ES2821938T3 - Composiciones útiles en el tratamiento de la deficiencia de ornitina transcarbamilasa (OTC) - Google Patents

Abstract

Un vector vírico recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína ornitina transcarbamilasa humana (hOTC) y secuencias de control de la expresión que dirigen la expresión de hOTC en una célula hepática, en donde la secuencia de ácido nucleico de hOTC es menos de 80 % idéntica a la secuencia de hOTC de tipo silvestre de la SEQ ID NO: 1 que codifica la proteína hOTC madura o de longitud completa y expresa una hOTC funcional, en donde dicha secuencia de ácido nucleico de hOTC se selecciona de la secuencia de ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 5 o una secuencia de ácido nucleico al menos de 96 % a aproximadamente 99 % idéntica a la misma.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones útiles en el tratamiento de la deficiencia de ornitina transcarbamilasa (OTC)

Declaración con respecto a la investigación o desarrollo con fondos federales

Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud, n.° P01-HD057247, P01-HL059407 y P30-DK047757. El gobierno de los Estados Unidos puede tener determinados derechos sobre la presente invención.

Antecedentes de la invención

La deficiencia de ornitina transcarbamilasa (OTC) representa casi la mitad de todos los casos de errores innatos de síntesis de urea, con una prevalencia estimada en al menos 1 de cada 15.000. Los defectos del ciclo de la urea ponen a los pacientes en riesgo de una elevación del amoníaco potencialmente mortal que puede conducir a deterioro cognitivo irreversible, coma y muerte. Los varones recién nacidos con deficiencia completa desarrollan coma hiperamonémico en los primeros 3 días de vida, que, si no se trata, es letal.

Las terapias actuales para la deficiencia de OTC (OTCD) tienen numerosos desafíos. Los pacientes pueden tratarse con una dieta baja en proteínas en combinación con el uso de medicamentos que activan rutas alternativas de eliminación de nitrógeno, pero esto no evita las crisis hiperamonémicas. A pesar del uso de diálisis y terapia de ruta alternativa, hay una tasa de mortalidad de casi 50 % en los recién nacidos. El trasplante de hígado puede curar la OTCD, pero el hígado del donante es limitante, el procedimiento conlleva una morbilidad significativa y son necesarios fármacos inmunosupresores durante toda la vida del sujeto.

La terapia génica de una enfermedad metabólica tal como la OTCD presenta un modelo más difícil para la terapia de reemplazo génico que otras afecciones. Debido a que el gen actúa de manera autónoma celular (es decir, solo puede influir en la célula en la que se expresa), los efectos terapéuticos deberían estar directamente relacionados con el número de células diana que se transducen, en lugar de con el nivel neto de expresión en el hígado, tal como con una proteína secretada donde una alta expresión por célula puede superar la baja transducción. Asimismo, ha habido al menos un informe publicado de que el ARNm de hOTCts es inestable. [Wang, L., et al., Molecular Genetics and Metabolism, 105 (2012) 203-211 ].

Se han publicado informes sobre el uso de vectores víricos para intentar tratar la deficiencia de OTC. Por ejemplo, varios grupos han intentado esto en modelos murinos de deficiencia de OTC, utilizando adenovirus recombinantes portadores de ADNc de OTC de rata, ratón o ser humano. Por ejemplo, Wang, L. et al. (Mol Genet Metab. febrero de 2012; 105 (2): 203-211) muestra que una evaluación preclínica de un vector AAV8 candidato clínico para la deficiencia de ornitina transcarbamilasa (OTC) revela una enzima funcional de cada genoma de vector persistente. Wang, L. et al. (Molecular Therapy, vol. 20, n.° supl. 1, S56) proporciona una terapia génica neonatal para la deficiencia de OTC. Se han informado de cierta cantidad de reconstitución exitosa de la actividad OTC hepática y corrección de alteraciones metabólicas en modelos animales con virus que portan ADNc de OTC de rata o ratón. Estudios previos utilizando vectores adenovíricos han ilustrado las dificultades de expresar niveles suficientes de OTC humana activa en ratones con OTCD.

Por lo tanto, existe la necesidad de otros enfoques para la terapia de OTCD.

Sumario de la invención

En un aspecto, la invención proporciona un vector vírico recombinante que comprende un casete de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la ornitina transcarbamilasa humana (hOTC) y secuencias de control de la expresión que dirigen la expresión de hOTC en una célula hepática, en donde la secuencia de ácido nucleico de hOTC es menos del 80 % idéntica a la secuencia de hOTC de tipo silvestre sobre la secuencia madura o hOTC de longitud completa de la SEQ ID NO: 1 y expresa una hOTC funcional, en donde dicha secuencia de ácido nucleico de hOTC se selecciona de la secuencia de ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 5 o una secuencia de ácido nucleico al menos de aproximadamente 96 a aproximadamente 99 % idéntica a la misma.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un virus adenoasociado recombinante (rAAV) que tiene una cápside de AAV y empaquetado en el mismo un casete de expresión que comprende al menos una secuencia de repetición terminal invertida (ITR) de AAV, una secuencia de ácido nucleico modificada por ingeniería genética que codifica al menos la ornitina transcarbamilasa humana madura (hOTC) y secuencias de control de la expresión que dirigen la expresión de la hOTC en una célula hepática, comprendiendo dichas secuencias de control de la expresión un promotor específico del hígado, en donde la secuencia de ácido nucleico de hOTC es menos del 80 % idéntica a la secuencia de hOTC de tipo silvestre sobre al menos la hOTC madura de la SEQ ID NO: 1 y comprende al menos la hOTC madura de la s Eq ID NO: 5 o una secuencia de ácido nucleico al menos de aproximadamente 96 a aproximadamente 99,9 % idéntica a la misma.

En un aspecto, la divulgación proporciona un vector vírico recombinante que tiene un casete de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico modificada por ingeniería genética que codifica la ornitina transcarbamilasa humana (hOTCasa) y secuencias de control de la expresión que dirigen la expresión de hOTC en una célula hepática, en donde la secuencia de ácido nucleico de hOTC es menos del 80 % idéntica a la secuencia de hOTC de tipo silvestre sobre la hOTC de longitud completa de la secuencia de tipo silvestre (p. ej., SEQ ID NO: 1) o un fragmento de la misma que comprende la hOTC madura pero que carece de al menos la secuencia líder nativa, u otro intermedio que comprende al menos la hOTC madura) y expresa una hOTCasa funcional. Convenientemente, se han optimizado los codones de la secuencia modificada por ingeniería genética y esta se ha mejorado adicionalmente de modo que mejore al menos una de transducción, transcripción y/o traducción de la enzima.

La secuencia de ácido nucleico puede comprender la hOTC madura de la SEQ ID NO: 5, o una secuencia de ácido nucleico al menos de aproximadamente 96 a aproximadamente 99 % idéntica a la misma, o una secuencia de ácido nucleico que comprende al menos la hOTC madura de la SEQ ID NO: 9, o una secuencia de ácido nucleico al menos de aproximadamente 96 a aproximadamente 99 % idéntica a la misma, que expresa una hOTC funcional. En una divulgación, la hOTC es la longitud completa de la SEQ ID NO: 5 o una secuencia de ácido nucleico al menos de aproximadamente 96 a aproximadamente 99 % idéntica a la misma o una secuencia de ácido nucleico de la longitud completa de la SEQ ID NO: 9, o una secuencia de ácido nucleico al menos de aproximadamente 96 a aproximadamente 99 % idéntica a la misma. La secuencia de hOTC puede ser la de los nucleótidos correspondientes de las SEQ ID NO: 3, 4, 8 o 9. Se incluyen dentro del alcance de la invención las cadenas complementarias a las del listado de secuencias. El vector vírico puede seleccionarse de un vector de virus adenoasociado (AAV), un vector adenovírico y un vector lentivírico.

En un aspecto adicional, la divulgación proporciona un virus adenoasociado recombinante (rAAV) que tiene una cápside de AAV y empaquetado en el mismo un casete de expresión que comprende al menos una secuencia de repetición terminal invertida (ITR) de AAV, una secuencia de ácido nucleico modificada por ingeniería genética que codifica la ornitina transcarbamilasa humana (hOTCasa) y secuencias de control de la expresión que dirigen la expresión de la hOTC en una célula hepática, comprendiendo dichas secuencias de control de la expresión un promotor específico del hígado. La secuencia de ácido nucleico de hOTC modificada por ingeniería genética es menos del 80 % idéntica a la secuencia de hOTC de tipo silvestre sobre la secuencia madura o hOTC de longitud completa de la secuencia de tipo silvestre (p. ej., SEQ ID NO: 1) y expresa una hOTCasa funcional. La secuencia de ácido nucleico de hOTC sintética comprende al menos la hOTC madura de la SEQ ID NO: 5 o una secuencia de ácido nucleico al menos de aproximadamente 96 a aproximadamente 99,9 % idéntica a la misma o una secuencia de ácido nucleico que comprende al menos la hOTC madura de la SEQ ID NO: 9 o una secuencia de ácido nucleico al menos de aproximadamente 96 a aproximadamente 99,9 % idéntica a la misma.

En otro aspecto adicional más, la invención proporciona un vector vírico que comprende al menos un gen de hOTC que codifica una ornitina transcarbamilasa quimérica que comprende al menos ornitina transcarbamilasa humana madura con un péptido de tránsito heterólogo, en donde la secuencia codificante de la ornitina transcarbamilasa humana madura es la secuencia de ácido nucleico de las SEQ ID NO: 3, 4 o 5. Opcionalmente, pueden seleccionarse las secuencias de longitud completa de cualquiera de estas secuencias, que incluyen la secuencia de tránsito. Como alternativa, pueden seleccionarse un gen de OTC quimérico que incluye una secuencia de tránsito heteróloga, como se describe en el presente documento, y estas hOTC maduras.

En otro aspecto, una composición farmacéutica que comprende un vehículo y una cantidad eficaz de un vector, se proporciona el rAAV y/o el vector vírico de la invención.

Otro aspecto más es un vector vírico como se describe en el presente documento usado en la preparación de un medicamento para administrar ornitina transcarbamilasa a un sujeto que lo necesite y/o para tratar la deficiencia de ornitina transcarbamilasa. En una realización particularmente deseable, el sujeto es un sujeto humano. El sujeto puede ser homocigoto o heterocigoto para la deficiencia de ornitina transcarbamilasa.

En otro aspecto más, se proporciona el uso de un vector vírico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la ornitina transcarbamilasa humana funcional para prevenir y/o tratar la fibrosis o la cirrosis relacionada con la deficiencia de ornitina transcarbamilasa (OTCD) en un sujeto con OTCD. En una realización, el sujeto es un paciente humano. En una realización adicional, el sujeto es heterocigoto y puede presentar síntomas de inicio tardío.

En un aspecto adicional más, se proporciona el uso de un vector vírico que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la ornitina transcarbamilasa humana funcional para prevenir y/o tratar el carcinoma hepatocelular en un sujeto que tiene OTCD. En una realización, el sujeto es un paciente humano. En una realización adicional, el sujeto es heterocigoto para OTCD y puede presentar síntomas de inicio tardío.

Otros aspectos y ventajas de la invención resultarán fácilmente evidentes a partir de la siguiente descripción detallada de la invención.

Breve descripción de los dibujos

La fig. 1A proporciona un ADNc de hOTC de tipo silvestre, que tiene 324 A, 223 C, 246 G y 269 T [SEQ ID NO: 1].

La fig. 1B - 1C proporciona la secuencia de ornitina transcarbamilasa humana codificada por la secuencia de la fig.

1A [SEQ ID NO: 2].

La fig. 2 proporciona un ADNc de hOTC modificado por ingeniería genética, con una proporción de CG alterada. El recuento de bases en la secuencia es de 283 A, 285 C, 284 G y 216 T [s Eq ID NO: 3].

La fig. 3 proporciona un ADNc de hOTC modificado por ingeniería genética denominado LW3 que comprende la secuencia de ácido nucleico expuesta en la SEQ ID NO: 4 que codifica una proteína hOTC. El recuento de bases en esta secuencia es de 279 A, 303 C, 288 G y 220 T. El codón de inicio para el marco de lectura abierto (ORF) de hOTC está precedido por una secuencia de Kozak en esta figura. La secuencia codificante del líder comienza en el nucleótido 15 (primeros 96 nucleótidos), seguido de la secuencia codificante de la hOTCasa de 322 aminoácidos. En esta figura, el codón de terminación va seguido de un sitio de restricción NotI (GCGGCCGC) que es un remanente del vector.

La fig. 4 proporciona un ADNc de hOTC modificado por ingeniería genética denominado LW4 que comprende la secuencia de ácido nucleico expuesta en la SEQ ID NO: 5 que codifica una proteína hOTC. El recuento de bases en esta secuencia es de 278 A, 303 C, 289 G y 220 T. La secuencia codificante del líder comienza en el nucleótido 15 (primeros 96 nucleótidos), seguido de la secuencia codificante de la hOTCasa de 322 aminoácidos. En esta figura, el codón de terminación va seguido de un sitio de restricción NotI (GCGGCCGC) que es un remanente del vector.

Las fig. 5A - 5C proporcionan una alineación de las secuencias de ADNc de la hOTC de tipo silvestre y cinco secuencias modificadas por ingeniería genética: GS (que comprende la secuencia de ácido nucleico expuesta en la SEQ ID NO: 3), LW3 (que comprende la secuencia de ácido nucleico expuesta en la SEQ ID NO: 4), LW4 (que comprende la secuencia de ácido nucleico expuesta en la SEQ ID NO: 5), LW5 (que comprende la secuencia de ácido nucleico expuesta en la SEQ ID NO: 8) y LW6 (que comprende la secuencia de ácido nucleico expuesta en la SEQ ID NO: 9), cada una de las cuales codifica una proteína hOTC. Las secuencias alineadas contienen una secuencia Kozak (primeros 14 nucleótidos de LW3 y LW4) y un sitio de enzima de restricción (después del codón de terminación para LW3 y LW4), que no forman parte del marco abierto de lectura.

