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KR101865624B1 - 파면 제어기를 이용한 초고속 3차원 굴절률 영상 촬영 및 형광 구조화 조도 현미경 시스템 및 이를 이용한 방법 - Google Patents

파면 제어기를 이용한 초고속 3차원 굴절률 영상 촬영 및 형광 구조화 조도 현미경 시스템 및 이를 이용한 방법 Download PDF

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KR101865624B1
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fluorescence
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박용근
신승우
박광식
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주식회사 토모큐브
한국과학기술원
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Abstract

파면 제어기를 이용한 초고속 3차원 굴절률 영상 촬영 및 형광 구조화 조도 현미경 시스템 및 이를 이용한 방법이 제시된다. 파면 제어기를 이용한 초고속 3차원 굴절률 영상 촬영 및 형광 구조화 조도 현미경 시스템을 이용한 방법은, 파면 제어기(Wavefront Shaper)를 이용하여 샘플에 입사되는 평면파의 조사 각도를 조절하는 단계; 상기 평면파의 조사 각도에 따른 상기 샘플을 통과한 2차원 광학장을 측정하는 단계; 및 측정된 상기 2차원 광학장의 정보를 광회절 단층 촬영법(optical diffraction tomography) 또는 여과된 역투사 알고리즘(filtered back projection algorithm)을 이용하여 3차원 굴절률 영상을 획득하는 단계를 포함할 수 있다.

Description

파면 제어기를 이용한 초고속 3차원 굴절률 영상 촬영 및 형광 구조화 조도 현미경 시스템 및 이를 이용한 방법{3D Refractive Index Tomogram and Structured Illumination Microscopy System using Wavefront Shaper and Method thereof}
아래의 실시예들은 파면 제어기를 이용한 초고속 3차원 굴절률 영상 촬영 및 형광 구조화 조도 현미경 시스템 및 이를 이용한 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 단일 파면 제어기를 이용하여 세포의 3차원 고해상도 형광 이미지와 3차원 굴절률 입체 영상을 동시에 측정할 수 있는 기술에 관한 것이다.
현재 세포 내부의 구조를 광학적으로 측정하기 위하여 사용하는 방법은 형광 단백질을 세포 내부의 특정 구조에 발현시켜 형광 신호를 측정하는 형광 이미지 방법과 세포 내부의 3차원 굴절률 분포를 측정하는 3차원 굴절률 단층 촬영법이 있다.
형광 단백질의 표지 없이, 입사된 파면에 대한 세포의 반응을 측정하여 세포 내부의 3차원 굴절률 분포를 측정하는 3차원 굴절률 단층 촬영법이 사용되고 있다. 측정된 굴절률 값은 세포 내 주요 구성 성분인 단백질의 농도와 선형적으로 비례하기 때문에, 측정된 세포 내부의 3차원 굴절률 분포로부터 세포 내의 구조적인 특성뿐만 아니라 단백질 농도의 분포와 같은 생화학적인 특성도 얻을 수 있다. 또한 형광 단백질의 표지를 사용하지 않기 때문에, 비침습적으로 살아있는 세포에 적용 가능하며 광퇴색(photobleaching)이 일어나지 않기 때문에 오랜 시간 동안 세포의 반응을 측정할 수 있게 되었다.
이러한 세포의 3차원 굴절률 이미지를 측정하기 위해서 여러 가지 종류의 파면 제어기를 이용한 3차원 굴절률 단층이 제시되었다[비특허문헌 1]. 결맞음 광원(coherent light source)에서 나온 빛을 세포에 입사시키고, 이렇게 세포에서 회절된 투과광을 간섭계를 이용하여 홀로그램을 측정한다.
이때 파면 제어기를 사용하여 세포에 입사되는 각도를 회전시키면서 여러 장의 2차원 홀로그램을 측정하고 측정된 홀로그램 정보를 알고리즘을 통해 분석하면 세포의 3차원 굴절률 분포를 측정할 수 있다.
최근에는 파면 제어기 중 하나인 디지털 마이크로미러 소자(Digital Micromirror Device)를 이용하여 초고속 3차원 광 단층 촬영이 가능하게 되었다[비특허문헌 2].
하지만 광회절 단층 촬영법은 세포 내부의 단백질 분포를 얻을 수 있지만 분자 특이적인 측정이 아니기 때문에 특정 단백질을 구별하는 것이 어렵다는 한계를 갖고 있다.
그리고, 세포의 형광 이미지를 위해서는 세포의 특정 기관(분자)에 형광 단백질이나 염료를 발현시키거나 붙인다. 이렇게 발현된 형광 물질에 여기 광원(excitation light source)이 입사하면 형광 단백질은 이를 흡수한 뒤 다른 파장으로 형광 신호를 방출한다. 이 형광 신호를 통해 세포 내부 특정 구조의 이미지를 구별하여 측정한다.
최근에는 이러한 형광 이미지의 해상도(resolution)를 증가시키는 방법으로 구조화 조도 현미경 기술을 사용하기 시작하였다. 구조화 조도 현미경 기술은 여기 광원을 특정 패턴으로 입사시켜, 광학적으로 측정 가능한 범위 밖의 신호를 측정하여 회절 한계치를 능가하는 초고해상도의 이미지를 얻을 수 있는 방법이다.
처음 구조화 조도 현미경 기술은 회절 격자를 통과시킴으로써 패턴을 만들어 이미지를 얻었다[비특허문헌 3]. 구조화 조도 현미경 기술은 격자 무늬를 회전 및 평행이동을 하여 다양한 패턴에서 이미지를 측정하고 이러한 저해상도 이미지에서 알고리즘을 통하여 고해상도의 이미지를 구한다. 그 후로는 파면 제어기를 통하여 패턴 모양 제어로 더욱 손쉽게 고해상도의 이미지를 얻을 수 있게 되었다.
