JPH10310556A

JPH10310556A - 微生物由来の多価不飽和脂肪酸エステルの分離精製方法

Info

Publication number: JPH10310556A
Application number: JP9137707A
Authority: JP
Inventors: Takaharu Yamamura; 隆治山村; Yasushi Shimomura; 泰志下村; Isao Sogo; 功十合; Satohiro Tanaka; 悟広田中; Toshiaki Yaguchi; 敏昭矢口; Takanori Higashihara; 孝規東原; Harurou Nakahara; 東郎中原; Toshihiro Yokochi; 俊弘横地
Original assignee: Y M SHII KK; Agency of Industrial Science and Technology; Nagase and Co Ltd; Suntory Ltd
Current assignee: Y M SHII KK; Nagase and Co Ltd; National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST; Suntory Ltd
Priority date: 1997-05-12
Filing date: 1997-05-12
Publication date: 1998-11-24

Abstract

(57)【要約】【課題】ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）、ドコサペン
タエン酸（ＤＰＡ）などの多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦ
Ａ）のエステル体を、微生物の培養菌体から、高効率か
つ低コストで、高純度まで精製し得る方法を提供するこ
と。【解決手段】多価不飽和脂肪酸エステルを分離精製す
る方法であって、多価不飽和脂肪酸エステルの２種以上
を含有する脂質混合物を、高速液体クロマトグラフィー
（ＨＰＬＣ）によって精製する工程を含む方法。ここ
で、脂質混合物は、シゾキトリウム(Schizochytrium)属
ＳＲ２１株の培養菌体抽出物をエステル化することによ
って得られる。そして、高速液体クロマトグラフィー
は、アルキルシランで誘導化された多孔性粒状基材を充
填剤として用いる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、微生物由来の多価
不飽和脂肪酸エステルの分離精製方法に関する。特に、
本発明は、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）およびドコサ
ペンタエン酸（ＤＰＡ）を含む、医薬品および機能性食
品の素材として有用な多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）の
エステルを、高純度にかつ効率的に分離精製する方法に
関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）
は、特異な生理活性を有する化合物として注目を浴びて
いる。代表的なＰＵＦＡとしてα−リノレン酸（ＡＬ
Ａ）、γ−リノレン酸（ＧＬＡ）、ジホモ−γ−リノレ
ン酸（ＤＧＬＡ）、アラキドン酸（ＡＡ）、エイコサペ
ンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサペンタエン酸（ＤＰ
Ａ）、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）などがある。ＰＵ
ＦＡはプロスタグランジン類などの生理活性物質の前駆
体であることより研究が進み、様々な生理作用が報告さ
れている。魚油由来のＥＰＡエチルエステルは、約９２
％の純度の精製品が、閉塞性動脈硬化症を適応症とした
医薬品として１９９０年に市販された。

【０００３】一方、ＤＨＡは、その生理活性機能として
コレステロール低下作用、抗血液凝固作用、制癌作用、
さらには脳代謝系に関連して記憶学習能力の向上作用、
老人性痴呆症の予防作用、アルツハイマー疾病の治療作
用、稚魚の成長必須因子としての作用などが示されてい
る。そのため、健康食品やベビーミルク等の素材として
使用されるとともに、医薬品としての研究が進められて
いる。また、ＤＰＡは、生体間でＤＨＡの欠乏に対する
代償となることが報告され、何らかの生理活性機能があ
ると考えられている。従って、ＤＰＡも医薬品として利
用できる可能性がある。なお、ＤＰＡには不飽和結合の
位置によって（ｎ−３）系と（ｎ−６）系とがあるが、
本明細書中で単に「ＤＰＡ」という場合、（ｎ−６）系
のＤＰＡを指す。

【０００４】これらのＰＵＦＡは、一般に化学合成の困
難な化合物である。一方、天然において、これらはトリ
グリセリドやリン脂質中の脂肪酸残基として存在する。
従って従来から、天然の素材からの抽出、精製が行われ
てきた。例えば、ＥＰＡおよびＤＨＡは海産魚の魚油中
に含有されており、従来はイワシ油、マグロの眼窩油な
ど、比較的複雑な脂肪酸組成を有する魚油から取り出さ
れていた。

