TW202540204A - 雙特異性分子及使用其的治療方法 - Google Patents

Abstract

本發明涉及靶向IL-13和OX40L的雙特異性抗原結合分子、靶向OX40L的抗體、包含其的藥物組合物以及使用其治療的方法，例如，治療皮膚疾病或病況，例如特應性皮炎。

Description

雙特異性分子及使用其的治療方法

本發明關於靶向IL-13和OX40L的雙特異性抗原結合分子、靶向OX40L的抗體、包含其的藥物組合物，以及使用其治療的方法，例如，治療皮膚疾病或病況，諸如特應性皮炎。

特應性皮炎（Atopic dermatitis；AD）是一種慢性、復發緩解型、非接觸傳染、瘙癢性的炎症性全身性皮膚病。這是一種常見且日益流行的疾病，在發達國家，估計約有15%-30%的兒童和2-10%的成年人受到影響，其中估計有20%的人認為在生命的某個階段受到AD的影響。雖然AD可能發生在任何年齡，但它通常始於兒童時期，並且這種疾病在兒童中更為常見。儘管許多人的病況已經好轉，但該疾病在成年人中仍然很普遍，可能是始於兒童時期的一種持續性疾病，也可能是成人發病或復發性AD。AD通常與血清IgE水平升高有關，並且患者通常有諸如過敏性鼻炎、哮喘或食物過敏等過敏性體質的個人或家族史（Boguniewiczet al.(2017),J Allergy Clin Immunol Pract5(6):1519-1531）。AD與感染和發展出嚴重臨床病況（例如，冠狀動脈疾病、缺血性中風和其他心血管疾病）的風險增加有關。AD的症狀包括紅斑、水腫、乾燥、糜爛/抓痕、滲出和結痂以及地衣化，伴有的瘙癢（發癢）被認為是該病況的標誌（Kirchhofet al.(2018),J Cutan Med Surg.,22(IS) 6S-9S）。

AD的病理生理學被認為是複雜的，有證據表明遺傳、環境和免疫因素在其中發揮作用，並且2型炎症通路在其中也發揮了核心作用（Kirchhofet al.(2018)）。與主要由Th17驅動的銀屑病不同，AD具有多因素的病理生理學，並且因此，最佳療效可能需要靶向多條通路。

雙特異性抗體具有靶向多條通路的潛力，並且與目前正在開發的其他AD生物製劑相比，提供競爭優勢。

許多細胞因子和其他因素與AD有關，並且靶向各種分子的抗體目前正處於AD的臨床試驗或開發。

T輔助細胞2型（Th2）相關的細胞因子對先天性和適應性免疫系統具有多效性作用。IL-4和IL-13與腫瘤壞死因子α協同作用，在角質形成細胞中誘導胸腺基質淋巴細胞生成素（thymic stromal lymphopoietin，TSLP）的產生，並增強免疫系統持續的Th2偏斜。IL-4和IL-13下調幾種結構屏障蛋白（包括絲聚蛋白、外皮蛋白和兜甲蛋白）的mRNA表達和蛋白質合成，從而誘導皮膚屏障功能障礙和角質形成細胞介導的免疫活化的加重。由於AD的Th2驅動的炎症特徵，Th2-相關分子可能提供有吸引力的靶點，以減少炎症，並打破有害的回饋循環。

然而，AD的病理生理學是複雜的。儘管2型機制占主導地位，但越來越多的證據表明，該疾病涉及多條免疫通路。在AD患者中，OX40L陽性樹突狀細胞（DC）的數量大量增加，並且其配偶體OX40在浸潤淋巴細胞的炎症部位上調。阻斷OX40-OX40L通路已被證明在人類自身免疫性疾病（例如，AD、哮喘、腸易激症候群、移植排斥、自身免疫性糖尿病、GvHD、自身免疫性腦脊髓炎）的幾種動物模型中具有保護作用。雙重IL-13加OX-40L阻斷將阻斷IL-13引發的2型反應，並對不同的Th亞群具有廣泛的抑制作用。

許多藥物和治療方法可用於AD的管理。這些通常旨在減少皮膚炎症和發癢（瘙癢），恢復皮膚屏障功能，並提高與健康相關的生活品質（HRQoL）。可用的療法包括保濕和基本護理（例如，避免觸發）、植物療法、局部療法和全身療法。用於治療AD的藥物的實例包括止癢霜、抗組胺藥、外用類固醇（TCS）和鈣調磷酸酶抑制劑。近年來，已經開發出基於抗體的治療方法。

本領域已經報導了現有治療方法的各種缺點，包括安全性和毒性問題、治療抗性的發展（例如，對TCS或鈣調神經磷酸酶抑制劑的抗性），以及導致患者依從性差的患者耐受性和便利性。因此，需要開發新的AD治療方法。

除了AD之外，IL-13和OX40L也已被確定為是許多其他疾病和病況的重要因子，因此這些細胞因子的拮抗作用可能有助於治療這些疾病和病況。

涉及IL-13的疾病和病況的實例包括：皮膚病（例如，特應性皮炎、結節性癢疹（prurigo nodularis）、慢性手部濕疹、過敏性皮炎）、哮喘、過敏性鼻炎、COPD、癌症、炎症性腸病、纖維化、硬皮病和嗜酸性食道炎（參見，例如，May R and Fung M.Cytokine2015;75:89-116和Gandhi N.et al. Nat. Rev. Drug Discover. 2016;15:35-50）。

涉及OX40L的疾病和病況的實例包括：皮膚病（例如，特應性皮炎、結節性癢疹、慢性手部濕疹、過敏性皮炎）、胃腸道自身免疫性疾病（例如，潰瘍性結腸炎或克羅恩病）、過敏性腦炎（allergic encephalitis）、移植物抗宿主病、增殖性狼瘡腎炎、類風濕性關節炎、炎性肌肉疾病、炎性血管炎、哮喘和膠原誘導性關節炎（參見，例如，Murataet al. J Immunol 2002; 169:4628-4636和Hori, Internat. J. Hematol. 2006; 83:17-22)）。

本發明提供了一種雙特異性抗原結合分子，其包含第一抗原結合結構域（A），其為IL-13抗原結合結構域，和第二抗原結合結構域（B），其為OX40L抗原結合結構域，並且其中該雙特異性抗體結合分子特異性結合IL-13和OX40L二者，並且拮抗來自IL-13R的IL-13訊號傳導（signalling）和來自OX40的OX40L訊號傳導二者；並且其中：B是抗體或其抗原結合片段，其包含三個重鏈互補決定區序列（CDR: CDRH1、CDRH2和CDRH3）和三個輕鏈CDR（CDRL1、CDRL2、CDRL3），其為：a) CDRH1: SEQ ID NO: 86，CDRH2: SEQ ID NO: 87, CDRH3: SEQ ID NO: 88；和CDRL1: SEQ ID NO: 104，CDRL2: SEQ ID NO: 105，CDRL3: SEQ ID NO: 106；b) CDRH1: SEQ ID NO: 92，CDRH2: SEQ ID NO: 93，CDRH3: SEQ ID NO: 94；和CDRL1: SEQ ID NO: 110，CDRL2: SEQ ID NO: 111，CDRL3: SEQ ID NO: 112；或c) CDRH1: SEQ ID NO: 98，CDRH2: SEQ ID NO: 99，CDRH3: SEQ ID NO: 100；和CDRL1: SEQ ID NO: 116，CDRL2: SEQ ID NO: 117，CDRL3: SEQ ID NO: 118。

任選地，A是抗體或其抗原結合片段，其包含SEQ ID NO: 1、2和3的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和SEQ ID NO: 13、14和15的CDRL1、CDRL2和CDRL3。

本發明的雙特異性抗原結合分子可以較佳地為雙特異性抗體，最佳地為對稱IgG-樣形式（format）的雙特異性抗體。A和B的相對位置較佳地使得A靠近分子的Fc區，並且B遠離Fc區。較佳的形式是WO2015103072中描述的FIT-Ig形式。因此，本發明的雙特異性抗原結合分子可以由三條多肽鏈組成，每條多肽鏈的結構域排列如下所示（N-C端）：鏈1：VH_B-CH1；鏈2：VL_B-CL-VH_A-CH1-Fc；和鏈3：VL_A-CL；或者替代地如下所示：鏈1：VH_A-CH1；鏈2：VL_A-CL-VH_B-CH1-Fc；和鏈3：VL_B-CL；其中CH1＝重鏈恆定結構域1，較佳為人IgG1，CL＝輕鏈恆定結構域，Fc＝抗體的Fc區，較佳地為包含重鏈恆定結構域2和3（CH2和CH3）的人IgG1。

較佳的實施方案包括這樣的雙特異性抗體，其由以下組成：a) 鏈1：SEQ ID NO: 36；鏈2：SEQ ID NO: 37；和鏈3：SEQ ID NO: 38；b) 鏈1：SEQ ID NO: 39；鏈2：SEQ ID NO: 40；和鏈3：SEQ ID NO: 41；或c) 鏈1：SEQ ID NO: 42；鏈2：SEQ ID NO: 43；和鏈3：SEQ ID NO: 44；d) 鏈1：SEQ ID NO: 45；鏈2：SEQ ID NO: 46；和鏈3：SEQ ID NO: 47e) 鏈1：SEQ ID NO: 48；鏈2：SEQ ID NO: 49；和鏈3：SEQ ID NO: 50；或f) 鏈1：SEQ ID NO: 51；鏈2：SEQ ID NO: 52；和鏈3：SEQ ID NO: 53。

本發明還提供了一種OX40L特異性抗體或其抗原結合片段，其包含三個重鏈互補決定區序列（CDR: CDRH1、CDRH2和CDRH3）和三個輕鏈CDR（CDRL1、CDRL2、CDRL3），其為：a) CDRH1: SEQ ID NO: 86，CDRH2: SEQ ID NO: 87，CDRH3: SEQ ID NO: 88；和CDRL1: SEQ ID NO: 104，CDRL2: SEQ ID NO: 105，CDRL3: SEQ ID NO: 106；b) CDRH1: SEQ ID NO: 92，CDRH2: SEQ ID NO: 93，CDRH3: SEQ ID NO: 94；和CDRL1: SEQ ID NO: 110，CDRL2: SEQ ID NO: 111，CDRL3: SEQ ID NO: 112；或c) CDRH1: SEQ ID NO: 98，CDRH2: SEQ ID NO: 99，CDRH3: SEQ ID NO: 100；和CDRL1: SEQ ID NO: 116，CDRL2: SEQ ID NO: 117，CDRL3: SEQ ID NO: 118。

本發明還提供了一種藥物組合物，其包括本發明的雙特異性抗原結合分子，或本發明的OX40L特異性抗體或其抗原結合片段，以及一種或多種藥學上可接受的載體、稀釋劑、賦形劑和/或防腐劑。

本發明還提供了一種治療患者疾病或病況的方法，其中該疾病或病況與IL-13和/或OX40L相關或由IL-13和/或OX40L介導，並且其中該方法包括向患者給予本發明的雙特異性抗原結合分子，或本發明的OX40L特異性抗體或其抗原結合片段，或本發明的藥物組合物。

本發明還提供了用於治療患者的疾病或病況的方法中的本發明的雙特異性抗原結合分子，或本發明的OX40L特異性抗體或其抗原結合片段，或本發明的藥物組合物，其中所述疾病或病況與IL-13和/或OX40L相關或由IL-13和/或OX40L介導。

本發明還提供了本發明的雙特異性抗原結合分子，或本發明的OX40L特異性抗體或其抗原結合片段，或本發明藥物組合物在製備用於治療患者疾病或病況的方法中的藥物中的用途，其中該疾病或病況與IL-13和/或OX40L相關或由IL-13和/或OX40L介導。

應當理解，所公開的產物和方法的不同應用可以根據本領域的具體需要進行調整。還應當理解，本文所用的術語僅用於描述本發明的具體實施方案的目的，而不旨在進行限制。

此外，如本說明書和所附申請專利範圍中所使用的，單數形式“一個、一種”和“該”包括複數對象，除非上下文另有明確規定。因此，例如，術語“一種試劑”包括單一試劑，也包括多種試劑（包括試劑的混合物）。

如本文所用，術語“約”在與數值相關時是指，例如數值的±25%，較佳±15%，更佳±10%，還更佳±5%，最佳±2%或±1%。必要時，詞語“約”可從本發明的定義中省略。

術語“多肽”在本文中以其最廣泛的意義使用，是指兩個或更多個亞基胺基酸、胺基酸類似物或其它肽模擬物的化合物。因此，術語“多肽”包括短肽序列、較長的多肽和蛋白質。術語“胺基酸”可以指天然和/或非天然或合成的胺基酸，包括D或L光學異構體，以及胺基酸類似物和肽模擬物。

本文所指的術語“抗體”包括完整抗體及其任何抗原結合片段。雖然抗體可以呈現多種形式和特徵，但抗體通常是指包括通過二硫鍵相互連接的至少兩條重（H）鏈和兩條輕（L）鏈的糖蛋白，或其抗原結合片段。每條重鏈由重鏈可變區（本文縮寫為HCVR或VH）和重鏈恆定區組成。每條輕鏈由輕鏈可變區（本文縮寫為LCVR或VL）和輕鏈恆定區組成。重鏈和輕鏈的可變區含有與抗原相互作用的結合結構域。VH和VL區可進一步細分為高變區，稱為互補決定區（CDR），其與更保守的區域交錯分佈，後者稱為框架區（FR）。

抗體可包括或由具有全長重鏈和輕鏈的完整抗體分子或其抗原結合片段組成。術語抗體的“抗原結合片段”或類似表述包括保留特異性結合抗原的能力的抗體部分。已經證明抗體的抗原結合功能可以通過全長抗體的片段來執行。抗體及其抗原結合片段可以是但不限於Fab、修飾的Fab、Fab’、修飾的Fab’、F(ab’)₂、Fv、單鏈抗體（例如VH或VL或VHH）、scFv、二價、三價或四價抗體、Bis-scFv、雙體、三體、四體和上述任何一種的表位結合片段（參見例如Holliger和Hudson, 2005,Nature Biotech.23(9):1126-1136; Adair和Lawson, 2005,Drug Design Reviews-Online2(3), 209-217）。用於創建和製備這些抗體片段的方法是本領域公知的（參見例如Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181），並且可以以與完整抗體相同的方式篩選片段的用途。用於本發明的其它抗體片段包括WO2005/003169、WO2005/003170和WO2005/003171記載的Fab和Fab’片段，以及WO2009/040562記載的Fab-dAb片段。多價抗體可以包括多特異性或可以是單特異性的（參見例如WO 92/22853和WO 05/113605，WO 2007/024715公開的DVD-Ig，或WO2011/030107記載的所謂的(FabFv)₂Fc）。備選的多特異性抗原結合片段包括與兩個scFv或dsscFv連接的Fab，每個scFv或dsscFv結合相同或不同的靶標（例如一個scFv或dsscFv結合治療靶標，一個scFv或dsscFv通過結合例如白蛋白而延長半衰期）。WO2015/197772中記載了此類抗體片段，其全文且特別是關於抗體片段的討論通過引用納入本文。這些抗體片段可以使用本領域技術人員已知的常規技術獲得，並且可以以與完整抗體相同的方式篩選片段的用途。

術語抗體包括單株抗體、多株抗體、單特異性抗體和多特異性（例如雙特異性）抗體，以及它們的抗原結合片段。多特異性抗體——通常在單獨的抗原上——能夠結合至少兩個靶表位。在本發明的雙特異性抗原結合分子的情況下，所述雙特異性抗原結合分子能夠結合兩種單獨的抗原（IL-13和OX40L）。雙特異性分子的較佳形式是雙特異性抗體，特別較佳對稱IgG樣形式。實例包括雙可變結構域(DVD)-Ig、2+2 CrossMab和串聯Fab片段(Fab-in-Tandem，FIT)-Ig分子。

術語抗體涵蓋任何類別的抗體（例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY抗體）或任何亞類的抗體（例如IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3或IgG4）。抗體可以是例如嵌合抗體、CDR-移植抗體、奈米抗體、人或人源化抗體、或任何前述抗體的抗原結合片段。抗體通常是人抗體或人抗體衍生物。術語“人抗體衍生物”或類似表述指人抗體的任何修飾形式，例如抗體和另一種試劑（例如藥物）或抗體的綴合物。完全人抗體是重鏈和輕鏈兩者的可變區和恆定區（如果存在）均是人源的，或與人源序列基本相同，但不一定來自同一抗體的那些抗體。

術語“疾病”、“病症”和“病況”可以在此互換使用，除非上下文另有明確規定。

本文引用的所有出版物、專利和專利申請，無論是上文還是下文，均全文通過引用納入本文。

IL-13和OX40L

術語“靶向”和“針對”等在本文中可以互換使用。本發明提供的雙特異性抗原結合分子靶向（i）IL-13和（ii）OX40L。所述分子可用於本發明的方法中，例如用於治療皮膚疾病或病況，如AD。本發明的分子的總類別在本文中可稱為“抗IL-13和OX40L雙特異性抗原結合分子”。

靶向IL-13的雙特異性抗原結合分子可以特異性結合IL-13，靶向OX40L的雙特異性抗原結合分子可以特異性結合OX40L。特異性結合通常意指該分子不表現出與預期靶標以外的任何物質的顯著結合。如果是與另一種通常在不同器官中表達的靶標結合，或由不同的細胞類型結合至表達IL-13或OX40L的那些，則一些脫靶結合也是可接受的。

通過結合至IL-13/IL-13R和OX40L/OX40相互作用的每一者的配偶體，雙特異性抗原結合分子拮抗IL-13和OX40L。因此，本發明的雙特異性抗原結合分子是IL-13拮抗劑以及OX40L拮抗劑。術語“拮抗劑”或類似表述包括意指抑制或減弱配體分子（例如IL-13或OX40L）的一種或多種生物活性（例如由配體分子在與其受體結合時介導的細胞內訊號傳導）的物質（例如本發明的雙特異性抗原結合分子）。拮抗劑可以（通過結合靶標或受體）抑制或減弱配體與其受體的結合或相互作用，但也可以例如抑制受體的二聚化而不影響配體與受體的結合。在一些實施方案中，配體與其受體之間的結合被完全或基本阻斷。拮抗劑可以例如是中和抗體。

在一些實施方案中，拮抗劑可抑制受體的二聚化或多聚化，而不抑制或減弱配體與一種或多種受體的結合或相互作用。例如，在IL-13拮抗作用的情況下，抗原結合分子可通過抑制IL4 Ra/IL13Ra1二聚化來抑制IL-13訊號傳導，而不抑制IL-13與IL13Ra1或IL13Ra2的結合。在一些實施方案中，受體的二聚化可被完全或基本抑制。作為另一個實例，在OX40L拮抗作用的情況下，抗原結合分子可以通過抑制OX40多聚化來抑制OX40L訊號傳導，而不抑制OX40L與OX40的結合。在一些實施方案中，受體的多聚化可被完全或基本抑制。

本文所用的表述“IL-13”（白介素-13）包括任何天然哺乳動物IL-13序列（例如人、非人靈長類動物（例如猴）或小鼠），較佳人IL-13。該術語涵蓋全長、未加工的IL-13以及由細胞加工產生的任何形式的IL-13。該術語涵蓋野生型蛋白質、天然存在的變體，例如剪接變體或等位基因變體，以及任何其它同種型和突變形式，以及前述任一者的修飾和未修飾形式。提及的IL-13包括例如可以重組或通過合成方法產生的蛋白質，其具有與天然存在的或內源性哺乳動物IL-13相同的胺基酸序列。當相應的哺乳動物是人時，所述蛋白質可稱為hIL-13。來自不同物種的IL-13的核苷酸和胺基酸序列已經被確定，並可容易地從公共序列資料庫獲得。術語hIL-13涵蓋由UniProtKB登錄號P35225可得的或如在WO 2022/079036中公開的（含有和不含有訊號肽的）示例性hIL-13序列，以及其生物活性片段和其它可能由其細胞加工產生的hIL-13序列。在某些情況下，IL-13序列可以包括訊號肽，其可以任選地是外源的，即非天然的訊號肽。在其它情況下，IL-13蛋白是不含訊號肽的成熟蛋白。