또한, 최근에 비선형 구조화 조도 현미경 기술(nonlinear structured illumination microscopy)을 통하여 해상도를 더욱더 좋게 만들 수 있게 되었다[비특허문헌 4]. 하지만 형광 이미지의 경우 형광 단백질을 발현시키기 위해 세포를 염색하는 과정이 침습적이며, 오랜 시간 동안 형광 이미지를 측정하면 광퇴색이 일어나 측정이 더 이상 되지 않을 수 있다는 단점이 있다.
Wolf, E. (1969). "Three-dimensional structure determination of semi-transparent objects from holographic data." Optics Communications 1(4): 153-156. Shin, S., et al. (2015). "Active illumination using a digital micromirror device for quantitative phase imaging." Optics letters 40(22): 5407-5410. Gustafsson, M. G. (2000). "Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy." Journal of microscopy 198(2): 82-87. Gustafsson, M. G. (2005). "Nonlinear structured-illumination microscopy: wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution." Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 102(37): 13081-13086. Lee, W.-H. (1979). "Binary computer-generated holograms." Applied Optics 18(21): 3661-3669.
실시예들은 파면 제어기를 이용한 초고속 3차원 굴절률 영상 촬영 및 형광 구조화 조도 현미경 시스템 및 이를 이용한 방법에 관하여 기술하며, 보다 구체적으로 단일 파면 제어기를 이용하여 세포의 3차원 고해상도 형광 이미지와 3차원 굴절률 입체 영상을 동시에 측정할 수 있는 기술을 제공한다.
실시예들은 살아있는 세포와 조직 내부의 3차원 굴절률 분포를 광학적으로 측정하고, 형광 단백질에 의해 표지된 특정 내부 구조를 동시에 구별할 수 있는 파면 제어기를 이용한 초고속 3차원 굴절률 영상 촬영 및 형광 구조화 조도 현미경 시스템 및 이를 이용한 방법을 제공하는데 있다.
일 실시예에 따른 파면 제어기를 이용한 초고속 3차원 굴절률 영상 촬영 및 형광 구조화 조도 현미경 시스템을 이용한 방법은, 파면 제어기(Wavefront Shaper)를 이용하여 샘플에 입사되는 평면파의 조사 각도를 조절하는 단계; 상기 평면파의 조사 각도에 따른 상기 샘플을 통과한 2차원 광학장을 측정하는 단계; 및 측정된 상기 2차원 광학장의 정보를 광회절 단층 촬영법(optical diffraction tomography) 또는 여과된 역투사 알고리즘(filtered back projection algorithm)을 이용하여 3차원 굴절률 영상을 획득하는 단계를 포함한다.
상기 평면파의 파면의 위상 및 패턴을 제어하여 3차원 고해상도 형광 이미지를 획득하는 단계를 더 포함하고, 상기 파면 제어기를 이용하여 상기 샘플의 상기 3차원 고해상도 형광 이미지와 상기 3차원 굴절률 입체 영상을 동시에 측정할 수 있다.
상기 파면 제어기를 이용하여 샘플에 입사되는 평면파의 조사 각도를 조절하는 단계는, 상기 샘플에 입사되는 상기 평면파의 진행 각도를 제어하기 위해서, 디지털 마이크로미러 소자에 표출(display)하는 패턴을 변경하여 다양한 진행 각도의 평면파를 형성할 수 있다.
상기 파면 제어기를 이용하여 샘플에 입사되는 평면파의 조사 각도를 조절하는 단계는, 상기 평면파의 조사 각도를 조절하여 회절광을 상기 샘플에 입사시키고 나머지를 차폐하여 하나의 평면파의 진행 방향을 제어하는 단계; 및 디지털 마이크로미러 소자의 패턴을 조절하여 원하는 위상 정보를 획득하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 평면파의 조사 각도를 조절하여 회절광을 상기 샘플에 입사시키고 나머지를 차폐하여 하나의 평면파의 진행 방향을 제어하는 단계는, 공간 필터(spatial filter)를 이용하여 상기 디지털 마이크로미러 소자에 의한 회절광 중 특정 회절광 하나만 사용할 수 있다.
상기 평면파의 조사 각도에 따른 상기 샘플을 통과한 2차원 광학장을 측정하는 단계는, 상기 샘플을 통과한 상기 2차원 광학장과 참조파(reference beam)의 간섭계를 만들고, 상기 평면파의 조사 각도를 다양하게 변경하여 상기 2차원 광학장을 측정할 수 있다.
상기 평면파의 파면의 위상 및 패턴을 제어하여 3차원 고해상도 형광 이미지를 획득하는 단계는, 상기 평면파를 특정 패턴으로 입사시키고 패턴을 구성하는 상기 평면파 간의 위상을 조절하는 단계; 상기 위상을 조절하여 제어된 패턴들에 의하여 형광 이미지를 획득하는 단계; 및 복수의 상기 형광 이미지들을 알고리즘을 통해 고해상도의 2차원 형광 이미지를 재건하여 3차원 고해상도 형광 이미지를 획득하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 평면파의 파면의 위상 및 패턴을 제어하여 3차원 고해상도 형광 이미지를 획득하는 단계는, 디지털 마이크로미러 소자의 패턴을 통하여 각도와 위상이 조절 가능 광학장 구별을 위한 N개의 패턴과 방위각 스캐닝(azimuthal angle scanning)을 위한 M개의 패턴으로 N*M개의 패턴을 형성할 수 있다.
상기 평면파를 발생시키는 광원을 저간섭성 빛을 사용하여 z축으로 특정 부분만 구별하여 측정할 수 있다.
상기 평면파의 파면의 위상 및 패턴을 제어하여 3차원 고해상도 형광 이미지를 획득하는 단계는, 스테이지나 집광 렌즈(condenser lens)를 z축으로 이동시켜 상기 샘플의 z축의 각 부분을 측정하여 상기 3차원 고해상도 형광 이미지를 획득할 수 있다.
