[go: up one dir, main page]

KR102615681B1 - 변형된 t 세포에 대한 조건부 활성 키메라 항원 수용체 - Google Patents

변형된 t 세포에 대한 조건부 활성 키메라 항원 수용체 Download PDF

Info

Publication number
KR102615681B1
KR102615681B1 KR1020177006675A KR20177006675A KR102615681B1 KR 102615681 B1 KR102615681 B1 KR 102615681B1 KR 1020177006675 A KR1020177006675 A KR 1020177006675A KR 20177006675 A KR20177006675 A KR 20177006675A KR 102615681 B1 KR102615681 B1 KR 102615681B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cells
antibody
cell
domain
antigen
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
KR1020177006675A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20170042325A (ko
Inventor
제이 엠 쇼트
Original Assignee
바이오아트라, 인코퍼레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 바이오아트라, 인코퍼레이티드 filed Critical 바이오아트라, 인코퍼레이티드
Priority to KR1020237043017A priority Critical patent/KR102818922B1/ko
Publication of KR20170042325A publication Critical patent/KR20170042325A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102615681B1 publication Critical patent/KR102615681B1/ko
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1058—Directional evolution of libraries, e.g. evolution of libraries is achieved by mutagenesis and screening or selection of mixed population of organisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/10—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K40/11—T-cells, e.g. tumour infiltrating lymphocytes [TIL] or regulatory T [Treg] cells; Lymphokine-activated killer [LAK] cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/30—Cellular immunotherapy characterised by the recombinant expression of specific molecules in the cells of the immune system
    • A61K40/31—Chimeric antigen receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70521—CD28, CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70535—Fc-receptors, e.g. CD16, CD32, CD64 (CD2314/705F)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/572—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 cytotoxic response
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Ecology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)

Abstract

본 발명은 표적 항원과의 결합을 위한 키메라 항원 수용체에 관한다. 키메라 항원 수용체는 야생형 단백질 또는 이의 도메인으로부터 진화되었으며, (a) 야생형 단백질 또는 이의 도메인의 항원 특이적 표적화 영역과 비교되었을 때 정상 생리학적 조건에서의 검정에서 활성의 감소 및 (b) 야생형 단백질 또는 이의 도메인의 항원 특이적 표적화 영역과 비교되었을 때 비정상 조건하의 검정에서 활성의 증가 중 적어도 하나를 보이는 항원 특이적 표적화 영역 적어도 하나를 포함한다. 키메라 항원 수용체와, 이 키메라 항원 수용체를 발현하는 세포 독성 세포를 제조하기 위한 방법도 또한 제공된다.