Descripción detallada de la invención

En el presente documento se proporciona un ADNc de ornitina transcarbamilasa (OTC) humana (h) modificado por ingeniería genética, que se diseñó para maximizar la traducción y mejorar la estabilidad del ARNm en comparación con el ADN y/o ARNm de hOTC de tipo silvestre. También se proporcionan en el presente documento secuencias de ARNm de hOTC modificadas por ingeniería genética. Estas composiciones pueden utilizarse en métodos terapéuticos y/o profilácticos como se describe en el presente documento. Opcionalmente, estas composiciones se utilizan en combinación con otras terapias acordes con el tratamiento de referencia para las afecciones para las que se ha diagnosticado al sujeto (p. ej., un sujeto humano).

Con fines de comparación, se ilustra una secuencia de ADNc de OTC humana de tipo silvestre en la fig. 1A. Esta secuencia codifica la ornitina transcarbamilasa humana de la secuencia de aminoácidos de las fig. 1A - 1C. Esta misma secuencia de aminoácidos está codificada por los genes hOTC modificados por ingeniería genética de las fig. 2A - fig.

5. La enzima hOTC, que puede denominarse hOTCasa para distinguirla del gen, se expresa a partir de esta secuencia en forma de una preproteína que tiene un péptido líder de 32 aminoácidos en su extremo N (codificado por nt 1 -96 de la fig. 1, aproximadamente los aminoácidos 1 a aproximadamente 32 de la SEQ ID NO: 2) que se escinde después de dirigir la enzima a la mitocondria celular, dejando la proteína "madura" de 322 restos de aminoácidos (de aproximadamente el aminoácido 33 a aproximadamente el aminoácido 354 de la SEQ ID NO: 2. Esta hOTCasa "denominada madura" es una proteína homotrimérica con una secuencia de 322 restos de aminoácidos en cada cadena polipeptídica. Opcionalmente, como alternativa a la secuencia de tipo silvestre de la SEQ ID NO: 2, se puede seleccionar una secuencia que incluya una o más de las posiciones polimórficas de origen natural que no están implicadas en la enfermedad: F101, L111, WI193-194 de la SEQ ID NO: 2 (véase, p. ej., http://www.uniprot.org/uniprot/P00480).

Aunque todas las secuencias de ADNc modificadas por ingeniería genética son de aproximadamente 77 % a aproximadamente 78 % idénticas a la secuencia de ácido nucleico de hOTC ts de la fig. 1A [SEQ ID NO: 1], existen diferencias estructurales entre estas secuencias (véase alineación en la fig. 5 que las ilustra). En particular, existe aproximadamente 4 % de diferencia en las secuencias de ácido nucleico entre hOTCco de la fig. 2 [SEQ ID NO: 3] y la hOTCcoLW4 de la fig. 4 [SEQ ID NO: 5]. Existe una diferencia de solo un nt entre LW-3 [fig. 3, SeQ ID NO: 4] y lW-4 [fig. 4, SEQ ID NO: 5], es decir, 0,094 % (1/1062) de diferencia (una A en LW-3 se cambia a una G en LW-4 como se muestra en la fig. 5].

En una realización, se proporciona una secuencia codificante de hOTC modificada cuya secuencia tiene menos de aproximadamente 80 % de identidad, preferentemente aproximadamente 77 % de identidad o menos con la secuencia codificante de hOTC de tipo silvestre de longitud completa (fig. 1A, SEQ ID NO: 1), que codifica hOTC funcional. En una realización, la secuencia codificante de hOTC modificada se caracteriza por una mejor estabilidad en comparación con hOTC ts después de la administración mediada por AAV (p. ej., rAAV). Adicionalmente o como alternativa, se proporciona una secuencia codificante de hOTC modificada que carece de marcos de lectura alternativos para proteínas de al menos aproximadamente 9 aminoácidos de longitud. Adicionalmente, o como alternativa, se proporciona una secuencia codificante de hOTC modificada que tiene niveles de expresión de hOTCasa al menos aproximadamente 25 veces, al menos aproximadamente 50 veces o al menos aproximadamente 100 veces cuando se miden después de la expresión de un vector vírico, en comparación con el tipo silvestre de hOTCasa. Adicionalmente, o como alternativa, se proporciona una secuencia codificante de hOTC modificada que tiene actividad hepática de hOTCasa que es al menos aproximadamente 10 veces mayor, al menos aproximadamente 20 veces mayor o al menos aproximadamente 30 veces mayor en comparación con el tipo silvestre de hOTCasa expresada a partir de un vector vírico.

En una realización, una secuencia codificante de hOTC modificada es de 96 % a 99,9 % idéntica a la secuencia que codifica la enzima madura (de aproximadamente nt 99 a aproximadamente 1068) o la longitud completa de la fig. 4 (hOTCco-LW4, SEQ ID NO: 5) o de 96,5 % a 99 % idéntica, o aproximadamente 97 % o aproximadamente 98 % idéntica a la s Eq ID NO: 5 (fig. 4).

En una realización, una secuencia codificante de hOTC modificada es de 96 % a 99,9 % idéntica a la secuencia que codifica la enzima madura (de aproximadamente nt 99 a aproximadamente 1068) de la fig. 3 (hOTCco-LW3, SEQ ID NO: 4) o de 96,5 % a 99 % idéntica, o aproximadamente 97 % o aproximadamente 98 % idéntica a la SEQ ID NO: 4 (fig. 3).

En otra realización, una secuencia codificante de hOTC modificada es de 96 % a 99,9 % idéntica a la secuencia que codifica la enzima madura (de aproximadamente nt 99 a aproximadamente 1068) o la longitud completa de la fig. 2 (hOTCco, SEQ ID NO: 3), o de 96,5 % a 99 % idéntica, o aproximadamente 97 % o 98 % idéntico a la SEQ ID NO: 3 (fig. 2).

En otra divulgación más, una secuencia codificante de hOTC modificada tiene la secuencia que codifica la proteína madura (de aproximadamente nt 99 a aproximadamente 1068) o la longitud completa de hOTCco-LW5 [SEQ ID NO: 8] o hOTCco-LW6 [SEQ ID NO: 9], o una secuencia de 96 % a 99,9 % idéntica a la misma. hOTCco-LW5 y hOTCco-LW6 son aproximadamente 97 % idénticas entre sí y cada una es aproximadamente 78 % idéntica a la secuencia de tipo silvestre [SEQ ID NO: 1].

Las secuencias de las fig. 2-5 se proporcionan como la hebra con sentido de las secuencias de ADNc. La presente divulgación también abarca las hebras antisentido correspondientes a estas secuencias de ADNc y las secuencias de ARN, p. ej., ARNm, correspondientes. Por ejemplo, el ARNm modificado por ingeniería genética de la SEQ ID NO: 10, corresponde al ADN de la SEQ ID NO: 4; el ARN modificado por ingeniería genética de la SEQ ID NO: 11, corresponde al Ad N de la SEQ ID NO: 5; el ARN modificado por ingeniería genética de la SEQ ID NO: 12, corresponde al ADN de la SEQ ID NO: 8; y el ARN de la SEQ ID NO: 13 corresponde al ADN de la SEQ ID NO: 9. Estas secuencias de ARN, y secuencias que son de 95 % a 99 %, o aproximadamente 97 % o aproximadamente 98 % idénticas a una o más de estas secuencias, están abarcadas dentro del alcance de la presente divulgación. Se conocen en la técnica métodos para alinear y determinar la identidad del ARN y estos incluyen bases de datos y servicios publicados y disponibles públicamente basados en la web o disponibles comercialmente. Véase, p. ej., LocARNA, CARNA, así como otros programas identificados en otras partes de los mismos.

En una realización de la divulgación, la secuencia de ARNm se puede administrar usando un sistema de administración de ARN seleccionado, ejemplos del cual se proporcionan en el presente documento.

También están abarcados en el presente documento fragmentos, p. ej., las secuencias que codifican el péptido de tránsito (aminoácidos 1 a aproximadamente 32), aproximadamente los aminoácidos 332 a aproximadamente 354, una enzima hOTC intermedia, o la enzima madura, u otros fragmentos según se desee. Puede hacerse referencia a la SEQ ID NO: 2. Véase, p. ej., Ye et al. 2001, Hum Gene Ther 12: 1035-1046.

En otra realización, se proporciona una OTC quimérica en el que la presecuencia N-terminal de OTC de tipo silvestre se reemplaza con una secuencia de tránsito de otra fuente que es compatible con el sistema del sujeto de manera que transporte eficazmente la hOTCasa madura codificada por el gen de OTC quimérico al orgánulo deseado. Véase, p. ej., Ye et al. 2001, Hum Gene Ther 12: 1035-1046. Dichas secuencias de tránsito codifican un péptido de tránsito (también denominado péptido señal, señal de direccionamiento o señal de localización) que se fusiona con la secuencia codificante de la hOTC madura de las SEQ ID NO: 1,3, 4 y/o 59. Por ejemplo, la secuencia de tránsito de hOTC de tipo silvestre corresponde a aproximadamente los primeros 98 nucleótidos de la SEQ ID NO: 1. Para construir una OTC quimérica, estas secuencias N-terminales de tipo silvestre pueden eliminarse (de aproximadamente ácidos nucleicos 1 a aproximadamente nt 96 - nt 98) y reemplazarse con una secuencia de tránsito heteróloga. Los péptidos de tránsito adecuados son, preferentemente, aunque no necesariamente, de origen humano. Los péptidos de tránsito adecuados pueden elegirse de http://proline.bic.nus.edu./spdb/zhang270.htm o pueden determinarse usando diversos programas informáticos para determinar el péptido de tránsito en una proteína seleccionada. Aunque sin limitación, dichas secuencias pueden tener de aproximadamente 15 a aproximadamente 50 aminoácidos de longitud o de aproximadamente 20 a aproximadamente 28 aminoácidos de longitud, o pueden ser mayores o menores según sea necesario.

La expresión "porcentaje (%) de identidad", "identidad de secuencia", "porcentaje de identidad de secuencia" o "porcentaje idéntico" en el contexto de las secuencias de ácido nucleico se refiere a los restos en las dos secuencias que son iguales cuando se alinean por correspondencia. La longitud de la comparación de identidad de secuencias puede abarcar la longitud completa del genoma, la longitud completa de una secuencia que codifica un gen o se desea un fragmento de al menos aproximadamente 500 a 5000 nucleótidos. Sin embargo, también se puede desear identidad entre fragmentos más pequeños, p. ej., de al menos aproximadamente nueve nucleótidos, habitualmente al menos de aproximadamente 20 a 24 nucleótidos, al menos de aproximadamente 28 a 32 nucleótidos, al menos aproximadamente 36 o más nucleótidos.

El porcentaje de identidad se puede determinar fácilmente para las secuencias de aminoácidos sobre la longitud completa de una proteína, un polipéptido, aproximadamente 32 aminoácidos, aproximadamente 330 aminoácidos o un fragmento peptídico de los mismos o las correspondientes secuencias codificantes de secuencias de ácido nucleico. Un fragmento de aminoácido adecuado puede tener al menos aproximadamente 8 aminoácidos de longitud y puede tener hasta aproximadamente 700 aminoácidos. En general, al hacer referencia a "identidad", "homología" o "similitud" entre dos secuencias diferentes, la "identidad", "homología" o "similitud" se determina con referencia a secuencias "alineadas". Las secuencias "alineadas" o "alineaciones" se refieren a múltiples secuencias de ácidos nucleicos o secuencias de proteínas (aminoácidos), que contienen con frecuencia correcciones para bases o aminoácidos ausentes o adicionales en comparación con una secuencia de referencia.

Las alineaciones se realizan utilizando cualquiera de diversos programas de alineación de múltiples secuencias disponibles pública o comercialmente. Están disponibles programas de alineación de secuencias para secuencias de aminoácidos, p. ej., los programas "Clustal X", "MAP", "PIMA", "MSA", "BLOCKMAKER", "MEME" y "Match-Box". En general, cualquiera de estos programas se utiliza con la configuración predeterminada, aunque un experto en la técnica puede modificar esta configuración según sea necesario. Como alternativa, un experto en la materia puede utilizar otro algoritmo o programa informático que proporcione al menos el nivel de identidad o alineación que proporcionan los algoritmos y programas a los que se ha hecho referencia. Véase, p. ej., J. D. Thomson et al., Nucl. Acids. Res., "A comprehensive comparison of multiple sequence alignments", 27 (13): 2682-2690 (1999).

También están disponibles múltiples programas de alineación de secuencias para secuencias de ácidos nucleicos. Los ejemplos de dichos programas incluyen, "Clustal W", "CAP Sequence Assembly", "BLAST", "MAP" y "MEME", a los que se puede acceder a través de servidores web en Internet. Los expertos en la técnica conocen otras fuentes para dichos programas. Como alternativa, también se utilizan las utilidades Vector NTI. También hay varios algoritmos conocidos en la técnica que pueden utilizarse para medir la identidad de secuencias de nucleótidos, incluyendo los contenidos en los programas descritos anteriormente. Como ejemplo adicional, se pueden comparar secuencias de polinucleótidos utilizando Fasta™, un programa en GCG Versión 6.1. Fasta™ proporciona alineaciones y un porcentaje de identidad de secuencia de las regiones de mejor solapamiento entre las secuencias de consulta y búsqueda. Por ejemplo, el porcentaje de identidad de secuencia entre secuencias de ácido nucleico se puede determinar utilizando Fasta™ con sus parámetros predeterminados (un tamaño de palabra de 6 y el factor NOPAM para la matriz de puntuación) como se proporciona en GCG Versión 6.1.

En una realización, los genes de hOTC modificados descritos en el presente documento se modifican por ingeniería genética en un elemento genético adecuado (vector) útil para generar vectores víricos y para su administración a una célula hospedadora, que transfiere las secuencias de hOTC portadas en el mismo. El vector seleccionado puede administrarse mediante cualquier método adecuado, incluyendo transfección, electroporación, suministro en liposomas, técnicas de fusión de membranas, microgránulos recubiertos con ADN de alta velocidad, infección vírica o fusión de protoplastos. Los métodos utilizados para crear dichas construcciones son conocidos por los expertos en la manipulación de ácido nucleico e incluyen ingeniería genética, ingeniería recombinante y técnicas sintéticas. Véase, p. ej., Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY.

