CN101827938A

CN101827938A - 涉及rt1基因、相关的构建体和方法的具有改变的根构造的植物

Info

Publication number: CN101827938A
Application number: CN200880022664A
Authority: CN
Inventors: H·萨凯; G·塔拉米诺
Original assignee: EI Du Pont de Nemours and Co
Current assignee: EIDP Inc
Priority date: 2007-06-29
Filing date: 2008-06-27
Publication date: 2010-09-08
Also published as: US20090044293A1; CA2687442A1; BRPI0811792A2; EP2162543A1; MX2009013884A; WO2009006276A1

Abstract

本发明描述了尤其可用于改变植物根构造的分离的多核苷酸和多肽及重组DNA构建体、包含这些重组DNA构建体的组合物(例如植物或种子)，以及利用这些重组DNA构建体的方法。所述重组DNA构建体包含可操作地连接在植物中有功能的启动子的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码可用于改变植物根构造的多肽。

Description

涉及RT1基因、相关的构建体和方法的具有改变的根构造的植物

发明领域

本发明涉及可用于改变植物根构造的组合物和方法。另外，本发明涉及已经用本发明的组合物进行遗传转化的植物。

发明背景

对于植物根的发育和功能的基因调控所知相对较少。阐明基因调控是很重要的，因为根起着诸如获取水和营养物质以及植物固定在土壤中之类的重要功能。

玉米根构造由在不同植物发育阶段形成的不同的根类型构成。已经描述了玉米中在不同发育阶段特定根类型受到影响的许多突变体(如rtcs(rootless concerning crown and seminal roots(冠根和种子根生长缺陷突变体))、lrt1(lateral rootless1)(侧根生长缺陷突变体1))、rt1((root less 1)(根生长缺陷突变体1)(Hochholdinger等人(2004)Annals of Botany 93：359-368)。突变体rt1是已经分离出的根系形成的第一个突变体，它显示具有数目减少的茎生根。rt1突变体在较高的茎节处不存在任何茎生根，同时在前两个茎节处的冠状根数目仅有轻微差异。突变体rt1作为单基因隐性性状遗传，其图谱位于染色体3(MaizeGDB，见World Wide Web，maizegdb.org)

rt1突变体由Jenkins首次描述(Jenkins M T(1930)J Hered 21：79-80)，但仍无对编码rt1表型相关蛋白的核酸的分子分析。实际上，迄今为止仍无rt1编码蛋白特性的报道。

发明概述

本发明包括：

在一个实施方案中分离的多核苷酸包括：(i)编码多肽的核酸序列，在与SEQ ID NO：13或21比较时，基于Clustal V比对方法，该多肽的氨基酸序列具有至少50％的序列同一性，并且其中所述多肽在植物中的表达导致与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时改变的根构造。或(ii)(i)的核酸序列的全长互补序列，其中(i)的全长互补核酸序列由相同数目的核苷酸组成，并且是100％互补的。

在另一个实施方案中，一种分离的多肽，在与SEQ ID NO：13或21比较时，基于Clustal V比对方法，该多肽的氨基酸序列具有至少50％的序列同一性，并且其中所述多肽在植物中的表达导致与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时改变的根构造。

在另一个实施方案中，一种分离的多核苷酸包含：(i)一种核酸序列，该序列在与SEQ ID NO：12或20比较时，基于Clustal V比对方法，具有至少50％的序列同一性，并且其中所述多核苷酸编码多肽，其中所述多肽的表达导致与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时改变的根构造，或(ii)(i)的核酸序列的全长互补序列。

在另一个实施方案中，一种分离的多核苷酸包含(i)一种核酸序列，该序列在与SEQ ID NO：12或20比较时，基于Clustal V比对方法，具有至少50％的序列同一性，并且其中所述多核苷酸编码多肽，其中所述多肽的表达导致与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时改变的根构造，并且其中所述多肽序列包含至少一个选自SEQ ID NO：22和23的基序，其中所述基序是基本上保守的亚序列。

在另一个实施方案中，一种编码多肽的分离的多核苷酸，其中所述多肽的表达导致改变的根构造，并且其中多肽序列包含至少一个选自SEQ ID NO：22和23的基序，其中所述基序是基本上保守的亚序列。

在另一个实施方案中，一种在基因组中包含重组DNA构建体的植物，该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一个调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，在与SEQ ID NO：13、17、19或21比较时，基于Clustal V比对方法，所述多肽的氨基酸序列具有至少50％的序列同一性，并且其中所述植物在与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时表现出改变的根构造。

在另一个实施方案中，一种在基因组中包含重组DNA构建体的植物，该重组DNA构建体包含：

(a)可操作地连接至少一个调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，在与SEQ ID NO：13、17、19或21比较时，基于ClustalV比对方法，所述多肽的氨基酸序列具有至少50％的序列同一性，或

(b)抑制DNA构建体，该构建体包含至少一个调控元件，该调控元件有效连接至：(i)如下序列的全部或部分：(A)编码多肽的核酸序列，在与SEQ ID NO：13、17、19或21比较时，基于Clustal V比对方法，所述多肽的氨基酸序列具有至少50％的序列同一性，或(B)所述(b)(i)(A)的核酸序列的全长互补序列；或(ii)源自所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域，在与所述区域所来源的有义链或反义链的全部或部分比较时，基于Clustal V比对方法，所述区域的氨基酸序列具有至少50％的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码RT1或RT1样多肽，并且其中在与未包含所述重组构建体的对照植物比较时，所述植物表现出至少一种农学特性的改变。

在另一个实施方案中，一种改变植物根构造的方法，该方法包括(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一个调控序列的多核苷酸，其中该多核苷酸编码多肽，在与SEQ ID NO：13、17、19或21比较时，基于Clustal V比对方法，所述多肽的氨基酸序列具有至少50％的序列同一性；以及(b)在步骤(a)之后从该可再生植物细胞再生转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含该重组DNA构建体并且在与未包含该DNA构建体的对照植物比较时表现出改变的根构造；并且任选地，(c)获得源自该转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在基因组中包含该重组DNA构建体并且在与未包含该DNA构建体的对照植物比较时表现出改变的根构造。

在另一个实施方案中，一种评价植物根构造的方法，该方法包括(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一个调控序列的多核苷酸，其中该多核苷酸编码多肽，在与SEQ ID NO：13、17、19或21比较时，基于Clustal V比对方法，所述多肽的氨基酸序列具有至少50％的序列同一性；(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及(c)与未包含该重组DNA构建体的对照植物比较来评价该转基因植物的根构造；以及任选地，(d)获得源自该转基因植物的子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含该重组DNA构建体；以及任选地，(e)与未包含该重组DNA构建体的对照植物比较来评价该子代植物的根构造。

在另一个实施方案中，一种评价植物根构造的方法，该方法包括(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一个调控序列的多核苷酸，其中该多核苷酸编码多肽，在与SEQ ID NO：13、17、19或21比较时，基于Clustal V比对方法，所述多肽的氨基酸序列具有至少50％的序列同一性；(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；(c)获得源自该转基因植物的子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含该重组DNA构建体；以及(d)与未包含该重组DNA构建体的对照植物比较来评价该子代植物的根构造。

在另一个实施方案中，一种确定植物农学特性改变的方法，该方法包括(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一个调控序列的多核苷酸，其中该多核苷酸编码多肽，在与SEQ ID NO：13、17、19或21比较时，基于ClustalV比对方法，所述多肽的氨基酸序列具有至少50％的序列同一性；(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及(c)确定该转基因植物在与不包含该重组DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变；以及任选地，(d)获得源自该转基因植物的子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含该重组DNA构建体；以及任选地，(e)确定该子代植物在与不包含该重组DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。

在另一个实施方案中，一种确定植物农学特性改变的方法，该方法包括(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一个调控序列的多核苷酸，其中该多核苷酸编码多肽，在与SEQ ID NO：13、17、19或21比较时，基于ClustalV比对方法，所述多肽的氨基酸序列具有至少50％的序列同一性；(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；(c)获得源自该转基因植物的子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含该重组DNA构建体；并且(d)确定该子代植物在与不包含该重组DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。

在另一个实施方案中，一种确定植物农学特征改变的方法，该方法包括：

(a)将包含至少一个调控元件的抑制DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，该调控元件可操作地连接至：

(i)以下序列的全部或部分：(A)编码多肽的核酸序列，在与SEQ ID NO：13、17、19或21比较时，基于Clustal V比对方法，所述多肽的氨基酸序列具有至少50％的序列同一性，或(B)所述(b)(i)(A)的核酸序列的全长互补序列；或

(ii)源自所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域，在与源所述区域所来源的有义链或反义链的全部或部分比较时，基于Clustal V比对方法，所述区域的氨基酸序列具有至少50％的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码RT1或RT1样多肽；

(b)在步骤(a)之后从该可再生植物细胞再生转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体；以及

(c)确定该转基因植物在与不包含该抑制DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变；

以及(d)获得源自该转基因植物的子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体；以及任选地，(e)确定该子代植物在与不包含该抑制DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。

(i)以下序列的全部或部分：(A)编码多肽的核酸序列，在与SEQ ID NO：13、17、19或21比较时，基于Clustal V比对方法，所述多肽的氨基酸序列具有至少50％的序列同一性，或(B)所述(a)(i)(A)的核酸序列的全长互补序列；或

(ii)源自所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域，在与所述区域所来源的有义链或反义链的全部或部分比较时，基于Clustal V比对方法，所述区域的氨基酸序列具有至少50％的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码RT1或RT1样多肽；

(b)在步骤(a)之后从该可再生植物细胞再生转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体并且在与未包含该抑制DNA构建体的对照植物比较时表现出改变的根构造；

(c)获得源自该转基因植物的子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体；以及

(d)确定该子代植物在与不包含该抑制DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。

在另一个实施方案中，一种改变植物根构造的方法，该方法包括：

(i)以下序列的全部或部分：(A)编码多肽的核酸序列，在与SEQ ID NO：13、17、19或21比较时，基于Clustal V比对方法，所述多肽的氨基酸序列具有至少50％的序列同一性；或(B)(a)(i)(A)的核酸序列的全长互补序列；或

(ii)源自所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域，在与所述区域所来源的有义链或反义链的全部或部分比较时，基于Clustal V比对方法，所述区域的氨基酸序列具有至少50％的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码RT1或RT1样多肽；以及

(b)在步骤(a)之后从该可再生植物细胞再生转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体并且在与未包含该抑制DNA构建体的对照植物比较时表现出改变的根构造；以及任选地，(c)获得源自该转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含该重组DNA构建体并且其中该子代植物在与不包含该抑制DNA构建体的对照植物比较时表现出改变的农学特性；

在另一个实施方案中，一种评价植物根构造的方法，该方法包括：

(c)与未包含该抑制DNA构建体的对照植物比较评价该转基因植物的根构造；

以及(d)获得源自该转基因植物的子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体；以及任选地，(e)与未包含该抑制DNA构建体的对照植物比较来评价该子代植物的根构造。

(b)在步骤(a)之后从该可再生植物细胞再生转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体；

(d)与未包含该抑制DNA构建体的对照植物比较评价该子代植物的根构造。

本发明中还包括的是上述植物的任何子代、上述植物的任何种子以及来自任意上述植物和子代植物的细胞。

一种生产可作为产品销售的种子的方法，该种子提供改变的根构造，该方法包括任意前述优选的方法，并且还包括从所述子代植物获得种子，其中所述种子在它们的基因组中包含所述重组DNA构建体。

附图以及序列清单的说明

根据以下的详细描述和附图以及序列清单，可以更全面地理解本发明，以下的详细描述和附图以及序列清单形成本申请的一部分。

图1描述了在bac克隆b0541.c13(SEQ ID NO：9)上的RT1基因。

图2示出了在加入乙烯以后诱导的RT1转录。

图3A至3B示出了来自B73(SEQ ID NO：13)的RT1蛋白、大米RT1同源物(NCBI General标识符SEQ ID NO：17)、拟南芥RT1同源物(NCBI General标识符SEQ ID NO：19)和来自克隆cfp7n.pk6.i3的玉米RT1同源物(SEQ ID NO：21)的全长氨基酸序列的多重比对。所有序列间保守的氨基酸在顶行用星号(*)标出；该程序用短划线来使序列间最大程度的对齐。在所有四个序列之间的两个高度保守基序在比对中用下划线标出。采用Clustal比对方法(Higgins和Sharp，1989，CABIOS.5：151-153)使用默认参数(空位罚分(GAP PENALTY)＝10，空位长度罚分(GAP LENGTH PENALTY)＝10)执行下面的用于产生序列多重比对的方法参数。

图4示出了图3A至3B中显示的每对氨基酸序列的百分比序列同一性的图表。

图5示出了载体pDONOR^TM/Zeo。

图6示出了载体pDONOR^TM221。

图7示出了载体PHP27840。

图8示出了载体PHP23236。

图9示出了载体PHP10523。

图10示出了载体PHP28408。

图11示出了载体PHP20234。

图12示出了载体PHP28529。

图13示出了载体PHP22020。

图14示出了载体PHP23112。

图15示出了载体PHP23235。

图16示出了载体PHP29635。

图17示出了载体pIIOXS2a-FRT87(ni)m。

图18是实施例19中用于半水栽玉米生长的培养基。

图19是列出实施例19中与不同硝酸盐浓度对Gaspe Bay Flint衍生的玉米系生长和发育的影响相关的数据的图表。

图20a至c图示了rt1和在田间、温室或水栽条件下生长的野生型植物的比较。

序列描述以及相关联的序列列表遵循如37C.F.R.§1.821-1.825中所列出的管理专利申请中的核苷酸和/或氨基酸序列公开的规则。

序列列表包含核苷酸序列字符的单字母码以及氨基酸的三字母码，如遵照IUPAC-IUBMB标准所定义的，该标准在Nucleic Acids Res.13：3021-3030(1985)以及在Biochemical J.219(No.2)：345-373(1984)中描述，将这两篇文献以引用的方式并入本文。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式遵循在37C.F.R.§1.822中示出的规则。

SEQ ID NO：1是实施例2中所用的标记MZA8757-F81的正向引物。

SEQ ID NO：2是实施例2中所用的标记MZA8757-R593的反向引物。

SEQ ID NO：3是实施例2中所用的标记MZA15417-F132的正向引物。

SEQ ID NO：4是实施例1中所用的标记MZA15417-R607的反向引物。

SEQ ID NO：5是实施例2中所用的CAP标记b0541的正向引物。

SEQ ID NO：6是实施例2中所用的CAP标记b0541的反向引物。

SEQ ID NO：7是实施例2中所用的CAP标记b0461的正向引物

SEQ ID NO：8是实施例2中所用的CAP标记b0461的反向引物。

SEQ ID NO：9是实施例3中所述的来源于BAC b0541.c13的候选基因的序列。

SEQ ID NO：10是实施例3中所用的RT1 3006F的正向引物。

SEQ ID NO：11是实施例3中所用的RT1 17631R的反向引物。

SEQ ID NO：12是实施例3中所述的RT1的B73cDNA。

SEQ ID NO：13是由SEQ ID NO：12的核苷酸50至1382(终止)编码的RT1氨基酸序列。

SEQ ID NO：14是正向引物4405F，用于

实施例5中。

SEQ ID NO：15是实施例5中所用的etr4Rnew反向引物。

SEQ ID NO：16是编码来自大米的最接近多肽RT1同源物的核苷酸序列。

SEQ ID NO：17对应于由SEQ ID NO：16的核苷酸91至1263(终止)编码的RT1氨基酸序列同源物，并且用NCBI General标识符115434026示出。

SEQ ID NO：18是编码来自拟南芥的最接近多肽RT1同源物的核苷酸序列。

SEQ ID NO：19对应于由SEQ ID NO：18的核苷酸132至1493(终止)编码的RT 1氨基酸序列同源物，并且用NCBI General标识符15217667示出。

SEQ ID NO：20是对应于玉米RT1序列的玉米同源物的EST。

SEQ ID NO：21是由SEQ ID NO：20编码的氨基酸序列。

SEQ ID NO：22对应于图3A至3B中示出的比对中的基序I。

SEQ ID NO：23对应于图3A至3B中示出的比对中的基序II。

SEQ ID NO：24是实施例9中描述的attB1序列。

SEQ ID NO：25是实施例9中描述的attB2序列。

SEQ ID NO：26是实施例9中描述的正向引物VC062的序列。

SEQ ID NO：27是实施例9中描述的反向引物VC063的序列。

SEQ ID NO：28是实施例9中描述的载体pDONOR^TM/Zeo的序列。

SEQ ID NO：29是实施例9中描述的载体pDONOR^TM/221的序列。

SEQ ID NO：30是实施例9中描述的PHP27840的序列。

SEQ ID NO：31是实施例9中描述的PHP23236的序列。

SEQ ID NO：32是PHP10523的序列。

SEQ ID NO：33是NAS2启动子的序列。

SEQ ID NO：34是GOS2启动子的序列。

SEQ ID NO：35是泛素启动子的序列。

SEQ ID NO：36是PINII终止子的序列。

SEQ ID NO：37是PHP28408的序列。

SEQ ID NO：38是PHP20234的序列。

SEQ ID NO：39是PHP28529的序列。

SEQ ID NO：40是PHP22020的序列。

SEQ ID NO：41是PHP23112的序列。

SEQ ID NO：42是PHP23235的序列。

SEQ ID NO：43是PHP29635的序列。

SEQ ID NO：44是pIIOXS2a-FRT87(ni)m的序列。

SEQ ID NO：45是S2A启动子的序列。

发明详述

藉此将本文中所列出的每篇参考文献的公开内容的全文以引用的方式并入本文。

如本文所用的并在附加的权利要求书中的单数形式“一个”和“所述”包括复数涵义，除非上下文中清楚地另有指明。因此，例如，“一株植物”的涵义包括多株此类植物，“一个细胞”的涵义包括一个或多个细胞及其本领域的技术人员已知的等同物，等等。

术语“根构造”指构成根的不同植物部分的布置方式。术语“根构造”、“根组织结构”、“根系”和“根系结构”本文可以互换使用。

一般来讲，植物由胚发育成的第一种根称为初生根。在大多数双子叶植物中，初生根被称为主根。这种主根向下生长并产生分枝根(侧根)。在单子叶植物中，植物的初生根发生分枝，生成须根系。

术语“改变的根构造”指与参照植株或对照植株比较，在其不同发育阶段构成根系的不同部分的改变状况。应该理解，改变的根构造涵盖了一种或多种可测量参数(包括但不限于一个或多个根系部分的直径、长度、数目、角度或表面)的改变，所述根系部分包括但不限于初生根、侧根或分枝根、冠根、不定根和根毛，所有这些都在本发明的范围内。这些改变可导致根所占的区域或空间的整体改变。

“农学特性”是可测量的参数，包括但不限于绿度、产量、生长速率、生物量、成熟时的鲜重、成熟时的干重、果实产量、种子产量、总植物含氮量、果实含氮量、种子含氮量、营养组织含氮量、总植物游离氨基酸含量、果实游离氨基酸含量、种子游离氨基酸含量、营养组织游离氨基酸含量、总植物蛋白质含量、果实蛋白质含量、种子蛋白质含量、营养组织蛋白质含量、耐旱性、氮摄取、根倒伏、茎杆倒伏、根穿透、植株高度、穗长和收获指数。

“收获指数”指粒重除以总株重。

“rt1”(rootless 1)指玉米突变体的核苷酸序列。

“rt1”指玉米突变体的多肽。

“RT1”指玉米RT1野生型基因和cDNA，无限制的分别包括SEQID NO：9和SEQ ID NO：12。“RT1”指玉米RT1野生型蛋白，由SEQID NO：9的外显子和SEQ ID NO：12的cDNA编码。

“RT1样”指玉米RT1序列的核苷酸同源物，并对应于大米、拟南芥、和另外的玉米序列，无限制的分别包括SEQ ID NO：16、18、和20的核苷酸序列。

“RT1样”指玉米RT1蛋白的多肽同源物，并无限制地包括SEQ IDNO：17、19和21的氨基酸序列，分别对应于另外的大米、拟南芥和另外的玉米同源物。

“环境条件”指植物生长的条件，例如水的可用性、营养物质(例如氮或磷)的可用性、土壤类型、或者昆虫或病害的存在。

“改变环境条件”指植物生长条件的改变，包括但不限于水的可用性、营养物质(例如氮或磷)的可用性、土壤类型、或者昆虫或病害的存在。

“根倒伏”指茎杆从中间倾倒。根倒伏可能最早在营养阶段后期发生并且最晚在采收成熟时发生。根倒伏可能受杂交感病性(即使杂交体受有害物影响导致根倒伏)、环境胁迫(干旱、洪涝)、昆虫和病害的影响。在一些情况下，根倒伏可能是由玉米根虫伤害所致。

“根穿透”指植物根系穿透到土壤中的速率和深度。

“土壤类型”指在具体样本中根据不同尺寸的颗粒确定土壤质地，包括但不限于矿物质颗粒。术语“土壤类型”也指在改变物理条件下(包括但不限于水含量和耕作)的土壤致密度。一般来讲，土壤部分地由细小的土石颗粒构成，根据尺寸分成沙土、粉土、和粘土。每种尺寸起到显著不同的作用。例如，最大的颗粒，沙土，决定透气和水系特征，然而最小的亚显微颗粒，粘土颗粒，具有化学活性，能结合水和植物营养素。这些尺寸的比率决定土壤类型：粘土、壤土、粘壤土、粉砂壤土、等等。

“基因组”在用于植物细胞时不仅涵盖存在于细胞核中的染色体DNA，而且还包括存在于细胞的亚细胞组分(如线粒体、质粒)中的细胞器DNA。

“植物”包括整个植株、植物器官、植物组织、种子和植物细胞以及同一植株的子代。植物细胞包括但不限于得自下列物质的细胞：种子、悬浮培养物、胚、分生区域、愈伤组织、叶、根、芽、配子体、孢子体、花粉和小孢子。

“子代”包括植物的任何后续世代。

“转基因”指其基因组因异源核酸(如重组DNA构建体)的存在而发生改变的任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，包括那些最初的转基因事件以及从最初的转基因事件通过有性杂交或无性生殖而产生的那些。如本文所用的术语“转基因”不涵盖通过常规植物育种方法或通过诸如随机异花受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变之类的自然发生事件导致的基因组(染色体基因组或染色体外基因组)改变。

“转基因植物”包括在其基因组内包含异源多核苷酸的植物。优选的是，异源多核苷酸被稳定地整合进基因组中，使得该多核苷酸能传递至连续的世代。异源多核苷酸可以单独地或作为重组DNA构建体的部分整合进基因组中。

针对序列而言的“异源”意指来自外来物种的序列，或者如果来自相同物种，则指通过蓄意的人为干预而从其天然形式发生了组成和/或基因座的显著改变的序列。

“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”和“核酸片段”可互换使用，并且指作为单链或双链的RNA或DNA聚合物，任选含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。核苷酸(通常以它们的5′-单磷酸形式存在)通过如下它们的单个字母名称来指代：“A”为腺苷酸或脱氧腺苷酸(分别对应RNA或DNA)，“C”表示胞苷酸或脱氧胞苷酸，“G”表示鸟苷酸或脱氧鸟苷酸，“U”表示尿苷酸，“T”表示脱氧胸苷酸，“R”表示嘌呤(A或G)，“Y”表示嘧啶(C或T)，“K”表示G或T，“H”表示A或C或T，“I”表示肌苷，而“N”表示任意核苷酸。

“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。术语“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白质”还可以包括修饰，包括但不限于糖基化、脂质连接、硫酸盐化、谷氨酸残基的γ羧化、羟化和ADP-核糖基化。

“信使RNA(mRNA)”指无内含子并且可以通过细胞翻译成蛋白质的RNA。

“cDNA”指与mRNA模板互补并且利用逆转录酶从mRNA模板合成的DNA。cDNA可以是单链的或者可以用DNA聚合成酶I的Klenow片段转化成双链形式。

“成熟”蛋白质指经翻译后加工的多肽；即已经去除了存在于初级翻译产物中的任何前肽或原肽的多肽。

“前体”蛋白质指mRNA的翻译初级产物；即具有仍然存在的前肽和原肽。前肽和原肽可以是并且不限于细胞内定位信号。

“分离的”指物质，例如核酸和/或蛋白质，该物质基本上不含在天然存在的环境中通常伴随该物质或与其反应的组分，或者说是该物质被从所述组分移出。分离的多核苷酸可以从它们天然存在于其中的宿主细胞纯化。技术人员已知的常规核酸纯化方法可用于获得分离的多核苷酸。该术语也涵盖重组多核苷酸和化学合成的多核苷酸。

“重组体”指(例如)通过化学合成或者通过用基因工程技术操纵分离的核酸片段来实现的两个原本分离的序列片段的人工组合。“重组体”也包括细胞或载体，通过导入异源核酸改变细胞，来源于该改变细胞的细胞也改变了。它不包括自然发生事件(例如，自发突变、自然转化/转导/转座)改变的细胞或载体，例如那些无蓄意的人为干预而发生的改变。

“重组DNA构建体”指在自然界中通常不会一起存在的核酸片段的组合。因此，重组DNA构建体可以包含源于不同来源的调控序列和编码序列，或源于相同来源但以不同于通常天然存在的方式排列的调控序列和编码序列。

术语“调控序列”和“调控元件”本文可互换使用。

“调控序列”指位于编码序列的上游(5′非编码序列)、中间或下游(3′非编码序列)，并且影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或者翻译的核苷酸序列。调控序列可以包括但不限于启动子、翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化识别序列等。

“启动子”指能够控制另一核酸片段转录的核酸片段。

“在植物中有功能的启动子”指能够控制植物细胞中的转录的启动子，无论其是否来源于植物细胞。

“组织特异性启动子”和“组织优选启动子”可以互换使用，并且指主要但非必须专一地在一种组织或器官中表达，而是也可以在一种特定细胞中表达的启动子。

“发育调控启动子”指其活性由发育事件决定的启动子。

术语“可操作地连接”指核酸片段联合成单一片段，使得其中一个核酸片段的功能受到另一个核酸片段的调控。例如，在启动子能够调节核酸片段的转录时，该启动子与该核酸片段进行了可操作地连接。

“表达”指功能产物的产生。因此，核酸片段的表达可以指核酸片段的转录(如生成mRNA或功能RNA的转录)和/或RNA翻译成前体或成熟蛋白质。

“表型”意指细胞或生物体的可检测的特征。

有关将核酸片段(例如重组DNA构建体)插入细胞内的“导入”意指“转染”或“转化”或“转导”，并且包括指将核酸片段整合进真核或原核细胞中，在该细胞中核酸片段可以整合进细胞的基因组(如染色体、质粒、质体或线粒体DNA)内，转变成自主的复制子或瞬时表达(如转染的mRNA)。

“转化细胞”是将核酸片段(如重组DNA构建体)引入其中的任何细胞。

在此所用的“转化”指稳定转化和瞬时转化两者。

“稳定转化”指将核酸片段引入宿主生物体的基因组中，导致基因稳定遗传。一旦稳定转化，核酸片段稳定地整合进宿主生物体和任何连续世代的基因组中。

“瞬时转化”指将核酸片段引入宿主生物体的核中或包含DNA的细胞器中，引起基因表达而没有基因稳定遗传。

“等位基因”是占据染色体上给定位点的基因的几种供选择形式的其中一种。当二倍体植物中一对同源染色体上给定基因座上存在的等位基因相同时，该植物在该基因座处是纯合的。如果二倍体植物中一对同源染色体上给定基因座上存在的等位基因不同，则该植物在该基因座处是杂合的。如果转基因存在于二倍体植物中一对同源染色体中的其中之一上，则该植物在该基因座处是半合子的。

序列比对和百分比同一性可以用设计用于检测同源序列的多种比较方法来确定，这些方法包括但不限于

生物信息计算包(

Inc.，Madison，WI)的

程序。除非另外说明，否则本文提供的序列的多重比对用Clustal V比对方法(Higgins和Sharp，1989，CABIOS.5：151-153)采用默认参数(空位罚分＝10，空位长度罚分＝10)执行。用Clustal V方法进行成对比对和蛋白质序列的百分比同一性计算的默认参数为KTUPLE＝1、缺口罚分＝3、窗口(WINDOW)＝5和DIAGONALS SAVED＝5。而对于核酸，这些参数为KTUPLE＝2，空位罚分＝5，窗口＝4和DIAGONALS SAVED＝4。用Clustal V程序比对序列后，可以通过查看同一程序中的“序列距离”表来获得“百分比同一性”和“趋异”值。除非另外说明，否则本文提供的和申明的百分比同一性和趋异度是以该方式计算。

