KR101357298B1 - 오메가-3계 고도불포화 지방산의 고순도 정제방법 - Google Patents
오메가-3계 고도불포화 지방산의 고순도 정제방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 오메가-3계 고도불포화 지방산의 고순도 정제방법에 관한 것으로, 구체적으로는 a) 캔디다(Candida) 속, 리조퍼스(Rhizopus) 속, 무코(Mucor) 속, 아스퍼질러스(Aspergillus) 속 및 수도모나스(Pseudomonas) 속으로 이루어진 군에서 선택되는 하나이상의 미생물에서 추출된 효소촉매 존재하에서 천연유지를 에탄올을 이용 에탄올리시스(ethanolysis)하여 지방산 에틸 에스테르(Fatty acid ethyl ester; FAEE)를 제조하는 단계;b) 상기 제조된 지방산 알킬 에스테르를 100 내지 200℃ 및 0.001 내지 10mmHg에서 단증류(Short Path Distillation;SPD) 장치를 이용하여 예비증류하는 단계;c) 상기 예비증류를 거친 알킬 에스테르화물을 100 내지 200℃ 및 0.001 내지 10mmHg에서 감압분별증류하여 농축지방산이 형성되는 단계; d) 상기 포화지방산이 제거된 농축지방산을 모사 이동상(Simulated Moving Bed;SMB) 컬럼 크로마토그래피를 통해 정제하는 단계;를 포함하는 오메가-3계 고도불포화 지방산의 고순도 정제방법.를 포함하여 환경친화적이면서도 용이하게 이용할 수 있는 오메가-3계 고도불포화 지방산의 고순도 정제방법에 관한 것이다.
오메가-3, 고도불포화 지방산, DHA, EPA, 분리, 정제, 고순도, 분별증류, 크로마토그래피
Description
본 발명은 오메가-3계 고도불포화 지방산의 고순도 정제방법에 관한 것으로, 구체적으로 생선기름에서 유래한 필수지방산의 하나인 오메가-3 지방산 계열의 고도불포화 지방산을 환경친화적이면서도 고순도로 농축 또는 정제하는 방법에 관한 것이다.
고도불포화 지방산이란 그 분자구조 내에 이중결합이 2개 이상인 지방산을 일컫는 말로 콜레스테롤을 낮추어주고 동맥경화와 같은 순환계 질환의 예방과 치료에 그 효능이 입증 되면서 최근에는 필수아미노산, 필수 비타민 등과 아울러 필수 지방산이라 불리어질 만큼 그 중요성이 높게 인식되어지고 있다.
이들은 주로 홍화씨유 대두유, 해발라기씨유, 옥수수기름, 들기름, 등의 종자유나 견과류에 들어있는 리놀산 또는 리놀레산과, 아마인유나 들깨에 포함된 알파 리놀렌산, 달맞이꽃 종자유에 포함된 감마리놀렌산, 그리고 꽁치, 정어리, 고등어, 참치 등 주로 등푸른 생선에 포함된 EPA, DHA 등과 그리고 최근 미생물이나 미세조류의 배양체으로부터 직접 얻어지는 아라키돈산을 주로 포함한다.
이들 지방산은 이중결합을 2개에서 6개까지 포함하는 대표적인 고도 불포화지방산으로 최근 건강기능성 뉴트라슈티컬(Nutraceutical) 식품소재에서부터 원료의약 소재로까지 널리 이용되고 있으며 스웨덴 덴마크 등 북유럽을 시작으로 북미 캐나다, 미국을 꺼쳐 중동과 중국에 까지 인지도가 급속히 확대되고 있으며 QOL(quality of life)을 개선하는 식품의 하나로 널리 인식되어지고 있다.
그중에서도 노르웨이 프로노바社에서 개발한 오마코라는 고순도 DHA 함유 제품은 가장 최근에 FDA에서 전문의약품으로 승인을 받은 새로운 계열의 고중성지방혈증 및 심근경색 후 2차 예방 약제로 고중성지방 환자에게는 45%까지 중성지방 수치를 낮춰 주고, 심근경색 후 2차 예방목적으로 복용시 심혈관 질환 사망률을 30% 이상 낮추어 주는 강력한 효과가 확인되고 있다.
특히 생선기름에서 정제, 농축한 전문 의약품이기 때문에 고중성지방혈증 환자에게서 흔하게 나타나는 고콜레스테롤혈증, 당뇨병 등의 치료를 위해 투약되는 타 약물과의 병용투여 시 약물상호작용이 없다는 것이 큰 장점으로 안전성과 내약성이 우수한 것으로 임상결과 밝혀졌다.
오마코TM는 이미 2004년 11월에 FDA에서 오메가-3 지방산 제품으로는 최초로 전문의약품으로 승인을 얻어 2005년 10월부터 미국에서 동일한 제품명으로 발매되어 발매 10주 만에 폭발적인 반응으로 이미 블록버스터로의 가능성을 보이고 있으며 유럽 대부분의 국가와 아시아에서 승인을 받아 국가별로 화이자, SPA, 시그마 타우, 솔베이, 아스트라제네카 등이 제휴해서 시판하고 있으며, 일본에서는 타케다가 그리고 한국에서는 건일제약이 시판중이다.
하지만 DHA와 같은 고도불포화산은 주로 생선기름에 포함되어 있는데 그 중에서도, 참치의 안구(眼球) 기름에 20~25% 포함되어 있다. 노르웨이 등 북유럽 국가의 경우 연어기름을 사용하고 일본의 경우 참치유를 사용하지만, 우리나라의 경우 대부분의 원료를 캐나다, 호주, 일본, 동남아(태국,말레이시아, 필리핀) 등에서 수입하고 있다.