다른 실시예에 따른 파면 제어기를 이용한 초고속 3차원 굴절률 영상 촬영 및 형광 구조화 조도 현미경 시스템은, 파면 제어기(Wavefront Shaper)를 이용하여 샘플에 입사되는 평면파의 조사 각도를 조절하는 변조부; 상기 평면파의 조사 각도에 따른 상기 샘플을 통과한 2차원 광학장을 측정하는 간섭계; 및 측정된 상기 2차원 광학장의 정보를 광회절 단층 촬영법(optical diffraction tomography) 또는 여과된 역투사 알고리즘(filtered back projection algorithm)을 이용하여 3차원 굴절률 영상을 획득하는 굴절률 영상부를 포함한다.
상기 평면파의 파면의 위상 및 패턴을 제어하여 3차원 고해상도 형광 이미지를 획득하는 형광 이미지부를 더 포함하고, 상기 파면 제어기를 이용하여 상기 샘플의 상기 3차원 고해상도 형광 이미지와 상기 3차원 굴절률 입체 영상을 동시에 측정할 수 있다.
상기 변조부는, 상기 평면파의 조사 각도를 조절하여 회절광을 상기 샘플에 입사시키고 나머지를 차폐하여 하나의 평면파의 진행 방향을 제어하고, 디지털 마이크로미러 소자의 패턴을 조절하여 원하는 위상 정보를 획득할 수 있다.
상기 변조부는, 공간 필터(spatial filter)를 이용하여 상기 디지털 마이크로미러 소자에 의한 회절광 중 특정 회절광 하나만 사용할 수 있다.
상기 간섭계는, 상기 샘플을 통과한 상기 2차원 광학장과 참조파(reference beam)의 간섭계를 만들고, 상기 평면파의 조사 각도를 다양하게 변경하여 상기 2차원 광학장을 측정할 수 있다.
상기 형광 이미지부는, 상기 평면파를 특정 패턴으로 입사시키고 패턴을 구성하는 상기 평면파 간의 위상을 조절하여 제어된 패턴들에 의하여 형광 이미지를 획득하고, 복수의 상기 형광 이미지들을 알고리즘을 통해 고해상도의 2차원 형광 이미지를 재건하여 3차원 고해상도 형광 이미지를 획득할 수 있다.
실시예들에 따르면 단일 파면 제어기를 이용하여 세포의 3차원 고해상도 형광 이미지와 3차원 굴절률 입체 영상을 동시에 측정할 수 있는 파면 제어기를 이용한 초고속 3차원 굴절률 영상 촬영 및 형광 구조화 조도 현미경 시스템 및 이를 이용한 방법을 제공할 수 있다.
실시예들에 따르면 살아있는 세포와 조직 내부의 3차원 굴절률 분포를 광학적으로 측정하고, 형광 단백질에 의해 표지된 특정 내부 구조를 동시에 구별할 수 있는 파면 제어기를 이용한 초고속 3차원 굴절률 영상 촬영 및 형광 구조화 조도 현미경 시스템 및 이를 이용한 방법을 제공할 수 있다.
도 1은 일 실시예에 따른 파면 제어기를 이용한 초고속 3차원 굴절률 영상 촬영 및 형광 구조화 조도 현미경 시스템을 설명하기 위한 도면이다.
도 2는 일 실시예에 따른 평면파의 상대적인 위상 차이를 설명하기 위한 도면이다.
도 3은 일 실시예에 따른 공간주파수 조절을 설명하기 위한 도면이다.
도 4는 일 실시예에 따른 3차원 초고해상도 형광 이미지 획득 방법을 설명하기 위한 도면이다.
도 5는 일 실시예에 따른 파면 제어기를 이용한 초고속 3차원 굴절률 영상 촬영 및 형광 구조화 조도 현미경 시스템을 나타내는 블록도이다.
도 6은 일 실시예에 따른 파면 제어기를 이용한 초고속 3차원 굴절률 영상 촬영 및 형광 구조화 조도 현미경 시스템을 이용한 방법을 나타내는 흐름도이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 실시예들을 설명한다. 그러나, 기술되는 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명되는 실시예들에 의하여 한정되는 것은 아니다. 또한, 여러 실시예들은 당해 기술분야에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 더욱 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다. 도면에서 요소들의 형상 및 크기 등은 보다 명확한 설명을 위해 과장될 수 있다.
살아있는 세포 내부의 구조를 3차원적으로 파악하고 실시간으로 구조의 변화를 측정하는 것은 생물학적, 병리학적 연구에 크게 기여할 수 있는 기술이다.
아래의 실시예들은 파면 제어기(Wavefront Shaper)를 활용하여 3차원 굴절률 단층 촬영 기술(3D refractive index tomogram)과 3차원 구조화 조도 현미경 기술(structured illumination microscopy)을 모두 구현하는 시스템 및 방법을 제시한다.
실시예들은 단일 파면 제어기를 이용하여 세포의 3차원 고해상도 형광 이미지와 3차원 굴절률 입체 영상을 동시에 측정할 수 있는 기술을 제공하는 것으로, 더 구체적으로 살아있는 세포와 조직 내부의 3차원 굴절률 분포를 광학적으로 측정하고, 형광 단백질에 의해 표지된 특정 내부 구조를 동시에 구별할 수 있는 파면 제어기를 이용한 초고속 3차원 굴절률 영상 촬영 및 형광 구조화 조도 현미경 시스템 및 이를 이용한 방법을 제공할 수 있다.
도 1은 일 실시예에 따른 파면 제어기를 이용한 초고속 3차원 굴절률 영상 촬영 및 형광 구조화 조도 현미경 시스템을 설명하기 위한 도면이다.
도 1을 참조하면, 파면 제어기(Wavefront Shaper)를 활용하여 3차원 고해상도 형광 이미지와 3차원 굴절률 분포를 조사파면제어 방법을 통해 측정하는 하나의 시스템을 나타낼 수 있다.
3차원 굴절률 단층 촬영법에서 굴절률 분포를 얻기 위해서는 임의의 다양한 각도의 평면파에 의한 샘플 이미지가 필요하다. 그리고 구조화 조도 현미경 기술을 위해서는 입사 파면의 위상 및 패턴을 제어할 수 있어야 한다.
