JP6196825B2 - 顕微鏡システム、及び、試料の屈折率測定方法 - Google Patents

Description

本発明は、顕微鏡システム、及び、試料の屈折率測定方法に関する。

生体試料を観察する方法として、多光子励起顕微鏡を用いた蛍光観察法が注目されている。多光子励起顕微鏡は、一光子励起顕微鏡の励起光に比べて長い波長の励起光で試料を励起する。長い波長の光ほど散乱しにくいことから、多光子励起顕微鏡によれば、生体試料のような光の散乱を生じさせやすい試料の深部にまで励起光を到達させることが可能であり、その結果、一光子励起顕微鏡よりも試料の深い部位を観察することができる。

特許文献１には、光路上に波面変調器を有する顕微鏡が開示されている。特許文献２には、レーザ加工装置が開示されていて、材料の分散によって色収差が発生することについて記載されている。

特開平１１−１０１９４２号公報 特開２００５−２２４８４１号公報

ところで、多光子励起顕微鏡では、蛍光物質に応じて複数の異なる励起波長の光が使用されるが、異なる波長の光では、基準波長の光に対して異なる量の色収差が発生する。このため、蛍光物質に応じて励起波長を変更すると、集光位置が変化してしまうことがある。これを回避するためには、使用する波長間で生じる色収差を補正すればよく、それによって、波長によらず集光位置を一定に保つことができる。

しかしながら、そのような対応は、対物レンズと集光位置の間の媒質の屈折率が既知であり、その結果、色収差量も既知である場合（例えば、試料表面を観察する場合など）に限り取ることができる。試料の内部を観察する場合（例えば、脳の深部をin vivoで観察する場合など）には一般に試料の屈折率は未知であり色収差量も未知であるので、色収差を補正して波長間で集光位置を一定に保つことは困難である。

なお、このような課題は、図１４に示すように、同じ波長の光でも試料の観察面の深さ（観察深さ）が異なると基準波長に対して異なる量の色収差が発生し集光位置が異なることから、試料の深部まで観察可能な多光子励起顕微鏡において特に顕著である。ただし、他の顕微鏡でも屈折率が未知である試料の内部を観察する場合には、同様の課題は存在する。

以上のような実情を踏まえ、本発明は、屈折率を測定するための技術を提供することを目的とする。

本発明の第１の態様は、光源からの光の波面を変調する波面変調手段と、前記波面変調手段で波面が変調された光を試料に照射する対物レンズと、前記対物レンズと前記試料との間の媒質の屈折率と前記試料の屈折率との差に起因する球面収差を補正する球面収差補正手段と、前記光源からの光の波長毎に、前記球面収差補正手段による球面収差の補正量に基づいて、前記対物レンズと前記対物レンズから出射された光の集光位置との間の媒質の平均屈折率を算出する屈折率算出手段と、前記屈折率算出手段で算出された波長毎の平均屈折率に基づいて算出される色収差を補正するように、前記波面変調手段を制御する制御手段と、を備える顕微鏡システムを提供する。

本発明の第２の態様は、第１の態様に記載の顕微鏡システムにおいて、さらに、前記屈折率算出手段で算出された波長毎の平均屈折率に基づいて、波長間で生じる色収差を算出する色収差算出手段を備え、前記制御手段は、前記色収差算出手段で算出された色収差を補正するように、前記波面変調手段を制御する顕微鏡システムを提供する。

本発明の第３の態様は、第１の態様または第２の態様に記載の顕微鏡システムにおいて、さらに、前記試料に対して前記対物レンズを前記光軸方向に相対的に移動させて、前記対物レンズから出射された光の集光位置を変更するＺ走査手段を備え、前記屈折率算出手段は、前記Ｚ走査手段により変更される前記集光位置毎で且つ前記光源からの光の波長毎に、前記球面収差補正手段による球面収差の補正量に基づいて、前記対物レンズと前記対物レンズから出射された光の集光位置の間の媒質の平均屈折率を算出する顕微鏡システムを提供する。

本発明の第４の態様は、第１の態様乃至第３の態様のいずれか１つに記載の顕微鏡システムにおいて、前記波面変調手段は、前記制御手段による制御下で、２波長のいずれか一方の波長の光の集光位置が、前記対物レンズの光軸方向に前記屈折率算出手段で算出された前記２波長間で生じる色収差が表わす距離だけ移動するように、当該一方の波長の光の波面を変調する顕微鏡システムを提供する。

本発明の第５の態様は、第１の態様乃至第４の態様のいずれか１つに記載の顕微鏡システムにおいて、前記対物レンズは、前記球面収差補正手段である補正環を備える顕微鏡システムを提供する。

本発明の第６の態様は、第１の態様乃至第５の態様のいずれか１つに記載の顕微鏡システムにおいて、さらに、前記対物レンズと、前記波面変調手段と、前記球面収差補正手段とを備えた多光子励起顕微鏡を含む顕微鏡システムを提供する。

本発明の第７の態様は、顕微鏡システムによる試料の屈折率測定方法であって、前記試料に対して前記対物レンズを光軸方向に相対的に移動させて、前記顕微鏡システムの対物レンズから出射される光の集光位置を前記試料の表面に一致させる第１の集光位置移動工程と、前記試料に対して前記対物レンズを前記光軸方向に相対的に移動させて、前記対物レンズから出射される光の集光位置を前記試料の内部に移動させる第２の集光位置移動工程と、前記試料の内部での球面収差を補正する球面収差補正工程と、前記球面収差補正工程での球面収差の補正量に基づいて、前記試料の表面と前記試料の内部の前記集光位置との間の前記試料の屈折率を算出する屈折率算出工程と、を備え、前記屈折率算出工程は、前記球面収差補正工程での球面収差の補正量に基づいて、前記対物レンズと前記試料の内部の前記集光位置までの媒質の平均屈折率を算出する第１の屈折率算出工程と、前記対物レンズの作動距離と、前記第２の集光位置移動工程での集光位置の移動量と、前記第１の屈折率算出工程で算出された前記平均屈折率と、前記対物レンズと前記試料の表面との間の媒質の屈折率とに基づいて、前記試料の表面と前記試料の内部の前記集光位置との間の前記試料の屈折率を算出する第２の屈折率算出工程と、を備える試料の屈折率測定方法を提供する。