또한, 이들 지방산은 공기 속에서 쉽게 산화되어 과산화물을 생성하거나 중합하기 쉬우며, 어유(魚油)에서 악취가 나게 되는데, 이것은 그 성분 속에 들어 있는 고도불포화산이 산화, 분해되어 생성된 물질 때문이다. 따라서 이들 지방산을 생선기름에서 분리하여 농축하고 정제하는데 별도의 전처리 방법과 특수한 정제공정이 필요하게 된다.
일반적으로 동식물에서 채취한 원유는 각종 불순물을 함유하고 있다. 불순물에는 당류, 단백질 및 그 분해물, 인지질, 스테린, 토코페롤, 색소, 점질물질, 지방산 등이 있는데 토코페롤은 천연의 항산화제이기 때문에, 오히려 바람직한 물질이다. 하지만 인지질, 당류, 단백질, 점질물 등은 유지의 가공과정에서 유지를 어두운 색으로 착색시키거나, 발연시키거나 기포를 발생시키는 원인이 되거나 하므로 미리 제거해야만 한다. 또한 유리 지방산은 산가를 높여 유지의 품질을 나쁘게 하고 비누를 만들기 때문에 사전에 제거해야 한다.
이처럼 바람직하지 않은 불물 미리 제거하는 작업을 일반적으로 정제 (Refining)라고 하는데, 여기에는 탈검(Degumming) 탈산(Refining), 탈색(Bleaching), 탈취(Deodorization) 등의 중요조작이 요구된다.
자연계의 유지는 주로 글리세린 한 분자에 지방산 세분자가 결합된 트리글리세라이드(TriGlyceride;TG) 형태로 존재하는데 이를 고순도로 정제하기 위해서는 알코올유와 에스테르 교환반응을 거쳐 지방산의 알킬 에스테르를 제조하고 글리세린을 제거하는 공정이 필요하다.
알코올류를 이용하는 에스테르 교환방법에도 알칼리를 촉매로 이용하는 방법, 리파아제 지방분해효소 또는 초임계 유체(메탄올, 에탄올)를 이용하는 방법 등 여러 가지가 있지만, 현재 알칼리 촉매법이 가장 일반화 되어있다. 하지만, 기존의 알칼리 촉매의 이용하여 지방산 알킬 에스테르를 제조하는 방법은 촉매가 유리 지방산과 결합하여 지방산 비누가 부산물로 생성되어 알칼리 촉매가 과잉으로 필요하고, 수율의 저하를 일으킨다. 또한 부산물로 생성된 지방산 알킬 에스테르 층과 글리세린 층과의 분리가 곤란해지며, 촉매와 지방산 비누의 제거를 위한 추가 공정이 필요하게 된다.
이러한 문제점들을 해결하기 위해 최근 알카리 촉매를 사용하지 않고 효소촉매로서 미생물 유래 리파제(lipase)와 알코올을 사용하는 알코올리시스(alcholysis)방법과 초임계 또는 아임계 상태의 알코올을 이용한 초임계 공정을 응용한 알킬에스테르 제조방법등 친환경 공정들이 바이오디젤을 생산하는 업계를 중심으로 활발히 연구 개발되고 있다.
친환경 공정으로서 초임계유체 크로마토그래피(Supercritical fluid chromatography; SFC) 를 이용하여 참치유로부터 95% 고순도 DHA를 제조한 예는 이전에도 있었으나 (Alkio등, 1999) 제조비용(Cost)이 $550/kg 으로 너무 높아 상용 화 되지는 못하였고, 리파제 효소 촉매를 이용하는 방법은 높은 효소가격과 반응 중에 효소의 실활 문제 등으로 인해 널리 사용되지 못하였었다. 그러나 최근 바이오디젤 제조 기술이 활발히 개발되기 시작하고 환경문제가 대두되면서 효소촉매를 이용한 알킬에스테르 제조공정이 친환경 대체공정으로 주목받고 있다.
대한민국 특허발명 제139006호는 일본특허공개(소-58-8037)와 아류 기술로서 발명내용이 매우 유사하며 알콜리시스 촉매로서 소듐 에톡사이드(sodium ethoxide)를 촉매로 사용하고 있으나, 이것은 인화성과 독성이 있는 물질로 선진국에서는 식품제조에 사용을 금지하고 있는 물질이다. 또한, 이러한 촉매를 사용함으로서 반응물의 세척을 위해 다량의 독성 폐수가 발생하는 환경오염 유발 공정을 채택하고 있다. 아울러 195℃이상 208℃정도에서 연속증류를 통해 얻어진 불포화지방산의 순도는 30~60% 정도에 불과하며 증류온도가 높아 비휘발성의 분해산물 즉, 폴리머(polymer), CFAM(cyclic fatty acid monomers), EPA 및 DHA의 구조이성질체가 생길 가능성이 높다(European journal of lipid science and technology ISSN 1438-7697, 2006)고 보고되어 있다.
일본 특허공개 제1999-246888호에서는 3단계의 증류탑을 이용한 연속증류와 주성분을 요소 메탄올 용액에 접촉시키는 요소부가법을 사용하여 85% 이상의 제품을 생산하는 방법을 사용하고 있다. 또한, 일본 특허공개 제1997-302380호에서는 2단 증류 또는 3단 증류탑을 이용하여 진공 증류하여 탄소수 C19이하를 제거하고 C21이상만 회수하는 방법으로 농도 80% 이상 EPA를 생산 후 초산은 처리를 거쳐 98.5% 이상 제품을 생산하거나 요소부가법으로 85% 제품을 생산하는 방법을 제안하 고 있다.
