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KR102390075B1 - 오르니틴 트랜스카르바밀라아제（ｏｔｃ） 결핍증의 치료에 유용한 조성물 - Google Patents

오르니틴 트랜스카르바밀라아제（ｏｔｃ） 결핍증의 치료에 유용한 조성물 Download PDF

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KR102390075B1
KR102390075B1 KR1020167027891A KR20167027891A KR102390075B1 KR 102390075 B1 KR102390075 B1 KR 102390075B1 KR 1020167027891 A KR1020167027891 A KR 1020167027891A KR 20167027891 A KR20167027891 A KR 20167027891A KR 102390075 B1 KR102390075 B1 KR 102390075B1
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릴리 왕
제임스 엠. 윌슨
Original Assignee
더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실베니아
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Abstract

엔지니어링된 hOTC DNA 및 RNA 서열을 포함하는 바이러스 벡터가 제공되며, 이것은 이를 필요로 하는 대상체에게 전달될 때 고암모니아혈증, 오르니틴 트랜스카르바밀라아제 트랜스카르바밀라아제 결핍증 및 이와 결부된 증상의 치료에 유용하다. 또한 제공되는 것은 hOTC의 투여에 의해 OTCD 환자에 있어서 간 섬유증, 간경변을 치료하기 위한 hOTC의 사용 방법이다.

Description

오르니틴 트랜스카르바밀라아제（ＯＴＣ） 결핍증의 치료에 유용한 조성물{COMPOSITIONS USEFUL IN TREATMENT OF ORNITHINE TRANSCARBAMYLASE (OTC) DEFICIENCY}
미국 연방 정부에 의해 후원된 연구 또는 개발에 관한 진술
이 연구는 부분적으로는 미국 국립 보건원(National Institutes of Health)으로부터의 보조금, 제P01-HD057247번, 제P01-HL059407번 및 제P30-DK047757번에 의해 지원되었다. 미국 정부는 본 발명에서 특정한 권리를 가질 수 있다.
전자 형태로 제출된 자료의 참고적 포함
본 출원인은 본원과 함께 전자 형태로 제출되는 서열 목록 자료를 본원에 참고로 포함시킨다. 이 파일은 "UPN-14-7037PCT_ST25.txt"로 라벨링되어 있다.
오르니틴 트랜스카르바밀라아제(ornithine transcarbamylase; OTC) 결핍증은 우레아 합성의 선천적 이상의 모든 사례 중 거의 절반을 차지하며, 이때 유병률은 15,000명 중 적어도 1명인 것으로 추산된다. 우레아 사이클 결함은 환자를 생명을 위협하는 암모니아 상승의 위험에 빠뜨리는데, 상기 암모니아 상승은 비가역성 인지 기능 장애, 혼수 상태 및 사망을 초래할 수 있다. 완전한 결핍증을 갖는 신생 남아는 삶의 처음 3일 내에 고암모니아혈증성 혼수 상태가 발병되며, 이는 비치료될 경우 치명적이다.
OTC 결핍증 (OTCD)에 대한 현재의 치료법에는 많은 난제가 있다. 환자는 다른 질소 제거 경로를 활성화시키는 투약의 이용과 조합된 저단백질식에 의해 관리될 수 있지만, 이는 고암모니아혈증성 위기를 예방하지 않는다. 투석 및 다른 경로의 치료법의 이용에도 불구하고, 신생아에 있어서 사망률이 거의 50%이다. 간 이식이 OTCD를 치유할 수 있지만, 공여자 간은 제한적이며, 그 절차에는 유의한 이환율이 수반되고, 면역억제약이 대상체의 삶의 지속 기간 동안 필요하다.
대사 질환, 예컨대 OTCD의 유전자 요법은 유전자 대체 요법에 대하여 다른 병태보다 더 도전적인 모델을 나타낸다. 유전자는 세포 자율적 방식으로 작용하기 때문에(즉, 이것은 단지 이것이 발현되는 세포에 영향을 줄 수 있기 때문에) 치료 효과는 세포당 높은 발현이 낮은 형질도입을 극복할 수 있는, 분비형 단백질과 상관되는 것과 같은 간에서의 순 발현 수준과 상관되는 것이 아니라 오히려, 형질도입되는 표적 세포의 수와 직접적으로 상관되어야 한다. 더욱이, hOTCwt mRNA가 불안정하다는 적어도 하나의 공개된 보고가 있었다. 문헌[Wang, L., et al, Molecular Genetics and Metabolism, 105 (2012) 203-211].
바이러스 벡터를 이용하여 OTC 결핍증을 치료하는 것에 대한 공개된 보고가 있었다. 예를 들어, 몇몇 그룹은 래트, 마우스 또는 인간 OTC cDNA를 지닌 재조합 아데노바이러스를 이용하여 이것을 OTC 결핍증의 쥐과 모델에서 시도하였다. 간 OTC 활성의 성공적인 재구성 및 대사 이상의 보정의 몇몇 척도가 래트 또는 마우스 OTC cDNA를 지닌 바이러스를 포함하는 동물 모델에서 보고되었다. 아데노바이러스 벡터를 이용하는 이전의 연구는 OTCD 마우스에서 충분한 수준의 활성 인간 OTC의 발현의 어려움을 예시하였다.
따라서 OTCD 치료법에 대한 다른 접근법이 필요하다.
일 측면에서, 본 발명은 인간 오르니틴 트랜스카르바밀라아제 (hOTC아제(hOTCase))를 코딩하는 엔지니어링된 핵산 서열 및 간세포에서의 hOTC의 발현을 지시하는 발현 제어 서열을 포함하는 발현 카세트를 갖는 재조합 바이러스 벡터를 제공하며, 여기서, hOTC 핵산 서열은 야생형 서열 (예를 들어, 서열 번호 1)의 전장 hOTC, 또는 성숙 hOTC (그러나 적어도 천연 리더 서열이 결여됨)를 포함하는 이의 단편, 또는 적어도 성숙 hOTC를 포함하는 또 다른 중간체에 대하여 야생형 hOTC 서열에 80% 미만으로 동일하며, 기능성 hOTC아제를 발현한다. 적합하게는, 본 엔지니어링된 서열은 바람직하게는 코돈 최적화되었으며, 이것이 상기 효소의 형질도입, 전사 및/또는 번역 중 적어도 1가지를 향상시키도록 추가로 개선되었다.
본 핵산 서열은 서열 번호 5의 성숙 hOTC, 또는 이에 대하여 적어도 약 96 내지 약 99% 동일한 핵산 서열 또는 적어도 서열 번호 9의 성숙 hOTC를 포함하는 핵산 서열, 또는 이에 대하여 적어도 약 96 내지 99% 동일한 핵산 서열을 포함할 수 있는데, 이는 기능성 hOTC아제를 발현한다. 일 실시 양태에서, hOTC는 서열 번호 5의 전장 서열 또는 이에 대하여 적어도 약 96 내지 약 99% 동일한 핵산 서열 또는 서열 번호 9의 전장 핵산 서열 또는 이에 대하여 적어도 약 96 내지 약 99% 동일한 핵산 서열이다. hOTC 서열은 서열 번호 3, 4, 8 또는 9의 상응하는 뉴클레오티드의 것일 수 있다. 본 발명이 서열 목록의 것에 상보성인 가닥일 경우 그 범주 내에 포함된다. 바이러스 벡터는 아데노-부속 바이러스(adeno-associated virus; AAV) 벡터, 아데노바이러스 벡터 및 렌티바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다.
추가의 측면에서, 본 발명은 AAV 캡시드 및 그 안에 패키징된(packaged) 발현 카세트를 갖는 재조합 아데노-부속 바이러스(rAAV)를 제공하며, 상기 발현 카세트는 적어도 하나의 AAV 역방위 말단 반복(inverted terminal repeat; ITR) 서열, 인간 오르니틴 트랜스카르바밀라아제 (hOTC아제)를 코딩하는 엔지니어링된 핵산 서열 및 간세포에서의 hOTC의 발현을 지시하는 발현 제어 서열을 포함하고, 상기 발현 제어 서열은 간-특이적 프로모터를 포함한다. 엔지니어링된 hOTC 핵산 서열은 야생형 서열 (예를 들어, 서열 번호 1)의 성숙 서열 또는 전장 hOTC에 대하여 야생형 hOTC 서열에 80% 미만으로 동일하며, 기능성 hOTC아제를 발현한다. 합성 hOTC 핵산 서열은 적어도 서열 번호 5의 성숙 hOTC 또는 이에 대하여 적어도 약 96 내지 약 99.9% 동일한 핵산 서열 또는 적어도 서열 번호 9의 성숙 hOTC를 포함하는 핵산 서열 또는 이에 대하여 적어도 약 96 내지 약 99.9% 동일한 핵산 서열을 포함한다.
다른 추가의 측면에서, 본 발명은 이종성 운송 펩티드를 포함하는 성숙 인간 오르니틴 트랜스카르바밀라아제를 포함하는 키메라 오르니틴 트랜스카르바밀라아제를 코딩하는 hOTC 유전자를 포함하는 바이러스 벡터를 제공하며, 여기서, 성숙 인간 오르니틴 트랜스카르바밀라아제 유래의 코딩 서열은 적어도 서열 번호 3, 4, 5, 8 또는 9의 성숙 hOTC를 포함하는 핵산 서열로부터 선택된다. 임의로, 상기 운송 서열을 포함하는 이러한 서열들 중 임의의 것의 전장 서열이 선택될 수 있다. 선택적으로, 이러한 성숙 hOTC, 및 본원에 기술된 바와 같은 이종성 운송 서열을 포함하는 키메라 OTC 유전자가 선택될 수 있다.
또 다른 측면에서, 담체 및 본원에 기술된 벡터의 유효량을 포함하는 제약 조성물이 제공된다.
또 다른 측면은 오르니틴 트랜스카르바밀라아제를 이를 필요로 하는 대상체에게 전달하기 위한 및/또는 오르니틴 트랜스카르바밀라아제 결핍증의 치료를 위한 의약의 제조에 사용되는 본원에 기술된 바이러스 벡터이다. 하나의 특히 바람직한 실시 양태에서, 대상체는 인간 대상체이다. 대상체는 오르니틴 트랜스카르바밀라아제 결핍증에 있어서 호모접합성(homozygous) 또는 헤테로접합성(heterozygous)일 수 있다.
또 다른 측면에서, OTCD에 있어서 대상체에서 섬유증 또는 오르니틴 트랜스카르바밀라아제 결핍증 (OTCD)-관련된 간경변의 예방 및/또는 치료에 있어서의, 기능성 인간 오르니틴 트랜스카르바밀라아제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 바이러스 벡터의 용도가 제공된다. 일 실시 양태에서, 대상체는 인간 대상체이다. 추가의 실시 양태에서, 대상체는 헤테로접합성이며, 증상의 후기 발병을 나타낼 수 있다.
다른 추가의 측면에서, OTCD를 갖는 대상체에서 간세포 암종의 예방 및/또는 치료에 있어서의, 기능성 인간 오르니틴 트랜스카르바밀라아제를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 바이러스 벡터의 용도가 제공된다. 일 실시 양태에서, 대상체는 인간 대상체이다. 추가의 실시 양태에서, 대상체는 OTCD에 대하여 헤테로접합성이며, 증상의 후기 발병을 나타낼 수 있다.
본 발명의 다른 측면 및 강점은 본 발명의 하기 [발명을 실시하기 위한 구체적인 내용]으로부터 쉽게 명백해질 것이다.
도 1a는 야생형 hOTC cDNA를 제공하며, 이는 324개의 A, 223개의 C, 246개의 G, 및 269개의 T를 갖는다 [서열 번호 1].
도 1b 내지 도 1c는 도 1a의 서열에 의해 코딩되는 인간 오르니틴 트랜스카르바밀라아제 서열을 제공한다 [서열 번호 2].
도 2는 변경된 GC 비를 갖는 엔지니어링된 hOTC cDNA를 제공한다. 이 서열에서의 염기 카운트는 283개의 A, 285개의 C, 284개의 G, 및 216개의 T이다 [서열 번호 3].
도 3은 LW3으로 칭해지는 엔지니어링된 hOTC cDNA를 제공한다 [서열 번호 4]. 이 서열에서의 염기 카운트는 279개의 A, 303개의 C, 288개의 G, 및 220개의 T이다. 이 도면에서 hOTC 오픈 리딩 프레임(open reading frame, ORF)에 있어서 개시 코돈 앞에 코작(Kozak) 서열이 온다. 리더의 코딩 서열은 뉴클레오티드 15에서 시작되며 (처음 96개의 뉴클레오티드), 이것에는 322개 아미노산의 hOTC아제의 코딩 서열이 뒤따른다. 이 도면에서, 종결 코돈에는 NotI 제한효소 부위 (GCGGCCGC)가 뒤따르는데, 이는 본 벡터의 산물이다.
도 4는 LW4로 칭해지는 엔지니어링된 hOTC cDNA를 제공한다 [서열 번호 5]. 이 서열에서의 염기 카운트는 278개의 A, 303개의 C, 289개의 G, 및 220개의 T이다. 리더의 코딩 서열은 뉴클레오티드 15에서 시작되며 (처음 96개의 뉴클레오티드), 이것에는 322개 아미노산의 hOTC아제의 코딩 서열이 뒤따른다. 이 도면에서, 종결 코돈에는 NotI 제한효소 부위 (GCGGCCGC)가 뒤따르는데, 이는 본 벡터의 산물이다.
도 5a 내지 도 5c는 야생형 hOTC, 및 5가지의 엔지니어링된 서열, GS [서열 번호 3], LW3 [서열 번호 4], LW4 [서열 번호 5], LW5 [서열 번호 8] 및 LW6 [서열 번호 9]의 cDNA 서열의 정렬을 제공한다. 정렬된 서열들은 코작 서열 (LW3 및 LW4의 처음 14개의 뉴클레오티드) 및 제한 효소 부위 (LW3 및 LW4에 있어서 종결 코돈 뒤에)를 함유하는데, 이들은 오픈 리딩 프레임의 일부가 아니다.
엔지니어링된 인간 (h) 오르니틴 트랜스카르바밀라아제 (OTC) cDNA가 본원에서 제공되는데, 이는 야생형 hOTC DNA 및/또는 mRNA와 비교하여 번역을 최대화하고 mRAN 안정성을 향상시키도록 설계되었다. 또한 본원에서 제공되는 것은 엔지니어링된 hOTC mRNA 서열이다. 이러한 조성물들은 본원에 기술된 바와 같이 치료 및/또는 예방 방법에서 사용될 수 있다. 임의로, 이러한 조성물들은 대상체 (예를 들어, 인간 대상체)에서 진단된 병태에 대한 케어의 표준과 일치하는 다른 치료법과 조합되어 사용된다.
비교 목적으로, 야생형 인간 OTC cDNA 서열이 도 1a에 예시되어 있다. 이 서열은 도 1a 내지 도 1c의 아미노산 서열의 인간 오르니틴 트랜스카르바밀라아제를 코딩한다. 이러한 상기 아미노산 서열은 도 2a 내지 도 5의 엔지니어링된 hOTC 유전자에 의해 코딩된다. 유전자와 구별하기 위하여 hOTC아제로 지칭될 수 있는 hOTC 효소는 이 서열로부터, 그의 N-말단에 32개 아미노산의 리더 펩티드 (도 1의 nt 1-96에 의해 코딩됨, 서열 번호 2의 대략 아미노산 1 내지 대략 32)를 갖는 프레단백질(pre-protein)의 형태로 발현되는데, 상기 리더 펩티드는 상기 효소를 세포 미토콘드리아로 안내한 후 절단되어서 322개 아미노산 잔기의 "성숙" 단백질 (서열 번호 2의 대략 아미노산 33 내지 대략 아미노산 354)을 남긴다. 이러한 "소위 성숙" hOTC아제는 각각의 폴리펩티드 사슬에서 322개 아미노산 잔기 서열을 갖는 호모삼량체(homotrimeric) 단백질이다. 임의로, 서열 번호 2의 야생형 서열에 대한 대안으로서, 질환에 연루되지 않은 하기 자연 발생 다형 위치들 중 하나 이상을 포함하는 서열을 선택할 수 있다: F101, L111, WI193-194 (예를 들어, http://www.uniprot.org/uniprot/P00480 참조).
엔지니어링된 cDNA 서열들 전부가 도 1a의 야생형 hOTC 핵산 서열 [서열 번호 1]에 대하여 약 77% 내지 약 78% 동일하지만, 이러한 서열들 사이에는 구조 차이가 있다 (이를 예시하는 도 5에서의 정렬을 참조). 특히, 도 2의 hOTCco [서열 번호 3]와 도 4의 hOTCcoLW4 [서열 번호 5] 사이에는 약 4%의 핵산 서열 차이가 있다. LW-3 [도 3, 서열 번호 4]과 LW-4 [도 4, 서열 번호 5] 사이에는 단지 1개의 nt 차이가 있으며, 즉, 0.094% (1/1062)의 차이가 있다 (도 5에 나타낸 바와 같이 LW-3에서의 A가 LW-4에서는 G로 변화됨).
일 실시 양태에서, 기능성 hOTC아제를 코딩하는 변형된 hOTC 코딩 서열이 제공되는데, 상기 서열은 전장 야생형 hOTC 코딩 서열 (도 1a, 서열 번호 l)에 대하여 약 80% 미만의 동일성, 바람직하게는 약 77% 이하의 동일성을 갖는다. 일 실시 양태에서, 변형된 hOTC 코딩 서열은 AAV-매개된 전달 (예를 들어, rAAV) 후 wt hOTC와 비교하여 향상된 안정성을 특징으로 한다. 부가적으로 또는 대안적으로, 약 9개 이상의 아미노산의 길이의 단백질에 있어서의 대안적인 리딩 프레임이 결여된 변형된 hOTC 코딩 서열이 제공된다. 부가적으로 또는 대안적으로, 바이러스 벡터로부터의 발현 후 측정될 때 hOTC아제 야생형과 비교하여 약 25배 이상, 약 50배 이상, 또는 약 100배 이상의 hOTC아제 발현 수준을 갖는 변형된 hOTC 코딩 서열이 제공된다. 부가적으로 또는 대안적으로, 바이러스 벡터로부터 발현되는 hOTC아제 야생형과 비교하여 약 10배 이상 더 높은, 약 20배 이상 더 높은, 또는 약 30배 이상 더 높은 hOTC아제 간 활성을 갖는 변형된 hOTC 코딩 서열이 제공된다.
일 실시 양태에서, 변형된 hOTC 코딩 서열은 성숙 효소를 코딩하는 서열 (대략 nt 99 내지 대략 1068) 또는 도 4의 전장 서열 (hOTCco-LW4, 서열 번호 5)에 대하여 96% 내지 99.9% 동일하거나, 서열 번호 5의 서열 (도 4)에 대하여 96.5% 내지 99% 동일하거나 약 97% 또는 약 98% 동일하다.
일 실시 양태에서, 변형된 hOTC 코딩 서열은 도 3 (hOTCco-LW3, 서열 번호 4)의 성숙 효소를 코딩하는 서열 (대략 nt 99 내지 대략 1068)에 대하여 96% 내지 99.9% 동일하거나, 서열 번호 4의 서열 (도 3)에 대하여 96.5% 내지 99% 동일하거나 약 97% 또는 약 98% 동일하다.
또 다른 실시 양태에서, 변형된 hOTC 코딩 서열은 성숙 효소를 코딩하는 서열 (대략 nt 99 내지 대략 1068) 또는 도 2의 전장 서열 (hOTCco, 서열 번호 3)에 대하여 96% 내지 99.9% 동일하거나 서열 번호 3의 서열 (도 2)에 대하여 96.5% 내지 99% 동일하거나 약 97% 또는 98% 동일하다.
또 다른 실시 양태에서, 변형된 hOTC 코딩 서열은 성숙 단백질을 코딩하는 서열 (대략 nt 99 내지 대략 1068) 또는 hOTCco-LW5의 전장 서열 [서열 번호 9], 또는 이에 대하여 96% 내지 99.9% 동일한 서열을 갖는다. hOTCco-LW5 및 hOTCco-LW6은 서로에 대하여 약 97% 동일하며, 각각은 야생형 서열 [서열 번호 1]에 대하여 약 78% 동일하다.
