KR102289238B1 - 지방산의 크로마토그래피 정제 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은, 하나 이상의 제2 지방산, 선택적으로 제3 지방산 및 선택적으로 제4 지방산을 추가로 포함하는 초기 혼합물을 사용하여 제1 지방산, 바람직하게는 고도 불포화된 지방산을 정제하는 방법에 관한 것이며, 본 방법은:
- 초기 혼합물을 사용하여, 제1 크로마토그래피 분리 유닛에서 수행되며, 제1 지방산으로 농화된 제1 흐름(flow) 및 제2 지방산으로 농화된 흐름을 회수할 수 있는, 액체상에서의 제1 크로마토그래피 분리 단계;
- 선택적으로, 제1 지방산으로 농화된 제1 흐름을 사용하여, 제2 크로마토그래피 분리 유닛에서 수행되며, 제1 지방산으로 농화된 제2 흐름 및 제3 지방산으로 농화된 흐름을 회수할 수 있는, 액체상에서의 제2 크로마토그래피 분리 단계;
- 선택적으로, 제1 지방산으로 농화된 제3 흐름을 사용하여, 제3 크로마토그래피 분리 유닛에서 수행되며, 제1 지방산으로 농화된 제3 흐름 및 제4 지방산으로 농화된 흐름을 회수할 수 있는, 액체상에서의 제3 크로마토그래피 분리 단계
를 포함하며,
제1 크로마토그래피 분리 유닛, 제2 크로마토그래피 분리 유닛 및 제3 크로마토그래피 분리 유닛 중 하나 이상은 고정 상태(stationary state)에서 재순환되는 단일 컬럼을 가진 고정상 크로마토그래피 분리 유닛이다.
- 초기 혼합물을 사용하여, 제1 크로마토그래피 분리 유닛에서 수행되며, 제1 지방산으로 농화된 제1 흐름(flow) 및 제2 지방산으로 농화된 흐름을 회수할 수 있는, 액체상에서의 제1 크로마토그래피 분리 단계;
- 선택적으로, 제1 지방산으로 농화된 제1 흐름을 사용하여, 제2 크로마토그래피 분리 유닛에서 수행되며, 제1 지방산으로 농화된 제2 흐름 및 제3 지방산으로 농화된 흐름을 회수할 수 있는, 액체상에서의 제2 크로마토그래피 분리 단계;
- 선택적으로, 제1 지방산으로 농화된 제3 흐름을 사용하여, 제3 크로마토그래피 분리 유닛에서 수행되며, 제1 지방산으로 농화된 제3 흐름 및 제4 지방산으로 농화된 흐름을 회수할 수 있는, 액체상에서의 제3 크로마토그래피 분리 단계
를 포함하며,
제1 크로마토그래피 분리 유닛, 제2 크로마토그래피 분리 유닛 및 제3 크로마토그래피 분리 유닛 중 하나 이상은 고정 상태(stationary state)에서 재순환되는 단일 컬럼을 가진 고정상 크로마토그래피 분리 유닛이다.
Description
본 발명은 지방산, 상세하게는 고도 불포화된(polyunsaturated) 지방산, 예컨대 에이코사펜타에노익산(eicosapentaenoic acid)의 제조를 위한 크로마토그래피 방법, 뿐만 아니라 이러한 방법을 수행하기에 적절한 장치에 관한 것이다.
고도 불포화된 지방산(PUFA로 약칭됨)을 비롯한 지방산은, 이들이 세포막의 구축 및 유지, 혈소판 응집, 염증 과정 및 면역 반응 등에서 역할을 하는 호르몬(예, 프로스타글란딘)의 합성과 같은 많은 생물학적 과정들에 개입하기 때문에, 특히 중요한 생물학적 화합물이다.
식품을 통해 섭취되어야 하는 필수 지방산이라고 하는 2가지 패밀리의 PUFA를 제외한 대부분의 PUFA는 인체에 의해 합성될 수 있다.
필수 지방산의 2가지 패밀리는 하기와 같다:
- 오메가-6로서, 호두유, 해바라기유, 대두유, 포도씨유 또는 옥수수유 및 지방성 가금류(예, 오리)에 특히 풍부함;
- 오메가-3로서, 특히 호두유, 평지(colza) 및 아마인(flaxseed)과 같은 식물 및 지방성 어류(예, 연어, 참치, 정어리, 고등어 또는 청어)에 존재함. 미세조류, 형질전환 효모 또는 크릴(krill)의 배양물을 사용한 오메가-3의 제조 방법이 최근 개발되었다.
오메가-3는 이의 항산화 특성으로 인해 특히 흥미로운 PUFA이다. 이들 오메가-3 중에서, 정제된 EPA(에이코사펜타에노익산, C20-5ω3) 및 DHA(도코사헥사에노익산(docosahexaenoic acid), C22-6ω3) 및 이들의 농화된(enriched) 조합들은 트리글리세라이드 수준, 심혈관 위험을 감소시키며, 인지 또는 시야 등을 개선하기 위해, 식품 보조제 또는 약물로서 가장 보편적으로 사용된다.
최근의 임상 연구는, 트리글리세라이드 수준이 500 ml/dL보다 높은 환자를, DHA 없이 96%에서 EPA의 에틸 에스테르로 1일 4 g으로 치료하면, LDL 수준("나쁜" 콜레스테롤)을 증가시키지 않으면서 트리글리세라이드 수준을 감소시킬 수 있을 것이며, 한편, 각각 약 50% 및 35%에서 EPA의 에틸 에스테르와 DHA의 에틸 에스테르의 혼합물로 1일 4 g으로 치료하면, LDL 수준을 증가시키고 이와 동시에 트리글리세라이드를 감소시켰음을 보여주었다.
현재까지, 사용되는 PUFA, 특히 오메가-3의 식품 보조제는 실질적으로, EPA와 DHA의 혼합물을 30% 내지 60%로 포함하는 혼합물을 토대로 한다. 오늘날 사용되는 분리 방법에서, 혼합물은, 트리글리세라이드를 에틸 에스테르로 트랜스에스테르화한 다음, 우레아를 사용한 포화 지방산 및 단일 불포화된(mono-unsaturated) 지방산의 공동-결정화(co-crystallisation) 및/또는 분자 증류를 통한 오메가-3의 농화에 의해 수득된다. 농화된 에틸 에스테르는 화학적으로 또는 바람직하게는 효소적으로 트리글리세라이드로 재변환될 수 있다.
그러나, 이들 분리 방법은 EPA, DHA 또는 스테아리돈산(stearidonic acid)(SDA, C18-Sω3)과 같은 오메가-3를 특히 에스테르화된 형태로 80% 넘게, 심지어 96% 넘게 제조하는 데에는 만족할만하지 않다.
그러나, 오메가-3의 정제는, 이들 화합물이 이들을 산화 또는 분해에 민감하게 만드는 몇 개의 탄소-탄소 이중 결합을 포함하기 때문에, 정교하다. 산소의 존재 시와 이들이 가열될 때, 이들 PUFA는 특히, 이성질체화(isomerisation), 산화, 과산화 및 올리고머화 반응을 수행한다.
이와 같이, 전술한 분리 기술들은 양호한 산출량(output) 및 허용가능한 순도를 가진 PUFA의 혼합물을 수득할 수 있게 하지만; 이들은 PUFA의 개별 분리에는 시행될 수 있다. 따라서, 이들은 이들 사이의 오메가-3를 분리하는 것이 불가능하다. 사실상, 예를 들어 분자 증류는 EPA 또는 SDA로부터 DHA를 경제적으로 제거할 수 없으며; C20 및 C22 유형의 장쇄 오메가-3의 효과적인 분리를 허용하지 않는다. 우레아를 사용한 포접화(clathration)와 분자 증류의 조합은 일반적으로 더 낮은 산출량 및 높은 작동 비용으로 오메가-3 혼합물을 보다 높은 순도로 수득할 수 있게 하지만, 이들 사이에서 장쇄 오메가-3, 특히 EPA 및 DHA로부터 분리하는 데 사용될 수 없다.
따라서, 에스테르화된 형태의 오메가-3를 매우 높은 순도로 공업적 정제하는 방법을 제공하는 것이 요망되고 있다.
크로마토그래피는 광 및 공기로부터 동떨어진 유연한 조건에서 분자를 효과적으로 정제 또는 농화시킬 수 있는 섬세한 분리 기술이다.
이러한 기술은, 분자들이 서로 다른 상호작용을 가진 고정상(stationary phase)과 접촉되게 되는 분자의 분리를 토대로 한다. 이동상 또는 용출제로 지칭되는 하나 또는 몇몇 유체들의 사용은 다양한 분자들을 서로 다른 속도로 삼출(percolation)시킬 수 있다. 이들 서로 다른 속도는 분자들을 물리적으로 분리하고, 하나 또는 복수 개의 컬럼을 사용하는 크로마토그래피 방법의 종료 시에 분자들을 정제된 형태로 수집할 수 있게 한다. 정제된 분획은 진공에서의 증발 또는 막 방법과 같은 수단에 의해 주위 온도 또는 온건한 온도에서 온화한 조건에서 일반적으로 농축된다.
특정한 경우, 크로마토그래피 정제의 출발 생성물은, 분자 증류를 통해 이미 농화된 지방산 에스테르로 구성된 오일, 바람직하게는 산화된 화합물의 제거를 위한 처리, 마지막 분자 증류, 또는 바람직하게는 예를 들어 실리카 유도체(실리카 겔, 벤토나이트, 규조토) 또는 활성탄 상에의 흡착이 수행된, 흥미로운 오메가-3를 바람직하게는 30% 넘게 포함하는 오일이다.
오메가-3를 높은 순도로 수득하기 위한 특정 수의 크로마토그래피 방법은 기술되어 있다.
이와 같이, 문헌 US 5,719,302는, PUFA가 특히 초임계 용출제(압력 하에 카보닉 가스(carbonic gas))를, 특히 SMB("가상 이동층(Simulated Moving Bed)") 상에서, 사용하여 분리되는 방법을 기술하고 있다.
문헌 US 2011/0091947은 가상 이동층 크로마토그래피의 기술을 사용하는, 오메가-3를 정제하는 또 다른 방법을 기술하고 있다. 이 문헌은 특히, 하나의 효소적 트랜스에스테르화 단계, 2개의 분자 증류 단계 및 하나의 SMB 유형 단계의 연쇄(succession)를 기술하고 있으며, 이들 마지막 3개 단계는 생성물을 체류 시간의 순서대로 2개의 분획으로 분리할 수 있다.
문헌 WO 2011/080503은 연속적으로 배열된 2개의 SMB 크로마토그래피 장치 및 세척 구역을 포함하는 장치를 사용하는 오메가-3의 정제에 대해 기술하고 있으며, 각각의 SMB 크로마토그래피 장치는 분리 구역을 한정하며, 복수 개의 컬럼으로 구성된다. 처리되는 로드(load)는 추출물의 흐름 및 라피네이트의 흐름을 수득하기 위해 제1 분리 구역으로 주입되며, 그런 다음, 흥미로운 화합물을 포함하는 상기 라피네이트 흐름은 제1 구역의 컬럼과 인접하지 않은 제2 분리 구역의 컬럼 내로 주입된다.
문헌 WO 2013/005051은 하이드로-유기(hydro-organic) 용출제를 사용한 역상(reversed phase)의 SMB 또는 AMB(실제 이동층; Actual Moving Bed)에 의한 2개의 크로마토그래피 분리에 의한 오메가-3의 정제를 기술하고 있으며, 여기서, SMB 또는 AMB에 의한 2개의 분리는 동일한 크로마토그래피 장치 또는 2개의 서로 다른 장치 상에서 순차적으로 수행되며, 제1 장치에 의해 정제된 중간 산물은 제2 장치 내로 도입된다.
문헌 WO 2013/005048은 제1 크로마토그래피 분리 이후, 하이드로-유기 용출제를 사용한 역상의 SMB 또는 AMB에 의한 2개의 크로마토그래피 분리에 의한, 순도 90% 초과의 EPA의 정제를 기술하고 있으며, 제1 장치에 의해 정제된 중간 산물은 제2 장치 내로 도입되고, 제2 크로마토그래피 분리에 의해 정제된 중간 산물은 제3 크로마토그래피 분리 내로 도입된다.
