KR101447300B1

KR101447300B1 - 안트라닐레이트 신타제의 엽록체를 표적으로 하는 발현에 의한 고-트립토판 옥수수의 생산

Info

Publication number: KR101447300B1
Application number: KR1020097004951A
Authority: KR
Inventors: 시바 맨쥬네이쓰; 산티아고 자비에르 나바로; 윌리엄 디. 래프; 시아오홍 쉬; 마거리트 제이. 바라고나; 제니퍼 엘. 윈슨; 구앤그닝 예
Original assignee: 몬산토 테크놀로지 엘엘씨
Priority date: 2006-08-11
Filing date: 2007-08-09
Publication date: 2014-10-07
Anticipated expiration: 2027-08-09
Also published as: BRPI0716657B1; US20080050506A1; US8981188B2; JP2010500035A; BRPI0716657A2; MX2009001573A; CA2660171A1; KR20090058519A; CN101522902A; CA2660171C; US20120246762A1; AU2007286176B2; WO2008021974A1; CN101522902B; EP2049670A1; JP5296684B2; AU2007286176A1; US8138393B2; NZ574568A

Abstract

단량체성 안트라닐레이트 신타제에 작동가능하게 연결된 엽록체 수송 펩티드 (CTP)를 코딩하는 신규 발현 벡터 및 구축물이 제공된다. 추가적으로, 단량체성 안트라닐레이트 신타제를 코딩하는 신규 폴리뉴클레오티드 서열이 제공된다. 상기 발현 벡터 및 구축물을 함유하는 트랜스제닉 식물에서 유리 트립토판의 수준을 증가시키는 방법이 또한 제공된다.

엽록체 수송 펩티드 (CTP), 단량체성 안트라닐레이트 신타제, 옥수수, 트립토판 함량

Description

안트라닐레이트 신타제의 엽록체를 표적으로 하는 발현에 의한 고-트립토판 옥수수의 생산{PRODUCTION OF HIGH TRYPTOPHAN MAIZE BY CHLOROPLAST TARGETED EXPRESSION OF ANTHRANILATE SYNTHASE}

본 출원은 미국 특허 가출원 일련 번호 60/837,200 (2006년 8월 11일 출원)을 우선권으로 청구하고, 이의 전문은 거명에 의해 본원에 명백하게 포함된다.

1. 발명의 분야

본 발명은 식물 세포 내에서 안트라닐레이트 신타제(synthase)를 발현 및 국소화시키기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.

2. 관련 기술

옥수수에서, 안트라닐레이트 신타제는 엽록체 내에서 방향족 아미노산 경로로부터 트립토판의 생합성으로 분기되는 첫번째 반응을 촉매하는 2-서브유닛 효소로 존재한다. 이는 식물에서의 트립토판 생산을 조절하는데 중요한 효소인 것으로 나타났다. Anderson 등 (미국 특허 번호 6,118,047)은 옥수수로부터의 안트라닐레이트 신타제의 트립토판-불감성 α-서브유닛의 과발현으로 트랜스제닉(transgenic) 옥수수 식물에서의 트립토판 수준이 증가되었음을 증명하였다. 최근, 원핵생물 공급원으로부터의 단량체성 형태의 안트라닐레이트 신타제가 트랜스제닉 대두 및 콘(corn)에서 트립토판 수준을 증가시킬 수 있는 것으로 나타났다 (미국 특허 출원 일련 번호 10/138,927 (미국 특허 7,217,865로 허여됨), 및 10/430,011 (미국 특허 출원 공보 20030213010으로 공개됨)).

엽록체 내에서의 생합성 경로에 참여하는 대부분의 단백질들은 핵에 의해 코딩되고, 사이토졸(cytosol)에서 합성된다. 따라서 이러한 단백질들을 색소체에 정확하게 표적화시키는 것이 이들의 생합성 기능에 필수적이다. 대부분의 경우에, 이러한 표적화는 엽록체 수송 펩티드 (CTP: chloroplast transit peptide) 또는 색소체 수송 펩티드로 칭해지는 N-말단 신장물(extension)의 존재에 의해 달성된다. 발현된 폴리펩티드가 엽록체 내에 구획화되려면 발현된 폴리펩티드를 코딩하는 서열에 융합된 CTP 서열을 코딩하는 서열이 박테리아 공급원으로부터의 트랜스진(transgene)에 있어야 한다. 따라서, CTP 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 외인성 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 5' 영역에 작동가능하게 연결시키는 것에 의해 외인성 폴리펩티드가 엽록체에 운반된다.

단량체성 안트라닐레이트 신타제를 이용하여 식물 세포를 조작하고 형질전환시키는 것에서의 다수의 목적을 위해, 식물 세포 내로 도입되는 유전자가, 색소체로 전위되어 색소체에서 기능하는 생성물을 초래하는 것이 바람직할 것이다. 그러나, 모든 CTP가 동일한 효능으로 이러한 전위를 달성할 수는 없다. 단자엽 식물, 특히 옥수수 식물에서의 안트라닐레이트 신타제의 성공적인 발현 및 국소화를 위한 효율적이고 효과적인 CTP의 확인이 당업계에서 요구된다.

발명의 개요

한 양상에서, 본 발명은 단량체성 안트라닐레이트 신타제 (AS)에 융합된 엽록체 수송 펩티드 (CTP)를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하고, 이때 엽록체 수송 펩티드가 안트라닐레이트 신타제를 식물 세포의 색소체 분획에 구획화시킬 수 있는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 이같은 안트라닐레이트 신타제 핵산이 트랜스제닉 식물에서 발현될 때, 상기 식물의 세포 내에서 트립토판의 수준 상승이 달성될 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 이러한 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터 및 구축물이 제공된다. 이같은 발현 벡터 및 구축물을 함유하는 재조합 식물 세포 또한 본 발명의 일부이다. 본 발명의 서열, 구축물 및 방법을 사용한 단백질의 발현에 의해 수득된 트랜스제닉 식물 세포, 종자(seed) 및 사료 제품이 본 발명의 일부로 추가로 간주된다.

또다른 양상에서, 본 발명은 단자엽 식물 내의 유리 트립토판 함량을 증가시키는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 단량체성 안트라닐레이트 신타제에 융합된 엽록체 수송 펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 단자엽 식물을 형질전환시키는 것을 포함하고, 이때 엽록체 수송 펩티드는 안트라닐레이트 신타제 활성을 식물 세포의 색소체 내에 국소화 또는 구획화시키는 기능을 한다.

또다른 양상에서, 본 발명은 아그로박테리움(Agrobacterium) 및 시노리조비움(Sinorhizobium) 공급원으로부터의 단량체성 안트라닐레이트 신타제를 코딩하는 단리된 신규 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명의 한 실시양태 양상에서, 이러한 신규 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터가 제공된다. 또다른 실시양태 에서, 이러한 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포, 트랜스제닉 식물 세포, 트랜스제닉 식물, 트랜스제닉 식물로부터의 종자 및 이로부터 생성된 사료 제품이 또한 본 발명의 일부로 간주된다.

도 1은 플라스미드 pMON66560의 제한효소 지도를 도해한다.

도 2는 식물 형질전환 벡터 pMON66560을 함유하는 트랜스제닉 콘 세포의 색소체 분획의 웨스턴 블롯(western blot) 분석을 도해한다.

도 3은 플라스미드 pMON78824의 제한효소 지도를 도해한다.

도 4는 플라스미드 pMON78832의 제한효소 지도를 도해한다.

도 5는 플라스미드 pMON69765의 제한효소 지도를 도해한다.

도 6은 플라스미드 pMON69755의 제한효소 지도를 도해한다.

도 7은 플라스미드 pMON82561의 제한효소 지도를 도해한다.

도 8은 플라스미드 pMON78152의 제한효소 지도를 도해한다.

도 9는플라스미드 pMON78153의 제한효소 지도를 도해한다.

도 10은 플라스미드 pMON82560의 제한효소 지도를 도해한다.

도 11은 플라스미드 pMON69779의 제한효소 지도를 도해한다.

도 12 는 플라스미드 pMON78137의 제한효소 지도를 도해한다.

도 13은 플라스미드 pMON78140의 제한효소 지도를 도해한다.

도 14 는 플라스미드 pMON78143의 제한효소 지도를 도해한다.

도 15 는 플라스미드 pMON78142의 제한효소 지도를 도해한다.

도 16은 플라스미드 pMON78139의 제한효소 지도를 도해한다.

도 17은 플라스미드 pMON69774의 제한효소 지도를 도해한다.

도 18은 플라스미드 pMON69775의 제한효소 지도를 도해한다.

도 19는 플라스미드 pMON69777의 제한효소 지도를 도해한다.

본 발명에 따라, 단량체성 안트라닐레이트 신타제를 발현시켜 식물 세포의 색소체로 운반하기 위한 조성물이 제공된다. 특히 본 발명은 형질전환된 식물의 세포에서 유리 트립토판 함량을 증가시키는 데 용도를 제공할 신규 폴리뉴클레오티드 서열을 제공한다. 추가적으로, 아그로박테리움 및 시노리조비움으로부터의 단량체성 안트라닐레이트 신타제 폴리펩티드를 코딩하는 신규 폴리뉴클레오티드가 제공된다.

본 발명은 단량체성 안트라닐레이트 신타제 (AS)에 융합된 엽록체 수송 펩티드 (CTP)를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하고, 이때 엽록체 수송 펩티드가 안트라닐레이트 신타제를 식물 세포의 색소체 분획에 구획화시킬 수 있는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 이같은 안트라닐레이트 신타제 핵산이 트랜스제닉 식물에서 발현될 때, 상기 식물의 세포 내에서 트립토판의 수준 상승이 달성될 수 있다. 본 발명의 한 양상에서, 이러한 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터 및 구축물이 제공된다. 이같은 발현 벡터 및 구축물을 함유하는 재조합 식물 세포 또한 본 발명의 일부이다. 본 발명의 서열, 구축물 및 방법을 사용한 단백질의 발현에 의해 수득된 트랜스제닉 식물 세포, 종자 및 사료 제품이 본 발명의 일부로 또한 간주된다.

본 발명의 또다른 양상에서, 단자엽 식물 내의 유리 트립토판 함량을 증가시키는 방법이 제공된다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 단량체성 안트라닐레이트 신타제에 융합된 엽록체 수송 펩티드를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 단자엽 식물을 형질전환시키는 것을 포함하고, 이때 엽록체 수송 펩티드는 안트라닐레이트 신타제 활성을 식물 세포의 색소체 내에 구획화시킬 수 있다.

추가적으로 본 발명은 아그로박테리움 및 시노리조비움 공급원으로부터의 단량체성 안트라닐레이트 신타제를 코딩하는 단리된 신규 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 본 발명의 한 양상에서, 이러한 신규 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터가 제공된다. 또다른 실시양태에서, 이러한 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포, 트랜스제닉 식물 세포, 트랜스제닉 식물, 트랜스제닉 식물로부터의 종자 및 이로부터 생성된 사료 제품이 또한 본 발명의 일부로 간주된다.

원하는 소질(trait), 예를 들어, 증가된 트립토판 수준을 나타내는 본 발명의 트랜스제닉 식물 또는 종자는 원하는 소질을 부여하는, 트랜스제닉 식물의 게놈 내로 삽입된 특정 외인성 DNA를 포함한다. 상기 소질은 대조군 식물, 예를 들어, 이러한 특정한 외인성 DNA가 없는 실질적으로 동일한 유전자형의 식물 또는 종자에서의 천연 발생 소질로부터의 측정가능한 변화이다. 강화된 원하는 소질은 강화된 원하는 소질과 관련된 특정한 외인성 DNA가 있는 트랜스제닉 식물 또는 종자에서의 소질을 대조군 식물 또는 종자에서의 소질과 비교함으로써 측정될 수 있다. 따라서, "고(高)-트립토판 옥수수"는 임의의 식물 부분, 바람직하게는 종자 내의 트립토판 수준이 증가된 콘 (옥수수) 식물을 지칭한다; 종자는 본원에서 낟알(kernel) 또는 곡식알(grain)로 또한 지칭될 수 있다.

안트라닐레이트 신타제 (AS; EC 4.1.3.27)는 식물, 진균류 및 박테리아에서 방향족 아미노산 경로로부터 트립토판의 생합성으로 분기되는 첫번째 반응을 촉매한다. 식물에서, 트립토판의 생합성을 위한 화학적 프로세스는 엽록체 내에 구획화된다. 안트라닐레이트 신타제는 사이토졸에서 합성되는, 핵에 의해 코딩되는 단백질이기 때문에, 트립토판의 생합성에 참여하기 위해서 어떤 수단에 의해 엽록체 내로 운반되어야 한다. 추가적으로, 야생형 또는 비-트랜스제닉 식물에 대해 천연인 내인성 안트라닐레이트 신타제는 생합성 프로세스 동안의 트립토판의 축적에 의한 피드백(feedback) 억제에 민감성이다. 이러한 방식으로, 비-트랜스제닉 식물 세포의 트립토판 함량이 비교적 낮은 수준으로 제한된다. 예를 들어, 비-트랜스제닉 콘에서, 트립토판 수준은 식물의 종자 내에서 전형적으로 25 백만분율 (ppm) 미만이고, 일반적으로 8 내지 10 ppm 범위이다. 본 발명은 안트라닐레이트 신타제를 색소체에 표적화시킬 수 있는 엽록체 수송 펩티드에 융합된 아그로박테리움 및 시노리조비움으로부터의 피드백-불응성 단량체성 안트라닐레이트 신타제 폴리펩티드를 코딩하는 신규 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명은 DNA 구축물 및 본 발명의 DNA 구축물의 식물 발현 카셋트들 중 하나 이상을 게놈 내에 함유하는 종자를 추가로 제공하고, 이때 상기 종자는 구축물을 함유하지 않는 종자보다 트립토판 함량이 더 높다.

증가된 트립토판은 낟알 내에 증가된 양 (25 ppm 초과)의 상기 아미노산이 축적되는 것에 의해 식물 세포에서 나타날 수 있고, 적합하게 추출된 조직의 질량 분광광도법 또는 고성능 액체 크로마토그래피와 같은 임의의 적절한 방법에 의해 측정될 수 있다. 트립토판이 증가된 본 발명의 트랜스제닉 콘 낟알은 사료 또는 식품 제품, 조분(粗粉) 또는 조분 제품, 또는 단백질 제품, 또는 유사한 종류의 비-트랜스제닉 낟알보다 더 높은 함량의 트립토판을 함유하는 낟알로부터 가공된 기타 제품의 공급원으로서 특히 유용하다.

임의의 본 발명의 식물 또는 이의 일부분은 사료 (예를 들어, 목초), 조분, 단백질 또는 오일 제제로 가공될 수 있다. 이러한 목적에 특히 바람직한 식물 부분은 종자이다. 바람직한 실시양태에서, 사료, 조분, 단백질 또는 오일 제제는 농장 동물 (가축)에게 먹이는데 사용하기 위해 디자인된다. 사료, 조분, 단백질 및 오일 제제의 제조 방법은 당업계, 예를 들어, 미국 특허 4,957,748; 5,100,679; 5,219,596; 5,936,069; 6,005,076; 6,146,669; 및 6,156,227 (거명에 의해 전문이 본원에 포함됨)에 공지되어 있다. 바람직한 실시양태에서, 단백질 제제는 고단백질 제제이다. 고단백질 제제는 단백질 함량이 바람직하게는 5％ w/v, 더욱 바람직하게는 10％ w/v, 더욱 바람직하게는 15％ w/v를 초과한다.

단리된 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드

한 실시양태에서, 본 발명은 단량체성 안트라닐레이트 신타제에 융합된 엽록체 수송 펩티드 (CTP; 색소체 수송 펩티드)를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 용어 "색소체"는 프로플라스티드(proplastid), 류코플라스트(leucoplast), 아밀로플라스트(amyloplast), 크로모플라스트(chromoplast), 및 엽록체를 포함하는 식물 세포 세포기관의 부류를 의미한다. 본 발명의 문맥에서, "수송 펩티드"라는 구절은 핵에 의해 코딩되는 단백질의 색소체로의 운반을 지시하는 폴리펩티드를 의미한다. 전형적으로, CTP 또는 수송 펩티드 서열은 폴리펩티드의 N-말단에 위치한다.

단량체성 안트라닐레이트 신타제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 CTP 또는 색소체 수송 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 그의 핵산이 천연적으로 발생하는 생물의 세포 내에서 정상적으로 그 핵산과 회합되는 또다른 핵산 서열, 즉, 기타 염색체 또는 염색체외 DNA로부터 실질적으로 분리 또는 정제되었다는 점에서 "단리"된다. 이 용어는 오염 핵산 및 기타 세포 성분이 실질적으로 제거되도록 생화학적으로 정제된 핵산을 포함한다. 이 용어는 재조합 핵산 및 화학적으로 합성된 핵산을 또한 포함한다. 본원에서 사용된 용어 "실질적으로 정제된"은 이의 천연 상태에서 정상적으로 회합되는 다른 분자들로부터 분리된 분자를 지칭한다. 더욱 바람직하게는, 실질적으로 정제된 분자는 제제 내에 존재하는 우세한 종이다. 실질적으로 정제된 분자는 천연 혼합물 내에 존재하는 다른 분자들 (용매 제외)이 60％, 바람직하게는 75％, 더욱 바람직하게는 90％ 초과로 없을 수 있다. 용어 "실질적으로 정제된"은 천연 상태로 존재하는 분자를 포함하도록 의도되지 않는다. 이같은 단리된 폴리뉴클레오티드는 외인성 폴리뉴클레오티드와 조합되었다는 점에서 또한 "재조합" 물질일 수 있다. 예를 들어, 재조합 DNA 분자는 외인성 프로모터, 또는 숙주 세포에 대해 내인성인 프로모터에 작동가능하게 연결된 단리된 폴리뉴클레오티드일 수 있다.

본원에서 사용된 "외인성" 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포 내로 도입되고, 바람직하게는 형질전환되지 않은 천연 상태의 세포 내에 존재하는 어떠한 DNA 서열과도 동일하지 않은 DNA 서열이다. "내인성" 또는 "천연" 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포 또는 생물 내에 천연적으로 존재하는 DNA 서열이다. 유사하게, "외인성" 폴리펩티드는 숙주 세포 내로 도입되고, 바람직하게는 형질전환되지 않은 천연 상태의 세포 내에 존재하는 어떠한 DNA 서열과도 동일하지 않은 단리된 DNA에 의해 코딩되는 단백질 서열이다. "내인성" 또는 "천연" 폴리펩티드는 숙주 세포 또는 생물 내에 천연적으로 존재하는 단백질이다.

단량체성 안트라닐레이트 신타제 폴리펩티드를 형질전환된 식물 세포의 색소체에 정확하게 구획화시킬 수 있는 본 발명의 CTP 서열을 나타내는 폴리펩티드가 특히 흥미롭다. CTP 서열은 옥수수로부터의, 또는 루타 그라베올렌스(Ruta graveolens), 오리자 사티바(Oryza sativa), 및 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)를 포함하지만 이에 한정되지 않는 기타 식물 종으로부터의 색소체-표적화 단백질을 코딩하는 유전자로부터 유래될 수 있다. 엽록체 수송 펩티드 서열은 당업계에 공지되어 있고, 아라비돕시스 탈리아나 리불로스-1,5-비스포스페이트 카르복실라제 (루비스코(rubisco)) 소형 서브유닛 1 (At-CTP1; [Silva-Filho et al. (1996)]; [Schnell et al. (1991)]); 아라비돕시스 탈리아나 5-(에놀피루빌)시키메이트-3-포스페이트 신타제 (At-CTP2; [Archer et al. (1990)]); 제아 메이스(Zea mays) 안트라닐레이트 신타제-알파 1 (Zm-ASA1-CTP) 및 알파 2 (Zm-ASA2-CTP) 서브유닛; 제아 메이스 디히드로디피콜리네이트 신타제 (Zm-DHDPS-CTP); 오리자 사티바 ADP 글루코스 피로포스포릴라제 (Os-Waxy (Os-Wx)-CTP); 및 루타 그라베올렌스 안트라닐레이트 신타제 알파 서브유닛 (Rg-ASA 단형-CTP 및 Rg-ASA 장형-CTP)이 포함된다. 엽록체 수송 펩티드의 사용의 설명은 미국 특허 번호 5,188,642 및 5,728,925 (양쪽 모두 거명에 의해 본원에 포함됨)를 참조한다.

본 발명의 엽록체 수송 펩티드 (CTP)를 코딩하는 대표적인 단리된 폴리뉴클레오티드에는 하기의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA가 포함된다:

서열 1: 변형된 절단 부위 (C/M)가 있는 At-CTP2(C/M) (아라비독시스 탈리아나 5-(에놀피루빌) 시키메이트-3-포스페이트 신타제)를 코딩하는 핵산 서열;

서열 2: 천연 절단 부위(E/K)가 있는 At-CTP2(E/K)를 코딩하는 핵산 서열;

서열 3: At-CTP2(E/K) + 성숙형 아라비돕시스 EPSPS 신타제로부터의 10개의 아미노산을 코딩하는 핵산 서열;

서열 4: At-CTP2(E/K) + 성숙형 아라비돕시스 EPSPS 신타제로부터의 5개의 아미노산을 코딩하는 핵산 서열;

서열 5: Zm-ASA1-CTP (제아 메이스 안트라닐레이트 신타제 α1 서브유닛)를 코딩하는 핵산 서열;

서열 6: Zm-ASA1-CTP + 성숙형 제아 메이스 안트라닐레이트 신타제 α1 서브유닛으로부터의 20개의 아미노산을 코딩하는 핵산 서열;

서열 7: Zm-ASA2-CTP (제아 메이스 안트라닐레이트 신타제 α2 서브유닛)를 코딩하는 핵산 서열;

서열 8: Zm-ASA2-CTP + 성숙형 제아 메이스 안트라닐레이트 신타제 α2 서브유닛으로부터의 5개의 아미노산;

서열 9: Zm-ASA2-CTP + 성숙형 제아 메이스 안트라닐레이트 신타제 α2 서브유닛으로부터의 18개의 아미노산을 코딩하는 핵산 서열;

서열 10: Os-Wx-CTP (오리자 사티바 ADP 글루코스 피로포스포릴라제)를 코딩하는 핵산 서열;

서열 11: Os-Wx-CTP + 성숙형 오리자 사티바 ADP 글루코스 피로포스포릴라제로부터의 5개의 아미노산을 코딩하는 핵산 서열;

서열 12: Os-Wx-CTP + 성숙형 오리자 사티바 ADP 글루코스 피로포스포릴라제로부터의 20개의 아미노산을 코딩하는 핵산 서열;

서열 13: Rg-AS 단형-CTP (루타 그라베올렌스 안트라닐레이트 신타제 α 서브유닛; Met1 내지 Ser72)를 코딩하는 핵산 서열;

서열 14: Rg-AS 장형-CTP (루타 그라베올렌스 안트라닐레이트 신타제 α 서브유닛; Met1 내지 Ser92)를 코딩하는 핵산 서열;

서열 15: Zm-DHDPS-CTP (제아 메이스 디히드로디피콜리네이트 신타제)를 코딩하는 핵산 서열;

서열 16: Zm-DHDPS-CTP + 성숙형 제아 메이스 디히드로디피콜리네이트 신타제로부터의 9개의 아미노산;

서열 17: Zm-DHDPS-CTP + 성숙형 제아 메이스 디히드로디피콜리네이트 신타제로부터의 20개의 아미노산을 코딩하는 핵산 서열;

서열 18: Zm-DHDPS-CTP + 성숙형 제아 메이스 디히드로디피콜리네이트 신타제로부터의 3개의 아미노산을 코딩하는 핵산 서열; 및

서열 19: 아라비돕시스 탈리아나 루비스코 소형 서브유닛 유전자 엽록체 수송 펩티드, CTP1을 코딩하는 핵산 서열.

하기의 아미노산 서열들 중 임의의 하나를 예를 들어 포함하는 엽록체 수송 펩티드 (CTP)를 코딩하는 임의의 단리된 핵산이 본 발명에서 또한 구현된다:

서열 20: 변형된 절단 부위 (C/M)가 있는 At-CTP2(C/M) (아라비돕시스 탈리아나 5-(에놀피루빌) 시키메이트-3-포스페이트 신타제);

서열 21: 천연 절단 부위(E/K)가 있는 At-CTP2(E/K);

서열 22: At-CTP2(E/K) + 성숙형 아라비돕시스 EPSPS 신타제로부터의 10개의 아미노산;

서열 23: At-CTP2(E/K) + 성숙형 아라비돕시스 EPSPS 신타제로부터의 5개의 아미노산;

서열 24: Zm-ASA1-CTP (제아 메이스 안트라닐레이트 신타제 α1 서브유닛);

서열 25: Zm-ASA1-CTP + 성숙형 제아 메이스 안트라닐레이트 신타제 α1 서브유닛로부터의 20개의 아미노산;

서열 26: Zm-ASA2-CTP (제아 메이스 안트라닐레이트 신타제 α2 서브유닛);

서열 27: Zm-ASA2-CTP + 성숙형 제아 메이스 안트라닐레이트 신타제 α2 서브유닛으로부터의 5개의 아미노산;

서열 28: Zm-ASA2-CTP + 성숙형 제아 메이스 안트라닐레이트 신타제 α2 서브유닛으로부터의 18개의 아미노산;

서열 29: Os-Wx-CTP (오리자 사티바 ADP 글루코스 피로포스포릴라제);

서열 30: Os-Wx-CTP + 성숙형 오리자 사티바 ADP 글루코스 피로포스포릴라제로부터의 5개의 아미노산;

서열 31: Os-Wx-CTP + 성숙형 오리자 사티바 ADP 글루코스 피로포스포릴라제로부터의 20개의 아미노산;

서열 32: Rg-AS 단형-CTP (루타 그라베올렌스 안트라닐레이트 신타제 α 서브유닛; Met1 내지 Ser72);

서열 33: Rg-AS 장형-CTP (루타 그라베올렌스 안트라닐레이트 신타제 α 서브유닛; Met1 내지 Ser92);

서열 34: Zm-DHDPS-CTP (제아 메이스 디히드로디피콜리네이트 신타제)

서열 35: Zm-DHDPS-CTP + 성숙형 제아 메이스 디히드로디피콜리네이트 신타제로부터의 9개의 아미노산;

서열 36: Zm-DHDPS-CTP + 성숙형 제아 메이스 디히드로디피콜리네이트 신타제로부터의 20개의 아미노산;

서열 37: Zm-DHDPS-CTP + 성숙형 제아 메이스 디히드로디피콜리네이트 신타제로부터의 3개의 아미노산; 및

서열 38: 아라비돕시스 탈리아나 루비스코 소형 서브유닛 유전자, CTP1.

녹색 형광 단백질 (GFP), 안트라닐레이트 신타제, 또는 GFP에 융합된 안트라닐레이트 신타제에 융합된 본 발명의 엽록체 수송 펩티드 (CTP)를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드에는 하기의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA가 포함된다:

서열 39: 녹색 형광 단백질 (GFP)에 융합된 At-CTP2를 코딩하는 핵산 서열;

서열 40: 녹색 형광 단백질 (GFP)에 융합된 Zm-ASA2-CTP를 코딩하는 핵산 서열;

서열 41: 녹색 형광 단백질 (GFP)에 융합된 Os-Wx-CTP를 코딩하는 핵산 서열;

서열 42: 녹색 형광 단백질 (GFP)에 융합된 Rg-AS 단형-CTP를 코딩하는 핵산 서열;

서열 43: 녹색 형광 단백질 (GFP)에 융합된 Zm-DHDPS-CTP를 코딩하는 핵산 서열;

서열 44: GFP에 융합된 Zm-DHDPS-CTP + 성숙형 제아 메이스 디히드로디피콜리네이트 신타제로부터의 5개의 아미노산을 코딩하는 핵산 서열;

서열 45: 리조비움 멜리로티(Rhizobium meliloti) 안트라닐레이트 신타제에 융합된 천연 절단 부위 E/K가 있는 At-CTP2를 코딩하는 핵산 서열;

서열 46: 리조비움 멜리로티 안트라닐레이트 신타제에 융합된 At-CTP2 + 성숙형 아라비돕시스 EPSPS 신타제로부터의 10개의 아미노산을 코딩하는 핵산 서열;

서열 47: 리조비움 멜리로티 안트라닐레이트 신타제에 융합된 Zm-ASA2-CTP를 코딩하는 핵산 서열;

서열 48: 리조비움 멜리로티 안트라닐레이트 신타제에 융합된 Zm-ASA2-CTP + 성숙형 제아 메이스 안트라닐레이트 신타제 α2 서브유닛으로부터의 18개의 아미노산을 코딩하는 핵산 서열; 및

서열 49: 녹색 형광 단백질에 융합된 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 단량체성 안트라닐레이트 신타제에 융합된 Zm-ASA2-CTP + 성숙형 제아 메이스 안트라닐레이트 신타제 α2 서브유닛으로부터의 18개의 아미노산 (Zm-ASA2 유전자에 의해 코딩되는 첫번째 65개의 아미노산)을 코딩하는 핵산 서열.

녹색 형광 단백질 (GFP) 또는 안트라닐레이트 신타제에 융합된 본 발명의 엽록체 수송 펩티드 (CTP)를 대표하는 서열에는 하기의 폴리펩티드 서열을 포함하는 아미노산이 포함된다:

서열 50: 녹색 형광 단백질 (GFP)에 융합된 At-CTP2;

서열 51: 녹색 형광 단백질 (GFP)에 융합된 Zm-ASA2-CTP;

서열 52: 녹색 형광 단백질 (GFP)에 융합된 Os-Wx-CTP;

서열 53: 녹색 형광 단백질 (GFP)에 융합된 Rg-AS 단형-CTP;

서열 54: 녹색 형광 단백질 (GFP)에 융합된 Zm-DHDPS-CTP;

서열 55: GFP에 융합된 Zm-DHDPS-CTP + 성숙형 제아 메이스 디히드로디피콜리네이트 신타제로부터의 5개의 아미노산;

서열 56: 리조비움 멜리로티 안트라닐레이트 신타제에 융합된 천연 절단 부위 E/K가 있는 At-CTP2;

서열 57: 리조비움 멜리로티 안트라닐레이트 신타제에 융합된 At-CTP2 + 성숙형 아라비돕시스 EPSPS 신타제로부터의 10개의 아미노산;

서열 58: 리조비움 멜리로티 안트라닐레이트 신타제에 융합된 Zm-ASA2-CTP;

서열 59: 리조비움 멜리로티 안트라닐레이트 신타제에 융합된 Zm-ASA2-CTP + 성숙형 제아 메이스 안트라닐레이트 신타제 α2 서브유닛으로부터의 18개의 아미노산; 및

서열 60: 녹색 형광 단백질에 융합된 아그로박테리움 투메파시엔스 단량체성 안트라닐레이트 신타제에 융합된 Zm-ASA2-CTP + 성숙형 제아 메이스 안트라닐레이트 신타제 α2 서브유닛으로부터의 18개의 아미노산 (Zm-ASA2 유전자에 의해 코딩되는 첫번째 65개의 아미노산).