파면 제어기를 활용하는 경우 평면파의 입사 각도를 조절할 수 있을 뿐 아니라, 평면파 파면의 위상 및 패턴을 제어할 수 있다. 따라서 파면 제어기를 활용하여 3차원 고해상도 형광 이미지와 3차원 굴절률 분포 이미지 두 가지 모두를 얻는 것이 가능하다.
일 실시예에 따른 파면 제어기를 이용한 초고속 3차원 굴절률 영상 촬영 및 형광 구조화 조도 현미경 시스템은 변조부, 간섭계, 굴절률 영상부, 및 형광 이미지부를 포함하여 이루어질 수 있다.
예를 들어, 변조부는 파면 제어기(110), 튜브 렌즈(120), 및 집광 렌즈(130)를 포함하여 이루어질 수 있다. 또한 실시예에 따라 변조부는 공간 필터(spatial filter)를 더 포함하여 이루어질 수 있다.
파면 제어기(110)는, 예컨대 디지털 마이크로미러 소자일 수 있다. 즉, 디지털 마이크로미러 소자(Digital Micromirror Device)는 파면 제어기로 다수의 마이크로미러를 포함하는 배열을 구비할 수 있다.
튜브 렌즈(120) 및 집광 렌즈(130)는 평면파 진행 각도를 확대하여 샘플에 입사시킬 수 있다.
여기에서 샘플(sample)은 측정하고자 하는 대상을 나타내는 것으로, 세포, 세균 또는 미생물 등이 될 수 있으며 세포 등을 포함하고 있는 대상물이 될 수도 있다.
그리고, 간섭계는 샘플을 통과한 2차원 광학장을 적어도 하나 이상의 입사광에 따라 측정할 수 있다.
굴절률 영상부는 측정된 2차원 광학장의 정보를 통해 3차원 굴절률 영상을 획득할 수 있다.
형광 이미지부는 평면파의 파면의 위상 및 패턴을 제어하여 3차원 고해상도 형광 이미지를 획득할 수 있다.
이에 따라 파면 제어기를 이용하여 샘플의 3차원 고해상도 형광 이미지와 3차원 굴절률 입체 영상을 동시에 측정할 수 있다.
아래에서 일 실시예에 따른 파면 제어기를 이용한 초고속 3차원 굴절률 영상 촬영 및 형광 구조화 조도 현미경 시스템에 대해 더 구체적으로 설명한다.
먼저, 3차원 굴절률 단층 촬영 이미지를 얻기 위해서 Lee Hologram[비특허문헌 5] 방법을 사용하여 파면 제어기로 입사 평면파의 조사 각도를 조절할 수 있다. 입사되는 평면파의 진행 각도를 제어하기 위해서, 디지털 마이크로미러 소자(digital micromirror device)에 표출(display)하는 Lee hologram 패턴을 적절히 변경할 수 있다.
더 구체적으로, 다양한 진행 각도의 평면파를 디지털 마이크로미러 소자로 형성하기 위해서 디지털 마이크로미러 소자에 아래의 식과 같은 Lee hologram 패턴을 입력할 수 있다.
[식 1]
Figure 112016055836581-pat00001
여기에서, u, v는 공간주파수로 디지털 마이크로미러 소자에서의 픽셀을 통해 조절되는 값이며,
Figure 112016055836581-pat00002
는 평면파의 상대적인 위상 차이를 나타낼 수 있다.
이 중 두 번째 식에서, 세 개의 항 중 두 번째 항에 해당하는 회절광만 샘플에 입사시키고 나머지를 차폐하면 하나의 평면파의 진행 방향을 제어할 수 있게 된다.
광축을 z축으로 정하고 표현하고자 하는 파장
Figure 112016055836581-pat00003
을 갖는 레이저 평면파의 x축 y축 방향의 각도를 각각
Figure 112016055836581-pat00004
로 한다면, 이에 해당하는 파면의 위상 정보는 다음 식과 같이 나타낼 수 있다.
[식 2]
Figure 112016055836581-pat00005
따라서 식 1에서 디지털 마이크로미러 소자의 패턴을 조절하면 식 2를 이용하여 원하는 위상 정보를 얻을 수 있게 된다. 이때, 하나의 반사광을 사용하기 위해서 공간 필터(spatial filter)를 통해 디지털 마이크로미러 소자에 의한 회절광 중 특정 회절광 하나만 사용할 수 있다.
샘플을 통과한 2차원 광학장과 참조파(reference beam)의 간섭계를 만들고, 평면파의 조사 각도를 다양하게 바꾸며 광학장을 측정할 수 있다. 이렇게 측정된 2차원 광학장의 정보를 광회절 단층 촬영법(optical diffraction tomography) 또는 여과된 역투사 알고리즘(filtered back projection algorithm) 기술을 활용하여 3차원 굴절률 영상을 얻을 수 있다.
다음으로, 초고해상도의 형광 이미지를 얻기 위해서 구조화 조도 현미경 기술을 이용한다.
구조화 조도 현미경 기술에서 초고해상도 이미지를 얻기 위해서는 특정 패턴을 입사하고 패턴을 구성하는 평면파 간의 위상을 조절할 수 있어야 한다.
일례로, 사인 곡선 모양의 패턴(sinusoidal pattern)을 다음 식과 같이 나타낼 수 있다.
[식 3]
Figure 112016055836581-pat00006
여기서, u, v는 공간주파수로 앞에서 설명한 바와 같이 디지털 마이크로미러 소자의 픽셀을 통해서 조절되는 값이며,
Figure 112016055836581-pat00007
는 평면파의 상대적인 위상 차이로 디지털 마이크로미러 소자의 패턴의 형태를 통해 조절이 가능하다.
도 2는 일 실시예에 따른 평면파의 상대적인 위상 차이를 설명하기 위한 도면이다. 도 2를 참조하면, 평면파의 상대적인 위상 차이
Figure 112016055836581-pat00008
는 디지털 마이크로미러 소자의 패턴의 형태를 통해 조절이 가능하다.
