5b는 mVHIgG1△CH1 & 힌지 동종접합성 마우스(1576HO) 또는 mVHIgG1△CH1 -힌지 x Vκ3-20Jκ1 ULC1 동종접합성 마우스(1576HO 1635HO)와 비교하여 면역화된 WT 마우스에서 항원 특이적 IgG1 혈청 역가를 도시한다. 마우스는 모델 항원으로서 β-갈락토시다제(βgal)로 면역화시키고, 항원 특이적 IgG1 역가는 ELISA로 측정하였다.
도 6은 비-환원 조건하에서 생산되고 2개의 hVH IgG1△CH1 & 힌지△IgG2b/2a x Vκ1-39Jκ5 ULC 동종접합성 마우스(1859HO 1633HO), 3개의 hVH IgG1△CH1△IgG2b/2a x Vκ3-20Jκ1 ULC 동종접합성 마우스(1673HO 1635 HO) 및 이량체성 단일 도메인 항원 결합 단백질(37-37 동종이량체) 또는 단량체성△ CH1 단일 도메인 결합 단백질(CH1 힌지는 단일 쇄를 결실시킨다)의 마우스 불변 영역과 함께 인간 가변 영역(VH 및 Vκ)을 갖는 3개의 VELOCIMMUNE® 대조군 마우스(VI3 IgG1)로부터 기원하는 마우스 혈청의 항-마우스 IgG로 가시화된 웨스턴 블롯의 이미지를 제공한다.
도 7은 hVHIG1△CH1△IgG2b/2a x Vκ1-39Jκ5 동종접합성 마우스(1673x1633) 또는 hVH IgG1△CH1△IgG2b/2a x Vκ3-20Jκ1 동종접합성 마우스(1673x1635)의 항원 X인 세포 표면 단백질을 사용한 복강내 면역화 후 상이한 시점(x-축)에서 동물의 혈장에서 발견되는 IgG1 역가(y-축)를 보여준다.
도 8은 비-환원 조건하에서 생산되고 3개의 hVH IgG1△CH1△IgG2b/2a△IgG3△IgD/A/E x Vκ1-39Jκ5 ULC 동종접합성 마우스(6180HO 1634 HO), 2개의 hVH IgG1△CH1△IgG2b/2a△IgG3△IgD/A/E 동종접합성 마우스(6180 HO) 및 이량체성 단일 도메인 항원 결합 단백질(37-37 동종이량체) 또는 단량체성△CH1 단일 도메인 결합 단백질(CH1은 단일 쇄를 결실시킨다)의 마우스 불변 영역과 함께 인간 가변 영역(VH 및 Vκ)을 갖는 3개의 VI3 대조군 마우스로부터 기원하는 마우스 혈청의 항-마우스 IgG로 가시화된 웨스턴 블롯의 이미지를 제공한다.
도 9는 hVH IgG1△CH1△IgG2a/2b△IgG3△IgD/A/E x Vκ1-39Jκ5(6180 HO x 1634 HO) 마우스 및 hVH IgG1△CH1△IgG2a/2b△IgG3△IgD/A/E(6180 HO) 및 VI3 대조군 동물의 혈장에서 안정한 상태의 IgM 및 IgG의 농도를 보여준다.
도 10은 대표적인 동종접합성 대조군 VI3 및 hVH IgG1△CH1△IgG2a/2b△IgG3△IgD/A/E (6180 HO) x Vκ1-39Jκ5(6180 HO 1634 HO) 마우스(A)로부터의 CD19 및 CD3에 대해 염색된 단일선상에 게이팅된 비장세포의 윤곽 플롯을 보여준다. 또한, 대표적인 대조군 VI3 마우스 및 대표적인 동종접합성 hVH IgG1△CH1△IgG2a/2b△IgG3△IgD/A/E x Vκ1-39Jκ5(6180 HO x 1634 HO) 마우스(C)로부터의 면역글로불린 D(IgD) 및 면역글로불린 M(IgM)에 대해 염색된 CD19+ B 세포 상에 게이팅된 비장세포의 윤곽 플롯을 나타낸다. 주목할만하게는, 상기 B 세포는 IgD 불변 도메인이 결실되었기 때문에 IgD-이다. 따라서, 상기 플롯에서 용어 "성숙한"은 단순히 IgD가 부재하고 다른 비-IgM 면역글로불린은 그렇지 않다는 것을 지적한다. 또한, 각각의 그룹 (B) 기원의 3개의 대표적인 마우스의 CD19+ B 세포(y-축: 세포/비장 X 107)의 총수를 보여주는 그래프가 제공된다. 윤곽 플롯이 포함되는 동물은 원으로 표시한다.
도 11은 (A) CD93 및 B220에 대해 염색된 비장으로부터 단리된 CD19+ 게이팅된 B 세포, (B) IgM 및 CD23에 대해 염색된 미성숙하거나 성숙한 게이팅된 B 세포, 또는 (C) 대표적인 대조군 VI3 마우스 및 대표적인 동종접합성 hVH IgG1△CH1△IgG2a/2b△IgG3△IgD/A/E x Vκ1-39Jκ5(6180 HO x 1634 HO) 마우스로부터의 CD21/35 및 IgM에 대해 염색된 미성숙하거나 성숙한 게이팅된 B 세포의 윤곽 플롯을 보여준다.
도 12는 CD19 및 CD3으로 염색된, 대표적인 대조군 VI3 마우스 및 대표적인 동종접합성 hVH IgG1△CH1 & IgG2a/2b△IgG3△IgD/A/E x Vκ1-39Jκ5(6180 HO x 1634 HO) 마우스의 대퇴부로부터 단리된 골수의 윤곽 플롯을 보여준다. 또한, 각각의 그룹으로부터의 3개의 대표적인 마우스의 대퇴부당 세포 또는 CD19+ B 세포의 총수(y-축; 세포/대퇴부 x 107)를 보여준다. 윤곽 플롯이 포함된 동물은 원형으로 나타낸다.
도 13은 IgM 및 B220으로 염색된, 대표적인 대조군 VI3 마우스 및 대표적인 동종접합성 hVH IgG1△CH1△IgG2a/2b△IgG3△IgD/A/E x Vκ1-39Jκ5(6180 HO x 1634 HO) 마우스의 대퇴부로부터 단리된 골수의 윤곽 플롯을 보여준다. 또한, 각각의 그룹으로부터의 3개의 대표적인 마우스의 대퇴부당 성숙한(IgM+B 220hi) 및 미성숙한(IgM+ B220int) B 세포의 총수(y-축; 세포/대퇴부 x 107)를 보여준다. 상기 윤곽 플롯이 포함되는 동물은 원형으로 나타낸다.
도 14a는 마우스 중쇄 유전자좌(비례축척이 아님)의 개략도를 도시한다. 마우스 중쇄 유전자좌는 길이가 약 3Mb이고 인핸서(Enh) 및 중쇄 불변(CH) 영역뿐만 아니라 대략적으로 200개의 중쇄 가변(VH) 유전자 분절, 13개의 중쇄 다양성(DH) 유전자 분절 및 4개의 중쇄 연결(JH) 유전자 분절을 포함한다.
도 14b는 인간 κ 경쇄 유전자좌(비례축척이 아님)의 개략도를 도시한다. 인간 κ 경쇄 유전자좌는 각각 약 440kb 및 600kb에 이르는 반대 극성의 원거리 및 근거리 콘티그에 복제된다. 2개 콘티그 사이에는 Vκ 유전자 분절이 부재인 것으로 사료되는 약 800kb의 DNA가 있다. 인간 κ 경쇄 유전자좌는 약 76Vκ 유전자 분절, 5Jκ 유전자 분절, 인트론 인핸서(Enh) 및 단일 불변 영역(Cκ)을 포함한다.
도 15는 내인성 중쇄 가변 영역 유전자 분절이 결실된 마우스 중쇄 유전자좌로의 40개 인간 Vκ 및 5개 인간 Jκ 유전자 분절의 진행성 삽입을 위한 표적화 전략(비례축척이 아님)을 보여준다. 하이그로마이신(HYG) 및 네오마이신 (NEO) 선택 카세트는 재조합효소 인지 부위(FRT)를 갖는 것으로 보여진다. 또한, Adam6a, Adam6b 및 IGCR1 유전자의 삽입을 위한 표적화 전략(비례축척이 아님)을 보여준다. 인간 가변 유전자 분절은 빈 공간 삼각형으로 나타낸다.
도 16은 도 15(hJκ, 40hVκ, Adam6; 상부)의 변형된 마우스 중쇄 유전자좌; 도 15의 변형된 마우스 중쇄 유전자좌로부터의 IgG1 유전자 서열, IgG2b 유전자 서열 및 IgG2a 유전자 서열의 CH1 도메인을 결실시키고/시키거나 불활성화시키는 표적화 전략(hJκ, 40hVκ, Adam6, ΔCH1, △IgG2b, △IgG2a; 중앙), 및 재배열되지 않은 인간 Jκ 유전자 분절 및 40개의 인간 Vκ 유전자 분절을 포함하는 변형된 마우스 중쇄 유전자좌(여기서, 변형된 마우스 중쇄 유전자좌는 IgG1 유전자에서 기능성 CH1 도메인이 부재이고 또한 기능성 IgG2b 및 IgG2a 유전자가 부재이다)로부터의 선택 카세트를 결실시키는 표적화 전략(hJκ, 40hVκ, Adam6, ΔCH1, △IgG2b, △IgG2a 선택 카세트가 결실됨; 또한 6082로 호칭됨, 바닥)을 보여준다. 인간 가변 유전자는 빈 공간 삼각형으로 나타낸다.
도 17a는 동물의 3개의 상이한 그룹의 비장 및 골수로부터 단리된 B 세포(x-축)에 의한 상대적 mRNA 발현(HPRT1 mRNA로 표준화됨; y-축): 야생형 (WT) 마우스, 도 16의 변형된 중쇄 유전자좌에 대해 동종접합성인 마우스(hJκ, 40hVκ, Adam6, ΔCH1△IgG2b△IgG2a 선택 카세트 결실됨; KoH CH1 del), 및 인간 중쇄 V, D 및 J 분절을 발현하고, IgG1 유전자에서 기능성 CH1 도메인이 부재이고 또한 기능성 IgG2b 및 IgG2a 유전자가 부재이고 단일의 재배열된 경쇄 유전자좌를 포함하는 변형된 마우스 중쇄 유전자좌 둘 다에 대해 동종접합성 마우스(CH1 del x ULC)를 보여준다. 프로브는 생산적 재배열을 검출하게 디자인하였고 인간 Jκ 분절과 뮤린 IgG1 힌지사이에 재조합을 검출하는 프로브(hJκ/mIgG1 힌지 프로브; 좌측 패널) 또는 인간 JH 분절 및 뮤린 IgG1 힌지 사이의 재조합을 검출하는 프로브(hJH/mIgG1 힌지 프로브; 우측 패널)로 이루어져 있다. ND: 검출되지 않음(Ct≥ 35). WT에 대해 n= 2, KoH CH1 del에 대해 2, 및 CH1 del x ULC에 대해 3.
도 17b는 동물의 3개의 상이한 그룹의 비장 및 골수로부터 단리된 B 세포(x-축)에 의한 상대적 mRNA 발현(mKappaC mRNA로 표준화됨; y-축): 야생형 (WT) 마우스, 도 16의 변형된 중쇄 유전자좌에 대해 동종접합성인 마우스(hJκ, 40hVκ, Adam6, ΔCH1△IgG2b△IgG2a 선택 카세트 결실됨; KoH CH1 del), 및 인간 중쇄 V, D 및 J 분절을 발현하고, IgG1 유전자 서열에서 기능성 CH1 도메인이 부재이고 또한 기능성 IgG2b 및 IgG2a 유전자 서열이 부재이고 단일의 재배열된 경쇄 유전자좌를 포함하는 변형된 마우스 중쇄 유전자좌 둘 다에 대해 동종접합성 마우스(CH1 del x ULC)를 보여준다. 프로브는 생산적 재배열을 검출하게 디자인하였고 인간 Jκ 분절과 뮤린 IgG1 힌지 사이에 재조합을 검출하는 프로브(hJκ/mIgG1 힌지 프로브; 좌측 패널) 또는 인간 JH 분절 및 뮤린 IgG1 힌지 사이의 재조합을 검출하는 프로브(hJH/mIgG1 힌지 프로브; 우측 패널)로 이루어져 있다. ND: 검출되지 않음(Ct≥ 35). WT에 대해 n= 2, KoH CH1 del에 대해 2, 및 CH1 del x ULC에 대해 3.
도 18은 비-환원 조건하에서 생산되고 3개의 hVκIgG1△CH1△IgG2a/2b x Vκ3-20Jκ1 ULC 동종접합성 마우스(6082HO 1635 HO), 마우스 불변 영역(WT)과 함께 인간 가변 영역(VH 및 Vκ)을 갖는 3개의 VELOCIMMUNE® 마우스(VI3 IgG1), 및 이량체 단일 도메인 항원 결합 단백질(37-37 동종이량체) 또는 단량체성△CH1 단일 도메인 결합 단백질(CH1은 단일 쇄를 결실시킨다)의 존재 또는 부재를 입증하는 2개의 hVH IgG1△CH1△IgG2a/2b△IgG3△IgD/A/E 마우스(6180 HO)로부터의 마우스 혈청의 항-마우스 IgG로 가시화된, 웨스턴 블롯의 이미지를 제공한다.
도 1b는 단일 재배열된 인간 VL/JL 유전자 서열을 포함하는 마우스 면역글로불린 경쇄 유전자좌(비례축척이 아님)를 설명한다***.
도 1c는 도 1b 및 1c의 Ig 유전자좌를 갖는 마우스에 의해 발현된 IgM을 도시하고, 상기 IgM은 온전한 CH1 도메인을 포함한다. 도 1c는 또한 클래스 전환시 도 1a 및 1c의 Ig 유전자좌를 갖는 마우스에 의해 발현되는 IgG1이 CH1 도메인 부재인 단일 도메인 중쇄 항원 결합 단백질임을 도시한다.
도 2는 2개의 범용 경쇄의 게놈 구조(비례축척이 아님)를 도시하고 상기 2개의 범용 경쇄 중 하나는 Vκ1-39Jκ5를 포함하는 단일 재배열된 인간 가변 영역을 포함하고 이중 다른 하나는 Vκ3-20Jκ1을 포함하는 단일 재배열된 인간 가변 영역을 포함한다.
도 3은 마우스에서 야생형 IgG1 유전자좌(IgG1, 상부)를 도시하고, 이는 CH1 유전자 분절에 융합된 JH 영역 유전자 분절, 이어서, 힌지 영역, CH2 유전자 분절 및 CH3 유전자 분절; CH1 도메인을 결실시키는 작제물로 표적화된 IgG1 유전자좌(IgG1△CH1; I); CH1 도메인 및 힌지 영역 둘 다 결실시키는 작제물로 표적화된 IgG1 유전자좌(IgG1△CH1-힌지; II); IgG1CH1 도메인, IgG2b 및 IgG2a를 결실시키는 작제물로 표적화된 불변 영역 유전자좌(IgG1△CH1△IgG2b/2a; III); IgG1 CH1 도메인, 힌지 영역, IgG2b 및 IgG2a를 결실시키는 작제물로 표적화된 불변 영역 유전자좌(IgG1△CH1&△힌지△IgG2b/2a; IV); 또는 IgG1CH1 도메인, IgG2b, IgG2a, IgG3, IgD, IgA, 및 IgE, 및 임의로 힌지 영역을 결실시키는 작제물로 표적화된 불변 영역 유전자좌(IgG1△CH1△IgG2b/2a△IgG3△IgD/A/E (임의로 힌지) ; V)를 보여준다. 유전자좌의 개략도적 개략도는 비례축적으로 제공되지 않는다. IgG2a/c는 마우스가 이의 종에 의존하여 IgG2a 대립형질유전자 또는 IgG2c 대립형질유전자를 가질 수 있기 때문에 IgG2a 또는 IgG2c 유전자좌를 지정한다.
도 4a는 인간 중쇄 가변 유전자 분절(빈 공간 삼각형)을 포함하고 기능성 IgG1CH1 도메인이 부재일 뿐만 아니라 IgG2a 및 IgG2b 유전자좌가 부재인 유전학적으로 변형된 유전자좌(일부 구현예에서 1673으로서 언급됨)를 생산하기 위해 마우스 중쇄 서열(비례축척이 아님)을 표적화하는 것을 도시한다.
도 4b는 CH1 도메인 및 힌지가 부재인 IgG1을 발현하는 유전학적으로 변형된 유전자좌(비례축척이 아님)(일부 구현예에서 1576으로서 언급됨)를 생산하기 위해 마우스 IgG1 유전자(모든 가변 유전자 분절은 마우스이고 채워진 삼각형에 의해 나타낸다)를 표적화하는 것을 도시한다.
도 4c는 IgM, IgD, IgG3, IgG1, IgG2b, IgG2a, IgE 및 IgA 유전자 분절(도 4d에서 계속되는 복제 IgG1△CH1△IgG2b/IgG2a, △IgG3, △IgD/A/E의 제1 부분)이 부재인 유전학적으로 변형된 유전자좌를 생산하기 위해 마우스 중쇄 불변 영역(비례축척이 아님)을 표적화하는 것을 도시한다. 인간 가변 유전자 분절은 빈 공간 삼각형으로 나타낸다.
도 4d는 인간 중쇄 가변 유전자 분절, 완전하고 기능적인 뮤린 IgM 유전자 영역 및 기능적 CH1 도메인이 부재이고 임의로 기능적 힌지 영역이 부재인 IgG1 유전자 영역을 포함하는 유전학적으로 변형된 유전자좌(비례축척이 아님)(마우스는 또한 IgG2b/IgG2a, IgG3, 및 IgD/A/E가 부재이고; 일부 구현예에서 6180으로서 언급됨)를 생산하기 위해 도 4c의 마우스 불변 영역을 표적화하는 것을 도시한다. 인간 가변 유전자 분절은 빈 공간 삼각형으로 나타낸다.
도 5a는 β-갈락토시다제(βgal)로 면역화시키기 전후 하기의 다양한 단일 도메인 IgG1 마우스간에 비교되는 총 혈청 IgG1 역가를 보여준다: 마우스 카파 쇄를 갖는 mVHIgG1△CH1 & 힌지에 대해 동종접합성 마우스(1576); 단일 재배열된 경쇄 Vκ3-20Jκ1 ULC인 카파 쇄를 갖는 mVHIgG1△CH1 & 힌지에 대해 동종접합성 마우스(1576/1635); 또는 동일한 유전학적 배경을 갖는 야생형(WT) 마우스. HO는 유전학적 변형을 위해 동종접합성이다.
도 5b는 mVHIgG1△CH1 & 힌지 동종접합성 마우스(1576HO) 또는 mVHIgG1△CH1 -힌지 x Vκ3-20Jκ1 ULC1 동종접합성 마우스(1576HO 1635HO)와 비교하여 면역화된 WT 마우스에서 항원 특이적 IgG1 혈청 역가를 도시한다. 마우스는 모델 항원으로서 β-갈락토시다제(βgal)로 면역화시키고, 항원 특이적 IgG1 역가는 ELISA로 측정하였다.
도 6은 비-환원 조건하에서 생산되고 2개의 hVH IgG1△CH1 & 힌지△IgG2b/2a x Vκ1-39Jκ5 ULC 동종접합성 마우스(1859HO 1633HO), 3개의 hVH IgG1△CH1△IgG2b/2a x Vκ3-20Jκ1 ULC 동종접합성 마우스(1673HO 1635 HO) 및 이량체성 단일 도메인 항원 결합 단백질(37-37 동종이량체) 또는 단량체성△ CH1 단일 도메인 결합 단백질(CH1 힌지는 단일 쇄를 결실시킨다)의 마우스 불변 영역과 함께 인간 가변 영역(VH 및 Vκ)을 갖는 3개의 VELOCIMMUNE® 대조군 마우스(VI3 IgG1)로부터 기원하는 마우스 혈청의 항-마우스 IgG로 가시화된 웨스턴 블롯의 이미지를 제공한다.
도 7은 hVHIG1△CH1△IgG2b/2a x Vκ1-39Jκ5 동종접합성 마우스(1673x1633) 또는 hVH IgG1△CH1△IgG2b/2a x Vκ3-20Jκ1 동종접합성 마우스(1673x1635)의 항원 X인 세포 표면 단백질을 사용한 복강내 면역화 후 상이한 시점(x-축)에서 동물의 혈장에서 발견되는 IgG1 역가(y-축)를 보여준다.
도 8은 비-환원 조건하에서 생산되고 3개의 hVH IgG1△CH1△IgG2b/2a△IgG3△IgD/A/E x Vκ1-39Jκ5 ULC 동종접합성 마우스(6180HO 1634 HO), 2개의 hVH IgG1△CH1△IgG2b/2a△IgG3△IgD/A/E 동종접합성 마우스(6180 HO) 및 이량체성 단일 도메인 항원 결합 단백질(37-37 동종이량체) 또는 단량체성△CH1 단일 도메인 결합 단백질(CH1은 단일 쇄를 결실시킨다)의 마우스 불변 영역과 함께 인간 가변 영역(VH 및 Vκ)을 갖는 3개의 VI3 대조군 마우스로부터 기원하는 마우스 혈청의 항-마우스 IgG로 가시화된 웨스턴 블롯의 이미지를 제공한다.
도 9는 hVH IgG1△CH1△IgG2a/2b△IgG3△IgD/A/E x Vκ1-39Jκ5(6180 HO x 1634 HO) 마우스 및 hVH IgG1△CH1△IgG2a/2b△IgG3△IgD/A/E(6180 HO) 및 VI3 대조군 동물의 혈장에서 안정한 상태의 IgM 및 IgG의 농도를 보여준다.