특정 올리고뉴클레오티드가 본 발명의 실행에 또한 유용하고, 예를 들어, 서열 61-198을 포함하는 올리고뉴클레오티드가 일시적인 원형질체 분석법용 형질감염 벡터의 구축에서 유용하고, 서열 226-231을 포함하는 올리고뉴클레오티드가 PCR 프라이머로서 유용하다.

본 발명의 또다른 양상은 단리된 단량체성 안트라닐레이트 신타제 (AS) 및 이의 단편; 및 상승된 수준의 유리 L-트립토판을 생산하는 식물을 수득하는 방법에서의 이의 용도에 관한 것이다. 이같은 폴리펩티드를 함유하는 트랜스제닉 식물에서의 유리 L-트립토판의 과잉생산은 안트라닐레이트 신타제 또는 이의 도메인을 코딩하는 핵산의 도입 및 발현으로부터 초래된다. 이같은 안트라닐레이트 신타제 핵산에는 야생형 또는 돌연변이 α-도메인, 또는 단량체성 형태의 안트라닐레이트 신타제가 포함된다. 단량체성 형태의 안트라닐레이트 신타제는 단일 폴리펩티드 사슬 내의 2개 이상의 안트라닐레이트 신타제 도메인, 예를 들어, β-도메인에 연결된 α-도메인을 포함한다.

천연 식물 안트라닐레이트 신타제는 일반적으로 L-트립토판 및 이의 유사체에 의한 피드백 억제에 대해 꽤 민감성이다. 이같은 억제는 트립토판 합성 경로를 조절하는 주요 메커니즘을 구성한다. 따라서, 고도로 활성이거나, 더욱 효율적이거나 또는 트립토판 또는 이의 유사체에 의해 더 적은 정도로 억제되는 안트라닐레이트 신타제 또는 이의 도메인은 상승된 수준의 트립토판을 생산할 것이다. 본 발명에 따르면, 아그로박테리움 투메파시엔스 및 시노리조비움 멜리로티(Sinorhizobium meliloti)로부터의 안트라닐레이트 신타제가 높은 수준의 트립토판을 생산하는데 특히 유용하다. 본 발명의 단리된 단량체성 안트라닐레이트 신타제는 탈조절(deregulated) 형태 및 이의 단편을 추가적으로 포함한다. 이같은 탈조절 형태에는 본원에 기술된 바와 같은 시노리조비움(Sinorhizobium)의 S51C 대립유전자; 미국 특허 출원 2003097677에 기술된 바와 같은 아그로박테리움 안트라닐레이트 신타제의 F298W, V48F, V48Y, S51F 및 S51C 대립유전자; 발명의 영문 명칭이 "High Tryptophan Maize"인 미국 특허 출원 11/503,532에 기술된 바와 같은 아그로박테리움안트라닐레이트 신타제 S51C 대립유전자의 코돈-최적화 형태가 포함되고, 각각의 상기 출원은 거명에 의해 전문이 본원에 포함된다. 이러한 대립유전자들은 트립토판으로부터의 피드백 억제에 대해 탈조절된다.

식물 또는 선택된 숙주 세포에서 높은 수준의 트립토판을 생성시키기 위해, 선택된 안트라닐레이트 신타제 핵산을 단리하고, 식물 세포 또는 기타 세포 유형에서의 유전자 발현에 요구되는 조절 신호를 포함하도록 시험관 내에서 조작할 수 있다. 트립토판 생합성 경로가 색소체 내에 존재하는 것으로 보고되었기 때문에, 외인성 안트라닐레이트 신타제 핵산이 색소체 내로 도입될 수 있거나, 또는 아미노-말단 색소체 수송 펩티드를 코딩하는 핵산 절편을 부가함으로써 변형될 수 있다. 이같은 색소체 수송 펩티드는 안트라닐레이트 신타제 유전자 생성물을 색소체 내로 향하도록 지시할 수 있다.

트립토판의 생합성을 변경시키기 위해, 안트라닐레이트 신타제 활성을 코딩하는 핵산이 식물 세포 또는 기타 숙주 세포 내로 도입되어야 하고, 이러한 형질전환된 세포가 직접적으로 또는 간접적으로 확인되어야 한다. 전체 안트라닐레이트 신타제 또는 이의 유용한 부분 또는 도메인이 사용될 수 있다. 안트라닐레이트 신타제는 식물 세포 게놈 내로 안정적으로 혼입된다. 안트라닐레이트 신타제의 발현을 제어하는 전사 신호가 식물 세포 또는 기타 숙주 세포에 의해 인식되어야 하고, 이러한 세포 내에서 기능성이어야 한다. 즉, 안트라닐레이트 신타제가 전령 RNA (mRNA)로 전사되어야 하고, mRNA가 식물 세포 핵에서 안정적이어야 하고 번역을 위해 세포질로 손상되지 않은 채로 운반되어야 한다. 안트라닐레이트 신타제 mRNA는 식물 세포 리보솜에 의해 인식되고 올바르게 번역되는 적합한 번역 신호를 가져야 한다. 폴리펩티드 유전자 생성물은 실질적으로 세포질에서의 단백질분해성 공격을 피해야하고, 정확한 세포 구획 (예를 들어, 색소체) 내로 운반되어야 하며, 효소 활성을 부여할 3차원 입체형상을 취할 수 있어야 한다. 추가로 안트라닐레이트 신타제는 트립토판 및 이의 유도체의 생합성에서 기능할 수 있어야 하고, 즉 필요한 기질을 수득하고 적합한 생성물로 나아가기 위하여, 생합성에서 측면에 위치하는 단계들을 촉매하는 천연 식물 효소들 (아마도 색소체 내에 존재할 것임)에 가깝게 국소화되어야 한다.

모든 이러한 조건들이 충족되더라도, 트립토판의 성공적인 과잉생산은 예측가능한 이벤트가 아니다. 일부 트랜스진의 발현이 가까운 염색체성 요소에 의해 음성으로 영향을 받을 수 있다. 높은 수준의 트립토판이 피드백 억제를 감소시키는 돌연변이에 의해 달성되는 경우, 안트라닐레이트 신타제 단계에서 감소된 조절을 보상하는 다른 제어 메커니즘이 있을 수 있다. 축적된 아미노산의 파괴 속도를 증가시키는 메커니즘이 있을 수 있다. 트립토판 및 관련된 아미노산은 또한 식물에 독성이지 않은 수준으로 과잉생산되어야 한다. 마지막으로, 도입된 소질이 상업적인 개발 및 사용을 허용하기 위하여 안정적이고 유전성이어야 한다.

안트라닐레이트 신타제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 단리 및 확인이 미국 특허 출원 일련 번호 10/138,927 (미국 특허 출원 공보 20030097677로 공개되고 미국 특허 7,217,865로 허여됨); 및 10/430,011 (미국 특허 출원 공보 20030213010로 공개됨)에 기술되어 있고, 이들은 거명에 의해 전문이 본원에 포함된다.

본 발명의 안트라닐레이트 신타제를 코딩하는 대표적인 단리된 DNA에는 하기의 뉴클레오티드 서열을 코딩하는 DNA들이 포함된다:

서열 199: 아그로박테리움 투메파시엔스 야생형 안트라닐레이트 신타제;

서열 201: 아그로박테리움 투메파시엔스 F298W 돌연변이 대립유전자;

서열 203: 아그로박테리움 투메파시엔스 S51F 돌연변이 대립유전자;

서열 205: 아그로박테리움 투메파시엔스 S51C 돌연변이 대립유전자;

서열 207: 아그로박테리움 투메파시엔스 코돈-최적화 S51C 돌연변이 대립유전자;

서열 209: 시노리조비움 멜리로티 안트라닐레이트 신타제 야생형; 및

서열 211: 시노리조비움 멜리로티 안트라닐레이트 신타제 S51C 돌연변이 대립유전자.

하기의 아미노산 서열들 중 임의의 하나를 예를 들어 포함하는 안트라닐레이트 신타제를 코딩하는 임의의 단리된 핵산이 본 발명에서 또한 구현된다:

서열 200: 아그로박테리움 투메파시엔스 야생형 안트라닐레이트 신타제;

서열 202: 아그로박테리움 투메파시엔스 F298W 돌연변이체;

서열 204: 아그로박테리움 투메파시엔스 S51F 돌연변이체;

서열 206: 아그로박테리움 투메파시엔스 S51C 돌연변이체;

서열 208: 아그로박테리움 투메파시엔스 코돈-최적화 S51C 돌연변이체;

서열 210: 시노리조비움 멜리로티 안트라닐레이트 신타제 야생형;

서열 212: 시노리조비움 멜리로티 안트라닐레이트 신타제 S51C 돌연변이.

안트라닐레이트 신타제와 관련하여 본원에서 사용된 용어 "단량체성"은 2개 이상의 안트라닐레이트 신타제 도메인이 기능성인 방식으로 단일 폴리펩티드 사슬 내로 혼입되는 것을 의미힌다. 단량체성 안트라닐레이트 신타제는 생체 내에서 이량체성 형태로 조립될 수 있다. 단량체성 안트라닐레이트 신타제 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드는 다양한 생물 예컨대 아그로박테리움 투메파시엔스, 아나바에나(Anabaena) M22983, 아조스피릴룸 브라실렌스(Azospirillum brasilense), 브루셀라 멜리텐시스(Brucella melitensis), 유글레나 그라실리스(Euglena gracilis), 메소리조비움 로티(Mesorhizobium loti), 노스톡(Nostoc) 종 PCC7120 또는 리조비움 멜리로티 (시노리조비움 멜리로티)로부터 단리될 수 있다. 별법적으로, 단량체성 안트라닐레이트 신타제 핵산 및 폴리펩티드는 임의의 편리한 단량체성 또는 다량체성 안트라닐레이트 신타제 유전자로부터 선택된 도메인들의 조합으로부터 구축될 수 있다. 이같은 생물에는, 예를 들어, 아그로박테리움 투메파시엔스, 아나바에나 M22983, 아라비돕시스 탈리아나, 아조스피릴룸 브라실렌스, 브루셀라 멜리텐시스, 메소리조비움 로티, 노스톡 종 PCC7120, 리조비움 멜리로티 (시노리조비움 멜리로티), 로도슈도모나스 팔루스트리스(Rhodopseudomonas palustris), 루타 그라베올렌스, 술포로부스 솔파타리쿠스(Sulfolobus solfataricus), 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium), 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens), 대두, 쌀, 면, 옥수수, 또는 안트라닐레이트 신타제의 서브유닛 또는 도메인을 코딩하는 임의의 유전자가 포함된다. 선택된 도메인을 코딩하는 핵산들이 재조합적으로 연결될 수 있다. 예를 들어, 포스포디에스테르 결합을 형성함으로써 α-도메인의 C-말단을 코딩하는 핵산이 β-도메인의 N-말단을 코딩하는 핵산에 연결될 수 있거나, 또는 반대로 연결될 수 있다. 별법적으로, 이같은 단일 도메인 폴리펩티드들이 화학적으로 연결될 수 있다. 예를 들어, 펩티드 결합을 형성함으로써 α-도메인이 이의 C-말단을 통해 β-도메인의 N-말단에 연결될 수 있거나 또는 반대로 연결될 수 있다.

본원에서 사용된, "트립토판에 의한 피드백 억제에 대해 탈조절된" 안트라닐레이트 신타제는 탈조절된 안트라닐레이트 신타제 및 "야생형" 안트라닐레이트 신타제가 등가량의 트립토판 또는 트립토판의 아미노산 유사체에 노출되는 경우 상응하는 "야생형" 또는 천연의 감수성 안트라닐레이트 신타제보다 약 10％를 초과하는 활성을 유지하는 안트라닐레이트 신타제이다. 바람직하게는, 탈조절된 안트라닐레이트 신타제는 상응하는 "야생형" 또는 천연의 감수성 안트라닐레이트 신타제보다 약 20％를 초과하는 활성을 유지한다.

폴리펩티드의 단편 및 변이체 또한 본 발명의 일부로 간주된다. 단편은 부분으로서는 전적으로 동일한 아미노산 서열을 갖지만, 앞서 기술된 폴리펩티드의 아미노산 서열 전부를 갖지는 않는 변이체 폴리펩티드이다. 단편은 "독립적으로 존재(free-standing)"하거나, 또는 더 큰 폴리펩티드 내에 포함되어 이의 일부분 또는 영역, 가장 바람직하게는 단일한 연속적인 영역을 형성한다. 바람직한 단편은 활성이 유사하거나 개선된 단편 또는 활성이 감소된 단편을 포함하여, 본 발명의 폴리펩티드의 활성을 매개하는 단편인 생물학적으로 활성인 단편이다. 검출 방법, 예를 들어, 효소-결합 면역흡착 분석법에서 유용한 항체를 생성시키기 위한 목적으로 동물에서 항원성 또는 면역원성인 단편이 또한 포함된다.

폴리펩티드의 변이체에는 잔기가 유사한 특성의 또다른 잔기로 치환되는 보존성 아미노산 치환에 의해 서열 목록에 기재된 서열로부터 변화된 폴리펩티드가 또한 포함된다. 일반적으로, 이같은 치환은 Ala, Val, Leu 및 Ile; Ser 및 Thr; Asp 및 Glu; Asn 및 Gln; Lys 및 Arg; 또는 Phe 및 Tyr 간의 치환이다. 5개 내지 10개; 1개 내지 5개; 1개 내지 3개 또는 1개의 아미노산(들)이 임의의 조합으로 치환, 결실 또는 부가된 변이체가 특히 바람직하다.

본원에 명시적으로 기술된 DNA 서열 및 아미노산 서열에 대해 80％, 더욱 바람직하게는 85％, 더욱 더 바람직하게는 90％ 내지 95％, 가장 바람직하게는 96％ 내지 99％의 서열 동일성을 나타내는 기능성 안트라닐레이트 신타제 DNA 서열 및 기능성 안트라닐레이트 신타제 폴리펩티드 또한 본 발명의 범주 내에 속한다. 예를 들어, 85％ 아미노산 동일성은 2개의 서열이 최대로 매칭(matching)되도록 정렬되었을 때 아미노산의 85％가 동일하다는 것을 의미한다. 매칭의 최대화에서 갭(gap) (매칭되는 2개의 서열 중 어느 한쪽 내의 갭)이 허용된다; 5개 이하의 갭 길이가 바람직하고, 2개 이하가 더욱 바람직하다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어, 본원에서 추가로 기술되는 바와 같이, 식물 숙주 세포의 형질전환에 유용한 재조합 발현 벡터의 구축에서 사용될 수 있다.

식물 형질전환 벡터

식물 숙주 세포 내에서 CTP에 유합된 단량체성 AS를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 전사 및 번역을 지시하기 위한 재조합 발현 벡터에서의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 폴리뉴클레오티드의 용도가 본 발명에 흥미롭다.

본원에서 사용된 "재조합"은 이종성 핵산 서열의 도입에 의해 변형된 세포 또는 벡터에 대한 지칭, 또는 세포가 이렇게 변형된 세포로부터 유래된다는 것을 포함한다. 따라서, 예를 들어, 재조합 세포는 천연 (비-재조합) 형태의 세포 내에서 동일한 형태로 발견되지 않는 유전자를 발현하거나, 또는 고의적인 인간의 개입 결과로 다르게 과도하게 발현되거나, 과소 발현되거나 또는 전혀 발현되지 않는 천연 유전자를 발현한다.

용어 "작동가능하게 연결된"은 프로모터와 제2 서열 간의 기능성 연결을 지칭하고, 이때 프로모터는 제2 서열에 상응하는 DNA 서열의 전사를 개시시키고 매개한다. 본원에서 사용된 "작동가능하게 연결된"은 연결되는 핵산 서열들이 인접하고, 2개의 단백질 코딩 영역을 결합시키는 것이 필요한 경우에는, 이들이 인접하고, 동일한 리딩 프레임(reading frame) 내에 존재하도록 하는 2개 이상의 별개의 뉴클레오티드 서열들 간의 기능성 연결을 또한 지칭한다. 예를 들어, CTP-코딩 서열을 단량체성 안트라닐레이트 신타제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결시키는 것은 DNA 서열들 중 하나 이상의 조작, 예컨대 편리한 제한효소 부위 또는 아미노-말단 수송 서열의 더 양호한 인식을 허용할 수 있는 링커 서열을 필요로 할 수 있다.

표준 PCR 증폭 기술에 따라 주형으로서의 cDNA, mRNA 또는 게놈 DNA 및 적합한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 이같은 폴리뉴클레오티드들을 증폭시킬 수 있다. 별법적으로, 표준 합성 기술, 예컨대 자동화 DNA 합성기를 사용하여 이들을 합성할 수 있다.

발현 벡터는 숙주 세포 내에서 발현되는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 최소한 포함한다. 전형적으로, 발현 벡터는 프로모터, 조직 특이적 조절 요소, 및 인핸서(enhancer)를 포함하는 특정 조절 요소의 제어 하에 놓인다. 이같은 발현 벡터는 조절 요소에 "작동가능하게 연결"된 것으로 언급된다.

본 발명의 발현 벡터는 본 발명의 엽록체 수송 펩티드 (CTP)에 융합된 안트라닐레이트 신타제를 코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된, 식물 세포에서 기능성인 프로모터, 및 식물 숙주 세포에서 기능성인 전사 종결 영역을 일반적으로 포함한다.

대표적인 본 발명의 발현 벡터는 하기 서열의 DNA를 포함한다:

서열 213: Zm-ASA2-CTP +18::AgroAS(S51C) 비-최적화 돌연변이 대립유전자에 대한 발현 벡터인 pMON68065를 코딩하는 핵산 서열;

서열 214: Zm-ASA2-CTP +18::AgroAS(S51C) 비-천연 최적화 (nno) 돌연변이 대립유전자에 대한 발현 벡터인 pMON68066을 코딩하는 핵산 서열;

서열 215: AgroAS(F298W) 돌연변이 대립유전자를 함유하는 구축물에 대한 발현 벡터인 pMON69757을 코딩하는 핵산 서열;

서열 216: 교대되는 3' UTR이 있는 AgroAS(S51C) 비-최적화 돌연변이 대립유전자를 함유하는 구축물에 대한 발현 벡터인 pMON69770을 코딩하는 핵산 서열;

서열 217: AgroAS(S51F) 돌연변이 대립유전자를 함유하는 구축물에 대한 발현 벡터인 pMON69768을 코딩하는 핵산 서열;

서열 218: 리조비움 멜리로티 안트라닐레이트 신타제 야생형 대립유전자를 함유하는 구축물에 대한 발현 벡터인 pMON78850을 코딩하는 핵산 서열;

서열 219: 리조비움 멜리로티 안트라닐레이트 신타제 S51C 대립유전자를 함유하는 구축물에 대한 발현 벡터인 pMON78851을 코딩하는 핵산 서열.

"숙주 세포"는 벡터를 함유하고, 발현 구축물의 복제, 및/또는 전사 또는 전사 및 번역 (발현)을 지지하는 세포를 의미한다. 본 발명에서 사용하기 위한 숙주 세포는 단자엽 식물 세포 또는 박테리아 세포일 수 있다. 본 발명의 박테리아 숙주 세포의 예는 아그로박테리움이다. 바람직한 실시양태에서, 숙주 세포는 옥수수 세포이다.

본원에서 사용된 "트랜스제닉 식물"은 게놈 내로 안정적으로 도입된 외인성 폴리뉴클레오티드, 예를 들어, 또다른 생물로부터의 핵 또는 색소체 폴리뉴클레오티드가 있는 식물이다.

용어 "종자" 및 "낟알"은 동등한 의미인 것으로 이해된다. 용어 낟알은 콘 또는 쌀 식물의 종자를 기술하는데 있어서 빈번하게 사용된다. 모든 식물에서, 종자는 종자 코트, 배아, 호분 및 배유로 구성되는 성숙한 밑씨이다.

숙주 식물 세포에서의 CTP와 융합된 단량체성 AS를 코딩하는 재조합 발현 벡터의 제조를 위한 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 용도가 특히 흥미롭고, 이때 CTP는 식물 숙주 세포의 색소체 분획으로의 AS의 국소화를 지시한다. 식물 발현 구축물은 본 발명의 핵산 서열에 작동가능하게 연결된, 식물 숙주 세포에서 기능성인 프로모터, 및 식물 숙주 세포에서 기능성인 전사 종결 영역을 일반적으로 포함한다.

본원에서 사용된 "프로모터"는 DNA로부터 RNA의 전사를 개시시키는데 필수적인 DNA 서열의 영역을 의미한다. 프로모터는 전사될 DNA의 상류에 위치하고, 프로모터에는 RNA 중합효소에 대한 결합 부위로서 작용하는 영역 및 다른 인자들과 함께 작업하여 RNA 전사를 촉진하는 영역이 있다. 더욱 특히, 식물에서의 기본적인 프로모터는 전사의 개시와 관련된 정규(canonical) 영역, 예컨대 CAAT 및 TATA 박스를 포함한다. 본 발명에서, 바람직한 프로모터 분자 및 5' UTR 분자는 식물의 다른 세포 및 조직에서보다 더 큰 속도 또는 수준으로 종자 세포 또는 조직에서의 전사를 허용한다. 당업자는 식물 세포에서 기능성이고 문헌에 기술된 다수의 구성성 및 조직 특이적 프로모터가 있다는 것을 인지할 것이다. 예를 들어, 미국 특허 6,437,217 (옥수수 RS81 프로모터); 미국 특허 5,641,876 (쌀 액틴 프로모터); 미국 특허 6,426,446 (옥수수 RS324 프로모터); 미국 특허 6,429,362 (옥수수 PR-1 프로모터); 미국 특허 6,232,526 (옥수수 A3 프로모터); 미국 특허 6,177,611 (구성성 옥수수 프로모터); 미국 특허 5,322,938, 5,352,605, 5,359,142 및 5,530,196 (35S 프로모터); 미국 특허 6,433,252 (옥수수 L3 올레오신 프로모터, P-Zm.L3); 미국 특허 6,429,357 (쌀 액틴 2 프로모터, 뿐만 아니라 쌀 액틴 2 인트론); 미국 특허 5,837,848 (뿌리 특이적 프로모터); 미국 특허 6,294,714 (광-유도성 프로모터); 미국 특허 6,140,078 (염-유도성 프로모터); 미국 특허 6,252,138 (병원체-유도성 프로모터); 미국 특허 6,175,060 (인 결핍-유도성 프로모터); 미국 특허 6,635,806 (감마-코익신 프로모터, P-Cl.Gcx); 미국 특허 출원 일련 번호 10/732,721 (옥수수 배아-특이적 프로모터 ZmEM; emb5); 미국 특허 7,151,204 (옥수수 엽록체 알돌라제 프로모터); 서열 220 (보리 Per1 프로모터); 서열 221 (옥수수 B32 프로모터); 서열 222 (옥수수 Z27 프로모터); 서열 223 (옥수수 글로불린 1 프로모터; [Belanger and Kriz, 1991]); 및 서열 224 (코익신 L-3 프로모터)에 프로모터들이 기술되어 있고, 이들 모두는 거명에 의해 본원에 포함된다.

구성성 프로모터 예컨대 콜리플라워 모자이크 바이러스로부터 유래된 CaMV35S 프로모터 (미국 특허 번호 5,858,741 및 5,322,938) 또는 현삼(figwort) 모자이크 바이러스로부터 유래된 FMV35S 프로모터 (미국 특허 번호 5,378,619)로 대부분의 식물 기관에서 높은 수준의 발현이 산출된다. 강화된 또는 중복된 버젼의 CaMV35S 및 FMV35S 프로모터, 예를 들어 강화된 CaMV35S (e35S) ([Odell, et al., 1985]); 미국 특허 5,378,619)가 본 발명의 실행에서 유용하다. 또한, 당해 단백질의 발현을 식물의 특정 조직, 예컨대 잎, 줄기, 뿌리, 덩이줄기, 종자 배유, 종자 배아, 열매 등에서 일으키는 것이 또한 바람직할 수 있고, 선택된 프로모터는 원하는 조직 및 발달 특이성이 있어야 한다.

조절성 전사 종결 영역이 본 발명의 식물 발현 벡터 내에 또한 제공될 수 있다. 전사 종결 영역은 내인성 안트라닐레이트 신타제의 유전자 서열 또는 상이한 유전자 공급원으로부터 유래된 편리한 전사 종결 영역에 의해 제공될 수 있다. 이러한 전사 종결 영역은 통상적으로 3' 비번역 영역 또는 3' UTR로 칭해진다. 3' UTR 영역의 예는 노팔린 신타제 3' 영역 (nos 3'; [Fraley et al., 1983]), 밀 열 충격 단백질 hsp17 (T-Ta.Hsp17), 오리자 사티바의 글루텔린 유전자의 3' 영역 (Os-gt1; 서열 225), 제인 유전자로부터의 3' UTR, 예컨대 Z27 3' UTR ([Lopes et al., 1995]), 옥수수 글로불린 1 (T-Zm.Glb1), 및 T-Ps.RbcS2:E9 (완두 루비스코 소형 서브유닛), WO0011200A2에 개시된 것들 및 엽록체 수송 펩티드에 융합된 안트라닐레이트 신타제 코딩 영역과 조합되어 테스트 및 사용될 수 있는 당업계에 공지된 기타 3' UTR이다. 당업자는 단자엽 식물 세포에서의 전사를 종결시킬 수 있는 임의의 편리한 전사 종결 영역이 본 발명의 구축물에서 사용될 수 있다는 것을 인지할 것이다.

또한, 전사 인핸서 또는 인핸서의 중복물이 특정 프로모터로부터의 발현을 증가시키는데 사용될 수 있다. 이같은 인핸서의 예로는 옥수수 hsp70 인트론 (Zm.DnaK로 또한 칭해짐) (미국 특허 번호 5,424,412 (Brown, et al.)), Adh 인트론1 ([Callis et al., 1987]), 쌀 액틴 인트론 ([McElroy et al., 1991]; 미국 특허 번호 5,641,876), 수크로스 신타제 인트론 ([Vasil et al., 1989]), TMV 오메가 요소 ([Gallie et al., 1999]), 및 CaMV 35S 인핸서 또는 옥토파인 신타제 인핸서 (미국 특허 번호 5,290,924)가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 전사 개시 부위와 코딩 서열의 개시부 사이의 DNA 서열, 즉 비번역 리더(leader) 서열이 유전자 발현에 영향을 미칠 수 있기 때문에, 특정 리더 서열을 사용하는 것이 또한 요망될 수 있다. 당업자가 이용가능한 임의의 리더 서열이 사용될 수 있다. 바람직한 리더 서열은, 예를 들어, mRNA 안정성을 증가 또는 유지시킴으로써 및/또는 부적합한 번역 개시를 방지함으로써, 부착된 유전자의 최적 수준의 발현을 지시한다 ([Joshi, 1987]). 이같은 서열의 선택은 당업자의 재량이다. 단자엽 식물, 특히 옥수수 및 쌀에서 고도로 발현되는 유전자로부터 유래된 서열이 구현된다.

본 발명의 단리된 CTP 서열이 당해 단백질을 색소체에 표적화하는 효율을 결정하기 위한 분석법은 당업계에 주지되어 있다. 예를 들어, 리포터 유전자 예컨대 β-글루쿠로니다제 (GUS), 클로람페니콜 아세틸 트랜스페라제 (CAT), 또는 녹색 형광 단백질 (GFP)이 CTP 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 이러한 유전자 융합물이 적절한 프로모터의 제어 하에 놓이고, 형질전환 벡터 내로 결찰되어, 식물 세포 내로 형질전환된다. 발현 및 색소체 내로의 국소화를 위한 충분한 기간의 시간 후, 색소체 분획을 추출하고, 리포터 활성을 분석한다. 리포터 단백질을 색소체에 표적화하고 전달하는 단리된 CTP 서열의 능력을 이렇게 하여 평가하고, 다른 공지된 CTP 서열과 비교한다; [Silva-Filho et al. (1996)] 참조.

식물 세포 형질전환

본 발명의 재조합 발현 벡터가 내부로 도입된 식물 세포, 조직, 기관, 또는 식물은 형질전환되었거나, 형질감염되었거나, 또는 트랜스제닉인 것으로 간주된다. 트랜스제닉 또는 형질전환된 식물 세포 또는 식물에는 교배에서 이같은 트랜스제닉 식물을 어버이로 사용하는 번식 프로그램으로부터 생산되고, 도입된 핵산 서열의 존재로부터 초래된 변경된 표현형을 나타내는 식물 세포 또는 식물의 자손 및 자손의 자손이 또한 포함된다.

핵산 서열을 세포 내로 삽입하는 것에서의 용어 "도입된"은 "형질감염", 또는 "형질전환" 또는 "형질도입"을 의미하고, 진핵생물 또는 원핵생물 세포 내로의 핵산 서열의 혼입에 대한 언급을 포함하며, 이때 핵산 서열은 세포의 게놈 (예를 들어, 염색체, 플라스미드, 색소체, 또는 미토콘드리아 DNA) 내로 혼입될 수 있거나, 자가 레플리콘(replicon)으로 전환될 수 있거나, 또는 일시적으로 발현될 수 있다 (예를 들어, 형질감염된 mRNA).

본원에서 사용된 용어 "식물"은 전체 식물, 식물 기관 (예를 들어, 잎, 줄기, 뿌리 등), 종자, 및 식물 세포 및 이의 자손에 대한 지칭을 포함한다. 본원에서 사용된 식물 세포에는 종자 현탁 배양물, 배아, 분열조직성(meristematic) 영역, 유합 조직, 잎, 뿌리, 새로운 가지, 배우체, 포자체, 화분, 및 소포자가 비제한적으로 포함된다. 본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 식물의 부류는 일반적으로 단자엽 식물이다. 바람직한 본 발명의 식물은 옥수수이다.

본원에서 사용된 "트랜스제닉 식물"은 게놈 내에 이종성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 식물에 대한 지칭을 포함한다. 일반적으로, 이종성 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드가 후속 세대로 전달되도록 게놈 내로 안정적으로 통합된다. 이종성 폴리뉴클레오티드는 게놈 내로 단독으로 또는 재조합 발현 벡터의 일부로서 통합될 수 있다. "트랜스제닉"은 이렇게 최초로 변경된 트랜스제닉, 뿐만 아니라 최초의 트랜스제닉으로부터 유성 교배 또는 무성 번식에 의해 생성된 트랜스제닉을 포함하여, 이종성 핵산의 존재에 의해 유전자형이 변경된 임의의 세포, 세포주, 유합 조직, 조직, 식물의 일부분 및 식물을 포함하도록 본원에서 사용된다.