本発明によれば、屈折率を測定するための技術を提供することができる。

本発明の実施例１に係る顕微鏡システムの構成を示す図である。 本発明の実施例１に係る顕微鏡システムの制御装置の機能ブロック図である。 本発明の実施例１に係る顕微鏡システムで行われる観察前処理のフローチャートである。 図３に示す試料の表面における観察前処理のフローチャートである。 図３に示す移動後のＺ位置における観察前処理のフローチャートである。 本発明の実施例１に係る本実施例に係る顕微鏡システムで観察前処理後に行われる観察処理のフローチャートである。 試料表面で色収差が補正されていない様子を示す図である。 試料表面で色収差が補正されている様子を示す図である。 試料内部で色収差が補正されていない様子を示す図である。 試料内部で色収差が補正されている様子を示す図である。 補正環の回転角度と球面収差補正量との関係を示す図である。 球面収差補正量と平均屈折率との関係を示す図である。 本発明の実施例１に係る顕微鏡システムで行われる試料の屈折率測定処理のフローチャートである。 本発明の実施例２に係る顕微鏡システムの構成を示す図である。 本発明の実施例３に係る顕微鏡システムの構成を示す図である。 本発明の実施例４に係る顕微鏡システムの構成を示す図である。 本発明の実施例５に係る顕微鏡システムの構成を示す図である。 基準波長に対する集光位置のずれ量を示す図である。

図１は、本実施例に係る顕微鏡システム１００の構成を示す図である。図１に示される顕微鏡システム１００は、２光子励起顕微鏡と、２光子励起顕微鏡を制御する制御装置であるパーソナルコンピュータ（ＰＣ）２０と、ＰＣ２０に接続された図示しないモニタ及び入力装置と、を備えている。

２光子励起顕微鏡は、図１に示すように、レーザ１と、波面変調器２と、ビームエクスパンダ３と、ガルバノスキャナ４と、瞳リレー光学系５と、ミラー６と、ダイクロイックミラー７と、レボルバ８と、補正環１０を備えた対物レンズ９と、試料Ｓが配置されたステージ１１と、検出光学系１２と、検出器１３とを備えている。

レーザ１は、波長の異なる複数のレーザ光を切り替えて出射するレーザ光源であり、いわゆる波長可変レーザである。レーザ１は、例えば、チタンサファイアレーザである。

波面変調器２は、レーザ１からのレーザ光の波面を変調する波面変調手段であり、対物レンズ９の瞳位置と光学的に共役な位置（以降、瞳共役位置と記す）に配置されている。波面変調器２は、例えば、ＬＣＯＳ（Liquid Crystal On Silicon）などの液晶デバイスである。

ビームエクスパンダ３は、波面変調器２で波面が変調されたレーザ光のビーム径を変更する光学系である。ビームエクスパンダ３は、ガルバノスキャナ４の像を波面変調器２に投影するように構成されている。

ガルバノスキャナ４は、レーザ光が偏向する方向を変化させることで、対物レンズ９から出射されたレーザ光の集光位置を対物レンズ９の光軸と直交するＸＹ方向に移動させるミラーである。即ち、ガルバノスキャナ４は、レーザ光で試料Ｓを対物レンズ９の光軸と直交するＸＹ方向に走査するＸＹ走査手段である。ガルバノスキャナ４は、瞳共役位置であって、波面変調器２の位置と光学的に共役な位置に配置されている。
瞳リレー光学系５は、ガルバノスキャナ４の像を対物レンズ９の瞳位置に投影するための光学系である。
ミラー６は、レーザ光を対物レンズ９に向けて反射させる反射ミラーである。

ダイクロイックミラー７は、レーザ１からのレーザ光を透過させ、試料Ｓからの蛍光を反射する光学特性を有するミラーであり、レーザ光と蛍光を分離することで照明光路と検出光路を分岐させる光路分岐手段である。

レボルバ８は、対物レンズ９を対物レンズ９の光軸方向（Ｚ方向）に移動可能に保持する装置である。即ち、レボルバ８は、試料Ｓに対して対物レンズ９を光軸方向に相対的に移動させて、対物レンズ９から出射されたレーザ光の集光位置を変更するＺ走査手段である。なお、レボルバ８及び対物レンズ９の代わりに、ステージ１１が光軸方向に移動してもよい。その場合、ステージ１１が対物レンズ９から出射されたレーザ光の集光位置を変更するＺ走査手段である。

対物レンズ９は、波面変調器２で波面が変調されたレーザ光を試料Ｓに照射する、補正環１０を備えた対物レンズである。この例では、対物レンズ９は、対物レンズ９と試料Ｓの間を浸液で満たした状態で用いられる液浸対物レンズであるが、顕微鏡システム１００は、液浸対物レンズの代わりに乾燥系対物レンズを備えても良い。

補正環１０は、対物レンズ９を構成するレンズの一部を光軸方向に移動させる機構である。補正環１０は、対物レンズ９と試料Ｓとの間の媒質（この例では、浸液）の屈折率と試料Ｓの屈折率との差に起因する球面収差（いわゆるインデックスミスマッチに起因する球面収差）を補正する球面収差補正手段である。
検出光学系１２は、対物レンズ９の瞳の像を検出器１３の受光面に投影する光学系である。
検出器１３は、試料Ｓからの蛍光を検出する光検出器である。検出器１３は、例えば、光電子増倍管（ＰＭＴ）である。

ＰＣ２０は、２光子励起顕微鏡の構成要素のうちの少なくとも、レーザ１、波面変調器２、ガルバノスキャナ４、レボルバ８、及び検出器１３に接続されている。ＰＣ２０は、予め記憶されている制御プログラムを実行することにより、図２に示すように、２光子励起顕微鏡の構成要素を制御する制御手段２１、対物レンズ９と対物レンズ９から出射される光の集光位置との間の媒質の平均屈折率を算出する屈折率算出手段２２、及び、波長間で生じる色収差を算出する色収差算出手段２３として機能する。