Description

변형된 T 세포에 대한 조건부 활성 키메라 항원 수용체{CONDITIONALLY ACTIVE CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS FOR MODIFIED T-CELLS}
본 발명은 단백질 진화 분야에 관한 것이다. 특히 본 발명은 야생형 단백질로부터 조건부 활성 키메라 항원 수용체를 제조하는 방법에 관한 것이다. 조건부 활성 키메라 항원 수용체는 야생형 정상 생리학적 조건에서는 가역적으로나 비가역적으로 비활성화되지만, 비정상 조건에서는 활성이다.
단백질, 특히 효소를 다양한 특징에 대해 진화시키기 위한 잠재성을 기술한 많은 문헌이 있다. 예를 들어 효소는 상이한 조건들, 예를 들어 고온에서의 작동에 대하여 안정화되도록 진화될 수 있다. 고온에서 활성이 개선되는 상황에서, 개선의 실질적인 부분은 고온에서 활성 개선이 있는 경우에, 개선의 실질적 부분은 Q10 룰에 의해 공통적으로 기술되는 더 높은 운동 활성의 결과일 수 있으며, 이때 효소의 경우에 매 10℃의 증가에 대해 산출량이 배가되는 것으로 평가된다.
그 외에, 정상 작동 조건에서 단백질을 탈 안정화하는 자연 발생 돌연변이의 예들이 존재한다. 임의의 돌연변이체는 더 낮은 온도에서 활성일 수 있지만, 야생형 단백질의 활성 수준과 비교되었을 때 감소한 수준으로 활성이다. 이는 또한 통상적으로, Q10 룰 또는 유사한 룰에 의해 유도되는 활성 감소에 의해 설명될 수 있다.
조건부 활성화된 유용 분자를 제조하는 것이 요망된다. 예를 들어 야생형 작동 조건에서 실질적으로 비활성이되, 야생형 작동 조건 이외의 조건에서는 이 야생형 작동 조건에서의 활성 수준과 동일하거나 더 높은 수준으로 활성인 분자, 또는 임의의 미세환경에서 활성화 또는 비활성화되는 분자, 또는 시간이 경과 함에 따라서 활성화 또는 비활성화되는 분자를 제조하는 것이 요망된다. 온도 이외에, 단백질이 진화되거나 최적화될 수 있는 다른 조건은 pH, 삼투압, 삼투질 농도, 산화 스트레스 및 전해질 농도를 포함한다. 진화 동안 최적화될 수 있는 기타 요망되는 특성은 화학적 저항성 및 단백 분해 저항성을 포함한다.
분자를 진화시키거나 조작하기 위한 많은 전략이 발표되어 있다. 그러나 야생형 작동 조건 이외의 조건에서 활성을 자체의 상응하는 야생형 단백질의 활성과 동일하거나 더 우수하게 유지하면서, 야생형 작동 조건에서 단백질을 비 활성 또는 사실상 비 활성(활성이 10% 미만, 바람직하게 활성이 1% 미만)이 되도록 조작 또는 진화시키는 것은, 탈안정화 돌연변이(들)가, 탈안정화 효과에 반대작용을 하지 않는 활성 증가 돌연변이와 동시 존재할 것을 필요로 한다. 탈안정화는 Q10과 같은 표준 룰에 의해 예측되는 효과보다 큰, 단백질 활성을 감소시키는 것으로 예상된다. 따라서, 상응하는 야생형 단백질에 대한 정상 작동 조건 하에 비 활성화되면서 더 낮은 온도에서 효율적으로 작업하는 단백질을 진화시키는 능력은 예측되지 않은 새로운 부류의 단백질을 생성한다.
키메라 항원 수용체는 암 치료에 사용되어 오고 있다. 미국 특허출원 제2013/0280220호는, 항원, 예를 들어 종양 항원 2개 이상에 특이적인, 키메라 항원 수용체를 암호화하는 개선된 세포를 제공하는 방법 및 조성물을 개시하고 있다. 키메라 항원 수용체를 발현하는 세포는 세포 치료법에 사용될 수 있다. 이러한 세포 치료법은 임의의 의학적 병태에 적합할 수 있지만, 특정 구현예에서, 세포 치료법은 암, 예를 들어 고형 종양을 수반하는 암을 위한 것이다.
본 발명은 정상 생리학적 조건에서는 비활성이거나 덜 활성이지만, 비정상 생리학적 조건에서는 활성인, 조작된 조건부 활성 키메라 항원 수용체를 제공한다.
본 출원 전반에서, 저자 및 일자가 다양한 공보가 참조된다. 본원에 기술되고 청구된 발명의 일자로 당업자에게 공지된 최신 기술을 더 충분히 기술하기 위해 이들 공보의 개시내용이 그 전체로서 본원에 참고문헌으로 인용되어 있다.
도면의 간단한 설명
도 1은 본 발명의 하나의 구현예에 따른 키메라 항원 수용체의 개략적 묘사를 도시한다. ASTR은 항원 특이적 표적화 영역이고, L은 링커이며, ESD는 세포 외 스페이서 도메인이고, TM은 경막 도메인이며, CSD는 보조 자극 도메인이고, ISD는 세포 내 신호전달 도메인이다.
도 2 및 도 3은, 2가 또는 1가 항체로서 실시예 6의 조건부 활성 항체를 발현하는 것은 pH 6.0 이하 및 pH 7.4 이상에서 이와 같은 항체의 선택성을 유의적으로 바꾸지 못한다는 것을 보여주고 있다.
도 4는 실시예 7의 조건부 활성 항체가 응집되지 않음을 보여주는 크기별 배제 크로마토그래피의 프로필이다.
도 5는 표면 플라스몬 공명(Surface Plasmon Resonance; SPR) 검정에 의해 측정된 바와 같은, 실시예 7의 조건부 활성 항체에 대한 온-오프 속도(on and off rate)를 보인다.
도 6a 및 도 6b는 실시예 7의 SPR 검정에 의해 측정된 바와 같은, 조건부 활성 항체의 선택성을 보인다.
본 발명의 개요
하나의 양상에서, 본 발명은 야생형 단백질 또는 이의 도메인으로부터 진화되었으며, (a) 야생형 단백질 또는 이의 도메인의 항원 특이적 표적화 영역과 비교되었을 때 정상 생리학적 조건에서의 검정에서 활성의 감소 및 (b) 야생형 단백질 또는 이의 도메인의 항원 특이적 표적화 영역과 비교되었을 때 비정상 조건하의 검정에서 활성의 증가 중 적어도 하나를 보이는 항원 특이적 표적화 영역 적어도 하나; 경막 도메인; 그리고 세포 내 신호전달 도메인을 포함하는, 표적 항원과의 결합을 위한 키메라 항원 수용체(CAR)를 제공한다. 몇몇 구현예들에서, 키메라 항원 수용체는 세포 외 스페이서 도메인 또는 적어도 하나의 보조 자극 도메인을 추가로 포함한다.
키메라 항원 수용체는, 야생형 단백질 또는 이의 도메인의 항원 특이적 표적화 영역과 비교되었을 때 정상 생리학적 조건에서 표적 항원과의 결합 친화성이 감소한 항원 특이적 표적화 영역을 포함할 수 있다.
키메라 항원 수용체는, 야생형 단백질 또는 이의 도메인의 항원 특이적 표적화 영역과 비교되었을 때 비정상 조건 하 검정에서의 활성이 증가하고, 야생형 단백질 또는 이의 도메인의 항원 특이적 표적화 영역과 비교되었을 때 정상 생리학적 조건에서 표적 항원과의 결합 친화성이 감소한, 항원 특이적 표적화 영역을 포함할 수 있다.
상기 키메라 항원 수용체들 중 임의의 것에 있어서, 항원 특이적 표적화 영역은 또한 야생형 단백질 또는 이의 도메인의 항원 특이적 표적화 영역과 비교되었을 때 비정상 조건하 검정에서의 선택성이 증가할 수도 있다.
상기 키메라 항원 수용체들 중 임의의 것은, 야생형 단백질 또는 이의 도메인과 비교되었을 때 항원 수용체를 함유하는 단백질의 발현 수준이 증가하도록 입체배열될 수 있다.
대안적 구현예에서, 본 발명은 야생형 단백질 또는 이의 도메인으로부터 진화되었으며, 야생형 단백질 또는 이의 도메인의 항원 특이적 표적화 영역과 비교되었을 때 비정상 조건 하 검정에서의 선택성 증가를 보이는 항원 특이적 표적화 영역 적어도 하나; 경막 도메인; 그리고 세포 내 신호전달 도메인을 포함하는, 표적 항원과의 결합을 위한 키메라 항원 수용체(CAR)를 제공한다. 몇몇 구현예들에서, 키메라 항원 수용체는 세포 외 스페이서 도메인 또는 적어도 하나의 보조 자극 도메인을 추가로 포함한다.
다른 양상에서, 본 발명은 본 발명의 키메라 항원 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터를 제공한다. 발현 벡터는 렌티바이러스 벡터, 감마 레트로바이러스 벡터, 거품형성 바이러스 벡터, 아데노 연관 바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 폭스 바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터, 조작된 하이브리드 바이러스 그리고 트랜스포손 매개 벡터로부터 선택된다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 본 발명의 키메라 항원 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자 조작 세포 독성 세포를 제공한다. 세포 독성 세포는 T 세포일 수 있고, 처녀 T 세포, 중심 기억 T 세포, 효과기 기억 T 세포로부터 선택될 수 있다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 본 발명의 키메라 항원 수용체, 발현 벡터 및/또는 유전자 조작 세포 독성 세포, 그리고 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 적어도 하나의 항원 특이적 표적화 영역, 경막 도메인 및 세포 내 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체를 제조하기 위한 방법을 제공한다. 본 방법은, 돌연변이 DNA를 제조하기 위해 하나 이상의 진화 기술을 사용하여 야생형 단백질 또는 이의 도메인을 암호화하는 DNA를 진화시킴으로써, 표적 항원과 특이적으로 결합하는 야생형 단백질 또는 이의 도메인으로부터 항원 특이적 표적화 영역 적어도 하나를 제조하는 단계; 이 돌연변이 DNA를 발현시켜 돌연변이 폴리펩티드를 제조하는 단계; 돌연변이 폴리펩티드와 야생형 단백질 또는 이의 도메인을 대상으로 정상 생리학적 조건하에서의 검정 및 비정상 조건하에서의 검정을 수행하는 단계; 그리고 돌연변이 폴리펩티드로부터 (a) 야생형 단백질 또는 이의 도메인의 항원 특이적 표적화 영역과 비교되었을 때 정상 생리학적 조건에서의 검정에서 활성의 감소 및 (b) 야생형 단백질 또는 이의 도메인의 항원 특이적 표적화 영역과 비교되었을 때 비정상 조건하의 검정에서 활성의 증가 중 적어도 하나를 보이는 조건부 활성 항원 특이적 표적화 영역을 선택하는 단계를 포함한다.
상기 방법에 의해 제조된 키메라 항원 수용체는 야생형 단백질 또는 이의 도메인의 항원 특이적 표적화 영역과 비교되었을 때 정상 생리학적 조건하에서의 표적 항원에 대한 결합 친화성이 감소한, 항원 특이적 표적화 영역을 포함할 수 있다.
상기 방법에 의해 제조된 키메라 항원 수용체는 야생형 단백질 또는 이의 도메인의 항원 특이적 표적화 영역과 비교되었을 때 비정상 조건하의 검정에서 활성의 증가 및 야생형 단백질 또는 이의 도메인의 항원 특이적 표적화 영역과 비교되었을 때 정상 생리학적 조건하에서 표적 항원에 대한 결합 친화성의 감소를 보이는 항원 특이적 표적화 영역을 포함할 수 있다.
상기 방법에 의해 제조된 상기 키메라 항원 수용체들 중 임의의 것에 있어서, 항원 특이적 표적화 영역은 또한 야생형 단백질 또는 이의 도메인의 항원 특이적 표적화 영역과 비교되었을 때 비정상 조건하의 검정에서 선택성 증가를 보일 수도 있다.
상기 방법에 의해 제조된 상기 키메라 항원 수용체들 중 임의의 것은, 야생형 단백질 또는 이의 도메인과 비교되었을 때 항원 수용체를 함유하는 단백질의 발현 수준이 증가하도록 배치될 수 있다.
상기 방법의 대안적 구현예에서, 본 방법에 의해 제조된, 표적 항원과의 결합을 위한 키메라 항원 수용체(CAR)는 야생형 단백질 또는 이의 도메인으로부터 진화되었으며, 야생형 단백질 또는 이의 도메인의 항원 특이적 표적화 영역과 비교되었을 때 비정상 조건 하 검정에서의 선택성 증가를 보이는 항원 특이적 표적화 영역 적어도 하나; 경막 도메인; 그리고 세포 내 신호전달 도메인을 포함한다. 몇몇 구현예들에서, 키메라 항원 수용체는 세포 외 스페이서 도메인 또는 적어도 하나의 보조 자극 도메인을 추가로 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 본 발명의 키메라 항원 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터를, 피험체로부터 얻은 세포 독성 세포에 도입하여 유전자 조작된 세포 독성 세포를 제조하는 단계; 및 유전자 조작된 세포 독성 세포를 피험체에 투여하는 단계를 포함하는, 피험체 내에서 암을 치료하기 위한 방법을 제공한다.
정의
본원에 제공된 예들의 이해를 용이하게 하기 위해, 자주 등장하는 임의의 방법들 및/또는 용어들이 본원에 정의될 것이다.
측정된 양과 관련하여 본원에 사용되는 바와 같이, "약"이라는 용어는 측정을 이루고 측정의 대상 및 사용되는 측정 기기의 정밀도에 상응하여 일정 수준의 주의를 기울이는 당업자에 의해 예측될, 측정된 양의 정상적인 변차를 지칭한다. 다른 식으로 나타내지 않은 한, "약"은 제공되는 값의 +/- 10%의 변차를 지칭한다.
"제제(agent)"라는 용어는, 화합물, 화합물들의 혼합물, 공간적으로 편재된 화합물들의 어레이(예를 들어 VLSIPS 펩티드 어레이, 폴리뉴클레오티드 어레이, 및/또는 조합 소 분자 어레이), 생체 거대분자, 박테리오파지 펩티드 전시 라이브러리, 박테리오파지 항체(예를 들어 scFv) 전시 라이브러리, 폴리솜 펩티드 전시 라이브러리, 또는 박테리아, 식물, 진균 또는 동물(특정 포유동물) 세포 또는 조직과 같은 생체시료로부터 제조되는 추출물을 나타내기 위해 본원에 사용된다. 제제는 하기에 기술되는 스크리닝 검정에 포함됨으로써 잠재적 효소 활성에 대해 평가된다. 제제는 하기에 기술된 스크리닝 검정에 포함됨으로써 조건부 활성 생체 치료용 효소로서의 잠재적 활성에 대해 평가된다.
본원에 사용되는 바와 같이, "아미노산"이라는 용어는, 바람직하게는 유리기로서, 또는 대안적으로 축합 후 펩티드 결합의 일부로서 아미노기(--NH2) 및 카르복실기(--COOH)를 함유하는 임의의 유기 화합물을 지칭한다. "20개의 자연적으로 암호화된 폴리펩티드 생성 알파-아미노산"은, 당 분야에서 알라닌(ala 또는 A), 아르기닌(arg 또는 R), 아스파라긴(asn 또는 N), 아스파르트산(asp 또는 D), 시스테인(cys 또는 C), 글루탐산(glu 또는 E), 글루타민(gln 또는 Q), 글리신(gly 또는 G), 히스티딘(his 또는 H), 이소루신(ile 또는 I), 루신(leu 또는 L), 리신(lys 또는 K), 메티오닌(met 또는 M), 페닐알라닌(phe 또는 F), 프롤린(pro 또는 P), 세린(ser 또는 S), 트레오닌(thr 또는 T), 트립토판(trp 또는 W), 티로신(tyr 또는 Y) 및 발린(val 또는 V)을 지칭하는 것으로 이해된다.
본원에 사용되는 바와 같이, "증폭(amplification)"이라는 용어는, 폴리뉴클레오티드의 복사체의 수가 증가함을 의미한다.
본원에 사용되는 바와 같은 "항체"라는 용어는, 항원의 에피토프에 결합될 수 있는 비 변형 면역글로불린 분자뿐만 아니라, 면역글로불린 분자의 단편, 예를 들어 Fab, Fab', (Fab')2, Fv, 그리고 SCA 단편을 지칭한다. 항체로부터 유도되는 것으로서, 항원(예를 들어 폴리펩티드 항원)에 선택적으로 결합하는 능력을 일부 보유하는, 항체의 이러한 단편들은 당 업계에 널리 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있으며[예를 들어 문헌(Harlow and Lane, 상동) 참조], 다음과 같이 추가로 기술된다. 항체는 면역친화성 크로마토그래피에 의해 예비 량만큼의 항원을 단리하는데 사용될 수 있다. 이러한 항체의 기타 다양한 용도는, 질환(예를 들어 종양 형성)의 진단 및/또는 기수 판단과, 질환, 예를 들어 종양 형성, 자가면역질환, AIDS, 심혈관질환 및 감염 등을 치료하기 위한 치료적 응용이다. 키메라, 인간 유사, 인간화 또는 전 인간 항체는 인간인 환자에의 투여에 특히 유용하다.
Fab 단편은 항체 분자의 1가 항원 결합 단편으로 이루어지고, 전 항체 분자를 파페인 효소로 분해하여, 비 변형 경쇄와 중쇄 일부로 이루어진 단편을 제조함으로써 제조될 수 있다.
항체 분자의 Fab' 단편은 전 항체 분자를 펩신으로 처리한 다음, 환원시켜 비변형 경쇄와 중쇄 일부로 이루어진 분자를 제조함으로써 제조될 수 있다. 이러한 방식으로 처리된 항체 분자당 2개의 Fab' 단편이 제조된다.
항체의 (Fab')2 단편은, 전 항체 분자를 펩신 효소로 처리하면서, 후속 환원 과정은 거치지 않았을 때 제조될 수 있다. (Fab')2 단편은 2개의 Fab' 단편이 2개의 이황화 결합에 의해 함께 결합되어 이루어진 이량체이다.
Fv 단편은, 2개의 사슬로서 발현된 중쇄의 가변 영역과 경쇄의 가변 영역을 함유하는 유전자 조작된 단편으로서 정의된다.
본원에 사용되는 바와 같이, "항원" 또는 "Ag"란 용어는, 면역 반응을 촉발하는 분자로서 정의된다. 이 면역 반응은 항체 생산, 또는 특이 면역학적 수용성 세포의 활성화 중 어느 하나, 또는 이 둘 다를 수반할 수 있다. 당 업자는 임의의 거대분자, 예를 들어 사실상 모든 단백질 또는 펩티드가 항원으로 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 뿐만 아니라, 항원은 재조합 DNA 또는 게놈 DNA로부터 유도될 수 있다. 당 업자는 이 "항원"이라는 용어가 본원에 사용되고 있음에 따라, 면역 반응을 유도하는 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 또는 부분 뉴클레오티드 서열을 포함하는 임의의 DNA가 "항원"을 암호화함을 이해할 것이다. 뿐만 아니라, 당 업자는, 항원이 오로지 유전자의 전장 뉴클레오티드 서열에 의해서만 암호화될 필요는 없음을 이해할 것이다. 본 발명은 하나를 초과하는 유전자로 이루어진 부분 뉴클레오티드 서열의 용도를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니고, 이러한 뉴클레오티드 서열이 원하는 면역 반응을 유도하기 위해 다양한 조합으로 정렬됨이 용이하게 파악된다. 더욱이 당 업자는, 항원은 "유전자"에 의해 암호화될 필요가 전혀 없음을 이해할 것이다. 항원은 제조, 합성 또는 생체 시료로부터 유도될 수 있음이 용이하게 파악된다. 이러한 생체 시료는 조직 시료, 종양 시료, 세포 또는 생체 유체를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본원에 사용되는 바와 같이, "항원 소실 도피 변이체(antigen loss escape variant)"는, 본 발명의 CAR에 의해 표적화되는 표적 항원의 발현 감소를 보이거나 이 표적 항원을 발현하지 않는 세포를 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "자가면역 질환"이란 용어는, 자가면역 반응으로부터 기인하는 장애로서 정의된다. 자가면역 질환은 자기 항원에 대한 부적절하고 과도한 반응의 결과이다. 자가면역 질환의 예들은 애디슨병, 탈모병, 강직성 척추염, 자가면역성 간염, 자가면역성 이하선염, 크론병, (제1형) 당뇨병, 수포성 표피 박리증, 부고환염, 사구체신염, 그레이브스병, 길랭-바레 증후군, 하시모토병, 용혈성 빈혈, 전신 홍반성 낭창, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 심상성 천포창, 건선, 류머티즘열, 류머티즘성 관절염, 유육종증, 피부경화증, 쇼그렌 증후군, 척추 관절병, 갑상선염, 혈관염, 백반증, 점액 수종, 악성 빈혈, 궤양성 대장염 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본원에 사용되는 바와 같이, "자기 유래의(autologous)"라는 용어는, 임의의 물질이, 추후 그 물질이 다시 도입된 개체와 동일한 개체로부터 유래하는 경우를 지칭한다. 예를 들어 어느 환자로부터 유래하는 T 세포는 단리되어 CAR을 발현하도록 유전자 조작된 후 동일한 환자에게 재도입될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, "B 세포 연관 질환"이란 용어는, B 세포 면역결핍증, 자가면역 질환 및/또는 B 세포 연관 과다/무한 세포 증식(예를 들어 림프종 및/또는 백혈병)을 포함한다. 이와 같이 본 발명의 이중 특이적 CAR이 치료 접근 방법을 위해 사용될 수 있는 질환의 예들은, 전신 홍반성 낭창(SLE), 당뇨병, 류머티즘성 관절염(RA), 반응성 관절염, 다발성 경화증(MS), 심상성 천포창, 셀리악병, 크론병, 염증성 장 질환, 궤양성 대장염, 자가면역성 갑상선 질환, X 연관 무감마글로불린혈증, pre-B 급성 림프아구성 백혈병, 전신 홍반성 낭창, 공통 가변성 면역결핍증, 만성 림프아구성 백혈병, 선택적 IgA 결핍증 및/또는 IgG 하위군 결핍증 연관 질환, B 계통 림프종(호지킨 림프종 및/또는 비호지킨 림프종), 흉선종 동반 면역결핍증, 일과성 저감마글로불린혈증 및/또는 고IgM 증후군뿐만 아니라, 바이러스 매개 B 세포 질환, 예를 들어 EBV 매개 림프증식성 질환, 그리고 B 세포가 병리생리학에 참여하는 만성 감염을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
"혈액 뇌 장벽" 또는 "BBB"이라는 용어는, 뇌 모세혈관 내피 원형질막 내부의 단단한 접합부들에 의해 형성되어, 분자, 심지어 매우 작은 분자(예를 들어 우레아(60 달톤))의 뇌로의 운반을 제한하는 단단한 장벽을 형성하는, 말초 혈류와 뇌, 그리고 척수 사이의 생리학적 장벽을 지칭한다. 뇌 내 혈액 뇌 장벽, 척수 내 혈액 척수 장벽, 그리고 망막 내 혈액 망막 장벽은 중추 신경계(CNS) 내 연속적인 모세관 장벽으로서, 본원에서는 "혈액 뇌 장벽" 또는 "BBB"로서 통칭된다. BBB는 또한, 장벽이 모세관 내피 세포보다는 신경교세포로 이루어질 때 혈액 뇌척수액 장벽(문맥총)을 포함하기도 한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "암" 및 "암성의"라는 용어는, 통상적으로 비 조절성 세포 성장에 의해 특징지어지는, 포유동물 내 생리학적 상태를 지칭하거나 기술한다. 암의 예는 B 세포 림프종(호지킨 림프종 및/또는 비 호지킨 림프종), 뇌 종양, 유방암, 결장암, 폐암, 간세포 암, 위암, 췌장암, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 요로암, 갑상샘암, 신장암, 암종, 흑색종, 두경부암, 뇌암, 그리고 전립선암, 예를 들어 안드로겐 의존적 전립선암 및 안드로겐 비 의존적 전립선암(이에 한정되는 것은 아님)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본원에 사용되는 바와 같이, "키메라 항원 수용체" 또는 "CAR" 또는 "CAR들"이라는 용어는, 항원 특이성을 세포독성 세포, 예를 들어 T 세포, NK 세포 및 대식세포에 이식시키는 조작된 수용체를 지칭한다. 본 발명의 CAR는 적어도 하나의 항원 특이적 표적화 영역(ASTR), 세포 외 스페이서 도메인(ESD), 경막 도메인(TM), 하나 이상의 보조 자극 도메인(CSD), 그리고 세포 내 신호전달 도메인(ISD)을 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, ESD 및/또는 CSD는 선택적이다. 다른 구현예에서, CAR은 2개의 상이한 항원 또는 에피토프에 특이적인 이중 특이적 CAR이다. ASTR이 표적 항원에 특이적으로 결합한 후, ISD는 세포 내 신호전달을 활성화한다. 예를 들어 ISD는 항체의 항원 결합 특성을 이용하면서, 선택된 표적에 대한 T 세포 특이성 및 반응성을 비 MHC 제한 방식으로 재유도(redirecting)할 수 있다. 비 MHC 제한 항원 인지는 CAR을 발현하는 T 세포에, 항원 가공과는 독립적인 항원을 인지하여 종양 도피의 주요 기작을 우회할 수 있는 능력을 부여한다. 더욱이 CAR이 T 세포에서 발현될 때, 이 CAR은 내인성 T 세포 수용체(TCR) 알파 사슬 및 베타 사슬과 이량체를 형성하지 않는 것이 유리하다.
본원에 사용되는 바와 같이, "공동 발현하다(co-express)"란 용어는, 2개 이상의 유전자가 동시 발현되는 것을 지칭한다. 유전자는, 예를 들어 단일 단백질 또는 키메라 단백질을 하나의 폴리펩티드 사슬로서 암호화하는 핵산일 수 있다. 예를 들어 본 발명의 CAR은 치료 제어 인자(예를 들어 절단된 상피 성장 인자(EGFRt))와 함께 공동 발현될 수 있는데, 이때 상기 CAR은 제1 폴리뉴클레오티드 사슬에 의해 암호화되고, 상기 치료 제어 인자는 제2 폴리뉴클레오티드 사슬에 의해 암호화된다. 하나의 구현예에서, 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드 사슬들은 절단 가능한 링커를 암호하하는 핵산 서열에 의해 연결된다. 대안적으로, CAR 및 치료 제어 인자는, 링커에 의해 연결되지 않고, 그 대신, 예를 들어 2개의 상이한 벡터에 의해 암호화되는, 상이한 폴리뉴클레오티드 2개에 의해 암호화된다.
본원에 사용되는 바와 같이, "동족체(cognate)"란 용어는, 종들 간에 진화 상으로뿐만 아니라 기능상 관련된 유전자 서열을 지칭한다. 제한적이지 않은 예를 들자면, 인간 게놈에 있어서 인간 CD4 유전자는 마우스 3d4 유전자에 대해 동족 유전자인데, 그 이유는 상기 2개의 유전자의 서열 및 구조가, 이 유전자들이 상동성이 크다는 것과, 이 두 유전자가 MHC 제II군 제한 항원 인지를 통하여 T 세포 활성화 신호전달에서 작용을 하는 단백질을 암호화함을 나타내기 때문이다.
"조건부 활성 생체 단백질(conditionally active biologic protein)"이라는 용어는, 하나 이상의 정상 생리학적 조건하에 모 야생형 단백질보다 활성이 크거나 작은, 야생형 단백질의 변이체 또는 돌연변이체를 지칭한다. 이 조건부 활성 단백질은 또한 체내의 선택된 영역에서 활성을 나타내고/나타내거나 비정상 또는 허용 생리학적 조건하에 증가 또는 감소한 활성을 나타낸다. 정상 생리학적 조건은 피험체에 대한 투여 위치에서 또는 작용 위치의 조직 또는 장기에서 정상 범위 내에 있는 것으로 간주되는 온도, pH, 삼투압, 삼투질 농도, 산화 스트레스 및 전해질 농도의 조건이다. 비정상 조건은 해당 조건에 대해 정상적으로 허용 가능한 범위로부터 벗어난 조건이다. 하나의 양상에서, 조건부 활성 생체 단백질은 사실상 야생형 조건에서 비 활성이지만, 야생형 조건 이외의 조건에서 야생형 조건에서와 동일하거나 이보다 높은 수준으로 활성이다. 예를 들어 하나의 양상에서, 진화된 조건부 활성 생체 단백질은 사실상 체온에서 비 활성이지만, 더 낮은 온도에서는 활성이다. 또 다른 양상에서, 조건부 활성 생체 단백질은 야생형 조건에서 가역적으로 또는 비가역적으로 비 활성화된다. 추가의 양상에서, 야생형 단백질은 치료용 단백질이다. 또 다른 양상에서, 조건부 활성 생체 단백질은 약물 또는 치료제로서 사용된다. 또 다른 양상에서, 단백질은 예를 들어 폐를 통한 통과 후에 또는 신장에서 발견되는 더 낮은 pH 환경에서와 같이 고도로 산소화된 혈액 중에서 더 활성이거나 덜 활성이다.
"보존적 아미노산 치환(conservative amino acid substitution)"은, 유사한 측쇄를 갖는 잔기들의 호환성을 지칭한다. 예를 들어 지방족 측쇄를 갖는 일 군의 아미노산은 글리신, 알라닌, 발린, 루신 및 이소루신이고; 지방족-하이드록실 측쇄를 갖는 일 군의 아미노산은 세린 및 트레오닌이고; 아미드 함유 측쇄를 갖는 일 군의 아미노산은 아스파라긴 및 글루타민이고; 방향족 측쇄를 갖는 일 군의 아미노산은 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판이고; 염기성 측쇄를 갖는 일 군의 아미노산은 리신, 아르기닌 및 히스티딘이고; 황 함유 측쇄를 갖는 일 군의 아미노산은 시스테인 및 메티오닌이다. 바람직한 보존적 아미노산 치환 군은 발린-루신-이소루신, 페닐알라닌-티로신, 리신-아르기닌, 알라닌-발린 및 아스파라긴-글루타민이다.
"~에 상응하다"라는 용어는 본원에서 폴리뉴클레오티드 서열이 기준 폴리뉴클레오티드 서열 전부 또는 일부에 대해 상동성이거나(즉 동일하되, 진화 상 엄격하게 관련되지 않거나), 또는 폴리펩티드 서열이 기준 폴리펩티드 서열과 동일하다는 것을 의미하는 것으로 사용된다. 대조적으로, "~에 상보성인"이라는 용어는 본원에서 상보성 서열이 기준 폴리뉴클레오티드 서열 전부 또는 일부에 대해 상동성임을 의미하는 것으로 사용된다. 예를 들어 뉴클레오티드 서열 "TATAC"는 기준 서열 "TATAC"에 상응하고, 기준 서열 "GTATA"에 상보성이다.
본원에 사용되는 바와 같이, "보조 자극 리간드"라는 용어는, 항원 제시 세포(예를 들어 수지상 세포 및 B 세포 등) 상 분자로서, T 세포 상 동족 보조 자극 분자와 특이적으로 결합하여, 예를 들어 TCR/CD3 복합체와, 펩티드가 장전된 MHC 분자의 결합에 의해 제공되는 1차 신호 이외에, T 세포 반응, 예를 들어 증식, 활성화 및 분화 등(이에 한정되는 것은 아님)을 매개하는 신호를 제공하는 분자를 포함한다. 보조 자극 리간드는 CD7, B7-1(CD80), B7-2(CD86), PD-L1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, 유도성 보조 자극 리간드(ICOS-L), 세포 내 접착 분자(ICAM), CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, MICB, HVEM, 림포톡신 베타 수용체, 3/TR6, ILT3, ILT4, HVEM, Toll 리간드 수용체에 결합하는 항체 또는 작용물질, 및 B7-H3와 특이적으로 결합하는 리간드를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 그중에서도 보조 자극 리간드는 또한 T 세포 상에 존재하는 보조 자극 분자, 예를 들어 CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 작용 연관 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3(이에 한정되는 것은 아님)와 특이적으로 결합하는 항체, 그리고 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드를 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "보조 자극 분자"라는 용어는, 보조 자극 리간드와 특이적으로 결합함으로써 T 세포에 의한 보조 자극 반응, 예를 들어 증식(이에 한정되는 것은 아님)을 매개하는, T 세포 상의 동족 결합 파트너를 지칭한다. 보조 자극 분자는 MHC 제1군 분자, BTLA 및 Toll 리간드 수용체를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본원에 사용되는 바와 같이, "보조 자극 신호"라는 용어는, 1차 신호, 예를 들어 TCR/CD3 결찰과 함께 T 세포 증식 및/또는 핵심 분자의 상향 조절 또는 하향 조절을 유도하는 신호를 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "세포 독성 세포"라는 용어는, 침입 미생물, 종양 세포 또는 기타 발병된 조직 세포를 손상 또는 파괴할 수 있는 세포를 의미한다. 이 용어는 여러 세포 류들 가운데 자연 살해(NK) 세포, 활성화된 NK 세포, 호중구, T 세포, 호산구, 호염기구, B 세포, 대식 세포 및 림포카인 활성화 살해(LAK) 세포를 포함하는 의미이다. 세포 독성 세포는 항체, 수용체, 리간드 또는 이것들의 단편/유도체를 통하여 표적 세포와 결합하며, 그 결과 안정한 복합체를 형성하고, 이 복합체는 세포 독성 세포를 자극하여 이 세포 독성 세포가 표적 세포를 파괴하게 한다.
세포 독성 세포는 또한 종양 용해 능을 가지는 다른 면역 세포들, 예를 들어 자연 살해 T 세포[Heczey et al., "Invariant NKT cells with chimeric antigen receptor provide a novel platform for safe and effective cancer immunotherapy," Blood, vol. 124, pp.2824-2833, 2014] 및 과립구(이에 한정되는 것은 아님)도 포함할 수 있다. 또한, 세포 독성 세포는 식세포 능을 보유하는 면역 세포, 예를 들어 대식세포 및 과립구(이에 한정되는 것은 아님), 줄기 세포 특성 및/또는 조상 세포 특성을 갖는 세포, 예를 들어 조혈 줄기/조상 세포[Zhen et al., "HIV-specific Immunity Derived From Chimeric Antigen Receptor-engineered Stem Cells," Mol Ther., vol. 23, pp.1358-1367, 2015], 배 줄기 세포(ESC), 제대혈 줄기 세포 및 유도 만능 줄기 세포(iPSC)(Themeli et al., "New cell sources for T cell engineering and adoptive immunotherapy," Cell Stem Cell., vol. 16, pp.357-366, 2015)(이에 한정되는 것은 아님)를 포함할 수도 있다. 뿐만 아니라, 세포 독성 세포는 "합성 세포", 예를 들어 iPSC 유도 T 세포(TiPSC)(Themeli et al., "Generation of tumor-targeted human T lymphocytes from induced pluripotent stem cells for cancer therapy," Nat Biotechnol., vol.31, pp.928-933, 2013) 또는 iPSC 유도 NK 세포를 포함한다.
"분해 유효량"이란 용어는, 효소와 접촉하지 않은 기질과 비교되었을 때, 기질의 적어도 50%를 처리하는데 필요한 효소의 양을 지칭한다.
"지향성 결찰(directional ligation)"이라는 용어는, 폴리뉴클레오티드의 5' 말단 및 3' 말단이 바람직한 결찰 배향을 지정하기에 충분할 정도로 상이한 결찰을 지칭한다. 예를 들어 달리 미처리 및 비 분해된 PCR 생성물로서, 평활 말단 2개를 가지는 PCR 생성물은 클로닝 벡터 자체의 다중 클로닝 위치에 평활 말단들을 형성하도록 분해된 클로닝 벡터에 결찰될 때 통상 바람직한 결찰 배향을 가지지 않을 것이므로; 지향성 결찰은 통상 이와 같은 환경 하에서는 보이지 않을 것이다. 이와는 대조적으로, 5' EcoRI 처리된 말단과 3' BamHI을 가지는, 분해된 PCR 생성물이, EcoRI 및 BamHI으로 분해된 다중 클로닝 위치를 가지는 클로닝 벡터에 결찰될 때, 통상 지향성 결찰은 보일 것이다.
본원에 사용되는 바와 같이, "유전자 변형된 세포 독성 세포에 의해 표적화된 질환"이라는 용어는, 유전자 변형된 세포가 치료학적으로 유리한 결과를 초래하기 위하여 발병된 세포를 표적화하는지 아니면 건강한 세포를 표적화하는지와는 상관 없이 본 발명의 유전자 변형된 세포에 의해 임의의 질환에 임의의 방식으로 관여하는 임의의 세포를 표적화하는 것을 포함한다. 유전자 변형된 세포는 유전자 변형된 T 세포, NK 세포 및 대식세포를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 유전자 변형된 세포는 본 발명의 CAR을 발현하는데, 이 CAR은 표적 세포의 표면상에 발현되는 항원들 중 임의의 것을 표적화할 수 있다. 표적화될 수 있는 항원의 예들은 B 세포상에 발현되는 항원; 암종, 육종, 림프종, 백혈병, 생식 세포 종양 및 아세포종 상에 발현되는 항원; 다양한 면역 세포 상에 발현되는 항원; 그리고 다양한 혈액학적 질환, 자가면역질환 및/또는 염증 질환과 연관된 세포상에 발현되는 항원을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 표적화될 수 있는 기타 항원은 당업자들에게 명백할 것이며, 본 발명의 대안적 구현예와 관계된 본 발명의 CAR에 의해 표적화될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, "유전자 변형된 세포", "재유도된 세포", "유전자 조작된 세포" 또는 "변형된 세포"라는 용어는, 본 발명의 CAR을 발현하는 세포를 지칭한다.
"DNA 셔플링"이라는 용어는, 실질적으로 상동성이지만 동일하지 않은 서열들 사이의 재조합을 나타내기 위해 본원에 사용되며, 몇몇 구현예들에서, DNA 셔플링은 cer/lox 및/또는 flp/frt 계 등을 통해서와 같이 비 상동성 재조합을 통한 크로스오버(crossover)를 수반할 수 있다. DNA 셔플링은 랜덤 또는 비 랜덤일 수 있다.
"약물(drug)" 또는 "약물 분자"라는 용어는, 인간 또는 동물 몸에 투여될 때, 인간 또는 동물 몸에 대한 유익한 효과를 갖는 물질을 포함하는 치료제를 지칭한다. 바람직하게는, 치료제는 인간 또는 동물 몸에서 한 가지 이상의 증상, 질병 또는 이상 병태를 치료, 치유 또는 경감시키거나 인간 또는 동물 몸의 건강을 향상시킬 수 있는 물질을 포함한다.
"유효량"은, 일부 기간에 걸쳐 투여되는 생체에서 병태를 치료하거나 예방하며, 예를 들어 요망되는 투여 간격 동안 치료 효과를 제공하기 위해 효과적인 조건부 활성 생체 단백질 또는 단편의 양이다.
본원에 사용되는 바와 같이, "전해질"이라는 용어는, 전하를 운반하는 혈액 또는 다른 체액 중의 미네랄을 정의한다. 예를 들어 하나의 양상에서, 정상 생리학적 조건 및 비정상 조건은 "전해질 농도"의 조건일 수 있다. 하나의 양상에서, 시험하려는 전해질 농도는 이온화된 칼슘, 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 염화물, 중탄산염 및 인산염 농도 중 하나 이상으로부터 선택된다. 예를 들어 하나의 양상에서, 혈청 칼슘의 정상 범위는 8.5 내지 10.2㎎/dL이다. 상기 양상에서, 비정상 혈청 칼슘 농도는 정상 범위보다 높거나 낮은 범위로부터 선택될 수 있다. 또 다른 예에서, 하나의 양상에서, 혈청 염화물의 정상 범위는 96~106 밀리당량/리터(mEq/L)이다. 상기 양상에서, 비정상 혈청 염화물 농도는 정상 범위보다 높거나 낮은 범위로부터 선택될 수 있다. 또 다른 예에서, 하나의 양상에서, 혈청 마그네슘의 정상 범위는 1.7~2.2㎎/dL이다. 상기 양상에서, 비정상 혈청 마그네슘 농도는 정상 범위보다 높거나 낮은 범위로부터 선택될 수 있다. 또 다른 예에서, 하나의 양상에서, 혈청 인의 정상 범위는 2.4 내지 4.1㎎/dL이다. 상기 양상에서, 비정상 혈청 인 농도는 정상 범위보다 높거나 낮은 범위로부터 선택될 수 있다. 또 다른 예에서, 하나의 양상에서, 혈청 또는 혈액 나트륨의 정상 범위는 135 내지 145 mEq/L이다. 상기 양상에서, 비정상 혈청 또는 혈액 나트륨 농도는 정상 범위보다 높거나 낮은 범위로부터 선택될 수 있다. 또 다른 예에서, 하나의 양상에서, 혈청 또는 혈액 칼륨의 정상 범위는 3.7 내지 5.2 mEq/L이다. 상기 양상에서, 비정상 혈청 또는 혈액 칼륨 농도는 정상 범위보다 높거나 낮은 범위로부터 선택될 수 있다. 추가의 양상에서, 혈청 중탄산염의 정상 범위는 20 내지 29 mEq/L이다. 상기 양상에서, 비정상 혈청 또는 혈액 중탄산염 농도는 정상 범위보다 높거나 낮은 범위로부터 선택될 수 있다. 상이한 양상에서, 중탄산염 수준은 혈액에서 정상 수준의 산도(pH)를 나타내기 위해 사용될 수 있다. "전해질 농도"라는 용어는, 또한 혈액 또는 혈장 이외의 체액 또는 조직 중 특정 전해질의 조건을 정의하기 위해 사용될 수 있다. 이 경우에, 정상 생리학적 조건은 조직 또는 체액에 대하여 임상으로 정상 범위인 것으로 간주된다. 상기 양상에서, 비정상 조직 또는 체액 전해질 농도는 정상 범위보다 높거나 낮은 범위로부터 선택될 수 있다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, "에피토프(epitope)"라는 용어는, 효소 특이적 항체와 같은 항체의 파라토프가 결합된, 효소 폴리펩티드와 같은 항원에 대한 항원결정기를 지칭한다. 항원 결정기는 일반적으로 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적 활성 표면 군으로 구성되며, 특이한 3차원 구조적 특징 및 특이한 하전 특징을 가질 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이, "에피토프"는 항체의 가변영역 결합체와 상호작용하는 결합 상호작용을 일으킬 수 있는 항원 또는 다른 거대분자의 부분을 지칭한다. 통상적으로, 이러한 결합 상호작용은 CDR의 하나 이상의 아미노산 잔기와의 분자 간 접촉으로서 나타난다.
본원에 사용되는 바와 같이, "진화(evolution)" 또는 "진화하는(evolving)"이라는 용어는, 신규 폴리펩티드를 암호화하는 신규 폴리뉴클레오티드를 제조하기 위한 돌연변이 유발의 하나 이상의 방법을 사용하는 것을 지칭하는데, 이 경우 신규 폴리펩티드는 자체로 개선된 생체 분자이고/분자이거나 다른 개선된 생체 분자의 생성에 기여한다. 특정의 비 제한적인 양상에서, 본 발명은 모 야생형 단백질로부터의 조건부 활성 생체 단백질의 진화에 관한 것이다. 하나의 양상에서, 예를 들어 진화는 본원에 참고문헌으로 인용된 미국 특허 출원 공고 2009/0130718에 개시된 비 확률론적 폴리뉴클레오티드 키메라 형성 및 비 확률론적 위치 배향 점 돌연변이 유발 둘 다를 수행하는 방법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 야생형 효소 모 분자와 비교되었을 때 정상 생리학적 조건하에 감소한 활성을 나타내고, 야생형 효소의 항원 특이적 표적화 영역과 비교되었을 때 하나 이상의 비정상 조건하에 증강된 활성을 나타내는 조건부 활성 생체 효소의 진화를 위한 방법을 제공한다.
기준 폴리펩티드 지칭시 "단편(fragment)", "유도체(derivative)", 및 "유사체(analog)"라는 용어는, 기준 폴리펩티드의 생체 기능 또는 활성과 적어도 본질적으로 동일한 생체 기능 또는 활성을 적어도 하나 보유하는 폴리펩티드를 포함한다. 또한 용어 "단편", "유도체" 또는 "유사체"는 절단에 의해 변형되어 유의적으로 더 큰 활성을 갖는 성숙 효소를 생성시킬 수 있는 작은 활성의 프로단백질과 같은 "프로폼(pro-form)" 분자에 의해 예시된다.
본원에 사용되는 바와 같이, "유전자(gene)"라는 용어는, 폴리펩티드 사슬을 제조하는 것에 수반되는 DNA의 분절을 의미하며; 이는 개별적 암호화 분절(엑손)들 사이의 개재 서열(인트론)뿐만 아니라, 암호화 영역(리더 및 트레일러) 전후에 있는 영역을 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "비 상동성(heterologous)"이라는 용어는, 하나의 단일 가닥 핵산 서열이 또 다른 단일 가닥 핵산 서열 또는 이의 상보체에 잡종화할 수 없음을 의미한다. 따라서, 비 상동성 구역은 폴리뉴클레오티드의 구역 또는 폴리뉴클레오티드가 또 다른 핵산 또는 폴리뉴클레오티드에 잡종화할 수 없는, 폴리뉴클레오티드 서열 내에 구역 또는 영역을 가짐을 의미한다. 이러한 영역 또는 구역은, 예를 들어 돌연변이의 구역이다.
본원에 사용되는 바와 같이, "상동성(homologous)" 또는 "부분 상동성(homeologous)"이란 용어는, 하나의 단일 가닥 핵산 서열이 상보성 단일 가닥 핵산 서열과 잡종화될 수 있는 경우를 의미한다. 잡종화도는, 이후에 논의될 바와 같은 서열들 간 동일성의 양과 잡종화 조건, 예를 들어 온도 및 염 농도를 포함하는 다수의 인자에 의존할 수 있다. 바람직하게 동일성 영역은 약 5 bp보다 크고, 더욱 바람직하게 동일성 영역은 10 bp보다 크다.
본 발명의 이익은 "산업적 응용"(또는 산업상 방법)에까지 확대되는데, 이 용어는 상업적 산업 고유의 영역(또는 단순하게는 산업)에서의 응용뿐만 아니라 비 상업적 산업 응용(예를 들어 비영리 기관의 생물 의학 연구)을 포함하여 사용된다. 관련 응용들은 진단, 의학, 농업, 제작 및 학술 분야에서의 응용을 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "면역 세포"라는 용어는, 항원 제시 세포, B 세포, 호염기구, 세포 독성 T 세포, 수지상 세포, 호산구, 과립구, 조력자 T 세포, 백혈구, 림프구, 대식세포, 비만 세포, 기억 세포, 단핵구, 자연 살해 세포, 호중구, 식세포, 원형질 세포 및 T 세포를 포함하되, 이에 한정되는 것은 아닌 포유동물 면역계의 세포를 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "면역 반응"이라는 용어는, 선천성 면역, 체액성 면역, 세포 면역, 면역, 염증 반응, 후천성(적응성) 면역, 자가면역 및/또는 과민성 면역을 포함하되, 이에 한정되는 것은 아닌 면역을 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "단리된(isolated)"이라는 용어는, 물질이 이의 기원 환경(예를 들어 이것이 자연 발생인 경우에는 자연 환경)으로부터 분리된 것을 의미한다. 예를 들어 살아있는 동물 중에 존재하는 자연 발생 폴리뉴클레오티드 또는 효소는 단리된 것이 아니지만, 자연계에 동시 존재하는 물질의 일부 또는 전부로부터 분리된 동일한 폴리뉴클레오티드 또는 효소는 단리된 것이다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 벡터의 부분일 수 있고/있거나 이러한 폴리뉴클레오티드 또는 효소는 조성물의 부분일 수 있으며, 이러한 벡터 또는 조성물은 자연 환경의 부분이 아니라는 점에서 여전히 단리된 것일 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, "단리된 핵산"이라는 용어는, 이것의 기원이 되는 유기체의 자연 발생 게놈에 존재할 때 보통 바로 인접하는 5' 및 3' 측접 서열과 바로 인접하지 않는 핵산, 예를 들어 DNA 또는 RNA 분자를 정의하기 위해 사용된다. 따라서, 이 용어는 예를 들어 플라스미드 또는 바이러스 벡터와 같은 벡터 내로 통합되는 핵산; 비 상동성 세포의 게놈(또는, 자연 발생하는 위치와는 상이한 위치에 있는 상동성 세포 게놈) 내로 통합되는 핵산; 및 별도의 분자, 예를 들어 PCR 증폭 또는 제한 효소 분해에 의해 제조되는 DNA 단편 또는 시험관 내 전사에 의해 제조되는 RNA 분자로서 존재하는 핵산을 기술하는 것이다. 이 용어는 또한, 예를 들어 융합 단백질의 제조에 사용될 수 있는 추가의 폴리펩티드 서열을 암호화하는 하이브리드 유전자의 부분을 형성하는 재조합 핵산을 기술하는 것이다.
본원에 사용되는 바와 같이, "렌티바이러스"라는 용어는, 레트로바이러스과의 속을 지칭한다. 렌티바이러스는 레트로바이러스들 중 비 분열 세포를 감염시킬 수 있는 것으로서 유일무이한데; 이 바이러스는 유의적 양만큼의 유전 정보를 숙주 세포의 DNA에 전달할 수 있으므로, 유전자 전달 벡터를 전달하기 위해 가장 유효한 방법들 중 하나이다. HIV, SIV 및 FIV는 렌티바이러스의 모든 예들이다. 렌티바이러스로부터 유래한 벡터들은 생체 내 유전자 전달의 유의적 수준을 달성하기 위한 수단을 제공한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "리간드"라는 용어는, 특정 수용체에 의해 인지되는 랜덤 펩티드 또는 가변성 분절 서열과 같은 분자를 지칭한다. 당업자가 인지할 바와 같이, 분자(또는 거대분자 복합체)는 수용체 및 리간드 둘 다일 수 있다. 일반적으로, 더 작은 분자량을 갖는 결합 파트너는 리간드로 지칭되고, 더 큰 분자량을 갖는 결합 파트너는 수용체로서 지칭된다.
본원에 사용되는 바와 같이, "결찰(ligation)"이라는 용어는, 2개의 이중 가닥 핵산 단편 사이의 포스포디에스테르 결합을 형성하는 과정을 지칭한다 (Sambrook et al., (1982). Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbor, NY., p. 146; Sambrook et al., Molecular Cloning: a Laboratory manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). 다른 식으로 제공되지 않는 한, 결찰은 결찰시키려는 0.5㎍의 대략적 등몰량의 DNA 단편당 10 단위의 T4 DNA 리가아제("리가아제")와 함께, 공지된 완충제 및 조건을 사용하여 달성될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, "링커(linker)" 또는 "스페이서(spacer)"라는 용어는, DNA 결합 단백질 및 랜덤 펩티드와 같은 2개의 분자를 연결하는 분자 또는 분자의 군을 지칭하며, 2개의 분자를 바람직한 입체구조로 위치시키는 역할을 하여, 예를 들어 랜덤 펩티드가 DNA 결합 단백질로 인한 입체 장해를 최소화하면서 수용체에 결합하도록 만든다. 본원에 사용되는 바와 같이, "링커(L)" 또는 "링커 도메인" 또는 "링커 영역"이란, 함께 본 발명의 CAR의 도메인/영역 중 임의의 것을 연결시키는, 길이 약 1 내지 약 100 아미노산의 올리고- 또는 폴리펩티드 영역을 지칭한다. 링커는 글리신 및 세린과 같은 가요성 잔기들로 이루어질 수 있어서, 인접 단백질 도메인들은 서로에 대해 자유롭게 움직일 수 있다. 더욱 긴 링커는 2개의 인접 도메인들이 서로 입체적으로 방해하지 않는 것을 보장하도록 사용될 수 있다. 링커는 절단 가능할 수 있거나 절단 가능하지 않을 수 있다. 절단 가능한 링커의 예들은 2A 링커(예를 들어 T2A), 2A 유사 링커 또는 이것들의 작용성 균등물, 그리고 이것들의 조합을 포함한다. 몇몇 구현예들에서, 링커는 피코나바이러스 2A 유사 링커, 돼지 테스코바이러스(teschovirus)의 CHYSEL 서열(P2A), 토시 아시그나 바이러스(Thosea asigna virus)의 것(T2A) 또는 이것들의 조합, 변이체 및 작용성 균등물들을 포함한다. 기타 링커들이 당 업자들에게 명백할 것이고, 본 발명의 대안적 구현예와 연계되어 사용될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, "포유동물 세포 표면 전시"란 용어는, 예를 들어 자성 비드 및 형광 활성화 세포 분류법(cell sorting)과의 조합에 의한 특이적 항원 결합에 대한 스크리닝에 의한 스크리닝을 위해 단백질 또는 항체 또는 항체의 일부분이 포유동물 숙주 세포 표면상에 발현되어 전시되게 하는 기술을 지칭한다. 하나의 양상에서, 본원에 참고문헌으로서 인용되어 있는 DuBridge외 다수의 미국 특허 공보 제2009/0136950호에서와 같이, 면역글로불린의 분비형 및 세포 표면 결합형 둘 다로서의 동시 발현에는 포유동물 발현 벡터가 사용된다. 다른 양상에서, 상기 기술은 본원에 참고문헌으로서 인용되어 있는 Gao외 다수의 미국 특허 공보 제2007/0111260호에서와 같이, 세포 내에서 발현될 때 세포막 상에 전시되는 항체 단편 또는 항체 라이브러리를 암호화하는 바이러스 벡터를 스크리닝하기 위해 사용된다. 포유동물 세포 상 전체 IgG 표면 전시가 공지되어 있다. 예를 들어 Akamatsuu외 다수는, IgG 분자의 항원 결합 친화성 및 생체 활성을 기반으로, 이 IgG 분자를 직접 단리하는 것에 적합한 포유동물 세포 표면 전시 벡터를 개발하였다. 엡스타인-바 바이러스 유도 에피좀 벡터가 사용되어, 항체 라이브러리가 전체 IgG 분자로서 세포 표면에 전시되었고, 자성 비드 및 형광 활성화 세포 분류법의 조합에 의해 특이적 항원 결합에 대하여 스크리닝되었다. 원하는 결합 특징을 갖는 항체를 암호화하는 플라스미드는 분류된 세포들로부터 회수되었으며, 가용성 IgG의 제조에 적합한 형태로 전환되었다. 본원에 참고문헌으로서 인용되어 있는 문헌[Akamatsuu et al. J. Immunol. Methods, vol. 327, pages 40-52, 2007]을 참조하시오. Ho외 다수는, 친화성 성숙에 대한 단일 사슬 Fv 항체의 세포 표면 전시를 위해, 일시적인 단백질 발현에 널리 사용되는 인간 배 신장 293T 세포를 사용하였다. 친화성이 더욱 큰 희귀 돌연변이 항체를 발현하는 세포는, 친화성이 약간 더 작은 WT 항체를 발현하는 과량의 세포로부터의 단일 계대 배양 세포 분류에 의해 240배 증폭되었다. 더욱이, 내인성 항체 핫 스팟(hotspot)을 랜덤하게 포함하는 조합 라이브러리의 단일 선택 후, CD22에 대하여 증가한 결합 친화성을 가지는, 고도로 증폭된 돌연변이체가 제조되었다. 본원에 참고문헌으로 인용되어 있는 문헌[Ho et al., "Isolation of anti-CD22 Fv with high affinity by Fv display on human cells," Proc Natl Acad Sci U S A, vol. 103, pages 9637-9642, 2006]을 참조하시오.
어느 항원에 특이적인 B 세포도 사용될 수 있다. 이러한 B 세포는 인간 공여자의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 직접 단리될 수 있다. 재조합 항원 특이적 단일 사슬 Fv(scFv) 라이브러리는 이와 같은 B 세포 풀로부터 제조되고, 신드비스(Sindbis) 바이러스 발현계를 사용함으로써 포유동물 세포 표면 전시에 의해 스크리닝된다. 중쇄(HC) 및 경쇄(LC)의 가변 영역(VR)은 양성 클론과, 전체 IgG 또는 Fab 단편으로서 제조된 재조합 전 인간 항체로부터 단리될 수 있다. 이러한 방식으로 Qβ 바이러스 유사 입자(VLP), 모델 바이러스 항원에 결합하는 과 돌연변이 고 친화성 항체 몇 개뿐만 아니라, 니코틴에 특이적인 항체가 단리될 수 있다. 본원에 참고문헌으로 인용되어 있는 문헌[Beerli et al., "Isolation of human monoclonal antibodies by mammalian cell display," Proc Natl Acad Sci U S A, vol. 105, pages 14336-14341, 2008]을 참조하시오.
효모 세포 표면 전시도 또한 본 발명에 사용될 수 있다[예를 들어 효모 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae)를 사용하는 세포 표면 조작 계에 대해 기술하고 있는 문헌(Kondo and Ueda, "Yeast cell-surface display-applications of molecular display," Appl. Microbiol. Biotechnol., vol. 64, pages 28-40, 2004)을 참조하시오]. 효모 에스.세레비지아에에서의 발현을 위한 몇몇 대표적 전시 계가 문헌[Lee et al, "Microbial cell-surface display," TRENDS in Bitechnol., vol. 21, pages 45-52, 2003]에 기술되어 있다. 또한 문헌[Boder and Wittrup, "Yeast surface display for screening combinatorial polypeptide libraries," Nature Biotechnol., vol. 15, pages 553, 1997]도 참조하시오.
본원에 사용되는 바와 같이, "제작(manufacturing)"이라는 용어는, 치료용 단백질의 적어도 제I상 임상 시험을 허용하도록 충분한 양만큼, 또는 진단용 단백질의 규제력을 지닌 승인에 충분한 양만큼 단백질을 제조하는 것을 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "미세환경"이란 용어는, 몸의 다른 영역들 또는 조직의 다른 영역으로부터의 항상적이거나 일시적인 물리적 또는 화학적 차이를 보이는 조직 또는 몸의 임의의 부분 또는 영역을 의미한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "진화될 분자 특성"이란 용어는 폴리뉴클레오티드 서열로 구성되는 분자, 폴리펩티드 서열로 구성되는 분자, 및 일부는 폴리뉴클레오티드 서열로, 그리고 일부는 폴리펩티드 서열로 구성되는 분자에 대한 언급을 포함한다. 진화될 분자 특성과 구체적으로 관련되지만 비 제한적인 예는, 온도; 염도; 삼투압; pH; 산화 스트레스, 및 글리세롤, DMSO, 세제, 및/또는 반응 환경에서 접촉이 이루어지는 임의의 다른 분자 종의 농도와 관련된 것과 같은 특정 조건에서의 단백질 활성을 포함한다. 진화될 분자 특성과 구체적으로 관련되지만 비 제한적인 추가 예는 안정성, 예를 들어 저장 중 우연히 마주할 수 있는 특정 환경에 대한 특정 노출 시간 후 존재하는 잔류 분자 특성의 양을 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "돌연변이(mutation)"라는 용어는, 야생형 핵산 서열의 서열 변동 또는 펩티드의 서열 변동을 의미한다. 이러한 돌연변이는 이행 또는 변위와 같은 점 돌연변이일 수 있다. 돌연변이는 결실, 삽입 또는 중복일 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, "다중 특이적 항체(multispecific antibody)"라는 용어는 적어도 2개의 상이한 에피토프에 대한 결합 친화성을 가지는 항체이다. 다중 특이적 항체(예를 들어 F(ab')2 이중 특이적 항체)는 전장 항체 또는 항체 단편으로서 제조될 수 있다. 조작된 항체는 2개, 3개 또는 그 이상의(예를 들어 4개의) 항원과 결합할 수 있다(예를 들어 미국 특허 공고 2002/0004587 A1 참조). 하나의 조건부 활성 항체는 다중 특이적이 되도록 조작될 수 있거나, 또는 2개의 항체는 2개의 항원과 결합하는 이종 이량체를 포함하도록 조작될 수 있다. 다중 특이적 항체는 또한 다중 작용성일 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 축퇴성 "N,N,G/T" 뉴클레오티드 서열은 32개의 가능한 삼원체를 나타내고, 여기에서 "N"은 A, C, G 또는 T일 수 있다.
대상물에 응용되는 것과 같이 본원에 사용되는 "자연 발생"이라는 용어는, 대상물이 자연에서 발견될 수 있다는 사실을 지칭한다. 예를 들어 자연에서 공급원으로부터 단리될 수 있는 유기체(바이러스 포함) 중에 존재하고, 실험실에서 인간에 의해 의도적으로 변형되지 않은 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열은 자연 발생의 것이다. 일반적으로, 자연 발생이라는 용어는, 종에 대해 대표적인 바와 같이 비 병리학적(비 발병) 개체 중에 대상물이 존재함을 의미한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "정상 생리학적 조건" 또는 "야생형 작동 조건"은, 피험체의 투여 위치 또는 작용 위치에서 정상 범위 내에 있는 것으로 간주될 온도, pH, 삼투압, 삼투질 농도, 산화 스트레스 및 전해질 농도에 관한 조건이다.
본원에 사용되는 바와 같이, "핵산 분자"는, 각각 단일 가닥인지 또는 이중 가닥인지에 따라서 적어도 하나의 염기 또는 적어도 하나의 염기쌍으로 구성된다. 더욱더, 핵산 분자는 다음과 같은 핵산 분자, 즉 RNA, DNA, 게놈 핵산, 비 게놈 핵산, 자연 발생 및 비자연 발생 핵산, 그리고 합성 핵산의 군에 의해 비 제한적으로 예시되는 바와 같이, 배타적으로 또는 키메라로서 뉴클레오티드 함유 분자의 임의의 군에 속할 수 있다. 이는 비 제한적 예로, 미토콘드리아와 같은 임의의 기관과 연관된 핵산, 리보솜 RNA, 및 자연 발생 성분과 함께 자연 발생되지 않는 하나 이상의 성분이 키메라로서 구성되는 핵산 분자를 포함한다.
또한, "핵산 분자"는, 비 제한적으로 아미노산 및 당에 의해 예시되는 바와 같은 비 뉴클레오티드 기반 성분 하나 이상을 부분적으로 함유할 수 있다. 따라서, 비 제한적인 예로서, 일부는 뉴클레오티드 기반이고 일부는 단백질 기반인 리보자임이 "핵산 분자"로 간주된다.
본원에 사용되는 바와 같이, "~를 암호화하는 핵산 서열" 또는 "~의 DNA 암호화 서열" 또는 "~를 암호화하는 뉴클레오티드 서열"이라는 용어는, 적절한 조절 서열, 예를 들어 프로모터의 제어하에 위치하는 경우에 전사되어 효소로 번역되는 DNA 서열을 지칭한다. "프로모터"는 세포에서 RNA 중합효소를 결합시키고 하류(3' 방향) 암호화 서열의 전사를 개시할 수 있는 DNA 조절 영역이다. 프로모터는 DNA 서열의 부분이다. 상기 서열 영역은 이의 3' 말단에 출발 코돈을 갖는다. 프로모터 서열은 최소 수의 염기를 포함하는 것으로서, 백그라운드 수준 이상으로 검출할 수 있는 수준으로 전사를 개시하기 위해 필요한 요소이다. 그러나, RNA 중합효소가 서열에 결합되고, 전사가 출발 코돈(프로모터가 결합된 3' 말단)에서 개시된 후에, 전사는 하류인 3' 방향으로 진행한다. 프로모터 서열 내에서 RNA 중합효소의 결합에 관여하는 전사 개시 위치(편의상 뉴클레아제 S1을 사용하는 맵핑에 의해 정의됨) 및 단백질 결합 도메인(공통 서열)이 발견될 것이다.
"올리고뉴클레오티드"(또는 동의어로 "올리고")라는 용어는, 화학적으로 합성될 수 있는 단일 가닥 폴리데옥시뉴클레오티드 또는 2개의 상보성 폴리데옥시뉴클레오티드 가닥중 어느 하나를 지칭한다. 이러한 합성 올리고뉴클레오티드는 5' 인산염을 갖거나 갖지 않을 수 있다. 5' 인산염을 갖지 않는 것은 키나아제의 존재하에 ATP에 의해 인산염이 첨가되지 않고서는 또 다른 올리고뉴클레오티드에 결찰되지 않을 것이다. 합성 올리고뉴클레오티드는 탈인산화되지 않은 단편으로 결찰될 것이다.
본원에 사용되는 바와 같이, "작동 가능하게 결합된"이라는 용어는, 폴리뉴클레오티드 요소들이 작용적 관계로 결합되는 것을 의미한다. 핵산은 또 다른 핵산 서열과의 작용적 관계로 위치할 때 "작동 가능하게 결합된 것이다". 예를 들어 프로모터 또는 인핸서는 그것이 암호화 서열의 전사에 영향을 주면 암호화 서열에 작동 가능하게 결합된 것이다. "작동 가능하게 결합된"은 결합되는 DNA 서열이 통상적으로 인접하여 있고, 2개의 단백질 암호화 영역이 접합되는 것이 필요한 경우, 인접하여 판독 프레임 내에 있게 되는 것을 의미한다.
암호화 서열은, RNA 중합효소가 2개의 암호화 서열을, 암호화 서열 둘 다로부터 유도되는 아미노산을 갖는 단일 폴리펩티드로 추후 번역될 단일 mRNA로 전사할 때 또 다른 암호화 서열에 "작동 가능하게 결합된다". 암호화 서열들은 발현된 서열들이 궁극적으로 가공되어 원하는 단백질을 생산하는 한, 서로 인접할 필요는 없다.
본원에 사용되는 바와 같이, "모 폴리뉴클레오티드 세트"라는 용어는, 하나 이상의 변별적 폴리뉴클레오티드 종으로 구성되는 세트이다. 일반적으로, 상기 용어는 바람직하게는 모 세트의 돌연변이 유발에 의해 얻어지는 자손 폴리뉴클레오티드 세트에 관련하여 사용되며, 이 경우에 "모(parent)", "출발(starting)" 및 "주형(template)"이라는 용어는 호환되어 사용된다.
"환자(patient)" 또는 "피험체(subject)"라는 용어는, 치료의 대상인 동물, 예를 들어 인간과 같은 포유동물을 지칭한다. 피험체 또는 환자는 웅성 또는 자성일 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, "생리학적 조건"이라는 용어는, 온도, pH, 삼투압, 이온 세기, 점도, 및 생존 유기체와 양립할 수 있고/있거나 통상적으로 생존 배양 효모 세포 또는 포유동물 세포 중에서 세포 내에 존재하는 유사 생화학적 매개변수를 지칭한다. 예를 들어 통상적 실험실 배양 조건하에 성장한 효모 세포 중의 세포 내 조건은 생리학적 조건이다. 시험관 내 전사 칵테일에 적합한 시험관 내 반응 조건은 일반적으로 생리학적 조건이다. 일반적으로, 시험관 내 생리학적 조건은 50~200 mM NaCl 또는 KCl, pH 6.5~8.5, 20~45℃ 및 0.001~10 mM 2가 양이온(예를 들어 Mg++, Ca++); 바람직하게는 약 150 mM NaCl 또는 KCl, pH 7.2~7.6, 5 mM 2가 양이온을 포함하며, 종종, 0.01~1.0% 비특이적 단백질(예를 들어 소 혈청 알부민(BSA))을 포함한다. 비이온성 세제(Tween, NP-40, Triton X-100)는 종종 일반적으로 약 0.001 내지 2%, 통상적으로 0.05~0.2%(v/v)로 존재할 수 있다. 특정 수성 조건은 통상적인 방법에 따라 전문가에 의해 선택될 수 있다. 일반적 안내를 위해 다음과 같은 완충된 수성 조건, 즉 2가 양이온(들) 및/또는 금속 킬레이터 및/또는 비이온성 세제 및/또는 막 분획 및/또는 발포방지제 및/또는 신틸런트의 선택적 첨가하에서의 10~250 mM NaCl, 5~50 mM Tris HCl, pH 5~8이 응용될 수 있다. 정상 생리학적 조건은 투여 위치 또는 작용 위치에서 환자 또는 피험체에서의 온도, pH, 삼투압, 삼투질 농도, 산화 스트레스 및 전해질 농도의 생체 내 조건을 지칭하며, 이는 환자에서 정상 범위 내에 있는 것으로 간주될 것이다.
표준 관례(5'→3')가 이중 가닥 폴리뉴클레오티드의 서열을 기술하기 위해 본원에 사용된다.
본원에 사용되는 바와 같이, "군집(population)"이라는 용어는, 폴리뉴클레오티드, 부분 또는 폴리뉴클레오티드 또는 단백질과 같은 성분들의 무리를 의미한다. "혼합된 군집"은 핵산 또는 단백질의 동일한 과에 속하지만(즉 관련되지만), 이의 서열이 상이하고(즉 동일하지 않고) 그에 따른 이의 생체 활성이 상이한 성분들의 무리를 의미한다.
"프로폼(pro-form)"을 갖는 분자는 하나 이상의 공유 및 비 공유 화학적 변형(예를 들어 글리코실화, 단백 분해 절단, 이량체화 또는 올리고머화, 온도 유도 또는 pH 유도 입체구조 변화, 보조인자와의 연합 등)의 임의의 조합이 일어 남으로 말미암아 기준 프로폼 분자와 비교되었을 때 특성에 차이(예를 들어 활성의 증가)를 보이는 더욱 성숙한 분자 형태를 달성하는 분자를 지칭한다. 2가지 이상의 화학적 변형(예를 들어 2개의 단백 분해 절단, 또는 단백 분해 절단과 탈글리코실화)이 성숙 분자의 생성 도중에 구별될 수 있을 때, 기준 전구체 분자는 "프리프로폼(pre-pro-form)" 분자로 칭하여질 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, "수용체"라는 용어는, 소정의 리간드에 대한 친화성을 갖는 분자를 지칭한다. 수용체는 자연발생 또는 합성 분자일 수 있다. 수용체는 비 변경 상태로 또는 다른 종과의 응집체로서 사용될 수 있다. 수용체는 직접 또는 특이적 결합 성분을 통해 결합 원에 공유 또는 비 공유 부착될 수 있다. 수용체의 예는 특이적 항원결정기(예를 들어 바이러스, 세포 또는 다른 물질에 대한 항원결정기)와 반응성인 모노클로날 항체 및 항혈청을 포함하는 항체, 세포막 수용체, 복합 탄수화물 및 당단백, 효소 및 호르몬 수용체를 포함하지만 이들로 제한되지는 않는다.
본원에 사용되는 바와 같이, "환원 재편성"이란 용어는, 반복된 서열에 의해 매개되는 결실(및/또는 삽입) 이벤트를 통해 축적되는 분자 다양성의 증가를 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "제한 위치"라는 용어는, 제한 효소의 작용을 보이기 위해 필요한 인지 서열을 지칭하는데, 이는 촉매 절단 위치를 포함한다. 절단 위치는 모호성이 낮은 서열(low ambiguity sequence)(즉 제한 위치의 발생 빈도에 대한 주요 결정기를 함유하는 서열)을 포함하는 제한 위치의 일부 내에 함유될 수 있거나 그렇지 않을 수 있음이 이해된다. 효소(예를 들어 제한 효소)가 폴리뉴클레오티드를 "절단"하는 것으로 언급될 때, 이 제한 효소는 폴리뉴클레오티드의 절단을 촉매화 또는 촉진함을 의미하는 것으로 이해된다.
본원에 사용되는 바와 같이, "단일 사슬 항체"란 용어는, 일반적으로 스페이서 펩티드를 통해 결합되어 있는, 폴리펩티드 결합 내 VH 도메인과 VL 도메인을 포함하는 폴리펩티드로서, 아미노 말단부 및/또는 카르복시 말단부에 추가의 아미노산 서열들을 포함할 수 있는 폴리펩티드를 지칭한다. 예를 들어 단일 사슬 항체는 암호화 폴리뉴클레오티드와의 결합을 위한 테더(tether) 분절을 포함할 수 있다. 예로서 scFv는 단일 사슬 항체이다. 단일 사슬 항체는 일반적으로 면역글로불린 상과의 유전자들에 의해 실질적으로 암호화된 연속적 아미노산[예를 들어 본원에 참고문헌으로서 인용되어 있는 문헌(The Immunoglobulin Gene Superfamily, A. F. Williams and A. N. Barclay, in Immunoglobulin Genes, T. Honjo, F. W. Alt, and T.H. Rabbits, eds., (1989) Academic press: San Diego, Calif., pp. 361-368)을 참조하시오], 매우 자주는, 설치류, 인간 이외의 영장류, 조류, 돼지, 소, 양, 염소 또는 인간 중쇄 또는 경쇄 유전자 서열에 의해 암호화된 연속적 아미노산 적어도 10개로 이루어진 폴리펩티드 분절 하나 이상으로 이루어진 단백질이다. 작용성 단일 사슬 항체는, 특이적 표적 분자(통상적으로는 수용체 또는 항원(에피토프))와의 결합 특성을 보유하기에 충분한, 면역글로불린 상과 유전자 산물의 일부를 일반적으로 함유한다.
한 쌍의 분자(예를 들어 항체-항원 쌍 또는 리간드-수용체 쌍)의 구성원들은 이것들이 다른 비특이적 분자와 더 큰 친화성으로 서로 결합되는 경우 서로 "특이적으로 결합되는" 것으로 여겨진다. 예를 들어 비특이적 단백질보다 더 효율적으로 결합되는, 항원에 대해 발생한 항체는, 항원에 특이적으로 결합되는 것으로서 기술될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이 "자극"이라는 용어는, 자극 분자(예를 들어 TCR/CD3 복합체)와 이의 동족 리간드가 결합함으로써 신호 전달 이벤트, 예를 들어 TCR/CD3 복합체를 통한 신호 전달(이에 한정되는 것은 아님)이 매개될 때 유도되는 1차 반응을 의미한다. 자극은 임의의 분자의 변경된 발현, 예를 들어 TGF-β의 하향 조절 및/또는 세포 골격 구조의 재조직화 등을 매개할 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이 "자극 분자"라는 용어는, 항원 제시 세포 상에 존재하는 동족 자극 리간드와 특이적으로 결합하는, T 세포 상 분자를 미한다.
본원에 사용되는 바와 같이 "자극 리간드"라는 용어는, 항원 제시 세포(예를 들어 수지상 세포 및 B 세포 등) 상에 존재할 때 T 세포 상 동족 결합 파트너(본원에서는 "자극 분자"라고 칭하여짐)와 특이적으로 결합함으로써, T 세포에 의한 1차 반응, 예를 들어 면역 반응의 활성화, 개시, 면역 세포의 증식 등(이에 한정되는 것은 아님)을 매개할 수 있는 리간드를 의미한다. 자극 리간드는 당 업계에 널리 공지되어 있으며, 그 중에서도 펩티드, 항CD3 항체, 초 작용물질(superagonist)인 항CD28 항체 및 초 작용물질인 항CD2 항체가 장전된 MHC 제I군 분자를 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이 "표적 세포"란 용어는, 질환에 연루되어 있으며, 본 발명의 유전자 변형된 세포 독성 세포(예를 들어 유전자 변형 T 세포, NK 세포 및 대식 세포(이에 한정되는 것은 아님))에 의해 표적화될 수 있는 세포를 지칭한다. 기타 표적 세포들은 당 업자들에게 명백할 것이며, 본 발명의 대안적 구현예들과 연관되어 사용될 수 있다.
"T 세포" 및 "T 림프구"라는 용어는, 본원에서 호환되어, 그리고 동의어로서 사용된다. 예들로서는 처녀 T 세포, 중심 기억 T 세포, 효과기 기억 T 세포 및 이것들의 조합을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본원에 사용되는 바와 같이 "형질도입"이란 용어는 바이러스 벡터를 사용하여 외래 핵산을 세포에 도입하는 것을 지칭한다. 본원에 사용되는 바와 같이 "형질감염"은, 재조합 DNA 기술을 사용하여 외래 핵산을 세포에 도입하는 것을 지칭한다. "형질전환"이라는 용어는, "외래"(즉 외재성 또는 세포 외) 유전자, DNA 또는 RNA 서열을 숙주 세포에 도입하여, 숙주 세포가 도입된 유전자 또는 서열을 발현하여 원하는 물질, 예를 들어 도입된 유전자 또는 서열에 의해 암호화된 단백질 또는 효소를 생산하도록 만드는 것을 의미한다. 도입된 유전자 또는 서열은 또한 "클로닝된" 또는 "외래" 유전자 또는 서열이라고 칭하여질 수도 있으며, 조절 또는 제어 서열, 예를 들어 개시 서열, 종결 서열, 프로모터, 신호 서열, 분비 서열 또는 세포의 유전자 기구에 의해 사용되는 기타 서열을 포함할 수 있다. 유전자 또는 서열은 비 작용성 서열 또는 공지된 기능이 없는 서열을 포함할 수 있다. 도입된 DNA 또는 RNA를 수용하여 발현하는 숙주 세포는 "형질전환된 것"이며, 이때의 숙주 세포는 "형질전환체" 또는 "클론"이다. 숙주 세포에 도입된 DNA 또는 RNA는, 숙주 세포와 동일한 속 또는 동일한 종에 속하는 세포, 또는 상이한 속 또는 상이한 종에 속하는 세포를 포함하는 임의의 공급원으로부터 유래할 수 있다.
