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CN119060200A - 用于靶向调节性t细胞以治疗自身免疫病的滑膜细胞外基质特异性嵌合抗原受体 - Google Patents

用于靶向调节性t细胞以治疗自身免疫病的滑膜细胞外基质特异性嵌合抗原受体 Download PDF

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CN119060200A
CN119060200A CN202411010159.1A CN202411010159A CN119060200A CN 119060200 A CN119060200 A CN 119060200A CN 202411010159 A CN202411010159 A CN 202411010159A CN 119060200 A CN119060200 A CN 119060200A
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seq
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car
cells
acid sequence
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J·马塔埃
A-R·范德乌斯特德弗里斯
J·贝尔克
V·马姆斯特罗姆
K·霍珀
R·约翰逊
L·克拉雷斯科格
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Kurara Co
Sonoma Biotherapy Co
Original Assignee
Kurara Co
Sonoma Biotherapy Co
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Publication date
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Abstract

本文公开了包含识别瓜氨酸化多肽的抗原结合位点的嵌合抗原受体(“CAR”)。诸如瓜氨酸化波形蛋白、纤维蛋白原和聚丝蛋白等瓜氨酸化多肽在患有类风湿性关节炎的受试者的滑膜中表达。进一步公开了表达这些CAR的T细胞并且特别是Treg细胞。这些CAR‑T细胞的施用可用于治疗类风湿性关节炎以及与瓜氨酸化肽相关的其他疾病。

Description

用于靶向调节性T细胞以治疗自身免疫病的滑膜细胞外基质 特异性嵌合抗原受体
本发明申请是基于申请日为2022年7月29日，申请号为202280061407.8(国际申请号为PCT/US2022/074321)、名称为“用于靶向调节性T细胞以治疗自身免疫病的滑膜细胞外基质特异性嵌合抗原受体”的发明专利申请的分案申请。
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年7月29日提交的美国临时申请号63/227,320和2022年5月6日提交的美国临时申请号63/339,361的权益，将其各自通过引用以其整体特此并入。
对电子序列表的引用
将电子序列表的内容(237752000340SEQLIST.xml；大小：50,843字节；和创建日期：2022年7月28日)通过引用以其整体并入本文。
技术领域
本公开文本涉及用于治疗自身免疫病的与瓜氨酸化抗原反应的嵌合抗原受体和表达这些受体的调节性T细胞。
背景技术
自身免疫病影响大量的人。例如，类风湿性关节炎(RA)是一种靶向外周关节的慢性炎性疾病，导致骨侵蚀、活动能力受损和生活质量下降。它正在影响全球0.5％-1％的人口，并且发病率持续上升。RA的发病机制主要位于滑膜关节，其中由T细胞、B细胞、巨噬细胞和树突细胞构成的免疫细胞浸润滑膜。此外，滑膜亚内层中存在的成纤维细胞样滑膜细胞增殖并导致软骨损伤。
类风湿性关节炎中的滑膜增生导致免疫细胞浸润滑膜以及随后的软骨损伤和骨侵蚀。
目前还没有治愈RA以及许多其他自身免疫性病症的方法。RA患者通常需要终身治疗，这除了极其昂贵外，还可能引起长期的严重的副作用，如感染和类风湿性关节炎风险。
附图说明
并入本文并形成说明书的一部分的附图展示了示例性实施方案，并且与说明书一起进一步用于使相关领域的技术人员能够制造和使用这些实施方案以及对本领域技术人员清楚的其他实施方案。将结合以下附图更具体地描述本发明，其中：
图1：包含MND启动子和EGFRt骨架的初始数据显示，CV CAR BVCA1和SBT01G对板结合的全长CV具有最强的反应(n＝2)。
图2：使用可溶性全长CV的测定仅显示CV CAR BVCA1和SBT01G-HL的剂量反应(n＝1)。
图3：用可溶性珠结合肽的测定展示结合特异性(n＝1)。
图4：与MND-BVCA1相比，MND-SBT01G显示对板结合的、抗体捕获的CV(但不是可溶性CV)的反应更强。
图5：对来自创新研究的首批滑液的测试显示，SBT01G比BVCA1具有更强的反应。
图6：对来自瑞典患者的15个滑液样品的进一步测试显示，对于产生反应的样品，SBT01G强于BVCA1。
图7：对滑液(SF)的原代Treg反应展示出，与BVCA1相比，SBT01G对来自RA患者的SF更敏感。
图8：SBT01G，而不是BVCA1，也能够对板结合的全长PAD2瓜氨酸化纤维蛋白原有反应。
图9作为效应物的SBT01G CAR和Treg对瓜氨酸化纤维蛋白原有反应，但BVCA1并未如此。
图10A-图10B：EF1A和MND启动子二者展示出CV CAR对可溶性珠结合肽的功能性反应。因此，CAR启动子不影响Treg表型。
图11：scFv接头对基于SBT01G CAR的功能几乎没有影响。
图12A-图12B：与BVCA1相比，SBT01G由更高百分比的细胞表达，但BVCA1和SBT01GCAR-T细胞具有相似的FoxP3和Helios特征。
图13：CV-CAR Treg细胞(SBT01G)而不是未转导的Treg细胞被瓜氨酸化波形蛋白(CV)激活。通过增殖、CD71表达和IL-10分泌的靶抗原特异性增加来证明激活。
图14：CV-CAR Treg细胞对来自大多数RA患者的滑液中的瓜氨酸化蛋白有反应。相比之下，CV-CAR Treg细胞不对来自正常对照(未患RA的受试者)的滑液有反应。
图15：来自两名供体的CV-CAR Treg细胞(SBT01G)而不是未转导的Treg细胞被来自RA患者的滑液特异性激活。
图16A-图16B：对CV-CAR Treg细胞的抑制功能的评估。图16A显示，CV-CAR Treg细胞能够在存在(而不是不存在)CV的情况下抑制CD3/CD28预激活的Teff细胞的增殖。图16B显示，CV-CAR Treg细胞能够在CV的存在下抑制CD19-CAR Teff细胞的增殖，而未转导的Treg细胞不能。
图17：示出了在脂多糖(LPS)诱导的鼠肺部炎症模型中人CV-CAR Treg细胞体内激活的时间线。简而言之，在第0天静脉内(IV)施用人CV-CAR Treg细胞，每日两次腹膜内(IP)施用人IL-2，并且在第0、1、6和12天鼻内(IN)施用LPS。在第13天，处死小鼠并收获器官以促成Treg细胞的分析。
图18A-图18B：示出了比较人CV-CAR Treg细胞的表皮生长因子(EGFR)表达与CellTrace Violet(CTV)水平的流式细胞术点图。图18A示出了如何确定CV-CAR Treg(EGFR+)的增殖比率。具体地，增殖比率等于EGFR+,CTV-细胞的％除以EGFR+,CTV-细胞的％。图18B示出了如何确定EGFR比率的变化倍数。
图19A-图19B：CV-CAR Treg在LPS诱导的鼠肺部炎症模型中但不在PBS的对照接受者中增殖。图19A示出了各种研究组的肺中CD45+,CD3+Treg的绝对数量，并且图19B示出了各种研究组的肺中Treg的增殖比率。
发明内容
调节性T细胞(Treg)在RA患者和小鼠模型中是有缺陷的。因此，基于Treg的过继细胞疗法(ACT)代表RA的有前景的方法。事实上，基于Treg的ACT逆转RA动物模型的疾病。在这项研究中，使用分离自RA患者的抗体来工程化对瓜氨酸化波形蛋白(CV)和在受影响关节的滑膜细胞外基质(ECM)中大量且几乎全在其中发现的其他翻译后修饰的蛋白具有特异性的CAR。
本文公开了特异性识别与自身免疫病相关的抗原的嵌合抗原受体(CAR)。特别地，CAR可以对翻译后修饰的抗原具有特异性。特别地，CAR可以特异性结合瓜氨酸化多肽，这些瓜氨酸化多肽包括波形蛋白、瓜氨酸化聚丝蛋白和瓜氨酸化纤维蛋白原。
嵌合抗原受体(CAR)被工程化以特异性靶向翻译后修饰的蛋白质(即瓜氨酸化波形蛋白、瓜氨酸化聚丝蛋白和瓜氨酸化纤维蛋白原)，这些蛋白质在类风湿性关节炎(RA)患者的发炎关节的细胞外基质中表达。在一些实施方案中，CAR的单链可变片段(scFv)部分是从对分离自RA患者外周血的瓜氨酸化蛋白具有高度特异性的抗体获得的。在一个实施方案中，将特定的scFv链插入第二代CAR构建体中。在一些实施方案中，将scFv链插入克隆在慢病毒载体中的CAR构建体中。在具体实施方式中，除非上下文另有指示，否则对抗体的提及适用于本公开文本的CAR的抗原结合结构域。
具体实施方式
I.定义
除非另有说明，否则生物化学、核酸化学、分子生物学、发育生物学和分子遗传学的术语和符号遵循例如以下的本领域标准条约和文字材料的术语和符号：Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版(Cold Spring Harbor Press,1989)；Alberts和Singer,Developmental Biology,第八版(Sinauer Associates Inc.,Sunderland,MA,2006)；Kornberg和Baker,DNA Replication,第二版(W.H.Freeman,NewYork,1992)；Gaits编辑Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach(IRL Press,Oxford,1984)；Lehninger,Biochemistry,第二版(Worth Publishers,New York,1975)；Eckstein编辑,Oligonucleotides and Analogs:A Practical Approach(OxfordUniversity Press,New York,1991)；等。
如本文所用，术语“抗原”、“免疫原”和“抗体靶标”是指被抗体识别(即可以被抗体结合)的分子、化合物或复合物。该术语可以指可被抗体识别的任何分子，例如多肽、多核苷酸、碳水化合物、脂质、化学部分或其组合(例如，磷酸化或糖基化多肽等)。技术人员将理解，该术语不指示分子在每种情境下都具有免疫原性，而是简单地指示它可以被抗体靶向。
如本文所用，术语“表位”是指抗原上被抗体识别并结合的局部位点。表位可以包括几个氨基酸或几个氨基酸的多部分，例如5个或6个或更多个(例如20个或更多个)氨基酸或那些氨基酸的多部分。在一些情况下，表位包括非蛋白质组分，例如来自碳水化合物、核酸或脂质的组分。在一些情况下，表位是三维部分。因此，例如，在靶标是蛋白质的情况下，表位可以由连续氨基酸或来自通过蛋白质折叠而接近的蛋白质的不同部分的氨基酸(例如，不连续表位)构成。
如本文所用，术语“抗体”是指包含来自免疫球蛋白基因的框架区的多肽，其特异性结合并识别抗原。典型地，“可变区”含有抗体(或其功能等效物)的抗原结合区，并且在结合的特异性和亲和力方面是最关键的。示例性免疫球蛋白(抗体)结构单元包含四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链构成，每对具有一条“轻”链(约25kD)和一条“重”链(约50-70kD)。
抗体可以是(i)基于其重链恒定结构域-α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)和μ(IgM)的身份的免疫球蛋白的五种主要类别中的任何一种，或(ii)其子类(同种型)(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。轻链可以是λ或κ。
以下是均保留抗原结合活性的不同抗体形式的非详尽列表：
(1)完整免疫球蛋白(也称为“完整”抗体)(两条轻链和两条重链，例如四聚体)；
(2)免疫球蛋白多肽(轻链或重链)；
(3)抗体片段，如Fv(单价或二价可变区片段，并且其可以仅涵盖可变区(例如，VL和/或VH))、Fab(VLCL VHCH)、F(ab')2、Fv(VLVH)、scFv(单链Fv)
(包含通过接头例如肽接头连接的VL和VH的多肽)、(scFv)2、sc(Fv)2、双特异性sc(Fv)2、双特异性(scFv)2、微型抗体(融合至CH3结构域的sc(FV)2)、双抗体(由通过小肽接头连接的重链可变(VH)和轻链可变(VL)区组成的单链Fv(scFv)片段的非共价二聚体)、三抗体(是三价sc(Fv)3或三特异性sc(Fv)3)；
(4)多价抗体(包含结合两个不同表位或蛋白质的结合区的抗体，例如“蝎子”抗体)；
(5)融合蛋白，其包含与另一个氨基酸序列(如荧光蛋白)融合的免疫球蛋白的结合部分；和
(6)仅重链抗体或抗体片段，其仅具有两条重链并且缺少两条通常存在于抗体中的轻链。
串联scFv和双抗体的产生和特性描述于例如Asano等人(2011)J Biol.Chem.286:1812；Kenanova等人(2010)Prot Eng Design Sel 23:789；Asano等人(2008)Prot EngDesign Sel 21:597中。
如本文所用，短语“CDR序列组”是指本文所述的特定抗体的3个重链和/或3个轻链CDR。“轻链”CDR序列组是指轻链CDR序列。“重链”CDR序列组是指重链CDR序列。“完整”CDR序列组是指重链和轻链CDR序列二者。基于IMGT序列比对预测CDR。
如本文所用，术语“嵌合抗体”是指具有源自两个或更多个物种的氨基酸序列的抗体。在一个实施方案中，轻链和重链二者的可变区对应于源自一个哺乳动物物种(例如，小鼠、大鼠、兔等)的具有所需特异性、亲和力和能力的抗体的可变区，而恒定区是源自另一个物种(典型地在接受疗法的受试者例如人中)的同源序列以避免引发免疫应答。
如本文所用，术语“人源化抗体”是指嵌合抗体，其中获自具有所需特异性、亲和力和能力的非人抗体的VH和VL区的CDR被移植到人框架序列。在一个实施方案中，修饰人源化抗体的框架残基以改进和优化抗体特异性、亲和力和能力。人源化(即非人C DR序列取代人抗体的对应序列)可以按照例如美国专利号5,545,806；5,569,825；5,633,425；5,661,016；Riechmann等人,Nature 332:323-327(1988)；Marks等人,Bio/Technolog y 10:779-783(1992)；Morrison,Nature 368:812-13(1994)；Fishwild等人,Nature Biotec hnology14:845-51(1996)中描述的方法进行。
如本文所用，术语“人抗体”是指由人产生的抗体或具有通过本领域已知的任何技术制备的与所述由人产生的抗体相对应的氨基酸序列的抗体。
可以根据与关于环境中的抗体和其他材料或通常不相关的分子的解离常数相比抗体(或其他靶向部分)针对靶标的比较解离常数(Kd)来定义结合的特异性。较大(较高)的Kd是描述较低亲和力相互作用的Kd。相反，较小(较低)的Kd是描述较高亲和力相互作用或较紧密结合的Kd。仅举例来说，抗体特异性结合靶标的Kd可以是飞摩尔、皮摩尔、纳摩尔或微摩尔，并且抗体结合无关材料的Kd可以是毫摩尔或更高。结合亲和力可以在微摩尔范围(kD＝10-4至10-6)、纳摩尔范围(kD＝10-7M至10-9M)、皮摩尔范围(kD＝10-10M至10-12M)、或飞摩尔(kD＝10-13M至10-15M)内。
如本文所用，如果抗体以小于10-4M(即，在微摩尔范围内)的Kd结合抗原或表位，则其“结合”或“识别”抗原或表位。关于细胞类型的术语“结合”(例如，结合癌细胞的抗体)典型地指示药剂结合那些细胞的纯群体中的大多数细胞。例如，结合给定细胞类型的抗体典型地结合指定细胞群体中的至少2/3的细胞(例如，67％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)。在一些情况下，与多肽的结合可以通过比较抗体与呈递该多肽的细胞的结合与抗体与不表达该多肽的细胞的结合(或缺乏结合)来测定。本领域技术人员将认识到，取决于测定结合的方法和/或阈值，将出现一些变化。可以根据本领域已知的方法(例如，如Ernst等人Determination of EquilibriumDissociation Constants,Therapeutic Monoclonal Anti bodies(Wiley&Sons ed.2009)中所综述的)测定抗体对靶标的亲和力。
