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KR101667440B1 - 키메라 항체의 제조를 위한 비-인간 동물의 유전적 조작 - Google Patents

키메라 항체의 제조를 위한 비-인간 동물의 유전적 조작 Download PDF

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KR101667440B1
KR101667440B1 KR1020127025784A KR20127025784A KR101667440B1 KR 101667440 B1 KR101667440 B1 KR 101667440B1 KR 1020127025784 A KR1020127025784 A KR 1020127025784A KR 20127025784 A KR20127025784 A KR 20127025784A KR 101667440 B1 KR101667440 B1 KR 101667440B1
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래리 그린
히로아키 시즈야
Original Assignee
아블렉시스, 엘엘씨
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Publication date
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Abstract

본 발명은 키메라 항체를 인코딩하는 게놈을 갖는 비-인간 세포 및 포유동물 및 형질전환 세포 및 포유동물을 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명의 특정한 관점은 키메라 항체, 인간화된 항체, 약학적 조성물 및 키트를 포함한다. 본 발명의 특정한 관점은 또한 본 발명의 항체를 사용하는 진단 및 치료 방법에 관한 것이다.

Description

키메라 항체의 제조를 위한 비-인간 동물의 유전적 조작{Genetic Engineering of non-human animals for the production of chimeric antibodies}
[관련 연관된 출원에 대한 교차 참조]
본 출원은 35 U.S.C.§119(e) 하에서 2010년 3월 31일 자로 출원된 미국 가특허 출원 제61/318, 690호 및 2010년 7월 2일 자로 출원된 미국 가특허 출원 제61/361,302호의 이익을 주장하며, 이들 두 가출원은 그 전문이 본원에 참조로서 포함된다.
본 발명은 일반적으로 키메라 면역글로불린 쇄(chimeric immunoglobulin chain), 항체 및 비-인간 동물 및 세포, 및 그의 제조에 관한 것이다.
모노클론 항체(mAbs)를 이용한 질환 치료법은 의약에 대변혁을 일으켰고, mAb-계 약물이 암, 자가면역, 염증, 황반 변성, 감염 등의 치료에 현재 이용되고 있다. 그러나, 질환 및 장애의 예방 및 치료에 사용하기 위한 mAb의 생성 및 발견을 위해 이용가능한 기술은 비효율, 충분한 효능의 부재 또는 상실, 특이성의 부재 또는 상실 및 치료학적 mAb에 대한 면역 반응의 유도를 비롯한 심각한 문제점을 가지고 있다. 치료제로서 mAb를 사용하기 위한 첫 번째 시도는 mAb의 마우스 아미노산 조성의 면역원성에 의해 저지되었다. 인간에게 투여하는 경우, 마우스 아미노산 서열은 약물의 효능 및 약물동력학을 극적으로 감소시킬 뿐만 아니라 심각하고 잠재적으로 치명적인 알레르기성 반응을 초래하는 인간 항-마우스 항체(HAMA) 반응을 유도하였다.
mAb 치료제를 만들기 위한 추가적 방법은 인간 불변 영역에 부착된 마우스-유래 가변 도메인을 조합하는 재조합 DNA 기술을 통해 생성된 키메라화된 mAb (cmAb)를 포함한다. 항체를 만드는 다른 방법은 mAb를 시험관 내에서 인간화하여 치료학적 mAb에서 마우스 아미노산 서열의 양을 더욱 감소시키는 것을 포함한다. "완전한-인간(fully human)" 항체를 시험관 내에서 생성하기 위해 개발된 항체-디스플레이 기술은 생체 내 면역 반응 동안 발생하는 자연 항체 성숙 과정을 아직 적절히 모방하지 못하고 있다(문헌[Lonberg, Nat. Biotech. (2005) 23:1117-1125]의 1122-33면 참조). 이들 방법을 이용하여 개발된 mAb는 효능을 감소시키고/시키거나 생명을 위협할 수 있는 면역 반응을 유도할 수 있으며, 이들 과정은 전형적으로 시간 소모적이며 값비싼 공정이다. 또한, 이들 방법에 내재하는 분자적 공정 동안, 친화성의 손실 및 에피토프 이동(shifting)이 발생하여, 효능이 감소되고 특이성에 바람직하지 않은 변화가 도입될 수 있다.
형질전환 마우스는 비활성화된 마우스 면역글로불린(Ig) 유전자좌를 기능적으로 대체하기 위해 인간 항체 전이유전자를 도입하여 완전한 인간 항체를 제조하도록 조작되어 왔다. 그러나, 다수의 이들 형질전환 마우스 모델은 항체 개발 과정에서 중요한 구성요소, 예를 들어 항체 가변 영역이 생성되는 유전자에서의 충분한 다양성, IgD를 만드는 능력 (문헌[Loset et al., J. Immunol., (2004) 172:2925-2934]), 클래스 스위치 재조합(CSR)에 중요한 중요 시스 조절 요소, 또는 완전한 기능적 3' 유전자좌 제어 영역(LCR)(예를 들어, 미국 특허 제7,049,426호; 및 문헌[Pan et al.,Eur. J.Immunol. (2000) 30:1019-1029])이 결여되어 있다. 일부 형질전환 마우스는 통합된 전이유전자로서 효모 인공 염색체 또는 인간 미니유전자좌(miniloci)를 함유한다. 다른 형질전환 마우스는 다양한 빈도의 유사분열 및 감수분열 불안정성을 나타내는 전이염색체를 보유한다. 또한, 이들 형질전환 마우스의 완전한 인간 불변 영역은 야생형 마우스와 비교하여, 다른 내인성 및 트랜스-작용 구성요소들, 예를 들어, 각각 BCR 신호 전달 장치, (Igα 및 Igβ) 및 Fc 수용체(FcR)와 관련된 감소된 활성으로 인해 차선적으로 기능한다.
녹-인(Knock-in) 마우스는 또한 J 유전자 클러스터의 모든 게놈 DNA 다운스트림을 포함하는 완전히-온전한 부분을 가진, 완전히 온전하게 잔존하는 마우스 C 도메인에 부착된 인간 V 도메인으로 구성된 키메라 항체를 생산하도록 유전적으로 조작되었다(참고: 미국 특허 제5,770,429호 및 제6,596,541호 및 미국 특허 출원 공개공보 제07/0061900호). 이들 마우스 유래의 인간 V 영역은 회수되어, 분자 생물학적 방법에 의해 인간 불변 영역 유전자에 부착되고, 재조합 방법에 의해 발현되어 완전한-인간 항체를 제조할 수 있다. 인간 V 영역이 함께 진화된 마우스 C 도메인의 맥락으로부터 제거된 후, 인간 C 영역에 부착되어 완전한 인간 항체를 만드는 경우, 이들 마우스로부터의 항체는 활성, 효능, 용해도 등의 감소 또는 손실을 나타낼 수 있다. 또한, 인간 면역글로불린 람다 유전자좌의 구조 대비 마우스 면역글로불린 람다 유전자좌의 고유하고 상이한 구조 때문에, 그리고 마우스 람다 유전자좌의 내인성 3' 인핸서가 결손될 수 있기 때문에, 기술된 녹-인 접근법은 비능률적으로 기능하는 람다 유전자좌를 양산하는 것으로 기대될 것이다.
진핵, 특히 후생동물, 종으로의 도입용 전이유전자 DNA 작제 방법은 분리된 천연 DNA로부터 만들어진 게놈 라이브러리로부터 분리된 DNA를 활용해왔다. 전이유전자를 위한 최종 목적한 고안으로 클로닝된 천연 DNA를 조작하는 것은 번거롭고, 비능률적이며, 느리고, 오류가 발생하기 쉬우며 게놈 라이브러리에 존재하는 DNA의 이용가능성에 의해 제한되는 재조합 과정을 통하여 전형적으로 달성된다. 일부 예시에서, 그의 게놈 라이브러리는 용이하게 이용가능하지 않지만, 그의 부분적인 게놈 서열 또는 전사체 서열 정보가 이용가능한 유기체, 균주, 또는 그의 특이적 하플로타입으로부터의 전이유전자를 작제하는 것이 바람직하다. 이들 장애는 복합적으로 재구성된 서열을 포함하는 전이유전자 및/또는 상이한 종 또는 상이한 균주 또는 같은 종의 상이한 하플로타입으로부터의 키메라 DNA 서열을 포함하도록 고안된 전이유전자의 생성을 방지한다. 결과적으로, 진핵생물, 특히 후생동물에 대한 고도의 맞춤 전이유전자의 조작이 방지된다.
치료학적 mAb를 개발하는 통상의 방법은, 초기 개발 단계 동안에 선택되었던, 항체의 기능, 예를 들어 용해도, 효능 및 항원 특이성을 변경시킬 수 있다. 게다가, 통상의 방법에 의해 생성된 mAb는 투여시 위험한 면역 반응을 촉발할 가능성을 지니고 있다. 현재의 인간 및 키메라 항체 제조 마우스는, 예를 들어, 유전적 다양성, 시스 조절 요소, 트랜스 액팅 조절 요소, 신호전달 도메인, 유전자 안정성을 적절히 기능하게 하는 적당한 유전자 함량이 결여되어 있다. 면역 반응을 촉발하지 않으면서 항체 생성, 발견, 개발 및 제조 공정을 통해 효능 및 특이성을 보유하는 치료학적 항체의 증진된 생성 및 발견을 위한 방법 및 조성물, 뿐만 아니라 그러한 항체의 제조 방법을 개발하는 것은 유익할 것이다. 일부 전이유전자 조성물은 복합적으로 변형된 DNA 서열을 포함하고 있어 이러한 향상이 구성되고 그들로부터의 산물의 파생이 방지된다. 마우스가 그들의 경제성 및 확립된 활용성으로 인하여 선호되나, 복합 종들에 걸친 넓은 해법이 바람직하다.
본 발명은 이러한 전이유전자를 만들고 도입하며, 마우스에서 적용될 경우, 이러한 전이유전자가 유전적 배경을 향상시키며, 특히 예로, 형질전환 동물에서 개량된 항체를 생성하기 위한 해결책을 제공한다.
본 발명은 비-인간 동물 및 세포, 전이유전자, 항체, 방법, 약학적 조성물을 비롯한 조성물뿐만 아니라, 본원에 개시된 다양한 실시양태의 키트에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 비-인간 동물 및 세포에 의해 제조된 키메라 Ig 쇄 및 항체와 관련된 방법, 조성물 및 키트 및 상기 키메라 항체의 가변 도메인으로부터 조작된 인간 항체 및 그의 단편에 관한 것이다. 본 발명의 특정한 실시양태에서, 비-인간 동물은 포유동물이다.
본 발명의 일 실시양태는 키메라 면역글로불린 쇄를 포함하는 게놈을 포함하는 세포를 제조하는 방법이며, 상기 면역글로불린 쇄가 비-내인성 가변 도메인 및 키메라 불변 영역을 포함하고, 상기 방법이 (1) DNA 작제물(construct)을 인실리코(in silico) 고안하는 단계로서, 여기서 상기 작제물이 하나 이상의 비-내인성 V, (D) 및/또는 J 유전자 분절 및 하나 이상의 비-내인성 불변 영역 유전자 분절을 포함하는 것인 단계; (2) 상기 DNA 작제물을 생산하는 단계; 및 (3) 세포의 게놈으로 상기 작제물을 도입하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다. 특정한 실시양태에서, 비-내인성 가변 도메인은 인간이다. 또 다른 실시양태에서, 키메라 불변 영역은 마우스 불변 도메인 유전자 분절을 포함한다. 일 실시양태에서, 키메라 불변 영역은 2개 이상의 비-내인성 종, 대립유전자 및/또는 하플로타입(haplotype)으로부터 유래된 비-내인성 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된다. 또 다른 실시양태에서, 비-내인성 가변 도메인은 2개 이상의 종, 대립유전자 및/또는 하플로타입으로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된다. 특정한 실시양태에서, 키메라 면역글로불린 쇄는 경쇄(light chain)이다.
특정한 다른 실시양태에서, 키메라 면역글로불린 쇄는 중쇄(heavy chain)이다. 관련된 실시양태에서, 키메라 불변 영역은 비-내인성 CH1 도메인을 포함한다. 다른 관련된 실시양태에서, 본 방법은 제2 DNA 작제물을 인실리코 고안하며, 상기 작제물은 비내인성 면역글로불린 경쇄를 포함하는 단계; 상기 제2 DNA 작제물을 생산하는 단계; 및 세포의 게놈내로 제2 작제물을 도입하는 단계를 추가로 포함한다. 일 실시양태에서, 비-내인성 경쇄는 하나 이상의 인간 Vκ 유전자 분절을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 비-내인성 경쇄는 하나 이상의 인간 Jκ 및 Cκ 유전자 분절을 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 비-내인성 경쇄는 8개 이상의 인간 Vλ 유전자 분절을 포함한다. 관련된 실시양태에서, 비-내인성 경쇄는 7개 이상의 인간 Jλ-Cλ 유전자 분절 쌍을 추가로 포함한다.
일 실시양태는 키메라 면역글로불린 쇄를 포함하는 게놈을 포함하는 비-인간 세포에 관련되며, 여기서 면역글로불린 쇄는 비-내인성 가변 도메인 및 키메라 불변 영역을 포함하고, 여기서 세포는 하기의 단계를 포함하는 방법에 의해 생산된다: (1) DNA 작제물을 인실리코 고안하는 단계로서, 상기 작제물이 하나 이상의 비-내인성 V, (D) 및/또는 J 유전자 분절 및 하나 이상의 비-내인성 불변 영역 유전자 분절을 포함하는 단계; (2) 상기 DNA 작제물을 생산하는 단계; 및 (3) 상기 세포의 게놈으로 작제물을 도입하는 단계. 다른 실시양태는 세포로부터 만들어진 비-인간 동물을 포함한다. 다른 실시양태는 비-인간 동물에 의해 생산된 키메라 면역글로불린 중쇄를 제공한다. 특정한 실시양태는 비-인간 동물에 의해 생산된 키메라 항체를 제공한다.
본 발명의 다른 실시양태는 비-내인성 가변 도메인 및 키메라 불변 영역을 포함하는 키메라 면역글로불린 중쇄를 제공하는데, 여기서 상기 비-내인성 가변 도메인은 비-인간 동물로부터 유래된 것이다. 관련된 실시양태에서, 키메라 불변 영역은 비-내인성 CH1 도메인을 포함한다. 일 실시양태는 비-내인성 가변 도메인 및 키메라 불변 영역을 포함하는 키메라 면역글로불린 중쇄를 제공하는데, 여기서 상기 키메라 불변 영역은 2개 이상의 비-내인성 종, 대립유전자 및/또는 하플로타입으로부터 유래된 비-내인성 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 것이다. 다른 실시양태는 비-내인성 가변 도메인 및 키메라 불변 영역을 포함하는 키메라 면역글로불린 중쇄를 제공하는데, 여기서 상기 비-내인성 가변 도메인은 2개 이상의 종, 대립유전자 및/또는 하플로타입으로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된다.
또 다른 실시양태는 개시된 키메라 면역글로불린 중쇄을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 특정한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 코딩 및 비-코딩 서열을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 합성적인 것이다. 일 실시양태는 개시된 키메라 면역글로불린 중쇄를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 작제물에 관한 것이다 .
본 발명의 다른 실시양태는 (1) 키메라 면역글로불린 중쇄, 및 (2) 비-내인성 면역글로불린 경쇄를 포함하는 키메라 항체, 또는 그의 항원-결합 단편을 제공하는데, 여기서 상기 키메라 중쇄가 비-내인성 중쇄 가변 도메인 및 키메라 중쇄 불변 영역을 포함하고, 여기서 상기 키메라 중쇄 불변 영역이 2개 이상의 비-내인성 종, 대립유전자 및/또는 하플로타입으로부터 유래된다. 다른 실시양태는 (1) 키메라 면역글로불린 중쇄, 및 (2) 비-내인성 면역글로불린 경쇄를 포함하는 키메라 항체, 또는 그의 항원-결합 단편을 제공하는데, 여기서 상기 키메라 중쇄는 비-내인성 중쇄 가변 도메인 및 키메라 중쇄 불변 영역을 포함하고, 여기서 상기 비-내인성 중쇄 가변 도메인은 2개 이상의 종, 대립유전자 및/또는 하플로타입로부터 유래된다. 일 실시양태는 키메라 면역글로불린 중쇄를 포함하는, 키메라 항체, 또는 그의 항원-결합 단편에 관한 것이며, 여기서 상기 키메라 중쇄는 비-내인성 가변 도메인 및 키메라 불변 영역을 포함하며, 여기서 상기 가변 도메인은 비-인간 동물로부터 유래된다. 관련된 실시양태에서, 개시된 키메라 항체, 또는 그의 항원-결합 단편은 비-내인성 경쇄를 추가로 포함한다.
본 발명의 일 실시양태는 비-내인성 가변 도메인 및 키메라 불변 영역을 포함하는 키메라 면역글로불린 중쇄를 포함하는 게놈을 포함하는 비-인간 세포를 제공하는데, 여기서 상기 비-내인성 가변 도메인은 비-인간 동물로부터 유래된다. 관련된 실시양태에서, 세포의 게놈은 비-내인성 면역글로불린 경쇄를 추가로 포함한다. 특정한 실시양태에서, 세포의 게놈은 비-내인성 Igκ경쇄 및 비-내인성 Igλ 경쇄를 포함한다. 특정한 실시양태에서, 세포는 불활성화된 내인성 면역글로불린 유전자좌(locus)를 포함한다. 일 실시양태는 개시된 세포에 의해 생산된 키메라 항체를 제공한다.
또 다른 실시양태는 비-내인성 가변 도메인 및 키메라 불변 영역을 포함하는 키메라 면역글로불린 중쇄를 포함하는 게놈을 포함하는 비-인간 세포를 제공하는데, 여기서 불변 영역은 2개 이상의 비-내인성 종, 대립유전자 및/또는 하플로타입로부터 유래된다. 일 실시양태는 비-내인성 가변 도메인 및 키메라 불변 영역을 포함하는 키메라 면역글로불린 중쇄를 포함하는 게놈을 포함하는 비-인간 세포를 제공하는데, 여기서 상기 비-내인성 가변 도메인은 2개 이상의 종, 대립유전자 및/또는 하플로타입으부터 유래된다. 다른 실시양태는 (1) 키메라 면역글로불린 중쇄를 포함하는, 키메라 항체, 또는 그의 항원-결합 단편을 인코딩하는 합성적 전이유전자를 포함하는 게놈을 포함하는 비-인간 세포를 제공하는데, 여기서 상기 키메라 중쇄는 비-내인성 중쇄 가변 도메인 및 키메라 중쇄 불변 영역을 포함하는 것이다. 특정한 실시양태에서, 개시된 세포의 게놈은 비-내인성 면역글로불린 경쇄를 추가로 포함한다. 일 실시양태에서는, 세포의 게놈은 비-내인성 Igκ경쇄 및 비-내인성 Igλ 경쇄를 포함한다. 특정한 실시양태에서, 세포는 불활성화된 내인성 면역글로불린 유전자좌를 포함한다. 다른 실시양태는 세포에 의해 생산된 키메라 항체를 제공한다.
본 발명의 다른 실시양태는 비-내인성 가변 도메인 및 키메라 불변 영역을 포함하는 키메라 면역글로불린 중쇄를 포함하는 게놈을 포함하는 비-인간 동물에 관한 것이며, 여기서 비-내인성 가변 도메인은 비-인간 동물로부터 유래된다. 관련된 실시양태에서, 동물의 게놈은 비-내인성 면역글로불린 경쇄를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 특정한 실시양태에서, 동물의 게놈은 비-내인성 Igκ경쇄 및 비-내인성 Igλ 경쇄를 포함한다. 다른 실시양태에서, 동물은 불활성화된 내인성 면역글로불린 유전자좌를 포함한다. 특정한 실시양태에서, 동물은 마우스이다. 다른 실시양태는 비-인간 동물에 의해 생산된 키메라 항체를 제공한다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 (1) 키메라 면역글로불린 중쇄, 및 (2) 비-내인성 면역글로불린 경쇄를 포함하는 게놈을 포함하는 비-인간 동물을 제공하는데, 여기서 키메라 중쇄는 비-내인성 중쇄 가변 도메인 및 키메라 중쇄 불변 영역을 포함하며, 여기서 키메라 중쇄 불변 영역은 2개 이상의 비-내인성 종, 대립유전자 및/또는 하플로타입으로부터 유래된다. 또 다른 실시양태는 (1) 키메라 면역글로불린 중쇄, 및 (2) 비-내인성 면역글로불린 경쇄를 포함하는 게놈을 포함하는 비-인간 동물을 제공하는데, 여기서 키메라 중쇄가 비-내인성 중쇄 가변 도메인 및 키메라 중쇄 불변 영역을 포함하고, 여기서 상기 비-내인성 중쇄 가변 도메인이 2개 이상의 종, 대립유전자 및/또는 하플로타입으로부터 유래된다. 일 실시양태는 (1) 키메라 면역글로불린 중쇄를 포함하는, 키메라 항체, 또는 그의 항원-결합 단편을 인코딩하는 합성적 전이유전자를 포함하는 게놈을 포함하는 비-인간 동물을 제공하는데, 여기서 키메라 중쇄는 비-내인성 중쇄 가변 도메인 및 키메라 중쇄 불변 영역을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 게놈은 비-내인성 면역글로불린 경쇄를 추가로 포함한다. 특정한 실시양태에서, 동물의 게놈은 비-내인성 Igκ 경쇄 및 비-내인성 Igλ 경쇄를 포함한다. 특정한 실시양태에서, 세포는 불활성화된 내인성 면역글로불린 유전자좌를 포함한다. 또 다른 실시양태는 개시된 동물에 의해 생산된 키메라 항체를 제공한다.
본 발명의 일 실시양태는 불활성화된 내인성 Ig 유전자좌를 포함하는 비-인간 동물을 제공하는데, 여기서 내인성 Ig 유전자좌는 프라이머리(primary) B 세포 발달을 유도할 수 있는 불변 영역의 형성 및 기능적 가변 도메인의 형성을 손상시키는 결실을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 내인성 면역글로불린 유전자좌는 중쇄 유전자좌이다. 특정한 다른 실시양태에서, 내인성 면역글로불린 유전자좌는 경쇄 유전자좌이다. 다른 실시양태는 불활성화된 내인성 Ig 유전자좌를 포함하는 비-인간 세포를 제공하는데, 여기서 내인성 Ig 유전자좌는 프라이머리 B 세포 발달을 유도할 수 있는 불변 영역의 형성 및 기능적 가변 도메인의 형성을 손상시키는 결실을 포함한다.
일 실시양태는 제1 플랭킹(flanking) 서열, 전이유전자, 및 제2 플랭킹 서열을 포함하는 DNA 작제물을 제공하는데, 여기서 전이유전자는 프라이머리 B 세포 발달을 지지할 수 있는 불변 영역의 형성 및 기능적 가변 도메인의 형성을 손상시키는 내인성 Ig 유전자좌에서의 결실을 도입할 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 다른 실시양태는 DNA 작제물을 포함하는 키트를 제공한다. 다른 실시양태는 기능적 가변 도메인의 형성을 손상시키는 단계, 및 프라이머리 B 세포 발달을 유도할 수 있는 불변 영역의 형성을 손상시키는 단계를 포함하는 내인성 면역글로불린 유전자좌를 불활성시키기 위한 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 실시양태는 키메라 면역글로불린 중쇄를 포함하는 게놈을 갖는 비-인간 동물을 제공하며, 여기서 키메라 중쇄는 비-내인성 중쇄 가변 도메인 및 키메라 중쇄 불변 영역을 포함하는 단계; 상기 동물로부터 폴리뉴클레오티드 서열을 회수하며, 여기서 폴리뉴클레오티드 서열이 면역글로불린 경쇄 가변 영역 및 비-내인성 면역글로불린 중쇄 가변 영역을 인코딩하는 단계; 및 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체 디스플레이 라이브러리를 생산하는 단계를 포함하는 항체 디스플레이 라이브러리를 생산하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명의 일 실시양태는 키메라 면역글로불린 중쇄를 포함하는 게놈을 갖는 비-인간 동물에 의해서 만들어진 면역글로불린 중쇄 가변 영역을 포함하는 항체 디스플레이 라이브러리를 제공하는데, 여기서 키메라 중쇄는 비-내인성 중쇄 가변 도메인 및 키메라 중쇄 불변 영역을 포함하고, 여기서 가변 영역은 키메라 항체로부터 유래된다.
상세한 설명
개요
본 발명은 키메라 또는 인간화된 항체를 생산하는 키메라 항체, 비-인간 동물, 그러한 비-인간 세포 및 동물을 제조하는 방법, 및 상기 항체를 포함하는 조성물 및 키트를 포함한다. 본 발명의 특정한 실시양태에서 비-인간 동물은 포유동물이다.
본원에 기술된 키메라 항체, 및 그의 항원-결합 단편은 비-내인성 가변 도메인 및 키메라 중쇄 불변 영역을 포함한다. 특정한 실시양태에서, IgH 쇄는 하나 이상의 비-내인성 V, D 및 J 유전자 분절, 비-내인성 CH1 도메인, 및 내인성 CH2 및 CH3 도메인을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 본원에 기술된 키메라 IgH 쇄를 포함하는, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 비-내인성 뉴클레오티드 서열에 의해서 인코딩된 아미노산 서열을 갖는 IgL 쇄를 추가로 포함한다. 다른 실시양태에서, 본원에 기술된 키메라 IgH 쇄를 포함하는, 항체, 또는 항원-결합 단편은 내인성 및 비-내인성 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 갖는 IgL 쇄를 추가로 포함한다.
이러한 방식으로 키메라 항체를 조작하는 것은 생체 내 면역 반응 동안 발달되는, 하나의 종, 예를 들어, 마우스로부터의 제1 C 영역 특히 CH1 도메인, 및 선택적으로 힌지 영역의 부분으로부터, 특히 CH1 도메인, 및 또 다른 종, 예를 들어, 인간으로부터의 제2 C 영역, 특히 CH1 도메인 및 선택적으로 힌지 영역의 일부로의 시험관 내 스위치에서 야기되는 V 도메인의 형태의 변경을 방지한다. 본 발명의 동물에 의해 생산된 항체는 예를 들어, 인간 V 영역이 인간 C 영역에 부착되어 완전한 인간 항체를 만들 경우, 다른 키메라 항체를 생산하는 동물로부터의 항체에서 보여진 활성 및 효능의 감소 또는 손실을 나타내지 않는데, 이러한 감소 또는 손실은 CH1 도메인의 변화로부터 초래된 VH 도메인의 변경된 형태, 및/또는 마우스로부터 인간 불변 영역으로 스위치 하는 경우, 상부 힌지 영역의 변경된 길이 또는 가용성으로 인한 항원 결합에서의 차이(길이, 및 조성이 가변적인, CH1의 말단부터 중쇄간 이황화 결합을 형성하는 힌지에서의 첫 번째 시스테인 잔기까지의 펩티드 서열)에 의해서 야기될 수 있다(문헌[Roux et al., J. Immunology(1997) 159:3372-3382] 및 그 안의 참조 참고). 중간 힌지 영역은 중쇄간 이황화 결합을 형성하는 시스테인 잔기에 의해 결합된다.
