CN105848748B

CN105848748B - 脂肪酸的色谱纯化方法

Info

Publication number: CN105848748B
Application number: CN201480071100.1A
Authority: CN
Inventors: 让·布莱奥; 埃里克·瓦莱里
Original assignee: Nova Sai Pu Technique Co
Current assignee: Sartorius Chromatography Equipment SAS
Priority date: 2013-12-11
Filing date: 2014-12-09
Publication date: 2018-07-24
Anticipated expiration: 2034-12-09
Also published as: ES2809404T3; ES2774754T3; CN105848748A; CA2932929A1; WO2015086607A1; US20160311750A1; EP3079788A1; EP3473318A1; JP2017504472A; EP3473318B1; EP3079788B1; CL2016001397A1; FR3014436A1; KR20160096110A; US9802882B2; FR3014436B1; KR102289238B1; JP6581090B2; CA2932929C

Abstract

本发明涉及一种利用初始混合物纯化第一脂肪酸，优选多不饱和脂肪酸的方法，所述初始混合物还包含至少一种第二脂肪酸、可选的第三脂肪酸和可选的第四脂肪酸，其中，所述方法包括：‑第一液相色谱分离步骤，利用所述初始混合物，在第一色谱分离单元中进行，使得可以在一方面回收富集有第一脂肪酸的第一物流，并在另一方面回收富集有第二脂肪酸的物流；‑可选地，第二液相色谱分离步骤，利用所述富集有第一脂肪酸的第一物流，在第二色谱分离单元中进行，使得可以在一方面回收富集有第一脂肪酸的第二物流，并在另一方面回收富集有第三脂肪酸的物流；‑可选地，第三液相色谱分离步骤，利用所述富集有第一脂肪酸的第三物流，在第三色谱分离单元中进行，使得可以在一方面回收富集有第一脂肪酸的第三物流，并在另一方面回收富集有第四脂肪酸的物流。所述第一色谱分离单元、所述第二色谱分离单元和所述第三色谱分离单元中的至少一个为稳态循环的具有单一色谱柱的固定床色谱分离单元。

Description

脂肪酸的色谱纯化方法

技术领域

本发明涉及一种生产脂肪酸，特别是多不饱和脂肪酸，例如二十碳五烯酸的色谱方法，以及一种适于实现该方法的设备。

背景技术

脂肪酸(包括多不饱和脂肪酸(缩写为PUFA))是特别重要的生物学化合物，这是因为他们介入多种生物进程，如细胞膜的构建和维持、在血小板聚集中起作用的激素类(例如前列腺素类)的合成、炎症过程和免疫应答等等。

除了必须通过食物摄取的两个PUFA家族(称为必需脂肪酸)之外，大部分的PUFA可由人体合成。

这两个必需脂肪酸家族为：

-欧米伽-6，其在核桃、向日葵、大豆、葡萄籽或玉米的油以及高脂家禽(如鸭)中特别丰富；

-欧米伽-3，其尤其存在于核桃的油中、植物(如油菜籽和亚麻籽)中以及高脂鱼(如鲑鱼、金枪鱼、沙丁鱼、鲭鱼或鲱鱼)中。近期已开发出了采用养殖微藻类、转基因酵母菌或磷虾来生产欧米伽-3的方法。

欧米伽-3由于其抗氧化性的优点而成为特别令人感兴趣的PUFA。在这些欧米伽-3中，纯化的EPA(二十碳五烯酸，C20-5ω3)和DHA(二十二碳六烯酸，C22-6ω3)及其富集组合是极其常用的膳食增补剂或药物，以降低甘油三酯水平、心血管风险，改善认知或视觉，等等。

近来临床研究表明，以每日4克的不含DHA的96％的EPA的乙基酯治疗甘油三酯水平在500mL/dL以上的患者可降低甘油三酯水平，而不会增高LDL水平(“坏”胆固醇)，而以每日4克的EPA的乙基酯和DHA的乙基酯的混合物(分别为约50％和35％)治疗时，则导致LDL水平的增高并伴随着甘油三酯的减少。

迄今为止，所用的PUFA膳食增补剂(尤其是欧米伽-3)基本上是基于含有30％至60％的EPA和DHA混合物的混合物。在目前所用的分离方法中，所述混合物是通过甘油三酯向乙基酯的酯交换反应，然后通过经由分子蒸馏和/或饱和和单不饱和脂肪酸与尿素的重结晶来富集欧米伽-3而获得的。所富集的乙基酯可以化学方法或优选酶促法重新转化为甘油三酯。

然而，对于以大于80％，甚至大于96％的欧米伽-3(如EPA、DHA或十八碳四烯酸(stearidonic acid，SDA，C18-Sω3))(特别是酯化形式)的生产来说，这些分离的方法并不能令人满意。

然而，欧米伽-3的纯化是脆弱的，因为这些化合物包含若干碳碳双键，这使得它们易于氧化或降解。在氧气的存在下且当它们被加热时，这些PUFA尤其会经历异构化、氧化、过氧化和低聚化的反应。

因此，上文提及的分离技术使得可以以良好的产量和可接受的纯化程度获得PUFA的混合物；但它们不能实现这些PUFA的单独分离。因而它们不可能在这些PUFA中分离欧米伽-3。事实上，例如，分子蒸馏不能经济地从EPA或SDA中去除DHA；其不能允许C20和C22型长链欧米伽-3的有效分离。尿素包合与分子蒸馏的组合可获得更高纯度的欧米伽-3混合物，代价是通常更低的产量和高的运行成本，但其不能用于从它们中，特别是从EPA和DHA中分离长链欧米伽-3。

因此，需要提供用于工业纯化极高纯度的酯化形式的欧米伽-3的方法。

色谱是一种精细分离技术，其允许在避光避空气的温和条件下有效纯化或富集分子。

此技术基于使得与固定相接触而与之具有不同的相互作用的分子的分离。使用一种或若干种流体(称为流动相或洗脱液)使得各种分子以不同的速度渗滤。这些不同的速度使得可以物理分离这些分子，并可在使用一个或若干个色谱柱的色谱方法的末尾以纯化的形式收集它们。纯化的馏分通常通过如真空蒸发或膜方法的方式在环境或中等温度的温和条件下浓缩。

在某些情况下，色谱纯化的起始产物为包含已通过分子蒸馏富集的脂肪酸酯的油，优选包含大于30％的目的欧米伽-3，所述油已进行处理以除去氧化的化合物，例如通过最近的分子蒸馏或者通过吸附，优选在二氧化硅衍生物(硅胶、膨润土、硅藻土)上或在活性炭上。

已有一些用于获得高纯欧米伽-3的色谱方法的描述。

对此，文献US 5,719,302描述了一种方法，其中特别是利用超临界洗脱液(压力下的二氧化碳气体)且特别是在SMB(“模拟移动床”)上分离PUFA的方法。

文献US 2011/0091947描述了另一种纯化欧米伽-3的方法，其采用模拟移动床色谱技术。所述文献尤其描述了连续进行一个酶促酯交换反应步骤、两个分子蒸馏步骤以及一个SMB类型步骤，这最后三个步骤可通过保留时间的次序将产物分离为两个馏分

文献WO 2011/080503描述了利用如下装置来纯化欧米伽-3，该装置包括串联设置的两个SMB色谱装置和一个洗涤区域，每个SMB色谱装置都限定了分离区域且由若干色谱柱组成。将待处理的装填物进样到第一分离区域中以获得提取物流和提余液流，然后将包含目的化合物的所述提余液流进样到并不临接所述第一区域的色谱柱的第二分离区域的色谱柱中。

文献WO 2013/005051描述了通过二级色谱分离进行欧米伽-3的纯化，所述二级色谱分离用水-有机洗脱液通过反相SMB或AMB(真实移动床)进行，其中，所述通过SMB或AMB进行的二级分离在相同的色谱装置上或在两个不同的装置上相继进行，由第一装置纯化的中间产物被引入到第二装置中。

文献WO 2013/005048描述了以大于90％的纯度纯化EPA，所述纯化进行第一色谱分离，然后进行通过反相SMB或AMB进行的两级色谱分离，在每个步骤中都采用水-有机洗脱液，由所述第一色谱分离纯化的中间产物被引入到第二色谱分离中，并且由所述第二色谱分离纯化的中间产物被引入到第三色谱分离中。