如本文所用，术语“更大的亲和力”如本文所用是指抗体结合的相对程度，其中抗体X与靶标Y的结合比与靶标Z的结合更强(Kon)和/或与其相比具有更小的解离常数(Koff)，并且在这种情境下，抗体X对靶标Y比对Z具有更大的亲和力。同样地，术语“较小的亲和力”在本文中是指抗体结合的程度，其中抗体X与靶标Y的结合不如与靶标Z的结合强烈和/或与其相比具有更大的解离常数，并且在这种情境下，抗体X对靶标Y比对Z具有更小的亲和力。抗体与其靶抗原之间的结合的亲和力可以表达为KA等于1/KD，其中KD等于kon/koff。可以使用表面等离子体共振技术(例如使用分子亲和力筛选系统(MASS-1)(SierraSensors GmbH，德国汉堡))测量kon和koff值。拮抗剂或阻断抗体是相对于在不存在抗体时的类似生理条件下的活性而言部分或完全阻断、抑制或中和与靶抗原相关的生物活性的抗体。拮抗剂可以是竞争性的、非竞争性的或不可逆的。竞争性拮抗剂是在与天然配体-受体相互作用相同的位点结合天然配体或受体或以诱导改变以阻止正常结合的方式变构结合的物质。非竞争性拮抗剂在与天然配体-受体相互作用不同的位点结合，但降低KD或由相互作用产生的信号。不可逆抑制剂引起对受体的共价修饰，进而防止任何随后的结合。
如本文所用，术语“亲合力”是指抗体与靶抗原之间的结合复合物的总体稳定性。它受三个因素控制，这三个因素是(i)抗体对抗原的内在亲和力，(2)抗体的效价，以及(3)相互作用组分的几何排列。亲和力是抗体与单个靶标之间相互作用的强度，而亲合力是多种亲和力的累积强度。在一个实施方案中，本文提供的抗体是二价的。
如本文所用，如果抗体以比与第二抗原更大的亲和力结合第一抗原，则相对于第二抗原而言抗体“优先结合”第一抗原。优先结合可以是至少2倍、5倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍、500倍或1000倍亲和力中的任一个。
如本文所用，如果抗体以至少1×10-6M、1×10-7M、1×10-8M、1×10-9M、1×10-10M、1×10-11M、1×10-12M中的任一个的亲和力结合靶抗原或靶抗原组的每个成员并且例如以对所比较的非靶抗原的亲和力的至少两倍的亲和力结合靶抗原或靶抗原组的每个成员，则抗体“特异性结合”靶抗原或靶抗原组或对靶抗原或靶抗原组具有“特异性”。典型地，特异性结合的特征在于以足够的亲和力结合抗原，使得抗体可用作检测抗原或表位的诊断剂和/或用作靶向抗原或表位的治疗剂。
如本文所用，术语“多肽”是指具有通过肽键连接的天然和/或非天然氨基酸的序列的分子。术语“肽”是指短多肽，典型地长度为不超过30个氨基酸。多肽的氨基酸序列称为其“一级结构”。术语“蛋白质”是指具有二级、三级和/或四级结构(例如通过氢键、二级结构与由多于一种蛋白质形成的结构之间的关系稳定的结构)的多肽。可以通过其他附接的部分(如碳水化合物(糖蛋白)、脂质(脂蛋白)、磷酸基团(磷蛋白)等)进一步修饰蛋白质。
如本文所用，氨基酸序列仅由该序列中的氨基酸“组成”。
如本文所用，如果第一氨基酸序列(1)包含第二氨基酸序列并且(2)比第二氨基酸序列长不多于1个、不多于2个或不多于3个氨基酸，则第一氨基酸序列“基本上由第二氨基酸序列组成”。
如本文所用，如果第二氨基酸序列包含第一氨基酸序列，则第一氨基酸序列是第二氨基酸序列的“片段”。在某些实施方案中，作为第二氨基酸序列的片段的第一氨基酸序列可以具有比第二氨基酸序列少不多于1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个中的任一个的氨基酸。
如本文所用，参考氨基酸序列的“功能等效物”是与参考序列不相同但含有微小改变(例如一个或几个氨基酸的插入、缺失或取代)的序列。功能等效序列保留与其所等效的参考序列的功能(例如，免疫原性)。如果功能等效氨基酸序列相对于参考序列含有一个或多个氨基酸的取代，则这些通常是保守氨基酸取代。
如本文所用，“保守氨基酸取代”是其中一个氨基酸残基被另一个氨基酸残基替代而不消除蛋白质的所需特性的取代。可以通过用具有相似疏水性、极性和R链长度的氨基酸取代另一个来进行合适的保守氨基酸取代。参见例如Watson等人,“Molecular Biology ofthe Gene,”第4版,1987,The Benjamin/Cummings Pub.Co.,Menlo Park,CA,第224页。保守氨基酸取代的例子包括以下(注意，某些类别不是相互排斥的)：
如本文所用，术语“基本上相同”是指第一氨基酸序列之间的同一性，该第一氨基酸序列含有足够或最小数量的i)与第二氨基酸序列中比对的氨基酸残基相同或ii)是第二氨基酸序列中比对的氨基酸残基的保守取代的氨基酸残基，使得第一和第二氨基酸序列具有共同的结构域和/或共同的功能活性和/或共同的免疫原性。例如，含有具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的共同结构域或抗原结构域的氨基酸序列称为充分或基本上相同。在核苷酸序列的上下文中，术语“基本上相同”在本文中用于指第一核酸序列含有足够或最少数量的与第二核酸序列中的比对核苷酸相同的核苷酸，使得第一核苷酸序列和第二核苷酸序列编码具有共同功能活性的多肽，或编码共同的结构多肽结构域或共同的功能多肽活性，或编码具有相同免疫原性特性的多肽。
如本文所用，如果化学实体(如，多肽)是组合物中其种类(例如，多肽)的主要化学实体，则该化学实体是“基本上纯的”或“分离的”。这包括如下化学实体，其代表组合物中该种类的化学实体中的多于50％、多于80％、多于90％、多于95％、多于98％、多于99％、多于99.5％、多于99.9％或多于99.99％。基本上纯化的级分是如下组合物，在组合物中目标物质占存在的所有大分子物质的至少约50％(以摩尔计)。通常，基本上纯的组合物意指组合物中存在的约80％至90％或更多的大分子物质是目的纯化物质。如果组合物基本上由单一大分子物质组成，则目标物质被纯化至本质上同质(通过常规检测方法不能检测到组合物中的污染物质)。出于此定义的目的，溶剂物质、小分子、稳定剂(例如，BSA)和元素离子物质不被认为是大分子物质。
短语“分离的抗体”是指体内或体外产生的抗体，该抗体已经被从产生抗体的来源(例如，动物、杂交瘤或其他细胞系(如产生抗体的重组昆虫、酵母或细菌细胞))中取出。
如本文所用，术语“序列同一性”是指两个多肽序列或两个核酸序列之间的序列同一性的百分比。为了确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的同一性百分比，出于最佳对比目的比对所述序列(例如，可在第一氨基酸或核酸序列的序列中引入空位，以实现与第二氨基酸或核酸序列的最佳比对)。然后比较在相应氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸残基或核苷酸。在第一序列中的位置由与第二序列中的相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，那么分子在该位置处是相同的。两个序列之间的同一性百分比是所述序列共有的相同位置的数目的函数(即，同一性％＝相同重叠位置的数量/位置总数乘以100％)。在一个实施方案中，两个序列具有相同长度。两个序列之间的同一性百分比的确定还可以使用数学算法来完成。用于比较两个序列的数学算法的优选的非限制性例子是Karlin和Altschul,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87:2264-2268的算法，如Karli n和Altschul,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:5873-5877中所修改的。这种算法被并入Altschul等人,1990,J.Mol.Biol.215:403的NBLAST和XBLAST程序中。可以用NB LAST核苷酸程序参数组(例如，对于得分＝100，字长＝12)进行BLAST核苷酸搜索，以获得与本申请的核酸分子同源的核苷酸序列。可以用XBLAST程序参数组(例如，得分-50，字长＝3)进行BLAST蛋白质搜索，以获得与本文所述的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对，可以如Altschul等人,(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-3402中所描述的使用空位BLAST(Gapped BLAST)。可替代地，可使用P SI-BLAST来进行迭代搜索，其检测分子之间的远距离关系(同上)。当使用BLAST、空位BLAST和PSI-Blast程序时，可以使用各程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数(参见例如NCBI网站)。用于比较序列的数学算法的另一个优选的非限制性例子是M yers和Miller,1988,CABIOS 4:11-17的算法。这样的算法被并入ALIGN程序(版本2.0)中，该程序是GCG序列比对软件包的一部分。当利用ALIGN程序比较氨基酸序列时，可以使用PAM120权重残基表，空位长度罚分为12，空位罚分为4。可以使用类似于上述那些的技术，在允许或不允许空位的情况下确定两个序列之间的同一性百分比。在计算同一性百分比时，典型地仅对精确匹配计数。
对于抗体，当通过IMGT最大地比对抗体序列时，可以确定序列同一性百分比。比对后，如果将主题抗体区域(例如，重链或轻链的整个成熟可变区)与参考抗体的相同区域进行比较，则主题抗体区域与参考抗体区域之间的序列同一性百分比是主题抗体区域和参考抗体区域二者中相同氨基酸所占位置的数量除以这两个区域的比对位置的总数量，乘以100以转换为百分比。
也可以使用序列比较程序NCBI-BLAST2确定氨基酸序列同一性百分比(Altschul等人,Nucleic Acids Res.25:3389-3402(1997))。NCBI-BLAST2序列比较程序可以获自美国国立卫生研究院(马里兰州贝塞斯达)。NCBI-BLAST2使用几个搜索参数，其中所有那些搜索参数都被设置为默认值，包括例如未遮蔽＝是，链＝所有，预期出现次数＝10，最小低复杂度长度＝15/5，多程e值＝0.01，多程常量＝25，最终空位化比对的衰减＝25，和评分矩阵＝BLOSUM62。
在采用NCBI-BLAST2进行氨基酸序列比较的情况下，给定氨基酸序列A与(to、with或against)给定氨基酸序列B的氨基酸序列同一性％(其可替代地可以用短语表示为给定氨基酸序列A与(to、with或against)给定氨基酸序列B具有或包含一定的氨基酸序列同一性％)如下计算：100乘以分数X/Y，其中X是通过序列比对程序NCBI-BLAST2在该程序的A和B的比对中评定为相同匹配的氨基酸残基数，并且其中Y是B中氨基酸残基的总数。将理解的是，在氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度的情况下，A与B的氨基酸序列同一性％将不等于B与A的氨基酸序列同一性％。如本文所用，术语“核酸序列”是指由天然存在的碱基、糖和糖间(骨架)连接组成的核苷或核苷酸单体的序列并且包括cDNA。术语还包括包含非天然存在的单体或其部分的经修饰或取代的序列。本申请的核酸序列可以是脱氧核糖核酸序列(DNA)或核糖核酸序列(RNA)，并且可以包括天然存在的碱基，包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸苷和尿嘧啶。序列还可以含有经修饰的碱基。此类经修饰的碱基的例子包括氮杂和去氮杂腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸苷和尿嘧啶；以及黄嘌呤和次黄嘌呤。应理解，包含非可转录核苷酸碱基的多核苷酸可用作例如杂交测定中的探针。核酸可以是双链或单链的，并且代表有义链或反义链。此外，术语“核酸”包括互补核酸序列以及优化的密码子或同义密码子等效物。
如本文所用，术语“分离的核酸”是指当通过重组DNA技术产生时基本上不含细胞材料或培养基或当化学合成时基本上不含化学前体或其他化学物质的核酸。分离的核酸还基本上不含衍生出该核酸的天然侧接该核酸的序列(即位于该核酸的5'和3'端的序列)。
全部或一部分核酸序列分子可以发生杂交。杂交部分的长度典型地为至少15(例如，20、25、30、40或50)个核苷酸。本领域技术人员将认识到，核酸双链体或杂交体的稳定性由Tm决定，Tm在含钠缓冲液中是钠离子浓度和温度的函数(Tm＝81.5℃–16.6(Log10[Na+])+0.41(％(G+C)–600/l)，或类似等式)。因此，确定杂交稳定性的洗涤条件中的参数是钠离子浓度和温度。为了鉴定与已知核酸分子相似但不相同的分子，可以假定1％错配导致Tm降低约1℃°，例如，如果寻找具有>95％同一性的核酸分子，最终的洗涤温度将降低约5℃。基于这些考虑，本领域技术人员将能够容易地选择适当的杂交条件。在优选的实施方案中，选择严格的杂交条件。举例来说，可以采用以下条件来实现严格杂交：基于上述等式，在Tm-5℃下在5x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)/5x Denhardt溶液/1.0％ SDS下杂交，然后在60℃下用0.2x SSC/0.1％ SDS洗涤。中等严格杂交条件包括在42℃下在3x SSC中的洗涤步骤。然而，应理解，使用替代的缓冲液、盐和温度可以实现等效的严格性。关于杂交条件的另外的指南可以在以下文献中找到：Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,N.Y.,2002，以及Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory Press,2001。
如本文所用，术语“表达构建体”是指包含与异源核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列的多核苷酸(该异源核苷酸序列即，表达控制序列在自然界中通常不与其连接的序列)，该异源核苷酸序列是表达的对象。如本文所用，术语“表达载体”是指包含表达构建体和足以在宿主细胞中复制或插入宿主染色体中的序列的多核苷酸。质粒和病毒是表达载体的例子。如本文所用，术语“表达控制序列”是指调节与其可操作地连接的核苷酸序列的转录和/或翻译的核苷酸序列。表达控制序列包括启动子、增强子、阻遏物(转录调节序列)和核糖体结合位点(翻译调节序列)。
如本文所用，当表达控制序列在细胞中起作用以调节核苷酸序列的转录时，核苷酸序列与表达控制序列“可操作地连接”。这包括通过聚合酶与启动子之间的相互作用促进核苷酸序列的转录。
如本文所用，术语“载体”包括用于核酸分子的任何中间媒介物，该媒介物使得所述核酸分子例如能够被引入原核和/或真核细胞中和/或整合到基因组中，并且包括质粒、噬菌粒、噬菌体或病毒载体(如基于逆转录病毒的载体、慢病毒载体、腺相关病毒载体等)。如本文所用，术语“质粒”通常是指染色体外遗传物质的构建体(通常是环状DNA双链体)，其可以独立于染色体DNA复制。
“转染”是指将新的遗传物质引入细胞中。它包括转化(通过细胞膜从其周围环境直接摄取和掺入外源性遗传物质)、转导(通过噬菌体病毒将外来DNA引入宿主细胞)和缀合。
如本文所用，“宿主细胞”是指包含表达构建体的重组细胞。
如本文所用，术语“生物样品”是指含有细胞(例如，肿瘤细胞)或源自细胞的生物分子的样品。
如本文所用，术语“疗法”、“治疗”、“治疗性干预”和“改善”是指导致症状严重程度降低的任何活动。术语“治疗”和“预防”不旨在是绝对的术语。治疗和预防可以指发作的任何延迟、症状的改善、患者存活期的改善、存活时间或存活率的增加等。治疗和预防可以是完全的或部分的。可以将治疗效果与未接受治疗的个体或个体集合比较，或者与治疗前或治疗期间不同时间的同一患者比较。在一些方面，例如与施用前的个体或未经历治疗的对照个体相比，疾病的严重程度降低至少10％。在一些方面，疾病的严重程度降低至少25％、50％、75％、80％或90％，或在一些情况下，使用标准诊断技术不再可检测到。“治疗(Treating)”和“治疗(Treatment)”还可以意指与未接受治疗时的预期存活期相比延长存活期。如本文所用，“治疗(Treating)”和“治疗(treatment)”还包括预防性治疗。
“包含”或“包括”一种或多种列举的要素的组合物或方法可以包括未具体列举的其他要素(例如，意指包括但不限于的开放式术语)。例如，“包含”或“包括”抗体的组合物可以含有单独的抗体或抗体与其他成分的组合。相反，短语“由……组成”是封闭性的，表明此类实施方案不包括另外的要素。术语“基本上由……组成”是指包括所列举的要素和不实质上影响所要求保护的组合的基本和新颖特征的其他要素(例如，部分封闭的术语)。应理解，本文描述为“包含”的方面和实施方案包括“由……组成”和“基本上由……组成”实施方案。