【０００５】今後、ＰＵＦＡを医薬品としての使用に供
するためには、少なくとも９５％以上の純度、望ましく
は９８％以上の純度が要求されるといわれる。遊離の脂
肪酸の状態では、そのような、試薬や医薬品として適切
なレベルの純度にまで精製することは困難である。その
ため、エステル体、特にエチルエステルとして精製する
ことが一般的に行われる。

【０００６】従来、遊離の脂肪酸またはそのエステル体
（以下、−Ｅで表す）の複数の種類を含む混合物から、
特定の脂肪酸を分離するための方法として、主として炭
素数の差を利用する蒸留法および超臨界流体抽出法、主
として二重結合数の差を利用する低温分別法、尿素添加
法、および溶剤分別法の他、イオン交換樹脂によるクロ
マトグラフィーなどが知られている。これらの方法の組
合せによって、９０〜９２％程度までの高純度化は達成
できるようになってきた。

【０００７】特に、ＤＨＡエステル（ＤＨＡ−Ｅ）につ
いては、工業的規模での高純度化を指向した方法とし
て、精密蒸留と分取液体クロマトグラフィーとを組み合
わせた方法（ＤＨＡ高度精製抽出技術開発事業研究報告
書(平成４〜６年度)、p.213、ＤＨＡ高度精製抽出技術
研究組合発行(平成７年１１月)）の他に、銀イオン交換
粘土鉱物を用いる吸着クロマトグラフィー（同報告書，
p.231；山口ら、油化学、第40巻、第10号、p.959(199
1)）、硝酸銀水溶液中での錯体形成を利用した液相抽出
法（同報告書，p.247；三澤ら、日本化学会第６１春期
年会予稿集、p.1245(1991)）などが開発されている。し
かしこれらの方法によっても、一回の精製工程によって
得られるＤＨＡ−Ｅの純度は、９５％程度までであっ
た。より高い純度、例えば医薬品としての使用に適切な
９８％以上の純度で、ＤＨＡ−Ｅや他のＰＵＦＡエステ
ルを得るためには、装置、試薬、原料素材などとして特
に高価なものを使用したり、複雑な精製操作を組み合わ
せることが要求された。

【０００８】このように従来の精製方法は、工業的な規
模において、合理的なコストで、再現性良く、高純度の
ＰＵＦＡエステルを得るためには、満足のいくものでは
なかった。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記問題点
の解決を意図するものである。その目的は、ＤＨＡ、Ｄ
ＰＡなどのＰＵＦＡのエステル体を、微生物の培養菌体
から、高効率かつ低コストで、高純度まで精製し得る方
法を提供することにある。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明の方法は、ＰＵＦ
Ａエステルを分離精製する方法であって、ＰＵＦＡエス
テルの２種以上を含有する脂質混合物を、高速液体クロ
マトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製する工程を含
む。ここで、脂質混合物は、シゾキトリウム(Schizochy
trium)属ＳＲ２１株の培養菌体抽出物をエステル化する
ことによって得られ、そして、高速液体クロマトグラフ
ィーは、アルキルシランで誘導化された多孔性粒状基材
を充填剤として用いる。

【００１１】上記多孔性粒状基材は、３０から１００μ
ｍまでの範囲の粒子径、および１００から１３０オング
ストロームまでの範囲の細孔径を有し得る。また、上記
多孔性粒状基材は、１４％から１９％までの範囲の炭素
含有率を有するオクタデシルシラン（ＯＤＳ）誘導化シ
リカゲルであり得る。