本文所用的表述“IL-13R”（白介素-13受體）通常指“共有的”IL-4/IL-13受體，其由IL-4Rα鏈亞基和IL-13Rα1鏈亞基形成的複合物組成，但也可包括“私有的”IL-13受體，後者由單個IL-13Rα2鏈亞基組成。IL-4Rα和IL-13Rα1的異源二聚化形成IL-13R是由IL-13結合來誘導的，並促進Janus激酶（JAK）/訊號傳導及轉錄活化因子（STAT）通路的活化，導致STAT6磷酸化。磷酸化的STAT6作為轉錄因子活化許多基因。IL-13還可以非常高的親和力與單鏈IL-13Rα2結合，所述單鏈IL-13Rα2被認為是IL-13的負調節因子。

IL-13R通常是哺乳動物的（例如人、非人靈長類動物（例如猴）或小鼠），較佳人。該術語涵蓋全長、未加工的亞基以及由細胞加工產生的任何形式的亞基。該術語涵蓋野生型蛋白質、天然存在的變體，例如剪接變體或等位基因變體，以及任何其它同種型和突變形式，以及前述任一者的修飾和未修飾形式。IL-13R包括例如可以重組或通過合成方法產生的蛋白質，其具有與天然存在的或內源性哺乳動物IL-13R亞基相同的胺基酸序列。當相應的哺乳動物是人時，所述蛋白質可稱為hIL-13R。來自不同物種的IL-13R亞基的核苷酸和胺基酸序列已經被確定，並可容易地從公共序列資料庫獲得。示例性hIL-13R序列同樣在WO 2022/079036中公開。術語hIL-13R涵蓋蛋白質，所述蛋白質包括或由這些序列以及其生物活性片段和其它可能由其細胞加工產生的序列組成。在某些情況下，上述序列可以包括訊號肽，其可以任選地是外源的，即非天然的訊號肽。在其它情況下，IL-13R蛋白是不含訊號肽的成熟蛋白。

存在能夠拮抗IL-13訊號傳導的不同結合模式。例如，來瑞組單抗（lebrikizumab）通過以極高親和力結合IL-13並抑制IL-13與IL-4Rα二聚化來抑制IL-13訊號傳導（Ultsch et al.，J Mol Biol. 2013），而曲羅蘆單抗（tralokinumab）可阻止IL-13與IL-13Rα1和IL-13Rα2結合（Popovic et al.，J Mol Biol. 2017）。在這兩種情況下，STAT6的磷酸化和隨後的基因表達結果都被阻止。

測定IL-13拮抗作用的測定法是已知的，並且可以使用任何合適的測定法，例如實施例中所述的方法。合適的測定法包括使用已設計用於評估IL-13誘導的STAT6通路活化的細胞系。合適的細胞系可以在STAT6應答性啟動子的控制下表達報告基因。例如，可以修飾細胞，使其在與4個STAT6結合位點融合的IFN-β最小啟動子的控制下表達分泌型胚胎鹼性磷酸酶（SEAP）。在這些細胞中，STAT6通路的活化誘導報告基因的表達（例如SEAP）。報告分子的表達可以使用任何已知的方法檢測。例如，使用SEAP檢測試劑（如QUANTI-Blue檢測溶液（QUANTI-Blue Solution））可以很容易地評估分泌到上清液中的SEAP。試驗中使用的細胞系必須具有完全活性的STAT6訊號傳導通路。因此，當細胞系是HEK（例如，HEK293），人STAT6基因必須被穩定轉染。在一個實施方案中，用於IL-13拮抗測試的HEK細胞是HEK-Blue IL-4/IL-13報告細胞（InvivoGen）。

或者，在人原代角質形成細胞（兩個供體）中IL-13誘導的STAT6磷酸化測定可用於測定IL-L3拮抗作用。例如，原代角質形成細胞（例如NHEK，成人皮膚，Lonza）可在補充有牛垂體提取物（25 μg/ml）和重組表皮生長因子（EGF）（0.25 ng/ml）的角質形成細胞無血清培養基（SFM）中培養。角質形成細胞在刺激前被除去生長因子，然後用人重組IL-13的系列稀釋液刺激。在10-60次刺激後，測定pSTAT6的細胞內水平，例如，使用AlphaLISA SureFire Ultra p-STAT6（Tyr641）分析試劑盒（ALSU-PST6-A500，PerkinElmer）。

本文所用的表述“OX40L”（OX40配體，腫瘤壞死因子配體超家族成員4）包括任何天然哺乳動物OX40L序列（例如人、非人靈長類動物（例如猴）或小鼠），較佳人OX40L。該術語涵蓋全長、未加工的OX40L以及由細胞加工產生的任何形式的OX40L。該術語涵蓋野生型蛋白質、天然存在的變體，例如剪接變體或等位基因變體，以及任何其它同種型和突變形式，以及前述任一者的修飾和未修飾形式。OX40L包括例如可以重組或通過合成方法產生的蛋白質，其具有與天然存在的或內源性哺乳動物OX40L相同的胺基酸序列。當相應的哺乳動物是人時，所述蛋白質可稱為hOX40L。來自不同物種的OX40L的核苷酸和胺基酸序列已經被確定，並可容易地從公共序列資料庫獲得。術語hOX40L涵蓋WO 2022/079036中的或由UniProtKB登錄號P23510可得的OX40L的全長、未加工的183個胺基酸序列，以及其生物活性片段和其他可能由其細胞加工產生的hOX40L序列，例如通過蛋白酶或可變剪接（例如全長hOX40L蛋白的殘基51-183）。示例性hOX40L序列包括所述全長序列的殘基51-183，並同樣在WO 2022/079036中公開。

本文所用的表述“OX40”（OX40，腫瘤壞死因子受體超家族成員4）包括任何天然哺乳動物OX40序列（例如人、非人靈長類動物（例如猴）或小鼠），較佳人OX40。該術語涵蓋全長、未加工的OX40以及由細胞加工產生的任何形式的OX40。該術語涵蓋野生型蛋白質、天然存在的變體，例如剪接變體或等位基因變體，以及任何其它同種型和突變形式，以及前述任一者的修飾和未修飾形式。OX40包括例如可以重組或通過合成方法產生的蛋白質，其具有與天然存在的或內源性哺乳動物OX40相同的胺基酸序列。

當相應的哺乳動物是人時，所述蛋白質可稱為hOX40。來自不同物種的OX40L的核苷酸和胺基酸序列已經被確定，並可容易地從公共序列資料庫獲得。術語hOX40涵蓋蛋白質，其包括由UniProtKB登錄號P43489可得的或如WO 2022/079036中的SEQ ID NO.8中所示的示例性OX40序列，以及其生物活性片段和其它可能由其細胞加工產生的序列，或由上述序列組成。在某些情況下，上述序列可以包括訊號肽，其可以任選地是外源的，即非天然的訊號肽。在其它情況下，OX40蛋白是不含訊號肽的成熟蛋白。

OX40L是排布成功能性同源三聚體的腫瘤壞死因子超家族成員。OX40的三個拷貝與三聚體配體結合形成OX40-OX40L複合物。受體聚集是訊號傳導通路完全活化所必需的。與OX40和OX40L均結合的抗體已被描述為能夠拮抗由OX40L-OX40複合物形成誘導的細胞內訊號傳導（Compaan et al.，Structure 2006; Croft et al.，Immunol Rev. 2009; Webb et al.，Review. Clinic Rev Allerg Immunol. 2016; Guttman-Yassky et al.，J Allergy Clin Immunol）。

測定OX40L拮抗作用的測定法是已知的，並且可以使用任何合適的測定法，例如實施例中所述的方法。合適的測定法包括設計用於通過監測NF-κB和AP-1通路的活化來檢測生物活性OX40L的那些測定法。例如，所述測定法可以使用在NF-κB/AP-1應答性啟動子控制下表達報告基因的細胞系。根據這些測定法，人OX40L與這些細胞表面上的同源三聚體OX40受體的結合觸發了訊號級聯，導致NF-κB活化和隨後報告基因的產生。

或者，在用次優濃度的抗CD3（已引發）處理的CD3陽性T細胞或PBMC（來自兩個供體）中的OX40L誘導的IL2和IFNγ表達可用於測定OX40L-OX40拮抗作用。例如，PBMC可以通過密度梯度離心從來自供體的新鮮人全血中純化。然後將分離的PBMC在補充有10% FBS、2 mM L-麩醯胺酸、100 U/mL青黴素和100 μg mL鏈黴素的RPMI 1640中鋪板，然後將細胞與次優濃度的抗CD3和人重組OX40L的系列稀釋液一起培育。將細胞培育過夜，然後可以根據製造商的說明書通過ELISA（R&D Systems，#D2050和#DY285）測量培養物上清液中的IL2和IFNγ水平。

或者，表達OX40L的細胞中的OX40L反向訊號傳導（back-signalling）可用於測定OX40L-OX40拮抗作用。例如，THP-1細胞系的細胞可由LPS引發，並在OX40（ECD）和/或基準和鑒定的抗體存在下培育。IL-6水平可以根據製造商的說明書通過ELISA（R&D Systems，#D6050）測量。OX40L的內化也可以通過FACS在相同條件下使用生物素綴合的人OX40蛋白的系列稀釋液來測量或使用生物素綴合的抗OX40L抗體並使用例如鏈黴親和素-別藻藍蛋白染色來測量。

前面段落或本文其它地方所述的所有資料庫條目的內容通過引用全文納入本文。

本文使用的術語IL-13、IL-13R、OX40L和OX40通常分別指hIL-13、hIL13R、hOX40L和hOX40。因此，除非上下文清楚地另外指明，本文提及的IL-13、IL-13R、OX40L和OX40應理解為是指其人形式。

抗OX40L抗體

本發明提供一種OX40L特異性抗體或其抗原結合片段，其包括三個重鏈互補決定區序列（CDR：CDRH1、CDRH2和CDRH3）和三個輕鏈CDR（CDRL1、CDRL2、CDRL3），分別為：a）CDRH1：SEQ ID NO：4、CDRH2：SEQ ID NO：5、CDRH3：SEQ ID NO：6；以及CDRL1：SEQ ID NO：16、CDRL2：SEQ ID NO：17、CDRL3：SEQ ID NO：18；b）CDRH1：SEQ ID NO：7、CDRH2：SEQ ID NO：8、CDRH3：SEQ ID NO：9；以及CDRL1：SEQ ID NO：19、CDRL2：SEQ ID NO：20、CDRL3：SEQ ID NO：21；或c）CDRH1：SEQ ID NO：10、CDRH2：SEQ ID NO：11、CDRH3：SEQ ID NO：12；以及CDRL1：SEQ ID NO：22、 CDRL2：SEQ ID NO：23、CDRL3：SEQ ID NO：24。

以上每種CDR均根據Chothia系統定義。

相同的三種OX40L特異性抗體或其抗原結合片段也可以替代地由根據Kabat系統定義的CDR來描述：a） CDRH1：SEQ ID NO：83、CDRH2：SEQ ID NO：84、CDRH3：SEQ ID NO：85；以及CDRL1：SEQ ID NO：101、CDRL2：SEQ ID NO：102、CDRL3：SEQ ID NO：103；b） CDRH1：SEQ ID NO：89、CDRH2：SEQ ID NO：90、CDRH3：SEQ ID NO：91；以及CDRL1：SEQ ID NO：107、CDRL2：SEQ ID NO：108、CDRL3：SEQ ID NO：109；或c） CDRH1：SEQ ID NO：95、CDRH2：SEQ ID NO：96、CDRH3：SEQ ID NO：97；以及CDRL1：SEQ ID NO：113、CDRL2：SEQ ID NO：114、CDRL3：SEQ ID NO：115。

相同的三種OX40L特異性抗體或其抗原結合片段也可以替代地由根據IMGT系統定義的CDR來描述：a） CDRH1：SEQ ID NO：86、CDRH2：SEQ ID NO：87、CDRH3：SEQ ID NO：88；以及CDRL1：SEQ ID NO：104、CDRL2：SEQ ID NO：105、CDRL3：SEQ ID NO：106；b） CDRH1：SEQ ID NO：92、CDRH2：SEQ ID NO：93、CDRH3：SEQ ID NO：94；以及CDRL1：SEQ ID NO：110、CDRL2：SEQ ID NO：111、CDRL3：SEQ ID NO：112；或c） CDRH1：SEQ ID NO：98、CDRH2：SEQ ID NO：99、CDRH3：SEQ ID NO：100；以及CDRL1：SEQ ID NO：116、CDRL2：SEQ ID NO：117、CDRL3：SEQ ID NO：118。不同的CDR系統可以互換使用，但IMGT系統通常是較佳的。

OX40L特異性抗體可以是單特異性的。另外，OX40L特異性抗體的結合及其他特性可以如在本文中與本發明的雙特異性分子關聯時所述，並在適當的時候限於該雙特異性分子的OX40L結合部分。

本發明的OX40L特異性抗體或其抗原結合片段可以包括重鏈可變區片段（VH_B）和輕鏈可變區片段（VL_B），其中：a） VH_B是包括或由SEQ ID NO：27或與之具有至少80%、90%、95%或99%胺基酸一致性的序列組成的多肽；且VL_B是包括或由SEQ ID NO：28或與之具有至少80%、90%、95%或99%胺基酸一致性的序列組成的多肽；b） VH_B是包括或由SEQ ID NO：29或與之具有至少80%、90%、95%或99%胺基酸一致性的序列組成的多肽；且VL_B是包括或由SEQ ID NO：30或與之具有至少80%、90%、95%或99%胺基酸一致性的序列組成的多肽；或c） VH_B是包括或由SEQ ID NO：31或與之具有至少80%、90%、95%或99%胺基酸一致性的序列組成的多肽；且VL_B是包括或由SEQ ID NO：32或與之具有至少80%、90%、95%或99%胺基酸一致性的序列組成的多肽；任選地，其中在（任選地根據IMGT、Kabat或Chothia系統中任一種（較佳IMGT系統）所定義的）所述VH_B和VL_B序列的CDR序列中不允許存在胺基酸一致性的變化。也就是說，只允許在框架區域內存在變化。

本發明的OX40L特異性抗體特異性結合OX40L。如本文所用，術語“特異性結合”及其類似表述可指存在以K_D值≤250 nM、≤100 nM、≤50 nM、≤25 nM、≤10 nM、≤5 nM、≤2.5 nM、≤2 nM、≤1 nM、≤0.5 nM、≤0.4 nM、≤0.25 nM、≤0.1 nM、≤0.05 nM、≤0.01 nM、≤0.005 nM或≤0.001 nM為特徵的結合親和力。

因此，本發明的OX40L特異性抗體可特異性結合OX40L，其K_D值≤250 nM、≤100 nM、≤50 nM、≤25 nM、≤10 nM、≤5 nM、≤2.5 nM、≤2 nM、≤1 nM、≤0.5 nM、≤0.4 nM、≤0.25 nM、≤0.1 nM、≤0.05 nM、≤0.01 nM、≤0.005 nM或≤0.001 nM。

在本領域中存在用於確定解離常數K_D值的各種方法，例如表面電漿共振（SPR）。在本發明的上下文中，K_D值較佳地於25℃和/或37℃下使用表面電漿共振（例如用Biacore™系統）測定。

本發明的OX40L特異性抗體或其抗原結合片段可以是嵌合的、人源化的或者是人的，或是抗體。OX40L特異性抗體或其抗原結合片段可包括IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恆定區，任選地人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恆定區。OX40L特異性抗體或其抗原結合片段可包括人IgG1 Fc（可結晶片段）區序列，所述序列包括減少Fc受體結合的人野生型序列的修飾（任選地L234A/L235A（LALA）修飾）和/或增加血清半衰期的人野生型序列的修飾（任選地M252Y/S254T/T256E（YTE）修飾）。

本文還公開了一種參比抗OX40L抗體。該參比抗OX40L抗體的序列在實施例中描述。

抗IL-13抗體

IL-13特異性結合結構域的較佳實例是其特異性針對IL-13的抗體或抗原結合片段，其包括SEQ ID NO：1、2和3的CDRH1、CDRH2和CDRH3；以及SEQ ID NO：13、14和15的CDRH1、CDRH2和CDRH3。

所述抗體或其抗原結合片段可以包括重鏈可變區序列（VH_A）和輕鏈可變區序列（VL_A），其中VH_A是包括或由SEQ ID NO：25或與之具有至少80%、90%、95%或99%胺基酸一致性的序列組成的多肽；且VL_A是包括或由SEQ ID NO：26或與之具有至少80%、90%、95%或99%胺基酸一致性的序列組成的多肽；任選地，其中在（任選地根據IMGT、Kabat或Chothia系統中任一種（較佳Kabat系統）定義的）所述VH_A和VL_A序列的CDR序列中不允許存在胺基酸一致性的變化。也就是說，只允許在框架區域內存在變化。

所述抗體可以是來瑞組單抗。

本文還公開了一種參比抗IL-13抗體。該參比抗IL-13抗體的序列在實施例中描述。

雙特異性抗原結合分子

如本文所用，術語“雙特異性抗原結合分子”涵蓋任何下述抗原結合構建體，即，其具有結合兩種不同的抗原/靶標（在本發明中為IL-13和OX40L）並較佳地中和這二者的生物學功能的能力。雙特異性抗原結合分子可以採取多種形式，並且可以例如是蛋白質、多肽或分子複合物。雙特異性抗原結合分子可以是例如單個多功能多肽，或者它可以是兩個或更多個共價或非共價結合多肽的多聚體複合物。在示例性實施方案中，雙特異性抗原結合分子是雙特異性抗體。

相比於（例如，當作為組合物施藥時）分別針對兩個靶標之一的單特異性藥物（“單體藥物（monad）”），和/或相比於具有IL-13結合結構域和OX40L結合結構域的其他雙特異性抗原結合分子，本發明的雙特異性結合分子較佳地在至少一個特性上表現優越。本文公開了FIT-Ig形式的該類型的示例性分子，並且可以將其稱為BsAb007或作為原型。

在用於治療與IL-13和/或OX40L相關或由IL-13和/或OX40L介導的疾病或病況（例如AD）中，相比於使用分別針對兩種靶標之一的單特異性藥物的組合的治療方案和/或相比於使用具有IL-13結合結構域和OX40L結合結構域的其他雙特異性抗原結合分子的治療方案，本發明的雙特異性結合分子可以有利地表現出更高的效力和/或功效和/或適用性。本發明的雙特異性結合分子可以有利地比這些對照物表現出更高的穩定性或更低的免疫原性。本發明的雙特異性抗原結合分子的特徵可以包括優於單體藥物或其他雙特異性抗原結合分子的功效，和/或其可以提供與單體藥物或其他雙特異性抗原結合分子相當或更好的PK值（這允許減少給藥頻率）和/或與單體藥物或其他雙特異性抗原結合分子相當或更好的安全特性。本發明的雙特異性抗體可能更適合臨床使用，例如，因為注射單一藥物比提供兩種單體藥物的兩次分別注射更方便且痛苦更少（這可能導致患者依從性增加），或者因為將兩種單體藥物配製為單一注射劑更具挑戰性（在可接受的粘度/穩定性方面）或更昂貴。在實施例中證明了本發明的示例性雙特異性抗原結合分子的特性。

本發明的雙特異性抗原結合分子包括特異性結合IL-13和OX40L的抗IL13/OX40L結合分子。如本文所用，術語“特異性結合”及其類似表述可指存在以K_D值≤250 nM、≤100 nM、≤50 nM、≤25 nM、≤10 nM、≤5 nM、≤2.5 nM、≤2 nM、≤1 nM、≤0.5 nM、≤0.4 nM、≤0.25 nM、≤0.1 nM、≤0.05 nM、≤0.01 nM、≤0.005 nM或≤0.001 nM為特徵的結合親和力。

因此，本發明的抗IL-13/OX40L雙特異性抗原結合分子可特異性結合IL-13，其K_D值≤250 nM、≤100 nM、≤50 nM、≤25 nM、≤10 nM、≤5 nM、≤2.5 nM、≤2 nM、≤1 nM、≤0.5 nM、≤0.4 nM、≤0.25 nM、≤0.1 nM、≤0.05 nM、≤0.01 nM、≤0.005 nM或≤0.001 nM，和/或可特異性結合OX40L，其K_D值≤250 nM、≤100 nM、≤50 nM、≤25 nM、≤10 nM、≤5 nM、≤2.5 nM、≤2 nM、≤1 nM、≤0.5 nM、≤0.4 nM、≤0.25 nM、≤0.1 nM、≤0.05 nM、≤0.01 nM、≤0.005 nM或≤0.001 nM。