如本文所用，除非另有说明，否则以下含义适用。“可以”一词是以允许的意义(即，意指有可能)而不是强制性的意义(即，意指必须)使用的。单数形式“一个/一种(a)”、“一个/一种(an)”和“所述(the)”包括复数指示物。因此，例如，尽管针对一个或多个要素使用其他术语和短语(如“一个或多个”)，但是对“一个/一种要素”的提及包括两个或更多个要素的组合。短语“至少一个/一种”包括“一个/一种”、“一个/一种或多个/多种”和“多个/多种”。除非另有说明，否则术语“或”是非排他性的，即涵盖“和”和“或”二者。修饰语与序列之间的术语“任何”意指修饰语修饰序列的每个成员。因此，例如，短语“至少1、2或3中的任一个”意味着“至少1、至少2或至少3”。
II.嵌合抗原受体
“嵌合抗原受体”或“CAR”是包含任选的信号肽、靶结合结构域、任选的铰链区、跨膜结构域、细胞内信号传导结构域和任选的共刺激结构域的工程化分子。CAR基于T细胞受体的结构，其在T细胞上表达并且参与细胞介导的免疫应答。“靶结合结构域”在本文中也称为“抗原结合结构域”，并且因此术语“靶”涵盖“抗原”。
所谓的“第一代”CAR具有靶向结构域和CD3ξ信号转导结构域。所谓的“第二代”CAR进一步包括共刺激结构域(如CD28或4-1BB结构域)。所谓的“第三代”CAR包含多个共刺激结构域。所谓的“第四代”CAR(也称为“TRUCK”)被工程化以在CAR信号传导后释放转基因细胞因子。
嵌合抗原受体(“CAR”)包括以下要素：(1)任选的信号肽，(2)靶结合结构域，(3)任选的铰链区；(4)跨膜区；(5)包含信号转导结构域的细胞内结构域。任选地，CAR可以包括以下中的任一个：CD3ζ信号转导结构域、Fc受体信号转导结构域、共刺激(信号转导)结构域。也就是说，除了其他任选的要素或代替其他任选的要素，可以包括这些任选的要素。靶结合结构域与其他结构域中的至少一个是异源的。也就是说，靶结合结构域不天然存在于T细胞受体上，或与其他结构域中的至少一个不在相同蛋白质中。
“靶结合结构域”提供对CAR的结合特异性。“信号肽”引导多肽通过细胞膜。对于所谓的“通用CAR”，靶结合结构域可以与结合靶抗原的抗体的结构域结合。“铰链区”是柔性连接器区域，例如天然或合成多肽，或任何其他类型的分子，从而提供结构柔性和与侧翼多肽区的间隔。“跨膜结构域”是跨膜蛋白结构域，通常是疏水性的。在结合后“信号转导结构域”或“信号传导结构域”通过信号转导途径将信号传送到细胞中。这种信号传导激活细胞的活性。“共刺激结构域”是进一步传送信号的辅助信号传导结构域。
在一些实施方案中，CAR包含：
(i)与瓜氨酸化蛋白或其瓜氨酸化片段反应的靶结合结构域(在本文中也称为抗原结合结构域)，如VH-VL或VL-VH，其中两个可变结构域通过长度为15-25个氨基酸的柔性接头分开；
(ii)铰链结构域；
(iii)共刺激结构域；和
(iv)细胞内信号传导结构域(在本文中也称为激活结构域)。也就是说，在一些实施方案中，CAR包含与CAR平台融合的抗原结合结构域，该平台包含铰链结构域、跨膜结构域以及包含共刺激结构域和激活结构域的细胞内结构域。CAR可以进一步包括信号肽(在本文中也称为前导序列)以将CAR的表达引导至细胞(如Treg)的表面。
在一些实施方案中，CAR包含与CAR平台框内融合的抗原结合结构域，该平台包含SEQ ID NO:15、SEQ ID:17、SEQ ID NO:28、和SEQ ID:19的氨基酸序列。在其他实施方案中，CAR包含与CAR平台框内融合的抗原结合结构域，该平台包含SEQ ID NO:30、SEQ ID:16、SEQID NO:28、和SEQ ID:19的氨基酸序列。在一些实施方案中，CAR包含与CAR平台框内融合的抗原结合结构域，该平台包含SEQ ID NO:30、SEQ ID:16、SEQ ID NO:29、和SEQ ID:19的氨基酸序列。在其他实施方案中，CAR包含与CAR平台框内融合的抗原结合结构域，该平台包含SEQ ID NO:30、SEQ ID:16、SEQ ID NO:29、和SEQ ID:19的氨基酸序列。
A.信号肽
信号肽可以是具有允许多肽穿过细胞膜的功能的任何肽。信号肽可以源自CD4、CD8、CD28、TLR或免疫球蛋白受体家族。
例如，信号肽可以包含以下序列：
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP(SEQ ID NO:18)；或
MALPVTALLLPLALLLHAAR(SEQ ID NO:23)。
B.靶结合结构域
1.结构
靶结合结构域可以包含含有靶结合功能的任何多肽，例如如本文所定义的抗体。在一个实施方案中，靶结合结构域可以包含如本文所定义的保留抗原结合活性的抗体形式。在一个实施方案中，靶结合结构域可包含单链抗体(scFV)。scFv可以经由铰链结构域连接到跨膜结构域，该铰链结构域的长度、柔性和来源为CAR的设计提供了可变性，并且可以与跨膜结构域一起促进与抗原的相互作用，促进构建免疫突触，并影响CAR与赋予稳固激活信号所需的另外的蛋白质的缔合。
2.靶标/抗原
本文所公开的嵌合抗原受体包含结合瓜氨酸化抗原(例如，在患有类风湿性关节炎的受试者的滑膜中发现的那些)的靶结合结构域(在本文中也称为抗原结合结构域)。特别地，靶结合结构域可以结合以下中的一个或多个：(i)瓜氨酸化波形蛋白，(ii)瓜氨酸化聚丝蛋白，(iii)瓜氨酸化纤维蛋白原，和(iv)其瓜氨酸化肽。在一些实施方案中，靶结合结构域可以结合(i)-(iii)的瓜氨酸化肽片段，其中肽片段的长度为至少10个氨基酸，例如长度为至少12个氨基酸、至少14个氨基酸或至少16个氨基酸。在一些实施方案中，靶结合结构域进一步结合生腱蛋白C。在一些实施方案中，靶结合结构域可以结合以下中的两个或更多个：(i)瓜氨酸化波形蛋白，(ii)瓜氨酸化聚丝蛋白，(iii)瓜氨酸化纤维蛋白原，和(iv)生腱蛋白C，或其瓜氨酸化肽片段。
在一些实施方案中，靶结构域是选自以下序列的一种或多种瓜氨酸化肽：
ST(Cit)SVSSSSY(Cit)(Cit)MFGG(SEQ ID NO:24)；
VYAT(Cit)SSAV(Cit)L(Cit)SSV(SEQ ID NO:25)；
(Cit)PAPPPISGGGY(Cit)A(Cit)(SEQ ID NO:26)；
SHQEST(Cit)GRSRGRSGRSGS(SEQ ID NO:27)。
在一些实施方案中，抗原结合结构域结合一种或多种瓜氨酸化肽，但不结合非瓜氨酸化对应物。在一些实施方案中，抗原结合结构域结合如SEQ ID NO:24所示的瓜氨酸化波形蛋白肽，但不结合STRSVSSSSYRRMFGG(SEQ ID NO:45)。在一些实施方案中，抗原结合结构域结合如SEQ ID NO:25所示的瓜氨酸化波形蛋白肽，但不结合VYATRSSAVRLRSSV(SEQ IDNO:46)。在一些实施方案中，抗原结合结构域结合如SEQ ID NO:26所示的瓜氨酸化纤维蛋白原肽，但不结合RPAPPPISGGGYRAR(SEQ ID NO:47)。在一些实施方案中，抗原结合结构域结合如SEQ ID NO:27所示的瓜氨酸化聚丝蛋白肽，但不结合SHQESTRGRSRGRSGRSGS(SEQ IDNO:48)。
靶结合结构域可以包含来自抗体VH和VL结构域的序列。在一些实施方案中，靶结合结构域可包含来自仅具有两个VH结构域的仅重链抗体或抗体片段的序列。这包括来自VH和VL结构域的特定CDR组。在一些实施方案中，靶结合结构域包含来自SEQ ID NO:1或SEQID NO:2的VH结构域的CDR。在一些实施方案中，靶结合结构域包含来自SEQ ID NO:3或SEQID NO:4的VL结构域的CDR。在一些实施方案中，靶结合结构域包含分别来自SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的VH和VL结构域的CDR。在一些实施方案中，靶结合结构域包含分别来自SEQID NO:1或SEQ ID NO:4的VH和VL结构域的CDR。在一些实施方案中，靶结合结构域包含分别来自SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的VH和VL结构域的CDR。在一些实施方案中，靶结合结构域包含分别来自SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:4的VH和VL结构域的CDR。
在一些实施方案中，靶结合结构域包含来自SEQ ID NO:1(SBT01 VH(M))和SEQ IDNO:4(SBT01 VL(G))的VH和VL结构域的互补决定区(CDR)。在一些实施方案中，靶结合结构域的VH结构域包含含有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的VH-CDR1、含有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VH-CDR2和含有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的VH-CDR3，并且靶结合结构域的VL结构域包含含有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的VL-CDR1、含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的VL-CDR2和含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的VL-CDR3。
区域 SEQ ID 序列片段 残基 长度
LFR1 NO:38 SYVLTQPPSVSVAPGKTARITC 1-22 22
CDR-L1 NO:39 GGNNIGSKSVH 23-33 11
LFR2 NO:40 WYQQKPGQAPVLVIY 34-48 15
CDR-L2 NO:41 YDSDRPS 49-55 7
LFR3 NO:42 GIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYC 56-87 32
CDR-L3 NO:43 QVWDSSSDHQV 88-98 11
LFR4 NO:44 FGTGTKVTV 99-108 11
在某些实施方案中，靶结合结构域包含选自以下的VH序列：
(1)SBT01 VH(M)
(2)SBT01 VH(G)
或
与前述序列具有80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％序列同一性中的至少任一序列同一性的序列，条件是靶结合结构域结合如本文所述的瓜氨酸化抗原。
靶结合区可以包含选自以下的VL序列：
(1)SBT01 VL(M)
(2)SBT01 VL(G)
或
与前述序列具有80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％序列同一性中的至少任一序列同一性的序列，条件是靶结合结构域结合如本文所述的瓜氨酸化抗原。
在另一个实施方案中，抗原结合区包含scFV，该scFV包含含有SEQ ID NO:1或SEQID NO:2的VH结构域的氨基酸序列的一个或多个VH结构域。在一些实施方案中，抗原结合区包含scFV，该scFV包含具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的至少80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％中的任一个的氨基酸序列，条件是scFV结构域结合如本文所述的瓜氨酸化抗原。
在一些实施方案中，scFV包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的VL结构域。在一些实施方案中，抗原结合区包含scFV，该scFV包含具有SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的至少80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％中的任一个的氨基酸序列，条件是scFV结构域结合如本文所述的瓜氨酸化抗原。
在一些实施方案中，scFV结构域包含分别为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3的VH和VL结构域。在一些实施方案中，抗原结合区包含scFV，该scFV包含具有SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:3的至少80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％中的任一个的氨基酸序列，条件是scFV结构域结合如本文所述的瓜氨酸化抗原。在一些实施方案中，选自SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22的接头置于VH与VL结构域之间。
在一些实施方案中，scFV结构域包含分别为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:4的VH和VL结构域。在一些实施方案中，抗原结合区包含scFV，该scFV包含具有SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:4的至少80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％中的任一个的氨基酸序列，条件是scFV结构域结合如本文所述的瓜氨酸化抗原。在一些实施方案中，选自SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22的接头置于VH与VL结构域之间。
在一些实施方案中，scFV结构域包含分别为SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的VH和VL结构域。在一些实施方案中，抗原结合区包含scFV，该scFV包含具有SEQ ID NO:2和SEQ IDNO:3的至少80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％中的任一个的氨基酸序列，条件是scFV结构域结合如本文所述的瓜氨酸化抗原。在一些实施方案中，选自SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22的接头置于VH与VL结构域之间。
在一些实施方案中，scFV结构域包含分别为SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4的VH和VL结构域。在一些实施方案中，抗原结合区包含scFV，该scFV包含具有SEQ ID NO:2和SEQ IDNO:4的至少80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％中的任一个的氨基酸序列，条件是scFV结构域结合如本文所述的瓜氨酸化抗原。在一些实施方案中，选自SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22的接头置于VH与VL结构域之间。
在另一个实施方案中，抗原结合区包含scFV，该scFV包含选自以下的氨基酸序列：
SBT01G-VHVL-GGGSx3接头-pSB_0149
(GGGSx3接头加下划线)；
SBT01G-VHVL-Whitlow 218接头-pSB_0158
(Whitlow 218接头加下划线)；
SBT01G-VHVL-AB pur接头-pSB_0159
(AB pur接头加下划线)；或
与前述序列具有80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％序列同一性中的至少任一序列同一性的序列，条件是靶结合结构域结合如本文所述的瓜氨酸化抗原。
例如，接头可以包含以下序列：
GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:20)GGGSx3接头；或
GSTSGSGKPGSGEGSTKG(SEQ ID NO:21)Whitlow 218接头；或
ASSGGSTSGSGKPGSGEGSSGSAR(SEQ ID NO:22)AB pur接头。
任选地，任何前述序列可包括来自上述VH和VL结构域的CDR组。
C.铰链区
在一些实施方案中，所公开的CAR的铰链区可以选自CD8、CD4或CD28细胞外结构域、IgG1抗体的Fc区、或如本领域技术人员已知的任何TLR受体的细胞外结构域，并且可以在GenBank数据库中找到。
例如，铰链区可包含以下序列：
IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP(SEQ ID NO:30)(CD28)；
或
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTC
GVLLLSLVITLYC(SEQ ID NO:15)(CD8)；或
与前述铰链区序列具有80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％序列同一性中的至少任一序列同一性的序列。