또한, 선행 기술의 장치보다 간단한 크로마토그래피 장치에서 수행될 수 있으며, 더욱이 높은 비 생산성(specific productivity)(고정상의 질량 및 시간 단위에 의한 정제된 생성물의 질량) 및 낮은 용매 소모율로 수행되어 투자 비용을 감소시킬 수 있는, 지방산의 정제 방법, 특히 고도 불포화된 지방산의 정제 방법을 제공하는 것이 요망된다.
본 발명은 우선, 하나 이상의 제2 지방산, 선택적으로 제3 지방산 및 선택적으로 제4 지방산을 추가로 포함하는 초기 혼합물을 사용하여 제1 지방산을 정제하는 방법에 관한 것이며, 본 방법은 적어도 하기의 단계들을 포함한다:
- 초기 혼합물을 사용하여, 제1 크로마토그래피 분리 유닛에서 수행되며, 한편으로는 제1 지방산으로 농화된 제1 흐름 및 다른 한편으로는 제2 지방산으로 농화된 흐름을 회수할 수 있는, 액체상에서의 제1 크로마토그래피 분리 단계;
- 선택적으로, 제1 지방산으로 농화된 제1 흐름을 사용하여, 제2 크로마토그래피 분리 유닛에서 수행되며, 한편으로는 제1 지방산으로 농화된 제2 흐름 및 다른 한편으로는 제3 지방산으로 농화된 흐름을 회수할 수 있는, 액체상에서의 제2 크로마토그래피 분리 단계;
- 선택적으로, 제1 지방산으로 농화된 제3 흐름을 사용하여, 제3 크로마토그래피 분리 유닛에서 수행되며, 한편으로는 제1 지방산으로 농화된 제3 흐름 및 다른 한편으로는 제4 지방산으로 농화된 흐름을 회수할 수 있는, 액체상에서의 제3 크로마토그래피 분리 단계;
제1 크로마토그래피 분리 유닛, 제2 크로마토그래피 분리 유닛 및 제3 크로마토그래피 분리 유닛 중 하나 이상은 고정 상태(stationary state)에서 재순환되는 단일 컬럼을 가진 고정상 크로마토그래피 분리 유닛이다.
일 구현예에 따르면, 제1 크로마토그래피 분리 유닛은 고정 상태에서 재순환되는 단일 컬럼을 가진 고정상 크로마토그래피 분리 유닛이며; 및/또는 제2 크로마토그래피 분리 유닛은 고정 상태에서 재순환되는 단일 컬럼을 가진 고정상 크로마토그래피 분리 유닛이며; 및/또는 제3 크로마토그래피 분리 유닛은 고정 상태에서 재순환되는 단일 컬럼을 가진 고정상 크로마토그래피 분리 유닛이다.
일 구현예에 따르면, 제1 크로마토그래피 분리 유닛, 제2 크로마토그래피 분리 유닛 및 제3 크로마토그래피 분리 유닛 중 둘 이상은 고정 상태에서 재순환되는 단일 컬럼을 가진 고정상 크로마토그래피 분리 유닛이이다.
일 구현예에 따르면, 제1 크로마토그래피 분리 유닛, 제2 크로마토그래피 분리 유닛 및 제3 크로마토그래피 분리 유닛 중 하나 이상, 바람직하게는 제1 크로마토그래피 분리 유닛은 복수 개의 컬럼을 가진 크로마토그래피 분리 유닛; 보다 특히 바람직하게는 가상 이동층(simulated moving bed) 시스템 또는 실제 이동층(actual moving bed) 시스템, 또는 흐름의 주입점 및 수집점이 비동기적(asynchronous) 방식으로 주기적으로 대체되는 시스템을 가진 크로마토그래피 분리 유닛이다.
일 구현예에 따르면:
- 제1 크로마토그래피 분리 단계는 하이드로-유기 용출제인 제1 용출제를 사용하여 수행되며; 및/또는
- 적용가능한 경우, 제2 크로마토그래피 분리 단계는 하이드로-유기 용출제인 제2 용출제를 사용하여 수행되며; 및/또는
- 적용가능한 경우, 제3 크로마토그래피 분리 단계는 하이드로-유기 용출제인 제3 용출제를 사용하여 수행된다.
일 구현예에 따르면:
- 제1 용출제는 케톤 / 물 혼합물, 보다 특히 바람직한 방식으로 아세톤 / 물이며;
- 적용가능한 경우, 제2 용출제는 알코올 / 물 혼합물, 보다 특히 바람직한 방식으로 메탄올 / 물이며;
- 적용가능한 경우 바람직하게는 제3 용출제는 케톤 / 물 혼합물, 보다 특히 바람직한 방식으로 아세톤 / 물이며;
- 적용가능한 경우 바람직하게는 제1 용출제는 제2 용출제와 상이하며, 적용가능한 경우 바람직하게는 제3 용출제는 제1 용출제 및 제2 용출제와 상이하다.
일 구현예에 따르면:
- 유기 용매(들) 중 제1 용출제의 질량 농도는 약 2%, 바람직하게는 약 1%, 약 0.5%, 약 0.2% 또는 약 0.1%로 조절되며;
- 적용가능한 경우 바람직하게는, 유기 용매(들) 중 제2 용출제의 질량 농도는 약 2%, 바람직하게는 약 1%, 약 0.5%, 약 0.2% 또는 약 0.1%로 조절되고;
- 적용가능한 경우 바람직하게는, 유기 용매(들) 중 제3 용출제의 질량 농도는 약 2%, 바람직하게는 약 1%, 약 0.5%, 약 0.2% 또는 약 0.1%로 조절된다.
일 구현예에 따르면, 제1 지방산은 제1 고도 불포화된 지방산이다.
예들에 따르면:
- 제1 고도 불포화된 지방산은 에이코사펜타에노익산이며, 바람직하게는 본 방법의 종료 시에 80% 이상, 90% 이상 또는 96% 이상의 순도로 회수되거나;
- 제1 고도 불포화된 지방산은 도코사헥사에노익산이며, 바람직하게는 본 방법의 종료 시에 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상의 순도로 회수되거나;
- 제1 고도 불포화된 지방산은 아라키돈산이며, 바람직하게는 본 방법의 종료 시에 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상의 순도로 회수되거나; 또는
- 제1 고도 불포화된 지방산은 도코사펜타에노익산이며, 본 방법의 종료 시에 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상의 순도로 회수된다.
일 구현예에 따르면, 본 방법은:
- 제1 지방산과, 제1 지방산보다 오래 보유되는 화합물 또는 화합물들 사이의 하나 이상의 크로마토그래피 분리 단계, 및 바람직하게는, 제1 지방산과, 제1 지방산보다 오래 보유되는 화합물 또는 화합물들 사이의 둘 이상의 크로마토그래피 분리 단계; 및/또는
- 제1 지방산과, 제1 지방산보다 짧게 보유되는 화합물 또는 화합물들 사이의 하나 이상의 크로마토그래피 분리 단계를 포함하고;
본 방법은 바람직하게는:
- 제1 지방산과, 제1 지방산보다 오래 보유되는 화합물 또는 화합물들 사이의 크로마토그래피 분리 단계인 제1 크로마토그래피 분리 단계를 수행한 다음, 제1 지방산과, 제1 지방산보다 오래 보유되는 화합물 또는 화합물들 사이의 크로마토그래피 분리 단계인 제2 크로마토그래피 분리 단계를 수행하고, 그런 다음, 제1 지방산과, 제1 지방산보다 짧게 보유되는 화합물 또는 화합물들 사이의 크로마토그래피 분리 단계인 제3 크로마토그래피 분리 단계를 수행하는 것을 포함한다.
일 구현예에 따르면, 제1 크로마토그래피 분리 유닛, 제2 크로마토그래피 분리 유닛 및 제3 크로마토그래피 분리 유닛 중 하나 이상은 길이가 5 cm 이상, 10 cm 이상, 20 cm 이상, 25 cm 이상, 30 cm 이상, 40 cm 이상, 50 cm 이상, 60 cm 이상이며; 및/또는 직경이 10 cm 이상, 20 cm 이상, 25 cm 이상, 30 cm 이상, 40 cm 이상, 50 cm 이상, 60 cm 이상인 분리 컬럼을 포함한다.
일 구현예에 따르면:
- 제1 크로마토그래피 분리 유닛에 공급되는 초기 혼합물은 유기 용매를 80% 미만으로 포함하며, 바람직하게는 유기 용매를 60% 미만, 40% 미만, 20% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 2% 미만 또는 1% 미만으로 포함하며, 보다 특히 바람직한 방식으로 유기 용매를 실질적으로 포함하지 않는 지방산의 혼합물이며; 및/또는
- 적용가능한 경우, 제2 크로마토그래피 분리 유닛에 공급되는 제1 지방산으로 농화된 제1 흐름은 유기 용매를 80% 미만으로 포함하며, 바람직하게는 유기 용매를 60% 미만, 40% 미만, 20% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 2% 미만 또는 1% 미만으로 포함하며, 보다 특히 바람직한 방식으로 유기 용매를 실질적으로 포함하지 않는 지방산의 혼합물이며; 및/또는
- 적용가능한 경우, 제3 크로마토그래피 분리 유닛에 공급되는 제1 지방산으로 농화된 제2 흐름은 유기 용매를 80% 미만으로 포함하며, 바람직하게는 유기 용매를 60% 미만, 40% 미만, 20% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 2% 미만 또는 1% 미만으로 포함하며, 보다 특히 바람직한 방식으로 유기 용매를 실질적으로 포함하지 않는 지방산의 혼합물이다.
본 발명은 또한, 초기 혼합물을 사용하여 제1 지방산을 정제하기 위한 장치를 목적으로 하며, 이러한 장치는 하기 유닛들을 포함하며:
- 초기 혼합물의 공급관에 의해 공급되는 액체상에서의 제1 크로마토그래피 분리 유닛으로서, 이러한 분리 유닛의 배출구에는 한편으로는 제1 지방산으로 농화된 흐름의 제1 관이 연결되고 다른 한편으로는 제2 지방산으로 농화된 흐름의 관이 연결되는, 제1 크로마토그래피 분리 유닛;
- 선택적으로, 제1 지방산으로 농화된 흐름의 제1 관에 의해 공급되는 액체상에서의 제2 크로마토그래피 분리 유닛으로서, 이러한 분리 유닛의 배출구에는 한편으로는 제1 지방산으로 농화된 제2 관이 연결되고 다른 한편으로는 제3 지방산으로 농화된 흐름의 관이 연결되는, 제2 크로마토그래피 분리 유닛;
- 선택적으로, 제1 지방산으로 농화된 흐름의 제2 관에 의해 공급되는 액체상에서의 제3 크로마토그래피 분리 유닛으로서, 이러한 분리 유닛의 배출구에는 한편으로는 제1 지방산으로 농화된 제3 관이 연결되고 다른 한편으로는 제4 지방산으로 농화된 흐름의 관이 연결되는, 제3 크로마토그래피 분리 유닛;
여기서, 제1 크로마토그래피 분리 유닛, 제2 크로마토그래피 분리 유닛 및 제3 크로마토그래피 분리 유닛 중 하나 이상은 고정 상태에서 재순환되는 단일 컬럼을 가진 고정상 크로마토그래피 분리 유닛이다.
일 구현예에 따르면, 제1 크로마토그래피 분리 유닛은 고정 상태에서 재순환되는 단일 컬럼을 가진 고정상 크로마토그래피 분리 유닛이며; 및/또는 제2 크로마토그래피 분리 유닛은 고정 상태에서 재순환되는 단일 컬럼을 가진 고정상 크로마토그래피 분리 유닛이며; 및/또는 제3 크로마토그래피 분리 유닛은 고정 상태에서 재순환되는 단일 컬럼을 가진 고정상 크로마토그래피 분리 유닛이고; 바람직하게는 제1 크로마토그래피 분리 유닛, 제2 크로마토그래피 분리 유닛 및 제3 크로마토그래피 분리 유닛 중 둘 이상의 유닛은 고정 상태에서 재순환되는 단일 컬럼을 가진 고정상 크로마토그래피 분리 유닛이다.
일 구현예에 따르면, 제1 크로마토그래피 분리 유닛, 제2 크로마토그래피 분리 유닛 및 제3 크로마토그래피 분리 유닛 중 하나 이상, 바람직하게는 제1 크로마토그래피 분리 유닛은 복수 개의 컬럼을 가진 크로마토그래피 분리 유닛이며; 보다 특히 바람직한 방식으로 가상 이동층 시스템 또는 실제 이동층 시스템, 또는 흐름의 주입점 및 수집점이 비동기적 방식으로 주기적으로 대체되는 시스템이다.
