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CN107490562A - 利用波面整形器的超高速三维折射率影像拍摄和荧光结构光照明显微镜系统及其使用方法 - Google Patents

利用波面整形器的超高速三维折射率影像拍摄和荧光结构光照明显微镜系统及其使用方法 Download PDF

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CN107490562A CN201610712730.3A CN201610712730A CN107490562A CN 107490562 A CN107490562 A CN 107490562A CN 201610712730 A CN201610712730 A CN 201610712730A CN 107490562 A CN107490562 A CN 107490562A
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Abstract

揭示了一种利用波面整形器的超高速三维折射率影像拍摄和荧光结构光照明显微镜系统及其使用方法。利用波面整形器的超高速三维折射率影像拍摄和荧光结构光照明显微镜系统的使用方法，包括如下步骤：利用波面整形器，调整入射到样本的平面波的照射角度；测定通过基于所述平面波的照射角度的所述样本的二维光场；和基于测定的所述二维光场信息，利用光衍射断层拍摄法或滤波反投影算法获取三维折射率影像。

Description

利用波面整形器的超高速三维折射率影像拍摄和荧光结构光 照明显微镜系统及其使用方法
技术领域
下述的实施例涉及一种利用波面整形器的超高速三维折射率影像拍摄和荧光结构光照明显微镜系统及其使用方法，更详细来讲，涉及一种利用单一波面整形器同时测定细胞的三维高分辨率荧光图像和三维折射率立体影像的技术。
背景技术
当前用于光学测定细胞内部结构的方法有在细胞内部的特定结构发现荧光蛋白质进而测定荧光信号的荧光图像方法和测定细胞内部的三维折射率分布的三维折射率断层拍摄法。
无需荧光蛋白质的标记，通过测定与入射的波面相关的细胞的反应而测定细胞内部的三维折射率分布的三维折射率断层拍摄法正被使用。测定的折射率值由于与细胞内主要构成成分即蛋白质的浓度成线性比例，因此从测定的细胞内部的三维折射率分布中不仅可获取细胞内的结构特性，而且可获取如蛋白质浓度的分布之生物化学特性。并且由于不使用荧光蛋白质的标记，因此可适用于非浸润性存活细胞，且由于不发生光漂白(photobleaching)，因此可长时间测定细胞的反应。
为了测定这种细胞的三维折射率图像，公开了利用多种类型的波面整形器的三维折射率断层[非专利文献1]。使相干光源(coherent light source)发出的光入射在细胞，且利用这种在细胞中衍射的透射光经由干涉仪来测定全息图(hologram)。
此时，利用波面整形器，旋转入射在细胞的角度，同时测定多张二维全息图，通过算法分析测定的全息图信息，可测定细胞的三维折射率分布。
近来，利用波面整形器中的一个即数字微镜器件(Digital Micro mirrorDevice)可进行超高速三维光断层拍摄[非专利文献2]。
但，为了细胞的荧光图像，在细胞的特定构成(分子)发现或粘附荧光蛋白质或染料。若在如此发现的荧光物质入射激发光源(excitation light source)，荧光蛋白质在吸收其后，按其他波长发出荧光信号。通过该荧光信号识别细胞内部特定结构的图像进继而进行测定。
近来，作为增加这种荧光图像的分辨率(resolution)的方法，开始使用结构光照明显微镜技术。结构光照明显微镜技术是一种使激发光源按特定图案入射，测定光学可测定范围外的信号，从而获取超出衍射界限值的超高分辨率的图像的方法。
开始，结构光照明显微镜技术通过使衍射光栅通过来制作图案而获取图像[非专利文献3]。结构光照明显微镜技术通过使光栅格旋转和平行移动在多种图案中测定图像，且在这种低分辨率图像中通过算法获取高分辨率的图像。之后，通过波面整形器经由图案模样控制可以更容易地获取高分辨率的图像。
并且，最近通过非线性结构光照明显微镜技术(nonlinear structuredillumination microscopy)能更好地形成分辨率[非专利文献4]。但，荧光图像之情形，存在下述缺点：为了发现荧光蛋白质，对细胞进行染色的过程是浸润的，且若长时间测定荧光图像，会发生光漂白，从而不能再进行测定。
[现有技术文献]
[非专利文献]
1.Wolf,E.(1969)."Three-dimensional structure determination of semi-transparent objects from holographic data."Optics Communications1(4):153-156.