하지만 이들 공정은 유독상의 촉매나 전처리 공정에서의 다량의 폐수발생, 그리고 용매의 잔류문제를 해결해야하는 문제가 따른다. 또한 지방산 에스테르화물을 예비증류 단계없이 직접 진공분별증류 처리함으로써 증류수율 향상 및 생산성 개선 문제가 따른다.
한편, 일본 특허발명 제3614177호에서는 DHA 또는 그 유도체를 함유하는 천연유지로부터 얻어지는 지방산 또는 에스테르 혼합물을 고진공하에서 복수의 증류탑에 따라서 진공 또는 감압 증류하고, 탄소수 22의 지방산 또는 그 에스테르를 주성분으로 하는 유분을 취득하고, 이를 분배컬럼 크로마토그래피를 통해 분획,정제하여 고순도의 DHA를 제조하는 방법이 제안된 바 있다. 여기서 천연유지로부터 불순물이 제거되도록 지방산 또는 에스테르 혼합물이 얻어지는 방법이 개시되어 있지 않으며, 천연유지에 포함된 중금속과 PCBs 등의 오염원제거 되어 있지 않는 문제가 있다.
이에 일본 특허공개 제1996-100191호에서는 EPA, DHA를 함유하는 천연유지로부터 얻어진 지방산 혼합물을 저급 알코올로 에스테르화하여 요소와 반응시키고, 여과, 원심분리 등의 수단으로 요소결정과 액상을 분리하고, 분리된 용매는 진공 하에서 가열하여 추출용매를 분별증류하여 회수하고, 감압증류하여 고순도의 DHA 에스테르를 회수하는 방법이 제안된 바 있다. 그러나, 상기 에스테르 회수 방법에 있어서 초기에 요소반응을 진행하여 분별하여 회수된 물질에 요소와 미반응한 포화지방산 또는 불순물이 여전히 잔류할 가능성이 있다.
아울러 이들 선행기술 중 지방산의 알콜리시스 및 에스테르화를 위한 공정은 단순히 바이오디젤 제조를 위한 지방산 알킬에스테르 제조에만 응용되고 있으며, 증류공정을 통한 지방산의 제조는 대부분 에이코사펜타엔산(EPA) 생산에 한정된 공정으로 본 발명에서 제시하는 효소 촉매방법으로 지방산의 에틸에스테르를 제조하고 단증류(SPD)장치를 이용한 예비증류 단계 그리고 비휘발성 열분해산물의 생성을 최소화하는 증류온도 180℃ 이하에서의 감압분별증류를 거쳐 모사 이동상 크로마토그래피 방법의 연속 공정을 통해 99% 이상의 고순도 EPA 또는 DHA 생산방법을 제공하는 선행 기술은 아직 전무한 실정이다.
상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 본 발명의 목적은 유독성 촉매나 가성소다를 이용하지 않고, 폐수의 발생이 최소화 되는 친환경적인 오메가-3계 고도불포화 지방산의 고순도 정제방법을 제공하는 데 있다.
또한 본 발명의 또 다른 목적은 단증류 장치를 이용한 예비 증류를 행함으로써 생산성이 향상되고 천연유지에 포함된 중금속과 PCBs 등의 오염원이 제거된 증류원료를 얻고 이를 이용하여 180℃ 이하의 저온 감압분별증류를 함으로써 장쇄 고도불포화 지방산의 열분해산물인 고리형 지방산 단량체(CFAM;cyclic fatty monomers)과 폴리머, 그리고 오메가-3 지방산의 트랜스(trans) 이성체 형성을 최소화한 고도 정제방법을 제공하함으로써 최종 크로마토그래피 공정에서 제약(Active pharmaceutical ingredient;API) 수준의 99% 이상 제품을 얻을 수 있는 방법을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위해 본 발명은 a) 캔디다(Candida) 속, 리조퍼스(Rhizopus) 속, 무코(Mucor) 속, 아스퍼질러스(Aspergillus) 속, 및 수도모나스(Pseudomonas) 속에서 선택되는 하나이상의 미생물에서 추출된 효소촉매 존재하에서 천연유지와 에탄올을 에탄올리시스(ethanolysis)하여 지방산 에틸 에스테르(Fatty acid ethyl ester; FAEE)를 제조하는 단계; b) 상기 제조된 지방산 알킬 에스테르를 100 내지 180℃ 및 0.005 내지 10mmHg에서 단증류(Short path distillation;SPD)장치를 이용하여 예비증류하는 단계; c) 상기 예비증류를 거친 알킬 에스테르화물을 150 내지 180℃ 및 0.001 내지 10mmHg에서 감압분별증류하여 농축지방산이 형성되는 단계; d) 상기 분별 증류된 농축지방산을 모사이동상 크로마토그래피를 통해 정제하는 단계; 를 포함하는 오메가-3계 고도불포화 지방산의 고도 정제방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 효소촉매로 천연유지의 트리글리세롤 탄소에 1,3-위치특이성을 가지는 리파제 및 천연유지의 트리아실글리세롤에 아실 사슬 특이성(acyl chain specificity)을 가지는 리파제가 포함되는 오메가-3계 고도불포화 지방산의 고순도 정제방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 1,3-위치 특이성 리파제는 리조퍼스속의 자바니쿠스(R. javanicus), 니베우스(R. niveus) 및 아스퍼질러스속 나이거(A. noger)로 이루어진 군에서 선택되는 하나이상의 리파제이고, 상기 아실사슬 특이성 리파제는 캔디다 속의 실린드라시아(C. cylindracea), 안타르티카(C. antarctica), 리조퍼스속의 미헤이(R. miehei) 및 아리주스(R. arrhizus)로 이루어진 군에서 선택되는 하나이상의 리파제인 오메가-3계 고도불포화 지방산의 고순도 정제방법을 제공한다.