도 10은 대표적인 동종접합성 대조군 VI3 및 hVH IgG1△CH1△IgG2a/2b△IgG3△IgD/A/E (6180 HO) x Vκ1-39Jκ5(6180 HO 1634 HO) 마우스(A)로부터의 CD19 및 CD3에 대해 염색된 단일선상에 게이팅된 비장세포의 윤곽 플롯을 보여준다. 또한, 대표적인 대조군 VI3 마우스 및 대표적인 동종접합성 hVH IgG1△CH1△IgG2a/2b△IgG3△IgD/A/E x Vκ1-39Jκ5(6180 HO x 1634 HO) 마우스(C)로부터의 면역글로불린 D(IgD) 및 면역글로불린 M(IgM)에 대해 염색된 CD19+ B 세포 상에 게이팅된 비장세포의 윤곽 플롯을 나타낸다. 주목할만하게는, 상기 B 세포는 IgD 불변 도메인이 결실되었기 때문에 IgD-이다. 따라서, 상기 플롯에서 용어 "성숙한"은 단순히 IgD가 부재하고 다른 비-IgM 면역글로불린은 그렇지 않다는 것을 지적한다. 또한, 각각의 그룹 (B) 기원의 3개의 대표적인 마우스의 CD19+ B 세포(y-축: 세포/비장 X 107)의 총수를 보여주는 그래프가 제공된다. 윤곽 플롯이 포함되는 동물은 원으로 표시한다.
도 11은 (A) CD93 및 B220에 대해 염색된 비장으로부터 단리된 CD19+ 게이팅된 B 세포, (B) IgM 및 CD23에 대해 염색된 미성숙하거나 성숙한 게이팅된 B 세포, 또는 (C) 대표적인 대조군 VI3 마우스 및 대표적인 동종접합성 hVH IgG1△CH1△IgG2a/2b△IgG3△IgD/A/E x Vκ1-39Jκ5(6180 HO x 1634 HO) 마우스로부터의 CD21/35 및 IgM에 대해 염색된 미성숙하거나 성숙한 게이팅된 B 세포의 윤곽 플롯을 보여준다.
도 12는 CD19 및 CD3으로 염색된, 대표적인 대조군 VI3 마우스 및 대표적인 동종접합성 hVH IgG1△CH1 & IgG2a/2b△IgG3△IgD/A/E x Vκ1-39Jκ5(6180 HO x 1634 HO) 마우스의 대퇴부로부터 단리된 골수의 윤곽 플롯을 보여준다. 또한, 각각의 그룹으로부터의 3개의 대표적인 마우스의 대퇴부당 세포 또는 CD19+ B 세포의 총수(y-축; 세포/대퇴부 x 107)를 보여준다. 윤곽 플롯이 포함된 동물은 원형으로 나타낸다.
도 13은 IgM 및 B220으로 염색된, 대표적인 대조군 VI3 마우스 및 대표적인 동종접합성 hVH IgG1△CH1△IgG2a/2b△IgG3△IgD/A/E x Vκ1-39Jκ5(6180 HO x 1634 HO) 마우스의 대퇴부로부터 단리된 골수의 윤곽 플롯을 보여준다. 또한, 각각의 그룹으로부터의 3개의 대표적인 마우스의 대퇴부당 성숙한(IgM+B 220hi) 및 미성숙한(IgM+ B220int) B 세포의 총수(y-축; 세포/대퇴부 x 107)를 보여준다. 상기 윤곽 플롯이 포함되는 동물은 원형으로 나타낸다.
도 14a는 마우스 중쇄 유전자좌(비례축척이 아님)의 개략도를 도시한다. 마우스 중쇄 유전자좌는 길이가 약 3Mb이고 인핸서(Enh) 및 중쇄 불변(CH) 영역뿐만 아니라 대략적으로 200개의 중쇄 가변(VH) 유전자 분절, 13개의 중쇄 다양성(DH) 유전자 분절 및 4개의 중쇄 연결(JH) 유전자 분절을 포함한다.
도 14b는 인간 κ 경쇄 유전자좌(비례축척이 아님)의 개략도를 도시한다. 인간 κ 경쇄 유전자좌는 각각 약 440kb 및 600kb에 이르는 반대 극성의 원거리 및 근거리 콘티그에 복제된다. 2개 콘티그 사이에는 Vκ 유전자 분절이 부재인 것으로 사료되는 약 800kb의 DNA가 있다. 인간 κ 경쇄 유전자좌는 약 76Vκ 유전자 분절, 5Jκ 유전자 분절, 인트론 인핸서(Enh) 및 단일 불변 영역(Cκ)을 포함한다.
도 15는 내인성 중쇄 가변 영역 유전자 분절이 결실된 마우스 중쇄 유전자좌로의 40개 인간 Vκ 및 5개 인간 Jκ 유전자 분절의 진행성 삽입을 위한 표적화 전략(비례축척이 아님)을 보여준다. 하이그로마이신(HYG) 및 네오마이신 (NEO) 선택 카세트는 재조합효소 인지 부위(FRT)를 갖는 것으로 보여진다. 또한, Adam6a, Adam6b 및 IGCR1 유전자의 삽입을 위한 표적화 전략(비례축척이 아님)을 보여준다. 인간 가변 유전자 분절은 빈 공간 삼각형으로 나타낸다.
도 16은 도 15(hJκ, 40hVκ, Adam6; 상부)의 변형된 마우스 중쇄 유전자좌; 도 15의 변형된 마우스 중쇄 유전자좌로부터의 IgG1 유전자 서열, IgG2b 유전자 서열 및 IgG2a 유전자 서열의 CH1 도메인을 결실시키고/시키거나 불활성화시키는 표적화 전략(hJκ, 40hVκ, Adam6, ΔCH1, △IgG2b, △IgG2a; 중앙), 및 재배열되지 않은 인간 Jκ 유전자 분절 및 40개의 인간 Vκ 유전자 분절을 포함하는 변형된 마우스 중쇄 유전자좌(여기서, 변형된 마우스 중쇄 유전자좌는 IgG1 유전자에서 기능성 CH1 도메인이 부재이고 또한 기능성 IgG2b 및 IgG2a 유전자가 부재이다)로부터의 선택 카세트를 결실시키는 표적화 전략(hJκ, 40hVκ, Adam6, ΔCH1, △IgG2b, △IgG2a 선택 카세트가 결실됨; 또한 6082로 호칭됨, 바닥)을 보여준다. 인간 가변 유전자는 빈 공간 삼각형으로 나타낸다.
도 17a는 동물의 3개의 상이한 그룹의 비장 및 골수로부터 단리된 B 세포(x-축)에 의한 상대적 mRNA 발현(HPRT1 mRNA로 표준화됨; y-축): 야생형 (WT) 마우스, 도 16의 변형된 중쇄 유전자좌에 대해 동종접합성인 마우스(hJκ, 40hVκ, Adam6, ΔCH1△IgG2b△IgG2a 선택 카세트 결실됨; KoH CH1 del), 및 인간 중쇄 V, D 및 J 분절을 발현하고, IgG1 유전자에서 기능성 CH1 도메인이 부재이고 또한 기능성 IgG2b 및 IgG2a 유전자가 부재이고 단일의 재배열된 경쇄 유전자좌를 포함하는 변형된 마우스 중쇄 유전자좌 둘 다에 대해 동종접합성 마우스(CH1 del x ULC)를 보여준다. 프로브는 생산적 재배열을 검출하게 디자인하였고 인간 Jκ 분절과 뮤린 IgG1 힌지사이에 재조합을 검출하는 프로브(hJκ/mIgG1 힌지 프로브; 좌측 패널) 또는 인간 JH 분절 및 뮤린 IgG1 힌지 사이의 재조합을 검출하는 프로브(hJH/mIgG1 힌지 프로브; 우측 패널)로 이루어져 있다. ND: 검출되지 않음(Ct≥ 35). WT에 대해 n= 2, KoH CH1 del에 대해 2, 및 CH1 del x ULC에 대해 3.
도 17b는 동물의 3개의 상이한 그룹의 비장 및 골수로부터 단리된 B 세포(x-축)에 의한 상대적 mRNA 발현(mKappaC mRNA로 표준화됨; y-축): 야생형 (WT) 마우스, 도 16의 변형된 중쇄 유전자좌에 대해 동종접합성인 마우스(hJκ, 40hVκ, Adam6, ΔCH1△IgG2b△IgG2a 선택 카세트 결실됨; KoH CH1 del), 및 인간 중쇄 V, D 및 J 분절을 발현하고, IgG1 유전자 서열에서 기능성 CH1 도메인이 부재이고 또한 기능성 IgG2b 및 IgG2a 유전자 서열이 부재이고 단일의 재배열된 경쇄 유전자좌를 포함하는 변형된 마우스 중쇄 유전자좌 둘 다에 대해 동종접합성 마우스(CH1 del x ULC)를 보여준다. 프로브는 생산적 재배열을 검출하게 디자인하였고 인간 Jκ 분절과 뮤린 IgG1 힌지 사이에 재조합을 검출하는 프로브(hJκ/mIgG1 힌지 프로브; 좌측 패널) 또는 인간 JH 분절 및 뮤린 IgG1 힌지 사이의 재조합을 검출하는 프로브(hJH/mIgG1 힌지 프로브; 우측 패널)로 이루어져 있다. ND: 검출되지 않음(Ct≥ 35). WT에 대해 n= 2, KoH CH1 del에 대해 2, 및 CH1 del x ULC에 대해 3.
도 18은 비-환원 조건하에서 생산되고 3개의 hVκIgG1△CH1△IgG2a/2b x Vκ3-20Jκ1 ULC 동종접합성 마우스(6082HO 1635 HO), 마우스 불변 영역(WT)과 함께 인간 가변 영역(VH 및 Vκ)을 갖는 3개의 VELOCIMMUNE® 마우스(VI3 IgG1), 및 이량체 단일 도메인 항원 결합 단백질(37-37 동종이량체) 또는 단량체성△CH1 단일 도메인 결합 단백질(CH1은 단일 쇄를 결실시킨다)의 존재 또는 부재를 입증하는 2개의 hVH IgG1△CH1△IgG2a/2b△IgG3△IgD/A/E 마우스(6180 HO)로부터의 마우스 혈청의 항-마우스 IgG로 가시화된, 웨스턴 블롯의 이미지를 제공한다.
상세한 설명
본 발명은 이러한 방법 및 조건이 다양할 수 있으므로, 기재된 특정 방법 및 실험 조건에 한정되지 않는다. 본원에 사용된 용어는 단지 특정 구현예를 기재할 목적을 위한 것이고 한정하려고 하는 것은 아니고 본 발명의 범위는 특허청구범위에 의해서만 한정된다.
달리 정의되지 않는 경우, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것들과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명을 수행하거나 시험하는데 사용될 수 있지만, 특정 방법 및 물질이 현재 기재된다. 본원에 언급된 모든 공보 및 특허문헌은 이들의 전문이 본원에 참조로 인용된다.
본 발명은 이들의 게놈에서, 예를 들어, 이들의 생식선에서 VH-단일 도메인 항원 결합 단백질 및 VL-단일 도메인 항원 결합 단백질을 포함하는 단일 도메인 항원 결합 단백질 및/또는 단일 재배열된 경쇄를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열(들)을 포함하는 유전학적으로 변형된 비-인간 동물(예를 들어, 마우스, 랫트, 토끼, 햄스터 등); 상기를 생산하는 방법; 및 상기를 사용하는 방법을 제공한다. 달리 정의되지 않는 경우, 본원에 사용된 모든 용어 및 문구는 상기 용어 및 문구가 반대로 명백하게 지적되지 않거나 용어 또는 문구가 사용된 내용으로부터 명백하게 자명하지 않는 경우 당업계에서 달성한 의미를 포함한다.
용어 "항체"는 디설파이드 결합에 의해 상호 연결된 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)인 4개의 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 전형적인 면역글로불린 분자를 포함한다. 상기 용어는 또한 항원 또는 이의 단편에 반응성인 면역글로불린을 포함한다. 적합한 항체는 인간 항체, 영장류화된 항체, 키메라 항체, 모노클로날 항체, 단일특이적 항체, 폴리클로날 항체, 폴리특이적 항체, 비특이적 항체, 이특이적 항체, 다중특이적 항체, 인간화된 항체, 합성 항체, 재조합 항체, 하이브리드 항체, 돌연변이된 항체, 그라프트된 접합 항체(즉, 다른 단백질, 방사선표지, 세포독소에 접합되거나 융합된 항체), 및 시험관내-생성된 항체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 당업자는 통상의 항체 이소형, 예를 들어, IgG, IgA, IgM, IgD, 및 IgE, 및 이의 임의의 서브클래스(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4)로 이루어진 그룹으로부터 선택된, 중쇄 불변 영역을 갖는 항체를 용이하게 인지할 것이다.
문구 "중쇄" 또는 "면역글로불린 중쇄"는 임의의 유기체 기원의 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 서열을 포함한다. 중쇄 가변 도메인은 달리 특정되지 않는 경우 3개의 중쇄 CDR 및 4개의 FR 영역을 포함한다. 중쇄의 단편은 CDR, CDR 및 FR, 및 이의 조합체를 포함한다. 전형적인 중쇄는 가변 도메인 후(N-말단에서 C-말단까지) CH1 도메인, 힌지, CH2 도메인, CH3 도메인 및 CH4 도메인(IgM 또는 IgE와 관련하여)을 갖는다. 중쇄의 기능성 단편은 에피토프를 특이적으로 인지할 수 있고(예를 들어, 마이크로몰, 나노몰 또는 피코몰 범위의 KD를 갖는 에피토프를 인지하는), 세포로부터 발현하고 분비할 수 있고, 적어도 하나의 CDR을 포함하는 단편을 포함한다. 중쇄 가변 도메인은 가변 영역 유전자 서열에 의해 암호화되어 있고 이는 일반적으로 생식선에 존재하는 VH, DH 및 JH 분절의 레퍼토리로부터 유래된 VH, DH 및 JH 분절을 포함한다. 다양한 유기체에 대한 V, D 및 J 중쇄 분절의 서열, 위치 및 명명법은 기관[International Immunogenetics Information System (IMGT)]의 웹 사이트(www.imgt.org)에서 검토될 수 있다.
문구 "경쇄"는 임의의 유기체 기원의 면역글로불린 경쇄 서열을 포함하고, 달리 특정되지 않는 경우 인간 카파 및 람다 경쇄 및 VpreB 및 대용 경쇄를 포함한다. 경쇄 가변 도메인은 전형적으로, 달리 특정되지 않는 경우 3개의 경쇄 CDR 및 4개의 프레임워크(FR) 영역을 포함한다. 일반적으로, 전장 경쇄는 아미노 말단에서 카복실 말단으로 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4를 포함하는 가변 도메인 및 경쇄 불변 영역을 포함한다. 경쇄 가변 도메인은 일반적으로, 생식선에 존재하는 VL 및 JL 유전자 분절의 레퍼토리로부터 유래된 VL 및 JL 유전자 분절을 포함하는 경쇄 가변 영역 유전자 서열에 의해 암호화된다. 다양한 유기체에 대한 V 및 J 경쇄 분절에 대한 서열, 위치 및 명명은 기관[International Immunogenetics Information System (IMGT)]의 웹사이트(www.imgt.org)에서 검토될 수 있다. 경쇄는 예를 들어, 이들이 나타나는 에피토프-결합 단백질에 의해 선택적으로 결합된 제1 또는 제2 에피토프에 선택적으로 결합하지 않는 것들을 포함한다. 경쇄는 또한 이들이 나타나는 에피토프-결합 단백질에 의해 선택적으로 결합된 하나 이상의 에피토프를 결합하고 인지하는 것과 함께 중쇄에 결합하고 인지하거나 원조하는 것들을 포함한다. 문구 경쇄는 또한 "범용 경쇄"(ULC)로서도 언급되는 "통상의 경쇄"를 포함한다.
통상적인 또는 범용 경쇄(ULC)는 경쇄 불변 영역과 작동적으로 연결된 단일의 재배열된 면역글로불린 경쇄 가변 영역 암호화 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 유전자좌로부터 유래된 것들을 포함하고, 상기 면역글로불린 경쇄 유전자좌의 발현은 면역글로불린 경쇄 유전자좌에서 다른 핵산 서열, 예를 들어, 다른 경쇄 유전자 분절의 내포와는 상관없이 경쇄 불변 영역에 작동적으로 연결된 단일의 재배열된 면역글로불린 경쇄 가변 영역으로부터 유래된 경쇄만을 생성시킨다. 범용 경쇄는 인간 Vκ1-39Jκ 유전자(예를 들어, Vκ1-39Jκ5 유전자) 또는 인간 Vκ3-20Jκ(예를 들어, Vκ3-20Jκ1 유전자)를 포함하고, 체세포적으로 돌연변이된 (예를 들어, 성숙화된 친화성) 버젼의 동일한 것을 포함한다.
문구 "유전자 분절" 또는 "분절"은 재배열(예를 들어, 내인성 재조합효소에 의해 매개된)에 참여하여 재배열된 V/J(경쇄) 또는 V/D/J (중쇄) 서열을 형성할 수 있는 면역글로불린 유전자좌에서(예를 들어, 인간 및 마우스에서) 재배열되지 않은 서열을 포함하는, V(경쇄 또는 중쇄) 또는 D 또는 J(경쇄 또는 중쇄) 면역글로불린 유전자 분절에 대한 언급을 포함한다. 달리 언급되지 않는 경우, V, D, 및 J 분절은 12/23 법칙에 따른 V/J 재조합 또는 V/D/J 재조합을 가능하게 하는 재조합 신호 서열(RSS)을 포함한다. 달리 지적되지 않는 경우, 분절은 이들이 천연적으로 연합된 서열 또는 이의 기능적 동등물(예를 들어, V 분절, 프로모터(들) 및 리더(들)을 위해)을 추가로 포함한다.
핵산 서열과 관련된 용어 "재배열되지 않은"은 동물 세포, 바람직하게는 유전학적으로 변형되지 않은 동물로부터 유래된 세포의 생식선에 존재하는 핵산 서열을 포함하고, 예를 들어, 야생형 게놈을 포함한다. 일반적으로, 천연의 생식선 배위에서, 중쇄 가변 영역은 재배열되지 않은 VH 유전자 분절, 재배열되지 않은 DH 유전자 분절 및 재배열되지 않은 JH 유전자 분절을 포함하고, 반면 경쇄 가변 영역은 재배열되지 않은 VL 유전자 분절 및 재배열되지 않은 JL 유전자 분절을 포함한다. B 세포 성숙화 과정 동안에, 이들 유전자 분절은 재배열하여 재배열된 가변 영역 유전자를 생성한다.
면역글로불린 핵산 서열과 관련된 용어 "생식선"은 후손으로 전달될 수 있는 핵산 서열을 포함한다.
문구 "상보성 결정 영역" 또는 용어 "CDR"은 면역글로불린 분자(예를 들어, 항체 또는 T 세포 수용체)의 경쇄 또는 중쇄의 가변 영역에서 2개의 골격부 사이에 정상적으로 (즉, 야생형 동물에서)에서 나타나는 유기체의 면역글로불린 유전자의 핵산 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함한다. CDR은, 예를 들어, 생식선 서열 또는 재배열되거나 재배열되지 않은 서열에 의해 및 예를 들어, 순수 또는 성숙한 B 세포 또는 T 세포에 의해 암호화될 수 있다. CDR은 체세포적으로 돌연변이되고(예를 들어, 동물의 생식선에 암호화된 서열과는 다양한), 인간화되고 및/또는 아미노산 치환, 첨가 또는 결실로 변형될 수 있다. 일부 상황에서(예를 들어, CDR3에 대해), CDR은 연속성이 아니지만(예를 들어, 재배열되지 않은 핵산 서열에서) B 세포 핵산 서열에서는, 예를 들어, 서열들을 스플라이싱하거나 연결한 결과(예를 들어, 중쇄 CDR3을 형성하기 위한 V-D-J 재조합)로서 연속성인 2개 이상의 서열(예를 들어, 생식선 서열)에 의해 암호화될 수 있다.
문구 "체세포적으로 돌연변이된"은 클래스-전환을 진행한 B 세포 기원의 핵산 서열에 대한 언급을 포함하고, 여기서, 클래스-전환된 B 세포에서 면역글로불린 가변 영역의 핵산 서열(예를 들어, 중쇄 가변 도메인을 암호화하거나 중쇄 CDR 또는 FR 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 서열)은, 예를 들어, 클래스-전환을 진행하지 않은 B 세포와 클래스-전환을 진행한 B 세포 간의 CDR 또는 프레임워크 핵산 서열에서의 차이와 같은 클래스-전환 전 B 세포에서 핵산 서열과 동일하지 않다. "체세포적으로 돌연변이된"은 친화성 성숙화되지 않은 B 세포에서 상응하는 면역글로불린 가변 영역 서열(즉, 생식선 세포의 게놈에서 서열)과 동일하지 않은 친화성-성숙화된 B 세포 기원의 핵산 서열에 대한 언급을 포함한다. 문구 "체세포적으로 돌연변이된"은 또한 B 세포의 목적하는 에피토프로의 노출 후 B 세포 기원의 면역글로불린 가변 영역 핵산 서열에 대한 언급을 포함하고, 여기서, 핵산 서열은 B 세포의 목적하는 에피토프로의 노출 전 상응하는 핵산 서열과는 상이하다. 문구 "체세포적으로 돌연변이된"은 동물, 예를 들어, 면역원 유발반응에 응답하여 인간 면역글로불린 가변 영역 핵산 서열을 갖는 마우스에서 생성되고 상기 동물에서 고유적으로 작동하는 선별 과정으로부터 비롯된 결합 단백질 기원의 서열을 언급한다.