本文使用的标准重组DNA和分子克隆技术是本领域所熟知的并且在如下文献中有更全面的描述：Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual；Cold Spring HarborLaboratory Press：Cold Spring Harbor，1989(下文称为“Sambrook”)。

现在来看优选的实施方案：

优选的实施方案包括分离的多核苷酸和多肽、重组DNA构建体、包含这些重组DNA构建体的组合物(例如植株或种子)以及利用这些重组DNA构建体的方法。

优选的分离的多核苷酸和多肽

本发明包括如下优选的分离的多核苷酸和多肽：

分离的多核苷酸，包括：(i)编码多肽的核酸序列，当与SEQ ID NO：13或21比较时，基于Clustal V比对方法，该多肽的氨基酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，并且其中所述多肽在植物中的表达导致与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时改变的根构造，或(ii)(i)的核酸序列的完全互补序列，其中(i)的完全互补序列和核酸序列由相同数目的核苷酸构成并且100％互补。

任意上述分离的多核苷酸可以用于本发明的任何重组DNA构建体(包括抑制DNA构建体)。

一种分离的多肽，在与SEQ ID NO：13或21比较时，基于ClustalV比对方法，该多肽的氨基酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，并且其中所述多肽在植物中的表达导致与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时改变的根构造。

一种分离的多核苷酸，该核苷酸包含(i)在与SEQ ID NO：13或21比较时，基于Clustal V比对方法，具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，并且其中所述多核苷酸编码多肽，其中所述多肽的表达导致与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时改变的根构造，或(ii)(i)的核酸序列的全长互补序列。任意上述分离的多核苷酸可以用于本发明的任何重组DNA构建体(包括抑制DNA构建体)。该分离的多核苷酸编码RT1或RT1样蛋白。

优选的重组DNA构建体和抑制DNA构建体

在一个方面，本发明包括重组DNA构建体(包括抑制DNA构建体)。

在一个优选的实施方案中，重组DNA构建体包含可操作地连接至少一个调控序列(如，在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中该多核苷酸包含(i)编码氨基酸序列的核酸序列，在与SEQ ID NO：13、17、19或21比较时，基于Clustal V比对方法，所述多肽的氨基酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，或(ii)所述(i)核酸序列的全长互补序列；

在另一个优选实施方案中，重组DNA构建体包含可操作地连接至少一个调控序列(如，在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含(i)核酸序列，在与SEQ ID NO：12、16、18、或20比较时，基于Clustal V比对方法，该序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，或(ii)(i)核酸序列的全长互补序列。

图3A至3B示出了B73RT1(SEQ ID NO：13)、大米RT1同源物(SEQ ID NO：17)、拟南芥RT1同源物(SEQ ID NO：19)、和来自克隆cfp7n.pk6.i3的玉米RT1同源物(SEQ ID NO：21)的全长氨基酸序列的多重比对。所有序列间保守的氨基酸在顶行用星号(*)标出；该程序用短划线来使序列间最大程度的对齐。两个高度保守序列基序在比对中用下划线标出。采用Clustal比对方法(Higgins和Sharp，1989，CABIOS.5：151-153)使用默认参数(空位罚分＝10，空位长度罚分＝10)执行下面的用于产生序列多重比对的方法参数，并且成对比对默认参数为KTUPLE＝1，空位罚分＝3，窗口＝5以及DIAGONALS SAVED＝5。

在另一个优选的实施方案中，重组DNA构建体包含可操作地连接至少一个调控序列(如，在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码RT1或RT1样蛋白。优选地，该RT1或RT1样蛋白来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)、玉米(Zea mays)、大豆(Glycinemax)、烟豆(Glycine tabacina)、野大豆(Glycine soja)和短绒野大豆(Glycine tomentella)。

在另一方面，本发明包括抑制DNA构建体。

抑制DNA构建体优选包含至少一个调控序列(优选在植物中有功能的启动子)，该调控序列可操作地连接至：(a)以下序列的全部或部分：(i)编码多肽的核酸序列，当与SEQ ID NO：13、或21比较时，基于Clustal V比对方法，所述多肽的氨基酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，或(ii)(a)(i)核酸序列的全长互补序列；或者(b)源自所关注的靶基因的有义链或反义链的区域，在与所述区域所来源的有义链或反义链的全部或部分比较时，基于Clustal V比对方法，所述区域的核酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码RT1蛋白；或(c)以下序列的全部或部分：(i)核酸序列，当与SEQ ID NO：12或20比较时，基于Clustal V比对方法，所述多肽的氨基酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，或(ii)(c)(i)核酸序列的全长互补序列。该抑制DNA构建体优选包含共抑制构建体、反义构建体、病毒-抑制构建体、发夹抑制构建体、茎-环抑制构建体、产生双链RNA的构建体、RNAi构建体或小RNA构建体(如，siRNA构建体或miRNA构建体)。

应该理解(正如本领域技术人员将会理解的)，本发明不仅仅涵盖这些具体的示例性序列。导致给定位点处产生化学上等价的氨基酸但不影响所编码多肽的功能特性的核酸片段中的改变是本领域众所周知的。因此，氨基酸丙氨酸(一种疏水性氨基酸)的密码子可以被编码另一个疏水性较弱的残基(例如甘氨酸)或疏水性较强的残基(例如缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸)的密码子取代。类似地，导致一个带负电荷的残基替换为另一个带负电荷的残基(例如，天冬氨酸替代谷氨酸)或者一个带正电荷的残基替换为另一个带正电荷的残基(例如，赖氨酸替换精氨酸)的改变也可以预期产生功能上等价的产物。导致多肽分子的N-末端和C-末端部分改变的核苷酸变化也将预计不会改变多肽的活性。所提出的修饰中的每一种均完全在本领域常规技术内，如测定所编码的产物的生物活性的保留。

“抑制DNA构建体”是在转化或稳定整合进植物基因组时，导致该植物中的靶基因“沉默”的重组DNA构建体。对该植物来说，该靶基因可以是内源性的或是转基因的。如本文针对靶基因所使用的，“沉默”通常指在由靶基因表达的mRNA或蛋白质/酶的水平上的抑制，和/或在酶活性或蛋白质功能性的水平上的抑制。本文中可交换使用的术语“抑制”、“抑制”以及“沉默”包括降低、减少、减退、减小、抑制、消除或防止。“沉默”或“基因沉默”不确定机理并且包括(并且不限于)反义、共抑制、病毒-抑制、发夹抑制、茎-环抑制、基于RNAi的方法以及基于小RNAi的方法。

抑制DNA构建体可以包含源自所关注的靶基因的区域并且可以包含所关注的靶基因的有义链(或反义链)的核酸序列的全部或部分。取决于所要利用的方法，该区域可以与所关注基因的有义链(或反义链)的全部或部分100％相同或者有少于100％的同一性(如，有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性)。

抑制DNA构建体是本领域所熟知的，一旦选定所关注的靶基因就很容易构建，并且包括但不限于共抑制构建体、反义构建体、病毒-抑制构建体、发夹抑制构建体、茎-环抑制构建体、产生双链RNA的构建体，以及更通常的是，RNAi(RNA干扰)构建体和小RNA构建体，例如siRNA(短干扰RNA)构建体和miRNA(微RNA)构建体。

“反义抑制”指产生能够抑制靶蛋白表达的反义RNA转录物。

“反义RNA”指与靶初级转录物或mRNA的全部或部分互补，并阻断分离的靶核酸片段表达的RNA转录物(美国专利号：5,107,065)。反义RNA可以与特定基因转录物的任何部分，即5′非编码序列、3′非编码序列、内含子或编码序列互补。

“共抑制”指产生能够抑制靶蛋白表达的有义RNA转录物。“有义”RNA指包括mRNA并且可以在细胞内或体外翻译成蛋白质的RNA转录物。此前，已通过着眼于以有义方向过表达与内源mRNA具有同源性的核酸序列(其导致与过表达的序列具有同源性的所有RNA减少)设计出了植物中的共抑制构建体(参见Vaucheret等人，1998，Plant J.，16：651-659；以及Gura，2000，Nature 404：804-808)。

另一种变型描述了将植物病毒序列用于引导对近端mRNA编码序列的抑制(于1998年8月20日公开的PCT专利公开WO 98/36083)。

此前描述的是“发夹”结构的利用，该结构以互补方向整合mRNA编码序列的全部或部分，导致已表达的RNA形成潜在的“茎-环”结构(于1999年10月21日公开的PCT专利公开WO99/53050)。在这种情况下，茎由对应相对于启动子以有义或反义方向插入的相关基因的多核苷酸形成，并且环由一些相关基因的多核苷酸形成，在构建体中该多核苷酸不具有互补序列。这增加了获得的转基因植物中的共抑制或沉默频率。关于发夹抑制的综述，参见Wesley，S.V.等人，2003，Methods inMolecular Biology，Plant Functional Genomics：Methods and Protocols236：273-286。

其中茎由至少30个来自待抑制基因的核苷酸形成而环由任意的核苷酸序列形成的构建体也已经有效地用于抑制(于1999年12月2日公开的PCT专利公开No.WO 99/61632)。

使用聚-T和聚-A序列产生茎-环结构中的茎已经有所描述(于2002年1月3日公开的PCT专利公开WO 02/00894)。

然而另一种改变形式涉及使用合成的重复序列来促进茎-环结构中的茎的形成。用这种重组DNA片段产生的转基因生物体已经显示由形成茎环结构的核苷酸片段编码的蛋白质的水平降低，如于2002年1月3日公开的PCT专利公开No.WO 02/00904中所述。

RNA干扰是指动物中由短干扰RNA(siRNA)介导的序列特异性转录后基因沉默的过程(Fire等人，Nature 391：8061998)。在植物中的对应过程通常称为转录后基因沉默(PTGS)或RNA沉默，并且在真菌中也称为阻抑作用(quelling)。据信转录后基因沉默过程是用于防止外来基因表达的进化保守性细胞防御机制，并且通常由不同植物区系和门所共有(Fire等人，Trends Genet.15：3581999)。这种防止外来基因表达的保护作用可能是通过特异性破坏病毒基因组RNA的同源单链RNA的细胞反应，响应源自病毒感染或源自转座因子随机整合到宿主基因组内的双链RNA(dsRNA)的生成而进化而来。dsRNA在细胞中的存在通过还没有完全表征的机制引发了RNAi反应。

细胞中长dsRNA的存在刺激了称为dicer的核糖核酸酶III的活性。Dicer涉及使dsRNA加工成称为短干扰RNA(siRNA)的短dsRNA片段(Berstein等人，Nature 409：3632001)。源自dicer活性的短干扰RNA的长度通常是约21至约23个核苷酸，并且包含约19个碱基对的双链体(Elbashir等人，Genes Dev.15：1882001)。Dicer还涉及从保守结构的前体RNA上切下21个和22个核苷酸的小时序RNA(stRNA)，该小时序RNA参与翻译控制(Hutvagner等人，2001，Science 293：834)。RNAi响应还涉及内切核酸酶复合物，通常称为RNA诱导沉默复合物(RISC)，其介导具有与siRNA双链体的反义链互补的序列的单链RNA的裂解。靶RNA的裂解在与siRNA双链体的反义链互补的区域中间发生(Elbashir等人，Genes Dev.15：188 2001)。此外，RNA干扰还涉及小RNA(如miRNA)介导的基因沉默，可推定是通过调节染色质结构并由此防止靶基因序列转录的细胞机制(参见(例如)Allshire，Science297：1818-1819 2002；Volpe等人，Science 297：1833-1837 2002；Jenuwein，Science 297：2215-2218 2002；和Hall等人，Science 297：2232-2237 2002)。这样，本发明的miRNA分子可用于通过与RNA转录物相互作用或者作为另一种选择通过与特定基因序列相互作用来介导基因沉默，其中这样的相互作用导致在转录或转录后水平上的基因沉默。

已经在多种系统中研究了RNAi。Fire等人(Nature 391：806 1998)首次在秀丽隐杆线虫(C.elegans)中观察到RNAi。Wianny和Goetz(Nature Cell Biol.2：701999)描述了在小鼠胚胎中由dsRNA介导的RNAi。Hammond等人(Nature 404：2932000)描述了在用dsRNA转染的果蝇(Drosophila)细胞中的RNAi。Elbashir等人(Nature 411：4942001)描述了通过将合成的21-核苷酸RNA的双链体引入包括人胚肾和HeLa细胞在内的培养的哺乳动物细胞中而诱导的RNAi。

小RNA在控制基因表达中起重要作用。很多发育过程(包括开花)的调节是由小RNA控制的。现在能够通过使用在植物中产生小RNA的转基因构建体来以工程手段改变植物基因的基因表达。

小RNA似乎是通过与互补RNA或DNA靶序列碱基配对来行使功能的。当与RNA结合时，小RNA或者引发靶序列的RNA裂解或者引发翻译抑制。当与DNA靶序列结合时，据信小RNA可介导靶序列的DNA甲基化。无论具体机制是什么，这些事件的后果是基因表达受到抑制。

据认为，小RNA和它们的RNA靶标之间的序列互补性有助于确定采用了哪种机制(RNA裂解或翻译抑制)。据信，优选与它们的靶标互补的siRNA通过RNA裂解起作用。一些miRNA与它们的靶基因具有完全或几乎完全的互补性，并且对于至少一些这样的miRNA，已经证实了RNA裂解。其他miRNA与它们的靶标具有若干错配，并且在翻译水平上明显抑制了它们的靶标。同样，无需坚持特定的作用机理，出现了这样一种一般规律：完全或几乎完全的互补性引起RNA裂解，而当miRNA/靶标双链体含有许多错配时倾向于翻译抑制。对于此规律的一个明显例外是植物中微RNA 172(miR172)。miR172的其中一个靶标是APETALA2(AP2)，尽管miR172与AP2具有几乎完全的互补性，但其表现出引起AP2的翻译抑制而不是引起RNA裂解。

微RNA(miRNA)是已经在动物和植物中都鉴定到的长度为约19至约24个核苷酸(nt)的非编码RNA(Lagos-Quintana等人，Science 294：853-858 2001；Lagos-Quintana等人，Curr.Biol.12：735-739 2002；Lau等人，Science 294：858-862 2001；Lee和Ambros，Science 294：862-8642001；Llave等人，Plant Cell 14：1605-1619 2002；Mourelatos等人，Genes.Dev.16：720-728 2002；Park等人，Curr.Biol.12：1484-1495 2002；Reinhart等人，Genes.Dev.16：1616-1626 2002)。它们是由大小为大约70至200nt的较长的前体转录物加工生成的，并且这些前体转录物能够形成稳定的发夹结构。在动物中，涉及加工miRNA前体的酶称为Dicer，这是一种类核糖核酸酶III蛋白(Grishok等人，Cell 106：23-34 2001；Hutvagner等人，Science 293：834-838 2001；Ketting等人，Genes.Dev.15：2654-2659 2001)。植物也具有类Dicer酶，即DCL1(以前称为CARPEL FACTORY/SHORT INTEGUMENTS1/SUSPENSOR1)，并且最近有证据表明，其像Dicer一样，也涉及发夹前体的加工以产生成熟miRNA(Park等人，Curr.Biol.12：1484-1495 2002；Reinhart等人，Genes.Dev.16：1616-1626 2002)。此外，最近的研究已经清楚地表明，至少某些miRNA发夹前体最初是作为较长的聚腺苷酸化转录物存在，并且在单个转录物中可以存在几种不同的miRNA以及相关发夹(Lagos-Quintana等人，Science 294：853-858 2001；Lee等人，EMBO J21：4663-4670 2002)。最近的研究还检验了miRNA链从dsRNA产物的选择，所述dsRNA产物是通过DICER加工发夹而产生的(Schwartz等人，2003，Cell 115：199-208)。看起来，经加工的dsRNA的两端的稳定性(即G∶C与A∶U的含量比，和/或错配)影响链选择，具有低稳定性的末端更容易因解旋酶活性而解旋。低稳定性末端的5′末端链被整合至RISC复合物内，而另一条链被降解。

微RNA看起来通过与位于由这些基因产生的转录物中的互补序列结合来调节靶基因。就lin-4和let-7而言，靶位点位于靶mRNA的3′非翻译区中(Lee等人，Cell 75：843-854 1993；Wightman等人，Cell 75：855-862 1993；Reinhart等人，Nature 403：901-906 2000；Slack等人，Mol.Cell 5：659-669 2000)，并且在lin-4和let-7miRNA与其靶位点之间有几个错配。lin-4或let-7miRNA的结合看起来引起了由靶mRNA编码的蛋白质的稳态水平下调，而不影响转录物自身(Olsen和Ambros，Dev.Biol.216：671-680 1999)。另一方面，最近有证据表明，在某些情况下，miRNA可以引起靶转录物在靶位点内特异性RNA裂解，并且该裂解步骤看起来需要miRNA与靶转录物之间具有100％的互补性(Hutvagner和Zamore，Science 297：2056-2060 2002；Llave等人，PlantCell 14：1605-1619 2002)。看起来有可能miRNA可以进入至少两条靶基因调控途径：当靶互补性＜100％时，蛋白下调，当靶互补性是100％时，RNA裂解。进入RNA裂解途径的微RNA与在动物中RNA干扰(RNAi)期间以及在植物中转录后基因沉默(PTGS)期间产生的21-25nt短干扰RNA(siRNA)类似(Hamilton和Baulcombe 1999；Hammond等人，2000；Zamore等人，2000；Elbashir等人，2001)，并且可能整合进与在RNAi情况中观察到的复合物类似或相同的RNA-诱导的沉默复合物(RISC)内。

用生物信息学鉴定miRNA的靶标在动物中没有成功，这可能是因为动物miRNA与它们的靶标具有低水平的互补性。另一方面，生物信息学方法已经成功地用于预测植物miRNA的靶标(Llave等人，Plant Cell14：1605-1619 2002；Park等人，Curr.Biol.12：1484-1495 2002；Rhoades等人，Cell 110：513-5202002)，因此，看起来植物miRNA与它们的推定靶标的整体互补性高于动物miRNA。植物miRNA的这些预测靶标中的大部分编码涉及植物发育模式或细胞分化的转录因子家族的成员。

本发明的重组DNA构建体(包括抑制DNA构建体)优选包含至少一种调控序列。

优选的调控序列是启动子。

多种启动子可用于本发明的重组DNA构建体(及抑制DNA构建体)中。可以根据所需结果来选择启动子，并且可以包括用于在宿主生物体中表达的组成型启动子、组织特异性启动子、诱导型启动子或其他启动子。

在35S启动子控制下的候选基因的高水平组成型表达可以具有多效性。可以在通过不同启动子驱动时测试候选基因的效率。

适用于植物宿主细胞的组成型启动子包括(例如)Rsyn7启动子的核心启动子和在WO 99/43838和美国专利6,072,050中公开的其他组成型启动子；CaMV 35S核心启动子(Odell等人，Nature 313：810-812(1985))；水稻肌动蛋白启动子(McElroy等人，Plant Cell 2：163-171(1990))；泛素启动子(Christensen等人，Plant Mol.Biol.12：619-632(1989)和Christensen等人，Plant Mol.Biol.18：675-689(1992))；pEMU(Last等人，Theor.Appl.Genet.81：581-588(1991))；MAS(Velten等人，EMBO J.3：2723-2730(1984))；ALS启动子(美国专利5,659,026)等。其他组成型启动子包括例如在美国专利5,608,149、5,608,144、5,604,121、5,569,597、5,466,785、5,399,680、5,268,463、5,608,142和6,177,611中公开的那些以及玉米GOS2(WO0020571A2)。

在选择启动子用于本发明方法时，可能有利的是使用组织特异性启动子或发育调节启动子。

优选的组织特异性启动子或发育调节启动子是这样的DNA序列，该序列调节DNA序列选择性地在对雄穗发育、结籽或两者重要的植物细胞/组织中表达，并限制这种DNA序列只在植物的雄穗发育或种子成熟期间表达。任何引起所需时空表达的可鉴定启动子都可用于本发明的方法中。

种子或胚特异性的并且可用于本发明的启动子包括大豆Kunitz胰蛋白酶抑制剂启动子(Kti3，Jofuku和Goldberg，Plant Cell 1：1079-1093(1989))、patatin启动子(马铃薯块茎)(Rocha-Sosa，M.等人，1989，EMBO J.8：23-29)、convicilin启动子、豌豆球蛋白启动子和豆球蛋白启动子(豌豆子叶)(Rerie，W.G.等人，1991，Mol.Gen.Genet.259：149-157；Newbigin，E.J.等人，1990，Planta 180：461-470；Higgins，T.J.V.等人，1988，Plant.Mol.Biol.11：683-695)、玉米蛋白启动子(玉米胚乳)(Schemthaner，J.P.等人，1988，EMBO J.7：1249-1255)、菜豆蛋白启动子(菜豆子叶)(Segupta-Gopalan，C.等人，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82：3320-3324)、植物凝集素启动子(菜豆子叶)(Voelker，T.等人，1987，EMBO J.6：3571-3577)、B-伴大豆球蛋白(conglycinin)启动子和大豆球蛋白启动子(大豆子叶)(Chen，Z-L等人，1988，EMBO J.7：297-302)、谷蛋白启动子(水稻胚乳)、大麦醇溶蛋白启动子(大麦胚乳)(Marris，C.等人，1988，Plant Mol.Biol.10：359-366)、麦谷蛋白启动子和醇溶蛋白启动子(小麦胚乳)(Colot，V.等人，1987，EMBO J.6：3559-3564)和sporamin启动子(甘薯块根)(Hattori，T.等人，1990，Plant Mol.Biol.14：595-604)。可操作地连接至嵌合基因构建体中的异源编码区的种子特异性基因的启动子在转基因植物中保持它们的时空表达模式。这样的实施例包括在拟南芥属和甘蓝型油菜(Brassica napus)种子中表达脑啡肽的拟南芥2S种子储藏蛋白基因启动子(Vanderkerckhove等人，Bio/Technology 7：L929-932(1989))、表达荧光素酶的菜豆凝集素和β-菜豆蛋白启动子(Riggs等人，Plant Sci.63：47-57(1989))，以及表达氯霉素乙酰转移酶的小麦谷蛋白启动子(Colot等人，EMBO J 6：3559-3564(1987))。

可诱导启动子响应内源性或外源性刺激的存在，例如，通过化合物(化学诱导剂)，或响应环境、激素、化学信号和/或发育信号而选择性表达可操作地连接的DNA序列。可诱导的或受调控的启动子包括(例如)受光、热、胁迫、水涝或干旱、植物激素、创伤或诸如乙醇、茉莉酮酸酯、水杨酸或安全剂之类的化学品调控的启动子。

优选的启动子包括如下启动子：1)胁迫可诱导的RD29A启动子(Kasuga等人，1999，Nature Biotechnol.17：287-91)；2)大麦启动子B22E；B22E的表达是发育中的玉米籽粒中的柄所特异性的(“PrimaryStructure of a Novel Barley Gene Differentially Expressed in ImmatureAleurone Layers(在未成熟糊粉层中差异表达的新大麦基因的一级结构)”。Klemsdal，S.S.等人，Mol.Gen.Genet.228(1/2)：9-16(1991))；和3)玉米启动子，Zag2(“Identification and molecular characterizationof ZAG1，the maize homolog of the Arabidopsis floral homeotic geneAGAMOUS”，Schmidt，R.J.等人，Plant Cell 5(7)：729-737(1993))。“Structural characterization，chromosomal localization and phylogeneticevaluation of two pairs of AGAMOUS-like MADS-box genes from maize”，Theissen等人，Gene 156(2)：155-166(1995)；NCBI GenBank AccessionNo.X80206))。Zag2转录物可以在授粉前5天至授粉后(DAP)7至8天被检测到，并且引导Ciml在发育中的雌花序心皮中表达，Ciml对发育中的玉米籽粒的籽仁而言是特异性的。Ciml转录物在授粉前4至5天至授粉后6至8天被检测到。其他可用的启动子包括可源自其表达与发育中的雌小花母系相关的基因的任何启动子。

用于调控本发明的核苷酸序列在植物中表达的其他优选启动子是茎特异性启动子。这种茎特异性启动子包括苜蓿S2A启动子(GenBank登记号：EF030816；Abrahams等人，Plant Mol Biol.27：513-528(1995))和S2B启动子(GenBank登记号：EF030817)等等，将这些文献以引用的方式并入本文。

启动子可以整个源于天然基因，或者由源于天然存在的不同启动子的不同元件构成，或者甚至包含合成的DNA片段。本领域内的技术人员应当理解，不同的启动子可以在不同的组织或细胞类型中，或者在不同的发育阶段，或者响应不同的环境条件而引导基因的表达。还应认识到，由于在大多数情况下还不能完全确定调控序列的确切范围，一些变型的DNA片段可能具有相同的启动子活性。在多数情况下引起基因在大多数细胞型中表达的启动子通常称为“组成型启动子”。目前不断在发现可用于植物细胞中的不同类型的新启动子；在Okamuro，J.K.和Goldberg，R.B.，Biochemistry of Plants 15：1-82(1989)的汇编中可以找到许多实例。

优选的启动子可以包括：RIP2、mLIP15、ZmCOR1、Rab17、CaMV35S、RD29A、B22E、Zag2、SAM合成酶启动子、泛素启动子、CaMV19S、nos、Adh、蔗糖合成酶启动子、R-等位基因启动子、根细胞启动子、维管组织优选的启动子S2A(Genbank登录号EF030816；SEQ ID NO：76)和S2B(Genbank登录号EF030817)及来自玉米的组成型启动子GOS2。其他优选的启动子包括根优选的启动子，例如玉米NAS2启动子、玉米Cyclo启动子(US 2006/0156439，公开于2006年7月13日)、玉米ROOTMET2启动子(WO05063998，公开于2005年7月14日)、CR1BIO启动子(WO06055487，公开于2006年5月26日)、CRWAQ81(WO05035770，公开于2005年4月21日)和玉米ZRP2.47启动子(NCBI登录号：U38790，gi：1063664)。

本发明的重组DNA构建体(及抑制DNA构建体)也可以包括其他调控序列，包括但不限于翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化识别序列。在本发明的另一个优选的实施方案中，本发明的重组DNA构建体还包括增强子或沉默子。

内含子序列可以加至部分编码序列的5’非翻译区或编码序列以增加积聚在胞浆中的成熟信息的量。已经显示，在植物和动物两者的表达构建体的转录单位中包含可剪接内含子可使基因表达在mRNA和蛋白质水平上都增强高达1000倍。参见Buchman和Berg，Mol.Cell Biol.8：4395-4405(1988)；Callis等人，Genes Dev.1：1183-1200(1987)。这种内含子对基因表达的增强通常在将其设置接近转录单位的5’端时为最大。玉米内含子Adh1-S内含子1、2和6、Bronze-1内含子的使用是本领域已知的。通常参见The Maize Handbook，第116章，Freeling和Walbot(编辑)，Springer，纽约(1994)。

如果期望进行多肽表达，则通常希望在多核苷酸编码区的3′-端处包含有多腺苷酸化区。该多腺苷酸化区可以源自天然基因，源自多种其他植物基因或源自T-DNA。要加入的3′端序列可以源自(例如)胭脂碱合成酶或章鱼碱合成酶基因，或作为选择源自另外的植物基因，或较不优选的是源自任何其他真核基因。

“翻译前导序列”指位于基因启动子序列和编码序列之间的DNA序列。翻译前导序列存在于翻译起始序列的经完全加工后的mRNA上游。翻译前导序列可影响mRNA的初级转录过程、mRNA稳定性或翻译效率。翻译前导序列的实例已经有所描述(Turner，R.和Foster，G.Molecular Biotechnology 3：225(1995))。