2.Shin,S.,et al.(2015)."Active illumination using a digitalmicromirror device for quantitative phase imaging."Optics letters 40(22):5407-5410.
3.Gustafsson,M.G.(2000)."Surpassing the lateral resolution limit by afactor of two using structured illumination microscopy."Journal of microscopy198(2):82-87.
4.Gustafsson,M.G.(2005)."Nonlinear structured-illuminationmicroscopy:wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimitedresolution."Proceedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America 102(37):13081-13086.
5.Lee,W.-H.(1979)."Binary computer-generated holograms."AppliedOptics 18(21):3661-3669.
发明内容
实施例涉及一种利用波面整形器的超高速三维折射率影像拍摄和荧光结构光照明显微镜系统及其使用方法的技术，更具体来讲，提供一种利用单一波面整形器同时测定细胞的三维高分辨率荧光图像和三维折射率立体影像的技术。
实施例提供一种利用波面整形器的超高速三维折射率影像拍摄和荧光结构光照明显微镜系统及其使用方法，可光学测定存活的细胞和组织内部的三维折射率分布且能同时识别根据荧光蛋白质标记的特定内部结构。
根据一个实施例的利用波面整形器的超高速三维折射率影像拍摄和荧光结构光照明显微镜系统的使用方法，包括如下步骤：利用波面整形器，调整入射到样本的平面波的照射角度；测定通过基于所述平面波的照射角度的所述样本的二维光场；和基于测定的所述二维光场信息，利用光衍射断层拍摄法或滤波反投影算法获取三维折射率影像。
进一步包括如下步骤：控制所述平面波的波面的位相和图案，获取三维高分辨率荧光图像，其中，利用所述波面整形器同时测定所述样本的所述三维高分辨率荧光图像和所述三维折射率立体影像。
所述利用波面整形器调整入射到样本的平面波的照射角度的步骤，为了控制入射到所述样本的所述平面波的进行角度，变更显示在数字微镜器件上的图案，进而形成各种进行角度的平面波。
所述利用波面整形器调整入射到样本的平面波的照射角度的步骤，包括如下步骤：调整所述平面波的照射角度进而使衍射光入射到所述样本，并且屏蔽余下的光从而控制一个平面波的进行方向；和调整数字微镜器件的图案，获取希望的位相信息。
所述调整所述平面波的照射角度进而使衍射光入射到所述样本，并且屏蔽余下的光从而控制一个平面波的进行方向的步骤，利用空间滤波器，在依据所述数字微镜器件的衍射光中仅使用一个特定衍射光。
所述测定通过基于所述平面波的照射角度的所述样本的二维光场的步骤，制作通过所述样本的二维光场和参考波的干涉仪，并且多样化地变换所述平面波的照射角度，测定所述二维光场。
所述控制所述平面波的波面的位相和图案获取三维高分辨率荧光图像的步骤，包括如下步骤：按特定图案入射所述平面波，并且调整构成图案的所述平面波间的位相；调整所述位相，根据控制的图案获取荧光图像；和针对多个所述荧光图像，通过算法重组高分辨率的二维荧光图像，获取三维高分辨率荧光图像。