도 2 내지 도 5의 서열은 cDNA 서열의 센스(sense) 가닥으로 제공된다. 또한 본 발명은 이러한 cDNA 서열들에 상응하는 안티센스(anti-sense) 가닥 및 상응하는 RNA 서열, 예를 들어 mRAN 서열을 포함한다. 예를 들어, 서열 번호 10의 엔지니어링된 mRNA는 서열 번호 4의 DNA에 상응하며; 서열 번호 11의 엔지니어링된 RNA는 서열 번호 5의 DNA에 상응하며; 서열 번호 12의 엔지니어링된 RNA는 서열 번호 8의 DNA에 상응하며; 서열 번호 13의 RNA는 서열 번호 9의 DNA에 상응한다. 이러한 RNA 서열들, 및 이러한 서열들 중 하나 이상에 대하여 95% 내지 99%, 또는 약 97%, 또는 약 98% 동일한 서열은 본 발명의 범주 내에 포함된다. RNA 아이덴티티(identity)를 정렬하는 그리고 결정하는 방법은 본 기술 분야에 공지되어 있으며, 공개된 그리고 공식적으로 이용가능한 웹-기반의 또는 구매가능한 데이터베이스 및 서비스를 포함한다. 예를 들어, LocARNA, CARNA와, 그 안의 다른 곳에서 확인되는 다른 프로그램을 참조한다.
본 발명의 일 실시 양태에서, mRNA 서열은 선택된 RNA 전달 시스템을 이용하여 전달될 수 있으며, 이의 예는 본원에 제공되어 있다.
또한 본원에 포함되는 것은 단편, 예를 들어, 운송 펩티드 (아미노산 1 내지 대략 32)를 코딩하는 서열, 대략 아미노산 332 내지 대략 354, 중간체형 hOTC 효소, 또는 성숙 효소, 또는 요망될 수 있는 다른 단편이다. 서열 번호 2를 참조할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Ye et al. 2001, Hum Gene Ther 12: 1035-1046]을 참조한다.
또 다른 실시 양태에서, 야생형 OTC의 N-말단 전서열(presequence)이 대상체의 시스템과 양립가능한 또 다른 소스(source)로부터의 운송 서열로 대체되어서 키메라 OTC가 키메라 OTC 유전자에 의해 코딩되는 성숙 hOTC아제를 요망되는 세포 소기관으로 효과적으로 수송하게 하는 키메라 OTC가 제공된다. 예를 들어, 문헌[Ye et al. 2001, Hum Gene Ther 12: 1035-1046]을 참조한다. 그러한 운송 서열은 운송 펩티드 (시그널(signal) 펩티드, 표적화 시그널, 또는 국소화 시그널)를 코딩하는데, 이는 서열 번호 1, 3, 4, 5, 8 및/또는 9의 성숙 hOTC의 코딩 서열에 융합된다. 예를 들어, 야생형 hOTC 운송 서열은 서열 번호 1의 대략 처음 98개 뉴클레오티드 서열에 상응한다. 키메라 OTC를 구성하기 위하여, 이러한 야생형 N-말단 서열들은 제거될 수 있으며 (대략 핵산 1 내지 대략 nt 96 - nt 98) 이종 기원 운송 서열로 대체될 수 있다. 적합한 운송 펩티드는 바람직하게는 인간 기원의 것이지만, 반드시 인간 기원의 것일 필요는 없다. 적합한 운송 펩티드는 본원에 참고로 포함된 http://proline.bic.nus.edu.sg/spdb/zhang270.htm으로부터 선택될 수 있거나, 선택된 단백질에 있어서 운송 펩티드를 결정하는 다양한 컴퓨터 프로그램을 이용하여 결정될 수 있다. 한정되는 것은 아니지만, 그러한 서열들은 약 15 내지 약 50개 아미노산의 길이, 또는 약 20 내지 약 28개 아미노산의 길이일 수 있거나, 요구될 경우 더 크거나 더 작을 수 있다.
핵산 서열의 맥락에서 "동일성 퍼센트(%)", "서열 동일성", "서열 동일성 퍼센트" 또는 "동일성 퍼센트"라는 용어는 대응을 위하여 정렬될 때 동일한 두 서열 내의 잔기를 나타낸다. 서열 동일성 비교 길이는 게놈의 전장, 유전자 코딩 서열의 전장에 대한 것일 수 있거나, 적어도 약 500 내지 5000개 뉴클레오티드의 단편이 요망된다. 그러나, 예를 들어 적어도 약 9개의 뉴클레오티드, 일반적으로 적어도 약 20 내지 24개의 뉴클레오티드, 적어도 약 28 내지 32개의 뉴클레오티드, 적어도 약 36개의 또는 이보다 더 많은 뉴클레오티드의 더 작은 단편들 중 아이덴티티가 또한 요망될 수 있다.
동일성 퍼센트는 전장의 단백질, 폴리펩티드, 약 32개의 아미노산, 약 330개의 아미노산, 또는 이의 펩티드 단편 또는 상응하는 핵산 서열 코딩 서열에 대한 아미노산 서열에 대하여 쉽게 결정될 수 있다. 적합한 아미노산 단편은 8개 이상의 아미노산의 길이일 수 있으며, 약 700개 이하의 아미노산일 수 있다. 일반적으로, 2개의 상이한 서열들 사이의 "동일성", "상동성" 또는 "유사성"을 언급할 때, "동일성", "상동성" 또는 "유사성"은 "정렬된" 서열들과 관련하여 결정된다. "정렬된" 서열들 또는 "정렬들"은 기준 서열과 비교하여 없어진 또는 추가의 염기 또는 아미노산에 대한 보정을 흔히 함유하는 다수의 핵산 서열 또는 단백질 (아미노산) 서열을 나타낸다.
정렬은 임의의 다양한 공식적으로 이용가능하거나 상업적으로 이용가능한 다중 서열 정렬 프로그램을 이용하여 수행된다. 서열 정렬 프로그램은 아미노산 서열에 대하여 이용가능하며, 예를 들어 "Clustal X", "MAP", "PIMA", "MSA", "BLOCKMAKER", "MEME", 및 "Match-Box" 프로그램이 있다. 일반적으로, 이러한 프로그램 중 임의의 것이 디폴트 설정에서 사용되지만, 당업자라면 필요할 경우 이러한 설정을 변경할 수 있다. 대안적으로, 당업자라면 적어도 상기 언급된 알고리즘 및 프로그램에 의해 제공되는 것과 같은 수준의 동일성 또는 정렬을 제공하는 또 다른 알고리즘 또는 컴퓨터 프로그램을 이용할 수 있다. 예를 들어, 문헌[J. D. Thomson et al, Nucl. Acids. Res., "A comprehensive comparison of multiple sequence alignments", 27(13):2682-2690 (1999)]을 참조한다.
다중 서열 정렬 프로그램이 핵산 서열에 대하여 또한 이용가능하다. 그러한 프로그램의 예는 "Clustal W", "CAP Sequence Assembly", "BLAST", "MAP", 및 "MEME"를 포함하며, 이들은 인터넷 상에서 웹 서버를 통하여 접근가능하다. 그러한 프로그램의 다른 소스가 당업자에게 공지되어 있다. 대안적으로, 벡터(Vector) NTI 유틸리티(utility)가 또한 사용된다. 상기에 기술된 프로그램 내에 포함된 것을 비롯하여 뉴클레오티드 서열 동일성을 측정하는 데 사용될 수 있는 본 기술 분야에 공지된 다수의 알고리즘이 또한 있다. 또 다른 예로서, 폴리뉴클레오티드 서열이 GCG 버전 6.1 내의 프로그램인 파스타(Fasta)™를 이용하여 비교될 수 있다. 파스타™는 쿼리(query) 서열과 검색(search) 서열 사이의 최상의 중첩의 영역들의 정렬 및 서열 동일성 퍼센트를 제공한다. 예를 들어, 핵산 서열들 사이의 서열 동일성 퍼센트는 GCG 버전 6.1에 제공된 바와 같은 디폴트 파라미터 (스코어링 매트릭스(scoring matrix)에 있어서 NOPAM 지수(factor) 및 6의 워드 크기(word size))를 갖는 파스타TM를 이용하여 결정될 수 있으며, 이는 본원에 참고로 포함된다.
일 실시 양태에서, 본원에 기술된 변형된 hOTC 유전자는 바이러스 벡터의 생성에 및/또는 숙주 세포에의 전달에 유용한 적합한 유전 요소 (벡터), 예를 들어, 네이키드(naked) DNA, 파지(phage), 트랜스포존(transposon), 코스미드(cosmid), 에피좀(episome) 등으로 엔지니어링되는데, 이는 보유된 hOTC 서열을 이전시킨다. 선택된 벡터는 형질감염, 전기 천공, 리포좀 전달, 막 융합 기술, 고속 DNA-코팅형 펠렛, 바이러스 감염 및 원형질(protoplast) 융합을 비롯한 임의의 적합한 방법에 의해 전달될 수 있다. 그러한 구성물을 만드는 데 사용되는 방법은 핵산 조작에 있어서의 당업자에게 공지되어 있으며, 유전 공학 기술, 재조합 공학 기술, 및 합성 기술을 포함한다. 예를 들어, 문헌[Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY]을 참조한다.
본원에서 사용될 때, "발현 카세트"는 hOTC 서열, 프로모터를 포함하고 이를 위한 다른 조절 서열을 포함할 수 있는 핵산 분자를 나타내며, 상기 카세트는 바이러스 벡터의 캡시드(capsid) (예를 들어, 바이러스 입자)로 패키징될 수 있다. 전형적으로, 바이러스 벡터를 생성하기 위한 그러한 발현 카세트는 바이러스 게놈의 패키징 시그널 및 다른 발현 제어 서열, 예컨대 본원에 기술된 것이 측면에 있는 본원에 기술된 패본원에 기술된 hOTC 서열을 함유한다. 예를 들어, AAV 바이러스 벡터에 있어서, 패키징 시그널은 5' 역방위 말단 반복(ITR) 및 3' ITR이다.
일 실시 양태에서, AAV2 유래의 ITR 서열, 또는 이의 결실된 버전(ΔITR)이 편의상 그리고 규제 승인을 가속화하기 위하여 사용된다. 그러나, 다른 AAV 소스 유래의 ITR이 선택될 수 있다. ITR의 소스가 AAV2 유래의 것이고 AAV 캡시드가 또 다른 AAV 소스 유래의 것인 경우, 생성된 벡터는 위형화된(pseudotyped) 것으로 칭해질 수 있다.
전형적으로, AAV 벡터를 위한 발현 카세트는 AAV 5' ITR, hOTC 코딩 서열 미 임의의 조절 서열과, AAV 3' ITR을 포함한다. 그러나, 이러한 요소들의 다른 구성이 적합할 수 있다. D-서열 및 내부 분해 부위(terminal resolution site, trs)가 결실된, ΔITR로 칭해지는 5' ITR의 단축 버전이 설명되었다. 다른 실시 양태에서, 전장 AAV 5' 및 3' ITR이 사용된다.
일 실시 양태에서, 구성물은 바이러스 벡터의 생성에 유용한 DNA 분자 (예를 들어, 플라스미드)이다. 바람직한 벡터 요소를 포함하는 예시적인 플라스미드는 pAAVsc.TBG.hOTCco-LW4로 예시되며, 이의 서열은 서열 번호 6이고, 이는 참고로 포함된다. 이러한 예시적인 플라스미드는 하기를 포함하는 발현 카세트를 포함한다: scITR (서열 번호 6의 nt 5-109), TATA 시그널 (서열 번호 6의 nt 851-854), 합성 hOTC 코딩 서열 (서열 번호 6의의 nt 976-2037), 폴리 A (서열 번호 6의 상보체 상의 nt 2182-2046), scITR (서열 번호 6의의 상보체 상의 nt 2378-2211), 및 간-특이적 (TBG) 프로모터 (서열 번호 6의 nt 4172-4760). 다른 발현 카세트가 본원에 기술된, 다른 합성 hOTC 코딩 서열 및 다른 발현 제어 요소를 이용하여 생성될 수 있다.
이와 관련하여 약어 "sc"는 자가-상보성(self-complementary)을 나타낸다. "자가-상보성 AAV"는 재조합 AAV 핵산 서열에 의해 보유된 코딩 영역이 분자내 이중 가닥 DNA 주형을 형성하도록 설계된 구성물을 나타낸다. 감염시에, 두 번째 가닥의 세포 매개된 합성을 기다리기보다는 오히려, scAAV의 두 상보성 절반은 회합되어 하나의 이중 가닥 DNA (dsDNA) 단위를 형성할 것인데, 상기 이중 가닥 DNA 단위는 즉각적인 복제 및 전사에 대해 준비가 되어 있다. 예를 들어, 문헌[D M McCarty et al, "Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis", Gene Therapy, (August 2001), Vol 8, Number 16, Pages 1248-1254]을 참조한다. 자가-상보성 AAV는 예를 들어 미국 특허 제6,596,535호; 미국 특허 제7,125,717호; 및 미국 특허 제7,456,683호에 기술되어 있는데, 이들 각각은 본원에 그 전체가 참고로 포함된다.
전형적으로 발현 카세트는 예를 들어 선택된 5' ITR 서열과 hOTC 코딩 서열 사이에 위치하는 발현 제어 서열의 일부로서의 프로모터 서열을 함유한다. 본원에 기술된 예시적인 플라스미드 및 벡터는 간-특이적 프로모터 티록신 결합 글로불린(thyroxin binding globulin, TBG)을 이용한다. 대안적으로, 다른 간-특이적 프로모터가 사용될 수 있다 [예를 들어, 간-특이적 유전자 프로모터 데이터베이스(The Liver Specific Gene Promoter Database), 콜드 스프링 하버(Cold Spring Harbor), http://rulai.schl.edu/LSPD/, 예컨대, 예를 들어, 알파 1 항-트립신(alpha 1 anti-trypsin; A1AT); 인간 알부민 (문헌[Miyatake et al., J. Virol., 71 :5124 32 (1997)], humA1b; 및 B형 간염 바이러스 코어 프로모터 (문헌[Sandig et al., Gene Ther., 3:1002 9 (1996)], TTR 최소 인핸서/프로모터, 알파-항트립신 프로모터, LSP (845 nt)25 (인트론-무함유 scAAV를 요구함); 또는 LSP1을 참조한다. 덜 요망되지만, 다른 프로모터, 예컨대 항시성 프로모터(constitutive promoter), 조절가능한 프로모터 [예를 들어, 국제 공개 제2011/126808호 및 국제 공개 제2013/04943호 참조], 또는 생리학적 신호(physiologic cue)에 대하여 반응성인 프로모터가 본원에 기술된 벡터에서 이용될 수 있다.
프로모터에 더하여, 발현 카세트 및/또는 벡터는 하나 이상의 다른 적절한 전사 개시, 종결, 인핸서 서열, 효율적인 RNA 프로세싱 시그널, 예컨대 스플라이싱(splicing) 및 폴리아데닐화 (폴리 A) 시그널; 세포질 mRNA를 안정화시키는 서열; 번역 효율을 향상시키는 서열 (즉, 코작 콘센서스(Kozak consensus) 서열); 단백질 안정성을 향상시키는 서열; 및 요망될 경우, 코딩된 생성물의 분비를 향상시키는 서열을 함유할 수 있다. 적합한 폴리 A 서열의 예는 예를 들어, SV40, SV50, 소 성장 호르몬(bovine growth hormone; bGH), 인간 성장 호르몬 및 합성 폴리 A를 포함한다. 적합한 인핸서의 예는 예를 들어 특히 알파 태아단백질(fetoprotein) 인핸서, TTR 최소 프로모터/인핸서, LSP (TH-결합 글로불린 프로모터/알파1-마이크로글로불린/비쿠닌 인핸서)를 포함한다. 일 실시 양태에서, 발현 카세트는 하나 이상의 발현 인핸서를 포함한다. 일 실시 양태에서, 발현 카세트는 2개 이상의 발현 인핸서를 함유한다. 이러한 인핸서들은 동일할 수 있거나 서로 다를 수 있다. 예를 들어, 인핸서는 알파 mic/bik 인핸서를 포함할 수 있다. 이러한 인핸서는 2개의 카피(copy)로 존재할 수 있는데, 이들은 서로에게 인접하여 위치한다. 대안적으로, 상기 인핸서의 이중 카피는 하나 이상의 서열에 의해 분리될 수 있다. 또 다른 실시 양태에서, 발현 카세트는 인트론, 예를 들어, 프로메가(Promega) 인트론을 추가로 함유한다. 다른 적합한 인트론은 본 기술 분야에 공지된 것, 예를 들어, 국제 공개 제2011/126808호에 기술된 것과 같은 것을 포함한다. 임의로, 하나 이상의 서열이 mRNA를 안정화시키도록 선택될 수 있다. 그러한 서열의 일례로는 변형된 WPRE 서열이 있으며, 이는 코딩 서열의 하류 및 폴리A 서열의 상류에서 엔지니어링될 수 있다 (예를 들어, 문헌[MA Zanta-Boussif, et al, Gene Therapy (2009) 16: 605-619] 참조).
이러한 제어 서열은 hOTC 유전자 서열에 "작동가능하게 연결된다". 본원에서 사용될 때, "작동가능하게 연결된"이라는 용어는 관심 대상의 유전자의 제어를 위하여 트랜스로(in trans) 또는 멀리서 작용하는 발현 제어 서열 및 관심 대상의 유전자와 연접한 발현 제어 서열 둘 모두를 나타낸다.
재조합 AAV 바이러스 벡터는 본원에 기술된 hOTC 발현 서열의 전달에 적절하다. 그러한 AAV 벡터는 캡시드와 동일한 AAV 소스로부터의 것인 ITR을 함유할 수 있다. 대안적으로, AAV ITR은 캡시드를 공급하는 것과는 다른 AAV 소스로부터의 것일 수 있다.
위형화 AAV를 생성할 경우, 발현 상태의 ITR은 캡시드의 AAV 소스와는 다른 소스로부터 선택된다. 예를 들어, AAV2 ITR은 간 (예를 들어, 간세포)의 표적화에 있어서 특별한 효율을 갖는 AAV 캡시드에서의 사용용으로 선택될 수 있다. AAV 캡시드는 본원에 기술된 조성물에 있어서 rh10 [국제 공개 제2003/042397호] 및 AAV8 [미국 특허 제7790449호; 미국 특허 제7282199호]로부터 선택될 수 있다. 그러나, 예를 들어 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV9를 비롯한 다른 AAV, 및 예를 들어 본원에 참고로 포함된 국제 공개 제2003/042397호; 국제 공개 제2005/033321호, 국제 공개 제2006/110689호; 미국 특허 제7588772 B2호에 기술된 것과 같은 기타의 것이 인간 대상체에서 사용될 수 있다.
일 실시 양태에서, 자가-상보성 AAV가 제공된다. 이러한 바이러스 벡터는 Δ5' ITR 및 AAV 3' ITR을 함유할 수 있다. 일 실시예에서, 바이러스 벡터는 scAAV2/8.TBG.hOTCco이다. 또 다른 실시예에서, 바이러스 벡터는 scAAV2/rh10.TBG.hOTCco이다. 이러한 벡터 둘 모두는 AAV2 유래의 5' ΔITR, 간-특이적 TBG 프로모터, 본 발명의 엔지니어링된 hOTCco 코딩 서열, SV40 폴리A, 및 AAV8 캡시드 [예를 들어, 미국 특허 제8,318,480 B2호 참조] 또는 AAV rh10 캡시드에서의 3' AAV2 ITR을 함유한다. 당해 서열은 서열 번호 3, 4, 5, 8 또는 9 중 하나의 엔지니어링된 hOTC로부터 선택될 수 있다. 임의로, 엔지니어링된 hOTC의 운송 서열은 성숙 hOTC아제를 보유하는 키메라 hOTC를 제공하도록 이종 기원 운송 서열로 치환될 수 있다.