"과의 동족"의 의미에서 사용되는 경우 용어 "동족", 예를 들어, 제2 VL 도메인"과의 동족"인 제1 VL 도메인은 본 발명에 따라 마우스에 의해 생산된 동일한 결합 단백질 기원의 2개의 VL 도메인간의 관련성에 대한 언급을 포함하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 본 발명의 구현예에 따라 유전학적으로 변형된 마우스, 예를 들어, VH, DH 및 JH 영역이 VL 및 JL 영역으로 대체된 중쇄 유전자좌를 갖는 마우스는 동일한 마우스 CH 영역으로 구성된 2개의 동일한 폴리펩타이드 쇄(예를 들어, 제1 인간 VL 도메인과 융합된 IgM 이소형) 및 제2 인간 VL 도메인과 융합된 동일한 마우스 CL 영역으로 구성된 2개의 동일한 폴리펩타이드 쇄를 갖는 항체형 결합 단백질을 생성한다. 마우스에서 클론 선별 동안에, 제1 및 제2 인간 VL 도메인은 단일 항체형 결합 단백질과 관련하여 함께 존재하는 클론 선별 과정에 의해 선택되었다. 따라서, 단일 항체형 분자에서 클론 선별 과정의 결과로서 함께 존재하는 제1 및 제2 VL 도메인은 "동족"인 것으로서 언급된다. 대조적으로, 제1 항체형 분자에 존재하는 VL 도메인 및 제2 항체형 분자에 존재하는 VL 도메인은 제1 및 제2 항체형 분자가 동일한 중쇄를 갖지 않는 경우(즉, 제1 인간 중쇄 영역과 융합된 VL 도메인 및 제2 인간 중쇄 영역과 융합된 VL 도메인이 동일하지 않은 경우) 동족이 아니다.
항체 발달 초기에, 항체 중쇄는 다양한 선별 계획을 통해 자연이 궁극적으로 기능성 및 친화성-성숙화된 항체를 형성하기 위한 추가의 선별을 진행하기 위해 적합한 중쇄를 선택하는 선별 과정을 진행한다. 중쇄 및 경쇄 가변 유전자 재배열로부터 발생되는 다양성은 골수에 존재하고 클래스 전환에 선행한다. 선조체 B 세포(또는 프로(pro) B 세포)에서 재조합된 중쇄 유전자 분절로부터 발현된 항체 중쇄는 정상적으로 IgM 이소형에서 프로-B 세포의 표면 상에 제공하기 위한 대용 경쇄와 쌍을 형성하여 프레(pre)-B 세포 수용체 또는 프레-BCR로서 언급되는 구조(다른 공-수용체를 포함하는)를 형성한다. 일단, 프레-BCR은 세포 표면상에 제공되고 프레 BCR은 복합체의 적당한 형성을 세포로 신호 전달하여 중쇄가 상기 조기 선별 단계를 거치도록 세포에게 효과적으로 지시하는 것으로 사료된다. 따라서, 세포는 중쇄가 추가의 선별을 진행할 수 있도록 고지된다. 중쇄가 IgM 및 대용 경쇄로 제공되는 경우 프레 BCR의 형성에 해로운 결하는 것을 포함하는 경우, 세포는 아폽토시스를 진행할 것이다. 세포가 아폽토시스를 진행하는 경우, 중쇄의 중쇄 가변 영역의 유용성, 또는 다양성으로의 기여가 상실될 것이다. 따라서, 항체 선별에서 매우 조기 단계는 IgM 이소형과 관련하여 대용 경쇄와 함께 중쇄의 제공을 요구한다. 항체 생산 B 세포의 정상적 발달은 일반적으로 CH1 도메인의 존재를 요구한다. IgM을 포함하는 모든 중쇄 이소형은 CH1 도메인을 포함한다. 대용 경쇄 및 동족 경쇄 둘 다는 IgM의 경우에 중쇄 CH1 도메인을 통해 소정의 중쇄와 상호작용하는 것으로 사료된다.
B-세포가 골수를 이탈한 후, 항원과의 접촉(세포-표면 IgM으로서 발현되는 재배열된 항체간의 낮은 친화성 상호작용을 요구하는)은 체세포 과돌연변이 및 클래스 전환의 협력적 유도를 자극한다. 클래스 전환 후, 표면 B-세포 수용체에 의한 차등적 항원 인지는 증가된 친화성의 항체가 본래의 IgM의 과돌연변이된 유도체 풀로부터 선택되게 한다.
용어 "중쇄만의 항체", "중쇄만의 항원 결합 단백질", "단일 도메인 항원 결합 단백질", "단일 도메인 결합 단백질" 등은, 중쇄 불변 영역은 전형적으로 기능성 CH1 도메인이 부재이기 때문에, 경쇄와 연합할 수 없는 중쇄 불변 영역과 작동적으로 연결된 가변 도메인을 포함하는 면역글로불린형 쇄를 포함하는 단량체성 또는 이종이량체성 면역글로불린 분자를 언급한다. 따라서, 용어 "중쇄만의 항체", "중쇄만의 항원 결합 단백질", "단일 도메인 항원 결합 단백질", "단일 도메인 결합 단백질" 등은 (i) 기능성 CH1 도메인이 부재인 중쇄 불변 영역과 작동적으로 연결된 가변 도메인을 포함하는 면역글로불린형 쇄 중 하나를 포함하는 단량체성 단일 도메인 항원 결합 단백질, 또는 (ii) 이의 각각이 기능성 CH1 도메인이 부재인 중쇄 불변 영역에 작동적으로 연결된 가변 도메인을 포함하는 2개의 면역글로불린형 쇄를 포함하는 동종이량체성 단일 도메인 항원 결합 단백질 둘 다 포괄한다. 다양한 측면에서, 동종이량체성 단일 도메인 항원 결합 단백질은 2개의 동일한 면역글로불린형 쇄를 포함하고, 이의 각각은 기능성 CH1 도메인이 없는 동일한 중쇄 불변 영역에 작동적으로 연결된 동일한 가변 도메인을 포함한다. 또한, 단일 도메인 항원 결합 단백질의 각각의 면역글로불린형 쇄는 중쇄 불변 영역 유전자의 CH1 암호화 서열 (및 임의로 힌지 영역)에서 결실 또는 불활성화 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역(CH) 유전자 서열에 연결된 중쇄 가변 영역 유전자 분절(예를 들어, VH, DH, JH), 경쇄 유전자 분절(예를 들어, VL, JL) 또는 이의 조합체, 예를 들어, IgG, IgA, IgE, IgD 또는 이의 조합체로부터 유래될 수 있는 가변 도메인을 포함한다. 중쇄 유전자 분절로부터 유래된 가변 도메인을 포함하는 단일 도메인 항원 결합 단백질은 "VH-단일 도메인 항체" 또는 "VH-단일 도메인 항원 결합 단백질"로서 지칭될 수 있다. 경쇄 유전자 분절로부터 유래된 가변 도메인을 포함하는 단일 도메인 항원 결합 단백질은 "VL-단일 도메인 항원 결합 단백질"로서 지칭될 수 있다.
상기된 바와 같이, 그와 같이 하게 가공된 비-인간 동물에 의해 단일 도메인 항원 결합 단백질의 생산은 통상적인 항체와 비교하여 항원에 응답하는 항원-특이적 단일 도메인 항원의 비교적 낮은 발현을 유도한다. 당업계에서는 고역가가 재배열된 경쇄의 발현이 거의 없는 경우에만 가능하는 것을 시사한다. 구체적으로, 재배열된 경쇄를 발현하지 않는 동물은 항원에 특이적으로 결합하는 보다 높은 수준의 단일 도메인 항원 결합 단백질을 생산할 수 있는 것으로 주장되었다[문헌참조: Janssens et al. (2006) PNAS 103:15130-15135; Zou et al. (2004) J. Exp. Med. 204:3271-32]. 당업계에서와는 반대로, 본원에 제공된 데이터는 유전학적으로 가공된 단일 재배열된 경쇄를 발현하는 동물이 유발반응 후 고역가의 항원-특이적 단일 도메인 항원 결합 단백질을 생성하는 것을 보여준다. 또한 본원에서는 재배열하고, 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 VL-단일 도메인 항원 결합 단백질을 암호화하기 위해 CH1 서열에서 결실 또는 불활성화 돌연변이를 포함하는 중쇄 불변 영역 유전자와 재조합하는 경쇄 가변 영역 유전자 분절의 능력을 보여준다. 상기 VL-단일 도메인 항원 결합 단백질의 경쇄 가변 도메인은 내인성 및 비변형된 면역글로불린 경쇄 유전자좌로부터 재배열된 경쇄 가변 영역 유전자 서열에서 전형적으로 보이지 않는 재배열된 경쇄 가변 영역 유전자 서열에서, 첨가, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 N 첨가에 의해 동족 경쇄의 부재를 보상하는 것이 가능하다.
따라서, 하나의 측면에서, 비-인간 동물이 제공되고, 상기 동물은 단일 도메인 항원 결합 단백질 및 유전학적으로 가공된 단일 재배열된 경쇄, 예를 들어, 통상의 경쇄를 포함하고, 이때, 단일 도메인 항원 결합 단백질의 적어도 하나의 중쇄는 기능성 CH1 도메인이 부재이다. 또 다른 측면에서, 비-인간 동물이 제공되고, 상기 동물은 경쇄 가변 영역 및 기능성 CH1 도메인이 부재인 중쇄 불변 영역을 포함하는 VL-단일 도메인 항원 결합 단백질을 포함한다. 또 다른 측면에서, 비-인간 동물이 제공되고, 상기 동물은 경쇄 가변 영역 및 기능성 CH1 도메인이 부재인 중쇄 불변 영역 및 유전학적으로 가공된 단일 재배열된 경쇄, 예를 들어, 통상의 경쇄를 포함하는 VL-단일 도메인 항원 결합 단백질을 포함한다. 또한, 유전학적으로 변형된 비-인간 동물을 생산하는 방법, 유전학적으로 변형된 비-인간 동물로부터 단리된 단백질(예를 들어, 단일 도메인 항원 결합 단백질) 세포 및 유전학적으로 변형된 동물로부터 단백질 및 세포를 분리하는 방법이 제공된다.
용어 "고친화성" 항체는 이의 표적 에피토프와 관련하여 약 10-9 M 이하(예를 들어, 약 1 x 10-9 M, 1 x 10-10 M, 1 x 10-11 M, 또는 약 1 x 10-12 M)의 KD를 갖는 항체를 언급한다. 하나의 구현예에서, KD는 표면 플라스몬 공명, 예를 들어, BIACORE™에 의해 측정되고; 또 다른 구현예에서, KD는 ELISA에 의해 측정된다.
용어 "세포"는 재조합 핵산 서열을 발현하기 위해 적합한 임의의 세포를 포함한다. 세포는 원핵 및 진핵 세포들(단일-세포 또는 다중-세포), 세균 세포들(예를 들어, 이. 콜라이(E. coli), 바실러스 종(Bacillus spp.), 스트렙토마이세스 종(Streptomyces spp,)의 균주 등), 마이코박테리아 세포, 진균류 세포, 효모 세포 (예를 들어, 에스. 세레비지애(S. cerevisiae), 에스. 폼베(S. pombe), 피. 파스토스(P. pastos), 피. 메탄올리카(P. methanolica), 등), 식물 세포, 곤충 세포(예를 들어, SF-9, SF-21, 바쿨로바이러스-감염된 곤충 세포, 트리코플러시아니 (Trichoplusia ni), 등), 비-인간 동물 세포, 인간 세포, 또는 예를 들어, 하이브리도마 또는 쿠아드로마와 같은 세포 융합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 인간, 몽키, 유인원, 햄스터, 랫트 또는 마우스 세포이다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 진핵 세포이고 하기의 세포로부터 선택된다: CHO(예를 들어, CHO K1 , DXB-1 1 CHO, Veggie-CHO), COS(예를 들어, COS-7), 망막 세포, Vero, CV1, 신장 (예를 들어, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo205, HB 8065, HL-60, (예를 들어, BHK21), Jurkat, Daudi, A431 (상피), CV-1, U937, 3T3, L 세포, C127 세포, SP2/0, NS-0, MMT 060562, 세르톨리(Sertoli) 세포, BRL 3A 세포, HT1080 세포, 골수종 세포, 종양 세포, 및 상기 언급된 세포로부터 유래된 세포주. 일부 구현예에서, 세포는 하나 이상의 바이러스 유전자, 예를 들어, 바이러스 유전자를 발현하는 망막 세포(예를 들어, PER.C6™ 세포)를 포함한다.
용어 "보존성"은 보존성 아미노산 치환을 기재하기 위해 사용되는 경우 아미노산 잔기가 유사한 화학적 성질(예를 들어, 전하 또는 소수성)을 갖는 측쇄 R 그룹을 갖는 또 다른 아미노산 잔기로 치환되는 것을 포함한다. 일반적으로, 보존성 아미노산 치환은 목적하는 단백질의 기능적 성질, 예를 들어, 요구되는 친화성으로 표적 에피토프에 특이적으로 결합하는 가변 영역의 능력을 실질적으로 변화시키지 않을 것이다. 유사한 화학적 성질을 갖는 측쇄를 갖는 아미노산 그룹의 예는 글라이신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신과 같은 지방족 측쇄; 세린 및 트레오닌과 같은 지방족-하이드록실 측쇄; 아스파라긴 및 글루타민과 같은 아미드-포함 측쇄; 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판과 같은 방향족 측쇄; 라이신, 아르기닌 및 히스티딘과 같은 염기성 측쇄; 아스파르트산 및 글루탐산과 같은 산성 측쇄; 및 시스테인 및 메티오닌과 같은 황-포함 측쇄를 포함한다. 보존성 아미노산 치환 그룹은, 예를 들어, 발린/류신/이소류신, 페닐알라닌/티로신, 라이신/아르기닌, 알라닌/발린, 글루타메이트/아스파르테이트, 및 아스파라긴/글루타민을 포함한다. 일부 구현예에서, 보존성 아미노산 치환은 단백질 중 임의의 천연 잔기가 예를 들어, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발에서 사용된 바와 같은 알라닌으로 치환된 것일 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 참조로 인용된 문헌[참조: Gonnet et al. (1992) Exhaustive Matching of the Entire Protein Sequence Database, Science 256:1443-45]에서 기재된 PAM250 로그-가능성 매트릭스에서 양성 값을 갖는 보존성 치환이 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 치환은 적당한 보존성 치환이고, 상기 치환은 PAM250 로그-가능성 매트릭스에서 비음성 값을 갖는다.
일부 구현예에서, 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄에서 잔기 위치는 하나 이상의 보존성 아미노산 치환으로 상이하다. 일부 구현예에서, 면역글로불린 경쇄 또는 이의 기능성 단편(예를 들어, B 세포로부터의 발현 및 분비를 가능하게 하는 단편)에서 잔기 위치는 이의 아미노산 서열이 본원에 열거된 경쇄와 동일하지 않지만 하나 이상의 보존성 아미노산 치환으로 상이하다.
문구 "에피토프-결합 단백질" 또는 "항원 결합 단백질"은 적어도 하나의 CDR을 갖고 에피토프를 선택적으로 인지할 수 있는, 예를 들어, 약 1마이크로몰 이하인 KD(예를 들어, 약 1 x 10-6 M, 1 x 10-7 M, 1 x 10-9 M, 1 x 10-9 M, 1 x 10-10 M, 1 x 10-11 M, 또는 약 1 x 10-12 M인 KD)로 에피토프에 결합할 수 있는 단백질을 포함한다. 치료학적 에피토프-결합 단백질(예를 들어, 치료학적 결합 단백질)은 흔히 나노몰 또는 피코몰 범위인 KD를 요구한다.
문구 "기능성 단편"은 발현되고 분비될 수 있고, 마이크로몰, 나노몰 또는 피코몰 범위의 KD로 에피토프와 특이적으로 결합할 수 있는 에피토프-결합 단백질의 단편을 포함한다. 특이적 인지는 적어도 마이크로몰 범위, 나노몰 범위 또는 피코몰 범위인 KD를 갖는 것을 포함한다.
서열의 비교와 관련된 용어 "동일성"은 뉴클레오타이드 및/또는 아미노산 서열 동일성을 측정하기 위해 사용될 수 있는 당업계에 공지된 임의의 다수의 상이한 알고리즘에 의한 측정시의 동일성을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 동일성은 10.0의 개방 갭 페널티, 0.1의 연장 갭 페널티를 사용하는 ClustalW v. 1.83(슬로우(slow)) 정렬 및 고넷 유사성 매트릭스(Gonnet similarity matrix)(MACVECTOR™ 10.0.2, MacVector Inc., 2008)를 사용하여 결정한다. 용어 "동일성"은 중합성 분자, 예를 들어, 핵산 분자(예를 들어, DNA 분자 및/또는 RNA 분자) 및/또는 폴리펩타이드 분자간의 전체 관련성을 포함한다. 일부 구현예에서, 중합체성 분자는 이들의 서열이 적어도 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 동일한 경우 서로 "실질적으로 동일한" 것으로 고려된다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 어느 잔기가 상이한 서열에서 서로 "상응"하는지를 고려하는 경우 또 다른 서열과 비교하여 하나의 서열에서 지정된 길이의 갭을 허용함에 의한 것을 포함하는 이들의 상동성 정도를 결정하기 위해 서열 비교를 가능하게 하는 다양한 알고리즘이 유용하다. 2개의 핵산 서열 간의 % 동일성의 계산은, 예를 들어, 최적의 비교 목적을 위해 2개의 서열을 정렬시킴에 의해 (예를 들어, 갭은 최적의 정렬을 위해 제1 및 제2 핵산 서열 중 하나 또는 둘 다에 도입되고 비-상응하는 서열은 비교 목적을 위해 무시될 수 있다) 수행될 수 있다. 특정 구현예에서, 비교 목적을 위해 정렬된 서열의 길이는 표준 서열의 길이의 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 실질적으로 100%이다. 이어서, 상응하는 뉴클레오타이드 위치에서 뉴클레오타이드를 비교한다. 제1 서열에서의 위치가 제2 서열에서 상응하는 위치와 동일한 뉴클레오타이드에 의해 점유되는 경우, 상기 분자는 당해 위치에서 동일하다. 2개의 서열 간의 % 동일성은 2개의 서열의 최적의 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 갭의 수 및 각각의 갭의 길이를 고려하여 서열에 의해 공유된 동일한 위치의 수의 함수이다. 2개의 뉴클레오타이드 서열 간의 % 동일성을 결정하는데 유용한 대표적인 알고리즘 및 컴퓨터 프로그램은, 예를 들어, PAM120 중량 잔기 표, 12의 갭 길이 페널티 및 4의 갭 페널티를 사용하는 ALIGN 프로그램(버젼 2.0)으로 도입된 메이어스 및 밀러(CABIOS, 1989, 4: 11-17)의 알고리즘을 포함한다. 2개의 뉴클레오타이드 서열 간의 % 동일성은 대안적으로, 예를 들어, NWSgapdna.CMP 매트릭스를 사용한 GCG 소프트웨어 팩키지에서 GAP 프로그램을 사용하여 결정될 수 있다.
문구 "마이크로몰 범위"는 1-999 마이크로몰을 의미하는 것으로 의도되고; 문구 "나노몰 범위"는 1 내지 999 나노몰을 의미하는 것으로 의도되고; 문구 "피코몰 범위"는 1 내지 999 피코몰을 의미하는 것으로 의도된다.
용어, "작동적으로 연결된"은 작동적으로 연결된 성분들이 이들의 의도된 방식으로 기능하는 관계를 언급한다. 하나의 경우에, 단백질을 암호화하는 핵산 서열은 조절 서열(예를 들어, 프로모터, 인핸서, 사일런서 서열 등)에 작동적으로 연결되어 적당한 전사 조절을 유지할 수 있다. 하나의 경우에, 면역글로불린 가변 영역(또는 V(D)J 분절)의 핵산 서열은 면역글로불린 불변 영역의 핵산 서열에 작동적으로 연결되어 재배열된 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 유전자 서열로의 서열 간의 적당한 재조합을 가능하게 할 수 있다.
유전자 대체를 지칭하는 용어 "대체"는 외인성 유전학적 물질이 내인성 유전학적 유전자좌에 위치하여 내인성 유전자 전부 또는 일부가 이종상동성 또는 상동성 핵산 서열로 대체되는 것을 지칭한다.
용어 "비-인간 동물"은 원구류, 경골어, 상어 및 레이와 같은 연골성 어류, 양서류, 파충류, 포유동물 및 조류와 같은 임의의 척추동물을 포함하기 위한 용어이다. 적합한 비-인간 동물은 포유동물을 포함한다. 적합한 포유동물은 비-인간 영장류, 염소, 양, 돼지, 개, 소 및 설치류를 포함한다.
본 발명의 일부 측면에서, 비-인간 동물은, 예를 들어, 슈퍼패밀리 디포도이데아 또는 무로이데아의 작은 포유동물을 포함한다. 하나의 구현예에서, 유전학적으로 변형된 동물은 설치류이다. 하나의 구현예에서, 상기 설치류는 마우스, 랫트, 다람쥐, 호저 또는 햄스터로부터 선택된다. 하나의 구현예에서, 설치류는 슈퍼패밀리 무로이데아로부터 선택된다. 하나의 구현예에서, 유전학적으로 변형된 동물은 칼로미시대(Calomyscidae)(예를 들어, 마우스형 햄스터), 크리세티대(Cricetidae)(예를 들어, 햄스터, 신세계 랫트 및 마우스, 들쥐), 무리대(Muridae) (진정한 마우스 및 랫트, 게르빌루스쥐, 아프리카가시쥐, 볏이 있는 랫트), 네소미이대(Nesomyidae) (클라임빙 마우스, 락 마우스, 흰꼬리 랫트, 말라가시 랫트 및 마우스), 플라타칸토미대(Platacanthomyidae)(예를 들어, 가시겨울잠쥐), 및 스팔라시대(Spalacidae) (예를 들어, 뒤쥐, 대나무 랫트 및 조코르(zokor))로부터 선택된 패밀리 기원이다. 특정 구현예에서, 유전학적으로 변형된 설치류는 진정한 마우스 또는 랫트(패밀리 무리대), 게르빌루스쥐, 아프리카가시쥐, 및 볏이 있는 랫트로부터 선택된다. 하나의 구현예에서, 유전학적으로 변형된 마우스는 패밀리 무리대의 구성원으로부터 기원한다. 하나의 구현예에서, 상기 동물은 설치류이다. 특정 구현예에서, 설치류는 마우스 및 랫트로부터 선택된다. 하나의 구현예에서, 비-인간 동물은 마우스이다.