【００１２】上記高速液体クロマトグラフィーには、溶
離液としてメタノール、エタノール、またはそのいずれ
かを８０％以上含有する水溶液を用い得る。

【００１３】上記高速液体クロマトグラフィーによっ
て、９５％以上の純度のＤＨＡエステルおよび／または
ＤＰＡエステルが得られ得る。

【００１４】

【発明の実施の形態】

（ＨＰＬＣによる精製）本発明の方法において、ＨＰＬ
Ｃのカラムに用いる充填剤は、アルキルシランで誘導化
された多孔性粒状基材である。本発明者らは、アルキル
シランで誘導化された充填剤が、適切な条件下、ＰＵＦ
Ａエステルの炭素数および不飽和結合数の違いを、従来
予測された程度を著しく越えるレベルの精度をもって識
別し得ることを発見し、これに基づいて本発明を完成し
た。

【００１５】多孔性粒状基材としては、クロマトグラフ
ィー用基材として適切な任意の基材を用い得る。好まし
い基材には、水和酸化金属または水和酸化メタロイドが
含まれる。その例としては、水和酸化アルミナ、水和酸
化チタニウム、水和酸化ジルコニウム、水和酸化ケイ
素、水和酸化スズなどが挙げられる。より具体的には、
シリカゲル、ヒドロキシアパタイト、アルミナ、シリカ
・アルミナ、チタニア、ケイソウ土、ケイ酸ガラス、ア
ルミノケイ酸塩、クレーカオリン、タルク、ゼオライト
などが例示できる。ガラスビーズ表面にシリカゲル微粒
子などをまぶした基材も、ここに含まれる。また、ポリ
スチレン、ポリメチルメタクリレート、およびそれらの
誘導体を含むポリマー粒子も、好ましい基材として用い
得る。シリカゲルが特に好ましい。この基材は、粒子径
および細孔径が適切な範囲にあるものが選択される。こ
こで、粒子径および細孔径は、シランで誘導化される前
の状態で測定される値をいう。この測定値は、例えば、
基材を走査型電子顕微鏡などで観察したときの、粒子の
平均値である。

【００１６】粒子径の上限は、代表的には１００μｍ、
好ましくは８０μｍ、より好ましくは６０μｍである。
粒子径の下限は、代表的には３０μｍ、好ましくは４０
μｍ、より好ましくは４５μｍである。粒子径が大きす
ぎる場合、カラムの分離能が低下する傾向があるため、
ＰＵＦＡエステルを高純度化することが困難になること
がある。粒子径が小さすぎる場合、ＨＰＬＣにおいて溶
離液を輸送する圧力が高くなりすぎるため、ＰＵＦＡエ
ステルを大量に分取することが困難になることがあり、
実用上好ましくない。なお、適切な粒子径は、ＨＰＬＣ
に用いるカラムのサイズ（内径×長さ）にも依存して変
化することに留意すべきである。

【００１７】細孔径の上限は、代表的には１３０オング
ストローム、好ましくは１２５オングストロームであ
る。細孔径の下限は、代表的には１００オングストロー
ム、好ましくは１１０オングストロームである。細孔径
が大きすぎるか、小さすぎる場合、溶質であるＰＵＦＡ
エステルの拡散、保持挙動を最適化しにくくなる。

【００１８】多孔性粒状基材は、アルキルシランで誘導
化される。アルキルシランの鎖長の上限は、代表的には
炭素数４０、好ましくは炭素数３０、より好ましくは炭
素数２０である。鎖長の下限は、代表的には炭素数１、
好ましくは炭素数８である。炭素数が多すぎると、カラ
ムの分離能が低下する傾向がある。入手の容易さの点か
ら、炭素数１８のオクタデシル基を有するオクタデシル
シラン（ＯＤＳ）が特に好ましい。

【００１９】多孔性粒状基材のアルキルシランによる誘
導化は、当該シランに由来する炭素含有率が適切な範囲
になるように行われる。この炭素含有率は、得られた充
填剤の疎水性を示す目安となる値であり、一般に元素分
析法によって測定される。ポリマーを基材として用いる
場合には、誘導化反応の仕込み量に基づいて、化学量論
的に算出することができる。炭素含有率の上限は、代表
的には１９％、好ましくは１８％、より好ましくは１
７．５％である。炭素含有率の下限は、代表的には１４
％、好ましくは１５％、より好ましくは１６％である。
炭素含有率が高すぎるか、低くすぎると、カラムの分離
能が低下する傾向がある。