상기 정제단계를 거친 오메가-3계 고도불포화 지방산은 EPA(Eicosapentaenoic Acid;EPA), 또는 DHA(Docosahexaenoic Acid ;DHA)로서 농도가 90%이상인 오메가-3계 고도불포화 지방산의 고순도 정제방법을 제공한다.
이하 본 발명에 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 일실시예를 상세히 설명하기로 한다. 우선, 도면들 중, 동일한 구성요소 또는 부품들은 가능한 동일한 참조부호를 나타내고 있음에 유의하여야 한다. 본 발명을 설명함에 있어, 관련된 공지기능 혹은 구성에 대한 구체적인 설명은 본 발명의 요지를 모호하지 않게 하기 위하여 생략한다.
본 명세서에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본 발명의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다.
도 1은 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 고도불포화 지방산의 정제공정도이다. 도 1을 참조하면, 본 발명의 고도불포화 지방산의 정제는 지방산 알킬 에스테르 제조단계 S100, 예비증류단계 S200, 감압-분별증류단계 S300, 크로마토그래피 정제단계 S400로 진행될 수 있다.
우선, 지방산 알킬 에스테르 제조단계 S100에 있어서, a) 캔디다(Candida) 속, 리조퍼스(Rhizopus) 속, 무코(Mucor) 속, 아스퍼질러스(Aspergillus) 속, 수도모나스(Pseudomonas) 속 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 미생물에서 추출된 효소촉매 존재하에서 천연유지를 에탄올을 이용 에탄올리시스(ethanolysis)하여 지방산 에틸 에스테르(Fatty acid ethyl ester; FAEE)를 제조하는 단계;를 진행할 수 있다.
본 발명에 있어서 사용되는 천연유지는 생선유지로서 수입산 참치유지 또는 정어리 유지가 바람직하며 이에 한정되지 않는다.
상기 천연유지는 탈검(Degumming), 탈산(Refining), 탈색(Bieaching), 탈취(Deodoriziation) 및 이들의 혼합방법으로 이루어진 군에서 선택되는 방법으로 분석 시 천연유지를 착색시키거나 발연시키거나 기포를 발생시키는 원인이 되는 인지질, 당류, 단백질, 점질물 등의 불순물을 미리 제거하여 전처리된 상태의 것이다.
상기 에탄올과 천연유지의 몰비는 3:1 내지 45:10 사이로 조절하고, 반응시간은 2내지 48시간 반응하여 에스테르 전환수율이 80 내지 97%가 되도록 반응시키는 것이 바람직하다.
구체적으로 캔디다(Candida) 속, 리조퍼스(Rhizopus) 속, 무코(Mucor) 속, 아스퍼질러스(Aspergillus) 속, 및 수도모나스(Pseudomonas) 속으로 이루어진 군에서 선택되는 하나이상의 미생물에서 추출된 1,3-위치 특이성을 가지는 리파제 효소 1종 이상 및 아실체인 특이성을 가지는 리파제 효소 1종 이상을 각각 천연유지와 교반하여 혼합한다. 상기 혼합물을 교반함에 따라 서서히 에탄올을 첨가하되, 천연유지와 에탄올의 몰비가 3:1 내지 45:10 몰(mol)비가 되도록 반응이 진행됨에 따라 많은 양으로 첨가함이 바람직하다.
상기 효소촉매는 천연유지와 에탄올 100중량부를 기준으로 0.1 내지 10중량부로 첨가 후 40ㅁ 2℃에서 100 내지 200rpm으로 교반하는 에스테르 교환반응을 실시하여 지방산 에틸 에스테르화물을 생산할 수 있다.
본 발명에 사용되는 효소촉매는 캔디다(Candida) 속, 리조퍼스(Rhizopus) 속, 무코(Mucor)속, 아스퍼질러스(Aspergillus) 속 및 수도모나스(Pseudomonas) 속 으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 미생물에서 추출된 효소로서, 상기 효소촉매 중 천연유지의 트리글리세롤 탄소의 1,3-위치특이성 리파제는 천연유지의 트리글리세롤 탄소의 1번과 3번 위치에만 작용하여 가수분해하는 효소촉매이고, 아실사슬 특이성 리파제는 지방산의 탄소수 길이에 특이성을 나타내는 효소촉매이다. 상기 아실사슬 특이성 리파제는 트리아실글리세롤 하이드롤라아제(triacylglycerol hydrolase)라고도 하며 이들 효소는 연속적인 활성유지를 위해 특정 담체에 고정화되는 것이 바람직하다.
상기 1,3-위치 특이성 효소촉매로는 리조퍼스속의 자바니쿠스(R. javanicus), 니베우스(R. niveus), 및 아스퍼질러스속 나이거(A. noger)로 이루어진 군에서 선택가능하며, 아실사슬 특이성 리파제로는 캔디다 속의 실린드라시아(C. cylindracea), 안타르티카(C. antarctica), 리조퍼스속의 미헤이(R. miehei), 및 아리주스(R. arrhizus)로 이루어진 군에서 선택되는 것이 바람직하다.