"치료(treating)"라는 용어는, (1) 상태, 장애 또는 병태로 고통받거나 이들에 걸리기 쉬울 수 있지만 상태, 장애 또는 병태의 임상 또는 준 임상 증상을 아직 경험하지 않거나 나타내지 않는 동물에서 발달하는 상태, 장애 또는 병태의 임상 증상의 발현을 예방하거나 지연시키는 것; (2) 상태, 장애 또는 병태를 억제하는 것(즉 질환의 발달, 또는 이의 적어도 하나의 임상 또는 준 임상 증상의 유지 치료의 경우에 이의 재발을 정지, 감소 또는 지연시키는 것); 및/또는 (3) 병태를 완화시키는 것(즉 상태, 장애 또는 병태, 또는 이의 임상 또는 준 임상 증상 중 적어도 하나의 퇴행을 유발하는 것)을 포함한다. 치료받을 환자에 대한 이점은 통계적으로 유의적이거나, 또는 적어도 환자 또는 의사에게 인지될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, "종양"이란, 악성이거나 양성인 모든 신생물 세포 성장 및 증식과, 모든 전암성 및 암성 세포 및 조직을 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "종양 미세환경"이란 용어는, 생존 및/또는 증식 및/또는 전이를 위한 악성 과정을 위해 구조상 및/또는 작용 기능상 환경을 조성하는 요소들을 포함하는 종양 환경의 임의의 요소들 및 전 요소들을 지칭한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "가변성 분절(variable segment)"이라는 용어는, 랜덤, 의사랜덤 또는 한정된 커널 서열(kernal sequence)을 포함하는 신생 펩티드의 일부를 지칭한다. "가변성 분절"은 랜덤, 의사랜덤, 또는 한정된 커널 서열을 포함하는 신생 펩티드의 일부를 지칭한다. 가변성 분절은 변이체 및 비변이체 잔기 위치 둘 모두를 포함할 수 있고, 변이체 잔기 위치에서의 잔기 변동의 정도는 제한될 수 있으며; 이와 같은 두 가지 선택권은 모두 실무자의 재량으로 선택된다. 통상적으로, 가변성 분절은 더 길거나 항체 단편, 핵산 결합 단백질, 수용체 단백질 등과 같은 항체 부분 또는 수용체 단백질을 포함할 수도 있지만, 가변성 분절은 길이가 약 5개 내지 약20개(예를 들어, 8개 내지 10개)의 아미노산 잔기이다.
본원에 사용되는 바와 같이, "벡터", "클로닝 벡터" 및 "발현 벡터"는, 폴리뉴클레오티드 서열(예를 들어 외래 유전자)이 숙주 세포에 도입되도록 함으로써 숙주를 형질전환시키고, 도입된 서열의 발현(예를 들어 전사 및 번역)을 촉진할 수 있는 비이클을 지칭한다. 벡터는 플라스미드, 파지, 바이러스 등을 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "야생형(wild-type)"이라는 용어는, 어떠한 돌연변이도 포함하지 않는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. "야생형 단백질", "야생-형 단백질", "야생-형 생체 단백질" 또는 "야생형 생체 단백질"은 자연에서 발견되는 활성의 수준에서 활성이고 자연에서 발견되는 아미노산 서열을 포함할, 자연으로부터 단리될 수 있는 단백질을 지칭한다. 용어 "모 분자" 및 "표적 단백질" 은 또한 야생형 단백질을 지칭하기도 한다. "야생형 단백질"은, 바람직하게 상이한 온도 또는 pH 환경에서, 원하는 특성, 예를 들어 더 우수한 안정성에 대해 단백질 라이브러리를 스크리닝함으로써 얻어질 수 있는 몇 가지 원하는 특성, 예를 들어 더 큰 결합 친화성 또는 효소 활성을 가진다.
"작업 샘플"에서와 같이, "작업(working)"이라는 용어는, 예를 들어, 단순히 샘플과 함께 이루어지는 하나의 실행이다. 이와 유사하게, "작업 분자"는, 예를 들어 실행중인 하나의 작업의 대상인 분자이다.
상세한 설명
예시의 목적으로 본 발명의 원리는 다양한 예시적 구현예가 참조됨으로써 기술된다. 본 발명의 임의의 구현예들은 본원에 구체적으로 기술되어 있지만, 당 업자는 동일한 원리가 다른 계와 방법에 균등하게 적용될 수 있고, 이에 사용될 수 있음을 용이하게 인지할 것이다. 본 발명의 개시된 구현예들이 상세히 설명되기에 앞서, 본 발명은 보인 임의의 특정 구현예에 관한 세부사항에 대하여 자체의 적용에서 제한되지 않음이 이해될 것이다. 뿐만 아니라, 본원에 사용된 용어는 설명을 목적으로 하는 것이지 제한을 목적으로 하는 것이 아니다. 더욱이 임의의 방법들은 본원에 임의의 순서로 제시된 단계들을 참조로 기술되지만, 다수의 경우, 이러한 단계들은 당 업자에 의해 이해될 수 있는 바와 같은 임의의 순서로 수행될 수 있으므로; 신규의 방법은 본원에 개시된 단계들의 특정 정렬에 제한되지 않는다.
본원, 특히 첨부된 청구의 범위에 사용되는 바와 같이, 문맥이 명백히 달리 지시하지 않는 한, 단수 형태를 나타내는 "하나", "하나의", 그리고 "상기"는 복수의 인용대상들을 포함하는 것임이 주목되어야할 것이다. 또한, "하나"(또는 "하나의"), "하나 이상의" 및 "적어도 하나"라는 용어는 본원에서 호환되어 사용될 수 있다. "~를 포함하는(comprising)", "~를 포함하는(including)", "~를 가지는" 및 "~로부터 구성된"이라는 용어도 또한 호환되어 사용될 수 있다.
본 발명은 야생형 단백질 또는 이의 도메인으로부터 진화되었으며, (a) 야생형 단백질 또는 이의 도메인의 항원 특이적 표적화 영역과 비교되었을 때 정상 생리학적 조건에서의 검정에서 활성의 감소 및 (b) 야생형 단백질 또는 이의 도메인의 항원 특이적 표적화 영역과 비교되었을 때 비정상 조건하의 검정에서 활성의 증가 중 적어도 하나를 보이는 항원 특이적 표적화 영역 적어도 하나; 경막 도메인; 그리고 세포 내 신호전달 도메인을 포함하는, 표적 항원과의 결합을 위한 키메라 항원 수용체(CAR)에 관한다. 몇몇 구현예들에서, 키메라 항원 수용체는 세포 외 스페이서 도메인 또는 적어도 하나의 보조 자극 도메인을 추가로 포함한다.
본 발명의 CAR은, (1) 정상 생리학적 조건에서 가역적으로나 비가역적으로 감소한, 표적 항원에 대한 자체의 친화성과, (2) 조건부 활성 항원 특이적 표적화 영역을 가지지 않는 상응 CAR과 비교되었을 때 증가한 친화성 중 적어도 하나를 ㅂ보인다. 이러한 CAR은 세포 독성 세포를 발병 위치, 즉 비정상 조건이 조성된 발병 위치, 예를 들어 종양 미세환경 또는 활액막 액으로 유도할 수 있다. 이러한 특성으로 인해, 이 CAR의 정상 조직에 대한 낮은 친화성으로 말미암아 CAR은 세포 독성 세포를 발병 위치에 우선적으로 유도할 수 있는 것이다. 이러한 CAR은 부작용을 극적으로 감소시킬 수 있고, 치료제 고용량이 치료 효능을 증가시키는데 사용되도록 허용한다. CAR은 피험체 내 짧은 기간 또는 제한된 기간 동안 필요로 하는 신규 치료제 개발에 특히 유용하다. 유리한 응용의 예들은 고용량 전신 치료뿐만 아니라, 고농도 국소 치료를 포함한다.
키메라 항원 수용체는 야생형 단백질 또는 이의 도메인의 항원 특이적 표적화 영역과 비교되었을 때 정상 생리학적 조건에서 표적 항원에 대한 결합 친화성이 감소한 항원 특이적 표적화 영역을 포함할 수 있다.
키메라 항원 수용체 다수는 야생형 단백질 또는 이의 도메인의 항원 특이적 표적화 영역과 비교되었을 때 비정상 조건하에서의 검정에서 활성 증가와, 야생형 단백질 또는 이의 도메인의 항원 특이적 표적화 영역과 비교되었을 때 정상 생리학적 조건에서 표적 항원에 대한 결합 친화성의 감소를 보이는 항원 특이적 표적화 영역을 포함한다.
상기 키메라 항원 수용체들 중 임의의 것에 있어서, 항원 특이적 표적화 영역은 또한 야생형 단백질 또는 이의 도메인의 항원 특이적 표적화 영역과 비교되었을 때 비정상 조건 하에서의 검정에서 선택성 증가를 보일 수도 있다.
상기 키메라 항원 수용체들 중 임의의 것은, 항원 수용체를 함유하는 단백질이 야생형 단백질 또는 이의 도메인과 비교되었을 때 발현 수준의 증가를 보이도록 입체배열될 수 있다.
대안적 구현예에서, 본 발명은 야생형 단백질 또는 이의 도메인으로부터 진화되고, 야생형 단백질 또는 이의 도메인의 항원 특이적 표적화 영역과 비교되었을 때 비정상 조건 하에서의 검정에서 선택성 증가를 보이는 항원 특이적 표적화 영역 적어도 하나; 경막 도메인; 및 세포 내 신호전달 도메인을 포함하는, 표적 항원과의 결합을 위한 키메라 항원 수용체(CAR)를 제공한다. 몇몇 구현예들에서, 키메라 항원 수용체는 세포 외 스페이서 도메인 또는 적어도 하나의 보조 자극 도메인을 추가로 포함한다.
본 발명은 또한 (a) 야생형 단백질 또는 이의 도메인의 항원 특이적 표적화 영역과 비교되었을 때 정상 생리학적 조건에서의 검정에서 활성의 감소 및 (b) 야생형 단백질 또는 이의 도메인의 항원 특이적 표적화 영역과 비교되었을 때 비정상 조건하의 검정에서 활성의 증가 중 적어도 하나를 보이는 조건부 활성 단백질을 제조하기 위하여 야생형 단백질 또는 이의 도메인을 진화시키는 방법에 관한 것이기도 하다. 조건부 활성 단백질은 CAR로 조작될 수 있다.
본 방법에 의해 제조된 키메라 항원 수용체는 야생형 단백질 또는 이의 도메인의 항원 특이적 표적화 영역과 비교되었을 때, 정상 생리학적 조건에서 표적 항원에 대한 결합 친화성이 감소한 항원 특이적 표적화 영역을 포함할 수 있다.
본 방법에 의해 제조된 키메라 항원 수용체는 야생형 단백질 또는 이의 도메인의 항원 특이적 표적화 영역과 비교되었을 때 비정상 조건하의 검정에서 활성의 증가와, 야생형 단백질 또는 이의 도메인의 항원 특이적 표적화 영역과 비교되었을 때 정상 생리학적 조건에서 표적 항원에 대한 결합 친화성의 감소를 보이는, 항원 특이적 표적화 영역을 포함할 수 있다.
본 방법에 의해 제조된 상기 키메라 항원 수용체들 중 임의의 것에 있어서, 항원 특이적 표적화 영역은 또한 야생형 단백질 또는 이의 도메인의 항원 특이적 표적화 영역과 비교되었을 때 비정상 조건하의 검정에서 선택성의 증가를 보일 수도 있다.
본 방법에 의해 제조된 상기 키메라 항원 수용체들 중 임의의 것은, 항원 수용체를 함유하는 단백질이 야생형 단백질 또는 이의 도메인과 비교되었을 때 발현 수준 증가를 보이도록 입체배열될 수 있다.
본 방법의 대안적 구현예에 있어서, 본 방법에 의해 제조된, 표적 항원과의 결합을 위한 키메라 항원 수용체(CAR)는, 야생형 단백질 또는 이의 도메인으로부터 진화되고, 야생형 단백질 또는 이의 도메인의 항원 특이적 표적화 영역과 비교되었을 때 비정상 조건 하에서의 검정에서 선택성 증가를 보이는 항원 특이적 표적화 영역 적어도 하나; 경막 도메인; 및 세포 내 신호전달 도메인을 포함한다. 몇몇 구현예들에서, 키메라 항원 수용체는 세포 외 스페이서 도메인 또는 적어도 하나의 보조 자극 도메인을 추가로 포함한다.
키메라 항원 수용체
포유동물, 특히 인간의 면역계는 발병된 조직 및/또는 병원체를 표적화하여 이를 파괴하는 세포 독성 세포를 가진다. 원치않는 조직(즉 표적 조직), 예를 들어 종양을 제거하기 위해 이러한 세포 독성 세포를 사용하는 것은 전도 유망한 치료적 접근법이다. 제거를 위해 표적화될 수 있는 기타 조직들은 선(예를 들어 전립선) 과형성, 사마귀 및 원치않는 지방 조직을 포함한다. 그러나, 이처럼 비교적 신규한 치료적 접근법은 지금까지 제한된 성공만을 달성해왔다. 예를 들어 종양을 표적화하여 이를 파괴하기 위하여 T 세포를 사용하는 것은 비교적 작은 장기 이득을 가져오는데, 그 이유는 이 치료법의 효능을 줄이기 위해 표면 항원의 발현을 줄임으로써 암 세포들이 신규 치료법에 순응하게 될 수 있기 때문이다. 암 세포는 종양 특이적 T 세포에 대한 반응의 검출을 피하기 위해 심지어 탈 분화할 수도 있다. 문헌[Maher, "Immunotherapy of Malignant Disease Using Chimeric Antigen Receptor Engrafted T Cells," ISRN Oncology, vol. 2012, article ID 278093, 2012]을 참조하시오.
키메라 항원 수용체를 발현하는 세포 독성 세포는 이러한 세포 독성 세포의 특이성과 감수성을 유의적으로 개선할 수 있다. 예를 들어 CAR을 발현하는 T 세포(CAR-T 세포)는 T 세포를, CAR에 특이적으로 결합하는 세포 표면 항원을 발현하는 표적 종양 세포에 인도하기 위해 CAR을 사용할 수 있다. 이러한 CAR-T 세포는 세포 독성 제제를 종양 세포에 더욱 큰 선택성으로 전달할 수 있다. CAT-T 세포는 표적 분자를 직접 인지할 수 있으므로, 통상 다형체 제시 요소, 예를 들어 인간 백혈구 항원(HLA)에 의해 제한되지 않는다. 이 CAR 표적화 전략의 이점은 3가지이다. 첫 번째, CAR-T 세포의 기능은 HLA 상태에 의존하지 않으므로, 동일한 CAR 기반 접근법은 원칙적으로 동일한 표적 표면 항원을 발현하는 종양이 발생한 모든 환자들을 대상으로 이용될 수 있다. 두 번째, 항원 가공 및 제시 기구의 변질(corruption)은 종양 세포의 통상적인 속성으로서, 면역 도피를 촉진할 수 있다. 그러나, 이는 CAR-T 세포에 대한 방어를 허용하지 않는다. 세 번째, 일정 범위의 거대분자는 단백질, 탄수화물 및 당지질을 포함하는 이 계를 사용하여 표적화될 수 있다.
본 발명의 키메라 항원 수용체는 적어도 하나의 항원 특이적 표적화 영역(ASTR), 경막 도메인(TM) 및 세포 내 신호전달 도메인(ISD)을 포함하는 키메라 인공 단백질이다. 몇몇 구현예들에서, CAR은 세포 외 스페이서 도메인(ESD) 및/또는 보조 자극 도메인(CSD)을 추가로 포함할 수 있다. 도 1을 참조하시오.
ASTR은, 특이적 표적 항원, 예를 들어 단백질, 탄수화물 및 당지질을 포함하는 특이적 표적 항원에 대한 결합을 위한 CAR의 세포 외 영역이다. 몇몇 구현예들에서, ASTR은 항체, 구체적으로 단일 사슬 항체, 또는 이의 단편을 포함한다. ASTR은 각각이 표적 항원에 특이적인 전장 중쇄, Fab 단편, 단일 사슬 Fv(scFv) 단편, 2가 단일 사슬 항체 또는 다이아바디(diabody)를 포함할 수 있다.
ASTR은 또한 표적 항원을 인지하여 이와 결합하기 위한 다른 단백질 작용성 도메인을 포함할 수도 있다. 표적 항원은 다른 생체 기능, 예를 들어 수용체나 리간드로서 작용하는 기능을 가질 수 있으므로, ASTR은 대안적으로 항원과 특이적으로 결합하기 위한 작용성 도메인을 포함할 수 있다. 작용성 도메인을 가지는 단백질의 몇몇 예는, (시토카인 수용체를 보유하는 세포의 인지를 초래하는) 결합된 시토카인들, 아피바디(affibody), 자연 발생 수용체로부터 유래하는 리간드 결합 도메인, 그리고, 예를 들어 종양 세포 상 수용체에 대한 가용성 단백질/펩티드 리간드를 포함한다. 사실, 당 업자들에 의해 이해될 바와 같이 소정의 항원과 큰 친화성으로 결합할 수 있는 거의 모든 분자가 ASTR에 사용될 수 있다.
하나의 구현예에서, 본 발명의 CAR은 상이한 항원 적어도 2개 또는 동일한 항원 상에 있는 에피토프 적어도 2개를 표적화하는 ASTR을 적어도 2개 포함한다. 하나의 구현예에서, CAR은 상이한 항원 또는 에피토프 적어도 3개 또는 그 이상을 표적화하는 ASTR을 3개 이상 포함한다. 다수의 ASTR이 CAR에 존재할 때, ASTR들은 나란히 정렬될 수 있고, 링커 펩티드에 의해 떨어져 있을 수 있다(도 1).
하나의 구현예에서, 만일 VH 도메인만이 항원 특이성을 부여하는데에 충분하다면("단일 도메인 항체"), ASTR은 표적 항원에 특이적이고 VH, CH1, 힌지, 그리고 CH2 및 CH3(Fc) Ig 도메인들을 가지는 전장 IgG 중쇄를 포함한다. 만일 VH 도메인과 VL 도메인 둘 다가 완전 활성 ASTR을 생성하는데에 필요하면, VH 함유 CAR과 전장 람다 경쇄(IgL)는 둘 다 동일한 세포 독성 세포에 도입되어, 그 결과 활성 ASTR이 생성된다. 다른 구현예에서, CAR 중 각각의 ASTR은 적어도 2개의 단일 사슬 항체 가변 단편(scFv)을 포함하는데, 여기서 이 scFv 각각은 상이한 표적 항원에 특이적이다. 하나의 가변 도메인(VH 또는 VL)의 C 말단은 폴리펩티드 링커를 통하여 다른 가변 도메인(각각 VL 또는 VH)의 N 말단부에 고정되어 있는 scFv가 항원 결합 또는 결합에 대한 특이성이 유의적으로 파괴 또는 저해되지 않도록 개발되었다[Chaudhary et al, "A recombinant single-chain immunotoxin composed of anti-Tac variable regions and a truncated diphtheria toxin," Proc. Natl. Acad. Sci., vol. 87, page 9491, 1990; Bedzyk et al," "Immunological and structural characterization of a high affinity anti- fluorescein single-chain antibody " J. Biol. Chem., vol. 265, page 18615, 1990]. 이러한 scFv는 원산 항체의 중쇄 및 경쇄에 존재하는 불변 영역(Fc)을 가지지 않는다. 적어도 2개의 상이한 항원에 특이적인 scFv는 나란히 정렬된다. 하나의 구현예에서, 세포 외 스페이서 도메인은 ASTR과 경막 도메인 사이에서 이 둘을 연결할 수 있다.
다른 구현예에서, scFv 단편은 중쇄의 불변 도메인의 일부 또는 전부에 융합될 수 있다. 추가의 구현예에서, CAR의 ASTR은 2가(또는 이가) 단일 사슬 가변 단편(di-scFv, bi-scFv)을 포함한다. di-scFv를 포함하는 CAR에서, 각각이 항원에 특이적인 scFv 2개는 서로 결합되어, 2개의 VH 영역 및 2개의 VL 영역을 가지는 단일 펩티드 사슬을 형성한다[Xiong et al, "Development of tumor targeting anti-MUC- 1 multimer: effects of di-scFv unpaired cysteine location on PEGylation and tumor binding," Protein Engineering Design and Selection, vol. 19, pages 359-367, 2006; Kufer et al, "A revival of bispecific antibodies," Trends in Biotechnology, vol. 22, pages 238-244, 2004].
또 다른 구현예에서, ASTR은 다이아바디를 포함한다. 다이아바디에 있어서, 너무 짧아서 2개의 가변 영역을 함께 폴딩시킬 수 없는 링커 펩티드에 의해 scFv가 생성되고, 이때 scFv들은 이량체화된다. 더욱 짧은 링커(1개 또는 2개의 아미노산)는 삼량체(소위 트리아바디(triabody) 또는 트리바디(tribody))의 형성을 초래한다. 테트라바디도 또한 ASTR에 사용될 수 있다.
2개 이상의 ASTR이 CAR에 존재할 때, ASTR은 올리고펩티드 링커 또는 폴리펩티드 링커, Fc 힌지 또는 막 힌지 영역을 통하여 단일 폴리펩티드 사슬 상에서 서로 공유적으로 연결된다.
CAR에 의해 표적화된 항원은, 제거를 위해 표적화되는 조직, 예를 들어 종양, 선(예를 들어 전립선) 과형성, 사마귀 및 원치않는 지방 조직 내 세포 내부 또는 표면상에 존재한다. 표면 항원은 CAR의 ASTR에 의해 더욱 효율적으로 인지 및 결합되는 반면, 세포 내 항원은 또한 CAR에 의해 표적화될 수 있다. 몇몇 구현예들에서, 표적 항원은 바람직하게 암, 염증 질환, 신경 장애, 당뇨병, 심혈관 질환 또는 감염성 질환에 특이적이다. 표적 항원의 예들은 다양한 면역 세포, 암종, 육종, 림프종, 백혈병, 생식 세포 종양, 아세포종, 그리고 다양한 혈액학적 질환, 자가면역 질환 및/또는 염증 질환과 연관된 세포에 의해 발현되는 항원들을 포함한다.
ASTR에 의해 표적화될 수 있는 암에 특이적인 항원은 4-IBB, 5T4, 선암종 항원, 알파-태아 단백질, BAFF, B 림프종 세포, C242 항원, CA-125, 탄산 탈수 효소 9(CA-IX), C-MET, CCR4, CD152, CD19, CD20, CD200, CD22, CD221, CD23(IgE 수용체), CD28, CD30(TNFRSF8), CD33, CD4, CD40, CD44 v6, CD51, CD52, CD56, CD74, CD80, CEA, CNT0888, CTLA-4, DR5, EGFR, EpCAM, CD3, FAP, 피브로넥틴 여분 도메인-B, 엽산염 수용체 1, GD2, GD3 강글리오사이드, 당단백 75, GPNMB, HER2/neu, HGF, 인간 산란 인자(human scatter factor) 수용체 키나아제, IGF-1 수용체, IGF-I, IgG1, LI -CAM, IL-13, IL-6, 인슐린 유사 성장 인자 I 수용체, 인테그린 α5β1, 인테그린 ανβ3, MORAb-009, MS4A1, MUC1, 뮤신 CanAg, N-글리콜일뉴라민산, NPC-1C, PDGF-Ra, PDL192, 포스파티딜세린, 전립선 암종 세포, RANKL, RON, ROR1, SCH900105, SDC1, SLAMF7, TAG-72, 테나신 C, TGF 베타 2, TGF-β, TRAIL-R1, TRAIL-R2, 종양 항원 CTAA16.88, VEGF-A, VEGFR-1, VEGFR2 또는 비멘틴 중 하나 이상을 포함한다.
ASTR에 의해 표적화될 수 있는 염증 질환에 특이적인 항원은 AOC3(VAP-1), CAM-3001, CCL11(에오탁신-1), CD125, CD147(바시긴), CD154(CD40L), CD2, CD20, CD23(IgE 수용체), CD25(IL-2 수용체의 사슬), CD3, CD4, CD5, IFN-a, IFN-γ, IgE, IgE Fc 영역, IL-1, IL-12, IL-23, IL-13, IL-17, IL-17A, IL-22, IL-4, IL-5, IL-5, IL-6, IL-6 수용체, 인테그린 a4, 인테그린 α4β7, 람다 감마, LFA-1(CD11a), MEDI-528, 미오스타틴, OX-40, rhuMAb β7, 스클레로신, SOST, TGF 베타 1, TNF-a 또는 VEGF-A 중 하나 이상을 포함한다.
본 발명의 ASTR에 의해 표적화될 수 있는 신경 장애에 특이적인 항원들은 베타 아밀로이드 또는 MABT5102A 중 하나 이상을 포함한다. 본 발명의 ASTR에 의해 표적화될 수 있는 당뇨병에 특이적인 항원은 L-Iβ 또는 CD3 중 하나 이상을 포함한다. 본 발명의 ASTR에 의해 표적화될 수 있는 심혈관 질환에 특이적인 항원은 C5, 심장 미오신, CD41(인테그린 알파-lib), 피브린 II, 베타 사슬, ITGB2(CD18) 및 스핑고신-1-인산염 중 하나 이상을 포함한다.
본 발명의 ASTR에 의해 표적화될 수 있는 감염성 질환에 특이적인 항원은 탄저균 독소, CCR5, CD4, 응고 인자 A(clumping factor A), 거대세포바이러스, 거대세포바이러스 당단백 B, 내독소, 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), B형 간염 표면 항원, B형 간염 바이러스, HIV-1, Hsp90, 인플루엔자 A 혈구응집소, 리포테이코산, 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 광견병 바이러스 당단백, 호흡기 세포 융합 바이러스 및 TNF-a 중 하나 이상을 포함한다.
표적 항원의 추가 예들로서는 특이적이거나 증폭된 형태로 암 세포 상에서 발견되는 표면 단백질, 예를 들어 B-세포 림프종에 대한 IL-14 수용체, CD19, CD20 및 CD40, 다양한 암종에 대한 루이스 Y 및 CEA 항원, 유방암 및 대장암에 대한 Tag72 항원, 폐암에 대한 EGF-R, 종종 인간 유방암 및 난소암에서 증폭되는 엽산염 결합 단백질 및 HER-2 단백질, 또는 바이러스 단백질, 예를 들어 HIV의 gp120 및 gp41 외피 단백질, B형 및 C형 간염 바이러스로부터 유래하는 외피 단백질, 인간 거대세포바이러스의 당단백 B 및 기타 외피 당단백, 그리고 발암 바이러스, 예를 들어 카포시 육종 연관 헤르페스 바이러스로부터 유래하는 외피 단백질을 포함한다. 기타 잠재적 표적 항원은 CD4(리간드가 HIV gp120 외피 당단백인 경우) 및 다른 바이러스 수용체, 예를 들어 ICAM(인간 리노바이러스에 대한 수용체, 그리고 소아마비 바이러스에 대한 관련 수용체 분자)을 포함한다.
다른 구현예에서, CAR은 암 치료 세포, 예를 들어 NK 세포 및 기타 본원에 예시된 세포에 들러붙어 면역 효과기 세포로서 작동함으로써 상기 암 치료 세포를 활성화하는 항원을 표적화할 수 있다. 이의 일례는, CD16A 항원이 NK 세포에 들러붙도록 표적화하여 CD30 발현 악성종양과 싸우도록 만드는 CAR이다. 이중 특이적 4가 AFM13 항체는 이 효과를 전달할 수 있는 항체의 일례이다. 이와 같은 유형의 구현예의 추가 세부 설명은, 예를 들어 문헌(Rothe, A., et al, "A phase 1 study of the bispecific anti-CD30/CD16A antibody construct AFM 13 in patients with relapsed or refractory Hodgkin lymphoma," Blood, vol. 125, no. 26, pp. 4024-4031)에서 발견될 수 있다.
CAR의 세포 외 스페이서 도메인은 ASTR 및 경막 도메인 사이에 위치하는 친수성 영역이다. 몇몇 구현예들에서, 이 도메인은 CAR에 적당한 단백질 폴딩을 촉진한다. 세포 외 스페이서 도메인은 CAR의 선택적 성분이다. 세포 외 스페이서 도메인은 항체의 Fc 단편, 항체의 힌지 영역, 항체의 CH2 영역, 항체의 CH3 영역, 인공 스페이서 서열 또는 이것들의 조합으로부터 선택되는 도메인을 포함할 수 있다. 세포 외 스페이서 도메인의 예들은 CD8a 힌지, 3개의 글리신(Gly)만큼 작을 수 있는 폴리펩티드로 이루어진 인공 스페이서뿐만 아니라, IgG(예를 들어 인간 IgG4)의 CH1 및 CH3 도메인을 포함한다
CAR의 경막 도메인은 세포 독성 세포의 원형질막을 가로지를 수 있는 영역이다. 경막 도메인은 경막 단백질, 예를 들어 I형 경막 단백질의 경막 영역, 소수성 인공 서열 또는 이것들의 조합으로부터 선택된다. 경막 도메인의 예들은 T 세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 사슬, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154의 경막 영역을 포함한다. 합성 경막 도메인은 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 삼원체를 포함할 수 있다. 선택적으로, 짧은(바람직하게 길이가 2개 내지 10개 아미노산인) 올리고펩티드 링커 또는 폴리펩티드 링커는 CAR의 경막 도메인과 세포 내 신호전달 도메인 사이에 결합을 형성할 수 있다. 글리신-세린 이원체는 경막 도메인과 세포 내 신호전달 도메인 사이에 특히 적합한 링커를 제공한다.
본 발명의 CAR은 또한 세포 내 신호전달 도메인을 포함하기도 한다. 세포 내 신호전달 도메인은 효과기 기능 신호를 전달한 다음, 이 신호를 세포 독성 세포에 인도하여, 특화된 기능, 즉 표적 세포의 손상 및/또는 파괴를 수행한다. 세포 내 신호전달 도메인의 예들은 T 세포 수용체 복합체의 ζ 사슬, 또는 이의 동족체들, 예를 들어 η 사슬, FcsRly 및 β 사슬, MB 1(Iga) 사슬, B29(Ig) 사슬 등, 인간 CD3 제타 사슬, CD3 폴리펩티드(Δ, δ 및 ε), syk 과 티로신 키나아제(Syk, ZAP 70 등), src 과 티로신 키나아제(Lck, Fyn, Lyn 등), 그리고 T 세포 신호전달에 관여하는 기타 분자, 예를 들어 CD2, CD5 및 CD28 중 임의의 것을 포함한다. 구체적으로 세포 내 신호전달 도메인은 인간 CD3 제타 사슬, FcyRIII, FcsRI, Fc 수용체의 세포질 미부, 세포질 수용체를 보유하는 면역 수용체 티로신 기반 활성화 모티브(ITAM) 및 이것들의 조합일 수 있다.
CAR에 사용된 세포 내 신호전달 도메인은 기타 다양한 면역 신호전달 수용체들, 예를 들어 CD3, B7과 보조 자극 수용체, 그리고 종양 괴사 인자 수용체(TNFR) 상과 수용체(이에 한정되는 것은 아님)를 포함하는 제1, 제2 및 제3 세대 T 세포 신호전달 단백질들 중 몇 가지 유형들의 세포 내 신호전달 도메인을 포함할 수 있다[Park et al., "Are all chimeric antigen receptors created equal?" J Clin Oncol., vol. 33, pp.651-653, 2015]. 추가로, 세포 내 신호전달 도메인은 NK 및 NKT 세포에 의해 사용되는 신호전달 도메인(Hermanson, et al., "Utilizing chimeric antigen receptors to direct natural killer cell activity," Front Immunol., vol. 6, p.195, 2015), 예를 들어 NKp30(B7-H6) (Zhang et al., "An NKp30-based chimeric antigen receptor promotes T cell effector functions and antitumor efficacy in vivo," J Immunol., vol. 189, pp.2290-2299, 2012), 및 DAP12(Topfer et al., "DAP12-based activating chimeric antigen receptor for NK cell tumor immunotherapy," J Immunol., vol. 194, pp.3201-3212, 2015), NKG2D, NKp44, NKp46, DAP10 및 CD3z의 신호전달 도메인들을 포함한다. 추가로, 세포 내 신호전달 도메인은 또한 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM)를 함유하는 인간 면역글로불린 수용체의 신호전달 도메인들, 예를 들어 Fc 감마 RI, Fc 감마 RIIA, Fc 감마 RIIC, Fc 감마 RIIIA, FcRL5도 포함한다(Gillis et al., "Contribution of Human FcγRs to Disease with Evidence from Human Polymorphisms and Transgenic Animal Studies," Front Immunol., vol. 5, p.254, 2014).
몇몇 구현예들에서, 세포 내 신호전달 도메인은 TCR 제타, FcR 감마, FcR 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b 또는 CD66d의 세포질 신호전달 도메인을 포함한다. CAR 내 세포 내 신호전달 도메인은 인간 CD3 제타의 세포질 신호전달 도메인을 포함하는 것이 특히 바람직하다.
본 발명의 CAR은, CAR을 발현하는 세포독성 세포에 대한 기억 세포의 발달, 세포 생존 및 세포 증식을 향상시키는 기능을 가지는 보조 자극 도메인을 포함할 수 있다. 본 발명의 CAR은 TNFR 상과에 속하는 단백질, CD28, CD137(4-1BB), CD134(OX40), DaplO, CD27, CD2, CD7, CD5, ICAM-1, LFA-1(CD1la/CD18), Lck, TNFR-I, PD-1, TNFR-II, Fas, CD30, CD40, ICOS LIGHT, NKG2C, B7-H3의 보조 자극 도메인들, 또는 이것들의 조합들로부터 선택되는 보조 자극 도메인 하나 이상을 포함할 수 있다. 만일 CAR이 1개를 초과하는 보조 자극 도메인을 포함하면, 이러한 도메인은, 선택적으로 링커에 의해 떨어져 있으면서 나란히 정렬될 수 있다. 보조 자극 도메인은 CAR 내 세포 내 신호전달 도메인과 경막 도메인 사이에 위치할 수 있는 세포 내 도메인이다.
몇몇 구현예들에서, 본 발명의 CAR의 2개 이상의 성분은 하나 이상의 링커에 의해 떨어져 있다. 예를 들어 적어도 2개의 ASTR을 포함하는 CAR에 있어서, 2개의 ASTR은 링커에 의해 떨어져 있을 수 있다. 링커는 길이가 약 1개 아미노산 내지 약 100개 아미노산인 올리고펩티드 또는 폴리펩티드 영역이다. 몇몇 구현예들에서, 링커는, 예를 들어 길이가 5개 아미노산 내지 12개 아미노산, 길이가 5개 아미노산 내지 15개 아미노산, 또는 길이가 5개 아미노산 내지 20개 아미노산일 수 있다. 링커는 글리신과 세린 같은 가요성 잔기들로 구성될 수 있어서, 인접하는 단백질 도메인들은 서로에 대해 자유롭게 움직일 수 있다. 더욱 긴 링커, 예를 들어 100개 아미노산보다 더욱 긴 링커는 본 발명의 대안적 구현예들과 연계하여 사용될 수 있는데, 예를 들어 2개의 인접 도메인들이 서로 입체적으로 방해하지 않는 것을 보장하도록 선택될 수 있다. 본 발명에 사용될 수 있는 링커의 예들은 2A 링커(예를 들어 T2A), 2A 유사 링커 또는 이것들의 작용성 균등물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
조건부 활성 항원 특이적 표적화 영역
본 CAR은 전술된 상이한 도메인들을 함께 융합하여, 융합 단백질을 제조함으로써 제조된 키메라 단백질이다. 본 CAR은 통상적으로 CAR의 상이한 도메인을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터에 의해 제조된다. 표적 세포상 항원을 인지하여 이와 결합하는 기능을 가지는 본 발명의 ASTR은 조건부 활성이다. 특히, ASTR은, 상응하는 야생형 단백질의 ASTR과 비교되었을 때 정상 생리학적 조건에서는 덜 활성이거나 비활성이고, 표적 항원과 결합하기 위한 비정상 조건에서는 활성이다. 본 발명은 야생형 단백질 또는 이의 결합 도메인(야생형 ASTR)로부터 조건부 활성 ASTR을 제조하기 위한 방법을 제공한다.
단백질 라이브러리를 제조하고, 표적 항원에 대하여 원하는 결합 친화성을 가지는 단백질에 대해 이 라이브러리를 스크리닝함으로써, 표적 항원을 위한 자체의 결합 도메인 최소한에 대해 전체 또는 일부가 본 발명의 ASTR로서 사용되기 적합한 야생형 단백질이 발견될 수 있다. 야생형 단백질은 cDNA 라이브러리를 스크리닝함으로써 발견될 수 있다. cDNA 라이브러리는 숙주 세포들의 무리에 삽입되어 각각이 함께 유기체 전사체의 몇몇 부분을 구성하는, 클로닝된 cDNA(상보성 DNA) 단편들의 조합이다. cDNA는 완전히 전사된 mRNA로부터 제조되므로, 유기체의 발현된 단백질에 대한 암호화 서열을 함유한다. cDNA 라이브러리 내 정보는, 표적 항원에 대하여 원하는 결합 친화성을 가지는 단백질에 대해서 라이브러리들을 스크리닝함으로써 원하는 특성을 갖는 단백질을 발견하기 위한 강력하고 유용한 도구이다.
야생형 단백질이 항체인 몇몇 구현예들에서, 야생형 항체는 항체 라이브러리를 제조 및 스크리닝함으로써 발견될 수 있다. 항체 라이브러리는 폴리클로날 항체 라이브러리이거나 모노클로날 항체 라이브러리 중 어느 하나일 수 있다. 표적 항원에 대한 폴리클로날 항체 라이브러리는 항원을 동물에 직접 주입하거나 또는 항원을 인간 이외의 동물에 투여함으로써 제조될 수 있다. 이와 같이 얻어진 항체는 항원에 결합되는 폴리클로날 항체들의 라이브러리를 나타낸다. 모노클로날 항체 라이브러리를 제조하기 위하여, 연속 세포주 배양에 의해 제조되는 항체를 제공하는 임의의 기술이 사용될 수 있다. 예들로는 하이브리도마 기술, 트리오마 기술, 인간 B 세포 하이브리도마 기술, 및 EBV-하이브리도마 기술을 포함한다[예를 들어 문헌(Cole (1985), Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96)을 참조하시오]. 단일 사슬 항체를 제조하기 위한 것으로 기술된 기술(예를 들어 미국 특허 제4,946,778호 참조)이 단일 사슬 항체 라이브러리를 제조하도록 적응될 수 있다.
야생형 항체를 발견하기 위해 항체 라이브러리를 제조 및 스크리닝하기 위한 다른 방법들이 존재한다. 예를 들어 완전 인간 항체 전시 라이브러리가 이용될 수 있다. 이러한 라이브러리는 숙주 세포(들)의 표면상에 전시되는 항체의 군집이다. 바람직하게 항체 라이브러리는, 항체들이 광범위한 항원에 대한 결합 능을 가진다는 점에서 항체들의 인간 레퍼토리를 대표하는 것이다. 항체는 세포 표면상에 전시되기 때문에, (결합활성으로 인한) 라이브러리 내 각각의 항체의 유효 친화성은 증가한다. 스크리닝 및 동정용인 항체의 결합활성이 덜 요망되는 다른 공공 라이브러리 류, 예를 들어 파지 전시 라이브러리와는 달리, 본 발명에서는 세포 표면 전시에 의해 제공된 초 결합활성이 요망된다. 세포 표면 전시 라이브러리는 스크리닝 또는 선택 단계에서 저, 중 및 고 결합 친화성 항체의 동정뿐만 아니라, 비 면역원성 에피토프 및 약 에피토프의 동정도 가능하게 한다.
모 분자로부터 진화된 분자들의 제조
야생형 단백질 또는 이의 결합 도메인(야생형 ASTR)은 돌연변이 유발 과정을 진행하여 돌연변이 폴리펩티드 군집을 제조하고, 추후 이 군집은 스크리닝되어, 야생형 ASTR과 비교되었을 때, 비정상 조건에서의 표적 항원에 대한 결합 친화성이 증가하였고, 선택적으로는 정상 생리학적 조건에서의 표적 항원에 대한 결합 친화성이 실질적으로 동일하거나 감소한 돌연변이 ASTR이 동정될 수 있다.
임의의 화학 합성법 또는 재조합 돌연변이유발법은 돌연변이 폴리펩티드 군집을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 실시에는 달리 지정되지 않는 한 업계의 기술 내에 있는 세포 생물학, 세포 배양, 분자 생물학, 유전자 이식 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 및 면역학의 통상적인 기술들이 사용될 수 있다. 이러한 기술들은 문헌에 자세히 설명되어 있다. 예를 들어 문헌[Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989); DNA Cloning, Volumes I and II (D. N. Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984); Mullis et al. U.S. Patent No: 4,683, 195; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Cabs eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155 (Wu et al. eds.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes 1-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986); Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986)]을 참조하시오.
본 발명은 조건부 활성인 돌연변이 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 돌연변이체를 제조하기 위한 방법을 제공하는데, 이 방법은, (i) 상이한 뉴클레오티드를 하나 이상의 뉴클레오티드로 치환하는 것[여기서 상기 뉴클레오티드는 자연 발생 또는 비 자연 발생 뉴클레오티드를 포함함]; (ii) 하나 이상의 뉴클레오티드를 결실시키는 것, (iii) 하나 이상의 뉴클레오티드를 추가하는 것, 또는 (iv) 이것들의 임의의 조합에 의해 핵산을 변형하는 것을 포함한다. 하나의 양상에서, 비 자연 발생 뉴클레오티드는 이노신을 포함한다. 또 다른 양상에서, 본 방법은 변경된 효소 활성에 대해 변형된 핵산에 의해 암호화된 폴리펩티드를 검정하여, 변경된 효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 변형된 핵산(들)을 동정하는 단계를 추가로 포함한다. 하나의 양상에서, 단계 (a)의 변형은 PCR, 오류 유발 PCR, 셔플링, 올리고뉴클레오티드 유도 돌연변이 유발, 조립 PCR, 유성 PCR 돌연변이 유발, 생체 내 돌연변이 유발, 카세트 돌연변이 유발, 반복 앙상블 돌연변이 유발, 지수 앙상블 돌연변이 유발, 위치 특이적 돌연변이 유발, 유전자 재조립, 유전자 위치 포화 돌연변이 유발, 리가아제 연쇄 반응, 시험관 내 돌연변이 유발, 리가아제 연쇄 반응, 올리고뉴클레오티드 합성, 임의의 DNA-제조 기술 및 이것들의 임의의 조합에 의해 이루어진다. 또 다른 양상에서, 방법은 변형 단계의 적어도 1회 반복을 추가로 포함한다.
본 발명은 2가지 이상의 핵산으로부터 폴리뉴클레오티드를 제조하는 방법을 추가로 제공하는데, 상기 방법은, (a) 2개 이상의 핵산 사이의 동일성의 영역 및 다양성의 영역을 동정하는 단계로서, 핵산들 중 적어도 하나가 본 발명의 핵산을 포함하는 단계; (b) 서열에서 2개 이상의 핵산 중 적어도 2개에 상응하는 올리고뉴클레오티드의 세트를 제공하는 단계; 및 (c) 중합효소로 올리고뉴클레오티드를 연장시켜서 폴리뉴클레오티드를 제조하는 단계를 포함한다.
돌연변이 유발의 임의 기술은 본 발명의 여러 구현예에서 사용될 수 있다. 확률론적 또는 랜덤 돌연변이 유발은 모 분자가 돌연변이(변형 또는 변이)되어 예정되지 않은 돌연변이(들)를 갖는 자손 분자의 세트를 얻는 경우에 의해 예시된다. 따라서, 시험관 내 확률론적 돌연변이 유발 반응에서, 예를 들어 달성되는 돌연변이의 정확한 성질에 대한 것뿐만 아니라, 제조되는 생성물에 대한 불확실성(무작위성)이 있기보다는, 생성이 의도된 특정의 예정 생성물은 없다. 확률론적 돌연변이 유발은 달성되는 돌연변이(들)가 랜덤하거나 예정되지 않은 경우에, 오류 유발 PCR 및 확률론적 셔플링과 같은 방법에서 나타난다. 변이체 형태는, 제1 변이체 형태의 오류 유발 PCR 또는 교정 활성이 결여된 중합효소의 사용[Liao(1990) Gene 88: 107-111 참조]과 같은 오류 유발 전사에 의하거나, 또는 돌연변이 유발 유전자 균주(돌연변이 유발 유전자 숙주 세포는 하기에 더 상세히 논의되며, 일반적으로 널리 공지되어 있음)에서 제1 형태의 복제에 의해 제조될 수 있다. 돌연변이 유발 유전자를 가지는 균주는 미스매치 수선의 기능이 손상된 임의의 유기체에서의 임의의 돌연변이체를 포함할 수 있다. 이들은 mutS, mutT, mutH, mutL, ovrD, dcm, vsr, umuC, umuD, sbcB, recJ 등의 돌연변이 유전자 생성물을 포함한다. 손상은 유전적 돌연변이, 대립 형질 치환, 작은 화합물 또는 발현된 안티센스 RNA와 같은 첨가된 시약에 의한 선택적 억제 또는 다른 기술에 의해 달성된다. 손상은 언급된 유전자의 손상 또는 임의의 유기체에서의 상동성 유전자의 손상일 수 있다.
기타 돌연변이 유발 방법은 올리고뉴클레오티드 유도 돌연변이 유발 기술, 오류 유발 중합효소 연쇄 반응(오류 유발 PCR) 및 카세트 돌연변이 유발을 포함하며, 여기에서, 모 폴리뉴클레오티드의 특이 영역은 합성적으로 돌연변이 유발된 올리고뉴클레오티드로 치환된다. 이들 경우에, 다수의 돌연변이체 위치는 모 서열 중 임의의 위치 주변에 생성된다.
올리고뉴클레오티드 유도 돌연변이 유발에서, 짧은 서열은 합성적으로 돌연변이 유발된 올리고뉴클레오티드로 치환된다. 올리고뉴클레오티드 유도 돌연변이 유발에서, 폴리뉴클레오티드의 짧은 서열은 제한 효소 분해를 사용하여 폴리뉴클레오티드로부터 제거되고, 원래의 서열로부터 다양한 염기가 변경된 합성 폴리뉴클레오티드로 치환된다. 폴리뉴클레오티드 서열은 또한 화학적 돌연변이 유발에 의해 변경될 수 있다. 화학적 돌연변이원은, 예를 들어 아황산수소나트륨, 아질산, 하이드록실아민, 히드라진 또는 포름산을 포함한다. 뉴클레오티드 전구체의 유사체인 다른 제제는 니트로소구아니딘, 5-브로모우라실, 2-아미노퓨린 또는 아크리딘을 포함한다. 일반적으로, 이들 제제는 뉴클레오티드 전구체 대신에 PCR 반응에 첨가되어 서열을 돌연변이시킨다. 프로플라빈, 아크리플라빈, 퀴나크린 등과 같은 끼어들기 제제가 또한 사용될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 서열의 랜덤 돌연변이 유발은 또한 X-선 또는 자외선에 의한 조사에 의해 달성될 수 있다. 일반적으로, 이렇게 돌연변이 유발된 플라스미드 폴리뉴클레오티드는 이.콜라이 내로 도입되어, 하이브리드 플라스미드의 풀 또는 라이브러리로서 번식된다.
오류 유발 PCR은 낮은 충실도의 중합 조건을 사용하여 긴 서열에 걸쳐 낮은 수준의 점 돌연변이를 랜덤하게 도입시킨다. 알려지지 않은 서열의 단편들의 혼합물에서, 오류 유발 PCR이 사용되어 혼합물을 돌연변이 유발할 수 있다.
카세트 돌연변이 유발에서, 단일 주형의 서열 블록은 통상적으로 (부분적으로) 랜덤화된 서열에 의해 대체된다[Reidhaar-Olson J F and Sauer R T: Combinatorial cassette mutagenesis as a probe of the informational content of protein sequences. Science 241(4861): 53-57, 1988].
대안적으로, 비 확률론적 또는 비 랜덤 돌연변이 유발의 임의의 기술이 본 발명의 여러 구현예에 사용될 수 있다. 비 확률론적 돌연변이 유발은 모 분자가 돌연변이(변형 또는 변이)되어 하나 이상의 예정된 돌연변이를 갖는 자손 분자를 얻는 경우에 의해 예시된다. 약간의 양만큼 배경 생성물이 존재함은 분자 가공이 일어나는 다수의 반응에서 실제로 일어나고, 이들 배경 생성물의 존재는 예정된 생성물을 내놓는 돌연변이 유발 방법의 비 확률론적 성질을 격하시키지 않는 것이 이해된다. 위치 포화 돌연변이 유발 및 합성 결찰 재조립은, 의도한 생성물(들)의 정확한 화학적 구조(들)가 예정된 돌연변이 유발 기술의 예이다.
위치 포화 돌연변이 유발의 하나의 방법은 본원에 참고문헌으로 인용된 미국 특허 출원 공고 2009/0130718에 개시되어 있다. 이 방법은 주형 폴리뉴클레오티드의 코돈에 상응하는 축퇴성 프라이머 세트를 제공하고, 중합효소 연장을 수행하여 축퇴성 프라이머에 상응하는 서열을 함유하는 자손 폴리뉴클레오티드를 생성시킨다. 자손 폴리뉴클레오티드는 유도된 진화를 위해 발현되고 스크리닝된다. 상세하게, 이는 자손 폴리뉴클레오티드의 세트를 제조하기 위한 방법으로서, (a) 주형 폴리펩티드 서열을 암호화하는 복수의 코돈을 각각 포함하는 주형 폴리뉴클레오티드의 복사체들을 제공하는 단계; 및 (b) 주형 폴리뉴클레오티드의 각각의 코돈에 대해, (1) 축퇴성 프라이머의 세트를 제공하는 단계로서, 각각의 프라이머가 주형 폴리뉴클레오티드의 코돈에 상응하는 축퇴성 코돈 및 주형 폴리뉴클레오티드의 코돈에 인접한 서열에 상동성인 인접 서열 적어도 하나를 포함하는 단계; (2) 프라이머의 주형 폴리뉴클레오티드 복사체들에의 어닐링을 허용하는 조건을 제공하는 단계; 및 (3) 주형을 따라 프라이머로부터의 중합효소 연장 반응을 수행하여, 어닐링된 프라이머의 축퇴성 코돈에 상응하는 서열을 각각 함유하는 자손 폴리뉴클레오티드들을 생성시켜서, 자손 폴리뉴클레오티드의 세트를 생성하는 단계를 수행하는 단계를 포함한다. 위치 포화 돌연변이 유발은 얻어진 관심 결합 활성 지향적으로 진화된 핵산을 함유하는 클론의 스크리닝 및 핵산의 유도된 진화에 관한다.
위치 포화 돌연변이 유발은, 일반적으로 1) 돌연변이 유발되어 적어도 하나의 점 돌연변이, 추가, 결실 및/또는 키메라화를 달성하는 분자(들)의 자손 세대(폴리뉴클레오티드 서열로 이루어진 분자, 폴리펩티드 서열로 이루어진 분자, 및 일부는 폴리뉴클레오티드 서열로, 그리고 일부는 폴리펩티드 서열로 이루어진 분자 포함)를 하나 이상의 조상 또는 모 세대 주형(들)으로부터 제조하는 단계; 2) 바람직하게는 고 처리량 방법을 사용하여, 표적 항원에 대한 원하는 결합 친화성에 대해 자손 세대 분자(들)를 스크리닝하는 단계; 3) 선택적으로 모 분자 및/또는 자손 세대 분자에 대한 구조 및/또는 기능 정보를 얻고/얻거나 목록을 작성하는 단계; 및 4) 선택적으로 단계 1) 내지 3) 중 임의의 단계를 반복하는 단계의 방법에 관한 것이다.
위치 포화 돌연변이 유발에서, 모든 코돈(또는 동일한 아미노산을 암호화하는 축퇴성 코돈의 모든 과)이 각각의 코돈 위치에서 나타날 수 있을 정도로, 각각이 3개 이하의 인접 점 돌연변이(즉 새로운 코돈을 포함하는 상이한 염기)의 세트 적어도 하나를 갖는 폴리뉴클레오티드들의 자손 세대가 (예를 들어 모 폴리뉴클레오티드 주형으로부터) 생성된다("코돈 위치 포화 돌연변이 유발"로 칭하여짐). 폴리뉴클레오티드의 상기 자손 세대에 상응하여(그리고 이에 의해 암호화되어), 각각이 적어도 하나의 단일 아미노산 점 돌연변이를 갖게 된 자손 폴리펩티드 세트도 또한 제조된다. 바람직한 양상에서, 폴리펩티드를 따라 각각의 그리고 매 아미노산 위치에서 19개의 자연 암호화된 폴리펩티드 생성 알파-아미노산 치환 각각에 대해 이와 같은 돌연변이 폴리펩티드 하나가 제조된다("아미노산 위치 포화 돌연변이 유발"이라 칭하여짐). 이는, 모 폴리펩티드를 따라서 각각의 그리고 매 아미노산 위치에 대해 원래의 아미노산을 포함하는 총 20개의 변별적 자손 폴리펩티드를 제공하거나, 또는 만일 20개의 자연 암호화된 아미노산 대신에 또는 이 아미노산에 더하여 추가 아미노산이 사용되면, 잠재적으로는 21개 초과의 변별적 자손 폴리펩티드를 제공한다.
재조합, 더욱 구체적으로 부분 상동성의 영역을 함유하는 폴리뉴클레오티드 서열의 생체 내 재편성의 방법에 의해 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제조하고, 폴리뉴클레오티드를 조립하여 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 제조하고, 유용한 특성을 갖는 폴리펩티드(들)의 제조를 위해 폴리뉴클레오티드를 스크리닝하기 위한 방법을 수반하는 다른 돌연변이 유발 기술이 또한 사용될 수 있다.
다른 양상에서, 돌연변이 유발 기술은, 상동성을 가지는 영역을 소유하는 반복 또는 연속 서열의 영역과 서열의 복잡성을 감소시키는 환원적 방법을 매개하고/매개하거나 분자를 재조합하는 세포의 자연 발생 특성을 이용한다.
생체 활성 하이브리드 폴리펩티드를 암호화하는 하이브리드 폴리뉴클레오티드를 제조하기 위한 방법을 제공하기 위해 다양한 돌연변이 유발 기술이 단독으로 또는 조합하여 사용될 수 있다. 이와 같은 목적들 및 다른 목적들을 달성하기 위해, 본 발명의 하나의 양상에 따라서 폴리뉴클레오티드를 적합한 숙주 세포 내로 도입시키고, 하이브리드 폴리펩티드를 제조하는 조건하에 숙주 세포를 성장시키기 위한 방법이 제공되었다.
키메라 유전자는 제한 효소(들)에 의해 제조되는 양립 가능한 점착성 말단을 사용하여 2개의 폴리뉴클레오티드 단편을 결합시킴으로써 제조되며, 여기에서 각각의 단편은 별도의 조상(또는 모) 분자로부터 유도된다. 또 다른 예는 단일 위치 돌연변이 유발된 폴리펩티드를 암호화하는 단일 자손 폴리뉴클레오티드를 제조하기 위해 모 폴리뉴클레오티드에서 (즉 코돈 치환, 추가 또는 결실이 달성되도록) 단일 코돈 위치를 돌연변이 유발하는 것이다.
추가로, 유전자의 하이브리드를 제조하기 위하고, 생체 내 재조합 랜덤 방법, 그리고 상동성이지만 잘린 유전자들 사이의 플라스미드 상 재조합을 달성하기 위한 생체 내 위치 특이적 재조합 계가 이용되었다. 돌연변이 유발은 또한 중첩 연장 및 PCR에 의해 보고되었다.
비 랜덤 방법이 더 많은 점 돌연변이 및/또는 키메라화를 달성하기 위해 사용되고 있으며, 예를 들어 주형 분자에서의 특이적 구조 군(예를 들어 특이적 단일 아미노산 위치 또는 2개 이상의 아미노산 위치로 이루어지는 서열)에 작용성을 부여하고, 돌연변이의 특이적 군을 분류 및 비교하기 위해, 돌연변이의 특정 군 내에서 모든 분자 종을 제조하기 위해 포괄적 또는 총망라한 접근법이 사용되고 있다.
야생형 단백질로부터 돌연변이 폴리펩티드의 새로운 군집(라이브러리)을 제조하기 위해 진화의 상기 방법 및 다른 방법 중 임의의 방법이 본 발명에 사용될 수 있다.
진화된 분자의 발현
진화 단계로부터 제조된 돌연변이 폴리뉴클레오티드는 공개된 프로토콜에 따라서 아가로스 겔 상에 크기별로 분획화되어, 발현 벡터에 삽입된 다음, 적절한 숙주 세포 내에 형질감염됨으로써 돌연변이 폴리펩티드를 생산할 수 있거나(발현) 그러할 수 없다. 발현은 통상적인 분자 생물학적 기술을 사용할 수 있다. 그러므로 발현 단계는 다양한 공지의 방법들을 이용할 수 있다.
예를 들어 간략하게, 진화 단계로부터 제조된 돌연변이 폴리뉴클레오티드는 이후 표준 분자 생물학적 기술을 사용하여 분해되어 플라스미드 DNA와 같은 벡터 DNA에 결찰된다. 벡터는 표준 프로토콜을 사용하여 박테리아 또는 다른 세포를 형질전환한다. 이는 고 처리량 발현 및 스크리닝을 위해 96-웰 트레이와 같은 다중 웰 트레이의 개별적 웰에서 수행될 수 있다. 과정은 각각의 돌연변이 폴리뉴클레오티드에 대해 반복된다.
기술된 바와 같이 선택되고 단리된 폴리뉴클레오티드는 적합한 숙주 세포 내로 도입된다. 적합한 숙주 세포는 재조합 및/또는 환원 재편성을 촉진할 수 있는 임의의 세포이다. 선택된 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 적절한 제어 서열을 포함하는 벡터 내에 이미 존재한다. 숙주 세포는 포유동물 세포와 같은 고등 진핵생물 세포, 또는 효모 세포와 같은 하등 진핵생물 세포일 수 있거나, 바람직하게 숙주 세포는 박테리아 세포와 같은 원핵생물 세포일 수 있다. 숙주 세포 내로의 구성물의 도입은 칼슘 인산염 형질감염, DEAE-덱스트란 매개 형질감염 또는 전기천공(예를 들어 Ecker and Davis, 1986, Inhibition of gene expression in plant cells by expression of antisense RNA, Proc Natl Acad Sci USA, 83: 5372-5376)에 의해 수행될 수 있다.
사용될 수 있는 발현 벡터의 대표적인 예로는, 바이러스 입자, 바큘로바이러스, 파지, 플라스미드, 파지미드, 코스미드, 포스미드, 박테리아 인공 염색체, 바이러스 DNA(예를 들어 백시니아, 아데노바이러스, 계두 바이러스, 가상 광견병 바이러스, 및 SV40의 유도체), P1 기반 인공 염색체, 효모 플라스미드, 효모 인공 염색체, 및 관심 있는 특정 숙주에 대해 특이적인 임의의 다른 벡터(예를 들어 바실러스, 아스퍼질러스 및 효모)가 예시될 수 있다. 따라서, 예를 들어 DNA는 폴리펩티드를 발현시키기 위한 다양한 발현 벡터 중 임의의 하나에 포함될 수 있다. 이러한 벡터는 염색체, 비 염색체 및 합성 DNA 서열을 포함한다. 많은 수의 적합한 벡터가 당업자에게 공지되어 있으며, 시판되고 있다. 예를 들어 하기의 벡터가 제공된다: Bacterial: pQE 벡터(Qiagen), pBluescript 플라스미드, pNH 벡터, 람다-ZAP 벡터(Stratagene); ptrc99a, pKK223-3, pDR540, pRIT2T(Pharmacia); 진핵생물: pXT1, pSG5(Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, pSVLSV40(Pharmacia). 그러나, 임의의 다른 플라스미드 또는 다른 벡터도, 이러한 것들이 숙주에서 복제되거나 생존할 수 있는 한 사용될 수 있다. 적은 복사체 수 또는 많은 복사체 수 벡터가 본 발명에 사용될 수 있다.
발현 벡터 중의 돌연변이 폴리뉴클레오티드 서열은 적절한 발현 제어 서열(들)(프로모터)에 작동 가능하도록 결합하여 RNA 합성을 유도한다. 구체적으로 명명된 박테리아 프로모터는 lad, lacZ, T3, T7, gpt, 람다 PR, PL 및 trp를 포함한다. 진핵생물 프로모터는 급 초기 CMV, HSV 티미딘 키나아제, 초기 및 후기 SV40, 레트로바이러스 유래 LTR, 및 마우스 메탈로티오네인-1을 포함한다. 적절한 벡터 및 프로모터의 선택은 널리 당업자의 수준 내에 있다. 발현 벡터는 또한 번역 개시를 위한 리보솜 결합 위치 및 전사 종결인자를 포함한다. 벡터는 또한 증폭 발현에 적절한 서열을 포함할 수 있다. 프로모터 영역은 클로람페니콜 전이효소(CAT) 벡터 또는 선별 마커를 갖는 다른 벡터를 사용하여 임의의 요망되는 유전자로부터 선택될 수 있다. 그 외에, 발현 벡터는 바람직하게는 진핵생물 세포 배양에 대한 디히드로폴레이트 환원 효소 또는 네오마이신 내성 또는 이.콜라이 내 테트라시클린 또는 암피실린 내성과 같은, 형질전환된 숙주 세포의 선택을 위한 표현형 형질을 제공하는 하나 이상의 선별 마커 유전자를 함유한다.
진핵생물 DNA 전사는 인핸서 서열이 발현 벡터에 삽입됨으로써 증가할 수 있다. 인핸서는 프로모터에 의한 전사를 증가시키는 10 bp 내지 300 bp의 시스-작용성 서열이다. 인핸서는 전사 단위에 대해 5' 또는 3' 중 어느 하나의 방향에 있을 때 효과적으로 전사를 증가시킬 수 있다. 인핸서는 또한 인트론 내부 또는 암호화 서열 자체의 내부에 위치하면 효과적이기도 하다. 통상적으로 바이러스 인핸서, 예를 들어 SV40 인핸서, 거대세포바이러스 인핸서, 폴리오마 인핸서 및 아데노바이러스 인핸서가 사용된다. 포유동물 계로부터 유래하는 인핸서 서열, 예를 들어 마우스 면역글로불린 중쇄 인핸서도 또한 통상적으로 사용된다.
포유동물 발현 벡터 계는 또한 통상 선별성 마커 유전자를 포함한다. 적합한 마커의 예들은 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR) 유전자, 티미딘 키나아제 유전자(TK), 또는 약물 내성을 부여하는 원핵생물 유전자를 포함한다. 처음 2개의 마커 유전자는 티미딘이 성장 배지에 첨가되지 않았을 때 성장하는 능력을 잃는 돌연변이 세포주의 사용을 선호한다. 이후, 형질전환된 세포는 이 세포가 비 보충 배지 상에서 성장하는 능력에 의해 동정될 수 있다. 마커로서 유용한 원핵생물 약물 내성 유전자의 예들은 G418, 마이코페놀산 및 하이그로마이신에 대한 내성을 부여하는 유전자를 포함한다.
관심 있는 DNA 분절을 함유하는 발현 벡터는, 세포 생산 숙주의 유형에 따라서 널리 공지된 방법에 의해 숙주 세포로 운반될 수 있다. 예를 들어 칼슘 염화물 형질감염은 통상적으로 원핵생물 숙주 세포에 대해 사용되는 반면에, 칼슘 인산염 처리법, 리포팩션 또는 전기천공법은 진핵생물 숙주 세포에 대해 사용될 수 있다. 포유동물 세포 생산 숙주를 형질전환하기 위해 사용되는 다른 방법은 폴리브렌을 사용하는 방법, 원형질체 융합법, 리포좀을 사용하는 방법, 전기천공법 및 미세주입법을 포함한다[일반적으로 문헌(Sambrook et al, 상동) 참조].
일단 발현 벡터가 적절한 숙주에 도입되면, 이 숙주는 도입된 돌연변이 폴리뉴클레오티드 서열들의 높은 발현 수준에 적합한 조건 하에 유지되고, 그 결과 돌연변이 폴리펩티드가 생산된다. 이러한 발현 벡터는 통상적으로 숙주 유기체 내에서 에피좀 또는 숙주 염색체 DNA의 필수적인 부분으로서 복제 가능하다. 통상적으로 발현 벡터는 선별 마커, 예를 들어 테트라사이클린 또는 네오마이신을 함유하므로, 원하는 DNA 서열로 형질전환된 세포의 검출이 가능할 것이다(예를 들어 본원에 참고문헌으로 인용된 미국 특허 제4,704,362호 참조).
따라서, 본 발명의 다른 양상에서, 돌연변이 폴리뉴클레오티드는 환원 재편성 방법에 의해 제조될 수 있다. 이 방법은, 연속 서열(원래의 암호화 서열)을 함유하는 구성물들의 제조, 이것들의 적절한 벡터 내로의 삽입, 및 이것들의 적절한 숙주 세포 내로의 후속 도입을 수반한다. 개별적 분자 동일성의 재편성은 상동성 영역을 소유하는 구성물 중 연속 서열 사이에서, 또는 유사 반복 단위 사이에서 조합식 방법에 의해 일어난다. 재편성 방법은 반복된 서열의 복잡성 및 범주를 재조합 및/또는 감소시키고, 신규 분자 종의 제조를 초래한다. 재편성의 속도를 증가시키기 위해 다양한 처리가 적용될 수 있다. 처리는 자외선 또는 DNA 피해 화학물질에 의한 처리 및/또는 "유전적 불안정성"의 수준 증가를 나타내는 숙주 세포주의 사용을 포함할 수 있다. 따라서, 재편성 방법은 유사 반복 서열의 상동성 재조합 또는 자연 특성을 수반하여 이 서열 자체의 진화를 유도할 수 있다.
세포가 번식되고 나서, "환원 재편성"이 수행된다. 환원 재편성 방법의 속도는, 요망된다면 생체 내 재편성이, 박테리아에서 일반적으로 "RecA-의존성" 현상인 것으로 간주되는 "재조합"으로 총칭되는 "분자 간" 과정에 초점을 둘 때, DNA 피해의 도입으로 가속화될 수 있다. 본 발명은 서열을 재조합 및 재편성하기 위한 숙주 세포의 재조합 과정, 결실에 의해 세포에서 유사 반복 서열의 복잡성을 감소시키기 위한 환원성 과정을 매개하는 세포의 능력에 의존할 수 있다. "환원 재편성"의 상기 방법은 "분자 내" RecA-비의존성 방법에 의해 일어난다. 최종 결과는 분자의 가능한 모든 조합으로의 재편성이다.
한 가지 양상에서, 숙주 유기체 또는 세포는 그람음성 박테리아, 그람양성 박테리아 또는 진핵생물 유기체를 포함한다. 본 발명의 다른 양상에서, 그람음성 박테리아는 에스테리치아 콜라이(Escherichia coli) 또는 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescence)를 포함한다. 본 발명의 다른 양상에서, 그람양성 박테리아는, 스트렙토마이세스 디베르사(Streptomyces diversa), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis), 락토코커스 크레모리스(Lactoccocus cremoris) 또는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)를 포함한다. 본 발명의 또 다른 양상에서, 진핵생물 유기체는, 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 한세눌라 플리모르파(Hansenula plymorpha) 또는 아스퍼질러스 나이저(Aspergillus niger)를 포함한다. 적절한 숙주의 대표적인 예로, 이.콜라이, 스트렙토마이세스, 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium)과 같은 박테리아 세포; 효모와 같은 진균 세포; 드로소필라 S2(Drosophila S2) 및 스포돕테라 Sf9(Spodoptera Sf9)와 같은 곤충 세포; CHO, COS 또는 보우스 흑색종과 같은 동물 세포; 아데노바이러스; 및 식물 세포가 예시될 수 있다. 적절한 숙주의 선택은 본원의 교시로부터 당업자의 범위 내에 있는 것으로 간주된다.
진핵생물 미생물, 예를 들어 효모 이외에, 포유동물 조직 세포 배양액도 또한 본 발명의 돌연변이 폴리펩티드를 발현시키기 위해 사용될 수 있다[예를 들어 본원에 참고문헌으로 인용되어 있는 문헌(Winnacker, "From Genes to Clones," VCH Publishers, N.Y., N.Y. (1987)) 참조]. 비 변형 면역글로불린을 분비할 수 있는 다수의 적합한 숙주 세포주가 당 업계에서 개발되었기 때문에, 진핵생물 세포가 바람직하고, 그 예로서는 CHO 세포주, 다양한 COS 세포주, HeLa 세포, 골수종 세포주, B 세포 또는 하이브리도마를 포함한다. 이와 같은 세포용 발현 벡터는 발현 제어 서열, 예를 들어 복제 기원, 프로모터, 인핸서(Queen et al, Immunol. Rev., vol. 89, page 49, 1986), 그리고 필요한 가공 정보 위치, 예를 들어 리보좀 결합 위치, RNA 스플라이싱 위치, 폴리아데닐화 위치 및 전사 종결 인자 서열을 포함할 수 있다. 바람직한 발현 제어 서열은 면역글로불린 유전자, 거대세포바이러스, SV40, 아데노바이러스 및 소 유두종 바이러스 등으로부터 유래하는 프로모터이다.
하나의 구현예에서, 진핵생물 세포 숙주 세포는 CHO, HEK293, IM9, DS-1, THP-1, Hep G2, COS, NIH 3T3, C33a, A549, A375, SK-MEL-28, DU 145, PC-3, HCT 1 16, Mia PACA-2, ACHN, Jurkat, MM1, Ovcar 3, HT 1080, Panc-1, U266, 769P, BT-474, Caco-2, HCC 1954, MDA-MB-468, LnCAP, NRK-49F 및 SP2/0 세포주; 및 마우스 비장세포 및 토끼 PBMC로부터 선택된다. 하나의 양상에서, 포유동물 숙주세포는 CHO 또는 HEK293 세포주로부터 선택된다. 하나의 특정 양상에서, 포유동물 숙주세포는 CHO-S 세포주이다. 또 다른 특정 양상에서, 포유동물 계는 HEK293 세포주이다. 또 다른 구현예에서, 진핵생물 세포 숙주는 효모 세포 계이다. 하나의 양상에서, 진핵생물 세포 숙주는 에스.세레비지아에 효모 세포 또는 피치아 효모 세포로부터 선택된다.
다른 구현예에서, 포유동물 숙주 세포는 계약 연구 또는 주문 생산 대행 기업에 의해 상업적으로 제조될 수 있다. 예를 들어 재조합 항체 또는 기타 단백질의 경우 Lonza사(Lonza Group Ltd, Basel, Switzerland)는 CHOK1SV 또는 NS0 세포 생산 숙주 중 어느 하나와 함께 GS Gene Expression System™ 기술을 사용하여 이와 같은 생산물을 발현하기 위한 벡터를 제조할 수 있다. 관심있는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 숙주 세포는 프로모터 활성화, 형질전환체 선택 또는 유전자 증폭에 적절하게 개질된 종래의 영양 배지 중에서 배양될 수 있다. 배양 조건, 예를 들어 온도 및 pH 등은 발현을 위해 선택된 숙주 세포에 이전에 적용된 조건으로서, 통상의 숙련자에게 명백할 것이다.
전술된 바와 같이, 조건부 활성 ASTR에 대한 발현 최적화는, 사용된 벡터(벡터 구성성분, 예를 들어 프로모터, 스플라이싱 위치들, 5' 및 3' 말단부 및 측접 서열들)의 최적화, 유전자 결실을 감소시키기 위한 숙주 세포의 유전자 변형 및 재정렬, 관련 유전자를 진화하는 생체 내 또는 시험관 내 방법에 의한 숙주 세포 유전자 활성의 진화, 관련 유전자의 진화에 의한 숙주 글리코실화 효소의 최적화, 및/또는 염색체 전체에 걸친 숙주 세포 돌연변이 유발 및 증강된 발현 능을 가지는 세포를 선택하기 위한 선택 전략에 의해 달성될 수 있다.
단백질 발현은 다양한 공지의 방법에 의해 유도될 수 있으며, 다수의 유전적 계가 단백질 발현의 유도용으로서 공개되어 있다. 예를 들어 적절한 계가 사용될 때, 유도제의 추가는 단백질 발현을 유도할 것이다. 이후 세포는 원심분리에 의해 펠릿화되고, 상청액이 제거된다. 주변세포질 단백질은, DNAse, RNAse 및 리소자임과 함께 세포가 항온처리될 때 증량될 수 있다. 원심분리 후, 새로운 단백질을 함유하는 상청액은 새로운 다중 웰 트레이로 운반되어 보관되었다가 검정된다.
세포는 통상적으로 원심분리에 의해 수확되고, 물리적 또는 화학적 수단에 의해 파괴되며, 생성된 미정제 추출물은 추가의 정제를 위해 머무르게 된다. 단백질의 발현을 위해 사용되는 미생물 세포는 동결-해동 순환, 초음파 처리, 기계적 파괴, 또는 세포 용해제의 사용을 포함하는 임의의 통상적 방법에 의해 파괴될 수 있다. 이러한 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 발현된 폴리펩티드 또는 이의 단편은, 황산암모늄 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로오스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피, 및 렉틴 크로마토그래피를 포함하는 방법에 의해 재조합 세포 배양액으로부터 회수되고 정제될 수 있다. 단백질 리폴딩(protein refolding) 단계는 필요에 따라 폴리펩티드의 입체구조를 형성완료하는데에 사용될 수 있다. 요망된다면, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)가 최종 정제 단계를 위해 사용될 수 있다. 조건부 활성 ASTR의 스크리닝은 편리한 고 처리량 스크리닝 또는 선택 방법의 이용 가능성에 의해 도움을 받을 수 있다. 세포 표면 전시 발현 및 스크리닝 기술(예를 들어 상기 정의된 바와 같은 기술)은 조건부 활성 ASTR에 대해 돌연변이 단백질을 스크리닝하기 위해 사용될 수 있다.
가역성 또는 비가역성 돌연변이체를 동정하기 위한 돌연변이체의 스크리닝
원하는 분자를 동정하는 것은 허용 조건 및 야생형 조건에서 단백질 활성을 측정함으로써 가장 직접 달성된다. 활성의 가장 큰 비(허용/야생형)를 갖는 돌연변이체가 선택될 수 있으며, 점 돌연변이의 순열이 표준방법을 사용하여 개별 돌연변이들을 조합함으로써 얻어진다. 그 다음, 조합된 순열 단백질 라이브러리는 허용 조건과 야생형 조건 사이에서 가장 큰 차등적 활성을 나타내는 단백질에 대해 스크리닝된다.
상청액의 활성은 다양한 방법, 예를 들어 형광 검정과 같은 고 처리량 활성 검정을 사용하여 스크리닝될 수 있고, 그 결과 원하던 특징(온도, pH등)이 무엇이든간에 그 특징에 감수성인 단백질 돌연변이체가 동정될 수 있다. 예를 들어 일시적으로 감수성인 돌연변이체를 스크리닝하기 위해, 각각의 개별 돌연변이체의 효소 또는 항체 활성은 시판용 기질을 사용하여 더 낮은 온도(예를 들어 25℃)와 원래의 단백질이 작용하는 온도(예를 들어 37℃)에서 측정된다. 스크리닝은 다양한 배지, 무엇보다도 혈청 및 BSA 중에서 수행될 수 있다. 반응은 처음에 96-웰 검정과 같은 다중 웰 검정 방식으로 수행될 수 있고, 14㎖들이 튜브 방식과 같은 상이한 방식을 사용하여 확인될 수 있다.
한 가지 양상에서, 방법은 조건부 생체 활성에 대해 후보를 시험하기 전에 핵산 또는 폴리펩티드 중 적어도 하나를 변형하는 단계를 더 포함한다. 또 다른 양상에서, 단계 (c)의 시험은, 숙주 세포 또는 숙주 유기체에서 폴리펩티드의 개선된 발현에 대해 시험하는 것을 더 포함한다. 추가 양상에서, 단계 (c)의 시험은, pH 약 3 내지 pH 약 12의 pH 범위 내에서 효소 활성에 대해 시험하는 것을 더 포함한다. 추가 양상에서, 단계 (c)의 시험은, pH 약 5 내지 pH 약 10의 pH 범위 내에서 효소 활성에 대해 시험하는 것을 더 포함한다. 추가 양상에서, 단계 (c)의 시험은, pH 약 6 내지 pH 약 8의 pH 범위 내에서 효소 활성에 대해 시험하는 것을 더 포함한다. 추가 양상에서, 단계 (c)의 시험은, pH 6.7 및 pH 7.5에서 효소 활성에 대해 시험하는 것을 더 포함한다. 또 다른 양상에서, 단계 (c)의 시험은, 약 4℃ 내지 약 55℃의 온도 범위에서 효소 활성에 대해 시험하는 것을 더 포함한다. 또 다른 양상에서, 단계 (c)의 시험은, 약 15℃ 내지 약 47℃의 온도 범위 내에서 효소 활성에 대해 시험하는 것을 더 포함한다. 또 다른 양상에서, 단계 (c)의 시험은, 약 20℃ 내지 약 40℃의 온도 범위에서 효소 활성에 대해 시험하는 것을 더 포함한다. 또 다른 양상에서, 단계 (c)의 시험은, 25℃ 및 37℃의 온도에서 효소 활성에 대해 시험하는 것을 더 포함한다. 또 다른 양상에서, 단계 (c)의 시험은, 정상 삼투압 및 비정상(포지티브 또는 네거티브) 삼투압 하에서 효소 활성에 대해 시험하는 것을 더 포함한다. 또 다른 양상에서, 단계 (c)의 시험은, 정상 전해질 농도 및 비정상(포지티브 또는 네거티브) 전해질 농도 하에서 효소 활성에 대해 시험하는 것을 더 포함한다. 시험될 전해질 농도는, 칼슘, 나트륨, 칼륨, 마그네슘, 염화물, 중탄산염 및 인산염 농도 중 하나로부터 선택된다. 또 다른 양상에서, 단계 (c)의 시험은, 안정화된 반응 생성물을 초래하는 효소 활성에 대해 시험하는 것을 더 포함한다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 효소 활성을 갖는 본 발명의 폴리펩티드 또는 이의 단편에 특이적으로 결합되는 정제된 항체를 제공한다. 하나의 양상에서, 본 발명은 효소 활성을 갖는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체의 단편을 제공한다.
항체 및 항체 기반 스크리닝 방법
본 발명은 본 발명의 효소에 특이적으로 결합되는 단리 또는 재조합 항체를 제공한다. 이들 항체는 본 발명의 효소 또는 관련된 폴리펩티드를 단리, 동정 또는 정량화하기 위해 사용될 수 있다. 이들 항체는 본 발명의 범위 내에 있는 다른 폴리펩티드 또는 다른 관련된 효소를 단리하기 위해 사용될 수 있다. 항체는 효소의 활성 위치에 결합되도록 디자인될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 항체를 사용하여 효소를 억제하는 방법을 제공한다.