정의
특정한 실시양태를 상세히 기술하기 전에, 본 발명은 다양할 수 있는 특정 조성물 또는 생물학적 시스템으로 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본원에 사용된 용어는 단지 특정 예시적 실시양태를 기술하기 위한 목적이며, 제한하려는 의도가 아님이 이해되어야 한다. 본 명세서에 사용된 용어는 일반적으로 본 발명의 맥락 내에서 및 각각의 용어가 사용된 구체적 문맥에서 당해 기술분야에서 그의 통상적인 의미를 갖는다. 특정 용어는 하기에서 또는 본 명세서의 다른 부분에서 논의되며, 본 발명의 조성물 및 방법을 기술함에 있어서 당업자에게 추가적 안내 및 이를 어떻게 제조하고 사용하는지를 제공하기 위함이다. 용어의 임의의 사용 범주 및 의미는 용어가 사용되는 구체적 문맥으로부터 명백할 것이다. 따라서, 본원에 기재된 정의는 특정 조성물 또는 생물학적 시스템으로 제한하지 않으면서, 본 발명의 특정한 실시양태를 확인하는 데 있어서 예시적 안내를 제공하려 함이다. 본 명세서 및 청구항에서 사용된 바와 같은, 단수 형태 "한", "하나의" 및 "그"는 그 문맥이 명백히 달리 지시하지 않는 한, 복수 형태를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은, "항체" 및 "면역글로불린" (Ig)은 본원에서 상호교환적으로 사용되고 특이적 항원을 인식하고 결합하며, 막 결합 또는 분비될 수 있는 B 세포에 의해 생산된 단백질 분자를 나타낸다. 항체는 그들이 B 세포의 단일 클론에 의해 제조되고, 따라서 동일한 에피토프를 인식하고 동일한 핵산 및 아미노산 서열을 가진다는 점에서, 모노클로날일 수 있으며 또는 항체는 B 세포의 다중 클론에 의해 생산되고, 동일한 항원의 하나 이상의 에피토프를 인식하고 전형적으로 상이한 핵산 및 아미노산 서열을 갖는다는 점에서 폴리클로날일 수 있다.
항체, 또는 Ig, 분자는 이황화 결합을 통해 함께 연결된 2개의 동일한 중쇄 및 2개의 동일한 경쇄로 전형적으로 구성된다. 두 가지 유형의 IgL, Igκ 및 Igλ가 있다. 중쇄(IgH) 및 경쇄(IgL) 둘 다는 가변 (V) 영역 또는 도메인 및 불변 (C) 영역 또는 도메인을 함유한다. V 영역을 인코딩하는 IgH 유전자좌의 부분은 가변 (V), 다양성 (D), 및 결합 (J) 유전자 분절의 다중 카피를 포함한다. V 영역을 인코딩하는, IgL 유전자좌, Igκ 및 Igλ의 부분은 V 및 J 유전자 분절의 다중 카피를 포함한다. IgH 및 IgL 유전자좌의 V 영역 인코딩 부분은 유전자 재배열, 예를 들어, 유전자 절편 배열의 상이한 조합이 이루어져 IgH 및 IgL 가변 영역을 형성하고, 항체에서 다양한 항원 특이성을 발달시킨다. IgH C 영역의 분비된 형태는 3개의 C 도메인인, CH1, CH2, CH3, 선택적으로 CH4(Cμ), 및 힌지 영역으로 구성된다. IgH C 영역의 막-결합 형태는 또한 막 및 세포내 도메인을 갖는다. IgH 불변 영역은 인간에서 항체의 이소타입(isotype), 예를 들어, IgM, IgD, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA 및 IgE를 결정한다. 다수 Ig 이소타입을 인코딩하는 비-인간 포유동물은 이소타입 클래스 스위칭이 이루어질 수 있음이 이해될 것이다.
"Fab" 도메인 또는 단편은 V 영역 및 IgH의 CH1 도메인을 포함하는 IgH의 N-말단 부분 및 전체 IgL을 포함한다. "F(ab')2" 도메인은 Fab 도메인 및 힌지 영역의 일부를 포함하며, 여기서 두 IgH는 중간 힌지 영역에서 이황화 연결을 통해 함께 연결된다. Fab 및 F(ab')2 둘 다는 "항원-결합 단편"이다. CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 IgH의 C-말단 부분은 "Fc" 도메인이다. Fc 도메인은 세포 수용체, 예를 들어 FcR에 의해 인식된 Ig의 부분이며, 여기에 상보체-활성화 단백질인 C1q가 결합한다. CH2 엑손의 5' 부분에서 인코딩된 하부 힌지 영역은 FcR 수용체에 결합하기 위해 항체 내에 유연성을 제공한다.
본원에 사용된 바와 같은 "키메라 항체"는 2개 이상의 종으로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 항체를 나타낸다.
"인간화된" 항체는 그의 모체 분자보다 더 많은 인간 서열을 포함하도록 가공된 키메라 항체이다. 인간화된 항체는 또 다른 종으로부터 제조된 비-인간화된 항체와 비교하는 경우, 인간에 투여한 후에 면역원성이 덜하다. 예를 들어, 인간화된 항체는 인간 불변 영역에 부착된 키메라 항체의 인간 가변 영역을 포함할 수 있다. 본원에 기술된 키메라 항체를 사용하여 완전한 인간 항체를 제조할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "키메라 Ig 쇄"는 2개 이상의 종으로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 Ig 중쇄 또는 Ig 경쇄를 나타낸다. 예를 들어, 키메라 Ig 중쇄는 인간 VH, DH, JH, 및 CH1 유전자 분절 및 마우스 CH2 및 CH3 유전자 분절을 포함할 수 있다.
"폴리펩티드," "펩티드" 또는 "단백질"은 화학 결합에 의해 함께 연결된 아미노산의 쇄를 기술하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 폴리펩티드 또는 단백질은 IgH, IgL, V 도메인, C 도메인, 또는 항체일 수 있다.
"폴리뉴클레오티드"는 화학 결합에 의해 함께 연결된 핵산의 쇄를 나타낸다. 폴리뉴클레오티드는, 이로 제한되지는 않지만, DNA, cDNA, RNA, mRNA, 및 유전자 서열 및 분절을 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 생존하는 공급원, 예를 들어 진핵생물 세포, 원핵생물 세포 또는 바이러스로부터 분리될 수 있거나, 또는 분자 생물학의 표준 기술의 사용에 의해, 또는 DNA 합성에 의해, 또는 다수의 기술의 조합에 의해 시험관 내 처리(manipulation)에 의해 유도될 수 있다.
"유전자좌"는 하나 이상의 유전자 또는 엑손, 예를 들어 IgH 또는 Igκ 유전자좌, 시스(cis) 조절 요소, 및 트랜스-액팅 인자가 결합하는 결합 영역을 포함하는 염색체 상 위치를 나타낸다. 본원에 사용된 바와 같은, "유전자" 또는 "유전자 분절"은 특정 폴리펩티드 또는 그의 부분, 예를 들어 VL 도메인, CH1 도메인, 상부 힌지 영역, 또는 그의 부분을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 본원에 사용된 바와 같은 "유전자 분절(segment)" 및 "엑손"은 상호교환적으로 사용될 수 있으며, 펩티드 또는 그의 일부분을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 나타낸다. 유전자, 또는 다른 유전자 분절은 하나 이상의 인트론, 전사적 제어 요소, 예를 들어, 프로모터, 인핸서, 또는 다른 비-코딩 영역(예를 들어, 시스 조절 요소, 예를 들어, 5' 및/또는 3' 비번역된 영역, 폴리아데닐화 부위)를 추가로 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "불활성화된 Ig 유전자좌"는 기능적 Ig 쇄를 인코딩하지 않는 Ig 유전자좌를 나타낸다. Ig 유전자좌로부터 생산된 "기능적 가변 영역"은 V-(D)-J 재조합을 거치고, 전사될 수 있으며 상기 전사체가 세포 표면상에서 발현될 수 있는 가변 영역 폴리펩티드로 번역되는, 폴리뉴클레오티드 서열을 나타낸다."기능적 중쇄 불변 영역"은 가변 영역에 작동적으로 결합하여 프라이머리 B 세포 발달을 유도할 수 있는 불변 영역을 나타낸다. 프라이머리 B 세포 발달은 프라이머리 림프계기관, 예를 들어 골수에서 B 세포 발달을 나타내며, 초기(early) 프로-B 세포의 발달 단계(즉, IgH D-J 재배열), 후기(late) 프로-B 세포의 발달 단계(즉, IgH V-DJ 재배열), 큰 프리-B 세포의 발달 단계(즉, 프리-B 수용체를 발현), 및 작은 프리-B 세포의 발달 단계(즉, IgL V-J 재배열)를 포함하는, 줄기세포로부터의 미성숙 B 세포로의 전이를 포함한다. 프라이머리 B 세포 발달을 "유도"함이란, 기능적 중쇄 불변 영역이 예를 들어, 세포 막에 고정, 신호 전달, 및/또는 Fc 수용체에 결합할 수 있음을 의미한다. "기능적 경쇄 불변 영역"은 가변 영역에 작동적으로 결합 및 작은 프리-B 세포 단계를 넘어 B 세포 발달을 위해 진행시키기 위해 중쇄에 결합할 수 있는 불변 영역을 나타낸다.
"손상"은 예를 들어, 더 이상 기능적이지 않는 가변 영역 또는 더 이상 기능적이지 않는 불변 영역을 초래하는 결실 또는 돌연변이의 도입을 나타낸다. 예를 들어, Cμ 동형 접합적 결실은 일부 포유동물 및 그의 종류에서 IgH가 프라이머리 B 세포 발달을 유도하는 것을 손상시킨다.
"돌연변이"는 천연적으로 발생하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열에서의 변화를 나타낸다. 돌연변이는 기능적 변화를 초래할 수 있다. 돌연변이는 뉴클레오티드의 추가 및 뉴클레오티드의 결실 둘다를 포함한다. "결실"은 천연적으로 발생하는 내인성 폴리뉴클레오티드 서열로부터의 하나 이상의 뉴클레오티드의 결실을 나타낸다. 결실 및 첨가는 프레임쉬프트(frameshift) 돌연변이를 도입할 수 있다. 결실은 전체 유전자, 유전자 분절 또는 모듈을 또한 제거할 수 있다. 일부 예에서, 천연적으로 발생하는 내인성 서열의 일부의 결실은 비-내인성 서열의 추가와 동시에 일어날 수 있다. 예를 들어, 내인성 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 비-내인성 서열 예를 들어, 선택 마커를 포함하는 폴리뉴클레오티드와의 상동성 재조합시에 제거 즉, 결실될 수 있다. 다른 측면에서, 내인성 폴리뉴클레오티드 서열의 결실은 부위-특이적 재조합효소 예를 들어, loxP 부위에 대한, 2 개의 비-내인성 인식 서열의 도입, 이어서 재조합효소, 예컨대 CRE에 대한 노출 후에 발생할 수 있다.
용어 "내인성"은 세포 또는 동물 내에서 천연적으로 발생한 폴리뉴클레오티드 서열을 나타낸다. "이종상동성(orthologous)"은 다른 종에서 상응하는 폴리펩티드, 예를 들어, 인간 CH1 도메인 및 마우스 CH1 도메인을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 용어 "동계(syngeneic)"는 동일한 종의 동물로 도입될 수 있는 동일한 종 내에서 발견된 폴리뉴클레오티드 서열, 예를 들어, 마우스로 도입된 마우스 Vκ 유전자 분절을 나타낸다. 같은 종이지만 상이한 종류의 2개의 개체로부터의 폴리뉴클레오티드 서열은 현저하게 상이한 부분을 가질 수 있다는 점이 강조되어야한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "상동" 또는 "상동성 서열"은 다른 폴리뉴클레오티드 서열 또는 그의 분절과 매우 유사한 서열, 또는 높은 백분율의 동일성(예를 들어, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상)을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 예를 들어, 본 발명의 DNA 작제물은 그 특이적 위치에서 재조합을 촉진하기 위해 내인성 DNA 서열의 일부분에 상동성인 서열을 포함할 수 있다. 상동성 재조합은 원핵생물 및 진핵생물 세포에서 일어날 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, "플랭킹 서열" 또는 "플랭킹 DNA 서열"은 내인성 DNA 서열 또는 이전에 재조합된 비-내인성 서열, 또는 그의 부분에 상동성인 DNA 작제물에서 비-내인성 DNA 서열에 인접한 DNA 서열을 나타낸다. 본 발명의 DNA 작제물 내의 하나 이상의 플랭킹 서열, 예를 들어, 비-내인성 서열의 3' 및 5' 말단 상의 플랭킹 서열 또는 비-내인성 서열의 3' 또는 5' 말단 상의 플랭킹 서열을 가질 수 있다. 플랭킹 서열은 내인성 유전자 내의 내인성 서열과 상동성이거나, 플랭킹 서열은 내인성 유전자에 인접한(즉, 바깥의) 내인성 서열과 상동성일 수 있다.
어구 "상동성 재조합-수용성 세포(competent-cell)"는 중복하는 상동성 영역을 함유하는 DNA 단편을 상동성 재조합할 수 있는 세포를 나타낸다. 상동성 재조합-수용성 세포의 예에는, 이로 제한되지는 않지만, 유도 만능(pluripotent) 줄기 세포, 조혈모세포, 박테리아, 효모, 다양한 세포주 및 배아 줄기(ES) 세포가 포함된다.
"비-인간 동물"은 인간 이외의 임의의 다른 동물, 예를 들어, 조류, 파충류, 포유류를 나타낸다. "비-인간 포유동물"은 포유류 강에 속하는 인간 이외의 동물을 나타낸다. 비-인간 포유동물의 예로는, 이로 제한되지는 않지만, 인간 이외의 영장류, 낙타류(camelids), 설치류, 소류, 양류, 말류, 개, 고양이, 염소, 양, 돌고래, 박쥐, 토끼, 및 유대류가 포함된다. 바람직한 비-인간 포유동물은 체세포 과다 돌연변이 및/또는 유전자 전환에 주로 의지하여 항체 다양성을 생성하며, 예를 들어, 마우스, 토끼, 돼지, 양, 염소, 낙타류, 설치류 및 소가 있다. 특히 바람직한 비-인간 포유동물은 마우스이다.
용어 "형질전환(transgenic)"은 그의 게놈으로 통합된, 또 다른 종으로부터 유래된 비-내인성 폴리뉴클레오티드 서열, 예를 들어, 전이유전자를 포함하는 세포 또는 동물을 나타낸다. 예를 들어, 내인성 마우스 IgH 유전자좌 외부에서 그의 게놈으로 통합된 인간 VH 유전자 분절을 함유하는 마우스는 형질전환 마우스이며; 내인성 마우스 IgH 유전자좌에서 내인성 마우스 VH 유전자를 직접적으로 대체하는, 그의 게놈으로 통합된 인간 VH 유전자 분절을 함유하는 마우스는 형질전환 마우스이며, 종종 "녹-인(knock-in)" 마우스로도 지칭된다. 형질전환 세포 및 비-인간 포유동물에서, 비-내인성 폴리뉴클레오티드 서열은 상기 세포 또는 비-인간 포유동물에서 본래 발견된, 상응하는 또는 이종상동성인 내인성 서열의 부재하에서 또는 내인성 유전자의 부재하에서 이소성으로, 내인성 서열과 함께 발현될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "대체"는 직접적 및 기능적 대체 둘 다를 나타낸다. "직접적인 대체"란 내인성 DNA 서열이 상동성 재조합에 의해서와 같이, 게놈 내의 내인성 서열의 위치에서 비-내인성 서열을 포함하는 조작된 DNA 서열로 대체됨을 의미한다. 예를 들어, 내인성 DNA 서열은 상동성 재조합을 통해 제거되거나, 2개의 통합된 비-내인성 서열 사이에 남아있는 내인성 서열은 결실된다. "기능적인 대체"에 의해서란 내인성 DNA 서열의 기능(예를 들어, 조작된 DNA 서열로부터 생산된 폴리펩티드에 의해 수행되는 바와 같이)이 비-내인성 DNA 서열에 의해서 수행됨을 의미한다. 예를 들어, 내인성 IgH 유전자좌는 키메라 IgH 쇄를 인코딩하며 내인성 IgH 유전자좌의 바깥에서 게놈 내로 삽입되는 전이유전자에 의해서 기능적으로 대체될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, "인간화된" 동물은 유사한 인간 서열로 대체된 본래의 유전적 구성의 하나 이상의 유전자 분절 및/또는 유전자 조절 서열에 더하여, 비-인간 동물의 유전자 서열을 보유하는 복합 유전자 구조를 갖는 비-인간 동물, 예를 들어, 마우스를 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "벡터"는 벡터의 복제 능력의 손실 없이 다른 핵산 단편이 그 안에 통합될 수 있는 핵산 분자를 나타낸다. 벡터는 바이러스, 플라스미드 또는 고등 유기체의 세포로부터 유래할 수 있다. 벡터를 이용하여 외래 또는 재조합 DNA를 숙주 세포로 도입하며, 여기서 벡터가 복제된다.
폴리뉴클레오티드 제제는 폴리뉴클레오티드의 표적 세포로의 도입을 포함하는, 폴리뉴클레오티드의 조작을 촉진할 수 있는 벡터 중에 함유될 수 있다. 벡터는 폴리뉴클레오티드를 유지하기에 유용한 클로닝 벡터이거나, 또는 폴리뉴클레오티드에 더하여 폴리뉴클레오티드를 발현하기에 유용한 조절 요소, 및 폴리뉴클레오티드가 RNA를 인코딩할 경우, 폴리펩티드로의 RNA의 후속적 번역 또는 세포에서 RNA에 의한 후속적 트랜스 조절 활성을 위해 특정 세포에서 인코딩된 RNA를 발현시키기에 유용한 조절 요소를 함유하는 발현 벡터일 수 있다. 발현 벡터는, 예를 들어, 인코딩 폴리뉴클레오티드의 지속되는 전사를 달성하기 위해 필요한 발현 요소를 함유할 수 있거나, 또는 조절 요소는 벡터 내로 클로닝되기 전에 벡터로 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결될 수 있다.
발현 벡터(또는 폴리뉴클레오티드)는 일반적으로 구성적인 또는, 필요하다면, 인코딩 폴리뉴클레오티드의 유도성 또는 조직 특이적 또는 발달 단계 특이적 발현을 제공할 수 있는 프로모터 서열, 폴리-A 인식 서열, 및 리보좀 인식 부위 또는 내부 리보좀 입장 부위, 또는 조직 특이적일 수 있는 다른 조절 요소, 예를 들어 인핸서를 함유하거나 인코딩한다. 벡터는 또한 필요하다면, 원핵세포 또는 진핵세포 숙주계 또는 둘 다에서 복제를 위해 요구되는 요소를 함유할 수 있다. 플라스미드 벡터 및 바이러스성 벡터, 예를 들어 박테리오파지, 배큘로바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 백시니아 바이러스, 알파 바이러스 및 아데노-연관 바이러스 벡터를 비롯한 그러한 벡터는 널리 공지되어 있으며, 상업적 공급원(Promega, Madison Wis.; Stratagene, La Jolla Calif.; GIBCO/BRL, Gaithersburg Md.)으로부터 구입할 수 있거나, 또는 당업자에 의해 구축될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Meth. Enzymol., Vol. 185, Goeddel, ed. (Academic Press, Inc., 1990)];[Jolly, Cane. Gene Ther. 1:51-64, 1994]; [Flotte, J. Bioenerg. Biomemb 25:37-42, 1993]; [Kirshenbaum et al., J. Clin. Invest 92:381-387, 1993] 참조; 이들 각각은 참고로 본원에 포함됨).
본 발명의 방법에 이용된 DNA 벡터는 양성 및 음성 선택 마커를 함유할 수 있다. 양성 및 음성 마커는 발현시 이들 유전자를 발현하는 세포에게 약물 내성을 부여할 수 있는 유전자일 수 있다. 대장균에 적합한 선택 마커는, 이로 제한되지는 않지만, Km(카나마이신 내성 유전자), tetA(테트라사이클린 내성 유전자) 및 베타-락타마제(암피실린 내성 유전자)를 포함할 수 있다. 배양 중인 포유동물 세포에 적합한 선택 마커는, 이로 제한되지는 않지만, hyg(하이그로마이신 내성 유전자), puro(퓨로마이신 내성 유전자) 및 G418(네오마이신 내성 유전자)을 포함할 수 있다. 선택 마커는 또한 물질을 독성 물질로 전환시킬 수 있는 물질대사 유전자일수 있다. 예를 들어, 유전자 티미딘 키나제는 발현시 약물 간시클로비르(gancyclovir)를 독성 생성물로 전환시킨다. 따라서, 간시클로비르로 세포를 처리하면 티미딘 키나제를 발현하지 않는 유전자를 음성적으로 선택할 수 있다.
관련된 측면에서, 선택 마커는 "스크리닝가능한 마커", 예를 들어 녹색 형광 단백질(GFP), 황색 형광 단백질(YFP), 적색 형광 단백질(RFP), GFP-유사 단백질, 및 루시페라제일 수 있다.
다양한 유형의 벡터가 당해 기술분야에서 이용가능하며, 이로 제한되지는 않지만, 박테리아, 바이러스성, 및 효모 벡터가 포함된다. DNA 벡터는 플라스미드, 코스미드, 박테리오파지, p1-유래된 인공 염색체(PAC), 박테리아 인공 염색체(BAC), 효모 인공 염색체(YAC), 또는 포유동물 인공 염색체(MAC)를 비롯한 임의의 적합한 DNA 벡터일 수 있다. 특정한 실시양태에서, DNA 벡터는 BAC이다. 다양한 DNA 벡터가 작제물에 삽입된 DNA의 크기에 대해 적당하게 선택된다. 일 실시양태에서, DNA 작제물은 박테리아 인공 염색체 또는 그의 단편이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "박테리아 인공 염색체" 또는 "BAC"는 박테리아 DNA 벡터를 나타낸다. BAC, 예를 들어, 대장균으로부터 유래된 것은 상동성 재조합을 통해 비-인간 포유동물 세포 또는 동물의 DNA 서열을 도입, 결실 또는 대체하기 위해 이용될 수 있다. 대장균은 코스미드 또는 효모 인공 염색체보다 DNA 안정성이 더 큰 BAC의 형태로 500 kb 이상만큼 큰 복잡한 게놈 DNA를 유지할 수 있다 (문헌[Shizuya and Kouros-Mehr, Keio J Med. 2001, 50(1):26-30] 참조). 게다가, 인간 DNA 게놈 DNA의 BAC 라이브러리는 코스미드 또는 효모 인공 염색체에서의 라이브러리보다 인간 게놈을 보다 완전하고 정확하게 나타낸다. BAC는 참고로 그 전문이 본원에 포함되는 미국 출원 제10/659,034호 및 제61/012,701호에 더 상세하게 기재되어 있다.
비-인간 포유동물 내로 통합될 Ig 유전자좌, 또는 그의 일부분을 포함하는 DNA 단편은 유전자좌의 인간화 전에 비-인간 포유동물의 동일한 종으로부터 분리된다. Ig 유전자좌의 중첩 단편을 함유하는 다중 BAC는 인간화될 수 있고, 중첩 단편은 재조합되어 연속 IgH 또는 IgL 유전자좌를 생성한다. 결과적인 키메라 Ig 유전자좌는 비-인간 포유동물 Ig 유전자 분절에 작동가능하게 연결된 인간 유전자 분절을 포함하여 기능적 Ig 유전자좌를 생성하며, 여기서 유전자좌는 유전자 재배열을 수행하고, 이로써 키메라 항체의 다각화된 레파토리를 생성할 수 있다.
BAC 재조합 및/또는 키메라 Ig 유전자좌 또는 그의 단편의 조작을 위한 이들 과정은 박테리아 세포, 예를 들어 대장균이 숙주 Ig 유전자좌 또는 그의 일부분을 함유하는 BAC로 형질전환되는 것이 요구된다. 그 후, BAC를 함유하는 바실러스가 숙주 Ig 유전자좌 또는 그의 일부분을 함유하는 BAC와 공유된 플랭킹 상동성 서열에 연결된 바람직한 인간 Ig 유전자 분절을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된다. 공유된 서열 상동성은 상동성 재조합을 매개하고, 재조합 벡터 상의 인간 Ig 유전자 분절과 BAC 상의 비-인간 포유동물 Ig 유전자 분절 사이에서 교차된다. 상동적으로 재조합된 BAC의 검출은 벡터 내로 통합된 선택가능한 및/또는 스크리닝 가능한 마커를 이용할 수 있다. 인간화된 BAC는 박테리아로부터 용이하게 분리될 수 있으며, 녹-인 비-인간 세포를 생산하기 위해 사용될 수 있다. BAC를 재조합하고 BAC 상의 DNA 내에서 삽입 및 결실을 조작하는 방법 및 그로부터 유전자 변경된 마우스의 제조 방법은 문서화되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 제 5,770,429호; 문헌 [Fishwild, D. et al. (1996) Nat . Biotechnol. 14:845-851]; [Valenzuela et al . Nature Biotech . (2003) 21:652-659]; [Testa et al . Nature Biotech . (2003) 21:443-447]; 및 [Yang 및 Seed. Nature Biotech . (2003) 21:447-451]을 참고하라.
제1 재조합 단계는 sbcB, sbcC, recB, recC 또는 recD 활성이 결핍되고 recA에서 온도 감수성 돌연변이를 갖는 대장균 균주에서 수행될 수 있다. 재조합 단계 이후에, 기술된 바와 같은 다양한 서열 및 배향을 갖는 재조합된 DNA 작제물이 분리된다.
BAC 리컴바이니어링(recombineering)에 사용된 영역은 상동성 재조합을 허용하는 길이여야 한다. 예를 들어, 플랭킹 영역은 약 0.1 내지 19 kb, 및 전형적으로 약 1 kb 내지 15 kb, 또는 약 2 kb 내지 10 kb일 수 있다.
Ig 유전자좌의 일부분을 포함하는 보다 큰 및/또는 맞춤된 BAC를 제조하기 위한 BAC 재조합 과정은 박테리아 세포, 예를 들어 대장균이 제1 Ig 유전자좌, 그의 일부분, 또는 몇 가지 다른 표적 서열을 보유하는 BAC로 형질전환될 것이 요구된다. 그 후, 대장균을 함유하는 BAC를 함유하는 대장균은 표적 DNA 내로 도입될 바람직한 Ig 유전자 분절 예를 들어, 마우스 IgH 유전자좌로부터의 영역에 결합될 하나 이상의 인간 VH, DH 및/또는 JH 유전자 분절을 포함하는 재조합 벡터(예를 들어, 플라스미드 또는 BAC)로 형질전환되며, 벡터는 둘 다 서열 동일성의 영역을 갖는다. 대장균에서 기능적 recA의 존재 하에 동일성의 이 공유된 영역은 재조합 벡터 상의 Ig 유전자 분절과 BAC 상의 비-인간 포유동물 Ig 유전자 분절 사이에서 교차를 매개한다. 상동적으로 재조합된 BAC의 선택 및 분해능(resolution)은 벡터 내로 통합되는 선택가능한 및/또는 스크리닝가능한 마커를 이용할 수 있다. 인간화된 및 키메라 BAC는 대장균으로부터 용이하게 정제될 수 있으며, 당해 기술 분야에 공지된 다양한 방법에 의해 DNA를 도입하고, 무작위 또는 표적화된 통합 사건에 대해 선택하고/하거나 스크리닝함으로써 형질전환 및 녹-인 비-인간 세포 및 동물을 제조하기 위해 사용될 수 있다.