일 구현예에 따르면, 제1 크로마토그래피 분리 유닛, 제2 크로마토그래피 분리 유닛 및 제3 크로마토그래피 분리 유닛 중 하나 이상은, 길이가 5 cm 이상, 10 cm 이상, 20 cm 이상, 25 cm 이상, 30 cm 이상, 40 cm 이상, 50 cm 이상, 60 cm 이상이며; 및/또는 직경이 10 cm 이상, 20 cm 이상, 25 cm 이상, 30 cm 이상, 40 cm 이상, 50 cm 이상, 60 cm 이상인 분리 컬럼을 포함한다.
본 발명은 선행 기술의 단점들을 극복할 수 있다. 본 발명은 보다 특히, 선행 기술보다 더 간단한 크로마토그래피 장치에서 수행될 수 있으며, 더욱이 특이적인 생산성이 높고 용매 소모율은 낮은, 지방산, 특히 고도 불포화된 지방산의 정제 방법을 제공한다.
이는 고정 상태에서 재순환되는 고정상 단일 컬럼 분리 유닛에서 분리 단계를 수행함으로써 달성된다.
본 발명은 다중-화합물 로드를 사용하여 식품 보조제 또는 약물의 조성물에 사용될 수 있는 고 순도의 지방산, 특히 고도 불포화된 지방산을 제공할 수 있게 하며, 사용되는 크로마토그래피 컬럼의 수를 최소화함으로써 이를 달성한다.
도 1은 본 발명의 실행을 위한 장치의 일 구현예를 도식적으로 도시한 것이다.
이하, 본 발명은 하기 상세한 설명에서 보다 상세하고 비제한적으로 기술되어야 한다.
일반적으로, 표현되는 비율은 다르게 언급되지 않는 한, 질량비이다.
하기 전체의 상세한 설명은 바람직한 구현예와 관련하여 수행되며, 여기서, 제1 지방산은 PUFA이며 "제1 PUFA"로 지칭된다. 그러나, 본 상세한 설명은 제1 지방산이 고도 불포화되지 않을 때 유사한 방식에서 유효하다. 그런 다음, 하기 상세한 설명에서 "제1 PUFA"를 보다 일반적인 용어인 "제1 지방산"으로 대체하는 것이 적절하다. 이와 같이, 제1 지방산은 또한, 포화 지방산, 단일 불포화된 지방산, 또는 분지형 지방산, 천연 지방산 또는 변형된 지방산과 같은 지방산 유도체일 수도 있다.
제조 방법
본 발명의 방법은 초기 혼합물을 사용하여 제1 PUFA를 정제된 형태로 수득할 수 있게 한다. 초기 혼합물은 제1 PUFA 외에도, 다른 바람직하지 못한 지방산, 즉 일반적으로 포화 지방산 또는 단일 불포화된 지방산 및 다른 PUFA, 뿐만 아니라 다른 가능한 불순물을 포함한다. 상기 언급된 제2 지방산, 제3 지방산 및 제4 지방산은 후자의 일부이다.
초기 혼합물은 어류, 식물, 조류 및/또는 효모, 바람직하게는 어류로부터 유래되는 지방산들의 혼합물일 수 있다. 초기 혼합물은 원료 생산물, 예를 들어 어유(fish oil), 해조유(algae oil) 또는 효모 오일(yeast oil)일 수 있다. 초기 혼합물은 또한, 상기 원료로부터 유래되는 생성물, 예를 들어 어유, 해조유 및/또는 효모 오일로부터 유래되는 생성물일 수도 있다. 오일은 예를 들어, 천연 식물, 조류 또는 효모, 또는 유전자 변형된 식물, 조류 또는 효모로부터 추출될 수 있다.
"원료로부터 유래되는 생성물"은 하나 또는 몇몇의 처리 단계를 받은 원료를 의미한다. 이들 처리 단계는 세포 분해, 분쇄, 분리 또는 정제(예, 분획화) 중 하나 이상의 단계 및/또는 트리글리세라이드를 유리 지방산으로 변환하기 위한 가수분해 단계 및/또는 지방산을 알킬 에스테르, 바람직하게는 에틸 에스테르로 변환하기 위한 트랜스에스테르화 단계 및/또는 퍼옥사이드 지수 및/또는 아니시딘 지수(아니시딘 지수)(하기와 비교)를 감소시키기 위한 단계 및/또는 분자 증류 단계 및/또는 하나 이상의 크로마토그래피 분리 단계 등을 포함한다.
유리한 구현예에 따르면, 초기 혼합물은 에스테르화된 생성물 또는 트랜스에스테르화된 생성물, 예컨대 어유, 식물유, 해조유 또는 트랜스에스테르화된 효모 오일이다.
이와 같이, 본 발명의 방법에서 수득 또는 사용되는 각각의 지방산(특히 각각의 PUFA)는 지방산 유도체, 특히 모노글리세라이드, 다이글리세라이드 또는 트리글리세라이드, 에스테르, 인지질, 아미드, 락톤 또는 염 형태의 지방산 유도체일 수 있다.
유리 지방산 및 에스테르 형태가 바람직하며, 매우 특히 에스테르가 바람직하다. 에스테르는 전형적으로 알킬 에스테르, 예를 들어 C1-C6 알킬 에스테르, 특히 C1-C4, 예를 들어 메틸 에스테르 및 에틸 에스테르이다. 에틸 에스테르가 바람직하다.
이와 같이, 본 출원에서 언급되는 제1 PUFA, 제2 지방산, 제3 지방산 및 제4 지방산은 예를 들어 유리 지방산 또는 에스테르 형태일 수 있으며, 바람직하게는 에틸 에스테르 화합물 형태이다.
도 1을 참조로, 본 발명에 따른 방법은 제1 크로마토그래피 분리 유닛(3)을 포함하는 장치에서 수행될 수 있다. 제1 크로마토그래피 분리 유닛(3)은 제1 PUFA와 제2 지방산 사이에서의 분리를 제공한다.
제1 PUFA와 주어진 지방산 사이의 분리가 본 출원에서 언급될 때마다, 주어진 지방산에 대한 분리와 동시에 제1 PUFA로부터 다른 지방산들도 분리될 수 있음을 이해한다.
일반적으로, 각각의 크로마토그래피 분리는 제1 PUFA보다 극성이 높거나 제1 PUFA보다 극성이 낮은 화합물 세트로부터 제1 PUFA를 분리한다. 분리는 또한, 지방족 사슬 길이의 크기 및 불포화 수의 기준에 따라 수행될 수 있다. 보다 일반적으로, 효과가 사용되는 용출제에 따라 다를 수 있기 때문에, 경우에 따라 상이한 체류 시간을 기준으로 분리가 수행되며, 이러한 경우, 제1 PUFA보다 오래 보유되거나 또는 더 짧게 보유되는 불순물들로부터 제1 PUFA를 분리할 수 있다.
분리 온도는 당업자에게 잘 알려져 있는 기준에 따라 5℃ 내지 90℃, 바람직하게는 15℃ 내지 60℃, 보다 바람직하게는 주위 온도 내지 45℃의 범위에서 조정될 수 있다. 적용가능한 경우, 압력은 컬럼에서 단상 상태(monophasic state), 바람직하게는 액체 또는 초임계를 유지하기 위해 조정된다.
제1 크로마토그래피 분리 유닛(3)은 지방산 혼합물(1)을 포함하는 공급관 뿐만 아니라 제1 용출제(2)를 포함하는 공급관에 의해 공급된다.
제1 크로마토그래피 분리 유닛(3)의 배출구에는, 한편으로는 제1 PUFA로 농화된 흐름의 제1관(5) 및 다른 한편으로는 제2 지방산으로 농화된 흐름의 관(4)이 연결되어 있다.
본 출원의 맥락에서, 용어 "농화된"은 상대적인 의미를 가진다: 초기 흐름으로부터 출발하는 화학종 A와 화학종 B 사이의 분리는 화학종 A로 농화된 흐름을 회수할 수 있게 하며, 회수된 흐름 그 자체는 초기 흐름의 A/B 몰 비보다 높은 A/B 몰 비를 가짐을 의미한다.
초기 혼합물은 전술한 바와 같은 예비 처리 단계들을 받았을 수 있으며, 이 경우, 상응하는 처리 유닛은 도시되진 않지만 본 발명의 장치에 포함될 수 있다.
바람직하게는, 제2 크로마토그래피 분리 유닛(6)은 제1 PUFA와 제3 지방산을 분리하기 위해 다운스트림에 제공된다. 이러한 제2 크로마토그래피 분리 유닛(6)은 제1 PUFA로 농화된 흐름의 제1 관(5)뿐만 아니라 제2 용출제를 포함하는 공급관(7)에 의해 공급된다.
제2 크로마토그래피 분리 유닛(6)의 배출구에는, 한편으로는 제1 PUFA로 농화된 흐름의 제2 관(9) 및 다른 한편으로는 제3 지방산으로 농화된 흐름의 관(8)이 연결되어 있다.
바람직하게는, 제3 크로마토그래피 분리 유닛(10)이 제1 PUFA와 제4 지방산을 분리하기 위해 제공된다. 이러한 제3 크로마토그래피 분리 유닛(10)은 제1 PUFA로 농화된 흐름의 제2 관(9)뿐만 아니라 제3 용출제를 포함하는 공급관(11)에 의해 공급된다.
제3 크로마토그래피 분리 유닛(10)의 배출구에는, 한편으로는 제1 PUFA로 농화된 흐름의 제3 관(12) 및 다른 한편으로는 제4 지방산으로 농화된 흐름의 관(13)이 연결되어 있다.
바람직하게는, 본 방법은 전술한 3개의 유닛에서의 3개의 크로마토그래피 분리 단계를 정확하게 포함한다.
다른 예로, 본 방법은 오로지 2개의 크로마토그래피 분리만 포함하며, 이 경우, 제3 크로마토그래피 분리 유닛(10)은 생략된다. 따라서, 정제된 형태의 제1 PUFA는 제1 PUFA로 농화된 흐름의 제2 관(9)에서 직접 회수된다.
보다 다른 예로, 본 방법은 오로지 하나의 크로마토그래피 분리 단계만 포함하며, 이 경우, 제2 크로마토그래피 분리 유닛(6) 및 제3 크로마토그래피 분리 유닛(10)은 생략된다. 따라서, 정제된 형태의 제1 PUFA는 제1 PUFA로 농화된 흐름의 제1 관(5)에서 직접 회수된다.
보다 다른 예로, 본 방법은 4개의(또는 그 이상의) 연속적인 크로마토그래피 분리 단계를 포함할 수 있으며, 이 경우, 부가적인 크로마토그래피 분리 유닛은 유사한 방식으로 첨가된다.
용어 "크로마토그래피 분리 유닛"은 단일 컬럼을 가진 크로마토그래피 시스템 또는 몇몇의 컬럼들을 가진 크로마토그래피 시스템을 지칭한다.
이는 고정상을 가진 크로마토그래피 시스템일 수 있거나 또는 그렇지 않을 수 있다. 고정상 크로마토그래피 시스템에서, 분리되어야 하는 화합물들의 혼합물은 인클로저(enclosure)(또는 컬럼), 일반적으로 실린더형의 인클로저 내에서 스며든다. 컬럼은 유체에 대해 투과성인 다공성 물질 층(고정상)을 함유한다. 혼합물 내 각각의 화합물의 삼출(percolation) 속도는 화합물의 물리적 특성에 따라 다르다. 고정상에 가장 잘 보유되는 화합물은, 고정상에 가장 적게 보유되는 화합물보다 느리게 스며든다. 이러한 원리에 의해, 요망되는 분리를 수행할 수 있다.
이러한 처리를 복수 개의 컬럼들에서 연속해서 또는 동시에 수행할 수 있지만, 일반적으로 고정상 시스템에서 하나의 크로마토그래피 분리는 단일 컬럼을 사용하여 수행된다.
이러한 고정상 크로마토그래피 시스템의 예는 HPLC(고성능 액체 크로마토그래피) 또는 CYCLOJET™ 시스템(즉, 고정상(stationary stage)에서 재순환되는 시스템)이다.