【００２０】上記の誘導化のための反応は、所望のアル
キル基（例えば、トリアコンチル基、エイコシル基、オ
クタデシル基、オクチル基、ｎ−ブチル基など）を有す
る適切なシラン化合物（例えば、クロロシラン化合物、
アルコキシシラン化合物など）を用いて、公知の方法に
よって行うことができる。また、粒子径、細孔径、およ
び炭素含有率が上述した適切な範囲にある、オクタデシ
ルシラン（ＯＤＳ）および他のアルキルシランで誘導化
された種々のシリカゲルが、例えば、(株)ワイエムシィ
社より「ＹＭＣ＊ＧＥＬ」の商品名で市販されている。

【００２１】ＨＰＬＣの溶離液としては、逆相クロマト
グラフィーに適切な任意の極性溶媒を用い得る。例え
ば、メタノール、エタノール、イソプロパノール、アセ
トニトリル、塩化メチレン、クロロホルム、テトロヒド
ロフラン、これらの組み合わせ、および、これらと水と
の組み合わせが挙げられる。メタノール、エタノール、
またはそのいずれかを８０％以上（好ましくは９０％以
上、より好ましくは９５％以上）含有する水溶液は、好
ましい溶離液の例である。溶媒の種類および混合比は、
高純度化されるべきＰＵＦＡエステルの種類に応じて、
適宜選択される。溶離液の最適化は、当業者には容易で
ある。

【００２２】例えば、メタノール、またはメタノールを
８０％以上（好ましくは９０％以上、より好ましくは９
５％以上）含有する水溶液は、ＤＨＡ−ＥとＤＰＡ−Ｅ
とを、同時に高純度で分取する場合に、好ましい溶離液
である。一方、エタノール、またはエタノールの８０％
以上（好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以
上）の水溶液は、ＤＨＡ−Ｅのみを高純度に分取する場
合に、好ましい溶離液である。

【００２３】本発明の方法において、充填剤を充填した
カラムへの、脂質混合物の一回のチャージ（負荷）量
は、脂質混合物中の、高純度化されるべきＰＵＦＡエス
テルの含有量、ならびに、ＨＰＬＣ上で当該エステルと
近接した保持時間を示す不要な化合物の含有量などに依
存して決定される。チャージ量は特に限定されるもので
はないが、通常、カラム容積１リットル当たり、約１ｇ
から約１０ｇ程度まで可能である。従って、本発明によ
れば、工業的規模での実施に適用する場合でも十分に実
用的な効率で、ＰＵＦＡエステルを分離精製することが
できる。

【００２４】溶離液の流速など、ＨＰＬＣの他の操作条
件は、当業者により適宜設定される。ＨＰＬＣの装置と
しては、市販の適切な装置を利用し得る。工業的規模で
の実施は、サンプル溶解タンク、サンプル供給タンク、
溶出タンク、溶離液回収システムなどを含む適切なプラ
ントを設置して行うことができる。

【００２５】カラムからの溶出物の検出には、紫外（Ｕ
Ｖ）検出器、屈折率（ＲＩ）検出器など、任意の適切な
手段を利用し得る。

【００２６】（ＰＵＦＡエステルを含む脂質混合物の調
製）本発明の方法によって、エステル体として分離精製
されるＰＵＦＡは、特にＤＨＡおよび／またはＤＰＡで
ある。

【００２７】従来から、ある種の微生物、特に海洋性の
菌類または藻類を培養することによって、ＤＨＡなどを
含む油脂が得られることが知られていた（例えば、特開
平７−８７９８８および特開平７−８２６８、および特
開平７−７５５５６を参照）。本発明者らは、Schizoch
ytrium属ＳＲ２１株が、その菌体中にＤＨＡおよびＤＰ
Ａを含む脂質を特に高含量で蓄積することを報告してい
る（J. Am. Oil Chem.Soc., Vol.73, No.11, p.1421 (1
996））。ここで得られる脂質は、ＤＨＡおよびＤＰＡ
の他に飽和脂肪酸類を多く含むが、他のＦＵＰＡの含量
は通常かなり低い。従って、この微生物の培養菌体は、
ＤＨＡおよび／またはＤＰＡを高純度化するために特に
有利に使用し得る。