대안적으로, 비-인간 포유동물 내로 통합될 Ig 유전자좌를 함유하는 DNA 단편은 시험관내에서 합성된 DNA로부터 유래된다. 다수의 유기체의 게놈은 완전히 시퀀싱되었고(예를 들어, 인간, 침팬지, 레서스(rhesus) 원숭이, 마우스, 랫트, 개, 고양이, 닭, 기니아 피그, 토끼, 말, 소, 알파카), 주석으로 공개적으로 이용가능하다. 수많은 다른 유기체에 대해, 전사체(transcriptome)의 서열에 대한 정보가 공개적으로 이용가능하다. 특히 이로 제한되는 것은 아니지만, 인간 및 마우스 면역글로불린 유전자좌가 연구되었고, 코딩 유전자 분절 및 비-코딩 조절 요소의 위치 및 활성에 대해 특성화되었다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "인실리코"는 컴퓨터 또는 컴퓨터 알고리즘을 사용하여 천연적으로 발생하는 또는 시험관내 과정을 모형화하고, 특히 무세포 시스템(cell free system)(예를 들어, 자동화된 화학 합성 이용)을 전부 또는 부분적으로 사용하는 뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 고안에서 및/또는 뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 합성적 제조에서 도움을 주는 것을 나타낸다. Ig 유전자좌의 서열은 핵산 서열 분석에 대한 통상적으로 사용가능한 소프트웨어를 사용하여 인실리코 처리 및 재조합될 수 있다. 인실리코 재조합은 동일한 유전자좌 내에서, 동일한 종으로부터의 2개의 유전자좌 사이, 또는 2개 이상의 종으로부터의 유전자좌 사이 내일 수 있다. 인실리코 재조합은 기능적 서열 또는 비-기능적, 불활성화된 서열을 고안하도록 수행될 수 있다. 정밀한 뉴클레오티드-대-뉴클레오티드 조작은 전이유전자의 기능을 정밀하게 조작하기 위해 적용될 수 있는 서열 조성물의 정밀한 조작을 가능케 하며, 전사 및 번역 후에 정밀하게 조작된 조성물 및 유전자좌의 폴리펩티드 생성물의 기능을 초래한다.
Ig 유전자좌의 서열은 또한 동일한 또는 상이한 종으로부터의 비-면역글로불린 유전자좌로부터 얻은 것과 인실리코 재조합될 수 있다. 이러한 서열은 이로 제한되지는 않지만, 양성 및 음성 약물 선택 마커에 대한 유전자, 예를 들어 G418, hyg, puro 및 tk, 및 부위-특이적 재조합효소 인식 서열, 예를 들어 loxP 부위 및 그의 변이체 및 frt 부위 및 상동성 재조합을 일으키기 위한 정밀하게 경계 표시된 서열을 포함할 수 있다. 바람직한 서열을 인실리코 조립 후에, 이어서 이는 합성되고 오류 없이 조립될 수 있다(문헌[Kodumal et al., Proc. Natl. Acad. Sci.(2004)101:15573-15578]). 큰 DNA의 합성, 조립 및 시퀀싱은 계약을 기반으로 제공된다 (예를 들어, DNA 2.0, 캘리포니아, 멘로파크; Blue Heron Biotechnology, Bothell, WA; 및 Eurogentec, San Diego, CA). 이러한 합성 DNA 서열은 벡터, 예를 들어 플라스미드 및 BAC 내에 보유되고, 다른 벡터 예를 들어 YAC로 옮겨질 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "작제물"은 유전적 조작, 리콤비니어링 또는 합성에 의해 인공적으로 작제된 DNA 서열을 나타낸다. 작제물에는 예를 들어, 전이유전자 및 벡터(예를 들어, BAC, P1, 람다 박테리오파지, 코스미드, 플라스미드, YAC 및 MAC)가 포함된다. 일 실시양태에서, DNA 작제물은 세포로 도입되기 전에 선형화된다. 또 다른 실시양태에서, DNA 작제물은 세포로 도입되기 전에 선형화되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같은 "loxP" 및 "CRE"는 P1 박테리오파지로부터 유래된 부위-특이적 재조합 시스템을 일컫는다. loxP 부위는 34개의 뉴클레오티드 길이이다. DNA가 loxP 부위에 의해 어느 한 측면에 플랭킹되고 CRE 매개된 재조합에 노출되면, 개재(intervening) DNA는 결실되며, 2개의 loxP 부위가 하나로 만난다. 마우스를 포함하는 다수의 종에서의 유전적 조작을 위한 변이체-서열 lox 부위 및 CRE의 변이체를 포함하는 CRE/lox 시스템의 사용은 널리 문서화되어 있다.
에스 . 세레비지애(S. Cerevisiae)로부터의 frt 부위 및 flp 재조합효소를 이용하는 유사한 시스템이 이용되어 유사한 효과를 낼 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은, 배양 중인 포유동물 세포에서 결실 사건을 매개하기 위한 CRE/loxP의 임의의 구현은 또한 flp/frt 시스템에 의해 매개될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "면역화하다", "면역화", 및 "면역화하는"은 동물의 후천성 면역계를 항원에 노출시키는 것을 일컫는다. 항원은 투여, 예를 들어 주사, 흡입 또는 섭취 또는 DNA 면역화와 같은 다양한 경로를 이용하여 도입될 수 있다. 동일한 항원에 두 번째 노출 시, 후천성 면역 반응, 즉 T 세포 및 B 세포 반응이 향상된다.
"항원"은 후천성 면역계에 의해 인식되는 펩티드, 지질, 아미노산, 핵산, 당류, 햅텐 또는 화학적 독립체를 일컫는다. 항원의 예에는, 이로 제한되지는 않지만, 박테리아 세포벽 성분, 화분, 및 rh 인자가 포함된다. "표적 항원"은 예를 들어, 특이적 감염제 또는 내인성 또는 외인성 세포 또는 이의 생성물에 대한 면역 반응을 생성하기 위해 선택된 후천성 면역계에 의해 인식되는 항원, 펩티드, 지질, 당류, 또는 아미노산을 나타낸다. 표적 항원에는, 이로 제한되지는 않지만, 박테리아 및 바이러스성 성분, 종양-특이적 항원, 사이토카인, 세포 표면 분자, 생체내 또는 시험관내 방법, 등에 의해서 만들어진 항체 또는 다른 결합 단백질이 그에 대해 임의의 및 모든 항원이 포함된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "제약" 또는 "제약 약물"은 개체 또는 환자에게 투여될 수 있는 임의의 약리학적, 치료적 또는 활성 생물학적 제제를 일컫는다. 특정한 실시양태에서 개체는 동물, 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 인간이다. 용어 "제약적으로 허용가능한 담체"는 제약 약물을 동반할 수 있고, 개체의 면역계와 역반응을 야기하지 않는 임의의 물질을 일반적으로 일컫는다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "투여하는"은 제약 약물 또는 다른 제제, 예를 들어 표적 항원을 개체에게 전이, 전달, 도입, 또는 보유하는 임의의 방식을 일컫는다. 그러한 방식에는 경구 투여, 국소 접촉, 정맥내, 복강내, 근육내, 비강내, 또는 피하 투여가 포함된다.
키메라 Ig 중쇄를 인코딩하는 비-인간 포유동물 및 세포
본 발명의 비-인간 동물 및 세포는 내인성 유전자 분절을 대체하는 비-내인성 Ig 유전자 분절을 포함하는 하나 이상의 변경된 Ig 유전자좌(예를 들어, IgH, Igk, 및/또는 Igλ)를 포함한다. 특정한 실시양태에서, 변경된 유전자좌는 내인성 유전자 분절을 직접적으로 대체한다. 다른 실시양태에서, 변경된 유전자좌는 내인성 유전자 분절을 기능적으로 대체한다.
비-내인성 유전자 분절은 임의의 종으로부터 유래될 수 있고, 동계의 유전자 분절을 포함할 수 있다. 비-내인성 서열은 예를 들어, 인간, 마우스, 비-인간 영장류, 낙타류, 설치류, 소류, 양류, 말류, 개, 고양이, 염소, 양, 돌고래, 박쥐, 토끼, 및 유대류로부터 유래될 수 있다. 상기 기술된 바와 같이, 비-인간 세포 또는 동물은 임의의 비-인간 동물일 수 있다. 따라서, 본원에 기술된 형질전환 세포 및 동물은 동물이 비-인간 포유동물이라면, 종의 임의의 조합으로부터 유래된 DNA 서열을 포함할 수 있다. 예로써, 인간 또는 낙타 Ig 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 키메라 마우스 세포 및 마우스가 상정된다. 추가로, 형질전환 세포 또는 동물은 하나 보다 많은 종으로부터의 비-내인성 DNA를 포함할 수 있다. 예를 들어, 형질전환 마우스 게놈은 인간 및 낙타 DNA 서열 둘 다를 포함할 수 있다.
본원에 기술된 형질전환 세포 및 동물은 하나 이상의 비-내인성 V 유전자 분절을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 바람직한 비-인간 동물은 포유동물이다. 특정한 실시양태에서, 세포 또는 동물은 하나 이상의 비-내인성 J 유전자 분절을 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 키메라 IgH 쇄를 포함하는 세포 또는 동물은 선택적으로 하나 이상의 비-내인성 D 유전자 분절을 추가로 포함한다.
일 실시양태에서, 세포 또는 동물은 키메라 IgH 쇄 및 형질전환 경쇄를 인코딩하는 게놈을 포함한다. 형질전환 경쇄는 Igκ 또는 Igλ 경쇄일 수 있다. 추가로, 형질전환 경쇄는 키메라일 수 있거나, 형질전환 경쇄는 비-내인성 아미노산 서열만을 포함할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 세포 또는 동물은 비-내인성 IgH, Igκ 및 Igλ 유전자 분절을 인코딩하는 게놈을 포함한다. 본원에 기술된 키메라 IgH 쇄를 포함하는 형질전환 세포 및 포유동물은 특정 내인성 CH 유전자, 예를 들어, Cμ, Cδ, 또는 Cγ에서 CH1 도메인을 대체하는 비-내인성 CH1 도메인을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 비-내인성 CH1 도메인은 내인성 CH 영역에 대해 이종상동성이다. 다른 실시양태에서, 비-내인성 CH1-도메인은 내인성 CH 영역에 대해 이종상동성이 아니다. 다른 실시양태에서, 하나 보다 많은 내인성 CH1 도메인이 비-내인성 CH1 도메인으로 대체된다. 관련된 실시양태에서,모든 내인성 CH1 도메인은 비-내인성 CH1 도메인으로 대체된다. 예를 들어, 이종상동성 인간 CH1은 각각의 내인성 Cγ 유전자를 대체할 수 있다(예를 들어, 인간 Cγ1 CH1은 마우스 Cγ1 CH1을 대체하고 인간 Cγ2 CH1은 마우스 Cγ2 CH1을 대체하는 등). 또 다른 실시양태에서, 각각의 내인성 Cγ유전자의 CH1 도메인을 대체하는 CH1 도메인은 치료학적 mAb에서 더욱 빈번하게 사용되는 단일 인간 IgG 이소타입, 전형적으로 Cγ1, Cγ2 또는 Cγ4이며, 보다 임상적으로 관련된 인간 CH1 도메인의 맥락에서 인간 V 도메인의 생체 내 돌연변이를 더욱 촉진한다.
선택적으로, 내인성 C 유전자의 상부 힌지 서열은 또한 이종상동성 비-내인성 C 힌지 서열로 대체될 수 있다. 대안적으로, 내인성 C 유전자의 상부 및 중간 힌지 서열은 또한 이종상동성 비-내인성 C 힌지 서열로 각각 대체될 수 있다. 인간 중간 힌지 영역이 사용된 경우, 인간 Cγ4 중간 힌지 서열은 조작되어 이황화결합을 통한 중쇄간 이량체화를 유도하기 위해 229 잔기 위치에서 세린보다는 프롤린을 함유할 수 있다. 내인성 Cγ 유전자의 하부 힌지 영역인 CH2 도메인의 일부는 내인성 FcγR에의 최적의 결합을 촉진하기 위하여 대체되지 않을 수 있다. 이러한 세가지의 선택적인 조작 전략은 각각, 비-내인성 중쇄 Fab 도메인, Fab 도메인+상부 힌지, 또는 F(ab')2를 제공한다. 상부 힌지 영역이 인간 상부 힌지 영역으로 대체되는 경우, 결과적인 항체의 가변 영역은 완전 인간 IgG로 전환시 최적의 특성을 보유할 가능성이 높다.
다른 실시양태는 천연 세포내 신호 전달을 제공하고, B-세포 수용체에 있는 IgH의 Igα및 Igβ와의 연합을 가능하게 하여, 그 안에서 B-세포 수용체를 함유하는 Igα, Igβ 및 IgG로부터의 내인성-형 신호전달을 허용하기 위하여, CH1-힌지-CH2-CH3(-CH4)를 포함하는 C 영역을 포함하는 완전한 비-내인성, 예를 들어, 인간, Ig 및 동족의 동계, 예를 들어, 마우스, 막 및 세포내 도메인을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 중쇄 불변 영역의 막 및 세포내 도메인은 동일한 또는 비-동족의 동계 중쇄 이소타입으로부터 얻는다. 이러한 불변 영역 유전자의 조작은 하기 상세한 바와 같이 본 발명의 방법을 사용하여 용이하게 달성될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 기술된 키메라 IgH 쇄를 포함하는 형질전환 세포 및 동물은 2개 이상의 종으로부터 유래된 비-내인성 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 불변 영역을 포함한다. 예를 들어, 인간 CH1 도메인, 인간 상부 힌지 영역, 및 랫트 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 키메라 IgH 쇄 불변 영역을 인코딩하는 게놈을 갖는 형질전환 마우스가 상정된다. 이종발생성 불변 영역을 갖는 동물에서, 내인성 FcR과 상호작용(예를 들어, 결합)할 수 있는 불변 영역이 바람직하다.
또 다른 실시양태에서, 본원에 기술된 키메라 IgH 쇄를 포함하는 형질전환 세포 및 동물은 2가지 종류로부터 유래된 비-내인성 폴리뉴클레오티드 서열 및 내인성 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 불변 영역을 포함한다. 예를 들어, 인간 CH1 도메인, 인간 상부 힌지 영역, 및 CH2 및 CH3에 대한 Balb/c-서열 엑손이 그들의 B6 대응부를 대체하는 것을 제외하고는 모든 B6 유전적 정보를 포함하는, C57BL/6 ("B6") 게놈 DNA 내 내장된(embedded) Balb/c 마우스 CH2 및 CH3 코딩 서열을 포함하는 키메라 IgH 쇄 불변 영역을 인코딩하는 게놈을 갖는 형질전환 마우스가 상정된다.
일 실시양태에서, 복합 IgH 서열은 D 유전자 클러스터를 통해 VH6 프로모터의 적어도 3 kb 상류부터 JH6의 3'까지 포함하며 모두 인간이며 생식계열 구성이다. 또 다른 실시양태에서, 복합 IgH 서열은 D 유전자 클러스터를 통해 VH6 프로모터의 적어도 3 kb 상부부터 JH6의 3'까지 포함하며, D 유전자 클러스터가 이종발생성 종의 모든 또는 부분에 의해 대체되는 것을 제외하고 모두 인간이며 생식계열 구성 내부이다. 본 발명의 또 다른 관점에서, 인간 VH6의 추가적인 인간 VH 유전자가 있다. 다른 관점에서, 추가적인 VH 유전자는 생식계열 구성이다. 대안적인 관점에서, 추가적인 VH 유전자는 인간 게놈에서의 크기보다 작은 크기이며, 단위 크기는 시스-조절 요소 및 트랜스-액팅 인자에 대한 결합 부위와 같은 상류 조절 요소, 코딩 서열, 인트론 및 각각의 VH의 마지막 코돈의 하류 500 bp를 포함한다. 일 관점에서, 단위 크기는 10 kb 미만이다. 또 다른 관점에서, 단위 크기는 5 kb 미만이다. 또 다른 관점에서, VH 유전자는 인간 하플로타입 가운데 공통적으로 공유된 VH 유전자의 서브세트로부터 선택된다. 또 다른 관점에서, VH 유전자, DH 유전자 및 JH 유전자는 인간 모집단에서 가장 우세한 대립유전자와 같은 특정 대립유전자를 반영하도록 선택된다. 또 다른 관점에서, VH 유전자의 개개의 코돈은 특정 비-인간 포유동물에서 효율적인 발현을 위해 코돈-최적화된다. 또 다른 관점에서 개개의 코돈은 체세포 초돌연변이(somatic hypermutation)를위한 주형이 되도록 최적화된다.
다른 실시양태에서, 복합 IgH 서열은 D 유전자 클러스터에 가장 가까운 기능적인 VH 유전자 예를 들어, VH5-2에 대한 프로모터의 적어도 3 kb 상류에서 시작하여 생식계열 구성의 JH4의 3'까지의 마우스 DNA 서열을 포함하고, 인간 코딩 서열에 의해, 모두 또는 부분에서, 코딩 서열이 대체되었으며, 예를 들어, 마우스 VH5-2에 대한 코딩 서열이 인간 VH6-1에 대한 코딩 서열에 의해 대체되고, 마우스 DH 코딩 서열이 인간 DH 코딩 서열에 의해 대체되고, 마우스 JH 코딩 서열이 인간 JH 코딩 서열에 의해 대체된다. 예로 인간 코딩 요소의 숫자는 마우스의 요소의 숫자를 초과하여, 예를 들어 6개 인간 JH 코딩 서열 대 4개 마우스 JH 코딩 서열이며, 추가적인 JH 유전자는 다양한 방식에 의해, 예를 들어 JH4의 하류 재조합 신호 서열과 같은, 그들의 시스 조절 요소와 함께 추가적인 인간 JH 코딩 서열을 삽입함에 의해 포함될 수 있거나, 모두 함께 생략될 수 있다.
다른 실시양태에서, 마우스 VH 코딩 서열은 인간 VL 코딩 서열에 의해 모두 또는 부분적으로 대체된다. 일부 실시양태에서, 전체 DH 유전자 클러스터는 마우스 서열의 것이다. 다른 실시양태에서, 전체 DH 유전자 클러스터는 이종발생성 종의 것이다. 본 발명의 또 다른 관점에서, VH6 코딩 서열의 상류에 추가적인 VH 유전자가 있어서, 기능적인 VH 유전자의 코딩 서열이 인간 VH 유전자의 코딩 서열로 대체되는 것을 제외하고 그러한 모든 서열은 마우스이다.
또 다른 관점에서, 추가적인 VH 유전자는 생식계열 구성이다. 대안적인 관점에서, 추가적인 VH 유전자는 마우스 게놈의 것보다 작은 크기이며, 단위 크기는 시스-조절 요소 및 트랜스-작용 인자에 대한 결합 부위와 같은 상류 조절 요소, 코딩 서열, 인트론 및 각각의 VH의 마지막 코돈의 하류 500 bp를 포함한다. 일 관점에서, 단위 크기는 10 kb 이하이다. 또 다른 관점에서, 단위 크기는 5 kb 이하이다.
다른 관점에서, VH 유전자는 기능적이라고 공지된 세브세트로부터 선택되며, 대체 인간 VH 유전자 코딩 서열은 공지된 기능적인 인간 VH 유전자로부터 오며 대체 마우스 VH 유전자 코딩 서열은 공지된 기능적 마우스 VH 유전자로부터 온다. 또 다른 관점에서, 인간 VH 코딩 서열은 인간 하플로타입 가운데 공통적으로 공유된 VH 유전자의 서브세트로부터 선택된다. 또 다른 관점에서, 대체 VH 코딩 서열, DH 코딩 서열 및 JH 코딩 서열은 인간 모집단에서 가장 우세한 대립유전자와 같은 특정 대립유전자를 반영하도록 선택된다. 또 다른 관점에서, 대체 VH 코딩 서열, DH 코딩 서열 및 JH 코딩 서열의 일부 또는 모두는 인간이 아닌 이종발생성 종으로부터의 것이다. 또 다른 관점에서 VH 유전자의 개개의 코돈은 특정 비인간 포유동물에서의 효율적 발현을 위해 코돈-최적화된다. 다른 관점에서, 개별 코돈은 체세포 초돌연변이에 대한 주형이 되도록 최적화된다.
다른 실시양태에서, 복합 IgH 서열은 그들의 인간 대응부에 의해 마우스 Cμ 및 Cδ의 CH1 도메인이 대체된 것을 제외하고, 추가로 모두 생식계열 구성인 마우스 JH4의 바로 하류의 가장 3' JH 마우스 서열의 3'부터 Eμ를 통과해 Cμ를 통과해 Cδ를 통과해 Cγ3 프로모터의 바로 5'까지 포함한다. 일부 예에서, 마우스 상부 힌지 영역은 그들 각자의 인간 상부 힌지 영역에 의해 대체된다. 추가의 실시양태에서, 마우스 Cγ유전자는 인간 CH1 도메인에 의해 그의 CH1 도메인이 대체됨을 제외하고 생식계열 구성으로 설정된다.
일부 예에서, 마우스 상부 힌지 영역은 인간 상부 힌지 영역에 의해 대체된다. 일부 실시양태에서, 마우스 Cγ3 코딩 서열은 인간 CH1 및 마우스 CH2, CH3, Cγ1으로부터의 막 및 세포내 도메인에 의해 대체된다. 또 다른 실시양태에서, 스위치 영역의 상류의 프로모터로부터 세포내 도메인 및 3' 비번역된 서열을 통과해 폴리(A) 부위까지의 완전 생식계열-구성된 마우스 Cγ3 서열은, 키메라 Cγ1에 의해 완전 Cγ3 유전자를 효과적으로 대체하도록 Cγ1로부터의 마우스 CH1을 인간 CH1로 대체한 생식계열 구성의 Cγ1로부터의 완전한 상응 서열에 의해 대체된다. 일부 실시양태에서, 마우스 불변 코딩 서열은 인간 CH1 및 상이한 마우스 불변 영역 이소타입으로부터의 마우스 CH2, CH3, 막, 및 세포내 도메인 예를 들어, CH2, CH3로부터의 세포내 도메인 마우스 Cγ2a로부터의 CH2, CH3 및 막 도메인 및 Cμ로부터의 세포내 도메인에 의해 대체된다. 여전히 다른 실시양태에서, CH2 및 CH3 도메인의 서열은 추가로 변경되어 억제성 수용체, FcgR2b에 결합을 약화시키는 것과 같이, Fc 수용체에의 결합을 조정하며, 그 안에서 더 강한 2차 면역 반응이 생성된다.
다른 실시양태에서, 세포 또는 비-인간 동물은 인간 Igκ 가변 영역을 포함하는 인간 Ig 경쇄를 인코딩하는 유전자좌를 포함한다. 관련된 실시양태에서, Ig 경쇄 유전자좌는 인간 Igκ 불변 영역을 추가로 포함한다. 일 실시양태에서, 복합 Igκ 서열은 마우스 Jκ1에 가장 근위인 Vκ 유전자(Vκ3-1)의 프로모터의 적어도 3 kb 상류로부터 마우스 Jκ5의 3' 까지의 마우스 DNA 서열을 포함하며 생식계열 구성이고 코딩 서열은 인간 코딩 서열에 의해, 모두 또는 부분이 대체되었으며, 예를 들어, 마우스 Vκ3-1에 대한 코딩 서열은 인간 Vκ4-1에 대한 코딩 서열에 의해 대체되고 마우스 Jκ 코딩 서열은 인간 Jκ 코딩 서열로 대체된다. 다른 실시양태에서 Jκ5로부터 Cκ까지 서열은 마우스이며 생식계열 구성이고, Cκ 코딩 서열은 인간 코딩 서열에 의해 모두 또는 부분이 대체되었다.
다른 관점에서 Cκ 유전자의 하류에 3' LCR 영역 및 RS 요소가 있다. 일 관점에서, 3' LCR 및 RS 요소는 마우스이며 생식계열 구성이다. 본 발명의 또 다른 관점에서, 인간 Vκ4-1에 대한 코딩 서열의 상류에 추가적인 Vκ 유전자가 있어, 모든 서열은 인간 Vκ 유전자의 코딩 서열로 기능적 Vκ 유전자의 코딩 서열을 대체하는 것을 제외하고는 마우스이다.
또 다른 관점에서, 추가적인 Vκ 유전자는 생식계열 구성이다. 대안적인 관점에서, 추가적인 Vκ 유전자는 마우스 게놈의 유전자보다 크기가 작고, 단위 크기는 시스-조절 요소 및 트랜스-작용 인자에 대한 결합 부위와 같은 상류 조절 요소, 코딩 서열, 인트론 및 각각의 Vκ의 마지막 코돈의 하류 500bp와 같은 상부 조절 성분을 포함한다. 일 관점에서, 단위 크기는 10 kb 이하이다. 또 다른 관점에서, 단위 사이즈는 5 kb 이하이다. 또 다른 관점에서, Vκ 유전자는 인간 하플로타입 가운데 공통적으로 공유된 Vκ 유전자의 서브세트로부터 선택된다. 다른 관점에서, Vκ 유전자 및 Jκ 유전자는 인간 모집단에서 가장 우세한 대립유전자와 같은 특정 대립유전자를 반영하도록 선택된다. 또 다른 관점에서, Vκ 유전자의 개개의 코돈은 특정 비-인간 포유동물에서의 효율적인 발현을 위해 코돈-최적화된다. 다른 관점에서 개개의 코돈은 체세포 초돌연변이에 대해 주형이 되도록 최적화된다.
또 다른 실시양태에서, 인간 Ig 경쇄 유전자좌는 인간 Igλ 경쇄 유전자좌의 모든 또는 일부분 및 Igλ 3'LCR, 또는 그의 기능적 단편을 포함한다. 일 실시양태에서, 인간 Igλ 경쇄 유전자좌는 전체 인간 Igλ 유전자좌를 포함한다. 또 다른 실시양태에서 인간 Igλ 경쇄 유전자좌는 인간 Vλ 코딩 서열 및 1개 내지 7개 Jλ-Cλ 코딩 서열 쌍을 포함하며, 여기서 인간 Cλ는 동계의 Cλ로 대체된다. 또 다른 실시양태에서, 인간 Igλ 경쇄 유전자좌는 인간 Vλ 코딩 서열, 1개 내지 7개 인간 Jλ 코딩 서열, 및 단일 인간 Cλ 코딩 서열을 포함하며, 여기서 인간 코딩 서열은 인간 Igλ 유전자좌 구성과 비슷하다.