또 다른 실시 양태에서, 단일 가닥 AAV 바이러스 벡터가 제공된다. 그러한 벡터는 5' AAV ITR 및 3' ITR을 함유할 수 있다. 하나의 예로는 AAV2/8.TBG.hOTCco가 있으며, 이는 전장 AAV2 - 5' ITR, 간-특이적 TBG 프로모터, hOTC 코딩 서열, 소 성장 호르몬 폴리 A, 및 AAV2 - 3' ITR을 함유한다. 또 다른 예로는 AAV2/8.TBG.hOTCco-.WPRE.bGH가 있으며, 이는 상기 벡터 요소들을 함유하고, 추가로, 우드척 간염 바이러스 전사 후 조절 요소(woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element; WPRE)를 함유한다. 다른 실시 양태에서, WPRE는 생체 내에서(in vivo) 사용될 구성물에는 없다. 엔지니어링된 hOTC 서열 (본원에서 hOTCco로 약칭됨)은 서열 번호 3, 4, 5, 8 또는 9 중 하나의 엔지니어링된 hOTC로부터 선택될 수 있다. 임의로, 엔지니어링된 hOTC의 운송 펩티드 서열은 성숙 hOTC아제를 보유하는 키메라 hOTC를 제공하도록 이종 기원 운송 서열로 치환될 수 있다.
조직 특이적 프로모터를 비롯한 또 다른 프로모터가 선택될 수 있다. 대상체에게 전달하기에 적합한 AAV 바이러스 벡터를 생성하는 그리고 단리하는 방법은 본 기술 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2007/0036760호 (2007년 2월 15일), 미국 특허 제7790449호; 미국 특허 제7282199호; 국제 공개 제2003/042397호; 국제 공개 제2005/033321호; 국제 공개 제2006/110689호; 및 미국 특허 제7588772 B2호를 참조한다. AAV8의 서열 및 AAV8 캡시드를 기반으로 하는 벡터의 생성 방법이 본원에 참고로 포함된 미국 특허 제7,282,199 B2호, 미국 특허 제7,790,449호 및 미국 특허 제8,318,480호에 기술되어 있다. 하나의 시스템에서, 생산 세포주를 ITR이 측면에 있는 트랜스진(transgene)을 코딩하는 구성물과, rep 및 cap를 코딩하는 구성물(들)로 일시적으로 형질감염시킨다. 제2 시스템에서, rep 및 cap를 안정하게 공급하는 패키징 세포주를 ITR이 측면에 있는 트랜스진을 코딩하는 구성물로 일시적으로 형질감염시킨다. 이러한 시스템들 각각에서, AAV 비리온이 헬퍼(helper) 아데노바이러스 또는 헤르페스바이러스에 의한 감염에 반응하여 생성되며, 이는 오염 바이러스로부터의 rAAV의 분리를 요구한다. 더욱 최근에는, AAV를 회수하기 위하여 헬퍼 바이러스에 의한 감염을 요구하는 것이 아닌 시스템이 개발되었으며, 요구되는 헬퍼 기능(즉, 아데노바이러스 E1, E2a, VA, 및 E4 또는 헤르페스바이러스 UL5, UL8, UL52, 및 UL29와, 헤르페스바이러스 폴리머라아제)은 또한 당해 시스템에 의해 트랜스로 공급된다. 이러한 더 새로운 시스템에서, 헬퍼 기능은 요구되는 헬퍼 기능을 코딩하는 구성물을 이용한 세포의 일시적인 형질감염에 의해 공급될 수 있거나, 세포는 헬퍼 기능을 코딩하는 유전자를 안정하게 함유하도록 엔지니어링될 수 있는데, 이의 발현은 전사 또는 전사 후 수준에서 제어될 수 있다. 또 다른 시스템에서, IT가 측면에 있는 트랜스진 및 rep/cap 유전자는 바큘로바이러스(baculovirus)-기반의 벡터를 이용한 감염에 의해 곤충 세포 내로 도입된다. 이러한 생산 시스템에 대한 개관을 위하여, 일반적으로 예를 들어 문헌[Zhang et al., 2009, "Adenovirus-adeno-associated virus hybrid for large-scale recombinant adeno-associated virus production," Human Gene Therapy 20:922-929]을 참조하는데, 이의 각각의 내용은 본원에 그 전체가 참고로 포함된다. 이러한 AAV 생산 시스템 및 다른 AAV 생산 시스템의 제조 및 사용 방법이 하기 미국 특허에 또한 기술되어 있는데, 이의 각각의 내용은 본원에 그 전체가 참고로 포함된다: 미국 특허 제5,139,941호; 미국 특허 제5,741,683호; 미국 특허 제6,057,152호; 미국 특허 제6,204,059호; 미국 특허 제6,268,213호; 미국 특허 제6,491,907호; 미국 특허 제6,660,514호; 미국 특허 제6,951,753호; 미국 특허 제7,094,604호; 미국 특허 제7,172,893호; 미국 특허 제7,201,898호; 미국 특허 제7,229,823호; 및 미국 특허 제7,439,065호.
패키징에 이용가능한 공간은 하나 초과의 전사 단위를 단일 구성물로 조합하고 이에 따라 요구되는 조절 서열 공간의 양을 감소시킴으로써 보존될 수 있다. 예를 들어, 단일 프로모터가 2개 또는 3개 또는 이보다 더 많은 유전자를 코딩하는 단일 RNA의 발현을 지시할 수 있으며, 하류 유전자의 번역은 IRES 서열에 의해 구동된다. 또 다른 실시예에서, 단일 프로모터는 단일 오픈 리딩 프레임(ORF) 내에 자가-절단 펩티드 (예를 들어, T2A) 또는 프로테아제 인식 부위 (예를 들어, 푸린(furin))를 코딩하는 서열에 의해 서로로부터 분리된 2개 또는 3개 또는 이보다 더 많은 유전자를 함유하는 RNA의 발현을 지시할 수 있다. 이와 같이 ORF는 번역 동안 (T2A의 경우) 또는 번역 후에 개별 단백질 (예를 들어, 트랜스진 및 이량체화가능한 전사 인자와 같은 것)로 절단되는 단일 폴리단백질을 코딩한다. 그러나, 이러한 IRES 및 폴리단백질 시스템을 이용하여 AAV 패키징 공간을 절약할 수 있지만 상기 시스템은 동일 프로모터에 의해 구동될 수 있는 구성 요소들의 발현에만 사용될 수 있음이 주지되어야 한다. 또 다른 대안에서, AAV의 트랜스진 용량은 헤드투테일 콘카타머(head to tail concatamer)를 형성하도록 어닐링될 수 있는 두 게놈의 AAV ITR의 제공에 의해 증가될 수 있다.
임의로, 본원에 기술된 hOTC 유전자를 이용하여 rAAV 이외의 바이러스 벡터를 생성할 수 있다. 유전자 요법에 적합한 임의의 바이러스를 포함할 수 있는 그러한 다른 바이러스 벡터가 사용될 수 있으며, 이는 아데노바이러스; 헤르페스 바이러스; 렌티바이러스; 레트로바이러스 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 적합하게는, 이러한 다른 벡터들 중 하나가 생성될 경우, 이것은 복제-결함 바이러스 벡터로서 생성된다.
"복제-결함 바이러스" 또는 "바이러스 벡터"는 관심 대상의 유전자를 함유하는 발현 카세트가 바이러스 캡시드 또는 엔벨로프(envelope) 내에 패키징된 합성 또는 인공 바이러스 입자를 나타내며, 여기서, 바이러스 캡시드 또는 엔벨로프 내에 또한 패키지되는 임의의 바이러스 게놈 서열이 복제-결함성이고; 즉, 이는 자손 비리온을 생성할 수는 없지만 표적 세포를 감염시키는 능력을 보유한다. 일 실시 양태에서, 바이러스 벡터의 게놈은 복제에 요구되는 효소를 코딩하는 유전자를 포함하지 않지만 (게놈은 인공 게놈의 증폭 및 패키징에 요구되는 시그널이 측면에 있는 관심 대상의 트랜스진만을 함유하는 "무기력한(gutless)" 것이 되도록 엔지니어링될 수 있음), 이러한 유전자들은 생성 동안 공급될 수 있다. 따라서, 유전자 요법에서 사용하기에 안전한 것으로 생각되며, 이는 자손 비리온에 의한 복제 및 감염이 복제에 요구되는 바이러스 효소가 존재하는 것을 제외하고는 일어날 수 없기 때문이다. 그러한 복제-결함 바이러스는 아데노-부속 바이러스(AAV), 아데노바이러스, 렌티바이러스 (통합성 또는 비통합성), 또 다른 적합한 바이러스 소스일 수 있다.
본원에 기술된 제약 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에게 임의의 적합한 경로 또는 상이한 경로들의 조합에 의해 전달하기 위하여 설계된다. 간으로의 직접적 전달 또는 간내 전달이 요망되며, 이는 임의로 혈관내 전달을 통하여, 예를 들어 간문맥, 간 정맥, 담관을 통하여, 또는 이식에 의해 수행될 수 있다. 대안적으로, 다른 투여 경로 (예를 들어, 경구, 흡입, 비내, 기관내, 동맥내, 안내, 정맥내, 근육내, 및 다른 비경구 경로)가 선택될 수 있다. 본원에 기술된 hOTC 전달 구성물은 단일 조성물 또는 다중 조성물 형태로 전달될 수 있다. 임의로, 둘 이상의 상이한 AAV가 전달될 수 있다 [예를 들어, 국제 공개 제2011/126808호 및 국제 공개 제2013/049493호 참조]. 또 다른 실시 양태에서, 그러한 다수의 바이러스는 상이한 복제-결함 바이러스 (예를 들어, AAV, 아데노바이러스, 및/또는 렌티바이러스)를 포함할 수 있다. 대안적으로, 전달은 비-바이러스 구성물, 예를 들어, "네이키드 DNA", "네이키드 플라스미드 DNA", RNA, 및 mRNA에 의해 매개될 수 있으며, 이는 예를 들어 미셀(micelle), 리포좀, 양이온성 지질 - 핵산 조성물, 폴리글리칸 조성물 및 기타 중합체, 지질 및/또는 콜레스테롤-기반 - 핵산 콘쥬게이트(conjugate), 및 기타 구성물, 예컨대 본원에 기술된 것을 비롯한 다양한 전달 조성물 및 나노 입자와 커플링된다. 예를 들어, 문헌[X. Su et al, Mol. Pharmaceutics, 2011, 8 (3), pp 774-787; 웹 공개: 2011년 3월 21일]; 국제 공개 제2013/182683호, 국제 공개 제2010/053572호 및 국제 공개 제2012/170930호를 참조하는데, 이들 둘 모두는 본원에 참고로 포함된다. 그러한 비-바이러스 hOTC 전달 구성물은 이전에 기술된 경로에 의해 투여될 수 있다.
바이러스 벡터, 또는 비-바이러스 DNA 또는 RNA 이전 모이어티(moiety)는 유전자 이전 및 유전자 요법 응용에서 사용하기 위한 생리학적으로 허용가능한 담체를 이용하여 제형화될 수 있다. AAV 바이러스 벡터의 경우, 게놈 카피 ("GC")의 정량화가 제형에 함유된 용량의 척도로서 사용될 수 있다. 본 기술 분야에 공지된 임의의 방법을 이용하여 본 발명의 복제-결함 바이러스 조성물의 게놈 카피 (GC) 수를 결정할 수 있다. AAV GC 수 적정을 수행하는 하나의 방법으로는 하기와 같은 것이 있다: 정제된 AAV 벡터 샘플을 먼저 DNase로 처리하여 비캡시드화(un-encapsidated) AAV 게놈 DNA 또는 오염 플라스미드 DNA를 생성 공정으로부터 제거한다. 그 후 DNase 저항성 입자를 열처리하여 게놈을 캡시드로부터 유리시킨다. 그 후 유리된 게놈을 바이러스 게놈의 특정 영역 (일반적으로 폴리 A 시그널)을 표적화하는 프라이머/프로브 세트를 사용하여 실시간 PCR에 의해 정량화한다. 복제-결함 바이러스 조성물은 (체중 70 kg의 평균적인 대상체를 처리하기 위하여) 약 1.0 x 109의 GC 내지 약 1.0 x 105의 GC, 그리고 바람직하게는 인간 환자의 경우 1.0 x 1012의 GC 내지 1.0 x 1014의 GC의 범위인 양의 복제-결함 바이러스를 함유하도록 하는 투여 단위로 제형화될 수 있다. 바람직하게는, 제형 중 복제-결함 바이러스의 용량은 1.0 x 109의 GC, 5.0 x 109의 GC, 1.0 x 1010의 GC, 5.0 x 1010의 GC, 1.0 x 1011의 GC, 5.0 x 1011의 GC, 1.0 x 1012의 GC, 5.0 x 1012의 GC, 또는 1.0 x 1013의 GC, 5.0 x 1013의 GC, 1.0 x 1014의 GC, 5.0 x 1014의 GC, 또는 1.0 x 1015의 GC이다.
DNA 및 RNA는 일반적으로 핵산의 나노그램(ng) 내지 마이크로그램(㎍)의 양으로 측정된다. 일반적으로, 인간에서의 치료를 위하여 바람직하게는 RNA의 투여량은 1 ng 내지 700 ㎍, 1 ng 내지 500 ㎍, 1 ng 내지 300 ㎍, 1 ng 내지 200 ㎍이거나, 1 ng 내지 100 ㎍이 제형화되어 투여된다. 발현 카세트를 함유하며 바이러스 벡터를 통하여 대상체에게 전달되는 것은 아닌 DNA 분자의 유사한 투여량이 비-바이러스 hOTC DNA 전달 구성물에 이용될 수 있다.
렌티바이러스의 생성량은 본원에 기술된 바와 같이 측정되며 부피 (예를 들어, mL)당 IU로서 표현된다. IU는 감염 단위(infectious unit), 또는 대안적으로 형질도입 단위(transduction unit; TU)이며; IU 및 TU는 바이러스 벡터 입자 제제의 역치의 정량적 척도로서 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 전형적으로 렌티바이러스 벡터는 비통합성이다. 바이러스 입자의 양은 약 3 x 106 IU 이상이며, 약 1 x 107 IU 이상, 약 3 x 107 IU 이상, 약 1 x 108 IU 이상, 약 3 x 108 IU 이상, 약 1 x 109 IU 이상, 또는 약 3 x 109 IU 이상일 수 있다.
상기 재조합 벡터는 공개된 방법에 따라 숙주 세포로 전달될 수 있다. 바람직하게는 생리학적으로 양립가능한 담체에 현탁된 rAAV는 인간 또는 인간외 포유류 환자에게 투여될 수 있다. 적합한 담체는 이전 바이러스를 지시하는 표시를 고려하여 당업자에 의해 쉽게 선택될 수 있다. 예를 들어, 하나의 적합한 담체는 염수를 포함하며, 이는 다양한 완충액 (예를 들어, 인산염 완충 염수)으로 제형화될 수 있다. 다른 예시적인 담체는 살균 염수, 락토스, 수크로스, 인산칼슘, 젤라틴, 덱스트란, 한천, 펙틴, 땅콩유, 참기름, 및 물을 포함한다. 담체의 선택은 본 발명의 제한이 아니다.
임의로, 본 발명의 조성물은 rAAV 및 담체(들)에 더하여, 다른 통상적인 제약 성분, 예컨대 보존제, 또는 화학 안정제를 함유할 수 있다. 적합한 예시적인 보존제는 클로로부탄올, 소르브산칼륨, 소르브산, 이산화황, 프로필 갈레이트, 파라벤, 에틸 바닐린, 글리세린, 페놀 및 파라클로로페놀을 포함한다. 적합한 화학 안정제는 젤라틴 및 알부민을 포함한다.
본원에 기술된 바이러스 벡터는 오르니틴 트랜스카르바밀라아제를 이를 필요로 하는 대상체 (예를 들어, 인간 환자)에게 전달하여 기능성 hOTC아제를 대상체에게 공급하기 위한 및/또는 오르니틴 트랜스카르바밀라아제 결핍증을 치료하기 위한 의약의 제조에서 사용될 수 있다. 치료 과정은 임의로 동일한 바이러스 벡터 (예를 들어, AAV8 벡터) 또는 상이한 바이러스 벡터 (예를 들어, AAV8 및 rh10)의 반복 투여를 포함할 수 있다. 또 다른 조합이 선택될 수 있으며 이는 본원에 기술된 바이러스 벡터 및 비-바이러스 전달 시스템을 이용한다.
또 다른 실시 양태에서, 본원에 기술된 핵산 서열은 비-바이러스 경로를 통하여 전달될 수 있다. 예를 들어, hOTC 서열은 본 기술 분야에 공지된 다수의 담체 시스템 중 하나를 이용하여 RNA 형태 (예를 들어, mRNA)로 전달하거나 발현시키기 위한 담체 시스템을 통한 것일 수 있다. 그러한 담체 시스템은 페이즈알엑스(PhaseRx)의 소위 "SMARTT" 기술과 같은 상업적 엔티티(entity)에 의해 제공되는 것을 포함한다. 이러한 시스템은 표적 숙주 세포에의 전달을 위하여 블록 공중합체를 이용한다. 예를 들어, 발명의 명칭이 "다중블록 중합체[Multiblock Polymers]이고 2011년 11월 24일자로 공개된 미국 특허 출원 공개 제2011/0286957호; 2011년 11월 17일자로 공개된 미국 특허 출원 공개 제2011/0281354호; 2013년 7월 31일자로 공개된 유럽 특허 제2620161호; 및 2015년 2월 5일자로 공개된 국제 공개 제2015/017519호를 참조한다. 또한, 문헌[S. Uchida et al, (Feb 2013) PLoS ONE 8(2): e56220]을 참조한다. 또 다른 방법은 합성 dsRNA의 생성 및 주사를 포함하며 (문헌[Soutschek et al. Nature (2004) 432(7014): 173-8]을 참조; 또한 문헌[Morrissey et al. Hepatol. (2005) 41(6): 1349-56]을 참조), 간에의 국소 투여는 또한 이중 가닥 RNA를 신정맥 카테터 삽입을 이용하여 간을 둘러싸고 있는 순환계 내로 직접적으로 주입함으로써 입증되었다. (문헌[Hamar et al. PNAS (2004) 101(41): 14883-8.]을 참조한다). 또 다른 시스템은 양이온성 복합체 또는 리포좀 제형을 이용하여 dsRNA 및 특히 siRNA를 전달하는 것을 포함한다 (예를 들어, 문헌[Landen et al. Cancer Biol. Ther. (2006) 5(12)]을 참조; 또한 문헌[Khoury et al. Arthritis Rheumatol. (2006) 54(6): 1867-77]을 참조). 다른 RNA 전달 기술, 예를 들어 베리타스 바이오(Veritas Bio)로부터의 것이 또한 이용가능하다 [예를 들어, 2010년 12월 23일자의 미국 특허 출원 공개 제2013/0323001호, "이중 가닥 RNA의 표적 세포로의 생체 내 전달" (RNA, 예를 들어 mRNA, 발현된 siRNA/shRNA/miRNA와, 가능하게는 심지어, 간과 같은 원위 부위로 전달될 그리고 외부 소낭(exovesicle) 내에 패키징되는 세포질에 존재하는 형질감염 DNA, 또는 주입된/도입된 siRNA/shRNA/miRNA를 포함하는 세포질 내용물)]. RNA 서열의 생체 내 전달을 위한 또 다른 시스템이 기술되었다. 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2012/0195917호 (2012년 8월 2일) (안정성을 개선시키고 RNA 발현을 증가시키기 위한 RNA의 5'-캡(cap) 유사체), 국제 공개 제2013/143555A1호 (2013년 10월 3일)를 참조하고/하거나 이는 구매가능하다 (바이오엔테크(BioNTech) (독일 소재); 발레라(Valera) (미국 매사추세츠주 캠브리지 소재); 자타 파마슈티칼스(Zata Pharmaceuticals)).