D.跨膜结构域
跨膜结构域可以包含免疫球蛋白家族受体(如CD8)的跨膜结构域。细胞内结构域可以选自T细胞上的任何跨膜分子。例如，所公开的CAR的跨膜(TM)结构域可以包含CD2、CD3、CD16、CD32、CD64、CD28、CD247、4-1BBL、CD4或CD8的TM结构域。
例如，跨膜结构域可以包含以下序列：
FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV(SEQ ID NO:16)；或
IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC(SEQ ID NO:17)；或
与前述铰链区序列具有80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％序列同一性中的至少任一序列同一性的序列。
E.信号转导结构域
1.CD3ζ信号转导结构域
在一些实施方案中，信号转导结构域包括CD3ζ信号传导结构域。所公开的CAR分子的CD3ζ信号传导结构域可以包含CD3ζ氨基酸序列，例如CD3ζ的信号转导结构域。
例如，CD3ζ信号转导结构域可以包含以下序列：
或
与前述CD3ζ信号转导结构域序列具有80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或
99.5％序列同一性中的至少任一序列同一性的序列。
例如，CD3ζ信号转导结构域可以包括SEQ ID NO:19中所示序列的氨基酸21-163、31-142、68-89和/或138-158，或其功能变体(例如，具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或10-20个氨基酸取代、缺失或添加)。
2.Fc受体信号转导结构域
在一些实施方案中，信号转导结构域包括Fc信号传导结构域。Fc信号传导结构域可以是Fc-α、Fc-γ、Fc-ε、Fc-μ和Fc-δ受体中的任一个。例如，Fc受体信号传导结构域可包含参与与Src(例如，Fgr、Fyn、Hck、Lyn、Yes和Src)和ZAP-70家族激酶的相互作用的氨基酸(例如，一个或多个ITAM结构域)(参见例如Sanchez-Mejorada等人(1998)J.LeukocyteBiol.63:531；Garcia-Garcia等人(2002)J.Leukocyte Biol.72:1092)。在一些实施方案中，Fc受体信号转导结构域包括至少一个ITAM结构域，例如，来自Fc-α、Fc-γ、Fc-ε、Fc-μ和Fc-δ受体中的任一个的至少一个ITAM结构域，或与其基本上相同。
序列也可以发现为如下：
F.共刺激结构域
除了CD3ζ或Fc受体的信号转导结构域，本公开文本的CAR还可以包括一个或多个共刺激结构域。共刺激结构域可以源自例如CD28、4-1BB、CD2、CD27、CD30、OX40、CD40、PD-1、PD-L1、PD-L2、ICOS、LFA-1、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、CD83L、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、B7-H3、B7-H4等。CAR构建体可以含有两个或更多个共刺激信号传导结构域(例如，CD28和4-1BB)。
一个或多个共刺激结构域可以位于信号转导结构域与跨膜区之间。
在某些实施方案中，CD28共刺激结构域可包含以下序列：
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID
NO:29)；或
与前述序列具有80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％序列同一性中的至少任一序列同一性的序列。
在某些实施方案中，41BB共刺激结构域可包含以下序列：
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL(SEQ ID
NO:28)；或
与前述序列具有80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％序列同一性中的至少任一序列同一性的序列。
III.核酸
A.编码CAR的核酸
本文公开了包含编码本公开文本的CAR的核苷酸序列的核酸分子(多核苷酸)。所公开的CAR的核酸可以是DNA的形式或RNA的形式。DNA包括cDNA、基因组DNA和合成DNA；并且可以是双链或单链，并且如果是单链，则可以是编码链或非编码(反义)链。RNA包括mRNA、siRNA、sRNA、ssRNA等。
例如，核酸可包含编码SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4中任一个的多肽的核苷酸序列。在某些实施方案中，编码VH结构域的核苷酸序列包含：
(1)SBT01 VH(M)
(2)SBT01 VH(G)
或
与前述序列具有80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％序列同一性中的至少任一序列同一性的序列。
在某些实施方案中，编码VL结构域的核苷酸序列包含：
(1)SBT01 VL(M)
(2)SBT01 VL(G)
或
与前述序列具有80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％序列同一性中的至少任一序列同一性的序列。
在另一个实施方案中，编码VH结构域的核酸分子包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9。在一些实施方案中，编码VH结构域的核酸分子包含具有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的至少80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％中的任一个的核酸序列，条件是scFV结构域结合如本文所述的瓜氨酸化抗原。
在一些实施方案中，编码VL结构域的核酸分子包含SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11。在一些实施方案中，编码VL结构域的核酸分子包含具有SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的至少80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％中的任一个的核酸序列，条件是scFV结构域结合如本文所述的瓜氨酸化抗原。
在一些实施方案中，编码scFV结构域的核酸分子包含SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:10。在一些实施方案中，编码scFV的核酸分子包含具有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:10的至少80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％中的任一个的氨基酸序列，条件是scFV结构域结合如本文所述的瓜氨酸化抗原。
在一些实施方案中，编码scFV结构域的核酸分子包含SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:11。在一些实施方案中，编码scFV的核酸分子包含具有SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:11的至少80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％中的任一个的氨基酸序列，条件是scFV结构域结合如本文所述的瓜氨酸化抗原。
在一些实施方案中，编码scFV结构域的核酸分子包含SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10。在一些实施方案中，编码scFV的核酸分子包含具有SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的至少80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％中的任一个的氨基酸序列，条件是scFV结构域结合如本文所述的瓜氨酸化抗原。
在一些实施方案中，编码scFV结构域的核酸分子包含SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:11。在一些实施方案中，编码scFV的核酸分子包含具有SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:11的至少80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％中的任一个的氨基酸序列，条件是scFV结构域结合如本文所述的瓜氨酸化抗原。
在另一个实施方案中，核酸分子编码scFv分子并具有以下核苷酸序列：
SBT01G-VHVL-GGGSx3接头-pSB_0149
(GGGSx3接头加下划线)；
或
与前述序列具有80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％序列同一性中的至少任一序列同一性的序列。
在另一个实施方案中，核酸分子编码scFv分子并具有以下核苷酸序列：
SBT01G-VHVL-Whitlow 218接头-pSB_0158
(Whitlow 218接头加下划线)；或
与前述序列具有80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％序列同一性中的至少任一序列同一性的序列。
在另一个实施方案中，核酸分子编码scFv分子并具有以下核苷酸序列：
SBT01G-VHVL-AB pur接头-pSB_0159
(AB pur接头加下划线)；或
与前述序列具有80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％序列同一性中的至少任一序列同一性的序列。
任选地，这些可以包括编码来自本文所述的VH和VL结构域的CDR组的序列。
多核苷酸变体可含有在编码区、非编码区、或二者中的改变。在一些实施方案中，多核苷酸变体含有产生沉默取代、添加或缺失但不改变编码的CAR多肽的特性或活性的改变。在一些实施方案中，多核苷酸变体含有在氨基酸序列中不产生任何变化的改变。在一些实施方案中，由于遗传密码的简并性，多核苷酸变体含有“沉默”取代。可以出于多种原因产生多核苷酸变体，例如，以优化针对特定宿主的密码子表达。
在一些实施方案中，如本文所述的多核苷酸是分离的。
编码CAR的多核苷酸是分离的分子，或者可以包括在载体(例如，质粒、粘粒、人工染色体或病毒)内。可将此类载体用于转染靶细胞。
B.表达构建体和载体
编码本公开文本的CAR的多核苷酸可以包括与编码CAR的核苷酸序列可操作地连接的调节元件。例如，多核苷酸可以包括一个或多个转录调节元件(如启动子或增强子)，当该多核苷酸存在于细胞中时，该一个或多个转录调节元件导致编码CAR的序列在细胞内表达。
可以将本文所公开的核酸掺入能够转染细胞的载体中。此类载体包括而不限于病毒载体、质粒和微泡，例如脂质体。示例性病毒载体为腺病毒载体Ad、AAV、慢病毒和水疱性口炎病毒(VSV)和逆转录病毒。慢病毒是逆转录病毒科的一个属，并且包括HIV、SIV和FIV。慢病毒可以将大量遗传物质递送到宿主细胞的DNA中。它们能够感染非分裂细胞。
IV.细胞
在一些实施方案中，重组(宿主)细胞具有编码所公开的CAR的核酸分子，其中核酸分子可进一步包含与编码CAR的核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列。可以将装配的CAR(通过合成、定点诱变或如本领域技术人员所已知的另一种方法)、编码所公开的CAR的核酸分子插入表达载体中，并与适于在所需宿主中表达所公开的CAR的表达控制序列可操作地连接。可以通过核苷酸测序、限制性酶切作图和/或CAR多肽在合适宿主中的表达来确认正确的装配。如本领域中所熟知的，为了获得转染基因在宿主中的高表达水平，必须将该基因可操作地连接至在所选表达宿主中起作用的转录和翻译表达控制序列。
本公开文本还提供了包含编码CAR的核酸分子和/或表达CAR的细胞(例如，重组细胞)。
可以将编码所公开的CAR的核酸分子通过如本领域技术人员所已知的质粒或病毒载体递送至宿主细胞，包括但不限于T细胞、B细胞、髓样祖细胞、巨噬细胞等。所得重组(宿主)细胞可包括但不限于如本领域技术人员所已知的T细胞、CD4 T细胞、Treg细胞、CD8αT细胞、CD8βT细胞、T辅助细胞、粒细胞(嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞)、巨核细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突细胞、T记忆干细胞以及表达I类或II类MHC的细胞。在一些实施方案中，具有编码所公开的CAR的核酸分子的重组(宿主)细胞可以是选自以下的如本领域技术人员所已知的髓样祖细胞：髓系共同祖细胞、粒细胞巨噬细胞祖细胞、巨核细胞红细胞祖细胞、粒细胞祖细胞和单核细胞祖细胞。在一些实施方案中，髓样细胞是自体或同种异体细胞。
在一些实施方案中，表达本公开文本的CAR的细胞是Treg细胞。“调节性T细胞”或“Treg细胞”是属于特化T细胞亚群的细胞，其作用是抑制免疫应答，从而维持稳态和自身耐受性。Treg能够抑制T细胞增殖和细胞因子产生，并在预防自身免疫中起关键作用。Treg的特征在于FoxP3的表达。Treg的表面标记物包括CD4、CD25高(高分子密度)和CD127低(低分子密度)。小鼠和人Treg表达GITR/AITR和CTLA-4。人CD4+FoxP3+Treg细胞可分为三个亚群：(1)CD45RA+CD25+FoxP3l0w静息Treg细胞，(2)CD45RO+CD25高FoxP3高经激活的Treg细胞，和(3)产生促炎性细胞因子的CD45RO+CD25+FoxP3低非抑制性效应T细胞(Teff)。
待用本文所公开的核酸转化的细胞可以是取自待施用重组细胞的受试者的细胞。以这种方式，可以减轻同种异体免疫应答的问题。
可以将细胞在施用于受试者之前离体扩增。
已经掺入表达本公开文本的CAR的核酸的Treg细胞可以表达这些CAR并用于本文所述的方法中以治疗类风湿性关节炎。
此外，可以根据任何合适的方法对由转化/重组宿主产生的蛋白质进行纯化。此类方法包括色谱(例如，离子交换、亲和和分级(sizing)柱色谱)、离心、差异性溶解度或用于蛋白质纯化的任何其他标准技术。可以将亲和力标签(如六组氨酸、麦芽糖结合结构域、流感外壳序列和谷胱甘肽-S-转移酶)附接到蛋白质上，以允许易于通过适当的亲和柱纯化。在一些实施方案中，还可以使用如蛋白水解、高效液相色谱(HPLC)、核磁共振和x射线晶体学的技术对蛋白质进行物理表征。
V.组合物
还公开了药物组合物，其包含具有编码所公开的CAR多肽和/或表达所公开的CAR多肽的核酸分子的重组细胞和药学上可接受的载体；以及用于治疗类风湿性关节炎的方法。
如本文所用，术语“药物组合物”是指包含药物化合物(例如，如本文所述的药物或重组Treg细胞)和药学上可接受的载体的组合物。
如本文所用，术语“药学上可接受的”是指与药物组合物的其他成分相容并且可以安全地施用于受试者的载体。该术语与“生理学上可接受的”和“药理学上可接受的”同义使用。根据本公开文本，药物组合物及其制备和使用技术是本领域技术人员已知的。有关合适的药理学组合物及其施用技术的详细列表，可以参考如以下的文章：Remington'sPharmaceutical Sciences,第17版1985；Brunton等人,“Goodman and Gilman’s ThePharmacological Basis of Therapeutics,”McGraw-Hill,2005；University of theSciences in Philadelphia(编),“Remington:The Science and Practice ofPharmacy,”Lippincott Williams&Wilkins,2005；和University of the Sciences inPhiladelphia(编),“Remington:The Principles of Pharmacy Practice,”LippincottWilliams&Wilkins,2008。
药学上可接受的载体通常是无菌的，至少对于人使用是无菌的。药物组合物通常包含用于缓冲和保存保藏的药剂，并且可以包括用于适当递送的缓冲液和载体，这取决于施用途径。药学上可接受的载体的例子包括而不限于生理(0.9％)盐水、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、汉克平衡盐溶液(Hank’s balanced salt solution)(HBSS)和多种电解质溶液(如PlasmaLyte ATM(Baxter))。