所述控制所述平面波的波面的位相和图案获取三维高分辨率荧光图像的步骤，通过数字微镜器件的图案可调整角度和位相，根据用于光场识别的N个图案和用于方位角扫描的M个图案，形成N*M个图案。
产生所述平面波的光源，利用低干涉性光，沿z轴仅区分特定部分而进行测定。
所述控制所述平面波的波面的位相和图案获取三维高分辨率荧光图像的步骤，沿z轴移动台或聚光透镜而测定所述样本的z轴的各部分，获取所述三维超高分辨率荧光图像。
根据另一实施例的一种利用波面整形器的超高速三维折射率影像拍摄和荧光结构光照明显微镜系统，包括：调制部，利用波面整形器，调整入射到样本的平面波的照射角度；干涉仪，测定通过基于所述平面波的照射角度的所述样本的二维光场；和折射率影像部，基于测定的所述二维光场信息，利用光衍射断层拍摄法或滤波反投影算法获取三维折射率影像。
进一步包括：荧光图像部，控制所述平面波的波面的位相和图案，获取三维高分辨率荧光图像，其中，利用所述波面整形器同时测定所述样本的所述三维高分辨率荧光图像和所述三维折射率立体影像。
所述调制部，调整所述平面波的照射角度进而使衍射光入射到所述样本，并且屏蔽余下的光从而控制一个平面波的进行方向，且调整数字微镜器件的图案，获取希望的位相信息。
所述调制部，利用空间滤波器，在依据所述数字微镜器件的衍射光中仅使用一个特定衍射光。
所述干涉仪，制作通过所述样本的二维光场和参考波的干涉仪，并且多样化地变换所述平面波的照射角度，测定所述二维光场。
所述荧光图像部，按特定图案入射所述平面波，并且调整构成图案的所述平面波间的位相，根据控制的图案获取荧光图像，并且针对多个所述荧光图像，通过算法重组高分辨率的二维荧光图像，获取三维高分辨率荧光图像。
根据实施例，提供一种利用波面整形器的超高速三维折射率影像拍摄和荧光结构光照明显微镜系统及其使用方法，可利用单一波面整形器同时测定细胞的三维高分辨率荧光图像和三维折射率立体影像。
根据实施例，提供一种利用波面整形器的超高速三维折射率影像拍摄和荧光结构光照明显微镜系统及其使用方法，可光学测定存活的细胞和组织内部的三维折射率分布且能同时识别根据荧光蛋白质标记的特定内部结构。
附图说明
图1是用于说明根据一个实施例的利用波面整形器的超高速三维折射率影像拍摄和荧光结构光照明显微镜系统的示图。
图2是用于说明根据一个实施例的平面波的相对位相差异的示图。
图3是用于说明根据一个实施例的空间频率调整的示图。
图4是用于说明根据一个实施例的三维超高分辨率荧光图像获取方法的示图。
图5是示出根据一个实施例的利用波面整形器的超高速三维折射率影像拍摄和荧光结构光照明显微镜系统的框图。
图6是示出根据一个实施例的利用波面整形器的超高速三维折射率影像拍摄和荧光结构光照明显微镜系统的使用方法的流程图。
具体实施方式
以下，参考附图对实施例进行详细说明。但记载的实施例可按各种其他形式进行变形，且本发明的范围并不被下述说明的实施例所限定。并且，各种实施例是为了向该技术领域具有通常知识的人更全面说明本发明而提供的。附图中要素的形状和大小等为了更明确的说明可被夸张显示。
三维度地把握存活的细胞内部的结构且实时测定结构的变化是一种对生物学、病理学研究做出很大贡献的技术。
下述实施例利用波面整形器(Wavefront Shaper)揭示了一种能全部实现三维折射率断层拍摄技术(3D Refractive Index Tomogram)和三维结构光照明显微镜技术(Structured Illumination Microscopy)的系统和方法。
实施例提供一种利用单一波面整形器能同时测定细胞的三维高分辨率荧光图像和三维折射率立体影像的技术，更具体来讲，提供一种利用波面整形器的超高速三维折射率影像拍摄和荧光结构光照明显微镜系统及其使用方法，可光学测定存活的细胞和组织内部的三维折射率分布且能同时识别根据荧光蛋白质标记的特定内部结构。