Como se usa en el presente documento, un "casete de expresión" se refiere a una molécula de ácido nucleico que comprende las secuencias de hOTC, promotor y puede incluir otras secuencias reguladoras para el mismo, pudiendo dicho casete empaquetarse en la cápside de un vector vírico (p. ej., una partícula vírica). Normalmente, dicho casete de expresión para generar un vector vírico contiene las secuencias de hOTC descritas en el presente documento flanqueadas por señales de empaquetamiento del genoma vírico y otras secuencias de control de la expresión tales como las descritas en el presente documento. Por ejemplo, para un vector vírico de AAV, las señales de empaquetamiento son la repetición terminal invertida 5' (ITR) y la iTr 3'.

En una realización, las secuencias de ITR de AAV2, o la versión suprimida de las mismas (AITR), se utilizan por conveniencia y para acelerar la aprobación reguladora. Sin embargo, pueden seleccionarse ITR de otras fuentes de AAV adecuadas. Cuando la fuente de las ITR sea de AAV2 y la cápside de AAV sea de otra fuente de AAV, el vector resultante puede denominarse pseudotipificado.

Normalmente, un casete de expresión para un vector de AAV comprende una ITR 5' de AAV, las secuencias codificantes de hOTC y cualquier secuencia reguladora, y una ITR 3' de AAV. Sin embargo, pueden ser adecuadas otras configuraciones de estos elementos. Se ha descrito una versión abreviada de la ITR 5', denominada AITR, en la que se eliminan la secuencia D y el sitio de resolución terminal (trs). En otras realizaciones, se utilizan las ITR 5' y 3' de AAV de longitud completa.

En una realización, la construcción es una molécula de ADN (p. ej., un plásmido) útil para generar vectores víricos. Un plásmido ilustrativo que contiene elementos vectoriales deseables se ilustra con pAAVsc.TBG.hOTCco-LW4, cuya secuencia es la SEQ ID NO: 6. Este plásmido ilustrativo contiene un casete de expresión que comprende: scITR (nt 5 - 109 de la SEQ ID NO: 6), una señal TATA (nt 851-854 de la SEQ ID NO: 6), una secuencia codificante sintética de hOTC (nt 976-2037 de la SeQ ID NO: 6), un poli A (nt 2182-2046 en el complemento de la SEQ ID NO: 6), una scITR (nt 2378-2211 en el complemento de la SEQ ID n O: 6) y un promotor específico de hígado (TBG) (nt 4172-4760) de la SEQ ID NO: 6). Se pueden generar otros casetes de expresión utilizando las otras secuencias codificantes sintéticas de hOTC y otros elementos de control de la expresión, descritos en el presente documento.

La abreviatura "sc" en este contexto se refiere a autocomplementario. "AAV autocomplementario" se refiere a una construcción en la que se ha diseñado una región codificante portada por una secuencia de ácido nucleico de AAV recombinante para formar un molde de ADN bicatenario intramolecular. Tras la infección, en lugar de esperar a la síntesis mediada por células de la segunda hebra, las dos mitades complementarias de scAAV se asociarán para formar una unidad de ADN bicatenario (ADNbc) que está lista para la replicación y transcripción inmediatas. Véase, p. ej., D M McCarty et al., "Self-complementary recombinant adeno-associated virus (scAAV) vectors promote efficient transduction independently of DNA synthesis", Gene Therapy, (agosto de 2001), vol 8, número 16, páginas 1248-1254. Se describen AAV autocomplementarios en, p. ej., las patentes de los Estados Unidos n.° 6.596.535; 7.125.717; y 7.456.683.

El casete de expresión normalmente contiene una secuencia promotora como parte de las secuencias de control de la expresión, p. ej., ubicada entre la secuencia de ITR 5' seleccionada y la secuencia codificante de hOTC. El plásmido y el vector ilustrativos descritos en el presente documento usan la globulina de unión a tiroxina (TBG) promotora específica del hígado. Como alternativa, se pueden usar otros promotores específicos del hígado [véase, p. ej., la base de datos de promotores de genes específicos del hígado, Cold Spring Harbor, http://rulai.schl.edu/LSPD/, tales como, p. ej., alfa 1 anti-tripsina (A1AT); albúmina humana Miyatake et al., J. Virol., 71: 512432 (1997), humAlb; y promotor central del virus de la hepatitis B, Sandig et al., Gene Ther., 3: 10029 (1996)]. Potenciador/promotor mínimo de TTR, promotor de alfa-antitripsina, LSP (845 nt) 25 (requiere scAAV sin intrones); o LSP1. Aunque son menos deseables, otros promotores, tales como promotores constitutivos, promotores regulables [véase, p. ej., documentos WO 2011/126808 y WO 2013/04943] o se puede utilizar un promotor sensible a señales fisiológicas en los vectores descritos en el presente documento.

Además de un promotor, un casete de expresión y/o un vector puede contener uno o más de otras secuencias adecuadas de inicio, terminación, potenciadoras de la transcripción, señales de procesamiento del ARN eficaces tales como señales de corte y empalme y de poliadenilación (poliA); secuencias que estabilizan el ARNm citoplásmico; secuencias que potencian la eficacia de traducción (es decir, secuencia consenso de Kozak); secuencias que mejoran la estabilidad de las proteínas; y, cuando se desee, secuencias que mejoran la secreción del producto codificado. Los ejemplos de secuencias de poliA adecuadas incluyen, p. ej., SV40, SV50, hormona del crecimiento bovina (bGH), hormona del crecimiento humana y poliA sintéticas. Los ejemplos de potenciadores adecuados incluyen, p. ej., el potenciador de alfa fetoproteína, el promotor/potenciador mínimo de TTR, LSP (promotor de globulina de unión a TH/alfa1-microglobulina/potenciador de bikunina), entre otros. En una realización, el casete de expresión comprende uno o más potenciadores de la expresión. En una realización, el casete de expresión contiene dos o más potenciadores de la expresión. Estos potenciadores pueden ser iguales o pueden diferir entre sí. Por ejemplo, un potenciador puede incluir un potenciador Alfa mic/bik. Este potenciador puede estar presente en dos copias que están ubicadas adyacentes entre sí. Como alternativa, las copias dobles del potenciador pueden estar separadas por una o más secuencias. En otra realización más, el casete de expresión contiene además un intrón, p. ej., el intrón Promega. Otros intrones adecuados incluyen los conocidos en la técnica, p. ej., tales como se describen en el documento WO 2011/126808. Opcionalmente, pueden seleccionarse una o más secuencias para estabilizar el ARNm. Un ejemplo de dicha secuencia es una secuencia de WPRE modificada, que puede modificarse por ingeniería genética cadena arriba de la secuencia de poliA y cadena abajo de la secuencia codificante [véase, p. ej., MA Zanta-Boussif, et al., Gene Therapy (2009) 16: 605-619.

Estas secuencias de control están "unidas operativamente" a las secuencias de genes de hOTC. Como se usa en el presente documento, la expresión "unidas operativamente" se refiere tanto a las secuencias de control de la expresión que son contiguas con el gen de interés y las secuencias de control de la expresión que actúan en trans o a distancia para controlar el gen de interés.

Los vectores víricos de AAV recombinantes son muy adecuados para el suministro de las secuencias de expresión de hOTC descritas en el presente documento. Dichos vectores de AAV pueden contener ITR que proceden de la misma fuente de AAV que la cápside. Como alternativa, los ITR de AAV pueden ser de una fuente de AAV diferente a la que suministra la cápside.

Cuando se va a producir AAV pseudotipificado, las ITR en la expresión se seleccionan de una fuente que difiere de la fuente de AAV de la cápside. Por ejemplo, se pueden seleccionar ITR de AAV2 para su uso con una cápside de AAV que tenga una eficacia particular para dirigirse al hígado (p. ej., hepatocitos). Las cápsides de AAV pueden seleccionarse de AAV8 [patente de los Estados Unidos 7790449; patente de los Estados Unidos 7282199] y rh10 [documento WO 2003/042397] para las composiciones descritas en el presente documento. Sin embargo, otros AAV, incluyendo, p. ej., AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV9 y otros, tales como, p. ej., los descritos en los documentos WO 2003/042397; WO 2005/033321, WO 2006/110689; US 7588772 B2,] se pueden utilizar en sujetos humanos.

En una realización, se proporciona un AAV autocomplementario. Este vector vírico puede contener una ITR A5' y una ITR 3' de AAV. En un ejemplo, el vector vírico es scAAV2/8.TBG.hOTCco. En otro ejemplo, el vector vírico es scAAV2/rh10.TBG.hOTCco. Ambos de estos vectores contienen la AITR 5' de AAV2, el promotor de TBG específico del hígado, una secuencia codificante de hOTCco modificada por ingeniería genética de la invención, una poliA de SV40 y la ITR 3' de AAV2 en una cápside de AAV8 [véase, p. ej., patente de los Estados Unidos n.° 8.318480B2] o cápside de AAV rh10. La secuencia puede seleccionarse de hOTC modificada por ingeniería genética de una de las SEQ ID NO: 3, 4, 5, 8 o 9. Opcionalmente, la secuencia de tránsito de la hOTC modificada por ingeniería genética puede sustituirse por una secuencia de tránsito heteróloga para proporcionar una hOTC quimérica, que conserva la hOTCasa madura.

En otra realización, se proporciona un vector vírico de AAV monocatenario. Dicho vector puede contener una ITR 5' de AAV y una ITR 3'. Un ejemplo es AAV2/8.TBG.hOTCco, que contiene la ITR 5' de AAV2 de longitud completa, el promotor de TBG específico del hígado, la secuencia codificante de hOTC, una poliA de la hormona del crecimiento bovina y ITR 3' de a Av 2. Otro ejemplo es AAV2/8.TBG.hOTCco-.WPRE.bGH, que contiene los mismos elementos de vector y contiene además el elemento regulador postranscripcional del virus de la hepatitis de la marmota (WPRE). En otras realizaciones, WPRE está ausente de las construcciones que se van a utilizar in vivo. La secuencia de hOTC modificada por ingeniería genética (abreviada en el presente documento hOTCco) puede seleccionarse de hOTC modificada por ingeniería genética de una de las SEQ ID NO: 3, 4 o 5, Opcionalmente, la secuencia del péptido de tránsito de la hOTC modificada por ingeniería genética puede sustituirse por una secuencia de tránsito heteróloga para proporcionar una hOTC quimérica, que conserva la hOTCasa madura.

Pueden seleccionarse otros promotores más, incluyendo promotores específicos de tejido. Se conocen en la técnica métodos para generar y aislar vectores víricos de AAV adecuados para su administración a un sujeto. Véase, p. ej., solicitud de patente publicada de los Estados Unidos n.° 2007/0036760 (15 de febrero de 2007), patente de los Estados Unidos 7790449; patente de los Estados Unidos 7282199; documentos WO 2003/042397; Wo 2005/033321, WO 2006/110689; y US 7588772 B2]. Las secuencias de AAV8 y métodos para generar vectores basados en la cápside de AAV8 se describen en la patente de los Estados Unidos 7.282.199 b 2, US 7.790.449 y US 8.318.480. En un primer sistema, una línea celular productora se transfecta transitoriamente con una construcción que codifica el transgén flanqueado por ITR y una construcción o construcciones que codifican rep y cap. En un segundo sistema, una línea celular de empaquetamiento que proporciona de forma estable rep y cap se transfecta de forma transitoria con una construcción que codifica el transgén flanqueado por las ITR. En cada uno de estos sistemas, se producen viriones de AAV en respuesta a la infección por adenovirus auxiliar o herpesvirus, lo que requiere la separación de los rAAV del virus contaminante. Más recientemente, se han desarrollado sistemas que no requieren infección con virus auxiliares para recuperar el AAV, las funciones auxiliares necesarias (es decir, adenovirus E1, E2a, VA y E4 o herpesvirus UL5, UL8, UL52 y UL29 y polimerasa de herpesvirus) también son suministradas, en trans, por el sistema. En estos sistemas más nuevos, las funciones auxiliares se pueden suministrar mediante transfección transitoria de las células con construcciones que codifican las funciones auxiliares necesarias o las células se pueden modificar por ingeniería genética para contener de manera estable genes que codifican las funciones auxiliares, cuya expresión se puede controlar a nivel transcripcional o postranscripcional. En otro sistema más, el transgén flanqueado por ITR y los genes rep/cap se introducen en células de insecto mediante infección con vectores basados en baculovirus. Para revisiones de estos sistemas de producción, véase, en general, p. ej., Zhang et al., 2009, "Adenovirus-adenoassociated virus hybrid for large-scale recombinant adeno-associated virus production", Human Gene Therapy 20: 922-929. También se describen métodos de fabricación y uso de estos y otros sistemas de producción de AAV en las siguientes patentes de los Estados Unidos: 5.139.941; 5.741.683; 6.057.152; 6.204.059; 6.268.213; 6.491.907; 6.660.514; 6.951.753; 7.094.604; 7.172.893; 7.201.898; 7.229.823; y 7.439.065.

El espacio disponible para el empaquetamiento se puede conservar combinando más de una unidad de transcripción en una sola construcción, reduciendo de este modo la cantidad de espacio de secuencia reguladora necesario. Por ejemplo, un solo promotor puede dirigir la expresión de un solo ARN que codifica dos o tres o más genes, y la traducción de los genes cadena abajo está conducida por secuencias de IRES. En otro ejemplo, un solo promotor puede dirigir la expresión de un ARN que contiene, en un solo marco abierto de lectura (ORF), dos o tres o más genes separados entre sí por secuencias que codifican un péptido de autoescisión (p. ej., T2A) o un sitio de reconocimiento de proteasa (p. ej., furina). Por tanto, el ORF codifica una sola poliproteína, que, ya sea durante (en el caso de T2A) o después de la traducción, se escinde en las proteínas individuales (tales como, p. ej., factor de transcripción transgénico y dimerizable). Debe observarse, sin embargo, que aunque estos sistemas de poliproteínas e IRES se pueden utilizar para ahorrar espacio de empaquetamiento de AAV, solo pueden utilizarse para la expresión de componentes que pueden ser conducidos por el mismo promotor. En otra alternativa, la capacidad transgénica de AAV puede aumentarse proporcionando ITR de AAV de dos genomas que pueden hibridarse para formar concatámeros de cabeza a cola.