항체는 면역침전, 염색 및 면역친화성 컬럼 등에 사용될 수 있다. 요망된다면 특이 항원을 암호화하는 핵산 서열은 면역화 후, 폴리펩티드 또는 핵산의 단리, 증폭 또는 클로닝, 그리고 본 발명의 어레이로의 폴리펩티드의 부동화에 의해 제조될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 방법은 변형될 세포에 의해 제조되는 항체의 구조를 변형하기 위해 사용될 수 있으며, 예를 들어 항체의 친화성은 증가되거나 감소될 수 있다. 더욱이, 항체를 제조 또는 변형하는 능력은 본 발명의 방법에 의해 세포에 조작되어 도입되는 표현형일 수 있다.
(폴리클로날 및 모노클로날) 항체를 면역화, 제조 및 단리하는 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 과학 문헌 및 특허 문헌에 기술되어 있다 (참조예: Coligan, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY (1991); Stites (eds.) BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY (7th ed.) Lange Medical Publications, Los Altos, Calif. ("Stites"); Goding, MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND PRACTICE (2d ed.) Academic Press, New York, N. Y. (1986); Kohler (1975) "Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity", Nature 256:495; Harlow (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Publications, New York). 항체는 또한 동물을 사용하는 통상적 생체 내 방법 이외에, 예를 들어 재조합 항체 결합 위치 발현 파지 라이브러리를 사용하여 시험관 내에서 제조될 수 있다. 예를 들어 문헌[Hoogenboom (1997) "Designing and optimizing library selection strategies for generating high-affinity antibodies", Trends Biotechnol. 15:62-70; and Katz (1997) "Structural and mechanistic determinants of affinity and specificity of ligands discovered or engineered by phage display", Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26:27-45]을 참조하시오.
폴리펩티드 또는 펩티드는 본 발명의 폴리펩티드, 예를 들어 효소에 특이적으로 결합되는 항체를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 제조된 항체는 면역친화성 크로마토그래피 방법에 사용되어, 폴리펩티드를 단리 또는 정제하거나, 폴리펩티드가 생체 샘플 중에 존재하는 지를 확인할 수 있다. 이러한 방법에서, 추출물과 같은 단백질 제조물 또는 생체 샘플은 본 발명의 폴리펩티드들 중 하나에 특이적으로 결합될 수 있는 항체와 접촉한다.
면역친화성 방법에서, 항체는 비드 또는 기타 컬럼 매트릭스와 같은 고형 지지체에 결합된다. 단백질 제조물은 항체가 본 발명의 폴리펩티드들 중 하나에 특이적으로 결합되는 조건하에 항체와 접촉하게 된다. 비 특이적 결합 단백질을 제거하기 위한 세정 후에, 특이적으로 결합되었던 폴리펩티드는 용리된다.
생체 샘플 중의 단백질이 항체에 결합하는 능력은 당업자에게 익숙한 다수의 방법들 중 임의의 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 예를 들어 결합은 형광제, 효소 표지 또는 방사성 동위 원소와 같은 검출가능 표지로 항체를 표지함으로써 측정될 수 있다. 대안적으로, 샘플에의 항체 결합은, 이러한 검출가능 표지를 그 위에 가지는 이차 항체를 사용하여 확인될 수 있다. 구체적 검정으로서는 ELISA 검정, 샌드위치 검정, 방사면역검정 및 웨스턴 블럿팅을 포함한다.
본 발명의 폴리펩티드에 대해 생성된 폴리클로날 항체는 폴리펩티드를 동물에 직접 주사하거나, 또는 폴리펩티드를 인간 이외의 동물에 투여함으로써 얻어질 수 있다. 그 다음, 이렇게 얻어진 항체는 폴리펩티드 자체와 결합할 것이다. 상기 방식으로, 폴리펩티드의 단편만을 암호화하는 서열조차도 전체가 원산인 폴리펩티드에 결합될 수 있는 항체를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 그 다음, 이러한 항체는 상기 폴리펩티드를 발현시키는 세포로부터 폴리펩티드를 단리하기 위해 사용될 수 있다.
모노클로날 항체의 제조를 위해, 연속 세포주 배양액에 의해 제조되는 항체를 제공하는 임의의 기술이 사용될 수 있다. 그 예로서는, 하이브리도마 기술, 트리오마 기술, 인간 B-세포 하이브리도마 기술, 그리고 EBV-하이브리도마 기술을 포함한다[예를 들어 문헌(Cole (1985), Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96) 참조].
단일 사슬 항체의 제조를 위해 설명된 기술[예를 들어 미국 특허 제 4,946,778호 참조]은 본 발명의 폴리펩티드에 대한 단일 사슬 항체를 제조하도록 적응될 수 있다. 대안적으로, 유전자이식 마우스는 이들 폴리펩티드 또는 이의 단편에 대한 인간화 항체를 발현시키기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드에 대해 생성되는 항체는 다른 유기체 및 샘플로부터 유사한 폴리펩티드(예를 들어 효소)를 스크리닝하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 기술에서, 유기체로부터 유래한 폴리펩티드는 항체와 접촉하고, 항체에 특이적으로 결합되는 이들 폴리펩티드가 검출된다. 상기 기술된 방법들 중 임의의 방법이 항체 결합을 검출하기 위해 사용될 수 있다.
스크리닝 방법 및 "온라인" 모니터링 장치
본 발명의 방법을 실시하는 경우, 본 발명의 폴리펩티드 및 핵산과 함께, 예를 들어 효소 활성에 대해 폴리펩티드를 스크리닝하고, 본 발명의 폴리펩티드에 결합되는 항체에 대해, 그리고 본 발명의 핵산에 잡종화되는 핵산에 대해, 효소 활성의 잠재적 조정제, 예를 들어 활성 인자 또는 억제인자로서의 화합물을 스크리닝하고, 본 발명의 폴리펩티드를 발현시키는 세포를 스크리닝하기 위하는 등 다양한 장치 및 방법이 사용될 수 있다.
어레이 또는 "바이오칩"
본 발명의 핵산 또는 폴리펩티드는 하나의 어레이에 부동화되거나, 적용될 수 있다. 어레이는 본 발명의 핵산 또는 폴리펩티드에 결합하는 능력 또는 이의 활성을 조정하기 위한 능력에 대해 조성물의 라이브러리(예를 들어 소 분자, 항체, 핵산 등)를 스크리닝 또는 모니터링하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어 본 발명의 하나의 양상에서, 모니터링되는 매개변수는 효소 유전자의 전사물 발현이다. 세포의 전사물들 중 하나 이상 또는 전부는 어레이 또는 "바이오칩" 상에 부동화된 핵산에의 잡종화에 의해, 세포의 전사물 또는 세포의 전사물을 대표하거나 이에 상보적인 핵산을 포함하는 샘플의 잡종화에 의해 측정될 수 있다. 마이크로칩 상에서 핵산의 "어레이"를 사용함으로써, 세포 전사물의 일부 또는 전부는 동시에 정량화될 수 있다. 대안적으로, 게놈 핵산을 포함하는 어레이는 또한 본 발명의 방법에 의해 제조된, 새로 조작된 균주의 유전자형을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 폴리펩티드 어레이는 또한 복수의 단백질을 동시에 정량화시키기 위해 사용될 수 있다. 본 발명은 "마이크로어레이" 또는 "핵산 어레이" 또는 "폴리펩티드 어레이" 또는 "항체 어레이" 또는 "바이오칩"으로도 지칭되는 임의의 공지된 "어레이" 또는 이것들의 변형예에 의해 실시될 수 있다. 어레이는 포괄적으로 복수의 "스폿" 또는 "표적 요소"로서, 각각의 표적 요소는 샘플 분자, 예를 들어 mRNA 전사물에 특이적으로 결합되기 위한 기질 표면의 한정된 구역에 부동화된, 한정된 양의 생체 분자, 예를 들어 올리고뉴클레오티드 하나 이상을 포함한다.
본 발명의 방법을 실시하는 데 있어서, 어레이를 제조하고 사용하는 임의의 공지된 어레이 및/또는 방법은, 예를 들어 하기 문헌에 기술된 바와 같이 전체적으로나 부분적으로, 또는 변형예로서 통합될 수 있다: 미국 특허 제6,277,628호; 동 제6,277,489호; 동 제6,261,776호; 동 제6,258,606호; 동 제6,054,270호; 동 제6,048,695호; 동 제6,045,996호; 동 제6,022,963호; 동 제6,013,440호; 동 제5,965,452호; 동 제5,959,098호; 동 제5,856,174호; 동 제5,830,645호; 동 제5,770,456호; 동 제5,632,957호; 동 제5,556,752호; 동 제5,143,854호; 동 제5,807,522호; 동 제5,800,992호; 동 제5,744,305호; 동 제5,700,637호; 동 제5,556,752호; 동 제5,434,049호; 예를 들어 WO 99/51773; WO 99/09217; WO 97/46313; WO 96/17958 참조; 예를 들어 Johnston (1998) "Gene chips: Array of hope for understanding gene regulation", Curr. Biol. 8:R171-R174; Schummer (1997) "Inexpensive Handheld Device for the Construction of High-Density Nucleic Acid Arrays", Biotechniques 23:1087-1092; Kern (1997) "Direct hybridization of large-insert genomic clones on high-density gridded cDNA filter arrays", Biotechniques 23:120-124; Solinas-Toldo (1997) "Matrix-Based Comparative Genomic Hybridization: Biochips to Screen for Genomic Imbalances", Genes, Chromosomes & Cancer 20:399-407; Bowtell (1999) "Options Available-From Start to Finish~for Obtaining Expression Data by Microarray", Nature Genetics Supp. 21:25-32. 공개 미국 특허 출원 제20010018642호; 동 제20010019827호; 동 제20010016322호; 동 제20010014449호; 동 제20010014448호; 동 제20010012537호; 동 제20010008765호도 참조하시오.
모세관 어레이
GIGAMATRIXTM(Diversa Corporation, San Diego, Calif.)와 같은 모세관 어레이가 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 본 발명의 핵산 또는 폴리펩티드는 모세관 어레이를 포함하는 어레이에 대해 부동화되거나 적용될 수 있다. 어레이는, 이것이 본 발명의 핵산 또는 폴리펩티드에 결합되거나 이의 활성을 조정하는 능력에 대해 조성물의 라이브러리(예를 들어 소 분자, 항체, 핵산 등)를 스크리닝하거나 모니터링하기 위해 사용될 수 있다. 모세관 어레이는 샘플을 보유하고 스크리닝하기 위한 또 다른 시스템을 제공한다. 예를 들어 샘플 스크리닝 장치는 인접 모세관의 어레이로 형성되는 복수의 모세관을 포함할 수 있으며, 각각의 모세관은 샘플을 담기 위한 루멘을 정의하는 적어도 하나의 벽을 포함한다. 장치는 어레이 중의 인접 모세관들 사이에 배치된 틈새 재료와, 이 틈새 재료 내에 형성된 기준 표지 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 모세관이 모세관들의 어레이에서 결합되도록 적응된 샘플 스크리닝용 모세관은 샘플을 담기 위한 루멘을 정의하는 제1 벽과, 샘플을 여기하기 위해 루멘에 제공된 여기 에너지를 여과시키기 위한 여과 재료로 형성된 제2 벽을 포함할 수 있다. 폴리펩티드 또는 핵산, 예를 들어 리간드는 제1 성분에 도입되어 모세관 어레이의 모세관 최소 부분 내에 도입될 수 있다. 모세관 어레이의 각각의 모세관은 제1 성분을 담기 위한 루멘을 정의하는, 적어도 하나의 벽을 포함할 수 있다. 제1 성분 뒤 모세관 내로 기포가 도입될 수 있다. 제2 성분이 모세관 내로 도입될 수 있는데, 이때 제2 성분은 기포에 의해 제1 성분과 분리된다. 관심 있는 샘플은 모세관 어레이의 모세관 내로 검출성 입자로 표지된 제1 액체로서 도입될 수 있으며, 여기서 모세관 어레이를 이루는 각각의 모세관은 제1 액체 및 검출성 입자를 담기 위한 루멘을 정의하는 적어도 하나의 벽을 포함하고, 이 경우 적어도 하나의 벽은 적어도 하나의 벽에 검출성 입자를 결합시키기 위해 결합 재료로 코팅된다. 이 방법은 제1 액체를 모세관 튜브로부터 제거하는 단계[이때, 결합된 검출성 입자는 모세관 내에 머무름], 그리고 제2 액체를 모세관 튜브 내로 도입시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 모세관 어레이는 루멘을 정의하는 적어도 하나의 외부 벽을 포함하는 개별 모세관을 다수 개 포함할 수 있다. 모세관의 외부 벽은 함께 융합된 하나 이상의 벽일 수 있다. 유사하게, 벽이 액체 또는 샘플을 담기 위한 루멘을 형성하는 한, 이 벽은 원통형, 정사각형, 육각형 또는 임의의 다른 기하학적 형태를 가지는 루멘을 정의할 수 있다. 모세관 어레이의 모세관들은 서로 근위에 모여 배치되어 평면 구조를 이룰 수 있다. 모세관들은 융합되거나 (예를 들어 모세관이 유리로 제조된 경우), 접착되거나, 결합되거나, 나란히 물림으로써 서로 결합될 수 있다. 모세관 어레이는 임의의 수의 개별 모세관, 예를 들어 100개 내지 4,000,000개의 모세관으로 이루어질 수 있다. 모세관 어레이는 약 100,000개 이상의 개별 모세관들이 함께 결합되어 이루어진 미세적정 플레이트를 형성할 수 있다.
조건부 활성 항체의 조작
조건부 활성 항체는 조작되어 다중 특이적 조건부 활성 항체로 제조될 수 있다. 본원에 전체가 참고문헌으로 인용되어 있는 WO 2013/170168에 기술된 바와 같이, 다중 특이적 항체는 다중 에피토프 특이성을 가지는 항체일 수 있다. 다중 특이적 항체는 중쇄 가변 도메인(VH) 및 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함하는 항체[여기서, VHVL 유닛은 다중 에피토프 특이성을 가짐], 2개 이상의 VH 및 VL 도메인을 가지는 항체[여기서, 각각의 VHVL 유닛은 상이한 에피토프에 결합함], 2개 이상의 단일 가변 도메인을 가지는 항체[여기서, 각각의 단일 가변 도메인은 상이한 에피토프와 결합함], 그리고 하나 이상의 항체 단편을 포함하는 항체뿐만 아니라, 공유 결합 또는 비 공유 결합된 항체 단편들을 포함하는 항체를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
이중 특이적 항체를 비롯하여 다중 특이적 항체를 구성하기 위해서 적어도 하나의 유리 설프히드릴기를 가지는 항체 단편들이 제조된다. 항체 단편은 전장 조건부 활성 항체로부터 제조될 수 있다. 조건부 활성 항체는 효소에 의해 분해될 수 있으며, 그 결과 항체 단편들이 제조된다. 예시적 효소 절단 방법으로서는, 펩신, 파페인 및 Lys-C 사용 방법을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예시적 항체 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 다이아바디(Db); 탠덤 다이아바디(taDb), 선형 항체(미국 특허 제5,641,870호, 실시예 2; Zapata et al., Protein Eng., vol. 8, pages 1057-1062 (1995) 참조); 한팔 항체(one-armed antibody), 단일 가변 도메인 항체, 미니바디(Olafsen et al (2004) Protein Eng. Design & Sel., vol. 17, pages 315-323), 단일 사슬 항체 분자, Fab 발현 라이브러리에 의해 생산된 단편, 항유전자형(항 Id) 항체, 상보성 결정 영역(CDR) 및 에피토프 결합 단편을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 항체 단편은 또한 DNA 재조합 기술을 사용하여 제조될 수도 있다. 항체 단편을 암호화하는 DNA는 플라스미드 발현 벡터 또는 파지미드 벡터에 클로닝되어, 이.콜라이 내에서 직접 발현될 수 있다. 항체 효소 분해 방법, DNA 클로닝 및 재조합 단백질 발현 방법은 당 업자들에게 널리 공지되어 있다.
항체 단편은 통상의 기술을 사용하여 정제될 수 있으며, 유리 티올기를 생성하도록 환원의 대상이 될 수 있다. 유리 티올기를 가지는 항체 단편은 가교제, 예를 들어 비스-말레이미드와 반응할 수 있다. 이와 같이 가교된 항체 단편은 정제된 다음, 유리 티올기를 가지는 제2의 항체 단편과 반응하게 된다. 2개의 항체 단편이 가교된 최종 생성물이 정제된다. 임의의 구현예들에서, 각각의 항체 단편은 Fab이고, 2개의 Fab가 비스-말레이미드를 통해 결합된 최종 생성물은, 본원에서 비스말레이미도-(티오-Fab)2 또는 비스-Fab라고 지칭된다. 이러한 다중 특이적 항체 및 항체 유사체, 예를 들어 비스-Fab는, 다수의 항체 단편 조합, 원산 항체의 구조 변이체 또는 특정 항체/단편 조합을 신속하게 합성하기 위해 이용될 수 있다.
다중 특이적 항체는 변형된 가교제로 합성될 수 있어서, 추가의 작용기가 다중 특이적 항체에 결합될 수 있다. 변형된 가교제는 임의의 설프히드릴-반응성 기의 결합을 허용한다. 하나의 구현예에서, N-숙신이미딜-S-아세틸티오아세테이트(SATA)는 비스-말레이미드에 결합되어, 비스-말레이미도-아세틸티오아세테이트(BMata)를 형성한다. 마스킹된 티올기가 탈보호되면, 설프히드릴 반응성(또는 티올 반응성) 기를 가지는 임의의 작용기가 다중 특이적 항체에 결합될 수 있다.
예시적 티올 반응성 시약으로서는 다 작용성 링커 시약, 포착제, 즉 친화성, 표지 시약(예를 들어 바이오틴-링커 시약), 검출 표지(예를 들어 형광단 시약), 고체상 부동화 시약(예를 들어 SEPHAROSE™, 폴리스티렌 또는 유리) 또는 약물-링커 중간체를 포함한다. 티올-반응성 시약의 일례는 N-에틸 말레이미드(NEM)이다. 이와 같이 변형된 가교제를 가지는 다중 특이적 항체 또는 항체 유사체는 약물 기 시약 또는 다른 표지와 추가로 반응할 수 있다. 다중 특이적 항체 또는 항체 유사체와 약물-링커 중간체의 반응은 각각 다중 특이적 항체-약물 접합체 또는 항체 유사체-약물 접합체를 제공한다.
다중 특이적 항체를 제조하기 위한 기타 기술들도 본 발명에 사용될 수 있다. 이와 같은 기술들을 기술하고 있는 (본원에 참고문헌으로서 인용된) 참고문헌들로서는,
(1) 상이한 특이성을 가지는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 공동 발현에 관한 문헌[Milstein and Cuello, Nature, vol. 305, page 537 (1983)), WO 93/08829, and Traunecker et al., EMBO J., vol. 10, page 3655 (1991)];
(2) "노브-인-홀(knob-in-hole)" 조작에 관한 문헌[미국 특허 제5,731,168호];
(3) 항체 Fc-이종 이량체 분자를 제조하기 위한 정전기 스티어링 효과 조작에 관한 문헌[WO 2009/089004 A1];
(4) 2개 이상의 항체 또는 단편을 가교하는 것에 관한 문헌[미국 특허 제4,676,980호, 및 Brennan et al., Science, vol. 229, page 81 (1985)];
(5) 이중 특이적 항체를 제조하기 위해 루신 지퍼를 사용하는 것에 관한 문헌[Kostelny et al., J. Immunol, vol. 148, pages 1547-1553 (1992)];
(6) 이중 특이적 항체 단편을 제조하기 위해 "다이아바디" 기술을 사용하는 것에 관한 문헌[Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 90, pages 6444-6448 (1993)];
(7) 단일 사슬 Fv(sFv) 이량체를 사용하는 것에 관한 문헌[Gruber et al., J. Immunol, vol. 152, page 5368 (1994)];
(8) 삼중 특이적 항체를 제조하는 것에 관한 문헌[Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)]; 그리고
(9) 3개 이상의 작용성 항원 결합 위치를 가지는 조작된 항체, 예를 들어 "옥토퍼스 항체(Octopus antibody)" 또는 "이중 가변 도메인 면역글로불린"(DVD)에 관한 문헌[미국 특허 공고 2006/0025576 A1 및 Wu et al. Nature Biotechnology, vol. 25, pages 1290-1297 (2007)]
를 포함한다.
본 발명의 다중 특이적 항체는 또한, 본원에 전체로서 참고문헌으로 인용된 WO 2011/109726에 기술된 바와 같이 제조될 수도 있다.
하나의 구현예에서, 혈액 뇌 장벽(BBB)을 통과하기 위한 조건부 활성 항체는 조작되어 다중 특이적 항체(예를 들어 이중 특이적 항체)로 제조된다. 이러한 다중 특이적 항체는, BBB-R과 결합되는 제1 항원 결합 위치와, 뇌 항원과 결합되는 제2 항원 결합 위치를 포함한다. 적어도 BBB-R에 대한 제1 항원 결합 위치는 조건부 활성이다. 뇌 항원은 뇌 내에서 발현되는 항원으로서, 항체나 소 분자로써 표적화될 수 있다. 이러한 항원의 예들로서는 베타-세크레타아제1(BACE1), 아밀로이드 베타(A베타), 상피 성장 인자 수용체(EGFR), 인간 상피 성장 인자 수용체 2(HER2), Tau, 아포지단백 E4(ApoE4), 알파-시누클레인, CD20, 헌팅틴, 프리온 단백질(PrP), 루신 풍부 반복 키나아제2(LRRK2), 파킨, 프레세닐린 1, 프레세닐린 2, 감마 세크레타아제, 사망 수용체 6(DR6), 아밀로이드 전구체 단백질(APP), p75 뉴로트로핀 수용체(p75NTR) 및 카스파아제 6를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 하나의 구현예에서, 항원은 BACE1이다.
BBB는, 이 BBB를 건너 거대분자가 운반되는 것을 허용하는 특이적 수용체인 BBB 수용체(BBB-R)에 의해 매개되는 내인성 운반 계를 가진다. 예를 들어 BBB-R과 결합할 수 있는 항체는 이 내인성 운반 계가 사용될 때 BBB 건너 운반될 수 있다. 이와 같은 항체는 BBB를 횡단하는 내인성 BBB 수용체 매개 운반 계가 사용됨으로써 약물 또는 기타 제제가 BBB를 건너 운반되도록 하기 위한 비이클로서 사용될 수 있다. 이러한 항체는 BBB-R에 대하여 큰 친화성을 가질 필요가 없다. 미국 특허 공고 2012/0171120(본원에 참고문헌으로서 인용됨)에 기술된 바와 같이, BBB-R에 대해 작은 친화성을 가지면서 조건부 활성 항체가 아닌 항체는 친화성이 큰 항체보다 BBB를 더욱 효율적으로 통과하는 것으로서 기술된바 있다.
항체를 조작하여 뇌에 도입되도록 만들기 위한 또 다른 방법은 중추신경계 림프관을 통해 뇌로 전달되도록 항체를 조작하는 것이다. 그러므로 항체는 림프관을 통해 중추신경계로 이동하는 면역 세포, 예를 들어 T 세포, 또는 활액막 액 또는 뇌척수액과 결합하거나 이를 모의하도록 조작될 수 있다. 중추신경계의 림프관에 관한 세부 설명은, 예를 들어 문헌(Louveau, A., et al, "Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels," Nature 523, pp. 337-341, 16 July 2015)과 이 문헌을 언급한 문헌들(본 출원의 출원일자로 공중이 이용 가능하게 된 문헌들)(이 문헌들 모두는 중추신경계 림프계와, 이 계를 이동하는 유체 및 세포에 관한 세부 설명을 제공하기 위해 본원에 그 전체로서 참고문헌으로 인용됨)에 기술되어 있다.
전통적인 항체와는 달리, 조건부 활성 항체는 BBB를 통과하여 뇌의 내부에 머무르도록 BBB-R에 대한 친화성이 높아야 한다. 조건부 활성 항체는 BBB의 혈액 쪽에 있는 BBB-R에 대해 큰 친화성을 가질 수 있으며, BBB의 뇌 쪽에 있는 BBB-R에 대해서는 작은 친화성을 갖거나 친화성을 가지지 않을 수 있다. 약물, 예를 들어 약물 접합체는 항체와 함께 BBB를 건너 뇌로 운반될 조건부 활성 항체와 커플링될 수 있다.
BBB-R은 뇌 내피 세포에 발현되는 경막 수용체 단백질로서, 혈액 뇌 장벽을 건너 분자를 운반할 수 있는 경막 수용체 단백질이다. BBB-R의 예는 트랜스페린 수용체(TfR), 인슐린 수용체, 인슐린 유사 성장 인자 수용체(IGF-R), 저 밀도 지단백 수용체, 예를 들어 저 밀도 지단백 수용체 관련 단백질 1(LRP1) 및 저 밀도 지단백 수용체 관련 단백질 8(LRP8)(이에 한정되는 것은 아님), 그리고 헤파린 결합 상피 성장 인자 유사 성장 인자(HB-EGF)를 포함한다. 본원에 있어서 예시적 BBB-R은 트랜스페린 수용체(TfR)이다. 이 TfR은, 척추동물에서 철 흡수에 관여하는, 이황화 결합된 2개의 서브유닛(이 서브유닛 각각의 겉보기 분자량은 약 90,000임)으로 이루어진 (분자량 약 180,000인) 경막 당단백질이다.
몇몇 구현예들에서, 본 발명은 BBB-R에 대하여, 모 항체 또는 야생형 항체로부터 제조된 조건부 활성 항체를 제공한다. 조건부 활성 항체는 BBB의 혈액 쪽 BBB-R에 결합되고, 이 BBB-R에 대한 친화성은 BBB의 뇌 쪽 BBB-R에 대한 모 항체 또는 야생형 항체의 친화성보다 더 작다. 기타 몇몇 구현예들에서, 조건부 활성 항체는 모 항체 또는 야생형 항체와는 달리 BBB의 혈액 쪽에 있는 BBB-R에 대하여 친화성을 가지고, BBB의 뇌 쪽에 있는 BBB-R에 대하여는 친화성을 가지지 않는다.
혈장은 뇌 세포 외액(ECF)과는 매우 상이한 체액이다. 문헌[Somjen ("Ions in the Brain: Normal Function, Seizures, and Stroke," Oxford University Press, 2004, pages 16 and 33) 및 Redzic ("Molecular biology of the blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: similarities and differences," Fluids and Barriers of the CNS, vol. 8:3, 2011)]에 논의되어 있는 바와 같이, 뇌 세포 외액은 혈장의 K+보다 유의적으로 더 적은 K+, 혈장의 Mg2 + 및 H+ 보다 더 많은 Mg2 + 및 H+를 갖는다. 혈장과 뇌 ECF 간 이온 농도 차는 이들 두 유체간 삼투압과 삼투질 농도에 유의적 차이를 가져온다. 표 1은, 혈장 및 뇌 ECF 둘 다에 공통된 이온들의 농도(밀리 몰)를 보여주고 있다.
Figure 112017023752157-pct00001
뇌 ECF는 또한 혈장보다 유의적으로 더 많은 젖산 염을 함유하고, 혈장보다 유의적으로 더 적은 글루코스를 함유한다[Abi-Saab et al., "Striking Differences in Glucose and Lactate Levels Between Brain Extracellular Fluid and Plasma in Conscious Human Subjects: Effects of Hyperglycemia and Hypoglycemia," Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism, vol. 22, pages 271-279, 2002].
그러므로 BBB의 양쪽 간에 상이한 몇 가지 생리학적 조건들, 예를 들어 pH, 다양한 물질(예를 들어 젖산 염, 글루코스, K+, Mg2 +)의 농도, 삼투압 및 삼투질 농도가 존재한다. pH의 생리학적 조건에 있어서, 인간의 혈장은 인간의 뇌 ECF보다 pH가 더 높다. K+ 농도의 생리학적 조건에 있어서, 뇌 ECF는 인간 혈장보다 K+ 농도가 더 낮다. Mg2 +농도의 생리학적 조건에 있어서, 인간 뇌 ECF는 인간 혈장보다 Mg2 +가 유의적으로 더 많다. 삼투압의 생리학적 조건에 있어서, 인간 뇌 ECF는 인간 혈장의 삼투압과 상이한 삼투압을 갖는다. 몇몇 구현예들에 있어서, 뇌 ECF의 생리학적 조건은, 일반 군집의 뇌 ECF의 생리학적 조건과 상이할 수 있는, 특정 신경 장애를 가지는 환자의 뇌 ECF의 조성, pH, 삼투압 및 삼투질 농도일 수 있다.
그러므로 본 발명은 돌연변이 DNA 라이브러리를 제조하기 위해 BBB-R에 대한 주형 항체를 암호화하는 DNA를 진화시키기 위한 방법을 제공한다. 그 다음, 돌연변이 DNA 라이브러리는 돌연변이 항체를 얻기 위해 발현된다. 돌연변이 항체는, 적어도 하나의 혈장 생리학적 조건하에 BBB-R과 결합되고, 적어도 하나의 뇌 생리학적 조건하에 주형 항체에 비해 뇌 ECF 중 BBB-R에 대한 친화성이 작거나 친화성을 가지 않는, 조건부 활성 항체에 대해 스크리닝된다. 그러므로 선택된 돌연변이 항체는, 혈장 쪽 BBB-R에 대한 친화성이 작거나 크고, 뇌 ECF 쪽 BBB-R에 대한 친화성이 작거나 친화성을 가지지 않는다. 이처럼 선택된 돌연변이 항체는 BBB를 건너 이루어지는 운반을 위한 조건부 활성 항체로서 유용하다.
이러한 조건부 활성 항체는 BBB를 통과하여 뇌 ECF 중에 머무는 것에 유리하다. 뇌 쪽에 있는 BBB-R에 대한 작은 친화성은, 조건부 활성 항체가 거꾸로 뇌로부터 BBB를 건너 운반되어 다시 혈액으로 되돌아가는 속도를, 주형 항체가 이처럼 되는 것에 비해 늦춰준다(또는 이러한 현상을 막아준다).
몇몇 다른 구현예들에서, 본 발명은, 돌연변이 DNA 라이브러리를 제조하기 위해 BBB-R에 대한 주형 항체를 암호화하는 DNA를 진화시키기 위한 방법을 제공한다. 이후 돌연변이 DNA 라이브러리는 돌연변이 항체를 얻도록 발현된다. 돌연변이 항체는 적어도 하나의 혈장 생리학적 조건하에 BBB-R에 결합되고, 적어도 하나의 뇌 생리학적 조건하에 BBB-R에 대한 친화성이 작거나 없는 조건부 활성 항체에 대해 스크리닝된다. 그러므로 선택된 돌연변이 항체는 혈장 쪽에서 BBB-R에 대한 친화성을 가지고, 뇌 ECF 쪽에서는 BBB-R에 대한 친화성이 작거나 친화성을 가지지 않는다. 이처럼 선택된 돌연변이 항체는 조건부 활성 항체이다.
이러한 조건부 활성 항체는 BBB를 통과하여 뇌 ECF 중에 머무는 것에 유리하다. 조건부 활성 항체는 혈장 쪽에 있는 BBB-R과 결합된 후 BBB를 건너 운반되고, 뇌 ECF 쪽에 있는 BBB-R에 대한 친화성은 작거나 친화성을 가지지 않는데, 이는 조건부 활성 항체가 뇌로부터 운반되어 나오는 것 같지는 않다는 것을 의미한다.
조건부 활성 항체의 BBB-R에 대한 친화성은 자체의 반 최대 억제 농도(IC50)에 의해 측정될 수 있는데, 상기 IC50은, 공지의 BBB-R 리간드가 BBB-R과 결합되는 것을 50% 까지 억제하기 위해서 얼마나 많은 항체가 필요한지에 대한 척도이다. 일반적인 접근법은 경쟁적 결합 검정, 예를 들어 경쟁적 ELISA 검정을 수행하는 것이다. TfR(BBB-R)에 대한 IC50을 측정하기 위한 예시의 경쟁적 ELISA 검정으로서는, TfR과의 결합에 대해, 증가한 농도의 항 TfR 항체가 바이오틴화된 TfRA와 경쟁시키는 검정이 있다. 항 TfR 항체 경쟁적 ELISA는, PBS 중 정제 쥣과 동물 TfR 세포 외 도메인 2.5 ㎍/㎖가 4 ℃에서 밤새도록 코팅된 Maxisorp 플레이트(Neptune, N.J.)에서 수행될 수 있다. 플레이트는 PBS/0.05% Tween 20으로 세정된 후, PBS 중 Superblock 차단 완충제(Therme Scientific, Hudson, N.H.)가 사용되어 차단된다. 각각의 개별 항 TfR 항체(1:3 일련 희석)의 적정액이, 바이오틴화 항 TfRA(최종 농도 0.5 nM)와 합하여진 후, 실온에서 1 시간 동안 상기 플레이트에 첨가된다. 플레이트는 PBS/0.05% Tween 20으로 세정되고, 이후 이 플레이트에 HRP-스트렙타비딘(Southern Biotech, Birmingham)이 첨가된 다음, 실온에서 1시간 동안 항온처리된다. 플레이트가 PBS/0.05% Tween 20으로 세정된 후, 이 플레이트에 결합된 바이오틴화 항 TfRA은 TMB 기질(BioFX Laboratories, Owings Mills)이 사용되어 검출된다.
높은 IC50은, BBB-R의 공지된 리간드의 결합을 억제하기 위해 더욱 많은 조건부 활성 항체가 필요하므로, 상기 BBB-R에 대한 항체의 친화성은 상대적으로 작음을 나타낸다. 역으로, 낮은 IC50은, BBB-R의 공지된 리간드의 결합을 억제하기 위해 더욱 적은 조건부 활성 항체가 필요하므로, 상기 BBB-R에 대한 항체의 친화성은 상대적으로 큼을 나타낸다.
몇몇 구현예들에서, 혈장 중 BBB-R로부터 유래한 조건부 활성 항체의 IC50은 약 1 nM 내지 약 100 μM, 또는 약 5 nM 내지 약 100 μM, 또는 약 50 nM 내지 약 100 μM, 또는 약 100 nM 내지 약 100 μM, 또는 약 5 nM 내지 약 10 μM, 또는 약 30 nM 내지 약 1 μM, 또는 약 50 nM 내지 약 1 μM일 수 있다.
활액막 액에 대한 조건부 활성 생체 단백질
관절 질환은 산업화된 국가에 있어서 장애와 조기 퇴직의 주요 원인이 되고 있다. 관절 질환은 종종 관절에 회복이 어려운 피해를 유발한다. 활액막 액은 인간이나 동물 몸의 관절(예를 들어 무릎, 둔부, 어깨)의 연골과 관절 접착 면을 마주보는 활액막 사이의 활액막 공동에서 발견되는 체액이다. 활액막 액은 연골에 영양분을 제공하고, 관절에 대해 윤활액의 역할을 한다. 연골 및 활액막 세포는 관절 접착면들 사이에서 윤활액의 역할을 하는 유체를 분비한다. 인간의 활액막 액은 물을 약 85 % 포함한다. 상기 활액막 액은 혈장의 투석액으로부터 유래하는데, 이 자체는 물, 용해된 단백질, 글루코스, 응혈 인자, 무기 이온, 호르몬 등으로 구성되어 있다. 단백질, 예를 들어 알부민 및 글로불린이 활액막 액에 존재하는데, 이는 관절 구역을 윤활시키는데 중요한 역할을 담당하는 것으로 생각된다. 몇몇 기타 단백질들, 예를 들어 당단백질, 예를 들어 알파-1-산 당단백(AGP), 알파-1-인티트립신(A1AT) 및 루브리신도 또한 인간의 활액막 액에서 발견된다.
활액막 액은 몸의 다른 부분과는 매우 상이한 조성을 갖는다. 그러므로 활액막 액은 몸의 다른 부분, 예를 들어 혈장과 상이한 생리학적 조건을 갖는다. 예를 들어 활액막 액은 글루코스를 약 10 ㎎/㎗ 미만 함유하는 한편, 인간 혈장 중 평균 정상 글루코스 농도는 약 100 ㎎/㎗이되, 1일 통틀어 70 ㎎/㎗ 내지 100 ㎎/㎗ 사이에서 유동적이다. 또한, 활액막 액 중 단백질의 총 수준은 혈장 단백질 수준의 약 3분의 1에 해당하는데, 그 이유는 거대 분자, 예를 들어 단백질이 활액막을 거쳐 활액막 액으로 용이하게 통과하지 못하기 때문이다. 인간 활액막 액의 pH가 인간 혈장의 pH보다 더 높다는 것 또한 발견되었다[Jebens et al., "On the viscosity and pH of synovial fluid and the pH of blood," The Journal of Bone and Joint Surgery, vol. 41 B, pages 388-400, 1959; Farr et al., "Significance of the hydrogen ion concentration in synovial fluid in Rheumatoid Arthritis," Clinical and Experimental Rheumatology, vol. 3, pages 99-104, 1985].
그러므로 활액막 액은, 몸의 다른 부분의 생리학적 조건들, 예를 들어 혈장의 생리학적 조건들과 상이한 생리학적 조건들을 몇 가지 갖는다. 활액막 액의 pH는 몸의 다른 부분, 특히 혈장의 pH보다 더 높다. 활액막 액은 몸의 다른 부분, 예를 들어 혈장보다 글루코스 농도가 더 낮다. 활액막 액은 또한 몸의 다른 부분, 예를 들어 혈장보다 단백질 농도가 더 낮다.
몇몇 항체들이 활액막 액에 도입됨으로써 이 항체들이 관절 질환을 치료하는데 사용되었다. 예를 들어 손상된 관절 내 활액막 액은, 골관절염 진행에 영향을 미치는 다수의 인자를 함유하는 것으로 공지되어 있다[예를 들어 문헌(Fernandes, et al., "The Role of Cytokines in Osteoarthritis Pathophysiology", Biorheology, vol. 39, pages 237-246, 2002) 참조]. 활성화된 활막세포에 의해 생산된 시토카인, 예를 들어 인터루킨-1(IL-1) 및 종양 괴사 인자-α(TNF-α)는 세포기질 메탈로프로티나아제(MMP) 유전자 발현을 상승 조절하는 것으로 공지되어 있다. MMP의 상승 조절은 관절 내 세포기질 및 비 세포기질 단백질의 분해를 유도한다. 시토카인을 중화하는 항체는 골관절염의 진행을 중단할 수 있다.
항체를 약물로서 사용하는 것은 관절 질환 치료에 있어서 유망한 전략이다. 예를 들어 지금까지 관절 질환에서 가장 큰 유병률을 가지는 골관절염을 치료하기 위한 항체(예를 들어 아그레칸 또는 아그레카나아제에 대한 항체)가 개발되어 오고 있다(WO 1993/022429 A1). 염증성, 자가면역성, 신경퇴행성 또는 악성 질환/장애인 관절 질환, 예를 들어 관절염의 진단 또는 치료용으로서, 아세틸화된 HMGB1(High-Mobility Group Box 1)에 대한 항체가 개발되었다. 이러한 항체는 활액막 액 중 HMGB1의 아세틸화된 형태를 검출하는데 사용될 수 있다(WO 2011/157905 A1). 다른 항체(CD20 항체)도 또한 관절의 결합 조직과 연골 피해를 치료하기 위해 개발되었다.
그러나 이와 같은 항체의 항원은 종종 중요한 생리학적 기능들을 가지는, 몸의 다른 부분에서 발현된다. 이와 같은 항원에 대한 항체는 또한 관절 질환 치료에 유효하긴 하지만 몸의 다른 부분에서 이러한 항원의 정상 생리학적 기능들을 유의적으로 방해할 수도 있다. 따라서 환자는 심각한 부작용을 경험할 수 있게 된다. 그러므로 부작용을 줄이기 위해 몸의 다른 부분에 있는 항원(단백질 또는 기타 거대분자)과 결합되지 않거나 단지 약하게 결합되면서, 예를 들어 상기 항원과 큰 친화도로 활액막 액 중에서 우선적으로 결합될 수 있는, 기타 항원 또는 시토카인에 대한 항체, 즉 치료제인 항체를 개발하는 것이 요망된다.
이와 같이 조건부 활성인 생체 단백질은 조건부 활성 항체일 수 있다. 몇몇 구현예들에서, 본 발명은 또한 항체 이외의 단백질인 조건부 활성 생체 단백질을 제공하기도 한다. 예를 들어 몸의 다른 부분에서의 면역 반응에 적은 영향을 미칠 수 있거나 영향을 미치지 않을 수 있는 조건부 활성 면역 조절 인자가, 활액막 액 중 면역 반응을 우선적으로 조절하기 위하여 본 발명에 의해 개발될 수 있다.
조건부 활성 생체 단백질은 시토카인 신호 전달의 조건부 활성 억제 인자(SOCS)일 수 있다. 이러한 SOCS 다수는 JAK-STAT 신호 전달 경로를 억제하는데 수반된다. 상기 시토카인 신호 전달의 조건부 활성 억제 인자는 활액막 액 중 시토카인 신호 전달을 우선적으로 억제할 수 있는 한편, 몸의 다른 부분에서의 시토카인 신호 전달은 억제하지 않거나 더 적게 억제할 수 있다.
몇몇 구현예들에서, 본 발명은 야생형 생체 단백질로부터 유도된 조건부 활성 생체 단백질을 제공한다. 조건부 활성 생체 단백질은, 몸의 임의의 부분들, 예를 들어 혈장 중 적어도 하나의 생리학적 조건하에 야생형 생체 단백질보다 더 작은 활성을 가지고, 활액막 액 중 적어도 하나의 생리학적 조건하에 야생형 생체 단백질보다 더 큰 활성을 가진다. 이러한 조건부 활성 생체 단백질은 우선적으로 활액막 액 중에서 기능을 할 수 있지만, 몸의 다른 부분에서는 작용을 하지 않거나 더 적게 작용을 할 수 있다. 결과적으로 이러한 조건부 활성 생체 단백질은 감소한 부작용을 가질 수 있다.
몇몇 구현예들에서, 조건부 활성 생체 단백질은 활액막 액 중 항원 또는 활액막 액에 노출된 항원에 대한 항체이다. 이러한 항원은, 종종 시토카인이기도 하지만, 관절 질환에 있어서 면역 반응/염증에 수반되는 임의의 단백질일 수 있다. 조건부 활성 항체는 야생형 항체보다 몸의 다른 부분(예를 들어 혈장) 중 적어도 하나의 생리학적 조건하에 동일한 항원에 대하여 더 작은 친화성을 가지는 한편, 야생형 항체보다 활액막 액 중 적어도 하나의 생리학적 조건하에 상기 항원에 대하여 더 큰 친화성을 가진다. 이러한 조건부 활성 항체는, 몸의 다른 부분에서 항원과 약하게 결합될 수 있거나 전혀 결합되지 않을 수 있지만, 예를 들어 활액막 액 중에서는 항원과 강력하고 단단하게 결합될 수 있거나, 아니면 더욱 강력하게 결합될 수 있다.
종양에 대한 조건부 활성 생체 단백질
고형 종양 내 암세포는 암세포 성장 및 전이를 지지하기 위하여 자체의 주변에 종양 미세환경을 형성할 수 있다. 종양 미세환경은 종양이 존재하는 세포 내 환경으로서, 주변 혈관, 면역 세포, 섬유아세포, 기타 세포, 가용성 인자, 신호 전달 분자, 세포 외 세포기질, 그리고 신생물 형성 변형을 촉진할 수 있고, 종양 성장 및 침습을 지지할 수 있으며, 숙주의 면역성으로부터 종양을 보호할 수 있고, 치료제 내성을 조장할 수 있으며, 잠재적 전이를 깨우기 위한 니치를 제공할 수 있는 기계적 신호를 포함한다. 종양 및 이의 주변 미세환경은 밀접하게 관련되어 있으며 지속적으로 상호작용한다. 종양은 세포 외 신호를 방출하고, 종양 혈관신생을 촉진하며, 말초 면역 관용성을 유도함으로써 종양 자체의 미세환경에 영향을 미칠 수 있는 한편, 미세환경 내 면역 세포는 암성 세포의 성장과 진화에 영향을 미칠 수 있다. 문헌[Swarts et al. "Tumor Microenvironment Complexity: Emerging Roles in Cancer Therapy," Cancer Res, vol., 72, pages 2473-2480, 2012]을 참조하시오.
종양 미세환경은 종종 저 산소성이다. 종양의 질량이 증가함에 따라서, 기존의 혈액 공급원으로부터 꽤 멀리 떨어진 곳에 있는 종양의 내측도 성장하는데, 이는 종양 미세환경에 산소를 완전히 공급함에 있어 어려움을 유발한다. 종양 환경의 산소 분압은, 혈장 중 산소 분압이 약 40 mmHg인 것과는 비교되게, 국소적으로 진행된 고형 종양 중 50 % 초과에서 5 mmHg 이하이다. 이와는 대조적으로, 몸의 다른 부분은 저 산소성이 아니다. 저 산소 환경은 뉴클레오티드 절개 수선 및 미스 매치 수선 경로의 하향 조절을 통하여 암 진행과 연관된 유전적 불안정성을 초래한다. 저산소증은 또한 저산소증 유도성 인자 1알파(HIF1-α)의 상향 조절을 유도하기도 하는데, 이는 혈관신생을 유도할 뿐더러, 전이와 연관된 유전자의 활성화 및 더 좋지 않은 예후와 연관된다. 문헌[Weber et al., "The tumor microenvironment," Surgical Oncology, vol. 21, pages 172-177, 2012 and Blagosklonny, "Antiangiogenic therapy and tumor progression," Cancer Cell, vol. 5, pages 13-17, 2004]을 참조하시오.
또한, 종양 세포는 산소를 필요로 하지 않는 젖산 발효로부터 생성되는 에너지에 의존하는 경향이 있다. 그러므로 종양 세포는 산소를 필요로 하는 정상적인 호기성 호흡을 이용하는 것으로 덜 여겨진다. 젖산 발효를 이용하는 결과 종양 미세환경은, 통상적으로 중성 또는 약 염기성인 몸의 다른 부분과는 대조적으로 산성(pH 6.5 ~ 6.9)이다. 예를 들어 인간 혈장의 pH는 약 7.4이다. 문헌[Estrella et al., "Acidity Generated by the Tumor Microenvironment Drives Local Invasion," Cancer Research, vol. 73, pages 1524-1535, 2013]을 참조하시오. 종양 미세환경 내에서의 영양분의 이용 가능성은 또한, 증식중인 암세포의 영양분 요구량이 몸의 다른 부분에 위치하는 세포들의 영양분 요구량에 비하여 상대적으로 큼으로 말미암아 작다.
또한, 종양 미세환경은 몸의 다른 부분에서 통상적으로 발견되지 않는 다수의 변별적 세포 류들을 포함하기도 한다. 이러한 세포 류들은 내피 세포 및 이의 전구체, 혈관주위세포, 평활근 세포, Wbro아세포, 암종 연관 Wbro아세포, 근 Wbro아세포, 호중구, 호산구, 호염기구, 비만 세포, T 및 B 림프구, 자연 살해 세포 및 항원 제시 세포(APC), 예를 들어 대식세포 및 수지상 세포를 포함한다[Lorusso et al., "The tumor microenvironment and its contribution to tumor evolution toward metastasis," Histochem Cell Biol, vol. 130, pages 1091-1103, 2008],
그러므로 종양 미세환경은 몸의 다른 부분의 생리학적 조건들(예를 들어 혈장 중 생리학적 조건들)과 상이한 생리학적 조건들을 적어도 몇 개 가진다. 종양 미세환경 pH는 몸의 다른 부분, 특히 혈장의 pH(pH 7.4)보다 더 낮다(산성). 종양 미세환경의 산소 농도는 몸의 다른 부분, 예를 들어 혈장의 산소 농도보다 더 낮다. 또한 종양 미세환경의 영양분 이용 가능성은 몸의 다른 부분, 특히 혈장의 영양분 이용 가능성보다 더 작다. 종양 미세환경은 또한 몸의 다른 부분, 특히 혈장에서 통상적으로 발견되지 않는 몇몇 변별적 세포 류를 가지기도 한다.
몇몇 암 약물은, 종양 미세환경에 침투하여 이 미세환경 내에서 암 세포에 작용할 수 있는 항체를 포함한다. 암의 항체 기반 치료법은 널리 확립되어 있으며, 혈액암 및 고형 종양 환자를 치료하는데 가장 성공적이고 중요한 전략들 중 하나가 되었다. 정상 조직에 비하여 암세포에서 과발현, 돌연변이 또는 선택적으로 발현된, 인간 암 세포에 의해 발현되는 세포 표면 항원의 넓은 어레이가 존재한다. 이와 같은 세포 표면 항원은 항체 암 치료법에서 뛰어난 표적이다.
항체들에 의해 표적화될 수 있는 암 세포 표면 항원들은 몇몇 상이한 카테고리에 속한다. 조혈세포 분화 항원은 보통 분화 클러스터(CD) 군과 연관된 당단백으로서, CD20, CD30, CD33 및 CD52를 포함한다. 세포 표면 분화 항원은, 정상 세포와 종양 세포 둘 다의 표면에서 발견되는 당단백 및 탄수화물의 다양한 군이다. 성장 및 분화 신호 전달에 수반되는 항원은 종종 성장 인자 및 성장 인자 수용체이다. 암 환자에서 항체의 표적인 성장 인자는 CEA2, 상피 성장 인자 수용체(EGFR; ERBB1이라고도 공지됨) 12, ERBB2(HER2라고도 공지됨) 13, ERBB3(REF.18), MET(HGFR로도 공지됨) 19, 인슐린 유사 성장 인자 1 수용체(IGF1R) 20, 에프린 수용체 A3(EPHA3) 21, 종양 괴사 인자(TNF) 관련 세포고사 유도성 리간드 수용체 1(TRAILR1; TNFRSF10A라고도 공지됨), TRAILR2(TNFRSF10B라고도 공지됨) 및 핵 내 인자-κB 리간드의 수용체 활성 인자(RANKL; TNFSF11이라고도 공지됨) 22를 포함한다. 혈관신생에 수반되는 항원은 보통 새로운 미세혈관의 형성을 지지하는 단백질 또는 성장 인자, 예를 들어 혈관 내피 성장 인자(VEGF), VEGF 수용체(VEGFR), 인테그린 αVβ3 및 인테그린 α5β1이다(REF.10). 종양 기질 및 세포 외 세포기질은 종양에 대한 불가피한 지지 구조이다. 치료 표적인 기질 및 세포 외 세포기질 항원은 섬유아세포 활성화 단백질(FAP) 및 테나신을 포함한다. 문헌[Scott et al., "Antibody therapy of cancer," Nature Reviews Cancer, vol. 12, pages 278-287, 2012]을 참조하시오.
항체 이외에도, 기타 생체 단백질도 또한 암 치료에 전망을 보였다. 그 예들로서는 종양 억제 인자, 예를 들어 망막아세포종 단백질(pRb), p53, pVHL, APC, CD95, ST5, YPEL3, ST7 및 ST14를 포함한다. 종양의 크기를 축소하기 위해 암세포 내에서 세포고사를 유도하는 몇몇 단백질도 또한 종양에 도입될 수도 있다. 종양에서 세포고사를 유도할 수 있는 기구가 적어도 2개 존재한다[종양 세포고사 인자 유도성 기구 및 Fas-Fas 리간드 매개성 기구]. 2개의 세포고사 기구들 중 어느 하나에 수반되는 단백질들 중 적어도 일부는 치료를 위해 종양에 도입될 수 있다.
암 줄기 세포는 특정 암 시료 중에 모든 세포 류가 발견되도록 만드는 능력을 가져서, 궁극적으로는 종양을 형성하는 암세포이다. 암 줄기 세포는, 자기 재생 및 다수의 세포 류로의 분화에 관한 줄기 세포 과정을 통해서 종양을 생성할 수 있다. 암 줄기 세포는 종양 내에 변별적 군집으로서 영속하면서, 새로운 종양을 발생시켜 재발 및 전이를 일으키는 것으로 생각된다. 암 줄기 세포를 표적화하는 특이적 치료법의 개발은 암 환자, 특히 전이된 질환 발병 개체들의 생존율과 삶의 질을 향상시킬 수 있다.
종양을 치료하기 위한 이러한 약물은 종종 종양 이외의 몸의 다른 부분에서 정상적인 생리학적 기능을 방해한다. 예를 들어 종양에서 세포고사를 유도하는 단백질은 또한 몸의 몇몇 다른 부분에서도 세포고사를 유도할 수 있으므로 부작용을 일으킬 수 있다. 항체가 종양 치료를 위해 사용되는 구현예들에서, 항체의 항원은 또한 정상적인 생리학적 기능들을 수행하는 몸의 다른 부분에서도 발현될 수 있다. 예를 들어 모노클로날 항체인 베바시주맙(혈관 내피 성장 인자 표적화)은 종양 혈관 성장을 중지시킨다. 이 항체는 또한 몸의 다른 부분에서 혈관 성장 또는 수선을 막을 수도 있으므로, 출혈, 상처 치유 능 저하, 응혈 및 신장 피해를 유발하기도 한다. 주로 또는 오로지 종양 표적화에 중점을 둔 조건부 활성 생체 단백질의 개발은 더욱 효과적인 종양 치료법에 절실히 요망되는 바이다.
몇몇 구현예들에서, 본 발명은 종양 치료의 후보물질일 수 있는, 야생형 생체 단백질로부터 제조된 조건부 활성 생체 단백질을 제공한다. 종양 미세환경 이외의 몸의 다른 부분, 예를 들어 혈장 중 적어도 하나의 생리학적 조건 하 조건부 활성 생체 단백질은 활성이 야생형 생체 단백질보다 활성이 더 작은 한편, 종양 미세환경 중 적어도 하나의 생리학적 조건 하 조건부 활성 생체 단백질은 야생형 생체 단백질보다 활성이 더 크다. 이와 같이 종양 치료를 위한 조건부 활성 생체 단백질은 종양 미세환경 중 우선적으로 암세포에 대해 작용을 할 수 있으므로, 부작용을 덜 일으킬 것이다. 생체 단백질이, 항원이 종양 미세환경에 노출되는, 종양 세포 표면상의 항원에 대한 항체인 구현예에서, 몸의 다른 부분(예를 들어 비 종양 미세환경)에서 조건부 활성 항체의 항원에 대한 친화성은 야생형 항체의 항원에 대한 친화성보다 더 작은 한편, 종양 미세환경에서 이 항체의 항원에 대한 친화성은 야생형 항체의 항원에 대한 친화성보다 더 크다. 이러한 조건부 활성 항체는 몸의 다른 부분에서 항원과 약하게 결합되거나 전혀 결합되지 않지만, 종양 미세환경에서는 항원과 더 강력하게 결합하거나, 강력하고 단단하게 결합된다.
몇몇 구현예들에서, 조건부 활성 항체는 면역 관문 단백질에 대한 항체로서, 면역 관문의 억제를 초래하는 항체이다. 이와 같이 조건부 활성 항체는 (1) 조건부 활성 항체의 기원이 된 야생형 항체에 비하여 종양 미세환경 중 면역 관문 단백질에 대해 증가한 결합 친화성, 그리고 (2) 조건부 활성 항체의 기원이 된 야생형 항체에 비하여 비 종양 미세환경 중 면역 관문 단백질에 대해 감소한 결합 친화성 중 적어도 하나를 보인다.
면역 관문은 자기 관용성을 유지하고, 항원 자극(즉 외래 분자, 세포 및 조직)에 대한 면역 반응의 지속 기간 및 그 정도를 조정하기 위해 면역계에 대한 내인성 억제 경로로서 작용을 한다. 문헌[Pardoll, Nature Reviews Cancer, vol. 12, pages 252-264, 2012]을 참조하시오. 하나 이상의 관문 단백질을 억제함으로써 면역 관문을 억제하는 것은 면역계, 특히 T 세포의 초 활성화를 유발하여, 면역계가 종양을 공격하도록 유도할 수 있다. 본 발명에 적합한 관문 단백질은 CTLA4와 이의 리간드인 CD80 및 CD86, PD1과 이의 리간드인 PDL1 및 PDL2, T 세포 면역글로불린 및 뮤신 단백질 3(TIM3) 및 이의 리간드인 GAL9, B 및 T 림프구 감쇠 인자(BTLA) 및 이의 리간드인 HVEM(헤르페스바이러스 도입 매개 인자), 수용체, 예를 들어 사멸 세포 면역글로불린 유사 수용체(KIR), 림프구 활성화 유전자 3(LAG3) 및 아데노신 A2a 수용체(A2aR), 그리고 리간드 B7-H3 및 B7-H4를 포함한다. 추가의 적합한 면역 관문 단백질은, 그 개시 내용이 본원에 참고문헌으로서 인용되어 있는 문헌[Pardoll, Nature Reviews Cancer, vol. 12, pages 252-264, 2012 and NirsCH1 & Drake, Clin Cancer Res, vol. 19, pages 4917-4924, 2013]에 기술되어 있다.
CTLA-4 및 PD1은 가장 잘 알려진 면역 관문 단백질들 중 2가지이다. CTLA-4는 T 세포 활성화 경로를 하향 조절할 수 있다[Fong et al., Cancer Res. 69(2):609-615, 2009; and Weber, Cancer Immunol. Immunother, 58:823-830, 2009]. 봉쇄 CTLA-4는 T 세포 활성화 및 증식을 증가시키는 것으로 보였다. CTLA-4의 억제제는 항 CTLA-4 항체를 포함한다. 항 CTLA-4 항체는 CTLA-4에 결합하여 CTLA-4와 이의 리간드 CD80 또는 CD86의 상호작용을 차단함으로써, CTLA-4와 이의 리간드의 상호작용으로 유도되는 면역 반응의 하향 조절을 차단한다.
관문 단백질 PD1은 감염에 대한 염증 반응시 말초 조직에서 T 세포의 활성을 억제하여 자가면역성을 제한하는 것으로 공지되어 있다. 시험관 내 PD1 봉쇄는 혼합 림프구 반응에서 특이적 항원 표적 또는 동종이계 세포에 의한 자극에 반응하여 T 세포 증식과 시토카인 생산을 증강할 수 있다. PD1 발현과 감소한 면역 반응간 강력한 상관관계는 PD1의 억제 기능, 즉 면역 관문 유도에 의해 유발되는 것으로 보였다[Pardoll, Nature Reviews Cancer, 12: 252-264, 2012]. PD1 봉쇄는 PD1 또는 이의 리간드인 PDL1 또는 PDL2와 결합되는 항체를 포함하는 다양한 기구에 의해 달성될 수 있다.
과거 연구는 몇몇 관문 단백질(CTLA4, PD1, PD-L1)에 대한 항체를 발견하였다. 이러한 항체는 종양을 공격하기 위해 면역 관문을 억제하여, 면역계, 특히 T 세포를 초 활성화함으로써 종양을 치료하는 것에 효과적이다[Pardoll, Nature Reviews Cancer, vol. 12, pages 252-264, 2012]. 그러나 초 활성화된 T 세포는 또한 숙주 세포 및/또는 조직을 공격하여, 환자의 몸에 부수적 피해를 초래할 수도 있다. 따라서, 이와 같이 면역 관문을 억제하는 것으로 공지된 항체를 사용하는 것을 바탕으로 한 치료법은 관리가 어렵고, 환자의 위험성은 깊은 우려가 되고 있다. 예를 들어 FDA 승인된, CTLA4에 대한 항체는 이 자체의 큰 독성으로 말미암아 블랙박스 경고(black box warning)를 받고 있다.
본 발명은 면역 관문 단백질에 대한 조건부 활성 항체를 제공함으로써, 초 활성화된 T 세포에 의한 부수적 피해에 관한 문제를 다룬다. 이와 같은 조건부 활성 항체는 종양 미세환경에서 우선적으로 면역 관문을 활성화한다. 이와 동시에, 비 종양 미세환경(들), 예를 들어 정상 체 조직에서 면역 관문은 조건부 활성 항체에 의해 억제되지 않거나 덜 억제되어서, 비 종양 미세환경에서 몸에 대한 부수적 피해 잠재성은 감소한다. 이 목표는, 조건부 활성 항체가 비 종양 미세환경에서보다 종양 미세환경에서 더욱 활성을 띠도록 조작함으로써 달성된다.
몇몇 구현예들에서, 면역 관문 단백질에 대한 조건부 활성 항체는, 종양 미세환경에서의 면역 관문 단백질에 대한 결합 활성 대 비 종양 미세환경에서의 동일한 면역 관문 단백질에 대한 결합 활성 비율이 적어도 약 1.1, 또는 적어도 약 1.2, 또는 적어도 약 1.4, 또는 적어도 약 1.6, 또는 적어도 약 1.8, 또는 적어도 약 2, 또는 적어도 약 2.5, 또는 적어도 약 3, 또는 적어도 약 5, 또는 적어도 약 7, 또는 적어도 약 8, 또는 적어도 약 9, 또는 적어도 약 10, 또는 적어도 약 15, 또는 적어도 약 20일 수 있다. 항체의 결합 활성을 측정하기 위한 통상의 검정은 ELISA 검정이다.
고도로 면역원성인 종양, 예를 들어 악성 흑색종이, 면역계 조작에 의해 달성된, 초 활성화된 면역계에 가장 취약하다. 그러므로 면역 관문 단백질에 대한 조건부 활성 항체는 이러한 고도로 면역원성인 종양을 치료하는 것에 특히 유효할 수 있다. 그러나 다른 종양 류들도 또한 초 활성화된 면역계에 취약하다.
몇몇 구현예들에서, 면역 관문 단백질에 대한 조건부 활성 항체가 조합 치료법에 사용될 수 있다. 예를 들어 조합 치료법은 종양 세포 표면 분자(종양 특이적 항원)에 대한 조건부 활성 항체와, 면역 관문 단백질에 대한 조건부 활성 항체를 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 조건부 활성 항체의 종양 세포 표면 분자에 대한 결합 활성과, 조건부 활성 항체의 면역 관문 단백질에 대한 결합 활성은 둘 다 하나의 단백질, 즉 본원에 개시된 바와 같은 이중 특이적 조건부 활성 항체에 항상 구비될 수 있다. 몇몇 추가의 구현예들에 있어서, 조합 치료법은 종양 세포 표면 분자(종양 특이적 항원)에 대한 조건부 활성 항체와, 2개 이상의 상이한 면역 관문 단백질에 대한 조건부 활성 항체 2개 이상을 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 이와 같은 결합 활성 모두는 하나의 단백질, 즉 본원에 개시된 바와 같은 다중 특이적 항체에 구비될 수 있다.
조건부 활성 항체의 활성은, 이 조건부 활성 항체의 기원이 된, 동일한 종양 세포 표면 분자 또는 관문 단백질에 대한 야생형 항체의 활성에 비하여, 종양 미세환경에서 더욱 크므로, 이러한 조합 치료법은 증강된 효능 및 독성의 유의적 감소 둘 다를 제공할 수 있다. 이와 같은 조건부 활성 항체, 특히 면역 관문 단백질에 대한 항체의 감소한 독성은, 유력한 항체, 예를 들어 본원에 기술된 바와 같은 ADC 항체의 안전한 사용과, 항체의 더 많은 용량을 허용할 수 있다.
몇몇 구현예들에서, 관문 단백질에 대한 조건부 활성 항체는 전구 약물 형태일 수 있다. 예를 들어 조건부 활성 항체는 절단되어 약물 형태로 되기 전에는 원하는 약물 활성을 가지지 않는 전구 약물일 수 있다. 전구 약물은 종양 미세환경에서 우선적으로 절단될 수 있는데, 그 이유는 이러한 절단을 촉매화하는 효소가 종양 미세환경에 우선적으로 존재하기 때문이거나, 또는 조건부 활성 항체가 종양 미세환경에서의 절단 위치를 비 종양 미세환경에서의 절단 위치보다 접근 가능성의 면에서 더욱 용이하게 달성되도록 만들기 때문이다.
종양 줄기 세포를 포함하는 줄기 세포의 니치에 대한 조건부 활성 생체 단백질
줄기 세포는 조직 생리학의 기본 단위를 구성하는 것으로서, 유기체의 요구에 대한 줄기 세포 반응을 매개하는 신호를 통합하는, 몸속 줄기 세포 니치(stem cell niche)라고 칭하여지는 환경에 존재한다. 그러나 니치는 또한 비정상 기능을 줄기 세포 또는 기타 표적에 부여함으로써 병리상태를 유도할 수도 있다. 줄기 세포와 이의 니치 간 상호작용은 조직을 지탱하고, 줄기 세포 치료제의 궁극적 디자인에 필요한 동적 계를 형성한다[Scadden, "The stem-cell niche as an entity of action," Nature, vol. 441, pages 1075-1079, 2006]. 척추동물에 통상적인 줄기 세포 니치는 생식계 줄기 세포 니치, 조혈 줄기 세포 니치, 모공 줄기 세포 니치, 장 줄기 세포 니치 및 심혈관 줄기 세포 니치를 포함한다.
줄기 세포 니치는 몸의 다른 부분(예를 들어 혈장)과는 상이한, 특화된 환경이다[Drummond-Barbosa, "Stem Cells, Their Niches and the Systemic Environment: An Aging Network," Genetics, vol. 180, pages 1787-1797, 2008; Fuchs, "Socializing with the Neighbors: Stem Cells and Their Niche," Cell, vol. 116, pages 769-778, 2004]. 줄기 세포 니치는 산화 DNA 피해가 감소하는 경우 저 산소성이다. 산소 수준의 직접 측정법은, 일반적으로 혈장에 비하여 골수가 매우 저 산소성(O2 약 1% 내지 약 2%)임을 규명하였다[Keith et al., "Hypoxia- Inducible Factors, Stem Cells, and Cancer," Cell, vol. 129, pages 465-472, 2007; Mohyeldin et al., "Oxygen in Stem Cell Biology: A Critical Component of the Stem Cell Niche," Cell Stem Cell, vol. 7, pages 150-161, 2010]. 뿐만 아니라, 줄기 세포 니치는, 이 니치 내부에서 줄기 세포 특징들을 조절하는 몇몇 기타 인자들, 예를 들어 세포 외 세포기질 성분, 성장 인자, 시토카인, 그리고 환경의 물리화학적 성질에 관한 인자, 예를 들어 pH, 이온 세기(예를 들어 Ca2 + 농도) 및 대사물질도 가질 필요가 있다.
이에 따라서 줄기 세포 니치는 몸의 다른 부분의 생리학적 조건들, 예를 들어 혈장 중 생리학적 조건들과 상이한 생리학적 조건들을 적어도 몇 개 가진다. 줄기 세포 니치는 몸의 다른 부분, 특히 혈장보다 산소 농도가 낮다(1 ~ 2%). 기타 줄기 세포 니치에 대한 생리학적 조건들, 예를 들어 pH 및 이온 세기도 또한 몸의 다른 부분의 생리학적 조건들과 상이할 수도 있다.
줄기 세포 치료법은 질환 또는 손상을 치료하기 위해 새로운 성체 줄기 세포를 피해 발생 조직에 도입하는 중재적 전략이다. 이 전략은 자기 재생하고 나서, 분화 능의 정도가 가변적인 자손을 생산하는 줄기 세포의 능력에 의존한다. 줄기 세포 치료법은, 거부 및 부작용의 최소 위험성으로 몸의 발병 부위 및 피해 발생 구역을 잠재적으로 교체할 수 있는, 조직 재생에 대한 유의적 잠재성을 제공한다. 그러므로 줄기 세포의 재생과 분화에 영향을 주기 위해 약물(생체 단백질(예를 들어 항체) 또는 화합물)을 줄기 세포 니치에 전달하는 것은 줄기 세포 치료법에서 중요한 부분이다.
줄기 세포 니치가 포유동물 내에서 줄기 세포의 재생 및/또는 분화에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 예가 몇 가지 존재한다. 첫 번째 예는, β-1 인테그린이 원시 세포에서 차등적으로 발현되고, 세포기질 당단백 리간드들과의 상호작용을 통한 줄기 세포 군집의 제한된 편재화에 참여하는 것으로 공지되어 있는, 피부에서의 경우이다. 두 번째 예는, 뇌실 하 대역에서 테나신 C의 부재가 신경 줄기 세포의 수와 기능을 변경하는, 신경계에서의 경우이다. 테나신 C는 섬유 아세포 성장 인자 2(FGF2) 및 골 형태 형성 단백질 4(BMP4)에 대한 줄기 세포의 감수성을 조정하여, 증가한 줄기 세포 성향(stem cell propensity)을 초래하는 것으로 보인다. 세 번째 예는, 다른 세포기질 단백질, Arg-Gly-Asp 함유 시알로단백질, 오스테오폰틴(OPN)이 현재 조혈 줄기 세포 조절에 기여하는 것으로 입증된 경우이다. OPN은 조혈 줄기 세포, CD44 및 α4 및 α5β1 인테그린 상에 있는 것으로 공지된 몇몇 수용체들과 상호작용한다. OPN 생산은, 특히 골 아세포 활성화로써 눈에 띄게 변할 수 있다. OPN 결핍은 조절 조건들 하에서 초 생리학적 줄기 세포 증식을 유도하므로, OPN이 결핍된 동물은 HS-세포 수가 증가한다. 그러므로 OPN은, 줄기 세포의 수를 항상성 조건들 하에서나 자극을 이용하여 제한하면서, 조혈 줄기 세포 수에 대한 제약으로서의 역할을 하는 것으로 보인다. 문헌[Scadden, "The stem-cell niche as an entity of action," Nature, vol. 441, pages 1075-1079, 2006]을 참조하시오.
Xie외 다수["Autocrine signaling based selection of combinatorial antibodies that transdifferentiate human stem cells," Proc Natl Acad Sci U S A, vol. 110, pages 8099-8104, 2013]는, 줄기 세포 분화에 영향을 주는 항체를 사용하는 방법을 개시한다. 항체는 과립구 콜로니 자극 인자 수용체에 대한 작용물질이다. 세포가 미리 정해진 경로를 따라 분화하도록 세포를 활성화하는 자연 과립구 콜로니 자극 인자와는 달리, 단리된 작용물질 항체는 인간 골수 계통 CD34+ 골수 세포를 신경 전구체로 교차분화하였다. Melidoni외 다수["Selecting antagonistic antibodies that control differentiation through inducible expression in embryonic stem cells," Proc Natl Acad Sci U S A, vol. 110, pages 17802-17807, 2013]는 또한 FGF4와 이의 수용체인 FGFR1β 간 상호작용을 방해하여, 자가분비 FGF-4 매개 배 줄기 세포 분화를 차단하는 항체를 사용하는 방법을 개시한다.
줄기 세포 분화에 있어서의 리간드/수용체의 기능에 대한 지식은, 생체 단백질을 줄기 세포 분화를 조절하거나 심지어 유도하기 위한 목적으로 이러한 리간드/수용체를 방해하기 위해 적용하는 전략을 가능하게 하였다. 항체의 줄기 세포 니치로의 투여를 통해 유전적으로 변형되지 않은 인간 줄기 세포의 분화를 제어하는 능력은, 줄기 세포 기반 치료법들에 대한 신규의 생체 외 또는 생체 내 접근법들을 제공할 수 있다. 몇몇 구현예들에서, 본 발명은, 암 줄기 세포를 비롯한 줄기 세포의 니치를 도입하여, 줄기 세포 또는 종양의 발달을 조절할 수 있는, 야생형 생체 단백질로부터 제조된 조건부 활성 생체 단백질을 제공한다. 조건부 활성 생체 단백질은 몸의 다른 부분들에서 적어도 하나의 생리학적 조건하의 활성이 야생형 생체 단백질의 활성보다 더 작은 한편, 줄기 세포 니치, 예를 들어 암 줄기 세포 환경에서 적어도 하나의 생리학적 조건하의 활성은 야생형 생체 단백질의 활성보다 더 크다. 이러한 조건부 활성 생체 단백질은 그다지 부작용을 일으킬 것 같지는 않으며, 우선적으로 줄기 세포 니치에서 작용하여 줄기 세포의 재생 및 분화를 조절할 것이다. 몇몇 구현예들에서, 조건부 활성 생체 단백질은 항체이다. 이러한 조건부 활성 항체는 몸의 다른 부분에서 이 자체의 항원과 약하게 결합되거나 전혀 결합되지 않을 수 있지만, 줄기 세포 니치에서는 항원과 강력하고 단단하게 결합될 수 있다.
활액막 액, 종양 미세환경 및 줄기 세포 니치에 대한 본 발명의 조건부 활성 단백질은, 돌연변이 DNA 라이브러리를 제조하기 위해 야생형 생체 단백질을 암호화하는 DNA를 진화시키는 방법에 의해 제조된다. 그 다음, 돌연변이 DNA 라이브러리는 발현되어 돌연변이 단백질이 제조된다. 돌연변이 단백질은, 활액막 액, 종양 미세환경, 및 줄기 세포 니치로 이루어진 군으로부터 선택되는 몸의 제1 부분의 생리학적 조건 적어도 하나 하에서의 활성이 야생형 생체 단백질의 활성보다 크고, 상기 몸의 제1 부분과 상이한 몸의 제2 부분의 생리학적 조건 적어도 하나 하에서의 활성이 야생형 생체 단백질의 활성보다 작은 조건부 활성 생체 단백질에 대해 스크리닝된다. 상기 몸의 제2 부분은 혈장일 수 있다. 이와 같이 선택된 돌연변이 생체 단백질은 몸의 제1 부분에서 큰 활성을 가지되, 몸의 제2 부분에서는 작은 활성을 가지는 조건부 활성 생체 단백질이다.
이러한 조건부 활성 생체 단백질은 야생형 단백질의 부작용을 줄이는 것에 있어 유리한데, 그 이유는 상기 조건부 활성 생체 단백질이 작용하도록 의도되지 않는 몸의 다른 부분들에서 조건부 활성 생체 단백질의 활성이 더 작기 때문이다. 예를 들어 만일 조건부 활성 생체 단백질이 종양 미세환경에 도입되도록 의도되면, 조건부 활성 생체 단백질이 종양 미세환경 이외의 몸의 부분들에서 작은 활성을 가진다는 사실은, 이러한 조건부 활성 생체 단백질이 종양 미세환경 이외의 몸의 부분들에서 정상적인 생리학적 기능들을 방해하는 것으로 덜 여겨질 것임을 의미한다. 이와 동시에, 조건부 활성 생체 단백질은 종양 미세환경에서 큰 활성을 가지는데, 이는 종양을 치료함에 있어서 조건부 활성 생체 단백질에 더 큰 효능을 제공한다.
감소한 부작용으로 인해 조건부 활성 생체 단백질은, 야생형 생체 단백질에 비하여, 유의적으로 더 많은 단백질 용량이 안전하게 사용되는 것을 허용할 것이다. 이는 특히 시토카인 또는 성장 인자에 대한 항체에 유익한데, 그 이유는 시토카인 또는 성장 인자에 대한 항체가 몸의 다른 부분들에서 시토카인 또는 성장 인자의 정상적인 생리학적 기능들을 방해할 수 있기 때문이다. 부작용이 감소한 조건부 활성 생체 단백질이 사용될 때, 더 큰 효능을 달성하기 위해 더욱 많은 용량이 사용될 수 있다.
활액막 액, 종양 미세환경 또는 줄기 세포 니치 중 어느 하나에서 작용하기 위한 조건부 활성 생체 단백질은 또한 신규 약물 표적들이 사용될 수 있도록 할 수 있다. 통상의 생체 단백질을 치료제로서 사용하는 것은 허용 불가능한 부작용을 유발할 수 있다. 예를 들어 상피 성장 인자 수용체(EGFR)의 억제는 종양 성장을 매우 효과적으로 억제할 수 있다. 그러나 EGFR을 억제하는 약물은 또한 피부와 위장관(GI tract)에서 성장을 억제할 것이다. 부작용은 EGFR을 종양 약물 표적으로서 부적합하게 만든다. 오로지 종양 미세환경에서만 큰 친화성으로 EGFR과 결합되되, 몸의 다른 임의의 부분들에서는 친화성을 갖지 않거나 매우 작은 친화성으로 EGFR과 결합되는 조건부 활성 항체를 사용하는 것은, 부작용을 유의적으로 감소시킴과 동시에 종양 성장을 억제할 것이다. 이러한 경우, 조건부 활성 항체들이 사용됨으로써 EGFR은 유효 신규 종양 약물 표적이 될 수 있다.
다른 예에서, 시토카인을 억제하는 것은 종종 관절 피해를 회복시키는데 유리하다. 그러나 몸의 다른 부분들에서 시토카인들을 억제하는 것은 또한 몸의 면역 반응을 억제하여, 면역 결핍증을 유발시킬 수도 있다. 그러므로 활액막 액 중 시토카인은 관절 피해를 치료하기 위한 통상의 항체 약물을 개발함에 있어서 이상적인 표적이 아니다. 그러나, 활액막 액 중 시토카인과 우선적으로 결합되는 한편, 몸의 다른 부분에서 동일한 시토카인과 결합되지 않거나 단지 약하게 결합되는 조건부 활성 항체가 사용될 때, 면역 결핍증의 부작용이 극적으로 감소될 수 있다. 그러므로 활액막 액 중 시토카인은 조건부 활성 항체를 사용함으로써 관절 피해를 회복시킴에 있어서 적합한 표적이 될 수 있다.
조건부 활성 바이러스 입자