以上のように構成された顕微鏡システム１００では、レーザ１から出射されたレーザ光は、波面変調器２でその波面が変調され、ビームエクスパンダ３でそのビーム径が変更され、その後、ガルバノスキャナ４に入射する。ガルバノスキャナ４で偏向されたレーザ光は、瞳リレー光学系５、ミラー６、ダイクロイックミラー７を介して対物レンズ９に入射する。対物レンズ９に入射したレーザ光は、対物レンズ９によって集光されて、試料Ｓに照射される。

レーザ光が照射された試料Ｓから生じた蛍光は、対物レンズ９を介してダイクロイックミラー７に入射する。蛍光はダイクロイックミラー７で反射し、検出光学系１２を介して検出器１３で検出される。検出器１３は、蛍光を電気信号に変換してＰＣ２０へ出力する。そして、ＰＣ２０は、検出器１３からの電気信号とガルバノスキャナ４の走査位置情報とから試料Ｓの画像を生成し、図示しないモニタに表示させる。

図３は、本実施例に係る顕微鏡システム１００で行われる観察前処理のフローチャートである。図４は、図３に示す試料の表面における観察前処理のフローチャートであり、図５は、図３に示す移動後のＺ位置における観察前処理のフローチャートである。図６は、本実施例に係る顕微鏡システム１００で観察前処理後に行われる観察処理のフローチャートである。以下、図３から図６に示すフローチャートを参照しながら、異なる２波長で試料Ｓ内部の同じ位置を観察する方法について説明する。

観察前処理が開始されると、ＰＣ２０は、利用者によって入力された初期条件を取得して設定する（図３のステップＳ１０）。ここでは、初期条件として、観察に使用する２つの励起波長（第１の波長λ１、第２の波長λ２）、浸液の屈折率ｎ２、使用する対物レンズの情報（作動距離ＷＤ、レンズデータなど）、光軸方向にＺ位置を移動する際のピッチΔｚ、試料の厚さｄなどが設定される。なお、浸液の屈折率ｎ２は励起波長毎に設定される。以降では、第１の波長における浸液の屈折率をｎ２１、第２の波長における浸液の屈折率をｎ２２と記す。
次に、ＰＣ２０は、試料Ｓの表面における観察前処理を行う（図３のステップＳ２０）。具体的には、図４に示す６つの処理が行われる。

まず、ＰＣ２０は、第１の波長λ１の光Ｌ１の集光位置を試料Ｓの表面に合わせる（図４のステップＳ２１）。ここでは、ＰＣ２０は、レーザ１を制御して、レーザ１に第１の波長λ１の光Ｌ１を出射させる。さらに、ＰＣ２０は、レボルバ８を制御して試料Ｓに対して対物レンズ９を光軸方向に相対的に移動させて、対物レンズ９から出射される第１の波長λ１の光Ｌ１の集光位置を試料Ｓの表面に一致させる。なお、レボルバ８の制御は、利用者がモニタに表示される試料Ｓの画像を見ながらＰＣ２０を介して手動で行ってもよく、また、ＰＣ２０がオートフォーカス技術を用いて自動的に行ってもよい。

図７Ａは、ステップＳ２１の処理が完了した状態を示している。ここで、光Ｌ１（実線）は第１の波長λ１の光、光Ｌ２（破線）は第２の波長λ２の光である。また、ｎ１（＝１）は空気の屈折率、ｎ２は浸液の屈折率、ｎ３は試料Ｓの屈折率であり、通常はｎ１＜ｎ２＜ｎ３の関係を有している。ステップＳ２１では、波面変調器２でレーザ光の変調は行われない。このため、図７Ａに示すように、対物レンズ９の瞳Ｐに直線状の波面を有するレーザ光が入射する。

ＰＣ２０は、第１の波長λ１の光Ｌ１に生じる球面収差を補正する（図４のステップＳ２２）。ここでは、レーザ１が引き続き第１の波長λ１の光Ｌ１を出射している状態で、利用者がモニタに表示される試料Ｓの画像を見ながら補正環１０を回転させて球面収差を補正する。そして、球面収差が補正された状態での補正環１０の回転角度θ１を、入力装置を用いてＰＣ２０に入力する。なお、ＰＣ２０が補正環１０を制御可能な構成であれば、ＰＣ２０は、補正環１０を制御して自動的に球面収差を補正し、その際の補正環１０の回転角度θ１を取得してもよい。この場合、ＰＣ２０は、補正環１０の回転角度毎の試料Ｓの画像のコントラストを比較して、最もコントラストの高い画像が得られた状態を球面収差が補正された状態と判断してもよい。この点は、以降の球面収差を補正する処理でも同様である。

ＰＣ２０は、第１の波長λ１と第２の波長λ２の２波長間の色収差Δｃａ１を算出する（図４のステップＳ２３）。２波長間の色収差とは、第１の波長λ１の光Ｌ１と第２の波長λ２の光Ｌ２の間で生じる色収差のことであり、光Ｌ１の集光位置と光Ｌ２の集光位置との間のＺ方向の距離を表わしている。ここでは、ＰＣ２０は、ステップＳ１０で設定された、初期条件（第１の波長λ１、第２の波長λ２、屈折率ｎ２１、屈折率ｎ２２など）から２波長間の色収差Δｃａ１を算出する。なお、光の集光位置までの屈折率が既知である状態での色収差の算出方法は公知であるので、色収差の算出方法についての詳細な説明は省略する。

ＰＣ２０は、第２の波長λ２の光Ｌ２に対して色収差を補正する（図４のステップＳ２４）。ここでは、ＰＣ２０は、レーザ１を制御して、レーザ１に第２の波長λ２の光Ｌ２を出射させる。さらに、ＰＣ２０は、波面変調器２を制御して、光Ｌ２の集光位置を光軸方向に移動させる。より具体的には、ステップＳ２３で算出された色収差Δｃａ１が表わす距離だけ光Ｌ２の集光位置が光軸に沿って光Ｌ１の集光位置に近づく方向に移動するように、波面変調器２は光Ｌ２の波面を変調する。これにより、図７Ｂに示すように、光Ｌ１の集光位置と光Ｌ２の集光位置がともに試料Ｓの表面に一致し、２波長間の色収差が補正される。