Opcionalmente, los genes de hOTC descritos en el presente documento pueden utilizarse para generar vectores víricos distintos de rAAV. Dichos otros vectores víricos pueden incluir el uso de cualquier virus adecuado para terapia génica, incluyendo, pero sin limitación, adenovirus; virus del herpes; lentivirus; retrovirus; etc. Convenientemente, cuando se genera uno de estos otros vectores, se produce como un vector vírico de replicación defectuosa.

Un "virus de replicación defectuosa" o "vector vírico" se refiere a una partícula vírica sintética o artificial en la que un casete de expresión que contiene un gen de interés está empaquetado en una cápside o envoltura vírica, donde cualquier secuencia genómica vírica empaquetada también dentro de la cápside o envoltura vírica es deficiente en replicación; es decir, no puede generar viriones descendientes pero conservan la capacidad de infectar células diana. En una realización, el genoma del vector vírico no incluye genes que codifican las enzimas necesarias para la replicación (el genoma puede modificarse para que sea "dependiente de auxiliar", que contiene solo el transgén de interés flanqueado por las señales necesarias para la amplificación y el empaquetamiento del genoma artificial), pero estos genes pueden suministrarse durante la producción. Por lo tanto, se considera seguro para su uso en terapia génica, ya que la replicación y la infección por viriones descendientes no pueden ocurrir excepto en presencia de la enzima vírica necesaria para la replicación. Dichos virus de replicación defectuosa pueden ser virus adenoasociados (AAV), adenovirus, lentivirus (integradores o no integradores) u otra fuente de virus adecuada.

Las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento están diseñadas para su administración a sujetos que lo necesiten mediante cualquier vía adecuada o una combinación de diferentes vías. Se desea la administración directa o intrahepática al hígado y, opcionalmente, se puede realizar mediante administración intravascular, p. ej., a través de la vena porta, vena hepática, conducto biliar o por trasplante. Como alternativa, se pueden seleccionar otras vías de administración (p. ej., oral, inhalación, intranasal, intratraqueal, intraarterial, intraocular, intravenosa, intramuscular y otras vías parentales). Las construcciones de administración de hOTC descritas en el presente documento pueden administrarse en una composición única o en múltiples composiciones. Opcionalmente, se pueden administrar dos o más AAV diferentes [véase, p. ej., documentos WO 2011/126808 y WO 2013/049493]. En otra realización, dichos múltiples virus pueden contener diferentes virus de replicación defectuosa (p. ej., AAV, adenovirus y/o lentivirus). Como alternativa, la administración puede estar mediada por construcciones no víricas, p. ej., "ADN desnudo", "ADN plasmídico desnudo", ARN y ARNm; junto con diversas composiciones de y nanopartículas administración, incluyendo, p. ej., micelas, liposomas, composiciones de lípido catiónico - ácido nucleico, composiciones de poliglucanos y otros polímeros, conjugados de ácidos nucleicos a base de lípidos y/o colesterol, y otras construcciones como las que se describen en el presente documento. Véase, p. ej., X. Su et al., Mol. Pharmaceutics, 2011,8 (3), págs. 774-787; publicación web: 21 de marzo de 2011; documentos WO2013/182683, WO 2010/053572 y WO 2012/170930. Dichas construcciones de administración de hOTC no víricas pueden administrarse mediante las vías descritas anteriormente.

Los vectores víricos, o restos de transferencia de ADN o ARN no víricos, se pueden formular con un vehículo fisiológicamente aceptable para su uso en aplicaciones de transferencia génica y terapia génica. En el caso de los vectores víricos de AAV, la cuantificación de las copias del genoma ("CG") puede usarse como la medida de la dosis contenida en la formulación. Puede usarse cualquier método conocido en la técnica para determinar el número de copias del genoma (CG) de las composiciones de virus de replicación defectuosa de la invención. Un método para realizar la valoración numérica de CG de AAV es el siguiente: Las muestras de vector de AAV purificadas se tratan primero con DNasa para eliminar el ADN del genoma de AAV no encapsidado o el ADN plasmídico contaminante del proceso de producción. Las partículas resistentes a la DNasa se someten después a un tratamiento térmico para liberar el genoma de la cápside. Después, los genomas liberados se cuantifican mediante PCR en tiempo real utilizando conjuntos de cebadores/sondas que se dirigen a una región específica del genoma vírico (habitualmente señal de poli A). Las composiciones de virus de replicación defectuosa se pueden formular en unidades de dosificación para contener una cantidad de virus de replicación defectuosa que se encuentra en el intervalo de aproximadamente 1.0 x 109 CG a aproximadamente 1,0 x 1015 CG (para tratar a un sujeto promedio de 70 kg de peso corporal) y, preferentemente, de 1,0 x 1012 CG a 1,0 x 1014 CG para un paciente humano. Preferentemente, la dosis de virus de replicación defectuosa en la formulación es de 1,0 x 109 CG, 5,0 x 109 CG, 1,0 x 1010 CG, 5,0 x 1010 CG, 1,0 x 1011 CG, 5,0 x 1011 CG, 1,0 x 1012 CG, 5,0 x 1012 CG, o 1,0 x 1013 CG, 5,0 x 1013 CG, 1,0 x 1014 CG, 5,0 x 1014 CG, o 1.0 x 1015 CG.

El ADN y el ARN se miden en general en cantidades de nanogramos (ng) a microgramos (pg) de los ácidos nucleicos. En general, para un tratamiento en un ser humano, preferentemente se formulan y administran dosificaciones del ARN en el intervalo de 1 ng a 700 pg, de 1 ng a 500 pg, de 1 ng a 300 pg, de 1 ng a 200 pg o de 1 ng a 100 pg. Se pueden utilizar cantidades de dosificación similares de una molécula de ADN que contiene un casete de expresión y que no se administra a un sujeto mediante un vector vírico para las construcciones de administración de ADN de hOTC no víricas.

La producción de lentivirus se mide tal como se describe en el presente documento y se expresa como UI por volumen (p. ej., ml). UI es unidad infecciosa o, como alternativa, unidades de transducción (UT); UI y UT se pueden usar indistintamente como una medida cuantitativa del título de una preparación de partículas de vectores víricos. El vector lentivírico normalmente no es integrador. La cantidad de partículas víricas es al menos aproximadamente 3 x 106 UI, y puede ser al menos aproximadamente 1 x 107 UI, al menos aproximadamente 3 x 107 UI, al menos aproximadamente 1 x 108 UI, al menos aproximadamente 3 x 108 UI, al menos aproximadamente 1 x 109 UI o al menos aproximadamente 3 x 109 UI.

Los vectores recombinantes descritos anteriormente pueden administrarse a células hospedadoras según métodos publicados. El rAAV, preferentemente suspendido en un vehículo fisiológicamente compatible, puede administrarse a un paciente mamífero humano o no humano. Un experto en la materia puede seleccionar fácilmente vehículos adecuados a la vista de la indicación para la que se dirige el virus de transferencia. Por ejemplo, un vehículo adecuado incluye solución salina, que puede formularse con diversas soluciones tamponantes (p. ej., solución salina tamponada con fosfato). Otros vehículos ilustrativos incluyen solución salina estéril, lactosa, sacarosa, fosfato de calcio, gelatina, dextrano, agar, pectina, aceite de cacahuete, aceite de sésamo y agua. La selección del vehículo no es una limitación de la presente invención.

Opcionalmente, las composiciones de la invención pueden contener, además del rAAV y el vehículo o vehículos, otros ingredientes farmacéuticos convencionales, tales como conservantes o estabilizantes químicos. Los conservantes ilustrativos adecuados incluyen clorobutanol, sorbato de potasio, ácido sórbico, dióxido de azufre, galato de propilo, los parabenos, etil vainillina, glicerina, fenol y paraclorofenol. Los estabilizantes químicos adecuados incluyen gelatina y albúmina.

Los vectores víricos descritos en el presente documento pueden utilizarse para preparar un medicamento para administrar ornitina transcarbamilasa a un sujeto (p. ej., un paciente humano) que lo necesite, suministrar hOTCasa funcional a un sujeto y/o para tratar la deficiencia de ornitina transcarbamilasa. Un ciclo de tratamiento puede implicar opcionalmente la administración repetida del mismo vector vírico (p. ej., un vector de AAV8) o un vector vírico diferente (p. ej., un AAV8 y un AAVrh10). Pueden seleccionarse otras combinaciones más utilizando los vectores víricos y sistemas de administración no víricos descritos en el presente documento.

En otra divulgación, las secuencias de ácido nucleico descritas en el presente documento pueden administrarse mediante una vía no vírica. Por ejemplo, una secuencia de hOTC puede ser a través de un sistema transportador para expresión o administración en forma de ARN (p. ej., ARNm) utilizando uno de varios sistemas transportadores que son conocidos en la técnica. Dichos sistemas transportadores incluyen los proporcionados por entidades comerciales, tales como la tecnología denominada "SMARTT" de PhaseRx. Estos sistemas utilizan copolímeros en bloque para la administración a una célula huésped diana. Véase, p. ej., documento US 2011/0286957 titulado, "Multiblock Polymers", publicado el 24 de noviembre de 2011; documento US 2011/0281354, publicado el 17 de noviembre de 2011; documento EP2620161, publicado el 31 de julio de 2013; y documento WO 2015/017519, publicado el 5 de febrero de 2015. Véase, también, S. Uchida et al., (febrero de 2013) PLoS ONE 8 (2): e56220. Otros métodos más implican generar e inyectar ARNbc sintéticos [véase Soutschek et al. Nature (2004) 432 (7014): 173-8; véase, también, Morrissey et al. Hepatol. (2005) 41 (6): 1349-56], también se ha demostrado la administración local en el hígado mediante la inyección de ARN bicatenario directamente en el sistema circulatorio que rodea el hígado mediante cateterismo de la vena renal. [Véase Hamar et al. PNAS (2004) 101 (41): 14883-8]. Otros sistemas más implican la administración de ARNbc y, en particular ARNip utilizando complejos catiónicos o formulaciones liposómicas [véase, p. ej., Landen et al. Cancer Biol. Ther. (2006) 5 (12); véase, también, Khoury et al. Arthritis Rheumatol. (2006) 54 (6): 1867-77. También están disponibles otras tecnologías de administración de ARN, p. ej., de Veritas Bio [véase, p. ej., documento US 2013/0323001, 23 de diciembre de 2010, "In vivo delivery of double stranded RNA to a target cell" (contenido citosólico incluyendo ARN, p. ej., ARNm, ARNip/ARNhp/miARN expresado, así como ARNip/ARNhp/miARN inyectado/introducido, o posiblemente incluso ADN transfectado presente en el citosol empaquetado dentro de las exovesículas y transportado a sitios distales tales como el hígado)]. Se han descrito otros sistemas más para administración in vivo de secuencias de ARN. Véase, p. ej., documento US 2012/0195917 (2 de agosto de 2012) (análogos de ARN de caperuza 5' para mejorar la estabilidad y aumentar la expresión de ARN), documento WO 2013/143555A1, 3 de octubre de 2013 y/o están disponibles en el mercado (BioNTech, Alemania; Valera (Cambridge, MA); Zata Pharmaceuticals).

Por tanto, en una realización, la divulgación proporciona un ARNm de hOTC modificado por ingeniería genética de la secuencia madura (al menos aproximadamente nt 99 - 1098) o la longitud completa de las SEQ ID NO: 10, 11, 12, 13, o una secuencia que tiene al menos de 97 % a 99 % de identidad con la misma, en una composición para la administración de ARN bicatenario o monocatenario que da lugar a la expresión de la hOTCasa madura en una célula hospedadora diana, p. ej., una célula hepática.

La cinética de la composición descrita en el presente documento que contiene ARNm (administrado directamente, en comparación con transcrito a partir de una molécula de administración de ADN) es en particular adecuada para su uso en sujetos en crisis aguda, ya que la expresión de la hOTCasa a partir del ARNm puede verse en un periodo de varias horas. Para evitar una rápida eliminación del ARN, se modifica como se describe en el presente documento (p. ej., utilizando una caperuza o una base modificada), de modo que sus efectos puedan conservarse durante más de 24 horas, durante 48 horas o hasta aproximadamente 3 días (aproximadamente 72 horas). Puede ser deseable coadministrar un ARNm directamente como se describe en el presente documento y coadministrar al mismo tiempo o sustancialmente al mismo tiempo, una composición de hOTC basada en ADN o vector vírico como se define en el presente documento. Por tanto, un sujeto puede recibir tratamiento inmediato y en el momento en que la expresión mediada por ARNm comienza a disminuir, la expresión de hOTC a largo plazo conferida por una expresión mediada por un vector vírico comienza a surtir efecto. Como alternativa, un sujeto puede recibir una segunda administración de una composición basada en ARNm como se define en el presente documento. Las composiciones de ARNm descritas en el presente documento pueden usarse en otros regímenes o métodos terapéuticos, incluyendo los que implican a pacientes con OTCD que no están en crisis aguda.

Las composiciones según la presente invención pueden comprender un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como se ha definido anteriormente. En una realización, la composición comprende un copolímero en bloque asociado con un polinucleótido de hOTC como se describe en el presente documento. Los copolímeros en bloque pueden formar una micela, de manera que la micela comprenda una pluralidad de copolímeros en bloque.