仍然需要提供一种纯化脂肪酸，特别是多不饱和脂肪酸的方法，所述方法能够在比现有技术更简单的色谱设备中实现，并且具有高的单位生产率(纯化产物的质量除以固定相的质量并除以单位时间)和低的溶剂消耗，由此来降低投资成本。

发明内容

首先，本发明涉及一种利用初始混合物纯化第一脂肪酸的方法，所述初始混合物还包含至少一种第二脂肪酸、可选的第三脂肪酸和可选的第四脂肪酸，其中，所述方法包括：

-第一液相色谱分离步骤，利用所述初始混合物，在第一色谱分离单元中进行，使得可以在一方面回收富集有第一脂肪酸的第一物流，并在另一方面回收富集有第二脂肪酸的物流；

-可选地，第二液相色谱分离步骤，利用所述富集有第一脂肪酸的第一物流，在第二色谱分离单元中进行，使得可以在一方面回收富集有第一脂肪酸的第二物流，并在另一方面回收富集有第三脂肪酸的物流；

-可选地，第三液相色谱分离步骤，利用所述富集有第一脂肪酸的第三物流，在第三色谱分离单元中进行，使得可以在一方面回收富集有第一脂肪酸的第三物流，并在另一方面回收富集有第四脂肪酸的物流。

所述第一色谱分离单元、所述第二色谱分离单元和所述第三色谱分离单元中的至少一个为稳态循环的具有单一色谱柱的固定床色谱分离单元。

根据一个实施方式，所述第一色谱分离单元为稳态循环的具有单一色谱柱的固定床色谱分离单元；和/或所述第二色谱分离单元为稳态循环的具有单一色谱柱的固定床色谱分离单元；和/或所述第三色谱分离单元为稳态循环的具有单一色谱柱的固定床色谱分离单元。

根据一个实施方式，所述第一色谱分离单元、所述第二色谱分离单元和所述第三色谱分离单元中的至少两个单元为稳态循环的具有单一色谱柱的固定床色谱分离单元。

根据一个实施方式，所述第一色谱分离单元、所述第二色谱分离单元和所述第三色谱分离单元中的至少一个，且优选所述第一色谱分离单元，为具有若干个色谱柱的色谱分离单元；且更特别优选地为模拟移动床或真实移动床系统，或者为以非同步的方式定期更改物流的进样点和收集点的系统。

根据一个实施方式：

-所述第一色谱分离步骤使用第一洗脱液进行，所述第一洗脱液为水-有机洗脱液；以及/或者

-适用时，所述第二色谱分离步骤使用第二洗脱液进行，所述第二洗脱液为水-有机洗脱液；以及/或者

-适用时，所述第三色谱分离步骤使用第三洗脱液进行，所述第三洗脱液为水-有机洗脱液。

根据一个实施方式：

-所述第一洗脱液为酮/水混合物，更特别优选地，为丙酮/水；

-适用时，所述第二洗脱液为醇/水混合物，更特别优选地，为甲醇/水；

-适用时，优选地，所述第三洗脱液为酮/水混合物，更特别优选地，为丙酮/水；

-适用时，优选地，所述第一洗脱液不同于所述第二洗脱液，以及适用时，优选地，所述第三洗脱液不同于所述第一洗脱液且不同于所述第二洗脱液。

根据一个实施方式：

-将第一洗脱液的有机溶剂的质量浓度控制为在2％以内，优选在1％以内，或在0.5％以内，或在0.2％以内，或在0.1％以内；

-适用时，优选地，将第二洗脱液的有机溶剂的质量浓度控制为在2％以内，优选在1％以内，或在0.5％以内，或在0.2％以内，或在0.1％以内；

-适用时，优选地，将第三洗脱液的有机溶剂的质量浓度控制为在2％以内，优选在1％以内，或在0.5％以内，或在0.2％以内，或在0.1％以内。

根据一个实施方式，所述第一脂肪酸为第一多不饱和脂肪酸。

根据实例：

-所述第一多不饱和脂肪酸为二十碳五烯酸，且优选在所述方法的末尾以大于或等于80％、或大于或等于90％、或大于或等于96％的纯度被回收；或者

-所述第一多不饱和脂肪酸为二十二碳六烯酸，且优选在所述方法的末尾以大于或等于70％、或大于或等于80％、或大于或等于90％、或大于或等于95％的纯度被回收；或者

-所述第一多不饱和脂肪酸为花生四烯酸，且优选在所述方法的末尾以大于或等于70％、或大于或等于80％、或大于或等于90％、或大于或等于95％的纯度被回收；或者

-所述第一多不饱和脂肪酸为二十二碳五烯酸，且优选在所述方法的末尾以大于或等于70％、或大于或等于80％、或大于或等于90％、或大于或等于95％的纯度被回收。

根据一个实施方式，所述方法包括：

-至少一个在所述第一脂肪酸与比所述第一脂肪酸保留更久的一种或多种化合物之间的色谱分离步骤，以及优选至少两个在所述第一脂肪酸与比所述第一脂肪酸保留更久的一种或多种化合物之间的色谱分离步骤；以及/或者

-至少一个在所述第一脂肪酸与比所述第一脂肪酸保留更短的一种或多种化合物之间的色谱分离步骤；以及

其中所述方法优选包括：

-第一色谱分离步骤，其为在所述第一脂肪酸与比所述第一脂肪酸保留更久的一种或多种化合物之间的色谱分离步骤；然后第二色谱分离步骤，其为在所述第一脂肪酸与比所述第一脂肪酸保留更久的一种或多种化合物之间的色谱分离步骤；然后第三色谱分离步骤，其为在所述第一脂肪酸与比所述第一脂肪酸保留更短的一种或多种化合物之间的色谱分离步骤。

根据一个实施方式，所述第一色谱分离单元、所述第二色谱分离单元和所述第三色谱分离单元中的至少一个包括具有大于或等于5cm、或大于或等于10cm、或大于或等于20cm、或大于或等于25cm、或大于或等于30cm、或大于或等于40cm、或大于或等于50cm、或大于或等于60cm的长度；和/或具有大于或等于10cm、或大于或等于20cm、或大于或等于25cm、或大于或等于30cm、或大于或等于40cm、或大于或等于50cm、或大于或等于60cm的直径的分离色谱柱。

根据一个实施方式：

-供料至所述第一色谱分离单元的初始混合物包含小于80％的有机溶剂，优选小于60％，或小于40％，或小于20％，或小于10％，或小于5％，或小于2％，或小于1％的有机溶剂，以及更加特别优选地为基本上没有有机溶剂的脂肪酸的混合物；以及/或者

-适用时，供料至所述第二色谱分离单元的富集有第一脂肪酸的第一物流包含小于80％的有机溶剂，优选小于60％，或小于40％，或小于20％，或小于10％，或小于5％，或小于2％，或小于1％的有机溶剂，以及更加特别优选地为基本上没有有机溶剂的脂肪酸的混合物；以及/或者

-适用时，供料至所述第三色谱分离单元的富集有第一脂肪酸的第二物流包含小于80％的有机溶剂，优选小于60％，或小于40％，或小于20％，或小于10％，或小于5％，或小于2％，或小于1％的有机溶剂，以及更加特别优选地为基本上没有有机溶剂的脂肪酸的混合物。

本发明的目的还在于一种利用初始混合物纯化第一脂肪酸的设备，其中，所述设备包括：

-第一液相色谱分离单元，其通过初始混合物的供料管道供料，以及在出口处一方面连接富集有第一脂肪酸的物流的第一管道，且另一方面连接富集有第二脂肪酸的物流的管道；

-可选地，第二液相色谱分离单元，其通过富集有第一脂肪酸的物流的第一管道供料，以及在出口处一方面连接富集有第一脂肪酸的物流的第二管道，且另一方面连接富集有第三脂肪酸的物流的管道；

-可选地，第三液相色谱分离单元，其通过富集有第一脂肪酸的物流的第二管道供料，以及在出口处一方面连接富集有第一脂肪酸的物流的第三管道，且另一方面连接富集有第四脂肪酸的物流的管道；