ＰＣ２０は、第２の波長λ２の光Ｌ２に生じる球面収差を補正する（図４のステップＳ２５）。ここでは、レーザ１が引き続き第２の波長λ２の光Ｌ２を出射している状態で、利用者がモニタに表示される試料Ｓの画像を見ながら補正環１０を回転させて球面収差を補正する。そして、球面収差が補正された状態での補正環１０の回転角度θ２を、入力装置を用いてＰＣ２０に入力する。

最後に、ＰＣ２０は、試料Ｓの表面における顕微鏡システム１００の設定情報を記録し（図４のステップ２６）、試料Ｓの表面における観察前処理を終了する。ここでは、ＰＣ２０は、ステップＳ２２で得られた光Ｌ１に対する補正環１０の回転角度θ１、ステップＳ２５で得られた光Ｌ２に対する補正環１０の回転角度θ２、及び、ステップＳ２３で算出された色収差Δｃａ１を、試料Ｓに対する対物レンズ９の光軸方向の相対的位置（Ｚ位置）に関連付けて、ＰＣ２０に設けられた記録部に記録する。

試料Ｓの表面における観察前処理が終了すると、ＰＣ２０は、Ｚ位置を移動する（図３のステップＳ３０）。ここでは、ＰＣ２０は、レボルバ８を制御して、試料Ｓに対して対物レンズ９を光軸方向に相対的に移動させる。より具体的には、ＰＣ２０は、ステップＳ１０で設定されたピッチΔｚだけ対物レンズ９が試料Ｓに近づくように、レボルバ８を制御する。これにより、図７Ｃに示すように、光Ｌ１と光Ｌ２の集光位置が試料Ｓの内部に移動する。
その後、ＰＣ２０は、移動後のＺ位置における観察前処理を行う（図３のステップＳ４０）。具体的には、図５に示す７つの処理が行われる。

ＰＣ２０は、第１の波長λ１の光Ｌ１に生じる球面収差を補正する（図５のステップＳ４１）。ここでは、ＰＣ２０は、レーザ１を制御して、レーザ１に第１の波長λ１の光Ｌ１を出射させる。そして、レーザ１が第１の波長λ１の光Ｌ１を出射している状態で、利用者がモニタに表示される試料Ｓの画像を見ながら補正環１０を回転させて球面収差を補正する。そして、球面収差が補正された状態での補正環１０の回転角度θ１を、入力装置を用いてＰＣ２０に入力する。

ＰＣ２０は、第２の波長λ２の光Ｌ２に生じる球面収差を補正する（図５のステップＳ４２）。ここでは、ＰＣ２０は、レーザ１を制御して、レーザ１に第２の波長λ２の光Ｌ２を出射させる。そして、レーザ１が第２の波長λ２の光Ｌ２を出射している状態で、利用者がモニタに表示される試料Ｓの画像を見ながら補正環１０を回転させて球面収差を補正する。そして、球面収差が補正された状態での補正環１０の回転角度θ２ａを、入力装置を用いてＰＣ２０に入力する。

ＰＣ２０は、レーザ光の波長毎に、対物レンズ９と対物レンズ９から出射された光の集光位置の間の媒質の平均屈折率を算出する（図５のステップＳ４３）。
ここでは、ＰＣ２０は、まず、ステップＳ４１で取得した補正環１０の回転角度θ１から補正環１０による光Ｌ１に対する球面収差の補正量を算出する。球面収差の補正量は、補正環１０の回転角度と球面収差の補正量との間には図８Ａに示すような比例関係が存在し、その傾きがステップＳ１０で初期条件として設定された対物レンズ９の情報から既知であることから、回転角度に対して一意に算出される。次に、ＰＣ２０は、算出された球面収差の補正量から対物レンズ９と光Ｌ１の集光位置の間の媒質の平均屈折率を算出する。媒質の平均屈折率は、球面収差の補正量と媒質の平均屈折率の逆数との間には、図８Ｂに示すような比例関係が存在し、その傾きがステップＳ１０で初期条件として設定された対物レンズ９の情報から既知であることから、球面収差の補正量に対して一意に算出される。同様の手順で、ステップＳ４２で取得した補正環１０の回転角度θ２ａから補正環１０による光Ｌ２に対する球面収差の補正量を算出し、算出された球面収差の補正量から対物レンズ９と光Ｌ２の集光位置の間の媒質の平均屈折率を算出する。

これにより、波長毎に、補正環１０による球面収差の補正量に基づいて対物レンズ９と対物レンズ９から出射された光の集光位置との間の媒質の各波長における平均屈折率が算出される。

なお、このステップ４３では、対物レンズ９と集光位置の間の媒質の平均屈折率を算出したが、さらに、試料Ｓの表面から集光位置までの間の試料Ｓの平均屈折率を算出してもよい。対物レンズ９と集光位置の間に占める浸液と試料Ｓの比率は、ステップＳ１０で設定した作動距離ＷＤとピッチΔｚから算出される。このため、ＰＣ２０は、試料Ｓの表面から集光位置までの間の試料Ｓの平均屈折率を、対物レンズ９と集光位置の間の媒質の平均屈折率、浸液の屈折率（屈折率ｎ２１、屈折率ｎ２２）、作動距離ＷＤ、ピッチΔｚ、及び、光の波長（波長λ１、波長λ２）に基づいて、波長毎に算出してもよい。