Normalmente, dicha composición contiene una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de ARNm correspondiente a la secuencia de hOTC que codifica la hOTCasa madura (al menos aproximadamente nt 99 a 1098). Además, esta molécula de ácido nucleico puede incluir la región 5' no traducida (UTR), también conocida como la secuencia líder o ARN líder, y uno o más de un intrón o intrones opcionales, un exón o exones opcionales, una secuencia opcional de Kozak, un WPRE opcional y una poliA, y la 3' UTR que flanquea las secuencias codificantes. Las secuencias líder adecuadas incluyen las analizadas anteriormente en relación con las secuencias de ADN de hOTC. Se han analizado anteriormente ejemplos de fuentes de secuencias líder adecuadas, distintas de las secuencias líder de hOTC nativas, o las correspondientes a fig. 2, fig. 3, fig. 4 o fig. 5. De manera similar, se han analizado anteriormente fuentes de intrones adecuados, poliA y secuencias de Kozak y son aplicables al suministro de las secuencias de ARN correspondientes analizadas en el presente párrafo. Además, se pueden generar diversas modificaciones al ARN, p. ej., se puede obtener por ingeniería genética una estructura de caperuza 5' modificada en la construcción para evitar la eliminación rápida del ARNm in vivo, o por otra razón deseada. Los expertos en la técnica conocen métodos para generar tales estructuras de caperuza 5'. Véase, p. ej., documentos US 2012/0195917 y WO 2013/143555A1, 3 de octubre de 2013. Además, se pueden utilizar nucleótidos modificados para producir ARNm in vitro, como pseudouridina. También se puede dosificar ARN repetidamente, o se puede dosificar al sujeto primero con ARNm para tratar crisis neonatales seguido de administración mediada por vectores víricos (p. ej., a AV) para terapia a largo plazo y para prevenir fibrosis/cirrosis y/o carcinoma hepatocelular.

El ARNm se puede sintetizar a partir de las secuencias de ADN de hOTC descritas en el presente documento, usando técnicas que se conocen bien en la materia. Por ejemplo, Cazenave C, Uhlenbeck OC, RNA template-directed RNA synthesis by T7 RNA polymerase. Proc Natl Acad Sci USA. 19 de julio de 1994; 91 (15): 6972-6, describen el uso de la ARN polimerasa de T7 para generar ARN a partir de moldes de ADNc o ARN. Véase también, Wichlacz A1, Legiewicz M, Ciesiolka J., Generating in vitro transcripts with homogenous 3' ends using trans-acting antigenomic delta ribozyme., Nucleic Acids Res. 18 de febrero de 2004; 32 (3): e39; Krieg PA, Melton DA., Functional messenger RNAs are produced by SP6 in vitro transcription of cloned cDNAs, Nucleic Acids Res. 25 de septiembre de 1984; 12 (18): 7057-70; y Rio, D. C., et al. RNA: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2011,205-220. Además, los equipos y protocolos para generar ARNm están disponibles comercialmente que incluyen, sin limitación, el sistema de transcripción in vitro Riboprobe® (Promega Corp.); sistemas de producción de ARN a gran escala RiboMAX™ (Promega Corp.); equipo MAXIscript (Ambion); equipo MEGIscript (Ambion); equipo de ARNa MessageAmp™ (Ambion); equipos mMESSAGE itimAc H iNE® (Ambion); y equipo de síntesis de Ar N de alto rendimiento HiScribe™ T7 (New England Biolabs® Inc.). El ARN personalizado también se puede generar comercialmente a partir de empresas incluyendo, sin limitación, TriLink Biotechnologies; bioSYNTHESIS; GE Dharmacon; e IBA Lifesciences.

Las secuencias de ADN de hOTC descritas en el presente documento se pueden generar in vitro y sintéticamente, usando técnicas muy conocidas en este campo. Por ejemplo, se puede utilizar el método de síntesis precisa basada en PCR (PAS) de secuencias largas de ADN, como se describe en Xiong et al, PCR-based accurate synthesis of long DNA sequences, Nature Protocols 1, 791 - 797 (2006). Se describe un método que combina los métodos de PCR asimétrica doble y PCR de extensión solapante en Young y Dong, Two-step total gene synthesis method, Nucleic Acids Res. 2004; 32 (7): e59. Véase también, Gordeeva et al., J Microbiol Methods. Improved PCR-based gene synthesis method and its application to the Citrobacter freundii phytase gene codon modification. mayo de 2010; 81 (2): 147-52. Publicación electrónica 10 de marzo de 2010; véase, también, las siguientes patentes sobre síntesis de oligonucleótidos y síntesis de genes, Gene Seq. abril de 2012; 6 (1): 10-21; US 8008005; y US 7985565. Además, los equipos y protocolos para generar ADN mediante PCR están disponibles en el mercado. Estos incluyen el uso de polimerasas incluyendo, sin limitación, Taq polimerasa; OneTaq® (New England Biolabs); ADN polimerasa de alta fidelidad Q5® (New England Biolabs); y polimerasa GoTaq® G2 (Promega). También se puede generar ADN a partir de células transfectadas con plásmidos que contienen las secuencias de hOTC descritas en el presente documento. Los kits y protocolos son conocidos y están disponibles en el mercado e incluyen, sin limitación, equipos de plásmidos QIAGEN; equipos de plásmidos de filtro Cliargeswitcli® Pro (Invitrogen); y equipos de plásmidos GenElute™ (Sigma Aldrich). Otras técnicas útiles en el presente documento incluyen métodos de amplificación isotérmica de secuencia específica, que eliminan la necesidad de termociclado. En lugar de calor, estos métodos emplean habitualmente una a Dn polimerasa de desplazamiento de hebra, como ADN polimerasa Bst, fragmento grande (New England Biolabs), para separar ADN bicatenario. También se puede generar ADN a partir de moléculas de ARN por amplificación mediante el uso de transcriptasas inversas (RT), que son ADN polimerasas dependientes de ARN. Las RT polimerizan una hebra de ADN que es complementaria del molde de ARN original y se denomina ADNc. Este ADNc puede después amplificarse adicionalmente mediante PCR o métodos isotérmicos como se ha descrito anteriormente. El ADN personalizado también se puede generar comercialmente a partir de empresas incluyendo, sin limitación, GenScript; GENEWIZ®; GeneArt® (Life Technologies); e Integrated DNA Technologies.

El término "expresión" se usa en el presente documento en su significado más amplio y comprende la producción de ARN o de ARN y proteína. Con respecto al ARN, el término "expresión" o "traducción" se refiere en particular a la producción de péptidos o proteínas. La expresión puede ser transitoria o estable.

El término "traducción" en el contexto de la presente invención se refiere a un proceso en el ribosoma, en donde una cadena de ARNm controla el ensamblaje de una secuencia de aminoácidos para generar una proteína o un péptido.

Según la presente invención, se administra una "cantidad terapéuticamente eficaz" de la hOTC como se describe en el presente documento para lograr el resultado deseado, es decir, tratamiento de la deficiencia de OTC o uno o más síntomas de la misma. Como se describe en el presente documento, un resultado deseado incluye reducir los niveles de ácido orótico, reducir la hiperamonemia y/o minimizar o eliminar una o más de las complicaciones neurofísicas, incluyendo el retraso del desarrollo, dificultades de aprendizaje, discapacidad intelectual, trastorno por déficit de atención con hiperactividad y déficits de la función ejecutiva. El tratamiento puede incluir el tratamiento de sujetos que tienen una enfermedad grave de inicio neonatal (hombres o, con menos frecuencia, mujeres) y enfermedad de inicio tardío (parcial) en hombres y mujeres, que puede presentarse desde la primera infancia hasta la niñez posterior, adolescencia o adultez. En determinadas realizaciones, la invención proporciona vectores víricos rAAV para su uso en un método de tratamiento de la deficiencia de ornitina transcarbamilasa (OCTD) en un paciente humano. Métodos de tratamiento y/o prevención de la fibrosis y/o cirrosis en sujetos, en particular, se describen en el presente documento los sujetos heterocigotos de aparición tardía mediante la administración de hOTC. En una realización, los objetivos terapéuticos para la deficiencia de OTC son mantener el amoníaco en plasma a menos de <80 pmol/l, glutamina en plasma <1000 pmol/l, argininemia 80-150 pmol/l y aminoácidos de cadena ramificada dentro del intervalo normal. Sin embargo, el médico tratante puede seleccionar otros criterios de valoración terapéuticos.

En otro aspecto más, la divulgación proporciona vectores víricos o rAAV para su uso en el rescate y/o el tratamiento de OTCD de un sujeto neonatal que comprende la etapa de administrar un gen de hOTC al hígado de un sujeto recién nacido (p. ej., un paciente humano). Este método puede utilizar cualquier secuencia de ácido nucleico que codifique una hOTCasa funcional, ya sea una hOTC sintética como se describe en el presente documento o una hOTC de tipo silvestre, o una hOTC de otra fuente, o una combinación de las mismas. En una realización, el tratamiento neonatal se define como la administración de una hOTC como se describe en el presente documento en las primeras 8 horas, las primeras 12 horas, las primeras 24 horas o las primeras 48 horas después del parto. En otra realización, en particular para un primate, el parto neonatal se realiza dentro del periodo de aproximadamente 12 horas a aproximadamente 1 semana, 2 semanas, 3 semanas o aproximadamente 1 mes, o después de aproximadamente 24 horas a aproximadamente 48 horas. Para abordar la dilución debido a la rápida renovación de las células hepáticas en un mamífero en crecimiento (p. ej., un primate no humano o humano), es deseable que la terapia neonatal vaya seguida de readministración aproximadamente a los 3 meses de edad, aproximadamente 6 meses, aproximadamente 9 meses o aproximadamente 12 meses. Opcionalmente, se permite más de una readministración. Dicha readministración puede ser con el mismo tipo de vector o con un vector vírico diferente.

En un aspecto de la divulgación, se utiliza un sistema de administración basado en ARN para hOTC funcional para estabilizar a un sujeto (p. ej., un paciente humano) en crisis, seguido de la administración de una administración mediada por un vector vírico de una hOTC funcional.

En otro aspecto de la divulgación, la terapia inicial de la divulgación implica la coadministración de sistemas de administración de hOTC mediados y no mediados por virus.

En un aspecto adicional de la divulgación, la hOTC de las construcciones de ADN y ARN de la divulgación se puede utilizar sola o en combinación con el tratamiento de referencia para el diagnóstico y el estado del paciente.

Como se describe en los ejemplos funcionales del presente documento, los inventores han descubierto que los sujetos heterocigotos para OTCD, incluyendo los que tienen OTCD de aparición tardía, tiene un aumento de fibrosis y/o esteatosis microvesicular en todo el hígado. Dichas fibrosis hepática y/o esteatosis microvesicular puede conducir a cirrosis relacionada con OTCD. Por tanto, en otro aspecto, la divulgación proporciona vectores víricos o rAAV para su uso en la prevención de la fibrosis hepática y/o la afección médica asociada a la cirrosis relacionada con OTCD mediante la administración al sujeto (p. ej., un paciente humano) de una hOTC. Este aspecto de la divulgación puede utilizar un sistema de administración vírico. El casete de expresión de ácido nucleico puede contener un ADN o ARN de hOTC sintético como se proporciona en el presente documento u otra secuencia adecuada que expresa hOTC funcional. En un aspecto, se proporciona un uso de vectores víricos o rAAV para tratar y/o prevenir la fibrosis hepática, esteatosis microvesicular y/o cirrosis relacionada con OTCD que implica administrar OTCasa a un sujeto que tiene OTCD. El sujeto puede ser un paciente humano. En una realización, el paciente es heterocigoto y tiene OTCD de aparición tardía. Es posible que el paciente no haya recibido tratamiento previo para OTCD o que haya recibido otros tratamientos convencionales. En la actualidad, no existe un tratamiento de referencia para OTCD, sino que los síntomas se tratan, p. ej., mediante la interrupción de la ingesta de proteínas, aumentos compensatorios de los carbohidratos y lípidos en la dieta, hemodiálisis para pacientes comatosos con niveles sanguíneos extremadamente altos; y/o administración intravenosa de benzoato de sodio, arginina y/o fenilacetato de sodio. La FDA de los Estados Unidos ha aprobado el fenilbutirato de glicerol (Ravicti®) para el tratamiento a largo plazo de algunos trastornos del ciclo de la urea en pacientes de 2 años o más; este fármaco ayuda a eliminar el amoníaco del cuerpo y está destinado a pacientes que no pueden ser tratados únicamente con una dieta restringida en proteínas o suplementos de aminoácidos. En un aspecto, el tratamiento del paciente (p. ej., una primera inyección) se inicia antes del primer año de vida. En otro aspecto, el tratamiento se inicia después del primer año, o después de los primeros 2 a 3 años de edad, después de los 5 años de edad, después de los 11 años o en una edad mayor.

En un aspecto, los vectores víricos o rAAV de la divulgación proporcionan un uso para tratar y/o invertir la fibrosis hepática y/o la cirrosis relacionada con OTCD mediante la administración al sujeto de una OTCasa funcional que está codificada por un ADN modificado por ingeniería genética de las SEQ ID NO: 1, 3, 4 o 5, o un ADN quimérico como se define en el presente documento. La administración del ADN puede estar mediada por un vector vírico que contiene el modificado por ingeniería genética en un casete de expresión, que media en la expresión de OTCasa funcional en las células hepáticas del sujeto. En otra realización, se administra al sujeto un ARN quimérico como se define en el presente documento. La administración del ARN puede estar mediada por un vector vírico que contiene el ARN modificado por ingeniería genética en un casete de expresión, que media en la expresión de OTCasa funcional en las células hepáticas del sujeto.

Los sujetos con OTCD heterocigotos tienen un mayor riesgo de desarrollar carcinoma hepatocelular (HCC). Véase, p. ej., JM Wilson et al., Molecular Genetics and Metabolism (2012), Mol Genet Metab. feb de 2012; 105 (2): 263-265, publicado en línea el 7 de noviembre de 2011. Por tanto, en otro aspecto, la divulgación proporciona vectores víricos o rAAV para su uso en el tratamiento y/o la prevención de HCC al administrar al sujeto (p. ej., un paciente humano) una hOTC. Este aspecto de la invención utiliza un sistema de administración vírico. El casete de expresión de ácido nucleico puede contener un ADN o ARN de hOTC sintético como se proporciona en el presente documento. Es posible que el paciente no haya recibido tratamiento previo para OTCD o que haya recibido otros tratamientos convencionales, es decir, tratamiento de referencia. En una realización, el tratamiento del paciente (p. ej., una primera inyección) se inicia antes del diagnóstico de HCC. En otra realización, el tratamiento del paciente se inicia tras el diagnóstico de HCC. Opcionalmente, el tratamiento implica la coadministración con sorafenib (disponible en el mercado como Nexavar®) o su uso junto con quimioembolización, radiación, ablación térmica, inyección de etanol precutáneo, terapia dirigida (p. ej., fármacos antiangiogénesis), infusión arterial hepática de fármacos antineoplásicos, inmunoterapia, o con opciones quirúrgicas incluyendo, p. ej., extirpación, criocirugía y trasplante de hígado. Cuando se usa para el tratamiento del HCC, puede ser deseable seleccionar un sistema de administración no integrador (p. ej., virus no integradores tales como adenovirus o lentivirus no integradores) para administración de un ADN o ARN de hOTC sintético como se describe en el presente documento.