在本領域中存在用於確定解離常數K_D值的各種方法，例如表面電漿共振（SPR）。在本發明的上下文中，K_D值較佳地於25℃和/或37℃下使用表面電漿共振（例如具有Biacore™系統）測定。測定解離常數K_D值的另一種較佳方法是KinExA（動力學排除試驗）技術。

本發明的抗IL-13/OX40L雙特異性抗原結合分子較佳結合IL-13，其親和力至少為在相同測定中所測得的來瑞組單抗對IL-13親和力的0.1倍；和/或較佳結合OX40L，其親和力至少為在相同測定中所測得的抗體amlitelimab對OX40L親和力的0.1倍。本發明的抗IL-13/OX40L雙特異性抗原結合分子更佳結合IL-13，其親和力至少為在相同測定中所測得的來瑞組單抗對IL-13親和力的0.5倍；和/或較佳結合OX40L，其親和力至少為在相同測定中所測得的抗體amlitelimab對OX40L親和力的0.5倍。

本發明的抗IL-13/OX40L雙特異性抗原結合分子較佳以——與在相同測定中所測得的包括相同的抗IL-13可變區的單特異性抗體對IL-13的親和力相比——增加、不減少或不顯著減少的親和力結合IL-13；和/或較佳以——與在相同測定中所測得的包括相同的抗OX40L可變區的單特異性抗體對OX40L的親和力相比——增加、不減少或不顯著減少的親和力結合OX40L。

如本文所述，本發明的雙特異性抗原結合分子包括第一抗原結合結構域（A）和第二抗原結合結構域（B），其中A是IL-13抗原結合結構域，B是OX40L抗原結合結構域，其中雙特異性抗原結合分子特異性結合IL-13和OX40L二者，並拮抗來自IL-13R的IL-13訊號傳導和來自OX40的OX40L訊號傳導二者。在一些實施方案中，B是抗體或其抗原結合片段，其包括三個重鏈互補決定區序列（CDR：CDRH1、CDRH2和CDRH3）和三個輕鏈CDR（CDRL1、CDRL2、CDRL3），分別為：CDRH1：SEQ ID NO：86、CDRH2：SEQ ID NO：87、CDRH3：SEQ ID NO：88；以及CDRL1：SEQ ID NO：104、CDRL2：SEQ ID NO：105、CDRL3：SEQ ID NO：106。

在一些實施方案中，B是抗體或其抗原結合片段，其包括三個重鏈互補決定區序列（CDR：CDRH1、CDRH2和CDRH3）和三個輕鏈CDR（CDRL1、CDRL2、CDRL3），分別為：CDRH1：SEQ ID NO：92、CDRH2：SEQ ID NO：93、CDRH3：SEQ ID NO：94；以及CDRL1：SEQ ID NO：110、CDRL2：SEQ ID NO：111、CDRL3：SEQ ID NO：112。

在一些實施方案中，B是抗體或抗原結合片段，其包括三個重鏈互補決定區序列（CDR：CDRH1、CDRH2和CDRH3）和三個輕鏈CDR（CDRL1、CDRL2、CDRL3），分別為：CDRH1：SEQ ID NO：98、CDRH2：SEQ ID NO：99、CDRH3：SEQ ID NO：100；以及CDRL1：SEQ ID NO：116、CDRL2：SEQ ID NO：117、CDRL3：SEQ ID NO：118。

在一些實施方案中，A是抗體或其抗原結合片段，其包括SEQ ID NO：1、2和3的CDRH1、CDRH2和CDRH3；以及SEQ ID NO：13、14和15的CDRL1、CDRL2、CDRL3。

在一些實施方案中，B包括重鏈可變區序列（VHB）和輕鏈可變區序列（VLB），其中：VHB是包括或由SEQ ID NO：27或與之具有至少80%、90%、95%或99%胺基酸一致性的序列組成的多肽；且VLB是包括或由SEQ ID NO：28或與之具有至少80%、90%、95%或99%胺基酸一致性的序列組成的多肽。

在一些實施方案中，B包括重鏈可變區序列（VHB）和輕鏈可變區序列（VLB），其中：VHB是包括或由SEQ ID NO：29或與之具有至少80%、90%、95%或99%胺基酸一致性的序列組成的多肽；且VLB是包括或由SEQ ID NO：30或與之具有至少80%、90%、95%或99%胺基酸一致性的序列組成的多肽。

在一些實施方案中，B包括重鏈可變區序列（VHB）和輕鏈可變區序列（VLB），其中：VHB是包括或由SEQ ID NO：31或與之具有至少80%、90%、95%或99%胺基酸一致性的序列組成的多肽；且VLB是包括或由SEQ ID NO：32或與之具有至少80%、90%、95%或99%胺基酸一致性的序列組成的多肽。

在本發明的雙特異性結合分子的一些實施方案中，A包括重鏈可變區序列（VHA）和輕鏈可變區序列（VLA），其中：VHA是包括或由SEQ ID NO：25或與之具有至少80%、90%、95%或99%胺基酸一致性的序列組成的多肽；且VLA是包括或由SEQ ID NO：26或與之具有至少80%、90%、95%或99%胺基酸一致性的序列組成的多肽。

在本發明的雙特異性結合分子的一些實施方案中，A和/或B包括或由抗體或其抗原結合片段組成，且所述抗體較佳為嵌合的、人源化的或人或抗體。

在一些實施方案中，雙特異性抗原結合分子是雙特異性抗體，例如二價、三價或四價雙特異性抗體。在一些實施方案中，雙特異性抗原結合分子是對稱IgG樣分子，例如DVD-Ig形式、2+2 CrossMab形式或FIT-Ig形式的雙特異性抗體。特別較佳FIT-Ig形式。所述形式記載於WO2015103072。

在一些實施方案中，雙特異性抗原結合分子是包括抗體可變結構域和T細胞受體（TCR）恆定區的多肽複合物，其中所述TCR恆定區能夠形成包括至少一個非天然鏈間鍵的二聚體（WO2019057122中記載了這種類型的複合物，並且在本文中可以稱為WuXibody）。

抗原結合結構域和其他組成部分

本發明的雙特異性抗原結合分子包括包含第一抗原結合結構域（A）和第二抗原結合結構域（B）的雙特異性抗原結合分子，其中A是IL-13抗原結合結構域，其中B是OX40L抗原結合結構域；此類雙特異性抗原結合分子在本文中通常稱為“抗IL-13和OX40L雙特異性抗原結合分子”。換言之，雙特異性抗原結合分子是這樣的分子：其中A特異性結合IL-13，並且B特異性結合OX40L。

本發明的抗IL-13和OX40L雙特異性抗原結合分子可以包括一個或多個其他的IL-13結合結構域。因此，設想了這樣的實施方案：其中存在例如兩個或三個IL-13結合結構域。在存在多於一個IL-13結合結構域的實施方案中，兩個或更多個IL-13結合結構域可以彼此相同、基本相同或不同。

本發明的抗IL-13和OX40L雙特異性抗原結合分子可以包括一個或多個其他的OX40L結合結構域。因此，設想了這樣的實施方案：其中存在例如兩個或三個OX40L結合結構域，或例如兩個或三個OX40結合結構域。在存在多於一個OX40L結合結構域的實施方案中，兩個或更多個OX40L結合結構域可以彼此相同、基本相同或不同。

術語“抗原結合結構域”和“結合結構域”及其類似表述在本文中可互換使用。抗原結合結構域通常能夠特異性結合感興趣的特定抗原（例如IL-13、OX40L），例如以≤250 nM、≤100 nM、≤50 nM、≤25 nM、≤10 nM、≤5 nM、≤2.5 nM、≤2 nM、≤1 nM、≤0.5 nM、≤0.4 nM、≤0.25 nM、≤0.1 nM、≤0.05 nM、≤0.01 nM、≤0.005 nM或≤0.001 nM的K_D值特異性結合。

可用於本發明的抗原結合結構域的實例包括基於免疫球蛋白的抗原結合結構域和非基於免疫球蛋白的抗原結合結構域。因此，抗原結合結構域的實例包括源自免疫球蛋白或抗體的或者源自除免疫球蛋白或抗體以外的來源（例如，源自具有免疫球蛋白樣結合特性的蛋白質結合分子）的結合結構域。如本文所用，術語“源自”及其類似表述包括意指，可以從特定來源——無論是直接還是間接地——獲得給定實體（例如抗原結合結構域、抗體），並且任選地具有一個或多個修飾，例如具有一個或多個突變。

抗原結合結構域（例如IL-13抗原結合結構域或OX40L抗原結合結構域）可以例如包括或由抗體或其抗原結合片段（例如Fab、scFab、Fv和scFv）組成。可用於實施本發明的抗原結合片段的非限制性實例包括Fab片段、F(ab’)₂片段、Fab’片段、Fd片段、Fv片段、dAb片段、分離的互補決定區（CDR）、單鏈抗體如scFv，以及重鏈抗體如VHH和駱駝抗體，以及本文其它地方公開的其它抗原結合片段。通常抗體的抗原結合片段包括一個或多個CDR（例如CDRH3任選地與一個或多個其他的CDR（例如來自HCVR/LCVR對的一組六個CDR）組合）。

用於本發明的抗體可以通過任何合適的方法獲得。例如，抗體可以通過使用公知的和常規的方案將多肽給予動物（例如非人動物）來獲得（參見例如Handbook of Experimental Immunology, D. M. Weir (ed.), Vol 4, Blackwell Scientific Publishers, Oxford, England, 1986）。許多溫血動物，如兔、小鼠、大鼠、綿羊、牛、駱駝或豬可以被免疫。然而，小鼠、兔、豬和大鼠通常是最合適的。抗體也可以通過將多肽給藥於轉基因動物獲得，所述動物例如是經過基因改造產生源自人重鏈和/或輕鏈編碼基因的抗體的動物，例如源自AlivaMab系統的小鼠（WO 2010/039900和WO 2011/123708）。單株抗體可以通過本領域已知的任何方法製備，例如雜交瘤技術（Kohler & Milstein, 1975,Nature, 256:495-497）、三源雜交瘤（trioma）技術、人B細胞雜交瘤技術（Kozbor et al.，1983,Immunology Today, 4:72）和EBV-雜交瘤技術（Cole et al.，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp77-96, Alan R Liss, Inc., 1985）。抗體也可以使用單淋巴細胞抗體方法通過克隆和表達免疫球蛋白可變區cDNA來產生，所述cDNA由被選擇用於通過例如記載於Babcook, J. et al.，1996,Proc. Natl. Acad. Sci. USA93(15): 7843-7848l; WO 92/02551; WO 2004/051268和WO 2004/106377中的方法製備特異性抗體的單淋巴細胞產生。抗體也可使用本領域已知的各種噬菌體展示法產生，包括公開於以下的方法：Brinkman et al.（J. Immunol. Methods, 1995, 182: 41-50）、Ames et al.（J. Immunol. Methods, 1995, 184:177-186）、Kettleborough et al.（Eur. J. Immunol. 1994, 24:952-958）、Persic et al.（Gene, 1997 187 9-18）、Burton et al.（Advances in Immunology, 1994, 57:191-280）和WO90/02809；WO91/10737；WO92/01047；WO92/18619；WO93/11236；WO95/15982；WO95/20401；和US5,698,426、US5,223,409、US5,403,484、US5,580,717、US5,427,908、US5,750,753、US5,821,047、US5,571,698、US5,427,908、US5,516,637、US5,780,225、US5,658,727、US5,733,743和US5,969,108。獲得和鑒定可用於實施本發明的抗體的方法還包括以下方法：記載於ImmunoQure專利申請WO2013/098419（“Methods of Providing Monoclonal Auto-Antibodies with Desired Specificity”）、WO2013/098420（“Method of Isolating Human Antibodies”）和WO2015/001407（“Method of Providing Anti-Human Cytokine Antibodies for Pharmaceutical Use”）。

非抗體抗原結合結構域也被預想用於本發明的實施。因此，抗原結合結構域（例如IL-13抗原結合結構域或OX40L抗原結合結構域）可以例如源自或包括或由非抗體支架蛋白、DARPin（設計的錨蛋白重複蛋白）、抗鈣蛋白（anticalin）或脂鈣蛋白（lipocalin）、親合體（affibody）、avimer、adnectin、atrimer或evasin等組成。

本文所述的不同類型抗原結合結構域的組合被預想落在本發明的雙特異性抗原結合分子之內。因此，例如，抗原結合結構域可各自獨立地包括或由抗體或抗體的抗原結合片段組成，或者源自、或包括或由非抗體支架蛋白、DARPin（設計的錨蛋白重複蛋白）、抗鈣蛋白或脂鈣蛋白、親合體、avimer、adnectin、atrimer或evasin等組成。

在某些實施方案中，A和/或B可包括或由抗體（例如IgG抗體，如IgG1或IgG4）組成。

在某些實施方案中，A和/或B可包括或由抗體的抗原結合片段（例如Fv片段（例如scFv）、Fab片段）組成。

在某些實施方案中，A和/或B可源自或包括或由非抗體支架蛋白、DARPin（設計的錨蛋白重複蛋白）、抗鈣蛋白或脂鈣蛋白、親合體、avimer、adnectin、atrimer或evasin組成。

在某些實施方案中，A包括或由抗體（例如IgG抗體，如IgG1或IgG4）組成，B包括或由抗體的抗原結合片段（例如Fv片段（例如scFv）、Fab片段）組成。

在某些實施方案中，A包括或由抗體的抗原結合片段（例如Fv片段（例如scFv）、Fab片段）組成，B包括或由抗體（例如IgG抗體如IgG1或IgG4）組成。

在某些實施方案中，A和B二者均包括或由抗體的抗原結合片段（例如Fv片段（例如scFv）、Fab片段）組成。

本發明的雙特異性抗原結合分子可通過任何合適的方法製備。例如，所述分子的全部或部分可以由包括編碼所述分子的核苷酸的細胞表達為融合蛋白。或者，分子的各部分可以分別製備——例如通過任選地在單獨的細胞中由單獨的核苷酸表達——並隨後連接在一起。

除了所述至少兩個抗原結合結構域之外，所述雙特異性抗原結合分子可以任選地包括一個或多個其它組成部分。此類一個或多個其它組成部分可以例如促進抗原結合結構域彼此的締合或結合。可納入本發明的雙特異性抗原結合分子中的一個或多個其它組成部分的非限制性實例包括接頭（例如肽接頭和鉸鏈區）、重鏈恆定區（例如人CH1、CH2或CH3）、輕鏈恆定區（CL）例如人κ或λ CL區，以及Fc結構域（其通常包括CH2和CH3）。因此，在某些實施方案中，本發明的雙特異性抗原結合分子包括Fc結構域，較佳人Fc結構域，或其片段。人Fc結構域可以是天然或變體的人Fc結構域。

Fc結構域由兩條多肽鏈組成，每條多肽鏈稱為重鏈Fc區，其二聚化形成Fc結構域。Fc結構域可以是天然或變體的Fc結構域（例如具有一個或多個胺基酸插入、缺失或替換）。Fc結構域可以例如被修飾或工程化以使其更好地適合於預期的藥理學用途，例如改變（例如增加）半衰期和/或改變效應物功能。

較佳Fc結構域是人Fc結構域。Fc結構域或區可以來自任何合適的抗體類別，例如IgA、IgD、IgE、IgG或IgM，或其亞類（例如IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3或IgG4）。較佳地，Fc結構域是人的和/或IgG結構域，例如IgG1或IgG4，更佳IgG1。在天然抗體中，Fc結構域內的Fc區通常是相同的，但出於本發明的目的，Fc結構域內的兩個Fc區（如果存在）可以是相同的或不同的，例如來自不同的抗體類別或亞類（例如來自兩個不同的IgG類別）。

較佳的Fc區序列是下述人IgG1序列，即，其包括一個或多個減少Fc受體結合的人野生型序列的修飾（例如N297G、N297A或N297Q修飾，L234A/L235A（LALA）修飾，或L234A/L235A/P329G（LALAPG）修飾）和/或增加血清半衰期的人野生型序列的修飾（例如M428L/N434S（LS）修飾，T250Q/M428L（QL）修飾，或M252Y/S254T/T256E（YTE）修飾）。更佳地，人IgG1 Fc區序列包括減少Fc受體結合的人野生型序列的修飾（L234A/L235A（LALA）修飾）和/或增加血清半衰期的人野生型序列的修飾（M252Y/S254T/T256E（YTE）修飾）。

本文所用的術語“接頭”或其類似表述包括意指連接本發明雙特異性抗原結合分子的兩個或更多個不同組成部分的任何分子或實體。接頭的實例包括肽接頭和非免疫球蛋白多肽，如白蛋白（例如，兩個或更多個抗原結合結構域可與白蛋白（例如HSA）連接，以形成包括了分別與白蛋白分子結合的兩個或更多個抗原結合結構域的雙特異性抗原結合分子）。鉸鏈區也可用於連接本發明的抗原結合分子的組成部分，例如將抗原結合結構域（例如以抗體的抗原結合片段，如Fab片段的形式）結合至Fc區。鉸鏈區通常位於Fc區的N-末端。鉸鏈區可以是天然的或修飾的/變體的鉸鏈區。

本發明的抗原結合分子的組成部分（例如A和B）可以通過任何合適的方式彼此連接。組成部分可以彼此直接連接，或通過一個或多個合適的分子（例如通過接頭或鉸鏈區）彼此間接連接。因此，例如，本發明的雙特異性抗原結合分子可包括或由融合蛋白組成，所述融合蛋白包括A和B，任選地通過肽接頭連接。在本發明的實施中設想了直接和/或間接方式的各種組合，因此可以使用各種直接和/或間接方式來連接本發明的雙特異性抗原結合分子的組成部分。在一些實施方案中，抗原結合結構域通過Fc結構域或其片段彼此連接。通常，Fc結構域需要使用鉸鏈區，因此抗原結合結構域可以例如經由一個或多個鉸鏈區通過Fc結構域連接。

本發明的雙特異性抗原結合分子可以任選地直接或間接連接到其他部分，例如治療性部分。因此，在一些實施方案中，雙特異性抗原結合分子（例如雙特異性抗體）與一種或多種其他治療劑綴合。

雙特異性抗體

本發明的雙特異性抗原結合分子可以是雙特異性抗體。本發明的抗體通常是單株抗體。本發明的抗體可以例如是嵌合抗體、CDR-移植抗體、奈米抗體、人或人源化抗體或任何前述抗體的抗原結合片段。通常所述抗體是人抗體。如上所述，抗體可包括具有全長重鏈和輕鏈的完整抗體分子或其抗原結合片段。因此，本發明的抗體可包括或由具有全長重鏈和輕鏈的完整抗體分子組成，或者，其可包括或由其抗原結合片段組成。

本發明的雙特異性抗體分子的恆定區結構域（如果存在）可以根據所提出的抗體分子的功能，特別是可能需要的效應物功能來選擇。例如，恆定區結構域可以是人IgA、IgD、IgE、IgG或IgM結構域。通常，恆定區結構域是人的。特別地，可以使用人IgG（即IgG1、IgG2、IgG3或IgG4）恆定區結構域，例如人IgG1或IgG4恆定區結構域。輕鏈恆定區可以是λ或κ。

本發明的雙特異性抗體可以是人抗體。本文所用的術語“人抗體”旨在包括具有可變區的抗體，其中框架區和CDR區二者均源自人種系免疫球蛋白序列。此外，如果抗體含有恆定區，則恆定區也源自人種系免疫球蛋白序列。人抗體可包括不是由人種系免疫球蛋白序列（例如，通過體外隨機或位點特異性誘變或體內體細胞突變引入的突變）編碼的胺基酸殘基。然而，本文所用的術語“人抗體”並非旨在包括這樣的抗體：其中源自另一哺乳動物物種（例如小鼠）種系的CDR序列已經移植到人框架序列上。

本領域技術人員還應當理解，抗體可以進行多種翻譯後修飾。這些修飾的類型和程度通常取決於用於表達抗體的宿主細胞系以及培養條件。此類修飾可能包括以下方面的變體：糖基化、甲硫胺酸氧化、二酮呱嗪形成、天冬胺酸異構化和天冬醯胺脫醯胺。常見的修飾是由於羧肽酶的作用而丟失羧基末端鹼性殘基（如離胺酸或精胺酸）（如記載於Harris, RJ.Journal of Chromatography705:129-134, 1995）。