따라서, 세포 내에 이종성 폴리뉴클레오티드가 있는 식물은 본원에서 트랜스제닉 식물로 지칭된다. 이종성 폴리뉴클레오티드는 게놈 내로 안정적으로 통합될 수 있거나, 또는 염색체외성일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 폴리뉴클레오티드가 후속 세대로 전달되도록 게놈 내로 안정적으로 통합된다. 폴리뉴클레오티드는 게놈 내로 단독으로 또는 재조합 발현 벡터의 일부로서 통합된다.

핵산과 관련하여 본원에서 사용된 "이종성"은 외래 종으로부터 기원하거나, 또는 동일한 종으로부터 기원하는 경우 고의적인 인간의 개입에 의해 조성 및/또는 게놈 유전자좌에서 이의 천연 형태로부터 실질적으로 변형된 핵산이다. 예를 들어, 이종성 구조 유전자에 작동가능하게 연결된 프로모터는 구조 유전자가 유래된 것과 상이한 종으로부터의 것이거나, 또는 동일한 종으로부터의 것인 경우, 하나 또는 양쪽 모두가 원래의 형태로부터 실질적으로 변형된다. 이종성 단백질은 외래 종으로부터 기원할 수 있거나, 또는 동일한 종으로부터 기원하는 경우, 고의적인 인간의 개입에 의해 원래의 형태로부터 실질적으로 변형된다.

숙주 식물 세포의 형질전환에 사용된 특정 방법은 본 발명에 결정적이지 않다. 식물의 형질전환은 바람직하게는 영구적이고, 즉, 도입된 발현 구축물의 숙주 식물 게놈 내로의 통합에 의한 것이어서, 도입된 구축물이 후속 식물 세대에 전달된다. 당업자는 광범위한 형질전환 기술이 당업계에 존재한다는 것을 인지할 것이다. 표적 숙주 식물에 적절한 임의의 기술이 본 발명의 범주 내에서 사용될 수 있다. 예를 들어, DNA 가닥으로서, 플라스미드 내에, 또는 인공 염색체 내에를 포함하지만 이에 한정되지 않는 다양한 형태로 구축물이 도입될 수 있다. 표적 식물 세포 내로의 구축물의 도입은 인산칼슘-DNA 공침전, 전기천공, 미세주사, 아그로박테리움 감염, 리포솜 또는 미세투사성(microprojectile) 형질전환 (즉, 유전자 총)이 포함되지만 이에 한정되지 않는 다양한 기술에 의해 달성될 수 있다.

미세투사성 포격과 관련하여 (미국 특허 5,550,318; 5,538,880; 및 5,610,042; 각각 전문이 거명에 의해 본원에 명확하게 포함됨), 입자들이 폴리뉴클레오티드로 코팅되어, 추진력에 의해 세포 내로 전달된다. 대표적인 입자에는 텅스텐, 백금, 바람직하게는 금으로 구성된 것들이 포함된다. 입자 가속화에 의해 DNA를 식물 세포 내로 전달하는 유용한 방법은 <Biolistics® Particle Delivery System> (BioRad, Hercules, California)이고, 이는 DNA 또는 세포로 코팅된 입자를 현탁 배양된 단자엽 식물 세포로 덮인 필터 표면 상에 스크린, 예컨대 스테인레스 스틸 또는 NYTEX 스크린을 통과하여 추진시키는데 사용될 수 있다. 미세투사성 포격 기술은 광범위하게 적용가능하고, 사실상 모든 식물 종을 형질전환시키는데 사용될 수 있다. 미세투사성 포격에 의해 형질전환된 종의 예로는 단자엽 종 예컨대 콘 (PCT 공보 WO95/06128), 보리, 밀 (거명에 의해 전문이 본원에 포함된 미국 특허 5,563,055), 쌀, 귀리, 호밀, 사탕수수, 및 수수; 뿐만 아니라 담배, 대두 (거명에 의해 전문이 본원에 포함된 미국 특허 5,322,783), 해바라기, 땅콩, 면, 토마토, 및 일반적인 콩류 (거명에 의해 전문이 본원에 포함된 미국 특허 5,563,055)이 포함되는 다수의 쌍자엽 종이 포함된다. 당업자는 상세사항에 대해 문헌을 참조할 수 있고, 본 발명의 방법에서 사용하기 위한 적절한 기술을 선택할 수 있다.

정상적으로, 숙주에서의 발현을 위한 필요한 조절 영역이 있고, 형질전환체 세포의 선별을 제공하는 구조 유전자가 본 발명의 발현 벡터와 함께 포함될 것이다. 상기 유전자는 세포독성제, 예를 들어 항생제, 중금속, 독소 등에 대한 저항성, 영양요구성 숙주에 자가영양성을 제공하는 상보성, 바이러스 면역 등을 제공할 수 있다. 발현 구축물 또는 이의 성분이 도입된 상이한 숙주 종의 수에 따라, 하나 이상의 마커가 사용될 수 있고, 이때 상이한 숙주들에 대해 상이한 선별 조건이 사용된다.

아그로박테리움이 식물 세포 형질전환에 사용되는 경우, 아그로박테리움 숙주 내에 존재하는 T-DNA 또는 Ti- 또는 Ri-플라스미드와의 상동성 재조합을 위해 아그로박테리움 숙주 내로 도입될 수 있는 벡터가 사용될 수 있다. 재조합을 위한 T-DNA를 함유하는 Ti- 또는 Ri-플라스미드는 무장될 수 있거나 (충영(gall) 형성을 야기할 수 있음) 또는 무장해제될 수 있고 (충영 형성을 야기할 수 없음), 후자는 형질전환된 아그로박테리움 숙주 내에 vir 유전자가 존재하는 한 허용가능하다. 무장된 플라스미드는 정상적인 식물 세포와 충영의 혼합물을 제공할 수 있다.

아그로박테리움이 숙주 식물 세포를 형질전환시키기 위한 비히클로서 사용되는 일부 예에서, T-DNA 경계 영역(들)과 접경된 발현 또는 전사 구축물이 대장균 및 아그로박테리움 내에서 복제할 수 있는 광범위한 숙주 범위의 벡터 (문헌에 기재됨) 내로 삽입될 것이다. pRK2 또는 이의 유도체가 통상적으로 사용된다. 예를 들어, 거명에 의해 본원에 포함된 [Ditta et al. (1980)] 및 EPA 0 120 515 참조. 별법적으로, 식물 세포에서 발현될 서열을 별도의 복제 서열들을 함유하는 벡터 내로 삽입할 수 있고, 이때 상기 복제 서열 중 하나는 대장균 내에서 벡터를 안정화시키고, 또다른 복제 서열은 아그로박테리움에서 안정화시킨다. 예를 들어, pRiHRI ([Jouanin et al., 1985]) 복제 기원이 사용되어, 숙주 아그로박테리움 세포에서의 식물 발현 벡터의 부가된 안정성을 제공하는 [McBride and Summerfelt (1990)] 참조.

형질전환된 아그로박테리움 및 형질전환된 식물 세포의 선별을 허용하는 하나 이상의 마커가 발현 구축물 및 T-DNA와 함께 포함될 것이다. 다수의 마커, 예컨대 클로람페니콜, 카나마이신, 아미노글리코시드 G418, 히그로마이신 등에 대한 저항성이 식물 세포와의 사용에 대해 개발되었다. 사용된 특정 마커는 본 발명에 필수적이지 않고, 특정 숙주 및 구축 방식에 따라 한 마커 또는 또다른 마커가 바람직하다.

아그로박테리움을 사용한 식물 세포의 형질전환을 위해, 외식편들을 조합하고, 형질전환된 아그로박테리움과 함께 형질전환에 충분한 시간 동안 인큐베이션하고, 박테리아를 사멸시키고, 식물 세포를 적합한 선별 배지에서 배양할 수 있다. 일단 유합 조직이 형성되면, 공지된 방법에 따라 적합한 식물 호르몬을 사용함으로써 새로운 가지 형성을 조장할 수 있고, 새로운 가지를 식물의 재생을 위해 뿌리형성 배지로 옮길 수 있다. 그후, 식물이 종자로 성장될 수 있고, 종자를 사용하여 반복성 세대를 수립할 수 있다.

다중 발현 벡터를 함유하는 본 발명의 식물 세포를 수득하기 위한 다양한 가능한 방식들이 있다. 본 발명의 벡터 또는 폴리뉴클레오티드 서열, 및 별도의 효소를 코딩하는 또다른 폴리뉴클레오티드 서열이 있는 하나 이상의 또다른 벡터를 포함하는 식물을 생산하기 위한 임의의 수단이 본 발명에 포함된다. 예를 들어, 양쪽 발현 벡터 모두를 단일 식물 형질전환 벡터 (플라스미드) 내에 포함시킴으로써 또는 각각 원하는 유전자를 발현하는 별도의 식물 형질전환 벡터들을 사용함으로써, 본 발명의 발현 벡터를 제2 구축물과 동시에 식물을 형질전환시키는데 사용할 수 있다. 제1 발현 벡터로 이미 형질전환된 식물 내로 제2 벡터가 도입될 수 있거나, 또는 별법적으로 제1 구축물이 있는 형질전환된 식물과 제2 구축물이 있는 형질전환된 식물을 표준 번식 기술을 사용하여 교배시켜, 구축물들이 동일한 식물 내에 오도록 할 수 있다.

방법

본 발명은 트랜스제닉 식물의 종자에서 유리 트립토판 수준을 증가시키는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 트립토판을 증가시키는 방법은 단량체성 안트라닐레이트 신타제를 식물 세포의 엽록체에 표적화 또는 국소화시킬 수 있는 CTP에 작동가능하게 연결된 단량체성 안트라닐레이트 신타제를 코딩하는 핵산 서열을 식물 세포 내로 도입하는 것을 포함한다. 본 발명의 단량체성 안트라닐레이트 신타제는 트립토판에 의한 피드백 억제에 대해 불응성인 탈조절 형태의 효소이다.

본원에서 사용된, 식물 세포, 식물 조직, 식물의 일부분 또는 식물 내의 유리 트립토판의 "증가된" 또는 "상승된" 수준은 형질전환되지 않은 식물 세포, 식물 조직, 식물의 일부분 또는 식물, 즉 단량체성 안트라닐레이트 신타제에 융합된 엽록체 수송 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 존재에 의해 게놈이 변경되지 않은 것에서 발견되는 수준의 약 2 내지 200배, 바람직하게는 약 5 내지 150배, 더욱 바람직하게는 약 10 내지 100배인 수준이다. 예를 들어, 형질전환된 식물 종자 내의 유리 L-트립토판의 수준이 형질전환되지 않은 식물 종자 ("출발 물질") 내의 수준과 비교된다.

본 발명의 추가적인 양상은 식물 세포의 색소체에 단량체성 AS를 정확하게 구획화시키는 CTP의 능력을 예측하기 위한, 처리량이 비교적 높은 방법을 제공하는 것이다. 본 발명은 다양한 단량체성 AS 및 다양한 CTP와 융합된 녹색 형광 단백질 (GFP)의 옥수수 원형질체 또는 옥수수로 발달되는 배아에서의 일시적인 발현을 사용하는 가시화 방법을 제공한다. GFP는 UV에서 395 nm에서 피크인 청색 범위로 흡수되고, 510 nm에서 피크인 녹색 범위에서 방출되는 녹색 형광을 생산할 수 있다. 이러한 방법은 AS::GFP 폴리펩티드의 국소화의 가시화를 허용한다. 50％를 초과하여 색소체에 국소화된 결과는 단량체성 AS를 성공적으로 구획화시키는 CTP의 능력의 양성 예보물일 것이다.

본 발명은 본 발명의 콘 식물의 종자를 조분, 단백질 또는 오일로 가공하는 것을 포함하는, 영양학적으로 강화된 콘 사료 제품을 제조하는 방법을 추가로 제공한다.

추가적으로, 본 발명은 트랜스제닉 식물 세포, 또는 이같은 트랜스제닉 식물 세포로부터 유래된 사료 또는 조분 제품에서 임의의 본원에 기술된 CTP::AS 서열 조합물에 속하는 독특한 DNA 서열을 검출하는 방법을 제공한다. 이같은 트랜스제닉 식물 세포, 또는 이같은 트랜스제닉 식물 세포로부터 유래된 사료 또는 조분 제품의 게놈은 이같은 트랜스제닉 식물 세포, 또는 이같은 트랜스제닉 식물 세포로부터 유래된 사료 또는 조분 제품으로부터 추출된 DNA로부터 DNA 분자를 증폭시키는 DNA 증폭 방법에서 테스트되는 경우 임의의 독특한 CTP::AS DNA 서열을 함유하는 발현 벡터에 대해 진단성인 앰플리콘(amplicon)을 생산한다. 본원에서 사용된 "앰플리콘"은 PCR 또는 LCR과 같은 증폭 기술을 사용하여 합성된 DNA의 조각이다. "앰플리콘"은 일반적인 관례에서 PCR 생성물인 것으로 또한 이해된다.

지금까지 본 발명이 일반적으로 기술되었지만, 예시의 목적으로만 포함되고 본 발명을 한정하도록 의도되지 않은 하기의 실시예를 참조로 더욱 쉽게 이해될 것이다.

하기의 실시예는 본 발명의 바람직한 실시양태를 설명하기 위해 포함된다. 당업자는 하기의 실시예에서 개시된 기술들은 본 발명의 실행에서 잘 기능하도록 본 발명가들이 발견한 기술을 나타내고, 따라서 본 발명의 실행을 위한 바람직한 방식을 구성하는 것으로 간주될 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 그러나, 본 개시내용의 견지에서, 당업자는 본 발명의 개념, 취지 및 범주를 벗어나지 않으면서 개시된 특정 실시양태들에서 다수의 변화가 이루어질 수 있고, 비슷한 또는 유사한 결과가 여전히 수득된다는 것을 이해할 것이다. 더욱 특히, 화학적으로 및 물리적으로 관련된 특정 작용제들이 동일하거나 유사한 결과를 달성하면서 본원에 개시된 작용제들을 치환할 수 있다는 것이 명백할 것이다. 당업자에게 명백한 모든 이같은 유사한 치환 및 변형은 첨부된 청구항에 의해 정의되는 본 발명의 취지, 범주 및 개념 내인 것으로 간주된다.

실시예 1

CTP1 엽록체 수송 펩티드를 포함하는 안트라닐레이트 신타제의 국소화

본 실시예는 아그로박테리움 안트라닐레이트 신타제 대립유전자의 아미노 말단에 융합된 CTP1 엽록체 수송 펩티드를 코딩하는 트랜스진의 단백질 생성물이 트랜스제닉 옥수수에서 배아 색소체에 효율적으로 표적화되지 않는다는 것을 설명한다.

식물 형질전환 벡터 pMON66560 (도 1)은 AgroAS(F298W (서열 201에 의해 코딩됨)의 아미노 말단에 융합된 아라비돕시스 루비스코 소형 서브유닛 유전자로부터 의 엽록체 수송 펩티드 서열 CTP1 (서열 19에 의해 코딩됨)을 포함하고 옥수수 배아-특이적 프로모터 (ZmEM)에 의해 구동되는 융합 단백질을 코딩한다.

트랜스제닉 옥수수 식물로부터의 미성숙 낟알의 배아로부터 색소체 분획을 단리하기 위해, 수분(受粉)시키고 나서 25-27일 후 (DAP)에 여러 알갱이들을 수확하였다. 동종접합성 F3 트랜스제닉 옥수수 식물이 식물 형질전환 벡터 pMON66560 (도 1)를 함유하였다.

약 2.5 g의 배아를 낟알로부터 절제된 그대로 얼음 상에 놓았다. 그후, 배아를 저온 무균수에서 3회 헹구고 나서, 저온 PIM 완충제 (20 mM Hepes/NaOH, 0.5M 소르비톨, 10 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 1 mM EDTA, 10 mM DTT, pH7.4)에서 헹구었다. 모든 단리 단계 동안 배아 및 이어지는 분획들을 저온으로 유지시켰다.

그후, 배아를 5 ㎖ PIM를 함유하는 페트리접시로 옮기고, 잘린 배아가 모래와 유사할 때까지 외날 면도칼을 사용하여 잘게 잘랐다. 잘린 배아를 1층의 Miracloth™ (Calbiochem Corporation, La Jolla, CA)을 통해 50 ㎖ 원추형 튜브 내로 여과하고, PIM으로 총부피가 20 ㎖가 되게 하였다. 이러한 여과된 균질화물의 약간의 분취량 (분획 H로 칭함)을 분석할 때까지 -80℃에서 보관하였다. 그후, 여과된 균질화물을 750×g에서 5분 동안 원심분리하여, 색소체를 펠렛화시켰다. 상청액을 따라버리고, 약간의 분취량 (S1으로 칭함)을 -80℃에서 보관하였다. 그후, PIM 2.5 ㎖의 분취량을 펠렛화된 색소체에 첨가하고, 부드러운 모질의 작은 그림붓을 사용하여 펠렛을 재현탁시켰다. 약간의 분취량 (분획 P1으로 칭함)을 제거 하고 동결시킨 후, 재현탁된 펠렛 2.5 ㎖를 2개의 불연속 퍼콜(Percoll) 구배 각각 상에 층상화시켰다. 구배 튜브는 3 ㎖ 75％ 퍼콜/PIM 상에 층상화된 6 ㎖ 35％ 퍼콜/PIM으로 구성되었다. 그후, 구배 튜브를 8분 동안 1000×g에서 원심분리하였다. 생성된 35％/75％ 계면의 색소체 밴드를 수집하고, 또다른 15 ㎖ 튜브로 옮기고, 5 ㎖ 1× PIM를 각각의 튜브에 첨가하였다. 750×g에서 5분 동안 원심분리한 후, 상청액을 제거하고, 양쪽 펠렛을 0.25 ㎖ PIM에 재현탁시켰다. 정제된 색소체를 함유하는 재현탁된 펠렛 분획을 P2로 칭하고, 분석할 때까지 -80℃에서 보관하였다.

4개의 단리된 분획 (H, S1, P1 및 P2) 내의 AS 단백질의 존재를 당업계에 주지된 방법을 사용하여 웨스턴 블롯 분석에 의해 분석하였다. 간략하게, 단백질 분획을 18 ㎍ 단백질/레인으로 로딩(loading)하여 4-12％ Bio-Rad Criterion Bis-Tris 젤 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) 상에서 SDS-PAGE에 의해 분리하였다. 전기영동 후, 단백질을 니트로셀룰로스로 옮기고, 이중 블롯을 차단, 1차 항체 인큐베이션 (하기에 기술된 1차 항체), 세정, 2차 항체 인큐베이션 (양고추냉이 과산화효소에 접합됨), 세정 및 화학발광 검출을 포함하는, 웨스턴 블롯팅을 위한 표준 프로토콜에 적용하였다. 블롯 분석에서 사용된 1차 항체는 (a) 공지된 색소체-국소화 단백질인 옥수수로부터의 안트라닐레이트 신타제 α-2 서브유닛; (b) 글루타민 신타제 (GS)의 사이토졸 형태인 완두 글루타민 신테타제(synthetase) 1 (GS1) ([Tingey et al., 1987]); 및 (c) 아그로박테리움 안트라닐레이트 신타제에 대해 염소에서 상승되었다. 항-옥수수 ASα, 항-완두 GS1 및 항-Agro AS로 각각 명명된 항체들을 당업계에 공지된 표준 방법을 사용하여 제조하였다.

결과 (도 2)는 항-옥수수 ASα 항체가, 4개의 분획 모두에서 옥수수 안트라닐레이트 신타제 α-2 서브유닛에 상응하는 밴드가 인식되면서, 색소체 분획 P1 및 P2에서 강화되었음을 설명한다. 반면에, 항-완두 GS1 항체에서는 분획 H 및 S1에서 예상된 크기의 단백질에 상응하는 밴드가 인식되었고, 미정제 P1 색소체 분획에는 단백질의 양이 더 적었고, 정제된 색소체인 P2 분획에는 단백질의 양이 거의 검출가능하지 않았다. 글루타민 신테타제의 이러한 구획화 패턴은 이의 사이토졸로의 국소화와 일치한다. 항-Agro AS 항체에서는 4개의 분획 모두에서 사이토졸 마커 GS1과 유사한 패턴을 나타내는 예상된 크기의 단백질이 인식되었고, 이는 코딩 서열이 CTP1 서열을 포함하였다는 사실에도 불구하고 항-Agro AS 항체 또한 주로 사이토졸에 국소화되었음을 가리킨다. 이러한 결과는 CTP1이 단백질을 옥수수 배아 세포의 색소체에 구획화시키기 위한 발현 벡터에서 유용하지 않을 것임을 가리킨다. 추가적으로, 이러한 결과는 모든 엽록체 수송 펩티드에 단량체성 AS를 옥수수 세포의 색소체에 성공적으로 국소화시키는 능력이 있지는 않다는 것을 시사한다.

실시예 2

안트라닐레이트 신타제의 국소화를 위한 추가적인 수송 펩티드 서열

본 실시예는 실시예 3에 상술된 옥수수 안트라닐레이트 신타제-녹색 형광 단백질 (Zm-AS::GFP) 융합물 및 대조군::GFP 융합물을 함유하는 원형질체 형질감염 벡터의 구축에서 혼입된 다양한 CTP 서열들의 디자인을 기술하고, 이들을 실시예 4 에 기술된 일시적 발현 분석 시스템에서 평가하였다.

CTP 변이체
CTP 명칭	서열 번호	CTP의 간략한 설명
At-CTP2(C/M)	1	변형된 절단 부위 (C/M)이 있는 At-CTP2 (아라비돕시스 탈리아나 5-(에놀피루빌) 시키메이트-3-포스페이트 신타제)
At-CTP2(E/K)	2	천연 절단 부위 (E/K)가 있는 At-CTP2
At-CTP2(E/K) +10	3	At-CTP2 + 성숙형 아라비돕시스 EPSPS 신타제로부터의 10개의 아미노산
At-CTP2(E/K) +5	4	At-CTP2 + 성숙형 아라비돕시스 EPSPS 신타제로부터의 5개의 아미노산
Zm-ASA1-CTP	5	Zm-ASA1 CTP (제아 메이스 안트라닐레이트 신타제 α1 서브유닛)
Zm-ASA1-CTP+20	6	Zm-ASA1 CTP + 성숙형 제아 메이스 안트라닐레이트 신타제 α1 서브유닛으로부터의 20개의 아미노산
Zm-ASA2-CTP	7	Zm-ASA2 CTP (제아 메이스 안트라닐레이트 신타제 α2 서브유닛)
Zm-ASA2-CTP+5	8	Zm-ASA2 CTP + 성숙형 제아 메이스 안트라닐레이트 신타제 α2 서브유닛으로부터의 5개의 아미노산
Zm-ASA2-CTP+18	9	Zm-ASA2 CTP + 성숙형 제아 메이스 안트라닐레이트 신타제 α2 서브유닛으로부터의 18개의 아미노산
Os-Wx-CTP	10	Os-Wx CTP (오리자 사티바 ADP 글루코스 피로포스포릴라제)
Os-Wx-CTP+5	11	Os-Wx CTP + 성숙형 오리자 사티바 ADP 글루코스 피로포스포릴라제로부터의 5개의 아미노산
Os-Wx-CTP+20	12	Os-Wx CTP + 성숙형 오리자 사티바 ADP 글루코스 피로포스포릴라제로부터의 20개의 아미노산
Rg-AS 단형-CTP	13	Rg-AS 단형-CTP (루타 그라베올렌스 안트라닐레이트 신타제 α 서브유닛; Met1 내지 Ser72)
Rg-AS 장형-CTP	14	Rg-AS 장형-CTP (루타 그라베올렌스 안트라닐레이트 신타제 α 서브유닛; Met1 내지 Ser92)
Zm-DHDPS-CTP	15	Zm-DHDPS CTP (제아 메이스 디히드로디피콜리네이트 신타제)
Zm-DHDPS-CTP+9	16	Zm-DHDPS CTP + 성숙형 제아 메이스 디히드로디피콜리네이트 신타제로부터의 9개의 아미노산
Zm-DHDPS-CTP +20	17	Zm-DHDPS CTP + 성숙형 제아 메이스 디히드로디피콜리네이트 신타제로부터의 20개의 아미노산
Zm-DHDPS-CTP+3	18	Zm-DHDPS CTP + 성숙형 제아 메이스 디히드로디피콜리네이트 신타제로부터의 3개의 아미노산

실시예 3

형질전환 벡터의 구축

본 실시예는 실시예 4에 기술된 일시적인 원형질체 및 배아 분석법에서 사용된 옥수수 안트라닐레이트 신타제::녹색 형광 단백질 (Zm-AS::GFP) 융합물 및 대조군::GFP 융합물을 함유하는 원형질체 형질감염 벡터의 구축을 기술한다. 2가지의 일반적인 전략을 사용하여 이러한 벡터들을 구축하였다.

첫번째 전략에서는 GFP 코딩 서열의 부가를 용이하게 하는 제한효소 부위를 도입과 함께 CTP-AS 코딩 서열의 PCR 증폭이 수반되었다. 첫번째 전략이 pMON78824 (도 3)의 구축에서 예시된다. 플라스미드 pMON66574를 주형으로 사용하여 Zm-ASA2 CTP- 코딩 서열을 함유하는 DNA 단편의 PCR 증폭에 의해 플라스미드 pMON78824를 구축하였다. BamHI 제한효소 부위가 프라이머 AS25 및 AS 3' (각각 서열 63 및 61) 내로 혼입되어, 단편이 플라스미드 pMON30098 내에 함유된 GFP 코딩 서열과 함께 프레임 내에 삽입되도록 하였다. PCR 생성물을 TA 클로닝 키트 (Invitrogen)에 함유된 제조업자의 설명서에 따라 pCRII 벡터 (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) 내로 클로닝하여, 플라스미드 pMON82553이 생성되었다. 당업계에 주지된 방법론을 사용하여 DNA 서열분석에 의해 서열 통합성을 확인하였다.

그후, Zm-ASA2 CTP- 단편을 pMON82553으로부터 BamHI을 사용하여 절단하고, 플라스미드 pMON30098의 BamHI 부위 내로 삽입하여, pMON78824를 생성시켰다. 생성된 플라스미드 pMON78824는 a) Zm-ASA2 유전자에 의해 코딩되는 첫번째 65개의 아미노산; b) 아그로박테리움 투메파시엔스 단량체성 안트라닐레이트 신타제; 및 c) GFP 코딩 영역을 포함하는 융합 단백질 (서열 60)을 코딩하였고, 이들 모두는 e35S 프로모터의 제어 하에 놓였다.

다양한 GFP 번역 융합물을 함유하는 추가적인 원형질체 형질전환 벡터를 당업계에 주지된 표준 PCR 및 클로닝 방법을 사용하여 유사한 방식으로 구축하였다. 형질감염 벡터 ID (pMON 번호), 형질감염 벡터 내에 포함된 융합 단백질의 일반적인 설명, 사용된 PCR 프라이머, 및 PCR 주형이 표 2에 요약된다.

원형질체 형질전환 벡터 구축에 사용된 두번째 전략에서는 다양한 CTP에 상응하는 서열의 조립, 및 이러한 서열을 AgroAS(F298W) (서열 201)의 N-말단 코딩 서열에 융합시키는 것이 수반되었다. [Withers-Martinez et. al. (1999)]의 방법을 기초로 하는 PCR-기반 조립 반응에서 중첩되는 프라이머들의 셋트를 사용하여 CTP 코딩 서열이 생성되었다. 이러한 두번째 전략의 예는 At-CTP2::AgroAS(F298W)::GFP 융합 단백질을 코딩하는 발현 벡터를 함유하는 플라스미드 pMON78832 (도 4)의 생성이다.

이러한 두번째 전략의 제1단계는 N-말단에의 다양한 CTP 및 C-말단에의 GFP의 인-프레임(in-frame) 융합을 위해 변형된 AgroAS(F298W) 코딩 서열을 함유하는 셔틀(shuttle) 벡터를 합성하는 것이다. 이를 위해, 당업계에 주지된 방법을 사용하여, 주형으로서의 pMON79961, 및 올리고뉴클레오티드 프라이머 AS5A (서열 84) 및 AS 3' (서열 63)을 사용하여 PCR 증폭 반응을 수행하였다. AgroAS(F298W) 코딩 서열을 함유하는 생성된 2.2 kb PCR 산물을 아가로스 젤에서 정제하고, pCRII 벡터 내로 결찰시키고, Invitrogen TA 클로닝 키트 (Invitrogen)를 사용하여 수용성 대장균 세포 내로 형질전환시켰다. 생성된 중간체 플라스미드를 WDRAPP01.0005로 명명하고, 서열분석하여 2.2 kb PCR 산물의 존재를 확인하였다. 그후, 2.2 kb 삽입물을 플라스미드 WDRAPP01.0005로부터 BamHI을 사용하여 절단하고, 플라스미드 pBluescriptII SK+의 BamHI 부위 내로 클로닝하여 플라스미드 pMON82554를 생성시켰다.

이러한 두번째 전략의 제2단계에서는 At-CTP2-AgroAS(F298W) N-말단 코딩 서열의 합성이 수반되었다. 이를 위해, 표 3에 열거된 14개의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 제조하였다.

