CN106631766A - Omega‑3脂肪酸工业化制备色谱分离纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种Omega‑3脂肪酸工业化制备色谱分离纯化方法，包括制备分离专用填料和采用所述专用填料对Omega‑3脂肪酸中的二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸进行色谱分离纯化。本发明直接采用粗提取后的鱼油粗品来制备DHA和EPA比例可控的高纯度鱼油，无需大量复杂繁琐的前处理过程，所用溶剂廉价、安全，分离纯化过程一步完成，且可在线实时监测，大大提高了安全性，节约了原料和时间成本，适用于大规模工业化生产。气相色谱最终测定显示，鱼油纯度(DHA+EPA)大于99.9％，总杂小于0.1％，DHA:EPA比例范围在0.01～99.99范围内可调。
Description
技术领域
本发明涉及一种Omega-3脂肪酸工业化制备色谱分离纯化方法。
背景技术
随着人们对深海鱼油的广泛重视，二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)对人体的医疗保健作用也越来越备受关注。富含EPA和DHA等Omega-3脂肪酸的深海鱼油具有降低血脂和胆固醇，预防关节炎和缓解痛风，预防老年痴呆，促进大脑神经和视网膜发育等重要生理功能。鱼油除了提供动物必需的n-3长链多聚不饱和脂肪酸外，还作为脂溶性维生素A、D和类胡萝卜素等的载体促进维生素以脂溶性的物质吸收利用，动物缺乏必需脂肪酸将引起生长停滞、繁殖机能下降、皮下水肿出血、体色暗淡等疾病。
目前主流的鱼油提纯方法主要为单次或多次分子蒸馏法，该方法每天的鱼油产量可达吨级及以上，但该方法分离得到的鱼油纯度一般比较低，且纯化步骤较为繁琐；当前，一种较好的分离纯化得到高纯度鱼油的方法为液相色谱法，该方法可实时监测鱼油纯化进度，较好地控制收集高纯度鱼油的时间段。
上述方法提取的鱼油虽纯度较高，但EPA和DHA的比例难以控制。而不同领域要求的EPA和DHA比例是有较大差异的，如婴儿及孕妇食品和保健品中一般是要求只含DHA而不含EPA；而对于心脑血管疾病患者而言，他们食用的保健品鱼油中DHA和EPA含量则一般为2:3。鉴于此，有必要开发一种鱼油纯化专用填料，通过控制优化键合相的组成来调控纯化得到的鱼油中的DHA和EPA含量，以适应不同人群的营养摄入要求。
发明内容
本发明的目的是解决目前鱼油提纯过程中EPA和DHA的比例难以控制的技术问题。
为实现以上发明目的，本发明提供一种Omega-3脂肪酸工业化制备色谱分离纯化方法，包括如下步骤：
S10：制备分离专用填料，包括以下工序；
S101硅胶粒子的稀酸活化，
将未键合的硅胶粒子在浓度为0.01-0.1wt％的氢氟酸中回流20小时，使所述硅胶粒子的浓度保持在0.1g/ml；
S102复合烷基相键合，
将活化干燥后的所述硅胶粒子以分析纯级的无水甲苯为溶剂，在分析纯级的有机胺的存在下，依次分别加入气相色谱分析纯度>95％的正十八烷基二甲基氯硅烷、气相色谱分析纯度>95％的正辛基二甲基氯硅烷和气相色谱分析纯度>95％的正丁基二甲基氯硅烷进行键合得到所述专用填料；
所述硅胶粒子、正十八烷基二甲基氯硅烷、正辛基二甲基氯硅烷和正丁基二甲基氯硅烷的加入量遵循以下比例：
当所述硅胶粒子表面羟基密度理论值为10umol/m2时，按投量比0.001-0.005mol/g进行投料，所述投量比＝三种键合相的总摩尔数/裸硅胶粒子克数；
所述正十八烷基二甲基氯硅烷、正辛基二甲基氯硅烷和正丁基二甲基氯硅烷三种键合相按序依次加入，加入时间间隔为10-20min分钟，保证前一种键合相反应完全后再加入下一种；
所述有机胺包括但不限于三甲胺、三乙胺、苯胺、咪唑和吡啶及其衍生物；
S20：采用所述专用填料进行色谱分离纯化，如下；
将键合得到的所述专用填料直接装填到动态轴向压缩柱制备色谱系统中用于对Omega-3脂肪酸中的二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸进行色谱分离纯化；
所述动态轴向压缩柱制备色谱系统的柱尺寸为所述专用填料的粒径为10μm，所述专用填料中三种键合相的投料比例为正十八烷基二甲基氯硅烷：正辛基二甲基氯硅烷：正丁基二甲基氯硅烷＝1:3:6，流动相为乙醇和水，10：90-20：80，流速为90ml/min，洗脱时间60min；