본 발명은 상기 효소촉매를 이용하여 주정용 알코올과 반응하여 알콜리시스(alcholysis)하여 지방산 에틸 에스테르화물을 생산하는 것이다.
상기의 효소촉매를 사용함으로써 화학촉매를 사용하지 않고, 고온에서 반응을 하지 않고도 지방산의 탄소사슬에 시스-트랜스(cis-trans) 이성화 반응 및 이중결합의 전이반응 등이 일어나지 않으며, 지방산 내에 존재하는 시스(cis)구조를 유지하는 오메가-3계 지방산이 생성될 수 있다.
오메가-3계 지방산에는 자연적으로 시스(cis)구조로 이루어져 있다.그러나, 트랜스(trans) 구조가 포함된 지방산은 오메가-3 처럼 불포화도가 높은 시스(cis) 형의 지방산을 가공하는 과정에서 생기는 것으로, 지방의 탄소사슬이 불포화지방산의 탄소 사이의 이중결합을 사이에 두고 대칭적(trans형)으로 형성된 너무 안정적인 지방산으로, 너무 안정되어 대사가 잘 되지 않아 섭취 시 동맥경화, 심장병, 심혈관계 질환을 유발하는 원인이 된다.
따라서, 본 발명에서는 이러한 트랜스 구조로의 전이를 막는 반응이 제공되는 것이다.
한편, 알킬에스테르에 이용되는 에탄올은 95% 이상의 순도를 가지는 주정용 에탄올인 것이 바람직하다. 메탄올을 이용한 메틸 에스테르의 경우 분해 산물인 메탄(Methane)의 대사독성이 문제시 되고 있기 때문에 에틸 에스테르가 선호된다.
이후, 예비증류단계 S200로서, b) 상기 제조된 지방산 알킬 에스테르를 100 내지 200℃ 및 0.001 내지 10mmHg에서 단증류(Short Path Distillation;SPD) 장치를 이용하여 예비증류하는 단계;가 진행될 수 있다. 상기 예비증류 시 조건이 온도 100℃, 압력 0.001mmHg미만인 경우, 100℃를 초과하는 화합물이 증발되지 않아 증류수율이 낮아질 우려가 있으며, 200℃, 10mmHg를 초과하면, 온도 및 압력이 너무 높아 열변성물이 생길 우려가 있다.
즉, 상기 a)단계에서 제조된 지방산 에틸에스테르를 단증류(Short path distillation;SPD)장치를 이용하여 연속적으로 농축 및 증류하며, 이때 온도는 100 내지 180℃, 진공도는 0.001 내지 1.0 mmHg 사이에서 반응하고, 증류물의 최종 회수율은 50 내지 70%가 되도록 반응시킴이 바람직하다.
본 발명의 완성을 위하여 예비증류 단계는 진공증류에 앞서 진행되는 단계로 100 내지 180℃ 사이에서 진행되는 분별증류에 앞서 저비점의 저분자물질 등을 사전에 제거함으로써 감압분별증류 시에 수율의 향상과 열변성물의 생성을 막기 위함이다. 예비증류 없이 진공증류를 실시할 경우, 다량의 저비점 화합물이 한꺼번에 증발되면서 감압 증류장치내의 진공도 유지가 힘들게 되어 평형상태의 연속증류가 힘들게 된다. 또한, 고온에서 열변성물이 만들어질 가능성이 커져 증류수율과 제품의 질을 저하시키는 결과를 초래한다.
본 발명의 예비증류에 사용되는 단증류(Short path distillation;SPD)장치는 마이어스-베큠(MYERS-VACUUM), 인콘(INCON), 켐텍-서비스(CHEMTECH SERVICE), 아사히(ASAHI), 울박(ULVAC), 또는 브이티에이(VTA), 유아이씨(UIC)제품이 사용가능하지만 반드시 이들 설비에 한정되지는 않는다.
또한, 본 발명의 단증류(Short path distillation;SPD) 장치는 증발 영역과 응축영역사이가 짧아 열안정성이 낮은 물질을 빠른 시간내에 대량 증발 및 농축시키는 것이 가능하며, 비교적 저온(100~200℃)의 진공 (0.001~10 mmHg) 하에서 행하는 증류로 필요로 하는 물질만을 다른 물질분자와 충돌하지 않고 분리할 수 있는 장치이다.
아울러 모든 공정은 비교적 높은 진공에서 이루어지는데 이런 과정으로 증발이 일어나기 때문에 매우 얇은 박막(두께 0.1mm)이 형성되고 열과의 접촉이 최소화된다. 열과의 접촉 시간은 불과 1~3초로 매우 짧은 것이 특징이며 고진공 감압 증류에 앞서 저비점 화합물을 제거하고 열안정성이 약한 물질을 대량생산할 수 있다.
따라서 본 발명은 단증류(PSD) 장치를 사용함으로서 단위 용량당 최고의 표면적을 만들어 주어 신속한 증발이 가능하며 벽면의 상승된 온도에 대하여 액의 접촉 시간을 수 초 혹은 그 이하로 조절 할 수 있어 지방산처럼 열 변성과 산화에 민감한 물질의 파괴나 손상을 최소화 할 수 있다.
c) 상기 예비증류를 거친 알킬 에스테르화물을 100 내지 200℃ 및 0.001 내지 10mmHg에서 감압분별증류하여 농축지방산이 형성되는 단계로서 분별증류단계 S300가 진행될 수 있다.
상기 분별증류가 100 ℃ 또는 0.001mmHg 미만에서 진행되면, 분별증류 효과가 낮고, 200℃ 또는 10 mmHg를 초과하면 알킬 에스테르화물의 변형될 우려가 있다.