필요한 양을 증류수에 용해시킴으로써 표 5에 기술된 14개의 올리고뉴클레오티드 각각에 대해 모액 (100 μm/ℓ)을 제조하였다. 그후, 각각의 개별적인 올리고뉴클레오티드 용액 5 ㎕를 조합함으로써 올리고뉴클레오티드 혼합물 (At-CTP2 N1 올리고 믹스)를 제조하였다. 하기의 조건을 사용하여 PCR 증폭을 수행하였다:

1차 PCR

믹스 1:

1 ㎕ CTP2 N1 올리고 믹스

1 ㎕ 4 dNTP 믹스 (Roche, 각각 10 mM)

23 ㎕ 물

믹스 2:

6 ㎕ 25 mM MgCl₂

5 ㎕ PCR 완충제 (MgCl₂ 없음)

0.75 ㎕ Expand Hi-Fi 효소 믹스 (Roche)

13.25 ㎕ 물

믹스 1 및 믹스 2를 얇은 벽의 PCR 튜브에서 합치고, PCR 반응을 하기와 같이 수행하였다:

1) 94℃ / 2분

2) 94℃ / 30초

3) 45℃ / 30초

4) 72℃ / 30초

5) 단계 2로 4번 돌아감

6) 72℃ / 2분

7) 4℃ / 유지

2차 PCR

믹스 3:

1 ㎕의 1차 PCR 반응물

1.5 ㎕ N1-1 올리고 (10 pM/㎕)

1.5 ㎕ N1-14 올리고 (10 pM/㎕)

1 ㎕ dNTP 믹스

20 ㎕ 물

믹스 4:

6 ㎕ 25 mM MgCl₂

5 ㎕ PCR 완충제 (MgCl₂ 없음)

0.75 ㎕ Expand Hi-Fi 효소 믹스 (Roche)

13.25 ㎕ 물

믹스 3 및 믹스 4를 얇은 벽의 PCR 튜브에서 합치고, PCR 반응을 하기와 같이 수행하였다:

1) 94℃ / 2분

2) 94℃ / 30초

3) 55℃ / 30초

4) 72℃ / 30초

5) 단계 2로 24번 돌아감

6) 72℃ / 2분

7) 4℃ / 유지

정확한 크기 (~0.3 kb)의 생성된 PCR 산물을 아가로스 젤에서 정제하고, 상기 기술된 바와 같이 pCRII 벡터 (Invitrogen TA 클로닝 키트, Invitrogen) 내로 결찰시켰다. 서열을 확인한 후, 플라스미드를 NcoI 및 BsiWI로 소화시키고, NcoI 및 BsiWI 부위에서 앞서 제거된 단편을 대체하면서 pMON82554 내로 클로닝하였다. 그후, 생성된 중간체 플라스미드를 BamH1으로 소화시켜 단편을 생성시키고, 이를 pMON30098 내로 클로닝하였다. 이러한 생성된 플라스미드 벡터는 e35S 프로모터::hsp70 인트론::At-CTP2:AgroAS(F298W)::GFP::nos 3' UTR 유전자 요소를 포함하였다 (pMON78832; 도 4).

CTP의 3' 말단에서 3 내지 20개의 아미노산을 코딩하는 상응하는 성숙형 단백질의 DNA 서열을 부가함으로써 상기 기술된 방식으로 각각의 CTP의 여러 변이체를 구축하였다. 이어서, CTP 변이체를 함유하는 각각의 pCRII 벡터에 대해, pCRII 벡터의 NcoI 제한효소 부위와 BSiWI 제한효소 부위 사이의 단편을 벡터로부터 제거하고, 상기 기술된 바와 같은 pMON82554 셔틀 벡터의 NcoI 부위와 BsiWI 부위 사이에 클로닝하였다. 이어서, 각각의 이러한 벡터들을 BamHI으로 소화시켜 단편을 생성시킨 후, 이를 상기 기술된 바와 같은 pMON30098의 BamHI 부위 내로 클로닝하여, 최종 플라스미드 벡터의 나머지 유전자 요소들을 제공하였다. GFP에 융합된 이러한 CTP 변이체 및 벡터의 나머지 유전자 요소들을 함유하는 최종 플라스미드 벡터가 이의 구축에 사용된 프라이머들과 함께 표 4에 열거된다.

실시예 4

색소체에 대한 AgroAS 및 변이체의 국소화

본 실시예는 AS::GFP 융합 단백질을 색소체에 표적화하는 것에서의 여러 엽록체 수송 펩티드 (CTP)의 능력을 예측하는데 사용된 2가지의 일시적인 발현 분석법을 기술한다. 이러한 분석법들에서 안트라닐레이트 신타제-녹색 형광 단백질 (AS::GFP) 융합물 및 실시예 3에서 기술된 융합물을 함유하는 원형질체 형질감염 벡터가 사용되었다.

옥수수 세포에서의 AS::GFP 융합 단백질의 국소화를 예측하기 위해 2가지 일시적인 발현 분석 방법이 개발되었다. 처리량이 중간 정도인 옥수수 원형질체 시스템을 사용하여 다수의 상이한 CTP들을 황화(etiolated) 옥수수 잎 세포의 색소체로 AS::GFP 융합 단백질을 표적화시키는 능력에 대해 스크리닝하였다. 발달 중인 옥수수 배아에서 단백질을 발현하는 더 낮은 처리량의 시스템을 사용하여, 원형질체 시스템에서 나타난 색소체 국소화 패턴을 확인하였다. 그후, 이러한 2가지 분석법으로부터의 데이터를 사용하여, 트랜스제닉 옥수수 배아에서의 아그로박테리움 및 시노리조비움 AS 단백질의 국소화를 지시하는 다양한 CTP의 능력을 예측하였다.

일시적인 분석 시스템에서 테스트된 모든 구축물들은 e35S 프로모터, hsp70 (DnaK) 인트론 및 nos 3'UTR을 사용하여 각각의 유전자를 발현한 통상적인 벡터 골격에서 동일한 유전자 요소로 건설되었다.

일시적인 분석 시스템이 정확하게 기능하고 있는지를 확증하기 위해, 대조군 플라스미드를 구축하였다. 사이토졸 국소화에 대한 대조군은 CTP가 없는 GFP 융합물 (pMON30098; 표 2 및 5), GFP에 대한 AgroAS 융합물 (CTP가 부가되지 않음) (pMON78818; 표 2 및 5), 및 Zm-ASA2-CTP가 없는 말단절단(truncated) Zm-ASA2-CTP::GFP 융합물 (pMON78822; 표 2 및 5)을 함유하는 벡터였다. 색소체 국소화에 사용된 대조군은 GFP에 융합된 옥수수 ASA2 (pMON78820; 표 2 및 5) 및 GFP에 융합된 At-CTP2 (pMON53173; 표 5)였다. 트랜스제닉 식물로부터의 데이터를 확증하기 위해 2개의 추가적인 대조군을 사용하였다; CTP1::GFP (pMON79960; 표 2 및 5) 및 CTP1::AgroAS(F298W)::GFP (pMON79961; 표 2 및 5). 각각의 이러한 벡터들로부터의 GFP 또는 GFP 융합 단백질의 국소화 패턴이 표 5에서 보고된다. 이러한 데이터에서 실시예 1에서 기술된 바와 같은 세포 분획화가 또한 확증되었고, 이는 CTP1::AgroAS(F298W)::GFP 융합 단백질의 사이토졸 국소화 및 CTP1이 AgroAS(F298W)를 색소체에 표적화할 수 없음을 가리켰다.

대부분의 실험에서, 각각의 테스트된 CTP에 대해 추가적인 대조군이 구축되었다. 이러한 대조군들은 GFP에 직접 융합된 테스트된 CTP로 구성되었다. 예를 들어, Zm-ASA2::AgroAS::GFP 융합물을 테스트하기 위해 Zm-ASA2-CTP가 GFP에 융합되었다 (pMON69771). 모든 테스트된 벡터들의 구축 방법은 실시예 3에 기술되어 있다.

각각의 테스트된 CTP들에 대해 여러 변이체가 제조되었다. 이러한 변형들은 천연 숙주 단백질의 CTP에 부가된 N-말단 아미노산의 개수를 다르게 함으로써 구별되었다 (표 1). 예를 들어, Zm-ASA2-CTP 시리즈에서, GFP에 직접 융합된 실험적으로 결정된 CTP, 뿐만 아니라 CTP에 인접한 성숙형 제아 메이스 안트라닐레이트 신타제 α2 서브유닛의 아미노-말단의 영역으로부터 단리된 Zm-ASA2의 N-말단으로부터의 아미노산 5개 및 18개를 포함한 2개의 추가적인 버젼이 사용되었다. 이러한 구축물들은 표 1에서 Zm-ASA2-CTP + 5 (서열 8) 및 Zm-ASA2-CTP + 18 (서열 9)로 표시된다.

1차 테스트로서, 표 1에 기술된 CTP 구축물을 황화 원형질체 시스템에서 평가하였다. 잎살 원형질체를 당업계에 주지된 방법을 사용하여 황화 옥수수 묘목으로부터 제조하였다 (예를 들어 [Sheen, 1993] 참조).

상이한 벡터들을 당업계에 주지된 방법을 사용하여 원형질체 내로 전기천공시켰다. 약 18 내지 24시간 후, 원형질체 세포를 공초점 현미경검사를 사용하여 GFP 형광에 대해 카운팅하였다. 간략하게, 아르곤 이온 레이저, 녹색 및 적색 헬륨-네온 레이저, 및 카멜레온 다이오드-펌프 레이저 (Coherent Laser Division, Santa Clara, CA)가 설비된 Zeiss 레이저 주사 현미경 LSM510 META (Carl Zeiss MicroImaging, Inc., Thornwood, NY)를 사용하여 현미경검사를 수행하였다. 3.2.0.70 버젼의 LSM 5 Image Examiner (Carl Zeiss MicroImaging, Inc., Thornwood, NY)를 사용하여 영상을 취득하고 분석하였다. 버젼 8.0의 Adobe Photoshop CS (Adobe Systems Incorporated, San Jose, CA)를 사용하여 영상을 프로세싱하였다. a) 색소체 단독, b) 사이토졸 단독 및 c) 색소체 및 사이토졸 모두에 GFP 형광이 있는지에 관하여 각각의 구축물에 대해 50개 이상의 세포를 점수를 매겼다.

2차 테스트로서, 발달 중인 옥수수 배 조직에서 발현되도록 디자인된 구축물들을 평가하기 위해 특이적인 일시적 분석 시스템이 개발되었다. 이러한 테스트로 평가된 구축물은 원형질체 시스템에서의 점수가 색소체 단독 국소화를 함유하는 형질전환 세포 50％ 이상인 것을 기초로 선택되었다. 상기 기술된 바와 같은 추가적인 대조군 구축물들을 또한 테스트하였다.

수분시키고 나서 약 14일 후 (DAP)에 옥수수, 예를 들어 HiII 또는 순계 어버이로부터의 표면-멸균 알갱이로부터 배아를 단리하였다. 약 20-30개의 배아를 0.2M 소르비톨 + 0.2M 만니톨이 보충된 N6 배지를 함유하는 페트리 플레이트 상에 놓았다 ([Chu, 1978]). 실온에서 4시간 인큐베이션한 후, Biolistic™ PDS-1000/He 입자 전달 시스템 (Bio-Rad Corporation)을 사용하여 DNA로 코팅된 0.6 ㎛ 금 입자를 배아에 포격하였다. 1100 psi의 파열 압력 및 1 cm의 갭 길이로, 표적 선반에 대해 정지 스크린으로부터 9 cm에서 플레이트에 2회 포격하였다. 포격 후, 배아를 28℃에서 암실에서 하룻밤 동안 인큐베이션하고 나서, 상기 기술된 바와 같이 다광자 공초점 현미경검사에 의해 분석하였다. 샘플 당 50개 이상의 세포를 카운팅하였고, 원형질체 시스템에 대해 상기 기술된 바와 같이 점수를 매겼다.

국소화 분석법으로부터의 결과가 표 5에 제시된다. 결과는 가시화를 기초로, 하기의 6개의 CTP가 AgroAS를 옥수수 배 세포의 색소체에 효과적으로 표적화한다는 것을 가리킨다: Zm-ASA2-CTP + 18 (서열 9; pMON78824의 CTP 성분), Rg-AS 장형-CTP (서열 14; pMON78142의 CTP 성분), Rg-AS 단형-CTP (서열 13; pMON78143 및 pMON78139의 CTP 성분), At-CTP2 (E/K) (서열 2; pMON78833의 CTP 성분), At-CTP2 (E/K) + 10 (서열 3; pMON78834의 CTP 성분), 및 Zm-DHDPS-CTP + 20 (서열 17; pMON69765의 CTP 성분). 결과는 분석된 다양한 CTP 모두가 원형질체 또는 배아에서의 일시적 발현 분석법에서 AS::GFP를 국소화시키는 능력에 대해 양성이지는 않았다는 것을 또한 가리킨다. 이러한 결과는 실시예 1에 기술된 결과를 보강하고, 단량체성 AS 단백질를 단자엽 식물의 엽록체에 성공적으로 국소화시키고, 따라서 트립토판 수준 상승을 일으키기 위한 유용한 CTP를 확인하는 것에 대한 필요성을 가리킨다.

실시예 5

형질전환 벡터 및 옥수수 형질전환

본 실시예는 다양한 엽록체 운반 단백질과 조합된 아그로박테리움 투메파시엔스 및 리조비움 멜리로티 안트라닐레이트 신타제 (AS) 모두의 야생형 (wt) 및 돌연변이 대립유전자를 코딩하는 핵산 서열을 함유하는 형질전환 벡터의 구축을 기술한다. 본 실시예는 여기서 기술된 형질전환 벡터로의 옥수수의 형질전환을 위한 프로토콜을 또한 제공한다.

야생형 아그로박테리움 투메파시엔스 AS를 함유하는 형질전환 벡터의 구축을 위해, XhoI로 소화시키고, 녹두 뉴클레아제를 사용하여 말단을 평활화시킨 후, BglII로 절단함으로써 플라스미드 pMON66580으로부터 AS 코딩 서열을 절단하여, 첫번째 단편을 단리하였다. 옥수수 올레오신 프로모터, hsp70 인트론, 및 Tr7-3'-UTR을 함유하는 두번째 단편을 단리하기 위해, 플라스미드 pMON69753을 BglII 및 SmaI으로 절단하였다. 이러한 2개의 단편을 결찰시켜, pMON69754를 생성시켰다. Zm-ASA2-CTP를 함유하는 최종 형질전환 벡터를 구축하기 위해, pMON69754를 XhoI로 소화시키고, 옥수수 올레오신 프로모터, hsp70 인트론, -wt에 융합된 Zm-ASA2-CTP, 및 Tr7-3'UTR을 함유하는 정제된 단편을 단리하였다. 그후, 이러한 단편을 XhoI으로 또한 소화된 벡터 pMON78808 내에 결찰시켜, 최종 형질전환 벡터 pMON69755 (도 6)를 생성시켰다.

AgroAS(F298W) 돌연변이 대립유전자를 함유하는 형질전환 벡터의 구축을 위해, pMON66869를 StuI 및 RsrII로 소화시켜, AgroAS(F298W) 코딩 영역의 일부분을 함유하는 단편을 단리하였다. 유사하게, pMON69754를 또한 StuI 및 RsrII로 소화시켜, 옥수수 올레오신 프로모터, hsp70 인트론, 코딩 영역의 일부분 및 Tr7 3'-UTR을 함유하는 단편을 단리하였다. 생성된 단편들을 결찰시켜 pMON69756을 생성시켰다. 최종 형질전환 벡터를 구축하기 위해, pMON69756을 XhoI로 소화시키고, 옥수수 올레오신 프로모터, hsp70 인트론, AgroAS(F298W)에 융합된 Zm-ASA2-CTP, 및 Tr7-3'UTR을 함유하는 단편을 정제하였다. 그 후, 이러한 단편을 pMON78808의 XhoI 부위 내로 결찰시켜, pMON69757 (서열 215)을 생성시켰다.

AgroAS(S51F) 코딩 영역 (서열 203)을 함유하는 형질전환 벡터를 유사하게 구축하였다. 예를 들어, 상기 기술된 플라스미드 pMON69754를 BamHI 및 NcoI으로 소화시켜, AgroAS 코딩 영역을 제거하였다. 플라스미드 pMON58121을 또한 BamHI 및 NcoI로 소화시켜 AgroAS(S51F) 돌연변이 대립유전자를 단리하였다. 그후, 생성된 단편들을 결찰시켜, 중간체 플라스미드 pMON69767을 생성시켰다. pMON69767을 XhoI로 소화시키고, 단편을 pMON78808의 XhoI 부위에 결찰시킴으로써 상기 기술된 바와 같이 최종 형질전환 벡터 pMON69768을 구축하였다.

AgroAS(S51C) 대립유전자를 함유하는 형질전환 벡터 구축의 예는 pMON68065이다. pMON68063을 XhoI 제한 효소로 소화시키고, 1.0％ 아가로스 젤 상에서 분리하고, Zmhsp70 (Zm.DNAK) 인트론에 융합된 제아 메이스 올레오신(Oleosin) 프로모터, AgroAS(S51C) 대립유전자 및 Os-gt1-3'UTR에 상응하는 4569 bp DNA 단편을 젤로부터 단리하였다.

pMON78808 DNA를 또한 XhoI 제한 효소로 절단하고, 알칼리성 포스파타제 효소 (New England BioLabs Inc.)를 사용하여 탈인산화시키고, QIAGEN PCR 정제 키트 (QIAGEN Inc.)를 사용하여 DNA를 정제하였다. pMON78808의 XhoI-소화 DNA 및 pMON68063의 4569bp의 XhoI-소화 DNA 단편을 함께 결찰시켜 pMON68065를 생성시켰다.

AgroAS(S51C) 코돈-최적화 (AgroAS(S51C)-nno) 대립유전자를 함유하는 형질전환 벡터 구축의 예는 pMON68066이다. AgroAS(S51C) 돌연변이 대립유전자의 코돈 최적화는 거명에 의해 본원에 포함된 미국 특허 출원 일련 번호 11/503,532에 기술된 바와 같이 수행하였다. 코돈-최적화 AgroAS(S51C)-nno DNA가 BLUE HERON BIOTECHNOLOGY 그룹 (Bothell, WA, USA)에 의해 합성되었다. 그후, 합성 DNA를 NcoI 및 BamHI 제한 효소로 소화시키고, 1.0％ 아가로스 젤 상에서 분리하고, AgroAS(S51C)-nno에 상응하는 2193 bp DNA 단편을 젤로부터 절단하고, 상기 기술된 바와 같이 정제하였다. pMON68063의 DNA를 또한 NcoI 및 BamHI 제한 효소로 소화시키고, 1.0％ 아가로스 젤 상에서 단리하였다. NcoI/BamHI로 소화된 단리된 5244 bp의 DNA 단편은 AgroAS(S51C) 돌연변이 대립유전자를 제외하고는 pMON68063에 기술된 모든 유전자 요소를 함유하였다. NcoI/BamHI-소화 AgroAS(S51C)-nno DNA (2193 bp 단편) 및 pMON68063 (5244 bp DNA 단편)의 DNA를 혼합함으로써 결찰 반응을 수행하여, pMON68064를 생성시켰다. 그 후, pMON68064를 XhoI 제한 효소로 절단하고, 1.0％ 아가로스 젤 상에서 분리하고, hsp70 (Zm.DNAK) 인트론에 융합된 제아 메이스 올레오신 프로모터, AgroAS(S51C)-nno 및 Os-gt1-3'UTR을 함유하는 4532 bp DNA 단편을 상기 기술된 바와 같이 정제하였다. pMON78808 DNA의 DNA를 또한 XhoI 제한 효소로 절단하고, 알칼리성 포스파타제 효소 (New England BioLabs Inc., Beverly, MA)를 사용하여 탈인산화시키고, QIAGEN PCR 정제 키트 (QIAGEN Inc., Valencia, CA)를 사용하여 정제하였다. 탈인산화된 XhoI-절단 pMON78808 DNA 및 pMON68064의 4532bp DNA 단편을 혼합함으로써 결찰 반응을 수행하여, pMON68066을 생성시켰다.

플라스미드 pMON69769를 기본 벡터로 사용하여, pMON82561 (도 7), pMON78152 (도 8), pMON78153 (도 9), pMON82560 (도 10), pMON69779 (도 11), pMON78846, pMON78850, pMON78851, pMON68065, pMON69781, pMON94548, pMON94549, pMON97701, pMON97703 및 pMON97705가 포함되는 다양한 또다른 형질전환 벡터들을 유사한 클로닝 전략을 사용하여 생성시켰다.

옥수수의 형질전환

본질적으로 미국 특허 출원 공보 20050005327 (거명에 의해 전문이 본원에 포함됨)에 기술된 바와 같이, 상기 기술된 형질전환 벡터들을 옥수수 내로 형질전환시켰다. 간략하게, 미성숙 배아를 함유하는 알갱이들을 수분하고 나서 약 10일 후에 수확하고, 사용할 때까지 4℃에서 냉동시켰다 (수확 후 5일까지). 이러한 형질전환 방법에 바람직한 배아 크기는 약 1.5-2.0 ㎜였다. 이러한 크기는 일반적으로 평균 온도 87℉, GE 1000 와트 고압 나트륨 램프에 의해 공급되는 추가적인 조명을 사용하는 14시간의 낮 길이의 성장 조건으로 온실 내부에서 수분 10일 후에 달성되었다.

미성숙 배아를 표면 멸균 알갱이로부터 단리하고, 1.5 ㎖ 미세원심분리 튜브 내의 준비된 아그로박테리움 세포 현탁액 내로 직접 떨어뜨렸다. 약 5분 내지 60분 동안 연속적으로 계속 단리하였다. 별법적으로, 배아를 5-60분 동안 접종 배지 (아그로박테리움 또는 아세토시린곤이 없음) 내로 직접적으로 절단하고, 이어서 5-30분 동안 아그로박테리움 세포 현탁액을 접종하였다. 미세한 팁이 있는 무균성 이동용 피펫을 사용하여 아그로박테리움 세포 현탁액을 제거한 후, 미성숙 배아를 crn398 공동-배양 배지 (표 6) 상으로 옮겼다. 그후, 배아를 배반 측면을 위로 하여 배지 상에 놓았다. 배아를 어두운 인큐베이터 (23℃)에서 14-48시간 동안 배양하였다.

그후, 배아를 페트리 접시 (100 mm × 25 mm) 내의 아그로박테리움을 억제하기 위한 500 ㎎/ℓ 카르베니실린 및 0.1 mM 글리포세이트를 함유하는 유합조직 유도 배지 (crn336, 표 6) 상으로 옮겼다. 배양물을 30℃의 어두운 배양실/인큐베이터에서 2주 동안 인큐베이션한 후, 추가로 1주 동안 27℃의 어두운 배양실/인큐베이터에서 인큐베이션하였다. 그후, 모든 유합조직 조각들을 0.1 mM 글리포세이트 및 250 ㎎/ℓ 카르베니실린을 함유하는 제1 재생 배지 (crn335, 표 6) 상으로 개별적으로 옮겼다. 7 내지 10일 동안 16시간 밝음/8시간 어두움의 광주기로 27℃ 배양실에서 이러한 배지 상에서 배양물을 성장시켰다. 그후, 이들을 페트리 접시 (100 mm × 25 mm) 내의 제2 재생 배지 (crn333, 표 6)로 옮기고, 약 2 내지 3주 동안 16시간 밝음으로 27℃에서 성장시켰다. 그후, 재생된 새로운 가지 및 살아 있는 조직이 있는 모든 유합조직을 새로운 crn333 플레이트 또는 crn334 PHYTATRAY (표 6) 상으로 옮기거나, 또는 뿌리 형성 배지 (crn366, 표 6)를 함유하는 선데이 컵으로 직접 옮겨서 추가로 성장시킨 후 토양으로 옮겼다 (약 1 내지 3주). 모든 재생 배지 (crn335, crn333 및 crn334)는 250 ㎎/ℓ 카르베니실린 및 0.1 mM 글리포세이트를 함유하였다.

그후, 묘목을 토양으로 옮기고, 27℃, 80％ 습도 및 낮은 조명 강도의 성장 챔버에서 약 1 내지 2주 동안 튼튼하게 한 후, 온실로 옮기고 표준 온실 조건 하에 성장시켰다. 생성된 낟알들을 수집하고, 하기 기술된 바와 같이 분석하였다.

실시예 6

AS의 면역국소화 및 옥수수 낟알 내의 트립토판의 정량을 위한 방법

본 실시예는 실시예 5에 기술된 CTP-구축물로 형질전환된 옥수수 이벤트들로부터의 면역국소화 연구 및 낟알 내의 유리 트립토판 수준의 정량에서 사용된 분석 절차를 기술한다.

상이한 구축물들을 보유하는 F1 단계 트랜스제닉 식물로부터의 낟알들을 26 DAP에 별도로 수확하였다. 이러한 구축물들은 pMON69755 (도 6), pMON69779 (도 11), pMON82560 (도 10), pMON82561 (도 7), pMON78153 (도 9) 및 pMON78152 (도 8)를 포함하였다. 8개 내지 10개의 배아를 이러한 구축물들의 각각의 트랜스제닉 세포주로부터 단리하고, 3.7％ 포름알데히드 용액 내에 고정시키고, 발현된 단백질의 국소화를 하기 기술된 면역표지화 연구에 의해 분석하기 전까지 4℃에서 보관하였다.

DNeasy™ 식물 키트 (카탈로그# 69104, Qiagen, Waltham, MA)를 사용하여 이러한 트랜스제닉 낟알들의 배유로부터 게놈 DNA를 추출하였다. 서열 목록에 각각 서열 226 및 서열 227로 지정된 올리고뉴클레오티드 프라이머 옥수수 AS2-5' 및 옥수수 AS2-3'을 사용하여 PCR 증폭을 수행하여 양성 및 음성 낟알을 확인하였다.

상기 기술된 콘 배아를 500 ㎕ 0.05％ 트리톤(Triton) X-100에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 사파이어 칼이 장착된 Leica VT 1000S 진동 블레이드 마이크로톰 (Leica Microsystems GmbH, Nussloch Germany)을 사용하여 배반 조직 절편을 20 ㎛ 두께의 절편으로 슬라이싱한 후, 10 mM 글리신을 함유하는 PBS 완충제 (137 mM NaCl, 3 mM KCl, 8 mM Na₂HPO₄ 및 1.5 mM KH₂PO₄)에서 세정 당 10분으로 3번 세정하였다.

그후, 조직 절편을 효소 혼합물 (4％ 펙티나제, 2％ 셀룰라제)에서 40분 동안 28℃에서 인큐베이션하였다. 그후, AgroAS 검출을 위해 염소 혈청 (Sigma 카탈로그# G-9023; Sigma Chemical Company, St. Louis, MO)을, 옥수수 AS를 위해 토끼 혈청 (Sigma R-9133)을 사용하여, 조직을 희석하지 않은 혈청으로 15분 동안 차단시켰다. 그후, PBS 완충제 내의 1％ 토끼 항-his AgroAS 또는 염소 항-옥수수 AS에서, 조직 절편을 부드럽게 진탕시키면서 4℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다.

하룻밤 동안의 인큐베이션 후, 조직을 10 mM 글리신을 함유하는 PBS 완충제에서 20분 동안 세정하고, 실온에서 15분 동안 각각의 희석되지 않은 혈청에서 다시 인큐베이션하였다. 그후, 조직을 암실에서 알렉사(Alexa)-접합체 2차 항체와 함께 2시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 희석율은 AgroAS 단백질에 대한 AlexaFluor® 532 (Molecular Probes, Inc., Eugene, OR) 염소 항-토끼-접합체 2차 항체에 대해 1:1000이었고, Zm AS 단백질에 대한 AlexaFluor® 488 (Molecular Probes, Inc.) 토끼 항-염소에 대해 1:1000이었다. 인큐베이션 후, 조직을 10 mM 글리신을 함유하는 PBS 완충제에서 세정 당 10분으로 3번 세정하였다. 그후, 진탕하면서 15분 동안 암실에서 세포벽용 칼코플루오르 화이트(calcofluor white) (Sigma) 용액 (2.5 ㎎/㎖의 모액, 증류수로 1:50 희석함) 및 핵용 Hoechst 염색 (Molecular Probes Inc.)으로 조직을 대비염색시켰다. 그후, 염색된 조직을 마운팅할 때까지 10분 동안 증류수에서 세정하였다.

결과는 채널들이 병합되면서 AgroAS (543 nm에서의 적색 형광) 및 대조군 Zm AS 항체 (488 nm에서의 녹색 형광) 모두로 샘플이 프로빙되었을 때, 황색의 출현이 색소체 내의 단백질들의 공동-국소화를 시사하였음을 보여준다 (데이터는 제시되지 않음).

아미노산 분획을 추출하기 위해, 분쇄된 낟알 30 mg을 원심분리 바이알 내에 놓았다. 1 ㎖의 5％ 트리클로로아세트산을 각각의 샘플에 첨가하였다. 와동(vortexing)에 의해 샘플들을 혼합하고, 하룻밤 동안 4℃에 놓았다. 그후, 샘플을 다시 혼합하고 15분 동안 14,000 rpm으로 미세원심분리기에서 회전시켰다. 그후, 상청액의 일부를 제거하고, HPLC 바이알 내에 놓고, 밀봉하였다. 분석 전까지 샘플을 4℃에서 유지시켰다.

[Agilent Technical Publication, "Amino Acid Analysis Using Zorbax Eclipse AAA Columns and the Agilent 1100 HPLC", March 17, 2000]에 기술된 바와 같이 아미노산 분석을 수행하였다. 분석에서, 아미노산을 o-프탈디알데히드 (OPA)로 예비-유도체화시킨 후, OPA 접합체를 역상 크로마토그래피에 의해 분리하였다. Eclipse XDB-C18 5 ㎛, 4.6×150 mm 컬럼, 및 1.2 ㎖/분의 유속으로 Agilent 1100 시리즈 HPLC 시스템 (Agilent, Palo Alto, CA)을 사용하여 분리하였다. 340 nm에서의 여기 및 450 nm에서의 방출의 형광을 사용하여 아미노산 농도를 결정하였다. 표 7에 따른 HPLC 완충제 A 및 B의 구배로 용출시켰고, 이때 HPLC 완충제 A는 40 mM Na₂HPO₄, pH 7.8였고, HPLC 완충제 B는 9:9:2의 메탄올:아세토니트릴:물이었다.

아미노산 표준물을 0 내지 100 ㎍/㎖ 범위의 농도로 제조하거나 구입하였다. 프롤린 분석은 9-플루오레닐메틸-클로로포르메이트 (FMOC)를 사용하는 추가적인 유도체화 단계를 필요로 하였다. 표 8에 제시된 결과는 ppm 단위로 보고된다.

실시예 7

옥수수 내의 유리 트립토판 수준의 분석

본 실시예는 실시예 5에 기술된 발현 벡터로 형질전환된 옥수수 식물 내의 유리 트립토판 수준의 분석을 기재한다.

F1 낟알을 실시예 6에 기술된 바와 같이 유리 트립토판에 대해 분석하였다. 하기 표 8에 제시된, 일부 형질전환 식물로부터의 결과는 일시적인 발현 분석 (표 5에 제시된 데이터)에서 GFP를 성공적으로 표적화시키는 능력을 나타낸 CTP에서 형질전환 식물 내의 유리 트립토판의 수준이 더 높았음을 보여준다. 추가적으로, GFP를 색소체 내에 국소화시키는 능력을 나타내지 않은 CTP는 유리 트립토판 수준이 더 낮았다. 이러한 결과들은 모든 CTP가 색소체에 단량체성 AS를 국소화시키는 것을 지시할 수 없고, 따라서 유리 트립토판 수준을 증가시킬 수는 없다는 것을 보여주고 있다.