이와 같이, 일 실시 양태에서, 본 발명은 표적 숙주 세포, 예를 들어, 간세포에서 성숙 hOTC아제를 발현시키는 이중 가닥 또는 단일 가닥 RNA의 전달을 위한 조성물 중의 서열 번호 10, 11, 12, 13의 성숙 서열 (적어도 대략 nt 99 내지 1098) 또는 전장의 엔지니어링된 hOTC mRNA, 또는 이에 대하여 적어도 97% 내지 99%의 동일성을 갖는 서열을 제공한다.
mRNA (DNA 전달 분자로부터 전사되는 것과 비교하여 직접적으로 전달됨)를 함유하는 본원에 기술된 조성물의 동력학적 특성은 급성 위기의 대상체에서 사용하기에 특히 적절하며, 그 이유는 이 mRNA로부터의 hOTC아제의 발현이 수 시간의 기간 내에 관찰될 수 있기 때문이다. RNA의 빠른 제거를 회피하기 위하여, 이것을 본원에 기술된 바와 같이 변형시켜서 (예를 들어, 캡 또는 변형된 염기를 이용함) 그 효과가 24시간 초과, 48시간 초과, 또는 약 3일 (약 72시간) 이하 동안 유지될 수 있도록 한다. 본원에 기술된 mRNA를 직접적으로 동시투여하고 본원에 정의된 DNA 또는 바이러스 벡터-기반의 hOTC 조성물을 동시에 또는 실질적으로 동시에 동시투여하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 대상체는 즉각적인 치료를 받을 수 있으며, mRNA-매개된 발현이 약해지기 시작하는 것과 같은 그러한 시점에, 바이러스 벡터-매개된 발현에 의해 부여되는 더 긴 기간의 hOTC 발현이 효과를 나타내기 시작한다. 대안적으로, 대상체는 본원에 정의된 mRNA-기반의 조성물의 두 번째 투여를 받을 수 있다. 본원에 기술된 mRNA 조성물은 급성 위기 상태에 있지 않은 OTCD 환자를 포함하는 것을 비롯한 다른 치료 요법 또는 방법에서 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 상기에 정의된 것과 같은 제약상 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 일 실시 양태에서, 조성물은 본원에 기술된 hOTC 폴리뉴클레오티드와 결부된 블록 공중합체를 포함한다. 블록 공중합체는 미셀이 복수의 블록 공중합체를 포함하도록 미셀을 형성할 수 있다.
전형적으로, 그러한 조성물은 서열 번호 10, 11, 12, 13 중 임의의 것의 전장 또는 성숙 hOTC아제 (적어도 대략 nt 99 내지 1098)를 코딩하는 hOTC 서열에 상응하는 mRNA 서열을 포함하는 핵산 분자를 함유한다. 게다가, 이러한 핵산 분자는 리더 서열 또는 리더 RNA로도 공지된 5' 비번역 영역(untranslated region; UTR), 및 임의적 인트론(들), 임의적 엑손(들), 임의적 코작 서열, 임의적 WPRE 및 폴리A 중 하나 이상, 및 코딩 서열 측면에 있는 3' UTR을 포함할 수 있다. 적합한 리더 서열은 hOTC DNA 서열과 관련하여 상기에 논의된 것을 포함하는데, 상기 논의는 본원에 참고로 포함된다. 천연 hOTC 리더 서열 이외의 적합한 리더 서열, 또는 도 2, 도 3 또는 도 4, 또는 도 5에 상응하는 것의 소스의 예가 상기에 논의되어 있다. 이와 유사하게, 적합한 인트론, 폴리A, 및 코작 서열의 소스는 상기에 논의되어 있으며, 현재의 단락에서 논의되는 상응하는 RNA 서열의 전달에 적용가능하다. 또한, RNA에 대한 다양한 변형이 생성될 수 있으며, 예를 들어, 변형된 5' 캡 구조가 생체 내에서의 mRNA의 빠른 제거를 회피하기 위하여 또는 또 다른 요망되는 이유로 구성물로 엔지니어링될 수 있다. 그러한 5' 캡 구조의 생성 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2012/0195917호 및 국제 공개 제2013/143555A1호 (2013년 10월 3일)를 참조한다. 게다가, 슈도우리딘과 같은 변형된 뉴클레오티드를 사용하여 시험관 내에서 mRNA를 만들 수 있다. 또한, RNA는 반복적으로 투약될 수 있거나, 대상체는 신생아 위기를 관리하기 위하여 먼저 mRAN를 투약하고 이어서 장시간 요법을 위하여 그리고 섬유증/간경변 및/또는 간세포 암종을 예방하기 위하여 바이러스 벡터-매개된 전달 (예를 들어, AAV)을 할 수 있다.
mRNA는 본 기술 분야에 잘 알려진 기술을 이용하여 본원에 개시된 hOTC DNA 서열로부터 합성될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Cazenave C, Uhlenbeck OC, RNA template-directed RNA synthesis by T7 RNA polymerase. Proc Natl Acad Sci U S A. 1994 Jul 19;91(15):6972-6]에는 cDNA 또는 RNA 주형으로부터 RNA를 생성하기 위한 T7 RNA 폴리머라아제의 사용이 기술되어 있다. 또한, 문헌[Wichlacz Al, Legiewicz M, Ciesiolka J., Generating in vitro transcripts with homogenous 3' ends using trans-acting antigenomic delta ribozyme., Nucleic Acids Res. 2004 Feb 18;32(3):e39]; 문헌[Krieg PA, Melton DA., Functional messenger RNAs are produced by SP6 in vitro transcription of cloned cDNAs, Nucleic Acids Res. 1984 Sep 25;12(18):7057-70]; 및 문헌[Rio, D. C, et al. RNA: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2011, 205-220]을 참조한다. 이러한 참고 문헌 각각은 본원에 참고로 포함된다. 게다가, mRNA를 생성하기 위한 키트 및 프로토콜이 구매가능하며, 이는 제한 없이 리보프로브(Riboprobe)® 시험관 내 전사 시스템(In Vitro Transcription System) (프로메가 코포레이션(Promega Corp.)); 리보맥스(RiboMAX)TM 대규모 RNA 생성 시스템(Large Scale RNA Production Systems) (프로메가 코포레이션); 맥시스크립트 키트(MAXIscript Kit) (암비온(Ambion)); 메기스크립트 키트(MEGIscript Kit) (암비온); 메시지앰프(MessageAmp)TM aRNA 키트 (암비온); 엠메시지 엠머신(mMESSAGE mMACHINE)® 키트 (암비온); 및 하이스크라이브(HiScribe)TM T7 고수율 RNA 합성 키트(High Yield RNA Synthesis Kit) (뉴 잉글랜드 바이오랩스(뉴 잉글랜드 바이오랩스)® 인크.(Inc.)를 포함한다. 또한 주문 제작 RNA가 제한 없이 트리링크 바이오테크놀로지즈(TriLink Biotechnologies); 바이오신테시스(bioSYNTHESIS); 지이 드하르마콘(GE Dharmacon); 및 아이비에이 라이프사이언시즈(IBA Lifesciences)를 포함하는 회사로부터 상업적으로 생성될 수 있다.
본원에 기술된 hOTC DNA 서열은 본 기술 분야에 잘 알려진 기술을 이용하여 시험관 내에서 그리고 합성에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 긴 DNA 서열의 PCR-기반의 정확한 합성(PCR-based accurate synthesis; PAS) 방법이 이용될 수 있으며, 이는 문헌[Xiong et al, PCR-based accurate synthesis of long DNA sequences, Nature Protocols 1, 791 - 797 (2006)]에 기술된 바와 같다. 이중 비대칭 PCR법과 중첩 연장 PCR법의 조합된 방법이 문헌[Young and Dong, Two-step total gene synthesis method, Nucleic Acids Res. 2004; 32(7): e59]에 기술되어 있다. 또한 문헌[Gordeeva et al, J Microbiol Methods. Improved PCR-based gene synthesis method and its application to the Citrobacter freundii phytase gene codon modification. 2010 May;81(2):147-52. Epub 2010 Mar 10]을 참조하며; 또한 올리고뉴클레오티드 합성 및 유전자 합성에 대한 하기 특허, 문헌[Gene Seq. 2012 Apr;6(l): 10-21]을 참조한다: 미국 특허 제8008005호; 및 미국 특허 제7985565호. 이러한 문서 각각은 본원에 참고로 포함된다. 게다가, PCR을 통한 DNA의 생성을 위한 키트 및 프로토콜은 구매가능하다. 이들은 제한 없이 Taq 폴리머라아제; 원탁(OneTaq)® (뉴 잉글랜드 바이오랩스); Q5® 고충실도 DNA 폴리머라아제(High-Fidelity DNA Polymerase) (뉴 잉글랜드 바이오랩스); 및 고탁(GoTaq)® G2 폴리머라아제 (프로메가)를 포함하는 폴리머라아제의 사용을 포함한다. 또한 DNA는 본원에 기술된 hOTC 서열을 함유하는 플라스미드로 형질감염된 세포로부터 생성될 수 있다. 키트 및 프로토콜은 공지되어 있으며 구매가능하고, 제한 없이 퀴아젠(QIAGEN) 플라스미드 키트; 차지스위치(Chargeswitch)® 프로 필터 플라스미드 키트(Pro Filter Plasmid Kits) (인비트로겐(Invitrogen)); 및 젠일루트(GenElute)TM 플라스미드 키트 (시그마 알드리치(Sigma Aldrich))를 포함한다. 본원에서 유용한 다른 기술은 서열 특이적 등온 증폭법을 포함하는데, 이는 서모사이클링(thermocycling)에 대한 필요성을 없앤다. 열 대신, 이러한 방법은 전형적으로 가닥-대체 DNA 폴리머라아제, 예컨대 Bst DNA 폴리머라아제, 큰 단편(Large Fragment) (뉴 잉글랜드 바이오랩스)을 이용하여 이중가닥 DNA를 분리한다. DNA는 또한 RNA-의존성 DNA 폴리머라아제인 역전사효소(Reverse Transcriptase; RT)의 사용을 통한 증폭을 통하여 RNA 분자로부터 생성될 수 있다. RT는 원래의 RNA 주형에 상보성인 DNA의 가닥을 중합시키며 이는 cDNA로 칭해진다. 그 후 이러한 cDNA는 상기에 약술된 PCR 또는 등온법을 통하여 추가로 증폭될 수 있다. 또한 주문 제작 DNA가 제한 없이 젠스크립트(GenScript); 제네위즈(GENEWIZ)®; 진아트(GeneArt)® (라이프 테크놀로지즈(Life Technologies)); 및 인테그레이티드 디엔에이 테크놀로지즈(Integrated DNA Technologies)를 포함하는 회사로부터 상업적으로 생성될 수 있다.
"발현"이라는 용어는 본원에서 그의 가장 넓은 의미로 사용되며 RNA의 생성 또는 RNA 및 단백질의 생성을 포함한다. RNA와 관련하여, "발현" 또는 번역"이라는 용어는 특히 펩티드 또는 단백질의 생성에 관련된다. 발현은 일시적일 수 있거나 안정할 수 있다.
본 발명의 맥락에서 "번역"이라는 용어는 리보좀에서의 과정에 관련되며, 여기서, mRNA 가닥은 아미노산 서열의 조립을 제어하여 단백질 또는 펩티드를 생성한다.
본 발명에 따르면, hOTC의 "치료적 유효량"을 본원에 기술된 바와 같이 전달하여 요망되는 결과, 즉, OTC 결핍증 또는 이의 1가지 이상의 증상의 치료를 달성한다. 본원에 기술된 바와 같이, 요망되는 결과는 오로트산 수준의 감소, 고암모니아혈증의 감소 및/또는 발달 지연, 학습 장애, 지적 장애, 주의력 결핍 과잉 행동 장애, 및 실행 기능 결함을 포함하는 신경물리학적 합병증 중 1가지 이상의 최소화 또는 제거를 포함한다. 치료는 중증 신생아-발병성 질환 (남자 또는 더욱 드물게는 여자), 및 유아기로부터 유년 시대 말기, 제거년기 또는 성년까지 존재할 수 있는 남자 및 여자에서의 후기-발병성 (부분적) 질환을 갖는 대상체의 치료를 포함할 수 있다. 특정 실시 양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 hOTC를 투여함으로써 대상체, 특히 후기-발병성 헤테로접합성 대상체에서 섬유증 및/또는 간경변을 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공한다. 일 실시 양태에서, OTC 결핍증의 치료적 목표는 혈장중 암모니아를 <80 μmol/L보다 적게, 혈장중 글루타민을 <1,000 μmol/L로, 아르기닌혈증은 80 내지 150 μmol/L로, 그리고 분지쇄 아미노산을 정상 범위 내에서 유지하는 것이다. 그러나, 다른 치료적 종점은 치료 의사에 의해 선택될 수 있다.
또 다른 실시 양태에서, 본 발명은 신생아 대상체 OTCD를 방지 및/또는 치료하는 방법을 제공하며, 이는 hOTC 유전자를 신생 대상체 (예를 들어, 인간 환자)의 간으로 전달하는 단계를 포함한다. 이 방법은 본원에 기술된 합성 hOTC든지 야생형 hOTC이든지, 또는 또 다른 소스로부터의 hOTC든지, 또는 이들의 조합이든지 간에, 기능성 hOTC아제를 코딩하는 임의의 핵산 서열을 이용할 수 있다. 일 실시 양태에서, 신생아 치료는 본원에 기술된 hOTC를 출산한지 8시간 내에, 처음 12시간 내에, 처음 24시간 내에, 또는 처음 48시간 내에 투여되는 것으로 정의된다. 또 다른 실시 양태에서, 특히 영장류의 경우, 신생아 전달은 약 12시간 내자 약 1주일, 2주일, 3주일 또는 약 1개월의 기간 내이거나, 약 24시간 내지 약 48시간 후이다. 성장 중인 포유류 (예를 들어, 인간외 영장류 또는 인간 영장류)에서 간세포의 빠른 턴오버(turnover)로 인한 희석에 대처하기 위하여, 신생아 요법에는 바람직하게는 약 3개월의 연령, 약 6개월, 약 9개월 또는 약 12개월에 재투여하는 것이 뒤따른다. 임의로, 1회 초과의 재투여가 허용된다. 그러한 재투여는 동일한 유형의 벡터, 상이한 바이러스 벡터를 이용한 것이거나 비-바이러스 전달을 통한 것일 수 있다. 일 실시 양태에서, 기능성 hOTC를 위한 RNA 기반의 전달 시스템을 이용하여 위기 상태의 대상체 (예를 들어, 인간 환자)를 안정화시키고, 이어서 기능성 hOTC의 바이러스 벡터 매개된 전달을 전달한다. 또 다른 실시 양태에서, 초기 요법은 바이러스 및 비-바이러스 매개된 hOTC 전달 시스템의 동시 투여를 포함한다. 추가의 실시 양태에서, hOTC DNA 및 RNA 구성물은 단독으로, 또는 환자의 진단 및 상태를 위한 케어의 표준과 조합되어 사용될 수 있다.
본원에서 실시예에서 기술된 바와 같이, 본 발명자는 후기 발병 OTCD를 갖는 것을 비롯한 헤테로접합성 OTCD 대상체는 간 전체에 걸쳐 증가된 섬유증 및/또는 미세소포 지방간을 가짐을 알아냈다. 그러한 간 섬유증 및/또는 미세소포 지방간은 OTCD-관련된 간경변을 초래할 수 있다. 따라서, 또 다른 실시 양태에서, 본 발명은 대상체 (예를 들어, 인간 환자)에게 hOTC를 전달함으로써 간 섬유증 및/또는 연관된 의학적 상태인 OTCD-관련된 간경변을 예방하는 방법을 제공한다. 본 발명의 이러한 측면은 바이러스 또는 비-바이러스 전달 시스템을 이용할 수 있다. 핵산 발현 카세트는 본원에 제공된 합성 hOTC DNA 또는 RNA, 또는 기능성 hOTC아제를 발현시키는 또 다른 적합한 서열을 함유할 수 있다. 일 실시 양태에서, 간 섬유증, 미세소포 지방간, 및/또는 OTCD-관련된 간경변의 치료 및/또는 예방 방법이 제공되며, 이는 OTC아제를 OTCD를 갖는 대상체에게 전달하는 것을 포함한다. 대상체는 인간 환자일 수 있다. 일 실시 양태에서, 환자는 헤테로접합성이며, 후기 발병 OTCD를 갖는다. 환자는 OTCD에 대하여 이전에 치료되지 않았을 수 있거나, 다른 통상적인 치료를 받았을 수 있다. 현재, OTCD에 대한 케어의 기존의 표준은 없으며, 오히려 증상은 예를 들어 단백질 섭취의 중단, 식이 탄수화물 및 지질의 보충적 증가, 극도로 높은 혈중 수준을 갖는 혼수 상태 환자에 대한 혈액 투석; 및/또는 벤조산나트륨, 아르기닌 및/또는 소듐 페닐아세테이트의 정맥내 투여를 통하여 관리된다. 미국 FDA는 2세 이상인 환자에 있어서 일부 우레아 사이클 장애의 장시간 관리를 위한 글리세롤 페닐부티레이트 (라빅티(Ravicti)®)를 승인하였으며; 이 약물은 신체에서 암모니아를 없애는 것을 돕고, 단백질 제한식 또는 아미노산 보충제 단독에 의해서는 관리될 수 없는 환자용으로 의도된다. 일 실시 양태에서, 환자의 치료 (예를 들어, 제1 주사)는 태어나기 전에 개시된다. 또 다른 실시 양태에서, 치료는 처음 1년 후, 또는 처음 2 내지 3세 이후, 5세 이후, 11세 이후, 또는 더 나이 많은 때에 개시된다.
일 실시 양태에서, 본 발명의 방법은 대상체에게 서열 번호 1, 3, 4, 5, 8 또는 9의 엔지니어링된 DNA, 또는 본원에 정의된 키메라 DNA에 의해 코딩되는 기능성 OTC아제를 전달함으로써 간 섬유증 및/또는 OTCD-관련된 간경변을 치료 및/또는 역전시키는 것을 제공한다. 이 DNA의 전달은 발현 카세트 중의 엔지니어링된 것을 함유하는 바이러스 벡터에 의해, 또는 비-바이러스 전달 시스템에 의해 매개될 수 있는데, 이들 중 어느 하나는 대상체의 간세포에서 기능성 OTC아제의 발현을 매개한다. 또 다른 실시 양태에서, 대상체에게는 서열 번호 10, 11, 12 또는 13의 엔지니어링된 RNA, 또는 본원에 정의된 키메라 RNA가 투여된다. 이 RNA의 전달은 발현 카세트 중의 엔지니어링된 RNA를 함유하는 바이러스 벡터에 의해, 또는 비-바이러스 전달 시스템에 의해 매개될 수 있는데, 이들 중 어느 하나는 대상체의 간세포에서 기능성 OTC아제의 발현을 매개한다.
헤테로접합성 OTCD 대상체는 간세포 암종(HCC)의 증가된 발병 위험성을 갖는다. 예를 들어, 문헌[JM Wilson et al, Moleuclar Genetics and Metabolism (2012), Mol Genet Metab. 2012 Feb; 105(2): 263-265, Published online 2011 Nov 7]을 참조한다. 따라서, 또 다른 실시 양태에서, 본 발명은 대상체 (예를 들어, 인간 환자)에게 hOTC를 전달함으로써 HCC를 예방 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공한다. 본 발명의 이러한 측면은 바이러스 또는 비-바이러스 전달 시스템을 이용할 수 있다. 핵산 발현 카세트는 본원에 제공된 합성 hOTC DNA 또는 RNA, 또는 기능성 hOTC아제를 발현시키는 또 다른 적합한 서열을 함유할 수 있다. 환자는 OTCD에 대하여 이전에 치료되지 않았을 수 있거나, 다른 통상적인 치료, 즉, 케어의 표준을 받았을 수 있다. 일 실시 양태에서, 환자의 치료 (예를 들어, 제1 주사)는 HCC로 진단되기 전에 개시된다. 또 다른 실시 양태에서, 환자의 치료는 HCC 진단 후에 개시된다. 임의로, 치료는 소라페닙(sorafenib) (넥사바르(Nexavar)®로 구매가능함)과의 동시 투여, 또는 화학색전술, 방사선, 열치료(thermal ablation), 경피 에탄올 주사, 표적화된 요법 (예를 들어, 항-혈관형성 약물), 항암 약물의 간동맥 주입, 면역요법과 함께, 또는 예를 들어 절제, 저온 수술 및 간 이식을 비롯한 외과적 옵션과 함께 사용되는 것을 포함한다. HCC의 치료에 사용될 때, 본원에 기술된 합성 hOTC DNA 또는 RNA의 전달을 위한 비-통합 전달 시스템 (예를 들어, 직접적 RNA 전달, 또는 비-통합 바이러스, 예컨대 아데노바이러스 또는 비-통합 렌티바이러스)을 선택하는 것이 바람직할 수 있다.