完全人抗體是重鏈和輕鏈二者的可變區和恆定區（如果存在）都是人源的、或與人源序列基本相同、但不一定來自同一抗體的那些抗體。完全人抗體的實例可包括例如通過如上文所述的噬菌體展示法製備的抗體和由下述小鼠製備的抗體，在所述小鼠中鼠免疫球蛋白可變區和任選地恆定區基因已被它們的人對應物取代，所述人對應物例如以一般術語記載於EP0546073、US5,545,806、US5,569,825、US5,625,126、US5,633,425、US5,661,016、US5,770,429、EP0438474和EP0463151。

術語“人源化抗體”旨在意指CDR-移植的抗體分子，其中源自另一哺乳動物物種種系（如小鼠）的CDR序列已經移植到人框架序列上。可以在人框架序列內進行其它框架區修飾。如本文所用，術語“CDR-移植的抗體分子”是指此類抗體分子，其中重鏈和/或輕鏈含有一個或多個來自供體抗體（例如鼠或大鼠單株抗體）的CDR（如果需要，包括一個或多個修飾的CDR），所述CDR被移植到受體抗體（例如人抗體）的重鏈和/或輕鏈可變區框架中。關於綜述，參見Vaughan et al.，Nature Biotechnology, 16, 535-539, 1998。在一個實施方案中，不是轉移整個CDR，而是僅將來自任何一個CDR的一個或多個特異性決定殘基轉移至人抗體框架（參見例如Kashmiri et al.，2005,Methods, 36, 25-34）。當CDR或特異性決定殘基被移植時，考慮到CDR來源的供體抗體的種類/類型，可以使用任何合適的受體可變區框架序列，包括小鼠、靈長類和人框架區。合適地，根據本發明的CDR移植抗體具有包括人受體框架區以及一個或多個CDR或特異性決定殘基的可變結構域。

抗體的抗原結合部分可被描述為結合結構域。結合結構域通常包括6個CDR（VHH為3個），3個來自重鏈，3個來自輕鏈。CDR通常在框架中，共同形成可變區。因此，在一個實施方案中，抗體或結合片段包括針對相關靶標的特異性結合結構域，該結構域包括輕鏈可變區和重鏈可變區。抗體可變區中的殘基根據本領域眾所周知的許多不同系統按慣例編號。這些系統包括眾所周知的Chothia、Kabat和IMGT。當使用根據其中一個系統定義的三個CDR序列來描述一個可變區時，應當理解其可以用根據另一個系統定義的相應的三個CDR序列來替代，儘管通常較佳IMGT定義。

本發明的抗體可以是“分離的”抗體。分離的抗體是基本上不含具有不同抗原特異性的其它抗體的抗體。

多種雙特異性抗體形式和製備方法是本領域已知的，並且任何合適的形式和製備方法可用於本發明的實施。有許多可用的雙特異性抗體形式，但一般而言，雙特異性抗體可分為IgG樣和非IgG樣雙特異性抗體。IgG樣雙特異性抗體包括Fc結構域，並且可以進一步分類為對稱IgG樣雙特異性抗體（例如雙可變結構域(DVD)-Ig，或串聯Fab (FIT)-Ig）和非對稱IgG樣雙特異性抗體。非IgG樣雙特異性抗體缺少Fc結構域，並且可以例如通過將兩種不同的抗原結合抗體片段融合到非免疫球蛋白蛋白（例如人血清白蛋白（HSA））、通過直接融合兩種抗原結合抗體片段、或通過化學綴合兩種不同的抗體或較小的抗原結合抗體片段來製備。這些IgG樣和非IgG樣形式和製備技術中的任何一種都可用於本發明的實施。對於雙特異性抗體的綜述，包括可用於實施本發明的示例性雙特異性抗體形式和製備方法（如下文討論中所概述的），可參考Kontermann和Brinkmann (2017)，“The making of bispecific antibodies”,Mabs, Feb-Mar 9(2): 182-199；Kontermann和Brinkmann (2015年6月)，“Bispecific antibodies”,Drug Discovery Today, 20(7): 838-847; Sedykh et al. (2018)，“Bispecific antibodies: design, therapy, perspectives”,Drug Design, Development and Therapy, 12: 195-208；和Fan et al. (2015)，“Bispecific antibodies and their applications”,Journal of Hematology and Oncology, 8:130。

根據本發明的示例性雙特異性抗體和技術包括但不限於不對稱IgG樣（例如Duobody雙特異性抗體）、對稱IgG樣（例如，包括兩個Fab區和一個Fc結構域，例如DVD-Ig雙特異性抗體或FIT-Ig雙特異性抗體）、非IgG樣、四源雜交瘤（quadromas）、WuXi body、凸-凹結構（knob-in-hole，kih）、IgG-scFv融合體、二合一或雙重作用Fab（DAF）抗體、半分子交換（half molecule exchange）、κλ-抗體、雙體抗體（Duobodies）、CrossMab、CrossFab、Triomab、(SEED)抗體、亮胺酸拉鍊、共同輕鏈（例如，kih IgG共同LC）、ortho-Fab IgG、二合一IgG、scFv2-Fc、三體抗體（triabodies）、基於scFv的或雙抗體（diabody）雙特異性形式、串聯scFv、單鏈雙抗體、奈米抗體、dock-and-lock（DNL）方法、雙奈米抗體、雙特異性T細胞銜接子（BiTE）、串聯雙抗體（tandAbs）、化學連接的Fab、二價和三價scFv、雙親和重靶向（DART）、DART-Fc、scFv-HSA-scFv和DNL-Fab3雙特異性抗體。

本發明的雙特異性抗體可以是WuXibody。WuXibody的詳細描述可參見WO 2019/057122（WuXi Biologics）。術語“WuXibody”包括這樣的雙特異性抗體：其包括具有抗體可變結構域和T細胞受體（TCR）恆定區的可溶性嵌合蛋白，其中TCR恆定區能夠形成包括至少一個非天然鏈間鍵的二聚體；WO 2019/057122中更詳細地記載了此類WuXibody及其的製備方法和各種可能的WuXibody形式。

在較佳的實施方案中，雙特異性抗體是IgG樣雙特異性抗體，其為對稱IgG樣雙特異性抗體（例如DVD-Ig雙特異性抗體或FIT-Ig雙特異性抗體）或非對稱IgG樣雙特異性抗體。在更佳的實施方案中，雙特異性抗體是對稱IgG樣形式。在本發明的較佳實施方案中，對稱IgG樣雙特異性抗體的A和B的相對位置為：A靠近分子的Fc區，B遠離Fc區。在本發明的另一個較佳實施方案中，對稱IgG樣雙特異性抗體的A和B的相對位置為：B靠近分子的Fc區，A遠離Fc區。

對稱IgG樣形式的實例為雙可變結構域免疫球蛋白（DVD-Ig）。DVD-Ig可從兩個親本mAb產生，通過將來自其中一個親本mAb的兩個可變結構域（而非一個可變結構域）置於另一親本抗體的重鏈和輕鏈上以產生四價IgG樣分子。另一個對稱IgG樣形式的實例是同樣為四價IgG樣的2+2 CrossMab，其可以由兩個親本mAb產生，其中將第一個親本mAb的Fab融合至第二個親本mAb的Fab中（如WO2010145792或WO2010145793所記載）。特別較佳的對稱IgG樣形式是WO2015103072中記載的串聯Fab免疫球蛋白（FIT-Ig）。在該形式的一個實施方案中，結合分子包括三條多肽鏈，其中所述第一多肽鏈包括從胺基端到羧基端的VH_B和CH1，第二多肽鏈包括從胺基端到羧基端的VL_B、CL、VH_A、CH1和Fc區（其中CL直接融合至VH_A），第三多肽鏈包括從胺基端到羧基端的VL_A和CL。在該形式的一個實施方案中，結合分子包括三條多肽鏈，其中所述第一多肽鏈包括從胺基端到羧基端的VH_A和CH1，第二多肽鏈包括從胺基端到羧基端的VL_A、CL、VH_B、CH1和Fc區（其中CL直接融合至VH_B），第三多肽鏈包括從胺基端到羧基端的VL_B和CL。不同VH/VL和CH1/CL對的配對產生四價IgG樣分子的組合。在這個實施方案中，VH_B為OX40L結合重鏈可變區序列，VL_B為OX40L結合輕鏈可變區序列，VH_A為IL-13結合重鏈可變區序列，且VL_A為IL-13結合輕鏈可變區序列。CH1為重鏈恆定結構域1，CL為輕鏈恆定結構域，Fc包括重鏈恆定結構域2和3（CH2和CH3）。較佳選擇此處公開的VH_A/VL_A對和VH_B/VL_B對。可以使用任何合適的CL、CH1和Fc結構域，但較佳使用人結構域。人CL可以是λ或κ。在較佳的實施方案中，人CL是κ。示例性CL κ序列如SEQ ID NO：35所示。示例性CL λ序列如SEQ ID NO：119所示。CH1和Fc是較佳的IgG1。示例性CH1序列如SEQ ID NO：33所示。Fc可任選地包括一個或多個相對於人野生型序列的修飾，以延長半衰期和/或阻斷Fc受體結合。本文中描述了適合的修飾。在較佳的實施方案中，雙特異性抗體包括人IgG1 Fc區序列，所述序列包括減少Fc受體結合的人野生型序列的修飾（任選地L234A/L235A（LALA）修飾）和/或增加血清半衰期的人野生型序列的修飾（任選地M252Y/S254T/T256E（YTE）修飾）。示例性Fc序列如SEQ ID NO：34所示。在實施例中進一步描述了本發明的示例性FIT-Ig分子，並提供了鏈1、2和3的序列。在一些實施方案中，本發明的雙特異性抗體由三個多肽鏈組成，每個多肽鏈的結構域排列如下（N-C端）：鏈1：VHB-CH1；鏈2：VLB-CL-VHA-CH1-Fc；以及鏈3：VLA-CL，其中VHB、CH1、VLB、CL、VHA、FC和VLA如本文所述。

在較佳的實施方案中，鏈1如SEQ ID NO：36所示；鏈2如SEQ ID NO：37所示；且鏈3如SEQ ID NO：38所示。

在較佳的實施方案中，鏈1如SEQ ID NO：39所示；鏈2如SEQ ID NO：40所示；且鏈3如SEQ ID NO：41所示。

在較佳的實施方案中，鏈1如SEQ ID NO：42所示；鏈2如SEQ ID NO：43所示；且鏈3如SEQ ID NO：44所示。

藥物組合物

本發明的任何分子（例如本發明的雙特異性抗體或抗OX40L抗體）均可以配製成藥物組合物給藥。因此，本發明的雙特異性抗原結合分子可以以包括雙特異性抗原結合分子和藥學上可接受的載體、稀釋劑、賦形劑或防腐劑的藥物組合物的形式提供。

如本文所用，“藥學上可接受的載體”包括任何和所有的溶劑、分散介質、包衣（coating）、抗細菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等生理上相容的物質。較佳地，所述載體適合於腸胃外給藥，例如靜脈內、肌內或皮下給藥（例如，通過注射或輸注）、局部或口服給藥。較佳的藥學上可接受的載體包括水性載體或稀釋劑。可用於本發明的組合物的合適水性載體的實例包括水、緩衝水和鹽水。其它載體的實例包括乙醇、多元醇（例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等）及其合適的混合物、植物油（例如橄欖油）和可注射的有機酯（例如油酸乙酯）。在許多情況下，較佳在組合物中包括等滲劑，例如糖、多元醇（如甘露醇）、山梨醇或氯化鈉。

藥物組合物通常必須是無菌的並且在製造和儲存條件下是穩定的。該組合物可以配製成溶液、微乳液、脂質體或其它適合於高藥物濃度的有序結構。

除了本發明的分子之外，本發明的藥物組合物可以包括一種或多種其他活性成分。

治療用途

在本發明的另一方面，提供了用作藥物的本發明的任意分子（例如雙特異性抗原結合分子或抗OX40L抗體）。本發明還提供了治療疾病或病況的方法，所述方法包括將本發明的分子給予有需要的受試者，從而治療所述疾病或病況。

如上所述，IL-13和OX40L已被鑒定為多種疾病和病況中的重要因子，因此，本發明的雙特異性抗原結合分子可用於治療此類疾病和病況。因此，本發明的一個方面提供了治療患者中與IL-13和/或OX40L相關或由其介導的疾病或病況的方法，該方法包括給予患者本發明的抗IL-13和OX40L雙特異性抗原結合分子（例如雙特異性抗體）。本發明還提供了本發明的抗IL-13和OX40L雙特異性抗原結合分子用於治療與IL-13和/或OX40L相關或由其介導的疾病或病況的方法。本發明還提供了本發明的抗IL-13和OX40L雙特異性抗原結合分子用於製備治療與IL-13和/或OX40L相關或由其介導的疾病或病況的藥物。

與特定細胞因子（此處為IL-13或OX40L）相關的短語“與……相關或由其介導的疾病或病況”及其類似表述包括意指與細胞因子的表達、訊號傳導或活性相關或由其介導的疾病或病況，或是可通過拮抗細胞因子治療的，例如通過阻斷細胞因子與細胞因子配體之間的相互作用或通過抑制細胞因子的活性和/或訊號傳導。與IL-13和/或OX40L相關或由IL-13和/或OX40L介導的疾病或病況的實例包括皮膚疾病（例如，特應性皮炎、結節性癢疹、慢性手部濕疹、過敏性皮炎、銀屑病、扁平苔蘚、化膿性汗腺炎）、哮喘、過敏性疾病（例如，過敏性鼻炎）、心血管疾病（例如，心肌梗塞、心臟肥大相關疾病）、動脈粥樣硬化、肌肉骨骼疾病（類風濕性關節炎）、COPD、年齡相關性黃斑變性、牙周炎葡萄膜炎、癌症、炎症性腸病、纖維化、硬皮病或嗜酸性食道炎。

本發明的分子可用於治療皮膚疾病或病況，例如特應性皮炎、結節性癢疹、慢性手部濕疹、過敏性皮炎、銀屑病、扁平苔蘚或化膿性汗腺炎。在較佳的實施方案中，本發明的分子可用於治療特應性皮炎。

因此，本發明提供了治療患者的皮膚疾病或病況的方法，包括給予患者本發明的分子（例如雙特異性抗體）。本發明還提供了本發明的分子用於治療皮膚疾病或病況的方法。本發明還提供了本發明的分子用於製備治療皮膚疾病或病況的藥物。

在本發明中，治療可以是針對患有疾病或病況的患者，或者可以是針對要預防病症的患者，例如傾向於患有疾病或病況或處於患有疾病或病況的風險中的患者。因此，本文所用術語“治療”及其類似表述涵蓋治療性和預防性治療。術語“治療”可以例如指預防疾病或病況的發生、延遲疾病或其一種或多種症狀的發作、使患者的疾病或醫學病症消退、抑制疾病或醫學病況（例如減緩疾病或醫學病況的發展，或降低突發的嚴重性和/或頻率），或在一定程度上減輕患者疾病或醫學病況的一種或多種症狀。AD的症狀包括瘙癢、紅斑、水腫、乾燥、糜爛/表皮脫落、膿液滲出和結痂、苔蘚樣硬化、皮膚屏障受損和泛紅。術語“治療”及其類似表述不一定需要完全的治療或預防，因此該術語可以涵蓋不同程度的治療或預防。

在治療性應用中，給藥是對已經患有疾病或病況的受試者。此類治療性處理可以例如治癒、減輕或部分阻止疾病或病況或其一種或多種症狀。因此，治療性給藥可導致症狀嚴重性降低，或無症狀期的頻率或持續時間增加。足以實現治療上有用效果的量可稱為“治療有效量”。

在預防性應用中，給藥是對尚未或目前尚未表現出疾病或病況症狀的受試者。此類預防性治療可以例如預防、延遲或在嚴重程度方面降低疾病或病況或其一種或多種症狀的發展。足以實現預防上有用效果的量可稱為“預防有效量”。可以通過任何合適的方法來鑒定受試者為處於發生疾病或病況的風險中。所述患者可能傾向於患有所述疾病或病況或處於患所述疾病或病況的風險中（例如，具有所述疾病或病況的家族史或個體史的患者），或在其中所述病症需要預防。

治療和預防有效量將取決於疾病或病況的嚴重程度以及受試者的體重和一般狀態。應當理解，通過構建數值矩陣並測試矩陣中的不同點，可以使用常規實驗來確定合適的劑量，這均在受過訓練的醫師的普通技能範圍內。

本文所用術語“治療”可以指疾病或病況的嚴重程度或生活品質（QoL）的改善。各種測試程式和評分系統可用於評估疾病嚴重程度（例如輕度、中度、中度至重度或重度）和生活品質，並且可使用任何一種或多種合適的測量法。AD的疾病嚴重程度和生活品質指標概述參見例如Rehal和Armstrong (2011), Plos ONE 6(4):e17520和Gooderham et al.(2018), J Cutan Med Surg., 22(IS) 10S-16S)。AD患者疾病嚴重程度的一個常用指標是濕疹面積嚴重程度指數（EASI）。AD的合適疾病嚴重程度和QoL測量的其它實例包括：特應性皮炎評分量表（SCORing Atopic Dermatitis，SCORAD）、體表面積（Body Surface Area，BSA）評估、醫生整體評估（Physician’s Global Assessments，PGA）、研究者整體評估（Investigator Global Assessment，IGA）、皮炎嚴重程度指數（Dermatitis Severity Index，ADSI）、六區域六體征特應性皮炎評分（Six Area, Six Sign Atopic Dermatitis，SASSAD）、研究者特應性皮炎整體評估（Investigators’ Global Atopic Dermatitis Assessment，IGADA）、瘙癢-視覺類比量表（Pruritus – Visual Analogue Scale，Pruritus-VAS）、5-D瘙癢量表（5-D Itch (Pruritis) Scale）、皮膚病生活品質指數（Dermatology Life Quality Index，DLQI）、兒童皮膚病生活品質指數（Children’s Dermatology Life Quality Index，CDLQI）、皮炎家庭影響量表（Dermatitis Family Impact，DFI）、嬰兒皮膚病與生活品質量表（Infant’s Dermatology and Quality of Life，IDQOL）以及醫學結果睡眠研究（Medical Outcome Sleep Study，MOSS）。

本發明的雙特異性抗原結合分子可以例如用於治療急性或慢性AD。本發明的雙特異性抗原結合分子可用於治療輕度、中度、中度至重度或重度AD。疾病嚴重程度可以由技術人員使用標準測試方法容易地確定，例如通過使用一種或多種上述AD的疾病嚴重程度的測量法或生活品質測量法，例如EASI。

術語“患者”和“受試者”在本文中可互換使用，並且所述術語包括任何人或非人動物（較佳地為哺乳動物）。本文所用的術語“哺乳動物”是指哺乳動物綱的任何成員，包括但不限於人和非人靈長類動物（如黑猩猩）和其它猿和猴物種；家畜，如牛、綿羊、豬、山羊和馬；家養/伴侶動物，如狗和貓；以及兔和齧齒類動物，如小鼠、大鼠和豚鼠等。通常，本發明涉及對人類患者的給藥。人類患者可以是成年患者（18歲或更大）。或者，人類患者可以是兒科患者（小於18歲）。在一些情況下，患者可能小於12歲。在某些實施方案中，所述受試者是已被鑒定為患有可能對本發明的雙特異性抗原結合分子有反應的病症或病況的人類患者。

給藥

本發明的分子和藥物組合物可以使用本領域已知的多種方法中的一種或多種通過一種或多種給藥途徑給藥。如本領域技術人員所理解的，給藥途徑和/或模式將根據所需結果而變化。給藥途徑可包括靜脈內、肌內、皮內、腹膜內、皮下或其它腸胃外給藥途徑，例如通過注射或輸注。本文所用短語“腸胃外給藥”意為除腸內和局部給藥以外的給藥方式，通常通過注射。在一些實施方案中，本發明的雙特異性抗原結合分子（例如本發明的雙特異性抗體）通過注射（較佳地通過皮下或靜脈內注射）給予患者。或者，本發明的雙特異性抗原結合分子可以通過非腸胃外途徑給藥，例如通過局部或口服給藥。