특정 구현예에서, 비-인간 동물은 C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr, 및 C57BL/Ola로부터 선택된 C57BL 종의 마우스인 설치류이다. 또 다른 구현예에서, 마우스는 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1(예를 들어, 129S1/SV, 129S1/Svlm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2(문헌참조: 예를 들어, Festing et al. (1999) Revised nomenclature for strain 129 mice, Mammalian Genome 10:836, 또한 참고, Auerbach et al (2000) Establishment and Chimera Analysis of 129/SvEv- and C57BL/6-Derived Mouse Embryonic Stem Cell Lines)인 종으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 129개 종이다. 특정 구현예에서, 유전학적으로 변형된 마우스는 상기 언급된 129개 종과 상기 언급된 C57BL/6 종의 혼합종이다. 또 다른 특정 구현예에서, 상기 마우스는 상기 언급된 129개 종의 혼합종 또는 상기 언급된 BL/6 종의 혼합종이다. 특정 구현예에서, 혼합종의 129개 종은 129S6(129/SvEvTac) 종이다. 또 다른 구현예에서, 상기 마우스는 BALB 종, 예를 들어, BALB/c 종이다. 또 다른 구현예에서, 상기 마우스는 BALB 종 및 또 다른 상기 언급된 종의 혼합종이다.
하나의 구현예에서, 비-인간 동물은 랫트이다. 하나의 구현예에서, 랫트는 위스타르 랫트, LEA 종, 스프라구 돌리 종(Sprague Dawley strain), 피셔 종(Fischer strain), F344, F6, 및 검은 아구터로부터 선택된다. 하나의 구현예에서, 랫트 종은 위스타르, LEA, 스프라구 돌리, 피셔, F344, F6, 및 검은 아구터로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 2개 이상의 종의 혼합종이다.
본원에 사용된 바와 같은 "유전학적으로 가공된", "유전학적으로 변형된" 등은, 예를 들어, 동물에 의한 비-천연 폴리펩타이드를 생성시키는 핵산 서열의 인공 조작, 변형 및/또는 재조합을 포함한다.
단일 도메인 항원 결합 단백질의 생산을 위해 유전학적으로 가공된 동물
본원에서는 (a) 하나 이상의 비-IgM 면역글로불린 불변 영역을 포함하는 변형된 면역글로불린 중쇄 유전자좌에서 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역 유전자 서열에 의해 각각 암호화될 수 있는 단일 도메인 항원 결합 단백질, 예를 들어, VH- 또는 VL- 단일 도메인 결합 단백질(여기서, 온전한 IgM CH1 불변 영역을 보유하면서 기능성 CH1 도메인이 불활성화되고/되거나 제거되어 있다) 및/또는 (b) 경쇄 유전자좌에서 단일의 재배열된 가변 유전자 서열, 예를 들어, 면역글로불린 카파 유전자좌로 삽입된 단일의 재배열된 Vκ:Jκ 유전자 서열에 의해 암호화될 수 있는 유전학적으로 가공된 단일의 재배열된 경쇄를 포함하는 유전학적으로 변형된 비-인간 동물이 제공된다.
항체는 인간 치료제로서 유용하다. 단일 도메인 결합 단백질은 또한 인간 치료제로서 유용하다. 단일 도메인 결합 단백질은 경쇄가 부재이기 때문에, 이들은 보다 소형이고 따라서 경쇄를 포함하는 항체보다 우수한 조직 침투를 나타내고 여전히 통상의 항체와 비교하여 유사한 것 이상의 우호적인 약리역학적 프로필을 갖고 여전히 유사한 작동체 기능을 보유한 것으로 예상된다. 이들은 보다 소형이기 때문에, 단일 도메인 결합 단백질은 또한 소정의 용적에서 보다 큰 투여 용량으로 투여할 수 있다. 결합 단백질의 빈번한 투여 방법은 피하 주사에 의한 것이고 소정의 항체의 투여 용량에 대한 투여 용적의 감소는 환자에게 이득을 제공할 수 있고 대형 용적의 피하 주사로 인한 합병증 및 통증을 회피할 수 있다.
단일 도메인 결합 단백질의 또 다른 이점은 단일 치료제에서 2개의 상이한 에피토프에 대해 특이성을 갖는 면역글로불린 쇄를 이종이량체화함에 의해 이특이적 항체를 형성하는 능력이다. 단일 도메인 결합 단백질은 경쇄가 부재이기 때문에, 이들은 특히 다른 쇄의 결합 친화성 또는 특이성을 방해하는 경쇄를 생성하는 경쇄 재배열이 없기때문에 이특이적 항체를 생산하는데 적합하다.
낙타과, 특정 어류 및 병리학적 병태에서 관찰은 일부 상황하에서 이의 중쇄 불변 영역에서 기능성 CH1 도메인이 부재인 결합 단백질이 동족 경쇄의 부재하에 발현될 수 있음을 밝힌다. 따라서, 하나의 구현예에서, 결합 단백질은 또한 경쇄 가변 영역 및 경쇄 불변 영역을 포함하는 경쇄가 없는 항체, 즉, 각각 중쇄 불변 영역을 포함하는 1개 또는 2개의 면역글로불린 폴리펩타이드 쇄를 포함하는 "중쇄만의 항체"로서 당업계에 널리 공지되어 있고, 여기서, 중쇄만의 항체의 면역글로불린 폴리펩타이드 쇄 중 적어도 하나는 기능성 CH1 도메인이 부재이다. 중쇄만의 항체에 대한 교시는 당업계에 보고되어 있고, 예를 들어, 문헌[PCT 공개공보 WO02085944, WO02085945, WO2006008548, 및 WO2007096779]을 참조한다. 또한 미국 특허 제5,840,526호; 미국 특허 제5,874,541호; 미국 특허 제6,005,079호; 미국 특허 제6,765,087호; 미국 특허 제5,800,988호; EP 1589107; WO 9734103; 및 미국 특허 제6,015,695호를 참조하고 이들은 본원에 참조로 인용된다.
중쇄만의 항원 결합 단백질을 생산하게 유전학적으로 변형된 비-인간 동물은 당업계에 널리 공지되어 있다. 문헌[예를 들어, Janssens et al. (2006) PNAS 103:15130-15135; Zou et al. (2004) J. Exp. Med. 204:3271-32]을 참조한다. 예를 들어, 면역글로불린 G(IgG) 유전자에서 기능성 CH1 서열이 부재이도록 유전학적으로 변형된 동물 및 특히 설치류(예를 들어, 마우스)는 이어서 단일의 도메인 항원 결합 단백질을 발현하였다.
낙타과, 특정 어류 및 생리학적 병태에서의 관찰이 일부 상황에서 이의 중쇄 불변 영역의 CH1 도메인이 부재인 결합 단백질이 동족 경쇄의 부재하에 발현될 수 있는 것으로 밝혔지만, 항체-생산 B 세포의 정상적 발달은 일반적으로 CH1 도메인의 존재를 필요로 한다. IgM을 포함하는 모든 중쇄 이소형은 CH1 도메인을 포함한다. 대용 경쇄 및 동족 경쇄 둘 다는 IgM에서 중쇄의 CH1 도메인을 통해 소정의 중쇄와 상호작용하는 것으로 사료된다. 단일 도메인 결합 단백질의 발달이 IgM 이소형 중쇄의 구조적 통합성 또는 기능성에 의존하는 정도로 IgM의 구조적 통합성 또는 기능의 붕괴는 바람직하지 않을 것이다.
항체의 정상적 발달은 항체가 기능적 및 유용한 항체의 생존적이고 궁극적인 발현을 유도하는 다수의 복합체 선택 계획을 거쳐 생존하는 것이 필요하다. 항체 구조에서의 붕괴는 구조적 붕괴가 하나 이상의 천연의 항체 선택 계획을 충족하기 위해 효과적으로 경쟁하고 전개하는 항체의 무능력을 유도하는 정도로 항체의 생존적이고 궁극적인 발현에 해로운 것을 입증할 수 있다.
항체 발달 초기에, 항체 중쇄는 자연이 다양한 선택 계획을 통해 적합한 중쇄를 선택하여 추가의 선별을 진행하여 궁극적으로 기능적 및 친화성-성숙화된 항체를 형성하는 선별 과정을 진행한다. 선조체 B 세포(또는 프로-B 세포)에서 재조합된 중쇄 유전자 분절로부터 발현된 항체 중쇄는 프레-B 세포 수용체 또는 프레-BCR로서 언급되는 구조(이는 다른 공-수용체를 포함하는)를 형성하게 정상적으로 IgM 이소형에서 프로-B 세포의 표면 상에 제공하기 위해 대용 경쇄와 쌍을 형성한다. 프레-BCR이 세포 표면상에 제공되는 경우, 프레-BCR은 복합체의 적당한 형성을 세포에 신호를 전달하여 상기 세포에게 중쇄가 이러한 조기 선별 단계를 거치도록 효과적으로 지시하는 것으로 사료된다. 따라서, 상기 세포는 중쇄가 추가의 선별을 진행할 수 있는 것으로 고지된다. 중쇄가 IgM 및 대용 경쇄에서 제공되는 경우 프레-BCR의 형성에 해로운 결하는 것을 포함하는 경우, 세포는 아폽토시스를 진행할 것이다. 세포가 아폽토시스를 진행하는 경우, 중쇄의 중쇄 가변 영역의 유용성 또는 다양성에 대한 기여는 상실된다. 따라서, 항체 선별에서 매우 조기 단계는 IgM 이소형에서 대용 경쇄와 함께 중쇄의 제공이 필요하다. 대용 경쇄는 적어도 부분적으로 IgM의 CH1 도메인을 통해 IgM과 상호작용하는 것으로 사료된다. 조기 접합부(예를 들어, 비기능성 CH1 도메인)에서 항체 구조에서의 실패 또는 붕괴는 클론 선별 실패, 중쇄를 발현하는 프로-B 세포의 상실 및 유용한 항체에서 특정 중쇄 가변 도메인을 사용할 가능성의 상실을 유도할 수 있다.
일단, 프레-BCR을 포함하는 세포가 상기 선별 단계를 거치는 경우, 다음의 선별 단계는 중쇄가 동족 경쇄(예를 들어, 마우스 및 인간에서 카파 또는 람다)와 쌍을 이룰 것을 요구한다. 상기 쌍을 이룬 중쇄/동족 경쇄 구조는 IgM의 CH1 도메인을 통해 IgM 이소형에서 세포, 현재 순수 프레-B 세포의 표면상에 다시 제공된다. 상기 표면상의 이러한 복합체는 기능성 막-결합된 B 세포 수용체(BCR)를 유도한다. 상기 BCR은 중쇄가 추가의 선별을 위해 적합하고 세포가 현재 상기 특정 경쇄를 발현하여 친화성 성숙화 및 클래스 전환을 포함하는 추가의 B 세포 성숙화 단계로 진행할 수 있음을 세포에 신호를 전달하는 것으로 사료된다. 중쇄가 IgM 및 이의 동족 경쇄에서 제공되는 경우 BCR의 형성에 해로운 결하는 것을 포함하는 경우, 세포는 아폽토시스를 진행할 것이다. 세포가 아폽토시스를 진행하는 경우, 중쇄의 중쇄 가변 영역의 유용성 또는 다양성으로 기여는 상실될 것이다. 따라서, 항체 선별에서 매우 조기 단계는 IgM 이소형에서 동족 경쇄와 함께 중쇄의 제공을 필요로 한다. 다시, 상기 조기 접합부에서 항체 구조(예를 들어, 비-기능성 CH1 도메인)에서 실패 또는 붕괴는 클론 선별 실패를 유도하고 결과적으로 중쇄를 발현하는 프레-B 세포를 상실시킬 수 있다.
따라서 지금까지 선별에서 생존하여 IgM과 관련하여 동족 경쇄와 쌍을 이룬 중쇄를 제공하는 프레-B 세포가 궁극적으로 클래스 전환 및 추가의 선별 기작(여기서, 중쇄 및 동족 경쇄는 IgG 이소형에서 B 세포 표면 상에 제공된다)을 유도하는 성숙화 과정을 진행한다. 상기 단계에서 CH1 도메인이 부재이거나 CH1 도메인 및 힌지 영역이 부재인 IgG 중쇄의 임의의 선별이 일어날 것이다. 본 발명에 따른 동물에서, 중쇄 유전자좌에서 가변 영역의 증가된 레퍼토리가 CH1 도메인이 부재이거나 CH1 도메인 및 힌지 영역이 부재인 IgG 중쇄에서 발현되게 생존할 것인지에 의존하여 선별을 위해 가용할 것으로 사료된다. 대조적으로, 손상된 IgM을 갖는 마우스는 손상된 IgM에서 선별에 생존할 수 있는 가변 영역이 클래스 전환을 위해 가용할 것이기 때문에 중쇄 가변 영역의 완전한`레퍼토리를 제공할 가능성이 없다.
따라서, 기능성 IgM이 부재인 동물은 달리 적합한 중쇄 가변 유전자 분절의 재배열 후 B 세포 집단을 생산할 능력에서의 현저한 감소를 경험할 수 있다. 상기 경우에, 가변 영역의 충분한 공급이 가능한 경우에도(즉, 동물이 예를 들어, 중쇄 면역글로불린 유전자좌에서 재배열하여 중쇄 불변 영역에 작동적으로 연결될 수 있는 적합한 수의 가변 영역 유전자 분절을 갖는다), 바람직한 정도의 다양성을 나타내는 만족할만한 B 세포 집단은 선별 과정 동안에 중쇄의 생존에 대해 완화시키는 IgM 손상 때문에 형성될 수 없다.
IgM과 관련하여 B 세포 발달 동안에 제공되는 경우 효과적으로 선별에서 생존할 수 있는 중쇄 면역글로불린 유전자좌에서 적합한 수의 재배열된 가변 영역은 비-인간 동물을 목적하는 면역원으로 면역화시킴에 의해 항체를 생산하기에 충분한 다양성을 생성시키기 위해 유지되는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 면역글로불린 중쇄에서 비기능성 CH1 도메인 또는 비기능성 CH1 도메인, 및 임의로 비기능성 힌지 영역을 포함하는 유전학적으로 변형된 비-인간 동물은 IgM 대립형질유전자 중 어느 하나 또는 둘 다에서 CH1 결실을 포함하지 말아야 한다. 본원에 참조로 인용된 미국 제2011/0145937호에 기재된 상기 동물은 CH1 도메인이 결실되거나 불활성화되고 1) 경쇄 파트너 없이 세포 표면에서 폴딩하고 발현하고 2) 항원에 의해 자극되고 선별되기 위해 경쇄의 부재하에 항원을 여전히 인지하는 단일-도메인 표면 IgG(B-세포 수용체)를 발현하는 IgG 불변 유전자 영역으로의 클래스 전환을 나타낸다.
본 발명의 다양한 구현예에서, 다음에 한정되지 않지만, 예를 들어, VH 및 VL 단일 도메인 결합 단백질과 같은 단일 도메인 항원 결합 단백질을 포함하는, CH1 도메인이 부재인 결합 단백질을 생산하는 유전학적으로 변형된 비-인간 동물이 제공된다. 유전학적으로 변형된 비-인간 동물은 기능성 면역글로불린 중쇄 도메인(CH1 도메인), 예를 들어, IgG1 CH1 도메인의 부재를 포함하는 유전학적 변형을 포함할 수 있고, 일부 구현예에서, 기능성 CH1 도메인이 부재인 면역글로불린 중쇄에서 힌지 영역의 결실을 포함하는 추가의 변형(여기서, 비-인간 동물은 기능성 IgM을 발현한다)을 포함한다. 다른 변형은 IgG1 및 IgM 이외의 다른 이소형이 비기능성이 되게하는 것을 포함하고 예를 들어, IgD, IgG3, IgG2a, IgG2c, IgG2b, IgA, 및 IgE에 대해 유전자에서의 결실 또는 유전자의 결실 또는 유전자에서 불활성화 돌연변이, 예를 들어, IgD, IgG3, IgG2a, IgG2c, IgG2b, IgA, 및 IgE의 CH1 도메인 또는 힌지 영역의 결실 또는 불활성화 돌연변이를 생성시킴을 포함한다. 비-인간 동물, 비-인간 배아 및 세포를 생산하기 위한 유전학적으로 변형된 비-인간 배아, 세포 및 표적화 작제물이 또한 제공된다.
VH 도메인(예를 들어, 내인성 또는 인간 VH 도메인) 또는 VL 도메인(예를 들어, 인간 VL 도메인)을 포함할 수 있는, 단일 도메인 항원 결합 단백질을 포함하는, 면역글로불린 CH1 도메인(및 임의로 힌지 영역)이 부재인 결합 단백질을 생산하는 동물을 생산하기 위한 조성물 및 방법이 또한 제공된다. 상기 방법은 선택적으로 내인성 비-IgM CH1 영역이 비기능성이 되게 하고(예를 들어, CH1 도메인의 서열의 결실 또는 불활성화에 의해) 비-인간에서 키메라 인간 결합 단백질을 생산하기 위해 내인성 가변 영역 유전자좌에서 재배열되지 않은 내인성 중쇄 가변 영역(HCVR) 유전자 분절, 재배열되지 않은 인간 가변 영역(hHCVR) 유전자 분절 또는 재배열되지 않은 인간 경쇄 가변 영역(hLCVR)을 사용하는 것을 포함한다. CH1 도메인의 결실은 하나 이상의 면역글로불린 불변 영역 유전자(예를 들어, IgG1, IgD, IgG3, IgG2a, IgG2c, IgG2b, IgA, 또는 IgE 유전자들)에서 생성되지만, IgM 유전자에서는 아니다. 결실이 IgG에 있는 구현예에서, 상기 방법은 기능성 IgM을 보유하면서, 하나 이상의 IgG CH1 도메인이 선택적으로 비기능성이 되게 한다. 하나 이상의 IgG CH1 도메인의 결실에 추가로, 기능성 CH1 도메인이 부재인 IgG(들)의 힌지 영역(들)을 결실시키거나 비기능성이 되게 하기 위한 추가의 구현예가 제공된다.
상기 특정 구현예에서, IgG CH1 결실 방법은 유전학적으로 변형된 비-인간 동물의 모든 Ig 이소형이 비기능성 CH1 또는 CH1 도메인(및, 임의로 힌지)의 결실을 나타내는 것은 아니기 때문에, 동물에서 천연 B 세포 발달에서 비교적 보존성 붕괴를 사용한다. 따라서, CH1 변형은 IgM 분자에서 일어나지 않고 따라서 기능성 CH1을 갖는 IgM에 의존하는 조기 B 세포 발달에서 상기된 바와 같은 상기 단계에 영향을 미치지 않는다. IgM은 변형되지 않기 때문에, IgG(및 임의로 IgG의 힌지 영역)의 CH1 도메인의 하나 이상의 결실을 포함하지만 IgM의 CH1 도메인은 결실되지 않은 동물은 IgG와 관련된 가변 도메인의 제공 전에 클론 선별 단계에서 만족할만한 대형 레퍼토리의 가변 영역을 가공할 수 있어야만 한다. 따라서, 다양한 구현예에서, 단일 도메인 결합 단백질에 사용하기 위해 가용한 가변 영역의 다양성에 대한 유전학적 변형(들)의 임의의 해로운 효과는 IgG 관련 선별을 위해 가용한 가변 영역의 풀에 부정적 영향을 주지 않아야 한다. 추가로, 생식선에서 비기능성이 되게 하는(예를 들어, 결실된) CH1 서열이 IgG1인 경우, 상기 동물은 CH1 도메인을 암호화하는 임의의 RNA를 생산하는 능력이 부재이다.
CH1 도메인, 하나 이상의 비-IgM 면역글로불린 이소형의 CH1 및 임의로 힌지 영역이 비기능성이 되게 비-인간 동물을 유전학적으로 변형시키는 것은 완전한, 또는 실질적으로 완전한 레퍼토리의 V 영역 유전자 분절, 예를 들어, VH 또는 VL 영역, 단일 도메인 결합 단백질에서 발현시키기 위해 적합한 V 영역으로부터 선별할 수 있는 동물을 유도할 수 있다. IgG 이소형(IgM이 아닌)을 선택적으로 변형시키는 것은 CH1 도메인의 부재 또는 IgM에서 CH1 도메인의 부재로 인해 선별에서 생존하는 가변 영역의 수의 잠재적 감소를 회피한다. 따라서, 보다 완전한 레퍼토리의 V 영역은 IgG와 관련된(CH1 도메인이 부재이거나 CH1 도메인이 부재이고 힌지 영역이 부재인) 선별을 위해 이용할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따라 유전학적으로 변형된 동물에서 V 도메인의 선택은, 예를 들어, V 도메인이 변형된 IgM 구조로 인해 조기 IgM 의존성 B 세포 발달 장애를 극복하게 도와줄 수 있는 것에 의존하지 않는다. 대신, 조기 IgM-의존성 단계들은 정상적으로 일어나야만 하고 CH1 도메인이 부재이거나 CH1-도메인이 부재이고 힌지 영역이 부재인 IgG와 관련하여 발현하게 하는 이들의 민감성에 대한 선별을 위해 가용한 대형 레퍼토리의 중쇄를 유도한다.