바이러스 입자는 오랫동안 단백질, 핵산 분자, 화합물 또는 방사성 동위 원소를 표적 세포 또는 조직에 운반하기 위한 전달 비이클로서 사용되어 오고 있다. 전달 비이클로서 통상적으로 사용되는 바이러스 입자는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 렌티바이러스, 헤르페스 바이러스 및 아데노 연관 바이러스를 포함한다. 바이러스 입자는 종종 리간드-수용체 결합 계에서 표적 세포의 표적 단백질로서 사용되는 세포성 단백질에 특이적으로 결합되기 위하여 인지 단백질로 사용되는 표면 단백질을 통해서 자체의 표적 세포를 인지한다[본원에 참고문헌으로 인용되어 있는 문헌(Lentz, "The reognition event between vims and host cell receptor: a target for antiviral agents," .J. of Gen. Virol., vol. 71, pages 751-765, 1990) 참조]. 예를 들어 바이러스 인지 단백질은 표적 세포 상의 수용체에 대한 리간드일 수 있다. 리간드와 수용체 간 특이성은 바이러스 입자가 표적 세포를 특이적으로 인지하여 자체의 내용물을 이 표적 세포에 전달하는 것을 허용한다.
야생형 바이러스로부터 인공 바이러스 입자를 개발하기 위한 기술은 당 업자에게 널리 공지되어 있다. 전달 비이클로서 공지된 인공 바이러스 입자는 레트로바이러스(예를 들어 WO 90/07936; WO 94/03622; WO 93/25698; WO 93/25234; 미국 특허 제5,219,740호; WO 93/11230; WO 93/10218; 미국 특허 제4,777,127호; 영국 특허 제2,200,651호; 유럽특허 제0 345 242호; 및 WO 91/02805 참조), 알파바이러스(예를 들어 신드비스 바이러스 벡터(Sindbis virus vector), 셈리키 포레스트 바이러스(Semliki forest virus)(ATCC VR-67; ATCC VR-1247), 로스 리버 바이러스(Ross River virus)(ATCC VR-373; ATCC VR-1246), 베네주엘라 말 뇌염 바이러스(ATCC VR-923; ATCC VR-1250; ATCC VR 1249; ATCC VR-532)) 및 아데노-연관 바이러스(예를 들어 WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191 ; WO 94/28938; WO 95/11984 및 WO 95/00655 참조)를 기반으로 하는 것들을 포함한다.
일반적으로 인공 바이러스 입자는 종종 재조합 기술에 의해 원산 인지 단백질 대신에 외래 인지 단백질을 바이러스 입자에 삽입함으로써 구성된다. 외래 인지 단백질은, 예를 들어 항체, 수용체, 리간드 또는 콜라겐 결합 도메인일 수 있다. 본 발명은 정상 생리학적 조건에서 세포와의 결합에 대해 비 활성이거나 활성이 더 작고, 비정상 조건에서는 세포와의 결합에 대해 활성이거나 활성이 더 큰 조건부 활성 인지 단백질을 제공한다. 이로써 조건부 활성 인지 단백질은 발병된 위치에서 비정상 조건의 존재를 바탕으로 이 발병된 위치 및/또는 발병된 조직의 표적 세포에 우선적으로 결합될 수 있고, 정상 생리학적 조건이 조성되는 정상 조직의 세포에 결합되지 않거나 다만 최소한으로 결합될 수 있게 된다. 조건부 활성 인지 단백질은 바이러스 입자 표면상에 발현되어 전시될 수 있다.
몇몇 구현예들에서, 본 발명은 야생형 인지 단백질을 진화시키고, 조건부 활성 인지 단백질에 대해 스크리닝하는 방법을 제공한다. 조건부 활성 인지 단백질은 정상 생리학적 조건하에 세포와 결합함에 있어서 야생형 인지 단백질보다 활성이 작고, 비정상 조건하에는 세포와 결합함에 있어서 야생형 인지 단백질보다 활성이 크다. 이와 같은 조건부 활성 인지 단백질이 널리 공지된 재조합 기술에 의해 바이러스 입자에 삽입되면, 조건부 활성 바이러스 입자가 제조될 수 있다.
다른 구현예에서, 본 발명은 조건부 활성 바이러스 입자가 정상 조직의 세포가 아닌, 발병된 조직 또는 발병 위치의 표적 세포를 인지하여 이에 결합되는 것을 허용하는, 조건부 활성 인지 단백질을 포함하는 조건부 활성 바이러스 입자를 제공한다. 이러한 조건부 활성 바이러스 입자는 바이러스 입자 내에 들어있는 치료제를 발병된 조직 또는 발병된 위치에 우선적으로 전달할 수 있는 한편, 조건부 활성 바이러스 입자는 정상 조직 세포에는 치료제를 덜 전달하거나 전달하지 않는다.
몇몇 구현예에서, 발병된 위치에 있는 표적 세포는, 건강하거나 특정 질환이나 병상이 발생하지 않은 몸의 다른 부분들에서의 pH 또는 온도와 비교되게, 비정상 pH(예를 들어 pH 6.5) 또는 비정상 온도인 대역 또는 미세환경 안에 있다. 이러한 구현예에서, 조건부 활성 인지 단백질은, 정상 생리학적 pH 또는 온도에서 표적 세포의 표적 단백질과 결합함에 있어서 야생형 인지 단백질보다 활성이 더 작고, 비정상 pH 또는 온도에서 표적 세포의 표적 단백질과 결합함에 있어서는 야생형 인지 단백질보다 활성이 더 크다. 이러한 방식으로, 인지 단백질은 비정상 pH 및 온도가 우연히 조성되는 위치에 우선적으로 결합될 것이고, 이로써 치료제를 발병된 위치에 전달할 것이다.
하나의 구현예에서, 바이러스 입자는 본 발명의 조건부 활성 항체, 특히 항체의 가변 영역(예를 들어 Fab, Fab', Fv)를 포함할 수 있다. 이러한 조건부 활성 항체는, 정상 조직과 어느 지역에서 우연히 마주할 수 있는 정상 생리학적 조건하에 야생형 항체의 친화성보다 더 작은 친화성으로, 그리고 발병된 위치 또는 발병된 조직에서 우연히 마주할 수 있는 비정상 조건하에는 야생형 항체의 친화성보다 더 큰 친화성으로 표적 세포의 표적 단백질(항원)에 결합할 수 있다. 조건부 활성 항체는 본 발명의 방법에 따라서 야생형 항체로부터 유도될 수 있다.
하나의 구현예에서, 표적 세포 상 표적 단백질은, 예를 들어 다수의 종양에서 세포 표면에 과발현되는 티로신 키나아제 성장 인자 수용체를 포함한다. 예시적인 티로신 키나아제 성장 인자로서는 VEGF 수용체, FGF 수용체, PDGF 수용체, IGF 수용체, EGF 수용체, TGF-알파 수용체, TGF-베타 수용체, HB-EGF 수용체, ErbB2 수용체, ErbB3 수용체 및 ErbB4 수용체가 있다.
조건부 활성 DNA/RNA 변형 단백질
DNA/RNA 변형 단백질이, 연구자들이 염색체상 정확한 위치에서 DNA 서열을 정밀하고 용이하게 변경하는, 유전자에 대한 현미경 수술을 수행할 수 있도록 허용하는 신규 게놈 조작 도구(특히 CRISPR로서 칭하여지는 도구)의 형태로서 발견되었다[genome editing, Mali, et al., "Cas9 as a versatile tool for engineering biology," Nature Methods, vol. 10, pages 957-963, 2013]. 예를 들어 겸상 적혈구 빈혈은 단일 염기 돌연변이에 의해 유발될 수 있는데, 이는 DNA/RNA 변형 단백질을 사용하여 잠재적으로 교정될 수 있다. 상기 기술은, 심지어 단일 염기 쌍을 변경함으로써 염색체의 조각(bit)들을 정밀하게 결실 또는 편집할 수 있다[Makarova et al., "Evolution and classification of the CRISPR-Cas systems," Nature Reviews Microbiology, vol. 9, pages 467-477, 2011].
CRISPR을 이용한 게놈 편집은 어느 세포에 대해 다수의 유전자 변이들을 신속하면서 동시에 만드는 능력을 갖는다. 다수의 인간 질병들, 예를 들어 심장 질환, 당뇨병 및 신경 질환은 다수의 유전자에서의 돌연변이에 의해 발병한다. 이 CRISPR 기반 기술은 질환 유발 돌연변이를 역전시켜 이러한 질환을 치유하거나 해당 질환의 심각성을 적어도 감소시키는 잠재력을 갖는다. 게놈 편집은 게놈 DNA를 자르기 위한 CRISPR 연관(Cas) 단백질(효소의 한 과)에 달려있다. 통상적으로 Cas 단백질은 소형 안내 RNA에 의해 게놈 내 표적 영역으로 안내되는데, 이 게놈 내 표적 영역에서 안내 RNA는 표적 영역과 매칭된다. Cas 단백질은 서열 특이성이 작거나 아예 없으므로, 안내 RNA는 정밀한 게놈 편집을 달성하기 위해 Cas 단백질에 대하여 포인터(pointer)로서의 역할을 한다. 하나의 구현예에서, 하나의 Cas 단백질은 다수의 안내 RNA들과 함께 사용되어, 다수의 유전자 돌연변이를 동시에 교정할 수 있다.
다수의 Cas 단백질이 존재한다. 예로서는 Cas1 , Cas2, Cas3', Cas3", Cas4, Cas5, Cas6, Cas6e, Cas6f, Cas7, Cas8a1, Cas8a2, Cas8b, Cas8c, Cas9, Cas1O, Cas1Od, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx1O, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3 및 Csf4를 포함한다(Makarova et al., "Evolution and classification of the CRISPR-Cas systems," Nature Reviews Microbiology, vol. 9, pages 467-477, 2011).
Cas 단백질은 게놈 편집을 실시하기 위해서 표적 세포에 들어가야 한다. 피험체 내 세포들은 해당 세포들 내부의 세포 내 pH가 상이할 수 있다. 발병된 조직 내 몇몇 세포들은 비정상적 세포 내 pH를 갖는다. 예를 들어 몇몇 종양 세포들은 세포 내 pH가 약 7.12 내지 약 7.65로 알칼리성인 경향이 있는 한편, 정상 조직 내 세포들은 세포 내 pH가 6.99 내지 7.20으로 중성이다. 문헌[Cardone et al., "The role of disturbed pH dynamics and the Na(+) H(+) exchanger in metatasis," Nat. Rev. Cancer, vol, 5, pages 786-795, 2005]을 참조하시오. 만성 저산소증에 있어서, 발병된 조직의 세포들의 세포 내 pH는 약 7.2 내지 약 7.5로서, 이는 역시 정상 조직의 세포 내 pH보다 더 높은 수치이다[Rios et al., "Chronic hypoxia elevates intracellular pH and activates Na+/H+ exchange in pulmonary arterial smooth muscle cells," American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology, vol. 289, pages L867-L874, 2005]. 또한, 허혈증 세포에서 세포 내 pH는 통상 6.55 내지 6.65의 범위인데, 이는 정상 조직의 세포 내 pH보다 더 낮은 수치이다[Haqberg, "Intracellular pH during ischemia in skeletal muscle: relationship to membrane potential, extracellular pH, tissue lactic acid and ATP," Pflugers Arch., vol. 404, pages 342-347, 1985]. 발병된 조직 내 비정상 세포 내 pH에 관한 더욱 많은 예들이 문헌[Han et al, "Fluorescent Indicators for Intracellular pH," Chem Rev., vol. 110, pages 2709-2728, 2010]에 논의되어 있다.
본 발명은 야생형 Cas 단백질로부터 조건부 활성 Cas 단백질을 제조하기 위한 방법을 제공하는데, 여기서 조건부 활성 Cas 단백질은 (1) 정상 세포 내 정상 생리학적 조건하에는 야생형 Cas 단백질의 활성에 비해 감소한 효소 활성, 그리고 (2) 상기 논의된 발병 세포들 중 어느 하나와 같은 표적 세포 내부 비정상 조건하에는 야생형 Cas 단백질의 활성에 비해 증가한 효소 활성 중 적어도 하나를 보인다. 몇몇 구현예들에서, 정상 생리학적 조건은 세포 내 pH가 거의 중성이고, 비정상 조건은 상이한 세포 내 pH가 중성을 초과하거나 그 이하이다. 하나의 구현예에서, 비정상 조건은 세포 내 pH가 7.2 내지 7.65이거나, 세포 내 pH가 6.5 내지 6.8이다.
몇몇 구현예들에서, 조건부 활성 Cas 단백질은 본 발명의 조건부 활성 바이러스 입자를 사용하여 표적 세포에 전달될 수 있다. 조건부 활성 바이러스 입자는 조건부 활성 Cas 단백질과, Cas 단백질을, 이 Cas 단백질이 게놈 DNA를 편집할 지역으로 인도하기 위한 안내 RNA 적어도 하나를 포함한다.
다중 특이적 항체는, 다중 특이적 항체가 결합될 수 있는 표적(항원) 전부 또는 대부분을 포함하는 조직을 우선적으로 표적화 함에 있어서 큰 선택성을 가진다. 예를 들어 이중 특이적 항체는, 이중 특이적 항체에 의해 인지되는 항원 둘 다를 발현하는 표적 세포에, 항원들 중 오로지 하나만을 발현할 수 있는 비 표적 세포에 대한 선호도와 비교되게, 더 큰 선호도를 보임으로써 표적 세포에 대한 선택성을 제공할 수 있다. 그러므로 계의 역동설로 말미암아, 더 많은 이중 특이적 항체들이 비 표적 세포보다 표적 세포와 평형을 이루며 결합된다.
본원의 조작된 다중 특이적 항체 또는 이의 항원 인지 단편들은 본 발명의 키메라 항원 수용체 중 ASTR로서 사용될 수 있다.
세포 독성 세포의 조작
일단 조건부 활성 ASTR이 스크리닝 단계에 의해 동정되면, 키메라 항원 수용체는 개별 도메인들을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열들을 결찰하여, 단일 폴리뉴클레오티드 서열(조건부 활성 CAR을 암호화하는 CAR 유전자)을 생성함으로써 조립될 수 있다. 개별 도메인은 조건부 활성 ASTR, TM 및 ISD를 포함한다. 몇몇 구현예들에서, ESD 및 CSD를 포함하는 기타 도메인들도 또한 CAR 내에 도입될 수도 있다(도 1). 만일 조건부 활성 CAR이 이중 특이적 CAR이면, CAR 유전자는, 예를 들어 다음과 같은 입체구조(N 말단 → C 말단 방향)로 존재할 수 있다: N 말단 신호 서열-ASTR1-링커-ASTR2-세포 외 스페이서 도메인-경막 도메인-보조 자극 도메인-세포 내 신호전달 도메인. 하나의 구현예에서, 이와 같은 CAR 유전자는 2개 이상의 보조 자극 도메인을 포함할 수 있다.
대안적으로, 조건부 활성 CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 다음과 같은 입체구조(N 말단 → C 말단 방향)로 존재할 수 있다: N 말단 신호 서열-ASTR1-링커-ASTR2-경막 도메인-보조 자극 도메인-세포 내 신호전달 도메인. 하나의 구현예에서, 이러한 CAR은 2개 이상의 보조 자극 도메인을 포함할 수 있다. 만일 CAR이 2개를 초과하는 ASTR을 포함하면, CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 다음과 같은 입체구조(N 말단 → C 말단 방향)로 존재할 수 있다: N 말단 신호 서열-ASTR1-링커-ASTR2-링커-(항원 특이적 표적화 영역)n-경막 도메인-보조 자극 도메인-세포 내 신호전달 도메인. 이러한 CAR은 세포 외 스페이서 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 각각의 ASTR은 링커에 의해 떨어져 있을 수 있다. 하나의 구현예에서, 이러한 CAR은 2개 이상의 보조 자극 도메인을 포함할 수 있다.
조건부 활성 CAR은 발현 벡터에 의해 세포 독성 세포에 도입된다. 본 발명의 조건부 활성 CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터도 또한 본원에 제공된다. 적합한 발현 벡터는 렌티바이러스 벡터, 감마 레트로바이러스 벡터, 거품형성 바이러스 벡터, 아데노 연관 바이러스(AAV) 벡터, 아데노바이러스 벡터, 조작된 하이브리드 바이러스, 나출형 DNA(naked DNA), 예를 들어 트랜스포손 매개 벡터, 예를 들어 슬리핑 뷰티(Sleeping Beauty), 피기백(Piggybak) 및 인테그라아제, 예를 들어 Phi31(이에 한정되는 것은 아님)을 포함한다. 기타 적합한 발현 벡터 몇몇은 헤르페스 심플렉스 바이러스(HSV) 및 레트로바이러스 발현 벡터를 포함한다.
아데노바이러스 발현 벡터는, 게놈 DNA로의 통합 능은 작지만, 숙주 세포를 형질감염하기 위한 효율은 큰 아데노바이러스를 기반으로 한다. 아데노바이러스 발현 벡터는 (a) 발현 벡터의 팩키징(packaging)을 지원하고, (b) 궁극적으로 숙주 세포 내에서 CAR 유전자를 발현하는데에 충분한 아데노바이러스 서열들을 함유한다. 아데노바이러스 게놈은 36kb의 선형 이중 가닥 DNA로서, 이 아데노바이러스 게놈에 있어서 외래 DNA 서열(예를 들어 CAR 유전자)은 삽입되어 아데노바이러스 DNA의 큰 조각들을 대체하고, 그 결과 본 발명의 발현 벡터가 제조될 수 있다(Grunhaus and Horwitz, "Adenoviruses as cloning vectors," Seminars Virol, vol. 3, pages 237-252, 1992).
또 다른 발현 벡터는 아데노바이러스 결합 계를 이용한 아데노 연관 바이러스를 기반으로 한다. 이 AAV 발현 벡터는 숙주 게놈으로의 통합 빈도가 높다. 이는 심지어 비 분열 세포를 감염할 수도 있으므로, 예를 들어 조직 배양액 중 또는 생체 내 유전자의 포유동물 세포로의 전달을 유용하도록 만든다. AAV 벡터는 감염에 대한 숙주 범위가 넓다. AAV 벡터의 제조 및 사용에 관한 세부 설명은, 각각 본원에 참고문헌으로 인용되어 있는 미국 특허 제5,139,941호 및 동 제4,797,368호에 기술되어 있다.
레트로바이러스 발현 벡터는 숙주 게놈으로의 통합, 다량의 외래 유전 물질의 전달, 광범위한 종 및 세포류의 감염, 그리고 특정 세포주 내에서의 팩키징을 가능하게 한다. 레트로바이러스 벡터는 핵산(예를 들어 CAR을 암호화하는 핵산)의, 복제가 진행되지 않는 바이러스를 제조하기 위한 임의의 위치에 존재하는 바이러스 게놈으로의 삽입에 의해 구성된다. 비록 레트로바이러스 벡터는 다양한 세포 류를 감염시킬 수 있지만, CAR 유전자의 통합 및 안정한 발현은 숙주 세포의 분열을 필요로 한다.
렌티바이러스 벡터는, 통상의 레트로바이러스 유전자인 gag, pol 및 env 이외에 조절 기능 또는 구조상 기능을 가지는 기타 유전자를 함유하는 콤플렉스 레트로바이러스인 렌티바이러스로부터 유래한다(미국 특허 제6,013,516호 및 동 제5,994,136호). 렌티바이러스의 몇몇 예들은 인간 면역결핍증 바이러스(HIV-1, HIV-2) 및 원숭이 면역결핍증 바이러스(SIV)를 포함한다. 렌티바이러스 벡터는, HIV 병독성 유전자, 예를 들어 유전자 env, vif, vpr, vpu 및 nef를 결실시켜 벡터를 생물학적으로 안전하게 만듦으로써 복합적으로 약독화되어 제조되었다. 렌티바이러스 벡터는 비 분열 세포를 감염시킬 수 있고, CAR 유전자의 발현과 생체 내 및 생체 외 유전자 이식 둘 다에 사용될 수 있다(본원에 참고문헌으로 인용되어 있는 미국 특허 제5,994,136호 참조).
조건부 활성 CAR 유전자를 포함하는 발현 벡터는 당 업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 숙주 세포에 도입될 수 있다. 원한다면, 발현 벡터는 형질감염용 바이러스 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로 발현 벡터는 융합, 전기천공, 유전자총, 형질감염 또는 리포팩션 등에 의해 도입될 수 있다. 숙주 세포는 배양액 중에서 성장 및 증식된 다음, 발현 벡터가 도입될 수 있으며, 이후 벡터의 도입 및 통합에 적당한 처리법이 수행될 수 있다. 그 다음, 숙주 세포는 벡터 내에 존재하는 마커로 말미암아 증식 및 스크리닝된다. 사용될 수 있는 다양한 마커는 hprt, 네오마이신 내성, 티미딘 키나아제, 하이그로마이신 내성 등을 포함한다. 본원에 사용되는 바와 같이, "세포", "세포주" 및 "세포 배양액"이란 용어는 호환되어 사용될 수 있다. 몇몇 구현예들에서, 숙주 세포는 T 세포, NK 세포 및 NKT 세포이다.
다른 양상에서, 본 발명은 또한 본 발명의 조건부 활성 CAR을 포함하고 안정하게 발현하는 유전자 조작 세포 독성 세포를 제공하기도 한다. 하나의 구현예에서, 유전자 조작된 세포는 치료학적으로 관련 있는 자손을 생산할 수 있는 T 림프구(T 세포), 처녀 T 세포(TN), 기억 T 세포(예를 들어 중심 기억 T 세포(TCM), 효과기 기억 세포(TEM)), 자연 살해 세포 및 대식 세포를 포함한다. 다른 구현예에서, 유전자 조작된 세포는 자기 유래 세포이다. 적합한 T 세포의 예들은 CD4+/CD8-, CD4-/CD8+, CD4-/CD8- 또는 CD4+/CD8+ T 세포들을 포함한다. T 세포는 CD4+/CD8- 및 CD4-/CD8+ 세포의 혼합 군집 또는 단일 클론의 군집일 수 있다. 본 발명의 CD4+ T 세포는 또한 시험관 내에서 표적 항원을 발현하는 세포(예를 들어 CD20+ 및/또는 CD19+ 종양 세포)와 공동 배양될 때, IL-2, IFN-감마, TNF-알파 및 기타 T 세포 효과기 시토카인을 생산할 수도 있다. 본 발명의 CD8+ T 세포는 표적 항원을 발현하는 세포를 용해할 수 있다. 몇몇 구현예들에서, T 세포는 CD45RA+ CD62L+ 처녀 세포, CD45RO CD62I7 중심 기억 제포, CD62L" 효과기 기억 세포 또는 이것들의 조합 중 임의의 것 하나 이상일 수 있다(Berger et al., "Adoptive transfer of virus-specific and tumor-specific T cell immunity," Curr. Opin. Immunol, vol. 21, pages 224-232, 2009).
유전자 조작된 세포 독성 세포는 세포를, 본 발명의 CAR 유전자를 포함하는 발현 벡터로 안정하게 형질감염시킴으로써 제조될 수 있다. 발현 벡터를 사용하여 세포를 유전자 조작하기 위한 추가의 방법은 화학적 형질전환 방법(예를 들어 칼슘 인산염, 덴드리머, 리포좀 및/또는 양이온 중합체를 사용하는 방법), 비 화학적 형질전환 방법(예를 들어 전기천공, 광학 형질전환, 유전자 전기이동 및/또는 수력학 전달) 및/또는 입자 기반 방법(예를 들어 유전자 총을 사용하는 충격주입법(impaefection) 및/또는 자기주입법(magnetofection))을 포함한다. 단일 통합된 비 재정렬 벡터의 존재를 보이고, 조건부 활성 CAR을 발현하는, 형질감염된 세포는 세포 외에서 증식될 수 있다.
발현 벡터를 숙주 세포에 도입하기 위한 물리적 방법은 칼슘 인산염 침전법, 리포팩션, 유전자총법, 미세주입법 및 전기천공법 등을 포함한다. 벡터 및/또는 외인성 핵산을 포함하는 세포를 제조하기 위한 방법은 당 업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어 문헌[Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York]을 참조하시오. 발현 벡터를 숙주 세포에 도입하기 위한 화학적 방법은 콜로이드 분산계, 예를 들어 거대분자 복합체, 나노캡슐, 미소구, 비드 및 지질 기반 계, 예를 들어 수중 유 에멀젼, 미셀, 혼합 미셀 및 리포좀을 포함한다.
세포들은, 세포 독성 세포가 원하는 조건부 활성 CAR을 발현하도록 유전자 변형되기 전인지 또는 후인지에 따라서, 예를 들어 미국 특허 제6,352,694호; 동 제6,534,055호; 동 제6,905,680호; 동 제6,692,964호; 동 제5,858,358호; 동 제6,887,466호; 동 제6,905,681호; 동 제7,144,575호; 동 제7,067,318호; 동 제7,172,869호; 동 제7,232,566호; 동 제7,175,843호; 동 제5,883,223호; 동 제6,905,874호; 동 제6,797,514호; 동 제6,867,041호; 및 미국특허출원 제20060121005호에 기술된 바와 같은 방법들이 사용되어 모두 활성화 및 증식될 수 있다. 예를 들어 본 발명의 T 세포는 그것이 부착되어 있는 표면, CD3/TCR 복합체 연관 신호를 자극하는 제제, 그리고 T 세포의 표면에서 보조 자극 분자를 자극하는 리간드와의 접촉에 의해 증식될 수 있다. 특히, T 세포 군집은 항CD3 항체, 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 표면상에 부동화된 au 항CD2 항체와의 접촉, 또는 칼슘 이온통로구와 함께 단백질 키나아제 C 활성 인자(예를 들어 브리오스타틴)와의 접촉에 의해 자극될 수 있다. T 세포 표면상 부속 분자의 부자극을 위하여, 부속 분자와 결합하는 리간드가 사용된다. 예를 들어 T 세포는, T 세포의 증식을 자극하기 위해 적절한 조건 하에 항CD3 항체 및 항CD28 항체와 접촉할 수 있다. 항CD3 항체 및 항CD28 항체가 사용되어 CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포 중 어느 하나의 증식이 자극된다. 항CD28 항체의 예들은 9.3, B-T3, XR-CD28을 포함하고(Diaclone, Besancon, France), 이러한 것들은 당 업계에 통상적으로 공지된 기타 방법들에서와 같이 본 발명에서도 사용될 수 있다(Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998; Haanen et al., J. Exp . Med. 190(9):13191328, 1999; Garland et al., J. Immunol. Meth. 227(1-2):53-63, 1999).
다양한 구현예들에서, 본 발명은 약학적으로 허용 가능한 부형제와, 치료학적 유효량의 본 발명의 조건부 활성 CAR을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 조성물 중 조건부 활성 CAR은, CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, CAR을 포함하는 단백질, 또는 CAR 단백질을 발현하는 유전자 변형된 세포 중 임의의 것 하나 이상일 수 있다. CAR 단백질은 약학적으로 허용 가능한 염의 형태를 가질 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 염이란, 제약 산업에서 치료용 단백질의 염으로서 사용될 수 있는 염, 예를 들어 나트륨, 칼륨 및 칼슘 등의 염과, 프로카인, 디벤질아민, 에틸렌디아민, 에탄올아민, 메틸글루카민 및 타우린 등의 아민 염뿐만 아니라, 염산염과 같은 산 부가염, 그리고 염기성 아미노산 등을 지칭한다.
약학적으로 허용 가능한 부형제는 일반적으로 안전하고, 무독성이며, 요망되는 약학 조성물을 제조함에 있어서 유용한 임의의 부형제를 포함할 수 있고, 수의학적 용도 및 인간 약제용으로서 허용 가능한 부형제를 포함한다. 이러한 부형제는 고체, 액체, 반고체일 수 있으며, 에어로졸 조성물의 경우에는 기체일 수 있다. 부형제의 한 종류는 조성물을 개선 또는 안정화하거나, 또는 조성물의 제조를 촉진하기 위해 첨가될 수 있는, 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 액체 담체는 시럽, 피넛 오일, 올리브 오일, 글리세린, 염수, 알코올 및 물을 포함한다. 고체 담체는 전분, 락토스, 황산칼슘, 이수화물, 백토, 스테아르산 마그네슘 또는 스테아르산, 활석, 펙틴, 아카시아, 아가 및 젤라틴을 포함한다. 담체는 또한 지연 방출 물질, 예를 들어 글리세릴 일스테아르산염 또는 글리세릴 이스테아르산염 단독, 또는 이와 왁스와의 혼합물을 포함할 수도 있다.
약학적으로 허용 가능한 담체는 부분적으로는 투여되는 특정 조성물뿐만 아니라, 이 조성물을 투여하기 위해 사용되는 특정 방법에 의해 결정된다. 그러므로, 본 발명의 약학 조성물의 매우 다양한 적합 제형들이 존재한다. 예를 들어 완충 염수 등과 같은 다양한 수성 담체가 사용될 수 있다. 이들 용액은 무균성인 것으로서, 일반적으로 요망되지 않는 물질을 함유하지 않는다. 이들 조성물은 통상적이고 널리 공지된 멸균 기술에 의해 멸균될 수 있다. 조성물은 생리학적 조건에 비슷해지도록 만드는데에 필요한, 약학적으로 허용 가능한 보조 물질, 예를 들어 pH 조정제 및 완충제, 독성 조정제 등, 예를 들어 아세트산나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 젖산나트륨 등을 함유할 수 있다. 이들 제형 중 CAR의 농도는 광범위하게 변할 수 있으며, 선택된 특정 투여 방식 및 환자의 요구에 따라 유체 부피, 점도, 체중 등을 기준으로 일차적으로 선택될 것이다.
다양한 구현예들에서, 본 발명에 의한 약학 조성물은 임의의 적합한 투여 경로를 통해 전달되도록 제형될 수 있다. "투여의 경로"란, 당 업계에 공지된 임의의 투여 경로, 예를 들어 에어로졸, 비 내, 경구, 정맥 내, 근육 내, 복막 내, 흡입, 경점막, 경피, 비경구, 주입 가능 펌프, 연속 주입, 국소 적용, 캡슐 및/또는 주사(이에 한정되는 것은 아님)를 지칭할 수 있다.
본 발명에 의한 약학 조성물은 경구 투여를 위해 캡슐화 또는 정제화될 수 있거나, 또는 에멀젼 또는 시럽 중 제조될 수 있다. 필요하면, 약학 조성물은 분쇄, 혼합, 과립화 및 압축(정제 형태)을 수반하는 약학 분야의 통상의 기술; 또는 분쇄, 혼합 및 충전(경질 젤라틴 캡슐 형태)을 수반하는 약학 분야의 통상의 기술에 따라서 제조된다. 액체 담체가 사용될 때, 제제는 시럽, 엘릭시르, 에멀전, 또는 수성이나 비수성 현탁액의 형태를 가질 수 있다. 이러한 액체 제형은 직접 경구 투여될 수 있거나, 아니면 연질 젤라틴 캡슐에 충전될 수 있다.
약학 조성물은 (a) 물, 식염수 또는 PEG 400과 같은 희석제 중에 패키징된 핵산이 유효량 현탁된 것과 같은 액체 용액; (b) 각각이 소정량의 활성 성분을 액체, 고체, 과립 또는 젤라틴으로서 함유하는 캡슐, 사세트 또는 정제; (c) 적절한 액체 중 현탁액; 그리고 (d) 적합한 에멀전으로서 제형될 수 있다. 특히 적합한 투여형은 정제, 알약, 분말, 당의정, 캡슐, 액체, 캔디, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁액 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
고체 제형은 적합한 고체 부형제, 예를 들어 탄수화물 또는 단백질 충전제, 예를 들어 락토오스, 수크로오스, 만니톨 또는 소르비톨을 포함하는 당; 옥수수, 밀, 쌀, 감자 또는 다른 식물로부터의 전분; 메틸 셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸 셀룰로오스 및 나트륨 카르복시-메틸셀룰로오스와 같은 셀룰로오스; 아라비아 검 및 트래거컨트 검을 포함하는 검; 및 단백질, 예를 들어 젤라틴 및 콜라겐을 포함한다. 가교된 폴리비닐 피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 알긴산나트륨과 같은 이의 염과 같은 붕해제 또는 용해제가 첨가될 수 있다. 정제 형태는 락토오스, 수크로오스, 만니톨, 소르비톨, 인산칼슘, 옥수수 전분, 감자 전분, 트래거컨트, 미세결정 셀룰로오스, 아카시아, 젤라틴, 콜로이드성 이산화규소, 크로스캐넬로오스 나트륨, 활석, 스테아르산마그네슘, 스테아르산 중 하나 이상, 및 다른 부형제, 착색제, 충전제, 결합제, 희석제, 완충제, 습윤제, 보존제, 풍미제, 염료, 붕해제, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다.
액체 현탁액은 수성 현탁액 제작에 적합한 부형제와 함께 조건부 활성 CAR을 포함한다. 이러한 부형제는, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 하이드록실프로필메틸셀룰로오스, 알긴산나트륨, 폴리비닐피롤리돈, 트래거컨트 검 및 아카시아 검과 같은 현탁제, 자연 발생 포스파타이드(예를 들어 레시틴)와 같은 습윤제 또는 분산제, 알킬렌 산화물과 지방산의 축합 생성물(예를 들어 폴리옥시에틸렌 스테아레이트), 에틸렌 산화물과 긴 사슬 지방족 알코올의 축합 생성물(예를 들어 헵타데카에틸렌 옥시세탄올), 에틸렌 산화물과, 지방산 및 헥시톨로부터 유도된 부분 에스테르의 축합 생성물(예를 들어 폴리옥시에틸렌 소르비톨 모노올레에이트), 또는 에틸렌 산화물과, 지방산 및 헥시톨 무수물로부터 유도된 부분 에스테르의 축합 생성물(예를 들어 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트)을 포함한다. 액체 현탁액은 또한 에틸 또는 n-프로필 p-하이드록시벤조에이트와 같은 하나 이상의 보존제, 하나 이상의 착색제, 하나 이상의 풍미제, 및 수크로오스, 아스파르탐 또는 사카린과 같은 하나 이상의 감미료를 함유할 수 있다. 제형은 삼투질 농도에 대해 조정될 수 있다.
캔디 형태는 풍미제, 일반적으로 수크로오스 및 아카시아 또는 트래거컨트 중에 활성 성분을 함유할 수 있으며, 활성 성분 이외에 당 분야에 공지된 담체를 함유하고, 젤라틴 및 글리세린 또는 수크로오스 및 아카시아 에멀션, 겔 등과 같은 비 활성 베이스 중에 활성 성분을 포함하는 드롭스를 포함할 수 있다. 경구 투여되는 경우에, 조건부 활성 CAR은 분해로부터 보호되어야 하는 것이 인지된다. 이는, 통상적으로 조건부 활성 CAR을 조성물과 복합체화하여 이를 산성 및 효소 가수분해에 대해 저항성이 되도록 하거나, 조건부 활성 CAR을 리포솜과 같은 적절한 저항성 담체 중에 패키징시킴으로써 달성된다. 단백질을 분해로부터 보호하는 수단은 당 분야에 널리 공지되어 있다. 약학 조성물은, 예를 들어 리포솜 중에, 또는 활성 성분의 느린 방출을 제공하는 제형 중에 캡슐화될 수 있다.
약학 조성물은 흡입을 통해 투여되는 에어로졸 제형(예를 들어 이들은 "분무"될 수 있음)으로 제조될 수 있다. 에어로졸 제형은 디클로로디플루오로메탄, 프로판, 질소 등과 같은 가압된 허용 가능 추진제에 배당될 수 있다. 직장 투여용으로 적합한 제형은, 예를 들어 좌제 베이스와 함께 패키징된 핵산으로 이루어진 좌제를 포함한다. 적합한 좌제 베이스는 자연 발생 또는 합성 트리글리세라이드 또는 파라핀 탄화수소를 포함한다. 그 외에, 패키징된 핵산과, 예를 들어 액체 트리글리세라이드, 폴리에틸렌 글리콜 및 파라핀 탄화수소를 포함하는 베이스의 조합물로 이루어진 젤라틴 직장 캡슐을 사용하는 것도 또한 가능하다.
약학 조성물은 비경구 투여용, 예를 들어 관절강 내(관절에서), 정맥 내, 근육 내, 피 내, 복막 내 및 피하 경로에 의해서와 같은 비경구 투여용으로 제형될 수 있고, 산화방지제, 완충제, 박테리아 발육 저지제, 및 제형을 의도된 수용자의 혈액과 등장성으로 만드는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비 수성 등장성 무균 주사액, 그리고 현탁제, 가용화제, 증점제, 안정화제 및 보존제를 포함할 수 있는 수성 및 비 수성 무균 현탁액을 포함한다. 본 발명을 실시함에 있어서, 조성물은, 예를 들어 정맥 내 주입, 경구, 국소, 복막 내, 방광 내 또는 척추 강 내 주입에 의해 투여될 수 있다. 하나의 양상에서, 비경구 투여 방식은 CAR 단백질 또는 유전자 조작된 세포독성 세포를 포함하는 조성물에 대한 바람직한 투여 방법이다. 조성물은 단위 투여 형태로 편리하게 투여될 수 있으며, 예를 들어 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. Easton Pa., 18th Ed., 1990]에 기술된 바와 같이, 제약 분야에 널리 공지된 방법들 중 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 정맥 내 투여용 제형은 무균 수 또는 식염수, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리알킬렌 글리콜, 식물 기원 오일, 수소화된 나프탈렌 등과 같은 약학적으로 허용 가능한 담체를 함유할 수 있다.
약학 조성물은 비 경구, 피하, 근육 내, 정맥 내, 관절강 내, 기관지 내, 복부 내, 낭 내, 연골 내, 강 내, 복강 내, 소뇌 내, 대뇌뇌실 내, 결장 내, 자궁경부 내, 위 내, 간 내, 심근 내, 골질 내, 골반 내, 심막 내, 복막 내, 흉막 내, 전립선 내, 폐 내, 직장 내, 신장 내, 망막 내, 척수 내, 활막 내, 흉 내, 자궁 내, 방광 내, 볼루스, 질, 직장, 협측, 설하, 비강 내 또는 경피로부터 선택되는 적어도 하나의 방식에 의해 투여될 수 있다. 본 방법은 선택적으로 조건부 활성 CAR 투여 전에, 이와 동시에 또는 이후에 검출가능 표지 또는 리포터, TNF 길항물질, 항류머티즘약, 근육 이완제, 진경제, 비 스테로이드 항 염증 약물(NSAK), 진통제, 마취제, 진정제, 국소 마취제, 신경근 차단제, 항미생물제, 항건선제, 코르티코스테로이드, 동화 스테로이드, 적혈구 생성 촉진 인자, 면역제, 면역 글로불린, 면역억제제, 성장 호르몬, 호르몬 대체 약물, 방사성 의약품, 항우울제, 항정신병약, 흥분제, 천식 의약품, 베타 작용물질, 흡입 스테로이드, 에피네프린 또는 이의 유사체, 세포독성 또는 기타 항암제, 메토트렉세이트와 같은 항 대사물질 또는 항증식제 중 적어도 하나로부터 선택되는 화합물 또는 단백질 적어도 하나를 유효량 포함하는 조성물 적어도 하나를 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물 또는 유전자 조작된 세포 독성 세포로 치료될 암의 종류는 암종, 아세포종 및 육종, 그리고 임의의 백혈병 또는 림프성 악성종양, 양성 및 악성 종양, 그리고 악성종양, 예를 들어 육종, 암종 및 흑색종을 포함한다. 암은 비 고형 종양(예를 들어 혈액학적 종양) 또는 고형 종양일 수 있다. 성인 종양/암 및 소아 종양/암도 또한 포함된다.
혈액학적 암은 혈액 또는 골수의 암이다. 혈액학적(또는 조혈) 암의 예들은 백혈병, 예를 들어 급성 백혈병(예를 들어 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 그리고 골수아구성, 전골수구성, 골수단핵구성, 단핵구성 백혈병 및 적 백혈병), 만성 백혈병(예를 들어 만성 골수구성(과립구성) 백혈병, 만성 골수성 백혈병 및 만성 림프구성 백혈병), 진성 적혈구증가증, 림프종, 호지킨병, 비 호지킨 림프종(무통성 및 고도 형태), 다발성 골수종, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 중쇄병, 골수이형성증후군, 모양 세포 백혈병 및 골수이형성증을 포함한다.
고형 종양은 일반적으로 낭종 또는 액체 구역을 함유하지 않는 조직의 비정상 덩어리이다. 고형 종양은 양성 또는 악성일 수 있다. 고형 종양의 상이한 유형들은 이 상이한 종류의 고형 종양을 형성하는 세포 유형에 대해 명명된다(예를 들어 육종, 암종 및 림프종). 고형 종양, 예를 들어 육종 및 암종의 예들은 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골육종 및 기타 육종, 활막종, 중피종, 유잉(Ewing) 종양, 평활근육종, 횡문근육종, 결장 암종, 림프성 악성종양, 췌장암, 유방암, 폐암, 난소암, 전립선암, 간세포 암종, 편평세포암종, 기저세포암종, 선암종, 한선 암종, 거대종격동암종, 유두갑상샘암종, 갈색세포종, 피지선 암종, 유두암종, 유두선암종, 수질암종, 기관지원성암종, 신세포암종, 간세포암, 담관암종, 융모암, 빌름(Wilm) 종양, 자궁경부암, 고환 종양, 정상피종, 방광암종, 흑색종 및 CNS 종양(예를 들어 신경교종(예를 들어 뇌간 신경교종 및 혼합 신경교종), 교모세포종(다형성 교모세포종이라고도 알려짐), 성상세포종, CNS 림프종, 배아세포종, 수모세포종, 신경초종 두개인두종, 상의세포종, 송과체부종양, 혈관모세포종, 청신경종, 핍지교종, 수막종, 신경아세포종, 망막아세포종 및 뇌 전이)를 포함한다.
본 발명은 또한 적어도 하나의 CAR 단백질, 이 CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이 CAR을 발현하는 숙주 세포를 포함하는 의료용 장치를 제공하는데, 이 장치는 비경구, 피하, 근육 내, 정맥 내, 관절강 내, 기관지 내, 복부 내, 낭 내, 연골 내, 강 내, 복강 내, 소뇌 내, 대뇌뇌실 내, 결장 내, 자궁경부 내, 위 내, 간 내, 심근 내, 골질 내, 골반 내, 심막 내, 복막 내, 흉막 내, 전립선 내, 폐 내, 직장 내, 신장 내, 망막 내, 척수 내, 활막 내, 흉 내, 자궁 내, 방광 내, 볼루스, 질, 직장, 협측, 설하, 비강 내 또는 경피로부터 선택되는 적어도 하나의 방식에 의해 적어도 하나의 조건부 활성 CAR을 투여하기에 적합하다.
추가 양상에서, 본 발명은 적어도 하나의 CAR 단백질, CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 CAR을 발현하는 숙주 세포를 동결 건조 형태로 제1 용기에 포함하고, 선택적으로는 무균 수, 무균 완충 수, 또는 수성 희석제 중 페놀, m-크레졸, p-크레졸, o-크레졸, 클로로크레졸, 벤질 알코올, 페닐수은 아질산염, 페녹시에탄올, 포름알데히드, 클로로부탄올, 염화마그네슘, 알킬파라벤, 염화벤잘코늄, 염화벤제토늄, 나트륨 데히드로아세테이트 및 티메로살, 또는 이것들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 보존제 적어도 하나를 포함하는 제2 용기도 포함하는 키트를 제공한다. 하나의 양상에서, 키트 내 제1 용기 중의 조건부 활성 CAR 또는 특정 부분 또는 변이체의 농도는 제2 용기의 함유물이 사용되어 약 0.1㎎/㎖ 내지 약 500㎎/㎖의 농도로 재구성된다. 또 다른 양상에서, 제2 용기는 등장제를 더 포함한다. 또 다른 양상에서, 제2 용기는 생리학적으로 허용 가능한 완충제를 더 포함한다. 하나의 양상에서, 본 발명은 적어도 하나의 야생형 단백질 매개 병태를 치료하는 방법으로서, 키트에 제공되었다가 투여 전 재구성되는 제형을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
또한, 패키징 재료와, 적어도 하나의 CAR 단백질, CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 CAR을 발현하는 숙주 세포의 용액 또는 동결 건조 형태를 포함하는 용기를 포함하는, 인간의 약제용 또는 진단용 제작 물품이 제공된다. 제작 물품은 선택적으로 비경구, 피하, 근육 내, 정맥 내, 관절강 내, 기관지 내, 복부 내, 낭 내, 연골 내, 강 내, 복강 내, 소뇌 내, 대뇌뇌실 내, 결장 내, 자궁경부 내, 위 내, 간 내, 심근 내, 골질 내, 골반 내, 심막 내, 복막 내, 흉막 내, 전립선 내, 폐 내, 직장 내, 신장 내, 망막 내, 척수 내, 활막 내, 흉내, 자궁 내, 방광 내, 볼루스, 질, 직장, 협측, 설하, 비강 내 또는 경피 전달 장치 또는 계의 부품으로서 용기를 포함할 수 있다.
몇몇 구현예들에서, 본 발명은 피험체로부터 세포 독성 세포를 검색하는 단계, 본 발명의 CAR 유전자를 세포 독성 세포에 도입하여 세포 독성 세포를 유전자 조작하는 단계, 및 유전자 조작된 세포 독성 세포를 피험체에 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 몇몇 구현예들에서, 세포 독성 세포는 T 세포, 처녀 T 세포, 기억 T 세포, 효과기 T 세포, 자연 살해 세포 및 대식 세포로부터 선택된다. 하나의 구현예에서, 세포 독성 세포는 T 세포이다.
하나의 구현예에서, T 세포는 피험체로부터 얻어진다. T 세포는 다수의 공급원, 예를 들어 말초혈액단핵세포, 골수, 림프 소절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염 위치로부터 유래하는 조직, 복수, 흉막삼출액, 비장 조직 및 종양으로부터 얻어질 수 있다. 본 발명의 임의의 구현예에서, 당 업계에서 사용 가능한 임의의 수의 T 세포주가 사용될 수 있다. 본 발명의 임의의 구현예들에서, T 세포는 당 업자에게 공지된 임의의 수의 기술(예를 들어 피콜(Ficoll)™ 분리법)이 사용되어 피험체로부터 수집된 혈액으로부터 얻어질 수 있다.
하나의 바람직한 구현예에서, 개체의 순환 혈액으로부터 유래하는 세포는 분리반출법에 의해 얻어진다. 분리반출법의 결과물은 통상적으로 림프구, 예를 들어 T 세포, 단핵구, 과립구, B 세포, 기타 유핵 백혈구, 적혈구 및 혈소판을 함유한다. 하나의 구현예에서, 분리반출법에 의해 수집된 세포는 세정될 수 있고, 그 결과 혈장 분획이 제거될 수 있으며, 또한 적절한 완충제 또는 배지 중 세포는 추후 가공 단계들에 사용될 수 있다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 세포는 인산염 완충 염수(PBS)로 세정된다. 대안적 구현예에서, 세정 용액은 칼슘을 함유하지 않으며, 마그네슘이 결여될 수 있거나, 또는 전부는 아니더라도 다수의 2가 양이온이 결여될 수 있다. 또한 놀랍게도 칼슘 부재하에서의 초반 활성화 단계는 확대된 활성화를 초래한다. 당 업자들이 용이하게 이해하는 바와 같이, 세정 단계는 당 업계에 공지된 방법들, 예를 들어 제작자의 지침에 따른 반자동화 "관류식" 원심분리(예를 들어 문헌(Cobe 2991 cell processor, the Baxter CytoMate, 또는 the Haemonetics Cell Saver 5) 참조)가 사용되는 방법에 의해 달성될 수 있다. 세정 후 세포는 다양한 생체적합성 완충제, 예를 들어 무 Ca2 + PBS, 무 Mg2 + PBS, PlasmaLyte A, 또는 완충제를 함유하거나 함유하지 않는 기타 염수 용액 중에 재현탁될 수 있다. 대안적으로 분리반출법 시료의 원치않는 성분들은 제거될 수 있으며, 세포는 배양 배지 중에 직접 재현탁될 수 있다.
다른 구현예에서, T 세포는, 예를 들어 PERCOLL™ 구배를 통한 원심분리 또는 역류 원심분리 경사법에 의하여 적혈구를 용해하고, 단핵구를 고갈시킴으로써 말초 혈액으로부터 단리된다. T 세포의 특이적 하위 군집, 예를 들어 CD3+, CD28+, CD4+, CD8+, CD45RA+ 및 CD45RO+ T 세포는 양성선택 기술 또는 음성선택 기술에 의해 추가로 단리될 수 있다. 예를 들어 음성선택에 의한 T 세포 군집의 증폭(enrichment)은 음성적으로 선택된 세포들에 유일무이한 표면 마커에 대하여 생성된 항체들의 조합으로 달성될 수 있다. 하나의 방법은 음성적으로 선택된 세포 상에 존재하는 세포 표면 마커에 대해 생성된 모노클로날 항체의 칵테일을 사용하는 유동 세포 분석법 또는 음극 자성 면역부착법을 통한 세포 분류법 및/또는 선택법이다. 음성 선택에 의해 CD4+ 세포를 증폭하기 위해, 모노클로날 항체 칵테일은 통상적으로 CD14, CD20, CD1lb, CD16, HLA-DR 및 CD8에 대한 항체들을 포함한다. 임의의 구현예들에서, 통상 CD4+, CD25+, CD62Lhi, GITR+ 및 FoxP3+를 발현하는 조절 T 세포를 증폭 또는 양성적으로 선택하는 것이 요망될 수 있다.
예를 들어 하나의 구현예에서, T 세포는 항CD3/항CD28(즉 3×28) 접합 비드, 예를 들어 DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T와, 원하는 T 세포의 양성선택에 충분한 기간 동안 항온처리됨으로써 단리된다. 하나의 구현예에서, 상기 기간은 약 30분이다. 추가의 구현예에서, 상기 기간의 범위는 30분 내지 36시간 또는 이 이상의 기간, 그리고 이 범위 사이에 있는 모든 정수 값 만큼이다. 추가의 구현예에서, 상기 기간은 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6시간이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 기간은 10시간 내지 24시간이다. 하나의 바람직한 구현예에서, 항온처리 기간은 24시간이다. 백혈병 환자로부터 T 세포를 단리하기 위해 더욱 긴 항온처리기간, 예를 들어 24시간이 적용되면 세포 수득량을 증가시킬 수 있다. 종양 조직 또는 면역 약화된 개체들로부터 종양 침습성 림프구(TIL)를 단리할 때와 같이, 다른 세포 류에 비하여 적은 수의 T 세포가 존재하는 임의의 상황에서 T 세포를 단리하기 위해서는 더욱 긴 항온처리 시간이 적용될 수 있다. 뿐만 아니라, 더욱 긴 항온처리 시간이 적용되면, CD8+ T 세포의 포착 효율은 증가할 수 있다. 그러므로 단순히 시간을 단축하거나 연장함으로써 T 세포는 CD3/CD28 비드에 결합할 수 있으며/있거나, (본원에 추가로 기술된 바와 같이) 비드 대 T 세포의 비율을 증가시키거나 감소시킴으로써 T 세포의 하위 군집은 방법이 진행되는 동안 배양 개시시 또는 기타 시점에서 우선적으로 선택되거나 도태될 수 있다. 추가로, 비드 또는 기타 표면 상 항CD3 항체 및/또는 항CD28 항체의 비율을 증가 또는 감소시킴으로써 T 세포의 하위 군집들은 배양 개시시 또는 기타 원하는 시점에서 우선적으로 선택되거나 도태될 수 있다. 당 업자는, 본 발명의 문맥 중에서 복수 회의 선택 라운드도 또한 실행될 수 있음을 인지할 것이다. 임의의 구현예들에서, 활성화 및 증식 방법에 있어서 선택 과정을 수행하고, "선택되지 않은" 세포들을 사용하는 것이 요망될 수 있다. "선택되지 않은" 세포는 또한 후속 선택 라운드의 대상이 될 수도 있다.
그 다음, 얻어진 세포 독성 세포는 본원에 기술된 바와 같이 유전자 조작된다. 통상 발현 벡터 내에 위치하는 CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 세포 독성 세포에 도입되며, 그 결과 세포 독성 세포는 바람직하게 안정적으로 CAR을 발현할 것이다. CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 통상 세포 독성 세포 숙주 게놈에 통합된다. 몇몇 구현예들에서, 폴리뉴클레오티드 도입은 통합을 초래할 필요는 없고, 오히려 도입된 폴리뉴클레오티드의 일시적 유지만이 충분할 수 있다. 이러한 방식으로, 세포 독성 세포가 숙주에 도입된 다음 소정의 시간 이후, 예를 들어 상기 세포가 치료를 위하여 특정 위치에 이동할 수 있게 된 이후 작동을 시작하게 되는 경우, 개체는 단기 효과를 볼 수 있다.
치료될 질환 및 세포 독성 세포의 성질에 따라서, 유전자 조작된 세포 독성 세포는 피험체, 예를 들어 포유동물에 다양한 방식으로 도입될 수 있다. 유전자 조작된 세포 독성 세포는 종양 위치에 도입될 수 있다. 하나의 구현예에서, 유전자 조작 세포 독성 세포는 유영하다 암 세포를 찾아가거나, 또는 변형되어 유영하다 암을 찾아가게 된다. 사용된 유전자 조작 세포 독성 세포의 수는 다수의 인자들, 예를 들어 환경, 도입 목적, 세포의 생존기간, 사용될 프로토톨에 따라서 달라질 것이다. 예를 들어 투여 횟수, 세포의 증식 능력, 그리고 재조합 구성물의 안정성에 따라서 달라질 것이다. 유전자 조작된 세포 독성 세포는 일반적으로 관심 있는 위치 또는 이러한 위치 근처에 주입되는 분산액으로서 적용될 수 있다. 세포는 생리학적으로 허용 가능한 매질 중에 있을 수 있다.
치료 방법은 다수의 변인, 예를 들어 CAR에 대한 세포 반응, 세포 독성 세포에 의한 CAR의 발현 효율, 그리고 적당하게는 분비 수준, 발현된 CAR의 활성, 시간과 환경에 따라서 달라질 수 있는 피험체의 특별한 요구, 유전자 조작된 세포 독성 세포의 소실로 말미암은 세포 활성의 소실 속도, 또는 개별 세포의 발현 활성 등에 좌우된다는 것이 이해되어야 할 것이다. 그러므로, 각각의 개별 환자에 대해서, 대체적으로 군집에 투여될 수 있는 보편적 세포가 존재한다 하더라도 각각의 환자는 개체에 적당한 용량에 대해 모니터링될 것으로 예상되고, 이처럼 환자를 모니터링하는 것은 당 업계에서 흔히 있는 일이다.
하기 실시예는 예시적인 것이지, 본 발명의 방법들을 제한하는 것은 아니다. 당업자에게 명백한 기타 적합한 변형 및 일반적으로 현장에서 마주치는 조건들과 매개 변수들의 다양한 변형의 수정적용도 본 발명의 범위 내에 속한다.
실시예
실시예 1: 온도 돌연변이체에 대한 다중 벽 검정(예를 들어 96-웰 검정)의 일반적 설명:
적절한 기간 동안 형광 기질을 야생형 반응 온도 및 이보다 더 낮은 새 반응 온도(예를 들어 상기 언급된 바와 같이 37℃ 또는 25℃) 둘 다에서 다중 벽 플레이트의 각각의 웰에 첨가하였다. 적절한 여기 및 발광 스펙트럼(예를 들어 320 nm 여기/405 nm 발광)에서 형광 플레이트 판독장치 내 형광도를 측정함으로써 형광도를 검출하였다. 상대 형광도 단위(RFU)를 측정하였다. 야생형 분자 및 플라스미드/벡터 형질전환된 세포로부터의 상청액을 포지티브 및 네거티브 대조군으로서 사용하였다. 각각의 샘플, 반응 온도, 그리고 포지티브 및 네거티브 대조군에 대해 반응을 중복 수행하였다.
더 낮은 온도에서 활성이되(예를 들어 25℃에서 활성이되), 야생형 온도에서 활성이 감소되어(예를 들어 37℃에서 활성이 10%, 20%, 30%, 40% 또는 그 이상 감소되어) 약 1.1 이상보다 크거나 동일한(예를 들어 25℃ 또는 37℃에서의 활성의 비(25℃/37℃)가 1.1 이상보다 크거나 동일한) 돌연변이체를 추정 일차 온도 감수성 히트(hit)인 것으로 간주할 수 있다. 그 다음, 이들 추정 일차 온도 감수성 히트를 동일한 검정을 사용하여 재스크리닝하여 임의의 일차 히트를 확인하였다.
실시예 2: 온도 돌연변이체에 대하여 활성 확인을 위한 상이한 검정 방식(예를 들어 14㎖ 검정)의 일반적 설명:
온도 감수성 일차 히트로서 동정된 돌연변이체를 14㎖들이 배양 튜브에서 발현시키고, 이의 효소 활성을 야생형 온도(예를 들어 37℃) 및 더 낮은 온도(예를 들어 25℃)에서 측정하였다. 단백질을, 다중 벽 방식에 대해 상기 기술된 바와 같이 발현시키고 정제하였는데, 다만 발현은 다중 벽(96-웰 플레이트) 방식과는 상이한 방식(14㎖들이 튜브)으로 수행하였다.
각각의 돌연변이체 상청액을 다중 벽 플레이트, 예를 들어 96-웰 마이크로플레이트로 옮겼다. 형광 기질을 필요한 기간 동안 지정 반응 온도(야생형 온도 및 더 낮은 온도)에서 각각의 튜브에 첨가하였다. 야생형 분자를 포지티브 대조군으로서 사용하고, 벡터만으로 형질전환시킨 세포로부터 얻은 상청액을 네거티브 대조군으로서 사용하였다. 적절한 발광 스펙트럼(예를 들어 320 nm 여기/405 nmn 발광)에서 형광 플레이트 판독장치에서 형광도를 측정함으로써 형광도를 검출하였다. 상대 형광도 단위(RFU)를 측정하였다. 각각의 샘플, 반응 온도, 그리고 포지티브 및 네거티브 대조군에 대해 반응을 중복 수행하였다.
더 낮은 온도(예를 들어 25℃)에서 활성이지만, 야생형 온도(예를 들어 37℃)에서 적어도 30% 또는 그 이상 감소한 활성을 나타내어, 더 낮은 온도(예를 들어 25℃)에서의 활성 대 야생형 온도(예를 들어 37℃)에서의 활성의 비가 1.5와 동일하거나 더 큰 돌연변이체가 온도 감수성 히트로서 동정되었다.
더 낮은 온도(예를 들어 25℃)에서의 돌연변이체의 활성을 야생형 온도(예를 들어 37℃)에서의 야생형 분자의 활성과 비교하였다. 1 초과, 바람직하게는 2, 또는 2보다 큰 잔류 활성에 의해 제시되는 바와 같이, 만일 분자가 더 낮은 온도(예를 들어 25℃)에서 야생형 분자보다 활성이 크고, 돌연변이체가 야생형 온도(37℃)에서 야생형 분자와 비교되었을 때에 활성의 전체적인 감소를 나타내면, 돌연변이체 표현형이 온도 감수성 돌연변이체로서 확인될 수 있다.
실시예 3: 발견된 히트의 추가 진화에 관한 일반적 설명:
요망된다면, 새로운 조합 변이체 라이브러리를 모든 돌연변이체로부터 또는 앞서 동정되어 선택된 돌연변이체 히트로부터 제조하였다. 새로운 라이브러리를, 선택된 돌연변이체 각각에 대한 아미노산 변이체의 가능한 모든 조합을 함유하도록 디자인하고 새로운 히트에 대해 설명된 바와 같이 재스크리닝하였다.
실시예 4: 온도 감소 후 효소 활성의 가역성의 일반적 설명
온도 감수성의 진화된 돌연변이체를 추가로 검정하여, 더 낮은 온도(예를 들어, 25℃)에서의 효소 활성이, 돌연변이체를 상승한 온도에 노출시킨 후에 이보다 더 낮은 온도(예를 들어, 25℃)로 되돌려 가역성인지 또는 비가역성인지를 결정할 수 있었다. 온도 감수성 돌연변이체를 간략하게 기술된 바와 같이, 예를 들어 14㎖ 배양 관에서 원하는 임의의 방식으로 발현시켰다. 돌연변이체를 야생형 온도(예를 들어, 37℃) 및 다른 온도를 포함하는 여러 가지 조건 하에서 이의 활성에 대해 시험하고, 이후 필요한, 더 낮은 온도(예를 들어, 25℃)에 다시 노출시켰다. 더 낮은 온도에서 활성이고, 더 높은 온도 또는 야생형 온도로 상승하는 경우에 감소한 활성을 보이며(즉, 더 낮은 온도에서의 활성 대 더 높은 온도에서의 활성의 비가 1 이상, 1.5 이상, 또는 2 이상이며), 더 낮은 온도로 다시 강하될 때 기준 활성을 보이는 돌연변이체를 "가역성 히트"로서 스코어를 매겼다. 더 낮은 온도에서 활성이고, 더 높은 온도 또는 야생형 온도로 상승하는 경우에 감소한 활성을 보이며(즉, 더 낮은 온도에서의 활성 대 더 높은 온도에서의 활성의 비가 1 이상, 1.5 이상, 또는 2 이상이며), 더 낮은 온도로 다시 강하할 때 적어도 동일한 양의 감소한 활성을 보이는 돌연변이체를 "비가역성 히트"로서 스코어를 매겼다.
실시예 5: 조건부 활성 안지오스타틴 변이체를 스크리닝하기 위한 재료 및 방법
조건부 활성 안지오스타틴 변이체를 스크리닝하기 위한 재료 및 방법은 본원에 참조로 인용된 문헌{Chi and Pizzo, "Angiosatin is directly cytotoxic to tumor cell at low extracellular pH: a mechanism dependent on cell surface-associated ATP synthase", cancer Res. 2006; 66(2): 875-882}으로부터 수정적용할 수 있다.
재료
인간 플라스미노겐으로부터 유래한 야생형 안지오스타틴 크링글 1 내지 3을 Calbiochem(Darmstadt, Germany)으로부터 입수하고, 무균 PBS 중에서 재구성하였다. ATP 합성효소의 촉매 베타-서브유닛에 대해 유도된 폴리클로날 항체를 생성하고, 소의 Fl ATP 합성효소 서브유닛을 사전에 공지된 바와 같이 정제할 수 있었다 (Moser et al., "Angiostatin binds ATP synthase on the surface of human endothelial cells", Proc Natl Acad Sci USA 1999;96:2811-6; Moser et al. "Endothelial cell surface Fl-FO ATP synthase is active in ATP synthesis and is inhibited by angiostatin", Proc Natl Acad Sci USA;2001;98:6656-61). 카리포라이드를 무균수 중에 용해시키고 무균 여과시켰다.
세포 배양액
A549(폐 암종 조직으로부터 유래한 인간 상피 세포주), 또는 대안적 암 세포주(DU145, LNCaP, 또는 PC-3 세포)를, 예를 들어, ATCC로부터 얻을 수 있었다. 인간 탯줄 정맥 내피 세포(HUVEC)를, 기술된 바와 같이 사람 탯줄 정맥으로부터 단리시킬 수 있었다 (Grant et al., "Matrigel induces thymosin h 4 gene in differentiating endothelial cells", J Cell Sci 1995;108:3685-94). HUVEC 세포를 세포 표면상에서 ATP 합성효소를 발현시키는 세포주인 포지티브 대조군으로서 사용할 수 있었다. 세포를 1% 페니실린 스트렙토마이신 및 10% 혈청 대체 매질 3(Sigma, St. Louis, MO)과 함께 DMEM(Life Technologies, Carlsbad, CA) 중에서 배양시켜서 플라스미노겐의 존재를 최소화시킬 수 있었다. 낮은-pH(6.7) 배지를, 중탄산염을 5% CO2에서 10 mmol/L로 감소시키고, 34 mmol/L NaCl로 보충하여 삼투질 농도를 유지하거나, 또는 17% CO2 조건 하에 22 mmol/L 중탄산염 배지를 항온처리함으로써 제조할 수 있었다. 적용되는 pH를 저하하는 방법은 실험적 제한 및 검정에 의해 다양할 수 있다.
유동 세포 분석법
ATP 합성효소가 종양 세포주의 세포 표면상에서 작용하는 것을 보장하기 위해, 유동 세포 분석법 실험을 수행할 수 있었다. 예를 들어, A549 세포주를 0, 12, 24, 48 및 72 시간 동안 저산소증 상태(0.5% 02, 5% CO2, N2 균형) 대 산소 정상 상태(21% O2, 5% CO2) 하에 변동 pH 배지(10, 22 및 44 mmol/L 중탄산염 DMEM)에서 배양할 수 있었다. 생 세포를 차단하고, 항β서브유닛 항체와 함께 항온처리한 다음, 세정, 차단시키고, 이차 염소 항-토끼 항체-FITC(Southern Biotech, Birmingham, AL)와 함께 항온처리한 다음, 다시 세정할 수 있었는데, 이때 모든 단계는 4℃에서 수행하였다. 요오드화 프로피듐(BD Biosciences, San Jose, CA)을 모든 샘플과 함께 항온처리하여, 면역 약화된 막을 갖는 세포를 식별할 수 있었다. 10,000개 세포 중 FITC의 평균 형광 세기를 FACSCalibur 유동 세포 분석기(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)에 의해 정량화시킬 수 있었고, 요오드화 프로피듐을 흡수한 세포를 배제시켜 CELLQuest 소프트웨어(BD Biosciences) 상에서 미토콘드리아 ATP 합성효소가 검출되지 않도록 할 수 있었다.
세포 표면 ATP 생성 검정
96-웰 플레이트 중의 A549 또는 1-LN 세포(웰당 60,000개)에 배지를 다시 채우고, 37℃, 5% CO2에서 30분 동안 안지오스타틴, 안지오스타틴 변이체, 항-베타-서브유닛 항체, 소 혈청 알부민에 대해 생성된 토끼 IgG(Organon Teknika, West Chester, PA), 피세아탄놀(포지티브 대조군으로 사용되는 ATP 합성효소 F1의 공지된 억제제, Sigma), 또는 배지 단독으로 처리하였다. 그 다음, 세포를 20초 동안 0.05 mmol/L ADP로 항온처리하였다. 상청액을 분리해내고, 공지된 바와 같이 (23) CellTiterGlo 발광 검정(Promega, Madison, WI)으로 ATP 생성에 대해 검정할 수 있었다. 세포 용해물을 유사하게 분석하여, ATP의 세포내 풀(pool)이 임의의 조건 하에 변하지 않았음을 확인할 수 있었다. Luminoskan Ascent(Thermo Labsystems, Helsinki, Finland)에서 기록이 이루어질 수 있었다. 데이터를 각각의 독립적 실험에 대해 결정된 표준을 기준으로 세포당 ATP의 몰로 표현하였다.
세포 증식 검정
암 세포주에 대한 안지오스타틴의 효과를 무혈청 배지 중에서 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-5-(3-카르복시메톡시페닐)-2-(4-술포페닐)-2H-테트라졸리움, 내부 염(MTS) 증식 검정으로 평가할 수 있었다. 안지오스타틴의 존재 또는 부재 하에 37℃ 및 5% CO2에서 20시간 동안 항온처리한 후에 96-웰 마이크로플레이트 각각의 웰에서의 상대적 세포 수를, 제작자의 프로토콜에 따라 AQueous One Cell Proliferation Assay(Promega)를 사용하여 측정할 수 있었다. 배지 pH를 중탄산염 농도를 통해 5% CO2에서 조절할 수 있었다.
세포 독성의 평가
세포 사멸 및 세포 용해를 정량화하기 위해, 시토졸로부터 상청액 내로 방출된 젖산 염 탈수소효소(LDH)의 활성을 Cytotoxicity Detection 키트(Roche, Indianapolis, IN)로 측정할 수 있었다. 안지오스타틴, 안지오스타틴 변이체, 항-베타-서브유닛 항체, 토끼 IgG, 카리포라이드, 및 Triton X(포지티브 대조군으로서 세포를 투과처리하기 위해 사용되는 세제)로 처리한 암 세포들(예를 들어, A549 세포)(웰당 5,000개)을 각각 중성 및 낮은 pH 조건하에 37℃ 및 5% CO2 또는 17% CO2에서 15시간 동안 항온처리할 수 있었다. 세포 독성의 지수를, 4회 동일처리된 샘플들로부터의 평균 흡광도를, 동일한 pH 배지에 상응하는 미처리 샘플들 4개로부터의 평균 흡광도로 나눔으로써 계산할 수 있었다. 세포 괴사 및 세포 자살의 평가. 안지오스타틴 유도 세포 사멸의 방식을 분석하기 위해, 히스톤-DNA ELISA를 수행할 수 있었다. A549 세포(웰당 5,000개)에 대한, 안지오스타틴, 안지오스타틴 변이체, 항-베타-서브유닛 항체, 토끼 IgG 및 카리포라이드의 효과를 핵외 히스톤-DNA 단편의 검출에 의존하는 ELISA 세포자살 및 세포괴사 검정(Roche)을 사용하여 분석할 수 있었다. 세포자살 또는 세포괴사를 각각, 제제의 존재 또는 부재 하에 37℃에서 15시간의 항온처리 후 4개 샘플의 세포 용해물 또는 상청액으로부터 분석하였다. 세포자살 또는 세포괴사 지수를, 시험된 샘플들 4개로부터의 평균 흡광도를 동일한 pH 배지에 상응하는 4개의 미처리 샘플들로부터의 평균 흡광도로 나눔으로써 계산할 수 있었다. 배지 pH를 5% CO2 또는 17% CO2에서 항온처리에 의해 조절할 수 있었다.
세포 내 pH(pHi) 측정
pHi를, 유리 커버슬립을 갖는 35-mm 마이크로웰 접시(MatTek, Ashland, MA) 상에 도말된 세포에서의 형광도에 의해 측정할 수 있었다. 세포를 성장 인자가 감소한 무 페놀-레드 Matrigel(BD Biosciences) 상에 도말할 수 있었다. 밤샘 성장 후에, 배지를 바꿀 수 있었고, 세포를 15분 동안 pH-감수성 형광 염료 cSNARF(Molecular Probes, Eugene, OR)로 로딩한 후, 새로운 배지에서 20분 동안 회수할 수 있었다. 세포를, 발광 스펙트럼의 1시간 수집 동안 37℃, 5% CO2에서 현미경 스테이지에 놓았는데, 이로부터 pHi를 각각 7 내지 15개 세포를 함유하는 필드(field)로부터 기술된 바와 같이 계산할 수 있었다(Wahl ML, Grant DS. "Effects of microenvironmental extracellular pH and extracellular matrix proteins on angiostatin's activity and on intracellular pH", Gen Pharmacol 2002;35:277-85). 스펙트럼 수집 개시시 배지를 접시로부터 제거할 수 있었으며, 세포에 pH 억제제 안지오스타틴, 항-베타-서브유닛, 토끼 IgG, 또는 카리포라이드, 나트륨-양성자 교환 억제제의 존재 또는 부재 하에 1㎖의 새로운 배지를 바꾸어 넣어줄 수 있었다. 상기 기술된 바와 같이, 배지 pH는 %CO2가 고정된 상태에서 중탄산염 농도에 의해 조절될 수 있었다.
실시예 6: scFv 조건부 활성 항체의 생성
약물 표적 X에 대한 조건부 활성 항체 2개(CAB-scFv-63.9-4 및 CAB-scFv-63.9-6)를 야생형 인간 IgG1 Fc와의 동종 이량체(그 결과, 2가 항체 CAB-scFv-63.9-4-01 및 CAB-scFv-63.9-6-01가 생성됨; 도 2 및 3)로서 뿐만 아니라, 노브-인-홀 계 내 이종 이량체(그 결과, 1가 scFv, 즉 1가 항체 scFv CAB-scFv-63.9-4-02 및 CAB-scFv-63.9-6-02가 생성됨; 도 2 및 3)로서 발현시켰다.
이처럼 약물 표적 X에 대한 항체들의 pH6.0 및 pH7.4에서의 결합 친화성을 ELISA 검정에 의해 측정하였다. 도 2에 보인 바와 같이, scFv 항체는 pH6.0 및 pH7.4 두 경우 모두에서 약물 표적 X에 대해 친화성을 보였는데, 이때의 친화성은 전 2가 항체의 친화성과 거의 동일하였다. 뿐만 아니라, 도 3에 보인 바와 같이 이러한 scFv 항체의 pH7.4에서의 선택성에 대한 pH6.0에서의 선택성도 또한 전 2가 항체의 경우와 거의 동일하였다. 이 실시예는, 본 발명의 조건부 활성 항체는 scFv 항체 또는 전 2가 항체 중 어느 하나의 친화성 및 선택성과 거의 동일한 친화성 및 선택성을 가짐을 보여주고 있다. 그러므로 본 발명의 조건부 활성 항체는, 본 발명의 CAR-T 플랫폼 내 CAR을 암호화하는 DNA 분자에 단일 DNA 사슬로서 삽입될 수 있다.
실시예 7: CAR-T 세포
본 발명의 하나의 구현예에 따라서, 선택성과 친화성뿐만 아니라, pH 6.0 및 pH 7.4 둘 다에서의 발현 수준에 대해 동시에 스크리닝하여 약물 표적 X에 대한 조건부 활성 항체를 제조하였다. 스크리닝시 잘못된 포지티브 값들을 보일 수 있는 인간 항체가 혈청 중에 존재하였기 때문에, FLAG 태그를 사용하여 스크리닝을 혈청 중에서 수행하였다. 스크리닝 완충제는 탄산염 완충제(링거 함유 크렙스 완충제 - PBS와 상이한 표준 완충제)이었다. 생성된 조건부 활성 항체는 pH 6.0에서 약물 표적 X에 대한 친화성이 더 컸지만, pH 7.4에서는 동일한 약물 표적 X에 대한 친화성은 더 작았는데, 이 결과는 둘 다 야생형 항체의 경우와 비교되었다. 또한 이러한 조건부 활성 항체 모두는 이하 표 2("클론" 컬럼은 항체를 보이고, 발현 수준 "㎎/㎖"는 두 번째 컬럼에 보임)에 보인 바와 같이 발현 수준이 높았다.
이와 같이 요구되는 발현 수준("주문된 양", 예상 발현 수준)을 보이는 항체의 클론은 서비스 제공자에게 보내어졌다. 그러나, 이러한 항체들의 실제 발현 수준("전달된 양")은 매우 높아서 예상 발현 수준을 초과하였다.
Figure 112017023752157-pct00002
일례로서 BAP063.9-13-1 항체가 사용되었을 때, 조건부 활성 항체는 도 4에 도시된 바와 같이 완충제 중에서 응집을 보이지 않았다. BAP063.9-13-1 항체를 크기별 배제 크로마토그래피로 분석하였다. 도 4에서, 오로지 하나의 피크만이 확인되었는데, 이는 항체가 거의 응집하지 않거나 아예 응집하지 않음을 보여준다.
표면 플라스몬 공명(SPR)을 이용하여 조건부 활성 항체를 또한 검정하여, 이 항체의 약물 표적 X에 대한 온-오프 속도를 측정하였다. SPR 검정은 조건부 활성 항체에 대한 온-오프 속도를 측정하기 위한 것으로 알려져 왔다. SPR 검정은 중탄산염의 존재 하에 수행되었다. (동물 및 인간 내) 조건부 활성 항체의 생체 내 온-오프 속도는 조건부 활성 항체에 있어 매우 중요한 특징이다.
음성 대조군(pH 6.0 및 pH 7.4 둘 다에서 유사한 온 속도(on-rate)를 보이는 BAP063 10F10)에 비하여, 조건부 활성 항체는 pH 6.0에서 신속한 온 속도를 보였고, pH 7.4에서는 더 느린 온 속도를 보였다(도 5). 뿐만 아니라, 실온에서 60 ℃로 온도를 상승시키는 것은 SPR 검정 결과들을 유의적으로 변경하지는 않았다(도 5). SPR 검정은 또한 이러한 조건부 활성 항체가 pH 7.4에서보다 pH 6.0에서 매우 선택적이었음을 보였다(도 6a 및 6b는 일례로서 하나의 항체를 보임).
조건부 활성 생체 항체에 대해 표 3에 요약하여 두었다. 항체들 중 2개는 scFv(BAP063.9-13.3 및 BAP063.9-48.3)로서 발현되었으며, 이것들은 CAR-T 플랫폼 내 CAR로 삽입될 준비가 되었다. 60 ℃에서 1시간 동안 항체를 항온처리하는 것은 항체 대부분의 친화성을 변경하지는 않았다("열 안정성"). pH 6.0 및 pH 7.4에서의 결합 활성을 확인하기 위해 SPR을 이용하여 데이터를 보고하는 2개의 컬럼(표 3의 마지막 두 컬럼)에서, "BAP063.6-hum1OF10-FLAG"에 대한 비교가 이루어졌다(음성 대조군, 표 3의 두 번째 열). 이러한 항체의 선택성은, 마지막 두 컬럼의 데이터들 사이 차에 의해 측정될 수 있었다. 2개의 scFv 항체는 매우 높은 선택성을 가졌다(pH 6에서 75 % 및 50 % 대 pH 7.4에서 0 %).
Figure 112017023752157-pct00003
본원에 언급된 모든 문헌들은 본 명세서에 그 전체가 참조로 인용되거나, 대안적으로 이 문헌들이 특별히 필요한 경우에 자체의 개시내용을 제공하기 위해 참조로 인용된다.
그러나, 본 발명의 다수 특징 및 이점이 전술된 본 발명의 설명에 제시되어 있긴 하지만, 본 발명의 기능과 구조에 관한 세부 설명과 함께 본 발명은 오로지 예시를 위한 것으로서, 특히 본 발명의 원리에 속하는 부분들의 형태, 크기 및 정렬의 문제에 있어서의 변화는, 첨부된 청구항에 표현된 용어들의 일반적인 넓은 의미들에 의해 지정되는 최대한도로 세부적으로 이루어질 수 있음이 이해되어야 한다.