或所述动态轴向压缩柱制备色谱系统的柱尺寸为所述专用填料的粒径为20μm，所述专用填料中三种键合相的投料比例为正十八烷基二甲基氯硅烷：正辛基二甲基氯硅烷：正丁基二甲基氯硅烷＝1.5:2:6.5，流动相为乙醇与水，梯度范围为20：80-30：70，流速为100ml/min，洗脱时间55min；
或所述动态轴向压缩柱制备色谱系统的柱尺寸为所述专用填料的粒径为30μm，所述专用填料中三种键合相的投料比例为正十八烷基二甲基氯硅烷：正辛基二甲基氯硅烷：正丁基二甲基氯硅烷＝2:3:5，流动相为乙醇与水，梯度范围为25：75～30：70，流速为100ml/min，洗脱时间60min。
进一步地，所述步骤S10中工序S102之后还包括：
对甲基或乙基进行封尾，
将键合后的所述硅胶粒子以分析纯级的无水甲苯为溶剂，在分析纯级的有机胺的存在下与气相色谱分析纯度>95％的三氯硅甲烷或气相色谱分析纯度>95％的三氯硅乙烷反应，得到纯化的所述专用填料；
所述三氯硅甲烷或三氯硅乙烷的加入量根据硅胶粒子表面羟基摩尔总数的两倍确定(理论羟基密度10umol/m2)，以便完全封尾。
进一步地，步骤S102中所述投量比为0.003mol/g，如，1g裸硅胶粒子，投入所述正十八烷基二甲基氯硅烷、正辛基二甲基氯硅烷和正丁基二甲基氯硅烷的总摩尔数为0.003mol。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明直接采用粗提取后的鱼油粗品来制备DHA和EPA比例可控的高纯度鱼油，无需大量复杂繁琐的前处理过程，所用溶剂廉价、安全，分离纯化过程一步完成，且可在线实时监测，大大提高了安全性，节约了原料和时间成本，适用于大规模工业化生产。气相色谱最终测定显示，鱼油纯度(DHA+EPA)大于99.9％，总杂小于0.1％，DHA:EPA比例范围在0.01～99.99范围内可调。
附图说明
图1是EPA和DHA标准品的气相色谱内标对照图谱。
图2-1是原始鱼油粗品的高效液相色谱测定图谱；图2-2是原始鱼油粗品的气相色谱测定图谱。
图3-1是用填充了10μm DHA和EPA的色谱分离纯化专用填料(C18：C8：C4＝1:3:6)的动态轴向压缩柱分离纯化鱼油的高效液相色谱测定图谱，进样400mg；
图3-2为提纯产物气相色谱检测图谱，显示EPA/DHA＝147.41。
图4-1是用填充了10μm DHA和EPA的色谱分离纯化专用填料(C18：C8：C4＝1.5:2:6.5)的动态轴向压缩柱分离纯化鱼油的高效液相色谱测定图谱，进样1g；
图4-2为提纯产物气相色谱检测图谱，显示EPA/DHA＝0.006。
图5-1是用填充了10μm DHA和EPA的色谱分离纯化专用填料(C18：C8：C4＝2:3:5)的动态轴向压缩柱分离纯化鱼油的高效液相色谱测定图谱，进样3g；
图5-2为提纯产物气相色谱检测图谱，显示EPA/DHA＝8.00。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
如各图所示，本发明的Omega-3脂肪酸工业化制备色谱分离纯化方法具体可参考如下实施例进行：
实施例1
取400mg鱼油粗品配置成溶液，过滤除去不溶物；
将鱼油溶液泵入动态轴向压缩柱制备色谱系统，柱尺寸为Φ50×250mm，填料粒径为10μm，正十八烷基二甲基氯硅烷(C18)，正辛基二甲基氯硅烷(C8)，正丁基二甲基氯硅烷(C4)的投料比例(或称键合比例)为1:3:6，硅胶粒子上样量为400mg，流动相为乙醇与水，梯度范围为10：90～20：80，流速为90ml/min，洗脱时间60min。采用的紫外光度检测器的检测波长为254nm，收集保留时间在30～35min的馏出液。如图3-2所示，经气相色谱分析鱼油EPA：DHA＝147.41。
实施例2
取1g鱼油粗品配置成溶液，过滤除去不溶物；
将鱼油溶液泵入动态轴向压缩柱制备色谱系统，柱尺寸为Φ50×250mm，填料粒径为20μm，C18，C8，C4的投料比例(或称键合比例)为1.5:2:6.5，硅胶粒子上样量为1g，流动相为乙醇与水，梯度范围为20：80～30：70，流速为100ml/min，洗脱时间55min。采用的紫外光度检测器的检测波长为254nm，收集保留时间在25～30min的馏出液。如图4-2所示，经气相色谱分析鱼油EPA：DHA＝0.006。