任何植物都可以选择用来鉴定将用于产生本发明重组DNA构建体和抑制DNA构建体的调控序列和基因。适用于分离基因和调控序列的靶植物的实例应该包括但不限于苜蓿、苹果、杏、拟南芥属植物、朝鲜蓟、芝麻菜、芦笋、鳄梨、香蕉、大麦、豆类、甜菜、黑莓、蓝莓、椰菜、抱子甘蓝、卷心菜、卡诺拉(canola)、香瓜、胡萝卜、木薯、蓖麻、花椰菜、芹菜、樱桃、菊苣、芫荽、柑桔类、克莱门氏小柑橘类、三叶草、椰子、咖啡、玉米、棉花、酸果蔓、黄瓜、花旗松、茄子、菊苣、阔叶菊苣、桉树、茴香、无花果、大蒜、葫芦、葡萄、柚子树、白兰瓜、豆薯、猕猴桃、生菜、韭葱、柠檬、莱檬、火炬松、亚麻子、芒果、甜瓜、黍、蘑菇、油桃、坚果、燕麦、油棕、油菜、秋葵、橄榄树、洋葱、橙、观赏植物、棕榈、番木瓜树、欧芹、欧洲防风草、豌豆、桃树、花生、梨树、胡椒、柿树、松树、菠萝、车前草、李树、石榴树、白杨、马铃薯、南瓜、温柏树、辐射松、菊苣、萝卜、油菜、悬钩子、水稻、黑麦、高粱、南方松、大豆、菠菜、南瓜、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、甘薯、枫香树、柑橘、茶、烟草、蕃茄、黑小麦、草皮草、芜菁、葡萄树、西瓜、小麦、薯蓣和西葫芦。用于鉴定调控序列的特别优选的植物是拟南芥属植物、玉米、小麦、大豆和棉花。

优选的组合物

本发明的优选组合物是其基因组中包含本发明的任何重组DNA构建体(包括任何抑制DNA构建体)(例如上面所讨论的那些优选构建体)的植物。优选的组合物还包括这种植物的任何子代，以及从这种植物或其子代获得的种子。子代包括通过植物的自花授粉或异型杂交而获得的连续世代。子代也包括杂种和自交系。

优选地，在杂交种子繁殖的农作物中，成熟的转基因植物可以自花授粉而产生纯合的自交系植物。该自交系植物产生含有新引入的重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)的种子。这些种子可以生长而产生将会表现出改变的农学特性(如，在氮或磷限制条件下农学特性增加)的植物，或者可以用于育种程序以产生杂交种子，这些杂交种子可以生长而产生将会表现出改变的根构造的植物。优选地，种子是玉米。

优选地，植物是单子叶植物或双子叶植物，更优选地，是玉米或大豆植物，甚至更优选的是玉米植物，例如玉米杂种植物或玉米自交系植物。植物还可以是向日葵、高梁、卡诺拉、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦或黍。

优选地，重组DNA构建体稳定地整合进植物的基因组中。

尤其优选的实施方案包括但不限于如下优选的实施方案：

1.在基因组中包含重组DNA构建体的植物(优选玉米或大豆植物)，该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一个调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，在与SEQ ID NO：13、17、19或21比较时，基于Clustal V比对方法，所述多肽的氨基酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，并且其中所述植物在与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时表现出改变的根构造。优选地，在与该对照植物比较时，该植物还表现出至少一种农学特性的改变。

2.在基因组中包含重组DNA构建体的植物(优选玉米或大豆植物)，该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一个调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码RT1或RT1样蛋白，并且其中在与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时，所述植物表现出改变的根构造。优选地，在与该对照植物比较时，该植物还表现出至少一种农学特性的改变。优选地，该RT1或RT1样蛋白来自拟南芥(Arabidopsisthaliana)、玉米(Zea mays)、大豆(Glycine max)、烟豆(Glycine tabacina)、野大豆(Glycine soja)和短绒野大豆(Glycine tomentella)。

3.在基因组中包含抑制DNA构建体的植物(优选玉米或大豆植物)，该抑制DNA构建体包含至少一个可操作地连接至源自所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域的调控元件，在与所述区域所来源的有义链或反义链的全部或部分比较时，基于Clustal V比对方法，所述区域的核酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码RT1或RT1样蛋白，并且其中在与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时，所述植物表现出至少一种农学特性的改变。

4.在基因组中包含抑制DNA构建体的植物(优选玉米或大豆植物)，该抑制DNA构建体包含至少一个可操作地连接至以下序列的全部或部分的调控元件：(a)编码多肽的核酸序列，在与SEQ ID NO：13、17、19、或21比较时，基于Clustal V比对方法，该多肽的氨基酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，或(b)(a)的核酸序列的完全互补序列，并且其中在与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时，所述植物表现出至少一种农学特性的改变。

5.上述优选实施方案1-4中的植物的任何子代、上述优选实施方案1-4中的植物的任何种子、上述优选实施方案1-4中的植物的子代的任何种子以及来自上述优选实施方案1-4中的植物以及它们的子代的细胞。

在上述优选的实施方案1-5或本发明的任意其他实施方案中的任意一项中，重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)优选包含至少一个在植物中有功能的启动子作为优选的调控序列。

在上述优选的实施方案1-5或本发明的任意其他实施方案中的任意一项中，至少一种农学特性的改变是增加或减少，优选增加。

在上述优选的实施方案1-5或本发明的任意其他实施方案中的任意一项中，是绿度、产量、生长速率、生物量、成熟时的鲜重、成熟时的干重、果实产量、种子产量、总植物氮含量、果实氮含量、种子氮含量、营养组织的氮含量、总植物游离氨基酸含量、果实游离氨基酸含量、种子游离氨基酸含量、营养组织中的游离氨基酸含量、总植物蛋白质含量、果实蛋白质含量、种子蛋白质含量、营养组织中的蛋白质含量、抗旱性、氮摄取、根倒伏、根穿透以及收获指数中的至少一种的改变。

绿度、收获指数、产量、生物量、抗根倒伏性、改善的根穿透是用于改变的特别优选的农学特性。此外，这些农学特性优选地相对于对照植物提高。

在上述优选的实施方案1-5或本发明的任意其他实施方案中的任意一项中，在与对照植物比较时，植物优选表现出至少一种与(例如)水和营养物质的可利用性无关的农学特性的改变。

本领域的普通技术人员熟悉确定植物根构造改变的规程。例如，根构造的改变可以通过统计温室培育的植物顶部第3或第4节的节根数目或根带的宽度来确定。根构造改变的其他度量包括但不限于与对照或参照植物比较时活力、生长、大小、产量、改善的根穿透或抗根倒伏性的改变。

下面的实施例描述了一些用于检测根构造改变的代表性规程和技术。

人们还可以在多种环境条件(如营养物质过剩或营养物质有限、暴露于昆虫或疾病)下的田间实验中，通过测量与正常的营养或水条件比较时在那些条件下基本等价的产量，或者通过测量与对照或参照植物比较时在过剩或有限的营养物质和水的条件下较少的产量下降，从而通过植物保持足够的产量阈值的能力来评估根构造的改变。

根构造的改变可以通过确定转基因植物较于参照植物或对照植物的抗根倒伏性来测量。改善的根穿透是用于测定根构造中改变的附加量度。

在评估或测量其中利用了对照或参照植物的本发明任何实施方案(如，如本文描述的组合物或方法)中的转基因植物的农学特性或表型时，本领域的普通技术人员将很容易认识到要利用的合适对照或参照植物。例如，通过如下非限制性示例来说明：

1.转化植物的子代，该植物对于重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)来说是半合子的，使得该子代分离成包含或不包含该DNA构建体(或抑制DNA构建体)的植株：包含该重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)的子代将通常相对于未包含该重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)的子代来进行测量(即，未包含该重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)的子代是对照或参照植株)。

2.重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)基因渗入至自交系中，例如在玉米中，或基因渗入进变体中，例如在大豆中：基因渗入品系将通常相对于亲本自交系或变种品系进行测量(即，亲本自交系或变种品系是对照或参照植物)。

3.双杂交系，其中第一杂交系由两个亲本自交系产生，而第二杂交系由相同的两个亲本自交系产生，不同的是其中一个亲本自交系含有重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)：第二杂交系通常将相对于第一杂交系进行测量(即亲本自交系或变种品系为对照植物或参照植物)。

4.包含重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)的植株：该植株可以相对于这样的对照植株进行评估或测量，该对照植株不包含重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)，但具有与该植株相当的遗传背景(例如，与包含重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)的植株相比较，核遗传物质具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性)。存在许多可用于分析、比较和表征植物遗传背景的基于实验室的技术；其中这些技术是同工酶电泳、限制性片段长度多态性(RFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、任意引物聚合成酶链反应(AP-PCR)、DNA扩增指纹(DAF)、序列特异扩增区域(SCAR)、扩增片段长度多态性(

)和也称为微卫星的简单序列重复(SSR)。

此外，本领域的普通技术人员将容易认识到，评估或测量转基因植物的农学特性或表型时合适的对照或参照植物将不包括先前已经针对所需的农学特性或表型，通过诱变或转化而选择的植物。

优选的方法

优选的方法包括但不限于用于改变植物根构造的方法、用于评价植物根构造改变的方法、用于改变植物农学特性的方法、用于评价植物农学特性改变的方法以及用于产生种子的方法。优选地，植物是单子叶植物或双子叶植物，更优选地，是玉米或大豆植物，甚至更优选地，是玉米植物。植物还可以是向日葵、高梁、卡诺拉、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦或黍。种子优选的是玉米或大豆种子，更优选的是玉米种子，并且甚至更优选的是玉米杂种种子或玉米自交系种子。

特别优选的方法包括但不限于如下方法：

一种改变植物根构造的方法，该方法包括：(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一个调控序列(优选在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中该多核苷酸编码多肽，在与SEQ ID NO：13、17、19或21比较时，基于Clustal V比对方法，所述多肽的氨基酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性；

以及(b)在步骤(a)之后从该可再生植物细胞再生转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含该重组DNA构建体并且在与未包含该DNA构建体的对照植物比较时表现出改变的根构造。该方法可以另外包括(c)获得源自该转基因植物的子代植物。

一种改变植物根构造的方法，该方法包括：(a)将抑制DNA构建体引入到可再生的植物细胞，该抑制DNA构建体包含至少一个调控序列(优选在植物中有功能的启动子)，该调控序列可操作地连接至以下序列的全部或部分：(i)编码多肽的核酸序列，在与SEQ ID NO：13、17、19或21比较时，基于Clustal V比对方法，所述多肽的氨基酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，或(ii)(a)(i)核酸序列的全长互补序列；以及(b)在步骤(a)之后从该可再生植物细胞再生转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含该重组DNA构建体并且在与未包含该重组DNA构建体的对照植物比较时表现出改变的根构造。该方法可以另外包括(c)获得源自该转基因植物的子代植物。

一种改变植物根构造的方法，该方法包括：(a)将抑制DNA构建体引入到可再生的植物细胞，该抑制DNA构建体包括至少一个调控序列(优选在植物中有功能的启动子)，该调控序列可操作地连接至源自所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域，在与所述区域所来源的有义链或反义链的全部或部分比较时，基于Clustal V比对方法，所述区域的核酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码RT1或RT1样蛋白；以及(b)在步骤(a)之后从该可再生植物细胞再生转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含该重组DNA构建体并且在与未包含该重组DNA构建体的对照植物比较时表现出改变的根构造。该方法可以另外包括(c)获得源自该转基因植物的子代植物。

一种评价植物根构造改变的方法，该方法包括：(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一个调控序列(优选在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，在与SEQ ID NO：13、17、19、或21比较时，基于Clustal V比对方法，该多肽的氨基酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，(b)在步骤(a)之后从该可再生植物细胞再生转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含该重组DNA构建体；以及(c)评价该转基因植物在与未包含该重组DNA构建体的对照植物比较时改变的根构造。该方法还可以包括：(d)获得源自该转基因植物的子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含该重组DNA构建体；以及(e)评价该子代植物在与未包含该重组DNA构建体的对照植物比较时改变的根构造。

一种评价植物根构造改变的方法，该方法包括：(a)将抑制DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，该抑制DNA构建体包含至少一个调控序列(优选在植物中有功能的启动子)，该调控序列可操作地连接至以下序列的全部或部分：(i)编码多肽的核酸序列，在与SEQ ID NO：13、17、19或21比较时，基于Clustal V比对方法，所述多肽的氨基酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，或(ii)(a)(i)核酸序列的全长互补序列；(b)在步骤(a)之后从该可再生植物细胞再生转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体；以及(c)评价该转基因植物在与未包含该抑制DNA构建体的对照植物比较时改变的根构造。该方法可以另外包括：(d)获得源自该转基因植物的子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体；以及(e)评价该子代植物在与未包含该抑制DNA构建体的对照植物比较时改变的根构造。

一种评价植物根构造改变的方法，该方法包括：(a)将抑制DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，该抑制DNA构建体包含至少一个调控序列(优选在植物中有功能的启动子)，该调控序列可操作地连接至源自所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域，在与所述区域所来源的有义链或反义链的全部或部分比较时，基于Clustal V比对方法，所述区域的核酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码RT1或RT1样蛋白；(b)在步骤(a)之后从该可再生植物细胞再生转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体；以及(c)评价该转基因植物在与未包含该抑制DNA构建体的对照植物比较时改变的根构造。该方法可以另外包括：(d)获得源自该转基因植物的子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体；以及(e)评价该子代植物在与未包含该抑制DNA构建体的对照植物比较时改变的根构造。

一种评价植物根构造改变的方法，该方法包括：(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一个调控序列(优选在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，在与SEQ ID NO：13、17、19、或21比较时，基于Clustal V比对方法，该多肽的氨基酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，(b)在步骤(a)之后从该可再生植物细胞再生转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含该重组DNA构建体；(c)获得源自所述转基因植物的子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含该重组DNA构建体；以及(d)评价该子代植物在与未包含该重组DNA构建体的对照植物比较时改变的根构造。

一种评价植物根构造改变的方法，该方法包括：(a)将抑制DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，该抑制DNA构建体包含至少一个调控序列(优选在植物中有功能的启动子)，该调控序列可操作地连接至以下序列的全部或部分：(i)编码多肽的核酸序列，在与SEQ ID NO：13、17、19或21比较时，基于Clustal V比对方法，所述多肽的氨基酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，或(ii)(a)(i)核酸序列的全长互补序列；(b)在步骤(a)之后从该可再生植物细胞再生转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体；(c)获得源自所述转基因植物的子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体；以及(e)评价该子代植物在与未包含该抑制DNA构建体的对照植物比较时改变的根构造。

一种评价植物根构造改变的方法，该方法包括：(a)将抑制DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，该抑制DNA构建体包含至少一个调控序列(优选在植物中有功能的启动子)，该调控序列可操作地连接至源自所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域，在与所述区域所来源的有义链或反义链的全部或部分比较时，基于Clustal V比对方法，所述区域的核酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码RT1或RT1样蛋白；(b)在步骤(a)之后从该可再生植物细胞再生转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体；(c)获得源自该转基因植物的子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体；以及(d)评价该子代植物在与未包含该重组DNA构建体的对照植物比较时改变的根构造。

一种评价植物农学特性改变的方法，该方法包括：(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一个调控序列(优选在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，在与SEQ ID NO：13、17、19、或21比较时，基于Clustal V比对方法，该多肽的氨基酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，(b)在步骤(a)之后从该可再生植物细胞再生转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及(c)确定该转基因植物在与未包含该重组DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。该方法还可以包括：(d)获得源自该转基因植物的子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含该重组DNA构建体；以及(e)确定该子代植物在与未包含该重组DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。

一种评价植物农学特性改变的方法，该方法包括：(a)将包含至少一个调控序列(优选在植物中有功能的启动子)的抑制DNA构建体引入到可再生的植物细胞，该调控序列可操作地连接至以下序列的全部或部分：(i)编码多肽的核酸序列，在与SEQ ID NO：13、16、17或19比较时，基于Clustal V比对方法，所述多肽的氨基酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，或(ii)所述(i)核酸序列的全长互补序列；(b)在步骤(a)之后从该可再生植物细胞再生转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体；以及(c)确定该转基因植物在与未包含该抑制DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。该方法可以另外包括：(d)获得源自该转基因植物的子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体；以及(e)确定该子代植物在与未包含该抑制DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。

一种评价植物农学特性改变的方法，该方法包括：(a)将抑制DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，该抑制DNA构建体包含至少一个调控序列(优选在植物中有功能的启动子)，该调控序列可操作地连接至源自所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域，在与所述区域所来源的有义链或反义链的全部或部分比较时，基于Clustal V比对方法，所述区域的核酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码RT1蛋白；(b)在步骤(a)之后从该可再生植物细胞再生转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体；以及(c)确定该转基因植物在与未包含该抑制DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。该方法可以另外包括：(d)获得源自该转基因植物的子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体；以及(e)确定该子代植物在与未包含该抑制DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。

一种评价植物农学特性改变的方法，该方法包括：(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，该重组DNA构建体包含可操作地连接至少一个调控序列(优选在植物中有功能的启动子)的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，在与SEQ ID NO：13、16、17、或19比较时，基于Clustal V比对方法，该多肽的氨基酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，(b)在步骤(a)之后从该可再生植物细胞再生转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；(c)获得源自所述转基因植物的子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含该重组DNA构建体；以及(d)确定该子代植物在与未包含该重组DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。

一种评价植物农学特性改变的方法，该方法包括：(a)将抑制DNA构建体引入到可再生的植物细胞包含至少一个调控序列(优选在植物中有功能的启动子)，该调控序列可操作地连接至以下序列的全部或部分：(i)编码多肽的核酸序列，在与SEQ ID NO：13、17、19或21比较时，基于Clustal V比对方法，所述多肽的氨基酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，或(ii)所述(i)核酸序列的全长互补序列；(b)在步骤(a)之后从该可再生植物细胞再生转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体；(c)获得源自所述转基因植物的子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体；以及(d)确定该子代植物在与未包含该重组DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。

一种评价植物农学特性改变的方法，该方法包括：(a)将抑制DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，该抑制DNA构建体包含至少一个调控序列(优选在植物中有功能的启动子)，该调控序列可操作地连接至源自所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域，在与所述区域所来源的有义链或反义链的全部或部分比较时，基于Clustal V比对方法，所述区域的核酸序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码RT1蛋白；(b)在步骤(a)之后从该可再生植物细胞再生转基因植物，其中该转基因植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体；(c)获得源自所述转基因植物的子代植物，其中该子代植物在其基因组中包含该抑制DNA构建体；以及(d)确定该子代植物在与未包含该抑制DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。

一种产生种子(优选可以作为提供改变的根构造的产品销售的种子)的方法，该方法包括任意上述的优选方法，并且还包括从所述子代植物获得种子，其中所述种子在它们的基因组中包含所述重组DNA构建体(或抑制DNA构建体)。

在任意上述的优选方法中，在所述引入步骤中，所述可再生的植物细胞优选包括愈伤组织(优选胚发生的愈伤组织)、配子细胞、分生细胞或未成熟胚的细胞。可再生的植物细胞优选来自自交系玉米植物。

在任意上述的优选方法或本发明方法的任意其他实施方案中，所述再生步骤优选包括：(i)在包含促进胚发生的激素的培养基中培育所述转化的植物细胞直至观察到愈伤组织；(ii)将所述步骤(i)的转化的植物细胞转移至包含促进组织机体形成的激素的第一培养基；以及(iii)在第二培养基上继代培养步骤(ii)后的所述转化的植物细胞，以允许嫩芽伸长、根发育或这两者同时发生。

将本发明的重组DNA构建体引入植物可以通过任何合适的技术来进行，这些技术包括但不限于引导DNA摄取、化学处理、电穿孔、微注射、细胞融合、感染、病毒介导的DNA转移、轰击或农杆菌介导的转化。

在任意上述的优选方法或本发明方法的任意其他实施方案中，至少一种农学特性优选选自由以下特性组成的组：绿度、产量、生长速率、生物量、成熟时的鲜重、成熟时的干重、果实产量、种子产量、总植物氮含量、果实氮含量、种子氮含量、营养组织中的氮含量、总植物游离氨基酸含量、果实游离氨基酸含量、种子游离氨基酸含量、营养组织中的游离氨基酸含量、总植物蛋白质含量、果实蛋白质含量、种子蛋白质含量、营养组织中的蛋白质含量、抗涝性、氮摄取、根倒伏、茎杆倒伏、植物高度、穗长以及收获指数；绿度、收产量、生物量、改善的根穿透、抗根倒伏性是用于改变的特别优选的农学特性(优选所述特性提高)。

在任意上述的优选方法或本发明方法的任意其他实施方案中，在与对照植物比较时，植物优选表现出至少一种与环境条件(如，水、营养物质的可利用性、昆虫或病害)无关的农学特性的改变。

优选的技术在下面实施例中示出。

用于转化双子叶植物(主要通过利用根瘤农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens))以及获得转基因植物的其他优选方法包括公开的用于棉花的那些(美国专利5,004,863、美国专利5,159,135、美国专利5,518,908)；用于大豆的那些(美国专利5,569,834、美国专利5,416,011、McCabe等人，Bio/Technology 6：923(1988)，Christou等人，Plant Physiol87：671674(1988))；用于芸苔属植物(Brassica)的那些(美国专利5,463,174)；用于花生的那些(Cheng等人，Plant Cell Rep.15：653657(1996)，McKently等人，Plant Cell Rep.14：699703(1995))；用于番木瓜的那些；以及用于豌豆的那些(Grant等人，Plant Cell Rep.15：254 258，(1995))。

用电穿孔、粒子轰击和农杆菌转化单子叶植物也已有报道并且作为优选的方法包括(例如)如在天门冬属(asparagus)中实现的转化和植物再生(Bytebier等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84：5354，(1987))；在大麦中实现的转化和植物再生(Wan和Lemaux，Plant Physiol.104：37(1994))；在玉米中实现的转化和植物再生(Rhodes等人，Science240：204(1988)；Gordon-Kamm等人，Plant Cell 2：603618(1990)；Fromm等人，Bio/Technology 8：833(1990)；Koziel等人，Bio/Technology11：194，(1993)；Armstrong等人，Crop Science 35：550-557(1995))；在燕麦中实现的转化和植物再生(Somers等人，Bio/Technology 10：1589(1992))；在鸭茅中实现的转化和植物再生(Horn等人，Plant Cell Rep.7：469(1988))；在水稻中实现的转化和植物再生(Toriyama等人，Theor.Appl.Genet.205：34，(1986)；Part等人，Plant Mol.Biol.32：1135 1148，(1996)；Abedinia等人，Aust.J.Plant Physiol.24：133141(1997)；Zhang和Wu，Theor.Appl.Genet.76：835(1988)；Zhang等人，Plant Cell Rep.7：379，(1988)；Battraw和Hall，Plant Sci.86：191 202(1992)；Christou等人，Bio/Technology 9：957(1991))；裸麦(De la Pena等人，Nature 325：274(1987))；在甘蔗中实现的转化和植物再生(Bower和Birch，Plant J.2：409(1992))；在高羊茅(tall fescue)中实现的转化和植物再生(Wang等人，Bio/Technology 10：691(1992))和在小麦中实现的转化和植物再生(Vasil等人，Bio/Technology 10：667(1992)；美国专利5,631,152)。

存在多种用于从植物组织再生植物的方法。再生的具体方法将取决于起始植物组织以及待再生的具体植物物种。

从单植物原生质体转化体或从多种经转化的外植体再生、发育和培育植物是本领域所熟知的(Weissbach和Weissbach(编辑)，载于：Methods for Plant Molecular Biology，Academic Press，Inc.San Diego，CA，(1988))。该再生和生长方法通常包括如下步骤：选择转化的细胞、培养这些单独化的细胞通过胚发育的通常阶段以及通过生根小植株阶段。转基因胚以及种子以类似的方式再生。随后将所得的转基因的生根小苗种植在诸如土壤之类的合适植物生长培养基中。

含有编码所关注蛋白质的外来的外源性分离核酸片段的植物的发育或再生是本领域所熟知的。优选地，将再生的植物进行自花授粉以产生纯合的转基因植物。或者，将得自再生植物的花粉与农学上重要的品系的产生种子的植株进行杂交。相反，将来自这些重要品系的植物用于给再生植物授粉。利用本领域技术人员所熟知的方法培育含有所需多肽的本发明的转基因植物。

实施例

本发明将在下面的实施例中进一步说明，其中份数和百分比是以重量计并且度数是摄氏度，除非另外说明。应该理解，尽管这些实施例说明了本发明的优选实施方案，但仅是以例证的方式给出的。根据上面的论述和这些实施例，本领域的技术人员能确定本发明的基本特征，并在不脱离本发明的精神和范围的情况下，能够对本发明做出多种改变和修饰，以使其适用于多种用法和条件。因此，除了那些本文所示和描述的那些之外，根据前文所述，本发明的各种修改形式对本领域的技术人员来说将是显而易见的。这些修改形式也旨在属于附加的权利要求书的范围内。

实施例1

rt1表型、根倒伏和根穿透的分析

rt1纯合体植物的表型是可变的，取决于生长条件。如图20a至c所示，田间生长的rt1植物具有非常强的根系损耗，并且显示显著的根倒伏表型，然而在温室或水栽条件下生长的植物仅显示中等的根构造改变。当rt1植物在温室中使用从田间收集的硬土生长时，它们仍然显示根系损耗(图20c)，指示rt1位点是冠状根穿透土壤和根与土壤交互作用必需的。rt1突变体不能穿透硬土。

抗根倒伏性可根据在多种田间条件下的机械扰动进行测量，如抗垂直根拉伸(Beck等人(1987)；Crop Sci.27：356-358)、抗机械推力(Kato等人(1999)Maydica 44，167-174)或由Fouere描述的便携式电子设计(Fouere等人(1995)，Agronomy J.87：1010-1024。

该设计由便携式电子装置组成，它测量每个植物的抗水平推力。该设备同时记录人造推力测试期间植物的倾斜角度和阻力扭矩。该装置由支撑件、力传感器、角度传感器、和控制头组成。通过使用基于微处理器的系统，可进行数据记录。使用RS232串行传送规程可将数据传送到计算机上。在田间条件下测试所需的时间为每株植物大约1分钟。从在三种田间环境中生长的14个玉米基因型中获取的初步结果显示易发生根倒伏的基因型特征在于它们的最大阻力扭矩的平均值较低。

例如通过比较RT1转基因植物和野生型植物在不同土壤类型中(例如耕作过的土壤对未耕作过的土壤)的出苗和/或植物生长可测量根穿透到土壤中的状况。未耕作过的土壤对根穿透具有更高抗性，因此减少出苗以及随后的植物生长。土壤类型可通过例如使用锥形透度计测量尖端阻力、套管摩擦力和/或孔隙水压力进行测量。可在植物生长的不同阶段进行测量，并记录RT1转基因品系和非转基因(野生型)品系之间的根穿透土壤的速率差异。

实施例2

基于作图的RT1的克隆

来源于MaizeGDB(Maize Genetics and Genomics Database)的遗传数据显示在玉米染色体3bin 04上的rt1突变体图谱。基于此信息我们从公共数据库中检索若干个SSR引物并将它们用于基因型88rt1植物，该植物来源于在原始rt1品系(未知发明背景，Jenkins M T，1930)和杂交品系B73之间的F2组合。对纯合rt1/rt1植物进行评分，评分根据当在田间生长30天或更长时间时的倒伏植物状况。用标准的分子生物学方法从这些植株提取DNA。发现公共的基于PCR的DNA SSR标记UMC1908(MaizeGDB)距离rt1位点1.7cM(在88个个体上的3个重组体)。

为了对rt1突变精细作图，利用分离rt1基因的两个作图群体和它们的对应玉米种子。第一个作图群体由1500种BC2S1植物组成，所述植物来源于rt1植物(来源于隔离rt1位点的上述F2群体)和自交品系B73(分离比率3∶1)间的自交。第二个作图群体由520种植物组成，所述植物来源于上述杂交与rt1植物、杂交亲本(分离比率1∶1)的回交。

为了获取递送重组体靠近rt1位点的植物，使用两个基于序列的DNA标记，它们来自已知图谱位置的杜邦专有序列。

引物MZA8757-F81(SEQ ID NO：1)和MZA8757-R593(SEQ ID NO：2)用于扩增和测序Mza8757标记位点，该位点递送在rt1亲本和B73亲本之间的SNP A/C。

引物MZA15417-F132(SEQ ID NO：3)和MZA15417-R607(SEQ IDNO：4)用于扩增和测序Mza 5417标记位点，该位点递送在rt1亲本和B73亲本之间的SNP A/G。两个标记位于名为306(杜邦Genomix数据库)的物理BAC重叠群上。

仅仅保留并自交了62种显示在两个侧接标记间的存在杂交事件(在一个标记处为纯合体，在另一个标记处为杂合体)的植物。为了确认rt1基因相对于侧接标记的位置，随后筛选那些植物的子代的表型。