"기능성 OCT"는 서열 번호 2를 특징으로 하는 것과 같은 야생형 OTC아제 또는 서열 번호 2의 서열 또는 질환과 연관되지 않은 이의 천연 변이체 또는 다형체를 특징으로 할 수 있는 야생형 인간 오르니틴 트랜스카르바밀라아제 효소의 생물학적 활성 수준의 약 50% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상, 또는 대략 동일한 것 또는 100% 초과를 제공하는 또 다른 OTC아제를 코딩하는 유전자를 의미한다. 더욱 특히는, 헤테로접합성 환자는 약 50% 이하만큼 낮은 OTC아제 기능 수준을 가질 수 있기 때문에, 효과적인 치료는 OTC아제 활성을 "정상" 또는 비-OTCD 환자의 범위 내의 수준까지 대체하는 것을 요구하지 않을 수 있다. 이와 유사하게, 검출가능한 양의 OTC아제를 갖지 않는 환자는 OTC아제 기능을 100% 미만의 활성 수준까지 전달함으로써 구해질 수 있으며, 임의로 후속적으로 추가로 치료될 수 있다. 본원에 기술된 바와 같이, 바이러스에 의한 것이든지 비-바이러스에 의한 것이든지 간에 본원에 기술된 유전자 요법은 다른 치료, 즉, 대상체의 (환자의) 진단을 위한 케어의 표준과 함께 이용될 수 있다.
일 실시 양태에서, 그러한 기능성 OTC아제는 서열 번호 2의 성숙 단백질 (즉, 대략 마지막 322개의 아미노산) 또는 전장 서열에 대하여 약 95% 이상의 동일성을 갖거나, 아미노산 수준에서 서열 번호 2의 서열에 대하여 약 97% 이상의 동일성 또는 약 99% 이상의 동일성을 갖는 서열을 갖는다. 그러한 기능성 OTC아제는 어떠한 질환과도 연관되지 않은 천연 다형체 (예를 들어, 서열 번호 2의 WI193-194, L111 및/또는 F101)를 또한 포함할 수 있다. 동일성은 서열들의 정렬을 준비함으로써 그리고 본 기술 분야에 공지되거나 구매가능한 다양한 알고리즘 및/또는 컴퓨터 프로그램 [예를 들어, BLAST, ExPASy; Clusta1O; FASTA; 예를 들어, 니들맨(Needleman)-분쉬(Wunsch) 알고리즘, 스미쓰(Smith)-워터맨(Waterman) 알고리즘의 사용]의 사용을 통하여 결정될 수 있다.
시험관 내에서 (예를 들어, 문헌[X Ye, et al, 1996 Prolonged metabolic correction in adult ornithine transcarbamylase-deficient mice with adenoviral vectors. J Biol Chem 271 :3639-3646] 참조) 또는 생체 내에서 OTC 발현 및 활성 수준을 측정하기 위한 다양한 분석법이 존재한다. 예를 들어, OTC 효소 활성은 액체 크로마토그래피 질량 분광법 안정성 동위원소 희석법을 이용하여 [1,2,3,4,5-13C5] 시트룰린 (98%의 13C)에 대하여 정규화된 시트룰린의 형성을 탐지하여 측정될 수 있다. 이 방법은 N-아세틸글루타메이트 신타아제 활성의 탐지를 위한 이전에 개발된 분석법으로부터 수정된 것이다 (문헌[Morizono H, et al, Mammalian N-acetylglutamate synthase. Mol Genet Metab. 2004;81(Suppl 1):S4-11.]). 신선 냉동 간의 조각을 칭량하고, 10 mM HEPES, 0.5% 트리톤(Triton) X-100, 2.0 mM EDTA 및 0.5 mM DTT를 함유하는 완충제에서 잠시 균질화한다. 균질화 완충제의 부피를 50 mg/ml의 조직이 수득되도록 조정한다. 효소 활성을 50 mM 트리스-아세테이트, 4 mM 오르니틴, 5 mM 카르바밀 포스페이트 (pH 8.3) 중 250 ㎍의 간 조직을 이용하여 측정한다. 효소 활성은 50 mM 트리스-아세테이트 (pH 8.3)에 용해시킨 신선하게 제조된 50 mM 카르바밀 포스페이트의 첨가에 의해 개시되며, 이를 25℃에서 5분 동안 진행시키고, 동일 부피의, 30% TCA 중 5 mM 13C5-시트룰린의 첨가에 의해 켄칭한다(quenched). 잔사를 5분간의 마이크로원심분리에 의해 분리하고, 상청액을 질량 분광법을 위하여 바이알로 옮긴다. 10 μL의 샘플은 93%의 용매 A (1 L의 물 중 1 ml의 트리플루오로아세트산):7%의 용매 B (1:9의 물/아세토니트릴 1 L 중 1 ml의 트리플루오로아세트산)의 이동상을 이용하여, 등용매 조건 하에서 애질런트(Agilent) 1100 시리즈 LC-MS 내로 주입된다. 시트룰린에 상응하는 피크 [176.1의 질량:전하 비 (m/z)] 및 13C5-시트룰린에 상응하는 피크 (181.1의 m/z)를 정량화하고, 이들의 비를 각각의 분석에서 시트룰린 런(run)의 표준 곡선에 대하여 수득된 비와 비교한다. 샘플을 전체 간 조직에 대하여 또는 바이오-라드(Bio-Rad) 단백질 분석 키트 (미국 캘리포니아주 허큘리스 소재의 바이오-라드)를 이용하여 결정된 단백질 농도에 대하여 정규화한다. 간 생검을 요구하지 않는 다른 분석법이 또한 이용될 수 있다. 하나의 그러한 분석법으로는 글루타민과 시트룰린의 비를 평가하고, 글루타민이 높고 (>800 마이크로리터/리터) 시트룰린이 낮을 경우 (예를 들어, 한 자릿수) 우레아 사이클 결함을 의심하는 혈장 아미노산 분석법이 있다. 혈장중 암모니아 수준이 측정될 수 있으며, 리터당 약 100 마이크로몰의 농도는 OTCD를 나타내는 것이다. 환자가 과호흡일 경우 혈액 가스가 평가될 수 있으며; 호흡성 알칼리증이 OTCD에서 빈번하다. 소변 중 오르트산, 예를 들어 약 20 마이크로몰/밀리몰 초과의 크레아틴은 OTCD를 나타내는 것이며, 이는 알로퓨리놀 챌린지(challenge) 검사 후 소변 오로테이트가 상승되는 바와 같다. OTCD에 대한 진단 기준은 본원에 참고로 포함된 문헌[Tuchman et al, 2008, Urea Cycle Disorders Consortium (UCDC) of the Rare Disease Clinical Research Network (RDCRN). Tuchman M, et al., Consortium of the Rare Diseases Clinical Research Network. Cross-sectional multicenter study of patients with urea cycle disorders in the United States. Mol Genet Metab. 2008;94:397-402]에 개시되었다. 또한, OCTD에 대한 케어의 현재의 표준에 대한 논의를 제공하는 http://www.ncbi.nlm.nih. gov/books/NBK154378/을 참조한다.
단수형 용어 ("a" 또는 "an")는 하나 이상을 나타낸다는 것이 주지되어야 한다. 그와 같이, 단수형 용어 ("a" 또는 "an"), "하나 이상", 및 "적어도 하나"는 본원에서 상호교환가능하게 사용된다.
"포함하다", "포함하고 있다" 및 "포함하는"이라는 단어는 배제적이라기보다는 오히려 포괄적으로 해석되어야 한다. "이루어지다", "이루어진"이라는 단어 및 그의 변이형은 포괄적이라기보다는 오히려 배제적으로 해석되어야 한다. 본 명세서에서 다양한 실시 양태가 "포함하는"이라는 언어를 이용하여 제시되어 있지만, 다른 상황 하에서는 관련 실시 양태는 또한 "이루어진" 또는 "본질적으로 이루어진"이라는 언어를 이용하여 해석되고 설명되는 것으로 의도된다.
본원에서 사용될 때, "약"이라는 용어는 달리 특정되지 않으면 주어진 기준으로부터의 10%의 가변성(±10%)을 의미한다.
본원에서 사용될 때 "조절"이라는 용어 또는 이의 변화는 화학식 I의 화합물이 생물학적 경로의 하나 이상의 구성 요소를 억제하는 능력을 나타낸다.
"대상체"는 포유류, 예를 들어, 인간, 마우스, 래트, 기니 피그, 개, 고양이, 말, 소, 돼지 또는 인간외 영장류, 예컨대 원숭이, 침팬지, 개코 원숭이 또는 고릴라이다.
본원에서 사용될 때, "질환", "장애" 및 "병태"는 대상체에서의 비정상적인 상태를 나타내도록 상호교환가능하게 사용된다.
본 명세서에서 달리 정의되지 않으면, 본원에서 사용되는 기술 용어 및 과학 용어는 당업자에 의해 그리고 출판된 교재의 참고에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는데, 이는 당업자에게 본 출원에서 사용되는 많은 용어에 대한 일반 지침을 제공한다.
하기 실시예는 단지 예시적이며, 본 발명을 한정하고자 하는 것이 아니다.
실시예 1 - hOTC를 함유하는 scAAV 벡터
인트론이 교란된 이전에 기술된 pAAVsc.TBG.mOTC 1.3으로부터 유래된 플라스미드에서 mOTC 코딩 서열을 각각 야생형 (WT) hOTC (hOTCwt) 또는 hOTCcoLW cDNA로 대체함으로써 pAAVsc.TBG.hOTCwt 및 pAAVsc.TBG.hOTCco-LW4를 구성하였다 (문헌[Moscioni D, et al, "Long-term correction of ammonia metabolism and prolonged survival in ornithine transcarbamylase-deficient mice following liver-directed treatment with adeno-associated viral vectors", Mol Ther. 2006;14:25-33]; 문헌[Cunningham SC, et al, "AAV2/8 -mediated correction of OTC deficiency is robust in adult but not neonatal Spf(ash) mice", Mol Ther. 2009;17: 1340-1346]; 문헌[Wang L, et al., "Sustained correction of OTC deficiency in spfash mice using optimized self-complementary AAV2/8 vectors", Gene Ther. 2012 Apr; 19(4):404-10, Epub 2011 Aug 18]).
scAAV2/8.TBG.hOTCco-LW4는 AAV2 3' ITR 및 5' ITR (D-서열 및 trs(말단 분해 부위) 내에 결실이 있음), TBG 프로모터, hOTCco-LW4 유전자, 및 137 bp SV40 폴리A를 함유한다. 초기 비교 연구에서 사용한 두 벡터 프렙(prep) (AAV2/8sc.TBG.hOTCwt 및 AAV2/8sc.TBG.hOTCco-LW4)을 2회 라운드의 염화세슘 구배 원심분리에 의해 정제하였으며, 이는 이전에 설명된 바와 같았다 (문헌[Wang L, et al, Systematic evaluation of AAV vectors for liver directed gene transfer in murine models. Mol Ther. 2010;18: 118-125]). 나머지의 연구에서 사용한 벡터를 폴리에틸렌이민(PEI) 형질감염을 기반으로 한 축척 생성 방법(scaled production method)에 의해 생성하고, 요오딕사놀 구배 원심분리에 의해 상청액 또는 전체 용해물(lysate)로부터 정제하였으며, 이는 설명된 바와 같았다 (문헌[Lock M, et al, Hum Gene Ther. 2010;21 :1259-1271]). AAV 벡터의 게놈 역치 [게놈 카피(GC)/ml]를 TBG 프로모터를 표적화하는 프라이머 및 프로브 세트 (정방향 프라이머 5'-AAACTGCCAATTCCACTGCTG-3' [서열 번호 14], 역방향 프라이머 5'-CCATAGGCAAAAGCACCAAGA-3' [서열 번호 15 ], 프로브 6FAM- TTGGCCCAATAGTGAGAACTTTTTCCTGC [서열 번호 16] -TAMRA)를 사용하여, 그리고 표준물로서 선형화된 플라스미드를 사용하여 실시간 PCR에 의해 결정하였다. 정방향 프라이머는 5' 폐쇄 헤어핀의 400 bp 하류에 위치한다. 최근에 문헌[Fagone et al, Systemic errors in quantitative polymerase chain reaction titration of self-complementary adeno-associated viral vectors and improved over alternative methods, Hum Gene Ther Methods. 2012 Feb;23(1): 1-7.]에는 정량적 PCR(Q-PCR) 방법이, 특히 PCR 프라이머가 scAAV 벡터의 폐쇄 헤어핀에 가깝게 있을 때 scAAV 벡터의 역치를 유의하게 과소평가할 수 있음이 보고되었다. 폴리A 영역 (5' 폐쇄 헤어핀의 1900 bp 하류)을 표적화하는 프라이머 및 프로브 세트를 이용한 AAV2/8sc.TBG.hOTCco-LW4 벡터의 하나의 로트(lot)의 역치, 및 게놈 역치는 원래의 역치의 1.1배였으며, 이는 Q-PCR의 분석내 오차 이내였다.
1 x 1011의 GC의 AAV2/8sc.TBG.hOTCwt 또는 AAV2/8sc.TBG.hOTCco-LW4 벡터를 정맥내 주사한지 14일 후 spfash 마우스의 간에서 OTC 단백질 발현 수준 및 OTC 활성을 평가하였다. spfash 마우스는 인간에 있어서의 후기 발병 OTC 질환의 모델이다. 모든 동물에서의 절차를 유니버시티 오브 펜실베이니아(University of Pennsylvania)의 실험 동물 운영 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee; IACUC)에 의해 승인된 프로토콜에 따라 수행하였다. spfash 마우스를 이전에 설명된 바와 같이 유니버시티 오브 펜실베이니아의 애니멀 퍼실리티 오브 더 트랜슬레이셔널 리서치 래보러토리즈(Animal Facility of the Translational Research Laboratories)에서 유지하였다. 3 내지 6개월령의 spfash 마우스 및 그의 정상 한배새끼를 연구에서 사용하였다. 벡터를 꼬리 정맥을 통한 정맥내(i.v.) 주사에 의해 투여하였다. 체류(resident) 벡터 게놈을 기반으로 한 유전자 이전의 정도는 두 군간에 통계학적으로 다르지 않았다. 소변 샘플을 이전에 설명된 바와 같이 오로트산 분석을 위한 벡터의 처리 전 및 상기 벡터의 처리 후 다양한 시점에 수집하였다 (문헌[Moscioni D, et al, Long-term correction of ammonia metabolism and prolonged survival in ornithine transcarbamylase-deficient mice following liver-directed treatment with adeno-associated viral vectors. Mol Ther. 2006;14:25-33]).
간 용해물에서의 hOTC 발현을 탐지하기 위한 웨스턴 블롯(Western blot) 분석을 이전에 설명된 바와 같이 수행하였다 (문헌[Wang L, et al, 2012, epub 201 1)]) . hOTC를 탐지하기 위한 일차 항체는 칠드런즈 내셔널 메디칼 센터(Children's National Medical Center)의 히로키 모리조노(Hiroki Morizono)의 실험실에 의해 제공된 주문 제작 토끼 다클론 항체였다. 간 용해물 (10 ㎍/레인)을 또한 블로팅하고 항-튜뷸린 항체 (미국 매사추세츠주 캠브리지 소재의 압캄(Abcam))에 의해 프로빙하였다. 웨스턴 분석에 의하면 hOTCwt 벡터와 비교하여 hOTCco-LW4 벡터로부터의 hOTC의 100배 더 높은 발현이 입증되었으며, 이는 WT 마우스에서 보여지는 것보다 약간 과량의 수준에 도달하였다.
액체 크로마토그래피 질량 분광법 안정성 동위원소 희석법을 이용하여 [1,2,3,4,5-13C5] 시트룰린 (98%의 13C)에 대하여 정규화된 시트룰린의 형성을 탐지하여 OTC 효소 활성을 측정하였다. 이 방법은 N-아세틸글루타메이트 신타아제 활성의 탐지를 위한 이전에 개발된 분석법으로부터 수정된 것이다 (문헌[Morizono H, et al, Mammalian N-acetylglutamate synthase. Mol Genet Metab. 2004;81(Suppl 1):S4-11.]). 신선 냉동 간의 조각을 칭량하고, 10 mM HEPES, 0.5% 트리톤 X-100, 2.0 mM EDTA 및 0.5 mM DTT를 함유하는 완충제에서 잠시 균질화하였다. 균질화 완충제의 부피를 50 mg/ml의 조직이 수득되도록 조정하였다. 효소 활성을 50 mM 트리스-아세테이트, 4 mM 오르니틴, 5 mM 카르바밀 포스페이트 (pH 8.3) 중 250 ㎍의 간 조직을 이용하여 측정하였다. 효소 활성은 50 mM 트리스-아세테이트 (pH 8.3)에 용해시킨 신선하게 제조된 50 mM 카르바밀 포스페이트의 첨가에 의해 개시되며, 이를 25℃에서 5분 동안 진행시키고, 동일 부피의, 30% TCA 중 5 mM 13C5-시트룰린의 첨가에 의해 켄칭하였다. 잔사를 5분간의 마이크로원심분리에 의해 분리하고, 상청액을 질량 분광법을 위하여 바이알로 옮겼다. 10 μL의 샘플을 93%의 용매 A (1 L의 물 중 1 ml의 트리플루오로아세트산):7%의 용매 B (1:9의 물/아세토니트릴 1 L 중 1 ml의 트리플루오로아세트산)의 이동상을 이용하여, 등용매 조건 하에서 애질런트 1100 시리즈 LC-MS 내로 주입하였다. 시트룰린에 상응하는 피크 [176.1의 질량:전하 비 (m/z)] 및 13C5-시트룰린에 상응하는 피크 (181.1의 m/z)를 정량화하고, 이들의 비를 각각의 분석에서 시트룰린 런의 표준 곡선에 대하여 수득된 비와 비교하였다. 샘플을 전체 간 조직에 대하여 또는 바이오-라드 단백질 분석 키트 (미국 캘리포니아주 허큘리스 소재의 바이오-라드)를 이용하여 결정된 단백질 농도에 대하여 정규화하였다.
본원에서 LW4로 칭해지는 엔지니어링된 hOTC cDNA (도 4)를 보유한 벡터는 발현된 hOTC 단백질 수준을 100배만큼 향상시키는 것으로 밝혀졌다. OTC 단백질은 내인성 OTC와 비교할 때 OTC 효소 활성보다 더 상승되었지만 OTC 효소 활성의 평가는 일반적으로 OTC 웨스턴 블롯 실험과 상관되었다. spfash 마우스에서 배경 활성 수준을 차감할 때, hOTCco-LW4는 hOTCwt보다 33배 초과의 더 높은 활성을 생성하였다. 지속된 그리고 용량-상관된 hOTC 발현 및 활성 수준이 처리된 spfash 마우스에서 관찰되었다. 주로 cDNA가 상이한 이전에 설명된 쥐과 OTC 벡터와 비교하여, hOTCco-LW4 벡터를 보유한 벡터는 약 10배 더 강력하였다.
변형된 hOTCco-LW4 (도 4)를 보유한 예시적인 벡터는 OTC의 조직학적 분석에 의해 측정할 때, 넓은 범위의 용량 전체에 걸쳐 고수준의 형질도입을 제공하였다. 조직화학적 염색에 의해 측정할 때, 1 x 1011의 GC와 3 x 109의 GC 사이에서 형질도입 효율은 50%와 70% 사이에서 변하였다. 1 x 109의 GC의 최저 용량에서, OTC의 조직화학적 염색에 의하면 간 면적의 40%가 양성이었다. 조직화학 및 면역염색에 의한 명백한 용량 효과의 결여는 형질도입된 간세포에서 코돈 최적화가 hOTC 발현을 유의하게 향상시킨다는 사실로 인한 것일 수 있었다. 이는 낮은 벡터 게놈 카피를 갖는 형질도입된 세포를 탐지하는 민감도의 향상을 초래한다. 형질도입은 고 벡터 용량 (1 x 1011 내지 1 x 1010의 GC)에 의해 포화될 수 있었으며, 따라서 원위치(in situ) 탐지 방법에 의해 측정한 형질도입 효율은 질량 분광법에 의해 측정한 간 용해물에서의 OTC 효소 활성과는 대조적으로 저용량군과 고용량군을 식별하지 못할 것이다.