특정한 실시양태에서, Igλ 3'LCR, 또는 그의 기능적 단편은 인간, 비-인간 영장류, 및 랫트로 구성된 그룹으로부터 선택된 포유동물로부터의 것이다. 일 실시양태에서, Igλ 3'LCR, 또는 그의 기능적 단편은 인간이다. 특정한 실시양태에서, Igλ 3'LCR, 또는 그의 기능적 단편은 NFκb와 결합한다. 일 실시양태에서, Igλ 3'LCR, 또는 그의 기능적 단편은, 마우스로부터의 것이며 NFκb의 결합을 복구하도록 돌연변이 유발되었다. 다른 실시양태에서, 인간 Igλ 유전자좌 내의, 3'LCR, 또는 그의 기능적 단편은 Igκ3'LCR, 또는 그의 기능적인 단편이다.
일 실시양태에서, 복합 Igλ 서열은 Vλ 3r 프로모터의 적어도 3 kb 상류로부터 Jλ7- Cλ7의 3'까지를 포함한다. 또 다른 관점에서, Jλ7- Cλ7로부터 λ3' LCR까지의 서열은 인간이며 생식계열 구성이다. 본 발명의 다른 관점에서, 인간 Vλ3r의 상류에 추가적인 인간 Vλ유전자가 있다. 다른 관점에서, 추가적인 Vλ 유전자는 생식계열 구성이다. 대안적인 관점에서, 추가적인 Vλ 유전자는 인간 게놈 내부에서의 크기보다 더 작은 크기이며, 단위 크기는 시스-조절 요소 및 트랜스-작용 인자에 대한 결합 부위와 같은 상류 조절 요소, 코딩 서열, 인트론 및 각각의 Vλ의 마지막 코돈의 하류 500bp를 포함한다. 일 관점에서, 단위 크기는 10 kb 이하이다. 다른 관점에서, 단위 크기는 5 kb 이하이다. 다른 관점에서, Vλ 유전자는 인간 하플로타입 가운데 공통적으로 공유된 Vλ 유전자의 서브세트로부터 선택된다.다른 관점에서, Vλ 유전자 및 Jλ 유전자는 인간 모집단에서 가장 우세한 대립유전자와 같은 특정 대립유전자를 반영하도록 선택된다. 또 다른 관점에서, Vλ 유전자의 개개의 코돈은 특정 비-인간 포유동물에서의 효율적인 발현을 위해 코돈-최적화된다. 또 다른 관점에서 개개의 코돈은 체세포 초돌연변이에 대해 주형이 되도록 최적화된다.
키메라 세포 및 동물의 제조
본 발명의 특정한 실시양태는 동물 및 세포를 제조하는 방법을 제공한다. 항체 생산 포유동물에서, 예를 들어 내인성 Ig V, (D) 및 J 유전자가 비-내인성 (예를 들어, 인간) Ig 유전자 분절에 의해 대체된다. 특정한 실시양태에서, 내인성 면역글로불린 (Ig) V, (D) 및 J 유전자는 비-내인성 이종상동체에 의해 직접적으로 대체된다. 다른 실시양태에서, 내인성 유전자는 본원에 기술되고 당해 기술 분야에 공지된 다양한 기술을 사용하여 불활성화되는 한편, 내인성 유전자는 비-내인성 이종상동체에 의해 기능적으로 대체된다.
예를 들어, 비-내인성 V, D 및 J 유전자의 큰 부분을 보유하는 하나 이상의 작제물은 내인성V, D 및 J 유전자의 모두 또는 부분을 대체할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 이는 각각의 Ig 유전자좌 내로 또는 인접하게 작제물을 상동적으로 재조합함으로써 수행될 수 있다. 따라서, 작제물은 순차적("보행((walking)")대체에 의해, 또는 2개의 작제물을 내인성 Ig 유전자좌 내로 또는 인접하게 도입하고 후속적으로 개재 서열을 제거함으로서 내인성 서열을 대체할 수 있다.
키메라 면역글로불린 중쇄를 포함하는 게놈을 갖는 세포를 생산하는 예시적인 방법이 제공되며, 여기서 중쇄는 비-내인성 가변 도메인 및 키메라 불변 영역을 포함하며, 상기 방법은 (1) 제1 DNA 작제물을 제조하는 단계로서, 여기서 제1 작제물은 하나 이상의 비-내인성 VH, DH 및/또는 JH 유전자 분절, 제1 및 제2 플랭킹 영역을 포함하고, 여기서 제1 플랭킹 영역은 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 5' DNA 서열 및 제1 작제물의 3' 말단에 가까운 제1 부위 특이적 재조합 인식 서열과 상동성인 단계; (2) 제2 DNA 작제물을 제조하는 단계로서, 여기서 제2 작제물은 하나 이상의 비-내인성 불변 영역 유전자 분절, 제3 및 제4 플랭킹 영역을 포함하고, 여기서 제4 플랭킹 영역은 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자좌의 3' DNA 서열 및 제2 작제물의 5' 말단에 가까운 제2 부위-특이적 재조합 인식 서열과 상동성인 단계; (3) 제1 및 제2 작제물을 세포의 게놈으로 상동적으로 재조합하는 단계; 및 (4) 부위-특이적 재조합효소를 세포로 도입함으로써, 이에 따라 제1 과 제2 부위-특이적 재조합효소 인식 서열 사이의 개재 서열을 제거하는 단계를 포함한다.
대안적으로, 작제물은 조직 배양에서 세포 내로 형질감염시키거나 수정란 내로 전-핵 미세주입하여 비-인간 동물 세포 내로 도입될 수 있으며, 비-내인성 서열은 게놈 내로 무작위로 통합된다. 내인성 유전자좌의 별도의 기능적 불활성화(즉, "녹-아웃")는 당해 기술분야에 공지된 또는 본원에 기술된 방법을 사용해 배양액 내에 포유동물 세포에서 유전자를 표적화함으로써 또는 징크-핑거 뉴클레아제 또는 메가뉴클레아제의 사용과 같은 다른 방법에 의해 수행될 수 있다.
JH 하류의 IgH 유전자좌의 모두 또는 부분을 보유하는 작제물은 조작되어 각각의 불변 영역 유전자에서, 내인성 CH1 도메인이 비-내인성 CH1 도메인으로 대체될수 있다. 이는 대장균에서 BAC 또는 에스 . 세레비지애에서 YAC의 재조합과 같은 당해 기술분야에 공지된 기술에 의해 달성될 수 있다. 이러한 대체는 순차적 상동성 재조합 유도된, 비-내인성 CH1 도메인에 의한 내인성 CH1 도메인의 녹-인 대체를 사용하여 또한 달성될 수 있다. 재조합체를 선택하기 위해 사용되는 선택 마커는 부위-특이적 재조합효소 인식 서열, 예를 들어, loxP 부위에 의해 플랭킹될 수 있고 부위-특이적 재조합 효소, 예를 들어 CRE에의 후속적인 노출을 통해 결실될 수 있다. 각각의 단계에서 선택적인 마커를 플랭킹하기 위한 상이한 변형 loxP 부위의 사용은 특정 loxP 부위 사이의 서열만으로 CRE-매개의 결실을 제한하고, 이미 존재하는 loxP 부위로의 긴-범위 결실을 방지한다. 대안적으로, 각각의 불변 영역 유전자에서, 인간 및 마우스와 같은 유기체의 공개된 게놈 서열을 기초로 하여 정확하게 DNA를 합성 및 조립 할 수 있는 능력을 사용하여, 내인성 CH1 도메인이 비-내인성 CH1 도메인으로 대체되도록, JH의 하류의 IgH 유전자좌 모두 또는 부분을 보유하는 작제물이 조작될 수 있다. 이러한 합성 및 조립은 당해 기술분야에 널리 알려져 있으며 상업적 업체에 의해 행해진다(예를 들어, DNA2.0, 캘리포니아, 멘로파크; 워싱턴, 보트헬, 블루 헤론 바이오테크놀로지).
본원에 기술된 바와 같은 키메라 중쇄를 포함하는 세포를 제조하기 위한 방법에 따르면, J 유전자 클러스터의 내인성 IgH 유전자좌를 포함하는 작제물 - 여기서 각각의 유지된 C 유전자는 비-내인성 CH1-내인성 CH2-CH3(및 Cμ에 대한 CH4), 막 및 세포내 도메인 엑손을 포함함 - 이 생성되고, 비-인간 세포의 게놈으로 도입된다. 특정한 실시양태에서, 상기 작제물은 내인성 IgH 유전자좌로 또는 인접하게 상동성 재조합된다. 다른 실시양태에서, 작제물은 세포의 게놈으로 무작위로 통합된다. 작제물은 하나 이상의 비-내인성 V 유전자 분절을 추가로 포함할 수 있다. 대안적인 실시양태에서, 불변 영역 유전자 분절을 포함하는 상기 작제물은 비내인성 V 유전자 분절로 내이성 V-D-J 유전자가 대체되는 것이 뒤따르는 제1 도입 단계로서, 또는 반대 순서로, 즉 본원에 기술된 대로 조작된 불변영역 유전자 분절을 포함하는 작제물의 도입이 뒤따르는 비내인성 V 유전자 분절의 도입으로 세포 게놈 내로 도입된다.
비-내인성 Ig 유전자 분절을 도입하기 위해 하나 초과의 작제물을 사용하는 경우, Ig 유전자좌의 내용(content)은 한 작제물 상의 불변 영역 유전자 분절 및 다른 하나의 작제물 상의 가변 영역 유전자 분절로만 제한되지 않는다. 예를 들어, C 유전자 분절을 포함하는 작제물은 하나 이상의 J 유전자 분절, D 유전자 분절 및/또는 V 유전자 분절을 포함할 수 있다. 유사하게, V 유전자 분절을 포함하는 작제물은 D 유전자 분절,J 유전자 분절 및/또는 C 유전자 분절 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.
불변 영역 유전자를 보유하는 작제물은 Cε 및 Cα 유전자와 같은 임의의 원치않는 또는 필요치않는 유전자 분절을 결실시키기 위해, ES 세포로 도입하기 전에 시험관내 대장균 또는 에스 . 세레비지애에서 조작되거나 시험관내 합성될 수 있다. 이는 동물이 1차 면역 반응에 대해 Cμ 및 Cδ, 및 2차, 친화성-성숙된 면역 반응에 대해 Cγ 이소타입을 만들도록 할 것이며, 이로부터 치료학적 항체 후보자가 전형적으로 회수될 것이다.
추가로, 작제물은 코딩 및 비-코딩 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는데, 비-코딩 폴리뉴클레오티드 서열은 비-내인성 또는 동계 폴리뉴클레오티드 서열 중 하나일 수 있다. 예를 들어, 내인성(즉, 동계) IgH 3'유전자좌 제어 영역 (LCR), 또는 그의 일부분은 가장 3' CH 유전자의 하류에 포함되고, Eμ, 또는 그의 부분은 가장 3'JH와 Cμ, Sμ 및 Sγ 영역의 모두 또는 일부분, V 유전자 분절과 같은 유전자 분절의 상류 프로모터 및 CH 스위치 영역 및 재조합 신호 서열(RSS) 사이에 포함된다. 추가로, 가장 3' VH 유전자와 D 클러스터의 개시 사이의 유전자간 영역 사이 및 Cδ와 제 1 Cg 스위치 영역 사이의 유전자간 영역과 같은 유전자 조절 기능을 갖는 것으로 가정된 다른 유전자간 영역을 포함하는 것이 유리하다. 상응하는 요소는 기록된 기능 및 위치를 갖는 Ig 경쇄 유전자좌, 예를 들어 Eκ, Igκ 3' LCR 및 Ed에 존재한다. 내인성 마우스 Igλ 경쇄 유전자좌가 결함 있는 3' LCR을 소유하기 때문에, 다른 종, 예를 들어 마우스보다는 인간, 설치류로부터의 이종상동성 기능적인 Igλ 3' LCR을 이용하거나, 또는 NFκb 결합을 회복시키기 위해 마우스 3' LCR을 돌연변이시키는 것이 유리하다.
완전 비-내인성 Cκ 유전자가 작제물에 통합되어 완전한 비-내인성 Igκ 쇄를 생산하는 것을 제외하고는 내인성 Igκ 유전자좌에 대해 유사한 전략이 적용될 수 있다. 비-내인성 Cλ 유전자좌는 유사한 방식으로 또한 통합될 수 있다. 예를 들어, 완전한 인간 Igκ 쇄를 인코딩하는, 인간 Vκ 및 Cκ 유전자 분절을 포함하는 작제물이 생성될 수 있다. 유사하게, 완전한 인간 Igλ 쇄를 인코딩하는, 인간 Vλ 및 Cλ 유전자 분절을 포함하는 작제물은 생성될 수 있으며 .
본 발명의 또 다른 관점은 완전 내인성 Ig 유전자좌 대신에, 인간 C 영역을 포함하는, 완전한 인간 Ig 유전자좌를 통합하는 것을 포함한다. 추가적인 실시양태에서, 내인성 FcR 유전자의 클러스터는 마우스 ES 세포와 같은 상동성 재조합 수용 세포에서 유사한 BAC-기반 유전 공학을 사용하여 인간 FcR 유전자의 이종상동성 클러스터로 또한 대체된다. 내인성 FcγR 유전자의 클러스터는 인간 IgH 유전자좌 또는 그의 부분이 내인성 유전자좌를 대체한 동일한 ES 세포에서 또는 별도의 ES 세포에서 직접적으로 대체될 수 있다. 대안적으로, 내인성 FcγR유전자의 클러스터는 인간 IgH 유전자좌 또는 그의 부분이 내인성 유전자좌를 대체한 동일한 ES 세포에서 또는 별도의 ES 세포에서 기능적으로 대체될 수 있다. 후자의 예에서, 마우스는 상기 ES 세포로부터 유래될 것이며 마우스 FcγR 유전자 대신에 인간 FcγR에 결합하는 인간 IgG 항체를 만드는 마우스를 제조하기 위하여 조작된 Ig 유전자좌(유전자좌들)를 보유하는 마우스와 교배될 수 있다. 둘 중 어느 쪽에서든, 완전한 인간 항체가 제조될 것이며 면역 반응 동안에 인간 FcR 수용체와 정상적으로 관계지어질 것이다. 이러한 형질전환 동물은 또한 모델 즉, SCID, nu/nu, nod, 및 lpr 마우스에 대해 적절한 유전적 배경 상에서 교배될 경우 질환 모델에서 인간 치료학적 mAb 후보의 활성 및 이펙터(effector) 기능에 대해 시험하는데 유용한 이점을 가질 수 있다. 또한, 인간 표적 유전자 서열은 상동성 재조합-수용 세포에서 BAC 표적화 기술을 사용하여 내인성 유전자를 대체하여 표적 확인 및 항체의 기능적인 시험에 대한 모델을 제공할 수 있다. 이러한 예에서, 인간 CH 유전자는 B 세포에서 천연 신호 전달을 촉진하도록 마우스 또는 다른 이종상동성 종으로부터의 세포질 및/또는 막 도메인 유전자 분절을 가지도록 조작될 수 있다. 전체 내인성 FcγR 유전자좌를 인간 FcγR 유전자좌에서 야생형 유전자의 완전 보체로 대체하는 대신, 특정한 FcγR은 돌연변이 되어 약화된 기능을 가지거나 전부 결실될 수 있다. 예를 들어, 억제성 인간 FcγR2b를 불활성으로 만드는 돌연변이 및 마우스 이종상동체의 동시적인 불활성화를 것은 둘 다의 돌연변이를 보유한 유전적으로 조작된 마우스를 발달하는 자가 반응 B 세포에 더욱 민감하게 하여, 항원에 대한 완전한 인간 항체 반응을 확장하는 결과적인 잠재 이점을 갖게 된다.
추가로, 본 발명의 또 다른 관점은 목적한 비-내인성 V 영역(예를 들어, 인간)의 고안에 관한 것이다. 특히, 전체 V 도메인 레파토리, 또는 그의 일부분은, 세포의 게놈으로 통합될 수 있거나, 맞춤된 V 도메인 레파토리가 통합될 수 있다. 예를 들어, 특정한 실시양태에서 일부 인간 하플로타입으로부터 빠져있는 V 도메인 유전자 분절을 제외시키고, 대신에, V 도메인 레파토리를 모든 공지된 인간 하플로타입에 걸쳐 공통인 기능적인 V 유전자 분절만으로 구성되도록 맞춤하는 것이 바람직하다. 그렇게 하는 것은 모든 잠재적인 환자에 걸쳐 용인되는 더 나은 면역성인 V 도메인을 가진 항체 약물 후보자를 제공하며, 이에 따라 개체에 인코딩된 항체의 투여시 위험한 면역 반응의 유도를 방지한다. 하나 이상의 V 도메인 분절은 세포의 게놈으로 통합될 수 있다.
본 발명의 특정한 실시양태에서, 원하는 Ig 유전자좌 유전자 분절을 함유하는 작제물은 상동성 재조합을 통해 표적 세포 게놈으로 유전적 정보를 통합하는데 사용된다. 특히, 대장균에서의 BAC 조작의 본질은 수용성 세포로 도입되기 전에 면역글로불린 유전자좌를 미세하게 조정할 추가적인 기회를 제공한다. BAC 라이브러리 및 Ig 유전자좌의 완전한 서열은 수많은 종에서 이용가능하다. 합성적 작제물이 또한 본원에서 기술된 바와 같이 미세하게 조정될 수 있다.
본원에 기술된 작제물을 미세하게 조정하는 능력은 특정 비-내인성 및 동계 성분을 도입할 수 있는 능력을 제공한다. 예를 들어, 비-내인성 DH 클러스터는 비-인간 영장류, 토끼, 랫트, 낙타, 햄스터 등과 같은 다른 종으로부터의 D 유전자로 대체되거나 보충될 수 있다. IgH 유전자좌 내의 D 유전자 분절은 공개적으로 이용가능한 서열 또는 유전적 구조 정보로부터, 또는 적절한 D 특이적 프로브 또는 프라이머를 사용하여 시험함으로써 규명될 수 있다. 이종상동성 D 유전자 클러스터 또는 그의 부분은 작제물 내로 상동성 재조합되거나 인실리코 조립되고 그 후 합성되어, 그 안에서 비- 내인성 D 유전자 분절의 클러스터를 대체하거나 첨가될 수 있다.
상보성 결정 영역-3(CDR3)을 만드는데 발생하는 현저한 다양성 때문에 그리고 V 영역의 구조가 CDR3가 상대적으로 용매 접근이 불가능하기 때문에, CDR3 서열에 대한 면역원성은 덜 염려된다. 따라서, CDR3로 통합된 비-인간 D 유전자에 의해 인코딩된 아미노산은 인간에게 투여시 덜 면역원성일 것으로 예상된다. 다른 종으로부터 유래된 D 유전자는 항원-특이적 항체의 패널에서 에피토프 특이성 및 친화성의 범위를 확장하는 신규한 CDR3 구조를 생성하고, mAb의 패널에 의해 매개된 활성의 질을 확장시킴으로써 이점을 부여할 수 있다.
유사하게, JH 유전자 클러스터, 즉 하나 이상의 JH 유전자 분절은 포유동물에 걸친 상대적인 서열 보존에 기인한 상이한 비-내인성 종으로부터의 것일 수 있다. JH 유전자 분절은 임의의 동물, 예를 들어 인간, 비-인간 영장류, 토끼, 양, 랫트, 햄스터, 낙타 및 마우스로부터 유래된 것일 수 있다. 특정한 실시양태에서, JH 유전자 분절은 인간이다.
추가의 관점에서, Ig 유전자좌 작제물을 조작한 후에, 작제물은 비-인간 포유동물 세포로 들어가고 게놈으로 무작위로 통합된다. 변경된 Ig 유전자좌, 또는 그의 부분을 포함하는 하나 이상의 작제물을 도입하기 위한 방법은, 예를 들어 전기천공법, 리포펙션, 칼슘 포스페이트 침전, 대장균 스페로플라스트(spheroplast) 융합, 효모 스페로플라스트 융합 및 미세주입이 포함되며, 수정란의 전핵으로 도입되어 직접적으로 형질전환 동물을 만들거나 시험관내에서 배양된 세포로 도입된다. 특정한 실시양태에서, 작제물은 조작되어 선택적인 마커 유전자, 예를 들어, G418R, 하이그로마이신R, 퓨로마이신R, 가장 5'V 유전자의 5'를 보유한다. 선택적인 마커 유전자는 또한 가장 5'V 유전자의 3'일 수 있다, 선택적인 마커 유전자는 부위-특이적 재조합효소 인식 서열에 의해 플랭킹될 수 있는데, 재조합효소의 존재로 가져올 경우, 재조합되어 개입하는 선택적인 마커를 결실시킬 것이다. 이는 선택적인 마커 카세트가 가장 5'V 유전자의 3' 및 인핸서 서열 가까이에 위치할 경우 인핸서의 기능을 약화하기 않도록 하기 위해 특히 중요하다.
특정한 실시양태에서, 2개 이상의 작제물, 예를 들어 BAC는 단일 단계에서 세포로 도입된다. 만약 2개의 작제물이 세포로 동시에 도입될 경우, 작제물은 전형적으로 공동-통합(co-intergrate)될 것이다. 공동-통합된 작제물의 일부는 예를 들어, C 영역 유전자 분절의 5'에 작동적으로 배향된 V, (D) 및 J 분절과 함께 기능적인 헤드-투-테일(head-to-tail) 방식으로 통합될 것이다. 공동-도입된 작제물은 BAC, YAC, 플라스미드, 박테리오파지, P1s 등의 임의의 조합일 수 있다. 일부 예에서, 단일-카피 전이유전자를 만드는, 2개의 작제물의 단일-카피 통합이 있을 것이다. 다른 예에서, 2개의 작제물의 다수-카피 통합이 있을 것이다. 다수-카피 통합은 반드시 바람직하지 않은 것은 아닌데, 이는 복합 카피 통합이 이로운 결과, 예를 들어 전이유전자의 증가된 발현을 산출하여 더 많은 목적 유전자 산물을 초래할 수 있기 때문이다. 그러나, 전이유전자의 단일 카피가 바람직할 경우, 그렇게 하는데 시험관내 및 생체내 과정이 있다
예를 들어, 부위-특이적 재조합효소 서열이 5'작제물의 3' 말단에 위치할 경우 및 부위-특이적 재조합효소 서열이 3' 작제물의 5' 말단에 위치할 경우, 둘 모두 5'에서 3' 방식으로 배향된 5'작제물 및 3'작제물의 결과적인 공동-통합체 말단 5' 작제물과 말단 3' 작제물 사이의 임의의 개재 서열이 부위-특이적 재조합효소에 노출시 결실되고, 따라서 말단 5' 작제물은 말단 3' 작제물에 작동적으로 연결되어, 단일 카피 전이유전자를 생성하도록 배향된 부위-특이적 재조합효소 서열을 가질 것이다. 이 방법은 배양 포유동물 세포에서 시험관 내에서 또는 재조합효소를 발현하는 형질전환 동물에서 생체 내에서 수행될 수 있다(예를 들어, 다수-카피 단일 작제물 전이유전자를 생체 내에서 단일-카피 전이유전자로 분해하는 것, 참조:문헌[Janssens et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (2006) 103: 15130-15135].) 기능적인 전이유전자는 3개 이상의 작제물의 전핵 공동-미세주입에 의해 또한 만들어질 수 있다(참조: 미국 특허출원 공개공보 제2010/0077497호).
본원에 기술된 Ig 유전자좌 또는 유전자좌들을 세포의 게놈으로 도입하여 내인성 Ig 유전자좌, 또는 그의 부분을 대체한 후(예를 들어, 기능적 대체), 비-인간 동물은 제조될 수 있다. 비-인간 포유동물 세포가 배아 줄기 세포일 경우, 유전적으로 조작된 비-인간 포유동물, 예를 들어 마우스 및 랫트는 배반포(blastocyst) 미세주입 후 키메라 동물의 교배, 상실배 응집(morula aggregation)과 같은 방법에 의해 세포로부터 제조될 수 있다. 세포가 체세포일 경우, 체세포 핵 전송과 같은 클로닝 방법론이 형질전환 동물을 제조하기 위해 사용될 수 있다. 다-단계 번식은 변경된 IgH 및 IgL 유전자좌(Igκ 또는 Igλ 중의 하나 또는 Igκ 및 Igλ둘다)에 대해 이종접합성 또는 반접합성인 동물을 제조하기 위해 사용된다. 변경된 IgH 및 IgL 유전자좌를 가진 마우스는 IgH 및 IgL(Igκ 또는 Igλ 중의 하나 또는 Igκ 및 Igλ둘다)에 대해 동형접합성인 마우스를 제조하기 위해 추가로 번식될 수 있다.
본원에 기술된 조작된 Ig 유전자좌는 비-인간 동물에서 기능할 것이다. 적절한 검출 시약, 예를 들어 항-인간 CH1 도메인 항체 또는 항-인간 CL 항체를 사용함으로써, 활성 내인성 유전자좌로부터 발현된 항체의 존재하에서조차도 조작된 유전자좌에 의해 생산된 항체를 검출하는 것이 가능하다. 추가로, 마우스에서, 예를 들어 수용자 마우스 종류, 예를 들어 마우스 IgH a 알로타입(allotype)(Balb/c) 대 IgH b 알로타입(C57BL/6)의 불변 영역의 알로타입 서열과 상이한 전이유전자의 불변 영역의 마우스 부분에서 알로타입 서열을 사용하는 것이 가능하다.
내인성 Ig 유전자좌의 불활성화
특정한 실시양태에서, 수용자 비-인간 포유동물에서 하나 이상의 내인성 Ig 유전자좌를 기능적으로 불활성시키는 것이 바람직할 수 있다. 당해 분야에 공지된 다양한 방법이 내인성 Ig 유전자좌를 불활성시키는데 사용될 수 있다. 조작된 Ig 전이유전자를 포함하는 동물을 하나 이상의 불활성화된 내인성 유전자좌를 포함하는 동물과 교배시켜, Ig 전이유전자가 불활성화된 내인성 유전자좌를 기능적으로 대체한, Ig 전이유전자로부터 항체를 발현할 수 있으며 불활성화된 내인성 유전자좌로부터 완전한 천연 면역글로불린을 생산하지 않는 동물을 유도한다.
인실리코 재조합 결합과 시험관내 DNA 합성 및 조립 기술을 조립하여 DNA 서열을 매우 미세하게 조정하는 것은 상동성 표적 서열의 정확한 결실 및/또는 변경을 가능케한다. 예를 들어, 특정 유전자 분절, 예컨대 J 유전자에 대한 재조합 신호 서열 또는 스플라이스 공여체 서열은 변경 또는 결실될 수 있다.
유전자좌 기능을 조절 저하 및/또는 폐지하도록 변형될 수 있는 IgH 유전자좌의 성분은 JH 클러스터(완전 결실, 재조합 신호 서열(RSS), 스플라이스 공여체 서열 또는 상기의 모두 또는 일부의 제거)(참조, 예를 들어 미국 특허 제5,939,598호), Eμ, Cμ 및 Cδ, D 유전자 클러스터(완전 결실, 재조합 신호 서열(RSS), 스플라이스 공여체 서열 또는 상기의 모두 또는 일부의 제거), VH 유전자(완전 결실, 재조합 신호 서열(RSS), 스플라이스 공여체 서열 또는 상기의 모두 또는 일부의 제거) 및 불변 영역 유전자 모두를 포함한다. Eμ와 같은 중요한 인핸서 요소의 위치에서 PGK와 같은 강한 구성적 프로모터를 위치시키는 것은 유전자좌 기능 상에 극도로 유해한 결과를 가져, 불활성화를 효과적으로 야기할 수 있다.