图1是用于说明根据一个实施例的利用波面整形器的超高速三维折射率影像拍摄和荧光结构光照明显微镜系统的示图。
参考图1，可示出一种利用波面整形器通过照射波面整形方法测定三维高分辨率荧光图像和三维折射率分布的一种系统。
在三维折射率断层拍摄法中为了获取折射率分布需要根据任意的多种角度的平面波的样本图像。并且，为了结构光照明显微镜技术，必须要能控制入射波面的位相和图案。
当利用波面整形器时，不仅可调整平面波的入射角度，而且也能控制平面波波面的位相和图案。因此，利用波面整形器能获取三维高分辨率荧光图像和三维折射率分布图像两种图像。
根据一个实施例的利用波面整形器的超高速三维折射率影像拍摄和荧光结构光照明显微镜系统包括调制部、干涉仪、折射率影像部和荧光图像部。
例如，调制部包括波面整形器110、镜筒透镜(tube lens)120和聚光透镜130。并且，根据实施例的调制部还可包括空间滤波器(spatial filter)。
波面整形器110例如可是数字微镜器件。即，数字微镜器件作为波面整形器可具备包括多个微镜的排列。
镜筒透镜120和聚光透镜130放大平面波进行角度可入射至样本。
在此，样本(sample)作为表示要测定的对象，可是细胞、细菌或微生物等，且也可是包括细胞等的对象物。
并且，干涉仪根据至少一个入射光可测定通过样本的二维光场(optical field)。
折射率影像部通过测定的二维光场的信息可获取三维折射率影像。
荧光图像部控制平面波的波面的位相和图案，从而可获取三维高分辨率荧光图像。
据此，利用波面整形器可同时测定样本的三维高分辨率荧光图像和三维折射率立体影像。
下述，针对根据一个实施例的利用波面整形器的超高速三维折射率影像拍摄和荧光结构光照明显微镜系统进行更具体的说明。
首先，为了获取三维折射率断层拍摄图像，利用Lee Hologram[非专利文献]方法通过波面整形器可调整入射平面波的照射角度。为了控制入射的平面波的进行角度，可适当变更显示在数字微镜器件上的Lee hologram图案。
更具体来讲，为了按数字微镜器件形成多种进行角度的平面波，可向数字微镜器件输入如下述数学式的Lee hologram图案。
[数学式1]
在此，u,v是按空间频率通过数字微镜器件中的像素而调整的值，且φ表示平面波的相对位相差异。
其中在第二个式中，仅与三个项中第二个项相对应的衍射光入射到样本，且若屏蔽余下的，则可控制一个平面波的进行方向。
若将光轴定为z轴且将要表现的具有波长λ的激光平面波的x轴、y轴方向角度分别定为θx，θy，与此相对应的波面的位相信息可按下述数学式进行表示。
[数学式2]
因此，在数学式1中若调整数字微镜器件的图案，利用数学式2，则可获取希望的位相信息。此时，为了使用一个反射光，通过空间过滤器在根据数字微镜器件的衍射光中可仅使用一个特定衍射光。
制作通过样本的二维光场和参考波(reference beam)的干涉仪，且多样化地变换平面波的照射角度可测定光场。基于如此测定的二维光场信息，利用光衍射断层拍摄法(optical diffraction tomography)或滤波反投影算法(filtered back projectionalgorithm)可获取三维折射率影像。
接着，为了获取超高分辨率的荧光图像，利用结构光照明显微镜技术。
在结构光照明显微镜技术中为了获取超高分辨率图像，必须要能调整构成入射特定图案之图案的平面波间的位相。
作为一个示例，可按下述数学式显示正弦波形状的图案(sinusoidal pattern)。
[数学式3]
在此，u,v是按空间频率通过如前所述数字微镜器件中的像素而调整的值，且φ作为平面波的相对位相差异通过数字微镜器件的图案的形状可进行调整。