3차원 굴절률 단층 촬영법에서는 식 1 또는 식 3의 세 개의 항 중 두 번째 항만을 사용하였으나, 구조화 조도 현미경 기술에서는 식의 세 항을 모두 사용할 수 있다.
이때, 입사된 사인 곡선 모양의 패턴을 구성하는 세 항 각각에 대한 시편의 광학장을 구별하기 위해 위상 변환 방법(phase shifting method)을 사용하고, 상대적 위상 차이
Figure 112016055836581-pat00009
를 3 스텝 이상의 다른 값으로 제어하여야 한다.
또한, 도 3을 참조하면 해상도의 방위각 대칭(azimuthal symmetry)을 유지하기 위해서 공간주파수를 조절하여 사인 곡선 모양의 패턴의 방향을 돌려가며 여러 방위각
Figure 112016055836581-pat00010
에 대하여 측정할 수 있다.
즉, 광학장 구별을 위한 N개의 패턴, 방위각 스캐닝(azimuthal angle scanning)을 위한 M개의 패턴으로 총 N*M개의 패턴이 필요하다. 필요한 패턴은 디지털 마이크로미러 소자의 패턴을 통하여 각도와 위상이 조절 가능하다.
이때, 위상
Figure 112016055836581-pat00011
는 디지털 마이크로미러의 픽셀 수를
Figure 112016055836581-pat00012
이라 하면
Figure 112016055836581-pat00013
의 스텝으로 조절이 된다. 도 4를 참조하면, 제어된 패턴들에 의하여 형광 이미지를 얻고 이러한 이미지들을 알고리즘을 통해 초고해상도의 2차원 형광 이미지를 재건할 수 있다.
그리고 광원을 저간섭성 빛을 사용하면 z축으로 특정 부분만 구별하여 측정하게 되며, 스테이지나 집광 렌즈(condenser lens)(430)를 z축으로 움직여 샘플(440)의 z축의 각 부분을 측정하면 3차원 초고해상도 형광 이미지를 얻을 수 있다. 한편, 도 1에서 설명한 바와 같이 변조부는 파면 제어기(410), 튜브 렌즈(420), 및 집광 렌즈(430)를 포함하여 이루어질 수 있다. 또한 실시예에 따라 변조부는 공간 필터(spatial filter)를 더 포함하여 이루어질 수 있다.
이러한 3차원 굴절률 영상 촬영 영상 및 3차원 고해상도 형광 이미지를 획득하는 시스템 및 방법에 대해 아래에서 더 구체적으로 설명하기로 한다.
도 5는 일 실시예에 따른 파면 제어기를 이용한 초고속 3차원 굴절률 영상 촬영 및 형광 구조화 조도 현미경 시스템을 나타내는 블록도이다.
도 5를 참조하면, 일 실시예에 따른 파면 제어기를 이용한 초고속 3차원 굴절률 영상 촬영 및 형광 구조화 조도 현미경 시스템(500)은 변조부(510), 간섭계(520), 및 굴절률 영상부(530)를 포함하여 이루어질 수 있다. 실시예에 따라 파면 제어기를 이용한 초고속 3차원 굴절률 영상 촬영 및 형광 구조화 조도 현미경 시스템(500)은 형광 이미지부(540)를 더 포함하여 이루어질 수 있다.
변조부(510)는 파면 제어기(Wavefront Shaper)를 이용하여 샘플에 입사되는 평면파의 조사 각도를 조절할 수 있다.
더 구체적으로, 변조부(510)는 파면 제어기를 사용하여 입사광의 조사 각도 및 파면 패턴 중 적어도 어느 하나 이상을 변경하여 샘플에 입사시킬 수 있다. 여기에서 파면 제어기는 빛의 위상을 제어할 수 있는 기기 또는 위상이 제어될 수 있는 고정된 형태의 필름이 사용될 수 있다. 예컨대 파면 제어기는 초고속으로 파면을 제어할 수 있는 디지털 마이크로미러 소자를 포함할 수 있다. 디지털 마이크로미러 소자(Digital Micromirror Device)는 파면 제어기로 다수의 마이크로미러를 포함하는 배열을 구비할 수 있다.
즉, 변조부(510)는 샘플에 입사되는 평면파의 진행 각도를 제어하기 위해서, 디지털 마이크로미러 소자에 표출(display)하는 패턴을 변경하여 다양한 진행 각도의 평면파를 형성할 수 있다.
또한 변조부(510)는 평면파의 조사 각도를 조절하여 회절광을 샘플에 입사시키고 나머지를 차폐하여 하나의 평면파의 진행 방향을 제어하고, 디지털 마이크로미러 소자의 패턴을 조절하여 원하는 위상 정보를 획득할 수 있다.
이때, 변조부(510)는 공간 필터(spatial filter)를 이용하여 디지털 마이크로미러 소자에 의한 회절광 중 특정 회절광 하나만 사용할 수 있다.
한편, 평면파를 발생시키는 광원을 저간섭성 빛을 사용하여 z축으로 특정 부분만 구별하여 측정할 수 있다.
예를 들어, 변조부(510)는 디지털 마이크로미러 소자, 튜브 렌즈, 및 집광 렌즈를 포함하여 이루어질 수 있다. 또한 실시예에 따라 변조부(510)는 공간 필터(spatial filter)를 더 포함하여 이루어질 수 있다.
간섭계(520)는 적어도 하나 이상의 입사광에서 간섭 신호를 추출하는 것으로, 샘플을 통과한 2차원 광학장을 적어도 하나 이상의 입사광에 따라 측정할 수 있다.
즉, 간섭계(520)는 평면파의 조사 각도에 따른 샘플을 통과한 2차원 광학장을 측정할 수 있다.