Por "OTC funcional", se entiende un gen que codifica la OTCasa de tipo silvestre tal como se caracteriza por la SEQ ID NO: 2 u otra OTCasa que proporciona al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 75 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 90 % o aproximadamente el mismo o más de 100 % del nivel de actividad biológica de la enzima ornitina transcarbamilasa humana de tipo silvestre, que se puede caracterizar por la secuencia de la SEQ ID NO: 2 o una variante natural o polimorfo de la misma que no está asociado con la enfermedad. Más en particular, ya que los pacientes heterocigotos pueden tener un nivel funcional de OTCasa tan bajo como aproximadamente 50 % o menos, el tratamiento eficaz puede no requerir el reemplazo de la actividad OTCasa a niveles dentro del rango de pacientes "normales" o sin OTCD. De manera similar, los pacientes que no tienen cantidades detectables de OTCasa pueden ser rescatados administrando la función OTCasa a niveles de actividad inferiores al 100 % y, opcionalmente, pueden someterse a un tratamiento adicional posteriormente. Como se describe en el presente documento, la terapia génica descrita en el presente documento, ya sea vírica o no vírica, se puede utilizar junto con otros tratamientos, es decir, el tratamiento de referencia para el diagnóstico del sujeto (paciente).

En una realización, dicha OTCasa funcional tiene una secuencia que tiene aproximadamente 95 % o más de identidad con la proteína madura (es decir, aproximadamente los últimos 322 aminoácidos) o la secuencia de longitud completa de la SEQ ID NO: 2, o aproximadamente 97 % de identidad o más, o aproximadamente 99 % o más con la SEQ ID NO: 2 al nivel de aminoácidos. Dicha OTCasa funcional también puede abarcar polimorfos naturales que no están asociados con ninguna enfermedad (p. ej., F101, L111 y/o WI193-194 de la SEQ ID NO: 2). La identidad se puede determinar preparando una alineación de las secuencias y mediante el uso de diversos algoritmos y/o programas informáticos conocidos en la técnica o disponibles en el mercado [p. ej., BLAST, ExPASy; ClustalO; FASTA; utilizando, p. ej., algoritmo de Needleman-Wunsch, algoritmo de Smith-Waterman].

Existen diversos ensayos para medir la expresión y los niveles de actividad de OTC in vitro. Véase, p. ej., X Ye, et al., 1996 Prolonged metabolic correction in adult ornithine transcarbamylase-deficient mice with adenoviral vectors. J Biol Chem 271: 3639-3646) o in vivo. Por ejemplo, la actividad enzimática de OTC se puede medir utilizando un método de dilución de isótopos estables por espectrometría de masas de cromatografía líquida para detectar la formación de citrulina normalizada a [1,2,3,4,5-13C5] citrulina (98 % 13C). El método está adaptado de un ensayo desarrollado previamente para la detección de la actividad de la N-acetilglutamato sintasa [Morizono H, et al., Mammalian N-acetylglutamate synthase. Mol Genet Metab. 2004; 81 (Supl. 1): S4-11.]. Se pesan cortes de hígado fresco congelado y se homogeneizan brevemente en tampón que contiene HEPES 10 mM, Triton X-100 al 0,5 %, EDTA 2,0 mM y DTT 0,5 mM. El volumen de tampón de homogeneización se ajusta para obtener 50 mg/ml de tejido. La actividad enzimática se mide utilizando 250 pg de tejido hepático en Tris-acetato 50 mM, ornitina 4 mM, fosfato de carbamilo 5 mM, pH 8,3. La actividad enzimática se inicia con la adición de carbamilfosfato 50 mM recién preparado disuelto en Tris-acetato 50 mM pH 8,3, se dejó continuar durante 5 minutos a 25 0C y se inactivó mediante la adición de un volumen igual de 13C5-citrulina 5 mM en TCA al 30 %. Los desechos se separan mediante 5 minutos de microcentrifugación y los sobrenadantes se transfieren a frascos para espectroscopia de masas. Se inyectan diez pl de muestra en un LC-MS Agilent serie 1100 en condiciones isocráticas con una fase móvil de 93 % de disolvente A (1 ml de ácido trifluoroacético en 1 l de agua):7 % de disolvente B (1 ml de ácido trifluoroacético en 1 l de agua/acetonitrilo 1:9). Se cuantifican los picos correspondientes a citrulina [176,1 de relación masa:carga (m/z)] y 13C5-citrulina (181,1 m/z), y sus relaciones se comparan con las relaciones obtenidas para una curva patrón de citrulina ejecutada con cada ensayo. Las muestras se normalizan con respecto al tejido hepático total o a la concentración de proteína determinada mediante un equipo de ensayo de proteínas Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA). También se pueden utilizar otros ensayos, que no requieren biopsia hepática. Uno de estos ensayos es un ensayo de aminoácidos plasmáticos en el que se evalúa la proporción de glutamina y citrulina y si la glutamina es alta (>800 microlitros/litro) y la citrulina baja (p. ej., menos de 10), se sospecha un defecto del ciclo de la urea. Se pueden medir los niveles de amoníaco en plasma y una concentración de aproximadamente 100 micromoles por litro es indicativa de OTCD. Se puede realizar una gasometría si un paciente está hiperventilando; la alcalosis respiratoria es frecuente en la OTCD. El ácido orótico en la orina, p. ej., más de aproximadamente 20 micromoles por milimol de creatina es indicativo de OTCD, al igual que el orotato urinario elevado después de la prueba de provocación con alopurinol. Los criterios de diagnóstico para OTCD se han expuesto en Tuchman et al., 2008, Consorcio de Trastornos del Ciclo de la Urea (UCDC) de la Red de Investigación Clínica de Enfermedades Raras (RDCRN). Tuchman M, et al., Consorcio de la Red de Investigación Clínica de Enfermedades Raras. Cross-sectional multicenter study of patients with urea cycle disorders in the United States. Mol Genet Metab.

2008; 94: 397-402. Véase, también, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK.154378/. que proporciona un análisis del tratamiento de referencia para OTCD.

Cabe señalar que el término "un" o "uno/a" se refiere a uno o más. Como tales, las expresiones "un" (o "uno/a"), "uno/a o más" y "al menos uno/a" se usan indistintamente en el presente documento.

Las palabras "comprender", "comprende" y "que comprende" deben interpretarse de manera inclusiva en lugar de exclusiva. Las palabras "consistir", "que consiste" y sus variantes, deben interpretarse de manera exclusiva, en lugar de inclusiva. Aunque se presentan diversas realizaciones en la memoria descriptiva que utilizan la expresión "que comprende", en otras circunstancias, también se pretende que una realización relacionada también sea interpretada y descrita usando la expresión "que consiste en" o "que consiste esencialmente en".

Como se usa en el presente documento, el término "aproximadamente" significa una variabilidad del 10 % (±10 %) con respecto a la referencia dada, a menos que se especifique otra cosa.

El término "regulación" o variaciones del mismo como se usa en el presente documento se refiere a la capacidad de un compuesto de fórmula (I) para inhibir uno o más componentes de una ruta biológica.

Un "sujeto" es un mamífero, p. ej., un ser humano, ratón, rata, cobaya, perro, gato, caballo, vaca, cerdo o primate no humano, tal como un mono, chimpancé, babuino o gorila.

Como se usa en el presente documento, "enfermedad", "trastorno" y "afección" se usan indistintamente, para indicar un estado anómalo en un sujeto.

A menos que se definan de otro modo en la presente memoria descriptiva, los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende habitualmente un experto habitual en la materia y por referencia a textos publicados, que proporcionan a un experto en la materia una guía general para muchos de los términos utilizados en la presente solicitud.

Los siguientes ejemplos son ilustrativos.

Ejemplo 1: vectores scAAV que contienen hOTC

pAAVsc.TBG.hOTCwt y pAAVsc.TBG.hOTCco-LW4 se construyeron reemplazando la secuenciación de codificación mOTC con ADNc de hOTC de tipo silvestre (TS) (hOTCts) o hOTCcoLW, respectivamente, en un plásmido procedente del pAAVsc.TBG.mOTC1.3 previamente descrito con el intrón alterado [Moscioni D, et al., "Long-term correction of ammonia metabolism and prolonged survival in ornithine transcarbamylase-deficient mice following liver-directed treatment with adeno-associated viral vectors", Mol Ther. 2006; 14: 25-33; Cunningham SC, et al., "AAV2/8-mediated correction of OTC deficiency is robust in adult but not neonatal Spf(ash) mice", Mol Ther. 2009; 17: 1340-1346; Wang L, et al., "Sustained correction of OTC deficiency in spfashmice using optimized self-complementary AAV2/8 vectors", Gene Ther. abril de 2012; 19 (4): 404-10, publicación electrónica del 18 de agosto de 2011 ].

El scAAV2/8.TBG.hOTCco-LW4 contiene una ITR 3' y un ITR 5' de AAV2 con una supresión en la secuencia D y trs (sitio de resolución terminal), un promotor de TBG, el gen de hOTCco-LW4 y un poliA de SV40 de 137 pb. Las dos preparaciones de vectores (AAV2/8sc.TBG.hOTCwt y AAV2/8sc.TBG.hOTCco-LW4) utilizadas en el estudio de comparación inicial se purificaron mediante dos ciclos de centrifugación en gradiente de cloruro de cesio, como se ha descrito anteriormente [Wang L, et al., Systematic evaluation of AAV vectors for liver directed gene transfer in murine models. Mol Ther. 2010; 18: 118-125]. Los vectores utilizados en el resto del estudio se produjeron mediante un método de producción a escala basado en la transfección de polietilenimina (PEI) y se purificaron a partir del sobrenadante o lisado total mediante centrifugación en gradiente de iodixanol como se ha descrito [Lock M, et al., Hum Gene Ther.

2010; 21: 1259-1271]. Se determinaron los títulos del genoma [copias del genoma (CG)/ml] de los vectores de AAV mediante PCR en tiempo real utilizando conjuntos de cebadores y sondas dirigidos al promotor de TBG (cebador directo 5'-AAACTGCCAATTCCACTGCTG-3' [SEQ ID NO: 14], cebador inverso 5'-CCATAGGCAAAAGCACCAAGA-3' [SEQ ID NO: 15], sonda 6FAM-TTGGCCCAATAGTGAGAACTTTTTCCTGC [SEQ ID NO: 16] -TAMRA) y usando un plásmido linealizado como patrón. El cebador directo está ubicado 400 pb cadena abajo de la horquilla cerrada 5'. Fagone et al. [Systemic errors in quantitative polymerase chain reaction titration of self-complementary adenoassociated viral vectors and improved over alternative methods, Hum Gene Ther Methods. febrero de 2012; 23 (1): 1­ 7.] informaron recientemente de que el método de PCR cuantitativa (Q-PCR) podría subestimar significativamente el título de los vectores scAAV, especialmente cuando los cebadores de PCR estaban cerca de la horquilla cerrada del vector scAAV. El título de un lote de vector AAV2/8sc.TBG.hOTCco-LW4 utilizando un conjunto de cebadores y sondas dirigido a la región poliA (1900 pb cadena abajo de la horquilla cerrada 5'), y el título del genoma fue 1,1 veces el título original, que estaba dentro del error intraensayo de Q-PCR.

Se evaluaron los niveles de expresión de proteínas OTC y la actividad OTC en el hígado de ratones spfash 14 días después de la inyección i.v. de 1 x 1011 c G de los vectores AAV2/8sc.TBG.hOTCwt o AAV2/8sc.TBG.hOTCco-LW4. Los ratones spfash son un modelo de enfermedad de OTC de aparición tardía en seres humanos. Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité Institucional de Uso y Cuidado de Animales (IACUC) de la Universidad de Pensilvania. Los ratones spfash se mantuvieron en las instalaciones para animales de los laboratorios de investigación traslacional de la Universidad de Pensilvania como se ha descrito anteriormente. En los estudios se utilizaron ratones spfash de tres a seis meses de edad y sus compañeros de camada normales. Los vectores se administraron mediante inyección intravenosa (i.v.) a través de la vena de la cola. El alcance de la transferencia de genes basada en genomas de vectores residentes no fue estadísticamente diferente entre los dos grupos. Se recogieron muestras de orina antes y en varios puntos de tiempo después del tratamiento con vector para el análisis de ácido orótico como se ha descrito anteriormente [Moscioni D, et al., Longterm correction of ammonia metabolism and prolonged survival in ornithine transcarbamylase-deficient mice following liver-directed treatment with adeno-associated viral vectors. Mol Ther. 2006; 14: 25-33].

Se realizó análisis de transferencia de Western para detectar la expresión de hOTC en el lisado de hígado como se ha descrito anteriormente [Wang L, et al., 2012, publicación electrónica 2011)]. El anticuerpo primario para detectar hOTC fue un anticuerpo policlonal de conejo personalizado proporcionado por el laboratorio de Hiroki Morizono en el Centro Médico Infantil Nacional. Los lisados de hígado (10 pg/carril) también se transfirieron y exploraron con un anticuerpo anti-tubulina (Abcam, Cambridge, MA). El análisis de Western demostró una expresión 100 veces mayor de hOTC del vector hOTCco-LW4 en comparación con el vector hOTCwt, alcanzando niveles ligeramente superiores a los observados en ratones TS.