图2是用于说明根据一个实施例的平面波的相对位相差异的示图。参考图2，平面波的相对位相差异φ通过数字微镜器件的图案的形状可进行调整。
在三维折射率断层拍摄法中，虽然仅使用了数学式1或数学式3的三个项中第二个项，但在结构光照明技术中可使用数学式中全部三项。
此时，为了识别与构成入射的正弦波形状的图案的三项分别相关的光场，利用位相变换方法(phase shifting method)，且必须按三步以上的其他值控制相对位相差异。
并且，参考图3，为了维持分辨率的方位角对称(azimuthal symmetry)，调整空间频率，转变正弦波形状的图案的方向且针对多个方位角φ可进行测定。
即，根据用于光场识别的N个图案、用于方位角扫描(azimuthal angle scanning)的M个图案，共需要N*M个图案。需要的图案通过数字微镜器件的图案可调整角度和位相。
此时，位相φ若将数字微镜的像素数作为Λ，则可按的步骤进行调整。参考图4，根据控制的图案获取荧光图像，且通过这种图像可重组超高分辨率的二次荧光图像。
并且，若光源使用低干涉性光，沿z轴仅识别特定部分而被测定，且若沿z轴移动台或聚光透镜(condenser lens)而测定样本440的z轴的各部分，可获取三维超高分辨率荧光图像。另外，如图1所述，调制部可包括波面整形器410、镜筒透镜(tube lens)420和聚光透镜430。并且，根据实施例的调制部还可包括空间滤波器(spatial filter)。
针对这种获取三维折射率影像拍摄影像和三维高分辨率荧光图像的系统和方法如下将进行更具体的说明。
图5是示出根据一个实施例的利用波面整形器的超高速三维折射率影像拍摄和荧光结构光照明显微镜系统的框图。
参考图5，根据一个实施例的利用波面整形器的超高速三维折射率影像拍摄和荧光结构光照明显微镜系统500包括调制部510、干涉仪520和折射率影像部530。根据一个实施例的利用波面整形器的超高速三维折射率影像拍摄和荧光结构光照明显微镜系统500还可包括荧光图像部540。
调制部510利用波面整形器可调整入射到样本的平面波的照射角度。
更具体来讲，调制部510利用波面整形器变更入射光的照射角度和波面图案中的至少一个进而可入射到样本。在此，波面整形器可使用能控制光的位相的设备或能控制位相的固定状态的胶片(film)。例如，波面整形器可包括能按超高速控制波面的数字微镜器件。数字微镜器件作为波面整形器可具备包括多个微镜的排列。
即，调制部510为了控制入射到样本的平面波的进行角度，变更显示在数字微镜器件上的图案，进而可形成各种进行角度的平面波。
并且，调制部510调整平面波的照射角度进而使衍射光入射到样本且屏蔽余下的光从而控制一个平面波的进行方向，且可调整数字微镜器件的图案以获取希望的位相信息。
此时，调制部510利用空间滤波器在依据数字微镜器件的衍射光中可仅使用一个特定衍射光。
另外，产生平面波的光源利用低干涉性光沿z轴仅区分特定部分从而进行测定。
例如，调制部510可包括数字微镜器件、镜筒透镜(tube lens)和聚光透镜。并且，根据实施例的调制部510还可包括空间滤波器(spatial filter)。
干涉仪520在至少一个的入射光中抽取干涉信号，根据至少一个入射光可测定通过样本的二维光场。
即，干涉仪520可测定通过基于平面波的照射角度的样本的二维光场。
干涉仪520制作通过样本的二维光场和参考波的干涉仪，且多样化变更平面波的照射角度可测定二维光场。
折射率影像部530通过测定的二维光场的信息获取三维折射率影像，能高速精密地测定三维折射率。