간섭계(520)는 샘플을 통과한 2차원 광학장과 참조파(reference beam)의 간섭계를 만들고, 평면파의 조사 각도를 다양하게 변경하여 2차원 광학장을 측정할 수 있다.
굴절률 영상부(530)는 측정된 2차원 광학장의 정보를 통해 3차원 굴절률 영상을 획득함으로써, 고속 정밀하게 3차원 굴절률을 측정 가능하다.
더 구체적으로, 굴절률 영상부(530)는 측정된 2차원 광학장의 정보를 광회절 단층 촬영법(optical diffraction tomography) 또는 여과된 역투사 알고리즘(filtered back projection algorithm)을 이용하여 3차원 굴절률 영상을 획득할 수 있다.
형광 이미지부(540)는 평면파의 파면의 위상 및 패턴을 제어하여 3차원 고해상도 형광 이미지를 획득할 수 있다. 이에 따라 파면 제어기를 이용하여 샘플의 3차원 고해상도 형광 이미지와 3차원 굴절률 입체 영상을 동시에 측정할 수 있다.
더 구체적으로, 형광 이미지부(540)는 평면파를 특정 패턴으로 입사시키고 패턴을 구성하는 평면파 간의 위상을 조절하여 제어된 패턴들에 의하여 형광 이미지를 획득하고, 복수의 형광 이미지들을 알고리즘을 통해 고해상도의 2차원 형광 이미지를 재건하여 3차원 고해상도 형광 이미지를 획득할 수 있다.
이러한 형광 이미지부(540)는 디지털 마이크로미러 소자의 패턴을 통하여 각도와 위상이 조절 가능 광학장 구별을 위한 N개의 패턴과 방위각 스캐닝(azimuthal angle scanning)을 위한 M개의 패턴으로 N*M개의 패턴을 형성할 수 있다.
형광 이미지부(540)는 스테이지나 집광 렌즈(condenser lens)를 z축으로 이동시켜 샘플의 z축의 각 부분을 측정하여 3차원 고해상도 형광 이미지를 획득할 수 있다.
실시예들에 따르면 살아있는 세포와 조직 내부의 3차원 굴절률 분포를 광학적으로 측정하고, 형광 단백질에 의해 표지된 특정 내부 구조를 동시에 구별할 수 있는 파면 제어기를 이용한 초고속 3차원 굴절률 영상 촬영 및 형광 구조화 조도 현미경 시스템 및 이를 이용한 방법을 제공할 수 있다.
도 6은 일 실시예에 따른 파면 제어기를 이용한 초고속 3차원 굴절률 영상 촬영 및 형광 구조화 조도 현미경 시스템을 이용한 방법을 나타내는 흐름도이다.
일 실시예에 따른 파면 제어기를 이용한 초고속 3차원 굴절률 영상 촬영 및 형광 구조화 조도 현미경 시스템을 이용한 방법은, 파면 제어기(Wavefront Shaper)를 이용하여 샘플에 입사되는 평면파의 조사 각도를 조절하는 단계(610), 평면파의 조사 각도에 따른 샘플을 통과한 2차원 광학장을 측정하는 단계(620), 및 측정된 2차원 광학장의 정보를 광회절 단층 촬영법(optical diffraction tomography) 또는 여과된 역투사 알고리즘(filtered back projection algorithm)을 이용하여 3차원 굴절률 영상을 획득하는 단계(630)를 포함한다.
또한, 평면파의 파면의 위상 및 패턴을 제어하여 3차원 고해상도 형광 이미지를 획득하는 단계(640)를 더 포함할 수 있다.
이에 따라 파면 제어기를 이용하여 샘플의 3차원 고해상도 형광 이미지와 3차원 굴절률 입체 영상을 동시에 측정할 수 있다.
아래에서 일 실시예에 따른 파면 제어기를 이용한 초고속 3차원 굴절률 영상 촬영 및 형광 구조화 조도 현미경 시스템을 이용한 방법을 하나의 예를 들어 더 구체적으로 설명하기로 한다.
일 실시예에 따른 파면 제어기를 이용한 초고속 3차원 굴절률 영상 촬영 및 형광 구조화 조도 현미경 시스템을 이용한 방법은 도 5에서 설명한 일 실시예에 따른 파면 제어기를 이용한 초고속 3차원 굴절률 영상 촬영 및 형광 구조화 조도 현미경 시스템을 이용하여 더 구체적으로 설명할 수 있다.
일 실시예에 따른 파면 제어기를 이용한 초고속 3차원 굴절률 영상 촬영 및 형광 구조화 조도 현미경 시스템(500)은 변조부(510), 간섭계(520), 및 굴절률 영상부(530)를 포함하여 이루어질 수 있다. 실시예에 따라 파면 제어기를 이용한 초고속 3차원 굴절률 영상 촬영 및 형광 구조화 조도 현미경 시스템(500)은 형광 이미지부(540)를 더 포함하여 이루어질 수 있다.
단계(610)에서, 변조부(510)는 파면 제어기(Wavefront Shaper)를 이용하여 샘플에 입사되는 평면파의 조사 각도를 조절할 수 있다.
예컨대 파면 제어기(Wavefront Shaper)는 디지털 마이크로미러 소자 등을 이용할 수 있다. 즉, 변조부(510)는 샘플에 입사되는 평면파의 진행 각도를 제어하기 위해서, 디지털 마이크로미러 소자에 표출(display)하는 패턴을 변경하여 다양한 진행 각도의 평면파를 형성할 수 있다.
또한 변조부(510)는 평면파의 조사 각도를 조절하여 회절광을 샘플에 입사시키고 나머지를 차폐하여 하나의 평면파의 진행 방향을 제어하고, 디지털 마이크로미러 소자의 패턴을 조절하여 원하는 위상 정보를 획득할 수 있다.
이때, 변조부(510)는 공간 필터(spatial filter)를 이용하여 디지털 마이크로미러 소자에 의한 회절광 중 특정 회절광 하나만 사용할 수 있다.
단계(620)에서, 간섭계(520)는 평면파의 조사 각도에 따른 샘플을 통과한 2차원 광학장을 측정할 수 있다.