【００２８】Schizochytrium属ＳＲ２１株は、例えば、
５０％の人工海水を含み、グルコース、コーンステープ
リカーを基本とした培地を用いた、室温付近の温度、弱
酸性のｐＨの下、好気的条件での液体培養により、多量
のＤＨＡおよびＤＰＡを含む脂質成分を蓄積する。これ
ら培地組成、温度、ｐＨなどの培養条件は、必要に応じ
て適宜変更され得る。適切な培養条件の選択は、当業者
には容易である。

【００２９】なお、 Schizochytrium属ＳＲ２１株は、
工業技術院生命工学工業技術研究所に「海生菌ＳＲ２１
株」の名称で平成７年３月６日付けで寄託され、受託番
号ＦＥＲＭＢＰ−５０３４を取得している。さらに、
財団法人発酵研究所に平成７年３月１７日付けで寄託さ
れ、受入番号ＩＦＯ３２６９３を取得している。

【００３０】本発明の方法に用いる脂質は、上記寄託株
の培養によって得られるものに限られず、ＳＲ２１株と
同一の菌学的性質を有し、同一の種に属すると認められ
る菌株の培養によって得られるものも含まれる。

【００３１】ＳＲ２１株の培養菌体を、必要に応じて乾
燥し、常法に従い、菌体の粉砕などの操作をした後、脂
質を抽出する。抽出された脂質をエステル化することに
よって、ＰＵＦＡエステル、特にＤＨＡ−Ｅおよび／ま
たはＤＰＡ−Ｅを含有する脂質混合物が得られる。ＰＵ
ＦＡエステルのエステル基は、代表的にはアルキル基で
ある。もっとも、ビニルなどのアルケニル基、フェニル
などのアリール基、およびベンジルなどのアリールアル
キル基などでもよい。アルキル基としては、炭素数１か
ら６までのアルキル基が好ましく、炭素数１から４まで
のアルキル基がより好ましい。ヒトに直接投与する医薬
品または機能性食品としては、エチルエステルが特に好
ましい。

【００３２】エステル化の適切な反応条件は、当業者に
は公知である。例えば、脂質をヘキサンなどの有機溶媒
に溶解した後、アルカリ（例えば１Ｎの水酸化カリウム
を含むエタノール）を添加し、１０〜２５℃程度の温度
でエステル化を行うことができる。有機相を分液した
後、常法に従って濃縮すれば、エステル体を含む脂質混
合物が得られる。

【００３３】この脂質混合物を、上述のように、ＨＰＬ
Ｃに供する。本発明の方法によれば、一回のＨＰＬＣの
操作によって、目的とするＰＵＦＡエステル、特にＤＨ
Ａ−Ｅおよび／またはＤＰＡ−Ｅが高純度で得られる。
従って、上記のエステル化反応の後、予備的な精製操作
を行う必要はなく、直ちにＨＰＬＣを行うことができ
る。

【００３４】本明細書中でＰＵＦＡエステルの純度と
は、ＨＰＬＣまたはＧＣの少なくとも一方によって測定
される純度をいうものとする。本発明によれば、代表的
には９５％以上、好ましくは９８％以上、より好ましく
は９９％以上の純度が達成できる。従って、得られたＰ
ＵＦＡエステルは、医薬品および機能性食品などの製造
に直ちに使用できる。

【００３５】

【実施例】以下の実施例により本発明をさらに詳しく説
明する。本発明はこれらの実施例に限定されるものでは
ない。

【００３６】なお、以下の実施例において、他に記載の
ない限り、ＤＨＡ−ＥおよびＤＰＡ−Ｅの純度は、高速
液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による場合、分析
用カラムとして(株)ワイエムシィ社製ＹＭＣ−Ｐａｃｋ
ＡＭ−３０３を用い、溶離液としてアセトニトリル／
水（９７．５／２．５）を流速１ｍｌ／分で流通させ、
ＵＶ（２２０ｎｍ）で検出することによって測定した。