ＰＣ２０は、第１の波長λ１と第２の波長λ２の２波長間の色収差Δｃａ２を算出する（図５のステップＳ４４）。ここでは、ＰＣ２０は、ステップＳ４３で算出された波長λ１の光Ｌ１に対する媒質の平均屈折率とステップＳ４３で算出された波長λ２の光Ｌ２に対する媒質の平均屈折率に基づいて波長λ１と波長λ２の間の色収差Δｃａ２を算出する。より詳細には、ＰＣ２０は、ステップＳ１０で設定された初期条件（第１の波長λ１、第２の波長λ２、作動距離ＷＤ、レンズデータなど）とステップＳ４３で算出した波長毎の平均屈折率とから、波長λ１と波長λ２間で生じる色収差を算出する。なお、ステップＳ４４では、ステップＳ４３で光の集光位置までの屈折率を算出済みであるため、ステップＳ２３と同様の方法について色収差を算出することができる。

ＰＣ２０は、第２の波長λ２の光Ｌ２に対して色収差を補正する（図５のステップＳ４５）。ここでは、ＰＣ２０は、レーザ１を制御して、レーザ１に第２の波長λ２の光Ｌ２を出射させる。さらに、ＰＣ２０は、波面変調器２を制御して、光Ｌ２の集光位置を光軸方向に移動させる。より具体的には、ステップＳ４４で算出された色収差Δｃａ２が表わす距離だけ光Ｌ２の集光位置が光軸に沿って光Ｌ１の集光位置に近づく方向に移動するように、波面変調器２は光Ｌ２の波面を変調する。これにより、図７Ｄに示すように、光Ｌ１の集光位置と光Ｌ２の集光位置が試料Ｓの内部で一致し、２波長間の色収差が補正される。

ＰＣ２０は、第２の波長λ２の光Ｌ２に生じる球面収差を補正する（図５のステップＳ４６）。ここでは、レーザ１が引き続き第２の波長λ２の光Ｌ２を出射している状態で、利用者がモニタに表示される試料Ｓの画像を見ながら補正環１０を回転させて球面収差を補正する。そして、球面収差が補正された状態での補正環１０の回転角度θ２ｂを、入力装置を用いてＰＣ２０に入力する。

最後に、ＰＣ２０は、現在のＺ位置（試料Ｓの内部）における顕微鏡システム１００の設定情報を記録し（図５のステップ４７）、移動後のＺ位置における観察前処理を終了する。ここでは、ＰＣ２０は、ステップＳ４１で得られた光Ｌ１に対する補正環１０の回転角度θ１、ステップＳ４６で得られた光Ｌ２に対する補正環１０の回転角度θ２ｂ、及び、ステップＳ４４で算出された色収差Δｃａ２を、試料Ｓに対する対物レンズ９の光軸方向の相対的位置（Ｚ位置）に関連付けて、ＰＣ２０に設けられた記録部に記録する。

移動後のＺ位置における観察前処理が終了すると、ＰＣ２０は、予定されているすべてのＺ位置に移動済みかどうかを判定する（図５のステップＳ５０）。ここでは、ＰＣ２０は、例えば、現在のＺ位置とステップＳ１０で設定された試料の厚さｄ及びピッチΔｚなどに基づいて判定する。すべてのＺ位置に移動済みではないと判定すると、ＰＣ２０は、ステップＳ３０からステップＳ５０までの処理を繰り返す。一方、すべてのＺ位置に移動済みではあると判定すると、ＰＣ２０は、図３に示す観察前処理を終了する。

以上のように、顕微鏡システム１００では、ＰＣ２０が図３に示す観察前処理を実行することで、試料Ｓの表面及び試料Ｓの内部の各位置における、第１の波長λ１と第２の波長λ２の間で生じる色収を補正するための設定が得られる。

図３に示す観察前処理を終了すると、ＰＣ２０は、図６に示す観察処理を開始する。まず、ＰＣ２０は、利用者によって入力された初期条件を取得して設定する（図６のステップＳ６０）。ここでは、初期条件として、観察すべき試料Ｓの面（Ｚ位置）などが設定される。なお、Ｚ位置は複数設定されて良い。

ＰＣ２０は、ステップＳ６０で設定されたＺ位置を移動する（図６のステップＳ７０）。ここでは、ＰＣ２０は、レボルバ８を制御して、試料Ｓに対して対物レンズ９を光軸方向に相対的に移動させることにより、Ｚ位置を移動する。

ＰＣ２０は、Ｚ位置の移動後、そのＺ位置に応じて設定情報を設定する（図６のステップＳ８０）。ここでは、ＰＣ２０は、記録部からＺ位置に応じた設定情報（光Ｌ１、Ｌ２に対する補正環１０の回転角度、光Ｌ１と光Ｌ２の間で生じる色収差）を読み出して、その情報を設定する。

ＰＣ２０は、第１の波長と第２の波長で画像を取得する（図６のステップＳ９０）。ここでは、まず、ＰＣ２０は、ステップＳ８０で設定された光Ｌ１に対する補正環１０の回転角度になるように補正環１０を回転させて、その後、レーザ１に第１の波長λ１の光Ｌ１を出射させて、試料Ｓの画像を取得する。さらに、取得した画像を記録部に記録する。次に、ＰＣ２０は、ステップＳ８０で設定された光Ｌ２に対する補正環１０の回転角度になるように補正環１０を回転させて、ステップＳ８０で設定された色収差を補正するように波面変調器２の変調パターンを設定する。その後、レーザ１に第２の波長λ２の光Ｌ２を出射させて、試料Ｓの画像を取得する。さらに、取得した画像を記録部に記録する。なお、ＰＣ２０が補正環１０の回転を制御する例を示したが、補正環１０は手動で回転させてもよい。

画像の取得が完了すると、ＰＣ２０は、ステップＳ６０で設定したすべてのＺ位置に移動済みか否かを判定する（図６のステップＳ１００）。すべてのＺ位置に移動済みではないと判定すると、ＰＣ２０は、ステップＳ７０からステップＳ１００までの処理を繰り返す。一方、すべてのＺ位置に移動済みではあると判定すると、ＰＣ２０は、図６に示す観察処理を終了する。

本実施例に係る顕微鏡システム１００によれば、試料Ｓの屈折率が未知である場合であっても、各Ｚ位置での波長間に生じる色収差を補正することができる。このため、任意の試料Ｓの内部で異なる２波長の光の集光位置を維持することが可能であり、異なる波長の光で任意の試料Ｓの内部の同じ位置を観察することができる。また、本実施例に係る顕微鏡システム１００によれば、試料Ｓの表面から集光位置までの間の試料Ｓの平均屈折率も得ることができる。