더 구체적으로, 간섭계(520)는 샘플을 통과한 2차원 광학장과 참조파(reference beam)의 간섭계를 만들고, 평면파의 조사 각도를 다양하게 변경하여 2차원 광학장을 측정할 수 있다.
단계(630)에서, 굴절률 영상부(530)는 측정된 2차원 광학장의 정보를 광회절 단층 촬영법(optical diffraction tomography) 또는 여과된 역투사 알고리즘(filtered back projection algorithm)을 이용하여 3차원 굴절률 영상을 획득할 수 있다.
단계(640)에서, 형광 이미지부(540)는 평면파의 파면의 위상 및 패턴을 제어하여 3차원 고해상도 형광 이미지를 획득할 수 있다. 이에 따라 파면 제어기를 이용하여 샘플의 3차원 고해상도 형광 이미지와 3차원 굴절률 입체 영상을 동시에 측정할 수 있다.
더 구체적으로, 형광 이미지부(540)는 평면파를 특정 패턴으로 입사시키고 패턴을 구성하는 평면파 간의 위상을 조절하여 제어된 패턴들에 의하여 형광 이미지를 획득하고, 복수의 형광 이미지들을 알고리즘을 통해 고해상도의 2차원 형광 이미지를 재건하여 3차원 고해상도 형광 이미지를 획득할 수 있다.
이러한 형광 이미지부(540)는 디지털 마이크로미러 소자의 패턴을 통하여 각도와 위상이 조절 가능 광학장 구별을 위한 N개의 패턴과 방위각 스캐닝(azimuthal angle scanning)을 위한 M개의 패턴으로 N*M개의 패턴을 형성할 수 있다.
한편, 평면파를 발생시키는 광원을 저간섭성 빛을 사용하여 z축으로 특정 부분만 구별하여 측정할 수 있다.
다시 말하면, 형광 이미지부(540)는 회절 격자나 파면 제어기의 종류의 하나인 디지털 마이크로미러 소자를 사용하여 패턴화된 저간섭성 빛(low coherent light)과 z축 이동 스테이지를 이용하여 광학적인 구간 측정(optical sectioning)을를 통하여 3차원의 형광 이미지를 얻는 수 있다.
형광 이미지부(540)는 스테이지나 집광 렌즈(condenser lens)를 z축으로 이동시켜 샘플의 z축의 각 부분을 측정하여 3차원 고해상도 형광 이미지를 획득할 수 있다.
실시예들에 따르면, 하나의 시스템에서 살아 있는 세포의 3차원 초고해상도 형광 이미지와 3차원 굴절률 분포 이미지를 모두 측정할 수 있게 된다. 이 기술을 이용하여 세포 내부의 3차원 단백질 분포와 3차원 초고해상도 형광 이미지를 통하여 표지된 특정 구조를 구별하여 측정할 수 있다.
또한, 세포 내부 구조를 긴 시간 동안 측정하여 시간에 따른 구조 및 생화학적 변화 또한 측정할 수 있다. 본 발명에서 제시한 기술은 세포 수준의 생물학 및 병리학적 연구에 크게 기여할 수 있다.
이상과 같이 실시예들이 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기의 기재로부터 다양한 수정 및 변형이 가능하다. 예를 들어, 설명된 기술들이 설명된 방법과 다른 순서로 수행되거나, 및/또는 설명된 시스템, 구조, 장치, 회로 등의 구성요소들이 설명된 방법과 다른 형태로 결합 또는 조합되거나, 다른 구성요소 또는 균등물에 의하여 대치되거나 치환되더라도 적절한 결과가 달성될 수 있다.
그러므로, 다른 구현들, 다른 실시예들 및 특허청구범위와 균등한 것들도 후술하는 특허청구범위의 범위에 속한다.

Claims (16)

  1. 파면 제어기(Wavefront Shaper)를 이용하여 샘플에 입사되는 평면파의 조사 각도를 조절하는 단계;
    상기 평면파의 조사 각도에 따른 상기 샘플을 통과한 2차원 광학장을 측정하는 단계;
    측정된 상기 2차원 광학장의 정보를 광회절 단층 촬영법(optical diffraction tomography) 또는 여과된 역투사 알고리즘(filtered back projection algorithm)을 이용하여 3차원 굴절률 영상을 획득하는 단계; 및
    상기 평면파의 파면의 위상 및 패턴을 제어하여 3차원 고해상도 형광 이미지를 획득하는 단계
    를 포함하고,
    상기 파면 제어기를 이용하여 상기 샘플의 상기 3차원 고해상도 형광 이미지와 상기 3차원 굴절률 입체 영상을 동시에 측정하는 것
    을 특징으로 하는 파면 제어기를 이용한 초고속 3차원 굴절률 영상 촬영 및 형광 구조화 조도 현미경 시스템을 이용한 방법.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 파면 제어기를 이용하여 샘플에 입사되는 평면파의 조사 각도를 조절하는 단계는,
    상기 샘플에 입사되는 상기 평면파의 진행 각도를 제어하기 위해서, 디지털 마이크로미러 소자에 표출(display)하는 패턴을 변경하여 다양한 진행 각도의 평면파를 형성하는 것
    을 특징으로 하는 파면 제어기를 이용한 초고속 3차원 굴절률 영상 촬영 및 형광 구조화 조도 현미경 시스템을 이용한 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 파면 제어기를 이용하여 샘플에 입사되는 평면파의 조사 각도를 조절하는 단계는,
    상기 평면파의 조사 각도를 조절하여 회절광을 상기 샘플에 입사시키고 나머지를 차폐하여 하나의 평면파의 진행 방향을 제어하는 단계; 및
    디지털 마이크로미러 소자의 패턴을 조절하여 원하는 위상 정보를 획득하는 단계
    를 포함하는 파면 제어기를 이용한 초고속 3차원 굴절률 영상 촬영 및 형광 구조화 조도 현미경 시스템을 이용한 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 평면파의 조사 각도를 조절하여 회절광을 상기 샘플에 입사시키고 나머지를 차폐하여 하나의 평면파의 진행 방향을 제어하는 단계는,