Claims (44)

  1. i. 티로신 키나제 성장 인자 수용체에 결합하는 모항체 또는 이의 도메인으로부터 진화되었으며, 정상 생리학적 pH에서 벗어나는 종양 미세환경 비정상 pH에서의 검정에서 티로신 키나제 성장 인자 수용체에 결합하는 동일한 활성에 비교하여 피험체에게 도입되는 부분, 또는 키메라 항원 수용체가 작용하는 부위의 조직 또는 기관에서의 정상 생리학적 pH에서의 검정에서 감소된 활성을 가지는, 적어도 하나의 항체 또는 항원 결합 항체 단편;
    ii. 경막 도메인; 그리고
    iii. 세포 내 신호전달 도메인
    을 포함하는, 종양 세포 표면에 과발현되는 티로신 키나제 성장 인자 수용체와의 결합을 위한 키메라 항원 수용체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 항체 단편은 모항체 또는 이의 도메인과 비교되었을 때 정상 생리학적 pH에서 티로신 키나제 성장 인자 수용체와의 결합 친화성이 감소한 키메라 항원 수용체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 항체 단편은 모항체 또는 이의 도메인과 비교되었을 때 비정상 pH 하의 검정에서 활성이 증가한 키메라 항원 수용체.
  4. 제2항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 항체 단편은 모항체 또는 이의 도메인과 비교되었을 때 비정상 pH 하의 검정에서 활성이 증가한 키메라 항원 수용체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 항체 단편은 모항체 또는 이의 도메인과 비교되었을 때 비정상 pH 하 검정에서의 선택성이 증가한 키메라 항원 수용체.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 모항체 또는 이의 도메인과 비교되었을 때 키메라 항원 수용체를 함유하는 단백질의 발현 수준이 증가하도록 입체배열되는 키메라 항원 수용체.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 세포 외 스페이서 도메인 또는 적어도 하나의 보조 자극 도메인을 추가로 포함하는 키메라 항원 수용체.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 키메라 항원 수용체는 2개의 항체 또는 항원 결합 항체 단편을 포함하고, 각각의 항체 또는 항원 결합 항체 단편은 동일한 표적 항원의 상이한 에피토프 또는 상이한 표적 항원과 결합하는 키메라 항원 수용체.
  9. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 항체 단편은 항체인 키메라 항원 수용체.
  10. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 항체 단편은 전장 항체, 단일 사슬 항체, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편, 그리고 2가 단일 사슬 항체 또는 다이아바디로부터 선택되는 키메라 항원 수용체.
  11. 제7항에 있어서, 상기 세포 외 스페이서 도메인은 항체의 Fc 단편, 항체의 힌지 영역, 항체의 CH2 영역, 항체의 CH3 영역, 인공 스페이서 서열 및 이것들의 조합으로부터 선택되는 키메라 항원 수용체.
  12. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 경막 도메인은 I형 경막 단백질, T 세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 사슬, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 및 CD154의 경막 영역들 및 소수성 인공 서열로부터 선택되는 키메라 항원 수용체.
  13. 제7항에 있어서, 상기 보조 자극 도메인은 TNFR 상과에 속하는 단백질, CD28, CD137, CD134, DaplO, CD27, CD2, CD5, ICAM-1, LFA-1, Lck, TNFR-I, TNFR-II, Fas, CD30, CD40, ICOS LIGHT, NKG2C 및 B7-H3의 보조 자극 도메인들로부터 선택되는 키메라 항원 수용체.
  14. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 세포 내 신호전달 도메인은 인간 CD3 제타 사슬, FcRIII, FcsRI, Fc 수용체의 세포질 미부, 세포질 수용체를 보유하는 면역 수용체 티로신 기반 활성화 모티브(ITAM), TCR 제타, FcR 감마, FcR 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b 및 CD66d의 세포질 신호전달 도메인들로부터 선택되는 키메라 항원 수용체.
  15. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항의 키메라 항원 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터.
  16. 제15항에 있어서, 상기 발현 벡터는 렌티바이러스 벡터, 감마 레트로바이러스 벡터, 거품형성 바이러스 벡터, 아데노 연관 바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 폭스 바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터, 조작된 하이브리드 바이러스 그리고 트랜스포손 매개 벡터로부터 선택되는 발현 벡터.
  17. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항의 키메라 항원 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자 조작 세포 독성 세포.
  18. 제17항에 있어서, 상기 세포 독성 세포는 T 세포인 유전자 조작 세포 독성 세포.
  19. 제18항에 있어서, 상기 T 세포는 처녀 T 세포, 중심 기억 T 세포 및 효과기 기억 T 세포로부터 선택되는 유전자 조작 세포 독성 세포.
  20. 제17항에 있어서, 상기 세포 독성 세포는 자연 살해 세포, 활성화된 NK 세포, 호중구, 호산구, 호염기구, B 세포, 대식 세포 및 림포카인 활성화 살해 세포로부터 선택되는 유전자 조작 세포 독성 세포.
  21. 제17항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 세포 독성 세포의 게놈에 통합되는 유전자 조작 세포 독성 세포.
  22. 제17항에 있어서, 상기 세포 독성 세포는 치료적 용도에 충분한 양으로 키메라 항원 수용체를 생산하는 유전자 조작 세포 독성 세포.
  23. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항의 키메라 항원 수용체, 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항의 키메라 항원 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터, 및 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항의 키메라 항원 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자 조작 세포 독성 세포 중 하나 이상; 그리고
    b. 약학적으로 허용 가능한 부형제
    를 포함하는 암의 치료를 위한 약학 조성물.
  24. 제23항에 있어서, 상기 암은 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골육종 및 기타 육종, 활막종, 중피종, 유잉(Ewing) 종양, 평활근육종, 횡문근육종, 결장 암종, 림프성 악성종양, 췌장암, 유방암, 폐암, 난소암, 전립선암, 간세포 암종, 편평세포암종, 기저세포암종, 선암종, 한선 암종, 거대종격동암종, 유두갑상샘암종, 갈색세포종, 피지선 암종, 유두암종, 유두선암종, 수질암종, 기관지원성암종, 신세포암종, 간세포암, 담관암종, 융모암, 빌름(Wilm) 종양, 자궁경부암, 고환 종양, 정상피종, 방광암종, 흑색종, 신경교종, 교모세포종, 성상세포종, CNS 림프종, 배아세포종, 수모세포종, 신경초종 두개인두종, 상의세포종, 송과체부종양, 혈관모세포종, 청신경종, 핍지교종, 수막종, 신경아세포종, 망막아세포종 및 뇌 전이로부터 선택되는 고형 종양인, 암의 치료를 위한 약학 조성물.
  25. 제23항에 있어서, 상기 암은 백혈병, 진성 적혈구증가증, 림프종, 호지킨병, 비 호지킨 림프종, 다발성 골수종, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 중쇄병, 골수이형성증후군, 모양 세포 백혈병 및 골수이형성증으로부터 선택된 혈액학적 종양인, 암의 치료를 위한 약학 조성물.
  26. 적어도 하나의 항체 또는 항원 결합 항체 단편, 경막 도메인 및 세포 내 신호전달 도메인을 포함하는 종양 세포 표면에 과발현되는 티로신 키나제 성장 인자 수용체와의 결합을 위한 키메라 항원 수용체를 제조하기 위한 방법으로서, 이 방법은
    i. 돌연변이 DNA를 제조하기 위해 하나 이상의 진화 기술을 사용하여 모항체 또는 이의 도메인을 암호화하는 DNA를 진화시키는 단계;
    ii. 이 돌연변이 DNA를 발현시켜 돌연변이 항체들 또는 항원 결합 항체 단편들을 제조하는 단계;
    iii. 돌연변이 항체들 또는 항원 결합 항체 단편들을 대상으로
    피험체에게 도입되는 부분, 또는 키메라 항원 수용체가 작용하는 부위의 조직 또는 기관에서의 정상 생리학적 pH에서 티로신 키나제 성장 인자 수용체에 대한 결합의 검정 및 정상 생리학적 pH에서 벗어나는 종양 미세환경의 비정상 pH에서 티로신 키나제 성장 인자 수용체에 대한 결합의 검정을 수행하는 단계; 그리고
    iv. 상기 단계 iii에서 돌연변이 항체들 또는 항원 결합 항체 단편들로부터 정상 생리학적 pH에서 벗어나는 종양 미세환경의 비정상 pH에서의 검정에서 티로신 키나제 성장 인자 수용체에 결합하는 동일한 활성에 비교하여 정상 생리학적 pH에서의 티로신 키나제 성장 인자 수용체에 결합하는 검정에서 감소된 활성을 가지는 조건부 활성 항체 또는 항원 결합 항체 단편을 선택하는 단계;의 상기 단계 (i)-(iv)에 의해 종양 세포 표면에 과발현되는 티로신 키나제 성장 인자 수용체에 결합하는 모항체 또는 이의 도메인으로부터 적어도 하나의 항체 또는 항원 결합 항체 단편을 제조하는 단계;
    개별 도메인들을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열들을 결찰(ligation) 하여 단일 폴리뉴클레오티드 서열을 생성하는 단계; 및
    상기 단계에서 생성된 폴리뉴클레오티드 서열로부터 키메라 항원 수용체를 발현하는 단계
    를 포함하는 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 항체 단편은 또한 정상 생리학적 pH 하에의 검정에서 모항체 또는 이의 도메인과 비교되었을 때, 티로신 키나제 성장 인자 수용체에 대한 결합 친화성이 감소한 방법.
  28. 제26항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 항체 단편은 비정상 pH 하에의 검정에서 모항체 또는 이의 도메인과 비교되었을 때, 활성이 증가한 방법.
  29. 제27항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 항체 단편은 모항체 또는 이의 도메인과 비교되었을 때 비정상 pH 하의 검정에서 활성이 증가한 방법.
  30. 제26항 내지 제29항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 항체 단편은 비정상 pH 하에의 검정에서 모항체 또는 이의 도메인의 항체 또는 항원 결합 항체 단편과 비교되었을 때, 선택성이 증가한 방법.
  31. 제26항 내지 제29항 중 어느 하나의 항에 있어서, 모항체 또는 이의 도메인과 비교되었을 때 키메라 항원 수용체를 함유하는 단백질의 발현 수준이 증가하도록 입체배열되는 방법.
  32. 제26항 내지 제29항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 진화 단계는 PCR, 오류 유발 PCR, 셔플링, 올리고뉴클레오티드 유도 돌연변이 유발, 조립 PCR, 유성 PCR 돌연변이 유발, 생체 내 돌연변이 유발, 카세트 돌연변이 유발, 반복 앙상블 돌연변이 유발, 지수 앙상블 돌연변이 유발, 위치 특이적 돌연변이 유발, 유전자 재조립, 유전자 위치 포화 돌연변이 유발, 시험관 내 돌연변이 유발, 리가아제 연쇄 반응, 올리고뉴클레오티드 합성 및 이것들의 조합으로부터 선택되는 기술을 포함하는 방법.
  33. a. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항의 키메라 항원 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터를 피험체로부터 얻은 세포 독성 세포에 도입하여, 유전자 조작된 세포 독성 세포를 제조하는 단계; 및
    b. 유전자 조작된 세포 독성 세포를 피험체에 투여하는 단계
    를 포함하는, 인간을 제외한 피험체에서 암을 치료하기 위한 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 발현 벡터는 렌티바이러스 벡터, 감마 레트로바이러스 벡터, 거품형성 바이러스 벡터, 아데노 연관 바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 폭스 바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터, 조작된 하이브리드 바이러스 그리고 트랜스포손 매개 벡터로부터 선택되는 방법.
  35. 제33항에 있어서, 상기 세포 독성 세포는 T 세포인 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 T 세포는 처녀 T 세포, 중심 기억 T 세포 및 효과기 기억 T 세포로부터 선택되는 방법.
  37. 제33항에 있어서, 상기 세포 독성 세포는 자연 살해 세포, 활성화된 NK 세포, 호중구, 호산구, 호염기구, B 세포, 대식 세포 및 림포카인 활성화 살해 세포로부터 선택되는 방법.
  38. 제33항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 세포 독성 세포의 게놈에 통합되는 방법.
  39. 제33항에 있어서, 상기 세포 독성 세포는 치료적 용도에 충분한 양으로 키메라 항원 수용체를 생산하는 방법.
  40. 제33항에 있어서, 상기 암은 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골육종 및 기타 육종, 활막종, 중피종, 유잉(Ewing) 종양, 평활근육종, 횡문근육종, 결장 암종, 림프성 악성종양, 췌장암, 유방암, 폐암, 난소암, 전립선암, 간세포 암종, 편평세포암종, 기저세포암종, 선암종, 한선 암종, 거대종격동암종, 유두갑상샘암종, 갈색세포종, 피지선 암종, 유두암종, 유두선암종, 수질암종, 기관지원성암종, 신세포암종, 간세포암, 담관암종, 융모암, 빌름(Wilm) 종양, 자궁경부암, 고환 종양, 정상피종, 방광암종, 흑색종, 신경교종, 교모세포종, 성상세포종, CNS 림프종, 배아세포종, 수모세포종, 신경초종 두개인두종, 상의세포종, 송과체부종양, 혈관모세포종, 청신경종, 핍지교종, 수막종, 신경아세포종, 망막아세포종 및 뇌 전이로부터 선택되는 고형 종양인 방법.
  41. 제33항에 있어서, 상기 암은 백혈병, 진성 적혈구증가증, 림프종, 호지킨병, 비 호지킨 림프종, 다발성 골수종, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 중쇄병, 골수이형성증후군, 모양 세포 백혈병 및 골수이형성증으로부터 선택된 혈액학적 종양인 방법.
  42. 삭제
  43. 삭제
  44. 삭제
KR1020177006675A 2014-08-28 2015-08-27 변형된 t 세포에 대한 조건부 활성 키메라 항원 수용체 Active KR102615681B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020237043017A KR102818922B1 (ko) 2014-08-28 2015-08-27 변형된 t 세포에 대한 조건부 활성 키메라 항원 수용체