따라서, 다양한 구현예에서, 본 발명에 따른 유전학적으로 변형된 동물은 보다 천연의 클론 선별 과정을 위한 기회를 제공해야만 하는 기능성 IgM 발현을 유지해야만 한다. 예를 들어, 기능성 IgM(예를 들어, 기능성 CH1 도메인을 포함하는 IgM)과 함께, 대용 경쇄 및 동족 경쇄 둘 다는 IgM의 CH1 도메인을 통해 연합할 수 있고 조기 B 세포 발달에서 선별 과정에 참여할 수 있다. 본 발명에 따른 유전학적으로 변형된 동물에서, IgG 이소형으로의 클래스 전환은 기능성 CH1 도메인이 부재이거나 기능성 CH1 도메인 및 기능성 힌지가 부재인 불변 도메인과 관련하여 발현될 수 있는 중쇄 가변 도메인의 임의의 선별이 접하게 되는 제1 선별 단계이다.
다양한 구현예에서, CH1 도메인에서 결실 또는 불활성화 돌연변이를 포함하는 비-인간 동물에서 비-IgM 중쇄 불변 영역은 비-인간, 예를 들어, 내인성 비-인간 중쇄 불변 영역을 포함한다. 또 다른 구현예에서, CH1 도메인에서 결실 또는 불활성화 돌연변이를 포함하는 비-인간 동물에서 비-IgM 중쇄 불변 영역은 인간 중쇄 불변 영역이다. 동물이 경쇄 불변 영역에 작동적으로 연결된 단일의 재배열된 경쇄 유전자 서열을 추가로 포함하는 또 다른 구현예에서, 경쇄 불변 영역은 비-인간, 예를 들어, 내인성 비-인간 경쇄 불변 영역이거나; 경쇄는 인간 경쇄 불변 영역이다.
V
L
-단일 도메인 결합 단백질, 예를 들어, 경쇄 가변 도메인을 갖는 단일 도메인 항원 결합 단백질
본원에서는 2개 유형의 단일 도메인 항원 결합 단백질: (1) 재배열된 중쇄 가변 영역 유전자 서열에 의해 암호화된 VH 단일 도메인 결합 단백질 및 (2) 재배열된 경쇄 가변 영역 유전자 서열에 의해 암호화된 VL 단일 도메인 결합 단백질을 포함하는 유전학적으로 변형된 비-인간 동물이 제공되고, 각각은 또한 온전한 IgM CH1 불변 영역을 보유하면서 기능성 CH1 도메인이 불활성화되고/되거나 제거된 하나 이상의 비-IgM 면역글로불린 불변 영역을 포함하는 변형된 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 의해 암호화되어 있다.
따라서, 하나의 구현예에서, 경쇄 가변 영역 유전자 분절들, 예를 들어, 중쇄 불변 영역에 작동적으로 연결된 Vκ, Jκ, Vλ, 및/또는 Jλ 유전자 분절을 포함하게 유전학적으로 가공된 중쇄 유전자좌가 제공된다. 경쇄 가변 영역을 포함하게 하기 위한 중쇄 유전자좌의 유전학적 가공이 기재되어 있다. 예를 들어, 하나 이상의, 실질적으로 모든 또는 모든 면역글로불린 중쇄 가변 영역 VH, DH, 및/또는 JH 유전자 분절이 하나 이상의 경쇄 가변 영역 VL 및/또는 JL 유전자 분절로 대체된 것을 포함하는 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 포함하는 비-인간 동물의 생산은, 예를 들어, 이의 전문이 본원에 참조로 인용된 미국 특허원 제20120096572호에 기재되어 있다.
당업자는 대체된 VL 및/또는 JL 유전자 분절이 생산적 재배열을 진행할 수 있는 재배열되지 않은 VL 및/또는 재배열되지 않은 JL 유전자 분절을 포함할 수 있음을 용이하게 인지한다. 추가로, VL 및/또는 JL 유전자 분절은 Vκ, Jκ, Vλ, Jλ 유전자 분절로부터 선택된 하나 이상의 분절일 수 있고 이의 조합체일 수 있다. 하나의 구현예에서, 하나 이상의 중쇄 가변 영역 유전자 분절은 하나 이상의 인간 경쇄 가변 유전자 분절로 대체되어 이것은 인간 유전자형을 갖는 가변 도메인의 생산을 가능하게 한다.
본원에 제공된 바와 같이, 중쇄 불변 영역에 작동적으로 연결된 경쇄 가변 영역 유전자 분절, 예를 들어, Vκ, Jκ, Vλ, 및/또는 Jλ 유전자 분절을 포함하게 유전학적으로 가공된 중쇄 유전자좌는 생산적 유전자 재배열을 진행하여 중쇄 불변 영역의 하나 이상의 도메인 또는 유전자 분절이 불활성화되거나 결실된 경우에도 면역글로불린 쇄를 형성할 수 있다. 본원에서 보여지는 바와 같이, 중쇄 가변 영역 유전자 분절이 예를 들어, IgG1 유전자에서 CH1 도메인의 결실과 커플링된 경쇄 가변 영역 유전자 분절로 대체되어 경쇄 가변 영역을 갖는 단일 도메인 항원 결합 단백질을 유도한다. 구체적으로, 중쇄 유전자좌의 내인성 중쇄 가변 영역 유전자 분절의 카파(κ) V 및 J 유전자 분절(Vκ 및 Jκ)로의 대체는 중쇄 불변 영역(KoH)에 작동적으로 연결된 카파 가변 영역을 유도한다. CH1 도메인(들)(CH1 del)을 결실시키기 위한 중쇄 유전자좌로의 추가의 변형은 기능성 CH1 도메인이 부재인 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 포함하는 면역글로불린 폴리펩타이드 쇄를 암호화하는 면역글로불린 유전자좌(KoH CH1 del)를 유도하고, 여기서, 면역글로불린 폴리펩타이드 쇄는 단일 도메인 항원 결합 단백질, 예를 들어, VL-단일 도메인 항원 결합 단백질을 형성할 수 있다.
따라서, 일부 구현예에서, 기능성 CH1 도메인이 부재인 중쇄 불변 영역에 작동적으로 연결된 경쇄 가변 도메인을 포함하는 VL 단일 도메인 결합 단백질을 포함하는 유전학적으로 변형된 비-인간 동물이 제공되고, 여기서, 면역글로불린 폴리펩타이드 쇄는 기능성 CH1 도메인이 온전한 IgM 불변 영역을 보유하면서 불활성화되고/되거나 제거된 하나 이상의 비-IgM 면역글로불린 불변 영역을 포함하는 변형된 면역글로불린 중쇄 유전자좌에서 경쇄 가변 영역 유전자 서열에 의해 암호화될 수 있는 단일 도메인 항원 결합 단백질을 형성할 수 있다.
본원에 기재된 측면은 바람직하게 재배열되지 않고 보다 바람직하게 하나 이상의 중쇄 불변 영역 유전자, 예를 들어, IgM, IgD, IgG, IgA 또는 IgE를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결된 바람직하게는 재배열되지 않고 보다 바람직하게는 인간, JL 유전자 분절(또는 이의 일부)로 재배열된, 바람직하게 재배열되지 않고 보다 바람직하게는 인간 VL 유전자 분절(또는 이의 일부)을 포함하거나 이로부터 유래된 하이브리드 면역글로불린 유전자에 의해 암호화된 하이브리드 쇄를 포함하는 VL 결합 단백질을 포함하고, 상기 IgD, IgG, IgA 또는 IgE 유전자는 CH1 암호화 서열에서 결실 또는 불활성화 돌연변이를 포함한다. VL 결합 단백질, 항원 결합 VL 단백질 등은 2개의 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항원 결합 부위를 포함하는 항원 결합 단백질을 포함한다. 하나의 구현예에서, VL 결합 단백질의 적어도 2개의 경쇄 가변 도메인은 동족이다. 일부 구현예에서, 2개의 경쇄 가변 도메인 각각은 경쇄 가변 영역(VL) 유전자 분절 및/또는 경쇄 연결 영역(JL) 유전자 분절에 의해 암호화되거나 이로부터 유래된다. 바람직한 구현예에서, 2개의 경쇄 가변 도메인 중 하나는 하이브리드 면역글로불린 쇄의 일부일 수 있고 2개의 경쇄 가변 도메인의 다른 하나는 면역글로불린 경쇄(L)의 일부일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 문구 "면역글로불린 하이브리드 쇄", "하이브리드 쇄", "하이브리드 면역글로불린 쇄" 등은 아미노 말단에서 카복실 말단으로 경쇄 가변 도메인(체세포적으로 돌연변이되거나 되지 않을 수 있는) 및 중쇄 불변 영역을 포함하는 면역글로불린 단백질을 지칭한다. 일반적으로, 하이브리드 쇄는 중쇄 불변 영역 유전자 서열에 작동적으로 연결된 재배열된 경쇄 가변 영역 유전자 서열에 의해 암호화되어 있다. 본원에 기재된 바와 같이, VL-단일 도메인 결합 단백질은 하이브리드 쇄를 포함하고, 상기 하이브리드 쇄는 CH1 암호화 서열에서 결실 또는 불활성화 돌연변이를 갖는 중쇄 불변 영역 유전자 서열에 작동적으로 연결된 재배열된 경쇄 가변 영역 유전자 서열에 의해 암호화되어 있다.
하이브리드 면역글로불린 쇄의 경쇄 가변 영역 유전자 서열은 일반적으로 경쇄 가변(VL) 유전자 분절(또는 이의 부분) 및 경쇄 연결(JL) 유전자 분절(또는 이의 일부)로부터의 서열을 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 경쇄 가변 영역 유전자 서열, 예를 들어, 하이브리드 쇄 가변 도메인을 암호화하는 재배열된 VL-JL 유전자 서열은 재배열되지 않은 VL 및 JL 유전자 분절, 바람직하게 (a) 생산적 유전자 재배열을 진행할 수 있는, 예를 들어, 재배열하여 프레임내 경쇄 가변 영역 유전자 서열을 형성할 수 있고 (b) 하나 이상의 중쇄 불변 영역 유전자 분절, 예를 들어, 불변 영역 유전자 분절들 또는 하나의 불변 영역 유전자 분절의 재배열되지 않은 클러스터에 작동적으로 연결된 생식선 재배열되지 않은 VL- 및 JL-유전자 분절의 레퍼토리로부터 유래된다.
경쇄 유전자 분절의 재배열시, 중쇄 불변 영역을 암호화하는 서열과 융합된 경쇄 가변 영역을 암호화하는 서열을 포함하는 재배열된 뉴클레오타이드 서열이 수득된다. 상기 서열은 중쇄 불변 도메인과 융합된 경쇄 가변 도메인을 갖는 하이브리드 면역글로불린 쇄를 암호화한다. 따라서, 하나의 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 하이브리드 면역글로불린은 필수적으로 N-말단에서 C-말단으로 VL 도메인 및 CH 도메인으로 이루어진다. 하나의 구현예에서, CH 도메인은 기능성 CH1 영역(IgM과 관련하여), 힌지, CH2 영역, CH3 영역 및 임의로 CH4 영역을 포함한다. 또 다른 구현예에서, CH 도메인은 기능성 CH1 영역이 부재이고, 예를 들어, 전체 또는 부분적으로 CH1 영역이 부재이고 추가로 예를 들어, IgG, IgA, IgE 및/또는 IgD와 관련하여 힌지 영역이 부재일 수 있다. 또 다른 구현예에서, CH 도메인은 기능성 CH1 영역이 부재이고, 예를 들어, 전체 또는 부분적으로 CH1 영역이 부재이고, 추가로 다른 비-IgM 이소형 불변 영역이 부재일 수 있다.
본원에 기재된 변형된 비-인간 동물은 항체형, 예를 들어, 사량체일 수 있는 VL 결합 단백질을 생산하기 위해 하이브리드 쇄와 쌍을 형성하는 동족 경쇄를 또한 포함하는 IgM 이소형을 갖는 VL 결합 단백질을 생성할 수 있지만, 여기서, 중쇄(또는 중쇄들의 쌍) 대신, VL 결합 단백질은 IgM CH 도메인에 융합된, VH 도메인이 아닌 VL 도메인을 포함하는 하이브리드 쇄(또는 하이브리드 쇄의 쌍)을 포함한다.
본원에 기재된 비-인간 동물은 바람직하게 기능성 CH1 도메인을 갖는 IgM 불변 영역 유전자를 포함하기 때문에, 본원에 기재된 비-인간 동물은 또한 일부 통상적인 항체의 사량체 구조와 유사하지만 결합 특성에서 상이한 VL 결합 단백질의 발현을 유도하고 비-인간 동물의 세포의 막 표면 상에 상기 VL 결합 단백질의 발현을 유도하는 면역글로불린 유전자좌의 인간화를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 비-인간 동물은 항원에 결합하는 VL 결합 단백질의 하이브리드 및 경쇄 중 어느 하나 또는 둘 다에 대해 인간 VL 도메인을 생성할 수 있고; 일부 구현예에서, 상기 비-인간 포유동물은 임의의 VH, DH 및/또는 JH 유전자 분절 서열에 의해 암호화되지 않거나 이로부터 유래되지 않은 가변 도메인을 포함하는 결합 단백질을 발현하는 B 세포 집단을 발달시키고/시키거나 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 비-인간 동물에 의해 발현된 VL 결합 단백질은 상기 항원-결합 부분이 전적으로 인간 VL 도메인으로 이루어져 있음을 특징으로 한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 비-인간 동물은 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌에서 비-인간 동물 및 이종성 종(예를 들어, 인간) 기원의 유전학적 물질을 포함하고 내인성 면역글로불린 경쇄 유전자좌에서 비-인간 동물 및 이종성 종(예를 들어, 인간) 기원의 유전학적 물질을 포함한다.
다양한 구현예에서, 변형된 비-인간 동물은 VL 단일 도메인 결합 단백질을 생산하고, 여기서, 하이브리드 쇄의 VL 도메인은 경쇄의 VL 도메인 상에 증진된 정도의 체세포 과돌연변이를 나타낸다. 일부 구현예에서, 하이브리드 쇄의 VL 영역은 CL 영역과 융합된 VL 영역 보다 약 1.5-배, 2-배, 2.5-배, 3-배, 3.5-배, 4-배, 4.5-배, 또는 5-배 이상의 체세포 과돌연변이를 나타낸다. 일부 구현예에서, 항원에 응답하는 변형된 비-인간 동물, 예를 들어, 마우스는 하이브리드 쇄의 VL 도메인을 포함하는 VL 단일 도메인 결합 단백질 집단을 나타내고, 여기서, VL 단일 도메인 결합 단백질 집단은 동일한 항원에 응답하는 야생형 마우스에 의해 나타나는 경쇄의 집단, 예를 들어, 경쇄의 VL 도메인에서 관찰되는 것 보다 하이브리드 사슬의 VL 도메인에서 평균 약 1.5-배, 2-배, 2.5-배, 3-배, 3.5-배, 4-배, 4.5-배, 5-배 이상의 체세포 과돌연변이를 나타낸다.
하나의 구현예에서, 하이브리드 쇄의 VL 도메인에서 체세포 과돌연변이는 CDR3에서 하나 이상 또는 2개 이상의 N 첨가를 포함한다. 다양한 구현예에서, VL 결합 단백질, 예를 들어, VL 단일 도메인 결합 단백질은 내인성 경쇄 유전자좌로부터 재배열된 경쇄에 대해 천연적으로 관찰된 것 보다 큰 수의 N 첨가를 포함하는 면역글로불린 경쇄 서열에 의해 암호화된 가변 도메인을 포함하는 하이브리드 쇄를 포함하고, 예를 들어, VL 및 인간 JL 유전자 분절은 재배열하여 중쇄 불변 영역 유전자와 작동적으로 연결된 재배열된 가변 영역 유전자를 형성하고, 여기서, 재배열된 경쇄 가변 영역은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 N 첨가를 포함한다.
다양한 구현예에서, VL 결합 단백질, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 VL 단일 도메인 결합 단백질, 예를 들어, 유전학적으로 변형된 비-인간 동물, 예를 들어 본원에 기재된 마우스에 의해 생산된 것들은 평균적으로 각각 통상의 항체 또는 중쇄만의 항체 보다 작을 수 있고 보다 작은 크기와 관련된 이점을 소유한다. 보다 작은 크기는 정상적으로 VH 도메인에 존재하는 DH 영역에 의해 암호화된 아미노산 서열의 부재를 통해 적어도 부분적으로 실현된다. 보다 작은 크기는 또한 예를 들어, Vκ 영역 및 Jκ 영역으로부터 유래되는 CDR3의 형성에서 실현될 수 있다.
하나의 측면에서, 면역글로불린 하이브리드 쇄 유전자좌를 포함하는 비-인간 동물, 예를 들어, 마우스가 제공된다. 하나의 구현예에서, 하이브리드 쇄 유전자좌는 내인성 중쇄 유전자좌내에서 생성되고, 여기서, 내인성 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자좌에서 하나 이상의 면역글로불린 중쇄 가변 영역(VH) 유전자 분절, 중쇄 다양성(DH) 유전자 분절 및 중쇄 연결(JH) 유전자 분절은 재배열하여 VL 유전자 분절, JL 유전자 분절 및 내인성 마우스 CH 유전자로부터 유래된 재배열된 유전자를 형성하기 위해 내인성 마우스 CH 유전자와 재조합하는 재배열된 가변 영역 VL/JL 유전자 서열을 형성하는 하나 이상의 경쇄 가변 영역(VL) 유전자 분절 및 하나 이상의 경쇄 연결 영역(JL) 유전자 분절로 대체되고, 여기서, CH 유전자는 IgM, IgD, IgG, IgA, IgE이고, IgD, IgG, IgA, 또는 IgE는 기능성 CH1 도메인이 부재이다. 하나의 측면에서, 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 대체하는 하이브리드쇄 유전자좌를 포함하는 비-인간 동물이 제공되고, 예를 들어, 하나 또는 2개의 중쇄 유전자좌의 모든 또는 실질적으로 모든 내인성 VH, DH, 및 JH 유전자 분절은 VL 유전자 분절, JL 유전자 분절 및 내인성 마우스 CH 유전자로부터 유래된 재배열된 유전자를 형성하기 위해 내인성 마우스 CH 유전자와 재조합하는 재배열된 가변 영역 VL/JL 유전자 서열을 형성하는 하나 이상의 VL 유전자 분절 및 하나 이상의 JL 유전자 분절로 대체되고, 여기서, CH 유전자는 IgM, IgD, IgG, IgA, IgE이고, 여기서, IgD, IgG, IgA, 또는 IgE는 기능성 CH1 도메인이 부재이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 비-인간 동물은 재배열되지 않은 인간 VL 유전자 분절 및/또는 인간 JL 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 하이브리드 쇄 유전자좌 및 재배열되지 않은 인간 VL 유전자 분절 및/또는 인간 JL 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 경쇄 유전자좌를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 비-인간 동물은 재배열되지 않은 인간 VL 유전자 분절 및/또는 인간 JL 유전자 분절을 포함하는 면역글로불린 하이브리드 쇄 유전자좌, 및 바람직하게 경쇄 불변 영역 유전자 서열에 작동적으로 연결된 단일의 재배열된 사람 VL/JL 가변 영역 유전자 서열을 포함하고, 예를 들어, 통상의 경쇄를 암호화하는 면역글로불린 경쇄 유전자좌를 포함한다.
단일 도메인 결합 단백질 및 재배열된 경쇄를 발현하는 유전학적으로 가공된 비-인간 동물
추가적 구현예에서, 본원에서는 (a) 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌에서 적어도 하나의 내인성 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자의 CH1 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에서 결실 또는 불활성화 돌연변이(여기서, 적어도 하나의 내인성 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자는 IgG, IgA, IgE, IgD, 또는 이의 조합체이다), (b) VL 및 JL 유전자 분절 서열을 포함하는 단일의 재배열된 면역글로불린 경쇄 가변 영역 VL/JL 유전자 서열을 포함하는 면역글로불린 경쇄 유전자좌(여기서, 단일의 재배열된 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자 서열은 면역글로불린 경쇄 불변 영역 유전자 서열에 작동적으로 연결되어 있고, 예를 들어, 단일 경쇄를 암호화한다) 및 임의로 또한 (c) 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌에서 내인성 VH, DH, JH 유전자 분절이 적어도 하나의 재배열되지 않은 면역글로불린 경쇄 가변 영역(VL) 유전자 분절 및 적어도 하나의 재배열되지 않은 면역글로불린 경쇄 연결(JL) 유전자 분절을 포함하는 핵산 서열로 대체된 것(여기서, 재배열되지 않은 VL 및 JL 유전자 분절 각각은 재조합하여 CH1 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에서 결실 또는 불활성화 돌연변이를 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자에 작동적으로 연결된 재배열된 면역글로불린 경쇄 가변 영역(VL/JL) 뉴클레오타이드 서열을 형성할 수 있다)를 포함하는 비-인간 동물이 제공된다.
단일의 재배열된 경쇄, 예를 들어, 재배열된 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄의 유전학적 가공이 기재되어 있다. 예를 들어, 상기 마우스에서 단일의 재배열된 가변 유전자 서열 VL:JL을 포함하는 범용 경쇄 마우스(ULC)의 생성 및 항원-특이적 항체의 생성은, 예를 들어, 미국 특허 출원 제13/022,759호, 제13/093,156호, 제13/412,936호, 제13/488,628호, 제13/798,310호, 및 제13/948,818호(각각 공개 번호 제 2011/0195454호, 제2012/0021409호, 제2012/0192300호, 제2013/0045492호, 제US20130185821호, 및 제US20130302836호)에 기재되어 있고, 이의 각각은 전문이 본원에 참조로 인용된다. 유전학적으로 가공된 단일의 재배열된 경쇄, 예를 들어, 범용 경쇄의 발현은 조기 IgM 단계에서 항체의 발현을 유발하고, 여기서, 다양성의 벌크 및 따라서 항원 인지는 중쇄에 대해 일어난다. 본 발명에 대한 제한 없이, 유전학적으로 가공된 단일의 재배열된 경쇄와 함께 조기 IgM 단계에서 확장은 기능성 CH1 도메인이 부재이거나 기능성 CH1 도메인이 부재이고 기능성 힌지 영역이 부재인 IgG와 관련하여 IgG 이소형 및 선별로의 클래스 전환을 진행하기 위해 생존할 수 있는 중쇄 또는 경쇄 가변 영역을 포함하는 보다 많은 세포를 유도한다.