유전자좌 기능을 조절 저하 및/또는 폐지하도록 변형될 수 있는 Igκ 유전자좌의 성분은 Jκ 클러스터(완전 결실, 재조합 신호 서열(RSS), 스플라이스 공여체 서열 또는 상기의 모든 일부의 제거), Eκ, Cκ 및 Vκ 유전자(완전 결실, 재조합 신호 서열(RSS), 스플라이스 공여체 서열 또는 상기의 모두 또두 일부의 제거)을 포함한다.
유전자좌 기능을 조절 저하 및/또는 폐지하도록 변형될 수 있는 Igλ 유전자좌의 성분은 Jλ 클러스터(완전 결실, 재조합 신호 서열(RSS), 스플라이스 공여체 서열 또는 상기의 모두 또는 일부의 제거), Eλ, Cλ 및 Vλ 유전자(완전 결실, 재조합 신호 서열(RSS), 스플라이스 공여체 서열 또는 상기의 모두 또는 일부의 제거)를 포함한다. 전체 Igλ 유전자좌, IgH 유전자좌 등의 전체 VH 유전자 레파토리와 같은 더 큰 서열 단위의 결실은, 결실되는 서열의 5'및 3' 말단에 인접한 부위-특이적 재조합 서열(lox P 또는 frt)의 순차적인 삽입에 이어서 관련 재조합효소, 예를 들어 CRE 또는 FLP의 일시적인 발현에 의해 이루어질 수 있다. 당해 분야에 공지된 다양한 방법이 내인성 Ig 유전자좌를 불활성시키는데 사용될 수 있다. 예를 들어, Chen J., et al. Int Immunol. 1993 Jun;5(6):647-56; Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (1993) 90: 2551-2555; Nitschke et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (1993) 90: 1887-1891; US Patent No. 5,591,669; Afshar et al., J. Immunol. (2006) 176: 2439-2447; Perlot et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (2005) 97: 14362-14367; Roes and Rajewsky J. Exp Med. (1993) 177: 45-55; Lutz et al. Nature (1998) 393: 797-801; Ren et al. Genomics (2004) 84: 686-695; Zou et al. EMBO J. (1993) 12: 811-820; Takeda et al. EMBO J. (1993) 12: 2329-2336; Chen et al. EMBO J. (1993) 12: 821-830; Zou et al., J. Immunol. (2003) 170: 1354-1361; Zheng et al. Molec. Cell. Biol. (2000) 20: 648-655; Zhu et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (2000) 97: 1137-1142; Puech et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (2000) 97: 10090-10095; LePage et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (2000) 97: 10471-10476; Li et al. Proc. Natl. Acad. Sci. (1996) 93: 6158-6162를 참조한다.
일부 실시양태에서, 다중 결실 또는 다중 돌연변이가 내인성 Ig 유전자좌로 도입되어 내인성 면역글로불린 유전자좌를 불활성 시키는데, 이에 따라 내인성 Ig 유전자좌를 부분적으로 불활성 시키는 문제점을 해결한다. 특히, 2개 이상의 돌연변이는 기능적인 가변 도메인의 형성 및 프라이머리 B 세포 발달을 유도할 수 있는 불변 영역의 형성 모두를 독립적으로 손상시킨다. 돌연변이는 프라이머리 B 세포 발달을 손상시키는데, 수득된 Ig 서열이 (그 자체에 의해서 또는 Igα 및/또는 Igβ와 조합하여) 신호전달을 매개할 수 있는 IgH의 형성을 방지하며, 예를 들어 유전자 재배열이 막히고, 완전 생성물의 전사 또는 번역이 실패하고, 또는 생성물이 신호를 전달할 수 없기 때문이다.
한 예에서, 내인성 J 유전자, Eμ, Cμ 및 Cδ가 결실된다. 다른 예에서, 내인성 J 유전자, Eμ, Cμ 및 Cδ가 ES 세포 및 B 세포에서 전사적 활성인 단일 약물-내성 카세트로 모두 대체된다. 마우스에서 사용하기 위한 약물-내성 카세트의 예는 마우스 pgk -1 프로모터를 포함하는 PGK-G418 네오마이신 내성 카세트이다. 종합하면, 이 결실은 V-D-J 재조합(J 결실 및 활성 발현 카세트에 의한 Eμ 대체) 및 프라이머리 B 세포 수용체 신호전달(Cμ 및 Cδ의 결실) 및 B 세포 막에서이 고정을 막는다. 다수 성분들의 불활성화는 상이한 발달 단계에서 IgH 유전자좌를 불활성화시키기 위한 중복되는 다수 층을 생성하며, B세포 발달을 구할 임의의 하나의 잔여 활성에 대한 페일세이프(failsafe)를 생성한다.
결실 또는 돌연변이의 다른 조합이 또한 수행될 수 있다. 예를 들어, 전체 C 유전자 클러스터는 JH 결실과 조합하여 결실될 수 있다. Cμ 및 Cδ와 조합된 전체 D 유전자 클러스터의 결실 또한 효과적일 것이다. 수득된 돌연변이가 기능적인 가변 영역의 형성 및 직접적으로 또는 부속의 신호 전달 단백질 Igα 및/또는 Igβ와 조합하여 신호전달을 할 수 있는 막-고정된 중쇄 불변 영역의 형성을 손상시키는 한, 하나 이상의 돌연변이의 임의의 조합이본원에 고려된다.
각각의 모듈 모두가 결실될 필요가 있는 것은 아니다. 예를 들어, J, Cμ 또는 Cδ 유전자의 일부분은, 재조합 신호 서열(RSS), 스플라이스 공여체, 및 스플라이스 수용체 서열과 같은 하나 이상의 시스 조절 요소가 결실되거나 돌연변이되거나 기능적인 오픈 리딩 프레임의 형성이 제거되는 한, 면역글로불린 유전자좌에서 남겨질 수 있다. 정확한 DNA 서열을 돌연변이 또는 합성하기 위한 현재의 방법론은 매우 특이적인, 심지어 단일 뉴클레오티드, 돌연변이가 도입되어 생성되는 것을 가능케한다. 이는 ES 세포에서 상동성 재조합을 유도하는 DNA 아암(arm)의 최적의 위치화를 허용하면서 동시에 여전히 유전자좌를 불활성화시키는 이점을 제공한다.
IgH 유전자좌의 일부분의 결실은 유전적 조작을 위한 현재 표준인 상동성 재조합 기술을 사용하여 세포에서 만들어질 수 있다. 결실은 단일 단계 또는 다중 단계로 만들어질 수 있으며, 그들은 하나 이상의 작제물을 사용해 생성될 수 있다. 결실은 Cre-lox 또는 Flp-Frt와 같은 부위-특이적 재조합효소 시스템을 사용하여 또한 만들어질 수 있다. 상동성 재조합 및 부위-특이적 재조합효소 시스템의 조합이 사용될 수 있다. 수정란으로 주입된 조작된 징크-핑거 뉴클레아제와 같은 다른 시스템이 IgH 유전자좌의 결실된 또는 돌연변이된 모듈의 수를 축적하기 위해 하나 이상의 단계에서, 유전자 내로 결실을 조작하는데 사용될 수 있다.
유사한 전략이 내인성 면역글로불린 카파 경쇄 및/또는 람다 경쇄를 불활성화시키 위해 적용될 수 있다. 불활성화를 위한 중요한 모듈, 특히 J, E (인트론 인핸서) 및 C 영역이 모든 Ig 유전자좌 사이에서 보존된다. Ig 경쇄 유전자좌의 불활성화와 관련된 실시양태에서, 불변 영역의 불활성화는 경쇄 불변 영역이 중쇄와 이황화 결합을 형성하는 것이 불가능하다는 점에서 완전한 항체 분자 또는 Fab 도메인의 형성을 방지할 것이다.
예를 들어, 내인성 Igκ 유전자좌는 J 유전자, Eκ, 및 Cκ를 PGK-G418 네오마신 내성 카세트와 같은, ES 세포 및 B 세포에서 전사적으로 활성인 단일 약물-내성 카세트로 대체함으로써 불활성화될 수 있다. 종합하면, 이 결실은 V-J 재조합(J 결실 및 활성 발현 카세트에 의한 Eκ 대체) 및 항체에서 중쇄와 Igκ 경쇄의 페어링(pairing)(Cκ의 결실)을 막는다. 수득된 돌연변이가 기능적인 가변 영역의 형성 및 중쇄와 이황화 결합을 형성할 수 있는 경쇄 불변 영역의 형성을 손상하는 한 하나 이상의 돌연변이의 임의의 조합이 본원에서 고려된다.
다른 실시양태에서, Vλ 유전자 분절의 Igλ 유전자좌 3'의 모든 J-C 쌍은 Cre/loxP와 같은 부위-특이적 재조합효소 시스템을 사용해 결실될 수 있다. 모든 J 분절 유전자의 결실은 V-J 재배열을 방지하고, 그러므로 기능적인 가변 영역의 형성을 손상한다. Cλ 유전자 분절의 결실은 기능적인 불변 영역의 형성을 방지하여, 임의의 IgH 쇄와 이황화 결합을 형성할 수 있는 불변 영역의 형성을 방지한다. 또 다른 실시양태에서, 마우스 Igλ의 불활성화는 2개의 분리된 불활성화를 통해 달성된다. 첫번째는 Vλ1의 불활성화이고 두번째는 Vλ2와 Vλx 둘 다의 불활성화이다. 두번째 불활성화는 첫번째 불활성화 전에 행해질 수 있다. 불활성화는 Vλ 유전자 각각의 5' 또는 3'의 RSS 불활성화, 각각의 유전자의 5'의 프로모터 불활성화, 또는 코딩 서열의 불활성화를 통해 달성될 수 있다. 불활성화는 비기능적으로 만들기 위한, 점, 삽입 또는 결실, 돌연변이 또는 완전 결실을 통해서일 수 있다.
비-인간 세포의 내인성 Ig 유전자좌는 기능적인 가변 도메인의 형성 및 프라이머리 B 세포 발달을 유도할 수 있는 불변 영역의 형성 둘 모두를 손상할 수 있는 결실 또는 돌연변이를 도입하도록 고안된 하나 이상의 작제물과의 상동성 재조합에 의해 불활성화될 수 있다. 마우스 및 랫트 ES 세포에서 상동성 재조합을 달성하기 위한 방법은 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 작제물 상에 위치한 플랭킹 영역과 세포에서 상응하는 상동성 내인성 DNA 서열 사이의 상동성 재조합시에, 목적한 결실 또는 돌연변이가 내인성 Ig 유전자좌로 통합된다.
정확한 재조합 사건을 겪은 세포는 약물 내성과 같은, 양성 및 음성 선택 마커를 사용하여 스크리닝될 수 있다. 상동성 재조합을 추가 확인하기 위해, 게놈 DNA는 단리된 클론으로부터 회수되고 제한효소단편길이다형성(RFLP; restriction fragment length polymorphism) 분석이 내인성 유전자좌로부터의 DNA 프로브를 이용한 서던 블롯팅과 같은 기술에 의해 수행되는데, 상기 프로브는 대체된 영역 바깥을 맵핑한다. RFLP 분석은 대체하는 DNA에서 신규한 제한 부위의 도입을 통해 상동성 재조합이 발생할 경우, 2개의 대립유전자, 내인성 DNA와 들어오는(incoming) DNA사이에 대립형질 상이성을 보여준다.
당해 기술 분야에 공지된 다양한 분석, ELISA 및 형광 현미경검사를 포함하나, 이로 제한되지 않는 것들이 내인성 Ig 유전자좌로 도입된 돌연변이가 세포에 의한 기능적인 Ig 중쇄 또는 경쇄의 발현을 손상시키는 것을 확인하는데 사용될 수 있다. 내인성 Ig 중쇄 또는 경쇄의 부재는 그의 발현이 손상된 것을 나타낸다. RT-PCR과 같은 다른 널리 공지된 분석은 변경된 유전자좌가 전사될 수 있는지 여부를 결정할 수 있다.
하나 이상의 불활성화된 Ig 유전자좌를 갖는 세포는 하나 이상의 불활성화된 Ig 유전자좌를 갖는 형질전환 비-인간 동물, 예를 들어 마우스를 제조하는데 사용될 수 있다. 내인성 Ig 유전자좌의 일부분을 결실 또는 대체하기 위해 돌연변이된 Ig 유전자좌를 돌연변이된 Ig 유전자좌를 비-인간 세포 내로 조작한 후, 마우스와 같은 유전적으로 조작된 비-인간 포유동물은 배반폰 미세주입, 그 후 키메라 동물의 번식, 상실배 응집 또는 체세포 핵 전이와 같은 클로닝 방법론과 같은 현재-표준인 방법에 의해 생산될 수 있다.
번식 전략
특정한 실시양태는 비-내인성 VH 및 CH1 유전자 분절 및 비-내인성 Ig 경쇄 유전자좌를 인코딩하는 게놈을 갖는 비-인간 포유동물을 제조하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 비-내인성 Ig 경쇄 유전자좌를 포함하는 비-인간 포유동물과 키메라 Ig 중쇄 유전자좌를 포함하는 비-인간 포유동물을 교배시키며, 여기서 Ig 중쇄 유전자좌는 비-내인성 VH 및 CH1 유전자 분절을 포함하는 단계; 키메라 Ig 중쇄 유전자좌 및 비-내인성 Ig 경쇄 유전자좌를 포함하는 게놈을 갖는 자손을 선별하는 단계; 상기 자손을 추가로 교배하는 단계; 및 키메라 중쇄 및 비-내인성 경쇄 유전자좌에 대해 동형접합성인 게놈을 가진 자손을 생산하는 단계를 포함한다. 관련 실시양태에서, 포유동물의 게놈은 또한 비-내인성 JH 유전자 분절을 인코딩한다.
추가 실시양태는 키메라 Ig 중쇄 유전자좌 및 비-내인성 Ig 경쇄 유전자좌를 포함하는 게놈을 갖는 자손을 선택하는 단계; 추가로 자손을 기능적으로 불활성인 내인성 Ig 유전자좌를 갖는 비-인간 포유동물과 교배하는 단계; 및 자손을 생산하고 기능적으로 불활성인 내인성 Ig 유전자좌, 키메라 중쇄 및 비-내인성 경쇄 유전자좌에 대해 동형접합성인 게놈을 자손을 생산하기 위해 추가로 교배하는 단계를 포함한다. 관련 실시양태에서, 포유동물의 게놈은 또한 비-내인성 JH 유전자 분절을 인코딩한다.
본원에 기술된 유전적 조작 전략은 이종발생성 C 영역과 결합된 비-내인성 서열 V 영역, 또는 완전히 비-내인성 항체, 또는 그의 일부 중간체를 발현하도록 마우스 및 다른 동물의 조작에 적용될 수 있다. 배반포 미세주입 또는 상실배 응집을 통한 유전적 조작을 위한 ES 세포 기술이 현재 없는 동물의 경우, 내인성 유전자좌는 다양한 클로닝 기술 또는 발달상의 재프로그래밍으로 처리할 수 있는 세포(예를 들어, 유도 다능성 줄기세포, IPS)에서 변경될 수 있다. BAC 기술에 의해 제공된 상동성 재조합의 증가된 빈도는 세포에서 이중적으로 대체된 유전자좌를 찾는 능력을 제공하고, 그로부터 유래된 클로닝된 동물은 돌연변이에 대해 동형접합성일 수 있어, 특히 긴 세대 시간을 가진 큰 동물을 번식할 경우 시간 및 비용이 절약된다. 배양된 세포에서의 반복적 대체는 다수 유전자좌에서 모든 필요한 조작, 및 그 후 적절한 유전형을 생산하기 위한, 잡육종 없이, 클로닝 또는 IPS 기술을 사용하는 동물의 직접적인 생산을 제공한다. 도입되는 Ig 유전자를 미세하게 조정하고 또한 도입되는 부위를 미세하게 특정화하는 능력은 더 나은 기능을 제공하는 항샹을 조작하기 위한 능력을 제공한다. 염소, 소, 양, 말, 토끼, 라마, 개, 등과 같은 조작된 동물은 완전 인간 폴리클로날 항체의 근원이다.
더욱이, BAC가 염색체 기능을 위해 요구되는 DNA 성분, 예를 들어 최적 기능을 위한 수용자 종의 바람직하게, 그러나 요구되지는 않는, 텔로미어(telomere) 및 센트로미어(centromere), 예를 들어 마우스 텔로미어 및 마우스 센트로미어를 이용하여 대장균에서 조작되는 경우, 그들은 전기천공, 미세주입, 등에 의해 수용자 세포로 도입되고 인공 염색체처럼 기능할 수 있다. 이들 BAC-기반 인공 염색체는 또한 더 큰 인공 염색체를 만들기 위한 상동성 재조합의 후속 라운드에 대한 기초로서 사용될 수 있다.
플라스미드, BAC 또는 YAC와 같은 벡터 상에 제공된 본원에 기술된 조작된 Ig 유전자좌 또는 유전자좌들은 마우스, 토끼, 랫트, 또는 햄스터와 같은 배아의 전핵으로 미세주입을 통해 도입된 표준 전이유전자로서 또한 사용될 수 있다. 다수의 BAC, YAC, 플라스미드 또는 그의 임의의 조합은 공동-미세주입될 수 있고 기능적인 유전자좌를 만들기 위해 공동-통합될 것이다. 당해 기술분야에 공지되고 본원에 기술된 다양한 방법은 내인성 Ig 유전자좌 및 불활성화된 내인성 유전자좌로부터 완전 천연 면역글로불린의 생산없이 전이유전자로부터 항체를 발현하는 유전형을 유도하기 위한 하나 이상의 불활성화된 유전자좌를 가진 것들과 교배된 조작된 Ig 전이유전자를 가진 동물을 불활성화하기 위해 사용될 수 있다.
항체
본원에 기재된 바와 같이, 키라메 항체, 또는 그의 항원-결합 단편은 비-내인성 가변 도메인 및 키메라 중쇄 불변 영역을 포함한다. 특히, 키메라 중쇄 불변 영역은 비-내인성 CH1 도메인을 포함한다. 특정한 실시양태에서, 키메라 항체는 키메라 중쇄 및 비-내인성 경쇄를 포함한다. 다른 실시양태에서, 키메라 항체는 키메라 중쇄 및 내인성 경쇄를 포함한다. 일 실시양태에서, 키메라 중쇄 가변 영역은 2개 이상의 비-내인성 종으로부터 유래된 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된다.
특정한 실시양태에서, 키메라 중쇄는 비-내인성 상부 힌지 영역을 포함한다. 관련 실시양태에서, 키메라 중쇄는 비-내인성 상부 및 중간 힌지 영역을 포함한다.
인실리코 고안되고 합성적으로 만들어진 서열을 포함하는 진핵생물 전이 유전자
주석이 달린 공공 데이터베이스로부터의, 또는 상업적으로 이용가능한 시퀀싱 기술을 사용하여 유래되거나, 또는 계약 기반으로 시퀀싱을 수행하는 상업적 작업을 통해 유래되는, 유전자, 유전자좌 및 전체 게놈에 대한 서열, 및 트랜스크립톰 서열을 수득하는 능력은 DNA 서열이 유전자 또는 유전자좌 내에서, 또는 유전자 또는 유전자좌 사이에서, 같은 종에 걸쳐, 하나의 종의 상이한 균주, 또는 2개 이상의 상이한 종에 걸쳐 용이하게 인실리코 조작, 예를 들어 분리되고 조립될 수 있음을 의미한다. 지금까지는 진핵생물 전이유전자, 특히 후생동물은 천연 근원으로부터 유래된 DNA로부터 작제되었다. 이러한 천연 근원 DNA는 플라스미드, 박테리오파지, P1, 코스미드, BAC, YAC 및 MAC와 같은 다양한 벡터로 클로닝된 게놈 DNA 라이브러리 및 벡터, 일반적으로 플라스미드 또는 박테리오파지 내로 클로닝된 cDNA 라이브러리를 포함한다. 이러한 벡터들 상에 보유된 DNA를 재조합 및 부위-지시적 돌연변이와 같은 작은 변경을 도입하기 위한 방법론은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 그들이 단리된 라이브러리에서 모체 DNA의 서열과 전체적으로 일치하는 서열로 구성되는 전이유전자를 만들기 위해 활용되어 왔다. 일부 예에서, DNA의 부분이 라이브러리로부터 누락되거나, 또는 바람직한 동물, 균주 또는 그의 하플로타입으로부터의 라이브러리는 이용가능하지 않을 수 있으며 당해 기술 분야에 통상적인 기술을 사용하여 작제되지 못할 수도 있다.
예를 들어, 대립형질 변이체를 전이유전자에 포함되도록 하는 것이 바람직할 수 있으며 상기 대립형질 변이체는 임의의 라이브러리에서 이용가능한 것이 아니고, 더욱이 RNA 또는 DNA와 같은 근원 핵산은 이용가능하지 않을 수 있다. 많은 유전자 또는 엑손 및 시스 조절 요소를 가진 복잡한 유전자좌에서, DNA가 그러한 상이한 종 및 균주 또는 하플로타입으로부터라면, 그들을 인코딩하는 DNA를 구하여 한 전이유전자로 재조합하는 것은 기술적으로 실행불가능할 수 있다. 따라서, 특히 완전히 인실리코 고안으로부터, 복잡하게 조작된 DNA를 생성하기 위한 수단은, 표준 방법론을 사용하는 것이 불가능할 수 있다.
기술된 DNA 서열을 생성하는 합성적 수단은 상업적으로 이용가능하며 완전한 인실리코 고안을 기초로 한 DNA 서열을 만들기 위해 사용될 수 있다. 그러나, 그들이 도입될 수 있는지, 그리고 특히 진핵생물, 특별히 후생동물에서 발현될 수 있는지 여부는 지금까지는 알려져 있지 않다.
본원에 개시된 일부의 Ig 전이유전자 작제물은 이러한 복합 서열 조성물을 포함하는데 그들은 이전에 기술된 수단에 의해 바람직한 정밀도 및 정확도로 조작될 수 없다. 추가로 고려된 전이유전자 구조는 코딩 서열, 그의 모두 또는 부분만이, 비-내인성 코딩 서열에 의해서 대체되어, 모든 시스 조절 서열이 내인성이고, 위치-독립적, 카피-수 독립적, 조직-특이적, 발달-특이적 유전자 조절에 적절한 완전한 천연 유전자 조절을 보유하도록 하는 생식계열 구성의 DNA를 포함하며 예를 들어, 그들의 마우스 이종상동체를 대체하는 인간 VH, DH, JH, CH1 및 상부 힌지 서열을 인코딩하는 서열을 제외하고 완전한 마우스 DNA를 포함하는 IgH 서열; 그들의 마우스 이종상동체를 대체하는 인간 FcγR을 인코딩하는 서열을 제외하고 완전한 마우스 DNA를 포함하는 FcγR 서열; 그들의 마우스 이종상동체를 대체하는 낙타 VH, DH, JH, 서열을 인코딩하는 서열을 제외하고 완전한 마우스 DNA를 포함하는 IgH 서열; 그들의 마우스 이종상동체를 대체하는 인간 VH, JH, CH1 및 상부 힌지 서열을 인코딩하는 서열 및 그들의 마우스 이종상동체를 대체하는 비-인간, 비-마우스 DH 코딩 서열, 예를 들어 토끼를 제외하고 완전한 마우스 DNA를 포함하는 IgH 서열; 그들의 마우스 이종상동체를 대체하는, 동물의 건강관리, 예를 들어, 개, 고양이, 양, 소, 돼지와 관련 있는 종으로부터의, VH, DH, JH을 인코딩하는 서열을 제외하고 완전한 마우스 DNA를 포함하는 IgH 서열; 그들의 마우스 이종상동체를 대체하는 인간 VL, JL, 및 선택적으로 CL을 인코딩하는 서열을 제외하고 완전한 마우스 DNA를 포함하는 IgL 서열; 그들의 마우스 이종상동체를 대체하는, 낙타 VL, JL, 및 선택적으로 CL을 인코딩하는 서열을 제외하고 완전한 마우스 DNA를 포함하는 IgL 서열; 그들의 마우스 이종상동체를 대체하는,동물의 건강관리, 예를 들어, 개, 고양이, 양, 소, 돼지와 관련 있는 종으로부터의 VL, JL, 및 선택적으로 CL을 인코딩하는 서열을 제외하고 완전한 마우스 DNA를 포함하는 Ig 서열을 포함한다. 다른 예는 불필요한 또는 바람직하지 않은 DNA 서열, 예를 들어 슈도유전자(pseudogene)인 V 유전자, 잘못 접힐 수 있는 생성물을 생산하는 V 유전자, 일부 인간 하플로타입으로부터 결여된 V 유전자, 비-조절성 DNA의 큰 트랙트(tract), 치료학적으로 중요하지 않은 CH 유전자를 결실시키는 것을 포함한다. 다른 예는 전이유전자 기능을 최적화하기 위해 DNA 서열을 변경하거나 바람직한 생성물을 생산하는 것 또는 그로부터, 예를 들어 V 유전자의 가장 우세한 대립유전자를 이용하는 것, NFκb 결합을 회복하기 위해 마우스 Igλ 3' 인핸서를 복구하는 것을 포함한다. 전이유전자는 합성인 부분 및 천연 근원으로부터의 부분을 포함할 수 있다. 유전자를 불활성화하기 위한 DNA는 모두 또는 부분에서 합성 DNA를 또한 포함할 수 있다. 게다가, 본원에 기술된 전이유전자 작제를 위한 방법은 면역글로불린 유전자좌로 제한되지 않는다. 임의의 전이유전자는 먼저 인실리코 방법을 사용하여 다양한 DNA 서열로부터의 서열을 재조합하고 조립하는 첫번째 단계 및 이용가능한 합성 DNA 방법을 이용하여 물리적 DNA를 생성하는 두번째 단계에 의해서 작제될 수 있다.
항체를 생산하는 방법
변경된 유전자좌 또는 유전자좌들을 보유하는 동물은 당해 기술 분야의 다양한 기술을 이용하여 항원으로 면역화될 수 있다. 항원은 다양한 유형의 암, 이식편 대 숙주 질환, 심혈관 질환 및 관련된 장애, 신경학적 질환 및 장애, 자가면역 및 염증성 장애, 및 병원성 감염과 같은, 특정 질환 또는 장애의 치료 또는 예방을 위해 선택될 수 있다. 다른 실시 양태에서, 표적 항원은 상기 질환 또는 장애 중 하나를 검출하기 위한 진단제로 유용할 항체를 개발하기 위해 선택될 수 있다.