なお、図３から図６では、試料Ｓの観察を開始する前に各Ｚ位置での色収差を一括して算出する方法を示したが、試料Ｓの観察を開始後、Ｚ位置を変更する毎に色収差を算出してその都度色収差を補正しても良い。

また、図３から図６では、第２の波長λ２の光の集光位置を調整することで第１の波長と第２の波長の間で生じる色収差を補正する例を示したが、顕微鏡システム１００は、第１の波長λ１の光の集光位置を調整して色収差を補正しても良い。また、２波長のいずれか一方の波長の光の集光位置を調整する代わりに、両方の波長の光の集光位置を調整して、色収差を補正しても良い。

また、図３から図６では、２波長間で生じる色収差を補正する例を示したが、顕微鏡システム１００は、３波長以上の間で生じる色収差を補正しても良い。この場合、例えば、基準波長に対する色収差を波長毎に算出して、基準波長の光の集光位置に各波長の光の集光位置を一致させてもよい。

また、図３から図６では、Ｚ位置毎に色収差を補正する例を示したが、顕微鏡システム１００は、Ｚ位置毎で、且つ、ガルバノスキャナ４によって制御されるＸＹ位置毎に、色収差を算出して補正してもよい。

図９は、本実施例に係る顕微鏡システム１００で行われる試料Ｓの屈折率測定処理のフローチャートである。以下、図９を参照しながら、試料Ｓの屈折率測定方法について説明する。

屈折率測定処理が開始されると、ＰＣ２０は、利用者によって入力された初期条件を取得して設定する（図９のステップＳ１１０）。ここでは、初期条件として、試料Ｓに照射する光の波長λ、浸液の波長λにおける屈折率ｎ２、使用する対物レンズの情報（作動距離ＷＤ、レンズデータなど）、光軸方向にＺ位置を移動する際のピッチΔｚ、試料の厚さｄなどが設定される。

次に、ＰＣ２０は、波長λの光の集光位置を試料Ｓの表面に合わせる（図９のステップＳ１２０、第１の集光位置移動工程）。ここでは、ＰＣ２０は、図４のステップＳ２１と同様の方法により、集光位置を試料Ｓの表面に合わせる。その後、ＰＣ２０は、ステップＳ１３０からステップＳ１６０までの処理を繰り返す。

まず、ＰＣ２０は、Ｚ位置を移動する（図９のステップＳ１３０、第２の集光位置移動工程）。ここでは、ＰＣ２０は、図４のステップＳ２１と同様の方法により、Ｚ位置を移動する。より具体的には、ＰＣ２０は、ステップＳ１１０で設定されたピッチΔｚだけ対物レンズ９が試料Ｓに近づくように、レボルバ８を制御する。

続いて、ＰＣ２０は、波長λの光に生じる試料Ｓ内部での球面収差を補正する（図９のステップＳ１４０、球面収差補正工程）。ここでは、ＰＣ２０は、レーザ１を制御して、レーザ１に波長λの光を出射させる。そして、レーザ１が波長λの光を出射している状態で、利用者がモニタに表示される試料Ｓの画像を見ながら補正環１０を回転させて球面収差を補正する。そして、球面収差が補正された状態での補正環１０の回転角度θを、入力装置を用いてＰＣ２０に入力する。

続いて、ＰＣ２０は、試料Ｓの表面から対物レンズ９から出射された光の集光位置までの間の試料Ｓの平均屈折率を算出する（図９のステップＳ１５０、屈折率算出工程）。ここでは、ＰＣ２０は、まず、図５のステップＳ４３と同様の方法により、ステップＳ１４０での補正環１０による球面収差の補正量に基づいて、対物レンズ９と集光位置との間の媒質の平均屈折率を算出する（第１の屈折率算出工程）。さらに、ＰＣ２０は、試料Ｓの表面から集光位置までの間の試料Ｓの平均屈折率を、作動距離ＷＤ及びピッチΔｚから算出される対物レンズ９と集光位置の間に占める浸液と試料Ｓの比率、対物レンズ９と集光位置の間の媒質の平均屈折率に基づいて算出する（第２の屈折率算出工程）。

ＰＣ２０は、Ｚ位置移動前後の２つの集光位置の間の試料Ｓの平均屈折率を算出する（図９のステップＳ１６０）。ここでは、ステップＳ１３０でのＺ位置の移動前後にステップＳ１５０で算出された２つの平均屈折率（つまり、試料Ｓの表面からＺ位置移動前の集光位置までの間の試料Ｓの平均屈折率と、試料Ｓの表面からＺ位置移動後の現在の集光位置までの間の試料Ｓの平均屈折率）とピッチΔｚに基づいて、Ｚ位置移動前後の集光位置の間の試料Ｓの平均屈折率を算出する。

ＰＣ２０は、すべてのＺ位置に移動済みか否かを判定する（図６のステップＳ１７０）。ここでは、ＰＣ２０は、例えば、現在のＺ位置とステップＳ１１０で設定された試料の厚さｄ及びピッチΔｚなどに基づいて判定する。すべてのＺ位置に移動済みではないと判定すると、ＰＣ２０は、ステップＳ１３０からステップＳ１７０までの処理を繰り返す。一方、すべてのＺ位置に移動済みではあると判定すると、ＰＣ２０は、図９に示す屈折率測定処理を終了する。

以上の屈折率測定処理により、本実施例に係る顕微鏡システム１００によれば、屈折率が未知である試料Ｓの屈折率の分布を得ることができる。また、ピッチΔｚを小さく取るほど、試料Ｓの屈折率のより詳細な分布を得ることができる。

なお、図９では、試料Ｓのある特定の波長に対する屈折率を測定する例を示したが、顕微鏡システム１００は、波長毎に図９の処理を繰り返して、複数の波長に対する屈折率を測定してもよい。