중측두 정맥을 통하여 주사되는 새끼당 5 x 1010의 GC의 용량의 scAAV2/8.TBG.hOTCco를 이용하여 삶의 제1일에 주사되는 spfash 마우스에서 hOTC의 신생아 발현을 평가하는 추가의 연구를 수행하였다. 강한 발현이 24시간 및 48시간에 탐지되었다. 추가의 연구를 1 x 1011, 3 x 1010 및 1 x 1010의 용량을 이용하여 수행하고, 12주 동안 평가하였다. 16주의 연구 기간에 걸쳐, 초기의 강한 발현 수준의 감소가 용량 각각에서 관찰되었다. 이것은 희석으로 인한 것으로 믿어지며, 즉, 성장 중인 동물에서의 간세포의 증식의 자연적인 결과로 인한 것으로 믿어진다. 따라서, OTC 간 활성의 초기 회복이 spfash 마우스에서의 신생아 유전자 이전 후 관찰되지만, 이러한 결과는 일시적인 것으로서, 이때 OTC 활성은 약 1주에 야생형(wt) 수준의 약 1000%로부터, 4주에 wt 수준의 약 50%까지, 12주에 wt 수준의 약 10%까지 (1 x 1011의 GC 수준); 또는 제1주에 wt 수준의 약 500%에서, wt 수준의 약 20%까지, 또는 제1주에 wt 수준의 약 10% (3 x 1010의 GC의 용량) 또는 제1주에 약 200%의 wt 수준에서 제4주에 약 10%의 wt 수준까지 (1 x 1010의 GC의 용량) 강하한다. 하나의 연구에서, 제1일에 3 x 1010의 GC의 제1 주사를 받은 동물을 이용하여, 제4주에 hOTCco 유전자를 보유한 제2 AAV 벡터 (scAAVrh10.hOTCco; 1.8 x 1010의 GC)를 동물에게 주사하였다. 대조구로서, 동물의 하나의 군은 재투여를 받지 않았으며, 하나의 군은 4주에 제2 벡터만을 받았다. AAV.hOTCco의 재투여는 간 OTC 활성을 회복시켰다.
단시간 및 장시간 둘 모두의 신생아 유전자 요법에 의해 OTC-KO 새끼를 구하는 능력을 평가하기 위하여 추가의 연구를 설계하였다.
실시예 2 - 코돈 최적화된 서열을 갖는 scAAV 벡터의 생성
A. scAAV8.TBG.hOTC-co
인트론을 갖는 이전에 설명된 pAAVsc.TBG.mOTC1.3으로부터 유래된 플라스미드에서 mOTC 코딩 서열을 hOTCco로 대체함으로써 각각 서열 번호 3, 4, 5, 9 또는 10의 코돈 최적화된 hOTC 서열을 함유하는 플라스미드를 실시예 1에 설명된 바와 같이 클로닝한다. 생성된 플라스미드 pAAVsc.TBG.hOTCco를 통상적인 기술을 이용하여 AAV8 캡시드 내에 클로닝한다 (문헌[Gao et al, PNAS USA, 2002, 99:11854-11859]).
B. scAAVrh10.TBG.hOTC-co
인트론을 갖는 이전에 설명된 pAAVsc.TBG.mOTC1.3으로부터 유래된 플라스미드에서 mOTC 코딩 서열을 hOTCco로 대체함으로써 각각 서열 번호 3, 4, 5, 9 또는 10의 코돈 최적화된 hOTC 서열을 함유하는 플라스미드를 실시예 1에 설명된 바와 같이 클로닝한다. 생성된 플라스미드 pAAVsc.TBG.hOTCco를 통상적인 기술을 이용하여 AAVrh10 캡시드 내에 클로닝한다 (문헌[Gao et al, PNAS USA, 2002, 99:11854-11859]).
실시예 3 - 코돈 최적화된 서열을 갖는 ssAAV 벡터의 생성
ssAAV2/8.LSP1.hOTC-co
pLSP1mOTC 플라스미드 (문헌[Cunningham et al, Mol Ther, 2009, 17: 1340-1346])의 mOTC 코딩 서열을 서열 번호 3, 4, 5, 9 또는 10의 상응하는 cDNA 서열로 대체함으로써 설명된 바와 같이 코돈 최적화된 hOTCco 서열을 함유하는 플라스미드를 클로닝한다. 생성된 플라스미드 pAAVsc.LSP1.hOTCco를 실시예 1에 설명된 기술을 이용하여 AAV8 캡시드 내에 클로닝하여 상응하는 ssAAV2/8.LSP1.hOTC-co 벡터를 형성한다.
B. ssAAV2/rh10.LSP1.hOTC-co
pLSP1mOTC 플라스미드 (문헌[Cunningham et al, Mol Ther, 2009, 17: 1340-1346])의 mOTC 코딩 서열을 서열 번호 3, 4, 5, 9 또는 10의 상응하는 cDNA 서열로 대체함으로써 설명된 바와 같이 코돈 최적화된 hOTCco 서열을 함유하는 플라스미드를 클로닝한다. 생성된 플라스미드 pAAVsc.LSP1.hOTCco를 실시예 1에 설명된 기술을 이용하여 AAV8 캡시드 내에 클로닝하여 상응하는 ssAAV2/8.LSP1.hOTC-co 벡터를 형성한다.
파트 A 또는 B에 따라 생성한 벡터를 2회의 라운드의 염화세슘 구배 원심분리에 의해 정제하고, PBS로 완충 교환하고, 아미콘 울트라(Amicon Ultra) 15 원심분리식 필터 장치-100K (미국 매사추세츠주 베드포드 소재의 밀리포어(Millipore))를 이용하여 농축시킬 수 있다. AAV 벡터의 게놈 역치(GC/ml)를 TBG 프로모터에 상응하는 프라이머/프로브 세트 및 선형화된 플라스미드 표준물을 이용하여 실시간 PCR에 의해 결정할 수 있다. 벡터는 벡터 순도에 대한 소듐 도데실 술페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE) 분석 및 내독소 검출을 위한 리물루스 변형 세포 용해물(Limulus amebocyte lysate; LAL) (미국 메릴랜드주 워커스빌 소재의 캄브렉스 바이오 사이언스(Cambrex Bio Science))을 포함하는 추가의 품질 제어 검사를 할 수 있다.
실시예 4 - 후기 발병 OTCD 모델에서의 ssAAV8.TBG. hOTCco
본원에 설명된 방법을 이용하여 AAV8 벡터를 생성하였다. 벡터에는 그 내부에 5' AAV2 ITR, TBG 프로모터, 인트론, hOTCco, WPRE 요소, 소 성장 호르몬 폴리 A, 및 3' AAV2 ITR이 패키징되었다. 이 벡터의 발현 및 동력학적 특성을 WPRE 요소가 있거나 없는 자가-상보성 AAV8 벡터와 비교하였다. 그 결과는 WPRE 요소를 갖는 단일 가닥 구성물이 WPRE 요소가 결여된 벡터를 능가하였고; 비견되는 용량에서 둘 모두의 단일 가닥 벡터 (WPRE를 갖는 그리고 갖지 않는 벡터)는 측정된 시점에서 WPRE가 결여된 자가-상보성 벡터보다 덜 강하였음을 보여준다.
그러나, 상기 단일 가닥 벡터들은 환자의 연령 및 상태에 따라 다른 바람직한 특성, 예를 들어 동력학적 특성 면에서의 것을 가질 수 있다.
실시예 5 - 코돈 최적화된 서열을 갖는 아데노바이러스 벡터의 생성
NotI 링커를 포함하는 hOTCco cDNA [서열 번호 3, 4, 5, 9 및 10]를 래트 PEPCK 프로모터의 하류에 클로닝하여 pPEPCK-hOTC를 생성하였으며, 이는 문헌[A. Mian et al, Molecular Therapy, 2004, 10: 492-499 (2004)]에 설명된 바와 같았다. 이 플라스미드를 AscI로 절단하고, 생성된 PEPCK-hOTCco 단편을 아데노바이러스 골격 플라스미드 pC4HSU31 내에 삽입하여 모(parental) 플라스미드 pC4HSU-PEPCK-hOTCco를 생성하였다. 플라스미드 pWPRE를 ClaI로 절단하여 WPRE를 유리시키며, 그 후 이를 pPEPCK-hOTC의 MluI 부위 내에 삽입하여 그의 각각의 hOTCco 서열들을 포함하는 pPEPCK-hOTCco-WPRE 플라스미드를 생성하였다. 아데노바이러스 플라스미드 pC4HSU-PEPCK-hOTCco-WPRE를 생성하기 위한 남아있는 단계들은 이전에 설명된 바와 같다. 모든 클로닝 부위를 DNA 서열 분석에 의해 확인한다. 재조합 아데노바이러스 플라스미드의 아이덴티티(identity)를 HindIII 및 BamHI을 이용한 제한 효소 절단에 의해 확인할 수 있다. 아데노바이러스 플라스미드를 PmeI으로 선형화한 후 293Cre4 세포를 형질감염시킨다. 아데노바이러스 벡터를 구하고, 293Cre4 세포 및 헬퍼 바이러스 AdLC8cluc를 이용하여 증폭시킨다. 현탁 293N3Scre8 세포를 벡터 생성의 마지막 단계에서 사용할 수 있다. 정제, OD260에 의한 정량화 및 바이러스 DNA 추출을 다른 곳에 상세하게 설명된 바와 같이 수행한다 (문헌[Brunetti-Pierri, N., et al. (2004). Acute toxicity after high-dose systemic injection of helper-dependent adenoviral vectors into nonhuman primates. Hum. Gene Ther. 15: 35-46]; 문헌[Ng, P., Parks, R. J. and Graham, F. L. (2002). Preparation of helper-dependent adenoviral vectors. Methods Mol. Med. 69: 371-388]).
실시예 6 - hOTCco 렌티바이러스 벡터의 생성
A. 플라스미드 pLenti-GIII-CMV-GFP-2A-Puro [캐나다 소재의 어플라이드 바이올로지칼 머티리얼즈 (에이비엠) 인크.(Applied Biological Materials (ABM) Inc.)로부터 구매가능함]의 래트 OTC 유전자 서열 인서트를 요망되는 hOTCco 서열 [서열 번호 3, 4, 5, 9 및 10]로 대체함으로써 본원에 제공된 hOTCco 서열을 함유하는 복제-결함성 렌티바이러스 벡터를 생성할 수 있다. 바이러스를 제조자의 지시에 따라 생성한다. ABM 시스템은 형질도입 및 표적 세포의 게놈 DNA 내로의 통합 후 렌티바이러스 벡터의 자가-불활성화를 보장하기 위하여 3' ΔLTR의 U3 영역 내에 인핸서 결실을 포함하며; 전부 패키징 시그널이 결여된 상이한 플라스미드들로부터 유래된, 패키징, 복제 및 형질도입에 필요한 최소 렌티바이러스 유전자(Gag/Pol/Rev)를 함유하며; 추가로, Gag, Pol, 또는 Rev 유전자 중 어떠한 것도 패키징된 바이러스 게놈 내에 포함되지 않으며, 이에 따라 성숙 바이러스를 복제-비적격성으로 만든다.
B. 복제-결함성, 비-통합성 hOTC 렌티바이러스 벡터
간-특이적 프로모터 및 서열 번호 3, 4, 5, 9 및 10의 hOTCco DNA를 함유하는 DNA 구성물을 본원에 참고로 포함된 미국 특허 출원 공개 제2011/0064763호에 설명된 바와 같이 생성된, 엔벨로프화된 신드비스(sindbis) 바이러스 E2로 위형화된 렌티바이러스 벡터 내로 엔지니어링한다. 모든 벡터는 스플라이스 도너(splice donor), 패키징 시그널(psi), Rev-반응성 요소(Rev-responsive element; RRE), 스플라이스 도너, 스플라이스 억셉터(splice acceptor), 중심 폴리-퓨린 트랙트(central poly-purine tract; cPPT)를 함유한다. 특정 바이러스에서 WPRE 요소를 제거한다.
C. 인비보겐(InvivoGen) (미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)으로부터 구매한, 수포성 구내염 바이러스(vesicular stomatitis virus; VSV) 엔벨로프 유전자로 위형화된 렌티바이러스 내로, 제조자의 지시를 이용하여 서열 번호 3, 4, 5, 9 및 10의 hOTCco DNA를 클로닝한다.
실시예 7 - hOTCco RNA 전달 시스템의 생성
RNA를 DNA 주형으로부터의 시험관 내 전사에 의해 제조하거나 합성할 수 있다. 5' UTR, 스플라이스 도너 및 억셉터 부위를 갖는 임의적 인트론, 임의적 코작 서열, 본원에 제공된 hOTC 코딩 서열, 폴리A, 및 3' UTR을 포함하는 RNA 발현 카세트를 공지된 기술을 이용하여 제조한다.
A. 공개된 기술을 이용하여 생성한 지질-엔벨로프 pH-반응성 중합체 나노입자 내로 적당량의 mRNA를 포함시킨다. 문헌[X. Su et al, Mol. Pharmaceutics, 2011, 8 (3), pp 774-787; web publication: March 21, 2011].
B. 25 kDa 분지형 폴리에틸렌이민(PEI)를 포함하는 중합체성 나노입자 제형을 하기와 같이 제조한다. PEI가 존재할 때, 이것은 10 내지 40 kDa의 범위의 분자량의 분지형 PEI, 예를 들어, 25 kDa 분지형 PEI (시그마 #408727)일 수 있다. 본 발명에 적합한 추가의 예시적인 중합체는 국제 공개 제2013182683호에 기술된 것을 포함하는데, 상기 국제 공개의 내용은 본원에 참고로 포함된다. 필요한 양의 mRNA를 적용 직전에 4 ml의 총 부피까지 주사용 물 (독일 멜순겐 소재의 브라운(Braun))에 희석시키고, 10의 N/P 비에서 피펫을 이용하여 25 kDa 분지형 PE으의 수성 용액 4 ml에 빠르게 첨가한다. 상기 용액을 위아래로 피펫팅함으로써 혼합한다.
C. 지질-기반의 나노입자에 있어서, 지질 제형을 cK - E12:DOPE:Chol:PEG-DMG2K (상대적인 양: 50:25:20:5 (mg:mg:mg:mg))의 제형 중 hOTCco RNA를 함유하는 발현 카세트를 이용하여 생성하여 전달용 용액을 제공한다. 양이온성 지질 cK -E12를 사용하며 (예를 들어, 국제 공개 제2013/063468호 참조), 이를 국제 공개 제2010/053572호 및 국제 공개 제2012/170930호에 설명된 제형화 방법을 이용하여 디올레오일포스파티딜-에탄올아민 또는 "DOPE", 콜레스테롤(chol), 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 페길화(PEGylated) 지질(PEG-DMG2K)과 조합하는데, 상기 둘 모두의 국제 공개는 본원에 참고로 포함된다.
실시예 8 - hOTCco DNA 전달 시스템
A. 네이키드(naked) 플라스미드 DNA - hOTCco 서열 [서열 번호 3, 4, 또는 5]을 (예를 들어, 혈관내 투여를 통하여) 표적 간세포로 전달되고 표적 세포에서 인간 OTC 단백질을 발현하는 네이키드 플라스미드 DNA 구성물로서 엔지니어링한다.
B. 양이온성 지질-DNA 복합체 - 적어도 프로모터, 임의적 인트론, 임의적 코작 서열, 서열 번호 3, 4 또는 5의 hOTCco, 폴리 A, 및 다른 임의적 발현 제어 서열을 함유하는 적당량의 발현 카세트를 이용하여 양이온성 지질 - DNA 복합체를 제조한다. 프로모터는 간 특이적 프로모터일 수 있다. 대안적으로, 또 다른 조직 비특이적 프로모터를 선택할 수 있다. 예를 들어, 적당량의 DNA를 cK - E12:DOPE:Chol:PEG-DMG2K (상대적인 양: 50:25:20:5 (mg:mg:mg:mg))의 양이온성 지질을 이용하여 제형화하여 대상체에게 전달하기에 적합한 양이온성 지질 - DNA 복합체를 형성한다. 양이온성 지질 cK -E12를 사용하며 (예를 들어, 국제 공개 제2013/063468호 참조), 이를 국제 공개 제2010/053572호 및 국제 공개 제2012/170930호에 설명된 제형화 방법을 이용하여 디올레오일포스파티딜-에탄올아민 또는 "DOPE", 콜레스테롤(chol), 및 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 페길화 지질(PEG-DMG2K)과 조합하는데, 상기 둘 모두의 국제 공개는 본원에 참고로 포함된다.
실시예 9 - 상이한 혈청형의 AAV 벡터를 이용한 다중 치료에 의한 OTC 결핍증의 신생아 치명적인 형태의 장시간 보정
현재의 연구에서, 실시예 1에 설명된 바와 같이 제조한 scAAV8.TBG.hOTCcoLW4를 이용하여 신생아 (초기) 발병 OTCD의 마우스 모델의 동물을 구하였다. OTC KO 마우스를 엑손 2-3의 결실을 통하여 생성하였으며, 이 마우스의 특성을 OTC의 널(null) 돌연변이를 갖는 인간 환자와의 유사성 면에서 특성화하였다. 요약하면, 엑손 2-3의 결실을 통하여 본 발명자의 실험실에서 생성한 OTC 넉아웃(knockout)(KO) 모델은 인간에 있어서 중증 신생아 발병 형태의 OTCD를 면밀하게 모방한다. 신생 수컷 OTC KO 새끼는 간에서의 OTC 발현의 부재로 인하여 상승된 혈장중 암모니아 수준을 가지며, 상기 새끼는 태어난 후 24시간 내에 필연적으로 죽는다. 헤테로접합성 암컷은 정상적으로 번식하며, 정상적인 혈장중 암모니아 수준, 감소된 간 OTC 효소 활성, 상승된 소변중 오로트산 수준, 및 일부의 경우에 더 낮은 체중 (야생형(WT) 한배 새끼)을 갖는다. 실시예 1에서 설명한 바와 같이 제조한 scAAV8-hOTCco 벡터를 출생 직후 새끼당 1 내지 3 x 10e10의 GC의 용량으로 단회 주사하면 OTC KO 새끼를 구할 수 있으며, 생명을 6주까지 연장시킬 수 있다. 장시간 보정을 달성하기 위하여, 4주령의 OTC-KO 마우스의 군은 실시예 1에 설명된 바와 같이 제조한 scAAVrh10-hOTCco 벡터의 두 번째 벡터 투여를 받았다.
제왕 절개술에 의해 회수한 30마리 초과의 OTC-KO 새끼를 유전자 전달에 의해 성공적으로 구하였다. 구해진 새끼는 그의 정상적인 한배 새끼보다 더 낮은 체중을 가졌으며, 희박한 털 및 비정상적인 피부의 일시적인 표현형을 가졌다. 가장 중요하게는, 그의 혈장중 암모니아 수준이 정상 범위 내에 있었다. 그러나, 효능은 신생아기에서의 빠른 간 증식 동안 벡터 게놈의 상실로 인하여 6주 뒤에는 유지될 수 없었다. 4주령의 OTC-KO 마우스에서의 scAAVrh10-hOTCco 벡터의 두 번째 벡터 투여는 그의 생명을 성년까지 더 연장시킬 수 있다. 가장 늙은 마우스는 18개월령에 도달하였다. 장시간 구해진 마우스는 혈장 암모니아의 정상 수준에 가깝게 보이지만, 이러한 마우스의 하위세트(subset)에서의 소변중 오로트산 수준은 유의하게 상승하였다. 상이한 연령 (6개월령, 12개월령 및 18개월령)의 헤테로접합성 마우스로부터의 간 샘플에서의 시리우스 레드(Sirius red) 염색에 의하면, 11세 OTCD 환자로부터의 간 샘플과 유사하게, 고령의 (18개월령의) OTC-KO 헤테로접합성 암컷 마우스에서 간 섬유증이 나타났다.