항원-특이적 레파토리는 하이브리도마 기술, 선택된 B 세포에 대한 단일-세포 RT-PCR, 항체 디스플레이 기술, 및 당해 기술 분야에 공지된 다른 방법에 의해 면역화된 동물로부터 회수될 수 있다. 예를 들어, 마우스-유래된 하이브리도마로부터 인간/마우스 키메라 mAb를 회수하기 위해, 인간 V-CH1-마우스 힌지+CH2+CH3 항체 또는 인간 V-CH1-상부/중간 힌지-마우스 하부 힌지+CH2+CH3 항체(IgH 유전자좌 조작에 따라 달라짐)가 배양 상층액으로 분비되고, 단백질 A, 단백질 G 등을 사용하는 칼럼 크로마토그래피와 같은 당해 기술분야에 공지된 수단에 의해 정제될 수 있다. 그러한 정제된 항체는 항체의 추가적 시험 및 특성화를 위해 사용되어 시험관 내 및 생체 내 효능, 친화성 등을 결정할 수 있다.
추가로, 2차 제제로서 사용된 내인성 불변 영역에 대해 특이적인 항체로 그들이 검출될 수 있으므로, 인간 V-CH1(상부/중간 힌지)-비-인간 CH2-CH3 mAb는 표적 항원의 조직 분포 및 발현을 평가하기 위한 인간 조직의 면역화학 분석에 유용할 수 있다. 본 발명의 키메라 항체의 이러한 특징은 정상 인간 Ig를 함유하는 조직에 대한 항-인간 불변 영역 2차 검출제를 사용하는 데 있어서 때때로의 도전으로 인해 인간 Fc 영역의 일부 조직에서의 세포 상에 발현되는 인간 FcR로의 결합으로부터 완전 인간 mAbs에 걸친 키메라 mAb의 특이적 확인을 가능하게 한다.
mAb의 비-내인성 가변 영역은 표준 방법에 의해 회수 및 시퀀싱될 수 있다. 선도 후보자 mAb를 확인하기 전 또는 후에, 비-내인성 VH 및 VL 도메인에 대한 유전자, 게놈 DNA 또는 cDNA는 RT-PCR과 같은 다양한 분자 생물학적 방법에 의해 회수된 후에, 비-내인성 불변 영역의 나머지 부분을 인코딩하는 DNA에 부착되어, 완전 비-내인성 mAb를 생산할 수 있다. 예를 들어, 완전 인간 mAb가 생성될 수 있다. 완전 비-내인성 VH-CH 및 비-내인성 VL-CL을 인코딩하는 DNA는 당해 기술 분야에 공지되거나 주문제작될 수 있는 적합한 발현 벡터로 클로닝되고, 포유동물 세포, 피치아(Pichia)와 같은 효모 세포, 다른 균류 등으로 형질감염되어 항체를 배양 상층액으로 분비할 수 있다. 마우스에서 하이브리도마 세포를 이용한 복수(ascite), 우유 또는 계란으로 항체를 분비하는 형질전환 동물, 및 과일, 뿌리 또는 잎에서 항체를 만드는 형질전환 식물과 같은 다른 제조 방법이 또한 발현을 위해 사용될 수 있다. 완전 비-내인성 재조합체 항체는 단백질 A, 단백질 G 등을 사용하는 칼럼 크로마토그래피와 같은 다양한 방법에 의해 정제될 수 있다.
정제된 항체는 저장을 위해 동결건조되거나, 또는 용해성 및 안정성 및 인간을 포함하는 동물에의 안전한 투여에서의 일관성에 대해 당해 기술 분야에 공지된 다양한 용액으로 제제화될 수 있다. 정제된 재조합 항체는 효능, 친화성, 특이성 등에 대한 시험관 내 분석, 효능, 독성학 및 약동학 등에 대한 동물 모델을 이용한 추가적 특성화를 위해 사용될 수 있다. 또한, 정제된 항체는 임상적 목적, 예컨대 질환의 치료 및 진단을 위해 인간 및 비인간 동물에게 투여될 수 있다.
비-내인성 V-CH1-(상부/중간 힌지)-내인성 CH2-CH3 mAb의 다양한 단편은 시약, 진단 및 치료를 포함하는 다양한 목적을 위해 효소에 의한 분해, 재조합 기술 등을 포함하는 방법에 의해 단리될 수 있다. 비-내인성 가변 도메인+CH1 또는 비-내인성 가변 도메인만의 레파토리를 위한 cDNA는 상기 기술된 조작된 비-인간 포유동물, 구체적으로 비장 및 림프절과 같은 2차 림프기관으로부터 얻은 RNA, 및 파지, 리보좀, 대장균, 효모, 포유동물 등과 같은 다양한 항체 디스플레이 시스템으로 구현된 VH 및 VL cDNA로부터 단리될 수 있다. 형질전환 포유동물은 면역학적으로 감염되지 않거나, 또는 선택 항원에 대해 최적으로 면역화될 수 있다. 가변 도메인의 리더 영역 또는 프레임워크 1에서의 5' 및 Cγ 유전자의 인간 CH1에서의 3'과 같은 적당한 PCR 프라이머를 이용함으로써, 체세포적으로 성숙된 V 영역은 친화성 성숙된 레파토리를 단독으로 디스플레이하기 위해 회수될 수 있다. 디스플레이된 항체는 표적 항원에 대해 선택되어 높은-친화성의 항원-특이적 Fv 또는 Fab를 효율적으로 회수할 수 있고, mAb가 포유동물로부터 직접 회수되는 경우 존재할 수 있는 내인성 CH2-CH3 도메인이 없다. 게다가, IgH 및 IgL 전이유전자를 보유하는 동물은 내인성 Ig 유전자좌에 대해 기능적으로 불활성화되는 것이 불필요하다. IgH 및 IgL 유전자좌에 대해 이종접합성인 동물, 또는 IgH 및 IgL 전이유전자를 보유하며 불활성화된 내인성 IgH 및 IgL에 대해 이종접합성인 동물은 본원에 기술된 키메라 항체 뿐만 아니라, 완전-내인성 항체(예를 들어, 마우스 항체)와 혼합된 내인성 및 비-내인성 항체(예를 들어, 인간-마우스 항체)를 생산하며, 항원-특이적 비-내인성 V-내인성 C mAb(예를 들어, 인간 V-마우스 C mAb)를 생성하는데 사용될 수 있다. 하나의 Ig 전이유전자, 예를 들어 IgH만을 보유하는 동물은 비-내인성(예를 들어, 인간) VH 도메인(VH-CH1)의 근원으로서 사용될 수 있으며, 하나의 상이한 Ig 전이유전자, 예를 들어 IgL, Igκ 또는 Igλ 중 하나만을 보유하는 다른 동물은 비-내인성(예를 들어, 인간) VL 도메인(VL-CL)의 근원으로서 사용될 수 있으며, 그 후 VH-CH1 및VL-CL 서열은 항체 디스플레이 라이브러리로 결합되어 완전한 인간 항체를 디스플레이한다. 이런 동물에서, 내인성 Ig 유전자좌 중 둘다 또는 하나가 활성화되거나 또는 하나도 활성화되지 않을 수 있다. 동물은 친화성-성숙 VH 및 VL의 회수가 가능하도록 면역화될 수 있다. 예를 들어, 2개의 분리된 마우스 - 인간 VH-CH1-마우스 CH2-CH3를 가진 하나 및 인간 Vκ-Cκ를 가진 다른 하나-로부터의 항체 디스플레이 라이브러리는 분자 생물학에서 널리-확립된 기술을 사용하여 완전한 인간 항체를 회수하는데 사용될 수 있다.
사용 방법
본 발명의 정제된 항체는 특정 질환 또는 장애, 예를 들어 다양한 유형의 암, 이식편 대 숙주 질환, 심혈관 질환 및 관련 장애, 신경학적 질환 및 장애, 자가면역 및 염증성 장애, 알러지, 및 병원성 감염의 치료 또는 예방을 위해 개체에게 투여될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 개체는 인간이다.
항체 조성물은 약 0.1 내지 100 mg/ml, 바람직하게는 약 1 내지 10 mg/ml의 농도로 개체에게 투여된다. 항체 조성물은 국소적으로, 비강내로, 또는 주사를 통해, 예를 들어, 정맥내, 복강내, 근육내, 안내, 또는 피하 투여될 수 있다. 바람직한 투여 방식은 주사이다. 투여는 약 10분 내지 24시간, 바람직하게는 30분 내지 약 6시간에 걸쳐 단일 주사 또는 주입으로 이루어질 수 있다. 유효 투여량은 1회 또는 시리즈 주사로 투여될 수 있다. 반복 투여량은 약력학, 약동학 및 임상 징후에 따라 1일 2회, 1일 1회, 1주 1회, 2주 1회, 3주 1회, 1달 1회, 또는 3달 1회로 투여될 수 있다. 치료 요법은 임의의 증상의 부재시에도 확장된 기간 동안 지속될 수 있다.
정제된 항체 조성물은 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를 포함할 수 있다. 항체 조성물은 다중 이소타입의 항체 또는 단일 이소타입의 항체를 함유할 수 있다. 항체 조성물은 변경되지 않은 키메라 항체를 함유할 수 있거나, 또는 항체는 몇 가지 방식으로, 예를 들어, 화학적으로 또는 효소적으로 변경될 수 있다. 항체 조성물은 변경되지 않은 인간 항체를 포함할 수 있거나, 또는 인간 항체는 몇 가지 방식, 예를 들어, 화학적으로 또는 효소적으로 변경될 수 있다. 따라서 항체 조성물은 온전한 Ig 분자 또는 그의 단편, 즉, Fab, F(ab')2, 또는 Fc도메인을 함유할 수 있다.
단독으로 또는 다른 치료제와 조합된, 감염제에 대한 항체 조성물의 투여는 개체로부터 감염제의 제거를 초래한다. 항체 조성물의 투여는 개체에 존재하는 감염성 유기체의 수를 10 내지 100배, 바람직하게는 1,000배 또는 1,000배 보다 많이 감소시킨다.
유사하게는, 단독으로 또는 다른 화학요법제와 조합된, 암 세포에 대한 항체 조성물의 투여는 개체로부터 암 세포의 제거를 초래한다. 항체 조성물의 투여는 개체에 존재하는 암 세포의 수를 10 내지 100배, 바람직하게는 1,000배, 또는 1,000배 보다 많이 감소시킨다.
본 발명의 특정 측면에서, 항체는 또한 가용성이거나 또는 세포 표면에 결합된 항원성 분자에 결합하고 중화시키기 위해 이용될 수 있다. 그러한 중화는 순환계에서 항원성 분자의 제거를 증진시킬 수 있다. 중화를 위한 표적 항원성 분자에는, 이로 제한되지는 않지만, 독소, 내분비 분자, 사이토카인, 케모카인, 상보체 단백질, 박테리아, 바이러스, 균류, 및 기생충이 포함된다. 그러한 항체는 단독으로 또는 다른 항체, 다른 생물학적 약물, 또는 화학 제제를 비롯한 다른 치료제와 조합하여 투여될 수 있다.
본 발명의 항체는 세포 표면 수용체 신호전달을 증진시키거나 억제하기 위해 사용될 수 있음이 또한 고려된다. 세포 표면 수용체에 특이적인 항체는 치료제 또는 연구 도구로 이용될 수 있다. 세포 표면 수용체의 예에는, 이로 제한되지는 않지만, 면역 세포 수용체, 아데노신 수용체, 아드레날린 작용성 수용체, 안지오텐신 수용체, 도파민 및 세로토닌 수용체, 케모카인 수용체, 사이토카인 수용체, 히스타민 수용체 등이 포함된다. 그러한 항체는 단독으로 또는 다른 항체, 다른 생물학적 약물, 또는 화학 제제를 비롯한 다른 치료제와 조합하여 투여될 수 있다.
본 발명의 항체는 추가로 변경되어 치료학적 잠재력을 증진시킬 수 있음이 또한 고려된다. 변경은 화학물질, 예를 들어 화학요법제, 방사성 동위원소, siRNA, 이중 가닥 RNA 등에의 직접- 및/또는 간접-접합을 포함할 수 있다. 다른 변경은 증가된 또는 감소된 항체-의존성 세포의 세포독소, 증가된 또는 감소된 보체-의존성 세포독소, 또는 증가된 또는 감소된 순환 반감기를 위해 조작된 Fc 영역을 포함할 수 있다.
다른 실시양태에서, 항체는 상기 질환 또는 장애 중 하나를 검출하기 위한 진단제로서 사용될 수 있다. 키메라 항체는 항체의 일부분, 예를 들어 Fc 또는 Fab 도메인을 인식하는 2차 검출제를 사용하여 검출될 수 있다. 불변 영역의 경우에, 인식된 일부분은 CH1, CH2, 또는 CH3 도메인일 수 있다. Cκ 및 Cλ 도메인 또한 검출을 위해 인식될 수 있다. 면역조직화학 분석, 예를 들어 표적 항원의 조직 분포 평가는 본 발명의 항체의 키메라 성질을 이용할 수 있다. 예를 들어, 인간 조직 샘플의 평가시, 2차 검출제 시약은 Ig 분자의 비인간 일부분을 인식함으로써, 배경 또는 조직 샘플에 존재할 수 있는 인간 Ig 분자에의 비-특이적 결합을 감소시킨다.
약학적 조성물 및 키트
본 발명은 또한 제약학 조성물 및 사용 방법에 관한 것이다. 본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체 중에 항체, 또는 그의 항원결합 단편을 포함한다. 약학 조성물은 질환 또는 장애의 치료 또는 예방을 위해 생체 내로 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체, 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 약학 조성물은 조합해서 사용하기 위한 하나 이상의 제제를 포함할 수 있거나, 또는 하나 이상의 제제와 함께 투여될 수 있다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 항체, 또는 그의 항원-결합 단편, 및/또는 방법 중 임의의 것과 관련된 키트를 제공한다. 본 발명의 키트는 진단 또는 치료 방법을 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 키트는 조성물 또는 항체의 사용에 대한 지침서 및 포장을 추가로 제공할 수 있다.
본 발명의 키트는 디바이스, 시약, 용기 또는 다른 성분을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 또한 컴퓨터를 비롯한 장치, 기구 또는 디바이스의 사용이 요구될 수 있다.
도 1은 대장균에서 BAC C5 및 BAC P12의 상동성 재조합을 도시한다.
도 2는 CRE-재조합효소를 사용하는 pBeloBAC 벡터의 두개의 카피 사이의 70 kb 반복의 제거를 도시한다.
도 3은 벡터의 접합부로부터 Tpn-Zeo 15 kb의 삽입을 도시한다.
도 4는 대장균에서 BAC C5P12 및 BAC C20의 상동성 재조합을 도시한다.
도 5는 CRE-재조합효소를 사용하는 pBeloBAC 벡터의 두개의 카피 사이의 44 kb 반복의 제거를 도시한다.
실시예
하기 실시예는 추가적인 예시로 제공된 것이고 본 발명을 제한하려는 것은 아니다. 본 명세서를 통해 인용된 모든 참고문헌, 특허, 공개된 출원의 기술 뿐만 아니라 도면은 참고로서 본원에 포함된다.
실시예 1
BAC C5P12 의 구성
BAC 벡터는 대장균에서 발견된 F-인자를 기초로 한다. F-인자 및 그로부터 유래된 BAC 벡터는 일반적으로 그의 라이프 사이클에 따라 세포당 하나 또는 2개 카피로서 발견되는, 낮은 카피 플라스미드로서 유지된다. F-인자 및 BAC 벡터 둘 다는 세포에서 플라스미드의 추가적인 카피를 배제하는 fi+ 표현형을 보여준다. 이 기작에 의하여, 대장균이 하나의 BAC를 이미 보유하고 유지하고, 그 후 대장균으로 추가적인 BAC가 도입될 경우, 세포는 세포에 이전에 존재한 BAC 또는 새로 도입된 외부 BAC 중 오직 하나의 BAC를 유지한다. 이러한 특징은 하기 기술된 바와 같이 상동성 재조합된 BAC를 선택적으로 단리하는데 매우 유용하다.
대장균에서 상동성 재조합은 기능적 RecA 유전자 생성물을 필요로 한다. 본 실시예에서, RecA 유전자는 온도-민감성 돌연변이(recA ts) 를 가지고 있어 ReaA 단백질은 인큐베이션 온도가 37℃ 미만 일 때만 기능적이었다. 인큐베이션 온도가 37℃를 초과하는 경우, RecA 단백질은 비-기능적이거나 현저히 감소된 재조합 활성을 갖게 되었다. 이러한 온도 민감성 재조합은 바람직한 경우에만 조건부 상동성 재조합을 활성화하기 위하여 대장균에서 RecA 기능의 조작을 허용하였다. 또한 RecA 단백질의 저온-민감성 돌연변이의 수득, 선택 또는 조작이 가능하여, 단백질은 특정 온도, 예를 들어 37℃ 초과에서만 오직 기능적이 된다. 그러한 조건에서, 대장균은 비록 느린 세대 기간을 갖지만, 더 낮은 온도에서 성장할 것이며, 재조합은 37℃ 초과에서 짧은 기간의 시간 동안 인큐베이팅함으로써 유발되어 재조합의 짧은 간격만을 허용할 것이다.
대장균에서 상동성 재조합을, 2개의 원형 BAC에서 발견되는 중복 DNA 기질을 제공함으로써 수행하였다. BAC P12(캘리포니아 공과대학 BAC 라이브러리)는 전체 크기가 182 kb였으며 그중 172 kb는 인간 Vκ 유전자(도 1, IGKV1-5 부터 IGKV1-12까지)를 포함하는 인간 게놈 DNA의 삽입물이었다. BAC P12는 제오신 내성 유전자 ZeoR를 가진 pBeloBAC2 벡터에 의해 보유되었다. BAC C5(캘리포니아 공과대학 BAC 라이브러리)는 대장균에서의 선택을 위해 카나마이신 내성 트랜스포존 카세트(kanR), KAN-2(에피센터 바이오테크놀로지)를 보유하였다. BAC C5는 전체 크기가 225 kb였으며 그중 218 kb는 인간 Vκ 유전자(IGKV4-1부터 IGK1-6까지), Jκ 클러스터, Cκ 및 3' 조절 요소를 포함하는 인간 게놈 DNA의 삽입물이었다. BAC C5 및 P12는 삽입물 DNA에서 70 kb의 상동성을 보유하였다. BAC C5 대장균 recAts에서 보유하였다.
정제된 BAC P12 DNA를 BAC C5를 보유하는 대장균 recAts에 전기천공시켰다. 세포를 30분 동안 recAts 활성을 허용하기 위한 온도인, 30℃에서 인큐베이션하였다. 2개의 BAC(kanRzeoR)의 상동성 재조합체를 보유하는 대장균은 제오신(50 ㎍/ml) 및 카나마이신(25 ㎍/ml)을 함유하는 선택적인 저염 LB 배지(인비트로젠)의 플레이트에 도말함으로써 선택하였고, recAts 활성을 허용하지 않는 온도인, 40℃에서 항온처리하였다. C5와 P12 사이에 공유된 70 kb 상동성에서의 상동성 재조합체는 전체 크기 407 kb의 단일 BAC를 생산하였는데, 그중 320 kb은 C5 및 P12의 재조합된 삽입체를 나타낸다(도 1). 예상한 바와 같이, 상동성 재조합 사건은 70 kb 중복의 듀플리케이션을 생성하였는데, 그중 한 카피는 pBeloBAC 벡터 서열의 반복된 카피들 사이에 위치하였고, 다른 카피는 Igκ 유전자좌로부터의 인간 DNA의 2개의 단편을 하나의 인접한 분절로 이제 결합하였다(도 1). kanRzeoR을 보였던 이중-선택 플레이트 상에서 자란 대장균 콜로니를 택하고, BAC DNA를 미니프렙에 의해서 단리하였다. BAC DNA를 NotI로 분해하고 펄스-필드(pulse-field) 겔에서 내렸다. 클론은 예상된 밴드 패턴을 보였다(도 2, 왼쪽 BAC 맵 및 왼쪽 겔 사진).
pBeloBAC 벡터의 2개 카피 사이의 70 kb 반복부를 pBeloBAC 상에 존재하는 2개의 loxP 부위에 작용하는 CRE-재조합효소를 사용하여 절제하였다(도 2). 정제된 BAC(C5+P12) DNA를 제조자의 권고 조건에 따라 시험관내에서 CRE 재조합효소(뉴 잉글랜드 바이오랩스)로 처리하였다. 처리된 DNA를 전기천공을 통해 대장균의 RecA 결핍(recA-) 균주로 도입하였고, 수득된 박테리아를 클로팜페니콜(Cm) 함유 플레이트에 도말하고, 37℃에서 인큐베이션하였다. 모든 pBeloBAC 벡터는 CmR 유전자를 보유한다. 분해된 BAC는 70 kb 중복의 듀플리케이션 및 pBeloBAC 벡터 2개에 대한 서열을 상실하였다(도 2, BAC 맵의 오른쪽). 올바르게 분해된 BAC는 ZeoR 및 KmR 의 마커를 둘다 상실하였다.
CmR을 보였던, 플레이트상에서 자란 대장균 콜로니를 택하고, BAC DNA를 미니프렙에 의해서 단리하였다. BAC DNA를 NotI로 분해하고 펄스-필드(pulse-field) 겔 상에서 내렸다. 클론은 예상된 밴드 패턴을 보였다(도 2, 오른쪽 BAC 맵 및 오른쪽 겔 사진). 분해된 BAC(C5P12)는 전체 크기가 327 kb였으며, 그중 320 kb는, 5' 에서 3'의 방향에서, 8개의 기능적인 Vκ 유전자, 전체 Jκ 클러스터 및 Cκ를 포함하는, Vκ1-12로부터 3' 시스 조절 영역까지 인간 게놈 DNA였다. BAC(참조, 실시예 2에서 5P12C20)를 만들기 위해, Tpn-Zeo가 벡터의 접합부로부터 15 kb에 삽입되었다(도 3). Tpn-Zeo는 트랜스포존 작제 벡터(에피센터 바이오테크놀로지), pMOD-3<R6Kγori/MCS> 플라스미드 내로 ZeoR 유전자를 삽입함으로써 작제하였다.
실시예 2
인간 Ig κ 유전자좌의 대부분을 포함하는 489 KB BAC 의 작제
대장균에서의 상동성 재조합을 2개의 원형 BAC에서 발견되는 중복 DNA 기질을 제공함으로써 수행하였다. BAC C20(캘리포니아 공과대학 BAC 라이브러리)은 전체 크기가 218 kb였으며 그중 206 kb는 인간 Vκ 유전자를 포함하는 인간 게놈 DNA의 삽입물이었다. BAC C20은 대장균에서의 선택을 위해 KAN-2 카나마이신 내성 트랜스포존 카세트(kanR)를 보유하였다. 실시예 1에서 만든 BAC C5P12는 대장균에서의 선택을 위해 제오신 내성 트랜스포존 카세트(zeoR)을 보유하였다. C20 및 C5P12는 삽입물 DNA에서 44 kb의 천연적 상동성을 보유하였다. BAC C5P12는 대장균 recAts 에 보유되었다.
정제된 BAC C20 DNA를 BAC C5P12를 보유한 recAts 내로 전기천공시켰다. 세포를 30분 동안, recAts 활성을 허용하는 온도인 30℃에서 인큐베이션하였다. pBeloBAC 벡터에 의해 부여된 fi+ 표현형은 세포에서 하나 보다 많은 BAC의 유지를 금하여, 오로지 C20(kanRzeoS), 오로지 C5P12(kanSzeoR), 2개의 BAC(kanRzeoR) 사이의 재조합체 또는 BAC(kanSzeoS)가 없는 것을 보유하는 대장균의 집단을 초래한다. 2개의 BAC의 상동성 재조합체를 보유하는 대장균은 제오신(50 ㎍/ml) 및 카나마이신(25 ㎍/ml)을 함유하는 선택적인 저염 LB 배지(인비트로젠)의 플레이트에 도말함으로써 선택되었고 recAts 활성을 허용하지 않는 온도인, 40℃에서 인큐베이션하였다.
C20과 C5P12 사이에서 공유된 44 kb 상동성에서의 상동성 재조합체는 전체 크기 545 kb의 단일 BAC("C")를 생산하였으며, 그중 482 kb는 C20 및 C5P12의 재조합된 삽입물을 나타낸다(참조 도 4). 예상한 바와 같이, 상동성 재조합 사건은 44 kb 중복의 듀블리케이션을 생성하였는데, 그중 한 카피는 pBeloBAC 벡터 서열의 반복된 카피 사이에 위치하였으며 Igκ 유전자좌로부터의 인간 DNA의 2개의 단편을 하나의 인접한 분절로 이제 결합하였다(도 4).
kanRzeoR을 보였던, 이중-선택 플레이트 상에서 자란 대장균 콜로니를 택하고, BAC DNA는 미니프렙에 의해서 단리하였다. BAC DNA는 NotI로 분해하고 펄스-필드 겔에서 내렸다. 클론은 예상된 밴드 패턴을 보였다(도 5, 왼쪽 BAC 맵 및 왼쪽 겔 사진).
pBeloBAC 벡터의 2개의 카피 사이의 44 kb 반복부를, pBeloBAC 상에 존재하는 2개의 loxP 부위에 작용하는 CRE-재조합효소를 사용하여 절제하였다(도 5). 정제된 BAC C DNA는 제조자의 권고된 조건에 따라 시험관내에서 CRE 재조합효소(뉴 잉글랜드 바이오랩스)로 처리하였다. 처리된 DNA를 전기천공을 통해 대장균의 RecA 결핍(recA-) 균주로 도입하고 수득된 박테리아는 상기한 바와 같이 제오신/카나마이신 이중-선택 플레이트 상에 도말하고 37℃에서 인큐베이션하였다.
분해된 BAC는 44 kb 중복의 듀플리케이션 및 pBeloBAC 벡터 3에 대한 서열을 상실하였다(도 5, 오른쪽 BAC 맵). KmRzeoR을 보였던, 이중-선택 플레이트 상에서 자란 대장균 콜로니를 선택하고 BAC DNA를 미니프렙에 의해 단리하였다. BAC DNA를 NotI로 분해하고 펄스-필드 겔에서 내렸다. 클론은 예상된 밴드 패턴을 보였다(도 5, 오른쪽 BAC 맵 및 오른쪽 겔 사진). 분해된 BAC는 전체 크기가 489 kb였으며 그중 467 kb는, 5' 에서 3' 순서로, Vκ2-30으로부터 16개의 기능적인 Vκ 유전자, 전체 Jκ 클러스터 및 Cκ를 포함하는, 3' 시스 조절 영역까지의 인간 게놈 DNA였다.
실시예 3
기능적인 198 KB 의 합성 인간 IG 람다 경쇄 전이유전자 서열의 인실리코 조립
인간 면역글로불린 람다 경쇄 유전자좌(Igλ)의 완전히 주석이 달린 서열이 이용가능하다. 예를 들어, 젠뱅크(GenBank) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) 기탁번호 NG_000002를 참고하라. 과학적인 참조를 지지하는 문헌서지사항을 포함하는 추가적인 상세 정보는 Vbase(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) 및 IMGT (http://imgt.cines.fr/)를 포함하는 다수의 공공 도메인 웹사이트에서 이용가능하다. 이러한 정보는 인간 Igλ 유전자좌의 유전적 및 표현형적 내용에 대한 데이터를 포함하는데, 예를 들어, 발현된 유전자 서열, 슈도유전자, 대립유전자 변이체 및 어떤 유전자가 잘못접히기(misfolding) 쉬운 도메인을 인코딩하는지의 확인을 포함하나 이로 제한되지 않는, 데이터를 포함한다.