상기 분별증류는 충전탑 형태의 증류장치를 이용하는 것이 바람직하다. 상기 b)단계에서 제조된 증류물을 탄소수 20개 이하의 저분자 증류분을 제거하기 위하여 이론단수 5 내지 20단의 증류탑에서 탑저온도 100 내지 200℃, 탑정온도 100 내지 180℃ 탑정의 진공도 0.001 내지 10mmHg, 환류비 0.5 내지 20의 조건으로 탑정의 응축액에 함유된 DHA 농도가 10%이하, 좋기로는 5%를 초과하지 않도록 조건을 변경하며 연속적으로 증류함이 바람직하다. 이때 증류수율은 50 내지 80% 가 되도록 함이 바람직하다.
상기 충진탑은 기체와 액체, 액체와 액체 등 이상(異相) 사이의 물질이동을 능률적으로 하기 위하여 내부에 충전물을 채운 탑이다. 상기 이상 사이의 접촉면적을 크게 하고 각 상(相)의 흐름에 충분한 교란을 주어, 흡수, 증류, 흡착, 추출 등 의 물질이동을 효과적으로 행하게 한다.
본 발명은 상기 충전탑을 채우는 충전물로 금속제 충전물을 사용함이 바람직하다. 왜냐하면, 상기 금속제 충전물은 제조가 간단하고 값이 싸며 가스류에 대한 저항이 적고 표면적이 크고 액으로 젖기 쉽고, 중량이 가볍고, 기계적 강도가 충분히 있는 내열성 및 내식성이 뛰어나기 때문이다.
상기 충전탑 형태의 감압분별 장치를 오메가-3 지방산의 정제에 사용함으로서 지방산의 0.001 내지 10mmHg 조건의 진공도와 100 내지 200℃의 증류온도에서 특정 지방산 성분인 에이코사펜테노익산(Eicosapentaenoic Acid;EPA), 도코사헥사엔산(Docosahexaenoic Acid ;DHA)을 연속적으로 생산할 수 있으며, 목적 지방산의 탄소수와 분자량에 따라 증류 조건 변경을 통하여 EPA 또는 DHA순도가 70내지 80% 정도의 다양한 조성의 고도불포화 지방산 생산이 가능하다.
본 발명은 정제단계 S400로서, d) 상기 포화지방산이 제거된 농축지방산을 모사 이동상(Simulated Moving Bed;SMB) 컬럼 크로마토그래피를 통해 정제하는 단계;가 진행되어 90 내지 99.7% 순도로 에이코사펜테노익산(Eicosapentaenoic Acid;EPA), 도코사헥사엔산(Docosahexaenoic Acid ;DHA) 등의 오메가-3계 고도불포화 지방산의 고순도의 정제가 완성될 수 있다.
상기 c)단계에서 얻어진 감압증류 결과물을 칼럼 크로마토그래피를 사용하여 DHA를 고 순도로 분리하는 조건을 탐색하는데, 이때 분리용 용매로서는 아세토나이트릴(acetonitrile)과 메탄올을 주 이동상으로 사용함이 바람직하며, H2O의 함량을 더 첨가하여 분리도를 조절하되, 분리용 용매 100중량부를 기준으로 0.0001~30 중량부로 포함되도록 조절하며 최적의 분리도를 완성할 수 있다.
상기 컬럼 크로마토그래피(Column Chromatography)는 액체 크로마토그래피(Liquid Chromatography;LC), 고성능 액체 크로마토그래피(High Performance Liquid Chromatography;HPLC), 트루 무빙베드(True Moving Bed;TMB) 또는 모사 이동상 칼럼(Simulated Moving Bed;SMB) 방법을 사용할 수 있다.
상기 HPLC를 이용한 불포화지방산의 분리에는 AgNO3가 코팅된 실리콘산(silic acid)나 혹은 실리카겔(silicagel)이 충진재로 쓰이기도 하지만 경제성 면에서는 주로 역상(reverse phase) C18 칼럼을 사용하는데 분자량이 크고 2중 결합이 많은 오메가-3 지방산을 분리하는 경우 분리시간이 짧으며 메탄올 등으로 쉽게 칼럼을 씻고 재사용이 가능하다. 또한, 분자량의 차이가 크지 않거나 분자량이 같은 이성체의 분리에 유리한 트루 무빙베드 칼럼(True Moving Bed) 크로마토그래피 또는 모사 이동상 칼럼(Simulated Moving Bed: SMB) 크로마토그래피를 사용하는 것이 바람직하다.
상기 모사 이동상 칼럼(SMB)은 고수율과 고순도로 분리가 가능하며 적절한 생산규모로 쉽게 용량확장(scale up)이 가능한 특징이 있어서 분자량과 구조적 차이가 크지 않은 EPA와 DHA를 효과적으로 분리하는데 유용하게 이용 될 수 있다.
또한, 본 발명에서 사용되는 모사 이동상 칼럼(Simulated moving bed)은 고정상(stationary phase)로서 단일 칼럼을 사용하는 기존의 액체 크로마토그래피에 다수의 크로마토그래피 칼럼을 여러 종류의 밸브와 펌프로 연결하여 연속 시료주입과 연속 제품 배출이 가능하도록 함으로써 분리가 어려운 이성분 이상의 혼합물이나 이성체 등의 분리가 용이하며 기존의 일반적인 크로마토그래피 공정보다 용매사용량이 적고 상업적 규모로 용량확장(scale up)이 용이하여 EPA와 DHA가 공존하는 오메가-3 지방산의 분리 및 농축에 90%이상, 바람직하게는 90 내지 99.9%의 고순도로 생산할 수 있다.