其中，所述第一色谱分离单元、所述第二色谱分离单元和所述第三色谱分离单元中的至少一个为稳态循环的具有单一色谱柱的固定床色谱分离单元。

根据一个实施方式，所述第一色谱分离单元为稳态循环的具有单一色谱柱的固定床色谱分离单元；和/或所述第二色谱分离单元为稳态循环的具有单一色谱柱的固定床色谱分离单元；和/或所述第三色谱分离单元为稳态循环的具有单一色谱柱的固定床色谱分离单元；以及优选地，所述第一色谱分离单元、所述第二色谱分离单元和所述第三色谱分离单元中的至少两个单元为稳态循环的具有单一色谱柱的固定床色谱分离单元。

本发明可克服现有技术的缺点。其更特别地提供了一种纯化脂肪酸，且特别是多不饱和脂肪酸的方法，所述方法能够在比现有技术更简单的色谱设备中实现，并且具有高的单位生产率和低的溶剂消耗。

此方法的实现归功于在稳态循环的固定床单一色谱柱分离单元中进行分离步骤。

本发明由此可利用多种化合物装填物且通过使所用色谱柱的数量最小化来提供一种允许被用于膳食增补剂或药物组合物中的高纯度脂肪酸(特别是多不饱和脂肪酸)。

附图说明

图1示意性图示了用于实施本发明的设备的一个实施方式。

具体实施方式

现在，将在以下叙述中更加详细地且以非限定性的方式描述本发明。

一般而言，除非另有规定，所表述的比例为质量比例。

结合其中所述第一脂肪酸为PUFA(称为“第一PUFA”)的优选实施方式进行以下的全部叙述。但是，当所述第一脂肪酸并非多不饱和脂肪酸时，该叙述以类似的方式是有效的。则在以下叙述中，适当地将“第一PUFA”替换为更加上位的术语“第一脂肪酸”。由此，所述第一脂肪酸也可以是饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸或脂肪酸衍生物，如枝化的、天然或改性的脂肪酸。

制备方法

本发明的方法使得可利用初始混合物获得纯化形式的第一PUFA。除了第一PUFA之外，所述初始混合物还包括其它非所需的脂肪酸，即普通的饱和或单不饱和脂肪酸和其它PUFA，以及其它可能的杂质。上文提及的第二脂肪酸、第三脂肪酸和第四脂肪酸即为其它非所需的脂肪酸的一部分。

所述初始混合物可以是来自鱼、植物、藻类和/或酵母(且优选来自鱼)的脂肪酸的混合物。其可以是粗产物，例如鱼油或藻油，或者酵母油。其还可以是来自上述原材料的产物，例如来自鱼油、藻油和/或酵母油的产物。所述油可以，例如，提取自天然的或遗传修饰的植物、藻类或酵母。

“来自原材料的产物”是指经历过一步或若干步处理的原材料。这些处理步骤包括一步或若干步的细胞解体、研磨、分离或纯化(例如，分馏)，和/或水解步骤以将甘油三酯转化为游离脂肪酸，和/或酯交换步骤以将所述脂肪酸转化为烷基酯(且优选为乙基酯)，和/或降低过氧化物指标和/或茴香胺指标(参见下文)的步骤，和/或分子蒸馏的步骤，和/或一步或若干步的色谱分离，等等。

根据一个有利的实施方式，所述初始混合物为酯化的或酯交换的产物，如鱼油、植物油、藻油或酯交换的酵母油。

由此，在本发明的方法中获得或使用的每个脂肪酸(特别是每个PUFA)都可以是脂肪酸衍生物，特别是甘油单酯、甘油二酯或甘油三酯形式的脂肪酸衍生物，酯形式的脂肪酸衍生物，磷脂形式的脂肪酸衍生物，酰胺形式的脂肪酸衍生物，内酯形式的脂肪酸衍生物，或盐形式的脂肪酸衍生物。

游离脂肪酸及酯形式是优选的，且更尤其是酯。所述酯通常为烷基酯，例如，C1-C6烷基酯，尤其是C1-C4烷基酯，例如，甲酯和乙酯。乙酯是优选的。

由此，本申请中提及的第一PUFA、第二脂肪酸、第三脂肪酸和第四脂肪酸可以是，例如，游离脂肪酸或酯的形式，且优选乙基酯化合物的形式。

参照图1，根据本发明的方法可在包括第一色谱分离单元3的设备中进行。第一色谱分离单元3提供了所述第一PUFA与所述第二脂肪酸之间的分离。

每次在本申请中提及所述第一PUFA与规定的脂肪酸之间的分离，应当理解的是，其它的脂肪酸也可在针对所述规定的脂肪酸的分离的同时与所述第一PUFA分离。

一般而言，每个色谱分离都使所述第一PUFA与极性比它更大或极性比它更小的一组化合物分离。所述分离也可根据脂族链长度的大小和不饱和度的数目的标准来进行。更普遍地，由于其效果可随着所用的洗脱液而定，所述分离根据依情况不同的保留时间的标准来进行，由此可使所述第一PUFA与比它保留更久或比它保留更短的杂质分离。

所述分离的温度可根据本领域技术人员公知的标准在5℃与90℃之间，优选15℃与60℃之间，更优选环境温度与45℃之间的范围内调节。适用时，调节压力以在色谱柱中维持单相状态，优选液态或超临界状态。

第一色谱分离单元3通过含有脂肪酸的混合物的供料管道1并通过含有第一洗脱液的供料管道2供料。

在第一色谱分离单元3的出口处，一方面连接富集有第一PUFA的物流的第一管道5，且另一方面连接富集有第二脂肪酸的物流的管道4。

在本申请上下文中，术语“富集”具有相对性的含义：从初始物流开始的物种A与物种B之间的分离，其可回收富集有物种A的物流，如此意味着由此回收的物流具有大于所述初始物流的A/B质量比。

所述初始混合物可已经历如上文所述的那些预处理步骤，在此情况下相应的处理单元(未显示)可包括于本发明的设备中。

优选地，第二色谱分离单元6设置在下游，以确保所述第一PUFA与第三脂肪酸之间的分离。此第二色谱分离单元6通过富集有第一PUFA的物流的第一管道5并通过含有第二洗脱液的供料管道7供料。

在第二色谱分离单元6的出口处，一方面连接富集有第一PUFA的物流的第二管道9，且另一方面连接富集有第三脂肪酸的物流的管道8。

优选地，设置第三色谱分离单元10，以确保所述第一PUFA与第四脂肪酸之间的分离。此第三色谱分离单元10通过富集有第一PUFA的物流的第二管道9并通过含有第三洗脱液的供料管道11供料。

在第三色谱分离单元10的出口处，一方面连接富集有第一PUFA的物流的第三管道12，且另一方面连接富集有第四脂肪酸的物流的管道13。

优选地，所述方法正好包括在上文所述的三个单元中的三个色谱分离步骤。

或者，所述方法仅包括两个色谱分离步骤，在此情况下省略第三色谱分离单元10。纯化形式的第一PUFA因而在富集有第一PUFA的物流的第二管道9中被直接回收。

再或者，所述方法仅包括一个色谱分离步骤，在此情况下第二色谱分离单元6和第三色谱分离单元10都被省略。纯化形式的第一PUFA因而在富集有第一PUFA的物流的第一管道5中被直接回收。

再或者，所述方法可包括四个连续的色谱分离步骤(或者更多)，在此情况下，以类似的方式增添额外的色谱分离单元。

术语“色谱分离单元”表示具有单一色谱柱的色谱系统或具有若干色谱柱的色谱系统。

其可以是或不是固定床色谱系统。在固定床色谱系统中，待分离化合物的混合物在通常为圆柱形的壳体(或色谱柱)中渗滤。所述色谱柱包括对流体可渗透的多孔性材料床层(固定相)。所述混合物中每种化合物的渗滤速度随所述化合物的物理性质而定。在所述固定相上保留最久的化合物比在所述固定相上保留最短的化合物更慢地渗滤。此原理使得可实现所需的分离。