이러한 공공 정보를 이용함으로써, 하나 내지 모든 7개 Jλ-Cλ쌍 및 완전한 기능적인 인간 Igλ 3' 인핸서(3' E)와 작동적으로 결합된 발현된 인간 Vλ 유전자만을 포함하는 인간 Igλ 경쇄 유전자좌를 인코딩하는 DNA 서열의 조작을 위해 일반적으로 이용가능한 소프트웨어(예를 들어, MacVector, DNASIS)를 사용하여 DNA 서열을 인실리코 조립하는 것이 가능하다. Vλ 유전자 발현을 제어하는 시스 조절 요소는 5' 비번역된 영역(UTR)의 시작에 바로 5'의 DNA의 500 bp 및 각각의 Vλ 유전자의 코딩 서열의 말단의 바로 3'의 재조합 신호 서열(RSS)에 바로 3'의 500 bp 이하 DNA만큼 적게 포획될 수 있다. 바람직하게, 5' UTR 개시의 5'의 더 큰 영역의 DNA가 V 유전자 분절들 사이의 거리를 증가시키고 임의의 및 모든 시스 조절 요소들을 완전히 포획하는데 사용될 수 있다.
추가로, 인간 Vλ 유전자(V3-1)의 가장 3' 제 1 Jλ-Cλ쌍인 Vλ1-Cλ1과 3'E까지 사이의 영역이 생식계열 구성 내에 포획된다. 대안적으로, Vλ3-1와 Jλ1-Cλ1 사이 서열의 거리 및/또는 마지막 Jλ-Cλ 쌍인 Jλ7-Cλ7과 인간 유전자좌에서 3' E 사이의 거리가 분해될 수 있다. 특정 거리는 스플라이스 수용체 및 스플라이스 공여체, RSS, 인트론 인핸서 및 3' 인핸서, 바람직하게는 모든 3개의 DNAseI 과민성 부위를 포함하는 필수적인 시스 조절 요소 및 목적한 코딩 요소의 포획만큼 중요하지는 않다. 추가로, 인간 Igλ 슈도유전자, Jλ4-Cλ4, Jλ5-Cλ5 및/또는 Jλ6-Cλ6는 인실리코 조립된 서열로부터 배제될 수 있다. 하나의 기능적인 Jλ-Cλ쌍, Jλ1-Cλ1, Jλ2-Cλ2, Jλ3-Cλ3 또는 Jλ7-Cλ7중 하나에 대한 최소 필요조건이 있다.
특정 제한 효소 부위가 서열의 말단으로 도입될 수 있다. 특정 제한 효소 부위는 또한 그들이 유전자 발현 또는 코딩을 교란하지 않는 한 서열 삽입, 결실, 또는 변경을 통해 내부적으로 도입되거나 결실될 수 있다. 이들 효소 부위는 시험관내에서 합성된 서열을 조립하거나, 벡터로부터 DNA를 절제하기 위해 유용하거나 표준 전기영동, 필드 인버전(field inversion) 겔 전기영동(FIGE), 및 펄스-필드 겔 전기영동(PFGE)을 사용한 아가로스 겔의 서던 블롯팅과 같은, 다양한 스크리닝 방법에 대해 유용한 서열을 포함할 수 있다.
삽입된 서열은 게놈으로의 목적한 무손상 통합을 위해, qPCR을 포함하는 qPCR-기반의 스크리닝 방법을 촉진하기 위하여 프라이머 결합 부위를 포함할 수 있다. 선택적으로, loxP 또는 그의 임의의 변이체 또는 frt와 같은 부위-특이적 재조합효소 부위(들)이 도입되어, 단일-카피 유전자를 만들기 위한 개재 서열의 결실을 촉진하거나, 부위 특이적 재조합을 통한 추가적인 DNA의 도입을 촉진하거나, 또는 당해 기술 분야에 공지된 바와 같은 다른 유전적 조작 고안을 촉진한다. 또한 선택적으로 하이그로마이신과 같은 약물에 대한 내성에 대한 양성 선택 마커 또는 티미딘 키나아제와 같은 음성 선택 카세트와 같은, 포유동물 세포에 대한 약물-선택 카세트를 위한 서열을 포함할 수 있다.
상기 서술한 전략을 사용하여, 코어 191 kb 서열("람다 프라임")을 인실리코 조립하였으며, 생식계열 구성의 Vλ3-1과 인간 3' 인핸서 사이에 57 kb 서열을 가진, 대략 ~5 kb 단위 상의 29개의 기능적인 인간 Vλ 유전자, 모든 7개 인간 Jλ-Cλ 쌍 및 인간 3'Igλ 유전자좌 인핸서를 포함하였다. 29개의 선택된 인간 Vλ 유전자가 인간에서 발현되는 것으로 기록되었고 과학적인 문헌의 조사에 의해 측정된 바와 같이 모든 공지된 인간 하플로타입에서 존재한다. 적절하게 접히는 가변 영역을 인코딩하는 가장 일반적으로 사용되는 대립유전자를 위한 서열을 선택하였다.
2개의 기능적인 Vλ 유전자를 인간 생식계열 구성에서 5 kb 거리 미만의 근접성으로 위치시킨 경우, 2개의 Vλ 유전자를 가장 5' 유전자의 5' UTR의 5'의 대략 4 kb로부터 및 가장 3'Vλ 유전자의 RSS의 3'의 대략 500 bp를 전체 서열을 사용하였다. 서열의 코딩 및 비-코딩 영역은 적절한 발달 조절 및 발현을 유도하고 일단 마우스 게놈으로 도입된 인간 Igλ 경쇄의 다양성을 만들어내기에 충분하였다.
하이그로마이신 내성 발현 카세트를 위한 서열은 가장 5' Vλ 카세트의 5'에 삽입하였다. BAC 벡터로부터의 절제의 용이성 및 온전한 통합을 확인하기 위해, 흔치않은 절단 제한 효소를 서열 내로 5' 말단에서 삽입하였으며, hygR 카세트의 5'와 3' 각각에서 StuI/EcoRV/AsiSI/PvuI 및 AgeI/PacI/AseI/BsaBI 부위를 위한 인식 서열, 그리고 3' 인핸서의 하류 3' 말단에서 AsiSI, AleI, EcoRI, Bsa BI에 대한 인식 서열을 삽입하였다.
실시예 4
IG 람다 - 프라임의 서열로부터 유래된 2개의 합성적 인간 IG 람다 경쇄 전이유전자의 서열의 인실리코 조립
실시예 3에서 기술된 람다-프라임 서열을 사용하여, 2개의 추가적인 전이유전자를 고안하였다. 대략 ~5 kb 단위 상에 8개의 기능적인 인간 Vλ 유전자, 모든 7개의 인간 Jλ-Cλ 쌍 및 인간 3' Igλ 유전자좌 인핸서를 포함하며, 생식계열 구성의 Vλ3-1과 인간 3' 인핸서 사이에 57 kb 서열을 가진, 코어 94 kb 서열("람다 3")을 조립하였다. 8개의 선택된 인간 Vλ 유전자는 인간에서 발현되는 것으로 기록되었다. 적절하게 접히는 가변 영역을 인코딩하는 가장 일반적으로 사용되는 대립유전자를 위한 서열을 선택하였다. 서열의 코딩 및 비-코딩 영역은 적절한 발달 조절 및 발현을 유도하고 일단 마우스 게놈으로 도입된 인간 Igλ 경쇄의 다양성을 만들어내기에 충분하였다. frt 부위를 가장 5' Vλ 유전자 카세트의 5'로 삽입하였다. BAC 벡터로부터의 절제의 용이성 및 온전한 통합을 확인하기 위해, 흔치않은 절단 제한 효소를 서열로 도입하였으며, 5' 말단에서, ApaLI/AvrII/EcoRI 부위에 대한 인식 서열을 frt 부위의 5'으로 삽입하였고 Fsel에 대한 인식 서열은 frt 부위의 3'로 삽입하였으며, 3' 말단에서, 실시예 3에서 기술된 AsiSI, AleI, EcoRI, Bsa BI에 대한 인식 서열은 유지하였다.
실시예 3에서 기술된 람다-프라임 서열을 사용하여, 발현 및 기능성이 증명되고, 개개의 인간에 걸쳐 공지된 비-기능적인 대립유전자 또는 하플로타입 변이가 없는 21개의 인간 Vλ 유전자를 포함하는 서열("람다")을 인실리코 조립하였다. Vλ 카세트는 일반적으로 대략 크기가 5 kb였다. 서열의 코딩 및 비-코딩 영역은 적절한 발달 조절 및 발현을 유도하고, 적어도 하나의 기능적인 Jλ-Cλ 쌍 및 바람직하게는 기능적인 3'E를 포함하는 임의의 DNA와 작동적으로 연결된 마우스 게놈으로 도입된 인간 Ig λ 경쇄의 다양성을 만들어내기에 충분하였다. 적절하게 접히는 가변 영역을 인코딩하는 가장 일반적으로 사용되는 대립유전자에 대한 서열을 선택하였다.
실시예 3에서 기술된 가장 5' Vλ 카세트의 5'의 하이그로마이신 내성 발현 카세트에 대한 서열은 유지되었다. 가장 3' Vλ 카세트의 3'에 frt 부위를 위한 서열을 삽입하였다. BAC 벡터로부터의 절제의 용이성 및 온전한 통합을 확인하기 위해, 흔치않은 절단 제한 효소를 서열 내로 삽입하였으며, 실시예 3에서 기술된 바와 같은, hygR 카세트의 5'에 StuI/EcoRV/AsiSI/PvuI 부위, hygR 카세트의 3'에 AgeI/PacI/AseI/BsaBI 부위 및 frt 부위의 5'에 FseI/PvuI 부위 및 frt 부위의 3'에 KpnI/NheI 부위를 삽입하였다.
실시예 5
람다 3 및 람다 5 전이유전자를 포함하는 DNA 의 합성 및 조립
크기가 대략 30-40 kb 보다 더 큰 DNA가 BAC 상에 보유된다. 실시예 2는 크기가 545 kb인 BAC의 생성을 기록한다. 추가로, YAC, PAC, MAC와 같은 큰 조각의 DNA를 보유할 수 있는 다른 클로닝 벡터를 사용할 수 있다. 이런 모든 벡터에서 큰 DNA의 유전적 조작 및 물리적 회수는 문헌에 널리-기록되어 있다.
계약 서비스 제공자는 매우 큰 조각의 DNA를 합성하고 조립한다. 람다 3의 DNA 서열을 DNA2.0, Inc.(캘리포니아, 멘로 파크)로 전송하였다. 서열이 물리적 DNA로 합성되고 조립되었다. 최종 완전하게 조립된 서열은 벡터 백본으로서 pBeloBAC을 가진 BAC에서 보유되었다. 전체 BAC를 454 시퀀싱 기술(454 라이프 사이언스, 로쉬)을 사용하여 SeqWright, Inc.(텍사스, 휴스턴)가 시퀀싱 하였다. 합성적 람다 3 DNA의 서열을 참조 서열에 대해 확인하였다. 인실리코 서열로부터의 6개의 서열 편차는 긴 호모폴리머 또는 다이폴리머 서열에 기인한 454 시퀀싱 판독 에러일 가능성이 높았다. 편차는, 실제 물리적인 합성 DNA에서 돌연변이가 아닐 가능성이 높았음에도 불구하고, 비-코딩, 비-조절성 영역으로 맵핑하였다.
람다 5의 DNA 서열을 DNA2.0, Inc.(캘리포니아, 멘로파크)로 전송하였다. 서열을 합성하고 조립하였다. 최종 완전하게 조립된 서열은 벡터 벡본으로서 pBeloBAC와 함께 BAC에서 보유되었다. 전체 BAC를 454 시퀀싱 기술(454 라이프 사이언스, 로쉬)을 사용하여 SeqWright, Inc.(텍사스, 휴스턴)가 시퀀싱하였다. 합성적 람다 5 DNA의 서열을 참조 서열에 대해 확인하였다. 인실리코 서열로부터의 최소 편차를 발견하였다. 임의의 편차는 긴 호모폴리머 또는 다이폴리머 서열에 기인한 454 시퀀싱 판독 에러일 가능성이 높았다. 편차는, 실제 물리적인 합성 DNA에서 돌연변이가 아닐 가능성이 높았음에도 불구하고, 비-코딩, 비-조절성 영역으로 맵핑하였다.
실시예 6
합성적 람다 3 전이 유전자를 보유하는 전이유전자 마우스의 생성
람다 3 BAC를 FseI 및 AsiSI로 분해하고 펄스-필드 겔 전기영동에 의해 벡터 서열로부터 합성적 인간 람다 3 삽입물을 정제하였다. 람다 3 서열을 함유하는 94 kb 겔 밴드를 겔로부터 절제하였고 겔로부터 정제되었다. 정제되고, 농축된 DNA를 마우스 수정난의 전핵으로 미세주입하였다. 전달된 758개 배아 중, 138 마리의 살아있는 마우스가 태어났다. 람다 3 전이유전자의 5' 및 3' 말단 및 중간 부분을 포함하는 인간 Igλ 서열을 검출하기 위한 PCR 분석을 이용하여, 람다 3 전이유전자의 5', 3' 및 중간에서 DNA의 존재에 대해 스크리닝하기 위한 마우스 새끼의 꼬리 조직으로부터 단리된 DNA를 스크리닝하였다. 24 마리의 마우스 새끼가 모든 3개의 PCR 생성물에 대해 양성인 것으로 확인하였다. 인간 Igλ에 대해 특이적인 ELISA 조상 마우스로부터의 혈청 시료 상에서 수행하였다. 20 마리의 독립적인 조상 마우스는 그들의 혈청내에 현저한 순환 수준의 인간 Igλ를 가지는 것으로 밝혀졌으며, 이는 람다 3 전이유전자의 기능을 증명하는 것이다. 조상 마우스는 형질전환 자손을 생산하기 위해 번식시켰다.
실시예 7
마우스에서 합성적 인간 람다 3 전이유전자로부터 인간 IG 람다 경쇄의 다양성의 발현
조상 마우스의 형질전환 자손으로부터의 혈청 시료는 실시예 6에서 기술된 바와 같이 무손상 발현된 람다 3 전이유전자를 가지는 것으로 증명된다.
람다 3 형질전환 마우스로부터 혈액을 채취하여 헤파린 처리된 튜브에 수집하였다. 림프구를 분리하고 림포라이트 M(Lympholyte M)에서의 밀도 구배 원심분리를 통해 농축한다. 림프구를 마우스 B 세포 마커, 예를 들어, B220 또는 CD19에 대한 플루오로크롬-결합된 항체 및 인간 Igλ에 대해 특이적인 항체로 처리한다. 인간 Igλ 경쇄를 그들 표면상에 발현하는 마우스 B 세포를 FAC에 의해 검출한다. 인간 Igλ 양성 B 세포의 퍼센트는 1 내지 40% 또는 그 이상의 범위이다.
mRNA를 람다 3 형질전환 마우스의 림프 조직 예를 들어, 지라, 림프절, 골수, 혈액으로부터 단리하고, 인간 Vλ 및 Cλ에 대해 특이적인 프라이머를 사용하는 RT-PCR을 람다 3 전이유전자로부터의 인간 가변 영역의 발현된 레파토리를 증폭하는데 사용한다. Vλ cDNA를 TA(캘리포티아, 칼스배드, 인비트로젠, 인크.,)와 같은 클로닝 벡터로 클로닝한다. 인간 Vλ cDNA가 시퀀싱한다. 모든 8개의 Vλ 유전자 및 기능적인 인간 Jλ-Cλ는 발현된 레파토리에서 나타나는 것으로 보여진다. cDNA의 서열은 오픈-리딩 프레임을 가지며 완전한 인간 가변 영역을 인코딩하여, Vλ-Jλ의 기능적 재조합 및 인간 Igλ 전이유전자의 적절한 발달 조절과 일치한다.
람다 3에 대해 형질전환된 마우스는 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 항원으로 면역화된다. mRNA를 람다 3 형질전환 마우스의 제 2 림프 조직, 예를 들어, 지라, 림프절로부터 단리하고, 인간 Vλ 및 Cλ에 대해 특이적인 프라이머를 사용하는 RT-PCR을 람다 3 전이유전자로부터의 인간 가변 영역의 발현된 레파토리를 증폭하는데 사용한다. VλcDNA를 TA와 같은 클로닝 벡터로 클로닝한다. 인간 Vλ cDNA를 시퀀싱한다. 인간 Vλ 영역은 생식계열 서열과 비교하여 돌연변이된 것으로 밝혀져서, 친화성 성숙과 일치하는 체세포 돌연변이 사건을 나타낸다.
이들 데이터를 종합하면 람다 3 전이유전자는 B 세포에서 발현되며 인간 Igλ 경쇄의 다양성을 발현하고, 제 2 면역 반응에서 친화성 성숙을 겪음을 나타내는 체세포 돌연변이 사건에 대한 주형이라는 것이 증명된다.
실시예 8
전핵 공동-미세주입에 의한, 합성적 194 KB 의 인간 IG 람다 전이유전자, 람 다- 프라임을 보유하는 형질전환 마우스의 생성
합성적, 서열 확인된 람다 5 BAC를 AsiSI 및 FseI로 분해하고, PFGE에서 아가로스 겔 상에서 내리고, 람다 5 서열을 포함하는 DNA를 실시예 6에서와 같이 단리한다. 이 DNA를 실시예 6에서처럼 단리된, 람다 3 서열을 포함하는 DNA와 함께 마우스 수정란의 전핵으로 공동-미세주입한다. 공동-미세주입된 DNA는 마우스 게놈으로 공동통합되며, 상당한 비율의 통합 사건이 작동가능한 결합에서 배향된 람다 5 및 람다 3를 포함하는 즉, 람다 5 및 람다 3 둘다는 각각 서로에 대해 동일한 5' 에서 3' 배향으로 배향되고 람다 5는 람다 3에 대해 5'에 통합되고 즉, 람다 5의 3' 말단이 람다 3의 5' 말단과 병렬된다. 따라서, 29개의 기능적인 인간 Vλ 서열, 모든 인간 Jλ-Cλ 및 인간 3'인핸서 서열을 포함하는, 람다-프라임의 연속적인 인간 서열인, 작동가능한 결합의 194 kb의 합성 DNA가 만들어진다. 작동가능한 결합으로 온전하게 통합된 것은 흔치않은 절단 제한 효소를 이용한 게놈 DNA 절단물(cut)의 서던 블롯, 표준 및 PGFE 겔 상에서의 러닝, 및 람다 5 및 람다 3에 특이적인 서열을 이용한 탐침에 의해 확인된다. 작동가능하게-연결된 공동-통합된 람다-프라임 서열의 완전한 뉴클레오티드 서열이 완전히 공지되어 있기 때문에, 실시예 4에서 서술된 바와 같이 서열 안으로 고안된 흔치않은-절단 제한 효소 부위에 의해 촉진되는 바처럼, 제한 단편 패턴의 인실리코 예측이 온전하고 작동가능한 결합이 확인하기 위해 쉽게 달성된다. 전이유전자 기능은 혈청내의 인간 Igλ에 대한 ELISA에 의해서 확인된다.
조상 마우스를 번식시켜 형질전환 자손을 생산한다. 카피 수는 qPCR 또는 게놈 DNA의 서던 블랏의 농도계 스캐닝과 같은 방법에 의해 용이하게 평가된다. 바람직한 경우, 다수-카피 람다 5-3 전이유전자가 통합되는 라인에서, 형질전환 마우스를 FLP-재조합효소를 발현하는 형질전환 마우스에 교배시킨다. 람다 5 및 람다 3 전이유전자에서 존재하는 frt 부위는 특히, 생식계열 세포에서 부위-특이적으로 재조합한다. 작동가능적하게 연결된 람다 5-람다 3의 분해된 단일-카피 전이유전자를 가진 생식세포가 생산되며, 이들 생식세포는 단일-카피 분해된 람다-프라임 서열을 다음 세대로 전달한다. 다수 카피 또는 단일 카피의 형질전환 마우스를 실시예 7에서 기술된 바와 같이 람다-프라임 기능에 대해 시험한다. 데이타는 람다-프라임 전이유전자가 B 세포에서 발현되며, 인간 Igλ 경쇄의 다양성을 발현하고, 제 2 면역 반응에서 친화성 성숙을 겪음을 나타내는 체세포 돌연변이 사건에 대한 주형이라는 것을 증명한다.
실시예 9
ES 세포로의 공동- 트랜스펙션에 의한 194 KB 의 합성적 인간 IG 람다 전이유전자를 보유하는 형질전환 마우스의 생성
람다 3 및 람다 5 서열을 포함하는 DNA가 실시예 8에서와 같이 단리된다. 이들 DNA는 리포펙션 또는 전기천공과 같은 방법에 의해서 마우스 ES 세포로 공동-도입된다. 람다 5 상의 가장 5' Vλ 유전자의 5' 양성-선택성 마커 카세트, 예를 들어 하이그로마이신의 존재는 람다 5의 통합에 대한 양성 선택을 가능하게 한다. 공동-도입된 DNA는 마우스 게놈으로 무작위로 공동통합되며, 통합 사건의 상당한 비율이 작동가능한 결합으로 배향된 람다 5 및 람다 3를 포함하며, 즉, 람다 5 및 람다 3 둘다는 각각 서로에 대해 동일한 5'에서 3' 배향으로 배향되고 람다 5는 람다 3에 5'으로 통합되고, 즉, 람다 5의 3' 말단이 람다 3의 5' 말단과 병렬된다. 따라서, 작동가능한 결합의 194 kb의 합성 DNA의 연속적인 람다-프라임 서열이 만들어진다.
작동가능한 결합으로 온전하게 통합된 것은 흔치않은 절단 제한 효소로 절단된 게놈 DNA의 서던 블롯, 표준 및 PGFE 겔 상에서의 러닝 및 람다 5 및 람다 3에 특이적인 서열을 이용한 탐침에 의해 확인된다. 작동가능하게-연결된 공동-통합된 람다-프라임 서열의 완전한 뉴클레오티드 서열이 완전히 공지되어 있기 때문에, 실시예 4에서 서술된 바와 같이 서열 안으로 고안된 흔치않은-절단 제한 효소 부위에 의해 촉진되는 바와 같이, 제한 단편 패턴의 인실리코 예측이 온전하고 작동가능한 결합을 확인하기 위해 쉽게 달성된다. 카피 수는 qPCR 또는 게놈 DNA의 서던 블랏의 농도계 스캐닝과 같은 방법에 의해 용이하게 평가된다. 바람직한 경우, 다수-카피 람다 5-3 전이유전자가 통합되는 클론에서, FLP-재조합효소가 클론에서 일시적으로 발현된다. 람다 5 및 람다 3 전이유전자에서 존재하는 frt 부위는 부위-특이적으로 재조합한다. 작동적으로 연결된 람다 5-람다 3의 분해된 단일-카피 전이유전자를 가진 클론이 생성된다.
작동적으로 연결된 람다-프라임 전이유전자 서열을 보유하는 ES 세포는 널리-확립된 방법을 사용하여 형질전환 마우스를 만드는데 사용된다. 예를 들어, ES 세포를 마우스 배반포로 미세주입하고, 그 후 이를 가짜-임신 위탁 암컷에 이식한다. 키메라 새끼가 태어난다. 키메라 마우스를 번식시키고 수득된 자손을 람다-프라임 전이유전자의 존재에 대해 스크리닝한다.
다수 카피 또는 단일 카피의 형질전환 마우스를 실시예 7에서 기술된 바와 같이 람다-프라임 기능에 대해 시험한다. 데이타는 람다-프라임 전이유전자가 B 세포에서 발현되며, 인간 Igλ 경쇄의 다양성을 발현하고, 제 2 면역 반응에서 친화성 성숙을 겪는 것을 나타내는 체세포 돌연변이 사건에 대한 주형이라는 것을 증명한다.
실시예 10
람다 - 프라임 전이유전자를 포함하는 DNA 의 합성 및 조립 및 그로부터의 형질전환 마우스의 생성
크기가 대략 30-40 kb 보다 더 큰 DNA가 BAC 상에 보유된다. 실시예 2는 크기가 545 kb인 BAC의 생성을 기록한다. 추가로, YAC, PAC, MAC와 같은 큰 조각의 DNA를 보유할 수 있는 다른 클로닝 벡터를 사용할 수 있다. 이런 모든 벡터에서 큰 DNA의 유전적 조작 및 물리적 회수는 문헌에 널리-기록되어 있다.
계약 서비스 제공자는 매우 큰 조각의 DNA를 합성하고 조립한다. 람다-프라임의 DNA 서열을 하나의 조사 서비스 제공자인 DNA2.0, Inc.(캘리포니아, 멘로 파크)로 전송한다. 서열은 물리적 DNA로 합성되고 조립된다. 최종 완전하게 조립된 서열은 벡터 백본으로서 pBeloBAC을 가진 BAC에서 보유된다. 완전한 BAC는 454 시퀀싱 기술(454 라이프 사이언스, 로쉬) 또는 표준 샷건 시퀀싱을 사용하여 SeqWright, Inc.(텍사스, 휴스턴)와 같은 시퀀싱 서비스 제공자에 의해 시퀀싱 되었다. 합성적 람다-프라임 DNA의 서열은 참조 서열에 대해 확인한다. 인실리코 서열로부터의 임의의 서열 편차는 긴 호모폴리머 또는 다이폴리머 서열에 기인한 시퀀싱 판독 에러일 가능성이 높다. 편차는, 실제 물리적인 합성 DNA에서 돌연변이일 가능성이 없었음에도 불구하고, 비-코딩, 비-조절성 영역으로 맵핑하였다.
대안적으로, 람다 3 및 람다 5는 실시예 1 및 2에서 기재된 바와 같은 기술을 사용하여 시험관내에서 재조합될 수 있다. 람다 3 및 람다 5는 pBeloBAC로 리컴바이니어링, 또는 표준 제한 단편 라이게이션, 이어서 대장균으로 형질감염하는 것과 같은 BAC를 조작하는 다른 방법을 사용하여 또한 재조합될 수 있다.
형질전환 마우스는 실시예 6에서 기술된 바와 같이 또는 실시예 9에서 예시된 바와 같이, 전기천공, 리포펙션 등에 의한 것과 같이 ES 세포로 도입됨으로써 생성된다. 다수 카피 또는 단일 카피인 형질전환 마우스를 실시예 8에서 기술된 바와 같이 람다-프라임 기능에 대해 시험한다. 데이터는 람다 프라임-전이유전자가 B 세포에서 발현되며, 인간 Igλ 경쇄의 다양성을 발현하고, 제 2 면역 반응에서 친화성 성숙을 겪음을 나타내는 체세포 돌연변이 사건에 대한 주형이라는 것을 증명한다.