실시예 8

조분 및 사료 제품의 제조

본 실시예는 실시예 5에 기술된 발현 벡터를 함유하는 조분 및 사료 제품의 제조 방법을 기재한다.

임의의 본 발명의 식물 또는 이의 일부분이 전체 트립토판 함량이 높은 사료, 조분, 단백질 또는 오일 제제를 포함하는, 사료, 조분, 단백질, 또는 오일 제제로 가공될 수 있다. 이러한 목적에 특히 바람직한 식물 부분은 종자이다. 바람직한 실시양태에서, 사료, 음식물, 단백질 또는 오일 제제는 가축 또는 인간, 또는 양쪽 모두에 대해 디자인된다. 사료, 음식물, 단백질 또는 오일 제제의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 4,957,748; 5,100,679; 5,219,596; 5,936,069; 6,005,076; 6,146,669; 및 6,156,227 참조. 바람직한 실시양태에서, 사료, 음식물, 단백질 또는 오일 제제는 고-트립토판 제제이다. 이같은 고-트립토판 제제는 트립토판 함량이 바람직하게는 약 200 ppm 내지 400 ppm 초과이고, 더욱 바람직하게는 400 내지 600 ppm 초과이며, 더욱 바람직하게는 600 내지 800 ppm 초과이다.

실시예 9

CTP::AS 트랜스진을 검출하는 방법

본 실시예는 트랜스제닉 식물 세포, 또는 이같은 트랜스제닉 식물 세포로부터 유래된 사료 또는 조분 제품 내에 임의의 본원에 기술된 CTP::AS 서열 조합물을 함유하는 구축물에 속하는 독특한 서열이 존재하는지를 검출하는데 사용될 수 있는 방법을 기재한다.

CTP::AS DNA의 PCR 증폭

트랜스제닉 식물 세포, 또는 이같은 트랜스제닉 식물 세포로부터 유래된 사료 또는 조분 제품으로부터의 게놈 DNA를 QIAGEN DNeasy™ 식물 미니 키트 (카탈로그# 69104; QIAGEN Inc.)를 사용하여 제조업자의 프로토콜에 따라 추출하였다. 일반적으로 PCR 반응 생성물은 약 100 mg의 추출된 게놈 DNA, 1× PCR 반응 완충제 (Expand High Fidelity PCR System, 카탈로그# 1732641; Roche Inc., Nutley, NJ), 0.2 mM dNTP, 5 피코몰의 각각의 프라이머, 3.5 유닛의 High Fidelity Taq 중합효소, 및 최종 부피가 50 ㎕가 되도록 하는 물을 함유하였다. 예를 들어, 추출된 DNA를 서열 228 및 서열 229; 또는 서열 230 및 서열 231의 프라이머 쌍을 사용하여 증폭시켜, pMON68066으로 형질전환된 식물 세포의 Zm-ASA2 + 18-CTP::AgroAS 구축물로부터의 DNA에 대해 진단성인 앰플리콘이 생성되었다. 35 사이클의 95℃에서의 변성, 60℃에서의 어닐링(annealing) 및 72℃에서의 확장이 포함될 수 있는 다양한 온도 사이클에 반응 혼합물을 적용하였다. 35 사이클의 PCR 후, 약 10 ㎕의 반응 혼합물을 1.0％ 아가로스 젤 상에서 분리시켰다. 2649 염기쌍의 단편 (서열 228 및 서열 229의 프라이머 쌍 사용) 또는 2735 염기쌍의 단편 (서열 230 및 서열 231의 프라이머 쌍 사용)의 존재는 식물 세포, 사료 또는 조분 제품이 AS 대립유전자에 융합된 Zm-ASA2 + 18-CTP를 포함한다는 것을 보여준다. 임의의 본원에 기술된 또다른 CTP::AS 서열 조합물을 함유하는 구축물에 속하는 독특한 서열을 검출하는데 유용할 추가적인 PCR 프라이머 쌍을 인식하고 디자인하는 것은 충분히 당업자의 수단 내에 속한다.

본원에서 개시 및 청구된 모든 물질 및 방법은 상기 개시내용에 의해 설명된 대로 과도한 실험 없이 제조 및 사용될 수 있다. 본 발명의 물질 및 방법이 바람직한 실시양태 및 설명적인 예의 관점에서 기술되었지만, 본 발명의 개념, 취지 및 범주를 벗어나지 않으면서 본원에 기술된 물질 및 방법에 변형이 적용될 수 있다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 당업자에게 명백한 모든 이같은 유사한 대용물 및 변형은 첨부된 청구항에 의해 정의되는 본 발명의 취지, 범주 및 개념 내인 것으로 간주된다.

참고문헌

하기의 참고문헌들은 본원에 개시된 것들에 보충적인 예시적인 절차상의 또는 기타 상세사항을 제공한다는 점에서 거명에 의해 본원에 명백하게 포함된다.

미국 특허, 출원 및 출원 공보: 미국 출원 09/757,089; 미국 출원 10/138,927; 미국 출원 10/430,011; 미국 출원 10/732,721; 미국 출원 11/503,532; 미국 특허 4,957,748; 미국 특허 4,957,748; 미국 특허 5,100,679; 미국 특허 5,100,679; 미국 특허 5,188,642; 미국 특허 5,219,596; 미국 특허 5,219,596; 미국 특허 5,290,924; 미국 특허 5,322,783; 미국 특허 5,322,938; 미국 특허 5,322,938; 미국 특허 5,352,605; 미국 특허 5,359,142; 미국 특허 5,378, 619; 미국 특허 5,378,619; 미국 특허 5,424,412; 미국 특허 5,530,196; 미국 특허 5,538,880; 미국 특허 5,550,318; 미국 특허 5,563,055; 미국 특허 5,610,042; 미국 특허 5,641,876; 미국 특허 5,728,925; 미국 특허 5,837,848; 미국 특허 5,858,741; 미국 특허 5,936,069; 미국 특허 5,936,069; 미국 특허 6,005,076; 미국 특허 6,005,076; 미국 특허 6,118,047; 미국 특허 6,140,078; 미국 특허 6,146,669; 미국 특허 6,146,669; 미국 특허 6,156,227; 미국 특허 6,156,227; 미국 특허 6,175,060; 미국 특허 6,177,611; 미국 특허 6,232,526; 미국 특허 6,252,138; 미국 특허 6,294,714; 미국 특허 6,426,446; 미국 특허 6,429,357; 미국 특허 6,429,362; 미국 특허 6,433,252; 미국 특허 6,437,217; 미국 특허 6,635,806; 미국 특허 번호 5,641,876; 미국 특허 7,151,204; 미국 특허 번호 7,217,865; 미국 공보 20030097677; 미국 공보 20030213010; 미국 공보 20050005327