また、図９では、Ｚ方向の屈折率の分布を算出する例を示したが、顕微鏡システム１００は、Ｚ方向の屈折率の分布に加えて、ガルバノスキャナ４によって制御されるＸＹ方向の屈折率の分布も併せて算出してもよい。

図１０は、本実施例に係る顕微鏡システム１０１の構成を示す図である。図１０に示す顕微鏡システム１０１は、補正環１０の代わりに、デフォーマブルミラー１４、瞳リレー光学系１７及びミラー１８を備えている点が、実施例１に係る顕微鏡システム１００と異なっている。その他の構成は、顕微鏡システム１００と同様である。

デフォーマブルミラー１４は、レーザ光の波面を変調することにより、対物レンズ９と試料Ｓとの間の媒質の屈折率と試料Ｓの屈折率との差に起因する球面収差を補正する球面収差補正手段である。デフォーマブルミラー１４は、対物レンズ９の瞳位置と光学的に共役な位置に配置されている。より具体的には、デフォーマブルミラー１４は、図１０に示すように、瞳リレー光学系１７及びミラー１８によりガルバノスキャナ４の像が投影される位置に配置されている。

本実施例に係る顕微鏡システム１０１によれば、補正環１０の代わりにデフォーマブルミラー１４が球面収差手段として機能することで、実施例１に係る顕微鏡システム１００と同様に、試料Ｓの屈折率が未知である場合であっても、各Ｚ位置での波長間に生じる色収差を補正することができる。このため、任意の試料Ｓの内部で異なる２波長の光の集光位置を維持することが可能であり、異なる波長の光で任意の試料Ｓの内部の同じ位置を観察することができる。また、屈折率が未知である試料Ｓの屈折率の分布を得ることができる点についても、本実施例に係る顕微鏡システム１００と同様である。

図１１は、本実施例に係る顕微鏡システム１０２の構成を示す図である。図１１に示す顕微鏡システム１０２は、補正環１０が省略されている点が、実施例１に係る顕微鏡システム１００と異なっている。その他の構成は、顕微鏡システム１００と同様である。

顕微鏡システム１０２では、波面変調器２は、色収差を補正するとともに球面収差も補正するように、レーザ光の波面を変調する。即ち、波面変調器２には、色収差を補正するための変調パターンと球面収差を補正するための変調パターンを重ね合わせた変調パターンが設定される。

本実施例に係る顕微鏡システム１０２によれば、補正環１０の代わりに波面変調器２が球面収差補正手段として機能することで、実施例１に係る顕微鏡システム１００と同様に、試料Ｓの屈折率が未知である場合であっても、各Ｚ位置での波長間に生じる色収差を補正することができる。このため、任意の試料Ｓの内部で異なる波長の光の集光位置を維持することが可能であり、異なる波長の光で任意の試料Ｓの内部の同じ位置を観察することができる。また、屈折率が未知である試料Ｓの屈折率の分布を得ることができる点についても、本実施例に係る顕微鏡システム１００と同様である。

図１２は、本実施例に係る顕微鏡システム１０３の構成を示す図である。図１２に示す顕微鏡システム１０３は、波面変調器２と補正環１０の代わりに、デフォーマブルミラー１４、瞳リレー光学系１７及びミラー１８を備える点が、実施例１に係る顕微鏡システム１００と異なっている。その他の構成は、顕微鏡システム１００と同様である。

デフォーマブルミラー１４は、レーザ光の波面を変調することによって、対物レンズ９と試料Ｓとの間の媒質の屈折率と試料Ｓの屈折率との差に起因する球面収差を補正する球面収差補正手段である。また、デフォーマブルミラー１４は、レーザ光の波面を変調することによって色収差を補正する色収差補正手段でもある。デフォーマブルミラー１４は、対物レンズ９の瞳位置と光学的に共役な位置に配置されている。より具体的には、デフォーマブルミラー１４は、図１２に示すように、瞳リレー光学系１７及びミラー１８によりガルバノスキャナ４の像が投影される位置に配置されている。

顕微鏡システム１０３では、デフォーマブルミラー１４は、色収差を補正するとともに球面収差も補正するように、レーザ光の波面を変調する。即ち、デフォーマブルミラー１４には、色収差を補正するための変調パターンと球面収差を補正するための変調パターンを重ね合わせた変調パターンが設定される。

本実施例に係る顕微鏡システム１０３によれば、補正環１０の代わりにデフォーマブルミラー１４が球面収差補正手段として機能し、且つ、波面変調器２の代わりにデフォーマブルミラー１４が色収差補正手段として機能することで、実施例１に係る顕微鏡システム１００と同様に、試料Ｓの屈折率が未知である場合であっても、各Ｚ位置での波長間に生じる色収差を補正することができる。このため、任意の試料Ｓの内部で異なる波長の光の集光位置を維持することが可能であり、異なる波長の光で任意の試料Ｓの内部の同じ位置を観察することができる。また、屈折率が未知である試料Ｓの屈折率の分布を得ることができる点についても、本実施例に係る顕微鏡システム１００と同様である。

図１３は、本実施例に係る顕微鏡システム１０４の構成を示す図である。図１３に示す顕微鏡システム１０４は、レーザ１、波面変調器２、及び、ビームエクスパンダ３の代わりに、複数のレーザ（レーザ１ａ、レーザ１ｂ）、複数の波面変調器（波面変調器２ａ、波面変調器２ｂ）、複数のビームエクスパンダ（ビームエクスパンダ３ａ、ビームエクスパンダ３ｂ）、ミラー１５、及び、ダイクロイックミラー１６を備える点が、実施例１に係る顕微鏡システム１００と異なっている。その他の構成は、顕微鏡システム１００と同様である。

本実施例に係る顕微鏡システム１０４では、レーザ１ａから出射されたレーザ光の波面を波面変調器２ａが変調し、レーザ１ｂから出射されたレーザ光の波面を波面変調器２ｂが変調することで、レーザ１ａから出射されたレーザ光とレーザ１ｂから出射されたレーザ光の間で生じる色収差が補正される。