실시예 11
추가적인 인간 V 람다 레파토리를 포함하는 게놈 DNA 와 함께 람다 3의 공동-도입을 통한 인간 IGL 전이유전자의 생성
인간 게놈 DNA 라이브러리는 상업적으로 또는 허가를 통해 이용가능하며 널리-특성화된다. 이들은 BAC 상에 보유되는 칼텍(CalTech) 인간 게놈 라이브러리 및 YAC 상의 다양한 인간 게놈 DNA 라이브러리를 포함한다. 라이브러리 B, C 및 D로부터의 칼텍 인간 라이브러리 BAC 클론은 인비트로젠(캘리포니아, 칼스배드)을 통해 주문할 수 있다. 인간 게놈 라이브러리는 또한 코스미드, 파지, P1, PAC 등에 보유되어 이용가능하다. 이들 벡터들 모두는 당해 기술 분야에 용이하게 이용가능한 기술을 사용하여 공동-도입 전에 변경될 수 있다.
DNA의 큰 단편이 시퀀싱될 수 있는 준비된 시설 때문에, 이들 BAC 또는 YAC 상의 게놈 삽입체는 상기 기술된 바와 같은 계약 서비스 제공자를 사용하여 시퀀싱되어 확인될 수 있다. 완전한 인간 DNA 삽입체를 단리할 수 있다. 대안적으로, 서브단편은 게놈 DNA에서 활용가능한 흔치않은-절단 제한 효소 부위를 사용하여 단리할 수 있다. 적합한 YAC의 예는 L1이다(미국 특허 제7,435,871호). 사용하기에 적합한 다른 YAC, BAC 및 코스미드 클론은 Kawasaki 등(Gen. Res. (1995) 5: 125-135) 및 Frippiat 등(Hum. Mol. Genet. (1995) 4: 983-991)에 기술된다. 추가적인 인간 Vλ 유전자를 포함하는 하나 이상의 BAC 또는 YAC는 람다 3 작제물과 함께 공동-도입된다. 선택적으로, 람다 3 DNA는 추가적인 Vλ 유전자를 가진 2개 이상의 다른 작제물과 함께 공동-도입된다. 2개 이상의 공동-도입된 작제물은 실시예 8 및 9에서 서술된 바와 같이 작동가능한 결합으로 공동-통합되도록 확인된다. 전이유전자 기능성은 실시예 7에서와 같이 확인된다. 따라서, 인간 Igλ 전이유전자는 부분적으로 합성되고 부분적으로 게놈 라이브러리로부터 유래될 수 있으며, 코어 Jλ-Cλ 및 3' 시스 조절 서열은 합성 수단에 의해 생성되고 Vλ 레파토리의 모두 또는 부분은 게놈 라이브러리로부터 유래된다.
실시예 12
적어도 하나의 기능적인 인간 JL - CL 쌍을 포함하는 게놈 DNA 서열과 람다 5의 공동-도입을 통한 인간 IGL 전이유전자의 생성
인간 게놈 DNA 라이브러리는 상업적으로 또는 허가를 통해 이용가능하며 널리-특성화된다. 이들은 BAC 상에 보유되는 칼텍 인간 게놈 라이브러리 및 YAC 상의 다양한 인간 게놈 DNA 라이브러리를 포함한다. 라이브러리 B, C 및 D로부터의 칼텍 인간 라이브러리 BAC 클론은 인비트로젠(캘리포니아, 칼스배드)을 통해 주문할 수 있다. 인간 게놈 라이브러리는 또한 코스미드, 파지, P1, PAC 등에 보유되어 이용가능하다. 이들 벡터들 모두는 당해 기술 분야에 용이하게 이용가능한 기술을 사용하여 공동-도입 전에 변경될 수 있다.
DNA의 큰 단편이 시퀀싱 될 수 있는 준비된 시설 때문에, 이들 BAC 또는 YAC 상의 게놈 삽입체는 상기 기술된 바와 같은 계약 서비스 제공자를 사용하여 시퀀싱되고 확인될 수 있다. 완전한 인간 DNA 삽입체가 단리될 수 있다. 대안적으로, 서브단편은 게놈 DNA에서 이용가능한 흔치않은-절단 제한 효소 부위를 사용하여 단리할 수 있다. 적합한 YAC의 예는 L2이며(미국 특허 제7,435,871호), 이는 모든 7개 Jλ-Cλ 쌍 및 인간 3' 인핸서를 함유한다. 사용하기에 적합한 다른 YAC, BAC 및 코스미드 클론은 Kawasaki 등(Gen. Res. (1995) 5: 125-135) 및 Frippiat 등(Hum. Mol. Genet. (1995) 4: 983-991)에 기술된다.
코어 작제물은 적어도 하나의 기능적인 인간 Jλ-Cλ 쌍 및 바람직하게 기능적인 3' 인핸서를 함유한다. 람다 5 DNA는 코어 작제물의 단리된 DAN 및 선택적으로, 추가적인 Vλ 유전자를 가진 하나 이상의 다른 작제물와 함께 공동-도입된다. 2개 이상의 공동-도입된 작제물은 실시예 8 및 8에서 서술된 바와 같이 작동가능한 결합으로 공동-통합되도록 확인된다. 전이유전자 기능성은 실시예 7에서와 같이 확인된다. 따라서, 인간 Igλ 전이유전자는 부분적으로 합성되고 부분적으로 게놈 라이브러리로부터 유래될 수 있으며, 코어 Jλ-Cλ 및 3' 시스 조절 서열은 합성 수단에 의해 생성되고 Vλ 레파토리의 모두 또는 부분은 게놈 라이브러리로부터 유래된다.
실시예 13
전이유전자를 재조합하기 위한 CRE - LOX 시스템의 사용
람다 3 전이유전자의 서열은 frt 부위의 서열을 대체하거나 frt 부위에 인접하게 위치되는 loxP 부위 또는 그의 변이체의 첨가의 변경을 가지고서 실시예 4에서 기술된 바와 같이 인실리코 고안되고, 람다 3P가 생성되며, 퓨로마이신-내성과 같은 포유동물 세포에서의 약물-내성 카세트 활성이 loxP 부위의 5'에 삽입되어, 람다 3P를 생성한다. 람다 3P 서열은 실시예 5에서 기술된 바와 같이 물리적 DNA로 합성되고 조립된다. 람다 3P DNA는 벡터 DNA로부터 단리되고, ES 세포로 도입되며, 퓨로마이신-내성 콜로니를 선택하고, 람다 3P의 온전한 통합에 대하여 분자적으로 스크리닝한다.
람다 5 전이유전자의 서열은 frt 위치의 서열을 대체하거나 또는 그에 인접한 곳에 위치되는 loxP 부위 또는 그 변이체의 첨가의 변경을 가지고서 실시예 4에서 기술된 바와 같이 인실리코 고안되어, 람다 3P가 생성된다. 람다 5P 서열은 pBeloBAC와 같은 BAC 벡터 서열이 결실된 loxP 부위를 가지거나 람다 5P 서열에서의 것과의 재조합에 대해 비양립성인 버전을 보유하는 것을 제외하고 실시예 5에서 기술된 바와 같이 물리적 DNA로 합성되고 조립된다. 원형 람다 5P BAC DNA는 단리되고 람다 3P ES 클론으로 CRE 재조합효소와 함께 공동-형질감염된다. CRE 재조합효소는 loxP 부위 사이에서 부위-특이적 재조합을 불러일으켜, 람다 3 DNA의 상류에 작동가능하게 결합된 람다 5P DNA의 통합을 초래하여, 람다 프라임 서열을 재구성한다. 람다 5P 양성 ES 클론을 퓨로마이신-내성에 대해 선택하고, 골라서 실시예 9에 기술된 바와 같이 람다 3P로의 람다 5P의 삽입에 대해 분자적으로 스크리닝한다. 형질전환 마우스가 ES 세포로부터 만들어지며 실시예 9에 기술된 바와 같이 람다 프라임 전이유전자 기능에 대하여 확인된다.
기능적인 코어 Jλ-Cλ 서열의 상류의 추가적인 Vλ 레파토리 상류의 삽입을 위한 이 방법은 loxP 부위가 Jλ-Cλ 코어 서열에 작동적으로 연결되기를 바라는 가장 3' Vλ 유전자의 3'인 한은, 원형 DNA로 존재하는, 예를 들어 플라스미드, 코스미드, BAC, 또는 YAC와 같은 원형화될 수 있는 임의의 벡터에 대해 적용가능하다.
실시예 15
고도의( highly ) 키메라 인간-마우스 DAN 서열을 포함하는 합성 DNA 전이유전자로부터 인간 IG 람다를 발현하는 형질전환 마우스 전이유전자의 생성
마우스 면역글로불린 람다 경쇄 유전자좌의 완전히 주석이 달린 서열이 공공 도메인에서 이용가능하며, 젠뱅크 기탁번호 NG_000082을 참고한다. 2개의 분리된 단위로 구성되는 마우스 Igλ 유전자좌의 고유한 구조 때문에(참조: Selsing et al., Immunoglobulin Genes 1989 Acad. Press Ltd., pp. 111-122), 마우스 Igλ 유전자좌 단위 중 하나의 서열을 선택한다. Vλ1의 개시 코돈의 상류 4 kb 및 3'인핸서의 하류 5 kb를 포함하는 60,000 뉴클레오티드(nt) 서열을 인실리코 단리한다. 마우스 Vλ2의 개시 코돈의 상류 4 kb의 서브-서열 및 RSS의 하류 500 bp를 확인ㅎ한다("Vλ 발현 카세트"). Ramsden 및 Wu(Proc. Natl. Acad. Sci. 1991 88: 10721-10725)의 도 1은 Vλ2 RSS 및 Jλ3 및 Jλ1에 대한 RSS를 확인한다. 마우스 Vλ1의 39개 뉴클레오티드 RSS의 서열은 인간 Vλ, 예를 들어 Vλ3-1로부터의 기능적인 RSS과 기능적인 배향으로 대체된다. 개시 코돈의 상류 4,000 nt, 인간 RSS 및 RSS의 하류 500 nt까지를 포함하는 이 대략 5,000 뉴클레오티드 서열이 코어 Vλ 발현 작제물이다.
마우스 Jλ3 및 Jλ1의 28 뉴클레오티드 서열은 인간 Jλ3 및 Jλ1로부터의 기능적인 RSS와 기능적인 배향으로 대체된다. 마우스 Jλ3 및 Jλ1에 대한 코딩 서열은 인간 Jλ3 및 Jλ1에 대한 코딩 서열에 의해 대체된다. 마우스 Cλ3 및 Cλ1에 대한 코딩 서열은 인간 Cλ3 및 Cλ1에 대한 코딩 서열에 의해 대체된다. 마우스 Vλ1의 코딩 서열은 인간 Vλ 유전자, 예를 들어 Vλ3-1의 코딩 서열로 대체된다. 마우스 3' 인핸서를 포함하는 서열은 인간 Igλ 3' 인핸서의 3 DNAseI 과민성 부위를 포함하는 7,562 뉴클레오티드 서열로 대체된다. 이 서열은 코어 키메라 Igl 작제물이다. Combriato 및 Klobeck(J. Immunol. 2002 168:1259-1266)는 마우스 3' 인핸서에 최적 인핸서 활성을 회복시키기 위한 다른 서열 변화를 알려준다.
추가적인 Vλ 레파토리는 코어 키메라 Igλ 작제물 5'에 코어 Vλ 발현 작제물 서열 부착을 통해 인실리코 첨가된다. 각각의 첨부된 Vλ 발현 작제물에서, 마우스 Vλ1 코딩 서열은 인간 Vλ 코딩 서열로 대체된다. 전체 인간 Vλ 레파토리는 대략 205,000 nt의 서열을 산출하도록 연속적으로 인실리코 부착될 수 있다.
서열 또는 그의 2개 부분을 이전 실시예에서 기술된 대로 물리적 DNA로 합성하고 조립한다. DNA는 이전 실시예에서 기술된 바와 같이 형질전환 마우스를 작제하는데 사용된다. 형질전환 마우스를 이전 실시예에서 기술된 바와 같이 전이유전자 발현 및 기능에 대해 분석한다. 데이터는 전이유전자가 B 세포에서 발현되며 인간 Igλ 경쇄의 다양성을 발현하고, 제 2 면역 반응에서 친화성 성숙을 겪음을 나타내는 체세포 돌연변이 사건에 대한 주형이라는 것을 증명한다.
선행하는 실시예는 정교하고 정확하게 그리고 복잡하게 조작된 서열이 인실 리코 구성되는 방법론 및 그 후 그 서열을 포함하는 형질전환 동물을 만들기 위한 방법을 분명히 보여준다. 상기 방법론은 기술된 순서로 제한되지 않는다.
실시예 14
기능적인 합성 인간 IG 카파 경쇄 전이유전자의 서열의 인실리코 조립
선행하는 실시예에서 기술된 방법론은 인실리코 조립 및 실시예 2에서 증명된 바와 같이, 적어도 500 kb인 BAC의 클로닝 능력까지의 임의의 서열의 후속적인 합성에 폭넓게 적용가능하다. 실시예3에서 기술된 바와 같이, 인간 Igκ 전이유전자를 인코딩하는 서열은 인간 및 마우스 Igκ 유전자좌의 서열에 대한 공개적으로 이용가능한 정보로부터 조립하였다. 완전 인간 Igκ 유전자좌에 대한 주석달린 서열은 젠뱅크, 등록번호 TNG_000834로부터 얻을 수 있다. 이 서열은 3' 조절 요소, 3' 인핸서, Ed 및 RS까지 완전 근위 Vκ 클러스터를 포함한다. 서지적으로 뒷받침되는 과학적 참조를 포함하는 추가적인 상세 정보는 Vbase(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) 및 IMGT (http://imgt.cines.fr/)를 포함하는 다수의 공공 도메인 웹사이트에서 이용가능하다. 이러한 정보는 인간 Igκ 유전자좌의 유전적 및 표현형적 내용에 대한 데이터를 포함하는데, 예를 들어, 발현된 유전자 서열, 슈도유전자, 대립유전자 변이체의 확인을 포함하나 이로 제한되지 않으며, 어떤 유전자가 잘못접히기(misfoding) 쉬운 도메인을 인코딩하는지에 관한 데이터를 포함한다.
인간 Vκ4-1의 상류 4kb부터 완전 인간 Jκ 클러스터 및 인간 Cκ의 3'의 1000 nt까지를 포함하는 30,000 nt 서열은 생식계열 구성이었다. Igκ 3' 인핸서, Ed 및 RS를 포함하는 25,600 nt 생식계열 구성된 마우스 DNA 서열이 인간 Cκ의 3'에 인실리코 부착되었다. 이 서열은 코어 Igκ 발현 카세트로서 기능 하였다.
레파토리를 확장하기 위해서, ~5,000 nt의 단위로서 추가적인 Vκ 발현 카세트에 대한 서열을 Vκ4-1의 5'에 추가하였다. 인간 생식계열 구성의 5 kb 거리 미만의 근위에 2개의 기능적인 Vκ 유전자가 위치된 경우에, 가장 5' 유전자의 5' UTR의 5'의 대략 4 kb로부터 및 가장 3' Vκ 유전자의 RSS의 3'의 대략 500 bp의 2개의 Vκ 유전자를 포함하는 전체 서열을 사용하였다. 실시예 3에 기술된 바와 같이, 특정 제한 효소에 대한 인식 서열을 서열의 말단에 도입하였다. 특이적 제한 효소에 대한 인식 서열은 도입되었고 서열 삽입, 결실 또는 변경을 통해서 내부적으로 결실시켰다; 이들은 유전자 발현 또는 코딩을 교란하지 못하였다.
실시예 16
인간 IGK 를 발현하는 유전자좌에 대한 형질전환 마우스의 생성, 상기 유전자좌는 합성적 DNA 를 포함하는 것임.
선행하는 실시예 1-2 및 실시예 4-14 중 임의의 것에 기술된 방법론 및 실시예 3 및 15에 기술된 서열의 인실리코 조립을 위한 방법을 사용하여, 인간 Igκ 경쇄를 인코딩하는 물리적 DNA를 합성하고 이용하여 형질전환 마우스를 만든다. 형질 전환 마우스는 핵산 및 단백질 수준에서 인간 Igκ 발현을 연구하는데 사용하기 위한 적절한 시약을 사용하여 이전 실시예에서 기술된 바와 같이 전이유전자 발현 및 기능에 대해 분석한다. 데이터는 전이유전자가 B 세포에서 발현되며 인간 Igκ 경쇄의 다양성을 발현하고, 제 2 면역 반응에서 친화성 성숙을 겪음을 나타내는 체세포 돌연변이 사건에 대한 주형이라는 것을 증명한다.
실시예 17
고도의 키메라 인간-마우스 DNA 서열을 포함하는 합성적 DNA 전이유전자로부터 인간 IGK 를 발현하는 마우스의 생성
인간 면역글로불린 카파 경쇄 유전자좌의 주석달린 서열은 공개적으로 이용가능하며, 젠뱅크 기탁번호 NG_000834를 참조한다. 마우스 면역글로불린 카파 경쇄 유전자좌의 주석 달린 서열은 공개적으로 이용가능하며, 젠뱅크 기탁번호 NC_005612를 참조한다. IGMT 레파토리 웹사이트(http://imgt.cines.fr/)와 같은 다른 출처가 유전자좌 내의 개개의 성분의 지도 및 기능성에 대한 자원으로 사용될 수 있다. Vκ, 바람직하게 가장 근위의 마우스 Vκ, Vκ3-1, Jκ 클러스터, Cκ, 3' 조절 영역까지를 포함하는, 대략 50,000개 염기의 마우스 DNA 서열을 인실리코 단리한다. 이 서열이 바람직하게는 생식계열 구성이라 하더라도, DNA의 유전자간 영역은 서열 및 위치가 모두 공개적으로 문서화된 Igκ 인트론 인핸서, 3' 인핸서, Ed 및 RS와 같은 중요한 조절 영역이 교란되지 않는 한은, 결실되어 더 작은 전체 서열을 만들 수 있다.
Vκ, Jκ 및 Cκ에 대한 마우스 엑손은 그들의 인간 대응부로 대체된다. 마우스 Vκ 엑손을 대체하는 인간 Vκ 엑손은 Vκ4-1일 수 있는데, 이것은 인간 Jκ 클러스터에 가장 근위인 인간 Vκ이나, 이는 절대적으로 필수적인 것은 아니다. 임의의 인간 Vκ 엑손 서열을 사용할 수 있다. 인간 Vκ4-1 및 다음 가장 근위 Vκ 유전자, Vκ5-2는 생식계열 구성의 인간 Jκ 클러스터에 관하여 3'-5' 전환되는 것이 주목된다. 인간 Vκ 4-1 엑손은 인실리코 작제된 서열에서 마우스 Jκ 유전자좌에 대하여 5'-3' 배향으로 맥락에 마우스 Vκ 맥락 내에 배향될 것이다. 마우스 Jκ 유전자좌는 5개의 Jκ 서열을 포함하나 비-표준적인(non-canonical) 공여체 스플라이스 서열 때문에 Jκ3는 발현되지 않을 수 있다. 인간 Jκ 유전자좌는 5개의 Jκ 서열을 포함하는데, 그 모두는 기능적이다. 인간 Jκ3 엑손의 통합은 특히, 인간 Cκ 상의 그의 대응부 스플라이스 수용체 서열에의 스플라이싱을 위한, 적절한 스플라이스 공여체 서열을 가져올 것이다.
추가적인 Vκ 레파토리는 근위에서 말단 순서로 기능적인 마우스 Vκ 유전자를 포함하는 대략 5 kb 단위를 규명함을 통해 인실리코 첨가된다. 5 kb 서열 단위의 이러한 숫자는 전이유전자에서 나타내어지는 인간 Vκ 유전자의 수와 등가이다.마우스 슈도유전자는 제거된다. 각각의 부착된 Vκ 발현 작제물에서, 마우스 Vκ 코딩 서열은 인간 Vκ 코딩 서열로 대체된다. 5 kb 단위는 또한 반복된 단위일 수 있어서 동일한 비-코딩 서열은 각각의 단위를 포함하고 상기 단위는 고유한 인간 Vκ 엑손 서열에 의해서만 구별된다. 각각의 단위는 선행하는 것에 5'의 코어 서열 상에 부착되며, 근위에서 말단으로, 연속적으로 인공적인 유전자좌의 서열을 만든다.
전체 근위의 인간 Vκ 레파토리는 대략 140,000 염기의 서열을 산출하도록 연속적으로 인실리코 부착될 수 있다. 인간 Vκ 유전자의 역전된 말단 클러스터가 또한 포함될 수 있지만, 그들이 근위의 클러스터에서 유전자의 듀플리케이션이기 때문에, 그들은 발현된 인간 Vκ 레파토리의 <10%에 기여하며, 그들이 일부 인간 하플로타입에서 결여되기 때문에, 그들의 포함은 필수적이지 않으며 이후 항체 약물 개발에 바람직하지 않을 수 있다.
서열 또는 그의 2개 부분을 이전 실시예에서 기술된 대로 물리적 DNA로 합성하고 조립한다. DNA를 이전 실시예에서 기술된 바와 같이 형질전환 마우스를 작제하는데 사용한다. 형질전환 마우스를 이전 실시예에서 기술된 바와 같이 전이유전자 발현 및 기능에 대해 분석한다. 데이터는 전이유전자가 B 세포에서 발현되며 인간 Igκ 경쇄의 다양성을 발현하고, 제 2 면역 반응에서 친화성 성숙을 겪는 것으로 나타나는 체세포 돌연변이 사건에 대한 주형이라는 것을 증명한다.
선행하는 실시예는 정교하고 정확하게 그리고 복잡하게 조작된 서열이 인실 리코 구성되는 방법론 및 그 후 그 서열을 포함하는 형질전환 동물을 만들기 위한 방법을 분명히 보여준다. 상기 방법론은 기술된 순서로 제한되지 않는다.
상기에 기술된 다양한 구현 예들은 조합하여 추가의 구현 예를 제공할 수 있다. 이 명세서 및/또는 명세서 데이터 시트에 언급된 미국 특허, 미국 특허출원 등록, 미국 특허 출원, 외국 특허, 외국 특허 출원 및 비특허 공개 문헌은 여기에 전체적으로 참고로 포함된다. 더 추가적인 구현 예를 제공하기 위해 필요한 경우 다양한 특허, 출원, 및 공개문헌의 개념을 사용하여 구현 예의 일면이 변형될 수 있다.
상기 자세히 기술된 관점에서 상기 구현 예에 대한 이들 및 다른 변화가 이루어질 수 있다. 일반적으로, 하기의 청구항에서, 사용된 용어는 명세서와 청구항에 기술된 특이적 구현 예에 대한 청구항을 제한하고자 해석되지 말아야 하나, 청구항이 명명된 유사어구의 전체 범위와 더불어 모든 가능한 구현 예를 포함하도록 해석되어야 한다. 따라서, 상기 청구항은 상기 기술내용으로 제한되지 않는다.

Claims (63)

  1. 인간 중쇄 가변 도메인 및 키메라 중쇄 불변 영역을 포함하는 키메라 면역글로불린 중쇄로서, 상기 키메라 불변 영역이 인간 CH1 도메인, 인간 상부 힌지 영역, 마우스 CH2 도메인, 및 마우스 CH3 도메인을 포함하고, 상기 인간 중쇄 가변 도메인이 하나 이상의 인간 V, (D), J 유전자 분절 또는 이들의 조합에 의해 인코딩되는 것인, 키메라 면역글로불린 중쇄.
  2. 제 1항에 따른 키메라 면역글로불린 중쇄를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩 및 비-코딩 서열을 포함하거나 상기 폴리뉴클레오티드가 합성적인 것인 폴리뉴클레오티드.
  4. 제 2항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 작제물.
  5. 하나 이상의 인간 V, (D), J 유전자 분절 또는 이들의 조합, 인간 CH1 유전자 분절, 인간 상부 힌지 유전자 분절, 마우스 CH2 유전자 분절 및 마우스 CH3 유전자 분절을 포함하는 합성 전이유전자(transgene)를 포함하는 게놈을 포함하는 마우스 세포로서, 상기 합성 전이유전자가 제 1항에 따른 키메라 면역글로불린 중쇄를 생산하도록 유전자 재배열을 진행하고, 상기 키메라 중쇄가 인간 중쇄 가변 도메인 및 키메라 중쇄 불변 영역을 포함하며, 상기 키메라 중쇄 불변 영역이 인간 CH1 도메인, 인간 상부 힌지 영역, 마우스 CH2 도메인, 및 마우스 CH3 도메인을 포함하고, 상기 게놈이 비활성화된 내인성 면역글로불린 유전자좌를 포함하는 것인, 마우스 세포.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 게놈이 인간 면역글로불린 경쇄를 추가로 포함하는 것인 마우스 세포.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 게놈이 인간 Igκ 경쇄 및 인간 Igλ 경쇄를 포함하는 것인 마우스 세포.
  8. 삭제
  9. 제 5항에 따른 마우스 세포에 의해 생산된 키메라 항체.
  10. (1) 하나 이상의 인간 V, (D), J 유전자 분절 또는 이들의 조합, 인간 CH1 유전자 분절, 인간 상부 힌지 유전자 분절, 마우스 CH2 유전자 분절 및 마우스 CH3 유전자 분절을 포함하는 제1 합성 전이유전자, 및 (2) 인간 면역글로불린 경쇄를 인코딩하는 제2 합성 전이유전자를 포함하는 게놈을 포함하는 마우스로서, 상기 제1 합성 전이유전자가 제 1항에 따른 키메라 면역글로불린 중쇄를 생산하도록 유전자 재배열을 진행하고, 상기 키메라 중쇄가 인간 중쇄 가변 도메인 및 키메라 중쇄 불변 영역을 포함하며, 상기 키메라 중쇄 불변 영역이 인간 CH1 도메인, 인간 상부 힌지 영역, 마우스 CH2 도메인 및 마우스 CH3 도메인을 포함하는 것인, 마우스.
  11. 하기 단계를 포함하는, 제 1항에 따른 키메라 면역글로불린 중쇄를 포함하는 게놈을 포함하는 마우스 세포를 제조하는 방법:
    하나 이상의 재배열되지 않은 인간 중쇄 V, (D), J 유전자 분절 또는 이들의 조합, 및 인간 CH1 유전자 분절, 인간 상부 힌지 유전자 분절, 마우스 CH2 유전자 분절 및 마우스 CH3 유전자 분절을 포함하는 키메라 중쇄 불변 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, DNA 작제물을 인실리코(in silico)로 고안하는 단계;
    상기 DNA 작제물을 제조하는 단계; 및
    세포의 게놈 내로 상기 작제물을 도입하는 단계.
  12. 삭제
  13. 제 11항에 있어서, 하기의 단계를 추가로 포함하는 방법:
    인간 면역글로불린 경쇄를 포함하는 제2 DNA 작제물을 인실리코(in silico)로 고안하는 단계;
    상기 제2 DNA 작제물을 제조하는 단계; 및
    세포의 게놈 내로 상기 제2 DNA 작제물을 도입하는 단계.
  14. 제 13항에 있어서, 인간 경쇄가 하나 이상의 인간 Vκ 유전자 분절을 포함하며, 인간 경쇄가 하나 이상의 인간 Jκ 및 Cκ 유전자 분절을 추가로 포함하는 것인 방법.
  15. 제 13항에 있어서, 인간 경쇄가 8개 이상의 인간 Vλ 유전자 분절을 포함하며, 인간 경쇄가 7개 이상의 인간 Jλ-Cλ유전자 분절 쌍을 추가로 포함하는 것인 방법.
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