실시예 10 - 후기 발병 OTC 결핍증(OTCD)의 치료
2개월령의 OTC-KO 헤테로접합성 마우스는 코돈-최적화된 인간 OTC 유전자 (서열 번호 5)를 코딩하는 자가-상보성 AAV8 벡터의 꼬리 정맥 단회 주사를 마우스당 1 x 1010, 3 x 1010, 및 1 x 1011의 벡터 게놈 카피로 받았다. 벡터 처리를 한지 1주일 후, 모든 3가지 벡터 용량 군의 마우스는 연구 전체에 걸쳐 (16개월) 유지된 정상적인 소변중 오로트산 수준을 가졌다. 간 샘플을 병리학적 분석을 위하여 18개월령의 처리된 마우스로부터 수확하고, 이를 연령-매칭된 비처리 헤테로접합성 마우스 및 WT 한배 새끼와 비교하였다. 모든 처리된 마우스는 간 전체에 걸쳐 섬유증을 갖는 비처리된 헤테로접합성 동물과는 대조적으로, WT와 유사한 정상적인 간의 조직학적 특성을 나타냈다. 마지막으로, AAV8sc-hOTCco 벡터의 단회 주사는 헤테로접합성 OTC-KO에서 간 섬유증을 예방할 수 있으며, OTCD 환자에 있어서 간 섬유증의 보정에 대한 큰 잠재력을 갖는다.
본원에 기술된 유전자 요법용 벡터는 심지어 OTC가 완전히 결여된 마우스에서도 빠르고, 강한 장시간의 유전자 발현이 가능하다. 헤테로접합성 암컷은 번식하여 반접합성(hemizygous) 수컷 새끼를 출산할 수 있지만, 이러한 새끼는 비처리될 경우 출산한지 하루 내에 죽는다. 비처리된 늙은 헤테로접합성 암컷 마우스는 인간 헤테로접합성 환자에서의 관찰과 유사하게 나타나는 결과인, 증가된 섬유증 및 미세소포 지방간의 증거를 나타낸다. 병든 수컷을 구할 수 있는 유전자 이전 요법이 개발되었으며, 치료된 수컷은 72주보다 오랫동안 생존하였다.
따라서, 이러한 데이터는 hOTC를 이용한 간-특이적 유전자 요법이 간 섬유증을 예방할 수 있음을 입증한다. 이러한 데이터는 헤테로접합성 OTC 결핍증 인간, 예를 들어, 후기 발병 OTCD를 갖는 대상체의 치료와 상관된다.
(서열 목록 프리 텍스트(Free Text))
하기 정보를 수치적 확인자 <223> 하의 프리 텍스트를 포함하는 서열에 대하여 제공한다.
Figure 112016097168462-pct00001
2014년 3월 9일자로 출원된 우선권 미국 가특허 출원 제61/950,157호 및 이 명세서에 인용된 모든 공개된 문서는 본원에 참고로 포함된다. 이와 유사하게, 본원에서 참고되고 첨부된 서열 목록에 나타나는 서열 번호가 참고로 포함된다. 본 발명을 특별한 실시 양태를 참고하여 설명하였지만, 본 발명의 사상으로부터 벗어나지 않고서 변형이 우리어질 수 있음을 알 것이다. 그러한 변형은 첨부된 청구 범위의 범주 내에 있는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> The Trustees of the University of Pennsylvania <120> COMPOSITIONS USEFUL IN TREATMENT OF OTC DEFICIENCY <130> US-16P-0823 <150> PCT/US15/19513 <151> 2015-03-09 <150> US 61/950,157 <151> 2014-03-09 <160> 16 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1062 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 1 atgctgttta atctgaggat cctgttaaac aatgcagctt ttagaaatgg tcacaacttc 60 atggttcgaa attttcggtg tggacaacca ctacaaaata aagtgcagct gaagggccgt 120 gaccttctca ctctaaaaaa ctttaccgga gaagaaatta aatatatgct atggctatca 180 gcagatctga aatttaggat aaaacagaaa ggagagtatt tgcctttatt gcaagggaag 240 tccttaggca tgatttttga gaaaagaagt actcgaacaa gattgtctac agaaacaggc 300 tttgcacttc tgggaggaca tccttgtttt cttaccacac aagatattca tttgggtgtg 360 aatgaaagtc tcacggacac ggcccgtgta ttgtctagca tggcagatgc agtattggct 420 cgagtgtata aacaatcaga tttggacacc ctggctaaag aagcatccat cccaattatc 480 aatgggctgt cagatttgta ccatcctatc cagatcctgg ctgattacct cacgctccag 540 gaacactata gctctctgaa aggtcttacc ctcagctgga tcggggatgg gaacaatatc 600 ctgcactcca tcatgatgag cgcagcgaaa ttcggaatgc accttcaggc agctactcca 660 aagggttatg agccggatgc tagtgtaacc aagttggcag agcagtatgc caaagagaat 720 ggtaccaagc tgttgctgac aaatgatcca ttggaagcag cgcatggagg caatgtatta 780 attacagaca cttggataag catgggacaa gaagaggaga agaaaaagcg gctccaggct 840 ttccaaggtt accaggttac aatgaagact gctaaagttg ctgcctctga ctggacattt 900 ttacactgct tgcccagaaa gccagaagaa gtggatgatg aagtctttta ttctcctcga 960 tcactagtgt tcccagaggc agaaaacaga aagtggacaa tcatggctgt catggtgtcc 1020 ctgctgacag attactcacc tcagctccag aagcctaaat tt 1062 <210> 2 <211> 354 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Leu Phe Asn Leu Arg Ile Leu Leu Asn Asn Ala Ala Phe Arg Asn 1 5 10 15 Gly His Asn Phe Met Val Arg Asn Phe Arg Cys Gly Gln Pro Leu Gln 20 25 30 Asn Lys Val Gln Leu Lys Gly Arg Asp Leu Leu Thr Leu Lys Asn Phe 35 40 45 Thr Gly Glu Glu Ile Lys Tyr Met Leu Trp Leu Ser Ala Asp Leu Lys 50 55 60 Phe Arg Ile Lys Gln Lys Gly Glu Tyr Leu Pro Leu Leu Gln Gly Lys 65 70 75 80 Ser Leu Gly Met Ile Phe Glu Lys Arg Ser Thr Arg Thr Arg Leu Ser 85 90 95 Thr Glu Thr Gly Phe Ala Leu Leu Gly Gly His Pro Cys Phe Leu Thr 100 105 110 Thr Gln Asp Ile His Leu Gly Val Asn Glu Ser Leu Thr Asp Thr Ala 115 120 125 Arg Val Leu Ser Ser Met Ala Asp Ala Val Leu Ala Arg Val Tyr Lys 130 135 140 Gln Ser Asp Leu Asp Thr Leu Ala Lys Glu Ala Ser Ile Pro Ile Ile 145 150 155 160 Asn Gly Leu Ser Asp Leu Tyr His Pro Ile Gln Ile Leu Ala Asp Tyr 165 170 175 Leu Thr Leu Gln Glu His Tyr Ser Ser Leu Lys Gly Leu Thr Leu Ser 180 185 190 Trp Ile Gly Asp Gly Asn Asn Ile Leu His Ser Ile Met Met Ser Ala 195 200 205 Ala Lys Phe Gly Met His Leu Gln Ala Ala Thr Pro Lys Gly Tyr Glu 210 215 220 Pro Asp Ala Ser Val Thr Lys Leu Ala Glu Gln Tyr Ala Lys Glu Asn 225 230 235 240 Gly Thr Lys Leu Leu Leu Thr Asn Asp Pro Leu Glu Ala Ala His Gly 245 250 255 Gly Asn Val Leu Ile Thr Asp Thr Trp Ile Ser Met Gly Gln Glu Glu 260 265 270 Glu Lys Lys Lys Arg Leu Gln Ala Phe Gln Gly Tyr Gln Val Thr Met 275 280 285 Lys Thr Ala Lys Val Ala Ala Ser Asp Trp Thr Phe Leu His Cys Leu 290 295 300 Pro Arg Lys Pro Glu Glu Val Asp Asp Glu Val Phe Tyr Ser Pro Arg 305 310 315 320 Ser Leu Val Phe Pro Glu Ala Glu Asn Arg Lys Trp Thr Ile Met Ala 325 330 335 Val Met Val Ser Leu Leu Thr Asp Tyr Ser Pro Gln Leu Gln Lys Pro 340 345 350 Lys Phe <210> 3 <211> 1068 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> engineered hOTC <400> 3 atgctgttca acctgcgaat cctgctgaac aatgccgctt ttcggaacgg gcacaatttc 60 atggtgagga actttcgctg cggacagccc ctccagaaca aggtccagct gaagggcagg 120 gacctgctga ccctgaaaaa tttcacaggg gaggaaatca agtacatgct gtggctgtca 180 gccgatctga agttccggat caagcagaag ggcgaatatc tgcctctgct ccagggcaaa 240 agcctgggga tgatcttcga aaagcgcagt actcggacca gactgtcaac agagactgga 300 ttcgcactgc tgggaggaca cccatgtttt ctgaccacac aggacattca tctgggagtg 360 aacgagtccc tgaccgacac agcacgcgtc ctgagctcca tggctgatgc agtgctggct 420 cgagtctaca aacagtctga cctggatacc ctggccaagg aagcttctat cccaatcatt 480 aatggcctga gtgacctgta tcaccccatc cagattctgg ccgattacct gaccctccag 540 gagcattatt ctagtctgaa agggctgaca ctgagctgga ttggggacgg aaacaatatc 600 ctgcactcca ttatgatgag cgccgccaag tttggaatgc acctccaggc tgcaacccca 660 aaaggctacg aacccgatgc ctccgtgaca aagctggcag aacagtatgc caaagagaac 720 ggcactaagc tgctgctgac caatgaccct ctggaggccg ctcacggagg caacgtgctg 780 atcactgata cctggattag tatgggacag gaggaagaga agaagaagcg gctccaggcc 840 ttccagggct accaggtgac aatgaaaact gctaaggtcg cagccagcga ctggaccttt 900 ctgcattgcc tgcccagaaa gcctgaagag gtggacgatg aggtcttcta ctcacccaga 960 agcctggtgt ttcctgaagc tgagaatagg aagtggacaa tcatggcagt gatggtcagc 1020 ctgctgactg attattcccc tcagctccag aaaccaaagt tctgataa 1068 <210> 4 <211> 1068 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> engineered hOTC coding sequence <400> 4 atgctgttca acctgcgaat cctgctgaac aacgccgctt ttcggaacgg gcacaacttt 60 atggtgagga actttcgctg cggacagccc ctccagaata aggtccagct gaagggcagg 120 gacctgctga ccctgaaaaa tttcacaggg gaggaaatca agtatatgct gtggctgtca 180 gctgatctga agttccggat caagcagaag ggcgaatatc tgcctctgct ccagggcaaa 240 agcctgggga tgatcttcga aaagcgcagt actcggacca gactgtcaac cgagactgga 300 ttcgctctgc tgggaggaca cccttgtttt ctgaccactc aggacattca cctgggagtg 360 aacgagtccc tgaccgacac tgctcgcgtc ctgagctcta tggccgacgc tgtgctagct 420 cgagtctaca aacagtccga cctggatacc ctggccaagg aagcttctat cccaattatt 480 aacggcctgt cagacctgta tcaccccatc cagattctgg ccgattacct gaccctccag 540 gagcactatt ctagtctgaa agggctgaca ctgagttgga ttggggacgg aaacaatatc 600 ctgcactcta ttatgatgtc agccgccaag tttggaatgc acctccaggc tgcaacccca 660 aaaggctacg aacccgatgc ctcagtgaca aagctggctg aacagtacgc caaagagaac 720 ggcactaagc tgctgctgac caacgaccct ctggaggccg ctcacggagg caacgtgctg 780 atcaccgata cctggattag tatgggacag gaggaagaga agaagaagcg gctccaggcc 840 ttccagggct accaggtgac aatgaaaacc gctaaggtcg cagccagcga ttggaccttt 900 ctgcactgcc tgcccagaaa gcccgaagag gtggacgacg aggtcttcta ctctcccaga 960 agcctggtgt ttcccgaagc tgagaatagg aagtggacaa ttatggcagt gatggtcagc 1020 ctgctgactg attattcacc tcagctccag aaaccaaagt tctgataa 1068 <210> 5 <211> 1068 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> engineered hOTC <400> 5 atgctgttca acctgcgaat cctgctgaac aacgccgctt ttcggaacgg gcacaacttt 60 atggtgagga actttcgctg cggacagccc ctccagaata aggtccagct gaagggcagg 120 gacctgctga ccctgaaaaa tttcacaggg gaggaaatca agtatatgct gtggctgtca 180 gctgatctga agttccggat caagcagaag ggcgaatatc tgcctctgct ccagggcaaa 240 agcctgggga tgatcttcga aaagcgcagt actcggacca gactgtcaac cgagactgga 300 ttcgctctgc tgggaggaca cccttgtttt ctgaccactc aggacattca cctgggagtg 360 aacgagtccc tgaccgacac tgctcgcgtc ctgagctcta tggccgacgc tgtgctggct 420 cgagtctaca aacagtccga cctggatacc ctggccaagg aagcttctat cccaattatt 480 aacggcctgt cagacctgta tcaccccatc cagattctgg ccgattacct gaccctccag 540 gagcactatt ctagtctgaa agggctgaca ctgagttgga ttggggacgg aaacaatatc 600 ctgcactcta ttatgatgtc agccgccaag tttggaatgc acctccaggc tgcaacccca 660 aaaggctacg aacccgatgc ctcagtgaca aagctggctg aacagtacgc caaagagaac 720 ggcactaagc tgctgctgac caacgaccct ctggaggccg ctcacggagg caacgtgctg 780 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180 gctagcaggt taatttttaa aaagcagtca aaagtccaag tggcccttgg cagcatttac 240 tctctctgtt tgctctggtt aataatctca ggagcacaaa cattccagat ccaggttaat 300 ttttaaaaag cagtcaaaag tccaagtggc ccttggcagc atttactctc tctgtttgct 360 ctggttaata atctcaggag cacaaacatt ccagatccgg cgcgccaggg ctggaagcta 420 cctttgacat catttcctct gcgaatgcat gtataatttc tacagaacct attagaaagg 480 atcacccagc ctctgctttt gtacaacttt cccttaaaaa actgccaatt ccactgctgt 540 ttggcccaat agtgagaact ttttcctgct gcctcttggt gcttttgcct atggccccta 600 ttctgcctgc tgaagacact cttgccagca tggacttaaa cccctccagc tctgacaatc 660 ctctttctct tttgttttac atgaagggtc tggcagccaa agcaatcact caaagttcaa 720 accttatcat tttttgcttt gttcctcttg gccttggttt tgtacatcag ctttgaaaat 780 accatcccag ggttaatgct ggggttaatt tataactaag agtgctctag ttttgcaata 840 caggacatgc tataaaaatg gaaagatgtt gctttctgag agacagcttt attgcggtag 900 tttatcacag ttaaattgct aacgcagtca gtgcttctga cacaacagtc tcgaacttaa 960 gctgcagccg ccaccatgct gttcaacctg cgaatcctgc tgaacaacgc cgcttttcgg 1020 aacgggcaca actttatggt gaggaacttt cgctgcggac agcccctcca gaataaggtc 1080 cagctgaagg gcagggacct gctgaccctg aaaaatttca caggggagga aatcaagtat 1140 atgctgtggc tgtcagctga tctgaagttc cggatcaagc agaagggcga atatctgcct 1200 ctgctccagg gcaaaagcct ggggatgatc ttcgaaaagc gcagtactcg gaccagactg 1260 tcaaccgaga ctggattcgc tctgctggga ggacaccctt gttttctgac cactcaggac 1320 attcacctgg gagtgaacga gtccctgacc gacactgctc gcgtcctgag ctctatggcc 1380 gacgctgtgc tggctcgagt ctacaaacag tccgacctgg ataccctggc caaggaagct 1440 tctatcccaa ttattaacgg cctgtcagac ctgtatcacc ccatccagat tctggccgat 1500 tacctgaccc tccaggagca ctattctagt ctgaaagggc tgacactgag ttggattggg 1560 gacggaaaca atatcctgca ctctattatg atgtcagccg ccaagtttgg aatgcacctc 1620 caggctgcaa ccccaaaagg ctacgaaccc gatgcctcag tgacaaagct ggctgaacag 1680 tacgccaaag agaacggcac taagctgctg ctgaccaacg accctctgga ggccgctcac 1740 ggaggcaacg tgctgatcac cgatacctgg attagtatgg gacaggagga agagaagaag 1800 aagcggctcc aggccttcca gggctaccag gtgacaatga aaaccgctaa ggtcgcagcc 1860 agcgattgga cctttctgca ctgcctgccc agaaagcccg aagaggtgga cgacgaggtc 1920 ttctactctc ccagaagcct ggtgtttccc gaagctgaga ataggaagtg gacaattatg 1980 gcagtgatgg tcagcctgct gactgattat tcacctcagc tccagaaacc aaagttctga 2040 taagcggccg ctatttgtga aatttgtgat gctattgctt tatttgtaac cattataagc 2100 tgcaataaac aagttaacaa caacaattgc attcatttta tgtttcaggt tcagggggag 2160 gtgtgggagg ttttttaggc atcgataagg atcttcctag agcatggcta cgtagataag 2220 tagcatggcg ggttaatcat taactacaag gaacccctag tgatggagtt ggccactccc 2280 tctctgcgcg ctcgctcgct cactgaggcc gggcgaccaa aggtcgcccg acgcccgggc 2340 tttgcccggg cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcagcc ttaattaacc taattcactg 2400 gccgtcgttt tacaacgtcg tgactgggaa aaccctggcg ttacccaact taatcgcctt 2460 gcagcacatc cccctttcgc cagctggcgt aatagcgaag aggcccgcac cgatcgccct 2520 tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgaa tgggacgcgc cctgtagcgg cgcattaagc 2580 gcggcgggtg tggtggttac gcgcagcgtg accgctacac ttgccagcgc cctagcgccc 2640 gctcctttcg ctttcttccc ttcctttctc gccacgttcg ccggctttcc ccgtcaagct 2700 ctaaatcggg ggctcccttt agggttccga tttagtgctt tacggcacct cgaccccaaa 2760 aaacttgatt agggtgatgg ttcacgtagt gggccatcgc cctgatagac ggtttttcgc 2820 cctttgacgt tggagtccac gttctttaat agtggactct tgttccaaac tggaacaaca 2880 ctcaacccta tctcggtcta ttcttttgat ttataaggga ttttgccgat ttcggcctat 2940 tggttaaaaa atgagctgat ttaacaaaaa tttaacgcga attttaacaa aatattaacg 3000 cttacaattt aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt 3060 tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat 3120 aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt 3180 ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg 3240 ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga 3300 tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc 3360 tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac 3420 actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg 3480 gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca 3540 acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg 3600 gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg 3660 acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg 3720 gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag 3780 ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg 3840 gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct 3900 cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac 3960 agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact 4020 catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga 4080 tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt 4140 cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct 4200 gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc 4260 taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgttc 4320 ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc 4380 tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg 4440 ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt 4500 cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg 4560 agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg 4620 gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt 4680 atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag 4740 gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt 4800 gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta 4860 ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt 4920 cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc 4980 cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca 5040 acgcaattaa tgtgagttag ctcactcatt aggcacccca ggctttacac tttatgcttc 5100 cggctcgtat gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg 5160 accatgatta cgccagattt aattaaggcc ttaat 5195 <210> 7 <211> 354 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> engineered hOTC <400> 7 Met Leu Phe Asn Leu Arg Ile Leu Leu Asn Asn Ala Ala Phe Arg Asn 1 5 10 15 Gly His Asn Phe Met Val Arg Asn Phe Arg Cys Gly Gln Pro Leu Gln 20 25 30 Asn Lys Val Gln Leu Lys Gly Arg Asp Leu Leu Thr Leu Lys Asn Phe 35 40 45 Thr Gly Glu Glu Ile Lys Tyr Met Leu Trp Leu Ser Ala Asp Leu Lys 50 55 60 Phe Arg Ile Lys Gln Lys Gly Glu Tyr Leu Pro Leu Leu Gln Gly Lys 65 70 75 80 Ser Leu Gly Met Ile Phe Glu Lys Arg Ser Thr Arg Thr Arg Leu Ser 85 90 95 Thr Glu Thr Gly Phe Ala Leu Leu Gly Gly His Pro Cys Phe Leu Thr 100 105 110 Thr Gln Asp Ile His Leu Gly Val Asn Glu Ser Leu Thr Asp Thr Ala 115 120 125 Arg Val Leu Ser Ser Met Ala Asp Ala Val Leu Ala Arg Val Tyr Lys 130 135 140 Gln Ser Asp Leu Asp Thr Leu Ala Lys Glu Ala Ser Ile Pro Ile Ile 145 150 155 160 Asn Gly Leu Ser Asp Leu Tyr His Pro Ile Gln Ile Leu Ala Asp Tyr 165 170 175 Leu Thr Leu Gln Glu His Tyr Ser Ser Leu Lys Gly Leu Thr Leu Ser 180 185 190 Trp Ile Gly Asp Gly Asn Asn Ile Leu His Ser Ile Met Met Ser Ala 195 200 205 Ala Lys Phe Gly Met His Leu Gln Ala Ala Thr Pro Lys Gly Tyr Glu 210 215 220 Pro Asp Ala Ser Val Thr Lys Leu Ala Glu Gln Tyr Ala Lys Glu Asn 225 230 235 240 Gly Thr Lys Leu Leu Leu Thr Asn Asp Pro Leu Glu Ala Ala His Gly 245 250 255 Gly Asn Val Leu Ile Thr Asp Thr Trp Ile Ser Met Gly Gln Glu Glu 260 265 270 Glu Lys Lys Lys Arg Leu Gln Ala Phe Gln Gly Tyr Gln Val Thr Met 275 280 285 Lys Thr Ala Lys Val Ala Ala Ser Asp Trp Thr Phe Leu His Cys Leu 290 295 300 Pro Arg Lys Pro Glu Glu Val Asp Asp Glu Val Phe Tyr Ser Pro Arg 305 310 315 320 Ser Leu Val Phe Pro Glu Ala Glu Asn Arg Lys Trp Thr Ile Met Ala 325 330 335 Val Met Val Ser Leu Leu Thr Asp Tyr Ser Pro Gln Leu Gln Lys Pro 340 345 350 Lys Phe <210> 8 <211> 1065 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> engineered hOTC <400> 8 atgctgttca acctgagaat cctgctgaac aacgccgcct tcagaaacgg ccacaacttc 60 atggtgagaa acttcagatg cggccagccc ctgcagaaca aggtgcagct gaagggcaga 120 gacctgctga ccctgaagaa cttcaccggc gaggagatca agtacatgct gtggctgagc 180 gccgacctga agttcagaat caagcagaag ggcgagtacc tgcccctgct gcagggcaag 240 agcctgggca tgatcttcga gaagagaagc accagaacca gactgagcac cgagaccggc 300 ctggccctgc tgggcggcca cccctgcttc ctgaccaccc aggacatcca cctgggcgtg 360 aacgagagcc tgaccgacac cgccagagtg ctgagcagca tggccgacgc cgtgctggcc 420 agagtgtaca agcagagcga cctggacacc ctggccaagg aggccagcat ccccatcatc 480 aacggcctga gcgacctgta ccaccccatc cagatcctgg ccgactacct gaccctgcag 540 gagcactaca gcagcctgaa gggcctgacc ctgagctgga tcggcgacgg caacaacatc 600 ctgcacagca tcatgatgag cgccgccaag ttcggcatgc acctgcaggc cgccaccccc 660 aagggctacg agcccgacgc cagcgtgacc aagctggccg agcagtacgc caaggagaac 720 ggcaccaagc tgctgctgac caacgacccc ctggaggccg cccacggcgg caacgtgctg 780 atcaccgaca cctggatcag catgggccag gaggaggaga agaagaagag actgcaggcc 840 ttccagggct accaggtgac catgaagacc gccaaggtgg ccgccagcga ctggaccttc 900 ctgcactgcc tgcccagaaa gcccgaggag gtggacgacg aggtgttcta cagccccaga 960 agcctggtgt tccccgaggc cgagaacaga aagtggacca tcatggccgt gatggtgagc 1020 ctgctgaccg actacagccc ccagctgcag aagcccaagt tctga 1065 <210> 9 <211> 1065 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> engineered hOTC <400> 9 atgctgttca acctgcgcat cctgctgaac aacgccgcct tccgcaacgg ccacaacttc 60 atggtgcgca acttccgctg cggccagccc ctgcagaaca aggtgcagct gaagggccgc 120 gacctgctga ccctgaagaa cttcaccggc gaggagatca agtacatgct gtggctgagc 180 gccgacctga agttccgcat caagcagaag ggcgagtacc tgcccctgct gcagggcaag 240 agcctgggca tgatcttcga gaagcgcagc acccgcaccc gcctgagcac cgagaccggc 300 ctggccctgc tgggcggcca cccctgcttc ctgaccaccc aggacatcca cctgggcgtg 360 aacgagagcc tgaccgacac cgcccgcgtg ctgagcagca tggccgacgc cgtgctggcc 420 cgcgtgtaca agcagagcga cctggacacc ctggccaagg aggccagcat ccccatcatc 480 aacggcctga gcgacctgta ccaccccatc cagatcctgg ccgactacct gaccctgcag 540 gagcactaca gcagcctgaa gggcctgacc ctgagctgga tcggcgacgg caacaacatc 600 ctgcacagca tcatgatgag cgccgccaag ttcggcatgc acctgcaggc cgccaccccc 660 aagggctacg agcccgacgc cagcgtgacc aagctggccg agcagtacgc caaggagaac 720 ggcaccaagc tgctgctgac caacgacccc ctggaggccg cccacggcgg caacgtgctg 780 atcaccgaca cctggatcag catgggccag gaggaggaga agaagaagcg cctgcaggcc 840 ttccagggct accaggtgac catgaagacc gccaaggtgg ccgccagcga ctggaccttc 900 ctgcactgcc tgccccgcaa gcccgaggag gtggacgacg aggtgttcta cagcccccgc 960 agcctggtgt tccccgaggc cgagaaccgc aagtggacca tcatggccgt gatggtgagc 1020 ctgctgaccg actacagccc ccagctgcag aagcccaagt tctga 1065 <210> 10 <211> 1068 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> engineered hOTC RNA sequence <400> 10 augcuguuca accugcgaau ccugcugaac aacgccgcuu uucggaacgg gcacaacuuu 60 auggugagga acuuucgcug cggacagccc cuccagaaua agguccagcu gaagggcagg 120 gaccugcuga cccugaaaaa uuucacaggg gaggaaauca aguauaugcu guggcuguca 180 gcugaucuga aguuccggau caagcagaag ggcgaauauc ugccucugcu ccagggcaaa 240 agccugggga ugaucuucga aaagcgcagu acucggacca gacugucaac cgagacugga 300 uucgcucugc ugggaggaca cccuuguuuu cugaccacuc aggacauuca ccugggagug 360 aacgaguccc ugaccgacac ugcucgcguc cugagcucua uggccgacgc ugugcuagcu 420 cgagucuaca aacaguccga ccuggauacc cuggccaagg aagcuucuau cccaauuauu 480 aacggccugu cagaccugua ucaccccauc cagauucugg ccgauuaccu gacccuccag 540 gagcacuauu cuagucugaa agggcugaca cugaguugga uuggggacgg aaacaauauc 600 cugcacucua uuaugauguc agccgccaag uuuggaaugc accuccaggc ugcaacccca 660 aaaggcuacg aacccgaugc cucagugaca aagcuggcug aacaguacgc caaagagaac 720 ggcacuaagc ugcugcugac caacgacccu cuggaggccg cucacggagg caacgugcug 780 aucaccgaua ccuggauuag uaugggacag gaggaagaga agaagaagcg gcuccaggcc 840 uuccagggcu accaggugac aaugaaaacc gcuaaggucg cagccagcga uuggaccuuu 900 cugcacugcc ugcccagaaa gcccgaagag guggacgacg aggucuucua cucucccaga 960 agccuggugu uucccgaagc ugagaauagg aaguggacaa uuauggcagu gauggucagc 1020 cugcugacug auuauucacc ucagcuccag aaaccaaagu ucugauaa 1068 <210> 11 <211> 1068 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> engineered hOTC RNA <400> 11 augcuguuca accugcgaau ccugcugaac aacgccgcuu uucggaacgg gcacaacuuu 60 auggugagga acuuucgcug cggacagccc cuccagaaua agguccagcu gaagggcagg 120 gaccugcuga cccugaaaaa uuucacaggg gaggaaauca aguauaugcu guggcuguca 180 gcugaucuga aguuccggau caagcagaag ggcgaauauc ugccucugcu ccagggcaaa 240 agccugggga ugaucuucga aaagcgcagu acucggacca gacugucaac cgagacugga 300 uucgcucugc ugggaggaca cccuuguuuu cugaccacuc aggacauuca ccugggagug 360 aacgaguccc ugaccgacac ugcucgcguc cugagcucua uggccgacgc ugugcuggcu 420 cgagucuaca aacaguccga ccuggauacc cuggccaagg aagcuucuau cccaauuauu 480 aacggccugu cagaccugua ucaccccauc cagauucugg ccgauuaccu gacccuccag 540 gagcacuauu cuagucugaa agggcugaca cugaguugga uuggggacgg aaacaauauc 600 cugcacucua uuaugauguc agccgccaag uuuggaaugc accuccaggc ugcaacccca 660 aaaggcuacg aacccgaugc cucagugaca aagcuggcug aacaguacgc caaagagaac 720 ggcacuaagc ugcugcugac caacgacccu cuggaggccg cucacggagg caacgugcug 780 aucaccgaua ccuggauuag uaugggacag gaggaagaga agaagaagcg gcuccaggcc 840 uuccagggcu accaggugac aaugaaaacc gcuaaggucg cagccagcga uuggaccuuu 900 cugcacugcc ugcccagaaa gcccgaagag guggacgacg aggucuucua cucucccaga 960 agccuggugu uucccgaagc ugagaauagg aaguggacaa uuauggcagu gauggucagc 1020 cugcugacug auuauucacc ucagcuccag aaaccaaagu ucugauaa 1068 <210> 12 <211> 1065 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> engineered hOTC <400> 12 augcuguuca accugcgcau ccugcugaac aacgccgccu uccgcaacgg ccacaacuuc 60 auggugcgca acuuccgcug cggccagccc cugcagaaca aggugcagcu gaagggccgc 120 gaccugcuga cccugaagaa cuucaccggc gaggagauca aguacaugcu guggcugagc 180 gccgaccuga aguuccgcau caagcagaag ggcgaguacc ugccccugcu gcagggcaag 240 agccugggca ugaucuucga gaagcgcagc acccgcaccc gccugagcac cgagaccggc 300 cuggcccugc ugggcggcca ccccugcuuc cugaccaccc aggacaucca ccugggcgug 360 aacgagagcc ugaccgacac cgcccgcgug cugagcagca uggccgacgc cgugcuggcc 420 cgcguguaca agcagagcga ccuggacacc cuggccaagg aggccagcau ccccaucauc 480 aacggccuga gcgaccugua ccaccccauc cagauccugg ccgacuaccu gacccugcag 540 gagcacuaca gcagccugaa gggccugacc cugagcugga ucggcgacgg caacaacauc 600 cugcacagca ucaugaugag cgccgccaag uucggcaugc accugcaggc cgccaccccc 660 aagggcuacg agcccgacgc cagcgugacc aagcuggccg agcaguacgc caaggagaac 720 ggcaccaagc ugcugcugac caacgacccc cuggaggccg cccacggcgg caacgugcug 780 aucaccgaca ccuggaucag caugggccag gaggaggaga agaagaagcg ccugcaggcc 840 uuccagggcu accaggugac caugaagacc gccaaggugg ccgccagcga cuggaccuuc 900 cugcacugcc ugccccgcaa gcccgaggag guggacgacg agguguucua cagcccccgc 960 agccuggugu uccccgaggc cgagaaccgc aaguggacca ucauggccgu gauggugagc 1020 cugcugaccg acuacagccc ccagcugcag aagcccaagu ucuga 1065 <210> 13 <211> 1065 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> engineered hOTC <400> 13 augcuguuca accugagaau ccugcugaac aacgccgccu ucagaaacgg ccacaacuuc 60 auggugagaa acuucagaug cggccagccc cugcagaaca aggugcagcu gaagggcaga 120 gaccugcuga cccugaagaa cuucaccggc gaggagauca aguacaugcu guggcugagc 180 gccgaccuga aguucagaau caagcagaag ggcgaguacc ugccccugcu gcagggcaag 240 agccugggca ugaucuucga gaagagaagc accagaacca gacugagcac cgagaccggc 300 cuggcccugc ugggcggcca ccccugcuuc cugaccaccc aggacaucca ccugggcgug 360 aacgagagcc ugaccgacac cgccagagug cugagcagca uggccgacgc cgugcuggcc 420 agaguguaca agcagagcga ccuggacacc cuggccaagg aggccagcau ccccaucauc 480 aacggccuga gcgaccugua ccaccccauc cagauccugg ccgacuaccu gacccugcag 540 gagcacuaca gcagccugaa gggccugacc cugagcugga ucggcgacgg caacaacauc 600 cugcacagca ucaugaugag cgccgccaag uucggcaugc accugcaggc cgccaccccc 660 aagggcuacg agcccgacgc cagcgugacc aagcuggccg agcaguacgc caaggagaac 720 ggcaccaagc ugcugcugac caacgacccc cuggaggccg cccacggcgg caacgugcug 780 aucaccgaca ccuggaucag caugggccag gaggaggaga agaagaagag acugcaggcc 840 uuccagggcu accaggugac caugaagacc gccaaggugg ccgccagcga cuggaccuuc 900 cugcacugcc ugcccagaaa gcccgaggag guggacgacg agguguucua cagccccaga 960 agccuggugu uccccgaggc cgagaacaga aaguggacca ucauggccgu gauggugagc 1020 cugcugaccg acuacagccc ccagcugcag aagcccaagu ucuga 1065 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR forward primer <400> 14 aaactgccaa ttccactgct g 21 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> PCR reverse primer <400> 15 ccataggcaa aagcaccaag a 21 <210> 16 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 16 ttggcccaat agtgagaact ttttcctgc 29

Claims (26)

  1. 인간 오르니틴 트랜스카르바밀라아제 (hOTC) 단백질을 코딩하는 핵산 서열(hOTC 핵산 서열) 및 간 세포에서의 hOTC의 발현을 지시하는 발현 제어 서열을 포함하는 재조합 바이러스 벡터로서, 상기 hOTC 핵산 서열은 성숙 서열 또는 전장 hOTC 단백질을 암호화하고, 기능성 hOTC를 발현하며, 상기 hOTC 핵산 서열은 서열 번호 3, 4, 또는 5의 뉴클레오타이드 97 내지 1068을 포함하는 핵산 서열로부터 선택되거나 상기 hOTC 핵산 서열은 서열 번호 3, 4, 또는 5의 뉴클레오타이드 1 내지 1068을 포함하는, 재조합 바이러스 벡터.
  2. 제1 항에 있어서, hOTC 핵산 서열은 서열 번호 5의 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 바이러스 벡터.
  3. 제1 항에 있어서, hOTC 핵산 서열은 서열 번호 4 또는 서열 번호 3의 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 재조합 바이러스 벡터.
  4. 제1 항에 있어서, hOTC 단백질은 키메라 OTC이고, hOTC 핵산 서열은 서열 번호 5의 천연 운송 서열에 대하여 치환된 이종성 운송 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 바이러스 벡터.
  5. 제1 항에 있어서, 바이러스 벡터는 아데노-부속 바이러스 (AAV) 벡터, 아데노바이러스 벡터, 또는 렌티바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 재조합 바이러스 벡터.
  6. 제1 항에 있어서, 발현 제어 서열은 간-특이적 프로모터를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 바이러스 벡터.
  7. 제6 항에 있어서, 간 특이적 프로모터는 티록신-결합 글로불린 (TBG) 프로모터인 것을 특징으로 하는 재조합 바이러스 벡터.
  8. 제1 항에 있어서, 발현 카세트는 인트론, 코작 서열, 폴리A, 및 전사 후 조절 요소 중 1가지 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 바이러스 벡터.
  9. 제1 항에 있어서, 재조합 바이러스 벡터는 적어도 하나의 ITR 서열 및 hOTC를 암호화하는 핵산을 포함하는 핵산 서열이 내부에 패키징된 AAV 캡시드를 포함하는 재조합 AAV 벡터인 것을 특징으로 하는 재조합 바이러스 벡터.
  10. 제9 항에 있어서, AAV 캡시드는 AAV8, AAV9 또는 AAVrh10인 것을 특징으로 하는 재조합 바이러스 벡터.
  11. AAV 캡시드 및 내부에 패키징된, 적어도 하나의 AAV ITR 서열, 인간 오르니틴 트랜스카르바밀라아제 (hOTC) 단백질을 암호화하는 엔지니어링된 핵산 서열(hOTC 핵산 서열), 및 간 세포에서 hOTC의 발현을 지시하는 발현 제어 서열을 포함하는 발현 카세트를 갖는 재조합 아데노-부속 바이러스 (rAAV)로서, 상기 발현 제어 서열은 간-특이적 프로모터를 포함하며, 상기 hOTC 핵산 서열은 서열 번호 3, 4, 또는 5의 뉴클레오타이드 97 내지 1068을 포함하는 핵산 서열이거나, 또는 상기 hOTC 핵산 서열은 서열 번호 3, 4, 또는 5의 뉴클레오타이드 1 내지 1068을 포함하는 핵산 서열인, 재조합 아데노-부속 바이러스 (rAAV).
  12. 제11 항에 있어서, hOTC 핵산 서열은 서열 번호 5의 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 rAAV.
  13. 제11 항에 있어서, AAV 캡시드는 AAV8, AAV9, 또는 AAVrh10인 것을 특징으로 하는 rAAV.
  14. 제13 항에 있어서, 발현 카세트는 5' AAV ITR 서열 및 3' ITR 서열을 추가로 포함하거나 또는 적어도 하나의 AAV ITR 서열은 D-서열 및 말단 분해 부위가 결실된 5' ITR을 포함하거나 또는 5' AAV ITR 서열 및 3' ITR은 AAV2 유래의 것임을 특징으로 하는 rAAV.
  15. 제11 항에 있어서, hOTC를 암호화하는 엔지니어링된 핵산은 서열 번호 3 또는 서열 번호 4의 코딩 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 rAAV.
  16. 제11 항에 있어서, rAAV는 AAV 8 캡시드 및 내부에 패키징된, AAV2 3' ITR 서열, D-서열 및 말단 분해 부위가 결실된 AAV2 5' ITR, 티록신-결합 글로불린 (TBG) 프로모터, 서열 번호 5의 핵산 서열, 및 SV40 폴리A를 포함하는 핵산 서열을 갖는 자가-상보성 AAV인 것을 특징으로 하는 rAAV.
  17. 이종성 운송 서열과 함께 적어도 성숙한 hOTC를 포함하는 키메라 오르니틴 트랜스카르바밀라아제 단백질을 암호화하는 hOTC 유전자를 포함하는 바이러스 벡터로서, 성숙 인간 오르니틴 트랜스카르바밀라아제를 암호화하는 핵산 서열은 서열 번호 3, 4, 또는 5의 뉴클레오타이드 97 내지 1068을 포함하는 핵산 서열로부터 선택된, 바이러스 벡터.
  18. 제17 항에 있어서, 핵산 서열은 서열 번호 5의 뉴클레오타이드 97 내지 1068을 포함하는 성숙 hOTC를 암호화하는 것을 특징으로 하는 바이러스 벡터.
  19. 담체, 및 제1 항 내지 제10 항 중 어느 한 항의 재조합 바이러스 벡터, 제11 항 내지 제16 항 중 어느 한 항의 rAAV, 또는 제17항 또는 제18 항 중 어느 한 항의 바이러스 벡터의 유효량을 포함하는, 인간 환자에서 오르니틴 트랜스카르바밀라아제 결핍증 (OTCD) 치료용 약학적 조성물.
  20. AAV2 3' ITR, D-서열 및 말단 분해 부위(terminal resolution site; trs)가 결실된 AAV2 5' ITR, 티록신-결합 글로불린 (TBG) 프로모터 서열, 서열 번호 5의 핵산 서열, 및 SV40 폴리A 서열을 포함하는 벡터 게놈을 포함하는 플라스미드.
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KR1020167027891A 2014-03-09 2015-03-09 오르니틴 트랜스카르바밀라아제（ｏｔｃ） 결핍증의 치료에 유용한 조성물 Active KR102390075B1 (ko)

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