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acgcggcgaa gtgctgctgg cgctgatcgc cgaggatctg 300 aagtccgttg ccgacatcac gctcggctca cttgccgccc gccgcctcga cctcaccatc 360 aacgagcccg atcgtgtctt caccgaggaa gagcggtcga agatgccgac ggtctttacg 420 gttcttcgcg cggtgacgaa cctcttccac tcggaggagg actcgaacct cggcctctat 480 ggcgccttcg gctacgacct cgccttccag ttcgatgcga tcgaactgaa gctttcgcgt 540 ccggacgacc agcgcgacat ggttctcttt ctgccggacg agatccttgt ggtcgatcac 600 tatgcggcca aggcctggat cgaccgctac gatttcgcca gggagaacct ttcgaccgag 660 ggcaaggcag cggacattgc tcccgagccg ttccgcagcg tcgacagcat cccgccgcac 720 ggggatcacc gcccgggcga atatgccgag ctcgtcgtca aggcgaagga aagcttccgt 780 cgcggcgatc ttttcgaagt ggtgccgggg cagaaattct acgagcgctg cgaaagccgc 840 ccgtccgaga tttccaaccg gctgaaggcg atcaatccgt cgccctattc cttcttcatc 900 aatctcggca accaggaata tctcgtcggt gcttcgccgg agatgttcgt gcgcgtttcc 960 ggccggcgca tcgagacctg cccgatctcc ggtacgatca agcgcggcga cgatccgatc 1020 gccgacagcg agcagatcct gaagctcttg aactcgaaga aggacgagtc cgagctcacc 1080 atgtgctcgg acgtcgaccg caacgacaag agccgggtct gcgtgccggg ctcggtcaag 1140 gtgatcggcc ggcgtcagat cgagatgtat tcgcggctga tccacacggt cgatcacatc 1200 gaggggcgcc tgcgcgacga tatggacgcc ttcgacgggt tcctcagcca cgcctgggcg 1260 gtgaccgtta ccggcgcgcc aaagctctgg gccatgcgct tcatcgagag ccacgagaag 1320 agcccgcgtg cctggtatgg cggcgcgatc ggcatggtcg gcttcaacgg cgacatgaat 1380 accgggctga ccttgcgtac catccgcatc aaggacggga tcgccgaggt gagggcgggt 1440 gcgacgctcc tctatgattc caatccggaa gaagaagaag ccgaaaccga actgaaggcc 1500 tctgccatga ttgcagccat ccgcgacgcg aaatccgcaa acagcgccaa atccgcgcgc 1560 gatgtcgccg ccgtcggcgc cggagtcagc atcctgctcg tcgatcacga ggacagcttc 1620 gtccataccc tcgcgaacta cttccgccag accggcgcgt ccgtcaccac cgtgcgcacg 1680 ccggtggccg aggaaatctt cgaccgggtc aagccggacc tcgtcgtgct ttcgcccggt 1740 cccggcaccc cgaaggactt cgactgcaag gcgacgatca agaaggcgcg ggcgcgggac 1800 ctgccgatct tcggcgtctg cctggggctg caggcgctcg cggaggccta tggcggcgac 1860 cttcgtcaac tggcgatccc gatgcatggg aagccctcgc gcatccgcgt gctcgaaccc 1920 ggcatcgtct tctccggcct cggcaaggag gtgacggtcg ggcgctatca ttcgattttc 1980 gccgatccgt ccaacctgcc gcgcgaattc gtgatcacgg ccgaaagcga agatggtacg 2040 atcatgggca tcgaacacag caaggagccg gtggcggccg tgcagttcca tccggaatcg 2100 atcatgacgc tgggcggcga cgccggcatg cggatgatcg agaacgtggt tgcccatctc 2160 gccaagcggg cgaagaccaa ggcagcctga a 2191 <210> 210 <211> 729 <212> PRT <213> Sinorhizobium meliloti <400> 210 Met Ala Ala Val Ile Leu Glu Asp Gly Ala Glu Ser Tyr Thr Thr Lys 1 5 10 15 Gly Gly Ile Val Val Thr Arg Arg Arg Arg Glu Ala Ser Tyr Ser Asp 20 25 30 Ala Ile Ala Gly Tyr Val Asp Arg Leu Asp Glu Arg Arg Gly Ala Val 35 40 45 Phe Ser Ser Asn Tyr Glu Tyr Pro Gly Arg Tyr Thr Arg Trp Asp Thr 50 55 60 Ala Val Val Asp Pro Pro Leu Ala Ile Ser Ser Phe Gly Arg Ser Leu 65 70 75 80 Trp Ile Glu Ala Tyr Asn Glu Arg Gly Glu Val Leu Leu Ala Leu Ile 85 90 95 Ala Glu Asp Leu Lys Ser Val Ala Asp Ile Thr Leu Gly Ser Leu Ala 100 105 110 Ala Arg Arg Leu Asp Leu Thr Ile Asn Glu Pro Asp Arg Val Phe Thr 115 120 125 Glu Glu Glu Arg Ser Lys Met Pro Thr Val Phe 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Lys Leu Leu Asn Ser 340 345 350 Lys Lys Asp Glu Ser Glu Leu Thr Met Cys Ser Asp Val Asp Arg Asn 355 360 365 Asp Lys Ser Arg Val Cys Val Pro Gly Ser Val Lys Val Ile Gly Arg 370 375 380 Arg Gln Ile Glu Met Tyr Ser Arg Leu Ile His Thr Val Asp His Ile 385 390 395 400 Glu Gly Arg Leu Arg Asp Asp Met Asp Ala Phe Asp Gly Phe Leu Ser 405 410 415 His Ala Trp Ala Val Thr Val Thr Gly Ala Pro Lys Leu Trp Ala Met 420 425 430 Arg Phe Ile Glu Ser His Glu Lys Ser Pro Arg Ala Trp Tyr Gly Gly 435 440 445 Ala Ile Gly Met Val Gly Phe Asn Gly Asp Met Asn Thr Gly Leu Thr 450 455 460 Leu Arg Thr Ile Arg Ile Lys Asp Gly Ile Ala Glu Val Arg Ala Gly 465 470 475 480 Ala Thr Leu Leu Tyr Asp Ser Asn Pro Glu Glu Glu Glu Ala Glu Thr 485 490 495 Glu Leu Lys Ala Ser Ala Met Ile Ala Ala Ile Arg Asp Ala Lys Ser 500 505 510 Ala Asn Ser Ala Lys Ser Ala Arg Asp Val Ala Ala Val Gly Ala Gly 515 520 525 Val Ser Ile Leu Leu Val Asp His Glu Asp Ser Phe Val His Thr Leu 530 535 540 Ala Asn Tyr Phe Arg Gln Thr Gly Ala Ser Val Thr Thr Val Arg Thr 545 550 555 560 Pro Val Ala Glu Glu Ile Phe Asp Arg Val Lys Pro Asp Leu Val Val 565 570 575 Leu Ser Pro Gly Pro Gly Thr Pro Lys Asp Phe Asp Cys Lys Ala Thr 580 585 590 Ile Lys Lys Ala Arg Ala Arg Asp Leu Pro Ile Phe Gly Val Cys Leu 595 600 605 Gly Leu Gln Ala Leu Ala Glu Ala Tyr Gly Gly Asp Leu Arg Gln Leu 610 615 620 Ala Ile Pro Met His Gly Lys Pro Ser Arg Ile Arg Val Leu Glu Pro 625 630 635 640 Gly Ile Val Phe Ser Gly Leu Gly Lys Glu Val Thr Val Gly Arg Tyr 645 650 655 His Ser Ile Phe Ala Asp Pro Ser Asn Leu Pro Arg Glu Phe Val Ile 660 665 670 Thr Ala Glu Ser Glu Asp Gly Thr Ile Met Gly Ile Glu His Ser Lys 675 680 685 Glu Pro Val Ala Ala Val Gln Phe His Pro Glu Ser Ile Met Thr Leu 690 695 700 Gly Gly Asp Ala Gly Met Arg Met Ile Glu Asn Val Val Ala His Leu 705 710 715 720 Ala Lys Arg Ala Lys Thr Lys Ala Ala 725 <210> 211 <211> 2190 <212> DNA <213> Sinorhizobium meliloti <400> 211 atggcagcgg taattctgga agacggcgcg gagagttata ccacgaaggg tggcatcgtc 60 gtcacccgca ggcggcgtga ggcatcctac agcgacgcga tcgccggtta tgtcgaccgg 120 ctggacgaac gccgcggcgc ggtcttttcc tgcaactacg aatatcccgg ccgctatacc 180 cgctgggaca ctgcggtggt cgacccgccg cttgccatct cctccttcgg tcgctcgctc 240 tggatcgaag cctataacga acgcggcgaa gtgctgctgg cgctgatcgc cgaggatctg 300 aagtccgttg ccgacatcac gctcggctca cttgccgccc gccgcctcga cctcaccatc 360 aacgagcccg atcgtgtctt caccgaggaa gagcggtcga agatgccgac ggtctttacg 420 gttcttcgcg cggtgacgaa cctcttccac tcggaggagg actcgaacct cggcctctat 480 ggcgccttcg gctacgacct cgccttccag ttcgatgcga tcgaactgaa gctttcgcgt 540 ccggacgacc agcgcgacat ggttctcttt ctgccggacg agatccttgt ggtcgatcac 600 tatgcggcca aggcctggat cgaccgctac gatttcgcca gggagaacct ttcgaccgag 660 ggcaaggcag cggacattgc tcccgagccg ttccgcagcg tcgacagcat cccgccgcac 720 ggggatcacc gcccgggcga atatgccgag ctcgtcgtca aggcgaagga aagcttccgt 780 cgcggcgatc ttttcgaagt ggtgccgggg cagaaattct acgagcgctg cgaaagccgc 840 ccgtccgaga tttccaaccg gctgaaggcg atcaatccgt cgccctattc cttcttcatc 900 aatctcggca accaggaata tctcgtcggt gcttcgccgg agatgttcgt gcgcgtttcc 960 ggccggcgca tcgagacctg cccgatctcc ggtacgatca agcgcggcga cgatccgatc 1020 gccgacagcg agcagatcct gaagctcttg aactcgaaga aggacgagtc cgagctcacc 1080 atgtgctcgg acgtcgaccg caacgacaag agccgggtct gcgtgccggg ctcggtcaag 1140 gtgatcggcc ggcgtcagat cgagatgtat tcgcggctga tccacacggt cgatcacatc 1200 gaggggcgcc tgcgcgacga tatggacgcc ttcgacgggt tcctcagcca cgcctgggcg 1260 gtgaccgtta ccggcgcgcc aaagctctgg gccatgcgct tcatcgagag ccacgagaag 1320 agcccgcgtg cctggtatgg cggcgcgatc ggcatggtcg gcttcaacgg cgacatgaat 1380 accgggctga ccttgcgtac catccgcatc aaggacggga tcgccgaggt gagggcgggt 1440 gcgacgctcc tctatgattc caatccggaa gaagaagaag ccgaaaccga actgaaggcc 1500 tctgccatga ttgcagccat ccgcgacgcg aaatccgcaa acagcgccaa atccgcgcgc 1560 gatgtcgccg ccgtcggcgc cggagtcagc atcctgctcg tcgatcacga ggacagcttc 1620 gtccataccc tcgcgaacta cttccgccag accggcgcgt ccgtcaccac cgtgcgcacg 1680 ccggtggccg aggaaatctt cgaccgggtc aagccggacc tcgtcgtgct ttcgcccggt 1740 cccggcaccc cgaaggactt cgactgcaag gcgacgatca agaaggcgcg ggcgcgggac 1800 ctgccgatct tcggcgtctg cctggggctg caggcgctcg cggaggccta tggcggcgac 1860 cttcgtcaac tggcgatccc gatgcatggg aagccctcgc gcatccgcgt gctcgaaccc 1920 ggcatcgtct tctccggcct cggcaaggag gtgacggtcg ggcgctatca ttcgattttc 1980 gccgatccgt ccaacctgcc gcgcgaattc gtgatcacgg ccgaaagcga agatggtacg 2040 atcatgggca tcgaacacag caaggagccg gtggcggccg tgcagttcca tccggaatcg 2100 atcatgacgc tgggcggcga cgccggcatg cggatgatcg agaacgtggt tgcccatctc 2160 gccaagcggg cgaagaccaa ggcagcctga 2190 <210> 212 <211> 729 <212> PRT <213> Sinorhizobium meliloti <400> 212 Met Ala Ala Val Ile Leu Glu Asp Gly Ala Glu Ser Tyr Thr Thr Lys 1 5 10 15 Gly Gly Ile Val Val Thr Arg Arg Arg Arg Glu Ala Ser Tyr Ser Asp 20 25 30 Ala Ile Ala Gly Tyr Val Asp Arg Leu Asp Glu Arg Arg Gly Ala Val 35 40 45 Phe Ser Cys Asn Tyr Glu Tyr Pro Gly Arg Tyr Thr Arg Trp Asp Thr 50 55 60 Ala Val Val Asp Pro Pro Leu Ala Ile Ser Ser Phe Gly Arg Ser Leu 65 70 75 80 Trp Ile Glu Ala Tyr Asn Glu Arg Gly Glu Val Leu Leu Ala Leu 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agcggtggcc gaaaaacggg cggaaaccct tgcaaatgct ggattttctg 720 cctgtggaca gcccctcaaa tgtcaatagg tgcgcccctc atctgtcagc actctgcccc 780 tcaagtgtca aggatcgcgc ccctcatctg tcagtagtcg cgcccctcaa gtgtcaatac 840 cgcagggcac ttatccccag gcttgtccac atcatctgtg ggaaactcgc gtaaaatcag 900 gcgttttcgc cgatttgcga ggctggccag ctccacgtcg ccggccgaaa tcgagcctgc 960 ccctcatctg tcaacgccgc gccgggtgag tcggcccctc aagtgtcaac gtccgcccct 1020 catctgtcag tgagggccaa gttttccgcg aggtatccac aacgccggcg gccggccgcg 1080 gtgtctcgca cacggcttcg acggcgtttc tggcgcgttt gcagggccat agacggccgc 1140 cagcccagcg gcgagggcaa ccagcccggt gagcgtcgga aagggtcgat cgaccgatgc 1200 ccttgagagc cttcaaccca gtcagctcct tccggtgggc gcggggcatg actatcgtcg 1260 ccgcacttat gactgtcttc tttatcatgc aactcgtagg acaggtgccg gcagcgctct 1320 gggtcatttt cggcgaggac cgctttcgct ggagcgcgac gatgatcggc ctgtcgcttg 1380 cggtattcgg aatcttgcac gccctcgctc aagccttcgt cactggtccc gccaccaaac 1440 gtttcggcga gaagcaggcc attatcgccg gcatggcggc cgacgcgctg ggctacgtct 1500 tgctggcgtt cgcgacgcga ggctggatgg ccttccccat tatgattctt ctcgcttccg 1560 gcggcatcgg gatgcccgcg ttgcaggcca tgctgtccag gcaggtagat gacgaccatc 1620 agggacagct tcaaggatcg ctcgcggctc ttaccagcct aacttcgatc attggaccgc 1680 tgatcgtcac ggcgatttat gccgcctcgg cgagcacatg gaacgggttg gcatggattg 1740 taggcgccgc cctatacctt gtctgcctcc ccgcgttgcg tcgcggtgca tggagccggg 1800 ccacctcgac ctgaatggaa gccggcggca cctcgctaac ggattcacca ctccaagaat 1860 tggagccaat caattcttgc ggagaactgt gaatgcgcaa accaaccctt ggcagaacat 1920 atccatcgcg tccgccatct ccagcagccg cacgcggcgc atctcgggca gcgttgggtc 1980 ctggccacgg gtgcgcatga tcgtgctcct gtcgttgagg acccggctag gctggcgggg 2040 ttgccttact ggttagcaga atgaatcacc gatacgcgag cgaacgtgaa gcgactgctg 2100 ctgcaaaacg tctgcgacct gagcaacaac atgaatggtc ttcggtttcc gtgtttcgta 2160 aagtctggaa acgcggaagt cagcgccctg caccattatg ttccggatct gcatcgcagg 2220 atgctgctgg ctaccctgtg gaacacctac atctgtatta acgaagcgct ggcattgacc 2280 ctgagtgatt tttctctggt cccgccgcat ccataccgcc agttgtttac cctcacaacg 2340 ttccagtaac cgggcatgtt 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tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc 3240 ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag 3300 gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc 3360 ttatccggta actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca 3420 gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg 3480 aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga aggacagtat ttggtatctg cgctctgctg 3540 aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct 3600 ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa 3660 gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa 3720 gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa 3780 tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatgc 3840 ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat agttgcctga 3900 ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg gagggcttac catctggccc cagtgctgca 3960 atgataccgc gagacccacg ctcaccggct ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc 4020 ggaagggccg agcgcagaag 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cgaagatcga actctccgat 13260 acgaaggctg cctgatgagc tcgaattccc gatcgttcaa acatttggca ataaagtttc 13320 ttaagattga atcctgttgc cggtcttgcg atgattatca tataatttct gttgaattac 13380 gttaagcatg taataattaa catgtaatgc atgacgttat ttatgagatg ggtttttatg 13440 attagagtcc cgcaattata catttaatac gcgatagaaa acaaaatata gcgcgcaaac 13500 taggataaat tatcgcgcgc ggtgtcatct atgttactag atcggggata acgatcaagc 13560 tataacttcg tataatgtat gctatacgaa gttatc 13596 <210> 214 <211> 13559 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pMON68066;Figure 49;the expression vector for Zm-ASA2-CTP +18::AgroAS(S51C)-nno <400> 214 gcgccaaatc gtgaagtttc tcatctaagc ccccatttgg acgtgaatgt agacacgtcg 60 aaataaagat ttccgaatta gaataatttg tttattgctt tcgcctataa atacgacgga 120 tcgtaatttg tcgttttatc aaaatgtact ttcattttat aataacgctg cggacatcta 180 catttttgaa ttgaaaaaaa attggtaatt actctttctt tttctccata ttgaccatca 240 tactcattgc tgatccatgt agatttcccg gacatgaagc catttacaat tgaatatatc 300 ctgccgccgc tgccgctttg cacccggtgg agcttgcatg ttggtttcta 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gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa 3780 tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatgc 3840 ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat agttgcctga 3900 ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg gagggcttac catctggccc cagtgctgca 3960 atgataccgc gagacccacg ctcaccggct ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc 4020 ggaagggccg agcgcagaag tggtcctgca actttatccg cctccatcca gtctattaat 4080 tgttgccggg aagctagagt aagtagttcg ccagttaata gtttgcgcaa cgttgttgcc 4140 attgctgcag gtcgggagca caggatgacg cctaacaatt cattcaagcc gacaccgctt 4200 cgcggcgcgg cttaattcag gagttaaaca tcatgaggga agcggtgatc gccgaagtat 4260 cgactcaact atcagaggta gttggcgtca tcgagcgcca tctcgaaccg acgttgctgg 4320 ccgtacattt gtacggctcc gcagtggatg gcggcctgaa gccacacagt gatattgatt 4380 tgctggttac ggtgaccgta aggcttgatg aaacaacgcg gcgagctttg atcaacgacc 4440 ttttggaaac ttcggcttcc cctggagaga gcgagattct ccgcgctgta gaagtcacca 4500 ttgttgtgca cgacgacatc attccgtggc gttatccagc taagcgcgaa ctgcaatttg 4560 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atcccgcatc agagtcctgg agcccggcct cgtcttctcc ggtctcggga aggaggtcac 9660 ggtcggtcgg tatcattcga tcttcgccga tccggcaacc ctcccgcgcg acttcatcat 9720 aaccgccgag tcggaggacg gaacgatcat gggaatcgaa cacgccaagg agcccgtagc 9780 tgcggttcag ttccaccctg agtccatcat gaccctcggt caagatgcgg gtatgcggat 9840 gatcgagaat gtggtggttc acctcacccg caaggccaag accaaggcag catgataggg 9900 atccgttggc aatgcggata aagaataact aaataaataa ataaataaat tgcaagcaat 9960 tgcgttgctg ctatgtactg taaaagtttc ttataatatc agttctgaat gctaaggaca 10020 tccctcaaga tggtctttct atttttgtgt tcccgttcca atgtactgtt ggtatcctct 10080 tggagattca tcaatatgag aaaacagaga atggacaacc ctcccttatc ttatggctcg 10140 agcggccgct ctagaactag tggatccccc ccttaattaa gggggctgca ggaattcata 10200 acttcgtata atgtatgcta tacgaagtta tgtttcgagg tcattcatat gcttgagaag 10260 agagtcggga tagtccaaaa taaaacaaag gtaagattac ctggtcaaaa gtgaaaacat 10320 cagttaaaag gtggtataaa gtaaaatatc ggtaataaaa ggtggcccaa agtgaaattt 10380 actcttttct actattataa aaattgagga tgtttttgtc ggtactttga tacgtcattt 10440 ttgtatgaat tggtttttaa gtttattcgc ttttggaaat gcatatctgt atttgagtcg 10500 ggttttaagt tcgtttgctt ttgtaaatac agagggattt gtataagaaa tatctttaga 10560 aaaacccata tgctaatttg acataatttt tgagaaaaat atatattcag gcgaattctc 10620 acaatgaaca ataataagat taaaatagct ttcccccgtt gcagcgcatg ggtatttttt 10680 ctagtaaaaa taaaagataa acttagactc aaaacattta caaaaacaac ccctaaagtt 10740 cctaaagccc aaagtgctat ccacgatcca tagcaagccc agcccaaccc aacccaaccc 10800 aacccacccc agtccagcca actggacaat agtctccaca cccccccact atcaccgtga 10860 gttgtccgca cgcaccgcac gtctcgcagc caaaaaaaaa aagaaagaaa aaaaagaaaa 10920 agaaaaaaca gcaggtgggt ccgggtcgtg ggggccggaa acgcgaggag gatcgcgagc 10980 cagcgacgag gccggccctc cctccgcttc caaagaaacg ccccccatcg ccactatata 11040 catacccccc cctctcctcc catcccccca accctaccac caccaccacc accacctcca 11100 cctcctcccc cctcgctgcc ggacgacgag ctcctccccc ctccccctcc gccgccgccg 11160 cgccggtaac caccccgccc ctctcctctt tctttctccg tttttttttc cgtctcggtc 11220 tcgatctttg gccttggtag tttgggtggg cgagaggcgg cttcgtgcgc 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gatcatcgat ggcgtcggca 12120 atggcggcct cctggcgcct gaggcgccgc tcgatttcgg caatgccgcc acgggctgcc 12180 gcctgacgat gggcctcgtc ggggtctacg atttcgacag caccttcatc ggcgacgcct 12240 cgctcacaaa gcgcccgatg ggccgcgtgt tgaacccgct gcgcgaaatg ggcgtgcagg 12300 tgaaatcgga agacggtgac cgtcttcccg ttaccttgcg cgggccgaag acgccgacgc 12360 cgatcaccta ccgcgtgccg atggcctccg cacaggtgaa gtccgccgtg ctgctcgccg 12420 gcctcaacac gcccggcatc acgacggtca tcgagccgat catgacgcgc gatcatacgg 12480 aaaagatgct gcagggcttt ggcgccaacc ttaccgtcga gacggatgcg gacggcgtgc 12540 gcaccatccg cctggaaggc cgcggcaagc tcaccggcca agtcatcgac gtgccgggcg 12600 acccgtcctc gacggccttc ccgctggttg cggccctgct tgttccgggc tccgacgtca 12660 ccatcctcaa cgtgctgatg aaccccaccc gcaccggcct catcctgacg ctgcaggaaa 12720 tgggcgccga catcgaagtc atcaacccgc gccttgccgg cggcgaagac gtggcggacc 12780 tgcgcgttcg ctcctccacg ctgaagggcg tcacggtgcc ggaagaccgc gcgccttcga 12840 tgatcgacga atatccgatt ctcgctgtcg ccgccgcctt cgcggaaggg gcgaccgtga 12900 tgaacggtct ggaagaactc cgcgtcaagg aaagcgaccg cctctcggcc gtcgccaatg 12960 gcctcaagct caatggcgtg gattgcgatg agggcgagac gtcgctcgtc gtgcgtggcc 13020 gccctgacgg caaggggctc ggcaacgcct cgggcgccgc cgtcgccacc catctcgatc 13080 accgcatcgc catgagcttc ctcgtcatgg gcctcgtgtc ggaaaaccct gtcacggtgg 13140 acgatgccac gatgatcgcc acgagcttcc cggagttcat ggacctgatg gccgggctgg 13200 gcgcgaagat cgaactctcc gatacgaagg ctgcctgatg agctcgaatt cccgatcgtt 13260 caaacatttg gcaataaagt ttcttaagat tgaatcctgt tgccggtctt gcgatgatta 13320 tcatataatt tctgttgaat tacgttaagc atgtaataat taacatgtaa tgcatgacgt 13380 tatttatgag atgggttttt atgattagag tcccgcaatt atacatttaa tacgcgatag 13440 aaaacaaaat atagcgcgca aactaggata aattatcgcg cgcggtgtca tctatgttac 13500 tagatcgggg ataacgatca agctataact tcgtataatg tatgctatac gaagttatc 13559 <210> 215 <211> 13905 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pMON69757;Figure 33;the expression vector for the construct containing the AgroAS(F298W) mutant allele <400> 215 gtcctccgat cgaggatttt tcggcgctgc gctacgtccg cgaccgcgtt gagggatcaa 60 gccacagcag cccactcgac cttctagccg acccagacga gccaagggat ctttttggaa 120 tgctgctccg tcgtcaggct ttccgacgtt tgggtggttg aacagaagtc attatcgcac 180 ggaatgccaa gcactcccga ggggaaccct gtggttggca tgcacataca aatggacgaa 240 cggataaacc ttttcacgcc cttttaaata tccgattatt ctaataaacg ctcttttctc 300 ttaggtttac ccgccaatat atcctgtcaa acactgatag tttaaactga aggcgggaaa 360 cgacaatctg atccccatca agctagcttc tgcaggtcct gctcgaggtc actaagcaac 420 taactttgag gaatgaggtg atgatgaatt aactcactcc attccacaaa ccaaacaaaa 480 atttgaggag tgagaagatg attgactatc tcattcctca aaccaaacac ctcaaatata 540 tctgctatcg ggattggcat tcctgtatcc ctacgcccgt gtaccccctg tttagagaac 600 ctccaaaggt ataagatggc gaagattatt gttgtcttgt ctttcatcat atatcgagtc 660 tttccctagg atattattat tggcaatgag cattacacgg ttaatcgatt gagagaacat 720 gcatctcacc ttcagcaaat aattacgata atccatattt tacgcttcgt aacttctcat 780 gagtttcgat atacaaattt gttttctgga caccctacca ttcatcctct tcggagaaga 840 gaggaagtgt cctcaattta aatatgttgt catgctgtag ttcttcacaa aatctcaaca 900 ggtaccaagc acattgtttc cacaaattat attttagtca caataaatct atattattat 960 taatatacta aaactatact gacgctcaga tgcttttact agttcttgct agtatgtgat 1020 gtaggtctac gtggaccaga aaatagtgag acacggaaga caaaagaagt aaaagaggcc 1080 cggactacgg cccacatgag attcggcccc gccacctccg gcaaccagcg gccgatccaa 1140 cggcagtgcg cgcacacaca caacctcgta tatatcgccg cgcggaagcg gcgcgaccga 1200 ggaagccttg tcctcgacac cccctacaca ggtgtcgcgc tgcccccgac acgagtcccg 1260 catgcgtccc acgcggccgc gccagatccc gcctccgcgc gttgccacgc cctctataaa 1320 cacccagctc tccctcgccc tcatctacct cactcgtagt cgtagctcaa gcatcagcgg 1380 cagcggcagc ggcaggatct ctgggcagcg tgcgcacgtg gggtatctag ctcgctctgc 1440 tagcctacca atcgaattcc tgcaggtcga ctctagagga tctaccgtct tcggtacgcg 1500 ctcactccgc cctctgcctt tgttactgcc acgtttctct gaatgctctc ttgtgtggtg 1560 attgctgaga gtggtttagc tggatctaga attacactct gaaatcgtgt tctgcctgtg 1620 ctgattactt gccgtccttt gtagcagcaa aatataggga catggtagta cgaaacgaag 1680 atagaaccta cacagcaata cgagaaatgt gtaatttggt gcttagcggt atttatttaa 1740 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ttcgactgca aggcaacgat caaggccgcc cgcgcccgcg atctgccgat cttcggcgtt 4320 tgcctcggtc tgcaggcatt ggcagaagcc tatggcggcg agctgcgcca gcttgctgtg 4380 cccatgcacg gcaagccttc gcgcatccgc gtgctggaac ccggcctcgt cttctccggt 4440 ctcggcaagg aagtcacggt cggtcgttac cattcgatct tcgccgatcc cgccaccctg 4500 ccgcgtgatt tcatcatcac cgcagaaagc gaggacggca cgatcatggg catcgaacac 4560 gccaaggaac cggtggccgc cgttcagttc cacccggaat cgatcatgac gctcggacag 4620 gacgcgggca tgcggatgat cgagaatgtc gtggtgcatc tgacccgcaa ggcgaagacc 4680 aaggccgcgt gatggcgctc gatgacacgg ttatatcact agtgcggcca tcggatccgg 4740 ggatcgatga gctaagctag ctatatcatc aatttatgta ttacacataa tatcgcactc 4800 agtctttcat ctacggcaat gtaccagctg atataatcag ttattgaaat atttctgaat 4860 ttaaacttgc atcaataaat ttatgttttt gcttggacta taatacctga cttgttattt 4920 tatcaataaa tatttaaact atatttcttt caagatatca ttctttacaa gtatacgtgt 4980 ttaaattgaa taccataaat ttttattttt caaatacatg taaaattatg aaatgggagt 5040 ggtggcgacc gagctcaagc acacttcaat tcctataacg gaccaaatcg caaaaattat 5100 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cgcacagggc gcagccctgg ttaaaaacaa ggtttataaa tattggttta aaagcaggtt 9360 aaaagacagg ttagcggtgg ccgaaaaacg ggcggaaacc cttgcaaatg ctggattttc 9420 tgcctgtgga cagcccctca aatgtcaata ggtgcgcccc tcatctgtca gcactctgcc 9480 cctcaagtgt caaggatcgc gcccctcatc tgtcagtagt cgcgcccctc aagtgtcaat 9540 accgcagggc acttatcccc aggcttgtcc acatcatctg tgggaaactc gcgtaaaatc 9600 aggcgttttc gccgatttgc gaggctggcc agctccacgt cgccggccga aatcgagcct 9660 gcccctcatc tgtcaacgcc gcgccgggtg agtcggcccc tcaagtgtca acgtccgccc 9720 ctcatctgtc agtgagggcc aagttttccg cgaggtatcc acaacgccgg cggccggccg 9780 cggtgtctcg cacacggctt cgacggcgtt tctggcgcgt ttgcagggcc atagacggcc 9840 gccagcccag cggcgagggc aaccagcccg gtgagcgtcg gaaagggtcg atcgaccgat 9900 gcccttgaga gccttcaacc cagtcagctc cttccggtgg gcgcggggca tgactatcgt 9960 cgccgcactt atgactgtct tctttatcat gcaactcgta ggacaggtgc cggcagcgct 10020 ctgggtcatt ttcggcgagg accgctttcg ctggagcgcg acgatgatcg gcctgtcgct 10080 tgcggtattc ggaatcttgc acgccctcgc tcaagccttc gtcactggtc ccgccaccaa 10140 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ctggcattga 10980 ccctgagtga tttttctctg gtcccgccgc atccataccg ccagttgttt accctcacaa 11040 cgttccagta accgggcatg ttcatcatca gtaacccgta tcgtgagcat cctctctcgt 11100 ttcatcggta tcattacccc catgaacaga aatccccctt acacggaggc atcagtgacc 11160 aaacaggaaa aaaccgccct taacatggcc cgctttatca gaagccagac attaacgctt 11220 ctggagaaac tcaacgagct ggacgcggat gaacaggcag acatctgtga atcgcttcac 11280 gaccacgctg atgagcttta ccgcagctgc ctcgcgcgtt tcggtgatga cggtgaaaac 11340 ctctgacaca tgcagctccc ggagacggtc acagcttgtc tgtaagcgga tgccgggagc 11400 agacaagccc gtcagggcgc gtcagcgggt gttggcgggt gtcggggcgc agccatgacc 11460 cagtcacgta gcgatagcgg agtgtatact ggcttaacta tgcggcatca gagcagattg 11520 tactgagagt gcaccatatg cggtgtgaaa taccgcacag atgcgtaagg agaaaatacc 11580 gcatcaggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc 11640 ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata 11700 acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg 11760 cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct 11820 caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa 11880 gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc 11940 tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt 12000 aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg 12060 ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg 12120 cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct 12180 tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc 12240 tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg 12300 ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc 12360 aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt 12420 aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa 12480 aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat 12540 gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct 12600 gactccccgt cgtgtagata actacgatac 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cgcccgactg ggctggcgat gagcgaaatg tagtgcttac 13500 gttgtcccgc atttggtaca gcgcagtaac cggcaaaatc gcgccgaagg atgtcgctgc 13560 cgactgggca atggagcgcc tgccggccca gtatcagccc gtcatacttg aagctaggca 13620 ggcttatctt ggacaagaag atcgcttggc ctcgcgcgca gatcagttgg aagaatttgt 13680 tcactacgtg aaaggcgaga tcaccaaggt agtcggcaaa taatgtctaa caattcgttc 13740 aagccgacgc cgcttcgcgg cgcggcttaa ctcaagcgtt agatgctgca ggcatcgtgg 13800 tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag 13860 ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc cttcg 13905 <210> 216 <211> 13905 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pMON69770;Figure 37;the expression vector for the construct containing the AgroAS(S51C) non-optimized allele <400> 216 tcgaggattt ttcggcgctg cgctacgtcc gcgaccgcgt tgagggatca agccacagca 60 gcccactcga ccttctagcc gacccagacg agccaaggga tctttttgga atgctgctcc 120 gtcgtcaggc tttccgacgt ttgggtggtt gaacagaagt cattatcgca cggaatgcca 180 agcactcccg aggggaaccc tgtggttggc atgcacatac aaatggacga acggataaac 240 cttttcacgc ccttttaaat atccgattat tctaataaac gctcttttct cttaggttta 300 cccgccaata tatcctgtca aacactgata gtttaaactg aaggcgggaa acgacaatct 360 gatccccatc aagctagctt ctgcaggtcc tgctcgaggt cactaagcaa ctaactttga 420 ggaatgaggt gatgatgaat taactcactc cattccacaa accaaacaaa aatttgagga 480 gtgagaagat gattgactat ctcattcctc aaaccaaaca cctcaaatat atctgctatc 540 gggattggca ttcctgtatc cctacgcccg tgtaccccct gtttagagaa cctccaaagg 600 tataagatgg cgaagattat tgttgtcttg tctttcatca tatatcgagt ctttccctag 660 gatattatta ttggcaatga gcattacacg gttaatcgat tgagagaaca tgcatctcac 720 cttcagcaaa taattacgat aatccatatt ttacgcttcg taacttctca tgagtttcga 780 tatacaaatt tgttttctgg acaccctacc attcatcctc ttcggagaag agaggaagtg 840 tcctcaattt aaatatgttg tcatgctgta gttcttcaca aaatctcaac aggtaccaag 900 cacattgttt ccacaaatta tattttagtc acaataaatc tatattatta ttaatatact 960 aaaactatac tgacgctcag atgcttttac tagttcttgc tagtatgtga tgtaggtcta 1020 cgtggaccag aaaatagtga gacacggaag acaaaagaag taaaagaggc ccggactacg 1080 gcccacatga gattcggccc cgccacctcc ggcaaccagc ggccgatcca acggcagtgc 1140 gcgcacacac acaacctcgt atatatcgcc gcgcggaagc ggcgcgaccg aggaagcctt 1200 gtcctcgaca ccccctacac aggtgtcgcg ctgcccccga cacgagtccc gcatgcgtcc 1260 cacgcggccg cgccagatcc cgcctccgcg cgttgccacg ccctctataa acacccagct 1320 ctccctcgcc ctcatctacc tcactcgtag tcgtagctca agcatcagcg gcagcggcag 1380 cggcaggatc tctgggcagc gtgcgcacgt ggggtatcta gctcgctctg ctagcctacc 1440 aatcgaattc ctgcaggtcg actctagagg atctaccgtc ttcggtacgc gctcactccg 1500 ccctctgcct ttgttactgc cacgtttctc tgaatgctct cttgtgtggt gattgctgag 1560 agtggtttag ctggatctag aattacactc tgaaatcgtg ttctgcctgt gctgattact 1620 tgccgtcctt tgtagcagca aaatataggg acatggtagt acgaaacgaa gatagaacct 1680 acacagcaat acgagaaatg tgtaatttgg tgcttagcgg tatttattta agcacatgtt 1740 ggtgttatag ggcacttgga ttcagaagtt tgctgttaat ttaggcacag gcttcatact 1800 acatgggtca atagtatagg gattcatatt ataggcgata ctataataat ttgttcgtct 1860 gcagagctta ttatttgcca aaattagata ttcctattct gtttttgttt gtgtgctgtt 1920 aaattgttaa cgcctgaagg aataaatata aatgacgaaa ttttgatgtt tatctctgct 1980 cctttattgt gaccataagt caagatcaga tgcacttgtt ttaaatattg ttgtctgaag 2040 aaataagtac tgacagtatt ttgatgcatt gatctgcttg tttgttgtaa caaaatttaa 2100 aaataaagag tttccttttt gttgctctcc ttacctcctg atggtatcta gtatctacca 2160 actgacacta tattgcttct ctttacatac gtatcttgct cgatgccttc tccctagtgt 2220 tgaccagtgt tactcacata gtctttgctc atttcattgt aatgcagata ccaagcggcc 2280 tctagaggac tccgatctat ggaatcccta gccgccacct ccgtgttcgc gccctcccgc 2340 gtcgccgtcc cggcggcgcg ggccctggtt agggcgggga cggtggtacc aaccaggcgg 2400 acgagcagcc ggagcggaac cagcggggtg aaatgctctg ctgccgtgac gccgcaggcg 2460 agcccagtga ttagcaggag cgctgcggcg gccatggtaa cgatcattca ggatgacgga 2520 gcggagacct acgagacgaa aggcggcatc caggtcagcc gaaagcgccg gcccaccgat 2580 tatgccaacg ccatcgataa ttacatcgaa aagcttgatt cccatcgcgg cgcggttttt 2640 tcgtgcaact atgaatatcc gggccgttac acccgctggg atacggccat cgtcgatccg 2700 ccgctcggca tttcctgttt tggccgcaag atgtggatcg aagcctataa tggccgcggc 2760 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aagagccgcg tctgcgagcc gggttcggtg aaggtcattg gccgccgcca gatcgagatg 3660 tattcacgcc tcatccacac cgtcgatcac atcgaaggcc gcctgcgcga cgatatggac 3720 gcctttgacg gtttcctcag ccacgcctgg gccgtcaccg tcaccggtgc accaaagctg 3780 tgggccatgc gcttcatcga aggtcatgaa aagagcccgc gcgcctggta tggcggtgcg 3840 atcggcatgg tcggcttcaa cggcgacatg aataccggcc tgacgctgcg caccatccgg 3900 atcaaggacg gtattgccga agtgcgcgcc ggcgcgaccc tgctcaatga ttccaacccg 3960 caggaagaag aagccgaaac cgaactgaag gcctccgcca tgatatcagc cattcgtgac 4020 gcaaaaggca ccaactctgc cgccaccaag cgtgatgccg ccaaagtcgg caccggcgtc 4080 aagatcctgc tcgtcgacca cgaagacagc ttcgtgcaca cgctggcgaa ttatttccgc 4140 cagacgggcg cgacggtctc gaccgtcaga tcaccggtcg cagccgacgt gttcgatcgc 4200 ttccagccgg acctcgttgt cctgtcgccc ggacccggca gcccgacgga tttcgactgc 4260 aaggcaacga tcaaggccgc ccgcgcccgc gatctgccga tcttcggcgt ttgcctcggt 4320 ctgcaggcat tggcagaagc ctatggcggc gagctgcgcc agcttgctgt gcccatgcac 4380 ggcaagcctt cgcgcatccg cgtgctggaa cccggcctcg tcttctccgg tctcggcaag 4440 gaagtcacgg tcggtcgtta ccattcgatc ttcgccgatc ccgccaccct gccgcgtgat 4500 ttcatcatca ccgcagaaag cgaggacggc acgatcatgg gcatcgaaca cgccaaggaa 4560 ccggtggccg ccgttcagtt ccacccggaa tcgatcatga cgctcggaca ggacgcgggc 4620 atgcggatga tcgagaatgt cgtggtgcat ctgacccgca aggcgaagac caaggccgcg 4680 tgatggcgct cgatgacacg gttatatcac tagtgcggcc atcggatccg gggatcgatg 4740 agctaagcta gctatatcat caatttatgt attacacata atatcgcact cagtctttca 4800 tctacggcaa tgtaccagct gatataatca gttattgaaa tatttctgaa tttaaacttg 4860 catcaataaa tttatgtttt tgcttggact ataatacctg acttgttatt ttatcaataa 4920 atatttaaac tatatttctt tcaagatatc attctttaca agtatacgtg tttaaattga 4980 ataccataaa tttttatttt tcaaatacat gtaaaattat gaaatgggag tggtggcgac 5040 cgagctcaag cacacttcaa ttcctataac ggaccaaatc gcaaaaatta taataacata 5100 ttatttcatc ctggattaaa agaaagtcac cggggattat tttgtgacgc cgattacata 5160 cggcgacaat aaagacattg gaaatcgtag tacatattgg aatacactga ttatattaat 5220 gatgaataca tactttaata tccttacgta ggatcgatcc gaatttcgac ctcgagcggc 5280 cgctctagaa ctagtggatc ccccccttaa ttaagggggc tgcaggaatt cataacttcg 5340 tataatgtat gctatacgaa gttatgtttc gaggtcattc atatgcttga gaagagagtc 5400 gggatagtcc aaaataaaac aaaggtaaga ttacctggtc aaaagtgaaa acatcagtta 5460 aaaggtggta taaagtaaaa tatcggtaat aaaaggtggc ccaaagtgaa atttactctt 5520 ttctactatt ataaaaattg aggatgtttt tgtcggtact ttgatacgtc atttttgtat 5580 gaattggttt ttaagtttat tcgcttttgg aaatgcatat ctgtatttga gtcgggtttt 5640 aagttcgttt gcttttgtaa atacagaggg atttgtataa gaaatatctt tagaaaaacc 5700 catatgctaa tttgacataa tttttgagaa aaatatatat tcaggcgaat tctcacaatg 5760 aacaataata agattaaaat agctttcccc cgttgcagcg catgggtatt ttttctagta 5820 aaaataaaag ataaacttag actcaaaaca tttacaaaaa caacccctaa agttcctaaa 5880 gcccaaagtg ctatccacga tccatagcaa gcccagccca acccaaccca acccaaccca 5940 ccccagtcca gccaactgga caatagtctc cacacccccc cactatcacc gtgagttgtc 6000 cgcacgcacc gcacgtctcg cagccaaaaa aaaaaagaaa gaaaaaaaag aaaaagaaaa 6060 aacagcaggt gggtccgggt cgtgggggcc ggaaacgcga ggaggatcgc gagccagcga 6120 cgaggccggc cctccctccg cttccaaaga aacgcccccc atcgccacta tatacatacc 6180 cccccctctc ctcccatccc cccaacccta ccaccaccac caccaccacc tccacctcct 6240 cccccctcgc tgccggacga cgagctcctc ccccctcccc ctccgccgcc gccgcgccgg 6300 taaccacccc gcccctctcc tctttctttc tccgtttttt tttccgtctc ggtctcgatc 6360 tttggccttg gtagtttggg tgggcgagag gcggcttcgt gcgcgcccag atcggtgcgc 6420 gggaggggcg ggatctcgcg gctggggctc tcgccggcgt ggatccggcc cggatctcgc 6480 ggggaatggg gctctcggat gtagatctgc gatccgccgt tgttggggga gatgatgggg 6540 ggtttaaaat ttccgccgtg ctaaacaaga tcaggaagag gggaaaaggg cactatggtt 6600 tatattttta tatatttctg ctgcttcgtc aggcttagat gtgctagatc tttctttctt 6660 ctttttgtgg gtagaatttg aatccctcag cattgttcat cggtagtttt tcttttcatg 6720 atttgtgaca aatgcagcct cgtgcggagc ttttttgtag gtagaagtga tcaaccatgg 6780 cgcaagttag cagaatctgc aatggtgtgc agaacccatc tcttatctcc aatctctcga 6840 aatccagtca acgcaaatct cccttatcgg tttctctgaa gacgcagcag catccacgag 6900 cttatccgat ttcgtcgtcg tggggattga agaagagtgg gatgacgtta attggctctg 6960 agcttcgtcc tcttaaggtc atgtcttctg tttccacggc gtgcatgctt cacggtgcaa 7020 gcagccggcc cgcaaccgcc cgcaaatcct ctggcctttc cggaaccgtc cgcattcccg 7080 gcgacaagtc gatctcccac cggtccttca tgttcggcgg tctcgcgagc ggtgaaacgc 7140 gcatcaccgg ccttctggaa ggcgaggacg tcatcaatac gggcaaggcc atgcaggcga 7200 tgggcgcccg catccgtaag gaaggcgaca cctggatcat cgatggcgtc ggcaatggcg 7260 gcctcctggc gcctgaggcg ccgctcgatt tcggcaatgc cgccacgggc tgccgcctga 7320 cgatgggcct cgtcggggtc tacgatttcg acagcacctt catcggcgac gcctcgctca 7380 caaagcgccc gatgggccgc gtgttgaacc cgctgcgcga aatgggcgtg caggtgaaat 7440 cggaagacgg tgaccgtctt cccgttacct tgcgcgggcc gaagacgccg acgccgatca 7500 cctaccgcgt gccgatggcc tccgcacagg tgaagtccgc cgtgctgctc gccggcctca 7560 acacgcccgg catcacgacg gtcatcgagc cgatcatgac gcgcgatcat acggaaaaga 7620 tgctgcaggg ctttggcgcc aaccttaccg tcgagacgga tgcggacggc gtgcgcacca 7680 tccgcctgga aggccgcggc aagctcaccg gccaagtcat cgacgtgccg ggcgacccgt 7740 cctcgacggc cttcccgctg gttgcggccc tgcttgttcc gggctccgac gtcaccatcc 7800 tcaacgtgct gatgaacccc acccgcaccg gcctcatcct gacgctgcag gaaatgggcg 7860 ccgacatcga agtcatcaac ccgcgccttg ccggcggcga agacgtggcg gacctgcgcg 7920 ttcgctcctc cacgctgaag ggcgtcacgg tgccggaaga ccgcgcgcct tcgatgatcg 7980 acgaatatcc gattctcgct gtcgccgccg ccttcgcgga aggggcgacc gtgatgaacg 8040 gtctggaaga actccgcgtc aaggaaagcg accgcctctc ggccgtcgcc aatggcctca 8100 agctcaatgg cgtggattgc gatgagggcg agacgtcgct cgtcgtgcgt ggccgccctg 8160 acggcaaggg gctcggcaac gcctcgggcg ccgccgtcgc cacccatctc gatcaccgca 8220 tcgccatgag cttcctcgtc atgggcctcg tgtcggaaaa ccctgtcacg gtggacgatg 8280 ccacgatgat cgccacgagc ttcccggagt tcatggacct gatggccggg ctgggcgcga 8340 agatcgaact ctccgatacg aaggctgcct gatgagctcg aattcccgat cgttcaaaca 8400 tttggcaata aagtttctta agattgaatc ctgttgccgg tcttgcgatg attatcatat 8460 aatttctgtt gaattacgtt aagcatgtaa taattaacat gtaatgcatg acgttattta 8520 tgagatgggt ttttatgatt agagtcccgc aattatacat ttaatacgcg atagaaaaca 8580 aaatatagcg cgcaaactag gataaattat cgcgcgcggt gtcatctatg ttactagatc 8640 ggggataacg atcaagctat aacttcgtat aatgtatgct atacgaagtt atcgcgccaa 8700 atcgtgaagt ttctcatcta agcccccatt tggacgtgaa tgtagacacg tcgaaataaa 8760 gatttccgaa ttagaataat ttgtttattg ctttcgccta taaatacgac ggatcgtaat 8820 ttgtcgtttt atcaaaatgt actttcattt tataataacg ctgcggacat ctacattttt 8880 gaattgaaaa aaaattggta attactcttt ctttttctcc atattgacca tcatactcat 8940 tgctgatcca tgtagatttc ccggacatga agccatttac aattgaatat atcctgccgc 9000 cgctgccgct ttgcacccgg tggagcttgc atgttggttt ctacgcagaa ctgagccggt 9060 taggcagata atttccattg agaactgagc catgtgcacc ttccccccaa cacggtgagc 9120 gacggggcaa cggagtgatc cacatgggac ttttcctagc ttggctgcca tttttggggt 9180 gaggccgttc gcggccgagg ggcgcagccc ctggggggat gggaggcccg cgttagcggg 9240 ccgggagggt tcgagaaggg ggggcacccc ccttcggcgt gcgcggtcac gcgcacaggg 9300 cgcagccctg gttaaaaaca aggtttataa atattggttt aaaagcaggt taaaagacag 9360 gttagcggtg gccgaaaaac gggcggaaac ccttgcaaat gctggatttt ctgcctgtgg 9420 acagcccctc aaatgtcaat aggtgcgccc ctcatctgtc agcactctgc ccctcaagtg 9480 tcaaggatcg cgcccctcat ctgtcagtag tcgcgcccct caagtgtcaa taccgcaggg 9540 cacttatccc caggcttgtc cacatcatct gtgggaaact cgcgtaaaat caggcgtttt 9600 cgccgatttg cgaggctggc cagctccacg tcgccggccg aaatcgagcc tgcccctcat 9660 ctgtcaacgc cgcgccgggt gagtcggccc ctcaagtgtc aacgtccgcc cctcatctgt 9720 cagtgagggc caagttttcc gcgaggtatc cacaacgccg gcggccggcc gcggtgtctc 9780 gcacacggct tcgacggcgt ttctggcgcg tttgcagggc catagacggc cgccagccca 9840 gcggcgaggg caaccagccc ggtgagcgtc ggaaagggtc gatcgaccga tgcccttgag 9900 agccttcaac ccagtcagct ccttccggtg ggcgcggggc atgactatcg tcgccgcact 9960 tatgactgtc ttctttatca tgcaactcgt aggacaggtg ccggcagcgc tctgggtcat 10020 tttcggcgag gaccgctttc gctggagcgc gacgatgatc ggcctgtcgc ttgcggtatt 10080 cggaatcttg cacgccctcg ctcaagcctt cgtcactggt cccgccacca aacgtttcgg 10140 cgagaagcag gccattatcg ccggcatggc ggccgacgcg ctgggctacg tcttgctggc 10200 gttcgcgacg cgaggctgga tggccttccc cattatgatt cttctcgctt ccggcggcat 10260 cgggatgccc gcgttgcagg ccatgctgtc caggcaggta gatgacgacc atcagggaca 10320 gcttcaagga tcgctcgcgg ctcttaccag cctaacttcg atcattggac cgctgatcgt 10380 cacggcgatt tatgccgcct cggcgagcac atggaacggg ttggcatgga ttgtaggcgc 10440 cgccctatac cttgtctgcc tccccgcgtt gcgtcgcggt gcatggagcc gggccacctc 10500 gacctgaatg gaagccggcg gcacctcgct aacggattca ccactccaag aattggagcc 10560 aatcaattct tgcggagaac tgtgaatgcg caaaccaacc cttggcagaa catatccatc 10620 gcgtccgcca tctccagcag ccgcacgcgg cgcatctcgg gcagcgttgg gtcctggcca 10680 cgggtgcgca tgatcgtgct cctgtcgttg aggacccggc taggctggcg gggttgcctt 10740 actggttagc agaatgaatc accgatacgc gagcgaacgt gaagcgactg ctgctgcaaa 10800 acgtctgcga cctgagcaac aacatgaatg gtcttcggtt tccgtgtttc gtaaagtctg 10860 gaaacgcgga agtcagcgcc ctgcaccatt atgttccgga tctgcatcgc aggatgctgc 10920 tggctaccct gtggaacacc tacatctgta ttaacgaagc gctggcattg accctgagtg 10980 atttttctct ggtcccgccg catccatacc gccagttgtt taccctcaca acgttccagt 11040 aaccgggcat gttcatcatc agtaacccgt atcgtgagca tcctctctcg tttcatcggt 11100 atcattaccc ccatgaacag aaatccccct tacacggagg catcagtgac 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cctcgcgcgc agatcagttg gaagaatttg ttcactacgt 13680 gaaaggcgag atcaccaagg tagtcggcaa ataatgtcta acaattcgtt caagccgacg 13740 ccgcttcgcg gcgcggctta actcaagcgt tagatgctgc aggcatcgtg gtgtcacgct 13800 cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat 13860 cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc tccga 13905 <210> 217 <211> 13905 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pMON69768;Figure 36;the expression vector for the construct containing the AgroAS(S51F) mutant allele <400> 217 tcgaggattt ttcggcgctg cgctacgtcc gcgaccgcgt tgagggatca agccacagca 60 gcccactcga ccttctagcc gacccagacg agccaaggga tctttttgga atgctgctcc 120 gtcgtcaggc tttccgacgt ttgggtggtt gaacagaagt cattatcgca cggaatgcca 180 agcactcccg aggggaaccc tgtggttggc atgcacatac aaatggacga acggataaac 240 cttttcacgc ccttttaaat atccgattat tctaataaac gctcttttct cttaggttta 300 cccgccaata tatcctgtca aacactgata gtttaaactg aaggcgggaa acgacaatct 360 gatccccatc aagctagctt ctgcaggtcc tgctcgaggt cactaagcaa ctaactttga 420 ggaatgaggt gatgatgaat taactcactc cattccacaa accaaacaaa aatttgagga 480 gtgagaagat gattgactat ctcattcctc aaaccaaaca cctcaaatat atctgctatc 540 gggattggca ttcctgtatc cctacgcccg tgtaccccct gtttagagaa cctccaaagg 600 tataagatgg cgaagattat tgttgtcttg tctttcatca tatatcgagt ctttccctag 660 gatattatta ttggcaatga gcattacacg gttaatcgat tgagagaaca tgcatctcac 720 cttcagcaaa taattacgat aatccatatt ttacgcttcg taacttctca tgagtttcga 780 tatacaaatt tgttttctgg acaccctacc attcatcctc ttcggagaag agaggaagtg 840 tcctcaattt aaatatgttg tcatgctgta gttcttcaca aaatctcaac aggtaccaag 900 cacattgttt ccacaaatta tattttagtc acaataaatc tatattatta ttaatatact 960 aaaactatac tgacgctcag atgcttttac tagttcttgc tagtatgtga tgtaggtcta 1020 cgtggaccag aaaatagtga gacacggaag acaaaagaag taaaagaggc ccggactacg 1080 gcccacatga gattcggccc cgccacctcc ggcaaccagc ggccgatcca acggcagtgc 1140 gcgcacacac acaacctcgt atatatcgcc gcgcggaagc ggcgcgaccg aggaagcctt 1200 gtcctcgaca ccccctacac aggtgtcgcg ctgcccccga cacgagtccc gcatgcgtcc 1260 cacgcggccg 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gcttcatcga aggtcatgaa aagagcccgc gcgcctggta tggcggtgcg 3840 atcggcatgg tcggcttcaa cggcgacatg aataccggcc tgacgctgcg caccatccgg 3900 atcaaggacg gtattgccga agtgcgcgcc ggcgcgaccc tgctcaatga ttccaacccg 3960 caggaagaag aagccgaaac cgaactgaag gcctccgcca tgatatcagc cattcgtgac 4020 gcaaaaggca ccaactctgc cgccaccaag cgtgatgccg ccaaagtcgg caccggcgtc 4080 aagatcctgc tcgtcgacca cgaagacagc ttcgtgcaca cgctggcgaa