【００３７】（実施例１）（シゾキトリウム属ＳＲ２１株による油脂の生産）グル
コース６０ｇ、ポリペプトン２０ｇ、酵母エキス１０ｇ
および５０％濃度の人工海水１リットルからなる培地
（Ａ）、またはグルコース９０ｇ、ポリペプトン１０
ｇ、コーンスチープリカー１０ｇおよび５０％濃度の人
工海水１リットルからなる培地（Ｂ）を用いて、ジャー
ファーメンター（培養槽容量５リットル、培地量３リッ
トル）での培養を行った。培養は、培養温度２５℃、通
気量０．５ｖｖｍ、および撹拌速度２００ｒｐｍで行っ
た。

【００３８】培養後、遠近分離法により菌体を集めて凍
結乾燥し、重量法により培地１リットル当たりの菌体量
を求めた。次いで、この乾燥菌体にクロロホルム／メタ
ノール(２／１；容積比)混合液を加え、ガラスビーズの
存在下でホモジナイズすることにより、菌体の破砕と油
脂（脂質）の抽出を行った。抽出液をFolch法により洗
浄した後、溶媒を留去して精製油脂を得、その重量を求
めた。

【００３９】得られた油脂の一部について、油脂を１０
％ＨＣｌを含むメタノール溶液とジクロロメタンの等量
混合液に溶解し、６０℃で２時間熱処理することにより
脂肪酸メチルエステルを調製し、油脂の脂肪酸組成をガ
スクロマトグラフ法により分析した。

【００４０】ここで、ＧＣの分離条件は次のようであっ
た。

【００４１】１）カラム：タイプ；キャピラリーカラム、ＴＣ−７０、メーカー；ＧＬサンエンス社、形状；直径０．２５ｍｍ×長さ３０ｍ２）流速：０．８ｍｌ／分、１００ｋＰａ(カラム頭部圧力) ３）キャリアーガス：窒素ガス４）カラム温度：昇温モード、１７０〜２２０℃(４℃／分) ５）検出：ＦＩＤ分析の結果を表１および表２に示す。

【００４２】

【表１】

【００４３】

【表２】

【００４４】以上の結果から、シゾキトリウム属ＳＲ２
１株は、実用的な培養法である通気撹拌培養でも良好な
増殖を示すとともに、油脂を効率よく蓄積することが示
された。また、高度不飽和脂肪酸としては、ドコサヘキ
サエン酸（ＤＨＡ）が極めて高い濃度で含有され、さら
にドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）も含有されているが、
アラキドン酸（ＡＡ）およびエイコサペンタエン酸（Ｅ
ＰＡ）をほとんど含まないことが示された。この結果
は、それら脂肪酸を１０重量％前後含んでいる魚油とは
大きく異なっている。

【００４５】上記のようにして得られた脂質（実験No.3
01）を、ヘキサン中で、水酸化カリウムを含むエタノー
ルの添加によってエステル化した。常法に従って後処理
することにより、脂肪酸のエステル体を含む脂質混合物
を得た。

【００４６】（ＨＰＬＣによる精製）粒子径５０μｍ、
細孔径１２０オングストローム、炭素含有率１７％の、
オクタデシルシラン（ＯＤＳ）充填剤（ＹＭＣ＊ＧＥＬ
ＯＤＳ−ＡＭ−１２０−Ｓ５０）を用いた。この充填
剤を充填した、内径４００ｍｍ、長さ２０００ｍｍのカ
ラムを用いてＨＰＬＣを行い、ＤＨＡ−ＥおよびＤＰＡ
−Ｅを分取した。用いた分取用ＨＰＬＣ装置は、(株)ワ
イエムシィ社製である。溶離液としてメタノールを使用
して、４．４リットル／分の流速で通液させた。