    공간 필터(spatial filter)를 이용하여 상기 디지털 마이크로미러 소자에 의한 회절광 중 특정 회절광 하나만 사용하는 것
    을 특징으로 하는 파면 제어기를 이용한 초고속 3차원 굴절률 영상 촬영 및 형광 구조화 조도 현미경 시스템을 이용한 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 평면파의 조사 각도에 따른 상기 샘플을 통과한 2차원 광학장을 측정하는 단계는,
    상기 샘플을 통과한 상기 2차원 광학장과 참조파(reference beam)의 간섭계를 만들고, 상기 평면파의 조사 각도를 다양하게 변경하여 상기 2차원 광학장을 측정하는 것
    을 특징으로 하는 파면 제어기를 이용한 초고속 3차원 굴절률 영상 촬영 및 형광 구조화 조도 현미경 시스템을 이용한 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 평면파의 파면의 위상 및 패턴을 제어하여 3차원 고해상도 형광 이미지를 획득하는 단계는,
    상기 평면파를 특정 패턴으로 입사시키고 패턴을 구성하는 상기 평면파 간의 위상을 조절하는 단계;
    상기 위상을 조절하여 제어된 패턴들에 의하여 형광 이미지를 획득하는 단계; 및
    복수의 상기 형광 이미지들을 알고리즘을 통해 고해상도의 2차원 형광 이미지를 재건하여 3차원 고해상도 형광 이미지를 획득하는 단계
    를 포함하는 파면 제어기를 이용한 초고속 3차원 굴절률 영상 촬영 및 형광 구조화 조도 현미경 시스템을 이용한 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 평면파의 파면의 위상 및 패턴을 제어하여 3차원 고해상도 형광 이미지를 획득하는 단계는,
    디지털 마이크로미러 소자의 패턴을 통하여 각도와 위상이 조절 가능 광학장 구별을 위한 N개의 패턴과 방위각 스캐닝(azimuthal angle scanning)을 위한 M개의 패턴으로 N*M개의 패턴을 형성하는 것
    을 특징으로 하는 파면 제어기를 이용한 초고속 3차원 굴절률 영상 촬영 및 형광 구조화 조도 현미경 시스템을 이용한 방법.
  9. 삭제
  10. 제1항에 있어서,
    상기 평면파의 파면의 위상 및 패턴을 제어하여 3차원 고해상도 형광 이미지를 획득하는 단계는,
    스테이지나 집광 렌즈(condenser lens)를 z축으로 이동시켜 상기 샘플의 z축의 각 부분을 측정하여 상기 3차원 고해상도 형광 이미지를 획득하는 것
    을 특징으로 하는 파면 제어기를 이용한 초고속 3차원 굴절률 영상 촬영 및 형광 구조화 조도 현미경 시스템을 이용한 방법.
  11. 파면 제어기(Wavefront Shaper)를 이용하여 샘플에 입사되는 평면파의 조사 각도를 조절하는 변조부;
    상기 평면파의 조사 각도에 따른 상기 샘플을 통과한 2차원 광학장을 측정하는 간섭계;
    측정된 상기 2차원 광학장의 정보를 광회절 단층 촬영법(optical diffraction tomography) 또는 여과된 역투사 알고리즘(filtered back projection algorithm)을 이용하여 3차원 굴절률 영상을 획득하는 굴절률 영상부; 및
    상기 평면파의 파면의 위상 및 패턴을 제어하여 3차원 고해상도 형광 이미지를 획득하는 형광 이미지부
    를 포함하고,
    상기 파면 제어기를 이용하여 상기 샘플의 상기 3차원 고해상도 형광 이미지와 상기 3차원 굴절률 입체 영상을 동시에 측정하는 것
    을 특징으로 하는 파면 제어기를 이용한 초고속 3차원 굴절률 영상 촬영 및 형광 구조화 조도 현미경 시스템.
  12. 삭제
  13. 제11항에 있어서,
    상기 변조부는,
    상기 평면파의 조사 각도를 조절하여 회절광을 상기 샘플에 입사시키고 나머지를 차폐하여 하나의 평면파의 진행 방향을 제어하고, 디지털 마이크로미러 소자의 패턴을 조절하여 원하는 위상 정보를 획득하는 것
    을 특징으로 하는 파면 제어기를 이용한 초고속 3차원 굴절률 영상 촬영 및 형광 구조화 조도 현미경 시스템.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 변조부는,
    공간 필터(spatial filter)를 이용하여 상기 디지털 마이크로미러 소자에 의한 회절광 중 특정 회절광 하나만 사용하는 것
    을 특징으로 하는 파면 제어기를 이용한 초고속 3차원 굴절률 영상 촬영 및 형광 구조화 조도 현미경 시스템.
  15. 제11항에 있어서,
    상기 간섭계는,
    상기 샘플을 통과한 상기 2차원 광학장과 참조파(reference beam)의 간섭계를 만들고, 상기 평면파의 조사 각도를 다양하게 변경하여 상기 2차원 광학장을 측정하는 것
    을 특징으로 하는 파면 제어기를 이용한 초고속 3차원 굴절률 영상 촬영 및 형광 구조화 조도 현미경 시스템.
  16. 제11항에 있어서,
    상기 형광 이미지부는,
    상기 평면파를 특정 패턴으로 입사시키고 패턴을 구성하는 상기 평면파 간의 위상을 조절하여 제어된 패턴들에 의하여 형광 이미지를 획득하고, 복수의 상기 형광 이미지들을 알고리즘을 통해 고해상도의 2차원 형광 이미지를 재건하여 3차원 고해상도 형광 이미지를 획득하는 것
    를 포함하는 파면 제어기를 이용한 초고속 3차원 굴절률 영상 촬영 및 형광 구조화 조도 현미경 시스템.
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