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201462043067P 2014-08-28 2014-08-28
US62/043,067 2014-08-28
PCT/US2015/047197 WO2016033331A1 (en) 2014-08-28 2015-08-27 Conditionally active chimeric antigen receptors for modified t-cells

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020237043017A Division KR102818922B1 (ko) 2014-08-28 2015-08-27 변형된 t 세포에 대한 조건부 활성 키메라 항원 수용체

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20170042325A KR20170042325A (ko) 2017-04-18
KR102615681B1 true KR102615681B1 (ko) 2023-12-18

Family

ID=55400578

Family Applications (4)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020237043017A Active KR102818922B1 (ko) 2014-08-28 2015-08-27 변형된 t 세포에 대한 조건부 활성 키메라 항원 수용체
KR1020177006675A Active KR102615681B1 (ko) 2014-08-28 2015-08-27 변형된 t 세포에 대한 조건부 활성 키메라 항원 수용체
KR1020247007173A Pending KR20240034265A (ko) 2014-08-28 2016-02-24 변형된 t 세포에 대한 조건부 활성 키메라 항원 수용체
KR1020187006771A Active KR102646445B1 (ko) 2014-08-28 2016-02-24 변형된 t 세포에 대한 조건부 활성 키메라 항원 수용체

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020237043017A Active KR102818922B1 (ko) 2014-08-28 2015-08-27 변형된 t 세포에 대한 조건부 활성 키메라 항원 수용체

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020247007173A Pending KR20240034265A (ko) 2014-08-28 2016-02-24 변형된 t 세포에 대한 조건부 활성 키메라 항원 수용체
KR1020187006771A Active KR102646445B1 (ko) 2014-08-28 2016-02-24 변형된 t 세포에 대한 조건부 활성 키메라 항원 수용체

Country Status (14)

Country Link
US (5) US20170260261A1 (ko)
EP (3) EP4074735B1 (ko)
JP (3) JP7286267B2 (ko)
KR (4) KR102818922B1 (ko)
CN (2) CN107074975A (ko)
AU (3) AU2015308818B2 (ko)
BR (1) BR112018003535A2 (ko)
CA (2) CA2959141A1 (ko)
DK (2) DK4074735T3 (ko)
ES (1) ES2913865T3 (ko)
HK (1) HK1246803A1 (ko)
MX (4) MX2017002605A (ko)
RU (2) RU2764074C2 (ko)
WO (2) WO2016033331A1 (ko)