更具体来讲，折射率影像部530基于如此测定的二维光场信息，利用光衍射断层拍摄法(optical diffraction tomography)或滤波反投影算法(filtered back projectionalgorithm)可获取三维折射率影像。
荧光图像部540控制平面波的波面的位相和图案，从而可获取三维高分辨率荧光图像。据此，利用波面整形器可同时测定样本的三维高分辨率荧光图像和三维折射率立体影像。
更具体来讲，荧光图像部540按特定图案入射平面波且调整构成图案的平面波间的位相，根据控制的图案获取荧光图像，且针对多个荧光图像，通过算法重组高分辨率的二维荧光图像从而可获取三维高分辨率荧光图像。
这种荧光图像部540通过数字微镜器件的图案可调整角度和位相，根据用于光场识别的N个图案和用于方位角扫描(azimuthal angle scanning)的M个图案，可形成N*M个图案。
荧光图像部540沿z轴移动台或聚光透镜(condenser lens)而测定样本的z轴的各部分，可获取三维超高分辨率荧光图像。
根据实施例，提供一种利用波面整形器的超高速三维折射率影像拍摄和荧光结构光照明显微镜系统及其使用方法，可光学测定存活的细胞和组织内部的三维折射率分布且能同时识别根据荧光蛋白质标记的特定内部结构。
图6是示出根据一个实施例的利用波面整形器的超高速三维折射率影像拍摄和荧光结构光照明显微镜系统的使用方法的流程图。
根据一个实施例的一种利用波面整形器的超高速三维折射率影像拍摄和荧光结构光照明显微镜系统的使用方法，包括：步骤610，利用波面整形器调整入射到样本的平面波的照射角度；步骤620，测定通过根据平面波的照射角度的样本的二次光场；和步骤630，基于测定的二维光场信息，利用光衍射断层拍摄法(optical diffraction tomography)或滤波反投影算法(filtered back projection algorithm)获取三维折射率影像。
并且，还可包括步骤640，控制平面波的波面的位相和图案，获取三维高分辨率荧光图像。
据此，利用波面整形器可同时测定样本的三维高分辨率荧光图像和三维折射率立体影像。
下述，针对根据一个实施例的利用波面整形器的超高速三维折射率影像拍摄和荧光结构光照明显微镜系统的使用方法进行更具体的说明。
根据一个实施例的利用波面整形器的超高速三维折射率影像拍摄和荧光结构光照明显微镜系统的使用方法利用根据图5所述的一个实施例的利用波面整形器的超高速三维折射率影像拍摄和荧光结构光照明显微镜系统进行更具体地说明。
根据一个实施例的利用波面整形器的超高速三维折射率影像拍摄和荧光结构光照明显微镜系统500包括调制部510、干涉仪520和折射率影像部530。根据一个实施例的利用波面整形器的超高速三维折射率影像拍摄和荧光结构光照明显微镜系统500还可包括荧光图像部540。
在步骤610中，调制部510利用波面整形器可调整入射到样本的平面波的照射角度。
例如，波面整形器可利用数字微镜器件等。即，调制部510为了控制入射到样本的平面波的进行角度，变更显示在数字微镜器件上的图案，进而可形成各种进行角度的平面波。
并且，调制部510调整平面波的照射角度进而使衍射光入射到样本且屏蔽余下的光从而控制一个平面波的进行方向，且可调整数字微镜器件的图案以获取希望的位相信息。
此时，调制部510利用空间滤波器在依据数字微镜器件的衍射光中可仅使用一个特定衍射光。
在步骤620中，干涉仪520可测定通过基于平面波的照射角度的样本的二维光场。
更具体来讲，干涉仪520制作通过样本的二维光场和参考波的干涉仪，且多样化变更平面波的照射角度可测定二维光场。
在步骤630中，折射率影像部530基于如此测定的二维光场信息，利用光衍射断层拍摄法(optical diffraction tomography)或滤波反投影算法(filtered backprojection algorithm)可获取三维折射率影像。