따라서, 동물을 생산하기 위한 방법 및 조성물과 함께 유전학적으로 변형된 비-인간 동물이 제공되고, 상기 유전학적 변형은 IgM 도메인이 아닌 Ig 도메인에서 기능성 CH1 도메인의 부재(추가의 구현예에서 기능성 힌지 영역의 부재)를 유도하고 상기 동물은 유전학적으로 가공된 단일의 재배열된 경쇄, 예를 들어, 온전한 IgM과 연합될 수 있는 가공된 통상의 경쇄(ULC)를 추가로 발현한다.
미국 출원 공개 번호 제2011/0195454호, 제2012/0021409호, 제2012/0192300호 및 제2013/0045492호에 기재된 가공된 통상의 경쇄 마우스는 제한된 레퍼토리의 경쇄 옵션, 예를 들어, 2개 이하의 VL 유전자 분절 또는 단일의 재배열된 인간 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열을 포함하는 통상적인 또는 범용 경쇄 "ULC"를 암호화하는 핵산 서열을 포함했다. 상기 제한된 레퍼토리를 성취하기 위해, 마우스를 가공하여 천연 마우스 경쇄 가변 도메인을 생산하거나 재배열하는 이의 능력을 비기능성이 되게 하거나 실질적으로 비기능성이 되게 하였다. 하나의 측면에서, 이것은, 예를 들어, 마우스의 경쇄 가변 영역 유전자 분절을 결실시킴에 의해 성취하였다. 이전에 기재된 바와 같이, 이어서 내인성 마우스 유전자좌는 외인성 가변 영역 유전자 분절이 내인성 마우스 경쇄 불변 영역 유전자와 조합되어 재배열된 역 키메라 경쇄 유전자(인간 가변, 마우스 불변)를 형성할 수 있는 방식으로, 내인성 마우스 경쇄 불변 도메인에 작동적으로 연결된 적합하게 선택된 외인성 경쇄 가변 영역 유전자 분절, 바람직하게 인간 경쇄 가변 영역 유전자 분절에 의해 변형될 수 있다. 다양한 구현예에서, 경쇄 가변 영역은 체세포적으로 돌연변이될 수 있다. 다양한 구현예에서, 체세포 돌연변이를 획득하기 위해 경쇄 가변 영역의 능력을 최대화하기 위해, 적당한 인핸서(들)가 마우스에 보유된다. 하나의 측면에서, 내인성 마우스 κ 경쇄 유전자 분절을 인간 κ 경쇄 유전자 분절로 대체하기 위해 마우스 κ 경쇄 유전자좌를 변형시키는데 있어서, 마우스 κ 인트론 인핸서 및 마우스 κ 3' 인핸서는 기능적으로 유지되거나 붕괴되어 있지 않다.
따라서, 역 키메라(인간 가변, 마우스 불변) 중쇄의 다양성과 연합된 제한된 레퍼토리의 역 키메라(인간 가변, 마우스 불변) 경쇄를 발현하는 유전학적으로 가공된 마우스가 제공되었다. 다양한 구현예에서, 내인성 마우스 κ 경쇄 유전자 분절은 결실되고 내인성 마우스 Cκ 유전자에 작동적으로 연결된 단일(또는 2개) 재배열된 재배열된 인간 경쇄 영역으로 대체된다. 재배열된 인간 경쇄 영역의 체세포 과돌연변이를 최대하기 위한 구현예에서, 마우스 κ 인트론 인핸서 및 마우스 κ 3' 인핸서는 유지된다. 다양한 구현예에서, 마우스는 또한 유전자좌가 비기능성 λ 경쇄 유전자좌 또는 이의 결실 또는 λ 경쇄를 생산할 수 없도록 하는 결실을 포함한다.
따라서, 하나의 구현예에서, 본원에서는 이의 게놈에, 예를 들어, 이의 생식선에 바람직하게 인간 경쇄 가변 유전자 분절의 제한된 레퍼토리로부터 기원하는 바람직하게 인간 경쇄 가변 영역또는 단일의 재배열된 인간 경쇄 가변 영역의 제한된 레퍼토리를 포함하는 비-인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 마우스 또는 랫트)이 제공되고, 여기서, 비-인간 동물은 또한 이의 게놈에, 예를 들어, 이의 생식선에 CH1 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에서 결실 또는 불활성화 돌연변이를 포함한다.
인간 경쇄 가변 영역 유전자 서열의 제한된 레퍼토리로부터 기원하는 제한된 레퍼토리의 인간 경쇄 가변 도메인 또는 단일 인간 경쇄 가변 도메인을 발현하는 유전학적으로 가공된 동물이 제공된다. 하나의 구현예에서, 단일의 재배열된 V/J 인간 경쇄 서열은 Vκ1-39Jκ 및 Vκ3-20Jκ, 예를 들어, Vκ1-39Jκ5 및 Vκ3-20Jκ1로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물은 모든 내인성 VL 및 모든 내인성 JL 유전자 분절이 단일의 재배열된 V/J 경쇄 서열로 대체된 것을 포함하는 변형된 경쇄 유전자좌를 포함하고 여기서, 단일의 재배열된 V/J 경쇄 서열은 내인성 경쇄 불변 영역 유전자에 작동적으로 연결되어 있다. 일부 구현예에서, 상기 변형된 경쇄 유전자좌는 비-인간 동물의 생식선 게놈에 존재한다. 하나의 구현예에서, 상기 비-인간 동물은 이의 생식선 게놈에 경쇄 불변 영역 유전자 서열에 작동적으로 연결된 단일의 재배열된 경쇄 가변 유전자 서열을 포함하고, 여기서, 단일의 재배열된 경쇄 가변 영역 유전자 서열은 인간 생식선 VL 및 인간 생식선 JL 유전자 분절, 예를 들어, 인간 생식선 Vκ1-39 및 인간 생식선 Jκ5 또는 인간 생식선 Vκ3-20 및 Jκ1을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물은 B 세포, 예를 들어, 이의 게놈에 내인성 경쇄 불변 영역 유전자에 작동적으로 연결된 단일의 재배열된 V/J 경쇄 서열을 포함하는, 클래스 전환을 진행하지 않는 B 세포를 포함하고, 상기 단일 재배열된 V/J 경쇄는 비-인간 동물의 생식선 게놈에서 발견되는 내인성 경쇄 불변 영역 유전자에 작동적으로 연결된 단일의 재배열된 V/J 경쇄 서열과 비교하여 체세포 돌연변이를 포함하지 않는다. 다른 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물은 B 세포, 예를 들어, 이의 게놈에 내인성 경쇄 불변 영역 유전자에 작동적으로 연결된 단일의 재배열된 V/J 경쇄 서열을 포함하는, 클래스 전환을 진행한 B 세포를 포함하고, 상기 단일의 재배열된 V/J 경쇄는 비-인간 동물의 생식선 게놈에서 발견되는 내인성 경쇄 불변 영역 유전자에 작동적으로 연결된 단일의 재배열된 V/J 경쇄 서열과 비교하여 체세포 돌연변이를 포함한다.
유전학적으로 변형된 동물의 생산
본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물을 생산하는 방법이 또한 제공된다. 상기 방법은 (a) IgG1 중쇄 유전자좌와 같은, 비-인간 동물의 중쇄 면역글로불린 유전자좌의 CH1 도메인 및 임의로 힌지 영역(들)을 불활성화시키거나 결실시키고, 유전학적으로 가공된 재배열된 경쇄 유전자좌를 암호화하는 핵산을 도입하고, 상기 동물이 불활성화된 CH1 도메인을 갖는 중쇄 면역글로불린 유전자좌 및 유전학적으로 재배열된 경쇄 유전자좌(ULC)를 발현하게 하는 것을 포함한다.
단일 도메인 결합 단백질을 발현하는 동물을 생산하기 위한 유전학적 변형은 본원에서 예로서 마우스를 사용함에 의해 간편하게 기재되어 있지만, 상기 변형은 용이하게 채택하여 다른 동물에게 적용될 수 있다. 본 발명에 따른 유전학적으로 변형된 동물은 다양한 방식으로 생산될 수 있고 이의 특정 구현예는 하기에서 논의된다.
IgG1 유전자좌의 예시된 개략적 도해(비례축척이 아님)는 도 1(상부)에 제공되고 IgG1 유전자좌에서 CH 도메인 정렬을 보여준다. 예시된 바와 같이, 도메인 CH1, CH2, 및 CH3 및 힌지 영역은 스위치 영역의 다운스트림에 용이하게 동정가능한 범위의 뉴클레오타이드 내로 존재한다.
IgG1의 CH1 도메인을 암호화하는 기능성 뉴클레오타이드 서열이 부재이지만 힌지 영역을 포함하는 유전학적으로 변형된 비-인간 동물, 예를 들어, 마우스는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, IgG1 유전자가 CH1 도메인이 부재이지만 힌지를 포함하는 절단된 IgG1로 대체된 표적화 벡터가 생산될 수 있다. 하나의 예에서, 마우스 게놈은 내인성 CH1 도메인의 업스트림에 5'(게놈 IgG1 유전자의 전사 방향과 관련하여) 상동성 아암 포함 서열에 이어서 IgG1 힌지, IgG1 CH2 도메인, IgG1 CH3 도메인, 약물 선택 카세트(예를 들어, 록스드(loxed) 내성 유전자), 및 IgG1 막관통 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, 및 막관통 도메인과 관련하여 다운스트림에 3' 상동성 아암 포함 서열을 갖는 표적화 작제물에 의해 표적화된다. 유전자좌에서 상동성 재조합 및 약물 선택 카세트의 제거(예를 들어, Cre 처리에 의해)시, 내인성 IgG1은 CH1 도메인이 부재인 IgG1로 대체된다(도 3)(IgG1△CH1; I). 일부 구현예에서, IgG1을 발현하는 수득한 유전자좌의 구조는 힌지 서열에 융합된 J 영역 서열을 갖는다.
IgG1의 CH1 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 부재이고 힌지 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 부재인 유전학적으로 변형된 비-인간 동물, 예를 들어, 마우스는 당업계에 임의의 공지된 임의의 방법에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, IgG1 유전자가 CH1 도메인을 암호화하는 서열이 부재이고 힌지 영역을 암호화하는 서열이 부재인 절단된 IgG1로 대체된 표적화 벡터가 생산될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 마우스 게놈은 내인성 CH1 도메인의 업스트림에 5'(게놈 IgG1 유전자의 전사 방향과 관련하여) 상동성 아암 포함 서열에 이어서 IgG1 CH2 도메인, IgG1 CH3 도메인, 약물 선택 카세트(예를 들어, 록스트 내성 유전자), 및 IgG1 막관통 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, 및 막관통 도메인과 관련하여 다운스트림에 3' 상동성 아암 포함 서열을 갖는 표적화 작제물에 의해 표적화된다. 유전자좌에서 상동성 재조합 및 약물 선택 카세트의 제거시(예를 들어, Cre 처리에 의해), 내인성 IgG1 유전자는 CH1 도메인을 암호화하는 서열이 부재인 IgG1 유전자에 의해 대체된다(도 3)(IgG1△CH1 & 힌지; II). 일부 구현예에서, 수득한 유전자좌의 구조는 CH2 도메인에 융합된 J 영역 서열을 갖는 IgG1을 발현한다.
유전학적으로 변형된 비-인간 동물, 예를 들어, IgG1 CH1 서열이 부재(IgG1△CH1)이거나, IgG1 CH1 서열이 부재이고 힌지가 부재(IgG1△CH1 & 힌지)인 마우스는 하나 이상의 다른 IgG 이소형, 예를 들어, IgG2b 및 IgG2a/IgG2c, 및 하나 이상의 다른 Ig 이소형, 예를 들어, IgD, IgA, 및 IgE를 결실시키고, 이들 이소형을 암호화하는 서열을 결실시키거나 기능적으로 불구화시킴으로써 변형된 IgG1 이소형의 용법을 선호하게 추가로 변형될 수 있다. 예를 들어, 내인성 힌지 영역 서열의 업스트림(또는 내인성 CH1 도메인 서열의 업스트림)에 5' 상동성 아암 포함 서열, IgG1 CH2 및 CH3 도메인을 암호화하는 서열, 약물 선택 카세트에 이어서 IgG1 막관통 도메인을 암호화하는 서열에 이어서 경우에 따라 또 다른 약물 선택 카세트 및 IgG2a/c 유전자와 관련하여 다운스트림에 3' 상동성 아암 포함 서열을 갖는 표적화 작제물이 생산된다. 유전자좌에서 상동성 재조합 및 약물 선택 카세트(들)의 제거 시(예를 들어, Cre 처리에 의해), 내인성 중쇄 불변 유전자좌는 단지 2개의 IgG 유전자를 포함한다: 내인성 IgG3 및 IgG1△CH1 또는 IgG1△CH1 & 힌지(도 3)(IgG1△CH1△IgG2b/2a; III 또는 IgG1△CH1 & 힌지△IgG2b/2a; IV).
상기된 바와 같이 가공된 동물은 중쇄 유전자좌의 IgG2a, IgG2b, IgG2c, IgG3, IgD, IgA, 및/또는 IgE 유전자 분절에서 결실 또는 불활성화 돌연변이를 포함하게 추가로 변형될 수 있다. 예를 들어, 중쇄 유전자좌의 불변 영역 유전자 서열을 결실시키는 표적화 벡터가 생산될 수 있다. 하나의 예에서, 마우스 게놈은 내인성 IgM 도메인의 업스트림에 5'(게놈 불변 영역 유전자 서열의 전사 방향과 관련하여) 상동성 아암 포함 서열에 이어서, 약물 선택 카세트를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열(예를 들어, 록스드 내성 유전자) 및 IgA 유전자 분절의 다운스트림에 3' 상동성 아암 포함 서열을 갖는 표적화 작제물에 의해 표적화된다. 유전자좌에서 상동성 재조합 및 약물 선택 카세트의 제거시(예를 들어, Cre 처리에 의해), 내인성 불변 영역은 결실되고/되거나 선택가능한 마커로 대체된다(도 4c). 상기 동물은 기능성 CH1 도메인 서열이 부재이고 임의로 기능성 힌지 영역이 부재인 IgM 유전자 분절 및 IgG1 유전자를 재도입하여 생산될 수 있는 표적화 벡터를 사용하여 추가로 변형시킬 수 있다(도 4d). 하나의 예에서, 동물의 게놈은 선별가능한 마커 유전자의 업스트림에 5' 상동성 아암 포함 서열에 이어서, 기능성 CH1 도메인이 부재이고, 임의로 기능성 힌지가 부재인 완전한 IgM 불변 영역 및 IgG1 불변 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, 약물 선택 카세트(예를 들어, 록스드 내성 유전자) 및 선택가능한 마커와 관련하여 다운스트림에 3' 상동성 아암 포함 서열을 갖는 표적화 작제물에 의해 표적화된다. 유전자좌에서 상동성 재조합 및 약물 선택 카세트의 제거시(예를 들어, Cre 처리에 의해), 기능성 CH1 도메인 서열이 부재이고 임의로 기능성 힌지 영역이 부재인 IgM 유전자 분절 및 IgG1 유전자가 재도입된다(도 3)(IgG1△CH1△IgG2b/2a△IgG3△IgD/A/E(임의로 △힌지); V). 내인성 면역글로불린 유전자좌의 다른 조작, 예를 들어, 다양한 비-IgM 면역글로불린 이소형의 CH1 영역(들)의 결실 또는 불활성화 돌연변이가 또한 제공된다.
적당한 불변 영역 작제물을 디자인하고 상기 작제물을 상기된 바와 같은 상동성 재조합에 의해 유전자좌로 도입함에 의해 비-IgM 면역글로불린 불변 영역의 CH1 도메인 및 임의로 힌지에 결실 또는 불활성화를 도입하는 유전학적 조작에 추가로, 비-IgM CH1에서 결실 또는 불활성화는 당업계에 공지된 다른 방법, 예를 들어, 항원 면역화시에만 마우스에서 유도되는 조건적 비-IgM CH1 결실에 의해 만들어질 수 있다. 유전자좌의 조건적 불활성화를 위한 방법은 당업계에 공지되어 있다.
상기된 바와 같은 중쇄 유전자좌의 유전학적 변형은 하나 이상, 실질적으로 모든 또는 모든 내인성 중쇄 가변 유전자 분절, 예를 들어, VH 유전자 분절, DH 유전자 분절 및/또는 JH 유전자 분절이 인간 유전자형을 갖는 결합 단백질을 암호화하게 재배열되거나 재배열을 진행할 수 있는 (a) 인간 VH 유전자 분절, DH 유전자 분절 및/또는 JH 유전자 분절, (b) 경쇄 가변 유전자 분절, 예를 들어, 기능성 CH1 도메인이 부재인 중쇄 불변 영역에 연결된 경쇄 가변 영역을 갖는 면역글로불린 폴리펩타이드 쇄, 예를 들어, VL 단일 도메인 결합 단백질, 예를 들어, 경쇄 가변 영역을 포함하는 단일 도메인 항원 결합 단백질을 암호화하게 재배열되거나 재배열을 진행할 수 있는 경쇄 V 유전자 분절 및/또는 경쇄 J 유전자 분절, 또는 (c) 기능성 CH1 도메인이 부재인 중쇄 불변 영역에 연결된 인간 경쇄 가변 영역을 갖는 면역글로불린 폴리펩타이드 쇄, 예를 들어, VL 단일 도메인 결합 단백질, 예를 들어, 인간 유전자형을 갖는 인간 경쇄 가변 영역을 포함하는 단일 도메인 항원 결합 단백질을 암호화하게 재배열하거나 재배열을 진행할 수 있는, 인간 경쇄 가변 유전자 분절, 예를 들어, 인간 경쇄 V 유전자 분절 및/또는 인간 경쇄 J 유전자 분절로 대체되는 것을 추가로 포함할 수 있다.
마우스 중쇄 및 인간 κ 경쇄 유전자좌의 개략적 도해(비례축척이 아님)는 도 14에 제공되고 대략 200개 중쇄 가변(VH) 유전자 분절, 13개 중쇄 다양성(DH) 유전자 분절 및 4개 중쇄 연결(JH) 유전자 분절 및 인핸서(Enh) 및 마우스 유전자좌의 중쇄 불변(CH) 영역, 및 약 76 Vκ 유전자 분절, 5개 Jκ 유전자 분절, 인트론 인핸서(Enh) 및 인간 κ 유전자좌의 단일 불변 영역(Cκ)을 보여준다.
도 15에 보여진 것은 mVH, mDH 및 mJH 유전자 분절의 표적화된 결실을 통해 내인성 마우스 중쇄 유전자좌를 불활성화시키기 위한 상동성 재조합에 의해 변형된, 인간 κ 유전자 분절을 뮤린 중쇄 유전자좌로 삽입하기 위한 개략적 도해(비례축척이 아님)이다. 도 15에 보여진 바와 같이, 4개의 별도의 표적화 벡터를 사용하여 인간 Vκ 유전자 분절 및 인간 Jκ 유전자 분절을 당업계에 인지된 표준 분자 기술을 사용하여 불활성화된 마우스 중쇄 유전자좌에 점진적으로 삽입할 수 있다. 4개의 표적화 작제물을 가공하기 위해 사용되는 인간 κ 유전자 분절은 생식선 인간 κ 경쇄 유전자좌의 인접 콘티그에서 천연적으로 발견될 수 있다.
유전학적으로 가공된 재배열된 경쇄를 포함하는 유전학적으로 변형된 마우스는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 내인성 경쇄 유전자좌의 내인성 재배열되지 않은 경쇄 가변 V 및 J 유전자 분절을 단일 재배열된 V:J 유전자로 대체하거나, 전체 재배열되지 않은 경쇄 유전자좌를 경쇄 불변 영역에 작동적으로 연결된 단일의 재배열된 V:J 유전자를 포함하는 유전학적으로 가공된 경쇄 유전자좌로 대체하는 표적화 벡터가 생산될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물은 ADAM 6(ADAM6a 및/또는 ADAM6b), 이의 기능성 단편, 동족체 또는 상동체를 암호화하는 이소성 뉴클레오타이드 서열을 포함하게 추가로 가공된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 비-인간 동물의 중쇄 유전자좌는 마우스 ADAM6(ADAM6a 및/또는 ADAM6b), 이의 기능성 단편, 동족체 또는 상동체를 암호화하는 이소성 뉴클레오타이드 서열을 포함하게 추가로 가공된다. 다양한 구현예에서, ADAM6 단백질은 비-인간 수컷 동물에서 기능성이다. 상기 비-인간 동물을 가공하기 위한 방법 및 조성물은, 예를 들어, 본원에 참조로 인용된 미국 특허 제8,642,835호에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 상기된 바와 같은 유전학적으로 변형된 동물 및 기타 동물은 적합한 표적화 작제물을 적합한 ES 세포(하나 이상의 독립적 표적화에서)에 도입함에 의해 생산되고, 표적화 작제물의 마커 또는 선택 카세트를 포함하는 양성 클론을 동정하고 성장시킨다. 이어서 클론은 키메라 동물 또는 완전한 ES 세포-유래된 동물을 생산하기 위해 적합한 조건하에서 숙주 배아에서 공여자 ES 세포로서 사용된다. 마커 또는 선택 카세트는 ES 세포 단계에서 또는 키메라 또는 ES 세포-유래된 마우스에서, 예를 들어, 록스드 카세트를 사용하고 Cre-포함 균주로 육종시킴에 의해, 또는 ES 세포를 Cre 발현 벡터로 전기천공함으로써 임의로 제거될 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 유전학적 변형은 동물의 생식선에서 발생한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 동물을 생산하는 방법은 단일 도메인 항원 결합 단백질을 생산할 수 있는 제1 동물, 예를 들어, 이의 생식선에서 기능성 CH1 도메인이 없는 IgG 중쇄 유전자좌를 포함하는 제1 동물을 유전학적으로 가공된 재배열된 경쇄를 생산할 수 있는 제2 동물, 예를 들어, 이의 생식선에서 경쇄 불변 영역에 작동적으로 연결된 단일 재배열된 V:J 가변 영역을 갖는 유전학적으로 가공된 경쇄 유전자좌를 포함하는 제2 동물과 교배시켜 F1 유전학적으로 가공된 동물을 생산하는 것을 포함하고, 여기서, F1 동물은 제1 동물의 IgG 중쇄 유전자좌 및 제2 동물의 경쇄 유전자좌를 포함한다. 상기 교배는 시험관내 조작을 포함하는, 동물 육종에 의해 또는 다르게는 배우자 결합에 의해 수행될 수 있다.