使用可用的物理定位的MZA序列和BAC的BAC末端序列设计新CAPS(Cleaved Amplified Polymorphic Site)标记，该BAC构建围绕有标记Mza 15417(左侧)和Mza 8757(右侧)的重叠群306区域。

将CAPS引物用于包含25ng DNA的PCR反应中。使用QiagenHotStart混合物和25ng DNA在25ul PCR反应物中进行CAPS标记扩增。热循环条件是：在95℃下15分钟(1个循环)，在94℃下45秒，在56℃下45秒，在72℃下45秒(35个循环)，在72℃下7分钟。

将3ul扩增产物用于使用合适限制性酶的限制消化(总体积15ul)。在合适温度下进行限制反应一小时。限制性扩增产物在3％琼脂糖凝胶上进行检查。

基于克隆BAC b0541.c13的BAC末端序列设计CAPS标记b0541(b0541正向引物，SEQ ID NO：5，和b0541反向引物，SEQ ID NO：6)。该引物对扩增250bp的区域，该区域经6-切割酶EcoRI限制酶切后在B73和rt1之间显示多形性。

CAPS标记b0461(b0461正向引物，SEQ ID NO：7，和b0461反向引物，SEQ ID NO：8)：基于克隆BAC b0461.g10的BAC末端序列进行设计。该引物对扩增约350bp的区域，该区域经6-切割酶NcoI限制酶切后在B73和rt1之间显示多形性。

通过筛选62个之前获取的具有CAPS b0541的重组体，仅仅发现了3个重组发生点，然而使用CAPS b0461，2个重组体在另一侧被发现。

BAC b0541.c13和BAC b0461.g10以及具有可用的指纹识别数据的公共BAC克隆显示有重叠。

实施例3

RT1基因的鉴定

为了鉴定定位于包含两个重叠BAC克隆的区域中的RT1基因，对BAC b0541.c13进行测序。用高压氮气喷吹BAC DNA，如Roe等人，1996(Roe等人，1996，“DNA isolation and Sequencing”John Wiley andSons，New York)中所描述的。

搜索所评估的165Kb的BAC b0541.c13序列是否存在开放阅读框，并且鉴定显示与基于由FGENESH(Softberry，Inc.Mount Kisco，NY，USA)执行的预测模型的基因相似的4个区域。

具体地讲，考虑对一个显示与“推定乙烯响应蛋白”同源的候选基因进行进一步评估。来源于BAC b0541.c13(B73基因型)的基因序列显示为SEQ ID NO：9(RT1乙烯响应基因7800bp)，并且在图1中，从来自B73品系和rt1品系的发育玉米根中提取总RNA，使用获取自LifeTechnologies Inc.，Rockville，MD，20849(GIBCO-BRL)的

试剂，它包含苯酚和硫氰酸胍。用cDNA进行RT-PCR，cDNA用Superscript III(Invitrogen，Carlsbad，CA)逆转录酶从1μg DNase处理的总RNA中合成。PCR在Perkin Elmer 9700热循环仪中进行，使用GC-2Advantage试剂盒(BD Biosciences)，PCR程序为：94℃3分钟，接下来的27个循环为：94℃30秒，58℃30秒，68℃1分钟，最终步骤为68℃3分钟。在PCR反应中使用基于图1中所述的基因组序列，SEQ ID NO：9，设计的引物，它们分别对RT1(RT1 3006F(SEQ ID NO：10)和RT17631R(SEQ ID NO：11)的5’和3’末端是特异性的。仅有B73野生型品系生成PCR产品，这指示rt1品系缺失RT1mRNA，证实缺失RT1转录物是形成rt1表型的原因。将PCR产物克隆进

II-

nt载体(Invitrogen^TM)中并测序以确认身份。RT1的B73cDNA在SEQ IDNO：12中示出。由SEQ ID NO：12的核苷酸50至1382(终止密码子)编码的RT1氨基酸序列在SEQ ID NO：13中示出。

实施例4

克隆RT1 cDNA

总RNA可使用

试剂从发育玉米中提取，该试剂得自LifeTechnologies Inc.，Rockville，MD，20849(GIBCO-BRL)，包含苯酚和硫氰酸胍。用mRNA纯化试剂盒从总RNA纯化出多聚腺苷酸mRNA，该mRNA纯化试剂盒得自Amersham Pharmacia Biotech Inc，Piscataway，NJ，08855，其由寡脱氧胸苷酸纤维素离心柱构成。为了制备cDNA文库，将5.5ug polyA RNA用于cDNA合成试剂盒，该试剂盒获取自Stratagene，La Jolla，CA，92037。

逆转录酶可获取自LifeTechnologies Inc.，Rockville，MD，20849(GIBCO-BRL)。BRL cDNASize Fraction Columns(GIBCO-BRL)可用于按大小分离cDNA，所得片段可进行沉淀、重悬并与1ug Uni-ZAP XR载体连接。在连接后，可将它包装到Gigapack III

包装提取物中，该提取物得自Stratagene，La Jolla，CA，92037。可估计未扩增的文库滴度。可使用合适的量用于扩增目的以制备扩增cDNA。

按照本领域的技术人员熟知的标准规程筛选RT1 cDNA(Ausubel等人，1993，“Current Protocols in Molecular Biology”John Wiley & Sons，USA，或Sambrook等人，1989.Molecular Cloning：A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press)。简而言之，可将1.5X 10⁶个噬菌体克隆铺板，然后转移到尼龙膜上，然后将其用放射性标记的RT1探针进行杂交。分离阳性克隆，并用RT1特异性引物通过PCR检查它们的特性是否和RT1 cDNA相同。分离提供PCR反应阳性结果的最长cDNA克隆并进行测序。

实施例5

乙烯诱导RT1基因

经由PLACE数据库(Higo等人，(1999)Nucleic Acids Res.27，297-300)进行的RT1基因启动子分析揭示了两个ERELEE4乙烯响应元件(TTTGAATTT和TTTGAAAT)存在。为了确定是否RT1基因受乙烯处理诱导，B73幼苗在纸卷中生长11天，光室中湿度60％，温度28℃，光周期为16h光照，8h黑暗，然后将其转移到1.5×10-4M乙烯利溶液中(Sigma Aldrich)。对照植物在蒸馏水中生长。在暴露于乙烯以后0、1、2.5和4小时时从初生根中分离RNA，并且在相同时间点从对照植物中也分离RNA。用RT1特异性寡核苷酸引物(4405F，SEQ ID NO：14，和etr4Rnew，SEQ ID NO：15)进行PCR反应。组蛋白2A(GenebankAAB04687)用作对照物。图2显示RT1基因在处理2.5小时时的诱导。

实施例6

RT1基因的基因确定

编码用于改变根构造的RT1分离核酸片段的基因确定可通过用分离RT1克隆序列转化rt1突变体完成。

来自其它谷类的RT1同源物也能在此体系中进行测试，测试通过获取全长基因序列、连接到合适的启动子如RT1启动子并与玉米rt1突变体互补。

为了确定RT1基因可能的组织特异表达，可通过RNA印迹分析和原位杂交分析不同组织中是否存在RT1转录物。

本领域的技术人员可用的一种转化DNA进入高等植物细胞的方法是高速弹道轰击，该方法使用涂覆有所关注的核酸构建体的金属粒子(参见Klein等人，Nature(1987)(London)327：70-73，以及参见美国专利公开4,945,050)。一种Biolistic PDS-1000/He(BioRADLaboratories，Hercules，CA)可用于这些互补实验。可将粒子轰击技术用于转化RT1突变体，转化使用编码功能性RT1蛋白的克隆RT1野生型序列[SEQ ID NO：12的核苷酸50至1382(终止)]。

来自吸水链霉菌的细菌潮霉素B磷酸转移酶(Hpt II)基因可用作玉米转化的选择性标记，该基因赋予对抗生素潮霉素的抗性。在载体pML18中，Hpt II基因能与来自花椰菜花叶病毒的35S启动子和来自根癌土壤杆菌的章鱼碱合酶基因的终止和聚腺苷酸化信号进行工程化处理。pML18在WO 97/47731中描述，它公布于1997年12月18日，其公开内容以引用方式并入本文。

衍生的玉米胚性愈伤组织培养物就转化实验而言起到源极材料的作用。该材料能通过无菌玉米种子发芽生成，种子在愈伤组织诱导培养基(MS salts，Nitsch和Nitsch维生素，1.0mg/l，2，4-D和10μM AgNO₃)中，在暗处、27-28℃条件下培养。然后将从胚芽盾片中增生的胚性愈伤组织转移到CM培养基中(N6salts，Nitsch和Nitsch维生素，1mg/l，2，4-D，Chu等人，1985，Sci.Sinica 18：659-668)。愈伤组织培养物通过每两周的常规传代培养在CM上维持，在诱导10周内用于转化。

可制备愈伤组织用于转化，所述制备通过传代培养0.5-1.0mm切片，每片距离大约1mm，排列于直径约4cm的圆形区域中，在圆形区域的中心将Whatman#541滤纸置于CM培养基上。带愈伤组织的平板在暗处，27-28℃下培养3-5天。在轰击前，将带愈伤组织的过滤器转移到补充了0.25M甘露糖醇和0.25M山梨醇的CM中，暗处培养3小时。然后在无菌纱布中将培养皿盖子保持微开状态20-45分钟以去除组织上的水分。

每个基因组DNA片段与pML 18共沉淀，它包含用于玉米转化到金颗粒表面上的选择性标记。为了完成此步骤，将总计10μg DNA，以2∶1的特定DNA：选择性标记DNA比率加入到50mL金颗粒的等分试样中，使其浓度为以60μg mL^-1的浓度重悬金颗粒。然后将氯化钙(50μL的2.5M溶液)和亚精胺(20μL的0.1M溶液)加入到金-DNA悬浮液中，将管涡旋3分钟。金颗粒在微量离心机中离心1秒钟，移除上清液。然后用1mL纯乙醇洗涤两次，随后重悬于50mL纯乙醇中并超声处理(水浴式超声波破碎仪)一秒钟以分散金颗粒。将金悬浮液在-70℃培养五分钟，如需要的话进行超声处理(水浴式超声波破碎仪)以分散颗粒。然后将六mL涂覆有DNA的金颗粒加到聚酯薄膜大载体盘上并使得乙醇蒸发。

在干燥末期，将包含组织的培养皿置于PDS-1000/He腔室中。然后将该腔室中的空气抽出至28-29英寸汞柱的真空。利用在击波管中氦气压力达到1080-1100psi时破裂的可破裂膜，宏载体被氦气冲击波加速。将组织置于距离停止筛网大约8cm处，将所述愈伤组织轰击两次。这样二至四个平板的组织用涂覆有DNA的金颗粒轰击。在轰击后，将愈伤组织转移到未补充山梨醇和甘露糖醇的CM培养基中。

在轰击后3-5天内，将愈伤组织转移至SM培养基(包含50mg/l潮霉素的CM培养基)。为了完成此步骤，将愈伤组织从板中转移到无菌50mL圆锥管中并称重。加入40℃的熔化顶层琼脂，使用2.5mL顶层琼脂/100mg愈伤组织。将愈伤组织块破碎成直径小于2mm的碎片，这通过重复分配通过10mL吸移管。将3mL愈伤组织悬浮液的等分试样铺板于新制SM培养基上，并将板在27-28℃暗培养4周。在4周后，鉴定转基因愈伤组织事件，并将其转移到新制SM板上，在27-28℃条件下暗处另外培养2周。

然后将生长的愈伤组织转移到RM1培养基(MS盐，Nitsch和Nitsch维生素，2％蔗糖，3％山梨醇，0.4％固化剂(gelrite)+50ppm hyg B)，在25℃下暗培养2周。在2周后，将愈伤组织转移到RM2培养基(MS盐，Nitsch和Nitsch维生素，3％蔗糖，0.4％固化剂(gelrite)+50ppmhyg B)并置于冷白光下(～40μEm^-2s^-1)，光周期为12小时，温度为25℃，湿度为30-40％。在光下培养2-4周后，愈伤组织开始形成有机体并出苗。将苗从围绕的愈伤组织/培养基中移除并轻轻转移到RM3培养基(1/2×MS盐，Nitsch和Nitsch维生素，1％蔗糖+50ppm潮霉素B)，phytatray中(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)，可使用如上述步骤所述相同条件继续培养。

在2-3周后，当植物已经长出足够的根和苗后，可将植物从RM3转移到包含Metro mix 350的4″罐中。可检查从转基因植物中获取的种子用于RT1突变与包含RT1基因的野生型基因组DNA的遗传互补。

实施例7

表征编码RT1同源物的cDNA克隆

使用来自表1中列出的克隆的EST序列进行的BLASTX搜索揭示由ORF编码的多肽与来自大米和拟南芥的蛋白的相似性。编码来自大米的最接近多肽RT1同源物的核苷酸序列在SEQ ID NO：16中示出，并且对应的氨基酸序列在NCBI General Identifier No：115434026，SEQ IDNO：17)中示出。编码来自拟南芥的最接近多肽RT1同源物的核苷酸序列在SEQ ID NO：18中示出，并且对应的氨基酸序列在NCBI GeneralIdentifier No：15217667，SEQ ID NO：19)中示出。来自大米和拟南芥的蛋白可分别定位于Os01g01600(TIGR)和Atlg27660(TAIR)。

表1和表2中所示的分别为单独的EST(“EST”)的文献和专利BLAST结果、包含标明的cDNA克隆的整个cDNA插入物的序列(“FIS”)，由两个或更多个EST装配而成的重叠群序列(“Contig”)，由FIS和一个或更多个EST装配而成的重叠群序列(“Contig^*”)，或编码源自FIS、重叠群或FIS和PCR的整个蛋白质的序列(“CGS”)。也示出了编码RT1及其同源物的序列的百分比同一性。

表1

BLAST结果(文献)和编码RT1及其同源物的序列的百分比同一性。

使用玉米RT1序列(SEQ ID NO：12)进行的BLASTX搜索揭示了它与来自水稻(GI No.115434026，SEQ ID NO：17)和拟南芥(GI No.15217667 SEQ ID NO：19)的RT1同源多肽的相似性，表1和2中示出的是单个EST(“EST”)、包含标明的cDNA克隆(“FIS”)的整个cDNA插入序列的序列、由两个或更多个EST装配的重叠群序列、FIS或PCR序列(“重叠群”)、或编码来源于FIS或重叠群(“CGS”)的完整或功能性蛋白的序列的BLAST结果：

表3

编码RT1同源多肽的序列的BLAST结果(专利)。

用LASERGENE生物信息计算包(DNASTAR Inc.，Madison，WI)的Megalign程序进行序列比对和百分比同一性计算。用带默认参数(空位罚分＝10，空位长度罚分＝10)的Clustal比对方法(Higgins和Sharp，1989，CABIOS.5：151-153)进行序列的多重比对。使用Clustal方法的成对比对的默认参数为KTUPLE 1，空位罚分＝3，窗口＝5，DIAGONALSSAVED＝5。

在杜邦专有数据库中存在另外一种玉米RT1同源物。玉米克隆cfp7n.pk6.i3(SEQ ID NO：20编码RT1样蛋白(SEQ ID NO：21)，该蛋白基于Clustal比对方法具有与B73RT1蛋白(SEQ ID NO：13)47.2％的同一性。玉米RT1蛋白和大米、拟南芥以及来自克隆cfp7n.pk6.i的氨基酸序列(SEQ ID NO：13；17、19、和21)的玉米同源物的比对在图3A至3B中示出。在所有四个序列中两个序列基序(基序I，SEQ ID NO：22，和基序II，SEQ ID NO：23进行比对)是高度保守的，并且在比对中用下划线标出。

实施例8

拟南芥RT1样基因的敲除分析

为了限定拟南芥中RT1基因的功能，可从Salk Institute GenomeAnalysis Laboratory(SIGnAL)数据库中检索在Atlg27660位点(参见实施例7)中包含T-DNA插入序列的若干敲除品系。具体地讲，可检索并种植来自两个品系Salk 102156和Salk 001968的种子，所述品系分离在所述基因的第二个内含子中存在的T-DNA插入序列。可使用侧接T-DNA插入序列的引物，按照数据库提供的说明确定幼苗基因型，并且可使用软件

(Regent Instruments Inc)确定在纯合体状态包含T-DNA插入序列的植物根的基因型。

是一种图像分析系统，特定设计用于根测量，它在像素中使用对照以从较暗背景中辨别较亮的根(也参见实施例21)。

实施例9

制备含有RT1基因或其同源物的植物表达载体

可以使用诸如BLAST(基本的局部比对搜索工具(Basic LocalAlignment Search Tool)；Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403-410，1993；也参见美国国家卫生研究院(National Institutes of Health)国立医学图书馆(National Library of Medicine)的国家生物技术信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information)的万维网网址上对BLAST算法的解释)之类的序列比较算法，鉴定与RT1基因同源的序列。RT1基因(SEQID NO：12)或RT1样基因(例如SEQ ID NO：20中所公开的基因)可以通过如下方法中的任一种来进行PCR扩增。

方法1(基于RNA的方法)：基于RT1(从SEQ ID NO：12的核苷酸50延伸至1382)或RT1同源物(例如从SEQ ID NO：20的核苷酸83延伸至1540的序列)的蛋白编码区的5’和3’序列信息，可设计基因特异性引物。可以将RT-PCR用于植物RNA来获得含有RUM 1蛋白编码区的核酸片段，该RT1蛋白编码区旁侧为attB1(SEQ ID NO：24)和attB2(SEQ ID NO：25)序列。引物可以含有起始密码子上游的共有Kozak序列(CAACA)。

方法2(基于DNA的方法)：作为另外一种选择，可PCR扩增编码RT1(SEQ ID NO：12或多肽同源物(如SEQ ID NO：20编码的RT1同源物)的克隆的完整cDNA插入序列(包含5’和3’非编码区)。可以设计正向引物和反向引物，使它们分别或者含有attB1序列和在该cDNA插入序列前面的载体特异性序列或者含有attB2序列和在该cDNA插入序列后面的载体特异性序列。对于克隆进载体pBluescript SK+中的cDNA插入序列，可以使用正向引物VC062(SEQ ID NO：26)和反向引物VC063(SEQ ID NO：27)。

方法1和方法2可以根据本领域技术人员已知的步骤进行修改。例如，方法1的引物可以含有限制性酶切位点而不是attB1和attB2位点，用于后来将PCR产物克隆进含有attB1和attB2位点的载体内。另外，方法2可以涉及从cDNA克隆、λ克隆、BAC克隆或基因组DNA扩增。

可以利用BP重组反应将通过任一种上述方法获得的PCR产物与

供体载体(例如pDONR^TM/Zeo(Invitrogen^TM，图5；SEQ ID NO：28)或pDONR^TM221(Invitrogen^TM，图6；SEQ ID NO：29)组合。这种方法将细菌致死ccdB基因以及氯霉素抗性基因(CAM)从该供体载体移除并定向地克隆了该在旁侧具有attB1和attB2位点的PCR产物而得到入门克隆(entry clone)。利用InvitrogenClonase^TM技术，可随后将该入门克隆的RT1或RT1样基因转移至合适的目的载体以获得用于大豆和玉米的植物表达载体，例如分别是PHP27840(图7；SEQID NO：30)或PHP23236(图8；SEQ ID NO：31)。

作为另外一种选择，可以进行多个入门克隆和合适的目的载体之间的MultiSite

LR重组反应以产生表达载体。这类反应的一个例子在实施例14中有所描述，该实施例描述了用于转化玉米品系的玉米表达载体的构建。

实施例10

制备大豆表达载体并用RT1或其同源物转化大豆

为了检查所得表型，可转化大豆植物以过表达RT1和其同源物，例如SEQ ID NO：20中示出的RT1样基因。

可以将实施例9中所述的入门克隆用于将每个基因定向克隆进PHP27840载体(图7，SEQ ID NO：30)中，使得该基因的表达处于SCP1启动子的控制下。

然后可以用包含编码本多肽的序列的表达载体转化大豆胚。

为了诱导体细胞胚，可以将子叶(长度为3-5mm，从大豆品种A2872的表面灭菌的未成熟种子解剖出来)于26℃在光下或黑暗下培养6-10周。然后切取体细胞胚(其产生次生胚)并将其置于合适的液体培养基内。在重复选择增殖为早期球形阶段胚的体细胞胚的簇后，按下面的描述保持该悬浮液。

可以将大豆胚发生悬浮培养物在26℃下在摇床(150rpm)上的35mL液体培养基中保持，荧光光照采用16∶8小时(白天/黑夜)的时间表。通过将大约35mg组织移植进35mL液体培养基中，每两周将培养物进行继代培养。

然后可以通过基因枪轰击方法(Klein等人，Nature(London)327：70-73，1987；美国专利4,945,050)转化大豆胚发生悬浮培养物。杜邦公司的Biolistic^TMPDS1000/HE仪器(氦气改进型)可以用于这些转化。

可用于帮助大豆转化的可选标记基因是由来自花椰菜花叶病毒的35S启动子(Odell等人，Nature 313：810-812，1985)、来自质粒pJR225(来自大肠杆菌；Gritz等人，Gene 25：179-188，1983)的潮霉素磷酸转移酶基因以及胭脂碱合成酶基因的3′区构成的嵌合基因，该胭脂碱合成酶基因来自根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)Ti质粒的T-DNA。可用于帮助大豆转化的另一种可选标记基因是来自大豆或拟南芥属的除草剂抗性乙酰乳酸合成酶(ALS)基因。ALS是支链氨基酸缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成中的第一共用酶。已经鉴定出ALS中的突变导致对三类ALS抑制剂中的某些或全部具有抗性(美国专利5,013,659；藉此将其全部内容以引用的方式并入本文)。除草剂抗性ALS基因的表达可以处于SAM合成酶启动子(美国专利申请No.US-2003-0226166-A1；藉此将其全部内容以引用的方式并入本文)的控制下。

将如下物质(依次)加入50μL 60mg/mL的1μm金颗粒悬浮液：5μLDNA(1μg/μL)、20μL亚精胺(0.1M)和50μL CaCl₂(2.5M)。然后搅拌该颗粒制备物三分钟，在微量离心机(microfuge)中离心10秒并移除上清液。然后将DNA包覆的颗粒在400μL 70％乙醇中洗涤一次并再悬浮于40μL无水乙醇中。可以将DNA/颗粒悬浮液用超声波处理三次，每次一秒钟。然后将5μL该DNA-包覆的金颗粒装载至每个宏载体盘上。

将大约300-400mg两周大的悬浮培养物置于60×15mm的空培养皿中并用吸管将残留的液体从组织移除。对于每次转化实验，大约5-10板的组织受到正常轰击。膜破裂压力设定为1100psi并将腔室抽成28英寸汞柱的真空。将组织置于离阻挡网大约35英寸的地方并轰击三次。轰击后，可以将组织分成两份并放回液体培养基中，如上所述进行培养。

轰击后五至七天，用新鲜培养基更换该液体培养基，并在轰击后七至十二天，用含有50mg/mL潮霉素的新鲜培养基更换。可以每周更换这种选择培养基。轰击后七至八周，可以观察到绿色的转化组织从未转化的坏死的胚发生簇长出来。移出分离的绿色组织并将其移植进单独的烧瓶中以产生新的、无性繁殖的、转化的胚发生悬浮培养物。可以将每一新品系当成是独立的转化事件。然后可以将这些悬浮培养物作为未成熟胚进行继代培养和维持，或者通过使单独体细胞胚成熟并萌发而再生成整株植株。

可以通过在土壤中栽培植株并在分析总根量前洗涤根来测量大豆增强的根构造，该测量使用

(Regent Instruments Inc)软件，该软件是专门设计用于根测量的图像分析系统。利用像素对照来从较暗的背景辨别出根构造。

然后可以分析用RT1基因转化的大豆植株以研究相对于对照或参照植株的农学特性，例如，在多种环境条件(如氮限制条件、干旱等)下的氮利用效率、产量增强和/或稳定性。

实施例11

用RT1基因和其同源物使用粒子轰击转化玉米

可以转化玉米植株以过表达RT1和RT1样基因，以便检验所得的表型。

可以将实施例9中所述的

入门克隆用于将每种基因定向克隆进玉米转化载体中。玉米基因的表达可以处于组成型启动子的控制下，例如玉米泛素启动子(Christensen等人，Plant Mol.Biol.12：619-632，1989，以及Christensen等人，Plant Mol.Biol.18：675-689，1992)。

然后可以通过下面的方法将上述重组DNA构建体引入玉米细胞中。可以从源于自交玉米系H99和LH132杂交的发育中的颖果切取未成熟的玉米胚。在授粉后10至11天分离胚，这时它们长为1.0至1.5mm。然后将胚以轴线侧朝下放置并与琼脂糖硬化的N6培养基(Chu等人，Sci.Sin.Peking 18：659-668，1975)接触。将胚在27℃下保持在黑暗中。从这些未成熟胚的胚鳞增生出易脆的胚发生愈伤组织，该愈伤组织由未分化的细胞块构成，在胚柄结构上长有体细胞原胚状体和胚状体。可以将从该原外植体分离的胚发生愈伤组织在N6培养基上培养，并每两至三周在这种培养基上进行继代培养。

可以将质粒p35S/Ac(得自Peter Eckes博士，Hoechst Ag，Frankfurt，Germany)用于转化实验以变提供可选标记。该质粒含有pat基因(见欧洲专利公布0242236)，该基因编码膦丝菌素乙酰转移酶(PAT)。酶PAT赋予对除莠谷氨酰胺合成酶的抑制剂(膦丝菌素)的抗性。p35S/Ac的pat基因处于来自花椰菜花叶病毒的35S启动子(Odell等人，Nature 313：810-812(1985))和胭脂碱合成酶基因的3′区的控制下，该胭脂碱合成酶基因来自根瘤农杆菌Ti质粒的T-DNA。

可以将基因枪方法(Klein等人，Nature 327：70-73(1987))用于将基因转移至愈伤组织培养细胞。根据该方法，利用下面的技术用DNA包覆金颗粒(直径1μm)。将10μg质粒DNA加至50μL金颗粒悬浮液(每mL 60mg)中。将氯化钙(50μL的2.5M溶液)和亚精胺游离碱(20μL的1.0M溶液)加至该颗粒。再加入这些溶液过程中涡旋该悬浮液。10分钟后，将试管粗略地离心(以15,000rpm进行5秒钟)并移除上清液。将该颗粒再悬浮于200μL的无水乙醇中，再次离心并移除上清液。再次进行乙醇冲洗并将颗粒再悬浮于终体积为30μL的乙醇中。可以将DNA包覆的金颗粒等分试样(5μL)置于Kapton^TM飞行圆盘(Bio-Rad Labs)的中心。然后使用PDS-1000/He(Bio-RadInstruments，Hercules CA)，采用1000psi的氦气压、0.5cm的间隙距离以及1.0cm的飞行距离，将颗粒加速射入玉米组织中。

对于轰击，将胚发生组织置于琼脂糖硬化的N6培养基上的滤纸上。组织布置成薄薄一层，并覆盖直径为约5cm的圆形区域。然后可以将包含组织的培养皿置于离阻挡网大约8cm的PDS-1000/He的腔室内。然后将该腔室中的空气抽出至28英寸汞柱的真空。利用在击波管中氦气压力达到1000psi时破裂的可破裂膜，宏载体被氦气冲击波加速。

轰击后七天，可以将组织转移至N6培养基中，该培养基含有双丙氨膦(每升5mg)并缺少酪蛋白或脯氨酸。组织继续在这种培养基上缓慢生长。另外两周后，可以将组织转移至含有bialophos的新鲜N6培养基上。六周后，在某些装有补充了双丙氨膦的培养基的盘上，可以辨别直径约1cm的区域上有活性生长的愈伤组织。当在选择培养基上继代培养时，这些愈伤组织可以继续生长。

通过首先将组织簇转移到补充有0.2mg每升的2，4-D的N6培养基中，可以从该转基因愈伤组织再生出植物。两周后，可将组织转移至再生培养基中(Fromm等人，Bio/Technology 8：833-839(1990))。

可以再生出转基因的T0植株并按照下面的HTP步骤确定它们的表型。可以收集T1种子。

可以栽培T1植株并分析表型变化。利用图像分析可以定量下面的参数：可以收集并定量植株面积、体积、生长速率以及颜色分析。导致与合适的对照植物比较时根构造改变的表达载体可以被认为是RT1基因在玉米中发挥功能而改变根构造的证据。