可在串联或并联的若干色谱柱中进行此处理，但通常利用单一色谱柱实施在固定床系统中的一个色谱分离。

此固定床色谱系统的实例为HPLC(高效液相色谱)或CYCLOJET^TM(即，稳态循环的系统)系统。

所述CYCLOJET^TM系统例如描述在文献US 6,063,284中，对该文献明确进行引用。这是一种单一色谱柱的间歇色谱分离系统，其中，在色谱柱的出口处分别收集最久保留的物种(i)以及最短保留的物种(ii)，其中色谱未分离的部分通过主泵再循环。待分离的混合物在色谱再循环部分凭借进样环定期进样。所述进样环优选连接在所述主泵与所述色谱柱之间。在若干色谱循环之后，所述方法达到了周期性稳态，其中进样的产物的量等于在所述色谱柱的出口处分别收集的产物的量。

根据一个实施方式，在稳态循环的单一色谱柱固定床系统中的色谱分离是周期性的，且包括以下步骤：

-凭借洗脱液泵在色谱柱中建立和维持循环的色谱曲线；

-间歇地且在每个循环向所述循环的色谱曲线中进样包含至少两种待分离化合物的样品，其中，所述进样凭借由进样阀控制于进样点处的进样环进行，以将存在于所述环中的样品进样到所述循环的色谱曲线中，其中，所述进样阀从开始所述进样直至全部所述曲线从色谱柱洗脱之时在进样点处保持不变，然后将所述进样阀切换至加载位置，以在整个曲线位于所述色谱柱中时加载所述进样环，以及

-以间歇和定期的方式，利用循环的曲线收集至少两个富集的馏分。

此分离也可包括以下步骤：

-凭借洗脱液泵，在循环期间以大致连续的方式使洗脱液通过所述色谱柱作为流动相。

此分离也可包括以下步骤：

-记录自开始收集第一馏分直至下次开始收集第一馏分为止发生的事项；

-在收集第三馏分期间中断所述洗脱液泵，其中，此中断持续到循环结束为止，由此可在时间上再现所述循环。

根据一个实施方式，在所维持的循环曲线中在进样期间没有损失循环的曲线。

此系统的详细实施方式在前述文献US 6,063,284中的第5栏第36行至第10栏第41行被提及。

所述色谱分离单元也可以是非固定床色谱系统。非固定床系统为多色谱柱系统，其中固定相床层与物流的进样点和/或收集点的相对位置随时间更改。

这种非固定床色谱系统的实例为SMB、iSMB、SSMB、AMB、VARICOL^TM、MODICON^TM、POWERFEED^TM、DCC或MCSGP系统。

SMB系统包括串联连接的多个包含吸附剂的独立色谱柱。洗脱液流根据第一方向经过所述色谱柱。供料的物流和洗脱液的进样点以及分离的化合物的收集点凭借一组阀门定期且同时地改变。整体效果是为了模拟包含固体吸附剂移动床的单一色谱柱的运行，同时所述固体吸附剂以与洗脱液流的流动相反的方向移动。照此，SMB系统是由包含洗脱液流经的固体吸附剂固定床的色谱柱组成，但所述运行是模拟逆流的连续移动床。

SMB系统最为常规的形式为具有四个区域的SMB系统。其它可能的形式为具有三个区域的SMB系统和具有两个区域的SMB系统(如在Kwangnam Lee的论文“Two SectionSimulated Moving Bed Process”,Separation Science and Technology 35(4):519-534,2000中所述，对该论文明确进行引用)。

iSMB系统例如描述在文献EP 0342629和US 5,064,539中，对所述文献明确进行引用。SSMB系统将物流的引入和收集削减成周期性应用的子序列。在所述iSMB和SSMB系统中，存在至少一个步骤，其中所述系统作为闭合回路运行，没有产物的入口和出口。

所述SMB系统的其它选择为：随时间变化的SMB系统以及POWERFEED^TM系统，如在文献US 5,102,553和Zhang等人的论文"PowerFeed operation of simulated moving bedunits:changing flow-rates during the switching interval",Journal ofChromatography A,1006:87-99,2003中所述，对所述文献明确进行引用；MODICON^TM系统，如文献US 7,479,228中所述，对该文献明确进行引用；以及具备内循环的SMB系统，如文献US8,282,831中所述，对该文献明确进行引用。

DCC色谱系统例如描述在文献FR 2889077中，对该文献明确进行引用。DCC系统为用于周期性变换流动相和待分离混合物的进样点的连续方法，具有始终处于开放回路中的特征。其采用两个以上的色谱柱。

AMB系统的运行类似于SMB系统。不过，不是改变供料物流和洗脱液的进样点以及收集点，而是凭借阀门系统，相对于供料和收集点物理变换一组吸附单元(色谱柱)。再一次，所述运行使得可模拟逆流的连续移动床。

VARICOL^TM色谱系统例如描述在文献US 6,136,198、US 6,375,839、US 6,413,419和US 6,712,973中，对所述文献明确进行引用。VARICOL^TM色谱系统包括串联连接的多个包含吸附剂的独立色谱柱。使洗脱液根据第一方向经过所述色谱柱。与所述SMB系统相反，凭借一组阀门定期但非同步地变换在系统中待分离混合物和洗脱液的进样点以及分离的化合物的收集点。整体效果是为了产生具有随时间变化的长度的分离区域，由此在最为有用的区域中动态分配固定相，并允许与较少的色谱分离单元相似的分离动力以及提高生产率。与SMB系统相反，VARICOL^TM系统没有模拟包含固体吸附剂移动床的单一色谱柱的运行，所述固体吸附剂在与洗脱液流相反的方向上移动，由此所述VARICOL^TM系统的运行原理不能在等价的AMB系统中贯彻。

本发明提供了至少一个将在稳态循环的固定床单一色谱柱单元(特别是例如上文所述的CYCLOJET^TM单元)中进行的色谱分离步骤。

当所述方法包括在第一色谱分离单元3中的单个色谱分离步骤时，则此第一色谱分离单元3为稳态循环的固定床单一色谱柱单元。

当所述方法仅包括相继在第一色谱分离单元3中和在第二色谱分离单元6中的两个色谱分离步骤时，则：

-仅第一色谱分离单元3为稳态循环的固定床单一色谱柱单元；

-或者仅第二色谱分离单元6为稳态循环的固定床单一色谱柱单元；

-或者第一色谱分离单元3和第二色谱分离单元6均为稳态循环的固定床单一色谱柱单元。

当所述方法包括相继在第一色谱分离单元3、第二色谱分离单元6和第三色谱分离单元10中的三个色谱分离步骤时，则：

-或者仅第三色谱分离单元10为稳态循环的固定床单一色谱柱单元；

-或者仅第一色谱分离单元3和第二色谱分离单元6为稳态循环的固定床单一色谱柱单元；

-或者仅第一色谱分离单元3和第三色谱分离单元10为稳态循环的固定床单一色谱柱单元；

-或者仅第二色谱分离单元6和第三色谱分离单元10为稳态循环的固定床单一色谱柱单元；

-或者第一色谱分离单元3、第二色谱分离单元6和第三色谱分离单元10均为稳态循环的固定床单一色谱柱单元；

不是稳态循环的固定床单元的色谱分离单元可以是固定床分离单元(单一色谱柱或不是)或者非固定床分离单元(多色谱柱)，特别是VARICOL^TM或SMB或AMB类型。

由此，根据一个实施方式，所述第一步骤在非固定床单元中进行，所述第二步骤在固定床单元中进行，以及适用时，所述第三步骤在固定床单元中进行。

术语“适用时”是指“在所讨论的色谱分离步骤实际存在的前提下”。

根据一个实施方式，所述第一步骤在VARICOL^TM或SMB或AMB单元中进行，所述第二步骤在CYCLOJET^TM单元中进行，以及所述第三步骤在VARICOL^TM或SMB或AMB单元中进行。

根据一个可选且优选的实施方式，所述第一步骤在VARICOL^TM或SMB或AMB单元中进行，所述第二步骤在HPLC或CYCLOJET^TM单元中进行，以及所述第三步骤在HPLC或CYCLOJET^TM单元中进行(其中，后两个步骤中的至少一个在CYCLOJET^TM单元中进行)。

在一个优选的可选方案中，所述第一步骤在VARICOL^TM单元中进行，所述第二步骤在CYCLOJET^TM单元中进行，以及所述第三步骤在CYCLOJET^TM单元中进行。