Families Citing this family (111)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2948544A4 (en) 2013-01-28 2016-08-03 St Jude Childrens Res Hospital CHIMERIC RECEPTOR WITH NKG2D SPECIFICITY FOR CELL THERAPY AGAINST CANCER AND INFECTION DISEASES
EP3143134B1 (en) 2014-05-15 2020-10-28 National University of Singapore Modified natural killer cells and uses thereof
EP4074735B1 (en) * 2014-08-28 2025-05-21 BioAtla, Inc. Conditionally active chimeric antigen receptors for modified t-cells
US11111288B2 (en) * 2014-08-28 2021-09-07 Bioatla, Inc. Conditionally active chimeric antigen receptors for modified t-cells
US20170151281A1 (en) 2015-02-19 2017-06-01 Batu Biologics, Inc. Chimeric antigen receptor dendritic cell (car-dc) for treatment of cancer
EP3262166A4 (en) 2015-02-24 2018-08-15 The Regents of The University of California Binding-triggered transcriptional switches and methods of use thereof
EA202090931A3 (ru) 2015-05-18 2020-10-30 Тср2 Терапьютикс Инк. Композиции и способы перепрограммирования tcr с помощью гибридных белков
US10434153B1 (en) 2015-05-20 2019-10-08 Kim Leslie O'Neill Use of car and bite technology coupled with an scFv from an antibody against human thymidine kinase 1 to specifically target tumors
US11173179B2 (en) 2015-06-25 2021-11-16 Icell Gene Therapeutics Llc Chimeric antigen receptor (CAR) targeting multiple antigens, compositions and methods of use thereof
TW202444897A (zh) 2015-06-25 2024-11-16 美商生物細胞基因治療有限公司 嵌合抗原受體(car)、組合物及其使用方法
KR20240132100A (ko) 2015-07-28 2024-09-02 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실베니아 키메릭 항원 수용체를 발현하는 변형된 단핵세포/대식세포 및 그의 용도
US11352439B2 (en) * 2015-08-13 2022-06-07 Kim Leslie O'Neill Macrophage CAR (MOTO-CAR) in immunotherapy
US12128102B2 (en) 2016-03-08 2024-10-29 Takeda Pharmaceutical Company Limited Constrained conditionally activated binding proteins
WO2020047527A2 (en) 2018-09-02 2020-03-05 F1 Bioventures, Llc Methods and compositions for genetically modifying lymphocytes in blood or in enriched pbmcs
AU2017236796B2 (en) * 2016-03-19 2021-07-15 Exuma Biotech, Corp. Methods and compositions for transducing lymphocytes and regulated expansion thereof
US11325948B2 (en) 2016-03-19 2022-05-10 Exuma Biotech Corp. Methods and compositions for genetically modifying lymphocytes to express polypeptides comprising the intracellular domain of MPL
WO2022047417A1 (en) * 2020-08-31 2022-03-03 Exuma Biotech Corp. Anti-idiotype compositions and methods of use thereof
US11111505B2 (en) 2016-03-19 2021-09-07 Exuma Biotech, Corp. Methods and compositions for transducing lymphocytes and regulating the activity thereof
WO2018161064A1 (en) 2017-03-03 2018-09-07 F1 Oncology, Inc. Methods and compositions for transducing and expanding lymphocytes and regulating the activity thereof
EP3443001B1 (en) 2016-04-11 2025-04-30 Obsidian Therapeutics, Inc. REGULATED BIOCIRCUIT SYSTEMS
KR102697688B1 (ko) * 2016-04-15 2024-08-21 바이오아트라, 인코퍼레이티드 항 Axl항체 및 이의 면역접합체와 이것들의 용도
WO2017192536A1 (en) 2016-05-02 2017-11-09 University Of Kansas Eliminating mhc restriction from the t cell receptor as a strategy for immunotherapy
WO2017193059A1 (en) * 2016-05-06 2017-11-09 The Regents Of The University Of California Systems and methods for targeting cancer cells
KR20240148936A (ko) 2016-05-13 2024-10-11 바이오아트라, 인코퍼레이티드 항 ror2 항체, 항체 단편 및 이의 면역접합체와 이것들의 용도
EP3474867A4 (en) 2016-06-24 2020-05-20 iCell Gene Therapeutics LLC CHIMEAN ANTIGENT RECEPTORS (CARS) COMPOSITIONS AND METHODS FOR USE THEREOF
CN109563507B (zh) 2016-07-08 2024-03-05 埃克苏马生物技术公司 用于转导淋巴细胞及调节其活性的方法及组合物
ES2960835T3 (es) 2016-07-12 2024-03-06 Kite Pharma Inc Moléculas de unión a antígeno y métodos de uso de las mismas
US11242376B2 (en) 2016-08-02 2022-02-08 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for TCR reprogramming using fusion proteins
KR102637610B1 (ko) 2016-08-23 2024-02-19 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 단백질용해 절단가능한 키메라 폴리펩타이드 및 이의 사용 방법
CN106279438B (zh) * 2016-08-24 2019-10-22 北京领柯生物科技有限公司 新型嵌合抗原受体及其用途
SG11201901411VA (en) 2016-08-31 2019-03-28 Bioatla Llc Conditionally active polypeptides and methods of generating them
US20190298771A1 (en) 2016-09-28 2019-10-03 Atossa Genetics Inc. Methods of adoptive cell therapy
JP7217970B2 (ja) 2016-10-07 2023-02-06 ティーシーアール２ セラピューティクス インク． 融合タンパク質を用いてｔ細胞受容体をリプログラミングするための組成物及び方法
EP3315511A1 (en) * 2016-10-29 2018-05-02 Miltenyi Biotec GmbH Adapter chimeric antigen receptor expressing cells for targeting of multiple antigens
CN110177803A (zh) 2016-11-22 2019-08-27 T细胞受体治疗公司 用于使用融合蛋白进行tcr重新编程的组合物和方法
US11155634B2 (en) 2016-12-02 2021-10-26 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute, Inc. TAG-72-binding chimeric antigen receptors
KR20190095502A (ko) * 2017-01-03 2019-08-14 바이오아트라, 엘엘씨 노화 세포 치료를 위한 단백질 치료제
JP7280827B2 (ja) 2017-01-18 2023-05-24 エクスマ バイオテック コーポレイション Ａｘｌまたはｒｏｒ２に対するキメラ抗原受容体およびその使用方法
CN110494557A (zh) 2017-03-27 2019-11-22 新加坡国立大学 用于离体扩增和活化自然杀伤细胞的刺激细胞系
KR20240057444A (ko) 2017-03-27 2024-05-02 내셔널 유니버시티 오브 싱가포르 절단된 nkg2d 키메라 수용체 및 자연 살해 세포 면역요법에서의 그의 용도
JP2020517259A (ja) 2017-04-19 2020-06-18 ボード・オブ・リージエンツ，ザ・ユニバーシテイ・オブ・テキサス・システム 操作された抗原受容体を発現する免疫細胞
US11596655B2 (en) 2017-04-27 2023-03-07 Washington University Activation of natural cytotoxicity receptor 2 (NCR2)
US10415017B2 (en) 2017-05-17 2019-09-17 Thunder Biotech, Inc. Transgenic macrophages, chimeric antigen receptors, and associated methods
US12331103B2 (en) 2017-06-16 2025-06-17 Protelica, Inc. Fibronectin binding domain chimeric antigen receptors and methods of use thereof
US20200171170A1 (en) * 2017-06-16 2020-06-04 Mayo Foundation For Medical Education And Research Materials and methods for increasing immune responses
JP2020524512A (ja) 2017-06-21 2020-08-20 アイセル・ジーン・セラピューティクス・エルエルシー キメラ抗体受容体（ＣＡＲｓ）の組成物およびその使用方法
KR20200036867A (ko) 2017-07-07 2020-04-07 바이오콘 리미티드 다사티닙의 다형체
MX2020000583A (es) 2017-07-20 2020-09-10 Aptevo Res & Development Llc Proteínas de fijación al antígeno que se fijan a 5t4 y 4-1bb y composiciones y métodos relacionados.
SG11202002089RA (en) 2017-09-08 2020-04-29 Maverick Therapeutics Inc Constrained conditionally activated binding proteins
CN111479921B (zh) * 2017-09-18 2024-08-02 埃克苏马生物技术公司 用于以基因方式修饰且扩增淋巴细胞以及调节其活性的方法及组合物
CN109776671B (zh) * 2017-11-14 2022-05-27 杭州康万达医药科技有限公司 分离的t细胞受体、其修饰的细胞、编码核酸、表达载体、制备方法、药物组合物和应用
CN109796532B (zh) * 2017-11-17 2024-09-10 恺兴生命科技(上海)有限公司 靶向成纤维激活蛋白α的结合单元及其应用
CN109957019A (zh) * 2017-12-25 2019-07-02 深圳宾德生物技术有限公司 一种靶向dr5的单链抗体、嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用
CN109957025A (zh) * 2017-12-25 2019-07-02 深圳宾德生物技术有限公司 一种靶向dr5的单链抗体、嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用
WO2019127215A1 (en) * 2017-12-28 2019-07-04 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Multispecific chimeric receptors comprising an nkg2d domain and methods of use thereof
KR20200120917A (ko) * 2018-02-02 2020-10-22 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 키메라 항원 수용체를 발현하는 변형된 단핵구/대식세포/수지상 세포 및 단백질 응집체와 연관이 있는 질환 및 장애에서의 용도
GB201801831D0 (en) * 2018-02-05 2018-03-21 Autolus Ltd Chimeric receptor
CN108314739B (zh) * 2018-02-05 2020-07-14 深圳市默赛尔生物医学科技发展有限公司 多信号嵌合抗原受体及其表达基因、其修饰的nk细胞及应用
EP3749685A4 (en) 2018-02-09 2021-12-22 National University of Singapore ACTIVATOR CHEMERIC RECEPTORS AND THEIR USES IN NATURAL KILLING CELL IMMUNOTHERAPY
MX2020008287A (es) * 2018-02-11 2021-01-08 Univ California Células t con receptor de antígeno quimérico (car-t) y enfermedades autoinmunes.
KR102251028B1 (ko) * 2018-04-18 2021-05-12 앱클론(주) 스위치 분자 및 스위처블 키메라 항원 수용체
US20220403001A1 (en) 2018-06-12 2022-12-22 Obsidian Therapeutics, Inc. Pde5 derived regulatory constructs and methods of use in immunotherapy
EP3821006A4 (en) * 2018-07-09 2022-12-07 Multitude Inc. FOLATE RECEPTOR ALPHA SPECIFIC ANTIBODIES
SG11202012339WA (en) * 2018-07-13 2021-01-28 Nanjing Legend Biotech Co Ltd Co-receptor systems for treating infectious diseases
EP4455166A3 (en) * 2018-08-10 2025-01-15 Kyoto University Method for producing cd3-positive cell
AU2019326407A1 (en) * 2018-08-21 2021-02-18 Bioatla, Inc. Conditionally active proteins with pH selectivity
JP7432250B2 (ja) * 2018-09-07 2024-02-16 バイオアトラ インコーポレイテッド 修飾ｔ細胞に対する条件的活性型キメラ抗原受容体
CN109266618B (zh) * 2018-10-18 2021-04-23 赛元生物科技(杭州)有限公司 能够靶向肿瘤细胞的巨噬细胞及其制备方法
EP3870600A1 (en) 2018-10-24 2021-09-01 Obsidian Therapeutics, Inc. Er tunable protein regulation
EP3894011A1 (en) 2018-12-11 2021-10-20 Obsidian Therapeutics, Inc. Membrane bound il12 compositions and methods for tunable regulation
WO2020146267A1 (en) * 2019-01-11 2020-07-16 Promab Biotechnologies, Inc. Cd37-antibody and cd37-car-t cells
MX2021009785A (es) * 2019-02-14 2021-09-08 Res Institute At Nationwide Children´S Hospital Uso de particulas de membrana plasmatica, liposomas y exosomas para evaluar la potencia de celulas inmunitarias.
WO2020181140A1 (en) 2019-03-05 2020-09-10 Maverick Therapeutics, Inc. Constrained conditionally activated binding proteins
MX2021010670A (es) 2019-03-05 2021-11-12 Nkarta Inc Receptores de antigeno quimerico dirigidos a cd19 y usos de los mismos en inmunoterapia.
CN111825769B (zh) * 2019-04-16 2022-03-25 上海科技大学 一种泛素化缺失的嵌合抗原受体及其用途
SG11202111345PA (en) * 2019-04-19 2021-11-29 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Chimeric receptor that recognizes engineered site in antibody
US11026973B2 (en) 2019-04-30 2021-06-08 Myeloid Therapeutics, Inc. Engineered phagocytic receptor compositions and methods of use thereof
WO2020227515A1 (en) 2019-05-07 2020-11-12 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the vectored augmentation of protein destruction, expression and/or regulation
CN114450410A (zh) * 2019-05-16 2022-05-06 华盛顿大学 使用从头设计的共定位依赖蛋白开关的超特异性细胞靶向
CA3144535A1 (en) * 2019-06-03 2020-12-10 The University Of Chicago Methods and compositions for treating cancer with collagen binding drug carriers
JP7387196B2 (ja) * 2019-06-11 2023-11-28 バイオアトラ インコーポレイテッド 条件付きで活性な抗ｅｐｃａｍ抗体、抗体フラグメント、それらのイムノコンジュゲート、及びそれらの使用
EP4013780A4 (en) * 2019-08-14 2024-04-10 The Regents Of The University Of California CAR T CELLS SPECIFIC FOR MODIFIED PROTEINS IN EXTRACELLULAR SPACES
AU2020341479A1 (en) 2019-09-03 2022-03-31 Myeloid Therapeutics, Inc. Methods and compositions for genomic integration
US20220348937A1 (en) 2019-09-06 2022-11-03 Obsidian Therapeutics, Inc. Compositions and methods for dhfr tunable protein regulation
WO2021092560A1 (en) * 2019-11-08 2021-05-14 Humanigen, Inc. Epha3 directed car-t cells for treatment of tumors
CN110964750A (zh) * 2019-11-13 2020-04-07 沣潮医药科技（上海）有限公司 携带基因元件组合的嵌合抗原受体细胞文库、制备和筛选方法及用途
US10980836B1 (en) 2019-12-11 2021-04-20 Myeloid Therapeutics, Inc. Therapeutic cell compositions and methods of manufacturing and use thereof
WO2021151119A1 (en) * 2020-01-23 2021-07-29 Exuma Biotech Corp. Chimeric antigen receptors to her2 and methods of use thereof
US20230183312A1 (en) * 2020-02-14 2023-06-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Chimeric antigen receptors with cd2 activation
EP4106802A1 (en) * 2020-02-17 2022-12-28 Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG Method for providing personalized cells with chimeric antigen receptors (car) against tumor microenvironment cells
IL298693A (en) 2020-06-04 2023-02-01 Carisma Therapeutics Inc Novel constructs for chimeric antigen receptors
CN111848797B (zh) * 2020-07-20 2021-02-09 北京鼎成肽源生物技术有限公司 一种靶向c-Met的单链抗体、嵌合抗原受体、重组载体、CAR-T细胞及应用
WO2022036495A1 (en) 2020-08-17 2022-02-24 Utc Therapeutics Inc. Lymphocytes-antigen presenting cells co-stimulators and uses thereof
KR20230133837A (ko) 2020-11-04 2023-09-19 마이얼로이드 테라퓨틱스, 인크. 조작된 키메라 융합 단백질 조성물 및 그의 사용 방법
JP2023550043A (ja) * 2020-11-12 2023-11-30 バイオアトラ インコーポレイテッド 抗Ａｘｌ抗体、抗体断片およびそれらの免疫コンジュゲートを用いたＡｘｌ発現癌の治療方法
CN118146395A (zh) * 2021-02-08 2024-06-07 浙江大学 一种以内源性蛋白质分子替代单结构域抗体的嵌合抗原受体
AU2022227686A1 (en) 2021-02-25 2023-07-27 Lyell Immunopharma, Inc. Ror1 targeting chimeric antigen receptor
WO2022187289A1 (en) 2021-03-01 2022-09-09 Exuma Biotech Corp. Methods and compositions for the delivery of retroviral particles
GB2623191A (en) 2021-03-17 2024-04-10 Myeloid Therapeutics Inc Engineered chimeric fusion protein compositions and methods of use thereof
WO2022203227A1 (ko) * 2021-03-23 2022-09-29 주식회사 이뮤노로지컬디자이닝랩 키메릭 항원 수용체(car)를 포함하는 형질전환된 항원 특이적 전문적 항원표출세포 및 이의 용도
JP2024518100A (ja) 2021-05-11 2024-04-24 マイエロイド・セラピューティクス，インコーポレーテッド ゲノム組込みのための方法および組成物
CN119060200A (zh) 2021-07-29 2024-12-03 索诺玛生物治疗公司 用于靶向调节性t细胞以治疗自身免疫病的滑膜细胞外基质特异性嵌合抗原受体
US20250223376A1 (en) 2021-09-20 2025-07-10 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of her2 positive cancer
WO2023092004A1 (en) 2021-11-17 2023-05-25 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of tau-related disorders
WO2023168305A1 (en) 2022-03-01 2023-09-07 Exuma Biotech Corp. Viral particles with membrane-bound hyaluronidase
WO2023220695A2 (en) 2022-05-13 2023-11-16 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of her2 positive cancer
TW202435912A (zh) 2022-08-03 2024-09-16 美商航海家醫療公司 用於穿過血腦屏障之組合物及方法
WO2024128219A1 (ja) * 2022-12-13 2024-06-20 愛知県 キメラ抗原受容体
TW202502825A (zh) * 2023-03-02 2025-01-16 美商拜奧亞特拉公司 條件性活性抗epcam抗體、抗體片段及併入其之構築體
WO2025122634A1 (en) 2023-12-05 2025-06-12 Voyager Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of tau-related disorders
CN119446257B (zh) * 2025-01-09 2025-05-27 苏州系统医学研究所 一种基于高通量测序数据的病毒数据处理方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010104821A1 (en) * 2009-03-09 2010-09-16 Bioatla, Llc Mirac proteins
WO2013123061A1 (en) * 2012-02-13 2013-08-22 Seattle Children's Hospital D/B/A Seattle Children's Research Institute Bispecific chimeric antigen receptors and therapeutic uses thereof

Family Cites Families (244)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US195A (en) 1837-05-15 Machine fob cutting and dressing stone
US4683A (en) 1846-08-08 waring and richard e
US3896111A (en) 1973-02-20 1975-07-22 Research Corp Ansa macrolides
US4151042A (en) 1977-03-31 1979-04-24 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method for producing maytansinol and its derivatives
US4704362A (en) 1977-11-08 1987-11-03 Genentech, Inc. Recombinant cloning vehicle microbial polypeptide expression
US4137230A (en) 1977-11-14 1979-01-30 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method for the production of maytansinoids
US4307016A (en) 1978-03-24 1981-12-22 Takeda Chemical Industries, Ltd. Demethyl maytansinoids
US4265814A (en) 1978-03-24 1981-05-05 Takeda Chemical Industries Matansinol 3-n-hexadecanoate
JPS5562090A (en) 1978-10-27 1980-05-10 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS5566585A (en) 1978-11-14 1980-05-20 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
US4256746A (en) 1978-11-14 1981-03-17 Takeda Chemical Industries Dechloromaytansinoids, their pharmaceutical compositions and method of use
JPS55164687A (en) 1979-06-11 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS55102583A (en) 1979-01-31 1980-08-05 Takeda Chem Ind Ltd 20-acyloxy-20-demethylmaytansinoid compound
JPS55162791A (en) 1979-06-05 1980-12-18 Takeda Chem Ind Ltd Antibiotic c-15003pnd and its preparation
JPS55164685A (en) 1979-06-08 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS55164686A (en) 1979-06-11 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
US4309428A (en) 1979-07-30 1982-01-05 Takeda Chemical Industries, Ltd. Maytansinoids
JPS5645483A (en) 1979-09-19 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd C-15003phm and its preparation
EP0028683A1 (en) 1979-09-21 1981-05-20 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibiotic C-15003 PHO and production thereof
JPS5645485A (en) 1979-09-21 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd Production of c-15003pnd
WO1981001145A1 (en) 1979-10-18 1981-04-30 Univ Illinois Hydrolytic enzyme-activatible pro-drugs
WO1982001188A1 (en) 1980-10-08 1982-04-15 Takeda Chemical Industries Ltd 4,5-deoxymaytansinoide compounds and process for preparing same
US4450254A (en) 1980-11-03 1984-05-22 Standard Oil Company Impact improvement of high nitrile resins
US4315929A (en) 1981-01-27 1982-02-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Method of controlling the European corn borer with trewiasine
US4313946A (en) 1981-01-27 1982-02-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Chemotherapeutically active maytansinoids from Trewia nudiflora
JPS57192389A (en) 1981-05-20 1982-11-26 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4797368A (en) 1985-03-15 1989-01-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Adeno-associated virus as eukaryotic expression vector
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US4777127A (en) 1985-09-30 1988-10-11 Labsystems Oy Human retrovirus-related products and methods of diagnosing and treating conditions associated with said retrovirus
US5139941A (en) 1985-10-31 1992-08-18 University Of Florida Research Foundation, Inc. AAV transduction vectors
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
GB8702816D0 (en) 1987-02-07 1987-03-11 Al Sumidaie A M K Obtaining retrovirus-containing fraction
US5219740A (en) 1987-02-13 1993-06-15 Fred Hutchinson Cancer Research Center Retroviral gene transfer into diploid fibroblasts for gene therapy
JP3101690B2 (ja) 1987-03-18 2000-10-23 エス・ビィ・２・インコーポレイテッド 変性抗体の、または変性抗体に関する改良
US5606040A (en) 1987-10-30 1997-02-25 American Cyanamid Company Antitumor and antibacterial substituted disulfide derivatives prepared from compounds possessing a methyl-trithio group
US5770701A (en) 1987-10-30 1998-06-23 American Cyanamid Company Process for preparing targeted forms of methyltrithio antitumor agents
US5700637A (en) 1988-05-03 1997-12-23 Isis Innovation Limited Apparatus and method for analyzing polynucleotide sequences and method of generating oligonucleotide arrays
US6054270A (en) 1988-05-03 2000-04-25 Oxford Gene Technology Limited Analying polynucleotide sequences
AP129A (en) 1988-06-03 1991-04-17 Smithkline Biologicals S A Expression of retrovirus gag protein eukaryotic cells
DE68913658T3 (de) 1988-11-11 2005-07-21 Stratagene, La Jolla Klonierung von Immunglobulin Sequenzen aus den variablen Domänen
US5858358A (en) 1992-04-07 1999-01-12 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US6352694B1 (en) 1994-06-03 2002-03-05 Genetics Institute, Inc. Methods for inducing a population of T cells to proliferate using agents which recognize TCR/CD3 and ligands which stimulate an accessory molecule on the surface of the T cells
US6905680B2 (en) 1988-11-23 2005-06-14 Genetics Institute, Inc. Methods of treating HIV infected subjects
US6534055B1 (en) 1988-11-23 2003-03-18 Genetics Institute, Inc. Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
JP2752788B2 (ja) 1989-01-23 1998-05-18 カイロン コーポレイション 感染および過剰増殖障害の為の組換え療法
US5744101A (en) 1989-06-07 1998-04-28 Affymax Technologies N.V. Photolabile nucleoside protecting groups
US5527681A (en) 1989-06-07 1996-06-18 Affymax Technologies N.V. Immobilized molecular synthesis of systematically substituted compounds
US5800992A (en) 1989-06-07 1998-09-01 Fodor; Stephen P.A. Method of detecting nucleic acids
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
WO1991002805A2 (en) 1989-08-18 1991-03-07 Viagene, Inc. Recombinant retroviruses delivering vector constructs to target cells
US5585362A (en) 1989-08-22 1996-12-17 The Regents Of The University Of Michigan Adenovirus vectors for gene therapy
CA2026147C (en) 1989-10-25 2006-02-07 Ravi J. Chari Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
AU675916B2 (en) 1991-06-14 1997-02-27 Genentech Inc. Method for making humanized antibodies
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
EP0648271B1 (en) 1991-08-20 2003-04-16 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA as represented by the SECRETARY OF THE DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Adenovirus mediated transfer of genes to the gastrointestinal tract
US5362852A (en) 1991-09-27 1994-11-08 Pfizer Inc. Modified peptide derivatives conjugated at 2-hydroxyethylamine moieties
FI941572A7 (fi) 1991-10-07 1994-05-27 Oncologix Inc Anti-erbB-2-monoklonaalisten vasta-aineiden yhdistelmä ja käyttömenete lmä
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
US5632957A (en) 1993-11-01 1997-05-27 Nanogen Molecular biological diagnostic systems including electrodes
WO1993010218A1 (en) 1991-11-14 1993-05-27 The United States Government As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Vectors including foreign genes and negative selective markers
GB9125623D0 (en) 1991-12-02 1992-01-29 Dynal As Cell modification
WO1993016185A2 (en) 1992-02-06 1993-08-19 Creative Biomolecules, Inc. Biosynthetic binding protein for cancer marker
JPH05236997A (ja) 1992-02-28 1993-09-17 Hitachi Ltd ポリヌクレオチド捕捉用チップ
FR2688514A1 (fr) 1992-03-16 1993-09-17 Centre Nat Rech Scient Adenovirus recombinants defectifs exprimant des cytokines et medicaments antitumoraux les contenant.
ZA932522B (en) 1992-04-10 1993-12-20 Res Dev Foundation Immunotoxins directed against c-erbB-2(HER/neu) related surface antigens
US5427954A (en) 1992-04-29 1995-06-27 Shriner's Hospitals For Crippled Children Compositions and methods for detection and treatment of human osteoarthritis
WO1993025234A1 (en) 1992-06-08 1993-12-23 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for targeting specific tissue
CA2137361A1 (en) 1992-06-10 1993-12-23 W. French Anderson Vector particles resistant to inactivation by human serum
GB2269175A (en) 1992-07-31 1994-02-02 Imperial College Retroviral vectors
ES2091684T3 (es) 1992-11-13 1996-11-01 Idec Pharma Corp Aplicacion terapeutica de anticuerpos quimericos y radiomarcados contra el antigeno de diferenciacion restringida de los linfocitos b humanos para el tratamiento del linfoma de las celulas b.
EP0911413A3 (en) 1992-12-03 2000-11-15 Genzyme Corporation Minimal adenovirus-based gene therapy vector
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
US5780588A (en) 1993-01-26 1998-07-14 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of selected pentapeptides
US6214345B1 (en) 1993-05-14 2001-04-10 Bristol-Myers Squibb Co. Lysosomal enzyme-cleavable antitumor drug conjugates
AU691811B2 (en) 1993-06-16 1998-05-28 Celltech Therapeutics Limited Antibodies
JP3532566B2 (ja) 1993-06-24 2004-05-31 エル． グラハム，フランク 遺伝子治療のためのアデノウイルスベクター
WO1995009864A1 (fr) 1993-10-01 1995-04-13 Teikoku Hormone Mfg. Co., Ltd. Nouveau derive peptidique
ATE437232T1 (de) 1993-10-25 2009-08-15 Canji Inc Rekombinanter adenoviren-vektor und verfahren zur verwendung
US6045996A (en) 1993-10-26 2000-04-04 Affymetrix, Inc. Hybridization assays on oligonucleotide arrays
US6468742B2 (en) 1993-11-01 2002-10-22 Nanogen, Inc. Methods for determination of single nucleic acid polymorphisms using bioelectronic microchip
US5965452A (en) 1996-07-09 1999-10-12 Nanogen, Inc. Multiplexed active biologic array
US7175843B2 (en) 1994-06-03 2007-02-13 Genetics Institute, Llc Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
US5807522A (en) 1994-06-17 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for fabricating microarrays of biological samples
US5556752A (en) 1994-10-24 1996-09-17 Affymetrix, Inc. Surface-bound, unimolecular, double-stranded DNA
US5830645A (en) 1994-12-09 1998-11-03 The Regents Of The University Of California Comparative fluorescence hybridization to nucleic acid arrays
US5663149A (en) 1994-12-13 1997-09-02 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Human cancer inhibitory pentapeptide heterocyclic and halophenyl amides
US5959098A (en) 1996-04-17 1999-09-28 Affymetrix, Inc. Substrate preparation process
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US7067318B2 (en) 1995-06-07 2006-06-27 The Regents Of The University Of Michigan Methods for transfecting T cells
US6692964B1 (en) 1995-05-04 2004-02-17 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for transfecting T cells
US5714586A (en) 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US5712374A (en) 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US5856174A (en) 1995-06-29 1999-01-05 Affymetrix, Inc. Integrated nucleic acid diagnostic device
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
US6013516A (en) 1995-10-06 2000-01-11 The Salk Institute For Biological Studies Vector and method of use for nucleic acid delivery to non-dividing cells
US6022963A (en) 1995-12-15 2000-02-08 Affymetrix, Inc. Synthesis of oligonucleotide arrays using photocleavable protecting groups
SG83659A1 (en) 1996-01-10 2001-10-16 Kibun Shokuhin Kk Cylindrical food consisting of plurality of concentric cylindrical layers of food material and method and apparatus for making the same
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
US6013440A (en) 1996-03-11 2000-01-11 Affymetrix, Inc. Nucleic acid affinity columns
US6300065B1 (en) * 1996-05-31 2001-10-09 Board Of Trustees Of The University Of Illinois Yeast cell surface display of proteins and uses thereof
WO1997046313A1 (en) 1996-06-07 1997-12-11 Eos Biotechnology, Inc. Immobilised linear oligonucleotide arrays
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
WO1998058964A1 (en) 1997-06-24 1998-12-30 Genentech, Inc. Methods and compositions for galactosylated glycoproteins
US6826296B2 (en) 1997-07-25 2004-11-30 Affymetrix, Inc. Method and system for providing a probe array chip design database
EP1012335A4 (en) 1997-08-15 2004-06-09 Hyseq Inc METHODS AND COMPOSITIONS FOR DETECTION OR QUANTIFICATION OF NUCLEIC ACID SPECIES
EP1012564B1 (en) 1997-09-11 2003-03-26 BioVentures, Inc., Method of making high density arrays
US6465178B2 (en) 1997-09-30 2002-10-15 Surmodics, Inc. Target molecule attachment to surfaces
CA2307166A1 (en) 1997-10-31 1999-05-14 Genentech, Inc. Methods and compositions comprising glycoprotein glycoforms
AU760562B2 (en) 1997-12-05 2003-05-15 Scripps Research Institute, The Humanization of murine antibody
US5994136A (en) 1997-12-12 1999-11-30 Cell Genesys, Inc. Method and means for producing high titer, safe, recombinant lentivirus vectors
EP1068241B1 (en) 1998-04-02 2007-10-10 Genentech, Inc. Antibody variants and fragments thereof
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
AU3463699A (en) 1998-04-03 1999-10-25 Phylos, Inc. Addressable protein arrays
JP4334141B2 (ja) 1998-04-20 2009-09-30 グリカート バイオテクノロジー アクチェンゲゼルシャフト 抗体依存性細胞傷害性を改善するための抗体のグリコシル化操作
US6048695A (en) 1998-05-04 2000-04-11 Baylor College Of Medicine Chemically modified nucleic acids and methods for coupling nucleic acids to solid support
PT1193270E (pt) 1998-08-27 2003-10-31 Spirogen Ltd Pirrolobenzodiazepinas
US6277628B1 (en) 1998-10-02 2001-08-21 Incyte Genomics, Inc. Linear microarrays
US6277489B1 (en) 1998-12-04 2001-08-21 The Regents Of The University Of California Support for high performance affinity chromatography and other uses
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
WO2000042072A2 (en) 1999-01-15 2000-07-20 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
US20090130718A1 (en) 1999-02-04 2009-05-21 Diversa Corporation Gene site saturation mutagenesis
WO2000061739A1 (en) 1999-04-09 2000-10-19 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
US6221653B1 (en) 1999-04-27 2001-04-24 Agilent Technologies, Inc. Method of performing array-based hybridization assays using thermal inkjet deposition of sample fluids
US6653151B2 (en) 1999-07-30 2003-11-25 Large Scale Proteomics Corporation Dry deposition of materials for microarrays using matrix displacement
CA2388245C (en) 1999-10-19 2012-01-10 Tatsuya Ogawa The use of serum-free adapted rat cells for producing heterologous polypeptides
US20010008765A1 (en) 1999-12-06 2001-07-19 Fuji Photo Film Co., Ltd. DNA chip and reactive solid carrier
DE60031793T2 (de) 1999-12-29 2007-08-23 Immunogen Inc., Cambridge Doxorubicin- und daunorubicin-enthaltende, zytotoxische mittel und deren therapeutische anwendung
KR20030032922A (ko) 2000-02-24 2003-04-26 싸이트 테라피스 인코포레이티드 세포의 동시 자극 및 농축
US6797514B2 (en) 2000-02-24 2004-09-28 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
US7572631B2 (en) 2000-02-24 2009-08-11 Invitrogen Corporation Activation and expansion of T cells
US6867041B2 (en) 2000-02-24 2005-03-15 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
PL357939A1 (en) 2000-04-11 2004-08-09 Genentech, Inc. Multivalent antibodies and uses therefor
JP3924113B2 (ja) 2000-05-15 2007-06-06 株式会社日立グローバルストレージテクノロジーズ 複数のヘッドサスペンションアッセンブリを有するヘッドキャリッジアッセンブリ及びこれを用いた磁気ディスク装置
US6333410B1 (en) 2000-08-18 2001-12-25 Immunogen, Inc. Process for the preparation and purification of thiol-containing maytansinoids
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
EP3690043A1 (en) 2000-10-06 2020-08-05 Kyowa Kirin Co., Ltd. Antibody composition-producing cell
US7064191B2 (en) 2000-10-06 2006-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
US6884869B2 (en) 2001-04-30 2005-04-26 Seattle Genetics, Inc. Pentapeptide compounds and uses related thereto
US6441163B1 (en) 2001-05-31 2002-08-27 Immunogen, Inc. Methods for preparation of cytotoxic conjugates of maytansinoids and cell binding agents
EP1423510A4 (en) 2001-08-03 2005-06-01 Glycart Biotechnology Ag ANTIBODY GLYCOSYLATION VARIANTS WITH INCREASED CELL CYTOTOXICITY DEPENDENT OF ANTIBODIES
WO2003026577A2 (en) 2001-09-24 2003-04-03 Seattle Genetics, Inc. P-amidobenzylethers in drug delivery agents
US7091186B2 (en) 2001-09-24 2006-08-15 Seattle Genetics, Inc. p-Amidobenzylethers in drug delivery agents
JP2005532253A (ja) 2001-10-25 2005-10-27 ジェネンテック・インコーポレーテッド 糖タンパク質組成物
JP2005511627A (ja) 2001-11-20 2005-04-28 シアトル ジェネティクス，インコーポレーテッド 抗ｃｄ３０抗体を使用する免疫学的疾患の治療
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
KR20050000380A (ko) 2002-04-09 2005-01-03 교와 핫꼬 고교 가부시끼가이샤 게놈이 개변된 세포
CA2481658A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Method of enhancing of binding activity of antibody composition to fcy receptor iiia
JPWO2003085118A1 (ja) 2002-04-09 2005-08-11 協和醗酵工業株式会社 抗体組成物の製造方法
ES2362419T3 (es) 2002-04-09 2011-07-05 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Células con depresión o deleción de la actividad de la proteína que participa en el transporte de gdp-fucosa.
US7691568B2 (en) 2002-04-09 2010-04-06 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd Antibody composition-containing medicament
CA2481925A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Therapeutic agent for patients having human fc.gamma.riiia
US20050276812A1 (en) 2004-06-01 2005-12-15 Genentech, Inc. Antibody-drug conjugates and methods
EP1382969A1 (en) 2002-07-17 2004-01-21 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Diagnosis and prevention of cancer cell invasion
HUE027549T2 (hu) 2002-07-31 2016-10-28 Seattle Genetics Inc Hatóanyagot tartalmazó konjugátumok és alkalmazásuk rák, autoimmun betegség vagy fertõzéses betegség kezelésére
WO2004032828A2 (en) 2002-07-31 2004-04-22 Seattle Genetics, Inc. Anti-cd20 antibody-drug conjugates for the treatment of cancer and immune disorders
US6913748B2 (en) 2002-08-16 2005-07-05 Immunogen, Inc. Cross-linkers with high reactivity and solubility and their use in the preparation of conjugates for targeted delivery of small molecule drugs
US7361740B2 (en) 2002-10-15 2008-04-22 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
RS51318B (sr) 2002-12-16 2010-12-31 Genentech Inc. Varijante imunoglobulina i njihova upotreba
JP4148883B2 (ja) 2002-12-18 2008-09-10 株式会社パイオラックス グローブボックス用リッドロック装置
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
US20060104968A1 (en) 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
AU2003215821B2 (en) 2003-03-31 2009-04-23 Council Of Scientific And Industrial Research Non-cross-linking pyrrolo(2,1-c)(1,4)benzodiazepines as potential antitumour agents and process thereof
US7276497B2 (en) 2003-05-20 2007-10-02 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising new maytansinoids
US20080241884A1 (en) 2003-10-08 2008-10-02 Kenya Shitara Fused Protein Composition
AU2004280065A1 (en) 2003-10-09 2005-04-21 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Process for producing antibody composition by using RNA inhibiting the function of alpha1,6-fucosyltransferase
AU2004284075A1 (en) 2003-10-22 2005-05-06 Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Pyrrolobenzodiazepine derivatives, compositions comprising the same and methods related thereto
MX337587B (es) 2003-11-05 2016-03-11 Glycart Biotechnology Ag Anticuerpos cd20 con funcion del efector y afinidad de enlace al receptor fc mejoradas.
SG10201701737XA (en) 2003-11-06 2017-04-27 Seattle Genetics Inc Monomethylvaline compounds capable of conjugation to ligands
WO2005053742A1 (ja) 2003-12-04 2005-06-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 抗体組成物を含有する医薬
AU2005216251B2 (en) 2004-02-23 2011-03-10 Genentech, Inc. Heterocyclic self-immolative linkers and conjugates
GB0404577D0 (en) 2004-03-01 2004-04-07 Spirogen Ltd Pyrrolobenzodiazepines
EP1723152B1 (en) 2004-03-09 2015-02-11 Spirogen Sàrl Pyrrolobenzodiazepines
US20050260711A1 (en) 2004-03-30 2005-11-24 Deepshikha Datta Modulating pH-sensitive binding using non-natural amino acids
JP5128935B2 (ja) 2004-03-31 2013-01-23 ジェネンテック， インコーポレイテッド ヒト化抗ＴＧＦ−β抗体
DK1737891T3 (da) 2004-04-13 2013-03-25 Hoffmann La Roche Anti-p-selectin-antistoffer
EP1791569A4 (en) * 2004-08-23 2009-12-16 Univ Emory Improved selection of-ph dependent compounds for in vivo therapy
TWI380996B (zh) 2004-09-17 2013-01-01 Hoffmann La Roche 抗ｏｘ４０ｌ抗體
US20100111856A1 (en) 2004-09-23 2010-05-06 Herman Gill Zirconium-radiolabeled, cysteine engineered antibody conjugates
CA2580141C (en) 2004-09-23 2013-12-10 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
US8871720B2 (en) 2005-07-07 2014-10-28 Seattle Genetics, Inc. Monomethylvaline compounds having phenylalanine carboxy modifications at the C-terminus
AU2006269422B2 (en) 2005-07-07 2012-12-06 Seagen Inc. Monomethylvaline compounds having phenylalanine side-chain modifications at the C-terminus
WO2007047578A2 (en) 2005-10-14 2007-04-26 Medimmune, Inc. Cell display of antibody libraries
SI1813614T1 (sl) 2006-01-25 2012-01-31 Sanofi 174 Citotoksična sredstva, ki obsegajo nove tomajmicinske derivate
KR101528939B1 (ko) 2006-07-18 2015-06-15 사노피 암 치료를 위한 ｅｐｈａ2에 대한 길항제 항체
EP1914242A1 (en) 2006-10-19 2008-04-23 Sanofi-Aventis Novel anti-CD38 antibodies for the treatment of cancer
US20080226635A1 (en) 2006-12-22 2008-09-18 Hans Koll Antibodies against insulin-like growth factor I receptor and uses thereof
WO2008127707A1 (en) 2007-04-13 2008-10-23 Dana Farber Cancer Institute, Inc. Receptor tyrosine kinase profiling
PL2019104T3 (pl) 2007-07-19 2014-03-31 Sanofi Sa Środki cytotoksyczne obejmujące nowe pochodne tomaymycyny i ich zastosowanie terapeutyczne
WO2009059235A2 (en) 2007-11-01 2009-05-07 Facet Biotech Corporation Immunoglobulin display vectors
RU2506276C2 (ru) 2007-11-12 2014-02-10 УЗ ФАРМА ГмбХ Axl-антитела
CA2706549A1 (en) 2007-11-15 2009-05-22 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Monoclonal antibody capable of binding to anexelekto, and use thereof
JP6157046B2 (ja) 2008-01-07 2017-07-05 アムジェン インコーポレイテッド 静電的ステアリング（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃｓｔｅｅｒｉｎｇ）効果を用いた抗体Ｆｃヘテロ二量体分子を作製するための方法
WO2009099741A1 (en) 2008-02-01 2009-08-13 Genentech, Inc. Nemorubicin metabolite and analog reagents, antibody-drug conjugates and methods
SG192517A1 (en) 2008-07-15 2013-08-30 Genentech Inc Anthracycline derivative conjugates, process for their preparation and their use as antitumor compounds
EP3006459B1 (en) * 2008-08-26 2021-10-06 City of Hope Method and compositions for enhanced anti-tumor effector functioning of t cells
FI4209510T3 (fi) 2008-12-09 2024-03-22 Hoffmann La Roche Anti-PD-L1-vasta-aineita ja niiden käyttö T-solutoiminnan tehostamiseksi
EP2451844B1 (en) * 2009-07-10 2015-04-22 Innate Pharma Tlr3 binding agents
MX347654B (es) 2009-07-17 2017-05-05 Bioatla Llc Seleccion y desarrollo integrados simultaneos del desempeño y la expresion de proteinas/anticuerpos en hospederos de produccion.
FR2948364B1 (fr) 2009-07-21 2011-07-15 Rhodia Operations Procede de preparation d'un fluorure d'halogenoacetyle et de ses derives
TW201106972A (en) 2009-07-27 2011-03-01 Genentech Inc Combination treatments
TWI518325B (zh) * 2010-02-04 2016-01-21 自治醫科大學 對ａｌｋ抑制劑具有先抗性或後抗性癌症的識別、判斷和治療
WO2011109726A2 (en) 2010-03-05 2011-09-09 Bioatla Llc Homologous multi-specific antibodies
BR112012026213B1 (pt) 2010-04-15 2021-12-28 Medimmune Limited Compostos de pirrolobenzodiazepinas, conjugado das mesmas, composição farmacêutica compreendendo o conjugado e uso do mesmo para o tratamento de uma doença proliferativa
AR082017A1 (es) 2010-06-18 2012-11-07 Genentech Inc Anticuerpos anti-axl (receptor de tirosina quinasas) y metodos de uso
FI20105715A0 (fi) 2010-06-18 2010-06-18 Helsingin Yliopisto Asetyloituun HMGB1:een sitoutuva polyklonaalinen vasta-aine
KR20130096731A (ko) * 2010-09-08 2013-08-30 할로자임, 아이엔씨 조건부 활성 치료적 단백질을 평가，확인 또는 진화시키는 방법
DK3012268T3 (en) * 2010-09-08 2018-02-19 Chemotherapeutisches Forschungsinstitut Georg Speyer Haus Chimeric antigen receptors with an optimized hinge region
EP2622074B1 (en) 2010-09-30 2014-11-12 Board Of Trustees Of Northern Illinois University Library-based methods and compositions for introducing molecular switch functionality into protein affinity reagents
TW202021621A (zh) 2010-11-30 2020-06-16 美商建南德克公司 低親和力血腦障壁受體抗體及其用途
JP2014509841A (ja) * 2011-01-18 2014-04-24 ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア 癌を治療するための組成物および方法
GB201108236D0 (en) * 2011-05-17 2011-06-29 Ucl Business Plc Method
DK2755487T3 (en) * 2011-09-16 2019-04-08 Baylor College Medicine TARGETATION OF THE TUMORMICROMY ENVIRONMENT USING MANIPULATED NKT CELLS
WO2013046722A1 (ja) * 2011-09-30 2013-04-04 中外製薬株式会社 イオン濃度依存性結合分子ライブラリ
US20140322234A1 (en) 2012-01-03 2014-10-30 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Analysis and Targeting of ROR2 in Cancer
US9783591B2 (en) 2012-02-22 2017-10-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Use of the CD2 signaling domain in second-generation chimeric antigen receptors
IN2014DN07414A (ko) * 2012-02-22 2015-04-24 Univ Pennsylvania
KR101721678B1 (ko) 2012-03-08 2017-03-31 할로자임, 아이엔씨 조건부 활성 항-표피 성장 인자 수용체 항체 및 이의 사용 방법
US9511152B2 (en) * 2012-04-05 2016-12-06 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Multicolored pH-activatable fluorescence nanoplatform
US20130280220A1 (en) 2012-04-20 2013-10-24 Nabil Ahmed Chimeric antigen receptor for bispecific activation and targeting of t lymphocytes
CA3202536A1 (en) 2012-05-10 2013-11-14 Bioatla, Llc Multi-specific monoclonal antibodies
EP2872617A4 (en) * 2012-07-13 2015-12-09 Univ Pennsylvania EPITOP SPREADING IN CONNECTION WITH CAR T CELLS
EP3838923B1 (en) 2012-08-24 2024-05-01 The Regents of The University of California Antibodies and vaccines for use in treating ror1 cancers and inhibiting metastasis
BR112015004522A2 (pt) 2012-09-04 2017-11-21 Cellectis receptor de antígeno quimérico multicadeia e usos destes
EP3881868B1 (en) 2013-02-15 2023-09-27 The Regents Of The University Of California Chimeric antigen receptor and methods of use thereof
KR102509562B1 (ko) 2013-02-20 2023-03-14 노파르티스 아게 인간화 항-EGFRvIII 키메라 항원 수용체를 사용한 암의 치료
US10808035B2 (en) * 2013-08-26 2020-10-20 Markus Chmielewski Anti CD30 chimeric antigen receptor and its use
EA201600252A1 (ru) 2013-09-12 2017-05-31 Галозим, Инк. Модифицированные антитела к рецепторам антиэпидермального фактора роста и способы их использования
GB201402631D0 (en) 2014-02-14 2014-04-02 Alligator Bioscience Ab Library
US11111288B2 (en) 2014-08-28 2021-09-07 Bioatla, Inc. Conditionally active chimeric antigen receptors for modified t-cells
EP4074735B1 (en) 2014-08-28 2025-05-21 BioAtla, Inc. Conditionally active chimeric antigen receptors for modified t-cells
EP3189152A4 (en) * 2014-09-03 2018-04-04 BioAtla LLC Discovering and producing conditionally active biologic proteins in the same eukaryotic cell production hosts
MX376225B (es) 2015-02-24 2025-03-07 Bioatla Llc Proteínas biológicas condicionalmente activas
JP7280827B2 (ja) 2017-01-18 2023-05-24 エクスマ バイオテック コーポレイション Ａｘｌまたはｒｏｒ２に対するキメラ抗原受容体およびその使用方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010104821A1 (en) * 2009-03-09 2010-09-16 Bioatla, Llc Mirac proteins
WO2013123061A1 (en) * 2012-02-13 2013-08-22 Seattle Children's Hospital D/B/A Seattle Children's Research Institute Bispecific chimeric antigen receptors and therapeutic uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
KR20230172625A (ko) 2023-12-22
AU2021203997A1 (en) 2021-07-08
EP3186284A4 (en) 2018-01-24
WO2017034615A1 (en) 2017-03-02
AU2015308818B2 (en) 2021-02-25
KR20170042325A (ko) 2017-04-18
KR20240034265A (ko) 2024-03-13
EP4074735B1 (en) 2025-05-21
JP2021137013A (ja) 2021-09-16
MX2017002605A (es) 2017-05-19
RU2017109966A3 (ko) 2019-03-11
JP2017532014A (ja) 2017-11-02
RU2017109966A (ru) 2018-09-28
KR102818922B1 (ko) 2025-06-11
MX2022009625A (es) 2022-09-07
EP3186284A1 (en) 2017-07-05
CA2996514A1 (en) 2017-03-02
KR102646445B1 (ko) 2024-03-11
CN107074975A (zh) 2017-08-18
HK1246803A1 (zh) 2018-09-14
DK4074735T3 (da) 2025-07-14
MX2018002400A (es) 2018-04-11
MX2022007894A (es) 2022-07-19
JP7048494B2 (ja) 2022-04-05
CA2959141A1 (en) 2016-03-03
CN107922473A (zh) 2018-04-17
US20230183679A1 (en) 2023-06-15
US20160207989A1 (en) 2016-07-21
KR20180036782A (ko) 2018-04-09
WO2016033331A8 (en) 2017-03-02
AU2015308818A1 (en) 2017-03-09
EP3186284B1 (en) 2022-04-06
EP3341406A4 (en) 2019-03-20
RU2764074C2 (ru) 2022-01-13
EP4074735A1 (en) 2022-10-19
BR112017003835A2 (pt) 2018-04-10
WO2016033331A1 (en) 2016-03-03
US20190010219A1 (en) 2019-01-10
RU2018110553A3 (ko) 2019-09-27
RU2018110553A (ru) 2019-09-27
DK3186284T3 (da) 2022-05-09
AU2016313107A1 (en) 2018-03-15
AU2021203997B2 (en) 2024-03-28
JP7286267B2 (ja) 2023-06-05
US20170260261A1 (en) 2017-09-14
US11584927B2 (en) 2023-02-21
RU2759957C2 (ru) 2021-11-19
ES2913865T3 (es) 2022-06-06
BR112018003535A2 (pt) 2018-09-25
JP7405444B2 (ja) 2023-12-26
EP3341406A1 (en) 2018-07-04
US20180340021A1 (en) 2018-11-29
JP2018529376A (ja) 2018-10-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7405444B2 (ja) 修飾ｔ細胞に対する条件的活性型キメラ抗原受容体
JP2021137013A5 (ko)
US20210355203A1 (en) Conditionally active chimeric antigen receptors for modified t-cells
JP7432250B2 (ja) 修飾ｔ細胞に対する条件的活性型キメラ抗原受容体
HK40082297A (en) Conditionally active chimeric antigen receptors for modified t-cells
BR112017003835B1 (pt) Método para produção de um receptor de antígeno quimérico

Legal Events

Date Code Title Description
PA0105 International application

Patent event date: 20170309

Patent event code: PA01051R01D

Comment text: International Patent Application

PG1501 Laying open of application
A201 Request for examination
PA0201 Request for examination

Patent event code: PA02012R01D

Patent event date: 20200727

Comment text: Request for Examination of Application

E902 Notification of reason for refusal
PE0902 Notice of grounds for rejection

Comment text: Notification of reason for refusal

Patent event date: 20220906

Patent event code: PE09021S01D

E902 Notification of reason for refusal
PE0902 Notice of grounds for rejection

Comment text: Notification of reason for refusal

Patent event date: 20230327

Patent event code: PE09021S01D

E701 Decision to grant or registration of patent right
PE0701 Decision of registration

Patent event code: PE07011S01D

Comment text: Decision to Grant Registration

Patent event date: 20230914

A107 Divisional application of patent
PA0104 Divisional application for international application

Comment text: Divisional Application for International Patent

Patent event code: PA01041R01D

Patent event date: 20231212

GRNT Written decision to grant
PR0701 Registration of establishment

Comment text: Registration of Establishment

Patent event date: 20231214

Patent event code: PR07011E01D

PR1002 Payment of registration fee

Payment date: 20231214

End annual number: 3

Start annual number: 1

PG1601 Publication of registration