可以将药物组合物配制用于任何施用途径，包括粘膜(例如，鼻、舌下、阴道、颊或直肠)、肠胃外(例如，皮下、静脉内、肌内或动脉内注射(推注或输注))、口服或透皮。
可注射(例如，静脉内)组合物可以包含悬浮在可接受的载体(如水性载体)中的组合物的溶液。可以使用多种水性载体中的任一种，例如水、缓冲水、0.4％盐水、0.9％等渗盐水、0.3％甘氨酸、5％右旋糖等，并且可以包括用于增强稳定性的糖蛋白，如白蛋白、脂蛋白、球蛋白等。通常，使用生理缓冲盐水(135-150mM NaCl)。组合物可含有接近生理条件的药学上可接受的辅助物质，如pH调节剂和缓冲剂、张力调节剂、润湿剂，例如乙酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、油酸三乙醇胺等。在一些实施方案中，可以将组合物配制在用于静脉内施用的试剂盒中。
适于肠胃外施用(例如，通过关节内(在关节中)、静脉内、肌内、瘤内、真皮内、腹膜内和皮下途径)的配制品包括：水性和非水性的等渗无菌注射溶液，其可以含有抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和使配制品与预期接受者的血液等渗的溶质；以及水性和非水性的无菌混悬剂，其可以包括助悬剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。注射溶液和混悬剂也可以由无菌散剂、颗粒剂和片剂制备。在本发明的实践中，可以例如通过静脉内输注、外用、腹膜内、膀胱内或鞘内施用组合物。组合物的配制品可以呈现于单位剂量或多剂量密封容器中，如安瓿和小瓶。
可以冷冻保存细胞。冷冻保存可包括用冷冻保存剂(如DMSO)配制细胞。可商购的培养基包括例如可从Millipore Sigma获得的和
可以将组合物配制为用于施用的剂型。术语“剂型”是指药物的特定形式，并且取决于施用途径。剂型的例子包括但不限于：分散剂；栓剂；软膏剂；巴布剂(cataplasm)(泥敷剂)；糊剂(paste)；散剂；敷料；乳膏；膏药；溶液；贴剂；气雾剂(例如，鼻喷雾剂或吸入器)；凝胶剂；适合口服或粘膜施用于患者的液体剂型，包括混悬剂(例如，水性或非水性液体混悬剂、水包油乳剂或油包水液体乳剂)、溶液和酏剂；适于向患者肠胃外施用的液体剂型；和可以被重构以提供适于向患者肠胃外施用的液体剂型的无菌固体(例如，结晶或无定形固体)。
术语“剂量(dose)”和“剂量(dosage)”在本文中可互换使用。剂量是指在每次施用时给予个体的活性成分的量。剂量将根据许多因素变化，这些因素包括施用频率；个体的大小和耐受性；病症的严重程度；副作用的风险；施用途径；和可检测标记(如果存在)的成像模式。本领域技术人员将认识到，可以根据上述因素或基于治疗进展来修改剂量。
可以以单位剂型包装或制备药物制剂。在这种形式中，例如根据治疗剂的剂量或组合物的浓度，将制剂细分成含有适当量的活性组分的单位剂量。单位剂型可以是包装制剂，该包装含有离散量的制剂。如果需要，组合物还可以含有其他相容的治疗剂。
在一些实施方案中，本发明的组合物包含具有编码CAR多肽的核酸分子的重组细胞，该CAR多肽包含来自SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的VH结构域的互补决定区(CDR)。在一些实施方案中，本发明的组合物包含具有编码CAR多肽的核酸分子的重组细胞，该CAR多肽包含来自SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的VL结构域的CDR。在一些实施方案中，本发明的组合物包含具有编码CAR多肽的核酸分子的重组细胞，该CAR多肽包含来自SEQ ID NO:1和SEQID NO:3的VH和VL结构域的CDR。在一些实施方案中，本发明的组合物包含具有编码CAR多肽的核酸分子的重组细胞，该CAR多肽包含来自SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:4的VH和VL结构域的CDR。在一些实施方案中，本发明的组合物包含具有编码CAR多肽的核酸分子的重组细胞，该CAR多肽包含来自SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的VH和VL结构域的CDR。在一些实施方案中，本发明的组合物包含具有编码CAR多肽的核酸分子的重组细胞，该CAR多肽包含来自SEQID NO:2和SEQ ID NO:4的VH和VL结构域的CDR。在一些实施方案中，细胞是T细胞、CD4 T细胞、Treg细胞、CD8αT细胞、CD8βT细胞、T辅助细胞、粒细胞(嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞)、巨核细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突细胞或T记忆干细胞。在一些实施方案中，细胞是Treg细胞。
在一些实施方案中，本发明的组合物包含具有编码CAR多肽的核酸分子的重组细胞，该CAR多肽包含来自SEQ ID NO:1(SBT01 VH(M))和SEQ ID NO:4(SBT01 VL(G))的VH和VL结构域的CDR。在一些实施方案中，CAR多肽的VH结构域包含含有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的VH-CDR1、含有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VH-CDR2和含有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的VH-CDR3，并且CAR多肽的VL结构域包含含有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的VL-CDR1、含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的VL-CDR2和含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的VL-CDR3。在一些实施方案中，细胞是T细胞、CD4T细胞、Treg细胞、CD8αT细胞、CD8βT细胞、T辅助细胞、粒细胞(嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞)、巨核细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突细胞或T记忆干细胞。在一些实施方案中，细胞是Treg细胞。
在另一个实施方案中，本发明的组合物包含具有编码包含scFV的CAR多肽的核酸分子的重组细胞，该scFV包含含有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的VH结构域的氨基酸序列的一个或多个VH结构域。在一些实施方案中，编码CAR多肽的核酸分子包含scFV，该scFV包含具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的至少80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％中的任一个的氨基酸序列，条件是scFV结构域结合如本文所述的瓜氨酸化抗原。在一些实施方案中，细胞是T细胞、CD4 T细胞、Treg细胞、CD8αT细胞、CD8βT细胞、T辅助细胞、粒细胞(嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞)、巨核细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突细胞或T记忆干细胞。在一些实施方案中，细胞是Treg细胞。
在一些实施方案中，本发明的组合物包含具有编码CAR多肽的核酸分子的重组细胞，该CAR多肽包含含有SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的VL结构域的scFV。在一些实施方案中，编码CAR多肽的核酸分子包含scFV，该scFV包含具有SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的至少80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％中的任一个的氨基酸序列，条件是scFV结构域结合如本文所述的瓜氨酸化抗原。在一些实施方案中，细胞是T细胞、CD4 T细胞、Treg细胞、CD8αT细胞、CD8βT细胞、T辅助细胞、粒细胞(嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞)、巨核细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突细胞或T记忆干细胞。在一些实施方案中，细胞是Treg细胞。
在一些实施方案中，本发明的组合物包含具有编码CAR多肽的核酸分子的重组细胞，该CAR多肽包含含有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3的VH和VL结构域的scFV。在一些实施方案中，编码CAR多肽的核酸分子包含scFV，该scFV包含具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的至少80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％中的任一个的氨基酸序列，条件是scFV结构域结合如本文所述的瓜氨酸化抗原。在一些实施方案中，细胞是T细胞、CD4 T细胞、Treg细胞、CD8αT细胞、CD8βT细胞、T辅助细胞、粒细胞(嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞)、巨核细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突细胞或T记忆干细胞。在一些实施方案中，细胞是Treg细胞。
在一些实施方案中，本发明的组合物包含具有编码CAR多肽的核酸分子的重组细胞，该CAR多肽包含含有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:4的VH和VL结构域的scFV。在一些实施方案中，编码CAR多肽的核酸分子包含scFV，该scFV包含具有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:4的至少80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％中的任一个的氨基酸序列，条件是scFV结构域结合如本文所述的瓜氨酸化抗原。在一些实施方案中，细胞是T细胞、CD4 T细胞、Treg细胞、CD8αT细胞、CD8βT细胞、T辅助细胞、粒细胞(嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞)、巨核细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突细胞或T记忆干细胞。在一些实施方案中，细胞是Treg细胞。
在一些实施方案中，本发明的组合物包含具有编码CAR多肽的核酸分子的重组细胞，该CAR多肽包含含有SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的VH和VL结构域的scFV。在一些实施方案中，编码CAR多肽的核酸分子包含scFV，该scFV包含具有SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的至少80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％中的任一个的氨基酸序列，条件是scFV结构域结合如本文所述的瓜氨酸化抗原。在一些实施方案中，细胞是T细胞、CD4 T细胞、Treg细胞、CD8αT细胞、CD8βT细胞、T辅助细胞、粒细胞(嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞)、巨核细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突细胞或T记忆干细胞。在一些实施方案中，细胞是Treg细胞。
在一些实施方案中，本发明的组合物包含具有编码CAR多肽的核酸分子的重组细胞，该CAR多肽包含含有SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4的VH和VL结构域的scFV。在一些实施方案中，编码CAR多肽的核酸分子包含scFV，该scFV包含具有SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4的至少80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％中的任一个的氨基酸序列，条件是scFV结构域结合如本文所述的瓜氨酸化抗原。在一些实施方案中，细胞是T细胞、CD4 T细胞、Treg细胞、CD8αT细胞、CD8βT细胞、T辅助细胞、粒细胞(嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞)、巨核细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突细胞或T记忆干细胞。在一些实施方案中，细胞是Treg细胞。
VI.使用方法
表达本文所公开的CAR的T细胞、并且特别是Treg细胞可用于治疗类风湿性关节炎。使用方法包括向有需要的受试者(例如，患有类风湿性关节炎的受试者)施用有效量的本公开文本的药物组合物。
如本文所用，术语“受试者”是指个体动物。如本文所用，术语“患者”是指在医疗保健提供者(如医生或护士)的护理或监督下的受试者。受试者包括哺乳动物，如人和非人灵长类动物(如猴)，以及狗、猫、马、牛、兔、大鼠、小鼠、山羊、猪和其他哺乳动物物种。受试者还可以包括禽类。患者可以是寻求治疗、监测、调整或修改现有治疗方案等的个体。术语“类风湿性关节炎受试者”是指已被诊断患有类风湿性关节炎的个体。类风湿性关节炎患者可以包括尚未接受治疗、目前正在接受治疗、已经接受治疗的个体以及已经中止治疗的那些个体。
如本文所用，术语“有效量”、“有效剂量”和“治疗有效量”是指足以产生所需反应(如减少或消除病症的体征或症状或改善障碍)的药剂的量。在一些例子中，“有效量”是治疗(包括预防)任何障碍或疾病的一种或多种症状和/或根本原因和/或预防疾病进展的量。例如，对于给定的参数，治疗有效量将显示出治疗效果至少5％、10％、15％、20％、25％、40％、50％、60％、75％、80％、90％或至少100％中任一个的增加或减少。治疗功效也可以表示为“倍数”增加或减少。例如，与对照相比，治疗有效量可以具有至少1.2倍、1.5倍、2倍、5倍或更多中任一个的作用。
可以通过任何合适的途径施用药物组合物，这些途径包括但不限于静脉内、皮下、肌内或腹膜内途径。药物组合物的施用的例子包括将组合物在4℃下以10mg/ml储存在无菌等渗注射用水性盐水溶液中，并在施用于患者之前将其稀释在100ml或200ml的0.9％注射用氯化钠中。经1小时历程以0.2与10mg/kg之间的剂量通过静脉内输注施用药物组合物。在其他实施方案中，经15分钟与2小时之间的时间段通过静脉内输注施用药物组合物。在再其他实施方案中，施用程序是经由皮下推注。
组合物的剂量被选择为患者提供有效的疗法，并且在小于0.1mg/kg体重至约25mg/kg体重的范围内或在1mg-2g/名患者的范围内。在一些情况下，剂量在1-100mg/kg或大约50mg-8000mg/名患者的范围内。可以以适当的频率重复剂量，该频率可以在每日一次至每三个月一次的范围内，这取决于组合物的药代动力学(例如，组合物在循环中的半衰期)和药效学反应(例如，组合物的治疗效果的持续时间)。在一些实施方案中，约7与约25天之间的体内半衰期和组合物给药在每周一次与每3个月一次之间重复。
施用可以是周期性的。取决于施用途径，可以例如每1、3、5、7、10、14、21或28天或更长时间一次(例如，每2、3、4或6个月一次)施用剂量。在一些情况下，施用更频繁，例如每日2或3次。如本领域技术人员将认识到的，可以监测患者以根据治疗进展和任何不良副作用来调整施用的剂量和频率。
因此，在一些实施方案中，另外的施用取决于患者的进展，例如，在施用之间监测患者。例如，在第一次施用或一轮施用后，可以监测患者的肿瘤生长速率、复发(例如，在术后患者的情况下)或一般疾病相关症状(如虚弱、疼痛、恶心等)。
在某些实施方案中，将本文所述的T细胞施用于患有类风湿性关节炎的受试者的关节的滑膜。这种施用可以是直接注射到关节中。