根据另一个可选方案，所述步骤中的每一个都在HPLC或CYCLOJET^TM单元中进行，前提是所述步骤中的至少一个在CYCLOJET^TM单元中进行；优选所述步骤中的两个在CYCLOJET^TM单元中进行；以及可能的话，所述三个步骤都在CYCLOJET^TM单元中进行。

所述分离步骤可在物理分离的单元中同时进行，或者可在物理分离的单元中或在相同的单元中依次进行。

应当注意的是，当两个色谱分离步骤在SMB或AMB型系统中进行时，其可在相同的SMB或AMB系统上同时进行。在相同的装置上同时进行的实例描述于文献WO 2011/080503或文献WO 2013/005048，或文献WO 2013/005051中，对所述文献明确进行引用。

优选地，全部的色谱分离单元都为物理分离的。

根据一个实施方式，第一色谱分离单元3的一个或多个分离色谱柱(优选多个分离色谱柱)具有大于或等于5cm、或大于或等于10cm、或大于或等于20cm、或大于或等于25cm、或大于或等于30cm、或大于或等于40cm、或大于或等于50cm、或大于或等于60cm的总的或累积长度；和/或具有大于或等于10cm、或大于或等于20cm、或大于或等于25cm、或大于或等于30cm、或大于或等于40cm、或大于或等于50cm、或大于或等于60cm的直径。

根据一个实施方式，第二色谱分离单元6的一个或多个分离色谱柱(优选多个分离色谱柱)具有大于或等于5cm、或大于或等于10cm、或大于或等于20cm、或大于或等于25cm、或大于或等于30cm、或大于或等于40cm、或大于或等于50cm、或大于或等于60cm的总的或累积长度；和/或具有大于或等于10cm、或大于或等于20cm、或大于或等于25cm、或大于或等于30cm、或大于或等于40cm、或大于或等于50cm、或大于或等于60cm的直径。

根据一个实施方式，第三色谱分离单元10的一个或多个分离色谱柱(优选多个分离色谱柱)具有大于或等于5cm、或大于或等于10cm、或大于或等于20cm、或大于或等于25cm、或大于或等于30cm、或大于或等于40cm、或大于或等于50cm、或大于或等于60cm的总的或累积长度；和/或具有大于或等于10cm、或大于或等于20cm、或大于或等于25cm、或大于或等于30cm、或大于或等于40cm、或大于或等于50cm、或大于或等于60cm的直径。

根据一个实施方式，本发明的方法或设备中所用的全部色谱柱具有大于或等于5cm、或大于或等于10cm、或大于或等于20cm、或大于或等于25cm、或大于或等于30cm、或大于或等于40cm、或大于或等于50cm、或大于或等于60cm的总的或累积长度；和/或具有大于或等于10cm、或大于或等于20cm、或大于或等于25cm、或大于或等于30cm、或大于或等于40cm、或大于或等于50cm、或大于或等于60cm的直径。

所述色谱柱的长度和直径为所述色谱柱的有效尺寸，即，所述色谱柱中固定相床层的尺寸。存在不同的色谱柱几何形状，包括轴向或径向圆柱形色谱柱，但也包括具有非圆柱形截面的腔室，对此明确进行引用(在此情况下，所述直径指的是所述截面的最大尺度)。

每个色谱分离步骤都可在作为吸附剂(固定相)的反相上进行。例如，可采用基于微极性树脂的或用有机基团化学改性的基于二氧化硅的固定相的吸附剂，所述有机基团如烷基(特别是C4、C8、C18、C24、C30)、苯基，等等。

每个色谱分离步骤都可利用水-有机洗脱液(即一种或若干有机溶剂与水的混合物)来进行。优选地，全部色谱分离步骤都利用水-有机洗脱液来进行。或者，可利用纯粹的有机洗脱液来进行某些色谱分离步骤。

可在本发明的框架内使用的有机溶剂(特别是用于形成水-有机洗脱液的有机溶剂)为，例如，醇类，如乙醇、丙醇，且更优选为甲醇；酮类，如丙酮或甲乙酮；腈类，如乙腈；酯类，如乙酸甲酯或乙酸乙酯；呋喃类，如四氢呋喃；醚类，如二乙醚或甲乙醚；以及所述实例中的两种或大于两种溶剂的组合。甲醇和丙酮是优选的有机溶剂。

每个水-有机洗脱液的特征在于水/有机比，其为所述洗脱液中水相对于有机溶剂的体积比。

每个水-有机洗脱液的水/有机比优选可在0.01:99.99至30:70，且优选在5:95至25:75变化。

各个色谱分离步骤可利用具有相同组成或不同组成的洗脱液进行。

优选采用具有不同组成，特别是具有不同水/有机比的洗脱液，这使得可在每个分离步骤调节洗脱液的洗脱强度，由此在每个步骤获得不同组分的分离。还可期望的是，在各个步骤中采用由不同有机溶剂组成的洗脱液，以在每个分离步骤调节要分离的某些物种之间的色谱选择性，并由此在每个步骤获得不同化合物的分离。

优选地，将第一洗脱液的有机溶剂的质量浓度控制为在2％以内，优选在1％以内，或在0.5％以内，或在0.2％以内，或在0.1％以内；适用时，优选将第二洗脱液的有机溶剂的质量浓度控制为在2％以内，优选在1％以内，或在0.5％以内，或在0.2％以内，或在0.1％以内；适用时，优选将第三洗脱液的有机溶剂的质量浓度控制为在2％以内，优选在1％以内，或在0.5％以内，或在0.2％以内，或在0.1％以内。所述洗脱液的组成的控制通过确保水和/或有机溶剂的供应来进行以开展所需的调节。

在所述第一色谱分离步骤中，第一PUFA优选与比其保留更久的化合物(特别是第二脂肪酸)分离。在此情况下，当第一色谱分离单元3为非固定床单元时，富集有第一PUFA的物流为提余物，而富集有第二脂肪酸的物流为提取物。

在所述第二色谱分离步骤中，第一PUFA优选与比其保留更久的化合物(特别是第三脂肪酸)分离。

在所述第三色谱分离步骤中，第一PUFA优选与比其保留更短的化合物(特别是第四脂肪酸)分离。

来自色谱分离步骤的每个物流都优选经历浓缩步骤。将所述物流浓缩，由此除去洗脱液(有机溶剂和水)，或将该物流的有机溶剂和水的质量含量降低至小于90％、或小于80％、或小于70％、或小于60％、或小于50％、或小于40％、或小于30％、或小于20％、或小于10％、或小于5％、或小于2％、或小于1％、或小于0.5％、或小于0.1％的水平。

由此，在一个优选实施方式中，将至少一个浓缩单元(图中未显示)连接每个色谱分离单元3、6、10。

由此，优选地，在第一色谱分离的末尾收集的富集有第一PUFA的第一物流为浓缩物流(洗脱液减少，或者没有或基本没有有机溶剂和水)；同样地，适用时，在第二色谱分离的末尾收集的富集有第一PUFA的第二物流优选为浓缩物流(洗脱液减少，或者没有或基本没有有机溶剂和水)；同样地，适用时，在第三色谱分离的末尾收集的富集有第一PUFA的第三物流优选为浓缩物流(洗脱液减少，或者没有或基本没有有机溶剂和水)。

可能地，富集有第二脂肪酸的物流、适用时富集有第三脂肪酸的物流以及适用时，富集有第四脂肪酸的物流为浓缩物流(洗脱液减少，或者没有或基本没有有机溶剂和水)。

在每个浓缩单元中，所述洗脱液可被蒸发和冷凝，由此来将其与脂肪酸的混合物分离。例如，可采用再循环降膜蒸发器、升流蒸发器、刮膜蒸发器、薄层蒸发器、热虹吸蒸发器、旋转蒸发器、蒸馏塔、精馏塔或者在装置底部允许洗脱液蒸发和浓缩脂肪酸浓缩的任何其它蒸发器或蒸发器的组合。所述蒸发优选在比大气压低的压力下，特别是在小于或等于750毫巴，或小于或等于500毫巴，或小于或等于300毫巴的压力下进行。