此外，可以将含有RT1基因的重组DNA构建体引入玉米品系中，该引入或者是通过直接转化或者是通过从独立转化的品系基因渗入而来。

可以对转基因植株(或者是自交的或者是杂交的)进行更有力的基于田间的实验来研究在多种环境和土壤条件下(如营养物质的改变和水的可利用性)的产量提高、改善的根穿透和/或抗根倒伏性。

还可以进行后续的产量分析以确定含有RT1基因的植株在与未包含RT1基因的对照(或参照)植株比较时是否具有产量表现的改善。在各种环境条件下，含有RT1基因的植株相对于对照植株将具有较少的产量损失，优选少于50％的产量损失，或相对于对照植株将具有增加的产量。

实施例12

农杆菌LBA4404的电穿孔

将电穿孔感受态细胞(40μL)，例如根瘤农杆菌LBA4404(含有PHP10523，图9，SEQ ID NO：32)在冰上解冻(20至30分钟)。PHP10523含有用于T-DNA转移的VIR基因、农杆菌属的低拷贝数质粒复制起始区、四环素抗性基因以及用于体内DNA生物分子重组的cos位点。同时，将电穿孔管(electroporation cuvette)在冰上冷却。将该电穿孔仪的设置调节至2.1kV。

将DNA等分试样(0.5μL JT(US 7,087,812)亲代DNA，在低盐缓冲液或双蒸H₂O中的浓度为0.2μg至1.0μg)与解冻的农杆菌细胞混合，同时仍然保持在冰上。将该混合物转移至电穿孔管的底部并静止保持在冰上1至2分钟。通过按下“pulse(脉冲)”键两次(理想的是获得4.0毫秒的脉冲)对细胞进行电穿孔(Eppendorf电穿孔仪2510)。随后，将0.5mL 2xYT培养基(或SOCmedium)加至电穿孔管并转移至15mLFalcon管中。将细胞在28至30℃、200至250rpm下孵育3小时。

将250μL的等分试样散布在#30B(YM+50μg/mL奇放线菌素)板上并在28至30℃下孵育3天。为了增加转化体的数目，可以进行如下两个可选步骤中的其中一个：

选择1：用30μL 15mg/mL的利福平覆盖平板。LBA4404具有针对利福平的染色体抗性基因。这种附加的选择消除了在使用较差的LBA4404感受态细胞制备物时观察到的一些污染克隆。

选择2：进行两次重复的电穿孔以补偿较差的电感受态细胞。

转化体的鉴定：

选取四个独立的克隆并划痕接种在AB基本培养基+50mg/mL奇放线菌素的平板(#12S培养基)上用于分离单个克隆。将平板在28℃下孵育2至3天。

对于每个推定的共整合体选取单个克隆并将其与4mL具有50mg/l的奇放线菌素的#60A孵育。将该混合物在28℃下摇动孵育24小时。采用Qiagen Miniprep+可选的PB洗涤，从4mL培养物分离出质粒DNA。DNA在30μL中洗提。将2μl等分试样用于如上所述电穿孔20μL DH10b+20μl ddH₂O。

可任选地，可将15μL等分试样用于转化75至100μL的InvitrogenLibrary Efficiency DH5α。将细胞散布在LB培养基+50mg/mL奇放线菌素的平板(#34T培养基)上并将其在37℃下孵育过夜。

对于每个推定的共整合体选取3至4个独立的克隆并将其接种在4mL具有50μg/mL奇放线菌素的2xYT(#60A)上。将细胞在37℃下摇晃培养过夜。

用Miniprep从4mL培养物分离质粒DNA，任选进行PB洗涤(在50μl中洗提)。将8μL用于用SalI消化(使用JT亲代DNA和PHP10523作为对照)。

对于4个质粒利用限制性内切酶BamHI、EcoRI和HindIII再进行三次消化(使用亲代DNA和PHP10523作为对照)，这4个质粒代表2种具有正确SalI消化模式的推定共整合体。推荐电凝胶(Electronic gel)用于比较。

作为另一种选择，对于高通量应用，例如针对Gaspe Bay Flint衍生的玉米品系(实施例16至18)所描述的，代替通过限制性酶切分析来评价所得的共整合载体，可将三个克隆同时用于感染步骤。

实施例13

农杆菌属细菌介导的玉米的转化

农杆菌属细菌介导的玉米转化基本上按照Zhao等人，Meth.Mol.Biol.318：315-323(2006)中描述的方法进行(还可参见Zhao等人，Mol.Breed.8：323-333(2001)和1999年11月9日公布的美国专利5,981,840，以引用的方式将该文献并入本文)。该转化过程涉及细菌接种、共孵育、静止期、选择以及植株再生。

1.未成熟胚的制备

从颖果切取未成熟胚并置于装有2mL PHI-A培养基的2mL微型管中。

2.胚的农杆菌属细菌感染以及共培养

2.1感染步骤

用1mL微量吸移管移除PHI-A培养基并加入1mL农杆菌属细菌悬浮液。轻轻倒置该管进行混合。将该混合物在室温下孵育5分钟。

2.2共培养步骤

用1mL微吸移管将农杆菌属细菌悬浮液从感染步骤中移出。使用无菌刮刀将胚从管中刮出并转移到100×15mm培养皿中的PHI-B培养基的平板中。确定胚的朝向，使得胚轴在培养基表面上朝下。将具有胚的平板在20℃下于黑暗中培养3天。L-半胱氨酸可用于共培养阶段。采用标准二元载体，补充有100-400mg/L L-半胱氨酸的共培养培养基对于回收稳定的转基因事件是至关重要的。

3.推定的转基因事件的选择

向100×15mm培养皿中的PHI-D培养基的每平板中转移10个胚，保持朝向，并用parafilm将培养皿密封。将平板在28℃下于黑暗中孵育。预计在6-8周将看见活性生长的推定事件(作为浅黄色胚组织)。不产生事件的胚可能是棕色和坏死的，并且几乎没有看见脆性组织生长。以2至3周的间隔(取决于生长速率)将推定的转基因胚组织转移到新鲜的PHI-D平板上进行继代培养。记录事件。

4.T0植株的再生

将在PHI-D培养基上增殖的胚组织转移至100×25mm培养皿中的PHI-E培养基(体细胞胚成熟培养基)进行继代培养并在28℃下，在黑暗中孵育约10至18天，直至体细胞胚成熟。将具有良好限定的盾片和胚芽鞘的个体成熟体细胞胚芽转移到PHI-F胚芽发芽培养基中，并且在28℃于光中(约80μE，来自冷光灯或同等荧光灯)培养。在7至10天，将约10cm高的再生植株盆载于园艺混合物中，并使用标准园艺方法使其受冷而变得耐寒。

用于植物转化的培养基

1.PHI-A：4g/L的CHU基础盐、1.0mL/L的1000×Eriksson维生素混合物、0.5mg/L的盐酸硫胺素、1.5mg/L的2，4-D、0.69g/L的L-脯氨酸、68.5g/L的蔗糖、36g/L的葡萄糖，pH为5.2。在使用前加入100μM的乙酰丁香酮，过滤灭菌。

2.PHI-B：无葡萄糖的PHI-A，2，4-D增加至2mg/L，蔗糖减少至30g/L并且补充有0.85mg/L的硝酸银(过滤灭菌)，3.0g/L的固化剂(gelrite)，100μM的乙酰丁香酮(过滤灭菌)，pH为5.8。

3.PHI-C：无固化剂和乙酰丁香酮的PHI-B，2，4-D减少至1.5mg/L并且补充有8.0g/L的琼脂，0.5g/L的Ms-吗啉乙磺酸(MES)缓冲液，100mg/L的羧苄青霉素(过滤灭菌)。

4.PHI-D：补充有3mg/L的双丙氨膦(过滤灭菌)的PHI-C。

5.PHI-E：43g/L的Murashige and Skoog(MS)盐(Gibco，BRL11117-074)、0.5mg/L的烟酸、0.1mg/L的盐酸硫胺素、0.5mg/L的盐酸吡哆醇、2.0mg/L的甘氨酸、0.1g/L的肌醇、0.5mg/L的玉米素(Sigma，商品目录号：Z-0164)、1mg/L的吲哚乙酸(IAA)、26.4μg/L的脱落酸(ABA)、60g/L的蔗糖、3mg/L的双丙氨膦(过滤灭菌)、100mg/L的羧苄青霉素(过滤灭菌)、8g/L的琼脂，pH为5.6。

6.PHI-F：不含玉米素、IAA、ABA的PHI-E；蔗糖减少至40g/L；用1.5g/L的固化剂代替琼脂；pH为5.6。

通过首先将组织簇转移到补充有0.2mg每升的2，4-D的N6培养基中，可以从该转基因愈伤组织再生出植物。两周后，可以将组织转移至再生培养基(Fromm等人，(1990)Bio/Technology 8：833-839)中。

可以进行对转基因T0植株和T1植株的表型分析。

可以分析T1植株表型的变化。利用图像分析，可以在植株生长过程中在多个时间点，分析T1植株在植株面积、体积、生长速率方面的表型变化以及可以进行颜色分析。可以如实施例21中所述分析根构造的改变。

可以对农学特性的改变进行后续分析以确定含有RT1或RT1L基因的植株在与不含有R1T或RT1L基因的对照(或参照)植株比较时，是否具有至少一种农学特性的改善。还可以在多种环境条件下研究改变。

实施例14

利用农杆菌属细菌介导的转化构建具有RT1和RT1样基因的玉米表达载体

玉米表达载体可使用RT1(SEQ ID NO：12)和RT1样基因(SEQID NO：20)在NAS2(SEQ ID NO：33)、GOS 2(SEQ ID NO：34)或泛素(UBI1ZM；SEQ ID NO：35)启动子的控制下进行制备。PINII是终止子(SEQ ID NO：36)。

使用Invitrogen’s^TM

技术，含有玉米RT1基因或玉米类RT基因的入门克隆(如实施例9中所述产生)可以用于单独的与：

1)组成型玉米GOS2启动子入门克隆PHP28408(图10，SEQ IDNO：37)和PinII终止子入门克隆PHP20234(图11，SEQ ID NO：38)的

LR反应，形成目的载体PHP28529(图12，SEQ ID NO：39)。

2)根玉米NAS2启动子入门克隆PHP22020(图13，SEQ ID NO：40)和PinII终止子入门克隆PHP20234(图11，SEQ ID NO：38)的

LR反应，形成目的载体PHP28529(图12，SEQ ID NO：39)。

3)组成型玉米UBI1ZM启动子入门克隆PHP23112(图14，SEQ IDNO：41)和PinII终止子入门克隆PHP20234(图11，SEQ ID NO：38)的

LR反应，形成目的载体PHP28529(图12，SEQ ID NO：39)。

目的载体PHP28529还给每种最终载体添加：

1)RD29A启动子::黄色荧光蛋白::PinII终止子盒，用于拟南芥属种子分选。

2)泛素启动子::moPAT/红色荧光蛋白融合基因::PinII终止子盒，用于转化选择和玉米种子分选。

除了GOS2或NAS2启动子，其他启动子，例如但不限于S2A和S2B启动子、玉米ROOTMET2启动子、玉米Cyclo、CR1BIO、CRWAQ81以及玉米ZRP2.4447，可用于引导RT1和RT1样基因在玉米中的表达。此外，多种终止子，例如但不限于PINII终止子，可以用于完成所关注基因在玉米中的表达。

实施例15

利用农杆菌属细菌介导的转化用RT1和RT1样基因转化玉米品系

然后，可以将最终载体(实施例14)独立地用电穿孔法进入含有PHP10523(图9；SEQ ID NO：32，Komari等人，Plant J 10：165-174(1996)，NCBI GI：59797027)的LBA4404农杆菌中以产生共整合载体用于玉米转化。该共整合载体是通过最终载体(玉米表达载体)与PHP10523的重组(通过每个载体上含有的COS重组位点)而形成。除了实施例14中所述的表达盒，该共整合载体还含有农杆菌属菌株以及农杆菌属细菌所介导的转化所需的基因(TET、TET、TRFA、ORI终止子、CTL、ORI V、VIR C1、VIR C2、VIR G、VIR B)。转化玉米品系可以如实施例18所述进行。

实施例16

用于转化Gaspe Bay Flint衍生的玉米品系的目的载体PHP23236和 PHP29635的制备

目的载体PHP23236(图8，SEQ ID NO：31)是通过用质粒PHP23235(图15，SEQ ID NO：42)转化包含质粒PHP10523(图9，SEQ ID NO：32)的农杆菌菌株LBA4404并分离所得的共整合产物而获得。目的载体PHP23236可以被用于如实施例9所述的与入门克隆的重组反应，以产生用于转化Gaspe Bay Flint衍生的玉米品系的玉米表达载体。所关注的基因的表达是处于泛素启动子(SEQ ID NO：35)的控制之下。

PHP29635(图16，SEQ ID NO：43)是通过用质粒PIIOXS2a-FRT87(ni)m(图17，SEQ ID NO：44)转化包含质粒PHP10523的农杆菌菌株LBA4404并分离所得的共整合产物而获得。目的载体PHP29635可以被用于如实施例10所述的与入门克隆的重组反应，以产生用于转化Gaspe Bay Flint衍生的玉米品系的玉米表达载体。所关注的基因的表达是处于S2A启动子(SEQ ID NO：45)的控制之下。

实施例17

制备包含RT1或RT1样的质粒

用于转化Gaspe Bay Flint衍生的玉米品系的基因

利用Invitrogen’s

重组技术，可以产生含有RT1或RT1样基因的入门质粒，如实施例10中所述，并且将该质粒用于将每种基因定向克隆进目的载体PHP23236(实施例16)中用于在泛素启动子的控制下表达，或定向克隆进目的载体PHP29635(实施例16)中用于在S2A启动子的控制下表达。每一种表达载体都是用于农杆菌属细菌介导的玉米转化的T-DNA二元载体。

Gaspe Bay Flint衍生的玉米品系可以如实施例18中所述用表达载体转化。

实施例18

用RT1和RT1样基因转化Gaspe Bay Flint衍生的玉米品系

受体植株

受体植株细胞可以来自具有短的生活周期(“快速循环”)、大小减少以及转化潜能高的单一玉米品系。对玉米典型的这些植株细胞是来自可公开获得的Gaspe Bay Flint(GBF)品系变种的植株细胞。一种可能的候选植株品系变种是GBF×QTM(Quick Turnaround Maize(快速周转玉米)，选择用于在温室条件下生长的Gaspe Bay Flint的可公开获得形式)的F1杂种，其在Tomes等人的美国专利申请公开No.2003/0221212中有所公开。从该品系获得的转基因植株具有如此小的大小使得它们可以在4英寸的盆中生长(是正常大小的玉米植株所需空间的1/4)并且它们在少于2.5个月时间内成熟。(传统上，一旦转基因植株适应温室后需要3.5个月来获得转基因T0种子。)另一合适的品系是GS3(高度可转化的品系)×Gaspe Flint的双单倍体品系。还有另一种合适的品系是携带引起较早开花、高度减小或这两者的转基因的可转化的优良自交系。

转化规程

任何合适的方法可以用于将转基因引入玉米细胞中，包括但不限于利用基于农杆菌载体的接种类型的步骤。转化可以在受体(靶标)植株的未成熟胚上进行。

精确的生长和植株跟踪

将由转化的玉米胚产生的转基因(T0)植株的事件群体在受控的温室环境中栽培，该温室使用改良的随机分块(block)设计以降低或消除环境误差。随机分块设计是这样一种植株布局，在该布局中，实验植株被分成组(如，每组30株植株)，称为块，而每株植株随块被随机分配一个位置。

对于一组30株植株，24株转化的实验植株和6株对照植株(具有设定好的表型的植株)(总起来说称为“重复组”)被置于盆中，这些盆在位于温室内的桌子上布置成阵列(也叫做重复组或块)。每株植株(对照植株或实验植株)随块被随机分配一个位置，所述的块映射一个唯一的、温室物理位置以及映射该重复组。在单次实验中多个30株植株的重复组中的每一个可以栽培在相同的温室中。应该确定重复组的布局(布置方式)以使对空间的要求最小以及温室内的环境影响最小。这样一种布局可以称为压缩的温室布局。

对于加入特定的对照组的一种替代方法是鉴定不表达所关注基因的那些转基因植株。可以将诸如RT-PCR之类的多种技术应用于定量评估引入基因的表达水平。可以将不表达转基因的T0植株与表达转基因的那些植株进行比较。

在整个评价过程中鉴定和跟踪事件群体中的每株植株，并且从那些植株收集的数据自动与那些植株相关联，使得所搜集的数据可以与由该植株携带的转基因关联。例如，每个植株容器具有机器可读的标签(例如通用货单代码(UPC)条形码)，该标签包含了关于植物身份的信息，身份信息继而又与温室位置相关，使得从植物获得的数据可以自动与该植物相关联。

作为另外一种选择，可以使用任何有效的、机器可读的植物识别系统，例如二维矩阵代码或甚至是射频识别标签(RFID)，其中数据被接收并由射频接收器/处理器进行翻译。参见美国公布的专利申请No.2004/0122592，将其以引用的方式并入本文。

利用三维成像进行表型分析

对T0事件群体中的每株温室植株(包括任意对照植株)分析所关注的农学特性，并且以这样一种方式记录或存储每株植株的农学数据，该方式使得数据与该植株的辨识数据(见上面)相关联。可以利用与上述类似的实验设计，可以在T1代中完成对表型(基因效应)的确认。

在植物的整个温室生活周期中，利用定量的非破坏性成像技术在表型水平上来分析T0植株以评估所关注的性状。优选的是，将数字成像分析仪用于整株植物的自动多维分析。成像可以在温室内进行。将两个摄像系统(位于顶部和侧面)和用于旋转植物的装置用于从所有侧面观察植物和成像。从每株植物的顶部、前面和侧面采集图像。所有的三个图像一起提供了足够的信息用于评价每株植物的生物量、大小和形态。

由于植物在第一片叶片从土壤显现出来时到植物处于它们发育的末期时大小的改变，最好是从顶部以较高的放大倍率记录植物发育的早期。这可以通过利用完全由成像软件控制的自动变焦镜头系统来完成。

在单次成像分析操纵中，进行如下事件：(1)将植株传送至分析仪区域内，旋转360度以便其机器可读标签可以被读取，并且让其保持静止直至其叶片停止移动；(2)获取侧面图像并将其输入数据库；(3)将植株旋转90度并再次让其保持静止直至其叶片停止移动，以及(4)将该植株传送出分析仪。

每24小时的周期让植物至少6个小时处于黑暗以便具有正常的白天/黑夜周期。

成像仪器

可以使用任何合适的成像仪器，包括但不限于可从LemnaTec GmbH(Wurselen，Germany)商购获得的光谱数字成像仪。获取图像并用具有1/2″IT Progressive Scan IEE CCD成像设备的LemnaTec ScanalyzerHTS LT-0001-2进行分析。该成像照相机可以配备有自动变焦、自动调节光圈和自动聚焦。可以利用LemnaTec软件设定所有的照相机设置。优选的是，对于主要组成成像分析仪的仪器差异小于约5％，对于次要组成成像分析仪的仪器差异小于约10％。

软件

成像分析系统包括用于颜色和结构分析的LemnaTec HTS Bonit软件程序和用于存储约500,000次分析的数据(包括分析数据)的服务器数据库。原始图像和分析过的图像储存在一起以允许用户根据需要进行再次分析。可以将数据库连接至成像硬件用于自动的数据收集和存储。多种可商购获得的软件系统(例如Matlab，其它软件)可用于定量解释图像数据，并且可将这些软件体系中的任何一种应用于所述图像数据集。

传送系统

具有植物旋转装置的传送系统可以用于将植物传送至成像区域并在成像过程中选择植物。例如，将最多4株植物(每株最高高度为1.5m)装上汽车，该汽车在循环的传送系统上行进并通过成像测量区域。在这种情况下，该单位(成像分析仪和传送环线)的总占有面积为约5m×5m。

可以扩大传送系统以同时容纳更多植物。将植物沿传送环线传送至成像区域并对每株植物分析最多50秒。获取植物的三个视图。传送系统以及成像设备应该能够用于温室环境条件。

照明

任何合适的照明模式可用于图像采集。例如，可以在暗背景上使用顶部照明。作为另外一种选择，可以采用使用白色背景的顶部照明和背部照明的组合。应该将被照亮的区域围起来以确保恒定的照明条件。遮蔽物应该长于测量区域使得能保持恒定的光条件而不需要打开和关闭门。作为另一种选择，可以变化照明以引起转基因(如，绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP))的激发或者引起内源性(如叶绿素)荧光基团的激发。

基于三维成像的生物量估计

为了更好地估计生物量，应该从至少三个轴(优选顶部视图和两个侧面(侧面1和侧面2)视图)获取植物图像。然后分析这些图像以将植物从背景(盆和花粉控制袋(如果适用的话))分离。可以通过如下计算估计植物的体积：

在上面的等式中，体积和面积的单位是“任意单位”。在该体系中，任意单位完全足以检测基因对植物大小和生长影响，因为所需的是检测与实验平均值或对照平均值的差值(正-较大和负-较小两者)。大小(如面积)的任意单位可以通过将物理参照加至成像过程而轻易地转化成物理量度。例如，可以在顶部成像过程和侧面成像过程两者中都包括已知面积的物理参照。基于这些物理参照的面积，可以测定转换因子以允许从像素转换为面积单位，例如平方厘米(cm2)。物理参照可以是或可以不是独立的样本。例如，具有已知直径和高度的盆足可以用作物理参照。

颜色分类

成像技术还可以用于确定植物颜色以及用于将植物颜色归为各种衍生类型。将图像颜色归属于颜色类型是LemnaTec软件的固有特色。使用其他图像分析软件系统，可以通过多种计算方法确定颜色分类。

对于植物大小和生长参数的测定，一种有用的分类方案是定义一种单一颜色方案，包括绿色的两种或三种色调，此外，还有关于缺绿病、坏死和漂白(在这些条件出现时)的颜色类型。还使用了背景颜色类型，其包括图像中的非植物颜色(例如盆和土壤颜色)，并将这些像素特别地从测定大小中排除。在受控的恒定照明下分析植物，使得可以定量一株植物内随时间推移的任何改变，或者植物之间或植物不同分枝之间的任何改变(如季节差异)。

除了其在测定植物的大小、生长中的有效性，颜色分类还可以用于评估其他产量构成性状。对于这些其他产量构成性状，可以使用另外的颜色分离方案。例如，称为“保绿度(staygreen)”的性状(已经将其与产量的提高相关联)可以通过颜色分类来评估，该颜色分类将绿色色调与黄色和棕色色调(其指示老化的组织)相分离。通过将这种颜色分类应用于在T0或T 1植物生活周期末获取的图像，可以鉴定绿色的量相对于黄色和棕色(例如，可以表示为绿色/黄色比率)增加的植物。这种绿色/黄色比率具有显著差异的植物可以被鉴定为携带影响这种重要农学特性的转基因。

熟练的植物学家将认识到可以指示植物健康或应激反应的其他植物颜色(花青素)的出现，以及认识到其他颜色分类方案可以提供对基因在与这些响应相关的性状方面的作用的进一步度量。

植物结构分析

改变植物结构参数的转基因也可以用本发明鉴定，包括诸如最大高度和宽度、节间距离、叶与茎之间的角度、在节处开始的叶片数以及叶片长度。LemnaTec系统软件可以如下用于确定植物结构。在第一成像步骤中将植物简化至其主要的几何结构，并且随后，基于该图像，可以进行不同结构参数的参数化识别。改变(或者是单独地或者是组合地)任意这些结构参数的基因可以通过应用此前所述的统计方法鉴定。

花粉脱落日期

花粉脱落日期是转基因植物中要分析的一个重要参数，并且可以通过活性雄花第一次出现在植物上来确定。为了找到雄花目标，通过颜色对茎的上端进行分类以检测黄色或紫色花药。然后将这种颜色分类分析用于定义活性花，活性花继而可以用于计算花粉脱落日期。

作为另外一种选择，花粉脱落日期和其他易于在视觉上检测到的植物属性(如授粉日期、第一穗丝日期)可以由负责进行植物看护的工作任人员来记录。为了使数据完整性和过程效率最大化，通过利用相同的由LemnaTec光谱数字分析设备利用的条形码来跟踪该数据。可以将具有条形码阅读器的电脑、掌上设备或笔记本电脑用于使记录观察时间、植物标识符的数据捕捉变得容易，以及使捕捉数据的操纵者变得舒适。

植物的取向

以接近商业栽培的密度种植的成熟玉米植物通常具有平面的结构。也就是说，植物具有一可清晰分辨的宽的侧面和窄的侧面。对来自植物宽侧的图像进行测定。对于每株植物，给其赋予一个明确界定的基本取向以获得宽侧图像与窄侧(edgewise)图像之间的最大差别。将顶部图像用于确定植物的主轴，而将额外的旋转装置用于在开始主图像采集前将植物转至合适的取向。

实施例19

在氮限制条件下筛选Gaspe Bay Flint衍生的玉米品系

氮利用率可通过在田间的氮消耗土壤上通过种植多列玉米、或通过在温室中使用如本文所述的实验条件进行测试。转基因植物将含有两个或三个剂量的Gaspe Flint-3与一个剂量的GS3(GS3/(Gaspe-3)2X或GS3/(Gaspe-3)3X)，并且对于显性转基因将会以1∶1分离。将植物在Turface中栽培，每天用1mM KNO₃生长培养基和2mM KNO₃或更高的生长培养基浇洒四次(见图18)。在1mM KNO₃培养基中培养的对照植物的绿度较小，产生较少的生物量并且在开花期具有较小的穗(关于样本数据的示例请参见图19)。

用统计学确定处理株之间所观察到的差异是否真有差异。图19示出了一种方法，该方法将字母放在数值后面。同一列中其后具有相同字母(不是字母组)的那些值不具有显著的差异。使用该方法，如果在一列中的值的后面没有字母，则该列中的任意这些值之间不存在显著的差异，换句话讲，该列中的所有这些值是均等的。

与无效转基因相比较，转基因的表达将导致植物在1mM KNO₃中具有改善的植物生长。因此，将会在生长期间监控生物量和绿度并将其与无效转基因相比较。生长、绿度、开花期穗的大小的改善将表明氮耐受性增强。

实施例20

具有RT1或RT1样基因的玉米品系的产量分析

可以将含有RT1或RT1样基因的重组DNA构建体通过直接转化或从独立转化的品系的基因渗入来引入玉米品系中。

可以将转基因植物(自交系或杂种)进行更强的基于田间的试验，以研究在不同环境条件(例如改变水和营养物质可利用性)下的产量增加和/或稳定性。

可以进行后续的产量分析，以确定在各种环境条件下含有RT1或RT1样基因的植物与不含RT1或RT1样基因的对照植物相比较时是否具有改善的产量表现。可以测得这两种植物的产量都有所减少。相对于对照植物，含RT1或RT1样基因的植物的产量损失较少，优选产量损失少于50％。

实施例21

测定玉米根构造改变的测定法

测定转基因玉米植物在幼苗期、花期或成熟期的根构造改变。测量玉米植物的根构造改变的测定法包括但不限于下面概述的方法。为了便于手动或自动地测定根构造改变，可以让玉米植物在透明的盆中生长。

1)根量(干重)。让植物在Turface中生长。将烘干的根和根组织称重并计算根冠比。

2)侧根分枝的水平。侧根分枝的程度(如侧根数量、侧根长度)通过这样确定：从完整的根系进行二次取样，将样本用平面扫描器或数码相机成像并用WinRHIZO^TM软件(Regent Instruments Inc.)分析。

3)根带宽度的测量。根带是植物成熟时在温室栽培盆的底部形成的根带或根量。测量成熟时根带的厚度(以mm为单位)，作为对根量的粗略估计。

4)节生根的计数。从支持培养基(support medium)(如盆栽混合物(potting mix))中分离出根后，可以测定上部节位处出现的冠根数。另外，可以测量冠根和/或支柱根的角度。对节生根和节生根的分枝量的数值分析形成对上述手动方法的另一种延伸。

对提取的有关根表型的所有数据进行统计分析(通常为t-检验)，以将转基因根与非转基因姊妹株植株的根进行比较。在多个事件和/或构建体涉及该分析的情况下，还可以使用单因素方差分析。