CYCLOJET™ 시스템은 문헌 US 6,063,284에 기술된 바와 같으며, 이를 명백하게 참조한다. 이는 단일 컬럼을 사용하는 불연속 크로마토그래피 분리 시스템이며, 여기서, (i) 가장 잘 보유되는 화학종, 및 그 다음으로 (ii) 가장 적게 보유되는 화학종이 컬럼의 배출구에서 개별적으로 수집되며, 크로마토그램의 비-분리된 부분은 주요 펌프에 의해 재순환된다. 분리되어야 하는 혼합물은 크로마토그램의 재순환된 부분에서 주입 루프에 의해 주기적으로 주입된다. 주입 루프는 바람직하게는 주요 펌프와 컬럼 사이에 연결된다. 몇 회의 크로마토그래피 사이클 후, 본 방법은 주기적인 고정 상태에 도달하며, 여기서, 주입되는 생성물의 양은 컬럼의 배출구에서 개별적으로 수집되는 생성물의 양과 동일하다.
일 구현예에 따르면, 고정 상태에서의 재순환을 포함하는 단일-컬럼 고정상 시스템에서의 크로마토그래피 분리는 실린더형이며, 하기 단계들을 포함한다:
- 용출제 펌프에 의해 컬럼 내에서 순환하는 크로마토그래피 프로파일을 구축하고 유지하는 단계;
- 루프 내에 존재하는 샘플을 순환하는 크로마토그래피 프로파일에 주입하기 위해, 분리되어야 하는 2개 이상의 화합물을 포함하는 샘플을 상기 순환하는 크로마토그래피 프로파일 내로 불연속적으로 각각의 사이클에서 주입하여, 주입은 주입 위치에서 주입 밸브에 의해 조절되는 주입 루프에 의해 수행되며, 주입 밸브는 주입 시작 시부터 전체 프로파일이 컬럼으로부터 용출되는 순간까지 주입 위치에서 유지되며, 그런 다음, 전체 프로파일이 컬럼 내에 존재할 때 주입 루프를 로딩(loading)하기 위해 주입 밸브를 로딩 위치로 스위칭(switching)하는 단계; 및
- 불연속적이며 주기적인 방식으로 순환 프로파일을 사용하여 농화된 2개 이상의 분획을 수집하는 단계.
이러한 분리는 또한, 하기 단계를 포함할 수 있다:
- 사이클 동안에 실질적으로 연속적인 방식으로 용출제 펌프에 의해 컬럼 내의 용출제를 이동상으로서 통과시키는 단계.
이러한 분리는 또한, 하기 단계들을 포함할 수 있다:
- 제1 분획의 수집 시작부터 제1 분획의 수집의 다음 시작까지 발생하는 사건들을 기록하는 단계;
- 제3 분획의 수집 동안 용출제 펌프를 방해하는 단계로서, 이러한 방해는 사이클이 종료될 때까지 계속되며, 이러한 방식으로 사이클은 일시적으로 재생될 수 있음.
일 구현예에 따르면, 유지되는 순환 프로파일에서 주입 동안에 순환 프로파일의 손실은 존재하지 않는다.
이러한 시스템에 대한 상세한 구현예는 상기 문헌 US 6,063,284의 col.5 l.36-col.10 l.41에서 언급되어 있다.
크로마토그래피 분리 유닛은 또한, 비-고정상을 포함하는 크로마토그래피 시스템일 수 있다. 비-고정상 시스템은 다중-컬럼 시스템이며, 여기서, 고정상 층(bed)의 상대적인 위치와 흐름의 주입점 및/또는 수집점의 상대적인 위치는 시간이 지남에 따라 대체된다.
비-고정상을 포함하는 이러한 크로마토그래피 시스템의 예는 SMB, iSMB, SSMB, AMB, VARICOL™, MODICON™, POWERFEED™, DCC 또는 MCSGP 시스템이다.
SMB 시스템은 흡착제를 포함하는 개별 컬럼을 복수 개로 포함하며, 이들 컬럼은 연속적으로 연결된다. 용출제 흐름은 제1 방향을 따라 컬럼을 통과한다. 공급물 흐름 및 용출제의 주입점뿐만 아니라 분리된 화합물의 수집점은 밸브 세트에 의해 주기적이고 동시적으로 시프트(shift)된다. 전반적인 효과는 고체 흡착제로 된 이동층을 포함하는 단일 컬럼의 작동을 시뮬레이션하는 것이며, 고체 흡착제는 용출제의 스트림과 반대 방향으로 이동한다. 이와 같이, SMB 시스템은, 용출제가 통과하는, 고체 흡착제로 된 고정상을 포함하는 컬럼으로 구성되지만, 작동은 흐름과 반대 방향으로 연속적인 이동층이 시뮬레이션되도록 수행된다.
SMB 시스템의 가장 보편적인 형태는 4개의 구역을 가진 SMB 시스템이다. 다른 가능한 형태는 3개의 구역을 가진 SMB 시스템, 및 2개의 구역을 가진 SMB 시스템이다(예, 명백하게 참조되는 논문 "Two Section Simulated Moving Bed Process" of Kwangnam Lee, in Separation Science and Technology 35(4):519-534, 2000에 기술된 바와 같음).
iSMB 시스템은 명백하게 참조되는 문헌 EP 0342629 및 US 5,064,539에 기술된 바와 같다. SSMB 시스템은 흐름의 도입 및 수집을 주기적으로 적용되는 이후 단계로 분리(cut)한다. iSMB 및 SSMB 시스템에는, 시스템이 생성물의 유입구 또는 배출구 없이 밀폐된 루프로서 작동하는 하나 이상의 단계가 존재한다.
SMB 시스템의 다른 대안은: 명백하게 참조되는 문헌 US 5,102,553 및 논문 "PowerFeed operation of simulated moving bed units: changing flow-rates during the switching interval", of Zhang et al. in Journal of Chromatography A, 1006:87-99, 2003에 기술된 바와 같이 시간에 따라 달라지는 SMB 시스템 및 POWERFEED™ 시스템; 명백하게 참조되는 문헌 US 7,479,228에 기술된 바와 같은 MODICON™ 시스템; 및 명백하게 참조되는 문헌 US 8,282,831에 기술된 바와 같이 내부 재순환을 가진 SMB 시스템이다.
DCC 크로마토그래피 시스템은 명백하게 참조되는 문헌 FR 2889077에 기술된 바와 같다. DCC 시스템은, 분리되어야 하는 이동상 및 혼합물의 주입점을 주기적으로 대체하는 순차적인 방법이며, 개방형 루프에서 지속적인 특징을 가진다. 이는 2개 이상의 컬럼을 사용한다.
AMB 시스템은 SMB 시스템과 유사한 작동을 가진다. 그러나, 밸브 시스템에 의해 공급 흐름 및 용출제의 주입점뿐만 아니라 수집점을 대체하는 대신, 흡착 유닛(컬럼)은 공급점 및 수집점과 관련하여 물리적으로 시트프된다. 또한, 작동은 흐름의 반대 방향으로 연속적인 이동층을 시뮬레이션할 수 있게 한다.
VARICOL™ 크로마토그래피 시스템은 문헌 US 6,136,198, US 6,375,839 US 6,413,419 및 US 6,712,973에 기술된 바와 같으며, 이들은 명백하게 참조된다. VARICOL™ 시스템은, 연속적으로 연결되는, 흡착제를 포함하는 개별 컬럼을 복수 개로 포함한다. 용출제는 제1 방향에 따라 컬럼을 통과하게 된다. SMB 시스템과는 대조적으로, 분리되어야 하는 혼합물 및 용출제의 주입점, 및 시스템에서 분리된 화합물의 수집점은 주기적으로 대체되지만, 비동기적으로 밸브 세트에 의해 대체된다. 전반적인 효과는 시간이 경과함에 따라 길이가 달라지는 분리 구역을 형성하는 것이며, 이와 같이, 고정상이 가장 유용한 구역에 고정상을 동역학적으로 할당하며, 크로마토그래피 분리 유닛이 더 적은 경우와 유사한 분리력(separation power) 및 증가된 생산성을 허용한다. SMB 시스템과는 대조적으로, VARICOL™ 시스템은 고체 흡착제의 이동층을 포함하는 단일 컬럼의 작동을 시뮬레이션하지 않으며, 고체 흡착제는 용출제의 흐름과 반대 방향으로 이동하며, 이와 같이 VARICOL™의 작동 원리는 동등한 AMB 시스템에서 수행될 수 없다.
본 발명은 고정 상태에서 재순환되는 고정상 단일 컬럼 유닛(특히, 전술한 바와 같은 CYCLOJET™ 유닛)에서 수행되는 하나 이상의 크로마토그래피 분리 단계를 제공한다.
본 방법이 오로지 하나의 크로마토그래피 분리 단계, 제1 크로마토그래피 분리 유닛(3)만 포함하는 경우, 제1 크로마토그래피 분리 유닛(3)은 고정 상태에서 재순환되는 고정상 단일 컬럼 유닛이다.
본 방법이 오로지 2개의 크로마토그래피 분리 단계인 제1 크로마토그래피 분리 유닛(3) 및 제2 크로마토그래피 분리 유닛(6)을 연속적으로 포함하는 경우,
- 오로지 제1 크로마토그래피 분리 유닛(3)만 고정 상태에서 재순환되는 고정상 단일 컬럼 유닛이거나;
- 오로지 제2 크로마토그래피 분리 유닛(6)만 고정 상태에서 재순환되는 고정상 단일 컬럼 유닛이거나; 또는
- 제1 크로마토그래피 분리 유닛(3) 및 제2 크로마토그래피 분리 유닛(6) 둘 다 고정 상태에서 재순환되는 고정상 단일 컬럼 유닛이다.
본 방법이 3개의 크로마토그래피 분리 단계인 제1 크로마토그래피 분리 유닛(3), 제2 크로마토그래피 분리 유닛(6) 및 제3 크로마토그래피 분리 유닛(10)을 연속적으로 포함하는 경우,
- 오로지 제1 크로마토그래피 분리 유닛(3)만 고정 상태에서 재순환되는 고정상 단일 컬럼 유닛이거나;
- 오로지 제2 크로마토그래피 분리 유닛(6)만 고정 상태에서 재순환되는 고정상 단일 컬럼 유닛이거나;
- 오로지 제3 크로마토그래피 분리 유닛(10)만 고정 상태에서 재순환되는 고정상 단일 컬럼 유닛이거나;
- 오로지 제1 크로마토그래피 분리 유닛(3) 및 제2 크로마토그래피 분리 유닛(6)만 고정 상태에서 재순환되는 고정상 단일 컬럼 유닛이거나;
- 오로지 제1 크로마토그래피 분리 유닛(3) 및 제3 크로마토그래피 분리 유닛(10)만 고정 상태에서 재순환되는 고정상 단일 컬럼 유닛이거나;
- 오로지 제2 크로마토그래피 분리 유닛(6) 및 제3 크로마토그래피 분리 유닛(10)만 고정 상태에서 재순환되는 고정상 단일 컬럼 유닛이거나; 또는
- 제1 크로마토그래피 분리 유닛(3), 제2 크로마토그래피 분리 유닛(6) 및 제3 크로마토그래피 분리 유닛(10) 모두 고정 상태에서 재순환되는 고정상 단일 컬럼 유닛이다.
고정 상태에서 재순환되는 고정상 유닛이 아닌 크로마토그래피 분리 유닛은 고정상 분리 유닛이거나, 단일 컬럼이거나 또는 그렇지 않거나, 또는 비-고정상 분리 유닛(다중-컬럼), 특히 VARICOL™, SMB 또는 AMB 유형일 수 있다.
이와 같이, 일 구현예에 따르면, 제1 단계는 비-고정상 유닛에서 수행되며, 제2 단계는 고정상 유닛에서 수행되고, 적용가능한 경우 제3 단계는 고정상 유닛에서 수행된다.
"적용가능한 경우"라는 표현은 "해당 크로마토그래피 분리 단계가 사실상 존재한다는 것을 가정하는 경우"를 의미한다.
일 구현예에 따르면, 제1 단계는 VARICOL™, SMB 또는 AMB 유닛에서 수행되며, 제2 단계는 CYCLOJET™ 유닛에서 수행되고, 제3 단계는 VARICOL™, SMB 또는 AMB 유닛에서 수행된다.