或者，可采用膜分离装置，其具有一个或若干个分离阶段，或蒸发和膜分离装置的组合。

在浓缩步骤的末尾获得的洗脱液(例如，蒸发的和冷凝的，或者其它方式分离的)可被再循环至所述方法的一个或若干个步骤中，特别是一个或若干个色谱分离步骤中。

由此，优选本发明的方法提供了在第一色谱分离步骤中所用的洗脱液的再循环。更加特别优选地，再循环洗脱液以在第一色谱分离步骤中再使用。

优选本发明的方法提供了在第二色谱分离步骤中所用的洗脱液的再循环。更加特别优选地，再循环洗脱液以在第二色谱分离步骤中再使用。

由此，优选本发明的方法提供了在第三色谱分离步骤中所用的洗脱液的再循环。更加特别优选地，再循环洗脱液以在第三色谱分离步骤中再使用。

根据特别的实施方式，再循环大于50％，优选大于60％，优选大于70％，优选大于80％，优选大于90％，优选大于95％，优选大于98％，优选大于99％的由富集有第一PUFA的第一物流分离的洗脱液。

根据特别的实施方式，再循环大于50％，优选大于60％，优选大于70％，优选大于80％，优选大于90％，优选大于95％，优选大于98％，优选大于99％的由富集有第一PUFA的第二物流分离的洗脱液。

根据特别的实施方式，再循环大于50％，优选大于60％，优选大于70％，优选大于80％，优选大于90％，优选大于95％，优选大于98％，优选大于99％的由富集有第一PUFA的第三物流分离的洗脱液。

根据特别的实施方式，再循环大于50％，优选大于60％，优选大于70％，优选大于80％，优选大于90％，优选大于95％，优选大于98％，优选大于99％的由富集有第二脂肪酸的物流分离的洗脱液。

根据特别的实施方式，再循环大于50％，优选大于60％，优选大于70％，优选大于80％，优选大于90％，优选大于95％，优选大于98％，优选大于99％的由富集有第三脂肪酸的物流分离的洗脱液。

根据特别的实施方式，再循环大于50％，优选大于60％，优选大于70％，优选大于80％，优选大于90％，优选大于95％，优选大于98％，优选大于99％的由富集有第四脂肪酸的物流分离的洗脱液。

优选地，在每个色谱分离单元的进口处供给的且意欲被分离的供给产物是尽可能没有溶剂的。

由此：

-所述初始混合物包含小于80％的有机溶剂，优选小于60％，或小于40％，或小于20％，或小于10％，或小于5％，或小于2％，或小于1％的有机溶剂，以及更加特别优选地为基本上没有有机溶剂的脂肪酸的混合物；以及/或者

-适用时，供料至第二色谱分离单元6的富集有第一PUFA的第一物流包含小于80％的有机溶剂，优选小于60％，或小于40％，或小于20％，或小于10％，或小于5％，或小于2％，或小于1％的有机溶剂，以及更加特别优选地为基本上没有有机溶剂的脂肪酸的混合物；以及/或者

-供料至第三色谱分离单元10的富集有第一PUFA的第二物流包含小于80％的有机溶剂，优选小于60％，或小于40％，或小于20％，或小于10％，或小于5％，或小于2％，或小于1％的有机溶剂，以及更加特别优选地为基本上没有有机溶剂的脂肪酸的混合物。

根据本发明的方法可选地提供了在一个色谱分离之后或在多个色谱分离之后除去(或在数量上减少)被氧化的化合物的步骤。

优选地，此步骤并非一个色谱分离步骤，且不在色谱分离单元中进行。

优选地，此步骤基本上不使所述第一PUFA与在该物流中存在的其它脂肪酸分离(除了醛或过氧化物类型的被氧化的化合物之外)。

所述除去被氧化的化合物的步骤可在处理单元14中进行，处理单元14由富集有第一PUFA的物流的第三管道12(或如果仅存在两个色谱分离步骤时由富集有第一PUFA的物流的第二管道9，或如果仅存在一个色谱分离步骤时由富集有第一PUFA的物流的第二管道5)直接或间接供料。此单元的出口处连接用于收集第一纯化的PUFA的管道15。

处理单元14可特别地为分子蒸馏单元或短程蒸发器。短程蒸发器设置有内部冷凝器，且可在小于或等于200℃，优选小于或等于150℃，优选小于或等于120℃，优选小于或等于100℃，优选小于或等于80℃的温度，在优选小于10毫巴，优选小于1毫巴，优选小于0.1毫巴，优选小于0.01毫巴，优选小于0.001毫巴的压力下，以优选小于1000s，优选小于100s，优选小于10s的停留时间进行蒸馏。

或者处理单元14可以是用于接触吸附基质的单元。

所述吸附基质为能吸附被氧化的化合物(如过氧化物或醛类化合物)的任意基质。其可选自，例如，二氧化硅、氧化铝、活性炭及它们的衍生物(特别是硅胶、硅酸盐、铝酸盐和铝硅酸盐)。粘土(如膨润土)为适合的基质的一个实例，类似的还有硅藻土。

所述吸附可通过经吸附床层的渗滤而间歇(即，“分批”)或连续进行。优选地，所述脂肪酸在此步骤期间不被稀释，且特别地，不添加溶剂。所述接触可持续，例如，5分钟至24小时，且特别地，10分钟至10小时、20分钟至5小时、30分钟至2小时以及45分钟至1小时30分钟。

所用吸附剂的量随吸附剂的性质及其俘获所述被氧化的化合物的能力而定。其可以是，例如，1至1000g吸附剂/kg待处理物流(脂肪酸的混合物)，特别是10至500g/kg，且更特别是25至200g/kg。

在所述接触之后，将所述吸附剂与所述脂肪酸的混合物分离，可将所述脂肪酸的混合物过滤以防止由残余吸附剂导致的任何污染。

优选地，所述被氧化的化合物与所述吸附剂的结合基本上是不可逆的，即所述吸附剂是不可再生的。不过，例如，可通过热处理来再生所述吸附剂，以限制处理废物的体积和/或成本。

处理单元14中的处理步骤可使处理过的物流的过氧化物指标降低至少25％，优选至少50％，优选至少75％，优选至少80％，或至少90％，或至少95％，或至少98％。

处理单元14中的处理步骤可使处理过的物流的茴香胺指标降低至少25％，优选至少50％，优选至少75％，优选至少80％，或至少90％，或至少95％，或至少98％。

所述过氧化物指标测量在脂肪酸混合物中的过氧化物化合物的量。所用的分析方法优选为Eur Ph 2.5.5方法A。

所述茴香胺指标测量在脂肪酸混合物中的醛类化合物的量。所用的分析方法优选为Eur Ph 2.5.36。

根据一个实施方式，来自处理步骤的物流(在用于收集第一纯化的PUFA的管道15中收集的产物)的过氧化物指标为小于或等于10，或小于或等于9，或小于或等于8，或小于或等于7，或小于或等于6，或小于或等于5，或小于或等于4，或小于或等于3，或小于或等于2，或小于或等于1.5，或小于或等于1。

根据一个实施方式，来自处理步骤的物流(在用于收集第一纯化的PUFA的管道15中收集的产物)的茴香胺指标为小于或等于20，或小于或等于18，或小于或等于16，或小于或等于14，或小于或等于12，或小于或等于10，或小于或等于9，或小于或等于8，或小于或等于7，或小于或等于6，或小于或等于5。

类似于上文所述的另一处理步骤，且更加特别地，分子蒸馏步骤，也可被设置在上游，特别是在任何的色谱分离步骤之前。

获得的产物

根据一个实施方式，所述第一PUFA为欧米伽-3脂肪酸。

根据不同的实施方式，所述第一PUFA可以是EPA，或DHA，或ARA，或DPA，或SDA。

根据一个实施方式，所述第一PUFA为EPA，所述第二脂肪酸为饱和或单不饱和脂肪酸，所述第三脂肪酸为DHA或SDA，以及所述第四脂肪酸为不同于所述第三脂肪酸的DHA或SDA。例如，所述第三脂肪酸为DHA而所述第四脂肪酸为SDA。