本公开文本的示例性方法包括从获自受试者的生物样品分离T淋巴细胞。可以通过免疫亲和力(例如，使用衍生的固体支持物和抗CD4抗体)分离这种T细胞。可以基于其标记物特征将CD4+调节性T细胞(Treg)与非Treg细胞分开。Treg细胞为CD4+、CD25+、CD127lo。非Treg细胞为：CD4+、CD25+和CD127+。然后用编码本公开文本的嵌合抗原受体(CAR)的表达载体转染经分离的Treg细胞。扩增经转染的细胞。将经扩增的细胞施用于受试者。
VII.试剂盒
如本文所用，术语“试剂盒”是指旨在一起使用的物品的集合。试剂盒可任选地包括参考药剂和/或其使用说明书。试剂盒可进一步包括适于容纳含有如本文所公开的组合物的容器(如小瓶)的运输容器。试剂盒可包括内含物品的集合的容器。
本公开文本的试剂盒可包含如本文所述的药物组合物，其包含在容器(如用于静脉内施用的袋或瓶)中。试剂盒中还可以包括具有滴注室的流体导管，如塑料管。滴注室可以通过流体导管与静脉针连通。流体导管还可以包含一个或多个Y型位点和滚动夹。
实施例
缩写：CAR(嵌合抗原受体)；CF(瓜氨酸化纤维蛋白原)；CFSE(羧基荧光素琥珀酰亚胺酯)；CV(瓜氨酸化波形蛋白)；EGFR(表皮生长因子受体)；IN(鼻内)；IV(静脉内)；LPS(脂多糖)；PAD2(肽基精氨酸脱亚氨酶2)；PBMC(外周血单个核细胞)；PBS(磷酸盐缓冲盐水)；RA(类风湿性关节炎)；scFv(单链可变片段)；SF(滑液)；Teff(效应T细胞)；Treg(调节性T细胞)；和UTD(未转导)。实施例1：SBT01G在萤光素酶系统中始终表现得与BVCA1一样好或优于BVCA1
Jurkat-FF-萤光素酶转导-在2个平底96孔板的每一个中在具有2X硫酸鱼精蛋白的RPMI中以每孔50,000个细胞铺板。将病毒在RPMI中稀释，使得100μl的MOI大约为1。然后将100μl添加到每个96孔板上的一列中。然后将板旋转并置于培养箱中。第二天合并样品。将经转导的细胞重悬于培养基中，并将100μl转移到U底板中，一式两份。将细胞在4℃下用CV-AF488和CV-AF647与1:100抗EGFR-PE染色20min，洗涤一次，然后通过Novocyte分析。然后通过添加3ml新鲜培养基将样品按比例放大到6孔板中。
板包被-首先将瓜氨酸化波形蛋白(CV)以1:100稀释到4ml PBS中。通过将1ml转移到3ml中得到5个4倍系列稀释液。然后将100μl添加到96孔板中。将板置于4℃下以包被过夜。
萤光素酶测定-将标准化的经转导细胞沉淀并重悬于1ml RPMI中。将CV包被的板用PBS洗涤三次。向板中添加50μl的细胞。添加25μl的3X PMA/Iono，并将板置于37℃培养箱中。大约24小时后，通过添加75μl BioGlo试剂、在黑暗中孵育2-3min并读板来读取萤光素酶板。
图1示出了病毒转导的Jurkat-FF-萤光素酶细胞对不同浓度的全CV包被板的反应。结果显示，BVCA1和STB01对板结合的全长CV具有最强的反应。
图2示出了病毒转导的Jurkat-FF-萤光素酶细胞对不同浓度的可溶性CV的反应。结果显示，仅BVCA1和SBT01G-HL对可溶性全长CV具有剂量依赖性反应。
图3示出了，在用可溶性珠结合肽的测定中，BVCA1和SBT01展示对CV的结合特异性。
图4示出了BVCA1和SBT01G在不同蛋白浓度下对板结合的CV、抗体(V9)捕获的CV和可溶性CV的反应。结果显示，与BVCA1相比，SBT01G对板结合的CV和抗体(V9)捕获的CV(但不是可溶性CV)具有更强的反应。
实施例2：SBT01和BVCA1对来自类风湿性关节炎患者的滑液有反应
Jurkat-FF-萤光素酶转导-将24×106个Jurkat-FF-luc细胞沉淀并重悬于含有硫酸鱼精蛋白和病毒(MOI为3)的24ml RPMI中，以表达pSB_0147、pSB-0149和pSB0139的CAR。将细胞混合并将4ml等分到6孔板的每个孔中。然后将板旋转并置于培养箱中过夜。将细胞沉淀并重新接种在T75烧瓶中的25ml RPMT中。
滑液刺激-将经转导的细胞沉淀并重悬于RPMI中，并置于黑/白板的孔中。将来自RA患者的滑液(SF)样品解冻、涡旋并在RPMI中稀释，然后添加到含有经转导细胞的板中。将细胞与SF在37℃下培养。
萤光素酶测定-大约24小时后，将75μl BioGlo试剂添加到每个孔中，并将板在黑暗中孵育2-3min。然后在读板仪上读取发光。
Treg分离和组织培养-原代人Treg细胞来源于健康供体，来自白细胞减少室残留物或经富集白细胞单采术产物(leukopaks)。使用Ficoll-Paque Plus通过密度梯度离心分离外周血单个核细胞(PBMC)。通过阳性选择富集CD25+细胞。接下来使用FACS通过对CD4+CD25+CD127lo细胞门控来分离Treg细胞。在分离后，将细胞用CTSDynabeads Treg Xpander(Gibco)以1:1的珠与细胞比率刺激，并在补充有10％ FBS、非必需氨基酸、丙酮酸钠和β-巯基乙醇的RPMI培养基中与重组人IL-2(300IU/mL)以25-30万个细胞/mL的密度培养。在扩增的第9天，以1:1的珠与细胞比率添加新鲜CTSDynabeads Treg Xpander。
原代Treg转导-在存在硫酸鱼精蛋白的情况下，在扩增的第2天经由spin-occulation用CV-CAR构建体转导原代Treg。
Treg激活-将表达CV-CAR的Treg细胞与1:5至1:160的范围的滑液样品稀释液在体外培养。通过测量CD71表达来评估Treg激活。
流式细胞术和FACS分析-将激活培养物收集并以300×g离心5min，然后重悬于具有活力染料(Invitrogen)、抗EGFR和CD71表面染色抗体的1X流式染色(Flowstain)缓冲液(Invitrogen)中。将Treg在4℃下孵育30min，然后离心并用1X流式染色缓冲液洗涤。将经染色的细胞用CytoFix(BD Biosciences)固定，然后通过流式细胞术分析。
图5示出了SBT01G和BVCA1对来自RA患者的滑液的反应。数据显示，与BVCA1相比，SBT01G对来自几个RA患者的滑液产生更强的反应。
图6示出了，对于来自瑞典RA患者的触发反应的滑液样品，SBT01G再次强于BVCA1。
图7示出了用CV-CAR转导的原代Treg细胞对来自多个RA患者的滑液的反应。与表达BVCA1 CAR的原代Treg细胞相比，表达SBT01G CAR的原代Treg细胞对来自RA患者的滑液更敏感。
实施例3：SBT01和BVCA1对瓜氨酸化纤维蛋白原的反应
板包被-将瓜氨酸化蛋白在PBS中稀释并添加到黑/白isoplate的孔中。将板置于4℃下过夜以包被板孔。
萤光素酶测定-将稳定转导和未转导(UTD)的Jurkat-FF-luc细胞系沉淀并重悬于含有10％ FBS的RPMI中。将瓜氨酸化蛋白包被的板用PBS洗涤三次。将75μl中的50,000个细胞/孔添加到包被的板中。将在RPMI中的5μl的15X PMA/Iono添加到每个孔中，并将板置于37℃培养箱中。在大约24小时后，将75μl BioGlo试剂添加到每个孔中，并将板在黑暗中孵育2-3min。然后在读板仪上读取发光。
Treg分离和组织培养-原代人Treg细胞来源于健康供体，来自白细胞减少室残留物或经富集白细胞单采术产物。使用Ficoll-Paque Plus通过密度梯度离心分离外周血单个核细胞(PBMC)。通过阳性选择富集CD25+细胞。接下来使用FACS通过对CD4+CD25+CD127lo细胞门控来分离Treg细胞，并使用FACS对CD4+CD25loCD127pos门控来分离Teff。在分离后，将细胞用CTSDynabeads Treg Xpander(Gibco)以1:1的珠与细胞比率刺激，并在补充有10％ FBS、非必需氨基酸、丙酮酸钠和b-巯基乙醇的RPMI培养基中与重组人IL-2(300IU/mL)以25-30万个细胞/mL的密度培养。在扩增的第9天，以1:1的珠与细胞比率添加新鲜CTSDynabeads Treg Xpander。
原代Treg和Teff转导-在存在硫酸鱼精蛋白的情况下，在扩增的第2天经由spin-occulation用CD19-CAR和CV-CAR构建体转导原代Treg和Teff。
Treg激活-在激活培养物开始之前，用增殖染料CFSE标记表达CAR的Treg和Teff。将表达CD19-CAR和CV-CAR的Treg细胞与板包被的剂量范围为30ng/ml至10μg/ml的瓜氨酸化波形蛋白(CV)或瓜氨酸化纤维蛋白原(CF)在体外培养。通过测量增殖细胞的百分比和通过CD71表达来评估Treg激活。
流式细胞术和FACS分析-将激活培养物收集并以300×g离心5min，然后重悬于具有活力染料(Invitrogen)、抗EGFR和CD71表面染色抗体的1X流式染色缓冲液(Invitrogen)中。将Treg在4℃下孵育30min，然后离心并用1X流式染色缓冲液洗涤。将经染色的细胞用CytoFix(BD Biosciences)固定，然后通过流式细胞术分析。
图8示出了SBT01G和BVCA1对板结合的全长肽基精氨酸脱亚氨酶2(PAD2)-瓜氨酸化纤维蛋白原的反应。结果显示，SBT01G，而不是BVCA1，也能够对板结合的全长PAD2瓜氨酸化纤维蛋白原有反应。
图9示出了在Teff细胞和Treg细胞上表达的SBT01G CAR对瓜氨酸化波形蛋白(CV)和瓜氨酸化纤维蛋白原(CF)有反应。相比之下，在Teff细胞和Treg细胞上表达的BVCA1 CAR对CV有反应，但对CF无反应。
因此，图1-图9示出了SBT01G在所有测定系统中始终表现得与BVCA1一样好或优于BVCA1。
实施例4：在使用不同启动子和接头时CV CARS展示出功能性反应
Treg分离和组织培养-原代人Treg细胞来源于健康供体，来自白细胞减少室残留物或经富集白细胞单采术产物。使用Ficoll-Paque Plus通过密度梯度离心分离外周血单个核细胞(PBMC)。通过阳性选择富集CD25+细胞。接下来使用FACS通过对CD4+CD25+CD127lo细胞门控来分离Treg细胞。在分离后，将细胞用CTSDynabeads Treg Xpander(Gibco)以1:1的珠与细胞比率刺激，并在补充有10％ FBS、非必需氨基酸、丙酮酸钠和b-巯基乙醇的RPMI培养基中与重组人IL-2(300IU/mL)以25-30万个细胞/mL的密度培养。在扩增的第9天，以1:1的珠与细胞比率添加新鲜CTSDynabeads Treg Xpander。
原代Treg转导-在存在硫酸鱼精蛋白的情况下，在扩增的第2天经由spin-occulation用CV-CAR构建体转导原代Treg。
Treg激活-在激活培养物开始之前，用增殖染料CFSE标记表达CAR的Treg。将表达CV-CAR的Treg细胞与珠捕获的CV肽在体外培养。通过测量增殖细胞的百分比来评估Treg激活。
流式细胞术和FACS分析激活测定-将激活培养物收集并以300×g离心5min，然后重悬于具有活力染料(Invitrogen)和抗EGFR表面染色抗体的1X流式染色缓冲液(Invitrogen)中。将Treg在4℃℃下孵育30min，然后离心并用1X流式染色缓冲液洗涤。将经染色的细胞用CytoFix(BD Biosciences)固定，然后通过流式细胞术分析。
流式细胞术和FACS分析Treg表型-在扩增未转导(UTD)细胞的第14天，对表达CD19-CAR和CV-CAR的Treg进行转录因子FoxP3和Helios染色。使用eBiosciences FoxP3转录因子缓冲液套件(eBiosciences)将细胞固定并透化。
Treg培养物静息-在扩增的第14天，将表达CD19-CAR和CV-CAR的Treg收获，使用磁铁去珠，并仅与300IU/ml IL-2以50万个细胞/ml培养。
CAR表达的流式细胞术和FACS分析-将表达CD19-CAR和CV-CAR的Treg在扩增的第14天和静息2或5天后用活力染料(Invitrogen)和抗EGFR表面染色抗体染色。通过将细胞与1μg/ml CV孵育，然后与FITC标记的抗波形蛋白(克隆V9，Invitrogen)孵育来检测CV-CAR表达。
板包被-将瓜氨酸化波形蛋白(CV)在PBS中稀释并添加到黑/白isoplate的孔中。将板置于4℃下过夜以包被板孔。
萤光素酶测定-将稳定转导和未转导(UTD)的Jurkat-FF-luc细胞系沉淀并重悬于含有10％ FBS的RPMI中。将瓜氨酸化蛋白包被的板用PBS洗涤三次。将75μl中的50,000个细胞/孔添加到包被的板中。将在RPMI中的5μl的15X PMA/Iono添加到每个孔中，并将板置于37℃培养箱中。在大约24小时后，将75μl BioGlo试剂添加到每个孔中，并将板在黑暗中孵育2-3min。然后在读板仪上读取发光。
图10A示出了EF1A和MND启动子二者均驱动CV-CAR T细胞的表达和对可溶性珠结合的瓜氨酸化肽(pCV)的功能性反应。图10B示出了使用不同的启动子不改变CV-CAR Treg细胞的表型。
图11示出了scFv接头的选择几乎不影响SBT01G CAR T细胞对全长CV的反应。
图12A示出了与用BVCA1 CAR载体转导的情况下相比，用SBT01G CAR载体的转导导致在更高百分比的细胞中的CV-CAR表达。图12B示出了SBT01G CAR和BVCA1CAR Treg细胞具有相似的FoxP3和Helios特征。
因此，图10-图12示出了SBT01G显示更高百分比的CAR阳性Treg，并且SBT01G显示更高水平的CAR表达。
实施例5：瓜氨酸化波形蛋白对CV-CAR Treg的激活的体外评估
Treg分离和组织培养-原代人Treg细胞来源于健康供体，来自白细胞减少室残留物或经富集白细胞单采术产物。使用Ficoll-Paque Plus通过密度梯度离心分离外周血单个核细胞(PBMC)。通过阳性选择富集CD25+细胞。接下来使用FACS通过对CD4+CD25+CD127lo细胞门控来分离Treg细胞。在分离后，将细胞用CTSDynabeads Treg Xpander(Gibco)以1:1的珠与细胞比率刺激，并在补充有10％ FBS、非必需氨基酸、丙酮酸钠和青霉素/链霉素的RPMI培养基中与重组人IL-2(300IU/mL)以25-30万个细胞/mL的密度培养。
Treg激活-将未转导的和表达CV-CAR的Treg细胞与剂量范围为10ng/mL至10μg/mL的瓜氨酸化波形蛋白抗原在体外培养。通过测量增殖细胞的百分比以及CD71表达和IL-10分泌的水平来评估Treg激活。
流式细胞术和FACS分析：将未转导的和表达CV-CAR的Treg细胞收集并以300×g离心5min，然后重悬于具有CD71表面染色抗体和Cell Trace Violet(CTV)活力染料混合物(Invitrogen)的1X RoboSep缓冲液(StemCell Technologies)中。将Treg在4℃下孵育30min，然后离心并用1X RoboSep缓冲液洗涤。然后通过流式细胞术分析经染色的细胞。
结果
在体外评估响应于瓜氨酸化波形蛋白(CV)的Treg激活。图13示出了CV-CAR Treg细胞的剂量依赖性的、CV诱导的激活，如通过增殖细胞、CD71表达和IL-10分泌的增加所展示的。相反，未转导的Treg细胞不被CV激活。这些结果证明，用CV刺激后的Treg激活是表达CV-CAR的Treg特有的。
通过ELISA评估健康供体和类风湿性关节炎(RA)患者的滑液中存在的CV的量，如图14所示。将表达三种不同CV-CAR之一或对照CD19-CAR的Jurkat报告细胞与渐增量的滑液孵育，并测量反应作为CV-CAR结合和T细胞激活的信号转导的指标。图14示出了表达CV-CAR1(BVCA1)和CV-CAR2(SBT01G)(而不是CV-CAR3(C03)或CD19-CAR)的Jurkat细胞(永生化的人T淋巴细胞)显示对滑液(SF)的反应增加。图14还示出了，与CV-CAR1(BVCA1)T细胞相比，来自更多RA患者的SF样品激活CV-CAR2(SBT01G)T细胞。
为了证明表达CV-CAR的Treg被RA患者的滑液中的瓜氨酸化抗原激活，将未转导的和CV-CAR2 Treg与RA滑液或媒介物孵育，并测量增殖和CD71表达的水平。图15示出了来自两名供体的CV-CAR2 Treg细胞被以RA滑液特异性方式激活。
总之，这些结果证明CV-CAR Treg细胞能够结合存在于RA滑液中的瓜氨酸化抗原，从而导致抑制功能所必需的激活。
实施例6：对CV诱导的由CV-CAR Treg对Teff细胞的抑制的评估
Treg抑制测定-如上所述在96孔U型底板中从新鲜人经富集白细胞单采术产物制备表达CV-CAR的Treg细胞。将Treg与作为抗原刺激物的CV或与媒介物对照孵育。将Treg与CD3/CD28激活的或CD19-CAR特异性的Teff细胞共培养以评估Treg对靶细胞的抑制。按以下Treg:Teff比率共培养Teff细胞：(CD3/CD28激活)1:4＝0.25、1:2＝0.5、1:1＝1、2:1＝2和4:1＝4，或(CD19特异性)1:4、1:2、1:1、2:1和4:1。
结果