本發明的分子的合適劑量可由熟練的醫務人員確定。本發明的藥物組合物中活性成分的實際劑量水平可以變化，以便獲得對於特定患者、組合物和給藥方式有效地實現所需治療回應而對患者沒有毒性的活性成分的量。所選擇的劑量水平將取決於多種藥代動力學因素，包括所用的特定雙特異性抗原結合分子的活性、給藥途徑、給藥時間、雙特異性抗原結合分子的排泄速率、治療持續時間、與所用的特定組合物組合使用的其它藥物、化合物和/或材料、被治療的患者的年齡、性別、體重、狀態、一般健康狀況和既往病史，以及醫學領域公知的類似因素。

本發明的分子的合適劑量可以是例如，在約0.1 µg/kg至約100 mg/kg待治療患者體重的範圍內。例如，合適的劑量可以是每天約1 µg/kg至約10 mg/kg體重或每天約10 g/kg至約5 mg/kg體重。本發明的雙特異性分子也可以以低於結合相同靶標的兩種單特異性分子的組合量的劑量給藥。

在初始劑量之後可以給予第二或多個後續劑量。第二和後續劑量可以間隔適當的時間。劑量和頻率可以根據患者中雙特異性抗原結合分子的半衰期和所需的治療持續時間而變化。給藥劑量和頻率也可以根據治療是預防性還是治療性的而變化。在預防性應用中，可以在長時間內以相對不頻繁的間隔給予相對低的劑量。在治療性應用中，可以給予相對高的劑量，例如直到患者表現出症狀的部分或完全改善。

其他藥物/單獨治療方法

本發明的分子（例如雙特異性抗體）可以與用於預防或治療疾病或病況的其他藥物和/或治療方法組合給藥。兩種或更多種藥劑的聯合給藥可以通過許多不同的方式實現。在一個實施方案中，本發明的分子和另一種藥劑可以在單一組合物中一起給藥。在另一個實施方案中，本發明的分子和另一種藥劑可以作為聯合治療的一部分在單獨的組合物中給藥。例如，本發明的分子可以在另一種藥劑之前、同時或之後給藥。單獨的組合物可以通過相同的途徑或不同的途徑給藥。

合適的藥物和/或治療的實例在本領域中有記載。例如，關於AD，參見例如，Dhadwal et al. (2018),J Cutan Med Surg.,22(IS) 21S-29S)。在AD的情況下，實例包括局部治療（例如，局部皮質類固醇和局部鈣調磷酸酶抑制劑）、光線療法和全身性治療（例如全身性皮質類固醇、甲胺蝶呤、環孢菌素A、黴酚酸酯和硫唑嘌呤）。

實施例

實施例1——OX40L結合抗體的發現

8隻AlivaMab（Ablexis）轉基因小鼠分別使用穩定化的人OX40L-Fc融合蛋白進行免疫，導致產生約11500個表達抗體的候選雜交瘤。基於以下篩選方法選擇了96個雜交瘤：（i）通過阻斷ELISA進行靶點阻斷（target blocking）（當OX40L固定且OX40可溶時，測量OX40-OX40L相互作用的抑制）；（ii）通過可溶性ELISA進行靶點阻斷（當OX40L可溶且OX40固定時，測量OX40-OX40L相互作用的抑制）；和（iii）通過流式細胞術進行靶點結合（評估與OX40L表達細胞的結合）。第二輪篩選選擇了24個雜交瘤，它們在以下兩個方面都是最佳的：（i）通過阻斷ELISA進行靶點阻斷；以及（ii）通過可溶性ELISA進行靶點阻斷。然後通過以下手段對其進行評估：重鏈和輕鏈可變區測序以及序列多樣性分析；可開發性評估（通過ELISA檢查與杆狀病毒顆粒（Baculonavirus particles，BVP）和多特異性試劑（PSR）的低/零非特異性結合，加上檢查有利的熱性能（通過Uncle測量的Tm/Tagg）和使用HPLC測量的低疏水性）；通過流式細胞術進行靶點結合（測定表達人和獼猴二者的OX40L表達細胞系的K_D）；以及使用可溶性競爭ELISA與作為對照的參比抗體Ab009相比進行功能測定。

基於對OX40L的結合和阻斷的表現性能最佳；高序列多樣性（使用6個重鏈V基因、5個κ和3個λ輕鏈基因）；以及無可開發性方面的顧慮（熱穩定性、疏水性），選擇了12個先導OX40L結合序列。然後排除滴度低於30mg/L的4個候選者，留下8個先導候選者。

實施例2——12個先導OX40L結合結構域的序列

表Ex2

雜交瘤編號	SEQ ID	重鏈可變區（VH）序列顯示為N-C端，其中CDR 1、2和3按順序出現，加底線（IMGT系統）	SEQ ID	輕鏈可變區（VL）序列顯示為N-C端，其中CDR 1、2和3按順序出現，加底線（IMGT系統）
10L15A	27	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTHYVQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSDYDSSGYYYGNSFDYWGQGTLVTVSS	28	EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSNSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVFYCQHYSRSPWTFGQGTKVEIK
10E23A	29	QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISNYFWSWIRQPAGKGLEWIGRIYKSWRTNYNPSLKSRVTMSVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARERFNRNDAYDAFDIWGQGTMVTVSS	30	DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQGISSYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTEFTFTISSLQPEDFVTYYCQQLNSYPPTFGQGTKVEIK
05P04A	31	EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFNSYNLHWVRQAPGKGLEWVSSIISTSTYKDYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARGTFFDYWGQGTLVTVSS	32	QLVLTQSPSASASLGASVKLTCTLSSGRSSYAIAWHQQRPEKGPRYLMKLNSDGSHSRGDGIPDRFSGSSSGTERYLTISSLQAEDEADYYCQTWVTGIQVFGGGTKLTVL
06C09A	65	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMTWVRQAPGKGLEWVSIISGSGGLTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAIYYCARDLQWEPLGYWGQGTLVTVSS	66	AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRDALGWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSWVPSRFSGSGSGTDFTLSISSLQPEDFATYYCLQDYNYPYTFGQGTKLEIK
08N01A	67	EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFIFSNAWMNWVRQAPGKGLEWVGRIKSIPDGRSIDYAAPVKGRFTISRDDSKHTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTTGGRSYGTFDFWGQGTLVAVSS	68	SFELTQPPSVSVSPGQTARITCFGDALPKQYAYWYQQKPGQAPVLVIYKDSKRPSGIPERFSGSSSGTTVTLTISGVQAEDEADYYCQSADSSGPYVVFGGGTKVTVL
12K10A	69	EVQLVESGGGLVRPGGSLRLSCAASGFTFSSYNMNWVRQAPGKGLEWVSSISSRNTYKDYADSVMGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGTFFDYWGQGTLVSVSS	70	QFVLTQSPSASASLGASVSLTCTLSSGRSSYAIAWHQQQPEKGPRYLMKLNSDGSHSKGDDIPDRFSGSSSGTERHLTISSLQSEDEANYYCQTWGSGIQVFGGGTKLTVL
13C22A	71	EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNALMSWVRQAPGQGLEWVGRIKSKTDGGTTDYGAPVKGRFTISRDDSRNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTLDQHYYGMDFWGQGTTVTVSS	72	DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSNLRTFGQGTKVEIK
13M16A	73	EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFIFSNAGMNWVRQAPGKGLEWVGRIKTKTDGGTTDYAAPVKARFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTTGGRTYPFDFWGQGTLVTVSS	74	QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSYYVYWYQHLPGTAPKLLIYSNNKRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDDSLSGWVFGGGTKLTVL
07C16A	75	QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGDSINRGGYFWSWIRKHPGKGLEWIGYIYHSGRTYYNPSLKSRVTISVDTSKKQFSLKLISVSAADTAVYYCARDRGRDGFDIWGQGTMVTVSS	76	DIQMTQSPSTLSAFVGDRVTITCRASQSISNWLAWYQQKPGIAPKLLIYKASTLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYDSYSTFGQGTKLDIK
07E10A	77	EVQLLESGGDLVQPGGSLRLSCAASGFAFSSYAMNWVRQAPGKGLEWVSATSGSGRSTLFADSVKGRFTVSRDNSKNTLYLQINSLRAEDTAVYYCTKVQLGFDGFDIWGQGTMVTVSS	78	DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQGISSYLAWYQQKPGKAPNLLISAASTLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQHLNSYPYTFGQGTKLEIK
08F15A	79	EVQLVESGGGFVKPGGSLRLSCAASGFTFSIAWMSWVRQAPGKGLEWVGRFKSKTDDGTTDYAAPVKGRFTISKDDSKNTLYLHMNSLKTEDTAVYYCTVAHWGFIDFWGQGTLVTVSS	80	DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVLYSSNNKKYLAWYQQKPGQPPTLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSTPFTFGPGTKVDIK
14P23A	81	QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWSWIRQSAGKGLEWIGRIYSTGRNNYNPSLTSRVTMSINTSQNRFSLKLSSVTAADTAVYYCARERFSRSYRDAFDIWGQGTMVIVSS	82	EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPLTFGGGTKVEIK

上表的前三行是三個較佳的候選OX40L結合序列。後四行是由於表達滴度低於30mg/L而排除在進一步分析之外的候選者。

下表提供了三個較佳的候選OX40L結合序列中的每一個的CDR序列，分別通過Chothia、Kabat和IMGT系統確定。這些系統在本文中可以互換使用。例如，當給定的OX40L結合區在本文中是通過參考根據Chothia確定的3個重鏈CDR來定義時，這些CDR可以被轉換為根據Kabat定義的相應的3個重鏈CDR，或根據IMGT定義的相應的3個重鏈CDR；並且，當給定的OX40L結合區在本文中是通過參考根據Chothia確定的3個輕鏈CDR來定義時，則這些CDR可以被轉換為根據Kabat定義的相應的3個輕鏈CDR，或根據IMGT定義的相應的3個輕鏈CDR。例如，根據下表，標記為10L15A的OX40L結合區可以定義為包含CDRH1：SEQ ID NO: 4，CDRH2：SEQ ID NO: 5，CDRH3：SEQ ID NO: 6；和CDRL1：SEQ ID NO: 16，CDRL2：SEQ ID NO: 17，CDRL3：SEQ ID NO: 18，其均為根據Chothia確定的。應當理解，這些序列可以替代CDRH1：SEQ ID NO: 83，CDRH2：SEQ ID NO: 84，CDRH3：SEQ ID NO: 85；和CDRL1：SEQ ID NO: 101，CDRL2：SEQ ID NO: 102，CDRL3：SEQ ID NO: 103，其均為根據Kabat確定的，或者這些序列可以替代CDRH1：SEQ ID NO: 86，CDRH2：SEQ ID NO: 87，CDRH3：SEQ ID NO: 88；和CDRL1：SEQ ID NO: 104，CDRL2：SEQ ID NO: 105，CDRL3：SEQ ID NO: 106，其均為根據IMGT確定的。這同樣適用於本文所述結合區的CDR，包括下表所示的另外兩個OX40L結合區。

	CDRH1	SEQ	CDRH2	SEQ	CDRH3
10L15A	GYTFTGY   (Chothia)	4	PNSG   (Chothia)	5	DYDSSGYYYGNSFD  (Chothia)	6
GYYMH  (Kabat)	83	WINPNSGGTHYVQKFQG  (Kabat)	84	SDYDSSGYYYGNSFDY  (Kabat)	85
GYTFTGYY (IMGT)	86	INPNSGGT  (IMGT)	87	ARSDYDSSGYYYGNSFDY  (IMGT)	88
10E23A	GGSISNY  (Chothia)	7	KSW    (Chothia)	8	RFNRNDAYDAFD  (Chothia	9
NYFWS  (Kabat)	89	RIYKSWRTNYNPSLKS   (Kabat)	90	ERFNRNDAYDAFDI  (Kabat)	91
GGSISNYF  (IMGT)	92	IYKSWRT   (IMGT)	93	ARERFNRNDAYDAFDI  (IMGT)	94
05P04A	GFTFNSY  (Chothia)	10	STST   (Chothia)	11	TFFD  (Chothia)	12
SYNLH  (Kabat)	95	SIISTSTYKDYADSVKG (Kabat)	96	GTFFDY  (Kabat)	97
GFTFNSYN  (IMGT)	98	IISTSTYK   (IMGT)	99	ARGTFFDY  (IMGT)	100
	CDRL1		CDRL2		CDRL3
10L15A	SQSVSNSY   (Chothia)	16	GAS   (Chothia)	17	YSRSPW   (Chothia)	18
RASQSVSNSYLA (Kabat)	101	GASSRAT  (Kabat)	102	QHYSRSPWT (Kabat)	103
QSVSNSY (IMGT)	104	GAS  (IMGT)	105	QHYSRSPWT  (IMGT)	106
10E23A	SQGISSY   (Chothia)	19	AAS    (Chothia)	20	LNSYPP   (Chothia)	21
RASQGISSYLA  (Kabat)	107	AASTLQS  (Kabat)	108	QQLNSYPPT  (Kabat)	109
QGISSY  (IMGT)	110	AAS  (IMGT)	111	QQLNSYPPT  (IMGT)	112
05P04A	LSSGRSSYA   (Chothia)	22	LNSDGSH    (Chothia)	23	WVTGIQ   (Chothia)	24
TLSSGRSSYAIA   (Kabat)	113	LNSDGSHSRGD  (Kabat)	114	QTWVTGIQV  (Kabat)	115
SGRSSYA  (IMGT)	116	LNSDGSH  (IMGT)	117	QTWVTGIQV  (IMGT)	118

為了比較，以下是參比抗OX40L抗體（Ab009）的可變區序列。

SEQ ID	重鏈可變區（ VH ）序列顯示為 N-C 端，其中 CDR 1 、 2 和 3 按順序出現，加底線（ Kabat 系統）	SEQ ID	輕鏈可變區（ VL ）序列顯示為 N-C 端，其中 CDR 1 、 2 和 3 按順序出現，加底線 （ Kabat 系統）
60	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMNWVRQAPGKGLEWVSTISGSGGATRYADSVKGRFTISRDNSRNTVYLQMNSLRVEDTAVFYCTKDRLIMATVRGPYYYGMDVWGQGTTVTVSS	61	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPNLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSETDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSHSVSFTFGPGTKVDIK

下表還提供了根據Kabat系統測定的參比抗OX40L抗體（Ab009）的CDR序列：

	CDR1	SEQ	CDR2	SEQ	CDR3	SEQ
HC	NYAMN (Kabat)	54	TISGSGGATRYADSVKG (Kabat)	55	DRLIMATVRGPYYYGMDV  (Kabat)	56
LC	RASQSISSYLN (Kabat)	57	AASSLQ    (Kabat)	58	QQSHSVSFT    (Kabat)	59

以下是參比抗IL-13抗體（Ab008）的可變區序列。

SEQ ID	重鏈可變區（VH）序列顯示為N-C端，其中CDR 1、2和3按順序出現，加底線（Kabat系統）	SEQ ID	輕鏈可變區（VL）序列顯示為N-C端，其中CDR 1、2和3按順序出現，加底線 （Kabat系統）
25	QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTVSGFSLSAYSVNWIRQPPGKALEWLAMIWGDGKIVYNSALKSRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCAGDGYYPYAMDNWGQGSLVTVSS	26	DIVMTQSPDSLSVSLGERATINCRASKSVDSYGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQNNEDPRTFGGGTKVEIK

下表還提供了根據Kabat系統測定的參比抗IL-13抗體（Ab008）的CDR序列：

	CDR1	SEQ	CDR2	SEQ	CDR3	SEQ
HC	AYSVN (Kabat)	1	MIWGDGKIVYNSALKS (Kabat)	2	DGYYPYAMDN  (Kabat)	3
LC	RASKSVDSYGNSFMH (Kabat)	13	LASNLES    (Kabat)	14	QQNNEDPRT     (Kabat)	15

實施例3——雙特異性分子的序列

下面所示的序列是雙特異性抗體的鏈1、2和3的序列，其形式為如WO2015103072中所述的FIT-Ig形式。每個都使用標準方法進行重組表達。BsAb001、BsAb003和BsAb002是雙特異性抗體，其分別包括前面的實施例中鑒定的前三個OX40L結合序列。每個序列的形式使得雙特異性的OX40L結合部分遠離分子的Fc區。BsAb004、BsAb005和BsAb006是BsAb001、BsAb002和BsAb003的“Fab轉換”版本，其形式使得雙特異性的OX40L結合部分靠近分子的Fc區。

示例性雙特異性抗體概述：

雙特異性分子的名稱代碼	OX40L部分-雜交瘤代碼或其他識別字的編號	OX40L部分靠近或遠離Fc
BsAb001	10L15A	遠離
BsAb002	05P04A	遠離
BsAb003	10E23A	遠離
BsAb004	10L15A	靠近
BsAb005	05P04A	靠近
BsAb006	10E23A	靠近
BsAb007	來自Amlitelimab	遠離

示例性雙特異性分子的序列資訊：

BsAb	鏈1 VHB-CH1	SEQ	鏈2  VLB-CL-VHA-CH1-Fc	SEQ	鏈3  VLA-CL	SEQ
001	QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTHYVQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSDYDSSGYYYGNSFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC	36	EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSNSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVFYCQHYSRSPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECQVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTVSGFSLSAYSVNWIRQPPGKALEWLAMIWGDGKIVYNSALKSRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCAGDGYYPYAMDNWGQGSLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK	37	DIVMTQSPDSLSVSLGERATINCRASKSVDSYGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQNNEDPRTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC	38
003	QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISNYFWSWIRQPAGKGLEWIGRIYKSWRTNYNPSLKSRVTMSVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARERFNRNDAYDAFDIWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC	39	DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQGISSYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTEFTFTISSLQPEDFVTYYCQQLNSYPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECQVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTVSGFSLSAYSVNWIRQPPGKALEWLAMIWGDGKIVYNSALKSRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCAGDGYYPYAMDNWGQGSLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK	40	DIVMTQSPDSLSVSLGERATINCRASKSVDSYGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQNNEDPRTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC	41
002	EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFNSYNLHWVRQAPGKGLEWVSSIISTSTYKDYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARGTFFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC	42	QLVLTQSPSASASLGASVKLTCTLSSGRSSYAIAWHQQRPEKGPRYLMKLNSDGSHSRGDGIPDRFSGSSSGTERYLTISSLQAEDEADYYCQTWVTGIQVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECSQVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTVSGFSLSAYSVNWIRQPPGKALEWLAMIWGDGKIVYNSALKSRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCAGDGYYPYAMDNWGQGSLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK	43	DIVMTQSPDSLSVSLGERATINCRASKSVDSYGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQNNEDPRTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC	44
007	EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMNWVRQAPGKGLEWVSTISGSGGATRYADSVKGRFTISRDNSRNTVYLQMNSLRVEDTAVFYCTKDRLIMATVRGPYYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC	62	DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPNLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSETDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSHSVSFTFGPGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECQVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTVSGFSLSAYSVNWIRQPPGKALEWLAMIWGDGKIVYNSALKSRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCAGDGYYPYAMDNWGQGSLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK	63	DIVMTQSPDSLSVSLGERATINCRASKSVDSYGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQNNEDPRTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC	64
BsAb	鏈1 VHA-CH1	SEQ	鏈2 VLA-CL-VHB-CH1-Fc	SEQ	鏈3 VLB-CL	SEQ
004	QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTVSGFSLSAYSVNWIRQPPGKALEWLAMIWGDGKIVYNSALKSRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCAGDGYYPYAMDNWGQGSLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC	45	DIVMTQSPDSLSVSLGERATINCRASKSVDSYGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQNNEDPRTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTHYVQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARSDYDSSGYYYGNSFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK	46	EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSNSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVFYCQHYSRSPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC	47
006	QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTVSGFSLSAYSVNWIRQPPGKALEWLAMIWGDGKIVYNSALKSRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCAGDGYYPYAMDNWGQGSLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC	48	DIVMTQSPDSLSVSLGERATINCRASKSVDSYGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQNNEDPRTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISNYFWSWIRQPAGKGLEWIGRIYKSWRTNYNPSLKSRVTMSVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARERFNRNDAYDAFDIWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK	49	DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQGISSYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTEFTFTISSLQPEDFVTYYCQQLNSYPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC	50
005	QVTLRESGPALVKPTQTLTLTCTVSGFSLSAYSVNWIRQPPGKALEWLAMIWGDGKIVYNSALKSRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCAGDGYYPYAMDNWGQGSLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC	51	DIVMTQSPDSLSVSLGERATINCRASKSVDSYGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQNNEDPRTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECEVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFNSYNLHWVRQAPGKGLEWVSSIISTSTYKDYADSVKGRFTISRDNAKNSLFLQMNSLRAEDTAVYYCARGTFFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK	52	QLVLTQSPSASASLGASVKLTCTLSSGRSSYAIAWHQQRPEKGPRYLMKLNSDGSHSRGDGIPDRFSGSSSGTERYLTISSLQAEDEADYYCQTWVTGIQVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS	53
VHB= OX40L結合重鏈可變區 VLB = OX40L結合輕鏈可變區 VHA= IL-13結合重鏈可變區 VLB= IL-13結合重鏈可變區 CH1＝重鏈恆定結構域1（人IgG1）（例如，SEQ ID NO：33） CL=輕鏈恆定結構域（人κ（例如，SEQ ID NO: 35）或人λ（例如，SEQ ID NO: 119）） Fc=包含重鏈恆定結構域2和3（人IgG1），任選地包括一種或多種為增加半衰期和/或破壞Fc受體結合的修飾（例如SEQ ID NO: 34）