【００４７】上記の脂質混合物１．４２ｋｇを、メタノ
ールの１０％溶液として、カラムにチャージした。予め
検討した結果に基づく各成分の保持時間を基に、各成分
のフラクションを分取した。各フラクションをエバポレ
ートして溶剤を留去し、ＤＨＡ−ＥおよびＤＰＡ−Ｅを
得た。得られたＤＨＡ−Ｅは０．３６、ＤＰＡ−Ｅは
０．０７ｋｇであった。

【００４８】これらの純度を、ＨＰＬＣにより分析した
ところ、ＤＨＡ−Ｅは９８．９％、ＤＰＡ−Ｅは９７．
７％であった。

【００４９】（実施例２）充填剤（ＹＭＣ＊ＧＥＬＯ
ＤＳ−ＡＭ−１２０−Ｓ５０）を充填した内径４００ｍ
ｍ、長さ２０００ｍｍのカラムを用いてＨＰＬＣを行
い、ＤＨＡ−ＥおよびＤＰＡ−Ｅを分取した。用いた分
取用ＨＰＬＣ装置は(株)ワイエムシィ社製である。溶離
液としてメタノール／水（９８／２；容積比）の混合溶
液を使用して、４．４リットル／分の流速で通液させ
た。

【００５０】実施例１と同じ脂質混合物１．３３ｋｇ
を、メタノールの１０％溶液として、カラムにチャージ
した。各成分のフラクションを分取し、各フラクション
をエバポレートして溶剤を留去し、ＤＨＡ−ＥおよびＤ
ＰＡ−Ｅを得た。得られたＤＨＡ−Ｅは０．３０ｋｇ、
ＤＰＡ−Ｅは０．０７ｋｇであった。これらの純度をＨ
ＰＬＣにより分析したところ、ＤＨＡ−Ｅは９９．０
％、ＤＰＡ−Ｅは９９．７％であった。

【００５１】（実施例３）粒子径約２０μｍ、細孔径１
２０オングストローム、炭素含有率１７％の、ＯＤＳ充
填剤（ＹＭＣ＊ＧＥＬＯＤＳ−Ａ−１２０−Ｓ１５／
３０）を充填した内径６ｍｍ、長さ２０００ｍｍのカラ
ムを用いてＨＰＬＣを行い、ＤＨＡ−ＥおよびＤＰＡ−
Ｅを分取した。用いた分取用ＨＰＬＣ装置は(株)島津製
作所製ＬＣ−８Ａである。溶離液としてメタノール／水
（９０／１０；容積比）を使用して、１ｍｌ／分の流速
で通液させた。

【００５２】各種脂質のエステル体を含む脂質の実施例
１と同じ脂質混合物４８０ｍｇを、メタノールの１０％
溶液として、カラムにチャージした。各成分のフラクシ
ョンを分取し、各フラクションをエバポレートして溶剤
を留去し、ＤＨＡ−ＥおよびＤＰＡ−Ｅを得た。得られ
たＤＨＡ−Ｅは１１４．２ｍｇ、ＤＰＡ−Ｅは１１．１
ｍｇであった。これらの純度をＨＰＬＣにより分析した
ところ、ＤＨＡ−Ｅは９９．３％、ＤＰＡ−Ｅは９９．
７％であった。

【００５３】（実施例４）粒子径５０μｍ、細孔径１２
０オングストローム、炭素含有率約１３％の、ＯＤＳ充
填剤（ＹＭＣ＊ＧＥＬＯＤＳ−ＡＱ−１２０−Ｓ５
０）を充填した内径６ｍｍ、長さ２０００ｍｍのカラム
を用いてＨＰＬＣを行い、ＤＨＡ−ＥおよびＤＰＡ−Ｅ
を分取した。用いた分取用ＨＰＬＣ装置は(株)島津製作
所製ＬＣ−８Ａである。溶離液としてエタノール／水
（９５／５；容積比）を使用して、１ｍｌ／分の流速で
通液させた。