所述方法末尾处获得的最终产物(在用于收集第一纯化的PUFA的管道15中，或者如果不存在除去被氧化的化合物的步骤时在用于收集富集有第一PUFA的物流的第三管道12中，或者如果不存在第三色谱分离步骤或除去被氧化的化合物的步骤时在用于收集富集有第一PUFA的物流的第二管道9中，或者如果不存在第二色谱分离步骤或第三色谱分离步骤或除去被氧化的化合物的步骤时在用于收集富集有第一PUFA的物流的第一管道5中收集的)中第一PUFA的浓度可大于或等于约80％，优选大于或等于约90％，或大于或等于约95％，或大于或等于约97％，或大于或等于约98％，或大于或等于约99％(相对于全部的脂肪酸)。

此最终产物中第二脂肪酸的浓度可以是小于或等于约1％，或小于或等于约0.1％，或小于或等于约0.05％，或小于或等于约0.03％，或小于或等于约0.01％(相对于全部的脂肪酸)。

此最终产物中第三脂肪酸的浓度可以是小于或等于约1％，或小于或等于约0.1％，或小于或等于约0.05％，或小于或等于约0.03％，或小于或等于约0.01％(相对于全部的脂肪酸)。

此最终产物中第四脂肪酸的浓度可以是小于或等于约1％，或小于或等于约0.1％，或小于或等于约0.05％，或小于或等于约0.03％，或小于或等于约0.01％(相对于全部的脂肪酸)。

例如，所述方法末尾处获得的最终产物可包含大于或等于约80％，或大于或等于约95％，或大于或等于约97％，或大于或等于约98％，或大于或等于约99％的比例的EPA(相对于全部的脂肪酸)，以及小于或等于约1％，或小于或等于约0.1％，或小于或等于约0.05％，或小于或等于约0.03％，或小于或等于约0.01％的比例的DHA。

富集有第一PUFA的油在包装和/或使用(包括，例如，最终的制剂和/或封装)之前避空气避光储存。

根据一个实施方式，所述最终产物与药学上和/或膳食上可接受的载体和/或与赋形剂和/或稀释剂相结合。由此可以将该产物形成，例如，明胶胶囊剂、胶囊剂或片剂的形式(或以适于口服或局部或非消化道给药的任何其它形式)。

每个形式的单个剂量(例如胶囊剂或明胶胶囊剂)可包含，例如，250至1500mg，优选300至1000mg的上文的产物。

所述产物可由此被用于制备药物组合物，所述药物组合物用于防治和/或治疗和/或预防如高甘油三酯血症、高胆固醇血症和高血压的心血管疾病；以及如心律不齐、心房和/或心室颤动、心脏代偿失调和衰竭的心血管疾病的危险因素；用于梗塞和再梗塞的一级和二级防治；用于治疗可由前述PUFA治疗的其它任何病变，例如，自身免疫性疾病、溃疡性结肠炎、肿瘤病变、神经系统疾病、细胞老化、脑梗塞、缺血性疾病、银屑病。

或者，所述产物可被用于准药物用途，特别是膳食用途。

实施例

以下实施例非限制性地显示了本发明。

实施例1a-实验室规模的纯化步骤

在此实施例中，采用包含大于70％的EPA的乙基酯的混合物通过2个色谱步骤获得了大于94％的EPA的乙基酯。

所述EPA在C18反相二氧化硅(其中颗粒具有20μm的平均直径)上通过色谱步骤进行纯化。所述色谱条件如下：

-设置有轴向动态压缩色谱柱(长39cm，直径5cm)的CYCLOJET^TM。

-洗脱液：93/7v/v的甲醇/水。

收集包含约94％的EPA(CPG中的面积)和小于0.1％的DHA的馏分。此馏分中的EPA的回收率大于95％。单位生产率为2.76kg纯EPA/kg固定相/日。洗脱液的单位消耗量为224L/kg纯EPA。

在真空下运行的旋转蒸发仪中浓缩之后，浓缩馏分包含小于1％的残余溶剂。

实施例1b(对比)

在此实施例中，利用93/7v/v的甲醇/水洗脱液，在设置有5根色谱柱(长9cm，直径4.8cm)的VARICOL^TM系统中纯化前述实施例的包含大于70％的EPA的乙基酯的混合物。

所述提余液包含约92％的EPA(CPG中的面积)和小于0.1％的DHA。所述提余液中的EPA的回收率大于95％。单位生产率为2.46kg纯EPA/kg固定相/日。洗脱液的单位消耗量为258L/kg纯EPA。

所述CYCLOJET^TM的单位生产率因此比所述VARICOL^TM的单位生产率高12％，且其洗脱液的单位消耗量相对于所述VARICOL^TM少13％。令人意想不到地，对于此一步纯化来说，所述CYCLOJET^TM产生了比所述VARICOL^TM更好的效果。

实施例2a-实验室规模的利用CYCLOJET^TM的超纯化

在此实施例中，采用实施例1a中获得的产物通过色谱步骤获得了大于96％的EPA的乙基酯。

所述EPA在C18反相二氧化硅(其中颗粒具有20μm的平均直径)上进行纯化。所述色谱条件如下：

-设置有轴向动态压缩色谱柱(长39cm，直径5cm)的Cyclojet。

-洗脱液：79/21v/v的丙酮/水。

收集的馏分之一包含约96.8％的EPA(CPG中的面积)和小于0.1％的DHA。此提取物中的EPA的回收率为约95％。单位生产率为3.58kg纯EPA/kg固定相/日。洗脱液的单位消耗量为153L/kg纯EPA。

实施例2b(对比)

在此实施例中，利用79/21v/v的丙酮/水洗脱液，在设置有5根色谱柱(长9cm，直径4.8cm)的VARICOL^TM中纯化实施例1a中获得的浓缩提余液。

提取物包含约97％的EPA(CPG中的面积)和小于0.1％的DHA。所述提取物中的EPA的回收率为约95％。单位生产率为3.35kg纯EPA/kg固定相/日。

所述Cyclojet的单位生产率比所述VARICOL^TM的单位生产率高7％。令人意想不到地，对于第二步纯化来说，所述Cyclojet产生了比所述VARICOL^TM更好的生产率。

实施例3-中试规模的三步纯化

在此实施例中，采用包含大于50％的EPA的乙基酯的混合物通过三个色谱步骤获得了大于96％的EPA的乙基酯。

所述EPA在C18反相二氧化硅上通过三个色谱步骤进行纯化。所述色谱条件如下：

步骤1：

-设置有5根色谱柱(长9cm，直径59cm)的VARICOL^TM。色谱柱的配置：在区域1/2/3/4中分别为1/1.6/1.6/0.8。

-洗脱液：90/10v/v的丙酮/水。

提余液包含约70％的EPA(CPG中的面积)。在真空下运行的旋转蒸发仪中浓缩之后，浓缩提余液包含小于1％的残余溶剂。

步骤2：

-设置有轴向动态压缩色谱柱(长49cm，直径30cm)的Cyclojet。

-洗脱液：93/7v/v的甲醇/水。

收集的馏分包含约94％的EPA(CPG中的面积)和小于0.1％的DHA。此馏分中的EPA的回收率大于95％。

步骤3：

-设置有轴向动态压缩色谱柱(长49cm，直径30cm)的Cyclojet。

-洗脱液：79/21v/v的丙酮/水。

收集的馏分包含约96.8％的EPA(CPG中的面积)和小于0.1％的DHA。此馏分中的EPA的回收率大于95％。

Claims

1.一种利用初始混合物纯化第一多不饱和脂肪酸的方法，所述初始混合物还包含至少一种第二脂肪酸，其中，所述方法包括：

-第一液相色谱分离步骤，利用所述初始混合物，在第一色谱分离单元中进行，以在一方面回收富集有第一多不饱和脂肪酸的第一物流，并在另一方面回收富集有第二脂肪酸的物流，

所述第一色谱分离单元为稳态循环的具有单一色谱柱的固定床色谱分离单元。

2.一种利用初始混合物纯化第一多不饱和脂肪酸的方法，所述初始混合物还包含至少一种第二脂肪酸和第三脂肪酸，其中，所述方法包括：

-第一液相色谱分离步骤，利用所述初始混合物，在第一色谱分离单元中进行，以在一方面回收富集有第一多不饱和脂肪酸的第一物流，并在另一方面回收富集有第二脂肪酸的物流；

-第二液相色谱分离步骤，利用所述富集有第一多不饱和脂肪酸的第一物流，在第二色谱分离单元中进行，以在一方面回收富集有第一多不饱和脂肪酸的第二物流，并在另一方面回收富集有第三脂肪酸的物流，