상술한 바와 같이 본 발명의 오메가-3계 고도불포화 지방산의 고순도 정제방법은 유독성 촉매나 가성소다를 이용하지 않고 지방분해효소인 리파제 촉매와 에탄올을 이용하여 알콜리시스(alcoholysis)하여 지방산의 알킬에스테를 제조하는 방법을 도입함으로써 폐수의 발생을 최소화 하는 친환경적인 효과가 있으며, 효소촉매를 사용함으로써 화학촉매를 사용하지 않고, 고온에서 반응을 하지 않고도 지방산의 탄소사슬에 시스-트랜스(cis-trans) 이성화 반응 및 이중결합의 전이반응 등이 일어나지 않으며, 지방산 내에 존재하는 시스(cis)구조를 유지하는 오메가-3계 지방산이 생성되는 효과가 있다.
또한, 본 발명은 10-3mmHg 이하의 고진공 조건에서의 감압분별증류를 통한 지방산의 분별증류 공정에 앞서 단증류(SPD)장치를 이용한 예비 농축과정을 도입함으로써 진공분별증류 공정에서의 증류수율이 높고, 생산성이 향상되며, 천연유지에 포함된 중금속과 PCBs 등의 오염원이 제거되는 효과가 있다.
또한, 본 발명은 감압분별 증류된 DHA농축액을 사용하여 모사이동상 크로마토그래피(SMB) 정제공정을 통해 DHA 농도를 99% 이상으로 농축하는 공정을 제공하여 더욱 고순도화 제품의 생산이 가능한 효과가 있다.
또한, 본 발명은 고순도의 농축을 위해 별도의 분별증류과정을 여러단계 거치는 대신 일련의 연속적인 공정을 통해서 순도 99%이상의 고순도의 오메가-3계 고도불포화 지방산이 편리하게 얻어지는 효과가 있다.
또한, 본 발명은 분리조건을 다양하게 설정하여 용도에 따라 요구에 맞는 오메가-3계 고도불포화 지방산이 얻어지는 효과가 있다.
하기의 실시예를 통하여 좀 더 상세하게 설명하고자 한다.
* 시험방법
본 발명에 사용된 오메가-3 지방산의 조성 및 농도는 분석은 휴렛-패커드(Hewlett-Packard)사 의 HP 6890 series 가스 크로마토그래피(Gas chromatography) 시스템을 사용하였으며 사용한 칼럼은 DB-WAX 석영유리관(fused silica capillary column) (30m X 0.32mm X 0.25μ) 이었으며 검출기(Detector)로는 FID를 사용하였다. 유입기(Injector)와 검출기(Detector)온도는 250℃, 초기 오븐의 온도는 150℃에서 250℃ (2.5℃/min)로 상승시켰고 이동(carrier) 가스는 헬륨(11 psig)을 사용하였다.
실시예
1
a) 지방산 알킬 에스테르 제조단계
회분식 반응기에 조정제(refining)를 거친 참치유인 유지를 물과 1:1 부피비로 첨가 후 온도 38-40℃, 효소촉매로는 유지의 트리아실글리세롤에 아실 사슬 특이성(acyl chain specificity)을 가지는 리파제인 캔디다(Candida) 속의 실린드라시아(cylindracea)종(C.rugosa)으로부터 추출된 Lipase-OF 360,000(일본, MEITO SANGYO사, Triacylglycerol lipase EC 3.1.1.3)와 유지의 트리글리세롤 탄소에 1,3-위치 특이성을 갖는 리파제인 캔디다(Candida) 속의 안트르티카(antarctica) 종으로부터 추출된 리파제 아크릴 수지(Lipase acrylic resin)로서 Immobilized Lipase(덴마크,Novozyme 435, EC 3.1.1.3)을 유지 100중량부를 기준으로 3중량부가 되도록 각각 첨가하여 교반속도 200rpm으로 24시간동안 가수분해 반응을 실시하였다. 반응개시 4시간 후부터 40℃로 가온된 주정용 에탄올을 유지와 에탄올의 몰비가 3:1 수준에 도달할 때 까지 첨가하여 에스테르 교환반응을 실시하고 지방산 에틸 에스테르화물을 생산하였다. 이때 알코올과 유지의 몰비는 3:1로 유지하였고 반응시간은 48시간이었으며, 에스테르 전환수율은 95%(DHA 농도 25%) 였다.
b) 예비증류단계
상기 a)단계에서 제조된 지방산 에틸에스테르를 원심식 박막증류 장치 또는 분자증류장치를 이용하여 연속적으로 증류하였다. 이때 온도는 150℃, 진공도는 0.05 mmHg를 유지하였고 증류물의 최종 회수율은 55% (DHA 농도 48%)였다.
c) 감압 분별증류단계
상기 b)단계에서 제조된 증류물을 탄소수 20~22개의 EPA 또는 DHA만을 농축 하기 위하여 이론단수 15단의 감압증류탑에서 탑저온도 180℃, 탑정온도 150℃ 탑정의 진공도 5mmHg, 환류비 5(환류비(Reflux ratio)=L/D, L=유입(feed)량, D=유출(output)량)의 조건으로 탑정의 응축액에 함유된 DHA 농도가 2% 이하가 되도록 조건을 변경하며 연속적으로 증류하였다. 이때 증류수율은 73% (DHA 농도 75%)였다.