【００５４】実施例１と同じ脂質混合物８０ｍｇを、メ
タノールの１０％溶液として、カラムにチャージした。
各成分のフラクションを分取し、各フラクションをエバ
ポレートして溶剤を留去し、ＤＨＡ−ＥおよびＤＰＡ−
Ｅを得た。得られたＤＨＡ−Ｅは２８ｍｇ、ＤＰＡ−Ｅ
は５ｍｇであった。これらの純度をＨＰＬＣにより分析
したところ、ＤＨＡ−Ｅは９６．５％、ＤＰＡ−Ｅは８
８．９％であった。

【００５５】

【発明の効果】本発明の方法によれば、ＤＨＡ、ＤＰＡ
などのＰＵＦＡのエステル体を、高効率、低コストで、
高純度まで精製することができる。

【００５６】本発明では、特に、ＤＨＡおよび／または
ＤＰＡを選択的に産生する微生物であるSchizochytrium
属ＳＲ２１株の培養菌体からの抽出物を利用する。得ら
れる脂肪酸エステルは、その脂肪酸組成が比較的に単純
であるため、カラムへの１回のチャージ量を増やすこと
ができる。従って、高純度のＰＵＦＡエステルを多量に
かつ高収率で得ることができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (74)上記４名の代理人弁理士山本秀策 (71)出願人 000001144 工業技術院長東京都千代田区霞が関１丁目３番１号 (74)上記１名の復代理人弁理士山本秀策（外１名） (71)出願人 597074239 東原孝規茨城県つくば市東１丁目１番３工業技術院生命工学工業技術研究所内 (71)出願人 597074240 中原東郎茨城県つくば市東１丁目１番３工業技術院生命工学工業技術研究所内 (71)出願人 597074251 横地俊弘茨城県つくば市東１丁目１番３工業技術院生命工学工業技術研究所内 (74)上記３名の代理人弁理士山本秀策 (72)発明者山村隆治京都府久世郡久御山町田井新荒見69−１株式会社ワイエムシィ分離センター内 (72)発明者下村泰志石川県小松市国府台５丁目28番株式会社ワイエムシィ技術開発センター内 (72)発明者十合功兵庫県神戸市西区美賀多台７丁目２−９ (72)発明者田中悟広京都府福知山市長田野町１丁目52番地ナガセ生化学工業株式会社内 (72)発明者矢口敏昭大阪府三島郡島本町若山台１丁目１番１号サントリー株式会社研究センター内 (72)発明者東原孝規茨城県つくば市東１丁目１番３工業技術院生命工学工業技術研究所内 (72)発明者中原東郎茨城県つくば市東１丁目１番３工業技術院生命工学工業技術研究所内 (72)発明者横地俊弘茨城県つくば市東１丁目１番３工業技術院生命工学工業技術研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】多価不飽和脂肪酸エステルを分離精製す
る方法であって、多価不飽和脂肪酸エステルの２種以上を含有する脂質混
合物を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によ
って精製する工程を包含し、ここで、該脂質混合物は、
シゾキトリウム(Schizochytrium)属ＳＲ２１株の培養菌
体抽出物をエステル化することによって得られ、そし
て、該高速液体クロマトグラフィーは、アルキルシラン
で誘導化された多孔性粒状基材を充填剤として用いる、
方法。
【請求項２】前記多孔性粒状基材が、３０から１００
μｍまでの範囲の粒子径、および１００から１３０オン
グストロームまでの範囲の細孔径を有する、請求項１に
記載の方法。
【請求項３】前記多孔性粒状基材が、１４％から１９
％までの範囲の炭素含有率を有するオクタデシルシラン
（ＯＤＳ）誘導化シリカゲルである、請求項１または２
に記載の方法。
【請求項４】前記高速液体クロマトグラフィーが、溶
離液としてメタノール、エタノール、またはそのいずれ
かを８０％以上含有する水溶液を用いる、請求項１から
３までのいずれかに記載の方法。
【請求項５】前記高速液体クロマトグラフィーによっ
て、９５％以上の純度のドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）
エステルおよび／またはドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）
エステルが得られる、請求項１から４までのいずれかに
記載の方法。
【請求項６】前記多価不飽和脂肪酸エステルがエチル
エステルである、請求項１から５までのいずれかに記載
の方法。