La actividad enzimática de OTC se midió utilizando un método de dilución de isótopos estables por espectrometría de masas de cromatografía líquida para detectar la formación de citrulina normalizada a [1,2,3,4,5-13C5] citrulina (98 % de 13C). El método está adaptado de un ensayo desarrollado previamente para la detección de la actividad de la N-acetilglutamato sintasa [Morizono H, et al., Mammalian N-acetylglutamate synthase. Mol Genet Metab. 2004; 81 (Supl.

1): S4-11.]. Se pesaron cortes de hígado fresco congelado y se homogeneizaron brevemente en tampón que contenía HEPES 10 mM, Triton X-100 al 0,5 %, EDTA 2,0 mM y DTT 0,5 mM. El volumen de tampón de homogeneización se ajustó para obtener 50 mg/ml de tejido. La actividad enzimática se midió utilizando 250 pg de tejido hepático en Trisacetato 50 mM, ornitina 4 mM, fosfato de carbamilo 5 mM, pH 8,3. La actividad enzimática se inició con la adición de carbamilfosfato 50 mM recién preparado disuelto en Tris-acetato 50 mM pH 8,3, se dejó continuar durante 5 minutos a 25 0C y se inactivó mediante la adición de un volumen igual de 13C5-citrulina 5 mM en TCA al 30 %. Los desechos se separaron mediante 5 minutos de microcentrifugación y los sobrenadantes se transfirieron a frascos para espectroscopia de masas. Se inyectaron diez pl de muestra en un LC-MS Agilent serie 1100 en condiciones isocráticas con una fase móvil de 93 % de disolvente A (1 ml de ácido trifluoroacético en 1 l de agua):7 % de disolvente B (1 ml de ácido trifluoroacético en 1 l de agua/acetonitrilo 1:9). Se cuantificaron los picos correspondientes a citrulina [176,1 de relación masa:carga (m/z)] y 13C5-citrulina (181,1 m/z), y sus relaciones se compararon con las relaciones obtenidas para una curva patrón de citrulina ejecutada con cada ensayo. Las muestras se normalizaron con respecto al tejido hepático total o a la concentración de proteína determinada mediante un equipo de ensayo de proteínas Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA).

Se encontró que el vector que porta ADNc de hOTC modificado por ingeniería genética denominado en el presente documento LW4 (fig. 4) mejora los niveles de proteína hOTC expresada en 100 veces. Una evaluación de la actividad enzimática de OTC se correlacionó en general con los experimentos de transferencia de Western de OTC, aunque la proteína OTC fue más elevada que la actividad enzimática de OTC en comparación con la OTC endógena. Al restar los niveles de actividad de fondo en los ratones spfash, el hOTCco-LW4 dio lugar a una actividad más de 33 veces mayor que la hOTCwt. Se observaron niveles de actividad y expresión de hOTC sostenidos y correlacionados con la dosis en los ratones spfash tratados. En comparación con un vector de OTC murino descrito anteriormente que se diferenciaba principalmente en el ADNc, el vector que portaba el vector hOTCco-LW4 era aproximadamente 10 veces más potente.

El vector ilustrativo que portaba el hOTCco-LW4 modificado (fig. 4) proporcionó un alto nivel de transducción, según lo medido por ensayos histológicos de OTC, a lo largo de una amplia gama de dosis. Entre las dosis 1 x 1011 CG y 3 x 109 CG, la eficacia de transducción, según lo medido por tinción histoquímica, varió entre 50-70 %. A la dosis más baja de 1 x 109 CG, el 40 % de las áreas hepáticas fueron positivas por tinción histoquímica de OTC. La falta de un efecto de dosis claro por histoquímica e inmunotinción podría deberse al hecho de que la optimización de codones mejoró significativamente la expresión de hOTC en los hepatocitos transducidos. Esto conduce a una sensibilidad mejorada para detectar células transducidas con bajas copias del genoma del vector. La transducción podría saturarse con altas dosis de vector (1 x 1011 - 1 x 1010 CG) y, por lo tanto, la eficacia de transducción medida por métodos de detección in situ no diferenciarían entre grupos de dosis baja y alta en contraste con la actividad enzimática de OTC en lisados hepáticos medida por espectrometría de masas.

Se realizó un estudio adicional en el que se evaluó la expresión neonatal de hOTC en ratones spfash, inyectado el día 1 de vida, utilizando scAAV2/8.TBG.hOTCco en una dosis de 5 x 1010 CG/cría inyectado a través de la vena temporal. Se detectó expresión robusta a las 24 y 48 horas. Se realizaron estudios adicionales utilizando dosis de 1 x 1011, 3 x 1010, y 1 x 1010 y se evaluaron durante 12 semanas. Durante el periodo de 16 semanas del estudio, se observó una reducción en los niveles iniciales de expresión robusta en cada una de las dosis. Se cree que esto se debe a la dilución, es decir, un resultado natural de la proliferación de células hepáticas en animales en crecimiento. Por tanto, aunque se observa restauración inicial de la actividad hepática de OTC después de la transferencia de genes neonatales en ratones spfash, este resultado es temporal, con un descenso de la actividad de OTC de aproximadamente 1000 % de los niveles de tipo silvestre (ts) en aproximadamente 1 semana, a aproximadamente 50 % de los niveles de ts a las 4 semanas, a aproximadamente 10 % de los niveles de ts a las 12 semanas (nivel de 1 x 1011 CG); o de aproximadamente 500 % de los niveles de ts en la semana 1, a aproximadamente 20 % de los niveles de ts o aproximadamente 10 % de los niveles de ts en la semana 1 (dosis de 3 x 1010 CG) o de niveles de aproximadamente 200 % de ts en la semana 1, a niveles de aproximadamente 10 % de ts en la semana 4 (dosis de 1 x 1010 CG). En un estudio, utilizando animales que reciben la primera inyección de 3 x 1010 CG el día 1, se inyectó a los animales un segundo vector AAV que portaba el gen de hOTCco (scAAVrh10.hOTCco; 1,8 x 1010 CG) en la semana 4. Como control, un grupo de animales no recibió readministración y un grupo recibió solo el segundo vector a las 4 semanas. La readministración del AAV.hOTCco dio lugar a restauración de la actividad OTC del hígado.

Se diseñaron estudios adicionales para evaluar la capacidad de rescatar crías OTC-KO mediante terapia génica neonatal, tanto a corto como a largo plazo.

Ejemplo 2: Producción de vectores scAAV que tienen secuencias con codones optimizados

A. scAAV8.TBG.hOTC-co

Los plásmidos que contienen una secuencia de hOTC con codones optimizados de las SEQ ID NO: 3, 4, 5, 9 o 10, respectivamente, se clonan como se describe en el ejemplo 1 reemplazando la secuenciación codificante de mOTC con hOTCco en un plásmido derivado del pAAVsc.TBG.mOTC1.3 previamente descrito con el intrón. El plásmido pAAVsc.TBG.hOTCco resultante se clona en una cápside de AAV8 [Gao et al., PNAS USA, 2002, 99: 11854-11859] utilizando técnicas convencionales.

B. scAAVrh10.TBG.hOTC-co

Los plásmidos que contienen una secuencia de hOTC con codones optimizados de las SEQ ID NO: 3, 4, 5, 9 o 10, respectivamente, se clonan como se describe en el ejemplo 1 reemplazando la secuenciación codificante de mOTC con hOTCco en un plásmido derivado del pAAVsc.TBG.mOTC1.3 previamente descrito con el intrón. Los plásmidos pAAVsc.TBG.hOTCco resultantes se clonan en una cápside de AAVrh10 [Gao et al., PNAS USA, 2002, 99: 11854­ 11859] utilizando técnicas convencionales.

Ejemplo 3: Producción de vectores ssAAV que tienen secuencias con codones optimizados

ssAAV2/8.LSP1.hOTC-co

Los plásmidos que contienen las secuencias de hOTCco con codones optimizados se clonan como se describe reemplazando la secuenciación de codificación de mOTC del plásmido pLSP1mOTC [Cunningham et al., Mol Ther, 2009, 17: 1340-1346] con la secuencia de ADNc correspondiente de las SEQ ID NO: 3, 4, 5, 9 o 10. Los plásmidos pAAVsc.LSP1.hOTCco resultantes se clonan en cápsides de AAV8 para formar los vectores ssAAV2/8.LSP1.hOTC-co correspondientes utilizando técnicas descritas en el ejemplo 1.

B. ssAAV2/rh10.LSP1.hOTC-co

Los plásmidos que contienen las secuencias de hOTCco con codones optimizados se clonan como se describe reemplazando la secuenciación de codificación de mOTC del plásmido pLSP1mOTC [Cunningham et al., Mol Ther, 2009, 17: 1340-1346] con la secuencia de ADNc correspondiente de las SEQ ID NO: 3, 4, 5, 9 o 10. Los plásmidos pAAVsc.LSP1.hOTCco resultantes se clonan en cápsides de AAV8 para formar los vectores ssAAV2/8.LSP1.hOTC-co correspondientes utilizando técnicas descritas en el ejemplo 1.

Los vectores generados según la Parte A o B pueden purificarse mediante dos ciclos de centrifugación en gradiente de cloruro de cesio, se intercambió el tampón con PBS y se concentraron utilizando dispositivos de filtro de centrífuga Amicon Ultra 15-100K (Millipore, Bedford, MA). El título del genoma (CG/ml) de los vectores de AAV se puede determinar mediante PCR en tiempo real utilizando un conjunto de cebador/sonda correspondiente al promotor de TBG y los patrones de plásmido linealizado. Los vectores pueden someterse a pruebas de control de calidad adicionales, incluyendo análisis de electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE) para determinar la pureza del vector y el lisado de amebocitos de Limulus (LAL) para la detección de endotoxinas (Cambrex Bio Science, Walkersville, MD, Estados Unidos).

Ejemplo 4: ssAAV8.TBG.hOTCco en el modelo de inicio tardío de OTCD

Se generó un vector de AAV8 utilizando los métodos descritos en el presente documento. El vector tiene empaquetado en el mismo una ITR 5' de AAV2, un promotor de TBG, un intrón, una hOTCco, un elemento WPRE, una poliA de hormona del crecimiento bovina y una ITR 3' de AAV2. La expresión y cinética de este vector se comparó con un vector de AAV8 autocomplementario con o sin el elemento WPRE. Los resultados muestran que las construcciones monocatenarias con el elemento WPRE superaron los vectores que carecen del elemento WPRE; a dosis comparables, ambos vectores monocatenarios (con y sin WPRE) fueron menos robustos que el vector autocomplementario que carece de WPRE en los puntos temporales medidos.

Sin embargo, los vectores monocatenarios pueden tener otras propiedades deseables, p. ej., con respecto a cinética, dependiendo de la edad y condición del paciente.

Ejemplo 5: Producción de vectores de adenovirus que tienen secuencias con codones optimizados

El ADNc de hOTCco [SEQ ID NO: 3, 4, 5, 9 y 10] con conectores NotI se clona cadena abajo de un promotor de PEPCK de rata para generar pPEPCK-hOTC como se describe en A. Mian et al., Molecular Therapy, 2004, 10: 492­ 499 (2004). Este plásmido se digiere con AscI y el fragmento de PEPCK-hOTCco resultante se inserta en el plásmido de cadena principal adenovírica pC4HSU31 para generar los plásmidos parentales pC4HSU-PEPCK-hOTCco. El plásmido pWPRE se digiere con ClaI para liberar el WPRE, que después se inserta en el sitio MluI de pPEPCK-hOTC, para generar el plásmido pPEPCK-hOTCco-WPRE con sus secuencias hOTCco respectivas. Las etapas restantes para generar el plásmido adenovírico pC4HSU-PEPCK-hOTCco-WPRE son como se ha descrito anteriormente. Todos los sitios de clonación se confirman mediante análisis de secuencia de ADN. La identidad de los plásmidos adenovíricos recombinantes puede confirmarse mediante digestión con enzimas de restricción con HindIII y BamHI. Los plásmidos adenovíricos se linealizan con PmeI antes de la transfección en células 293Cre4. Se rescatan y amplifican vectores adenovíricos con células 293Cre4 y el virus auxiliar AdlC8cluc. Pueden utilizarse células 293N3Scre8 en suspensión en la etapa final de la producción del vector. Se realizan purificación, cuantificación mediante DO260 y extracción de ADN vírico como se describe en detalle en otra parte [Brunetti-Pierri, N., et al. (2004). Acute toxicity after high-dose systemic injection of helper-dependent adenoviral vectors into nonhuman primates. Hum. Gene Ther. 15: 35-46; Ng, P., Parks, R. J. y Graham, F. L. (2002). Preparation of helper-dependent adenoviral vectors. Methods Mol. Med. 69: 371-388].

Ejemplo 6: Producción de vectores lentivíricos hOTCco

A. Los vectores lentivíricos de replicación defectuosa que contienen las secuencias de hOTCco proporcionadas en el presente documento pueden producirse reemplazando el inserto de secuencia del gen de OTC de rata del plásmido pLenti-GIII-CMV-GFP-2A-Puro [disponible en el mercado de Applied Biological Materials (ABM) Inc.; Canadá] con la secuencia de hOTCco deseada [SEQ ID NO: 3, 4, 5, 9 y 10]. Los virus se generan según las instrucciones del fabricante. El sistema ABM incluye una supresión potenciadora en la región U3 de 3'ALTR para garantizar la auto-inactivación del vector lentivírico después de la transducción e integración en el ADN genómico de la célula diana; contiene genes lentivíricos mínimos necesarios para el empaquetamiento, la replicación y la transducción (Gag/Pol/Rev), procedentes de diferentes plásmidos que carecen todos de señales de empaquetamiento; además, no se incorpora ninguno de los genes Gag, Pol o Rev en el genoma vírico empaquetado, haciendo de este modo que el virus maduro sea incompetente para replicación.