所述第一色谱分离单元和所述第二色谱分离单元中的至少一个为稳态循环的具有单一色谱柱的固定床色谱分离单元。

3.一种利用初始混合物纯化第一多不饱和脂肪酸的方法，所述初始混合物还包含至少一种第二脂肪酸、第三脂肪酸和第四脂肪酸，其中，所述方法包括：

-第二液相色谱分离步骤，利用所述富集有第一多不饱和脂肪酸的第一物流，在第二色谱分离单元中进行，以在一方面回收富集有第一多不饱和脂肪酸的第二物流，并在另一方面回收富集有第三脂肪酸的物流；

-第三液相色谱分离步骤，利用所述富集有第一多不饱和脂肪酸的第二物流，在第三色谱分离单元中进行，以在一方面回收富集有第一多不饱和脂肪酸的第三物流，并在另一方面回收富集有第四脂肪酸的物流，

4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述第一色谱分离单元为稳态循环的具有单一色谱柱的固定床色谱分离单元；和/或所述第二色谱分离单元为稳态循环的具有单一色谱柱的固定床色谱分离单元；和/或所述第三色谱分离单元为稳态循环的具有单一色谱柱的固定床色谱分离单元。

5.根据权利要求3所述的方法，其中，所述第一色谱分离单元、所述第二色谱分离单元和所述第三色谱分离单元中的至少两个单元为稳态循环的具有单一色谱柱的固定床色谱分离单元。

6.根据权利要求3所述的方法，其中，所述第一色谱分离单元、所述第二色谱分离单元和所述第三色谱分离单元中的至少一个为具有若干个色谱柱的色谱分离单元。

7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述第一色谱分离单元为模拟移动床或真实移动床系统，或者为以非同步的方式定期更改物流的进样点和收集点的系统。

8.根据权利要求1所述的方法，其中：

-所述第一液相色谱分离步骤使用第一洗脱液进行，所述第一洗脱液为水-有机洗脱液。

9.根据权利要求2所述的方法，其中：

-所述第一液相色谱分离步骤使用第一洗脱液进行，所述第一洗脱液为水-有机洗脱液；以及/或者

-所述第二液相色谱分离步骤使用第二洗脱液进行，所述第二洗脱液为水-有机洗脱液。

10.根据权利要求3所述的方法，其中：

-所述第二液相色谱分离步骤使用第二洗脱液进行，所述第二洗脱液为水-有机洗脱液；以及/或者

-所述第三液相色谱分离步骤使用第三洗脱液进行，所述第三洗脱液为水-有机洗脱液。

11.根据权利要求10所述的方法，其中：

-所述第一洗脱液为酮/水混合物；以及/或者

-所述第二洗脱液为醇/水混合物以及/或者

-所述第三洗脱液为酮/水混合物；

-所述第一洗脱液不同于所述第二洗脱液，以及所述第三洗脱液不同于所述第一洗脱液且不同于所述第二洗脱液。

12.根据权利要求1所述的方法，其中：

-将第一洗脱液的有机溶剂的质量浓度控制为在2％以内。

13.根据权利要求2所述的方法，其中：

-将第一洗脱液的有机溶剂的质量浓度控制为在2％以内；以及/或者

-将第二洗脱液的有机溶剂的质量浓度控制为在2％以内。

14.根据权利要求3所述的方法，其中：

-将第一洗脱液的有机溶剂的质量浓度控制为在2％以内；

-将第二洗脱液的有机溶剂的质量浓度控制为在2％以内；以及/或者

-将第三洗脱液的有机溶剂的质量浓度控制为在2％以内。

15.根据权利要求1所述的方法，其中：

-所述第一多不饱和脂肪酸为二十碳五烯酸；或者

-所述第一多不饱和脂肪酸为二十二碳六烯酸；或者

-所述第一多不饱和脂肪酸为花生四烯酸；或者

-所述第一多不饱和脂肪酸为二十二碳五烯酸。

16.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，包括：

-至少一个在所述第一多不饱和脂肪酸与比所述第一多不饱和脂肪酸保留更久的一种或多种化合物之间的色谱分离步骤；以及/或者

-至少一个在所述第一多不饱和脂肪酸与比所述第一多不饱和脂肪酸保留更短的一种或多种化合物之间的色谱分离步骤。

17.根据权利要求3所述的方法，其中，所述第一色谱分离单元、所述第二色谱分离单元和所述第三色谱分离单元中的至少一个包括具有大于或等于5cm的长度；和/或具有大于或等于10cm的直径的分离色谱柱。

18.根据权利要求1所述的方法，其中：

-供料至所述第一色谱分离单元的初始混合物包含小于80％的有机溶剂。

19.根据权利要求2所述的方法，其中：

-供料至所述第一色谱分离单元的初始混合物包含小于80％的有机溶剂；以及/或者

-供料至所述第二色谱分离单元的富集有第一多不饱和脂肪酸的第一物流包含小于80％的有机溶剂。

20.根据权利要求3所述的方法，其中：

-供料至所述第二色谱分离单元的富集有第一多不饱和脂肪酸的第一物流包含小于80％的有机溶剂；以及/或者

-供料至所述第三色谱分离单元的富集有第一多不饱和脂肪酸的第二物流包含小于80％的有机溶剂。

21.一种利用初始混合物纯化第一多不饱和脂肪酸的设备，其中，所述设备包括：

-第一液相色谱分离单元(3)，其通过初始混合物的供料管道(1)供料，以及在出口处一方面连接富集有第一多不饱和脂肪酸的物流的第一管道(5)，且另一方面连接富集有第二脂肪酸的物流的管道(4)；

其中，所述第一液相色谱分离单元(3)为稳态循环的具有单一色谱柱的固定床色谱分离单元。

22.一种利用初始混合物纯化第一多不饱和脂肪酸的设备，其中，所述设备包括：

-第二液相色谱分离单元(6)，其通过富集有第一多不饱和脂肪酸的物流的第一管道(5)供料，以及在出口处一方面连接富集有第一多不饱和脂肪酸的物流的第二管道(9)，且另一方面连接富集有第三脂肪酸的物流的管道(8)；

其中，所述第一液相色谱分离单元(3)和所述第二液相色谱分离单元(6)中的至少一个为稳态循环的具有单一色谱柱的固定床色谱分离单元。

23.一种利用初始混合物纯化第一多不饱和脂肪酸的设备，其中，所述设备包括：

-第三液相色谱分离单元(10)，其通过富集有第一多不饱和脂肪酸的物流的第二管道(9)供料，以及在出口处一方面连接富集有第一多不饱和脂肪酸的物流的第三管道(12)，且另一方面连接富集有第四脂肪酸的物流的管道(13)；

其中，所述第一液相色谱分离单元(3)、所述第二液相色谱分离单元(6)和所述第三液相色谱分离单元(10)中的至少一个为稳态循环的具有单一色谱柱的固定床色谱分离单元。

24.根据权利要求23所述的设备，其中，所述第一液相色谱分离单元(3)为稳态循环的具有单一色谱柱的固定床色谱分离单元；和/或所述第二液相色谱分离单元(6)为稳态循环的具有单一色谱柱的固定床色谱分离单元；和/或所述第三液相色谱分离单元(10)为稳态循环的具有单一色谱柱的固定床色谱分离单元。

25.根据权利要求23所述的设备，其中，所述第一液相色谱分离单元(3)、所述第二液相色谱分离单元(6)和所述第三液相色谱分离单元(10)中的至少一个为具有若干个色谱柱的色谱分离单元。

26.根据权利要求25所述的设备，其中，所述第一液相色谱分离单元(3)、所述第二液相色谱分离单元(6)和所述第三液相色谱分离单元(10)中的至少一个为模拟移动床或真实移动床系统，或者为以非同步的方式定期更改物流的进样点和收集点的系统。

27.根据权利要求23所述的设备，其中，所述第一液相色谱分离单元(3)、所述第二液相色谱分离单元(6)和所述第三液相色谱分离单元(10)中的至少一个包括具有大于或等于5cm的长度；和/或具有大于或等于10cm的直径的分离色谱柱。