다른 바람직한 구현예에 따르면, 제1 단계는 VARICOL™, SMB 또는 AMB 유닛에서 수행되며, 제2 단계는 HPLC 또는 CYCLOJET™ 유닛에서 수행되고, 제3 단계는 HPLC 또는 CYCLOJET™ 유닛(이들 마지막 2개 단계들 중 하나 이상은 CYCLOJET™ 유닛에서 수행됨)에서 수행된다.
바람직한 다른 구현예에서, 제1 단계는 VARICOL™ 유닛에서 수행되며, 제2 단계는 CYCLOJET™ 유닛에서 수행되고, 제3 단계는 CYCLOJET™ 유닛에서 수행된다.
보다 다른 구현예에 따르면, 각각 하나의 단계는 HPLC 또는 CYCLOJET™ 유닛에서 수행되며, 하나 이상의 단계는 CYCLOJET™ 유닛에서 수행되며; 바람직하게는 2개 이상의 단계가 CYCLOJET™ 유닛에서 수행되고; 가능하게는 3개 단계 모두 CYCLOJET™ 유닛에서 수행된다.
분리 단계는 물리적으로 분리된 유닛에서 동시에 수행될 수 있거나, 또는 물리적으로 분리된 유닛 또는 동일한 유닛에서 순차적으로 수행될 수 있다.
2개의 크로마토그래피 분리 단계가 SMB 유형 시스템 또는 AMB 유형 시스템에서 수행될 때, 이들 단계를 동일한 SMB 시스템 또는 AMB 시스템에서 동시에 수행할 수 있음을 주지해야 한다. 동일한 장치에서 동시에 수행하는 일례는 문헌 WO 2011/080503, 문헌 WO 2013/005048 또는 문헌 WO 2013/005051에 기술되어 있으며, 이들은 명백하게 참조된다.
바람직하게는, 모든 크로마토그래피 분리 유닛들은 물리적으로 분리되어 있다.
일 구현예에 따르면, 제1 크로마토그래피 분리 유닛(3)의 분리 컬럼 또는 컬럼들(바람직하게는 분리 컬럼)은 총 길이 또는 누적 길이(cumulative length)가 5 cm 이상, 10 cm 이상, 20 cm 이상, 25 cm 이상, 30 cm 이상, 40 cm 이상, 50 cm 이상, 60 cm 이상이며; 및/또는 직경이 10 cm 이상, 20 cm 이상, 25 cm 이상, 30 cm 이상, 40 cm 이상, 50 cm 이상, 60 cm 이상이다.
일 구현예에 따르면, 제2 크로마토그래피 분리 유닛(6)의 분리 컬럼 또는 컬럼들(바람직하게는 분리 컬럼)은 총 길이 또는 누적 길이가 5 cm 이상, 10 cm 이상, 20 cm 이상, 25 cm 이상, 30 cm 이상, 40 cm 이상, 50 cm 이상, 60 cm 이상이며; 및/또는 직경이 10 cm 이상, 20 cm 이상, 25 cm 이상, 30 cm 이상, 40 cm 이상, 50 cm 이상, 60 cm 이상이다.
일 구현예에 따르면, 제3 크로마토그래피 분리 유닛(10)의 분리 컬럼 또는 컬럼들(바람직하게는 분리 컬럼)은 총 길이 또는 누적 길이가 5 cm 이상, 10 cm 이상, 20 cm 이상, 25 cm 이상, 30 cm 이상, 40 cm 이상, 50 cm 이상, 60 cm 이상이며; 및/또는 직경이 10 cm 이상, 20 cm 이상, 25 cm 이상, 30 cm 이상, 40 cm 이상, 50 cm 이상, 60 cm 이상이다.
일 구현예에 따르면, 본 발명의 방법 또는 장치에 사용되는 모든 크로마토그래피 컬럼들은 총 길이 또는 누적 길이가 5 cm 이상, 10 cm 이상, 20 cm 이상, 25 cm 이상, 30 cm 이상, 40 cm 이상, 50 cm 이상, 60 cm 이상이며; 및/또는 직경이 10 cm 이상, 20 cm 이상, 25 cm 이상, 30 cm 이상, 40 cm 이상, 50 cm 이상, 60 cm 이상이다.
컬럼의 길이 및 직경은 컬럼의 유용한 치수, 즉 컬럼 내의 고정상 층의 치수이다. 축방향 또는 방사상 실린더형 컬럼을 비롯하여 서로 다른 컬럼 기하 형태가 존재할 뿐만 아니라, 비-실린더형 구획을 가진 셀도 존재하며, 명백하게 참조된다(이러한 경우, 직경은 구획의 최대 치수를 지칭함).
각각의 크로마토그래피 분리 단계는 역상(reversed phase)에서 흡착제(고정상)로서 수행될 수 있다. 예를 들어, 흡착제는 약간 극성의 수지를 토대로 사용될 수 있거나, 또는 알킬기(특히 C4, C8, C18, C24, C30), 페닐기 또는 다른 것들과 같은 유기 기를 사용하여 화학적으로 변형된 실리카 베이스를 가진 고정상을 토대로 사용될 수 있다.
각각의 크로마토그래피 분리 단계는 하이드로-유기 용출제, 즉 하나 이상의 유기 용매와 물의 혼합물을 사용하여 수행될 수 있다. 바람직하게는, 모든 크로마토그래피 분리 단계들은 하이드로-유기 용출제를 사용하여 수행된다. 다른 예로, 순수하게 유기 용출제를 사용하여 특정한 크로마토그래피 분리 단계를 수행할 수도 있다.
본 발명의 작업(특히 하이드로-유기 용출제의 형성)에 사용될 수 있는 유기 용매는 예를 들어, 에탄올, 프로판올, 보다 바람직하게는 메탄올과 같은 알코올; 아세톤 또는 메틸에틸-케톤과 같은 케톤; 아세토니트릴과 같은 니트릴; 메틸 아세테이트 또는 에틸 아세테이트와 같은 에스테르; 테트라하이드로푸란과 같은 푸란; 다이에틸에테르 또는 메틸에틸에테르와 같은 에테르; 및 이들 중 2개 이상의 용매들의 조합이다. 메탄올 및 아세톤이 바람직한 유기 용매이다.
각각의 하이드로-유기 용출제는 물/유기 비에 의해 특정화되며, 이 비율은 용출제에서 유기 용매(들)에 대한 물의 부피비이다.
각각의 하이드로-유기 용출제의 물/유기 비는 바람직하게는 0.01:99.99 내지 30:70, 바람직하게는 5:95 내지 25:75로 다양하다.
다양한 크로마토그래피 분리 단계들은 동일한 조성물 또는 상이한 조성물을 가진 용출제를 사용하여 수행될 수 있다.
상이한 조성을 가진 용출제, 특히 상이한 물/유기 비를 가진 용출제를 사용하는 것이 바람직하며, 이는 각각의 분리 단계에서 용출제의 용출 강도를 조정하여, 각각의 단계에서 서로 다른 성분들을 분리할 수 있게 한다. 또한, 다양한 단계들에서 서로 다른 유기 용매로 구성된 용출제를 사용하여, 각각의 분리 단계에서 분리되어야 하는 특정한 화학종들 사이에서 크로마토그래피 선택성을 조정하고, 이와 같이 각각의 단계에서 서로 다른 화합물을 분리하는 것이 요망될 수 있다.
바람직하게는, 유기 용매(들) 중 제1 용출제의 질량 농도는 약 2%, 바람직하게는 약 1%, 약 0.5%, 약 0.2% 또는 약 0.1%로 조절되며; 적용가능한 경우 바람직하게는 유기 용매(들) 중 제2 용출제의 질량 농도는 약 2%, 바람직하게는 약 1%, 약 0.5%, 약 0.2% 또는 약 0.1%로 조절되고; 적용가능한 경우 바람직하게는 유기 용매(들) 중 제3 용출제의 질량 농도는 약 2%, 바람직하게는 약 1%, 약 0.5%, 약 0.2% 또는 약 0.1%로 조절된다. 용출제의 조성물의 조절은 필요한 조정을 진행하도록 물 및/또는 유기 용매(들)의 공급을 보장함으로써 수행된다.
제1 크로마토그래피 분리 단계에서, 바람직하게는 제4 PUFA보다 오래 보유되는 화합물(특히 제2 지방산)로부터 제4 PUFA가 분리된다. 이러한 경우, 제1 크로마토그래피 분리 유닛(3)이 비-고정상 유닛일 때, 제1 PUFA로 농화된 흐름은 라피네이트이고, 제2 지방산으로 농화된 유동(flux)은 추출물이다.
제2 크로마토그래피 분리 단계에서, 바람직하게는 제4 PUFA보다 오래 보유되는 화합물(특히 제3 지방산)로부터 제4 PUFA가 분리된다.
제3 크로마토그래피 분리 단계에서, 바람직하게는 제4 PUFA보다 짧게 보유되는 화합물(특히 제4 지방산)로부터 제4 PUFA가 분리된다.
크로마토그래피 분리 단계로부터 나오는 각각의 흐름은 바람직하게는, 농축 단계를 수행한다. 흐름은, 용출제(유기 용매 및 물)를 제거하기 위해 또는 유기 용매와 물 중 유기 용매의 흐름의 질량 함량을 90% 미만, 80% 미만, 70% 미만, 60% 미만, 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 2% 미만, 1% 미만, 0.5% 미만 또는 0.1% 미만의 수준으로 감소시키도록 농축된다.
이와 같이, 바람직한 구현예에서, 하나 이상의 농축 유닛(도면에 도시되지 않음)은 각각의 크로마토그래피 분리 유닛(3, 6, 10)과 연관 있다.
이와 같이, 바람직하게는, 제1 크로마토그래피 분리 종료 시 수집되는 제1 PUFA로 농화된 제1 흐름은 농축된 흐름(용출제가 감소되어 있거나 또는 유기 용매 및 물이 없거나 또는 실질적으로 없는 흐름)이며; 마찬가지로, 적용가능한 경우, 제2 크로마토그래피 분리 종료 시 수집되는 제1 PUFA로 농화된 제2 흐름은 농축된 흐름(용출제가 감소되어 있거나 또는 유기 용매 및 물이 없거나 또는 실질적으로 없는 흐름)이고; 마찬가지로, 적용가능한 경우, 제3 크로마토그래피 분리 종료 시 수집되는 제1 PUFA로 농화된 제3 흐름은 바람직하게는 농축된 흐름(용출제가 감소되어 있거나 또는 유기 용매 및 물이 없거나 또는 실질적으로 없는 흐름)이다.
가능하게는, 제2 지방산으로 농화된 흐름, 적용가능한 경우 제3 지방산으로 농화된 흐름 및 적용가능한 경우 제4 지방산으로 농화된 흐름은 농축된 흐름(용출제가 감소되어 있거나 또는 유기 용매 및 물이 없거나 또는 실질적으로 없는 흐름)이다.
각각의 농축 유닛에서, 용출제는 증발 및 축합되며, 이로써, 지방산 혼합물로부터 용출제를 분리할 수 있다. 예를 들어, 재순환 시 낙하하는 필름을 이용하는 증발기, 상승 흐름을 이용하는 증발기, 스크랩트 필름(scrapped film)을 이용하는 증발기, 박막 증발기, 열 사이펀(thermosiphon) 증발기, 회전 증발기, 증류 컬럼, 재순환 컬럼, 또는 용출제를 증발시키고 장치의 바닥에 농축된 지방산을 농축시키는 임의의 다른 증발기 또는 증발기들의 조합을 사용하는 것이 가능하다. 증발은 바람직하게는 대기압보다 낮은 압력, 특히 750 mbar 이하, 500 mbar 이하 또는 300 mbar 이하의 압력에서 수행된다.
다른 예로, 하나 이상의 분리 단계, 또는 증발과 막 분리의 조합을 이용하는 막 분리 장치가 사용될 수 있다.
농축 단계(예, 증발 및 축합 또는 그렇지 않다면 분리 단계)의 종료 시 수득되는 용출제는 본 방법의 하나 이상의 단계, 특히 크로마토그래피 분리의 하나 이상의 단계로 재순환될 수 있다.
이와 같이, 바람직하게는 본 발명의 방법은 제1 크로마토그래피 분리 단계에 사용되는 용출제의 재순환을 제공한다. 보다 특히 바람직한 방식으로, 용출제는 제1 크로마토그래피 분리 단계에 재사용되기 위해 재순환된다.