实施例22

筛选Gaspe Bay Flint衍生的玉米品系用于耐旱性

可用以下方法筛选具有耐旱性的含RT1或RT1样基因的转基因Gaspe Bay Flint衍生玉米品系。

转基因玉米植物经受供水良好条件(对照)和干旱胁迫条件。在T1阶段或更晚的时期筛选转基因玉米植物。

在播种后(DAS)10至14天或移植后7天时开始施加胁迫，持续至抽穗丝。在整个干旱胁迫处理期间通过自动系统给罐浇水，该自动系统配有定时器以提供25或50％的田间持水量的水。该胁迫的强度和持续时间将允许鉴定对植物生长的影响以及对开花-抽穗丝间隔的影响。

罐混合物：使用1/3蒙脱石(Profile Products LLC，IL，USA)、1/3沙土和1/3SB300(Sun Gro Horticulture，WA，USA)的混合物。SB300可用Fafard Fine-Germ(Conrad Fafard，Inc.，MA，USA)替代，并且可减少沙土在混合物中的比例。因此，最终罐混合物可以是3/8(37.5％)的蒙脱石、3/8(37.5％)的Fafard和1/4(25％)沙土。

田间持水量测定：测量用于一个S200罐(减去罐重量)的土壤混合物(w1)的重量。如果土壤混合物的所有组分都不是干燥的，在测定W1前在100℃下干燥土壤至恒重。罐中的土壤加水至完全饱和，并排出所有土壤重力水。测定排出土壤重力水后的土壤(w2)重量(减去罐重量)。田间持水量是获取自w2至w1的土壤中保有的水的重量。它可被描述为烘干土壤重量的百分比。

胁迫处理：在植物生长的早期阶段(10DAS至21DAS)，供水良好的对照具有75％田间持水量的每日供水，而干旱胁迫处理具有25％田间持水量的每日供水，两者都是在或约10AM时的单日剂量。当植物进一步生长时(21DAS)，必须将供水良好对照的每日供水量提高到全田间持水量，并将干旱胁迫处理的每日供水量提高到50％田间持水量。

营养物质溶液：用自来水稀释至1/16的改良Hoagland溶液被用于灌溉。

表4

使用以下配方制备20L改良Hoagland溶液：

组分	量/20L
组分	量/20L	10X微量营养素溶液	16mL
KH₂PO₄(分子量：136.02)	22g	10X微量营养素溶液	16mL
KH₂PO₄(分子量：136.02)	22g	MgSO₄(分子量：120.36)	77g
KNO₃(分子量：101.2)	129.5g	MgSO₄(分子量：120.36)	77g

组分	量/20L
组分	量/20L	Ca(NO₃)₂·4H₂O(分子量：236.15)	151g
NH₄NO₃(分子量：80.04)	25.6g	Ca(NO₃)₂·4H₂O(分子量：236.15)	151g
NH₄NO₃(分子量：80.04)	25.6g	Sprint 330(铁螯合物)	32g

表5

使用以下配方制备1L 10X微量营养素溶液：

组分	mg/L	浓缩
组分	mg/L	浓缩	H₃BO₃	1854	30mM
MnCl₂·4H₂O	1980	10mM	H₃BO₃	1854	30mM
MnCl₂·4H₂O	1980	10mM	ZnSO₄·7H₂O	2874	10mM
CuSO₄·5H₂O	250	1mM	ZnSO₄·7H₂O	2874	10mM
CuSO₄·5H₂O	250	1mM	H₂MoO₄·H₂O	242	1mM

使用肥料级KNO₃。

在移植时或在出苗后加入半茶匙奥绿肥(Osmocote)(NPK 15:9:12)到罐中是有用的(The Scotts Miracle-Gro Company，OH，USA)。

边界植物：将一排边界植物放置在邻近温室玻璃墙的工作台边缘，或邻近其它潜在微环境变化原因(如制冷风扇)的工作台边缘。

自动操作：使用具有钻孔的PVC管进行浇水，使用虹吸装置将水系统的供给到放置的罐中。使用定时器安排灌溉时序。

统计分析：在不同胁迫处理条件下的转基因事件中记录的植物尺寸、颜色和叶绿素荧光的平均值将被输出到Spotfire(Spotfire，Inc.，MA，USA)。处理平均值将使用方差分析进行差值评估。

重复：每个事件每种处理使用八至十株植物。

进行观察：在整个生长阶段每周进行三次Lemnatec测量以捕集植物生长速率。在整个胁迫期间使用Lemnatec每周进行三次叶片颜色测定。使用Hansatech FMS2仪(LemnaTec GmbH，Wurselen，Germany)，在实验期间将叶绿素荧光记录为PhiPSII(它指示光合体系II光化学的工作量子效率)和Fv’/Fm’ (它是光合体系II的最大效率)二至四次，记录在测量日的11AM开始。在胁迫期间，在开始看到干旱胁迫症状(即，叶片灰化及叶片卷曲)时开始测量，直至实验结束，并且在最幼嫩的、伸展最充分的叶片上进行测量并记录。记录每单株植物的抽穗和抽穗丝日期，并计算ASI。

序列表

<110>E.I.du Pont de Nemours and Company

<120>涉及RT1基因、具有改变的根构造的植物、相关的构建体和方法

<130>BB1590

<150>60/947117

<151>2007-06-29

<160>45

<170>PatentIn版本3.3

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物

<400>1

gcagacgcga caaagatgaa 20

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物

<400>2

cgaatctcaa gctaatgagg a 21

<210>3

<211>18

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物

<400>3

aggagcccag cgtgggcg 18

<210>4

<211>22

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物

<400>4

caaaagaacc ccggagaagc ta 22

<210>5

<211>23

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物

<400>5

ctatcccggt catccaatat gta 23

<210>6

<211>23

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物

<400>6

gatctgccac tgggtattat gac 23

<210>7

<211>23

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物

<400>7

gctgcagctt acattgttct ctc 23

<210>8

<211>22

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物

<400>8

caacaccaga gcctctacag tg 22

<210>9

<211>7800

<212>DNA

<213>玉米

<400>9

ggagatgttt cagtacatgc agagccttgg tgccgcatcc ggattccctg ctcaattcca 60

tactcttgtg agtatcaaaa ttttagtccc gcatgatata tattcatctg gtctcacaca 120

tgcaatatct tctctgtgca gagacaatcg gcggcatcga acaaccctca cgcttcaccc 180

agcccttcgt cgaaccagtc tagccgccca cctcgttgat gacattgtgt tggtgacatg 240

tttgagaaac ttgttgtgag atacttgttt gtgaaacttt tgtgagagac ctatgtttgt 300

gaaacttgtt tgatgtgttg atatttgtga gatatatggt gttggtgatg catgtgttga 360

ttctgtgata tatgtgatgc ctacgatatg tatcttttgt ttgtttggat ggaatagcaa 420

aaacaaataa aaagggtatt atggccactt tgccgagtgt aactctcggc aaagaaggca 480

cacctgggat ccggtaaagc ttctttgccg agtgttgtgg tccaggcact cagcaaaggg 540

actggcaaag gggcccatta gagccacctt tgccaagagc tcgtgcatca ggcactcgac 600

aaagaagtcc gctttgccga gtgcatatca tcgcactcgg cgaaggggct ggcaaaaggg 660

gtgcctagtg ccaggatagc agacacttga caaagactcc atcaccgtca cttggtatcg 720

cgagttttct ttgccgagta ccaattgcac tcggtaaaga ctttatcaag tgtccgacaa 780

aaaagtactc ggcaaagaag ccgatctata gttcgcaaga cttctttgtc gagagtcaca 840

ctcggtaaag agtctgtcga gtgttttctg gactttgctg aagcacttgg aaaaacagtt 900

gtatccgtta gtgatgtagg gatggatttc ctaaagtctt gtaaaagaac gaataggcag 960

tgcacaactc aacaaacttg tatatacact acggagtact acacttttag agctgcagta 1020

agaaaaagga gagagaaaca gtgaacgcaa tacatgggaa agctagggtc gggcggtacg 1080

gtaaggtatc tgccgtgccc atacctggca tctcatcaca atctcctggc caagcttgtc 1140

gatctagcct ctctctctct tttgtgcagt gagacccgac atgaatgggt gtggggctca 1200

tctgatcagt ccttgtgtta ctttgtttcc ttttcctttg aatttccggg gtttgcagaa 1260

ggacagccgg gtactgcatc gatgttgggc attctccagt tttgttcttg gtcttggagg 1320

aggaaaaggc ccagggacca actttttcgc agccccccct tcttcctccc tttgcactgc 1380

tgctgccgtg gaatcataca tcacaattac cgaggccaca gaaaagagtg tttttttgct 1440

tgaggaaaag ggctagtccc tttattccaa ccacacacat gcatgcagaa aaagtcgatg 1500

gtggtggagt cgtacagtag tacaattaaa aactaactcg atcatatata tacatacttt 1560

gaaatgcaag tgccaggttc ttgagtactg tcctcagcta ctactacgta ccttgaagaa 1620

atttctagca agagacaatg gctaagaaag agaccatgca tggtgaaatt aaagagtgtt 1680

cttgacatga gaaacgtggt ttgctaactt taatcaagcc caaccaaagc tatcccaata 1740

tttaatggat gcatgggcta gccggccggg tgagagcaag gttaataata tagattataa 1800

tggcttttat gatgttgtca taccatgtat atagcaaact aaaagtccag tcatacaata 1860

actctaccat gatataagct atacatttaa tattaggact tatctttttt tttctcacac 1920

aaagtggctt agagtctatg agtaggccac ttttagctgg ctattagagc aagtttaata 1980

atataacgca tagtaagttt tataatgtta ccatgttaca tatagccaac aaaacatcta 2040

gtcatataat aactttcttg tgtatggtac aagttgtata tttaatattt attctactcc 2100

ttcctctcat aagttgtctt gtagtcagcc cacgtccagc tgactactag tgagcagccc 2160

gtttttctct ctttcttcgg tatggccata aatctgatgt gttatctctt gcagcttgtc 2220

tctgtcacct tattatactt gttcttagtg agcagtccgc ttctgtgtca ccgtaaacct 2280

gatagggcat gcacgtatta caatccgtcc acgtcatctt atcatgcttg ctctagtctt 2340

gttaaataga tctgtaataa accatatata gtccgttttt caagttggca tctttgctac 2400

ttccatttgg taccaacatg atctgacatc tctacgtcaa ctcgccagac agacaaatac 2460

ctattgcaga cgccaaagac aaacaataat tgacattact ttggccgttt tctgtagacc 2520

gttttctttt cccgagaaca atttgtacca gcagtgactg atcgatgagg cgttttagcc 2580

ctatatatgg cggctataat aatacacccg agccagaaaa gacttgtctc tttggtgcca 2640

tatgcatgtt tatggctacg ctagctttag ggcagagaga gagagagatc ctactagcta 2700

gcagaaatgt tagaatgata tgagagagag aacagagaga gcagagagag agagcttttc 2760

ttcttgcctt gaaaggagag gaacgggaac aaaggtaccc aatgctagca gatacataag 2820

gagggacgta cgggccgggt aaagcgacga agccttatgg atgggcatct ccatttctct 2880

aacccgatat gcctagctta gcttccattg gtgggggcgt gtgtgttctt tgagagattc 2940

taaaagctcg tcaccgtaga gctagcagtg cgacctttat tttcttctcc ccctcgtggg 3000

ggaagtggca tcgatcgatt aagatcccct ttacaaccac catgatggca gcctcgtcgt 3060

cgtcgtcctt caacctcagt gatcatctcg ttcaagatga cctcccgtgg cctgcttctt 3120

cttcttcttc ctcccagctg ccatttgctc cttctcatcc tcctcacggc gccattattg 3180

gaggcagcca gcaatggtgg cagcaacctc aaatgctgta agcaccttgc agctctagct 3240

agcactagta tttccttatg tttacaatta ttgtcagggt caaaatttgt tctttgtgca 3300

ttgtgagtgt tcaatcatat tcccttcctc tctctctctc aaaggaaagt aattttggag 3360

tgcattcatg cattctttgt ttttatagta ctggattctt cctaggtaga atttggagtt 3420

ttcctctgca tatgcttgtt ctctctcccc cccccccccc ccagctgctc cctgttgtct 3480

ccatggagtc tagggaatcg tagctcggca aaatgacaac tttcggcaga aacagataaa 3540

cagcacacgg atgatgatgc aacttatgtg catgactcca tccaacaatt tgttggtttc 3600

ctccgcgact ccgaaaggtc gctgtgcatg catttttctt ttttgtcatg gtcatcaatg 3660

gacggccggc atatatatac atacatacat agtgattcgt cctccacatc ttgtttaccc 3720

agcaggccag gccagccgga tgcatatgca tctatttgat tccttttact actgcagaaa 3780

ctgtgcagac cggcatccct ccgacgagct tgaggtcctc ctctcagcac aaggcagcca 3840

ccaccaccac caccatcctt cttcttcagt gatccatcct cagctaagct cgctgctaat 3900

gatgcaagac ctagggttcc aatggagcag ctgcggcagc ttcgtggaca cctcctcgtc 3960

gtcgcccatg ccaccaccac tggtgaacgg ccagcagcac gacggccaca acaagatcaa 4020

ggagtgggac cgcccgctca ctgctaataa ctcatcaagg tcatcgtgtg cgagcacagc 4080

tatggcttgc cgagatgtcg tcctcgacgg cggcggcggc ggcggcctcc ctgccatggc 4140

cgccgtcgcc gccgatcttg acgacggcac cgtgctcccg gcgagcgtca acgtcccccg 4200

gacgacgacg acgcgccaga ggccattccc ggcggcgccg ccacctctcc ccggcgacgc 4260

gttcgagata ctggcttcgt cgaggctatg caagaccctg ctgcttagcc aagcttcttc 4320

ttcggtactg ctccataatg gcacgacgat gcctttgttg agatcagagc atgtgcccta 4380

tggccctcct gctcctgctc atccccaagg accatccatc ggcaactaca agcaggtcag 4440

tcaaattaaa gtacagtgta gagcttgcgt cgttgcttga acagtacagt actctctctc 4500

tctctctctc tctcactctc agagaaggga aaggaaaagg atggatgcat gcatcaaacc 4560

gttagctgca tatgcagcag ctgctgtttt ttttttcttt ctttctttgg ctgaacagct 4620

gatgatactt atcctgcagt gtcttagaac tcaagcagta agtgtatagc cccatttgcc 4680

ctactgtctt gagacctcta gttaattgag ttcagacatt aaattgatag gagataactt 4740

aactaaaatc atttgaactc taaaagatag cataaaatct ccttttatga ttatatagtg 4800

tggcatgtaa actcaggtat atacatggta ttccatccat ccacctccag aaaactatat 4860

gcttgctgac ttgattagtc tcttgttagc caagccaaaa catgtttctt tcgtgagaga 4920

atgaactacg tgatggtata gttattgtgt atatacacgc atgtatatat atatatatat 4980

atatatatat atatatatat aggcgaagag agttcaagtc aataacagat taacagttac 5040

cagtagttct actctcccct atatatatgt gtgcatgttt tgctcatact ctctctatct 5100

atctatatgt ctatctgtcc gtgtccgtgt atatatgtgc atgcttcatt agagaaaata 5160

atggtcgatt tattttctaa gcccaaaaaa cagagtcaaa tatctatcta ctattataaa 5220

gcatcagatt cgatggtcgt cctacatcac gcgcgtaggt ctattcctct ccctttatca 5280

gtgtgggccg tgagaaacca cacaaggctc tattagtggg tcgttacctc gtagatgggc 5340

cgtgagtcaa gcctaacaac agaaagccgc atacagtgca acgcttccac atagtaccac 5400

tccactatct aaaggaggac gagctactgt gcgaactata aaaaaagagg gtaaggctca 5460

ttttcaactc ataactttct aagacctttg gctaagataa aatgtaatat tttgttcttg 5520

tgtgtcgtgg caacacatgt gtattgtact agtctgtata tacacatagg atgtatgagt 5580

acctaagcta agagggtgtg tttgtttggg attataaact gttcagacta tataatccaa 5640

cagattttga actaataagt gttagttcaa aaatttattg gattatataa tctgggcaga 5700

ttataaaccc taaacaaaac atccctatgc cacctcacgt agctagcaac atgttacata 5760

tgtacagtat gtgatagaac aacatttgca tgccaaaagg cattgcgctt tcagtgtgag 5820

gaccattaca tttagctgtt attatgtgat cgagtagtac ggacaggggc gtacgattgt 5880

gttcaagctg ctaagaggtt acagctcatt gggtttgccg gtttgcgtgc cttgcctgct 5940

agagtaccag ctacacgcgc atgatatgat gtcctactcc tactcctaat ctcatgcatg 6000

catgtcctga tggatctgca gtgtgtgctg gcagccagtc tagtgcatgc tctctcgctc 6060

tccgatgaga tcctggccga agcaaaggta gagagagagc aggtcggagc agaagctagg 6120

cccagccggg ccgggcccat gctgtacaaa gaggaggagg aggagtacaa caggccggcc 6180

gggctctccc ttttgctctg catccattgc agcagccttt tagggttgga gagtgaccgc 6240

ccggccgcgc catctttttt ccgcccaata tcgtcgtacc gcccataccc tcctccggct 6300

ctggcctcgc tgcacttgca tcgtcttcac ttaactcctc gcaggctttg ttgtgtttgc 6360

agggaactaa taaagccgtt tgcagtgctg ctggcgccct gcccgtgccc tgtcaccacc 6420

atacgactaa ttacacacac cttattcata tatataatac accctccata tagatatata 6480

tagttgatga tatagaaaag agagcatgca tgggtgacag gctttgttct gttgaagaac 6540

gcaacgtgat cttaattctt ccctagctaa gatcagcggt cctccatcgt ttctgatgaa 6600

cacgcgtgcg tgcgtgcgcc tttgcagtgc atgcagatgg gcgcgtcttg tggaggccgc 6660

gcgcagcacg aagcggcatg tcaaagcatg gcggcggcag cagcacgccc agcactgcca 6720

gtggtgccgt cgtcgaagaa gcctcgagtc gagcagcggt cctccaccat cgtcccttct 6780

ttcaaggtac tcgtatactc taggctgggt ctcgtgccgt ctcgatcgtt tcgtcatttc 6840

gatcaacgtt aattgacagt aacaccaacc taatatccaa tcatatatat atagtactaa 6900

ttctgttccc tgattaggta aggaaagaga aattagggga ccggatcgct gctcttcagc 6960

agctcgtctc accgtttggc aaggtacccg gccgtcgtca cgattattca gcattattag 7020

ggttttggag ggcaggcagg attacatata ttattaactc tctctctata tatataaata 7080

tatacctgac actaacacta ctatgtatgt gcagactgat accgcatctg tgctcatgga 7140

ggccatcggt tacatcaaat ttcttcaaga tcaagtcgag gtaaccaact agctagctgc 7200

ttatcagcca cacttggtcc atgagttcca gacatagcca cgctcgccaa gaaatactgt 7260

ttctttcttt ccatggcaag catctgctgg taggattttt ttcctcctga cagcagttct 7320

catgatcacc ctcaccctca cctgcagact ctgagccgcc cctacctgaa atcctccaga 7380

agtaagaagc ccaggccgac accgcgggta acaccatacg tctaaatcag gctcggtttc 7440

aaaatctggg ggaaactttc atgttaaatc tgatgtttgt gcacgtcgcg ttgcgtgtga 7500

atcagggttc ttcaaacgcg agcgctgggg agctggagga aacgaggcct gacctccgca 7560

gcagagggct ctgcctggtg cctctctcgt gcacgtccta cgtgaccaac gagaacggag 7620

tctgggttcc accgaatttt agggcaaact aaagtcatgt cagcgctact agagacacag 7680

cacaacagtg taccaagaac tactaatcca cggttcatct cagttcatcc acggttaata 7740

ccagttctcc gggccaaaag acacccacca tctacctctt gtgttgtctc tctttgccac 7800

<210>10

<211>25

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物

<400>10

tggcatcgat cgattaagat cccct 25

<210>11

<211>23

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物

<400>11

tggaacccag actccgttct cgt 23

<210>12

<211>1385

<212>DNA

<213>玉米

<400>12

ctcgtggggg aagtggcatc gatcgattaa gatccccttt acaaccacca tgatggcagc 60

ctcgtcgtcg tcgtccttca acctcagtga tcatctcgtt caagatgacc tcccgtggcc 120

tgcttcttct tcttcttcct cccagctgcc atttgctcct tctcatcctc ctcacggcgc 180

cattattgga ggcagccagc aatggtggca gcaacctcaa atgctaaact gtgcagaccg 240

gcatccctcc gacgagcttg aggtcctcct ctcagcacaa ggcagccacc accaccacca 300

ccatccttct tcttcagtga tccatcctca gctaagctcg ctgctaatga tgcaagacct 360

agggttccaa tggagcagct gcggcagctt cgtggacacc tcctcgtcgt cgcccatgcc 420

accaccactg gtgaacggcc agcagcacga cggccacaac aagatcaagg agtgggaccg 480

cccgctcact gctaataact catcaaggtc atcgtgtgcg agcacagcta tggcttgccg 540

agatgtcgtc ctcgacggcg gcggcggcgg cggcctccct gccatggccg ccgtcgccgc 600

cgatcttgac gacggcaccg tgctcccggc gagcgtcaac gtcccccgga cgacgacgac 660

gcgccagagg ccattcccgg cggcgccgcc acctctcccc ggcgacgcgt tcgagatact 720

ggcttcgtcg aggctatgca agaccctgct gcttagccaa gcttcttctt cggtactgct 780

ccataatggc acgacgatgc ctttgttgag atcagagcat gtgccctatg gccctcctgc 840

tcctgctcat ccccaaggac catccatcgg caactacaag cagtgcatgc agatgggcgc 900

gtcttgtgga ggccgcgcgc agcacgaagc ggcatgtcaa agcatggcgg cggcagcagc 960

acgcccagca ctgccagtgg tgccgtcgtc gaagaagcct cgagtcgagc agcggtcctc 1020

caccatcgtc ccttctttca aggtaaggaa agagaaatta ggggaccgga tcgctgctct 1080

tcagcagctc gtctcaccgt ttggcaagac tgataccgca tctgtgctca tggaggccat 1140

cggttacatc aaatttcttc aagatcaagt cgagactctg agccgcccct acctgaaatc 1200

ctccagaagt aagaagccca ggccgacacc gcggggttct tcaaacgcga gcgctgggga 1260

gctggaggaa acgaggcctg acctccgcag cagagggctc tgcctggtgc ctctctcgtg 1320

cacgtcctac gtgaccaacg agaacggagt ctgggttcca ccgaatttta gggcaaacta 1380

aagtc 1385

<210>13

<211>443

<212>PRT

<213>玉米

<400>13

Met Met Ala Ala Ser Ser Ser Ser Ser Phe Asn Leu Ser Asp His Leu

1 5 10 15

Val Gln Asp Asp Leu Pro Trp Pro Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gln

20 25 30

Leu Pro Phe Ala Pro Ser His Pro Pro His Gly Ala Ile Ile Gly Gly

35 40 45

Ser Gln Gln Trp Trp Gln Gln Pro Gln Met Leu Asn Cys Ala Asp Arg

50 55 60

His Pro Ser Asp Glu Leu Glu Val Leu Leu Ser Ala Gln Gly Ser His

65 70 75 80

His His His His His Pro Ser Ser Ser Val Ile His Pro Gln Leu Ser

85 90 95

Ser Leu Leu Met Met Gln Asp Leu Gly Phe Gln Trp Ser Ser Cys Gly

100 105 110

Ser Phe Val Asp Thr Ser Ser Ser Ser Pro Met Pro Pro Pro Leu Val

115 120 125

Asn Gly Gln Gln His Asp Gly His Asn Lys Ile Lys Glu Trp Asp Arg

130 135 140

Pro Leu Thr Ala Asn Asn Ser Ser Arg Ser Ser Cys Ala Ser Thr Ala

145 150 155 160

Met Ala Cys Arg Asp Val Val Leu Asp Gly Gly Gly Gly Gly Gly Leu

165 170 175

Pro Ala Met Ala Ala Val Ala Ala Asp Leu Asp Asp Gly Thr Val Leu

180 185 190

Pro Ala Ser Val Asn Val Pro Arg Thr Thr Thr Thr Arg Gln Arg Pro

195 200 205

Phe Pro Ala Ala Pro Pro Pro Leu Pro Gly Asp Ala Phe Glu Ile Leu

210 215 220

Ala Ser Ser Arg Leu Cys Lys Thr Leu Leu Leu Ser Gln Ala Ser Ser

225 230 235 240

Ser Val Leu Leu His Asn Gly Thr Thr Met Pro Leu Leu Arg Ser Glu

245 250 255

His Val Pro Tyr Gly Pro Pro Ala Pro Ala His Pro Gln Gly Pro Ser

260 265 270

Ile Gly Asn Tyr Lys Gln Cys Met Gln Met Gly Ala Ser Cys Gly Gly

275 280 285

Arg Ala Gln His Glu Ala Ala Cys Gln Ser Met Ala Ala Ala Ala Ala

290 295 300

Arg Pro Ala Leu Pro Val Val Pro Ser Ser Lys Lys Pro Arg Val Glu

305 310 315 320

Gln Arg Ser Ser Thr Ile Val Pro Ser Phe Lys Val Arg Lys Glu Lys

325 330 335

Leu Gly Asp Arg Ile Ala Ala Leu Gln Gln Leu Val Ser Pro Phe Gly

340 345 350

Lys Thr Asp Thr Ala Ser Val Leu Met Glu Ala Ile Gly Tyr Ile Lys

355 360 365

Phe Leu Gln Asp Gln Val Glu Thr Leu Ser Arg Pro Tyr Leu Lys Ser

370 375 380

Ser Arg Ser Lys Lys Pro Arg Pro Thr Pro Arg Gly Ser Ser Asn Ala

385 390 395 400

Ser Ala Gly Glu Leu Glu Glu Thr Arg Pro Asp Leu Arg Ser Arg Gly

405 410 415

Leu Cys Leu Val Pro Leu Ser Cys Thr Ser Tyr Val Thr Asn Glu Asn

420 425 430

Gly Val Trp Val Pro Pro Asn Phe Arg Ala Asn

435 440

<210>14

<211>23

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物

<400>14

ccaaggacca tccatcggca act 23

<210>15

<211>20

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物

<400>15

actccgttct cgttggtcac 20

<210>16

<211>1167

<212>DNA

<213>水稻

<400>16

atgatggcct cctcctcttc ctcctccagc ctctgtgata atcatctctt gcaagatgac 60

ctgatcccat ggccttccat gccctttgct cctgctccca acacctttgg attgaaccac 120

caatggagcc agcctccaat gctaagcagc agtactgatc agttaagctc atatgagctt 180

gaatcactcc aatcagttga aagtcagctg gcagctgctg ctcctccgac attaagcccc 240

catctgcagg ctcatcaact cagcacggtg ctaatgatgc aggagctagg gttccaatgg 300

agcagctgcg ctgcgccagc agatcaacat agtattgcaa gctccacgaa taataatagt 360

aatgtgatga tgaacgagga ggagctacgg ccacgtcctg atcaatccct aatcagcaat 420

ccaaggtcat gcagcgccac cacgcttctt cctccgccgc atctacatct ggacggcgct 480

gtgctcccga gcatcaacgt ctcgcggctg cagaagctgg ccgccggcga tgagccgctg 540

cagatatgtt gcaagaggca ggctgctgct gctgcagtgg tcggccatag cagcataaga 600

gatgagcatg tgccctgccc ctatgctggc cctcctgctc atctaattca aggaccatcc 660

aacaccctgc agatgaagag gaatacgaat gcagcagctc aagggagagg tggccgccat 720

gggagttcaa cggagcacag atcatcaaca gcgctgccgc catcgtcaaa gaagccccgg 780

ctcgagtcac actcctcctc aatgcttcct tcattcaagg taaggaaaga gaaactaggg 840

gatagaattg ccgcccttca gcaactggtc tcaccctttg gtaagactga taccgcatcg 900

gtactcatgg aggccatcgg ttacatcaaa tttcttcagg accaagttga gactttgagc 960

ggtccatacc tgagatcatc caagaacagc aagaaattag cctgcagggc agcacaacaa 1020

caacggaagg ggacgtcaaa tggaggggac gcagcagcaa agcttgacct ccgaagtaga 1080

ggactctgcc tggtgcccct gtcgtgcacc tcctacgtca ccaacgagaa tggggtttgg 1140

cctccaccca atttcagagg aaactga 1167

<210>17

<211>388

<212>PRT

<213>水稻

<400>17

Met Met Ala Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Leu Cys Asp Asn His Leu