ttatttccgc 4140 cagacgggcg cgacggtctc gaccgtcaga tcaccggtcg cagccgacgt gttcgatcgc 4200 ttccagccgg acctcgttgt cctgtcgccc ggacccggca gcccgacgga tttcgactgc 4260 aaggcaacga tcaaggccgc ccgcgcccgc gatctgccga tcttcggcgt ttgcctcggt 4320 ctgcaggcat tggcagaagc ctatggcggc gagctgcgcc agcttgctgt gcccatgcac 4380 ggcaagcctt cgcgcatccg cgtgctggaa cccggcctcg tcttctccgg tctcggcaag 4440 gaagtcacgg tcggtcgtta ccattcgatc ttcgccgatc ccgccaccct gccgcgtgat 4500 ttcatcatca ccgcagaaag cgaggacggc acgatcatgg gcatcgaaca cgccaaggaa 4560 ccggtggccg ccgttcagtt ccacccggaa tcgatcatga cgctcggaca ggacgcgggc 4620 atgcggatga 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gattctcgct gtcgccgccg ccttcgcgga aggggcgacc gtgatgaacg 8040 gtctggaaga actccgcgtc aaggaaagcg accgcctctc ggccgtcgcc aatggcctca 8100 agctcaatgg cgtggattgc gatgagggcg agacgtcgct cgtcgtgcgt ggccgccctg 8160 acggcaaggg gctcggcaac gcctcgggcg ccgccgtcgc cacccatctc gatcaccgca 8220 tcgccatgag cttcctcgtc atgggcctcg tgtcggaaaa ccctgtcacg gtggacgatg 8280 ccacgatgat cgccacgagc ttcccggagt tcatggacct gatggccggg ctgggcgcga 8340 agatcgaact ctccgatacg aaggctgcct gatgagctcg aattcccgat cgttcaaaca 8400 tttggcaata aagtttctta agattgaatc ctgttgccgg tcttgcgatg attatcatat 8460 aatttctgtt gaattacgtt aagcatgtaa taattaacat gtaatgcatg acgttattta 8520 tgagatgggt ttttatgatt agagtcccgc aattatacat ttaatacgcg atagaaaaca 8580 aaatatagcg cgcaaactag gataaattat cgcgcgcggt gtcatctatg ttactagatc 8640 ggggataacg atcaagctat aacttcgtat aatgtatgct atacgaagtt atcgcgccaa 8700 atcgtgaagt ttctcatcta agcccccatt tggacgtgaa tgtagacacg tcgaaataaa 8760 gatttccgaa ttagaataat ttgtttattg ctttcgccta taaatacgac ggatcgtaat 8820 ttgtcgtttt 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gacctgaatg gaagccggcg gcacctcgct aacggattca ccactccaag aattggagcc 10560 aatcaattct tgcggagaac tgtgaatgcg caaaccaacc cttggcagaa catatccatc 10620 gcgtccgcca tctccagcag ccgcacgcgg cgcatctcgg gcagcgttgg gtcctggcca 10680 cgggtgcgca tgatcgtgct cctgtcgttg aggacccggc taggctggcg gggttgcctt 10740 actggttagc agaatgaatc accgatacgc gagcgaacgt gaagcgactg ctgctgcaaa 10800 acgtctgcga cctgagcaac aacatgaatg gtcttcggtt tccgtgtttc gtaaagtctg 10860 gaaacgcgga agtcagcgcc ctgcaccatt atgttccgga tctgcatcgc aggatgctgc 10920 tggctaccct gtggaacacc tacatctgta ttaacgaagc gctggcattg accctgagtg 10980 atttttctct ggtcccgccg catccatacc gccagttgtt taccctcaca acgttccagt 11040 aaccgggcat gttcatcatc agtaacccgt atcgtgagca tcctctctcg tttcatcggt 11100 atcattaccc ccatgaacag aaatccccct tacacggagg catcagtgac caaacaggaa 11160 aaaaccgccc ttaacatggc ccgctttatc agaagccaga cattaacgct tctggagaaa 11220 ctcaacgagc tggacgcgga tgaacaggca gacatctgtg aatcgcttca cgaccacgct 11280 gatgagcttt accgcagctg cctcgcgcgt ttcggtgatg acggtgaaaa cctctgacac 11340 atgcagctcc cggagacggt cacagcttgt ctgtaagcgg atgccgggag cagacaagcc 11400 cgtcagggcg cgtcagcggg tgttggcggg tgtcggggcg cagccatgac ccagtcacgt 11460 agcgatagcg gagtgtatac tggcttaact atgcggcatc agagcagatt gtactgagag 11520 tgcaccatat gcggtgtgaa ataccgcaca gatgcgtaag gagaaaatac cgcatcaggc 11580 gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg 11640 tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa 11700 agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg 11760 cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga 11820 ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg 11880 tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg 11940 gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc 12000 gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg 12060 gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca 12120 ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt 12180 ggcctaacta cggctacact agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag 12240 ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg 12300 gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc 12360 ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt 12420 tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt 12480 ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca 12540 gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg 12600 tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac 12660 cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg 12720 ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc 12780 gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt gccattgctg 12840 caggtcggga gcacaggatg acgcctaaca attcattcaa gccgacaccg cttcgcggcg 12900 cggcttaatt caggagttaa acatcatgag ggaagcggtg atcgccgaag tatcgactca 12960 actatcagag gtagttggcg tcatcgagcg ccatctcgaa ccgacgttgc tggccgtaca 13020 tttgtacggc tccgcagtgg atggcggcct gaagccacac agtgatattg atttgctggt 13080 tacggtgacc gtaaggcttg atgaaacaac gcggcgagct ttgatcaacg accttttgga 13140 aacttcggct tcccctggag agagcgagat tctccgcgct gtagaagtca ccattgttgt 13200 gcacgacgac atcattccgt ggcgttatcc agctaagcgc gaactgcaat ttggagaatg 13260 gcagcgcaat gacattcttg caggtatctt cgagccagcc acgatcgaca ttgatctggc 13320 tatcttgctg acaaaagcaa gagaacatag cgttgccttg gtaggtccag cggcggagga 13380 actctttgat ccggttcctg aacaggatct atttgaggcg ctaaatgaaa ccttaacgct 13440 atggaactcg ccgcccgact gggctggcga tgagcgaaat gtagtgctta cgttgtcccg 13500 catttggtac agcgcagtaa ccggcaaaat cgcgccgaag gatgtcgctg ccgactgggc 13560 aatggagcgc ctgccggccc agtatcagcc cgtcatactt gaagctaggc aggcttatct 13620 tggacaagaa gatcgcttgg cctcgcgcgc agatcagttg gaagaatttg ttcactacgt 13680 gaaaggcgag atcaccaagg tagtcggcaa ataatgtcta acaattcgtt caagccgacg 13740 ccgcttcgcg gcgcggctta actcaagcgt tagatgctgc aggcatcgtg gtgtcacgct 13800 cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat 13860 cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc tccga 13905 <210> 218 <211> 13888 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pMON78850;Figure 47;the expression vector for the construct containing the Rhizobium meliloti anthranilate synthase wild type allele <400> 218 ccaaatcgtg aagtttctca tctaagcccc catttggacg tgaatgtaga cacgtcgaaa 60 taaagatttc cgaattagaa taatttgttt attgctttcg cctataaata cgacggatcg 120 taatttgtcg ttttatcaaa atgtactttc attttataat aacgctgcgg acatctacat 180 ttttgaattg aaaaaaaatt ggtaattact ctttcttttt ctccatattg accatcatac 240 tcattgctga tccatgtaga tttcccggac atgaagccat ttacaattga atatatcctg 300 ccgccgctgc cgctttgcac ccggtggagc ttgcatgttg gtttctacgc agaactgagc 360 cggttaggca gataatttcc attgagaact gagccatgtg caccttcccc ccaacacggt 420 gagcgacggg gcaacggagt gatccacatg ggacttttcc tagcttggct gccatttttg 480 gggtgaggcc gttcgcggcc gaggggcgca gcccctgggg ggatgggagg cccgcgttag 540 cgggccggga gggttcgaga agggggggca ccccccttcg gcgtgcgcgg tcacgcgcac 600 agggcgcagc cctggttaaa aacaaggttt ataaatattg gtttaaaagc aggttaaaag 660 acaggttagc ggtggccgaa aaacgggcgg aaacccttgc aaatgctgga ttttctgcct 720 gtggacagcc cctcaaatgt caataggtgc gcccctcatc tgtcagcact ctgcccctca 780 agtgtcaagg atcgcgcccc tcatctgtca gtagtcgcgc ccctcaagtg tcaataccgc 840 agggcactta tccccaggct tgtccacatc atctgtggga aactcgcgta aaatcaggcg 900 ttttcgccga tttgcgaggc tggccagctc cacgtcgccg gccgaaatcg agcctgcccc 960 tcatctgtca acgccgcgcc gggtgagtcg gcccctcaag tgtcaacgtc cgcccctcat 1020 ctgtcagtga gggccaagtt ttccgcgagg tatccacaac gccggcggcc ggccgcggtg 1080 tctcgcacac ggcttcgacg gcgtttctgg cgcgtttgca gggccataga cggccgccag 1140 cccagcggcg agggcaacca gcccggtgag cgtcggaaag ggtcgatcga ccgatgccct 1200 tgagagcctt caacccagtc agctccttcc ggtgggcgcg gggcatgact atcgtcgccg 1260 cacttatgac tgtcttcttt atcatgcaac tcgtaggaca ggtgccggca gcgctctggg 1320 tcattttcgg cgaggaccgc tttcgctgga gcgcgacgat gatcggcctg tcgcttgcgg 1380 tattcggaat cttgcacgcc ctcgctcaag ccttcgtcac tggtcccgcc accaaacgtt 1440 tcggcgagaa gcaggccatt atcgccggca tggcggccga cgcgctgggc tacgtcttgc 1500 tggcgttcgc gacgcgaggc tggatggcct tccccattat gattcttctc gcttccggcg 1560 gcatcgggat gcccgcgttg caggccatgc tgtccaggca ggtagatgac gaccatcagg 1620 gacagcttca aggatcgctc gcggctctta ccagcctaac ttcgatcatt ggaccgctga 1680 tcgtcacggc gatttatgcc gcctcggcga gcacatggaa cgggttggca tggattgtag 1740 gcgccgccct ataccttgtc tgcctccccg cgttgcgtcg cggtgcatgg agccgggcca 1800 cctcgacctg aatggaagcc ggcggcacct cgctaacgga ttcaccactc caagaattgg 1860 agccaatcaa ttcttgcgga gaactgtgaa tgcgcaaacc aacccttggc agaacatatc 1920 catcgcgtcc gccatctcca gcagccgcac gcggcgcatc tcgggcagcg ttgggtcctg 1980 gccacgggtg cgcatgatcg tgctcctgtc gttgaggacc cggctaggct ggcggggttg 2040 ccttactggt tagcagaatg aatcaccgat acgcgagcga acgtgaagcg actgctgctg 2100 caaaacgtct gcgacctgag caacaacatg aatggtcttc ggtttccgtg tttcgtaaag 2160 tctggaaacg cggaagtcag cgccctgcac cattatgttc cggatctgca tcgcaggatg 2220 ctgctggcta ccctgtggaa cacctacatc tgtattaacg aagcgctggc attgaccctg 2280 agtgattttt ctctggtccc gccgcatcca taccgccagt tgtttaccct cacaacgttc 2340 cagtaaccgg gcatgttcat catcagtaac ccgtatcgtg agcatcctct ctcgtttcat 2400 cggtatcatt acccccatga acagaaatcc cccttacacg gaggcatcag tgaccaaaca 2460 ggaaaaaacc gcccttaaca tggcccgctt tatcagaagc cagacattaa cgcttctgga 2520 gaaactcaac gagctggacg cggatgaaca ggcagacatc tgtgaatcgc ttcacgacca 2580 cgctgatgag ctttaccgca gctgcctcgc gcgtttcggt gatgacggtg aaaacctctg 2640 acacatgcag ctcccggaga cggtcacagc ttgtctgtaa gcggatgccg ggagcagaca 2700 agcccgtcag ggcgcgtcag cgggtgttgg cgggtgtcgg ggcgcagcca tgacccagtc 2760 acgtagcgat agcggagtgt atactggctt aactatgcgg catcagagca gattgtactg 2820 agagtgcacc atatgcggtg tgaaataccg cacagatgcg taaggagaaa ataccgcatc 2880 aggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga 2940 gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataacgca 3000 ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg 3060 ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt 3120 cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc 3180 ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct 3240 tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc 3300 gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta 3360 tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca 3420 gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag 3480 tggtggccta actacggcta cactagaagg acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag 3540 ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt 3600 agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa 3660 gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg 3720 attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa ttaaaaatga 3780 agttttaaat caatctaaag tatatatgag taaacttggt ctgacagtta ccaatgctta 3840 atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt tgcctgactc 3900 cccgtcgtgt agataactac gatacgggag ggcttaccat ctggccccag tgctgcaatg 3960 ataccgcgag acccacgctc accggctcca gatttatcag caataaacca gccagccgga 4020 agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact ttatccgcct ccatccagtc tattaattgt 4080 tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca gttaatagtt tgcgcaacgt tgttgccatt 4140 gctgcaggtc gggagcacag gatgacgcct aacaattcat tcaagccgac accgcttcgc 4200 ggcgcggctt aattcaggag ttaaacatca tgagggaagc ggtgatcgcc gaagtatcga 4260 ctcaactatc agaggtagtt ggcgtcatcg agcgccatct cgaaccgacg ttgctggccg 4320 tacatttgta cggctccgca gtggatggcg gcctgaagcc acacagtgat attgatttgc 4380 tggttacggt gaccgtaagg cttgatgaaa caacgcggcg agctttgatc aacgaccttt 4440 tggaaacttc ggcttcccct ggagagagcg agattctccg cgctgtagaa gtcaccattg 4500 ttgtgcacga cgacatcatt ccgtggcgtt atccagctaa gcgcgaactg caatttggag 4560 aatggcagcg caatgacatt cttgcaggta tcttcgagcc agccacgatc gacattgatc 4620 tggctatctt gctgacaaaa gcaagagaac atagcgttgc cttggtaggt ccagcggcgg 4680 aggaactctt tgatccggtt cctgaacagg atctatttga ggcgctaaat gaaaccttaa 4740 cgctatggaa ctcgccgccc gactgggctg gcgatgagcg aaatgtagtg cttacgttgt 4800 cccgcatttg gtacagcgca gtaaccggca aaatcgcgcc gaaggatgtc gctgccgact 4860 gggcaatgga gcgcctgccg gcccagtatc agcccgtcat acttgaagct aggcaggctt 4920 atcttggaca agaagatcgc ttggcctcgc gcgcagatca gttggaagaa tttgttcact 4980 acgtgaaagg cgagatcacc aaggtagtcg gcaaataatg tctaacaatt cgttcaagcc 5040 gacgccgctt cgcggcgcgg cttaactcaa gcgttagatg ctgcaggcat cgtggtgtca 5100 cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca 5160 tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat cgaggatttt 5220 tcggcgctgc gctacgtccg cgaccgcgtt gagggatcaa gccacagcag cccactcgac 5280 cttctagccg acccagacga gccaagggat ctttttggaa tgctgctccg tcgtcaggct 5340 ttccgacgtt tgggtggttg aacagaagtc attatcgcac ggaatgccaa gcactcccga 5400 ggggaaccct gtggttggca tgcacataca aatggacgaa cggataaacc ttttcacgcc 5460 cttttaaata tccgattatt ctaataaacg ctcttttctc ttaggtttac ccgccaatat 5520 atcctgtcaa acactgatag tttaaactga aggcgggaaa cgacaatctg atccccatca 5580 agctagcttc tgcaggtcct gctcgaggtc actaagcaac taactttgag gaatgaggtg 5640 atgatgaatt aactcactcc attccacaaa ccaaacaaaa atttgaggag tgagaagatg 5700 attgactatc tcattcctca aaccaaacac ctcaaatata tctgctatcg ggattggcat 5760 tcctgtatcc ctacgcccgt gtaccccctg tttagagaac ctccaaaggt ataagatggc 5820 gaagattatt gttgtcttgt ctttcatcat atatcgagtc tttccctagg atattattat 5880 tggcaatgag cattacacgg ttaatcgatt gagagaacat gcatctcacc ttcagcaaat 5940 aattacgata atccatattt tacgcttcgt aacttctcat gagtttcgat atacaaattt 6000 gttttctgga caccctacca ttcatcctct tcggagaaga gaggaagtgt cctcaattta 6060 aatatgttgt catgctgtag ttcttcacaa aatctcaaca ggtaccaagc acattgtttc 6120 cacaaattat attttagtca caataaatct atattattat taatatacta aaactatact 6180 gacgctcaga tgcttttact agttcttgct agtatgtgat gtaggtctac gtggaccaga 6240 aaatagtgag acacggaaga caaaagaagt aaaagaggcc cggactacgg cccacatgag 6300 attcggcccc gccacctccg gcaaccagcg gccgatccaa cggcagtgcg cgcacacaca 6360 caacctcgta tatatcgccg cgcggaagcg gcgcgaccga ggaagccttg tcctcgacac 6420 cccctacaca ggtgtcgcgc tgcccccgac acgagtcccg catgcgtccc acgcggccgc 6480 gccagatccc gcctccgcgc gttgccacgc cctctataaa cacccagctc tccctcgccc 6540 tcatctacct cactcgtagt cgtagctcaa gcatcagcgg cagcggcagc ggcaggatct 6600 ctgggcagcg tgcgcacgtg gggtatctag ctcgctctgc tagcctacca atcgaattcc 6660 tgcaggtcga ctctagagga tctaccgtct tcggtacgcg ctcactccgc cctctgcctt 6720 tgttactgcc acgtttctct gaatgctctc ttgtgtggtg attgctgaga gtggtttagc 6780 tggatctaga attacactct gaaatcgtgt tctgcctgtg ctgattactt gccgtccttt 6840 gtagcagcaa aatataggga catggtagta cgaaacgaag atagaaccta cacagcaata 6900 cgagaaatgt gtaatttggt gcttagcggt atttatttaa gcacatgttg gtgttatagg 6960 gcacttggat tcagaagttt gctgttaatt taggcacagg cttcatacta catgggtcaa 7020 tagtataggg attcatatta taggcgatac tataataatt tgttcgtctg cagagcttat 7080 tatttgccaa aattagatat tcctattctg tttttgtttg tgtgctgtta aattgttaac 7140 gcctgaagga ataaatataa atgacgaaat tttgatgttt atctctgctc ctttattgtg 7200 accataagtc aagatcagat gcacttgttt taaatattgt tgtctgaaga aataagtact 7260 gacagtattt tgatgcattg atctgcttgt ttgttgtaac aaaatttaaa 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tataaagtaa aatatcggta 10680 ataaaaggtg gcccaaagtg aaatttactc ttttctacta ttataaaaat tgaggatgtt 10740 tttgtcggta ctttgatacg tcatttttgt atgaattggt ttttaagttt attcgctttt 10800 ggaaatgcat atctgtattt gagtcgggtt ttaagttcgt ttgcttttgt aaatacagag 10860 ggatttgtat aagaaatatc tttagaaaaa cccatatgct aatttgacat aatttttgag 10920 aaaaatatat attcaggcga attctcacaa tgaacaataa taagattaaa atagctttcc 10980 cccgttgcag cgcatgggta ttttttctag taaaaataaa agataaactt agactcaaaa 11040 catttacaaa aacaacccct aaagttccta aagcccaaag tgctatccac gatccatagc 11100 aagcccagcc caacccaacc caacccaacc caccccagtc cagccaactg gacaatagtc 11160 tccacacccc cccactatca ccgtgagttg tccgcacgca ccgcacgtct cgcagccaaa 11220 aaaaaaaaga aagaaaaaaa agaaaaagaa aaaacagcag gtgggtccgg gtcgtggggg 11280 ccggaaacgc gaggaggatc gcgagccagc gacgaggccg gccctccctc cgcttccaaa 11340 gaaacgcccc ccatcgccac tatatacata cccccccctc tcctcccatc cccccaaccc 11400 taccaccacc accaccacca cctccacctc ctcccccctc gctgccggac gacgagctcc 11460 tcccccctcc ccctccgccg ccgccgcgcc 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gcggtgaaac gcgcatcacc ggccttctgg aaggcgagga 12360 cgtcatcaat acgggcaagg ccatgcaggc gatgggcgcc cgcatccgta aggaaggcga 12420 cacctggatc atcgatggcg tcggcaatgg cggcctcctg gcgcctgagg cgccgctcga 12480 tttcggcaat gccgccacgg gctgccgcct gacgatgggc ctcgtcgggg tctacgattt 12540 cgacagcacc ttcatcggcg acgcctcgct cacaaagcgc ccgatgggcc gcgtgttgaa 12600 cccgctgcgc gaaatgggcg tgcaggtgaa atcggaagac ggtgaccgtc ttcccgttac 12660 cttgcgcggg ccgaagacgc cgacgccgat cacctaccgc gtgccgatgg cctccgcaca 12720 ggtgaagtcc gccgtgctgc tcgccggcct caacacgccc ggcatcacga cggtcatcga 12780 gccgatcatg acgcgcgatc atacggaaaa gatgctgcag ggctttggcg ccaaccttac 12840 cgtcgagacg gatgcggacg gcgtgcgcac catccgcctg gaaggccgcg gcaagctcac 12900 cggccaagtc atcgacgtgc cgggcgaccc gtcctcgacg gccttcccgc tggttgcggc 12960 cctgcttgtt ccgggctccg acgtcaccat cctcaacgtg ctgatgaacc ccacccgcac 13020 cggcctcatc ctgacgctgc aggaaatggg cgccgacatc gaagtcatca acccgcgcct 13080 tgccggcggc gaagacgtgg cggacctgcg cgttcgctcc tccacgctga agggcgtcac 13140 ggtgccggaa gaccgcgcgc cttcgatgat cgacgaatat ccgattctcg ctgtcgccgc 13200 cgccttcgcg gaaggggcga ccgtgatgaa cggtctggaa gaactccgcg tcaaggaaag 13260 cgaccgcctc tcggccgtcg ccaatggcct caagctcaat ggcgtggatt gcgatgaggg 13320 cgagacgtcg ctcgtcgtgc gtggccgccc tgacggcaag gggctcggca acgcctcggg 13380 cgccgccgtc gccacccatc tcgatcaccg catcgccatg agcttcctcg tcatgggcct 13440 cgtgtcggaa aaccctgtca cggtggacga tgccacgatg atcgccacga gcttcccgga 13500 gttcatggac ctgatggccg ggctgggcgc gaagatcgaa ctctccgata cgaaggctgc 13560 ctgatgagct cgaattcccg atcgttcaaa catttggcaa taaagtttct taagattgaa 13620 tcctgttgcc ggtcttgcga tgattatcat ataatttctg ttgaattacg ttaagcatgt 13680 aataattaac atgtaatgca tgacgttatt tatgagatgg gtttttatga ttagagtccc 13740 gcaattatac atttaatacg cgatagaaaa caaaatatag cgcgcaaact aggataaatt 13800 atcgcgcgcg gtgtcatcta tgttactaga tcggggataa cgatcaagct ataacttcgt 13860 ataatgtatg ctatacgaag ttatcgcg 13888 <210> 219 <211> 13888 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pMON78851;Figure 48;the expression vector for the construct containing the Rhizobium meliloti anthranilate synthase S51C allele <400> 219 ccaaatcgtg aagtttctca tctaagcccc catttggacg tgaatgtaga cacgtcgaaa 60 taaagatttc cgaattagaa taatttgttt attgctttcg cctataaata cgacggatcg 120 taatttgtcg ttttatcaaa atgtactttc attttataat aacgctgcgg acatctacat 180 ttttgaattg aaaaaaaatt ggtaattact ctttcttttt ctccatattg accatcatac 240 tcattgctga tccatgtaga tttcccggac atgaagccat ttacaattga atatatcctg 300 ccgccgctgc cgctttgcac ccggtggagc ttgcatgttg gtttctacgc agaactgagc 360 cggttaggca gataatttcc attgagaact gagccatgtg caccttcccc ccaacacggt 420 gagcgacggg gcaacggagt gatccacatg ggacttttcc tagcttggct gccatttttg 480 gggtgaggcc gttcgcggcc gaggggcgca gcccctgggg ggatgggagg cccgcgttag 540 cgggccggga gggttcgaga agggggggca ccccccttcg gcgtgcgcgg tcacgcgcac 600 agggcgcagc cctggttaaa aacaaggttt ataaatattg gtttaaaagc aggttaaaag 660 acaggttagc ggtggccgaa aaacgggcgg aaacccttgc aaatgctgga ttttctgcct 720 gtggacagcc cctcaaatgt caataggtgc gcccctcatc tgtcagcact ctgcccctca 780 agtgtcaagg atcgcgcccc tcatctgtca gtagtcgcgc ccctcaagtg tcaataccgc 840 agggcactta tccccaggct tgtccacatc atctgtggga aactcgcgta aaatcaggcg 900 ttttcgccga tttgcgaggc tggccagctc cacgtcgccg gccgaaatcg agcctgcccc 960 tcatctgtca acgccgcgcc gggtgagtcg gcccctcaag tgtcaacgtc cgcccctcat 1020 ctgtcagtga gggccaagtt ttccgcgagg tatccacaac gccggcggcc ggccgcggtg 1080 tctcgcacac ggcttcgacg gcgtttctgg cgcgtttgca gggccataga cggccgccag 1140 cccagcggcg agggcaacca gcccggtgag cgtcggaaag ggtcgatcga ccgatgccct 1200 tgagagcctt caacccagtc agctccttcc ggtgggcgcg gggcatgact atcgtcgccg 1260 cacttatgac tgtcttcttt atcatgcaac tcgtaggaca ggtgccggca gcgctctggg 1320 tcattttcgg cgaggaccgc tttcgctgga gcgcgacgat gatcggcctg tcgcttgcgg 1380 tattcggaat cttgcacgcc ctcgctcaag ccttcgtcac tggtcccgcc accaaacgtt 1440 tcggcgagaa gcaggccatt atcgccggca tggcggccga cgcgctgggc tacgtcttgc 1500 tggcgttcgc gacgcgaggc tggatggcct tccccattat gattcttctc gcttccggcg 1560 gcatcgggat gcccgcgttg caggccatgc tgtccaggca ggtagatgac gaccatcagg 1620 gacagcttca aggatcgctc gcggctctta ccagcctaac ttcgatcatt ggaccgctga 1680 tcgtcacggc gatttatgcc gcctcggcga gcacatggaa cgggttggca tggattgtag 1740 gcgccgccct ataccttgtc tgcctccccg cgttgcgtcg cggtgcatgg agccgggcca 1800 cctcgacctg aatggaagcc ggcggcacct cgctaacgga ttcaccactc caagaattgg 1860 agccaatcaa ttcttgcgga gaactgtgaa tgcgcaaacc aacccttggc agaacatatc 1920 catcgcgtcc gccatctcca gcagccgcac gcggcgcatc tcgggcagcg ttgggtcctg 1980 gccacgggtg cgcatgatcg tgctcctgtc gttgaggacc cggctaggct ggcggggttg 2040 ccttactggt tagcagaatg aatcaccgat acgcgagcga acgtgaagcg actgctgctg 2100 caaaacgtct gcgacctgag caacaacatg aatggtcttc ggtttccgtg tttcgtaaag 2160 tctggaaacg cggaagtcag cgccctgcac cattatgttc cggatctgca tcgcaggatg 2220 ctgctggcta ccctgtggaa cacctacatc tgtattaacg aagcgctggc attgaccctg 2280 agtgattttt ctctggtccc gccgcatcca taccgccagt tgtttaccct cacaacgttc 2340 cagtaaccgg gcatgttcat catcagtaac ccgtatcgtg agcatcctct ctcgtttcat 2400 cggtatcatt acccccatga acagaaatcc cccttacacg gaggcatcag tgaccaaaca 2460 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gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta 3360 tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca 3420 gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag 3480 tggtggccta actacggcta cactagaagg acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag 3540 ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt 3600 agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa 3660 gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg 3720 attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa ttaaaaatga 3780 agttttaaat caatctaaag tatatatgag taaacttggt ctgacagtta ccaatgctta 3840 atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt tgcctgactc 3900 cccgtcgtgt agataactac gatacgggag ggcttaccat ctggccccag tgctgcaatg 3960 ataccgcgag acccacgctc accggctcca gatttatcag caataaacca gccagccgga 4020 agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact ttatccgcct ccatccagtc tattaattgt 4080 tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca gttaatagtt tgcgcaacgt tgttgccatt 4140 gctgcaggtc gggagcacag gatgacgcct aacaattcat tcaagccgac accgcttcgc 4200 ggcgcggctt aattcaggag ttaaacatca tgagggaagc ggtgatcgcc gaagtatcga 4260 ctcaactatc agaggtagtt ggcgtcatcg agcgccatct cgaaccgacg ttgctggccg 4320 tacatttgta cggctccgca gtggatggcg gcctgaagcc acacagtgat attgatttgc 4380 tggttacggt gaccgtaagg cttgatgaaa caacgcggcg agctttgatc aacgaccttt 4440 tggaaacttc ggcttcccct ggagagagcg agattctccg cgctgtagaa gtcaccattg 4500 ttgtgcacga cgacatcatt ccgtggcgtt atccagctaa gcgcgaactg caatttggag 4560 aatggcagcg caatgacatt cttgcaggta tcttcgagcc agccacgatc gacattgatc 4620 tggctatctt gctgacaaaa gcaagagaac atagcgttgc cttggtaggt ccagcggcgg 4680 aggaactctt tgatccggtt cctgaacagg atctatttga ggcgctaaat gaaaccttaa 4740 cgctatggaa ctcgccgccc gactgggctg gcgatgagcg aaatgtagtg cttacgttgt 4800 cccgcatttg gtacagcgca gtaaccggca aaatcgcgcc gaaggatgtc gctgccgact 4860 gggcaatgga gcgcctgccg gcccagtatc agcccgtcat acttgaagct aggcaggctt 4920 atcttggaca agaagatcgc ttggcctcgc gcgcagatca gttggaagaa tttgttcact 4980 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tgcaggtcga ctctagagga tctaccgtct tcggtacgcg ctcactccgc cctctgcctt 6720 tgttactgcc acgtttctct gaatgctctc ttgtgtggtg attgctgaga gtggtttagc 6780 tggatctaga attacactct gaaatcgtgt tctgcctgtg ctgattactt gccgtccttt 6840 gtagcagcaa aatataggga catggtagta cgaaacgaag atagaaccta cacagcaata 6900 cgagaaatgt gtaatttggt gcttagcggt atttatttaa gcacatgttg gtgttatagg 6960 gcacttggat tcagaagttt gctgttaatt taggcacagg cttcatacta catgggtcaa 7020 tagtataggg attcatatta taggcgatac tataataatt tgttcgtctg cagagcttat 7080 tatttgccaa aattagatat tcctattctg tttttgtttg tgtgctgtta aattgttaac 7140 gcctgaagga ataaatataa atgacgaaat tttgatgttt atctctgctc ctttattgtg 7200 accataagtc aagatcagat gcacttgttt taaatattgt tgtctgaaga aataagtact 7260 gacagtattt tgatgcattg atctgcttgt ttgttgtaac aaaatttaaa aataaagagt 7320 ttcctttttg ttgctctcct tacctcctga tggtatctag tatctaccaa ctgacactat 7380 attgcttctc tttacatacg tatcttgctc gatgccttct ccctagtgtt gaccagtgtt 7440 actcacatag tctttgctca tttcattgta atgcagatac caagcggcct ctagaggatc 7500 tccctagagg atctccagat ctatggaatc cctagccgcc acctccgtgt tcgcgccctc 7560 ccgcgtcgcc gtcccggcgg cgcgggccct ggttagggcg gggacggtgg taccaaccag 7620 gcggacgagc agccggagcg gaaccagcgg ggtgaaatgc tctgctgccg tgacgccgca 7680 ggcgagccca gtgattagca ggagcgctgc ggcggccatg gcagcggtaa ttctggaaga 7740 cggcgcggag agttatacca cgaagggtgg catcgtcgtc acccgcaggc ggcgtgaggc 7800 atcctacagc gacgcgatcg ccggttatgt cgaccggctg gacgaacgcc gcggcgcggt 7860 cttttcctgc aactacgaat atcccggccg ctatacccgc tgggacactg cggtggtcga 7920 cccgccgctt gccatctcct ccttcggtcg ctcgctctgg atcgaagcct ataacgaacg 7980 cggcgaagtg ctgctggcgc tgatcgccga ggatctgaag tccgttgccg acatcacgct 8040 cggctcactt gccgcccgcc gcctcgacct caccatcaac gagcccgatc gtgtcttcac 8100 cgaggaagag cggtcgaaga tgccgacggt ctttacggtt cttcgcgcgg tgacgaacct 8160 cttccactcg gaggaggact cgaacctcgg cctctatggc gccttcggct acgacctcgc 8220 cttccagttc gatgcgatcg aactgaagct ttcgcgtccg gacgaccagc gcgacatggt 8280 tctctttctg ccggacgaga tccttgtggt cgatcactat gcggccaagg cctggatcga 8340 ccgctacgat ttcgccaggg agaacctttc gaccgagggc aaggcagcgg acattgctcc 8400 cgagccgttc cgcagcgtcg acagcatccc gccgcacggg gatcaccgcc cgggcgaata 8460 tgccgagctc gtcgtcaagg cgaaggaaag cttccgtcgc ggcgatcttt tcgaagtggt 8520 gccggggcag aaattctacg agcgctgcga aagccgcccg tccgagattt ccaaccggct 8580 gaaggcgatc aatccgtcgc cctattcctt cttcatcaat ctcggcaacc aggaatatct 8640 cgtcggtgct tcgccggaga tgttcgtgcg cgtttccggc cggcgcatcg agacctgccc 8700 gatctccggt acgatcaagc gcggcgacga tccgatcgcc gacagcgagc agatcctgaa 8760 gctcttgaac tcgaagaagg acgagtccga gctcaccatg tgctcggacg tcgaccgcaa 8820 cgacaagagc cgggtctgcg tgccgggctc ggtcaaggtg atcggccggc gtcagatcga 8880 gatgtattcg cggctgatcc acacggtcga tcacatcgag gggcgcctgc gcgacgatat 8940 ggacgccttc gacgggttcc tcagccacgc ctgggcggtg accgttaccg gcgcgccaaa 9000 gctctgggcc atgcgcttca tcgagagcca cgagaagagc ccgcgtgcct ggtatggcgg 9060 cgcgatcggc atggtcggct tcaacggcga catgaatacc gggctgacct tgcgtaccat 9120 ccgcatcaag gacgggatcg ccgaggtgag ggcgggtgcg acgctcctct atgattccaa 9180 tccggaagaa gaagaagccg aaaccgaact gaaggcctct gccatgattg cagccatccg 9240 cgacgcgaaa tccgcaaaca gcgccaaatc cgcgcgcgat gtcgccgccg tcggcgccgg 9300 agtcagcatc ctgctcgtcg atcacgagga cagcttcgtc cataccctcg cgaactactt 9360 ccgccagacc ggcgcgtccg tcaccaccgt gcgcacgccg gtggccgagg aaatcttcga 9420 ccgggtcaag ccggacctcg tcgtgctttc gcccggtccc ggcaccccga aggacttcga 9480 ctgcaaggcg acgatcaaga aggcgcgggc gcgggacctg ccgatcttcg gcgtctgcct 9540 ggggctgcag gcgctcgcgg aggcctatgg cggcgacctt cgtcaactgg cgatcccgat 9600 gcatgggaag ccctcgcgca tccgcgtgct cgaacccggc atcgtcttct ccggcctcgg 9660 caaggaggtg acggtcgggc gctatcattc gattttcgcc gatccgtcca acctgccgcg 9720 cgaattcgtg atcacggccg aaagcgaaga tggtacgatc atgggcatcg aacacagcaa 9780 ggagccggtg gcggccgtgc agttccatcc ggaatcgatc atgacgctgg gcggcgacgc 9840 cggcatgcgg atgatcgaga acgtggttgc ccatctcgcc aagcgggcga agaccaaggc 9900 agcctgaact agatcggatc cggggatcga tgagctaagc tagctatatc atcaatttat 9960 gtattacaca taatatcgca ctcagtcttt catctacggc aatgtaccag ctgatataat 10020 cagttattga aatatttctg aatttaaact tgcatcaata aatttatgtt tttgcttgga 10080 ctataatacc tgacttgtta ttttatcaat aaatatttaa actatatttc tttcaagata 10140 tcattcttta caagtatacg tgtttaaatt gaataccata aatttttatt tttcaaatac 10200 atgtaaaatt atgaaatggg agtggtggcg accgagctca agcacacttc aattcctata 10260 acggaccaaa tcgcaaaaat tataataaca tattatttca tcctggatta aaagaaagtc 10320 accggggatt attttgtgac gccgattaca tacggcgaca ataaagacat tggaaatcgt 10380 agtacatatt ggaatacact gattatatta atgatgaata catactttaa tatccttacg 10440 taggatcgat ccgaatttcg acctcgagcg gccgctctag aactagtgga tccccccctt 10500 aattaagggg gctgcaggaa ttcataactt cgtataatgt atgctatacg aagttatgtt 10560 tcgaggtcat tcatatgctt gagaagagag tcgggatagt ccaaaataaa acaaaggtaa 10620 gattacctgg tcaaaagtga aaacatcagt taaaaggtgg tataaagtaa aatatcggta 10680 ataaaaggtg gcccaaagtg aaatttactc ttttctacta ttataaaaat tgaggatgtt 10740 tttgtcggta ctttgatacg tcatttttgt atgaattggt ttttaagttt attcgctttt 10800 ggaaatgcat atctgtattt gagtcgggtt ttaagttcgt ttgcttttgt aaatacagag 10860 ggatttgtat aagaaatatc tttagaaaaa cccatatgct aatttgacat aatttttgag 10920 aaaaatatat attcaggcga attctcacaa tgaacaataa taagattaaa atagctttcc 10980 cccgttgcag cgcatgggta ttttttctag taaaaataaa agataaactt agactcaaaa 11040 catttacaaa aacaacccct aaagttccta aagcccaaag tgctatccac gatccatagc 11100 aagcccagcc caacccaacc caacccaacc caccccagtc cagccaactg gacaatagtc 11160 tccacacccc cccactatca ccgtgagttg tccgcacgca ccgcacgtct cgcagccaaa 11220 aaaaaaaaga aagaaaaaaa agaaaaagaa aaaacagcag gtgggtccgg gtcgtggggg 11280 ccggaaacgc gaggaggatc gcgagccagc gacgaggccg gccctccctc cgcttccaaa 11340 gaaacgcccc ccatcgccac tatatacata cccccccctc tcctcccatc cccccaaccc 11400 taccaccacc accaccacca cctccacctc ctcccccctc gctgccggac gacgagctcc 11460 tcccccctcc ccctccgccg ccgccgcgcc ggtaaccacc ccgcccctct cctctttctt 11520 tctccgtttt tttttccgtc tcggtctcga tctttggcct tggtagtttg ggtgggcgag 11580 aggcggcttc gtgcgcgccc agatcggtgc gcgggagggg cgggatctcg cggctggggc 11640 tctcgccggc gtggatccgg cccggatctc gcggggaatg gggctctcgg atgtagatct 11700 gcgatccgcc gttgttgggg gagatgatgg ggggtttaaa atttccgccg tgctaaacaa 11760 gatcaggaag aggggaaaag ggcactatgg tttatatttt tatatatttc tgctgcttcg 11820 tcaggcttag atgtgctaga tctttctttc ttctttttgt gggtagaatt tgaatccctc 11880 agcattgttc atcggtagtt tttcttttca tgatttgtga caaatgcagc ctcgtgcgga 11940 gcttttttgt aggtagaagt gatcaaccat ggcgcaagtt agcagaatct gcaatggtgt 12000 gcagaaccca tctcttatct ccaatctctc gaaatccagt caacgcaaat ctcccttatc 12060 ggtttctctg aagacgcagc agcatccacg agcttatccg atttcgtcgt cgtggggatt 12120 gaagaagagt gggatgacgt taattggctc tgagcttcgt cctcttaagg tcatgtcttc 12180 tgtttccacg gcgtgcatgc ttcacggtgc aagcagccgg cccgcaaccg cccgcaaatc 12240 ctctggcctt tccggaaccg tccgcattcc cggcgacaag tcgatctccc accggtcctt 12300 catgttcggc ggtctcgcga gcggtgaaac gcgcatcacc ggccttctgg aaggcgagga 12360 cgtcatcaat acgggcaagg ccatgcaggc gatgggcgcc cgcatccgta aggaaggcga 12420 cacctggatc atcgatggcg tcggcaatgg cggcctcctg gcgcctgagg cgccgctcga 12480 tttcggcaat gccgccacgg gctgccgcct gacgatgggc ctcgtcgggg tctacgattt 12540 cgacagcacc ttcatcggcg acgcctcgct cacaaagcgc ccgatgggcc gcgtgttgaa 12600 cccgctgcgc gaaatgggcg tgcaggtgaa atcggaagac ggtgaccgtc ttcccgttac 12660 cttgcgcggg ccgaagacgc cgacgccgat cacctaccgc gtgccgatgg cctccgcaca 12720 ggtgaagtcc gccgtgctgc tcgccggcct caacacgccc ggcatcacga cggtcatcga 12780 gccgatcatg acgcgcgatc atacggaaaa gatgctgcag ggctttggcg ccaaccttac 12840 cgtcgagacg gatgcggacg gcgtgcgcac catccgcctg gaaggccgcg gcaagctcac 12900 cggccaagtc atcgacgtgc cgggcgaccc gtcctcgacg gccttcccgc tggttgcggc 12960 cctgcttgtt ccgggctccg acgtcaccat cctcaacgtg ctgatgaacc ccacccgcac 13020 cggcctcatc ctgacgctgc aggaaatggg cgccgacatc gaagtcatca acccgcgcct 13080 tgccggcggc gaagacgtgg cggacctgcg cgttcgctcc tccacgctga agggcgtcac 13140 ggtgccggaa gaccgcgcgc cttcgatgat cgacgaatat ccgattctcg ctgtcgccgc 13200 cgccttcgcg gaaggggcga ccgtgatgaa cggtctggaa gaactccgcg tcaaggaaag 13260 cgaccgcctc tcggccgtcg ccaatggcct caagctcaat ggcgtggatt gcgatgaggg 13320 cgagacgtcg ctcgtcgtgc gtggccgccc tgacggcaag gggctcggca acgcctcggg 13380 cgccgccgtc gccacccatc tcgatcaccg catcgccatg agcttcctcg tcatgggcct 13440 cgtgtcggaa aaccctgtca cggtggacga tgccacgatg atcgccacga gcttcccgga 13500 gttcatggac ctgatggccg ggctgggcgc gaagatcgaa ctctccgata cgaaggctgc 13560 ctgatgagct cgaattcccg atcgttcaaa catttggcaa taaagtttct taagattgaa 13620 tcctgttgcc ggtcttgcga tgattatcat ataatttctg ttgaattacg ttaagcatgt 13680 aataattaac atgtaatgca tgacgttatt tatgagatgg gtttttatga ttagagtccc 13740 gcaattatac atttaatacg cgatagaaaa caaaatatag cgcgcaaact aggataaatt 13800 atcgcgcgcg gtgtcatcta tgttactaga tcggggataa cgatcaagct ataacttcgt 13860 ataatgtatg ctatacgaag ttatcgcg 13888 <210> 220 <211> 866 <212> DNA <213> Hordeum vulgare <400> 220 ggtttacata tttaaaggaa aaaatgttca tcgattttaa aaaaaagttc atacctttca 60 aaaacgttca tcaatttttt taaaaagttc actaaaaatg aaaaaaagtt catccaattt 120 aaaaaaagtt cattaatttt ttataaattt caataaattt gaaaaaactt cataaaattc 180 aacaaaagtt cattgaagtg aaaaaagctc ataaatcttt aaaaagtgca tccattttca 240 aaaagatgtt catcaaaatt caatatagtt caccaatatt caaaaaagtt cattaatctt 300 aaaaaatatt cgctaaaatt taaaaaatgt ttatcaatat ttaaacggcg tctagatgag 360 ccggtctatt tacaaacacc ataggcgcca attaacaaaa atgcacgtta gatcacgtct 420 acggcgtcaa ataggaaatg cccatcggcc ttactattaa gagttgtttt ggttatcctt 480 taggatttat gctgtgggct ggacttaaca caaaacccac agccatggta ggccggaatc 540 tattattcag ctcacaaacg atgttctact caaaagaaga aaaaaatctg ttgtcagaaa 600 aagagaacaa aaaaggctca cgaacatgcc gcggctcgca caggtggccg tgagcttctg 660 aatgacttgg ccacccggca tgtccactgc ccccctagac ggtgtgggtg ggtggacagg 720 tcaagcgcat tgaacaaggt caccctgcgt tctgccacga ggccaactgc gtggccctca 780 tgcaacgcgc cttgctgcca cttctacaca cgccctcgcc ggccgaccgc tgctataaaa 840 gcagctcccc gttgcgtcct cgacgg 866 <210> 221 <211> 392 <212> DNA <213> Zea mays <400> 221 gatctcgtca atttttccct tttgtaattt tgtaatttat aatttacttt cctgtatgct 60 tctaactctg tcgttttaaa attttaataa aatttcagta ggggcttgcc cctcctgtcc 120 tataaaaaaa agttgacgtg aatagatttc attaagaggt tggatgttag tgggatgaca 180 tgactattag taggacgaga tgatgtggaa agttagtggg agatgatatg gatagttttt 240 gctttcatcg aaaggttgga agttagtatg atgacatggc taatatagat acatagatat 300 agactaccaa catggctgca tgcccccaag ctctcccact atatatatct ctggtagcac 360 atcatcccaa ttcacaatgc ttacaaaaac cc 392 <210> 222 <211> 1041 <212> DNA <213> Zea mays <400> 222 gtcccgcgtc aatattatta aaaaactcct acatttcttt ataatcaacc cgcactctta 60 taatctcttc tctactacta taataagaga gtttatgtac aaaataaggt gaaattatgt 120 ataagtgttc tggatattgg ttgttggctc catattcaca caacctaatc aatagaaaac 180 atatgtttta ttaaaacaaa atttatcata tatcatatat atatatatac atatatatat 240 atatatatat aaaccgtagc aatgcacggg catataacta gtgcaactta atacatgtgt 300 gtattaagat gaataagagg gtatccaaat aaaaaacttg ttcgcttacg tctggatcga 360 aaggggttgg aaacgattaa atctcttcct agtcaaaatt gaatagaagg agatttaatc 420 tctcccaatc cccttcgatc atccaggtgc aaccgtataa gtcctaaagt ggtgaggaac 480 acgaaacaac catgcattgg catgtaaagc tccaagaatt tgttgtatcc ttaacaactc 540 acagaacatc aaccaaaatt gcacgtcaag ggtattgggt aagaaacaat caaacaaatc 600 ctctctgtgt gcaaagaaac acggtgagtc atgccgagat catactcatc tgatatacat 660 gcttacagct cacaagacat tacaaacaac tcatattgca ttacaaagat cgtttcatga 720 aaaataaaat aggccggaca ggacaaaaat ccttgacgtg taaagtaaat ttacaacaaa 780 aaaaaagcca tatgtcaagc taaatctaat tcgttttacg tagatcaaca acctgtagaa 840 ggcaacaaaa ctgagccacg cagaagtaca gaatgattcc agatgaacca tcgacgtgct 900 acgtaaagag agtgacgagt catatacatt tggcaagaaa ccatgaagct gcctacagcc 960 gtctcggtgg cataagaaca caagaaattg tgttaattaa tcaaagctat aaataacgct 1020 cgcatgcctg tgcacttctc c 1041 <210> 223 <211> 1401 <212> DNA <213> Zea mays <400> 223 aagcttgccg agtgccatcc ttggacactc gataaagtat attttatttt ttttattttg 60 ccaaccaaac tttttgtggt atgttcctac actatgtaga tctacatgta ccattttggc 120 acaattacat atttacaaaa atgttttcta taaatattag atttagttcg tttatttgaa 180 tttcttcgga aaattcacat ttaaactgca agtcactcga aacatggaaa accgtgcatg 240 caaaataaat gatatgcatg ttatctagca caagttacga ccgatttcag aagcagacca 300 gaatcttcaa gcaccatgct cactaaacat gaccgtgaac ttgttatcta gttgtttaaa 360 aattgtataa aacacaaata aagtcagaaa ttaatgaaac ttgtccacat gtcatgatat 420 catatataga ggttgtgata aaaatttgat aatgtttcgg taaagttgtg acgtactatg 480 tgtagaaacc taagtgacct acacataaaa tcatagagtt tcaatgtagt tcactcgaca 540 aagactttgt caagtgtccg ataaaaagta ctcgacaaag aagccgttgt cgatgtactg 600 ttcgtcgaga tctctttgtc gagtgtcaca ctaggcaaag tctttacgga gtgtttttca 660 ggctttgaca ctcggcaaag cgctcgattc cagtagtgac agtaatttgc atcaaaaata 720 gctgagagat ttaggccccg tttcaatctc acgggataaa gtttagcttc ctgctaaact 780 ttagctatat gaattgaagt gctaaagttt agtttcaatt accaccatta gctctcctgt 840 ttagattaca aatggctaaa agtagctaaa aaatagctgc taaagtttat ctcgcgagat 900 tgaaacaggg ccttaaaatg agtcaactaa tagaccaact aattattagc tattagtcgt 960 tagcttcttt aatctaagct aaaaccaact aatagcttat ttgttgaatt acaattagct 1020 caacggaatt ctctgttttt ctaaaaaaaa actgcccctc tcttacagca aattgtccgc 1080 tgcccgtcgt ccagatacaa tgaacgtacc tagtaggaac tcttttacac gctcggtcgc 1140 tcgccgcgga tcggagtccc cggaacacga caccactgtg gaacacgaca aagtctgctc 1200 agaggcggcc acaccctggc gtgcaccgag ccggagcccg gataagcacg gtaaggagag 1260 tacggcggga cgtggcgacc cgtgtgtctg ctgccacgca gccttcctcc acgtagccgc 1320 gcggccgcgc cacgtaccag ggcccggcgc tggtataaat gcgcgccacc tccgctttag 1380 ttctgcatac agccaaccca a 1401 <210> 224 <211> 1805 <212> DNA <213> Coix lacryma-jobi <400> 224 ggcggaagtt ttgcggcgga gctccggtcg gtgttggaga agacgaccac agcggtggcg 60 ttacggttca ccggagtagg ctagcgaggg ctcaacgaaa gctcaggagg cggcgggatc 120 agaagcacgg ccaatttggc cgtagacggc gtaacgacgg cgaggtgtgg aagcggagct 180 tggcgatttc agaggagcag aggaggaaaa cggggatggt accggcgatg aggaggctta 240 tatagccggc caaggacctg gggcgaaggg cacgtcaaag gcggtcacca cagtgcaagc 300 aggaggtggc ctggtggcgt ggcatggtcg gcagaggata cggcggtgtg gcggccgacg 360 agcagagcac gactctgctc tgatattttt tcccctccgg ttactgttca ccagagaaca 420 tctagatctt ctttccccta tttctccaaa aacattatac aacaggaaaa actcccaaca 480 tgaaagttgt tccaaaaatt aggacctaca actttcattt aaggagcaca accaaaatct 540 gcctagattt taaaatcaca ttttgaattt gaaaaacatt caaacttgaa ttcaaaatta 600 cttttgaatt ttctgaacga cttcaaattt tatcaatata aaagttgttc ctcattaaat 660 tatctacaac tttgtttttg gtcatatatc caaattgtgc ttaattttga aactaaaaaa 720 gggataaaac taggttttgg gaattgattt tcaatttgaa accaaatcaa acttgttttc 780 caaatcactt cagattctct ttagtaactt gaaaatctat cttaataaaa gttgtttctt 840 ttaatcctct ctacaacttt gattaaaaga cccaagtcta attcttttta gtttttgaaa 900 tctagtttag gggtcaaatt cagggtttga aacatttcaa atttattcaa aattttgtac 960 agaaacttta aaaactttga ataccaaagt tgtacatctc aacaagagct acaactttgc 1020 ttttgaaatc attttgaaat ttgacatact ttttgactta ttaaaaaggg gacaaaaaga 1080 gagatttaaa aaccaaggtt ttctcacttg ccctatcatg taacaccaaa catctcaatc 1140 aagccacata tatatcaaac atggaaatca acactcaaaa acatacaaca ctcttgtcaa 1200 acatacaaag catcatattt atgccttaaa cataaaaaca tgaaatgctt ttatgccatg 1260 atgccagatg attatgcata ctaaacaact taattaaaat tttaattaat gtttaacacc 1320 aggggtgtta cattaggcaa ttagtccatg ccaaacattt ctattgcatc cagagaccag 1380 aatagctttt tttttaatat ttaaccaaaa aaagaagaaa atgaggtgaa tgaatgggcc 1440 gacgggcaca taaactattg catggaccca gactattgaa ggcccgctaa tgttgagaca 1500 cggaacgcaa aaggaaaaga gggcccagac tacggcccac gcgtgggatt cggcccggcc 1560 acctccggca accagcggct catcatccaa cgccactacg ccagggcgtt cgtccacaac 1620 ctcctcgtac atatcgccgg gcggaagcgg cgcgaccgcg caagcgcaag cttgtcctcg 1680 acagcccgca caggtgtcgc gcggccccgg acacgagtcc cgcatgcgcc ccacgcggcc 1740 gcgccaggtc ccgcctcccc gcatccccac gccctctata aaccccgcgc tctccctggc 1800 cctcg 1805 <210> 225 <211> 232 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 225 gttggcaatg cggataaaga ataactaaat aaataaataa ataaattgca agcaattgcg 60 ttgctgctat gtactgtaaa agtttcttat aatatcagtt ctgaatgcta aggacatccc 120 tcaagatggt ctttctattt ttgtgttccc gttccaatgt actgttggta tcctcttgga 180 gattcatcaa tatgagaaaa cagagaatgg acaaccctcc cttatcttat gg 232 <210> 226 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 226 atgagtataa gaatgctgtt ctgc 24 <210> 227 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 227 gcacactgtt tttcacttaa c 21 <210> 228 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 228 tcgcgcccct caagtgtcaa tacc 24 <210> 229 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 229 caccgcctac atacctcgct ctgc 24 <210> 230 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 230 ggacagcccc tcaaat 16 <210> 231 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 231 cctacatacc tcgctctgct 20