[표 1]
| 구분 | a) | b) | c) |
| 단 계 | 알콜리시스 알킬 에스테르 제조 |
예비증류 | 진공분별 증류 |
| 설 비 | 초임계장치 | SPD 단증류장치 | 감압분별 증류탑 |
| 최대수율(%) | 95 | 55 | 73 |
| DHA 농도(%) | 25 | 48 | 76 |
| 반응온도 | 40℃ | 150℃ | 180℃ |
| 압력/진공도 | 상온,상압 | 0.005 mmHg | 0.001~1.0 mmHg |
| 누적수율(%) | 95% | 52% | 38% |
d) 정제단계
상기 c)단계에서 얻어진 결과물을 역상칼럼 크로마토그래피(Waters, M-501)를 사용하여 DHA를 고 순도로 분리하는 조건을 탐색하였다. 이때 분리용 용매로서는 아세토나이트릴(acetonitrile)과 메탄올을 주 이동상으로 사용하였으며 H2O의 함량을 상기 이동상 각 용매 100중량부를 기준으로 10중량부를 첨가하여 최적의 분리도를 완성하였다. 결과는 표 2에 나타내었다.
[표 2]
| 구분 | d) |
| 분석조건 | 칼럼:μ-bondapak C18 이동상:아세토니트릴(Acetonitrile), 메탄올(Methanol), 물(H2O) Flow rate: 1ml/min(1000~2000psi) Detector: uv 215nm Injection volume; 0.5㎕ |
| 최대 회수율(%) | 87 |
| DHA 최종농도(%) | 98.7 |
실시예 2
실시예 1에서 얻어진 결과를 바탕으로 모사이동상 크로마토그래피(SMB 10㎝x8 columns, Novasep France)에서 대량생산을 위한 용량 확장(Scale up) 조건을 탐색하였다. 이때 분리용 용매로서는 메탄올만을 주 이동상으로 사용하였으며 고순도의 DHA를 얻기 위해 분취조건을 달리하여 최적화된 고순도의 분리조건을 완성하였다. 결과는 표 3에 나타내었다.
[표 3] 용량 확장(Scale up)을 위한 SMB 분취조건 검토결과 분석표
| 구분 | DHA 순도(%) | 생산수율(%) | 생산성(g/day/L) | 농축도(%) |
| 1차 | 99.49 | 95.83 | 7.4 | 88 |
| 2차 | 99.63 | 89.80 | 6.9 | 81 |
| 3차 | 94.89 | 99.99 | 7.8 | 53 |
상기 표 3의 결과에 따라 DHA순도와 생산수율은 반비례 관계를 보여주고있다. 따라서, 생산수율과 농도를 고려하여 분리조건을 설정한다면 원하는 농도와 수율의 DHA를 얻을 수 있다.
이상에서 설명한 본 발명은 전술한 실시예 및 첨부된 도면에 의해 한정되는 것이 아니고, 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 여러 가지 치환, 변형 및 변경이 가능함은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 명백할 것이다.
도 1은 본 발명의 바람직한 일실시예에 따른 고도불포화 지방산의 정제공정도.
Claims (4)
- a) 캔디다(Candida) 속, 리조퍼스(Rhizopus) 속, 무코(Mucor) 속, 아스퍼질러스(Aspergillus) 속 및 수도모나스(Pseudomonas) 속으로 이루어진 군에서 선택되는 하나이상의 미생물에서 추출된 효소촉매 존재하에서 천연유지와 에탄올을 에탄올리시스(ethanolysis)하여 지방산 에틸 에스테르(Fatty acid ethyl ester; FAEE)를 제조하는 단계;b) 상기 제조된 지방산 알킬 에스테르를 100 내지 200℃ 및 0.001 내지 10mmHg에서 단증류(Short Path Distillation;SPD) 장치를 이용하여 예비증류하는 단계;c) 상기 예비증류를 거친 알킬 에스테르화물을 100 내지 200℃ 및 0.001 내지 10mmHg에서 감압분별증류하여 농축지방산이 형성되는 단계;d) 상기 포화지방산이 제거된 농축지방산을 모사 이동상(Simulated Moving Bed;SMB) 컬럼 크로마토그래피를 통해 정제하는 단계;가 연속적으로 진행되는 오메가-3계 고도불포화 지방산의 고순도 정제방법.
- 제1항에 있어서,상기 효소촉매는 천연유지의 트리글리세롤 탄소에 1,3-위치특이성을 가지는 리파제 및 천연유지의 트리아실글리세롤에 아실 사슬 특이성(acyl chain specificity)을 가지는 리파제가 포함되는 오메가-3계 고도불포화 지방산의 고순도 정제방법.
- 제2항에 있어서,상기 1,3-위치 특이성 리파제는 리조퍼스속의 자바니쿠스(R. javanicus), 니베우스(R. niveus), 및 아스퍼질러스속 나이거(A. noger)로 이루어진 군에서 선택된 하나이상의 리파제이고,상기 아실사슬 특이성 리파제는 캔디다 속의 실린드라시아(C. cylindracea), 안타르티카(C. antarctica), 리조퍼스속의 미헤이(R. miehei), 및 아리주스(R. arrhizus)로 이루어진 군에서 선택된 하나이상의 리파제인 오메가-3계 고도불포화 지방산의 고순도 정제방법.
- 제1항에 있어서,상기 정제단계를 거친 오메가-3계 고도불포화 지방산은 EPA(Eicosapentaenoic Acid;EPA), 또는 DHA(Docosahexaenoic Acid ;DHA)로서 농도가 90%이상인 오메가-3계 고도불포화 지방산의 고순도 정제방법.
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