유전학적으로 변형가능한 적합한 ES 세포를 쉽게 이용할 수 없는 비-인간 동물의 경우, 본원에 기재된 것들과 명백히 다른 방법을 사용하여 유전학적 변형을 포함하는 비-인간 동물을 생산한다. 상기 방법은, 예를 들어, 비-ES 세포 게놈(예를 들어, 섬유아세포 또는 유도된 만능 세포)을 변형시키고 핵 전달을 사용하여 상기 변형된 게놈을 적합한 세포, 예를 들어, 난모세포로 전달하고, 상기 변형된 세포(예를 들어, 변형된 난모세포)를 배아를 형성하기에 적합한 조건하에서 비-인간 동물에 착상시키는 것을 포함한다.
단일 도메인 항원 결합 단백질의 생산
단일 도메인 항원 결합 단백질 및/또는 유전학적으로 가공된 단일의 재배열된 경쇄를 생산할 수 있는 유전학적으로 가공된 동물이 수득되면, 항원에 대한 면역글로불린 및 결합 단백질 제제는 동물을 항원으로 면역화시킴에 의해 용이하게 수득될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 "폴리클로날 항혈청 조성물"은 친화성 정제된 폴리클로날 결합 단백질 제제를 포함한다.
하나의 측면에서, CH1 도메인이 부재인 결합 단백질을 생산하기 위한 방법이 제공되고, 상기 방법은 (a) 본원에 기재된 바와 같은 비-인간 동물을 항원으로 면역화시키고; (b) 비-인간 동물이 결합 단백질을 생산하기에 충분한 조건하에서 상기 비-인간 동물을 유지시키고; (c) 기능성 CH1 도메인이 부재이고/이거나 기능성 힌지 영역이 부재인 마우스에 의해 생산된 결합 단백질을 동정하고; (d) 상기 비-인간 동물로부터 결합 단백질, 결합 단백질을 생산하는 세포 또는 결합 단백질의 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 단리시킴을 포함한다.
다양한 항원을 사용하여 유전자 전이 동물을 면역화시킬 수 있다. 상기 항원은 세포성 단백질, 미생물, 예를 들어, 바이러스 및 단세포 유기체(예를 들어, 세균 및 진균류), 생, 약독화된 또는 죽은 유기체, 유기체의 단편, 또는 상기 유기체로부터 단리된 항원 분자를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
항원은 보조제의 존재 또는 부재하에 임의의 간편한 방식으로 유전자전이 동물로 투여될 수 있고 미리 결정된 스케줄에 따라 투여될 수 있다.
모노클로날 결합 단백질을 생산하기 위해, 비장 세포는 면역화된 유전자전이 동물로부터 단리되고 하이브리도마의 생산을 위해 형질전환된 세포주와의 세포 융합에 사용되거나, 항체를 암호화하는 cDNA는 표준 분자 생물학 기술에 의해 복제하고 형질감염된 세포에서 발현한다. 모노클로날 항체를 생산하기 위한 과정은 당업계에 널리 확립되어 있다. 예를 들어, 문헌[European Patent Application 0 583 980 A1 ("Method For Generating Monoclonal Antibodies From Rabbits"), 미국 특허 제4,977,081호("Stable Rabbit-Mouse Hybridomas And Secretion Products Thereof"), 제WO 97/16537호("Stable Chicken B-cell Line And Method of Use Thereof"), 및 제EP 0 491 057 B1호("Hybridoma Which Produces Avian Specific Immunoglobulin G")를 참조하고, 이의 기재 내용은 본원에 참조로 인용된다. 복제된 cDNA 분자로부터 모노클로날 항체의 시험관내 생산은 문헌[참조: Andris-Widhopf et al., "Methods for the generation of chicken monoclonal antibody fragments by phage display", J Immunol Methods 242:159 (2000), 및 Burton, D. R., "Phage display", Immunotechnology 1:87 (1995)]에 기재되어 있다.
모노클로날 단일 도메인 항원 결합 단백질이 생산되면, 상기 결합 단백질은경우에 따라 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 완전한 인간 결합 단백질로 용이하게 전환될 수 있다. 완전한 인간 모노클로날 결합 단백질은 인간에서 면역원성이 아니고 인간 대상체의 치료학적 치료에 사용하기에 적당하다.
따라서, 단일 도메인 항원 결합 단백질이 비-IgM CH1 도메인에서 결실 또는 불활성화 돌연변이를 포함하는, 인간 VH 또는 인간 VL 영역 및 마우스 중쇄 불변 영역을 포함하는 하나의 구현예에서, 단일 도메인 항원 결합 단백질의 VH 또는 VL 도메인의 서열은 적합한 세포, 예를 들어, 전형적으로 항체 발현을 위한 세포, 예를 들어, 진핵 세포, 예를 들어, CHO 세포에서 발현될 수 있는 완전한 인간 단일 도메인 항원 결합 단백질을 암호화하는 발현 작제물을 유도하는 적합한 발현 벡터에서 임의로 CH1 도메인이 부재인 인간 불변 영역의 업스트림에 복제될 수 있다.
따라서, 본원에서는 또한 본원에 기재된 바와 같이 유전학적으로 변형된 동물로부터 유래된 모노클로날 결합 단백질 생산 세포, 및 이로부터 유래된 핵산이 제공된다. 또한, 이로부터 유래된 하이브리도마가 제공된다. 또한, 완전한 인간 단일 도메인 결합 단백질, 및 이로부터 유래된 암호화 핵산이 제공된다.
본원에 기재된 단일 도메인 항원 결합 단백질은 또한 이특이적 항체를 생산하기 위해 사용될 수 있다. 본원에 기재된 단일 도메인 항원 결합 단백질의 이점은 단일 치료제에서 2개의 상이한 에피토프에 대해 특이성을 갖는 중쇄를 이종이량체화함에 의해 이특이적 항체를 생산하는 능력이다.
실시예
당업자에게 본 발명의 방법 및 조성물을 생산하고 사용하는 방법을 기재하기 위해 하기의 실시예가 제공되고, 발명자가 이들의 발명으로 여기는 것의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다. 사용되는 수(예를 들어, 양, 온도, 등)에 관한 정확도를 보장하기 위해 노력해 왔지만 일부 실험적 오차 및 편차가 고려되어야만 한다. 실시예는 당업자에게 널리 공지된 통상적인 방법(분자 복제 기술 등)의 상세한 기재를 포함하지 않는다.
실시예 1: V
H
단일 도메인 결합 단백질을 암호화하는 마우스: 기능성 C
H
1 도메인이 부재인 중쇄 가변 영역 및 중쇄 불변 영역을 갖는 면역글로불린 쇄를 포함하고 단일의 재배열된 경쇄(ULC)를 포함하는 마우스.
실시예 1.1: 동물의 생성
기능성 CH1 유전자 서열이 부재이고 임의로 기능성 힌지 영역이 부재인 완전한 기능성 IgM 유전자 서열 및 IgG1 유전자 서열을 포함하는 중쇄 유전자좌를 포함하게 유전학적으로 변형된 마우스(도 1a)는 본원에 참조로 인용된 문헌[참조: US2011/0145937, Macdonald et al.]에 기재된 방법에 따라 생산하였다. 다양하게 조합된 중쇄 불변 유전자 서열이 부재이고 CH1 도메인(들)의 결실을 포함하지만 완전하고 기능성 IgM을 포함하는 여러 버젼의 마우스를 생산하였다(도 3). 예를 들어, 기능성 CH1 유전자 서열 및 힌지 영역(도 3 및 4b에서 mVHIgG1△CH1 & 힌지; 1576 HO, "II")이 부재인, 마우스 중쇄 가변 유전자 분절 및 완전한 기능성 IgM 유전자 서열 및 IgG1 유전자 서열을 포함하는 중쇄 유전자좌에 동종접합성인 마우스를 생산하였다. 추가로, 인간 중쇄 가변 유전자 분절 및 완전한 기능성 IgM 유전자 서열, 기능성 CH1 유전자 서열 및 힌지 영역이 부재인 IgG1 유전자 서열을 포함하고, IgG2b 및 IgG2a 유전자 서열(hVH IgG1△CH1 & 힌지△IgG2b/2a; 1859 HO, 도 3에서 "IV"를 참조한다)이 부재인 중쇄 유전자좌에 대해 동종접합성 마우스를 생산하였다. 추가로, 인간 중쇄 가변 유전자 분절 및 완전한 기능성 IgM 유전자 서열, 기능성 CH1 유전자 서열이 부재인 IgG1 유전자 서열을 포함하고, IgG2b 및 IgG2a 유전자 서열(hVH IgG1△CH1△IgG2b/2a; 1673 HO, 예를 들어, 도 3 및 도 4a에서 "III"를 참조한다)이 부재인 중쇄 유전자좌에 대해 동종접합성인 마우스를 생산하였다. 추가로, 인간 중쇄 가변 유전자 분절 및 완전한 기능성 IgM 유전자 서열, 기능성 CH1이 부재인 IgG1 유전자 서열을 포함하고, IgD, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgE, 및 IgA 유전자 서열(hVH IgG1△CH1△IgG2b/2a△IgG3△IgD/A/E; 6180 HO, 도 3 및 도 4c-d에서 "V"를 참조한다)이 부재인 중쇄 유전자좌에 대해 동종접합성인 마우스를 생산하였다. 중쇄 불변 영역에서 추가의 예시적 버젼의 변형은 도 3에 제공된다. CH1 결실/불활성화 및/또는 면역글로불린 불변 영역 결실/불활성화의 조합의 다른 변화를 만들었고, 예를 들어, IgG1 및 IgG2a 둘 다가 CH1 도메인 결실을 포함하는 마우스를 생산하고, 마우스는 또한 IgD, IgE, IgG3, 및 IgG2b의 결실을 포함한다. 도 4에 보여지는 바와 같이, 중쇄 유전자좌는 또한 인간 중쇄 가변 영역[또는 인간 경쇄 가변 영역(도 16, 하기 실시예 2 및 3 참조)]일 수 있는 인간 가변 영역을 포함하게 변형시킬 수 있다. 중쇄 유전자좌는 또한 Adam 6a 유전자, Adam 6b 유전자 또는 둘 다 또는 유전자의 단편을 포함하게 변형시킬 수 있고, 상기 유전자 또는 이의 단편은 수컷 마우스에서 기능성이다(문헌참조: 예를 들어, 본원에 참조로서 인용된 미국 제2012/0322108호).
단일 재배열된 가변 유전자 서열 V:J(예를 들어, Vκ1-39Jκ5 또는 Vκ3-20Jκ1 통상의 경쇄 마우스)를 포함하는 통상의 경쇄 마우스(또한 범용 경쇄 또는 ULC 마우스로서 언급됨)의 생성 및 이들 마우스에서 항원-특이적 항체의 생성은 문헌[예를 들어, 미국 특허 출원 번호 제13/022,759호, 제13/093,156호, 제13/412,936호, 제13/488,628호, 제13/798,310호, 및 제13/948,818호(각각 공개 번호 제2011/0195454호, 제2012/0021409호, 제2012/0192300호, 제2013/0045492호, 제US20130185821호, 및 제US20130302836호]을 참조하고 이의 각각은 이의 전문이 본원에 참조로 인용된다. 구체적으로, 이들의 생식선에서 유전학적으로 가공된 Vκ1-39Jκ5 카파 경쇄(1633 HO 또는 1634 HO) 또는 유전학적으로 가공된 Vκ3-20Jκ1 카파 경쇄(1635 HO 또는 1636 HO)를 발현하는 마우스를 생산하였다.
단일의 재배열된 인간 생식선 경쇄 영역을 포함하는 VELOCIMMUNE® 마우스(ULC Vκ1-39Jκ5; 1633 또는 1634) 또는 (ULC Vκ3-20Jκ1; 1635 또는 1636)는 변형된 IgG 불변 영역을 갖는 마우스에 교배된다. 구체적으로, 상기 ULC 마우스는 뮤린 중쇄 불변 영역에 작동적으로 연결된 뮤린 중쇄 가변 영역을 갖는 마우스(여기서, IgG1 CH1 및 IgG1 힌지 영역은 결실되거나 불활성화되어 있다)(mVHIgG1△CH1 & 힌지, 1576), 뮤린 중쇄 불변 영역에 작동적으로 연결된 인간 중쇄 가변 영역을 갖는 마우스(여기서, IgG1 CH1 및 IgG1 힌지 영역, 및 IgG2a 및 IgG2b 유전자는 결실되거나 불활성화되어 있다)(hVH IgG1△CH1 & 힌지△IgG2b/2a; 1859), 뮤린 중쇄 불변 영역에 작동적으로 연결된 인간 중쇄 가변 영역을 갖는 마우스(여기서, IgG1CH1 영역, 및 IgG2a 및 IgG2b 유전자는 결실되어 있거나 불활성화되어 있다)(hVH IgG1△CH1△IgG2b/2a; 1673), 또는 뮤린 중쇄 불변 영역에 작동적으로 연결된 인간 중쇄 가변 영역을 갖는 마우스(여기서, IgG1 CH1 영역, 및 IgG2a 및 IgG2b, IgD, IgG3, IgA, 및 IgE 유전자는 결실되어 있거나 불활성화되어 있다)(hVH IgG1△CH1△IgG2b/2a△IgG3△IgD/A/E; 6180)로 육종하여 하기의 후손 마우스를 수득하였다:
mVHIgG1△CH1 & 힌지 x Vκ3-20Jκ1 ULC 또는 mVHIgG1△CH1 & 힌지 X Vκ1 -39Jκ5 ULC 동종접합성 마우스(1576HO 1635HO 또는 1576 HO 1633 HO),
hVH IgG1△CH1 & 힌지△IgG2b/2a x Vκ3-20Jκ1 ULC 또는 hVH IgG1△CH1 & 힌지△IgG2b/2a x Vκ1-39Jκ5 ULC 동종접합성 마우스(1859 HO 1635 HO 또는 1859HO 1633HO),
hVHIgG1△CH1△IgG2b/2a x Vκ3-20Jκ1 ULC 또는 hVHIgG1△CH1△IgG2b/2a x Vκ1-39Jκ5 ULC 동종접합성 마우스(1673HO 1635 HO 또는 1673 HO 1633 HO), 및
hVH IgG1△CH1 & 힌지△IgG2a/2b△IgG3△IgD/A/E x Vκ3-20Jκ1 ULC 또는 hVH IgG1△CH1 & 힌지△IgG2a/2b△IgG3△IgD/A/E x Vκ1-39Jκ5 ULC 동종접합성 마우스(6180 HO 1635 HO 또는 6180 HO 1634 HO).
CH1 도메인에서 결실 또는 불활성화 돌연변이 및 면역글로불린 불변 영역 유전자에서 결실 또는 불활성화 돌연변이를 포함하는 다른 버젼의 마우스는 상기된 바와 같은 단일의 재배열된 인간 생식선 경쇄 영역을 포함하는 마우스로 육종한다.
실시예 1.2: 항원을 사용한 마우스의 면역화 및 단일 도메인 결합 단백질의 발현.
변형에 대해 동종접합성 마우스는 상이한 항원으로 면역화시키고 다양한 보조제를 사용하여 다양한 경로로 부스팅하였다. IgG1 특이적 반응에 대한 역가는 ELISA 또는 웨스턴 블롯에 의해 평가하였다.
도 5a에 보여진 바와 같이, IgG1△CH1/힌지 및 ULC 변형 둘 다에 대해 동종접합성 마우스는 면역화시키기 전후 둘 다의 혈청에서 단독의 IgG1△CH1을 갖는 마우스와 비교하여 총량의 IgG1의 증가된 발현을 나타낸다. △CH1/힌지 x ULC 마우스에서 보다 높은 역가는 범용 경쇄의 존재가 항원 특이적 단일 도메인 항원 결합 단백질을 생성할 가능성을 증가시킴을 시사한다. 도 5b.
도 7은 고역가가 △CH1 및 ULC 변형을 포함하게 유전학적으로 가공된 다양한 버젼의 마우스와 함께 수득할 수 있음을 입증한다.
또한, 도 6 및 8은 단일 도메인 항원-결합 단백질이 존재하고 CH1 영역 및 단일의 재배열된 경쇄(범용 경쇄)에서의 결실과 함께 인간 중쇄 가변 영역 둘 다 포함하는 마우스로부터 단리될 수 있다.
실시예 1.3:
단일 도메인 결합 단백질 및 단일 재배열된 경쇄(ULC)를 발현하는 마우스에서 B 세포 발달 및 성숙화
변형된 CH1 도메인 및 단일의 재배열된 경쇄(ULC)에 대해 동종접합성 마우스 기원의 비장, 혈액 및 골수 격실의 B 세포 함량(도 2 참조)을 본원에 명시된 바와 같은 다양한 세포 표면 마커의 유동 세포측정을 사용하여 B 세포 발달 및 B 세포 성숙화를 통한 진행에 대해 분석하였다.
간략하게, ULC 마우스 및 변형된 CH1 도메인 및 재배열된 경쇄에 대해 동종접합성 마우스를 희생시키고 혈액, 비장 및 골수를 수거하였다. 혈액은 EDTA(BD Bioscience)를 사용하여 마이크로테이너 튜브에 수거하였다. 골수는 완전한 RPMI 배지(태아 소 혈청, 나트륨 피루베이트, 헤페스, 2-머캅토에탄올, 비필수 아미노산 및 젠타마이신이 보충된 RPMI 배지)로 세정함에 의해 대퇴부로부터 수거하였다. 비장 및 골수 제제로부터의 RBC는 ACK 용해 완충액(Lonza Walkersville)으로 용해시키는 것에 이어서 완전한 RPMI 배지로 세척하였다.
세포(1 x 106)는 10분 동안 빙상에서 항-마우스 CD16/CD32(2.4G2, BD)로 배양함에 이어서 빙상에서 30분 동안 하기의 항체로 표지화시켰다: APC-H7 접합된 항-마우스 CD19(클론 1D3, BD), 퍼시픽 블루 접합된 항-마우스 CD3(클론 17A2, BIOLEGEND®), PeCy7-IgM(II/41, EBIOSCIENCE®), PerCP-Cy5.5-IgD(11-26c.2a, BIOLEGEND®), APC-eFluor 780-B220(RA3-6B2, EBIOSCIENCE®), APC-CD19(MB19-1, EBIOSCIENCE®), PE-CD93(AA4.1, BIOLEGEND®), FITC-CD23(B3B4, BD), APC-CD21/CD35(7G6, BD). 골수: 미성숙한 B 세포(B220intIgM+), 성숙한 B 세포 (B220hiIgM+). 혈액 및 비장: B 세포(CD19+), 성숙한 B 세포(CD19+IgMintIgDhi), 전사/미성숙한 B 세포(CD19+IgMhiIgDint).
염색 후, 세포를 세척하고 2% 포름알데하이드에 고정시켰다. 데이터 획득은 LSRII 유동 세포측정기에 대해 수행하고 FLOWJO™ 소프트웨어(Tree Star, Inc.)로 분석하였다. 도 9는 이들 마우스가 정상의 혈청 안정 상태 IgM 및 IgG 수준을 가짐을 보여준다. 도 10 및 11은 비장 격실에 대한 결과를 보여주고, 비장에서 거의 정상적 B 세포 수 및 거의 정상적 B 세포 성숙화를 입증한다. 도 12 및 13은 골수 격실에 대한 결과를 보여주고, 골수에서 정상적 B 세포 수 및 거의 정상적 B 세포 발달을 입증한다.
실시예 2: V
L
단일 도메인 결합 단백질을 암호화하는 마우스: 기능성 C
H
1 도메인이 부재인 경쇄 가변 영역 및 중쇄 불변 영역을 갖는 면역글로불린 쇄를 포함하는 마우스.
실시예 2.1: 동물의 생성
중쇄 유전자좌로 도입된 경쇄 유전자 분절을 갖는 마우스는 미국 특허 공보 제2012/0096572호에 기재된 바와 같이 생성하였다. 구체적으로, 다양한 표적화 작제물은 VELOCIGENE® 유전학적 가공 기술을 사용하여 생산하고 마우스 게놈 세균 인공 염색체(BAC) 라이브러리를 변형시켰다(문헌참조: 예를 들어, 미국 특허 제6,586,251호 및 Valenzuela, D.M., Murphy, A.J., Frendewey, D., Gale, N.W., Economides, A.N., Auerbach, W., Poueymirou, W.T., Adams, N.C., Rojas, J., Yasenchak, J., Chernomorsky, R., Boucher, M., Elsasser, A.L., Esau, L., Zheng, J., Griffiths, J.A., Wang, X., Su, H., Xue, Y., Dominguez, M.G., Noguera, I., Torres, R., Macdonald, L.E., Stewart, A.F., DeChiara, T.M., Yancopoulos, G.D. (2003). High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis. Nat Biotechnol 21, 652-659). 마우스 BAC DNA는 상동성 재조합으로 변형시켜 재배열되지 않은 인간 생식선 κ 경쇄 유전자 서열의 연속 삽입을 위한 VH, DH 및 JH 유전자 분절의 표적화된 결실을 통해 내인성 마우스 중쇄 유전자좌를 불활성화시켰다(도 15의 상부).