在步骤640中，荧光图像部540控制平面波的波面的位相和图案，从而可获取三维高分辨率荧光图像。据此，利用波面整形器可同时测定样本的三维高分辨率荧光图像和三维折射率立体影像。
更具体来讲，荧光图像部540按特定图案入射平面波且调整构成图案的平面波间的位相，根据控制的图案获取荧光图像，且针对多个荧光图像，通过算法重组高分辨率的二维荧光图像从而可获取三维高分辨率荧光图像。
这种荧光图像部540通过数字微镜器件的图案可调整角度和位相，根据用于光场识别的N个图案和用于方位角扫描(azimuthal angle scanning)的M个图案，可形成N*M个图案。
另外，产生平面波的光源利用低干涉性光沿z轴仅区分特定部分从而进行测定。
也就是说，荧光图像部540利用光栅格或波面整形器的种类的一个即数字微镜器件，利用图案话的低干涉性光和z轴移动台，通过光学区间测定，可获取三维的荧光图像。
荧光图像部540沿z轴移动台或聚光透镜(condenser lens)而测定样本的z轴的各部分，可获取三维超高分辨率荧光图像。
根据实施例，在一个系统中可全部测定存活细胞的三维超高分辨率影像图像和三维折射率分布图像。利用该技术，通过细胞内部的三维蛋白质分布和三维超高分辨率荧光图像，可识别标记的特定结构从而进行测定。
并且，也可长时间测定细胞内部结构从而测定基于时间的结构和生化性变化。本发明揭示的技术可对细胞水准的生物学和病理学研究起到很大贡献。
如上所述，虽然根据实施例所限定的实施例和附图进行了说明，但对本技术领域具有一般知识的技术人员来说能从上述的记载中进行各种修改和变形。例如，根据与说明的技术中所说明的方法相不同的顺序来进行，和/或根据与说明的系统、结构、装置、电路等构成要素所说明的方法相不同的形态进行结合或组合，或根据其他构成要素或均等物进行替换或置换也可达成适当的效果。
因此，其他具体体现、其他实施例以及与权利要求范围相均等的都属于所述的权利要求所保护的范围。

Claims (16)

1.一种利用波面整形器的超高速三维折射率影像拍摄和荧光结构光照明显微镜系统的使用方法，包括如下步骤：
利用波面整形器，调整入射到样本的平面波的照射角度；
测定通过基于所述平面波的照射角度的所述样本的二维光场；和
基于测定的所述二维光场信息，利用光衍射断层拍摄法或滤波反投影算法获取三维折射率影像。
2.如权利要求1所述的利用波面整形器的超高速三维折射率影像拍摄和荧光结构光照明显微镜系统的使用方法，其特征在于，进一步包括如下步骤：
控制所述平面波的波面的位相和图案，获取三维高分辨率荧光图像，
其中，利用所述波面整形器同时测定所述样本的所述三维高分辨率荧光图像和所述三维折射率立体影像。
3.如权利要求1所述的利用波面整形器的超高速三维折射率影像拍摄和荧光结构光照明显微镜系统的使用方法，其特征在于，所述利用波面整形器调整入射到样本的平面波的照射角度的步骤，
为了控制入射到所述样本的所述平面波的进行角度，变更显示在数字微镜器件上的图案，进而形成各种进行角度的平面波。
4.如权利要求1所述的利用波面整形器的超高速三维折射率影像拍摄和荧光结构光照明显微镜系统的使用方法，其特征在于，所述利用波面整形器调整入射到样本的平面波的照射角度的步骤，包括如下步骤：
调整所述平面波的照射角度进而使衍射光入射到所述样本，并且屏蔽余下的光从而控制一个平面波的进行方向；和
调整数字微镜器件的图案，获取希望的位相信息。
5.如权利要求4所述的利用波面整形器的超高速三维折射率影像拍摄和荧光结构光照明显微镜系统的使用方法，其特征在于，所述调整所述平面波的照射角度进而使衍射光入射到所述样本，并且屏蔽余下的光从而控制一个平面波的进行方向的步骤，