B. Vectores lentivíricos de hOTC de replicación defectuosa, no integradores Una construcción de ADN que contiene un promotor específico del hígado y el ADN de hOTCco de las SEQ ID NO: 3, 4, 5, 9 y 10 se introducen por ingeniería genética en vectores de lentivirus que se pseudotipifican en el virus sindbis E2 con envoltura producido como se describe en el documento US2011/0064763. Todos los vectores contienen donante de corte y empalme, señal de empaquetamiento (psi), un elemento de respuesta a Rev (RRE), donante de corte y empalme, aceptor de corte y empalme, tramo central de poli-purina (cPPT). El elemento WPRE se elimina en determinados virus. C. El ADN de hOTCco de las SEQ ID NO: 3, 4, 5, 9 y 10, se clona en un lentivirus pseudotipificado con un gen de la envoltura del virus de la estomatitis vesicular (VSV), obtenido de InvivoGen (SanDiego, CA) usando las instrucciones del fabricante.

Ejemplo 7: Sistemas de suministro de ARN de hOTCco de producción

El ARN puede prepararse mediante transcripción in vitro a partir de un molde de ADN o sintetizarse. Se prepara el casete de expresión de ARN que incluye una UTR 5', un intrón opcional con sitios donantes y aceptores de corte y empalme, una secuencia Kozak opcional, la secuencia codificante de hOTC proporcionada en el presente documento, una poliA y una UTR 3' usando técnicas conocidas.

A. Se incorpora una cantidad adecuada de ARNm en nanopartículas poliméricas sensibles al pH con envoltura lipídica generadas usando técnicas publicadas. [X. Su et al., Mol. Pharmaceutics, 2011, 8 (3), págs. 774-787; publicación web: 21 de marzo de 2011].

B. Las formulaciones de nanopartículas poliméricas con polietilenimina (PEI) ramificada de 25 kDa se preparan de la siguiente manera. Cuando está presente PEI, esta puede ser PEI ramificada de un peso molecular que varía de 10 a 40 kDa, p. ej., PEI ramificada de 25 kDa (Sigma n.° 408727). Los polímeros ilustrativos adicionales adecuados para la presente invención incluyen los descritos en la publicación PCT WO2013182683. Se diluye la cantidad necesaria de ARNm justo antes de su aplicación en agua para inyección (Braun, Melsungen) hasta un volumen total de 4 ml y se añade rápidamente a 4 ml de una solución acuosa de PEI ramificada de 25 kDa utilizando una pipeta en una relación N/P de 10. La solución se mezcla pipeteando arriba y abajo.

C. Para una nanopartícula a base de lípidos, se crea una formulación de lípidos utilizando un casete de expresión que contiene el ARN de hOTCco en una formulación de cK - E12:DOPE:Col:PEG-DMG2K (cantidades relativas 50:25:20:5 (mg:mg:mg:mg)) para proporcionar una solución para la administración. Se utiliza el lípido catiónico cK -E12 (véase, p. ej., documento WO 2013/063468) y se combina con dioleoilfosfatidil-etanolamina o "DOPE", colesterol (col) y polietilenglicol (PEG) o un lípido PEGilado (PEG-DMG2K) utilizando los métodos de formulación descritos en las publicaciones de patente internacional WO 2010/053572 y WO 2012/170930.

Ejemplo 8: Sistemas de suministro de ADN de hOTCco

A. ADN plasmídico desnudo: las secuencias de hOTCco [SEQ ID NO: 3, 4 o 5] se obtienen por ingeniería genética como construcciones de ADN plasmídico desnudo que se administran a una célula hepática diana (p. ej., mediante administración intravascular) y expresan la proteína OTC humana en la célula diana.

B. Complejos de ADN-lípido catiónico - Se preparan complejos de ADN-lípido catiónico utilizando una cantidad adecuada de un casete de expresión que contiene al menos un promotor, un intrón opcional, una secuencia Kozak opcional, una hOTCco de las SEQ ID NO: 3, 4 o 5, una poliA y otras secuencias de control de la expresión opcionales. El promotor puede ser un promotor específico de hígado. Como alternativa, puede seleccionarse otro promotor no específico de tejido. Por ejemplo, se formula una cantidad adecuada de ADN con un lípido catiónico de cK - E12:DOPE:Col:PEG-DMG2K (cantidades relativas 50:25:20:5 (mg:mg:mg:mg)) para formar un complejo de ADN - lípido catiónico adecuado para su administración a un sujeto. Se utiliza el lípido catiónico cK -E12 (véase, p. ej., documento WO 2013/063468) y se combina con dioleoilfosfatidil-etanolamina o "DOPE", colesterol (col) y polietilenglicol (PEG) o un lípido PEGilado (PEG-DMG2K) utilizando los métodos de formulación descritos en las publicaciones de patente internacional WO 2010/053572 y WO 2012/170930.

Ejemplo 9 Corrección a largo plazo de una forma letal neonatal de deficiencia de OTC mediante múltiples tratamientos con vectores de AAV de diferentes serotipos

En el estudio actual, el scAAV8.TBG.hOTCcoLW4 preparado como se ha descrito en el ejemplo 1 se utilizó para rescatar animales en un modelo de ratón de OTCD de inicio neonatal (temprano). Se generaron ratones OTC KO mediante la supresión de los exones 2-3 y se caracterizaron las propiedades de este ratón en términos de similitud con pacientes humanos con mutaciones nulas de OTC. En resumen, el modelo de inactivación de OTC (KO) generado en el laboratorio de los inventores a través de la supresión de los exones 2-3 imita estrechamente la forma de aparición neonatal grave de OTCD en seres humanos. Las crías machos OTC KO neonatales tienen niveles elevados de amoníaco en plasma debido a la ausencia de expresión de OTC en el hígado e inevitablemente mueren en las primeras 24 horas después del nacimiento. Las hembras heterocigotas se reproducen normalmente, tienen niveles normales de amoníaco en plasma, reducción de la actividad enzimática de OTC hepática, niveles elevados de ácido orótico en orina y, en algunos casos, menor peso corporal en comparación con los compañeros de camada de tipo silvestre (TS). Una sola inyección de vector scAAV8-hOTCco preparado como se ha descrito en el ejemplo 1 a una dosis de 1-3x10e10 CG/cría inmediatamente después del nacimiento es capaz de rescatar a las crías OTC KO y extender la vida a 6 semanas. Para lograr una corrección a largo plazo, un grupo de ratones OTC-KO de 4 semanas de edad recibió una segunda administración de vector del vector scAAVrh10-hOTCco, que se había preparado como se ha descrito en el ejemplo 1.

Se han rescatado con éxito más de 30 crías OTC-KO obtenidos por cesárea con la administración de genes. Las crías rescatadas tenían un peso corporal más bajo que sus compañeros de camada normales y tenían un fenotipo transitorio de pelaje escaso y piel anómala. Lo que es más importante, sus niveles de amoníaco en plasma estaban en el intervalo normal. Sin embargo, la eficacia no puede mantenerse más allá de las 6 semanas debido a la pérdida del genoma del vector durante la rápida proliferación hepática en la etapa neonatal. Una segunda administración de vector del vector scAAVrh10-hOTCco en ratones OTC-KO de 4 semanas de edad puede prolongar adicionalmente sus vidas hasta la adultez. Los ratones más viejos han alcanzado los 18 meses de edad. Los ratones rescatados a largo plazo muestran niveles cercanos a los normales de amoníaco en plasma, aunque los niveles de ácido orótico en orina en un subconjunto de estos ratones estaban significativamente elevados. La tinción con rojo sirio en muestras de hígado de ratones heterocigotos de diferentes edades (6, 12 y 18 meses de edad) mostró fibrosis hepática en ratonas heterocigotas OTC-KO envejecidas (18 meses), similar a una muestra de hígado de un paciente con OTCD de 11 años de edad.

Ejemplo 10: T ratamiento de la deficiencia de OTC de inicio tardío (OTCD)

Ratones heterocigotos OTC-KO de dos meses de edad recibieron una única inyección en la vena de la cola de un vector de AAV8 autocomplementario que codifica un gen de OTC humano con codones optimizados (SEQ ID NO: 5) a 1 x 1010, 3 x 1010 y 1 x 1011 copias del genoma del vector por ratón. Una semana después del tratamiento con vectores, los ratones de los tres grupos de dosis de vector tenían niveles normales de ácido orótico en orina que se mantuvieron durante todo el estudio (16 meses). Se recogieron muestras de hígado de ratones tratados de 18 meses de edad para el análisis patológico y se compararon con ratones heterocigotos sin tratar y compañeros de camada TS de la misma edad. Todos los ratones tratados mostraron una histología hepática normal similar a TS, en contraste con los animales heterocigotos sin tratar que tenían fibrosis en todo el hígado. En conclusión, una sola inyección del vector AAV8sc-hOTCco puede prevenir la fibrosis hepática en OTC-KO heterocigotos y tiene un gran potencial para la corrección de la fibrosis hepática en pacientes con OTCD.

Los vectores de terapia génica descritos en el presente documento tienen capacidad de expresión génica rápida, robusta y prolongada incluso en ratones con una falta total de OTC. Las hembras heterocigotas son capaces de reproducirse y dar a luz descendientes masculinos hemicigotos, pero estas crías mueren al día de su nacimiento si no se tratan. Las ratonas heterocigotas viejas sin tratar muestran pruebas de aumento de fibrosis y esteatosis microvesicular, un hallazgo que parece similar a las observaciones en pacientes humanos heterocigotos. Se ha desarrollado un régimen de transferencia de genes que puede rescatar a los machos afectados y los machos tratados han sobrevivido durante 72 semanas.

Por tanto, estos datos demuestran que la terapia génica específica del hígado con hOTC puede prevenir la fibrosis hepática. Estos datos se correlacionan con el tratamiento de seres humanos heterocigotos con deficiencia de OTC, p. ej., sujetos que tienen inicio tardío de OTCD.

(Texto independiente del listado de secuencias)

La siguiente información se proporciona para secuencias que contienen texto independiente con el identificador numérico <223>.

Claims (17)

REIVINDICACIONES

1. Un vector vírico recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína ornitina transcarbamilasa humana (hOTC) y secuencias de control de la expresión que dirigen la expresión de hOTC en una célula hepática, en donde la secuencia de ácido nucleico de hOTC es menos de 80 % idéntica a la secuencia de hOTC de tipo silvestre de la SEQ ID NO: 1 que codifica la proteína hOTC madura o de longitud completa y expresa una hOTC funcional, en donde dicha secuencia de ácido nucleico de hOTC se selecciona de la secuencia de ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO: 5 o una secuencia de ácido nucleico al menos de 96 % a aproximadamente 99 % idéntica a la misma.

2. El vector vírico recombinante según la reivindicación 1, en donde la secuencia de ácido nucleico de hOTC tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 5.

3. El vector vírico recombinante según la reivindicación 1, en donde la secuencia de ácido nucleico de hOTC tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 4 o de la SEQ ID NO: 3.

4. El vector vírico recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la hOTC es una OTC quimérica que comprende una secuencia de tránsito heteróloga que sustituye la secuencia de tránsito nativa de la SEQ ID NO: 5.

5. El vector vírico recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el vector vírico se selecciona de un vector de virus adenoasociado (AAV), un vector adenovírico y un vector lentivírico.

6. El vector vírico recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde las secuencias de control de la expresión comprenden un promotor específico del hígado, opcionalmente en donde el promotor específico del hígado es un promotor de globulina de unión a tiroxina (TBG).

7. El vector vírico recombinante según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde el casete de expresión comprende además uno o más de un intrón, una secuencia de Kozak, una poli A y elementos reguladores postranscripcionales.

8. El vector vírico recombinante de la reivindicación 1, en donde el vector vírico recombinante es un vector de AAV recombinante que comprende una cápside de AAV que tiene empaquetada en la misma una secuencia de ácido nucleico que comprende al menos una secuencia de ITR y el ácido nucleico que codifica hOTC, opcionalmente en donde la cápside de AAV se selecciona de AAV8, AAV9 y/o AAVrh10.

9. Un virus adenoasociado recombinante (rAAV) que tiene una cápside de AAV y empaquetado en el mismo un casete de expresión que comprende al menos una secuencia de repetición terminal invertida (ITR) de AAV, una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos la ornitina transcarbamilasa humana madura (hOTC) y secuencias de control de la expresión que dirigen la expresión de la hOTC en una célula hepática, comprendiendo dichas secuencias de control de la expresión un promotor específico del hígado, en donde la secuencia de ácido nucleico de hOTC es menos del 80 % idéntica a la secuencia de hOTC de tipo silvestre de la SEQ ID NO: 1 que codifica la proteína hOTC madura y comprende al menos la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína hOTC madura de la SEQ ID NO: 5 o una secuencia de ácido nucleico al menos de 96 % a 99,9 % idéntica a la misma.

10. El rAAV según la reivindicación 9, en donde la secuencia de ácido nucleico de hOTC tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 5.

11. El rAAV según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en donde la cápside de AAV se selecciona de AAV8, AAV9 o AAVrh10.

12. El rAAV según la reivindicación 11, en donde el casete de expresión comprende además una secuencia de repetición terminal invertida (ITR) 5' de AAV y una secuencia de ITR 3' o en donde al menos una ITR de AAV comprende una ITR 5' en la que la secuencia D y el sitio de resolución terminal se suprimen o en donde las ITR 5' y 3' son de AAV2.

13. El rAAV según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, en donde el ácido nucleico que codifica hOTC tiene la secuencia codificante de la SEQ ID NO: 3 o, en donde el ácido nucleico que codifica hOTC tiene la secuencia codificante de la SEQ ID NO: 4.

14. Un vector vírico que comprende al menos un gen de hOTC que codifica una ornitina transcarbamilasa quimérica que comprende al menos ornitina transcarbamilasa humana madura con una secuencia de tránsito heteróloga, en donde la secuencia de ácido nucleico que codifica la ornitina transcarbamilasa humana madura se selecciona de la de una secuencia de ácido nucleico de las SEQ ID NO: 3, 4 o 5.

15. El vector vírico según la reivindicación 14, en donde la secuencia codificante de hOTC es la secuencia de la SEQ ID NO: 5.

16. Una composición farmacéutica que comprende un vehículo y una cantidad eficaz del vector según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, el rAAV según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13 y/o el vector vírico según la reivindicación 14 o 15.

17. Un vector vírico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, el rAAV según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13 y/o el vector según la reivindicación 14 o 15 para su uso en un método de tratamiento de la deficiencia de ornitina transcarbamilasa (OTCD) en un paciente humano.