바람직하게는 본 발명의 방법은 제2 크로마토그래피 분리 단계에 사용되는 용출제의 재순환을 제공한다. 보다 특히 바람직한 방식으로, 용출제는 제2 크로마토그래피 분리 단계에 재사용되기 위해 재순환된다.
이와 같이, 바람직하게는 본 발명의 방법은 제3 크로마토그래피 분리 단계에 사용되는 용출제의 재순환을 제공한다. 보다 특히 바람직한 방식으로, 용출제는 제3 크로마토그래피 분리 단계에 재사용되기 위해 재순환된다.
특정 구현예에 따르면, 제1 PUFA로 농화된 제1 흐름을 사용하여 분리된 용출제는 50% 초과, 바람직하게는 60% 초과, 바람직하게는 70% 초과, 바람직하게는 80% 초과, 바람직하게는 90% 초과, 바람직하게는 95% 초과, 바람직하게는 98% 초과, 바람직하게는 99% 초과로 재순환된다.
특정 구현예에 따르면, 제1 PUFA로 농화된 제2 흐름을 사용하여 분리된 용출제는 50% 초과, 바람직하게는 60% 초과, 바람직하게는 70% 초과, 바람직하게는 80% 초과, 바람직하게는 90% 초과, 바람직하게는 95% 초과, 바람직하게는 98% 초과, 바람직하게는 99% 초과로 재순환된다.
특정 구현예에 따르면, 제1 PUFA로 농화된 제3 흐름을 사용하여 분리된 용출제는 50% 초과, 바람직하게는 60% 초과, 바람직하게는 70% 초과, 바람직하게는 80% 초과, 바람직하게는 90% 초과, 바람직하게는 95% 초과, 바람직하게는 98% 초과, 바람직하게는 99% 초과로 재순환된다.
특정 구현예에 따르면, 제2 지방산으로 농화된 흐름을 사용하여 분리된 용출제는 50% 초과, 바람직하게는 60% 초과, 바람직하게는 70% 초과, 바람직하게는 80% 초과, 바람직하게는 90% 초과, 바람직하게는 95% 초과, 바람직하게는 98% 초과, 바람직하게는 99% 초과로 재순환된다.
특정 구현예에 따르면, 제3 지방산으로 농화된 흐름을 사용하여 분리된 용출제는 50% 초과, 바람직하게는 60% 초과, 바람직하게는 70% 초과, 바람직하게는 80% 초과, 바람직하게는 90% 초과, 바람직하게는 95% 초과, 바람직하게는 98% 초과, 바람직하게는 99% 초과로 재순환된다.
특정 구현예에 따르면, 제4 지방산으로 농화된 흐름을 사용하여 분리된 용출제는 50% 초과, 바람직하게는 60% 초과, 바람직하게는 70% 초과, 바람직하게는 80% 초과, 바람직하게는 90% 초과, 바람직하게는 95% 초과, 바람직하게는 98% 초과, 바람직하게는 99% 초과로 재순환된다.
바람직하게는, 각각의 크로마토그래피 분리 유닛의 유입구에 공급되며 분리되어야 하는 공급 생성물은 가능한 한 용매를 함유하지 않는다.
이와 같이:
- 초기 혼합물은 유기 용매를 80% 미만으로 포함하며, 바람직하게는 유기 용매를 60% 미만, 40% 미만, 20% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 2% 미만, 1% 미만으로 포함하고, 보다 특히 바람직한 방식으로 유기 용매를 실질적으로 포함하지 않는 지방산 혼합물이며; 및/또는
- 적용가능한 경우, 제2 크로마토그래피 분리 유닛(6)에 공급되는 제1 PUFA로 농화된 제1 흐름은 유기 용매를 80% 미만으로 포함하며, 바람직하게는 유기 용매를 60% 미만, 40% 미만, 20% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 2% 미만, 1% 미만으로 포함하고, 보다 특히 바람직한 방식으로 유기 용매를 실질적으로 포함하지 않는 지방산 혼합물이며; 및/또는
- 제3 크로마토그래피 분리 유닛(10)에 공급되는 제1 PUFA로 농화된 제2 흐름은 유기 용매를 80% 미만으로 포함하며, 바람직하게는 유기 용매를 60% 미만, 40% 미만, 20% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 2% 미만, 1% 미만으로 포함하고, 보다 특히 바람직한 방식으로 유기 용매를 실질적으로 포함하지 않는 지방산 혼합물이다.
본 발명에 따른 방법은 선택적으로, 크로마토그래피 분리 후 또는 크로마토그래피 분리들 후, 산소화된(oxygenated) 화합물의 제거(또는 양의 감소) 단계를 제공한다.
바람직하게는, 이러한 단계는 크로마토그래피 분리 단계가 아니며, 크로마토그래피 분리 유닛에서 수행되지 않는다.
바람직하게는, 이러한 단계는 흐름에 존재하는 다른 지방산으로부터 제1 PUFA를 실질적으로 분리하지 않는다(알데하이드 유형 및 퍼옥사이드 유형의 산소화된 화합물의 경우는 제외함).
산소화된 화합물의 제거 단계는 직접적으로 또는 제1 PUFA로 농화된 흐름의 제3 관(12)(또는 오로지 2개의 크로마토그래피 분리 단계만 존재하는 경우 제1 PUFA로 농화된 흐름의 제2 관(9) 또는 오로지 1개의 크로마토그래피 분리 단계만 존재하는 경우 제1 PFUA로 농화된 흐름의 제1 관(5))에 의해 간접적으로 공급되는 처리 유닛(14)에서 수행될 수 있다. 이러한 유닛의 배출구에는 정제된 제1 PUFA의 수집관(15)이 연결되어 있다.
처리 유닛(14)은 특히, 통과가 짧은 분자 증류 유닛 또는 증발기일 수 있다. 통과가 짧은 증발기는 내부 축합기가 제공되며, 바람직하게는 10 mbar 미만, 바람직하게는 1 mbar 미만, 바람직하게는 0.1 mbar 미만, 바람직하게는 0.01 mbar 미만, 바람직하게는 0.001 mbar 미만의 압력 하에 200℃ 이하, 바람직하게는 150℃ 이하, 바람직하게는 120℃ 이하, 바람직하게는 100℃ 이하, 바람직하게는 80℃ 이하의 온도에서 바람직하게는 1000 s 미만, 바람직하게는 100 s 미만, 바람직하게는 10 s 미만의 체류 시간 동안 증발시킬 수 있다.
다른 예로, 처리 유닛(14)은 흡착 기판과 접촉되는 유닛일 수 있다.
흡착 기판은 퍼옥사이드 및 알데하이드 화합물과 같은 산소화된 화합물을 흡착할 수 있는 임의의 기판이다. 이는 예를 들어 실리카, 알루미나, 활성탄 및 후자의 유도체, 특히 실리카 겔, 실리케이트, 알루미네이트 및 알루미노실리케이트로부터 선택될 수 있다. 벤토나이트와 같은 클레이(clay)는 규조토와 마찬가지로 적절한 기판의 일례이다.
흡착은 불연속적으로, 즉 "회분식으로(batch)" 수행되거나 또는 흡착제 층을 통한 삼출을 통해 연속적으로 수행될 수 있다. 바람직하게는, 지방산은 이러한 단계 동안에 희석되지 않으며, 특히 용매가 첨가되지 않는다. 접촉은 예를 들어, 5분 내지 24시간, 특히 10분 내지 10시간, 20분 내지 5시간, 30분 내지 2시간 및 45분 내지 1시간 30분 동안 지속될 수 있다.
사용되는 흡착제의 양은 흡착제의 성질, 및 산소화된 화합물을 포착하는 흡착제의 능력에 따라 다르다. 흡착제의 양은 예를 들어, 처리되어야 하는 흐름(지방산 혼합물) 1 kg 당 흡착제 1 g 내지 1000 g, 특히 10 g/kg 내지 500 g/kg, 보다 특히 25 g/kg 내지 200 g/kg일 수 있다.
접촉 후, 흡착제는 지방산 혼합물로부터 분리되며, 지방산 혼합물은 잔여 흡착제에 의해 오염되지 않도록 여과될 수 있다.
바람직하게는, 산소화된 화합물과 흡착제의 결합은 실질적으로 비가역적이며, 즉, 흡착제는 재생되지 않는다. 그러나, 예를 들어, 폐기물의 부피 및/또는 처리 비용을 제한하기 위해 열 처리를 통해 흡착제를 재생하는 것이 가능하다.
처리 유닛(14)에서의 처리 단계는 처리되는 흐름의 퍼옥사이드 지수를 25% 이상, 바람직하게는 50% 이상, 바람직하게는 75% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 98% 이상 감소시킬 수 있다.
처리 유닛(14)에서의 처리 단계는 처리되는 흐름의 아니시딘 지수를 25% 이상, 바람직하게는 50% 이상, 바람직하게는 75% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상 또는 98% 이상 감소시킬 수 있다.
퍼옥사이드 지수는 지방산 혼합물 내 퍼옥사이드 화합물의 양을 측정한다. 사용되는 분석 방법은 바람직하게는 Eur Ph 2.5.5 met A이다.
아니시딘 지수는 지방산 혼합물 내 알데하이드 화합물의 양을 측정한다. 사용되는 분석 방법은 바람직하게는 Eur Ph 2.5.36이다.
일 구현예에 따르면, 처리 단계로부터 나오는 흐름(정제된 제1 PUFA의 수집관(15)에서 수집되는 생성물)의 퍼옥사이드 지수는 10 이하, 9 이하, 8 이하, 7 이하, 6 이하, 5 이하, 4 이하, 3 이하, 2 이하, 1.5 이하 또는 1 이하이다.
일 구현예에 따르면, 처리 단계로부터 나오는 흐름(정제된 제1 PUFA의 수집관(15)에서 수집되는 생성물)의 아니시딘 지수는 20 이하, 18 이하, 16 이하, 14 이하, 12 이하, 10 이하, 9 이하, 8 이하, 7 이하, 6 이하 또는 5 이하이다.
전술한 것과 유사한 또 다른 처리 단계, 보다 특히 분자 증류 단계가 또한, 업스트림, 특히 크로마토그래피 분리 단계 전에 제공될 수 있다.
수득되는
생성물
일 구현예에 따르면, 제1 PUFA는 오메가-3 지방산이다.
상이한 구현예에 따르면, 제1 PUFA는 EPA, DHA, ARA, DPA 또는 SDA일 수 있다.
일 구현예에 따르면, 제1 PUFA는 EPA이며, 제2 지방산은 포화 지방산 또는 단일 불포화된 지방산이며, 제3 지방산은 DHA 또는 SDA이고, 제4 지방산은 제3 지방산이 아닌 DHA 및 SDA이다. 예를 들어, 제3 지방산은 DHA이고, 제4 지방산은 SDA이다.
본 방법의 종료 시 수득되는 최종 생성물에서의 제1 PUFA(정제된 제1 PUFA의 수집관(15), 산소화된 화합물의 제거 단계가 존재하지 않는다면 제1 PUFA로 농화된 흐름을 수집하기 위한 제3 관(12), 또는 제3 크로마토그래피 분리 단계 또는 산소화된 화합물의 제거 단계가 존재하지 않는다면 제1 PUFA로 농화된 흐름을 수집하기 위한 제2 관(9), 또는 제2 크로마토그래피 분리 단계 및 제3 크로마토그래피 분리 단계 또는 산소화된 화합물의 제거 단계가 존재하지 않는다면 제1 PUFA로 농화된 흐름을 수집하기 위한 제1 관(5)에서 수집됨)의 농도는 (지방산의 총 양에 대해) 약 80% 이상, 바람직하게는 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상 또는 약 99% 이상일 수 있다.
이러한 최종 생성물 내 제2 지방산의 농도는 (지방산의 총 양에 대해) 약 1% 이하, 약 0.1% 이하, 약 0.05% 이하, 약 0.03% 이하 또는 약 0.01% 이하일 수 있다.
이러한 최종 생성물 내 제3 지방산의 농도는 (지방산의 총 양에 대해) 약 1% 이하, 약 0.1% 이하, 약 0.05% 이하, 약 0.03% 이하 또는 약 0.01% 이하일 수 있다.
이러한 최종 생성물 내 제4 지방산의 농도는 (지방산의 총 양에 대해) 약 1% 이하, 약 0.1% 이하, 약 0.05% 이하, 약 0.03% 이하 또는 약 0.01% 이하일 수 있다.