Claims

단량체성 안트라닐레이트 신타제(synthase)에 융합된 엽록체 수송 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하고, 이때

a) 엽록체 수송 펩티드가 서열 28의 폴리펩티드 서열을 포함하거나; 또는

b) 엽록체 수송 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자가 서열 9를 포함하며;

상기 엽록체 수송 펩티드는 CTP1에 의한 상기 안트라닐레이트 신타제의 표적화와 비교하여 식물 세포의 엽록체에 대한 상기 단량체성 안트라닐레이트 신타제의 강화된 표적화를 제공하고; 상기 엽록체 수송 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자는, 동일한 유전자형이지만 상기 폴리뉴클레오티드 분자가 없는 식물 세포와 비교하여 상기 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 트랜스제닉(transgenic) 식물 세포에서 트립토판의 2 내지 200배의 수준 강화를 제공하는 발현 벡터.
제1항에 있어서, 상기 단량체성 안트라닐레이트 신타제가 트립토판에 대해 피드백(feedback)-불감성인 발현 벡터.
제2항에 있어서, 상기 단량체성 안트라닐레이트 신타제가 서열 200, 202, 204, 206, 208, 210, 및 212를 포함하는 군으로부터 선택된 폴리펩티드 서열을 포 함하는 발현 벡터.
제1항에 있어서, 서열 213 또는 서열 214의 핵산 서열을 포함하는 것으로 정의되는 발현 벡터.
제2항에 있어서, 단량체성 안트라닐레이트 신타제에 융합된 엽록체 수송 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된, 프로모터를 추가로 포함하는 발현 벡터.
제5항에 있어서, 상기 프로모터가 구성성, 유도성, 종자-특이적, 또는 조직-특이적 프로모터인 발현 벡터.
제5항에 있어서, 엽록체 수송 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 서열 9를 포함하고, 단량체성 안트라닐레이트 신타제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 서열 207을 포함하는 발현 벡터.
제1항의 발현 벡터로 형질전환된 트랜스제닉 세포.
제8항에 있어서, 식물 세포로 정의되는 트랜스제닉 세포.
제9항에 있어서, 단자엽 세포로 정의되는 트랜스제닉 식물 세포.
제9항에 있어서, 쌍자엽 세포로 정의되는 트랜스제닉 식물 세포.
제9항에 있어서, 상기 단량체성 안트라닐레이트 신타제가 서열 200, 202, 204, 206, 208, 210, 및 212로 구성된 군으로부터 선택된 폴리펩티드 서열을 포함하는 트랜스제닉 식물 세포.
제9항에 있어서, 단량체성 안트라닐레이트 신타제에 융합된 엽록체 수송 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자에 작동가능하게 연결된 프로모터를 추가로 포함하는 트랜스제닉 식물 세포.
제13항에 있어서, 상기 프로모터가 구성성, 유도성, 종자-특이적, 및 조직-특이적 프로모터로 구성된 군으로부터 선택되는 트랜스제닉 식물 세포.
제9항에 있어서, 상기 트랜스제닉 식물 세포가 옥수수 세포인 트랜스제닉 식물 세포.
제9항에 있어서, 엽록체 수송 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 서열 9를 포함하고, 단량체성 안트라닐레이트 신타제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 서 열 207을 포함하는 트랜스제닉 식물 세포.
제1항의 발현 벡터를 식물 세포에서 발현시키는 것을 포함하고, 이때 상기 엽록체 수송 펩티드가 상기 단량체성 안트라닐레이트 신타제를 상기 식물 세포 내의 색소체에 구획화시킬 수 있고, 동일한 유전자형이지만 상기 엽록체 수송 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자가 없는 식물과 비교하여, 단자엽 식물의 종자에서 유리 트립토판의 수준을 2 내지 200배 증가시키는 방법.
제1항의 발현 벡터로 형질전환된 트랜스제닉 식물.
종자가 제1항의 발현 벡터를 포함하는, 제1항의 발현 벡터로 형질전환된 트랜스제닉 식물의 종자.
제19항의 종자를 조분(粗粉), 단백질 또는 오일로 가공하는 것을 포함하는, 영양학적으로 강화된 옥수수 사료 제품을 생산하는 방법.
제20항의 방법에 의해 생산된 사료 제품.
제21항에 있어서, 서열 28의 폴리펩티드 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 분자를 함유하는 사료 제품.
제21항에 있어서, DNA 증폭 방법에서 테스트되는 경우 제1항의 발현 벡터에 대해 진단성인 앰플리콘(amplicon)을 생산하는 핵산을 포함하는 것으로 정의되는 사료 제품.