以下是適用於本發明雙特異性分子的恆定區序列的實例。

IgG CH1	SEQ	IgG Fc	SEQ	IgG κ CL	SEQ
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC	33	DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK	34	RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC	35
				IgG λ CL	119
				GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS

實施例4——雙特異性分子的結合親和力

1）通過SPR測定IL-13臂的結合親和力

使用多循環動力學SPR（運行Biacore Insight Evaluation Software Instrument V 3.0.12.15655的Biacore 8K）定量對人IL-13的親和力，以抗體的平衡解離常數（K_D）表示。在運行緩衝液（含BSA的HBS-P）中稀釋至1.0 μg/mL的抗體在蛋白A感測器晶片（貨號29127555）上被捕獲至~500 RU。將IL-13（Sino Biological 10369-HNAC）用作分析物，其形式為室溫下從0.391 nM至25 nM的7點2倍稀釋系列。採用1:1擬合模型和雙參比扣除法（double reference substraction）進行分析。結果如圖1和下表所示。

樣品編號	Ka(1/Ms)	Kd(1/s)	KD(M)	RMAX(RU)	Chi2(RU2)
BsAb001	7.21E+05	3.36E-08	＜1.00E-11	67.3	5.51
BsAb002	9.46E+05	9.68E-09	＜1.00E-11	47.4	0.65
BsAb003	1.07E+06	1.83E-07	＜1.00E-11	62.0	4.24
BsAb004	2.06E+06	1.84E-08	＜1.00E-11	53.4	3.22
BsAb005	1.91E+06	3.48E-08	＜1.00E-11	56.3	3.93
BsAb006	2.54E+06	2.75E-09	＜1.00E-11	55.4	3.72
BsAb007	6.51E+05	1.53E-07	＜1.00E-11	65.3	4.55
Ab008	2.26E+06	5.03E-08	＜1.00E-11	88.3	1.73
Ab009	-	-	NB	-	-

2）通過Kinexa測定IL-13臂的結合親和力

通過動力學排斥試驗（KinExA），使用KinExA 3200 S/N: 5000儀器和來自Sino Biological的重組IL-13作為結合配偶體（10369-HNAC），對雙特異性抗體與人IL-13的結合親和力進行畫像。樣品在含有1mg/mL BSA和0.1%NaN₃的PBS中製備。該測定旨在通過實驗估算Kon，而解離速率Koff則根據以下方程計算：Koff = Kd × KonA。Kd分析需要將重組IL-13固定至固相（微珠），該固相用作捕獲不同抗體分子的探針，該不同抗體分子使用螢光二級分子標記以進行檢測。將捕獲至固相的標記抗體產生的訊號用於確定Kd值。KinExA Pro軟體對測量資料進行最小二乘分析，以分析這些值是否吻合代表1:1可逆雙分子相互作用的曲線。抗體對IL-13的結合親和力（Kd）、結合速率和解離速率（Kon和Koff）的結果如下表所示。BsAb002被用於測定IL-13的活性。於是IL-13被用作其他抗體（mAb）的濃度參比，這允許直接比較每種抗體的Kd。根據Kd測量，所有雙特異性分子與對照Ab008相比均顯示出較高的對IL-13的親和力。特別是，抗體BsAb004、BsAb005和BsAb006顯示Kd比對照低約十倍。值得注意的是，參比抗體Ab008不吻合標準1:1結合模型，而是吻合提供“有效”Kd的協同結合分析（cooperative binding analysis）。BsAb005還顯示了無法用協同模型糾正的非標準結合。在這些情況下，當參數調整至90%的置信區間而不是95%的置信區間時，Kd的下限確實會得以解析。

	BsAb001	BsAb002	BsAb003	BsAb004	BsAb005	BsAb006	Ab008
Kd	1.06 pM	2.51 pM	1.33 pM	388 fM	315 fM	306 fM	3,73 pM（有效）
95%置信區間	560 fM- 1.68 pM	1.47 pM – 3.86 pM	550 fM-2.47 pM	69.0 fM – 1.02 pM	106 fM – 623 fM *	22.1 fM -845 fM	3.24 pM – 4.28 pM
濃度計算所針對的是：	BsAb001	IL13	BsAb003	BsAb004	BsAb005	BsAb006	Ab008
活性度	74.6%	54.8%	77.8%	64.2%	71.9%	87.5%	75.8%
95%置信區間	69.4%- 80.0%	50.2%- 59.9%	66.4%- 89.3%	58.0%- 70.7%	61.6%- 83.6%	76.0%- 100%	63.3%- 89.4%
希爾係數	-	-	-	-	-	-	1.98
95%置信區間	-	-	-	-	-	-	1.80-2.00
結合速率(on rate，M-1 s-1)	8.28 x105	4.40 x105	5.57 x105	5.34 x106	5.71 x106	2.42 x106	2.23 x106
95%置信區間	7.74 x105-8.84 x105	4.25 x105 -4.55 x105	5.50 x105- 5.63 x105	4.94 x106- 5.83 x106	5.22 x106-6.30 x106	2.16 x106-2.72 x106	1.75 x106-2.84 x106
解離速率(off rate，s-1)	8.77 x107	1.11 x106	7.40 x107	2.07 x106	1.79 x106	7.41 x107	8.33 x106

*該曲線以置信區間90解析

希爾係數；通常用作協同程度的經驗量度，且對參比抗體Ab008估計了95%置信區間。

3）通過SPR分析OX40L臂的結合親和力

使用多循環動力學SPR（運行Biacore InsightEvaluation Software Instrument V 3.0.12.15655的Biacore 8K）定量對人OX40L的親和力，以抗體的平衡解離常數（K_D）表示。在運行緩衝液（含BSA的HBS-P）中稀釋至1.0 μg/mL的抗體在蛋白A感測器晶片（貨號29127555）上被捕獲至~300 RU。OX40L（Acro Biosystems OXL-H52Q8）的細胞外結構域用作分析物，其形式為室溫下從0.781 nM至50 nM的7點2倍稀釋系列。該實驗獨立重複3次。採用1:1擬合模型和雙參比扣除法進行分析。結果如圖2和下表所示。

	n=1*	n=2	n=3
樣品編號	KD(M)	RMAX (RU)	Rel. KD	KD(M)	RMAX(RU)	Rel.KD	KD(M)	RMAX(RU)	Rel.KD
Ab009	4.15E-10	93.7	-	3.47E-10	89.6	-	3.25E-10	88.9	-
BsAb001**	1.38E-09	43.5	1.03	1.59E-09	45.1	1.21	1.54E-09	45.7	1.31
BsAb002	1.09E-08	40.4	8.13	1.19E-08	33.7	9.08.	1.30E-08	39.5	11.02
BsAb003**	1.85E-09	47.5	1.38	1.37E-09	44.6	1.05	2.34E-09	49	1.98
BsAb004	1.98E-09	38.1	1.48	2.49E-09	47	1.90	2.51E-09	47.8	2.13
BsAb005**	3.90E-09	50.4	2.91	2.90E-09	54.3	2.21	2.89E-09	53.6	2.45
BsAb006	7.10E-09	42.7	5.30	8.65E-09	38.4	6.60	1.08E-08	49.2	9.15
BsAb007	1.34E-09	49.5	1.00	1.31E-09	49	1.00	1.18E-09	49	1.00

*n=1數據

**資料不嚴格吻合1:1結合動力學模型

所示為與BsAb007相比的相對K_D。

4）用表達OX40L的CHO細胞通過FACS分析測定OX40L臂的結合親和力。

使用表達人OX40L的CHO細胞，通過流式細胞術定量雙特異性抗體對細胞膜上表達的人OX40L的親和力，以平衡解離常數（K_D）表示。為此，將每孔100000個細胞（位於180µl培養基中）接種在96孔板中。為了減少非特異性訊號，在室溫（RT）下，在10分鐘內，加入2µl FcR阻斷劑（130-059-901，Miltenyi）。然後，在室溫下加入20µl劑量反應（範圍為90µM至13.7 pM，終濃度）的抗體30分鐘。洗滌細胞，並且使用與AF647偶聯的多株抗-IgG H+L抗體30分鐘，對該抗體進行檢測。洗滌細胞，並且使用碘化丙啶在流式細胞儀中分析該細胞的細胞活力。該實驗獨立重複3-4次。使用單位點特異性結合方程（GraphPad）進行K_D計算。BsAb001、BsAb002、BsAb003和BsAb005具有最低K_D（1-2 nM）的最高結合親和力（見圖3和下表）。圖3顯示雙特異性抗體在與CHO細胞表達的膜OX40L結合時的K_D。每個點都顯示獨立實驗的資料。柱狀圖顯示三至四個獨立實驗的算術平均值±SD。柱狀圖上方的數字表示算術平均值。

BsAb001、BsAb002、BsAb003和BsAb005的K_D類似於原型BsAb007（1-2nM），並且高於參比抗體Ab009約7倍（見圖3和下表）。BsAb004和BsAb006具有最低的親和力和最高的K_D（見圖3和下表）。

BsAb004的K_D約為8 nM，高於原型BsAb007約3.6倍，高於Ab009約46倍（圖3柱狀圖和下表）。由於沒有觀察到結合飽和度，因此無法計算BsAb006的K_D（見圖3和下表）。

	KD(nM) CHO-OX40L流
n=1	n=2	n=3	n=4
Ab009	0.09	0.12	0.26	0.14
BsAb001	2.2	1.8	1.35
BsAb002	1.39	1	0.82
BsAb003	1.44	1.4	1.13
BsAb004		6	5.2	14
BsAb005		2	1.02	0.97
BsAb007	3.2	0.46	3.5

5）用HUVEC細胞通過FACS分析測定OX40L臂的結合親和力

通過流式細胞術定量BsAb001、BsAb002和BsAb003對天然表達於HUVEC細胞系（人臍靜脈內皮細胞）上的人OX40L的親和力，以平衡解離常數（K_D）表示。方法：將180µl培養基中的細胞接種在96孔板中。為了減少非特異性訊號，在室溫（RT）下，在10分鐘內，加入2.5 µl FcR阻斷劑（130-059-901，Miltenyi）。然後，在室溫下加入20µl劑量反應（範圍為90µM至13.7 pM，終濃度）的抗體30分鐘。洗滌細胞，並且使用與AF647偶聯的多株抗-IgG H+L抗體30分鐘，對該抗體進行檢測。使用活/死染色試劑eFluor780評估細胞活力。該實驗獨立地重複兩到三次。使用單位點特異性結合方程（GraphPad）進行K_D計算。結果如圖4所示：雙特異性抗體在與HUVEC細胞天然表達的膜OX40L結合時的K_D。每個點都顯示獨立實驗的資料。柱狀圖顯示兩到三個獨立實驗的算術平均值±SD。柱狀圖上方的數字表示算術平均值。BsAb001、BsAb002和BsAb003與膜OX40L結合時的K_D類似於原型BsAb007（0.5-2 nM）。

實施例5——雙特異性分子的阻斷效力

1）通過雙特異性抗體的IL-13阻斷效力

使用HEK Blue™ IL4/IL-13細胞（Invivogen，cat. # hkb-il413）——其用rhIL-13（來自Sino Biological的重組人IL-13，cat.#LS10369-HNAC）刺激，以活化STAT6通路——且通過報告基因分析，評估雙特異性抗體的IL-13阻斷效力。將在24µl檢測培養基中的25000個HEK Blue™ IL4/IL-13細胞/孔，接種於384孔板中並培育2小時。然後將20µl劑量反應（最終濃度範圍為2 nM至4 pM）的雙特異性抗體——其與rhIL-13（以其EC80）預培育30分鐘——或單獨的rhIL-13加入細胞中。將細胞培育過夜後，收穫10µl培養上清液，並且使用QUANTI Blue試劑培育2小時。通過吸光度（在635nm處）測量STAT6活性。由不同抗體濃度下獲得的IL-13訊號傳導抑制百分比曲線（見圖5）計算IL-13訊號傳導的阻斷效力（絕對IC₅₀）。圖5是%抑制的圖表。它顯示了使用IL-13-STAT6報告基因分析所獲得的不同的BsAb的IL-13效力曲線的代表性%抑制。所示資料來自三個獨立實驗中的一個（n1）。相對於單獨使用IL-13觀察到的活性，計算IL-13訊號傳導抑制的百分比。所有雙特異性抗體的IL-13阻斷效力（IC₅₀）均在50-250pM範圍內（下表和圖5）。與參比抗體Ab008（~100 pM）相比，具有外部抗IL-13臂的雙特異性抗體（BsAb004、BsAb005和BsAb006）的IL-13阻斷效力非常相似（下表和圖6）。圖6是一張柱狀圖，顯示了根據三個獨立實驗中完成的%抑制曲線所計算的抗體的絕對IL-13阻斷IC₅₀。每個點都顯示獨立實驗的資料。柱狀圖顯示三個獨立實驗的算術平均值±SD。

與參比抗體Ab008相比，具有內部抗IL-13臂的雙特異性抗體的IL-13阻斷效力低約2倍（下表和圖6）。

	絕對IC50（pM）或2nM時的%抑制
抗體	n1	n2	n3	平均值	SD
Ab008	66	139	79	95	39
Ab009	6%	-	10%	8%	3%
同種型對照IgG4	13%	22%	3%	13%	10%
BsAb的同種型對照	16%	25%	1%	14%	12%
BsAb001	135	171	208	171	37
BsAb002	170	218	254	214	42
BsAb003	139	189	231	186	46
BsAb004	72	115	121	103	27
BsAb005	68	106	114	96	25
BsAb006	58	82	75	72	12
BsAb007	144	253	281	226	72
根據三個獨立實驗（n1、n2和n3）中完成的%抑制曲線及其算術平均值和標準差（SD）計算得出抗體的絕對IC50或在最高濃度（2nM）下的%抑制。

2）抗OX40L臂飽和後的雙特異性抗體的IL-13阻斷效力。

如上所述，使用HEK-Blue™ IL4/IL-13細胞（Invivogen, cat.# hkb-il413）——其用rhIL-13（來自Sino Biological的重組人IL-13，cat.#LS10369-HNAC）刺激，以活化STAT6通路——且通過報告基因分析，評估雙特異性抗體在與可溶性OX40L結合後的IL-13阻斷效力。

如上所述進行測定，包括在進行劑量反應稀釋之前使用最高濃度（2nM）的雙特異性抗體與200nM或20nM可溶性人OX40L（Sigma，cat #SRP0571）預先培育5分鐘。通過模擬BsAb至OX40L的結合動力學，預測200 nM OX40L在5分鐘內有效飽和2 nM BsAb的兩個OX40L臂。

在預測的飽和濃度下，雙特異性抗體的IL-13阻斷效力不受預先與OX40L結合的影響（圖7）。圖7是一張柱狀圖，顯示了在指定濃度下預先結合OX40L的抗體的絕對IL-13阻斷IC₅₀。IC₅₀由IL-13-STAT6報告基因分析完成的IL-13效力抑制曲線計算。每個點都顯示獨立實驗的資料。柱狀圖表示兩個（OX40L 200 nM）或三個（無OX40L和20 nM的OX40L）獨立實驗的算術平均值±SD。

3）OX40L阻斷效力（OX40報告基因分析）。

使用來自Promega的OX40生物測定法（JA2195）評估雙特異性抗體的OX40L阻斷效力，該方法包括使用被過表達人OX40L的CHO細胞刺激的OX40效應Jurkat T細胞。

於384孔板中每孔接種20000個OX40效應細胞在20µl測定培養基-5% FBS中，並培育過夜。第二天，將20µl劑量反應（範圍為400 nM至0.2 pM，終濃度）的抗體——用過表達OX40L（在其EC80）的CHO細胞預培育30分鐘——加入效應細胞中。培育5小時後，向測定中加入20µl Bio-Glo發光試劑，以檢測效應細胞中的OX40活性。

根據不同抗體濃度下獲得的OX40訊號傳導抑制百分比曲線計算OX40L的阻斷效力（絕對IC₅₀）。見圖8，這是%抑制圖，顯示了使用OX40報告基因分析針對不同BsAb獲得的OX40效力曲線的代表性%抑制。所示資料來自三個獨立實驗中的一個（n1）。相對於單獨的過表達OX40L的CHO細胞觀察到的活性，計算OX40訊號傳導抑制的百分比。

除BsAb006外，所有雙特異性抗體的OX40阻斷效力絕對IC₅₀在3-5nM範圍內，類似於參比抗體Ab009（下表和圖9）。圖9是一張柱狀圖，顯示了根據兩或三個獨立實驗中完成的%抑制曲線計算出的抗體的絕對OX40L阻斷IC₅₀。每個點都顯示獨立實驗的資料。柱狀圖顯示獨立實驗的算術平均值±SD。與參比抗體Ab009相比，BsAb006的OX40阻斷效力明顯降低。與Ab009相比，BsAb004顯示出一定程度的阻斷效力衰減。

	絕對IC50（nM）或400nM時的%抑制
	n1	n2	n3	平均值	SD
同種型對照IgG4	27%	17%	N/A	22.00%	7.07%
BsAb的同種型對照	-33%	-9%	N/A	-21.00%	16.97%
BsAb001	3.42	4.27	2.53	3.41	0.87
BsAb002	4.56	3.52	N/A	4.04	0.74
BsAb003	3.26	4.24	2.40	3.30	0.92
BsAb004	5.40	9.59	3.77	6.25	3.00
BsAb005	5.21	4.32	N/A	4.77	0.63
BsAb006	9.08	46.40	6.56	20.68	22.31
BsAb007	2.90	3.86	1.87	2.88	0.99
Ab008	-19%	1%	N/A	-9%	14%
Ab009	4.36	5.55	3.34	4.42	1.11
根據三個獨立實驗（n1、n2和n3）中完成的%抑制曲線及其算術平均值和標準差計算得出抗體的絕對IC50或在最高濃度（400 nM）下的%抑制。 N/A表示不適用，因為n3實驗僅使用一部分抗體進行。 BsAb的同種型對照是FIT-Ig形式的分子，與候選者具有相同的人IgG1恆定區序列（即，包括YTE和LALA突變），但具有已知不與任何人蛋白質結合的抗原結合結構域。

4）IL-13臂飽和後的OX40L阻斷效力。

如上所述，使用來自Promega報告基因分析的OX40生物測定法評估雙特異性抗體在預先結合IL-13後的OX40L阻斷效力。

如上所述進行該測定，包括在進行劑量反應的稀釋之前使用最高濃度（400 nM）的雙特異性抗體與120 nM或1200 nM的人IL-13預先培育5分鐘。通過模擬BsAb至IL-13的結合動力學，預測1200 nM IL-13在5分鐘內完全飽和400nM BsAb的兩個IL-13臂。

在預測的飽和濃度下，雙特異性抗體的OX40L阻斷效力不受預先與IL-13結合的影響（見圖10）。圖10是一張柱狀圖，顯示了在指定濃度下預先結合IL-13的抗體的絕對OX40L阻斷IC₅₀。IC₅₀由OX40基因報告分析完成的OX40效力抑制曲線計算。每個點都顯示獨立實驗的資料。柱狀圖顯示兩個獨立實驗的算術平均值±SD。