예를 들어, 본 방법의 종료 시 수득되는 최종 생성물은 EPA를 (지방산의 총 양에 대해) 약 80% 이상, 약 95% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상 또는 약 99% 이상의 비율로 함유할 수 있으며; 뿐만 아니라 DHA를 약 1% 이하, 약 0.1% 이하, 약 0.05% 이하, 약 0.03% 이하 또는 약 0.01% 이하의 비율로 포함할 수 있다.
예를 들어 최종 제형화 및/또는 캡슐화를 포함하는 제1 PUFA로 농화된 오일은 포장 및/또는 사용 전에 공기 및 빛으로부터 떨어져서 보관된다.
일 구현예에 따르면, 최종 생성물은 약제학적으로 및/또는 영양학적으로 허용가능한 비히클 및/또는 부형제 및/또는 희석제와 함께 조합된다. 이러한 생성물은 그 자체로 예를 들어, 캡슐, 캡(cap) 또는 정제 형태(또는 경구 투여, 국소 투여 또는 비경구 투여에 적합한 임의의 다른 형태)로 형성될 수 있다.
개별 투약량의 각각의 형태(예, 캡 또는 캡슐)는 상기 생성물을 예를 들어 250 mg 내지 1500 mg, 바람직하게는 300 mg 내지 1000 mg으로 포함할 수 있다.
생성물은 과트리글리세라이드혈증(hypertriglyceridemia), 과콜레스테롤혈증(hypercholesterolemia) 및 고혈압과 같은 심혈관 질환; 및 부정맥(arrhythmia), 심방세동(atrial fibrillation) 및/또는 심실세동(ventricular fibrillation), 심장 대상 부전(heart decompensation) 및 심부전(heart failure)과 같은 심혈관 질환의 위험 인자들의 방지 및/또는 치료 및/또는 예방; 경색(infarction) 및 재경색(re-infarction)의 일차 방지 및 이차 방지; 자가면역질환, 궤양성 대장염, 종양 병태, 신경계 질환, 세포 노화, 뇌경색, 허혈성 질환, 건선과 같이 상기 PUFA에 의해 치료될 수 있는 임의의 다른 병태의 치료를 위한 약제학적 조성물의 제조에 그 자체로 사용될 수 있다.
다른 예로, 본 생성물은 약제학적 용도, 특히 영양학적 용도에 사용될 수 있다.
실시예
하기 실시예는 본 발명을 제한하지 않으면서 본 발명을 나타낸다.
실시예
1a - 실험실 규모에서의 정제 단계
본 실시예에서, 70% 초과의 EPA를 포함하는 에틸 에스테르의 혼합물을 사용하여 2개 단계의 크로마토그래피에 의해, 94% 초과에서 EPA의 에틸 에스테르를 수득한다.
EPA를 입자의 평균 직경이 20 ㎛인 C18-역상 실리카 상에서 크로마토그래피 단계에 의해 정제한다. 크로마토그래피 조건은 하기와 같다:
- 길이가 39 cm이며 직경이 5 cm인 축방향 동적 압축기(axial dynamic compression)가 구비된 컬럼이 제공된 CYCLOJET™.
- 용출제: 93/7 v/v의 메탄올/물.
EPA를 약 94%(CPG에서의 영역)로 포함하며 DHA를 0.1%보다 적게 포함하는 분획을 수집한다. 이러한 분획에서의 EPA의 회수율은 95%보다 크다. 비생산성(specific productivity)은 순수한 EPA 2.76 kg/고정상 kg/day이다. 용출제의 특정 소모율(specific consumption)은 순수한 EPA 1 kg 당 224 L이다.
진공에서 작동되는 회전 증발기에서 농축 후, 농축된 분획은 잔여 용매를 1%보다 적게 포함한다.
실시예
1b (
비교예
)
본 실시예에서, 선행 실시예의 EPA를 70% 넘게 포함하는 에틸 에스테르의 혼합물을, 메탄올/물 용출제를 93/7 v/v를 사용하여, 길이가 9 cm이며 직경이 4.8 cm인 컬럼이 5개 제공된 VARICOL™ 시스템에서 정제한다.
라피네이트는 EPA를 약 92%(CPG에서의 영역)로 포함하며 DHA를 0.1%보다 적게 포함한다. 라피네이트에서의 EPA의 회수율은 95%보다 크다. 비생산성은 순수한 EPA 2.46 kg/고정상 kg/day이다. 용출제의 특정 소모율은 순수한 EPA 1 kg 당 258 L이다.
따라서, CYCLOJET™의 비생산성은 VARICOL™의 비생산성보다 12% 더 크며, 용출제의 특정 소모율은 VARICOL™보다 13% 더 낮다. 놀랍게도, CYCLOJET™는 이러한 1 단계 정제를 위해 VARICOL™보다 양호한 성능을 유도한다.
실시예
2a:
CYCLOJET
™에 의한 실험실 규모에서의
초정제
(ultra-purification)
본 실시예에서, 실시예 1a에서 수득된 생성물을 사용하여 크로마토그래피 단계에 의해, 96% 초과에서 EPA의 에틸 에스테르를 수득한다.
EPA를 입자의 평균 직경이 20 ㎛인 C18-역상 실리카 상에서 정제한다. 크로마토그래피 조건은 하기와 같다:
- 길이가 39 cm이며 직경이 5 cm인 축방향 동적 압축기가 구비된 컬럼이 제공된 사이클로제트(cyclojet).
- 용출제: 79/21 v/v의 아세톤/물.
수집된 분획들 중 하나는 EPA를 약 96.8%(CPG에서의 영역)로 포함하며, DHA를 0.1%보다 적게 포함한다. 추출물에서의 EPA의 회수율은 약 95%이다. 비생산성은 순수한 EPA 3.58 kg/고정상 kg/day이다. 용출제의 특정 소모율은 순수한 EPA 1 kg 당 153 L이다.
진공에서 작동되는 회전 증발기에서 농축 후, 농축된 분획은 잔여 용매를 1%보다 적게 포함한다.
실시예
2b (
비교예
)
본 실시예에서, 실시예 1a에서 수득된 농축된 라피네이트를, 아세톤/물 용출제를 79/21 v/v를 사용하여, 길이가 9 cm이며 직경이 4.8 cm인 컬럼이 5개 제공된 VARICOL™ 시스템에서 정제한다.
추출물은 EPA를 약 97%(CPG에서의 영역)로 포함하며 DHA를 0.1%보다 적게 포함한다. 추출물에서의 EPA의 회수율은 약 95%보다 크다. 비생산성은 순수한 EPA 3.35 kg/고정상 kg/day이다.
사이클로제트의 비생산성은 VARICOL™의 비생산성보다 7% 더 크다. 놀랍게도, 사이클로제트는 정제의 제2 단계 동안에 VARICOL™보다 양호한 생산성을 유도한다.
실시예
3 - 파일럿 규모에서의 3개 단계에서의 정제
본 실시예에서, EPA를 50%보다 많이 포함하는 에틸 에스테르의 혼합물을 사용하여 3개 크로마토그래피 단계에 의해, 96% 초과에서 EPA의 에틸 에스테르를 수득한다.
EPA를 C18-역상 실리카 상에서 3개 크로마토그래피 단계에 의해 정제한다. 크로마토그래피 조건은 하기와 같다:
단계 1:
- 길이가 9 cm이며 직경이 59 cm인 컬럼이 5개 제공된 VARICOL™. 컬럼의 배치: 각각 구역 1/2/3/4에서 1/1.6/1.6/0.8.
- 용출제: 90/10 v/v의 아세톤/물.
라피네이트는 EPA를 약 70%(CPG에서의 영역)로 포함한다. 진공에서 작동되는 회전 증발기에서 농축 후, 농축된 라피네이트는 잔여 용매를 1%보다 적게 포함한다.
단계 2:
- 길이가 49 cm이며 직경이 30 cm인 축방향 동적 압축기가 구비된 컬럼이 제공된 사이클로제트.
- 용출제: 93/7 v/v의 아세톤/물.
EPA를 약 94%(CPG에서의 영역)로 포함하며, DHA를 0.1%보다 적게 포함하는 분획을 수집한다. 분획에서의 EPA의 회수율은 95%보다 크다.
진공에서 작동되는 회전 증발기에서 농축 후, 농축된 분획은 잔여 용매를 1%보다 적게 포함한다.
단계 3:
- 길이가 49 cm이며 직경이 30 cm인 축방향 동적 압축기가 구비된 컬럼이 제공된 사이클로제트.
- 용출제: 79/21 v/v의 아세톤/물.
EPA를 약 96.8%(CPG에서의 영역)로 포함하며, DHA를 0.1%보다 적게 포함하는 분획을 수집한다. 분획에서의 EPA의 회수율은 95%보다 크다.
진공에서 작동되는 회전 증발기에서 농축 후, 농축된 분획은 잔여 용매를 1%보다 적게 포함한다.