1 5 10 15

Leu Gln Asp Asp Leu Ile Pro Trp Pro Ser Met Pro Phe Ala Pro Ala

20 25 30

Pro Asn Thr Phe Gly Leu Asn His Gln Trp Ser Gln Pro Pro Met Leu

35 40 45

Ser Ser Ser Thr Asp Gln Leu Ser Ser Tyr Glu Leu Glu Ser Leu Gln

50 55 60

Ser Val Glu Ser Gln Leu Ala Ala Ala Ala Pro Pro Thr Leu Ser Pro

65 70 75 80

His Leu Gln Ala His Gln Leu Ser Thr Val Leu Met Met Gln Glu Leu

85 90 95

Gly Phe Gln Trp Ser Ser Cys Ala Ala Pro Ala Asp Gln His Ser Ile

100 105 110

Ala Ser Ser Thr Asn Asn Asn Ser Asn Val Met Met Asn Glu Glu Glu

115 120 125

Leu Arg Pro Arg Pro Asp Gln Ser Leu Ile Ser Asn Pro Arg Ser Cys

130 135 140

Ser Ala Thr Thr Leu Leu Pro Pro Pro His Leu His Leu Asp Gly Ala

145 150 155 160

Val Leu Pro Ser Ile Asn Val Ser Arg Leu Gln Lys Leu Ala Ala Gly

165 170 175

Asp Glu Pro Leu Gln Ile Cys Cys Lys Arg Gln Ala Ala Ala Ala Ala

180 185 190

Val Val Gly His Ser Ser Ile Arg Asp Glu His Val Pro Cys Pro Tyr

195 200 205

Ala Gly Pro Pro Ala His Leu Ile Gln Gly Pro Ser Asn Thr Leu Gln

210 215 220

Met Lys Arg Asn Thr Asn Ala Ala Ala Gln Gly Arg Gly Gly Arg His

225 230 235 240

Gly Ser Ser Thr Glu His Arg Ser Ser Thr Ala Leu Pro Pro Ser Ser

245 250 255

Lys Lys Pro Arg Leu Glu Ser His Ser Ser Ser Met Leu Pro Ser Phe

260 265 270

Lys Val Arg Lys Glu Lys Leu Gly Asp Arg Ile Ala Ala Leu Gln Gln

275 280 285

Leu Val Ser Pro Phe Gly Lys Thr Asp Thr Ala Ser Val Leu Met Glu

290 295 300

Ala Ile Gly Tyr Ile Lys Phe Leu Gln Asp Gln Val Glu Thr Leu Ser

305 310 315 320

Gly Pro Tyr Leu Arg Ser Ser Lys Asn Ser Lys Lys Leu Ala Cys Arg

325 330 335

Ala Ala Gln Gln Gln Arg Lys Gly Thr Ser Asn Gly Gly Asp Ala Ala

340 345 350

Ala Lys Leu Asp Leu Arg Ser Arg Gly Leu Cys Leu Val Pro Leu Ser

355 360 365

Cys Thr Ser Tyr Val Thr Asn Glu Asn Gly Val Trp Pro Pro Pro Asn

370 375 380

Phe Arg Gly Asn

385

<210>18

<211>1362

<212>DNA

<213>拟南芥

<400>18

atggactctg ctaatctcca tcagcttcaa gatcaattac agcttgtggg gtcttcttca 60

tcttcttctt ccttagacaa taactctgac ccttcttgct atggagcttc atctgcccat 120

caatggagcc caggaggtat ttctttgaat agtgtgagct tgagtcataa ttataacaat 180

gagatgttaa acacaagagc tcacaacaac aacaacaaca acaacacaag tgaatgtatg 240

agtctctcca gcatccacaa tcactccttg atccaacaac aagactttcc tttacaatgg 300

cctcatgacc aatcttcata tcaacatcat gaaggacttc tcaagatcaa agaagagctt 360

tcctcatcaa ctatctcaga ccatcaagaa ggcatatcca agttcacaga catgttaaat 420

agtccagtga taacaaacta tttgaagatc aatgaacata aggactacac tgagaagctt 480

cttctcaaga gtatgtcttc tggattcccg atcaatggag actatggtag cagccttccc 540

tcttcttctt cttcctcttc accttcgtct cagtcgcata gaggcaactt cagtcagatt 600

tacccaagcg taaacatatc gagtttgagc gaatctcgga agatgagcat ggacgacatg 660

agtaacatct caagaccatt tgatataaac atgcaggttt ttgatggaag attgtttgaa 720

ggaaatgtat tagttcctcc ttttaacgct caagagatta gtagtcttgg gatgagcaga 780

ggaagccttc cttcttttgg cctccctttt catcatcatc tgcagcaaac acttccccac 840

ctttcttctt cccctactca tcaaatggaa atgttcagca atgaacctca aacaagtgaa 900

gggaagaggc ataacttctt gatggcaaca aaagcaggag aaaatgcttc caagaaaccg 960

cgcgtggaat cacgctcctc ttgcccaccc ttcaaggtga ggaaagaaaa gttaggagac 1020

agaatagcag ctctgcagca gttggtttca ccctttggga agacagatac agcatctgtg 1080

ttaatggaag caattggata catcaaattc ctacagagcc agatcgagac tttaagcgtc 1140

ccctacatga gagcatctag gaaccgaccc ggaaaagcct cccagctggt ctcacaatca 1200

caagaagggg atgaggaaga gacgagagat cttagaagcc gtgggctatg tctagtgccg 1260

ttatcatgca tgacttatgt taccggagat ggtggggatg gaggaggcgg tgttggtact 1320

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<210>19

<211>453

<212>PRT

<213>拟南芥

<400>19

Met Asp Ser Ala Asn Leu His Gln Leu Gln Asp Gln Leu Gln Leu Val

1 5 10 15

Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Leu Asp Asn Asn Ser Asp Pro Ser

20 25 30

Cys Tyr Gly Ala Ser Ser Ala His Gln Trp Ser Pro Gly Gly Ile Ser

35 40 45

Leu Asn Ser Val Ser Leu Ser His Asn Tyr Asn Asn Glu Met Leu Asn

50 55 60

Thr Arg Ala His Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Thr Ser Glu Cys Met

65 70 75 80

Ser Leu Ser Ser Ile His Asn His Ser Leu Ile Gln Gln Gln Asp Phe

85 90 95

Pro Leu Gln Trp Pro His Asp Gln Ser Ser Tyr Gln His His Glu Gly

100 105 110

Leu Leu Lys Ile Lys Glu Glu Leu Ser Ser Ser Thr Ile Ser Asp His

115 120 125

Gln Glu Gly Ile Ser Lys Phe Thr Asp Met Leu Asn Ser Pro Val Ile

130 135 140

Thr Asn Tyr Leu Lys Ile Asn Glu His Lys Asp Tyr Thr Glu Lys Leu

145 150 155 160

Leu Leu Lys Ser Met Ser Ser Gly Phe Pro Ile Asn Gly Asp Tyr Gly

165 170 175

Ser Ser Leu Pro Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Pro Ser Ser Gln Ser

180 185 190

His Arg Gly Asn Phe Ser Gln Ile Tyr Pro Ser Val Asn Ile Ser Ser

195 200 205

Leu Ser Glu Ser Arg Lys Met Ser Met Asp Asp Met Ser Asn Ile Ser

210 215 220

Arg Pro Phe Asp Ile Asn Met Gln Val Phe Asp Gly Arg Leu Phe Glu

225 230 235 240

Gly Asn Val Leu Val Pro Pro Phe Asn Ala Gln Glu Ile Ser Ser Leu

245 250 255

Gly Met Ser Arg Gly Ser Leu Pro Ser Phe Gly Leu Pro Phe His His

260 265 270

His Leu Gln Gln Thr Leu Pro His Leu Ser Ser Ser Pro Thr His Gln

275 280 285

Met Glu Met Phe Ser Asn Glu Pro Gln Thr Ser Glu Gly Lys Arg His

290 295 300

Asn Phe Leu Met Ala Thr Lys Ala Gly Glu Asn Ala Ser Lys Lys Pro

305 310 315 320

Arg Val Glu Ser Arg Ser Ser Cys Pro Pro Phe Lys Val Arg Lys Glu

325 330 335

Lys Leu Gly Asp Arg Ile Ala Ala Leu Gln Gln Leu Val Ser Pro Phe

340 345 350

Gly Lys Thr Asp Thr Ala Ser Val Leu Met Glu Ala Ile Gly Tyr Ile

355 360 365

Lys Phe Leu Gln Ser Gln Ile Glu Thr Leu Ser Val Pro Tyr Met Arg

370 375 380

Ala Ser Arg Asn Arg Pro Gly Lys Ala Ser Gln Leu Val Ser Gln Ser

385 390 395 400

Gln Glu Gly Asp Glu Glu Glu Thr Arg Asp Leu Arg Ser Arg Gly Leu

405 410 415

Cys Leu Val Pro Leu Ser Cys Met Thr Tyr Val Thr Gly Asp Gly Gly

420 425 430

Asp Gly Gly Gly Gly Val Gly Thr Gly Phe Trp Pro Thr Pro Pro Gly

435 440 445

Phe Gly Gly Gly Thr

450

<210>20

<211>1759

<212>DNA

<213>玉米

<400>20

cgctactagc tagtgcgact ttttctttct ctccccctct tggaagtagc atcgatcgat 60

taaggccgcc tttacaacca ccatgatggc ggcttcgtca tcgtcctcca acctcagtga 120

tcacctcgcg caagatgacc tcctcccatg gccttcttct tcttcctcct ccctgccatt 180

tgctcctgct gctccccatc acagcgccat tattggaggc aacagccagc aacctctagc 240

gctaaactgc gctgaccggc atcactccga cgagcttgag gtgctcctct cagcacaagg 300

cagccaccac caccagagcc acagccacag gcacagccac cctgcttctc cggtgatccc 360

tccgcagctc agcagctctc tgctaacgat gcaagaccta gggttccaat ggagcaactg 420

cggcggcggc ttcctagaca cctcaccgtc cacgccgccg acgaacgggc agctgcagca 480

cgatggccac gacgacgaca agatcgaggc ggagggcacg cttattacta actcgtcaag 540

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gacgcacacg caggcgcagc agcagcagcg accgttcctg gcggcgccgc cgcctctccc 720

gggcgacgcg ttcgagatac tactggcctc gtcgaggctg tgcaagaccc tgctgcttag 780

ccaagctgct gcttcttctt cttcttcttc ggtgctgctc cacgacgacg gcacgatcag 840

cacggtgcct tcgctgagat cggagtcgga gcatgtggcc tatggctatg gcggcggccc 900

tcctcctcct gctcctgccg ctgctcatcg tccccgagga cgacgaccat ccgttgacaa 960

ctacaagcag cagatgggcg ccgccgcctg tgccgcggga gcaggccgcc agtggagcgc 1020

ggagcacgga gggcgagccg ccgcctgtga agaaagggcg gcagcggcac cagcacgccg 1080

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ctccggctcc tccaccacca tcctcccttc tttcgaggta cggaaagaga agttagggga 1200

ccggatcgct gccctccagc agctcgtctc gccattcggc aagaccgata ccgcgtctgt 1260

gctcatggag gccattggct acatcaagtt cctccaagac caagtcgaga ctttgagccg 1320

cccctacttg aagtcgtcca gaagtagcaa gaagcccagg ccgacgcacc agcgggggtg 1380

ttggaacgcc agcgctgcag gggaggagca ggagcaggag gagacgacga cgaggaggcg 1440

gcggcctgac ctccgcagca gagggctctg cctcgtgccc ctctcctgca cgtcctacgt 1500

caccaacgag aacggggcct gggttccttc ccaattttaa ttttagggga gactactagc 1560

tatagagatc agaggagcag agacaacact gtaccacgaa ctaatccacg gttaatatca 1620

cctcacatct ctgctctgct catgttgttg tctgtgtctc tttgccttgg cccttggccg 1680

taaataccag tcagtttcta aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1740

aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 1759

<210>21

<211>485

<212>PRT

<213>玉米

<400>21

Met Met Ala Ala Ser Ser Ser Ser Ser Asn Leu Ser Asp His Leu Ala

1 5 10 15

Gln Asp Asp Leu Leu Pro Trp Pro Ser Ser Ser Ser Ser Ser Leu Pro

20 25 30

Phe Ala Pro Ala Ala Pro His His Ser Ala Ile Ile Gly Gly Asn Ser

35 40 45

Gln Gln Pro Leu Ala Leu Asn Cys Ala Asp Arg His His Ser Asp Glu

50 55 60

Leu Glu Val Leu Leu Ser Ala Gln Gly Ser His His His Gln Ser His

65 70 75 80

Ser His Arg His Ser His Pro Ala Ser Pro Val Ile Pro Pro Gln Leu

85 90 95

Ser Ser Ser Leu Leu Thr Met Gln Asp Leu Gly Phe Gln Trp Ser Asn

100 105 110

Cys Gly Gly Gly Phe Leu Asp Thr Ser Pro Ser Thr Pro Pro Thr Asn

115 120 125

Gly Gln Leu Gln His Asp Gly His Asp Asp Asp Lys Ile Glu Ala Glu

130 135 140

Gly Thr Leu Ile Thr Asn Ser Ser Arg Pro Ser Cys Ala Gly Thr Ala

145 150 155 160

Thr Ile Ala Ala Ser Cys His Asp Val Val Leu His Gly Gly Gly Gly

165 170 175

Gly Gly Thr Val Leu Pro Thr Ile Asn Ile Ser Leu Thr Thr Thr Thr

180 185 190

Thr Thr His Thr Gln Ala Gln Gln Gln Gln Arg Pro Phe Leu Ala Ala

195 200 205

Pro Pro Pro Leu Pro Gly Asp Ala Phe Glu Ile Leu Leu Ala Ser Ser

210 215 220

Arg Leu Cys Lys Thr Leu Leu Leu Ser Gln Ala Ala Ala Ser Ser Ser

225 230 235 240

Ser Ser Ser Val Leu Leu His Asp Asp Gly Thr Ile Ser Thr Val Pro

245 250 255

Ser Leu Arg Ser Glu Ser Glu His Val Ala Tyr Gly Tyr Gly Gly Gly

260 265 270

Pro Pro Pro Pro Ala Pro Ala Ala Ala His Arg Pro Arg Gly Arg Arg

275 280 285

Pro Ser Val Asp Asn Tyr Lys Gln Gln Met Gly Ala Ala Ala Cys Ala

290 295 300

Ala Gly Ala Gly Arg Gln Trp Ser Ala Glu His Gly Gly Arg Ala Ala

305 310 315 320

Ala Cys Glu Glu Arg Ala Ala Ala Ala Pro Ala Arg Arg Pro Val Val

325 330 335

Val Pro Trp Lys Lys Pro Arg Leu Glu Gln Arg Ser Gly Ser Gly Ser

340 345 350

Gly Ser Gly Ser Ser Thr Thr Ile Leu Pro Ser Phe Glu Val Arg Lys

355 360 365

Glu Lys Leu Gly Asp Arg Ile Ala Ala Leu Gln Gln Leu Val Ser Pro

370 375 380

Phe Gly Lys Thr Asp Thr Ala Ser Val Leu Met Glu Ala Ile Gly Tyr

385 390 395 400

Ile Lys Phe Leu Gln Asp Gln Val Glu Thr Leu Ser Arg Pro Tyr Leu

405 410 415

Lys Ser Ser Arg Ser Ser Lys Lys Pro Arg Pro Thr His Gln Arg Gly

420 425 430

Cys Trp Asn Ala Ser Ala Ala Gly Glu Glu Gln Glu Gln Glu Glu Thr

435 440 445

Thr Thr Arg Arg Arg Arg Pro Asp Leu Arg Ser Arg Gly Leu Cys Leu

450 455 460

Val Pro Leu Ser Cys Thr Ser Tyr Val Thr Asn Glu Asn Gly Ala Trp

465 470 475 480

Val Pro Ser Gln Phe

485

<210>22

<211>47

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>基序I

<400>22

Val Arg Lys Glu Lys Leu Gly Asp Arg Ile Ala Ala Leu Gln Gln Leu

1 5 10 15

Val Ser Pro Phe Gly Lys Thr Asp Thr Ala Ser Val Leu Met Glu Ala

20 25 30

Ile Gly Tyr Ile Lys Phe Leu Gln Ser Gln Ile Glu Thr Leu Ser

35 40 45

<210>23

<211>14

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>基序II

<400>23

Asp Leu Arg Ser Arg Gly Leu Cys Leu Val Pro Leu Ser Cys

1 5 10

<210>24

<211>29

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>attB1重组位点

<400>24

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggct 29

<210>25

<211>29

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>attB2重组位点

<400>25

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggt 29

<210>26

<211>54

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物

<400>26

ttaaacaagt ttgtacaaaa aagcaggctg caattaaccc tcactaaagg gaac 54

<210>27

<211>53

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>引物

<400>27

ttaaaccact ttgtacaaga aagctgggtg cgtaatacga ctcactatag ggc 53

<210>28

<211>4291

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>载体

<400>28

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agatggtatt agtgacctgt agtcgaccga cagccttcca aatgttcttc gggtgatgct 840

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caagtcgttc ggcttcatct ggattttcag cctctatact tactaaacgt gataaagttt 1140

ctgtaatttc tactgtatcg acctgcagac tggctgtgta taagggagcc tgacatttat 1200

attccccaga acatcaggtt aatggcgttt ttgatgtcat tttcgcggtg gctgagatca 1260

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aactggtgaa actcacccag ggattggctg agacgaaaaa catattctca ataaaccctt 2100

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atactgttct tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt caagaactct gtagcaccgc 3840

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<210>29

<211>4762

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>载体

<400>29

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taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga 120

gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca 180

cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaata cgcgtaccgc 240

tagccaggaa gagtttgtag aaacgcaaaa aggccatccg tcaggatggc cttctgctta 300

gtttgatgcc tggcagttta tggcgggcgt cctgcccgcc accctccggg ccgttgcttc 360

acaacgttca aatccgctcc cggcggattt gtcctactca ggagagcgtt caccgacaaa 420

caacagataa aacgaaaggc ccagtcttcc gactgagcct ttcgttttat ttgatgcctg 480

gcagttccct actctcgcgt taacgctagc atggatgttt tcccagtcac gacgttgtaa 540

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agctgaacga gaaacgtaaa atgatataaa tatcaatata ttaaattaga ttttgcataa 720

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agatggtatt agtgacctgt agtcgaccga cagccttcca aatgttcttc gggtgatgct 840

gccaacttag tcgaccgaca gccttccaaa tgttcttctc aaacggaatc gtcgtatcca 900

gcctactcgc tattgtcctc aatgccgtat taaatcataa aaagaaataa gaaaaagagg 960

tgcgagcctc ttttttgtgt gacaaaataa aaacatctac ctattcatat acgctagtgt 1020

catagtcctg aaaatcatct gcatcaagaa caatttcaca actcttatac ttttctctta 1080

caagtcgttc ggcttcatct ggattttcag cctctatact tactaaacgt gataaagttt 1140

ctgtaatttc tactgtatcg acctgcagac tggctgtgta taagggagcc tgacatttat 1200

attccccaga acatcaggtt aatggcgttt ttgatgtcat tttcgcggtg gctgagatca 1260

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agacgtgcac tggccagggg gatcaccatc cgtcgcccgg gcgtgtcaat aatatcactc 1440

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atttcaccag cccctgttct cgtcagcaaa agagccgttc atttcaataa accgggcgac 1560

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attctgcatg gttgtgctta ccagaccgga gatattgaca tcatatatgc cttgagcaac 1680

tgatagctgt cgctgtcaac tgtcactgta atacgctgct tcatagcata cctctttttg 1740

acatacttcg ggtatacata tcagtatata ttcttatacc gcaaaaatca gcgcgcaaat 1800

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attgggatat atcaacggtg gtatatccag tgattttttt ctccatttta gcttccttag 2520

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gttgcaacga acaggtcact atcagtcaaa ataaaatcat tatttgccat ccagctgata 3000

tcccctatag tgagtcgtat tacatggtca tagctgtttc ctggcagctc tggcccgtgt 3060

ctcaaaatct ctgatgttac attgcacaag ataaaataat atcatcatga acaataaaac 3120

tgtctgctta cataaacagt aatacaaggg gtgttatgag ccatattcaa cgggaaacgt 3180

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aggcgcaatc acgaatgaat aacggtttgg ttgatgcgag tgattttgat gacgagcgta 3660

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attcagtcgt cactcatggt gatttctcac ttgataacct tatttttgac gaggggaaat 3780

taataggttg tattgatgtt ggacgagtcg gaatcgcaga ccgataccag gatcttgcca 3840

tcctatggaa ctgcctcggt gagttttctc cttcattaca gaaacggctt tttcaaaaat 3900

atggtattga taatcctgat atgaataaat tgcagtttca tttgatgctc gatgagtttt 3960

tctaatcaga attggttaat tggttgtaac actggcagag cattacgctg acttgacggg 4020

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cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct 4140

gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc 4200

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attaggcacc ccaggcttta cactttatgc ttccggctcg tataatgtgt ggattttgag 1200

ttaggatccg tcgagatttt caggagctaa ggaagctaaa atggagaaaa aaatcactgg 1260

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attacaacag tactgcgatg agtggcaggg cggggcgtaa agatctggat ccggcttact 1920

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ggtcgaccat agtgactgga tatgttgtgt tttacagtat tatgtagtct gttttttatg 2640

caaaatctaa tttaatatat tgatatttat atcattttac gtttctcgtt cagctttctt 2700

gtacaaagtg gttgataacc tagacttgtc catcttctgg attggccaac ttaattaatg 2760

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tagtgaacaa attcttccaa ctgatctgcg cgcgaggcca agcgatcttc ttgtccaaga 7980

taagcctgcc tagcttcaag tatgacgggc tgatactggg ccggcaggcg ctccattgcc 8040

cagtcggcag cgacatcctt cggcgcgatt ttgccggtta ctgcgctgta ccaaatgcgg 8100

gacaacgtaa gcactacatt tcgctcatcg ccagcccagt cgggcggcga gttccatagc 8160

gttaaggttt catttagcgc ctcaaataga tcctgttcag gaaccggatc aaagagttcc 8220

tccgccgctg gacctaccaa ggcaacgcta tgttctcttg cttttgtcag caagatagcc 8280

agatcaatgt cgatcgtggc tggctcgaag atacctgcaa gaatgtcatt gcgctgccat 8340

tctccaaatt gcagttcgcg cttagctgga taacgccacg gaatgatgtc gtcgtgcaca 8400

acaatggtga cttctacagc gcggagaatc tcgctctctc caggggaagc cgaagtttcc 8460

aaaaggtcgt tgatcaaagc tcgccgcgtt gtttcatcaa gccttacagt caccgtaacc 8520

agcaaatcaa tatcactgtg tggcttcagg ccgccatcca ctgcggagcc gtacaaatgt 8580

acggccagca acgtcggttc gagatggcgc tcgatgacgc caactacctc tgatagttga 8640

gtcgatactt cggcgatcac cgcttccctc atgatgttta actcctgaat taagccgcgc 8700

cgcgaagcgg tgtcggcttg aatgaattgt taggcgtcat cctgtgctcc cgagaaccag 8760

taccagtaca tcgctgtttc gttcgagact tgaggtctag ttttatacgt gaacaggtca 8820

atgccgccga gagtaaagcc acattttgcg tacaaattgc aggcaggtac attgttcgtt 8880

tgtgtctcta atcgtatgcc aaggagctgt ctgcttagtg cccacttttt cgcaaattcg 8940

atgagactgt gcgcgactcc tttgcctcgg tgcgtgtgcg acacaacaat gtgttcgata 9000

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taggggctca cacttctggt agatagttca aagccttggt cggataggtg cacatcgaac 9180

acttcacgaa caatgaaatg gttctcagca tccaatgttt ccgccacctg ctcagggatc 9240

accgaaatct tcatatgacg cctaacgcct ggcacagcgg atcgcaaacc tggcgcggct 9300

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attgctgggg atttcaggaa agtaaacatc accttccggc tcgatgtcta ttgtagatat 9480

atgtagtgta tctacttgat cgggggatct gctgcctcgc gcgtttcggt gatgacggtg 9540

aaaacctctg acacatgcag ctcccggaga cggtcacagc ttgtctgtaa gcggatgccg 9600

ggagcagaca agcccgtcag ggcgcgtcag cgggtgttgg cgggtgtcgg ggcgcagcca 9660

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gattgtactg agagtgcacc atatgcggtg tgaaataccg cacagatgcg taaggagaaa 9780

ataccgcatc aggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg 9840

gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg 9900

ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa 9960

ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg 10020

acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc 10080

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ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc 10200

ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg 10260

ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc 10320

actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga 10380

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caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg 10560

atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc 10620

acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa 10680

ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag taaacttggt ctgacagtta 10740

ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt 10800

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tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca gttaatagtt tgcgcaacgt 11040

tgttgccatt gctgcagggg gggggggggg gggggacttc cattgttcat tccacggaca 11100

aaaacagaga aaggaaacga cagaggccaa aaagcctcgc tttcagcacc tgtcgtttcc 11160

tttcttttca gagggtattt taaataaaaa cattaagtta tgacgaagaa gaacggaaac 11220

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tacctgtcgg atcaccggaa aggacccgta aagtgataat gattatcatc tacatatcac 11340

aacgtgcgtg gaggccatca aaccacgtca aataatcaat tatgacgcag gtatcgtatt 11400

aattgatctg catcaactta acgtaaaaac aacttcagac aatacaaatc agcgacactg 11460

aatacggggc aacctcatgt cccccccccc cccccccctg caggcatcgt ggtgtcacgc 11520

tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga 11580

tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt 11640

aagttggccg cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc 11700

atgccatccg taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa 11760

tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa cacgggataa taccgcgcca 11820

catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca 11880

aggatcttac cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct 11940

tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc 12000

gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa 12060

tattattgaa gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt 12120

tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc acctgacgtc 12180

taagaaacca ttattatcat gacattaacc tataaaaata ggcgtatcac gaggcccttt 12240

cgtcttcaag aattcggagc ttttgccatt ctcaccggat tcagtcgtca ctcatggtga 12300

tttctcactt gataacctta tttttgacga ggggaaatta ataggttgta ttgatgttgg 12360

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gttttctcct tcattacaga aacggctttt tcaaaaatat ggtattgata atcctgatat 12480

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gttgtaacac tggcagagca ttacgctgac ttgacgggac ggcggctttg ttgaataaat 12600

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cgtggctccc tcactttctg gctggatgat ggggcgattc aggcctggta tgagtcagca 12780

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cgtgaggctt ggacgctagg gcagggcatg aaaaagcccg tagcgggctg ctacgggcgt 12900

ctgacgcggt ggaaaggggg aggggatgtt gtctacatgg ctctgctgta gtgagtgggt 12960

tgcgctccgg cagcggtcct gatcaatcgt caccctttct cggtccttca acgttcctga 13020

caacgagcct ccttttcgcc aatccatcga caatcaccgc gagtccctgc tcgaacgctg 13080

cgtccggacc ggcttcgtcg aaggcgtcta tcgcggcccg caacagcggc gagagcggag 13140

cctgttcaac ggtgccgccg cgctcgccgg catcgctgtc gccggcctgc tcctcaagca 13200

cggccccaac agtgaagtag ctgattgtca tcagcgcatt gacggcgtcc ccggccgaaa 13260

aacccgcctc gcagaggaag cgaagctgcg cgtcggccgt ttccatctgc ggtgcgcccg 13320

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tatgattctc cgccagcatg gcttcggcca gtgcgtcgag cagcgcccgc ttgttcctga 13500

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gaccgtctac gccgacctcg ttcaacaggt ccagggcggc acggatcact gtattcggct 13620

gcaactttgt catgcttgac actttatcac tgataaacat aatatgtcca ccaacttatc 13680

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cggcctgatt atgccggtgc tgccgggcct cctgcgcgat ctggttcact cgaacgacgt 13860