实施例3
取3g鱼油粗品配置成浓度溶液，过滤除去不溶物；
将鱼油溶液泵入动态轴向压缩柱制备色谱系统，柱尺寸为Φ50×250mm，填料粒径为30μm，C18，C8，C4的投料比例(或称键合比例)为2:3:5，硅胶粒子上样量为3g，流动相为乙醇与水，梯度范围为25：75～30：70，流速为100ml/min，洗脱时间60min。采用的紫外光度检测器的检测波长为254nm，收集保留时间在25～30min的馏出液。如图5-2所示，气相色谱分析鱼油EPA：DHA＝8.00。
以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。
Claims (3)
1.Omega-3脂肪酸工业化制备色谱分离纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：
S10：制备分离专用填料，包括以下工序；
S101硅胶粒子的稀酸活化，
将未键合的硅胶粒子在浓度为0.01-0.1wt％的氢氟酸中回流20小时，使所述硅胶粒子的浓度保持在0.1g/ml；
S102复合烷基相键合，
将活化干燥后的所述硅胶粒子以分析纯级的无水甲苯为溶剂，在分析纯级的有机胺的存在下，依次分别加入气相色谱分析纯度>95％的正十八烷基二甲基氯硅烷、气相色谱分析纯度>95％的正辛基二甲基氯硅烷和气相色谱分析纯度>95％的正丁基二甲基氯硅烷三种键合相进行键合得到所述专用填料；
所述硅胶粒子、正十八烷基二甲基氯硅烷、正辛基二甲基氯硅烷和正丁基二甲基氯硅烷的加入量遵循以下比例：
当所述硅胶粒子表面羟基密度理论值为10umol/m2时，按投量比0.001-0.005mol/g进行投料，所述投量比＝三种键合相的总摩尔数/裸硅胶粒子克数；
所述正十八烷基二甲基氯硅烷、正辛基二甲基氯硅烷和正丁基二甲基氯硅烷三种键合相按序依次加入，加入时间间隔为10-20min分钟，保证前一种键合相反应完全后再加入下一种；
所述有机胺包括但不限于三甲胺、三乙胺、苯胺、咪唑和吡啶及其衍生物；
S20：采用所述专用填料进行色谱分离纯化，如下；
将键合得到的所述专用填料直接装填到动态轴向压缩柱制备色谱系统中用于对Omega-3脂肪酸中的二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸进行色谱分离纯化；
所述动态轴向压缩柱制备色谱系统的柱尺寸为所述专用填料的粒径为10μm，所述专用填料中三种键合相的投料比例为正十八烷基二甲基氯硅烷：正辛基二甲基氯硅烷：正丁基二甲基氯硅烷＝1:3:6，流动相为乙醇和水，10∶90-20∶80，流速为90ml/min，洗脱时间60min；
或所述动态轴向压缩柱制备色谱系统的柱尺寸为所述专用填料的粒径为20μm，所述专用填料中三种键合相的投料比例为正十八烷基二甲基氯硅烷：正辛基二甲基氯硅烷：正丁基二甲基氯硅烷＝1.5:2:6.5，流动相为乙醇与水，梯度范围为20：80-30：70，流速为100ml/min，洗脱时间55min；
或所述动态轴向压缩柱制备色谱系统的柱尺寸为所述专用填料的粒径为30μm，所述专用填料中三种键合相的投料比例为正十八烷基二甲基氯硅烷：正辛基二甲基氯硅烷：正丁基二甲基氯硅烷＝2:3:5，流动相为乙醇与水，梯度范围为25：75～30：70，流速为100ml/min，洗脱时间60min。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S10中工序S102之后还包括：
对甲基或乙基进行封尾，
将键合后的所述硅胶粒子以分析纯级的无水甲苯为溶剂，在分析纯级的有机胺的存在下与气相色谱分析纯度>95％的三氯硅甲烷或气相色谱分析纯度>95％的三氯硅乙烷反应，得到纯化的所述专用填料；
所述三氯硅甲烷或三氯硅乙烷的加入量根据硅胶粒子表面羟基摩尔总数的两倍确定(理论羟基密度10umol/m2)，以便完全封尾。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤S102中所述投量比为0.003mol/g。
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