Claims (15)
- 하나 이상의 제2 지방산, 선택적으로 제3 지방산 및 선택적으로 제4 지방산을 추가로 포함하는 초기 혼합물을 사용하여 제1 지방산을 정제하는 방법으로서,
- 초기 혼합물을 사용하여, 제1 크로마토그래피 분리 유닛에서 수행되며, 한편으로는 제1 지방산으로 농화된 제1 흐름(flow) 및 다른 한편으로는 제2 지방산으로 농화된 흐름을 회수할 수 있는, 액체상에서의 제1 크로마토그래피 분리 단계;
- 선택적으로, 제1 지방산으로 농화된 제1 흐름을 사용하여, 제2 크로마토그래피 분리 유닛에서 수행되며, 한편으로는 제1 지방산으로 농화된 제2 흐름 및 다른 한편으로는 제3 지방산으로 농화된 흐름을 회수할 수 있는, 액체상에서의 제2 크로마토그래피 분리 단계;
- 선택적으로, 제1 지방산으로 농화된 제3 흐름을 사용하여, 제3 크로마토그래피 분리 유닛에서 수행되며, 한편으로는 제1 지방산으로 농화된 제3 흐름 및 다른 한편으로는 제4 지방산으로 농화된 흐름을 회수할 수 있는, 액체상에서의 제3 크로마토그래피 분리 단계
를 포함하며;
상기 제1 크로마토그래피 분리 유닛, 상기 제2 크로마토그래피 분리 유닛 및 상기 제3 크로마토그래피 분리 유닛 중 하나 이상이 고정 상태(stationary state)에서 재순환되는 단일 컬럼을 가진 고정상 크로마토그래피 분리 유닛인, 정제 방법. - 제1항에 있어서,
상기 제1 크로마토그래피 분리 유닛이 고정 상태에서 재순환되는 단일 컬럼을 가진 고정상 크로마토그래피 분리 유닛이고; 또는
상기 제2 크로마토그래피 분리 유닛이 고정 상태에서 재순환되는 단일 컬럼을 가진 고정상 크로마토그래피 분리 유닛이고; 또는
상기 제3 크로마토그래피 분리 유닛이 고정 상태에서 재순환되는 단일 컬럼을 가진 고정상 크로마토그래피 분리 유닛인 것을 특징으로 하는, 정제 방법. - 제1항에 있어서,
상기 제1 크로마토그래피 분리 유닛, 상기 제2 크로마토그래피 분리 유닛 및 상기 제3 크로마토그래피 분리 유닛 중 둘 이상의 유닛이 고정 상태에서 재순환되는 단일 컬럼을 가진 고정상 크로마토그래피 분리 유닛인 것을 특징으로 하는, 정제 방법. - 제1항에 있어서,
상기 제1 크로마토그래피 분리 유닛, 상기 제2 크로마토그래피 분리 유닛 및 상기 제3 크로마토그래피 분리 유닛 중 하나 이상이
복수 개의 컬럼을 가진 크로마토그래피 분리 유닛, 또는
가상 이동층(simulated moving bed) 시스템 또는 실제 이동층(actual moving bed) 시스템, 또는 흐름의 주입점 및 수집점이 비동기적(asynchronous) 방식으로 주기적으로 대체되는 시스템
인 것을 특징으로 하는, 정제 방법. - 제1항에 있어서,
- 상기 제1 크로마토그래피 분리 단계가 하이드로-유기 용출제인 제1 용출제를 사용하여 수행되거나; 또는
- 적용가능한 경우, 상기 제2 크로마토그래피 분리 단계가 하이드로-유기 용출제인 제2 용출제를 사용하여 수행되거나; 또는
- 적용가능한 경우, 상기 제3 크로마토그래피 분리 단계가 하이드로-유기 용출제인 제3 용출제를 사용하여 수행되거나; 또는
- 상기 제1 크로마토그래피 분리 단계가 하이드로-유기 용출제인 제1 용출제를 사용하여 수행되고, 적용가능한 경우 상기 제2 크로마토그래피 분리 단계가 하이드로-유기 용출제인 제2 용출제를 사용하여 수행되고, 적용가능한 경우 상기 제3 크로마토그래피 분리 단계가 하이드로-유기 용출제인 제3 용출제를 사용하여 수행되는 것을 특징으로 하는, 정제 방법. - 제5항에 있어서,
- 상기 제1 용출제가 케톤 / 물 혼합물, 또는 아세톤 / 물이며;
- 적용가능한 경우, 상기 제2 용출제가 알코올 / 물 혼합물, 또는 메탄올 / 물이며;
- 적용가능한 경우, 상기 제3 용출제가 케톤 / 물 혼합물, 또는 아세톤 / 물이며;
- 적용가능한 경우, 상기 제1 용출제가 상기 제2 용출제와 상이하며, 적용가능한 경우, 상기 제3 용출제가 상기 제1 용출제 및 상기 제2 용출제와 상이한 것을 특징으로 하는, 정제 방법. - 제1항에 있어서,
- 유기 용매(들) 중 상기 제1 용출제의 질량 농도가 2%, 1%, 0.5%, 0.2% 또는 0.1%로 조절되며;
- 적용가능한 경우, 유기 용매(들) 중 상기 제2 용출제의 질량 농도가 2%, 1%, 0.5%, 0.2% 또는 0.1%로 조절되고;
- 적용가능한 경우, 유기 용매(들) 중 상기 제3 용출제의 질량 농도가 2%, 1%, 0.5%, 0.2% 또는 0.1%로 조절되는 것을 특징으로 하는, 정제 방법. - 제1항에 있어서,
상기 제1 지방산이 제1 고도 불포화된 지방산(polyunsaturated fatty acid)이고; 또는
상기 제1 지방산이
- 에이코사펜타에노익산이며, 상기 방법의 종료 시에 80% 이상, 90% 이상 또는 96% 이상의 순도로 회수되는, 제1 고도 불포화된 지방산;
- 도코사헥사에노익산이며, 상기 방법의 종료 시에 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상의 순도로 회수되는, 제1 고도 불포화된 지방산;
- 아라키돈산이며, 상기 방법의 종료 시에 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상의 순도로 회수되는, 제1 고도 불포화된 지방산; 또는
- 도코사펜타에노익산이며, 상기 방법의 종료 시에 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 또는 95% 이상의 순도로 회수되는 제1 고도 불포화된 지방산
인 것을 특징으로 하는, 정제 방법. - 제1항에 있어서,
상기 정제 방법이
- 상기 제1 지방산과, 제1 지방산보다 오래 보유되는 화합물 또는 화합물들 사이의 하나 이상의 크로마토그래피 분리 단계, 또는 상기 제1 지방산과, 제1 지방산보다 오래 보유되는 화합물 또는 화합물들 사이의 둘 이상의 크로마토그래피 분리 단계; 또는
- 상기 제1 지방산과, 제1 지방산보다 짧게 보유되는 화합물 또는 화합물들 사이의 하나 이상의 크로마토그래피 분리 단계
를 포함하고; 또는
상기 정제 방법이
- 상기 제1 지방산과, 제1 지방산보다 오래 보유되는 화합물 또는 화합물들 사이의 크로마토그래피 분리 단계인 제1 크로마토그래피 분리 단계를 수행한 다음, 상기 제1 지방산과, 제1 지방산보다 오래 보유되는 화합물 또는 화합물들 사이의 크로마토그래피 분리 단계인 제2 크로마토그래피 분리 단계를 수행하고, 그런 다음, 상기 제1 지방산과, 제1 지방산보다 짧게 보유되는 화합물 또는 화합물들 사이의 크로마토그래피 분리 단계인 제3 크로마토그래피 분리 단계를 수행하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는, 정제 방법. - 제1항에 있어서,
상기 제1 크로마토그래피 분리 유닛, 상기 제2 크로마토그래피 분리 유닛 및 상기 제3 크로마토그래피 분리 유닛 중 하나 이상이
길이가 5 cm 이상, 10 cm 이상, 20 cm 이상, 25 cm 이상, 30 cm 이상, 40 cm 이상, 50 cm 이상, 또는 60 cm 이상인 분리 컬럼; 또는
직경이 10 cm 이상, 20 cm 이상, 25 cm 이상, 30 cm 이상, 40 cm 이상, 50 cm 이상, 또는 60 cm 이상인 분리 컬럼; 또는
길이가 5 cm 이상, 10 cm 이상, 20 cm 이상, 25 cm 이상, 30 cm 이상, 40 cm 이상, 50 cm 이상, 또는 60 cm 이상이고, 직경이 10 cm 이상, 20 cm 이상, 25 cm 이상, 30 cm 이상, 40 cm 이상, 50 cm 이상, 또는 60 cm 이상인 분리 컬럼
을 포함하는 것을 특징으로 하는, 정제 방법. - 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
- 상기 제1 크로마토그래피 분리 유닛에 공급되는 초기 혼합물이 유기 용매를 80% 미만, 60% 미만, 40% 미만, 20% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 2% 미만 또는 1% 미만으로 포함하거나, 또는 유기 용매를 실질적으로 포함하지 않는 지방산의 혼합물이며; 또는
- 적용가능한 경우, 상기 제2 크로마토그래피 분리 유닛에 공급되는 제1 지방산으로 농화된 제1 흐름이 유기 용매를 80% 미만, 60% 미만, 40% 미만, 20% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 2% 미만 또는 1% 미만으로 포함하거나, 또는 유기 용매를 실질적으로 포함하지 않는 지방산의 혼합물이며; 또는
- 적용가능한 경우, 상기 제3 크로마토그래피 분리 유닛에 공급되는 제1 지방산으로 농화된 제2 흐름이 유기 용매를 80% 미만, 60% 미만, 40% 미만, 20% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 2% 미만 또는 1% 미만으로 포함하거나, 또는 유기 용매를 실질적으로 포함하지 않는 지방산의 혼합물이며; 또는
- 상기 제1 크로마토그래피 분리 유닛에 공급되는 초기 혼합물이 유기 용매를 80% 미만으로 포함하고, 적용가능한 경우 상기 제2 크로마토그래피 분리 유닛에 공급되는 제1 지방산으로 농화된 제1 흐름이 유기 용매를 80% 미만으로 포함하고, 적용가능한 경우 상기 제3 크로마토그래피 분리 유닛에 공급되는 제1 지방산으로 농화된 제2 흐름이 유기 용매를 80% 미만으로 포함하고; 또는
- 상기 제1 크로마토그래피 분리 유닛에 공급되는 초기 혼합물이 유기 용매를 실질적으로 포함하지 않는 지방산의 혼합물이고, 적용가능한 경우 상기 제2 크로마토그래피 분리 유닛에 공급되는 제1 지방산으로 농화된 제1 흐름이 유기 용매를 실질적으로 포함하지 않는 지방산의 혼합물이고, 적용가능한 경우 상기 제3 크로마토그래피 분리 유닛에 공급되는 제1 지방산으로 농화된 제2 흐름이 유기 용매를 실질적으로 포함하지 않는 지방산의 혼합물인 것을 특징으로 하는, 정제 방법. - 하기의 유닛들을 포함하는, 초기 혼합물을 사용하여 제1 지방산을 정제하기 위한 장치로서,
- 초기 혼합물의 공급관(1)에 의해 공급되는 액체상에서의 제1 크로마토그래피 분리 유닛(3)으로서, 상기 분리 유닛(3)의 배출구에는 한편으로는 제1 지방산으로 농화된 흐름의 제1 관(5)이 연결되고 다른 한편으로는 제2 지방산으로 농화된 흐름의 관(4)이 연결되는, 제1 크로마토그래피 분리 유닛(3);
- 선택적으로, 제1 지방산으로 농화된 흐름의 제1 관(5)에 의해 공급되는 액체상에서의 제2 크로마토그래피 분리 유닛(6)으로서, 상기 분리 유닛(6)의 배출구에는 한편으로는 제1 지방산으로 농화된 제2 관(9)이 연결되고 다른 한편으로는 제3 지방산으로 농화된 흐름의 관(8)이 연결되는, 제2 크로마토그래피 분리 유닛(6);
- 선택적으로, 제1 지방산으로 농화된 흐름의 제2 관(9)에 의해 공급되는 액체상에서의 제3 크로마토그래피 분리 유닛(10)으로서, 상기 분리 유닛(10)의 배출구에는 한편으로는 제1 지방산으로 농화된 제3 관(12)이 연결되고 다른 한편으로는 제4 지방산으로 농화된 흐름의 관(13)이 연결되는, 제3 크로마토그래피 분리 유닛(10);
상기 제1 크로마토그래피 분리 유닛(3), 상기 제2 크로마토그래피 분리 유닛(6) 및 상기 제3 크로마토그래피 분리 유닛(10) 중 하나 이상이 고정 상태에서 재순환되는 단일 컬럼을 가진 고정상 크로마토그래피 분리 유닛인, 정제 장치. - 제12항에 있어서,
상기 제1 크로마토그래피 분리 유닛(3)이 고정 상태에서 재순환되는 단일 컬럼을 가진 고정상 크로마토그래피 분리 유닛이거나; 또는
상기 제2 크로마토그래피 분리 유닛(6)이 고정 상태에서 재순환되는 단일 컬럼을 가진 고정상 크로마토그래피 분리 유닛이거나; 또는
상기 제3 크로마토그래피 분리 유닛(10)이 고정 상태에서 재순환되는 단일 컬럼을 가진 고정상 크로마토그래피 분리 유닛이거나; 또는
상기 제1 크로마토그래피 분리 유닛(3), 상기 제2 크로마토그래피 분리 유닛(6) 및 상기 제3 크로마토그래피 분리 유닛(10) 중 둘 이상의 유닛이 고정 상태에서 재순환되는 단일 컬럼을 가진 고정상 크로마토그래피 분리 유닛이거나; 또는
상기 제1 크로마토그래피 분리 유닛(3)이 고정 상태에서 재순환되는 단일 컬럼을 가진 고정상 크로마토그래피 분리 유닛이고, 상기 제2 크로마토그래피 분리 유닛(6)이 고정 상태에서 재순환되는 단일 컬럼을 가진 고정상 크로마토그래피 분리 유닛이고, 상기 제3 크로마토그래피 분리 유닛(10)이 고정 상태에서 재순환되는 단일 컬럼을 가진 고정상 크로마토그래피 분리 유닛인 것을 특징으로 하는, 정제 장치. - 제12항에 있어서,
상기 제1 크로마토그래피 분리 유닛(3), 상기 제2 크로마토그래피 분리 유닛(6) 및 상기 제3 크로마토그래피 분리 유닛(10) 중 하나 이상이
복수 개의 컬럼을 가진 크로마토그래피 분리 유닛; 또는
가상 이동층 시스템 또는 실제 이동층 시스템, 또는 흐름의 주입점 및 수집점이 비동기적 방식으로 주기적으로 대체되는 시스템
인 것을 특징으로 하는, 정제 장치. - 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제1 크로마토그래피 분리 유닛(3), 상기 제2 크로마토그래피 분리 유닛(6) 및 상기 제3 크로마토그래피 분리 유닛(10) 중 하나 이상이,
길이가 5 cm 이상, 10 cm 이상, 20 cm 이상, 25 cm 이상, 30 cm 이상, 40 cm 이상, 50 cm 이상, 60 cm 이상인 분리 컬럼; 또는
직경이 10 cm 이상, 20 cm 이상, 25 cm 이상, 30 cm 이상, 40 cm 이상, 50 cm 이상, 60 cm 이상인 분리 컬럼; 또는
길이가 5 cm 이상, 10 cm 이상, 20 cm 이상, 25 cm 이상, 30 cm 이상, 40 cm 이상, 50 cm 이상, 60 cm 이상이고, 직경이 10 cm 이상, 20 cm 이상, 25 cm 이상, 30 cm 이상, 40 cm 이상, 50 cm 이상, 60 cm 이상인 분리 컬럼
을 포함하는 것을 특징으로 하는, 정제 장치.
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