従って、本実施例に係る顕微鏡システム１０４によっても、実施例１に係る顕微鏡システム１００と同様に、試料Ｓの屈折率が未知である場合であっても、各Ｚ位置での波長間に生じる色収差を補正することができる。このため、任意の試料Ｓの内部で異なる波長の光の集光位置を維持することが可能であり、異なる波長の光で任意の試料Ｓの内部の同じ位置を観察することができる。また、屈折率が未知である試料Ｓの屈折率の分布を得ることができる点についても、本実施例に係る顕微鏡システム１００と同様である。

上述した各実施例は、発明の理解を容易にするために具体例を示したものであり、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。これらの実施例に係る顕微鏡システム及び屈折率測定方法は、特許請求の範囲により規定される本発明の思想を逸脱しない範囲において、さまざまな変形、変更が可能である。

例えば、上述した実施例では、顕微鏡システムがいずれも２光子励起顕微鏡を備える例を示したが、顕微鏡システムは、３光子励起顕微鏡のような他の多光子励起顕微鏡を備えても良い。また、試料内部を観察する顕微鏡であればよく、共焦点顕微鏡のような多光子励起顕微鏡以外の顕微鏡を備えても良い。
また、上述した実施例では、走査手段としてガルバノスキャナを採用する例を示したが、レゾナントスキャナを採用しても良い。

１、１ａ、１ｂ レーザ
２、２ａ、２ｂ 波面変調器
３、３ａ、３ｂ ビームエクスパンダ
４ ガルバノスキャナ
５、１７ 瞳リレー光学系
６、１５、１８ ミラー
７、１６ ダイクロイックミラー
８ レボルバ
９ 対物レンズ
１０ 補正環
１１ ステージ
１２ 検出光学系
１３ 検出器
１４ デフォーマブルミラー
２０ ＰＣ
２１ 制御手段
２２ 屈折率算出手段
２３ 色収差算出手段
１００、１０１、１０２、１０３、１０４ 顕微鏡システム
Ｓ 試料
Ｌ１、Ｌ２ 光
Ｐ 瞳

Claims (7)

1. 光源からの光の波面を変調する波面変調手段と、
   前記波面変調手段で波面が変調された光を試料に照射する対物レンズと、
   前記対物レンズと前記試料との間の媒質の屈折率と前記試料の屈折率との差に起因する球面収差を補正する球面収差補正手段と、
   前記光源からの光の波長毎に、前記球面収差補正手段による球面収差の補正量に基づいて、前記対物レンズと前記対物レンズから出射された光の集光位置との間の媒質の平均屈折率を算出する屈折率算出手段と、
   前記屈折率算出手段で算出された波長毎の平均屈折率に基づいて算出される色収差を補正するように、前記波面変調手段を制御する制御手段と、を備える
   ことを特徴とする顕微鏡システム。
2. 請求項１に記載の顕微鏡システムにおいて、さらに、
   前記屈折率算出手段で算出された波長毎の平均屈折率に基づいて、波長間で生じる色収差を算出する色収差算出手段を備え、
   前記制御手段は、前記色収差算出手段で算出された色収差を補正するように、前記波面変調手段を制御する
   ことを特徴とする顕微鏡システム。
3. 請求項１または請求項２に記載の顕微鏡システムにおいて、さらに、
   前記試料に対して前記対物レンズを前記光軸方向に相対的に移動させて、前記対物レンズから出射された光の集光位置を変更するＺ走査手段を備え、
   前記屈折率算出手段は、前記Ｚ走査手段により変更される前記集光位置毎で且つ前記光源からの光の波長毎に、前記球面収差補正手段による球面収差の補正量に基づいて、前記対物レンズと前記対物レンズから出射された光の集光位置の間の媒質の平均屈折率を算出する
   ことを特徴とする顕微鏡システム。
4. 請求項１乃至請求項３のいずれか１項に記載の顕微鏡システムにおいて、
   前記波面変調手段は、前記制御手段による制御下で、２波長のいずれか一方の波長の光の集光位置が、前記対物レンズの光軸方向に前記屈折率算出手段で算出された前記２波長間で生じる色収差が表わす距離だけ移動するように、当該一方の波長の光の波面を変調する
   ことを特徴とする顕微鏡システム。
5. 請求項１乃至請求項４のいずれか１項に記載の顕微鏡システムにおいて、
   前記対物レンズは、前記球面収差補正手段である補正環を備える
   ことを特徴とする顕微鏡システム。
6. 請求項１乃至請求項５のいずれか１項に記載の顕微鏡システムにおいて、さらに、
   前記対物レンズと、前記波面変調手段と、前記球面収差補正手段とを備えた多光子励起顕微鏡を含む
   ことを特徴とする顕微鏡システム。
7. 顕微鏡システムによる試料の屈折率測定方法であって、
   前記試料に対して前記対物レンズを光軸方向に相対的に移動させて、前記顕微鏡システムの対物レンズから出射される光の集光位置を前記試料の表面に一致させる第１の集光位置移動工程と、
   前記試料に対して前記対物レンズを前記光軸方向に相対的に移動させて、前記対物レンズから出射される光の集光位置を前記試料の内部に移動させる第２の集光位置移動工程と、
   前記試料の内部での球面収差を補正する球面収差補正工程と、
   前記球面収差補正工程での球面収差の補正量に基づいて、前記試料の表面と前記試料の内部の前記集光位置との間の前記試料の屈折率を算出する屈折率算出工程と、を備え、
   前記屈折率算出工程は、
   前記球面収差補正工程での球面収差の補正量に基づいて、前記対物レンズと前記試料の内部の前記集光位置までの媒質の平均屈折率を算出する第１の屈折率算出工程と、
   前記対物レンズの作動距離と、前記第２の集光位置移動工程での集光位置の移動量と、前記第１の屈折率算出工程で算出された前記平均屈折率と、前記対物レンズと前記試料の表面との間の媒質の屈折率とに基づいて、前記試料の表面と前記試料の内部の前記集光位置との間の前記試料の屈折率を算出する第２の屈折率算出工程と、を備える
   ことを特徴とする試料の屈折率測定方法。