利用空间滤波器，在依据所述数字微镜器件的衍射光中仅使用一个特定衍射光。
6.如权利要求1所述的利用波面整形器的超高速三维折射率影像拍摄和荧光结构光照明显微镜系统的使用方法，所述测定通过基于所述平面波的照射角度的所述样本的二维光场的步骤，
制作通过所述样本的二维光场和参考波的干涉仪，并且多样化地变换所述平面波的照射角度，测定所述二维光场。
7.如权利要求2所述的利用波面整形器的超高速三维折射率影像拍摄和荧光结构光照明显微镜系统的使用方法，其特征在于，所述控制所述平面波的波面的位相和图案获取三维高分辨率荧光图像的步骤，包括如下步骤：
按特定图案入射所述平面波，并且调整构成图案的所述平面波间的位相；
调整所述位相，根据控制的图案获取荧光图像；和
针对多个所述荧光图像，通过算法重组高分辨率的二维荧光图像，获取三维高分辨率荧光图像。
8.如权利要求2所述的利用波面整形器的超高速三维折射率影像拍摄和荧光结构光照明显微镜系统的使用方法，其特征在于，所述控制所述平面波的波面的位相和图案获取三维高分辨率荧光图像的步骤，
通过数字微镜器件的图案可调整角度和位相，根据用于光场识别的N个图案和用于方位角扫描的M个图案，形成N*M个图案。
9.如权利要求1所述的利用波面整形器的超高速三维折射率影像拍摄和荧光结构光照明显微镜系统的使用方法，其特征在于，产生所述平面波的光源，利用低干涉性光，沿z轴仅区分特定部分而进行测定。
10.如权利要求2所述的利用波面整形器的超高速三维折射率影像拍摄和荧光结构光照明显微镜系统的使用方法，其特征在于，所述控制所述平面波的波面的位相和图案获取三维高分辨率荧光图像的步骤，
沿z轴移动台或聚光透镜而测定所述样本的z轴的各部分，获取所述三维超高分辨率荧光图像。
11.一种利用波面整形器的超高速三维折射率影像拍摄和荧光结构光照明显微镜系统，包括：
调制部，利用波面整形器，调整入射到样本的平面波的照射角度；
干涉仪，测定通过基于所述平面波的照射角度的所述样本的二维光场；和
折射率影像部，基于测定的所述二维光场信息，利用光衍射断层拍摄法或滤波反投影算法获取三维折射率影像。
12.如权利要求11所述的利用波面整形器的超高速三维折射率影像拍摄和荧光结构光照明显微镜系统，其特征在于，进一步包括：
荧光图像部，控制所述平面波的波面的位相和图案，获取三维高分辨率荧光图像，
其中，利用所述波面整形器同时测定所述样本的所述三维高分辨率荧光图像和所述三维折射率立体影像。
13.如权利要求11所述的利用波面整形器的超高速三维折射率影像拍摄和荧光结构光照明显微镜系统，其特征在于，所述调制部，调整所述平面波的照射角度进而使衍射光入射到所述样本，并且屏蔽余下的光从而控制一个平面波的进行方向，且调整数字微镜器件的图案，获取希望的位相信息。
14.如权利要求13所述的利用波面整形器的超高速三维折射率影像拍摄和荧光结构光照明显微镜系统，其特征在于，所述调制部，利用空间滤波器，在依据所述数字微镜器件的衍射光中仅使用一个特定衍射光。
15.如权利要求11所述的利用波面整形器的超高速三维折射率影像拍摄和荧光结构光照明显微镜系统，其特征在于，所述干涉仪，制作通过所述样本的二维光场和参考波的干涉仪，并且多样化地变换所述平面波的照射角度，测定所述二维光场。
16.如权利要求12所述的利用波面整形器的超高速三维折射率影像拍摄和荧光结构光照明显微镜系统，其特征在于，所述荧光图像部，按特定图案入射所述平面波，并且调整构成图案的所述平面波间的位相，根据控制的图案获取荧光图像，并且针对多个所述荧光图像，通过算法重组高分辨率的二维荧光图像，获取三维高分辨率荧光图像。
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