간략하게, 마우스 중쇄 유전자좌는 재조합효소-매개된 재조합을 사용하여 2개의 연속 표적화 반응에서 결실되었다. 제1 표적화 반응은 5'에서 3'로 5' 마우스 상동성 아암, 재조합효소 인지 부위, 네오마이신 카세트 및 3' 상동성 아암을 포함하는 표적화 벡터를 사용하여 마우스 중쇄 유전자좌의 5' 말단에서 표적화하는 것을 포함했다. 5' 및 3' 상동성 아암은 마우스 중쇄 유전자좌의 5' 서열을 포함하였다. 제2 표적화 반응은 5'에서 3'로 5' 마우스 상동성 아암, 5' 재조합효소 인지 부위, 제2 재조합효소 인지 부위, 하이그로마이신 카세트, 제3 재조합효소 인지 부위 및 3' 마우스 상동성 아암을 포함하는 제2 표적화 벡터를 사용하여 JH 유전자 분절의 영역에서 마우스 중쇄 유전자좌의 3' 말단에서 표적화하는 것을 포함했다. 5' 및 3' 상동성 아암은 마우스 JH 유전자 분절을 플랭킹하는 서열 및 5'의 인트론 인핸서 및 불변 영역을 포함했다. 표적화 벡터(상기된 바와 같이) 둘 다로 표적화된 변형된 중쇄 유전자좌를 포함하는 양성 ES 세포는 핵형분류에 의해 확인하였다. 이어서, DNA는 이중-표적화된 ES 세포로부터 단리하고 재조합효소로 처리하여 제1 표적화 벡터에서 5' 재조합효소 인지 부위와 제2 표적화 벡터에서 5' 재조합효소 인지 부위 간의 마우스 중쇄 유전자좌의 게놈 DNA의 결실을 매개하고 2개의 재조합효소 인지 부위에 의해 플랭킹된 단일 재조합효소 인지 부위 및 하이그로마이신 카세트를 잔류시킨다(도 15의 상부 참조). 따라서, 온전한 CH 유전자를 포함하는 변형된 마우스 중쇄 유전자좌는 도 15에 명시된 바와 같은 표적화 벡터를 사용하여 정확한 방식으로 인간 κ 생식선 분절을 점진적으로 삽입함에 의해 생산하였다.
4개의 별도의 표적화 벡터를 가공하여 40개 인간 Vκ 유전자 분절 및 5개의 인간 Jκ 유전자 분절을 불활성화된 마우스 중쇄 유전자좌(상기된 바와 같이)에 점진적으로 삽입하였다(도 15). 4개의 표적화 작제물을 가공하기 위해 사용되는 인간 κ 유전자 분절은 생식선 인간 κ 경쇄 유전자좌의 근접 콘티그에서 천연적으로 발견된다(도 14b).
상기 변형된 중쇄 유전자좌에 대해 동종접합성 마우스는 상기된 바와 같은 중쇄 유전자좌에 대해 동종접합성 마우스를 수득하기 위해 육종하였다. 경쇄 가변 영역 유전자 분절을 포함하는 상기 변형된 중쇄 유전자좌를 포함하는 배아 줄기 세포는 도 16에 제공된 도해에 따라 표적화하고 본원에 참조로 인용된 미국 특허 공보 제US2011/0145937호(Macdonald et al.)에 기재된 방법을 사용하여 IgG1 유전자에서 기능성 CH1 도메인이 부재이고, IgG2b 및 IgG2a 유전자가 추가로 부재인 경쇄 가변 영역 및 중쇄 불변 영역을 포함하는 중쇄 유전자좌에 대해 동종접합성 마우스를 생산한다.
따라서, 예를 들어, 미국 제2012/0096572호에 기재된 경쇄 가변 영역 유전자 분절을 포함하는 변형된 중쇄 유전자좌 마우스의 생식선은 도 16에 기재된 바와 같은 표적화 벡터를 사용하여 추가로 변형시켜 IgG1 유전자 분절이 기능성 CH1 도메인이 부재이고 IgG2a 및 IgG2b 유전자가 결실되어 인간 카파 가변 도메인 및 뮤린 IgG1 불변 영역을 포함하는 단일 도메인 항원 결합 단백질에 대해 동종접합성 마우스를 수득하게 중쇄 유전자좌를 가공하였고, 여기서, IgG1 불변 도메인은 기능성 CH1 영역(hVκIgG1△CH1△IgG2a△IgG2b; 6082 HO)이 부재이다. CH1 결실 및/또는 면역글로불린 불변 유전자 결실의 조합의 추가적 변형을 만들고, 예를 들어, 인간 경쇄 카파 가변 영역을 포함하는 중쇄 유전자좌를 포함하는 마우스를 생산하고, 여기서, IgG1 및 IgG2a 둘 다는 CH1 도메인 결실을 포함하고, 마우스는 또한 IgD, IgE, IgG3, 및 IgG2b의 결실을 포함한다.
웨스턴 블롯팅은 경쇄 유일 단일 도메인 결합 단백질이 존재하고 인간 카파 가변 도메인 및 뮤린 IgG1 불변 영역을 포함하게 유전학적으로 변형된 마우스로부터 단리될 수 있음을 확인하였고, 여기서, IgG1 불변 도메인은 기능성 CH1 영역이 부재이다(6082 HO, 데이터는 나타내지 않음).
실시예 2.2: VL 단일 도메인 결합 단백질을 암호화하는 유전자 서열의 생산적 재배열의 확인
B 세포의 mRNA는 (a) IgG1 유전자에서 기능성 CH1 도메인이 부재이고 추가로 IgG2b 및 IgG2a 유전자가 부재인 경쇄 가변 영역 및 중쇄 불변 유전자 서열을 포함하는 중쇄 유전자좌에 대해 동종접합성 마우스, (b) 대조군 야생형 및 (c) 인간 중쇄 V, D 및 J 분절을 발현하고, IgG1 유전자에서 기능성 CH1 도메인이 부재이고, 또한 기능성 IgG2b 및 IgG2a 유전자가 부재이고 또한 통상적 또는 범용 경쇄로서 언급된 단일의 재배열된 경쇄 유전자좌를 포함하는 변형된 마우스 중쇄 유전자좌 둘 다에 대해 동종접합성 대조군 CH1 del x ULC 마우스의 비장 및 골수로부터 단리하였다[문헌참조: 예를 들어, 미국 특허 공보 제2011/0195454호]. 단리된 mRNA는 TAQMAN 검정에서 하기의 프로브 및 프라이머를 사용한 생산적 재배열을 위해 분석하였다:
hJκ/mIgG1 힌지-세트 71 (Biosearch Technologies로부터 주문)
(센스) 5'-GGACCAAGCTGGAGATCAAAC-3' (서열번호 1),
(안티-센스) 5'-CTTCTGGGACTGTACATATGCAA -3' (서열번호 2),
(프로브) 5'-FAM-CCCAGGGATTGTGGTTGTAAGCC-BHQ1-3' (서열번호 3);
hJH/mIgG1 힌지-세트 72 (Applied Biosystems로부터 주문)
(센스) 5'-TGGTCACCGTCTCCTCAGTG-3' (서열번호 4),
(안티센스) 5'-CACACGTGACCTTAGGAGTCAGAG-3' (서열번호 5),
(프로브) 5'-FAM-TGGTTGTAAGCCTTGC-MGB-3' (서열번호 6);
mHPRT1-세트 51 (Biosearch Technologies로부터 주문)
(센스) 5'-CGAGTCTGAAGCTCTCGATTTCCT-3' (서열번호 7),
(안티센스) 5'-CAGCCAACACTGCTGAAACATG-3' (서열번호 8),
(프로브) 5'-FAM-CAGCATCTAAGAGGTTTTGCTCAGTGGA-BHQ-3 (서열번호 9)';
도 17a 및 17b에 보여진 바와 같이, 내인성 중쇄 가변 영역 유전자 분절을 대체하는 재배열되지 않은 경쇄 가변 영역 유전자 분절은 기능성 CH1 도메인이 부재인 내인성 중쇄 불변 IgG1 유전자와 생산적 재배열을 진행할 수 있다.
실시예 3: VL 단일 도메인 결합 단백질을 암호화하는 마우스: 경쇄 가변 영역 및 기능성 C
H
1 도메인이 부재인 중쇄 불변 영역을 갖고, 그리고 단일의 재배열된 경쇄(ULC)를 포함하는 면역글로불린 쇄를 포함하는 마우스
단일 재배열된 인간 생식선 경쇄 영역을 포함하는 VELOCIMMUNE® 인간화된 마우스(ULC Vκ3-20Jκ1; 1635, 대안적으로 ULC Vκ1-39Jκ5; 1633이 또한 사용된다)는 뮤린 불변 영역에 작동적으로 연결된 인간 경쇄 카파 가변 영역을 포함하는 변형된 중쇄 유전자좌를 갖는 마우스로 육종하였고, 여기서, IgG1 CH1 도메인, 및 IgG2a 및 IgG2b 유전자를 결실되거나 불활성화되어 (hVκIgG1△CH1△IgG2a/2b; 6082) 하기의 자손 마우스를 수득하였다: hVκIgG1△CH1△IgG2a/2b x Vκ3-20Jκ1 ULC 동종접합성 마우스(6082HO 1635 HO). 이들 마우스는 VL 단일 도메인 결합 단백질을 발현하였다(도 18).
SEQUENCE LISTING
<110> Regeneron Pharmaceuticals, Inc.
<120> Non-human Animals that Make Single Domain Binding Proteins
<130> 017283.0587/1450WO01
<150> 61/968,986
<151> 2014-03-21
<150> 61/968,905
<151> 2014-03-21
<160> 9
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense probe
<400> 1
ggaccaagct ggagatcaaa c 21
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-sense probe
<400> 2
cttctgggac tgtacatatg caa 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe
<400> 3
cccagggatt gtggttgtaa gcc 23
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense probe
<400> 4
tggtcaccgt ctcctcagtg 20
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> anti-sense probe
<400> 5
cacacgtgac cttaggagtc agag 24
<210> 6
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe
<400> 6
tggttgtaag ccttgc 16
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense probe
<400> 7
cgagtctgaa gctctcgatt tcct 24
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sense probe
<400> 8
cagccaacac tgctgaaaca tg 22
<210> 9
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 9
cagcatctaa gaggttttgc tcagtgga 28
Claims (100)
- 기능성 CH1 도메인이 부재이고 항원, 항원 결합 단백질을 암호화하는 핵산, 또는 항원 결합 단백질을 발현하는 세포에 결합하는 항원 결합 단백질을 생산하는 방법으로서, 방법은:
(A) 유전학적으로 변형된 비-인간 동물을 항원으로 면역화시키는 단계로서, 유전학적으로 변형된 동물은 생식선에:
(I) 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌에서,
(i) 적어도 하나의 내인성 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자의 CH1 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에서 결실 또는 불활성화 돌연변이로서, 상기 적어도 하나의 내인성 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자는 IgG, IgA, IgE, IgD, 또는 이의 조합체인, 결실 또는 불활성화 돌연변이, 및
(ii) 기능성 CH1 도메인을 암호화하는 서열을 포함하는 IgM 유전자,
(II) 적어도 하나의 재배열되지 않은 면역글로불린 경쇄 가변 영역(VL) 유전자 분절 및 적어도 하나의 재배열되지 않은 면역글로불린 경쇄 연결(JL) 유전자 분절을 포함하는 핵산 서열로서, 상기 적어도 하나의 재배열되지 않은 VL 유전자 분절 및 적어도 하나의 재배열되지 않은 JL 유전자 분절은 재조합하여 CH1 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에서 결실 또는 불활성화 돌연변이를 포함하는 내인성 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자에 작동적으로 연결된 재배열된 면역글로불린 경쇄 가변 영역(VL/JL) 뉴클레오타이드 서열을 형성할 수 있는, 핵산 서열을 포함하는 것인 단계;
(B) 유전학적으로 변형된 비-인간 동물을, 이의 혈청에서
(i) CH1 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에서 결실 또는 불활성화 돌연변이를 포함하는 내인성 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자에 작동적으로 연결된 재배열된 면역글로불린 경쇄 가변 영역(VL/JL) 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 VL-단일 도메인 결합 단백질, 및
(ii) 기능성 CH1 도메인을 암호화하는 서열을 포함하는 IgM 유전자에 의해 암호화된 IgM CH 도메인에 융합된 VL 도메인을 포함하는 하이브리드 쇄로서, 상기 하이브리드 쇄는 경쇄와 연합되어 있는, 하이브리드 쇄
를 포함하도록 유지하는 단계
를 포함하는, 방법. - 제1항에 있어서,
(a)
(i) 상기 적어도 하나의 재배열되지 않은 VL 유전자 분절은 인간이고,
(ii) 상기 적어도 하나의 재배열되지 않은 JL 유전자 분절은 인간이고,
(iii) 상기 적어도 하나의 재배열되지 않은 VL 유전자 분절은 인간 카파 유전자 분절 또는 인간 람다 유전자 분절이고,
(iv) 상기 적어도 하나의 재배열되지 않은 JL 유전자 분절은 인간 카파 유전자 분절 또는 인간 람다 유전자 분절이고, 및/또는
(v) 상기 적어도 하나의 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자는 비-인간이고;
(b) 상기 적어도 하나의 재배열되지 않은 VL 유전자 분절 및 적어도 하나의 재배열되지 않은 JL 유전자 분절이
(i) 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌에서 하나 이상의 내인성 면역글로불린 중쇄 VH, DH 및 JH 유전자 분절, 및/또는
(ii) 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌에서 모든 내인성 기능성 면역글로불린 중쇄 VH, DH 및 JH 유전자 분절을 대체하고; 및/또는
(c) 모든 기능성 내인성 면역글로불린 중쇄 VH, DH 및 JH 유전자 분절 및/또는 모든 기능성 내인성 면역글로불린 경쇄 VL 및 JL 유전자 분절이 결실되거나 기능적으로 불활성된 것을 특징으로 하는 방법. - 제1항에 있어서,
(a) 상기 적어도 하나의 내인성 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자는 힌지 영역을 암호화하는 서열에 결실 또는 불활성화된 돌연변이를 더 포함하고;
(b) CH1 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에서 결실 또는 불활성화 돌연변이가 IgG1 서열에 있고, 상기 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌가 IgD, IgG3, IgG2a, IgG2b, IgG2c, IgE, IgA, 및 이의 조합체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 면역글로불린 유전자의 결실 또는 불활성화 돌연변이를 더 포함하고;
(c)
(i) CH1 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에서 결실 또는 불활성화 돌연변이가 IgG1 서열에 있고, 상기 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌가 IgD, IgG3, IgG2a, IgG2b, IgG2c, IgE, IgA, 및 이의 조합체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 면역글로불린 유전자의 결실 또는 불활성화 돌연변이를 더 포함하고; 및
(ii) 상기 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌가 IgG2a 및 IgG2b 면역글로불린 유전자, IgG2b 및 IgG2c 면역글로불린 유전자, 또는 IgG3, IgD, IgA, 및 IgE 면역글로불린 유전자에서 결실 또는 불활성화 돌연변이를 포함하고;
(d) 상기 비-인간 동물이 수컷 비-인간 동물에서 기능성인 Adam6 유전자 또는 이의 일부를 포함하고, 상기 Adam6 유전자가 Adam6a 유전자, Adam6b 유전자, 또는 둘 다이고;
(e) 상기 VL-단일 도메인 결합 단백질의 적어도 하나의 중쇄가 기능성 힌지 영역이 추가로 부재이고;
(f) 상기 VL-단일 도메인 결합 단백질이 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG2c 및 IgG3로 이루어진 그룹으로부터 선택된 IgG 이소형을 갖고;
(g) 상기 VL-단일 도메인 결합 단백질이 인간 가변 도메인 및 비-인간 불변 도메인을 포함하고;
(h) 상기 VL-단일 도메인 결합 단백질이 단량체성이고; 및/또는
(i) 상기 비-인간 동물이 랫트 또는 마우스인 것을 특징으로 하는 방법. - 제1항에 있어서,
유전학적으로 변형된 비-인간 동물은,
(a) 비-인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자가 적어도 하나의 내인성 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자의 CH1 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 결실 또는 불활성화 돌연변이를 포함하게 비-인간 동물의 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌에서 적어도 하나의 비-인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자를 변형시키는 단계로서, 상기 비-인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자는 IgG, IgA, IgE, IgD, 또는 이의 조합체이고,
내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌는 기능성 CH1 도메인을 암호화하는 서열을 포함하는 IgM 유전자를 포함하는 것인 단계, 및
(b) 핵산 서열을 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌에 삽입하는 단계로서, 여기서 상기 핵산 서열은 적어도 하나의 재배열되지 않은 면역글로불린 경쇄 가변 영역(VL) 유전자 분절 및 적어도 하나의 재배열되지 않은 면역글로불린 경쇄 연결(JL) 유전자 분절을 포함하고, 상기 재배열되지 않은 VL 유전자 분절 및 재배열되지 않은 JL 유전자 분절은 재조합하여 CH1 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에서 결실 또는 불활성화 돌연변이를 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자 서열에 작동적으로 연결된 재배열된 면역글로불린 경쇄 가변 영역(VL/JL) 뉴클레오타이드 서열을 형성할 수 있는, 단계
를 포함하는 방법에 의해 생산되는 것을 특징으로 하는 방법. - 제4항에 있어서,
(a) 상기 변형시키는 단계가 CH1 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 결실 또는 불활성화 돌연변이를 포함하는 비-인간 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자의 힌지 영역을 암호화하는 서열을 결실 또는 불활성화시키는 것을 더 포함하고, 및/또는
(b)
(i) 상기 삽입하는 단계가 중쇄 면역글로불린 유전자좌의 발현이 기능성 CH1 도메인이 부재인 면역글로불린 경쇄 가변 도메인 및 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 포함하는 VL-단일 도메인 결합 단백질을 유도하게 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌에서 하나 이상의 내인성 면역글로불린 중쇄 VH, DH 및 JH 유전자 분절을 적어도 하나의 재배열되지 않은 VL 유전자 분절 및 적어도 하나의 재배열되지 않은 JL 유전자 분절로 대체하는 것을 포함하거나, 또는,
(ii) 상기 삽입하는 단계가 중쇄 면역글로불린 유전자좌의 발현이 기능성 CH1 도메인이 부재인 면역글로불린 경쇄 가변 도메인 및 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 포함하는 VL-단일 도메인 결합 단백질을 유도하게 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌에서 모든 기능성 내인성 면역글로불린 중쇄 VH, DH 및 JH 유전자 분절을 적어도 하나의 재배열되지 않은 VL 유전자 분절 및 적어도 하나의 재배열되지 않은 JL 유전자 분절로 대체하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제4항에 있어서,
(i) CH1 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 결실 또는 불활성화 돌연변이가 IgG1 유전자에 있고;
(ii) 상기 핵산 서열은 상기 유전학적으로 변형된 비-인간 동물의 생식선에 있고;
(iii) 상기 CH1 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 결실 또는 불활성화 돌연변이가 IgG1에 있고, 상기 방법은 (c) IgD, IgG3, IgG2a, IgG2b, IgG2c, IgE, IgA, 및 이의 조합체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 면역글로불린 유전자를 결실 또는 불활성화 하는 단계를 더 포함하고; 및/또는
(iv) 상기 비-인간 동물이 랫트 또는 마우스인 것을 특징으로 하는 방법. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
유전학적으로 변형된 비-인간 동물이 랫트 또는 마우스인 것을 특징으로 하는 방법. - 제7항에 있어서,
(C) 비-인간 동물로부터 항원에 특이적으로 결합하는 세포 또는 단백질을 단리시키는 단계로서, 상기 세포 또는 단백질은 체세포적으로 돌연변이된 단일 도메인 항원 결합 단백질을 포함하는 것인 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제8항에 있어서,
(D) (C)에서 단리된 세포로부터 단일 도메인 항원 결합 단백질의 가변 도메인을 암호화하는 제1 핵산을 단리시키는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제9항에 있어서,
(E) 벡터의 발현을 위해 충분한 조건하에서 벡터로 형질감염된 세포를 배양하는 단계로서, 상기 벡터는 인간 중쇄 불변 영역 유전자에 작동적으로 연결된 제2 핵산을 포함하고, 상기 제2 핵산은 단계 (D)에서 단리된 제1 핵산과 동일한 것인 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제10항에 있어서, 상기 인간 IgG 불변 영역 유전자가 IgG1, IgG2a, IgG2b, 및 IgG3으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제8항에 있어서,
(D) (C)에서 단리된 세포로부터 하이브리도마를 생성하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제12항에 있어서,
(D)에서 생성된 하이브리도마의 배양액으로부터 상등액을 수거하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제12항에 있어서,
(E) (D)에서 생성된 하이브리도마로부터 단일 도메인 항원 결합 단백질의 가변 도메인을 암호화하는 제1 핵산을 단리시키는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제13항에 있어서,
(F) 벡터의 발현을 위해 충분한 조건에서 벡터로 형질감염된 세포를 배양하는 단계로서, 상기 벡터는 인간 중쇄 불변 영역 유전자에 작동적으로 연결된 제2 핵산을 포함하고, 상기 제2 핵산은 단계 (D)에서 단리된 제1 핵산과 동일한 것인 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제14항에 있어서, 상기 중쇄 불변 영역 유전자가 IgG1, IgG2a, IgG2b, 및 IgG3으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 인간 IgG 불변 영역 유전자인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제12항의 방법에 따라 생성된 하이브리도마로서, 하이브리도마는 CH1 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에서 결실 또는 불활성화 돌연변이를 포함하는 내인성 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자에 작동적으로 연결된 재배열된 면역글로불린 경쇄 가변 영역(VL/JL) 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되는 VL-단일 도메인 결합 단백질을 발현하는, 하이브리도마.
- 제9항의 방법에 따라 단리된 핵산.
- 제14항의 방법에 따라 단리된 핵산.
- 제9항의 핵산과 동일한 핵산을 포함하는 세포.
- 제14항의 핵산과 동일한 핵산을 포함하는 세포.
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