實施例6：雙特異性分子與獼猴蛋白質的結合親和力和阻斷效力

通過動力學排斥試驗（KinExA）和來自Sino Biology的重組人IL-13作為結合配偶體（10369-HNAC），使用KinExA 4000 S/N:4004儀器（Sapidyne Instruments GmbH，Hanover，Germany），對雙特異性抗體與獼猴IL-13（Sino Biological，11057-CNAH）的結合親和力進行畫像，類似於之前在實施例4.2中解釋的。樣品在含有1mg/mL BSA和0.02%NaN₃的PBS中製備。對測量資料進行最小二乘分析，以將Kd和抗體活性的最佳解決方案擬合至代表1:1可逆雙分子相互作用的曲線。結果如下表所示，並與人IL-13的結果進行了比較。

使用多循環動力學SPR（運行Biacore Insight評估軟體儀器V 3.0.12.15655的Biacore 8K）定量對獼猴OX40L的親和力，以抗體的平衡解離常數（K_D）表示。在運行緩衝液（含BSA的HBS-P）中稀釋至1.0μg/mL的抗體在蛋白質A感測器晶片（貨號29127555）上被捕獲至~300 RU。OX40L的細胞外結構域（Acro Biosystems OXL-H52Q8用於人蛋白，OXL-C5243用於猴蛋白（Cyno））用作分析物。以運行緩衝液進行八點兩倍稀釋（範圍為50 nM至0.39 nM的人OX40L，以及範圍為100 nM至0.78 nM的獼猴OX40L）。對於每種濃度，締合相被監測240秒，並且解離相被測量900秒，並裁剪至500秒以改進擬合。該實驗獨立重複3次。採用1:1擬合模型和雙參比扣除法進行分析。結果如下表所示，並與人OX40L的結果進行了比較。

	KD（M）（通過Kinexa測量）	KD（M）（通過SPR測量）
	hIL-13	cyno IL-13	hOX40-L	cyno OX40-L
BsAb001	1.06E-12	＜1.13E-12	1.38E-09	3.9E-09

BsAb001以相似的效力（在10倍以內）結合人和獼猴屬IL-13和OX40-L。

使用HEK-Blue™ IL4/IL-13細胞（Invivogen，cat.#hkb-il413）——其用（來自Sino Biological的重組人IL-13，cat.#LS10369-HNAC）或rcIL-13（來自Sino-Biological的重組獼猴IL-13，cat.#11057-CNAH）刺激，以活化STAT6通路——且通過報告基因分析，評估雙特異性抗體的IL-13阻斷效力。在這兩種情況下，雙特異性抗體與rhIL-13或rcIL-13預培育30分鐘，然後將24µl混合物加入預先接種於384孔板中的24µl  25000個HEK-Blue™ IL4/IL-13細胞/孔中，並在37℃、5%CO₂下培育24小時。然後將10µl上清液與40µl QUANTI-Blue™ 溶液在37℃、5% CO₂下培育2小時，然後使用分光光度計（EnSight/Revivity）在635 nm下測定SEAP水平。雙特異性抗體的劑量反應濃度範圍為2nM至3pM。

下表顯示了兩個獨立實驗的結果。

	絕對IC50（pM）或2 nM時的%抑制
	hIL13	cIL13
抗體	平均值	SD	平均值	SD
Ab008	100.0	25.4	159.0	55.2
Ab009	2%	1%	1%	2%
BsAb002	213.6	69.9	194.3	78.6
BsAb003	190.0	31.2	149.7	96.7
BsAb001	214.9	45.9	142.1	81.9
BsAb004	107.1	26.0	143.8	59.7
BsAb006	63.3	5.8	111.7	60.1
BsAb005	93.4	33.5	144.0	60.4
根據兩個獨立實驗中完成的%抑制曲線計算得出抗體的絕對IC50或最高濃度（2 nM）下的抑制百分比。顯示了算術平均值和標準差（SD）。

使用來自Promega的OX40生物測定法（JA2195）評估雙特異性抗體的OX40L阻斷效力，該方法包括使用被過表達人OX40L的CHO細胞（來自Wuxi的CHO-W3789F2培養基）或被過表達獼猴OX40L的HEK-293細胞（來自Wuxi的Flpin293-W3789獼猴）刺激的OX40效應Jurkat T細胞。在這種情況下，將20µl 20000 OX40效應細胞接種於384孔板中，並在37℃、5%CO₂下培育24小時。第二天，將雙特異性抗體與CHO-hOX40L細胞或HEK-cOX40L細胞預培育30分鐘，然後將20µl混合物加入20µl效應細胞中，並在37℃、5% CO₂下培育5小時。然後將20µl Bio-Glo試劑加入到測定中，並在Luminoskan（Thermo）中讀取發光。添加OX40L會誘導OX40通路活化的發光，這種發光可以以劑量依賴的方式檢測到。

下表顯示了兩個獨立實驗的結果。

	絕對IC50（nM）或400 nM時的%抑制
	hOX40L	cOX40L
抗體	平均值	SD	平均值	SD
Ab008	3%	7%	-16%	1%
Ab009	2.7	0.6	2.5	0.0
BsAb002	2.9	0.1	3.9	0.1
BsAb003	2.8	0.7	3.6	0.1
BsAb001	3.2	1.7	2.8	0.1
BsAb004	4.9	3.0	5.6	1.0
BsAb006	7.3	4.9	8.5	0.4
BsAb005	4.4	1.7	4.2	0.1
根據兩個獨立實驗中完成的%抑制曲線計算得出抗體的絕對IC50或最高濃度（400 nM）下的抑制百分比。顯示了算術平均值和標準差（SD）。

實施例7——雙特異性分子中的兩個靶標結合臂的同步功能

在細胞系統中評估了兩個臂（IL-13和OX40L）的同步功能，在該細胞系統中PBMC（來自對DerP1有反應的過敏供體）與MRC5細胞（成纖維細胞）和A549細胞（上皮細胞）共培養。使用含有DerP1蛋白的屋塵蟎（Dermatophagoides pteronyssinus，DerP）刺激培養物。DerP刺激誘導了IL-13和IL-5通過PBMC在這些培養物中的產生。在該系統中，IL-5的產生由OX40L-OX40軸控制。測量雙特異性抗體對IL-5產生的抑制作用，以評估OX40L臂的功能。IL-13通過上皮細胞觸發嗜酸細胞活化趨化因子-3（Eotaxin-3）產生。測量雙特異性抗體對嗜酸細胞活化趨化因子-3產生的抑制作用，以評估IL-13臂的功能。

方法：將100µl無血清樹突狀細胞基礎培養基中的12500個MRC5細胞/孔和12500個A549細胞/孔接種於96孔板中並培育過夜。第二天，將20µl劑量反應（最終濃度範圍為0.1µM至0.01 pM）的抗體加入板中30分鐘。然後，將200000個過敏PBMC/孔在40µl的檢測培養基中加入，然後加入20µl含有DerP提取物的培養基。將培養物培育6天，並且收集上清液用於隨後對嗜酸細胞活化趨化因子-3和IL-5的ELISA分析。每種情況都進行了三次技術試驗。顯示了來自2-3個供體的資料。

結果：結果如圖11和12所示。圖11顯示BsAb（BsAb001、BsAb002和BsAb003）和參比抗體Ab008（aIL-13）和Ab009（aOX40L）在三元共培養（triculture）系統中的嗜酸細胞活化趨化因子-3和IL-5抑制畫像。相對於未接受抗體的未刺激（底部）和DerP刺激（頂部）對照樣品計算抑制百分比。所表示的資料是使用每個供體測定的三份平行樣本的算術平均值±平均值標準誤差（SEM）。所示資料來自2-3個不同供體。圖12顯示了三元共培養系統中抗體對嗜酸細胞活化趨化因子-3產生的阻斷效力（IC₅₀）。每個點都顯示來自一個獨立實驗的資料。柱狀圖顯示三個獨立實驗的算術平均值±SD。

BsAb001、BsAb002和BsAb003顯示出完全的嗜酸細胞活化趨化因子-3抑制作用，其功能水平與參比抗體Ab008、Ab008/Ab009組合或雙特異性抗體BsAb007類似。通過阻斷OX40L而非阻斷IL-13來選擇性抑制IL-5的事實，已通過使用Ab009與Ab008處理得到證實（圖11）。與Ab009、Ab009/Ab008組合或雙特異性抗體BsAb007相比，BsAb001、BsAb002和BsAb003顯示出類似的IL-5抑制作用。這些資料顯示，OX40L臂對於所有3種被測雙特異性抗體都是功能性的。

總之，這些結果表明，在使用與上皮細胞和成纖維細胞共培養的人過敏PBMC的複雜細胞測定中，BsAb001、BsAb002和BsAb003在阻斷IL-13和OX40L及隨後抑制嗜酸細胞活化趨化因子-3和IL-5的產生方面，與參比抗體Ab008和Ab009相比，具有類似的功能水平。這些結果證實了治療特應性皮炎、以及廣泛的免疫性疾病適應症的治療潛力。

實施例8——通過IL13Ra2受體的雙特異性分子的內化

使用A375細胞評估BsAbs在與IL-13結合時的通過IL13Ra2受體的內化。使用Incucyte®人Fabfluor-pH紅色抗體標記試劑（Incucyte® Human Fabfluor-pH Red Antibody Labeling Reagent）（Sartorius，4722）標記抗體，並使用等量的IL-13（Sinobiological，10369-HNAC）預培育。從50nM到22pM進行劑量反應。在Incucyte®活細胞分析系統（Incucyte® Live-Cell Analysis System）中分析A375細胞的內化。培養48h後分析內化效率。所有BsAb均顯示出類似內化效率（EC₅₀）且與參比抗體Ab008相當（下表和圖13）。當沒有預先進行IL-13預培育時，BsAbs均未被內化。圖13顯示了抗體內化試驗 + IL-13（與樣品濃度相同）的結果（總紅色對象面積）。記錄48小時的資料，然後由安裝在Incucyte上的資料處理軟體進行自動分析。資料代表48小時時的總紅色對象面積（μm2/圖）±SEM（n=2）。

log（促效劑）與反應——可變斜率（四個參數）
最佳擬合值
	BsAb001	BsAb002	BsAb003	BsAb004	BsAb005	BsAb006	Ab008
底部	-1712	-1398	-1689	-2212	-1139	-1148	-1638
頂部	403101	475941	466829	438235	329039	387222	238135
LogEC50	0.5911	0.578	0.5515	0.481	0.5556	0.5494	0.6701
希爾斜率（HillSlope）	2.215	2.372	2.344	2.294	2.677	2.37	2.315
EC50	3.9	3.785	3.561	3.027	3.594	3.543	4.679
跨度	404813	477339	468518	440447	330179	388370	239773
根據圖13所示的總紅色對象面積測量值得出的內化研究的最佳擬合值總結

實施例9——雙特異性分子的安全性評估

1）通過OX40L進行反向訊號傳導

在THP-1細胞（ATCC，TIB-202）——其用LPS刺激，以促進巨噬細胞分化——中評估了雙特異性抗體在誘導OX40L訊號傳導方面的潛在促效劑活性。分析IL-6的產生以評估OX40L的活化。

使用100 ng/ml LPS或載體培育THP-1細胞24小時。在以300g離心5分鐘和2次PBS洗滌步驟後，將100µl培養基 + 1µl Fc阻斷劑（Invitrogen，31245）加入每個孔中1小時。在板離心和洗滌後，將抗體 +/- 多株抗-IgG抗體的劑量反應（終濃度範圍為2uM至31nM）用作抗藥物抗體（ADA）（Biorad，5211-8004）的代用品加入特定孔中。培育24小時後，通過離心收集培養基，並通過ELISA評估IL-6水平。

即使在存在多株抗IgG抗體（用作ADA的代用品）的情況下，BsAb也均未在THP-1細胞中誘導OX40L介導的訊號傳導（其導致IL-6產生）。相比之下，使用重組OX40-Fc分子作為陽性對照，觀察到IL-6有效產生（圖14）。圖14顯示了THP1細胞系的刺激，測量為與單獨LPS相比的IL-6產生的增加。所示資料為兩次獨立實驗中每三個平行樣本所獲得的值的平均值±SD。

2）健康供體PBMC的細胞因子釋放試驗。

為了評估急性細胞因子釋放症候群的潛在風險，將10名健康人血供體的人PBMC與抗體共培養，並且48小時後測量細胞因子釋放。

方法：將來自10名健康血液供體的人PBMC（100000個細胞/孔）在100µl培養基中培養，培養基中含有每種BsAb、參比抗體Ab008和Ab009、陽性/陰性對照（抗CD3 OKT3板結合併可溶的濃度為2ug/mL，並且OX40 Fc的濃度與BsAb相同）或陰性對照（單獨的PBMC和Fab串聯形式同種型）的50µl劑量反應（範圍為0.2 nM至2µM，終濃度）。48小時後，收集上清液，用於通過Luminex後續分析細胞因子（ProcartaPlex™ Panel 21 Storm：G-CSF、GM-CSF、IFNa、IFNg 、IL-1b、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-17A、IL-18、IP-10、MCP-1、MIP-1 alfa、MIP-1 beta、TNFa、TNFb）。

結果：在使用BsAb001-006培育的PBMC中檢測到的細胞因子量始終低於參比抗體Ab008和Ab009的檢測量。此外，在所有樣本中均未觀察到BsAb001-006濃度與細胞因子釋放呈正相關。因此，這些資料未預測急性細胞因子釋放症候群的高風險。

實施例10——雙特異性分子的熱應力/穩定性評估

測試樣品在50℃的培養箱中經受7天的熱應激並用SEC-UPLC和cIEF進行分析，以監測0、1、2、4和7天後的聚集和電荷變化。代表性結果如圖15所示。在熱處理過程中，BsAb004-006觀察到不同的結構變化（即朝向HMWS形成肩峰），這可能是結構重折疊或二聚化。在BsAb001-003中沒有觀察到該重折疊/二聚化的趨勢。熱處理中最穩定的候選者是BsAb003。

實施例11：Tg小鼠的藥代動力學和藥效學研究

通過單次靜脈注射將總共三種本發明的雙特異性分子以10mg/kg的劑量水平施用給表達人FcRn受體的雄性轉基因小鼠（scid FcRn-/- hFcRn [32] Tg小鼠, The Jackson Laboratory, USA）（每種化合物n=4隻動物）。

在延長的一段時間內，應用微量取樣技術進行連續血液取樣，以捕獲給定動物的完整PK曲線，因為它提供了更確鑿的PK參數計算，並有助於檢測加速的抗藥物抗體相關的全身清除率。在28天內，從每隻動物身上採集了13個血清樣本，並使用配體結合測定法對候選者的濃度進行了定量。濃度-時間曲線如圖16所示（顯示了平均值）。使用非房室分析（non-compartmental analysis）計算相應的PK參數。

生物分析方法

開發了一種配體結合測定法，用於測定小鼠血清中的候選者。試驗以夾心法形式進行，建立在MesoScale Discovery（MSD）平台上，該平台倚賴通過電化學發光檢測複合分析物；與傳統的光度檢測ELISA相比，該檢測方法提供了更高的靈敏度和更寬的動態範圍。利用雙特異性結構中的兩個功能，通過使用重組人OX40L包被微量滴定板，開發了一種靶向特異性測定法來測量游離藥物。在血清樣品中捕獲分析物後，加入生物素化的重組人IL-13進行絡合。然後加入鏈黴親和素標記的磺基標籤（Sulfo-tag），並將板載入到MSD上進行讀取。該測定能勝任評估以下性能參數：基質中分析物的測定範圍、試驗內和試驗間的準確性、定量限度、選擇性、稀釋線性和鉤狀效應（hook effect），以及長期穩定性。

結果

如圖16和下表所示，候選者均不顯示出加速的清除，並且觀察到三種雙特異性分子的半衰期相似。

化合物	統計	Cmax	AUC0-inf	CL	Vss	t1/2
(µg/mL)	(天*µg/mL)	(mL/天/kg)	(mL/kg)	(天)
BsAb002	平均值	249	2030	5.0	113	16
SD	50	269	0.77	12	2.1
BsAb003	平均值	290	2770	3.6	94	17
SD	36	299	0.44	14	0.8
BsAb001	平均值	257	2760	3.7	94	17
SD	52	392	0.47	18	3.6

將小鼠PK資料擬合至房室模型中，並進行異速生長標度，從而預測人類半衰期為18-25天。

實施例12. NHP的藥代動力學和藥效學研究

對於非臨床研究，本發明的雙特異性分子之一被選作治療候選者（以下稱為候選者）。

本研究的目的是：在連續4周、每週一次對食蟹猴（Cynomolgus monkey）（Macaca fascicularis）靜脈注射（30分鐘輸注）給藥時，評估候選者的毒性，並確定其藥代動力學和藥效學特性。基於人和獼猴IL-13和OX40L蛋白之間的高序列同一性（分別為94.7%和98.91%），以及本發明的雙特異性分子對獼猴蛋白的交叉反應性（如實施例6所示），選擇非人靈長類獼猴作為藥理學和非臨床安全性測試的物種。

此外，為了評估候選者對免疫系統功能的影響，通過體內T細胞依賴性抗體反應（TDAR）和遲發型超敏反應（DTH）測試評估了細胞和體液免疫反應。

研究設計如下表所示：

組別編號	試驗材料	劑量水平（mg/kg/adm）	給藥天數	主要研究
動物數量
雄性	雌性
1	載體對照	0	1，8，15，22	4	-
2	候選者	3	1	3	-
3	0.1	1，8，15，22	4	-
4	1	4	-
5	10b	4	-
6	30b	1	1
7	100b	1	1

- = 不適用；

b交錯給藥起始

在所有的或選定的組中評估了以下毒性參數和終點：死亡率、臨床觀察、注射部位的局部反應、體重、攝食量、心電學、臨床病理參數（血液學、凝結、臨床化學）、器官重量，以及宏觀和微觀檢查。對所有組的毒代動力學參數進行了評估。

通過TDAR（抗KLH和抗TTx IgG和IgM）、PBMC的免疫表型、ELISPOT（IFN-γ和IL-4）、DTH，包括對KLH和TTx攻擊的皮膚部位活檢的臨床評分、組織病理學、免疫組織化學和RNA測序，分析第1組和第3組至第5組對KLH和TTx免疫的免疫反應。

在任何劑量水平下，候選給藥均未出現計畫外的死亡、臨床症狀、注射部位的局部反應、體重、攝食量、心電圖、臨床病理參數、器官重量、宏觀或微觀變化。

給藥後，所有治療組的血清中都檢測並定量了候選者，其中的例外是第3組（0.1mg/kg）在第22天採集的所有樣本均＜LLOQ。因此，在這項毒代動力學研究中測量的血清水平證實了動物在研究期間全身暴露於藥物。對照組所有分析樣本的血清濃度均是＜LLOQ。

每週一次30分鐘靜脈輸注後（第3組至第7組），大多數動物在輸注時間結束時（0.5小時）出現了候選者的最高血清濃度，儘管在一些動物中t_max略有延遲。一般來說，暴露參數C_max和AUC_{（ 0-τ ）}的增加在1至100mg/kg之間呈劑量比例。重複給藥後觀察到一些積累，因為平均（第3組至第5組）或個體（第6組和第7組）積累率在1.3至3.2之間。

總之，食蟹猴在第1天、第8天、第15天和第22天以0.1mg/kg/adm、1mg/kg/adm、10mg/kg/adm、30mg/kg/adm或100mg/kg/adm的水平靜脈輸注給藥候選者30分鐘時，耐受性良好。

最相關的藥理作用如下。1mg/kg/adm和/或10mg/kg/adm的劑量與體液反應的降低有關，正如在免疫接種後第21天和第28天時使用1mg/kg/adm和10mg/kg/adm的劑量治療下的抗KLH IgM和IgG的劑量相關性降低、以及在1mg/kg/adm和10mg/kg/adm劑量下的TTx特異性IgM和IgG血清水平降低所觀察到的。