图16A示出了用CV刺激的CV-CAR Treg能够在低Treg:Teff比率下抑制CD3/CD28激活的Teff细胞的增殖。图16B示出了用CV刺激的CV-CAR Treg能够在低Treg:Teff比率下抑制CD19-CAR Teff细胞的增殖。
实施例7：在CV相关的肺部炎症的啮齿动物模型中分析CV-CAR Treg
在人风湿性关节炎(RA)患者中，滑液中始终高浓度的瓜氨酸化波形蛋白(CV)使得将CV鉴定为人RA的相关生物标记物。然而，本发明的RA小鼠模型显示不一致的CV水平，这使得CV-CAR Treg的体内分析复杂化。为了诱导CV产生并释放到细胞外基质中，开发LPS诱导的肺部炎症的小鼠模型。该模型的特征在于在鼻内LPS激发后数天内，有急性炎症反应，包括肺嗜中性粒细胞增多和促炎性细胞因子白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1b)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的分泌增加，以及在肺组织中CV累积。已经显示对CV具有特异性的嵌合抗原受体(CAR)与肺组织中累积的CV蛋白反应，这导致对应的CV-CAR Treg细胞的存活、增殖和以抗原特异性方式的抑制活性增加。
方法
六至八周大的免疫受损的NCG小鼠获自查尔斯河实验室(Charles RiverLaboratories)。将小鼠按体重随机分组并分成5-10只动物的组。在第0、1、6和12天，用LPS(5mg/kg)对小鼠进行鼻内(IN)处理，以诱导肺部炎症，并在受影响的组织中释放和累积瓜氨酸化波形蛋白(CV)。在第0天，从活跃生长的培养物中收获CV-CAR Treg细胞，将刺激珠以磁力方式去除，随后用Cell Trace Violet(CTV)(Invitrogen)标记Treg。在初始LPS激发后约4小时，将CTV标记的Treg在0.9％无菌盐水溶液(NaCl)中调节至25x 106个细胞/mL，并静脉内(IV)注射200μl剂量，使得每只小鼠接受总共5x 106个细胞。在CV-CAR Treg或对照CD19-CAR Treg过继细胞转移后，所有小鼠在第1、2、5、6、7、8、9和12天接受腹膜内(IP)注射IL-2(160,000IU)。每日监测小鼠的任何病痛临床体征，并每周两次测量体重。在第13天对小鼠实施安乐死，将脾和肺收获并加工成单细胞悬浮液，以用于人CV-CAR和CD19-CAR Treg的流式细胞术分析。
结果
图17示出了在小鼠中诱导CV相关的肺部炎症和CV-CAR Treg细胞体内激活的示例性时间线。
结果
图18A示出了如何从流式细胞术数据计算增殖率，并且图18B示出了如何从相同数据计算EGFR比率(CAR标记物)的变化倍数。
图19A示出了CV-CAR Treg的绝对数量在来自患有LPS诱导的肺部炎症的小鼠的肺组织中显著富集。图19B示出了CV-CAR Treg的增殖比率在来自患有LPS诱导的肺部炎症的小鼠的肺组织中显著增加。这些结果证明，与对照Treg相比，CV-CAR Treg具有改善的导向由瓜氨酸化波形蛋白累积表征的发炎肺组织和在所述发炎肺组织中增殖的能力。因此，此鼠肺部炎症模型允许体内测试人CV-CAR Treg。
示例性实施方案
1.一种嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体包含抗原结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域、一个或多个共刺激结构域和细胞内信号传导结构域，其中所述抗原结合结构域特异性结合瓜氨酸化多肽，任选地其中所述抗原结合结构域特异性结合三种或更多种不同的瓜氨酸化蛋白或其瓜氨酸化片段。
2.根据实施方案1所述的CAR，其中所述抗原结合结构域结合多种不同的瓜氨酸化蛋白或其瓜氨酸化片段。
3.根据实施方案1所述的CAR，其中所述抗原结合结构域结合以下中的一种或多种：(i)瓜氨酸化波形蛋白，(ii)瓜氨酸化聚丝蛋白，(iii)瓜氨酸化纤维蛋白原，和(iv)这些的瓜氨酸化肽片段，例如具有至少10、12、14或16个氨基酸中的任一个的所述片段。
4.根据实施方案1所述的CAR，其中所述抗原结合结构域结合以下中的至少两种：(i)瓜氨酸化波形蛋白，(ii)瓜氨酸化聚丝蛋白，和(iii)瓜氨酸化纤维蛋白原，或它们的瓜氨酸化肽片段。
5.根据实施方案1所述的CAR，其中所述抗原结合结构域结合以下中的全部三种：(i)瓜氨酸化波形蛋白，(ii)瓜氨酸化聚丝蛋白，和(iii)瓜氨酸化纤维蛋白原，或它们的瓜氨酸化肽片段。
6.根据实施方案5所述的CAR，所述CAR进一步结合瓜氨酸化生腱蛋白C。
7.根据实施方案1所述的CAR，其中所述抗原结合结构域包含VH结构域和VL结构域，其中：
(i)所述VH结构域包含含有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的VH-CDR1、含有SEQ IDNO:34的氨基酸序列的VH-CDR2、和含有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的VH-CDR3，并且
(ii)靶结合结构域的所述VL结构域包含含有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的VL-CDR1、含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的VL-CDR2、和含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的VL-CDR3。
8.根据实施方案1所述的CAR，其中所述细胞内信号传导结构域源自CD3ζ。
9.根据实施方案1所述的CAR，其中所述至少一个共刺激结构域源自由以下组成的组的成员：FceR1g、Fcg、CD28、4-1BB、CTLA-4、CTLA-4/CD-28杂合体、DAP10、CD27和2B4，任选地其中所述至少一个共刺激结构域包括CD28和/或4-1BB共刺激结构域。
10.根据实施方案1所述的CAR，其中所述抗原结合结构域包括抗体、抗体片段、骆驼科纳米抗体、仅重链抗体或适配体。
11.根据实施方案1至10中任一项所述的CAR，其中所述跨膜结构域是CD8跨膜结构域或CD28跨膜结构域；并且所述铰链结构域是CD8铰链结构域或CD28铰链结构域；和/或进一步包括信号肽，任选地其中所述信号肽是CD8信号肽或GM-CSF信号肽。
12.根据实施方案11所述的CAR，其中所述抗原特异性结合结构域包含单链片段。
13.根据实施方案12所述的CAR，其中所述单链片段包含单链可变片段(scFv)，任选地其中所述scFv片段包含：
(a)含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的VH结构域；和
(b)含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的VL结构域。
14.根据实施方案13所述的CAR，其中所述scFv片段包含：
(a)选自以下的VH：
(1)SBT01 VH(M)
或
(2)SBT01 VH(G)
和
(b)选自以下的VL：
(1)SBT01 VL(M)
或
(2)SBT01 VL(G)
15.根据实施方案14所述的CAR，其中所述VH-VL片段通过选自以下的接头连接：(i)GGGSx3(SEQ ID NO:20)，(ii)Whitlow 218(SEQ ID NO:21)，和(iii)AB Pur(SEQ IDNO:22)。
16.根据实施方案13所述的CAR，其中所述scFv包含以下的氨基酸序列：
(a)SBT01G-VHVL-GGGSx3接头-pSB_0149
(GGGSx3接头加下划线)；或
(b)SBT01G-VHVL-Whitlow 218接头-pSB_0158
(Whitlow
218接头加下划线)；或
(c)SBT01G-VHVL-AB pur接头-pSB_0159
(AB pur接头加下划线)。
17.根据实施方案1-16中任一项所述的CAR，其中所述共刺激结构域包括CD28、41BB、OX40、OX40、CD40L、MyD88、CD40、CD27、ICOS或RANK/TRANCE-R共刺激结构域。
18.一种编码根据实施方案1-17中任一项所述的CAR的核酸。
19.根据实施方案18所述的核酸，所述核酸包含DNA或RNA。
20.根据实施方案18所述的核酸，其中
所述VH由包含以下的核酸序列编码：
或
并且
所述VL由包含以下的核酸序列编码：
或
21.根据实施方案20所述的核酸，其中所述VH和VL片段通过接头连接并且包含(i)SEQ ID NO:12，(ii)SEQ ID NO:13，或(iii)SEQ ID NO:14的核酸序列。
22.一种表达载体，所述表达载体包含可操作地连接至根据实施方案16-21中任一项所述的核酸序列的表达控制序列。
23.根据实施方案22所述的表达载体，其中所述表达控制序列包含调节区，其中所述调节区选自：启动子序列、增强子序列、应答元件、蛋白质识别位点、诱导型元件、蛋白质结合序列、5'和3'非翻译区、转录起始位点、终止序列、多腺苷酸化序列、核定位、信号和内含子。
24.根据实施方案23所述的表达载体，其中所述载体是腺病毒载体、慢病毒载体或质粒。
25.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据实施方案22、23或24所述的表达载体。
26.一种经修饰的T细胞，所述经修饰的T细胞已被修饰以表达根据实施方案1-17中任一项所述的嵌合抗原受体(CAR)。
27.根据实施方案26所述的经修饰的T细胞，其中所述T细胞是哺乳动物T细胞。
28.根据实施方案27所述的经修饰的T细胞，其中所述T细胞是Treg细胞。
29.根据实施方案28所述的经修饰的T细胞，其中所述T细胞是人T细胞。
30.根据实施方案29所述的经修饰的T细胞，其中所述T细胞是原代T细胞。
31.根据实施方案30所述的经修饰的T细胞，其中所述T细胞为CD4+、CD25+和CD127lo。
32.一种药物组合物，所述药物组合物包含多个根据实施方案26至31中任一项所述的经修饰的T细胞和药学上可接受的载体。
33.一种治疗患有类风湿性关节炎的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据实施方案32所述的药物组合物。
34.根据实施方案33所述的方法，其中所述受试者是人。
35.根据实施方案33或34所述的方法，其中将所述药物组合物施用至所述受试者的滑膜中。
36.根据实施方案33或34所述的方法，其中将所述药物组合物静脉内施用。
37A.根据实施方案33所述的方法，其中施用包括：
(a)从获自所述受试者的生物样品分离T细胞；
(b)富集所述T细胞中的调节性T细胞(Treg)；
(c)用表达载体转染所述经富集的Treg细胞，所述表达载体包含可操作地连接至编码嵌合抗原受体(CAR)的核苷酸序列的表达控制序列，所述嵌合抗原受体包
含结合瓜氨酸化多肽的抗原结合结构域；
(d)扩增所述经转染的Treg细胞；以及(e)向所述受试者施用所述经扩增的Treg细胞。
37B.一种治疗患有类风湿性关节炎的受试者的方法，所述方法包括：
(a)从获自所述受试者的生物样品分离T细胞；
(b)富集所述T细胞中的调节性T细胞(Treg)；
(c)用编码根据实施方案1-17中任一项所述的CAR的表达载体转染所述经富
集的Treg细胞；
(d)扩增所述经转染的Treg细胞；以及
(e)向所述受试者施用所述经扩增的Treg细胞。
38.根据实施方案37所述的方法，其中所述扩增包括使用抗CD3/CD28包被的珠。
39.根据实施方案37所述的方法，其中所述扩增不使用抗CD3/CD28包被的珠。
40.根据实施方案37所述的方法，其中通过使用病毒载体、电穿孔、热激、噬菌体、超声处理或磷酸钙进行所述转染。
41.根据实施方案37至40中任一项所述的方法，所述方法进一步包括向所述受试者施用一种或多种抗炎剂和/或治疗剂。
42.根据实施方案41所述的方法，其中所述抗炎剂包括抑制促炎性细胞因子的抗体
43.根据实施方案42所述的方法，其中所述抗炎剂是抗TNF抗体、抗IL-6抗体或其组合。
44.一种试剂盒，所述试剂盒包含含有根据实施方案32所述的药物组合物的容器，所述容器通过流体导管与滴注室连通，其中所述滴注室通过流体导管与静脉针连通。
45.根据实施方案44所述的试剂盒，其中所述容器包括袋。
46.根据实施方案44所述的试剂盒，其中所述容器与所述针之间的所述流体导管包括一个或多个Y型位点和滚动夹。
应理解的是，说明书和附图并不旨在将本发明限制为所公开的特定形式，而是相反，本发明涵盖落入由所附权利要求限定的本发明的精神和范围内的所有修改、等效物和替代物。鉴于本说明书，本发明的各个方面的进一步修改和替代实施方案对于本领域技术人员将是清楚的。因此，本说明书和附图仅被理解为说明性的，并且是为了传授本领域技术人员实施本发明的一般方式。应理解，本文示出和描述的本发明的形式将被视为实施方案的例子。要素和材料可以取代本文示出和描述的要素和材料，部件和过程可以颠倒或省略，并且可以独立地使用本发明的某些特征，所有这些是如对于本领域技术人员在受益于本发明的本说明书之后所清楚的。在不脱离如以下权利要求所述的本发明的精神和范围的情况下，可以对本文所述的要素进行改变。本文使用的标题仅用于组织目的，并不意在用于限制本说明书的范围。
本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请都通过引用并入本文，并入程度就像每个单独的出版物、专利或专利申请被明确和单独地指出以通过引用并入一样。
综上所述，本发明包括但不限于以下各项：
1.一种嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体包含抗原结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域、一个或多个共刺激结构域和细胞内信号传导结构域，其中所述抗原结合结构域特异性结合三种或更多种不同的瓜氨酸化蛋白或其瓜氨酸化片段。
2.根据项1所述的CAR，其中所述抗原结合结构域结合以下中的全部三种：(i)瓜氨酸化波形蛋白，(ii)瓜氨酸化聚丝蛋白，和(iii)瓜氨酸化纤维蛋白原，或它们的瓜氨酸化肽片段。
3.根据项2所述的CAR，其中所述抗原结合结构域进一步结合瓜氨酸化生腱蛋白C。
4.根据项1所述的CAR，其中所述抗原结合结构域包含VH结构域和VL结构域，其中：
(i)所述VH结构域包含含有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的VH-CDR1、含有SEQ IDNO:34的氨基酸序列的VH-CDR2、和含有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的VH-CDR3，并且
(ii)靶结合结构域的所述VL结构域包含含有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的VL-CDR1、含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的VL-CDR2、和含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的VL-CDR3。
5.根据项1所述的CAR，其中所述细胞内信号传导结构域源自CD3-ζ。
6.根据项1所述的CAR，其中所述至少一个共刺激结构域包括由以下组成的组的成员的共刺激结构域：FceR1g、Fcg、CD28、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CTLA-4、CTLA-4/CD-28杂合体、DAP10、CD27、2B4及其组合，任选地其中所述至少一个共刺激结构域包括CD28和/或4-1BB共刺激结构域。
7.根据项1所述的CAR，其中所述抗原结合结构域包括抗体、抗体片段、骆驼科纳米抗体、仅重链抗体或适配体。
8.根据项1所述的CAR，其中所述跨膜结构域是CD8跨膜结构域或CD28跨膜结构域。
9.根据项1所述的CAR，其中所述铰链结构域是CD8铰链结构域或CD28铰链结构域。
10.根据项1所述的CAR，所述CAR进一步包含信号肽。
11.根据项10所述的CAR，其中所述信号肽是CD8信号肽或GM-CSF信号肽。
12.根据项1所述的CAR，其中所述抗原特异性结合结构域包含单链片段。
13.根据项12所述的CAR，其中所述单链片段包含单链可变片段(scFv)。
14.根据项13所述的CAR，其中所述scFv片段包含：
(a)含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的VH结构域；和
(b)含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的VL结构域。
15.根据项13所述的CAR，其中所述scFv片段包含：
(a)选自以下的VH：
(1)SBT01 VH(M)
HLHLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSINDTTYYWGWIRQPPGKGLEWIGSI
YYRGNTHYNSSLRSRVTMSVDTSKNRFSLKVTSVTAADTAVYYCARLDPFDYWGRGTLVTVSS(SEQID NO:1)；或
(2)SBT01 VH(G)
QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIGSIY
YSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARLDPFDYWGRGTLVTVSS(SEQ IDNO:2)；和
(b)选自以下的VL：
(1)SBT01 VL(M)
SYVLTQPPSVSLAPGETATITCGGDDIENQNVNWYQQKSGQAPMLLIFFDTRR
PSGIPERFSGSRSEDTANLTITRVEAGDDADYFCQVYDRKTDHQVFGPGTTVTVL(SEQ ID NO:3)或
(2)SBT01 VL(G)
SYVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGNNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVIYYDSD
RPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDHQVFGTGTKVTVL(SEQ ID NO:4)。
16.根据项15所述的CAR，其中所述VH-VL片段通过选自以下的接头连接：(i)GGGSx3(SEQ ID NO:20)，(ii)Whitlow 218(SEQ ID NO:21)，和(iii)AB Pur(SEQ ID NO:22)。
17.根据项16所述的CAR，其中所述scFv包含以下的氨基酸序列：
(a)SEQ ID NO:5的SBT01G-VHVL-GGGSx3接头；或
(b)SEQ ID NO:6的SBT01G-VHVL-Whitlow 218接头；或
(c)SEQ ID NO:7的SBT01G-VHVL-AB pur接头。
18.一种编码根据项1-17中任一项所述的CAR的核酸。
19.根据项18所述的核酸，所述核酸包含DNA或RNA。
20.根据项18所述的核酸，其中所述VH由包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9的核酸序列编码；并且所述VL由包含SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11的核酸序列编码。
21.根据项20所述的核酸，其中所述VH和VL片段通过接头连接并且包含SEQ IDNO:12，或(ii)SEQ ID NO:13，或(iii)SEQ ID NO:14的核酸序列。
22.一种表达载体，所述表达载体包含可操作地连接至根据项21所述的核酸序列的表达控制序列。
23.根据项22所述的表达载体，其中所述表达控制序列包含调节区，其中所述调节区选自：启动子序列、增强子序列、应答元件、蛋白质识别位点、诱导型元件、蛋白质结合序列、5'和3'非翻译区、转录起始位点、终止序列、多腺苷酸化序列、核定位、信号和内含子。
24.根据项23所述的表达载体，其中所述载体是腺病毒载体、慢病毒载体或质粒。
25.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据项24所述的表达载体。
26.一种经修饰的T细胞，所述经修饰的T细胞已被修饰以表达根据项1-17中任一项所述的嵌合抗原受体(CAR)。
27.根据项26所述的经修饰的T细胞，其中所述T细胞是哺乳动物T细胞。
28.根据项27所述的经修饰的T细胞，其中所述T细胞是Treg细胞。
29.根据项28所述的经修饰的T细胞，其中所述T细胞是人T细胞。
30.根据项29所述的经修饰的T细胞，其中所述T细胞是原代T细胞。
31.根据项30所述的经修饰的T细胞，其中所述T细胞为CD4+、CD25+和CD127lo。
32.一种药物组合物，所述药物组合物包含多个根据项31所述的经修饰的T细胞和药学上可接受的载体。
33.一种治疗患有类风湿性关节炎的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据项32所述的药物组合物。
34.根据项33所述的方法，其中所述受试者是人。
35.根据项33所述的方法，其中将所述药物组合物施用至所述受试者的滑膜中。
36.根据项33所述的方法，其中将所述药物组合物静脉内施用。
37.一种治疗患有类风湿性关节炎的受试者的方法，所述方法包括：
(a)从获自所述受试者的生物样品分离T细胞；
(b)富集所述T细胞中的调节性T细胞(Treg)；
(c)用编码根据项1-17中任一项所述的CAR的表达载体转染所述经富集的Treg细胞；
(d)扩增所述经转染的Treg细胞；以及
(e)向所述受试者施用所述经扩增的Treg细胞。
38.根据项37所述的方法，其中所述扩增包括使用抗CD3/CD28包被的珠。
39.根据项37所述的方法，其中所述扩增不包括使用抗CD3/CD28包被的珠。
40.根据项37所述的方法，其中通过使用病毒载体、电穿孔、热激、噬菌体、超声处理或磷酸钙进行所述转染。
41.根据项37所述的方法，所述方法进一步包括向所述受试者施用一种或多种抗炎剂和/或治疗剂。
42.根据项41所述的方法，其中所述抗炎剂包括抑制促炎性细胞因子的抗体。
43.根据项42所述的方法，其中所述抗炎剂是抗TNF抗体、抗IL-6抗体或其组合。
44.一种试剂盒，所述试剂盒包含含有根据项32所述的药物组合物的容器，所述容器通过流体导管与滴注室连通，其中所述滴注室通过流体导管与静脉针连通。
45.根据项44所述的试剂盒，其中所述容器包括袋。
46.根据项44所述的试剂盒，其中所述容器与所述针之间的所述流体导管包括一个或多个Y型位点和滚动夹。

Claims (30)

1.一种嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体包含抗原结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域、一个或多个共刺激结构域和细胞内信号传导结构域，其中所述抗原结合结构域特异性结合三种或更多种不同的瓜氨酸化蛋白或其瓜氨酸化片段，并且所述抗原结构域包含来自SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:4的VH和VL结构域的互补决定区(CDR)。
2.根据权利要求1所述的CAR，其中所述抗原结合结构域结合以下中的全部三种：(i)瓜氨酸化波形蛋白，(ii)瓜氨酸化聚丝蛋白，和(iii)瓜氨酸化纤维蛋白原，或它们的瓜氨酸化肽片段。
3.根据权利要求1所述的CAR，其中所述抗原结合结构域包含VH结构域和VL结构域，其中：
(i)所述VH结构域包含含有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的VH-CDR1、含有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VH-CDR2、和含有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的VH-CDR3，并且
(ii)所述VL结构域包含含有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的VL-CDR1、含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的VL-CDR2、和含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的VL-CDR3。
4.根据权利要求1所述的CAR，其中所述细胞内信号传导结构域源自CD3-ζ。
5.根据权利要求1所述的CAR，其中所述一个或多个共刺激结构域包括由以下组成的组的结构域：FceR1g、Fcg、CD28、CD134(OX40)、CD137(4-1BB)、CTLA-4、CTLA-4/CD-28杂合体、DAP10、CD27、2B4及其组合。
6.根据权利要求1所述的CAR，其中所述抗原结合结构域包括抗体、抗体片段、骆驼科纳米抗体、仅重链抗体或适配体。
7.根据权利要求1所述的CAR，其中所述跨膜结构域是CD8跨膜结构域或CD28跨膜结构域。
8.根据权利要求1所述的CAR，其中所述铰链结构域是CD8铰链结构域或CD28铰链结构域。
9.根据权利要求1所述的CAR，其中所述抗原特异性结合结构域包含单链片段。
10.根据权利要求9所述的CAR，其中所述单链片段包含单链可变片段(scFv)。
11.根据权利要求10所述的CAR，其中所述scFv片段包含：
(a)含有与SEQ ID NO:1具有至少95％同一性的氨基酸序列的VH结构域；和
(b)含有与SEQ ID NO:4具有至少95％同一性的氨基酸序列的VL结构域。
12.根据权利要求10所述的CAR，其中所述scFv片段包含：
(a)含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的VH结构域；和
(b)含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列的VL结构域。
13.根据权利要求12所述的CAR，其中所述VH结构域和所述VL结构域通过包含SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:21或SEQ ID NO:22的氨基酸序列的接头连接。
14.根据权利要求13所述的CAR，其中所述scFv片段包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。
15.一种核酸，所述核酸编码根据权利要求1-14中任一项所述的CAR。
16.根据权利要求15所述的核酸，其中所述VH结构域由包含SEQ ID NO:8的核酸序列编码；并且所述VL结构域由包含SEQ ID NO:11的核酸序列编码。
17.根据权利要求16所述的核酸，其中所述VH和VL片段通过接头连接并且包含SEQ IDNO:12，或(ii)SEQ ID NO:13，或(iii)SEQ ID NO:14的核酸序列。
18.一种表达载体，所述表达载体包含可操作地连接至根据权利要求17所述的核酸序列的表达控制序列。
19.一种经修饰的T细胞，所述经修饰的T细胞已被修饰以表达根据权利要求1-14中任一项所述的嵌合抗原受体(CAR)。
20.根据权利要求19所述的经修饰的T细胞，其中所述T细胞是调节性T(Treg)细胞。
21.根据权利要求20所述的经修饰的T细胞，其中所述T细胞是人T细胞。
22.根据权利要求21所述的经修饰的T细胞，其中所述T细胞是原代T细胞。
23.根据权利要求22所述的经修饰的T细胞，其中所述T细胞为CD4+、CD25+和CD127lo。
24.一种药物组合物，所述药物组合物包含多个根据权利要求23所述的经修饰的T细胞和药学上可接受的载体。
25.根据权利要求24所述的药物组合物在制备用于治疗类风湿性关节炎的药物中的用途。
26.根据权利要求25所述的用途，其中所述药物组合物被配制为施用至受试者的滑膜中。
27.根据权利要求25所述的用途，其中所述药物组合物被配制为静脉内施用至受试者。
28.一种方法，所述方法包括：
(a)从调节性T(Treg)细胞的生物盐工中富集T细胞；
(b)用编码根据权利要求1-14中任一项所述的CAR的表达载体转染所述经富集的Treg细胞；以及
(c)扩增所述经转染的Treg细胞。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述扩增包括使用抗CD3/CD28包被的珠。
30.根据权利要求28所述的方法，其中所述扩增不包括使用抗CD3/CD28包被的珠。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2694396A1 (en) * 2007-07-25 2009-01-29 Astrazeneca Ab Targeted binding agents directed to kdr and uses thereof - 035
EP2694530B1 (en) 2011-04-05 2018-02-14 Curara AB Novel peptides that bind to types of mhc class ii and their use in diagnosis and treatment
WO2014141244A1 (en) * 2013-03-12 2014-09-18 Tel Hashomer Medical Research Infrastructure And Services Ltd. Synthetic peptides for the treatment of autoimmune diseases
WO2015104564A2 (en) * 2014-01-13 2015-07-16 Imperial Innovations Limited Biological materials and therapeutic uses thereof
EP3097123A1 (en) 2014-01-24 2016-11-30 The United States of America, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services Anti-ny-br-1 polypeptides, proteins, and chimeric antigen receptors
KR20230172625A (ko) 2014-08-28 2023-12-22 바이오아트라, 인코퍼레이티드 변형된 t 세포에 대한 조건부 활성 키메라 항원 수용체
MY192062A (en) * 2014-12-05 2022-07-25 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Chimeric antigen receptors targeting fc receptor-like 5 and uses thereof
US10822419B2 (en) 2015-06-26 2020-11-03 University Of Southern California Masking chimeric antigen receptor T cells for tumor-specific activation
JP6932709B2 (ja) 2015-11-04 2021-09-08 ジェイ． プライスマン，ソール Ｈｅｒ２を標的とするキメラ抗原受容体
CN109072194B (zh) * 2015-12-09 2022-12-27 纪念斯隆-凯特林癌症中心 免疫细胞组合物及其使用方法
IL263385B2 (en) 2016-06-06 2023-04-01 Hope City Modified t cells - Baff-r targeted chimeric antigen receptor
EP3697820A4 (en) 2017-10-17 2022-01-05 The General Hospital Corporation PROCEDURES AND COMPOSITIONS RELATED TO MANIPULATED REGULATORY T-CELLS
EP3746468A4 (en) 2018-02-02 2021-12-01 The Trustees of The University of Pennsylvania MODIFIED MONOCYTES / MACROPHAGES / DENDRITIC CELLS EXPRESSING CHEMERICAL ANTIGENIC RECEPTORS AND USES IN DISEASES AND DISORDERS ASSOCIATED WITH PROTEIN AGGREGATES
JP7475686B2 (ja) 2018-02-11 2024-04-30 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア Ｃａｒ－ｔ細胞及び自己免疫疾患
WO2019178518A1 (en) 2018-03-16 2019-09-19 The Regents Of The University Of California Cellular signaling domain engineering in chimeric antigen receptor-modified regulatory t cells
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