以1mg/kg/adm和10mg/kg/adm的劑量使用候選藥物進行治療，導致免疫細胞反應減少，這可以通過不同的指標來觀察到。首先，由於治療，血液中幾種免疫細胞群的頻率降低。活化和增殖的NKT細胞、活化和增殖的NK細胞、增殖輔助性T中樞記憶（hTCM）細胞、增殖輔助性T效應記憶（hTEM）、增殖細胞毒性T中央記憶（cTCM）、活化的細胞毒性T效應記憶細胞、調節性T細胞和記憶性B細胞都是這種情況。體外T細胞活化試驗證實了T細胞反應性降低的趨勢，因為使用KLH和TTx對PBMC進行體外攻擊後，ELISPOT上IFNg和IL-4的釋放減少。

DTH為候選治療對皮膚的效應免疫反應的影響提供了見解。在顯微鏡水平上，與對照組動物的皮膚相比，1mg/kg和10mg/kg治療組的動物皮膚表現出較低的表皮增生評分和細胞浸潤評分（CD68+、CD3+、CD4+和CD8+細胞的減少）。在轉錄組水平和KLH攻擊的皮膚中，候選者10mg/kg劑量與對照組的對比顯示了對表皮分化、角質化和皮膚屏障功能相關通路的影響。在DTH資料集中，分析了IL-13特徵（由IL-13刺激的角質形成細胞在體外產生），結果表明，與對照相比，1mg/kg和10mg/kg組的IL-13特徵下調。

總之，1mg/kg和10mg/kg劑量的候選者治療有效地調節了食蟹猴KLH/TTx免疫誘導的體液和細胞反應。

圖17和下表顯示了三隻動物3 mg/kg劑量的藥代動力學。

參數	單位	平均值	SD
Cmax	µg/mL	95.5	15.7
tmax*	h	0.5	-
t1/2	h	281	59.6
λz	h-1	0.003	0.001
AUC(0-t)	µg/mL*h	23721	6650
AUC	µg/mL	24187	7225
CL	mL/h/kg	0.13	0.040
Vss	mL/kg	39.5	2.20
Vz	mL/kg	51.3	6.53

對於先前研究的第2組（單劑量和更長時間的藥代動力學評估採樣），血清濃度似乎呈雙指數下降。消除半衰期的平均值±SD估計值為11.7±2.5天（個體值為8.9至13.4天）。

來自NHP的異速生長標度預測人體半衰期約為18天，這與Tg鼠的異速生長標度一致，其預測人體半衰期為18-25天（實施例6）。

序列簡述

SEQ ID NOs: 1、2、3 = 分別為來瑞組單抗的CDRH1、CDRH2和CDRH3（Kabat）

SEQ ID NOs: 4、5、6 = 分別為10L15A的CDRH1、CDRH2和CDRH3（Chothia）

SEQ ID Nos：7、8、9 = 分別為10E23A的CDRH1、CDRH2和CDRH3（Chothia）

SEQ ID NOs: 10、11、12 = 分別為05P04A的CDRH1、CDRH2和CDRH3（Chothia）

SEQ ID NOs: 13、14、15 = 分別為來瑞組單抗的CDRL1、CDRL2和CDRL3（Kabat）

SEQ ID NOs: 16、17、18 = 分別為10L15A的CDRL1、CDRL2和CDRL3（Chothia）

SEQ ID NOs: 19、20、21 = 分別為10E23A的CDRL1、CDRL2和CDRL3（Chothia）

SEQ ID NOs: 22、23、24 = 分別為05P04A的CDRL1、CDRL2和CDRL3（Chothia）

SEQ ID NOs: 25、26 = 分別為來瑞組單抗的VH和VL

SEQ ID NOs: 27、28 = 分別為10L15A的VH和VL

SEQ ID NOs: 29、30 = 分別為10E23A的VH和VL

SEQ ID NOs: 31、32 = 分別為05P04A的VH和VL

SEQ ID NO: 33 = 示例性人IgG CH1

SEQ ID NO: 34 = 示例性人IgG Fc

SEQ ID NO: 35 = 示例性人輕鏈κ恆定區

SEQ ID NOs: 36-38，分別為BsAb001的FIT-Ig鏈1、2、3

SEQ ID NOs: 39-41，分別為BsAb003的FIT-Ig鏈1、2、3

SEQ ID NOs: 42-44，分別為BsAb002的FIT-Ig鏈1、2、3

SEQ ID NOs: 45-47，分別為BsAb004的FIT-Ig鏈1、2、3

SEQ ID NOs: 48-50，分別為BsAb006的FIT-Ig鏈1、2、3

SEQ ID Nos：51-53，分別為BsAb005的FIT-Ig鏈1、2、3

SEQ ID NOs: 54、55、56 = 分別為Amlitelimab的CDRH1、CDRH2和CDRH3（Kabat）

SEQ ID NOs: 57、58、59 = 分別為Amlitelimab的CDRL1、CDRL2和CDRL3（Kabat）

SEQ ID NOs: 60、61 = 分別為Amlitelimab的VH和VL

SEQ ID NOs: 62-64，分別為179的FIT-Ig鏈1、2、3

SEQ ID NOs: 65-82是實施例2中顯示的可替代的抗OX40L VH和VL序列

SEQ ID NOs: 83、84、85 = 分別為10L15A的CDRH1、CDRH2和CDRH3（Kabat）

SEQ ID NOs: 86、87、88 = 分別為10L15A的CDRH1、CDRH2和CDRH3（IMGT）

SEQ ID NOs: 89、90、91 = 分別為10E23A的CDRH1、CDRH2和CDRH3（Kabat）

SEQ ID NOs: 92、93、94 = 分別為10E23A的CDRH1、CDRH2和CDRH3（IMGT）

SEQ ID NOs: 95、96、97 = 分別為05P04A的CDRH1、CDRH2和CDRH3（Kabat）

SEQ ID NOs: 98、99、100 = 分別為05P04A的CDRH1、CDRH2和CDRH3（IMGT）

SEQ ID NOs: 101、102、103 = 分別為10L15A的CDRL1、CDRL2和CDRL3（Kabat）

SEQ ID NOs: 104、105、106 = 分別為10L15A的CDRL1、CDRL2和CDRL3（IMGT）

SEQ ID NOs: 107、108、109 = 分別為10E23A的CDRL1、CDRL2和CDRL3（Kabat）

SEQ ID NOs: 110、111、112 = 分別為10E23A的CDRL1、CDRL2和CDRL3（IMGT）

SEQ ID NOs: 113、114、115 = 分別為05P04A的CDRL1、CDRL2和CDRL3（Kabat）

SEQ ID NOs: 116、117、118 = 分別為05P04A的CDRL1、CDRL2和CDRL3（IMGT）

SEQ ID NO：119 = 示例性人輕鏈λ恆定區

無

圖1：測量示例性雙特異性分子與IL-13結合親和力的實驗的代表性結果。

圖2：測量示例性雙特異性分子與OX40L結合親和力的實驗的代表性結果。

圖3：測量示例性雙特異性分子與OX40L結合親和力的實驗的代表性結果。

圖4：測量示例性雙特異性分子與OX40L結合親和力的實驗的代表性結果。

圖5：測量示例性雙特異性分子的IL-13阻斷效力的實驗的代表性結果。

圖6：測量示例性雙特異性分子的IL-13阻斷效力的實驗的代表性結果。

圖7：測量示例性雙特異性分子的IL-13阻斷效力的實驗的代表性結果。

圖8：測量示例性雙特異性分子的OX40L阻斷效力的實驗的代表性結果。

圖9：測量示例性雙特異性分子的OX40L阻斷效力的實驗的代表性結果。

圖10：測量示例性雙特異性分子的OX40L阻斷效力的實驗的代表性結果。

圖11：表明示例性雙特異性分子的兩個臂是同時發揮功能的實驗的代表性結果。

圖12：表明示例性雙特異性分子的兩個臂是同時發揮功能的實驗的代表性結果。

圖13：表明示例性雙特異性分子通過IL-13Ra2受體的內化作用的實驗的代表性結果。

圖14：表明示例性雙特異性分子不通過OX40L產生促效作用的實驗的代表性結果。

圖15：測量示例性雙特異性分子在熱應力下的穩定性的實驗的代表性結果。

圖16：示例性雙特異性分子在Tg小鼠中的濃度-時間PK曲線的代表性結果。

圖17：示例性雙特異性分子在獼猴中的濃度-時間PK曲線的代表性結果。

TW202540204A_114103196_SEQL.xml

Claims (24)

1. 一種雙特異性抗原結合分子，其包含第一抗原結合結構域（A）和第二抗原結合結構域（B），所述第一抗原結合結構域（A）為IL-13抗原結合結構域，所述第二抗原結合結構域（B）為OX40L抗原結合結構域，並且其中所述雙特異性抗原結合分子特異性結合至IL-13和OX40L二者，並且拮抗來自IL-13R的IL-13訊號傳導和來自OX40的OX40L訊號傳導二者；並且其中B是包含三個重鏈互補決定區序列（CDR：CDRH1、CDRH2和CDRH3）和三個輕鏈CDR（CDRL1、CDRL2、CDRL3）的抗體或其抗原結合片段，其為：a) CDRH1: SEQ ID NO: 86，CDRH2: SEQ ID NO: 87，CDRH3: SEQ ID NO: 88；和CDRL1: SEQ ID NO: 104，CDRL2: SEQ ID NO: 105，CDRL3: SEQ ID NO: 106；b) CDRH1: SEQ ID NO: 92，CDRH2: SEQ ID NO: 93，CDRH3: SEQ ID NO: 94；和CDRL1: SEQ ID NO: 110，CDRL2: SEQ ID NO: 111，CDRL3: SEQ ID NO: 112；或c) CDRH1: SEQ ID NO: 98，CDRH2: SEQ ID NO: 99，CDRH3: SEQ ID NO: 100；和CDRL1: SEQ ID NO: 116，CDRL2: SEQ ID NO: 117，CDRL3: SEQ ID NO: 118。
2. 如請求項1所述之雙特異性抗原結合分子，其中B包含重鏈可變區序列（VHB）和輕鏈可變區序列（VLB），其中：a）VHB是包含或由SEQ ID NO: 27或與其具有至少80%、90%、95%或99%胺基酸同一性的序列組成的多肽；VLB是包含或由SEQ ID NO: 28或與其具有至少80%、90%、95%或99%胺基酸同一性的序列組成的多肽；b）VHB是包含或由SEQ ID NO: 29或與其具有至少80%、90%、95%或99%胺基酸同一性的序列組成的多肽；VLB是包含或由SEQ ID NO: 30或與其具有至少80%、90%、95%或99%胺基酸同一性的序列組成的多肽；或c）VHB是包含或由SEQ ID NO: 31或與其具有至少80%、90%、95%或99%胺基酸同一性的序列組成的多肽；VLB是包含或由SEQ ID NO: 32或與其具有至少80%、90%、95%或99%胺基酸同一性的序列組成的多肽。
3. 如請求項1或2所述之雙特異性抗原結合分子，其中A是包含SEQ ID NO： 1、2和3的CDRH1、CDRH2和CDRH3；和SEQ ID NO: 13、14和15的CDRL1、CDRL2和CDRL3的抗體或其抗原結合片段。
4. 如請求項3所述之雙特異性抗原結合分子，其中A包含重鏈可變區序列（VHA）和輕鏈可變區序列（VLA），並且其中VHA是包含或由SEQ ID NO: 25或與其具有至少80%、90%、95%或99%胺基酸同一性的序列組成的多肽；並且VLA是包含或由SEQ ID NO: 26或與其具有至少80%、90%、95%或99%胺基酸同一性的序列組成的多肽。
5. 如前述請求項中任一項所述之雙特異性抗原結合分子，其中A和/或B包含或由抗體或其抗原結合片段組成，並且其中所述抗體較佳地為嵌合的、人源化的或人或抗體。
6. 如前述請求項中任一項所述之雙特異性抗原結合分子，其為下述雙特異性抗體，所述雙特異性抗體（a）包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恆定區，任選地人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恆定區；和/或（b）是：i）IgG樣雙特異性抗體；或ii）非IgG樣雙特異性抗體。
7. 如請求項6所述的雙特異性抗體，其包含人IgG1 Fc（可結晶片段）區序列，所述序列包含減少Fc受體結合的人野生型序列的修飾（任選地L234A/L235A（LALA）修飾）和/或增加血清半衰期的人野生型序列的修飾（任選地M252Y/S254T/T256E（YTE）修飾）。
8. 如請求項6或7所述之雙特異性抗體，其為下述IgG樣雙特異性抗體，即是：i）對稱IgG樣雙特異性抗體（例如，DVD-Ig雙特異性抗體或FIT-Ig雙特異性抗體）；或ii）非對稱IgG樣雙特異性抗體。
9. 如請求項8所述之雙特異性抗體，其為：（a）對稱IgG樣雙特異性抗體，其中A和B的相對位置使得A靠近分子的Fc區，並且B遠離Fc區；或（b）對稱IgG樣雙特異性抗體，其中A和B的相對位置使得B靠近分子的Fc區，並且A遠離Fc區；其中（a）是較佳的。
10. 如請求項9（a）所述之雙特異性抗體，其由三條多肽鏈組成，每條多肽鏈的結構域排列如下（N-C端）：鏈1：VHB-CH1；鏈2：VLB-CL-VHA-CH1-Fc；和鏈3：VLA-CL；或如請求項9（b）所述之雙特異性抗體，其由三條多肽鏈組成，每條多肽鏈的結構域排列如下（N-C端）：鏈1：VHA-CH1；鏈2：VLA-CL-VHB-CH1-Fc；和鏈3：VLB-CL；其中VHA、VLA、VHB和VLB各自是包含或由前述請求項中任一項所定義的序列組成的多肽；CH1是包含或由任何重鏈恆定結構域1（較佳地人IgG1）的序列組成的多肽，CL是包含或由任何輕鏈恆定結構域（較佳地人κ或λ）的序列組成的多肽；Fc是包含或由下述抗體（較佳地人IgG1）的任何Fc區的序列組成的多肽，所述抗體包含重鏈恆定結構域2和3（CH2和CH3），並且任選地包括請求項7中所定義的一個或多個修飾。
11. 如請求項10所述之雙特異性抗體，其包括：a) 鏈1：SEQ ID NO: 36；鏈2：SEQ ID NO: 37；鏈3：SEQ ID NO: 38；b) 鏈1：SEQ ID NO: 39；鏈2：SEQ ID NO: 40；鏈3：SEQ ID NO: 41；c) 鏈1：SEQ ID NO: 42；鏈2：SEQ ID NO: 43；鏈3：SEQ ID NO: 44；d) 鏈1：SEQ ID NO: 45；鏈2：SEQ ID NO: 46；鏈3：SEQ ID NO: 47e) 鏈1：SEQ ID NO: 48；鏈2：SEQ ID NO: 49；鏈3：SEQ ID NO: 50；或f) 鏈1：SEQ ID NO: 51；鏈2：SEQ ID NO: 52；鏈3：SEQ ID NO: 53。
12. 如請求項5所述之雙特異性抗原結合分子，其中所述雙特異性抗體包含抗體的可變結構域和T細胞受體（TCR）恆定區，其中TCR恆定區能夠形成包含至少一個非天然鏈間鍵的二聚體。
13. 一種OX40L特異性抗體或其抗原結合片段，其包含三個重鏈互補決定區序列（CDR：CDRH1，CDRH2和CDRH3）和三個輕鏈CDR（CDRL1，CDRL2和CDRL3），其為a) CDRH1: SEQ ID NO: 86，CDRH2: SEQ ID NO: 87，CDRH3: SEQ ID NO: 88；和CDRL1: SEQ ID NO: 104，CDRL2: SEQ ID NO: 105，CDRL3: SEQ ID NO: 106；b) CDRH1: SEQ ID NO: 92，CDRH2: SEQ ID NO: 93，CDRH3: SEQ ID NO: 94；和CDRL1: SEQ ID NO: 110，CDRL2: SEQ ID NO: 111，CDRL3: SEQ ID NO: 112；或c) CDRH1: SEQ ID NO: 98，CDRH2: SEQ ID NO: 99，CDRH3: SEQ ID NO: 100；和CDRL1: SEQ ID NO: 116，CDRL2: SEQ ID NO: 117，CDRL3: SEQ ID NO: 118。
14. 如請求項13所述之OX40L特異性抗體或其抗原結合片段，其包含重鏈可變區序列（VHB）和輕鏈可變區順序（VLB），其中：a）VHB是包含或由SEQ ID NO: 27或與其具有至少80%、90%、95%或99%胺基酸同一性的序列組成的多肽；並且VLB是包含或由SEQ ID NO: 28或與其具有至少80%、90%、95%或99%胺基酸同一性的序列組成的多肽；b）VHB是包含或由SEQ ID NO: 29或與其具有至少80%、90%、95%或99%胺基酸同一性的序列組成的多肽；VLB是包含或由SEQ ID NO: 30或與其具有至少80%、90%、95%或99%胺基酸同一性的序列組成的多肽；或c）VHB是包含或由SEQ ID NO: 31或與其具有至少80%、90%、95%或99%胺基酸同一性的序列組成的多肽；VLB是包含或由SEQ ID NO: 32或與其具有至少80%、90%、95%或99%胺基酸同一性的序列組成的多肽。
15. 如請求項13或14所述之OX40L特異性抗體或其抗原結合片段，其為嵌合的、人源化的或人或抗體。
16. 如請求項13至15中任一項所述之OX40L特異性抗體或其抗原結合片段，其包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恆定區，任選地為人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恆定區。
17. 如請求項13至16中任一項所述之OX40L特異性抗體或其抗原結合片段，其包含人IgG1 Fc（可結晶片段）區序列，所述序列包含減少Fc受體結合的人野生型序列的修飾（任選地L234A/L235A（LALA）修飾）和/或增加血清半衰期的人野生型序列的修飾（任選地M252Y/S254T/T256E（YTE）修飾）。
18. 一種藥物組合物，其包含如請求項1至11中任一項所述之雙特異性抗原結合分子或如請求項13至17中任一項所述之OX40L特異性抗體或其抗原結合片段；以及一種或多種藥學上可接受的載體、稀釋劑、賦形劑和/或防腐劑。
19. 一種治療患者疾病或病況的方法，其中：（i）所述疾病或病況與IL-13和/或OX40L相關或由IL-13和/或OX40L介導，並且其中所述方法包括向患者給予如請求項1至12中任一項所述之雙特異性抗原結合分子、如請求項13至17中任一項所述之OX40L特異性抗體或其抗原結合片段或如請求項18所述之藥物組合物。
20. 如請求項19所述之方法，其中所述疾病或病況選自：皮膚病（例如，特應性皮炎、結節性癢疹、慢性手部濕疹、過敏性皮炎、牛皮癬、扁平苔癬、化膿性汗腺炎）、哮喘、過敏性疾病（例如，過敏性鼻炎）、心血管疾病（例如，心肌梗死、心臟肥大相關疾病）、動脈粥樣硬化、肌肉骨骼疾病（類風濕性關節炎）、COPD、年齡相關性黃斑變性、牙周炎葡萄膜炎、癌症、炎症性腸病、纖維化、硬皮病和嗜酸性食道炎。
21. 如請求項19或20所述之方法，其中：（i）所述疾病或病況是皮膚病，例如特應性皮炎；（ii）所述雙特異性抗原結合分子通過注射給予患者，任選地是皮下注射；和/或（iii）患者是人類患者。
22. 如請求項19至21中任一項所述之方法，其中所述方法還包括給予額外的藥物和/或實施單獨的治療方法來治療所述疾病或病況。
23. 用於治療患者的疾病或病況的方法中的如請求項1至12中任一項所述之雙特異性抗原結合分子，如請求項13至17中任一項所述之OX40L特異性抗體或其抗原結合片段，或如請求項18所述之藥物組合物，其中所述疾病或病況與IL-13和/或OX40L相關或由IL-13和/或OX40L介導，任選地其中所述方法如請求項19至22中任一項所限定。
24. 一種如請求項1至12中任一項所述之雙特異性抗原結合分子、如請求項13至17中任一項所述之OX40L特異性抗體或其抗原結合片段、或如請求項18所述之藥物組合物在製備用於治療患者疾病或病況的方法的藥物中的用途，其中所述疾病或病況與IL-13和/或OX40L相關或由IL-13和/或OX40L介導，任選地其中所述方法如請求項19至22中任一項所限定。