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cggcgccact gtcgactacg ccatcatggc gacagcgcct ttcctttggg ttctctatat 14040

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cgatatcact gatggcgatg agcgcgcgcg gcacttcggc ttcatgagcg cctgtttcgg 14160

gttcgggatg gtcgcgggac ctgtgctcgg tgggctgatg ggcggtttct ccccccacgc 14220

tccgttcttc gccgcggcag ccttgaacgg cctcaatttc ctgacgggct gtttcctttt 14280

gccggagtcg cacaaaggcg aacgccggcc gttacgccgg gaggctctca acccgctcgc 14340

ttcgttccgg tgggcccggg gcatgaccgt cgtcgccgcc ctgatggcgg tcttcttcat 14400

catgcaactt gtcggacagg tgccggccgc gctttgggtc attttcggcg aggatcgctt 14460

tcactgggac gcgaccacga tcggcatttc gcttgccgca tttggcattc tgcattcact 14520

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gctcggaatg attgccgacg gcacaggcta catcctgctt gccttcgcga cacggggatg 14640

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ttctataaca acgtggaacg ggtgggcatg gattgcaggc gctgccctct acttgctctg 14880

cctgccggcg ctgcgtcgcg ggctttggag cggcgcaggg caacgagccg atcgctgatc 14940

gtggaaacga taggcctatg ccatgcgggt caaggcgact tccggcaagc tatacgcgcc 15000

ctaggagtgc ggttggaacg ttggcccagc cagatactcc cgatcacgag caggacgccg 15060

atgatttgaa gcgcactcag cgtctgatcc aagaacaacc atcctagcaa cacggcggtc 15120

cccgggctga gaaagcccag taaggaaaca actgtaggtt cgagtcgcga gatcccccgg 15180

aaccaaagga agtaggttaa acccgctccg atcaggccga gccacgccag gccgagaaca 15240

ttggttcctg taggcatcgg gattggcgga tcaaacacta aagctactgg aacgagcaga 15300

agtcctccgg ccgccagttg ccaggcggta aaggtgagca gaggcacggg aggttgccac 15360

ttgcgggtca gcacggttcc gaacgccatg gaaaccgccc ccgccaggcc cgctgcgacg 15420

ccgacaggat ctagcgctgc gtttggtgtc aacaccaaca gcgccacgcc cgcagttccg 15480

caaatagccc ccaggaccgc catcaatcgt atcgggctac ctagcagagc ggcagagatg 15540

aacacgacca tcagcggctg cacagcgcct accgtcgccg cgaccccgcc cggcaggcgg 15600

tagaccgaaa taaacaacaa gctccagaat agcgaaatat taagtgcgcc gaggatgaag 15660

atgcgcatcc accagattcc cgttggaatc tgtcggacga tcatcacgag caataaaccc 15720

gccggcaacg cccgcagcag cataccggcg acccctcggc ctcgctgttc gggctccacg 15780

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tcagcgaacg cctccatggg ctttttctcc tcgtgctcgt aaacggaccc gaacatctct 15960

ggagctttct tcagggccga caatcggatc tcgcggaaat cctgcacgtc ggccgctcca 16020

agccgtcgaa tctgagcctt aatcacaatt gtcaatttta atcctctgtt tatcggcagt 16080

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tgatcttcac gtccttgttg acgtggaaaa tgaccttgtt ttgcagcgcc tcgcgcggga 16860

ttttcttgtt gcgcgtggtg aacagggcag agcgggccgt gtcgtttggc atcgctcgca 16920

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taaggccaac ccctcgttga aggtgatgga ggccattgcc gacgccctgg aaactcccct 18060

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caccaaggaa agtctacacg aaccctttgg caaaatcctg tatatcgtgc gaaaaaggat 21360

ggatataccg aaaaaatcgc tataatgacc ccgaagcagg gttatgcagc ggaaaagcgc 21420

tgcttccctg ctgttttgtg gaatatctac cgactggaaa caggcaaatg caggaaatta 21480

ctgaactgag gggacaggcg agagacgatg ccaaagagct acaccgacga gctggccgag 21540

tgggttgaat cccgcgcggc caagaagcgc cggcgtgatg aggctgcggt tgcgttcctg 21600

gcggtgaggg cggatgtcga ggcggcgtta gcgtccggct atgcgctcgt caccatttgg 21660

gagcacatgc gggaaacggg gaaggtcaag ttctcctacg agacgttccg ctcgcacgcc 21720

aggcggcaca tcaaggccaa gcccgccgat gtgcccgcac cgcaggccaa ggctgcggaa 21780

cccgcgccgg cacccaagac gccggagcca cggcggccga agcagggggg caaggctgaa 21840

aagccggccc ccgctgcggc cccgaccggc ttcaccttca acccaacacc ggacaaaaag 21900

gatctactgt aatggcgaaa attcacatgg ttttgcaggg caagggcggg gtcggcaagt 21960

cggccatcgc cgcgatcatt gcgcagtaca agatggacaa ggggcagaca cccttgtgca 22020

tcgacaccga cccggtgaac gcgacgttcg agggctacaa ggccctgaac gtccgccggc 22080

tgaacatcat ggccggcgac gaaattaact cgcgcaactt cgacaccctg gtcgagctga 22140

ttgcgccgac caaggatgac gtggtgatcg acaacggtgc cagctcgttc gtgcctctgt 22200

cgcattacct catcagcaac caggtgccgg ctctgctgca agaaatgggg catgagctgg 22260

tcatccatac cgtcgtcacc ggcggccagg ctctcctgga cacggtgagc ggcttcgccc 22320

agctcgccag ccagttcccg gccgaagcgc ttttcgtggt ctggctgaac ccgtattggg 22380

ggcctatcga gcatgagggc aagagctttg agcagatgaa ggcgtacacg gccaacaagg 22440

cccgcgtgtc gtccatcatc cagattccgg ccctcaagga agaaacctac ggccgcgatt 22500

tcagcgacat gctgcaagag cggctgacgt tcgaccaggc gctggccgat gaatcgctca 22560

cgatcatgac gcggcaacgc ctcaagatcg tgcggcgcgg cctgtttgaa cagctcgacg 22620

cggcggccgt gctatgagcg accagattga agagctgatc cgggagattg cggccaagca 22680

cggcatcgcc gtcggccgcg acgacccggt gctgatcctg cataccatca acgcccggct 22740

catggccgac agtgcggcca agcaagagga aatccttgcc gcgttcaagg aagagctgga 22800

agggatcgcc catcgttggg gcgaggacgc caaggccaaa gcggagcgga tgctgaacgc 22860

ggccctggcg gccagcaagg acgcaatggc gaaggtaatg aaggacagcg ccgcgcaggc 22920

ggccgaagcg atccgcaggg aaatcgacga cggccttggc cgccagctcg cggccaaggt 22980

cgcggacgcg cggcgcgtgg cgatgatgaa catgatcgcc ggcggcatgg tgttgttcgc 23040

ggccgccctg gtggtgtggg cctcgttatg aatcgcagag gcgcagatga aaaagcccgg 23100

cgttgccggg ctttgttttt gcgttagctg ggcttgtttg acaggcccaa gctctgactg 23160

cgcccgcgct cgcgctcctg ggcctgtttc ttctcctgct cctgcttgcg catcagggcc 23220

tggtgccgtc gggctgcttc acgcatcgaa tcccagtcgc cggccagctc gggatgctcc 23280

gcgcgcatct tgcgcgtcgc cagttcctcg atcttgggcg cgtgaatgcc catgccttcc 23340

ttgatttcgc gcaccatgtc cagccgcgtg tgcagggtct gcaagcgggc ttgctgttgg 23400

gcctgctgct gctgccaggc ggcctttgta cgcggcaggg acagcaagcc gggggcattg 23460

gactgtagct gctgcaaacg cgcctgctga cggtctacga gctgttctag gcggtcctcg 23520

atgcgctcca cctggtcatg ctttgcctgc acgtagagcg caagggtctg ctggtaggtc 23580

tgctcgatgg gcgcggattc taagagggcc tgctgttccg tctcggcctc ctgggccgcc 23640

tgtagcaaat cctcgccgct gttgccgctg gactgcttta ctgccgggga ctgctgttgc 23700

cctgctcgcg ccgtcgtcgc agttcggctt gcccccactc gattgactgc ttcatttcga 23760

gccgcagcga tgcgatctcg gattgcgtca acggacgggg cagcgcggag gtgtccggct 23820

tctccttggg tgagtcggtc gatgccatag ccaaaggttt ccttccaaaa tgcgtccatt 23880

gctggaccgt gtttctcatt gatgcccgca agcatcttcg gcttgaccgc caggtcaagc 23940

gcgccttcat gggcggtcat gacggacgcc gccatgacct tgccgccgtt gttctcgatg 24000

tagccgcgta atgaggcaat ggtgccgccc atcgtcagcg tgtcatcgac aacgatgtac 24060

ttctggccgg ggatcacctc cccctcgaaa gtcgggttga acgccaggcg atgatctgaa 24120

ccggctccgg ttcgggcgac cttctcccgc tgcacaatgt ccgtttcgac ctcaaggcca 24180

aggcggtcgg ccagaacgac cgccatcatg gccggaatct tgttgttccc cgccgcctcg 24240

acggcgagga ctggaacgat gcggggcttg tcgtcgccga tcagcgtctt gagctgggca 24300

acagtgtcgt ccgaaatcag gcgctcgacc aaattaagcg ccgcttccgc gtcgccctgc 24360

ttcgcagcct ggtattcagg ctcgttggtc aaagaaccaa ggtcgccgtt gcgaaccacc 24420

ttcgggaagt ctccccacgg tgcgcgctcg gctctgctgt agctgctcaa gacgcctccc 24480

tttttagccg ctaaaactct aacgagtgcg cccgcgactc aacttgacgc tttcggcact 24540

tacctgtgcc ttgccacttg cgtcataggt gatgcttttc gcactcccga tttcaggtac 24600

tttatcgaaa tctgaccggg cgtgcattac aaagttcttc cccacctgtt ggtaaatgct 24660

gccgctatct gcgtggacga tgctgccgtc gtggcgctgc gacttatcgg ccttttgggc 24720

catatagatg ttgtaaatgc caggtttcag ggccccggct ttatctacct tctggttcgt 24780

ccatgcgcct tggttctcgg tctggacaat tctttgccca ttcatgacca ggaggcggtg 24840

tttcattggg tgactcctga cggttgcctc tggtgttaaa cgtgtcctgg tcgcttgccg 24900

gctaaaaaaa agccgacctc ggcagttcga ggccggcttt ccctagagcc gggcgcgtca 24960

aggttgttcc atctatttta gtgaactgcg ttcgatttat cagttacttt cctcccgctt 25020

tgtgtttcct cccactcgtt tccgcgtcta gccgacccct caacatagcg gcctcttctt 25080

gggctgcctt tgcctcttgc cgcgcttcgt cacgctcggc ttgcaccgtc gtaaagcgct 25140

cggcctgcct ggccgcctct tgcgccgcca acttcctttg ctcctggtgg gcctcggcgt 25200

cggcctgcgc cttcgctttc accgctgcca actccgtgcg caaactctcc gcttcgcgcc 25260

tggtggcgtc gcgctcgccg cgaagcgcct gcatttcctg gttggccgcg tccagggtct 25320

tgcggctctc ttctttgaat gcgcgggcgt cctggtgagc gtagtccagc tcggcgcgca 25380

gctcctgcgc tcgacgctcc acctcgtcgg cccgctgcgt cgccagcgcg gcccgctgct 25440

cggctcctgc cagggcggtg cgtgcttcgg ccagggcttg ccgctggcgt gcggccagct 25500

cggccgcctc ggcggcctgc tgctctagca atgtaacgcg cgcctgggct tcttccagct 25560

cgcgggcctg cgcctcgaag gcgtcggcca gctccccgcg cacggcttcc aactcgttgc 25620

gctcacgatc ccagccggct tgcgctgcct gcaacgattc attggcaagg gcctgggcgg 25680

cttgccagag ggcggccacg gcctggttgc cggcctgctg caccgcgtcc ggcacctgga 25740

ctgccagcgg ggcggcctgc gccgtgcgct ggcgtcgcca ttcgcgcatg ccggcgctgg 25800

cgtcgttcat gttgacgcgg gcggccttac gcactgcatc cacggtcggg aagttctccc 25860

ggtcgccttg ctcgaacagc tcgtccgcag ccgcaaaaat gcggtcgcgc gtctctttgt 25920

tcagttccat gttggctccg gtaattggta agaataataa tactcttacc taccttatca 25980

gcgcaagagt ttagctgaac agttctcgac ttaacggcag gttttttagc ggctgaaggg 26040

caggcaaaaa aagccccgca cggtcggcgg gggcaaaggg tcagcgggaa ggggattagc 26100

gggcgtcggg cttcttcatg cgtcggggcc gcgcttcttg ggatggagca cgacgaagcg 26160

cgcacgcgca tcgtcctcgg ccctatcggc ccgcgtcgcg gtcaggaact tgtcgcgcgc 26220

taggtcctcc ctggtgggca ccaggggcat gaactcggcc tgctcgatgt aggtccactc 26280

catgaccgca tcgcagtcga ggccgcgttc cttcaccgtc tcttgcaggt cgcggtacgc 26340

ccgctcgttg agcggctggt aacgggccaa ttggtcgtaa atggctgtcg gccatgagcg 26400

gcctttcctg ttgagccagc agccgacgac gaagccggca atgcaggccc ctggcacaac 26460

caggccgacg ccgggggcag gggatggcag cagctcgcca accaggaacc ccgccgcgat 26520

gatgccgatg ccggtcaacc agcccttgaa actatccggc cccgaaacac ccctgcgcat 26580

tgcctggatg ctgcgccgga tagcttgcaa catcaggagc cgtttctttt gttcgtcagt 26640

catggtccgc cctcaccagt tgttcgtatc ggtgtcggac gaactgaaat cgcaagagct 26700

gccggtatcg gtccagccgc tgtccgtgtc gctgctgccg aagcacggcg aggggtccgc 26760

gaacgccgca gacggcgtat ccggccgcag cgcatcgccc agcatggccc cggtcagcga 26820

gccgccggcc aggtagccca gcatggtgct gttggtcgcc ccggccacca gggccgacgt 26880

gacgaaatcg ccgtcattcc ctctggattg ttcgctgctc ggcggggcag tgcgccgcgc 26940

cggcggcgtc gtggatggct cgggttggct ggcctgcgac ggccggcgaa aggtgcgcag 27000

cagctcgtta tcgaccggct gcggcgtcgg ggccgccgcc ttgcgctgcg gtcggtgttc 27060

cttcttcggc tcgcgcagct tgaacagcat gatcgcggaa accagcagca acgccgcgcc 27120

tacgcctccc gcgatgtaga acagcatcgg attcattctt cggtcctcct tgtagcggaa 27180

ccgttgtctg tgcggcgcgg gtggcccgcg ccgctgtctt tggggatcag ccctcgatga 27240

gcgcgaccag tttcacgtcg gcaaggttcg cctcgaactc ctggccgtcg tcctcgtact 27300

tcaaccaggc atagccttcc gccggcggcc gacggttgag gataaggcgg gcagggcgct 27360

cgtcgtgctc gacctggacg atggcctttt tcagcttgtc cgggtccggc tccttcgcgc 27420

ccttttcctt ggcgtcctta ccgtcctggt cgccgtcctc gccgtcctgg ccgtcgccgg 27480

cctccgcgtc acgctcggca tcagtctggc cgttgaaggc atcgacggtg ttgggatcgc 27540

ggcccttctc gtccaggaac tcgcgcagca gcttgaccgt gccgcgcgtg atttcctggg 27600

tgtcgtcgtc aagccacgcc tcgacttcct ccgggcgctt cttgaaggcc gtcaccagct 27660

cgttcaccac ggtcacgtcg cgcacgcggc cggtgttgaa cgcatcggcg atcttctccg 27720

gcaggtccag cagcgtgacg tgctgggtga tgaacgccgg cgacttgccg atttccttgg 27780

cgatatcgcc tttcttcttg cccttcgcca gctcgcggcc aatgaagtcg gcaatttcgc 27840

gcggggtcag ctcgttgcgt tgcaggttct cgataacctg gtcggcttcg ttgtagtcgt 27900

tgtcgatgaa cgccgggatg gacttcttgc cggcccactt cgagccacgg tagcggcggg 27960

cgccgtgatt gatgatatag cggcccggct gctcctggtt ctcgcgcacc gaaatgggtg 28020

acttcacccc gcgctctttg atcgtggcac cgatttccgc gatgctctcc ggggaaaagc 28080

cggggttgtc ggccgtccgc ggctgatgcg gatcttcgtc gatcaggtcc aggtccagct 28140

cgatagggcc ggaaccgccc tgagacgccg caggagcgtc caggaggctc gacaggtcgc 28200

cgatgctatc caaccccagg ccggacggct gcgccgcgcc tgcggcttcc tgagcggccg 28260

cagcggtgtt tttcttggtg gtcttggctt gagccgcagt cattgggaaa tctccatctt 28320

cgtgaacacg taatcagcca gggcgcgaac ctctttcgat gccttgcgcg cggccgtttt 28380

cttgatcttc cagaccggca caccggatgc gagggcatcg gcgatgctgc tgcgcaggcc 28440

aacggtggcc ggaatcatca tcttggggta cgcggccagc agctcggctt ggtggcgcgc 28500

gtggcgcgga ttccgcgcat cgaccttgct gggcaccatg ccaaggaatt gcagcttggc 28560

gttcttctgg cgcacgttcg caatggtcgt gaccatcttc ttgatgccct ggatgctgta 28620

cgcctcaagc tcgatggggg acagcacata gtcggccgcg aagagggcgg ccgccaggcc 28680

gacgccaagg gtcggggccg tgtcgatcag gcacacgtcg aagccttggt tcgccagggc 28740

cttgatgttc gccccgaaca gctcgcgggc gtcgtccagc gacagccgtt cggcgttcgc 28800

cagtaccggg ttggactcga tgagggcgag gcgcgcggcc tggccgtcgc cggctgcggg 28860

tgcggtttcg gtccagccgc cggcagggac agcgccgaac agcttgcttg catgcaggcc 28920

ggtagcaaag tccttgagcg tgtaggacgc attgccctgg gggtccaggt cgatcacggc 28980

aacccgcaag ccgcgctcga aaaagtcgaa ggcaagatgc acaagggtcg aagtcttgcc 29040

gacgccgcct ttctggttgg ccgtgaccaa agttttcatc gtttggtttc ctgttttttc 29100

ttggcgtccg cttcccactt ccggacgatg tacgcctgat gttccggcag aaccgccgtt 29160

acccgcgcgt acccctcggg caagttcttg tcctcgaacg cggcccacac gcgatgcacc 29220

gcttgcgaca ctgcgcccct ggtcagtccc agcgacgttg cgaacgtcgc ctgtggcttc 29280

ccatcgacta agacgccccg cgctatctcg atggtctgct gccccacttc cagcccctgg 29340

atcgcctcct ggaactggct ttcggtaagc cgtttcttca tggataacac ccataatttg 29400

ctccgcgcct tggttgaaca tagcggtgac agccgccagc acatgagaga agtttagcta 29460

aacatttctc gcacgtcaac acctttagcc gctaaaactc gtccttggcg taacaaaaca 29520

aaagcccgga aaccgggctt tcgtctcttg ccgcttatgg ctctgcaccc ggctccatca 29580

ccaacaggtc gcgcacgcgc ttcactcggt tgcggatcga cactgccagc ccaacaaagc 29640

cggttgccgc cgccgccagg atcgcgccga tgatgccggc cacaccggcc atcgcccacc 29700

aggtcgccgc cttccggttc cattcctgct ggtactgctt cgcaatgctg gacctcggct 29760

caccataggc tgaccgctcg atggcgtatg ccgcttctcc ccttggcgta aaacccagcg 29820

ccgcaggcgg cattgccatg ctgcccgccg ctttcccgac cacgacgcgc gcaccaggct 29880

tgcggtccag accttcggcc acggcgagct gcgcaaggac ataatcagcc gccgacttgg 29940

ctccacgcgc ctcgatcagc tcttgcactc gcgcgaaatc cttggcctcc acggccgcca 30000

tgaatcgcgc acgcggcgaa ggctccgcag ggccggcgtc gtgatcgccg ccgagaatgc 30060

ccttcaccaa gttcgacgac acgaaaatca tgctgacggc tatcaccatc atgcagacgg 30120

atcgcacgaa cccgctgaat tgaacacgag cacggcaccc gcgaccacta tgccaagaat 30180

gcccaaggta aaaattgccg gccccgccat gaagtccgtg aatgccccga cggccgaagt 30240

gaagggcagg ccgccaccca ggccgccgcc ctcactgccc ggcacctggt cgctgaatgt 30300

cgatgccagc acctgcggca cgtcaatgct tccgggcgtc gcgctcgggc tgatcgccca 30360

tcccgttact gccccgatcc cggcaatggc aaggactgcc agcgctgcca tttttggggt 30420

gaggccgttc gcggccgagg ggcgcagccc ctggggggat gggaggcccg cgttagcggg 30480

ccgggagggt tcgagaaggg ggggcacccc ccttcggcgt gcgcggtcac gcgcacaggg 30540

cgcagccctg gttaaaaaca aggtttataa atattggttt aaaagcaggt taaaagacag 30600

gttagcggtg gccgaaaaac gggcggaaac ccttgcaaat gctggatttt ctgcctgtgg 30660

acagcccctc aaatgtcaat aggtgcgccc ctcatctgtc agcactctgc ccctcaagtg 30720

tcaaggatcg cgcccctcat ctgtcagtag tcgcgcccct caagtgtcaa taccgcaggg 30780

cacttatccc caggcttgtc cacatcatct gtgggaaact cgcgtaaaat caggcgtttt 30840

cgccgatttg cgaggctggc cagctccacg tcgccggccg aaatcgagcc tgcccctcat 30900

ctgtcaacgc cgcgccgggt gagtcggccc ctcaagtgtc aacgtccgcc cctcatctgt 30960

cagtgagggc caagttttcc gcgaggtatc cacaacgccg gcggccgcgg tgtctcgcac 31020

acggcttcga cggcgtttct ggcgcgtttg cagggccata gacggccgcc agcccagcgg 31080

cgagggcaac cagcccggtg agcgtcggaa aggcgctgga agccccgtag cgacgcggag 31140

aggggcgaga caagccaagg gcgcaggctc gatgcgcagc acgacatagc cggttctcgc 31200

aaggacgaga atttccctgc ggtgcccctc aagtgtcaat gaaagtttcc aacgcgagcc 31260

attcgcgaga gccttgagtc cacgctagat gagagctttg ttgtaggtgg accagttggt 31320

gattttgaac ttttgctttg ccacggaacg gtctgcgttg tcgggaagat gcgtgatctg 31380

atccttcaac tcagcaaaag ttcgatttat tcaacaaagc cacgttgtgt ctcaaaatct 31440

ctgatgttac attgcacaag ataaaaatat atcatcatga acaataaaac tgtctgctta 31500

cataaacagt aatacaaggg gtgttatgag ccatattcaa cgggaaacgt cttgctcgac 31560

tctagagctc gttcctcgag gaacggtacc tgcggggaag cttacaataa tgtgtgttgt 31620

taagtcttgt tgcctgtcat cgtctgactg actttcgtca taaatcccgg cctccgtaac 31680

ccagctttgg gcaagctcac ggatttgatc cggcggaacg ggaatatcga gatgccgggc 31740

tgaacgctgc agttccagct ttccctttcg ggacaggtac tccagctgat tgattatctg 31800

ctgaagggtc ttggttccac ctcctggcac aatgcgaatg attacttgag cgcgatcggg 31860

catccaattt tctcccgtca ggtgcgtggt caagtgctac aaggcacctt tcagtaacga 31920

gcgaccgtcg atccgtcgcc gggatacgga caaaatggag cgcagtagtc catcgagggc 31980

ggcgaaagcc tcgccaaaag caatacgttc atctcgcaca gcctccagat ccgatcgagg 32040

gtcttcggcg taggcagata gaagcatgga tacattgctt gagagtattc cgatggactg 32100

aagtatggct tccatctttt ctcgtgtgtc tgcatctatt tcgagaaagc ccccgatgcg 32160

gcgcaccgca acgcgaattg ccatactatc cgaaagtccc agcaggcgcg cttgatagga 32220

aaaggtttca tactcggccg atcgcagacg ggcactcacg accttgaacc cttcaacttt 32280

cagggatcga tgctggttga tggtagtctc actcgacgtg gctctggtgt gttttgacat 32340

agcttcctcc aaagaaagcg gaaggtctgg atactccagc acgaaatgtg cccgggtaga 32400

cggatggaag tctagccctg ctcaatatga aatcaacagt acatttacag tcaatactga 32460

atatacttgc tacatttgca attgtcttat aacgaatgtg aaataaaaat agtgtaacaa 32520

cgcttttact catcgataat cacaaaaaca tttatacgaa caaaaataca aatgcactcc 32580

ggtttcacag gataggcggg atcagaatat gcaacttttg acgttttgtt ctttcaaagg 32640

gggtgctggc aaaaccaccg cactcatggg cctttgcgct gctttggcaa atgacggtaa 32700

acgagtggcc ctctttgatg ccgacgaaaa ccggcctctg acgcgatgga gagaaaacgc 32760

cttacaaagc agtactggga tcctcgctgt gaagtctatt ccgccgacga aatgcccctt 32820

cttgaagcag cctatgaaaa tgccgagctc gaaggatttg attatgcgtt ggccgatacg 32880

cgtggcggct cgagcgagct caacaacaca atcatcgcta gctcaaacct gcttctgatc 32940

cccaccatgc taacgccgct cgacatcgat gaggcactat ctacctaccg ctacgtcatc 33000

gagctgctgt tgagtgaaaa tttggcaatt cctacagctg ttttgcgcca acgcgtcccg 33060

gtcggccgat tgacaacatc gcaacgcagg atgtcagaga cgctagagag ccttccagtt 33120

gtaccgtctc ccatgcatga aagagatgca tttgccgcga tgaaagaacg cggcatgttg 33180

catcttacat tactaaacac gggaactgat ccgacgatgc gcctcataga gaggaatctt 33240

cggattgcga tggaggaagt cgtggtcatt tcgaaactga tcagcaaaat cttggaggct 33300

tgaagatggc aattcgcaag cccgcattgt cggtcggcga agcacggcgg cttgctggtg 33360

ctcgacccga gatccaccat cccaacccga cacttgttcc ccagaagctg gacctccagc 33420

acttgcctga aaaagccgac gagaaagacc agcaacgtga gcctctcgtc gccgatcaca 33480

tttacagtcc cgatcgacaa cttaagctaa ctgtggatgc ccttagtcca cctccgtccc 33540

cgaaaaagct ccaggttttt ctttcagcgc gaccgcccgc gcctcaagtg tcgaaaacat 33600

atgacaacct cgttcggcaa tacagtccct cgaagtcgct acaaatgatt ttaaggcgcg 33660

cgttggacga tttcgaaagc atgctggcag atggatcatt tcgcgtggcc ccgaaaagtt 33720

atccgatccc ttcaactaca gaaaaatccg ttctcgttca gacctcacgc atgttcccgg 33780

ttgcgttgct cgaggtcgct cgaagtcatt ttgatccgtt ggggttggag accgctcgag 33840

ctttcggcca caagctggct accgccgcgc tcgcgtcatt ctttgctgga gagaagccat 33900

cgagcaattg gtgaagaggg acctatcgga acccctcacc aaatattgag tgtaggtttg 33960

aggccgctgg ccgcgtcctc agtcaccttt tgagccagat aattaagagc caaatgcaat 34020

tggctcaggc tgccatcgtc cccccgtgcg aaacctgcac gtccgcgtca aagaaataac 34080

cggcacctct tgctgttttt atcagttgag ggcttgacgg atccgcctca agtttgcggc 34140

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tggcaatgag aagttgctcg cgcgatagaa cgtcgcgggg tttctctaaa aacgcgagga 34260

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caacgttggg gcgcacgcgc aaggcaaccc gaatgcgtgc aagaaactct ctcgtactaa 34440

acggcttagc gataaaatca cttgctccta gctcgagtgc aacaacttta tccgtctcct 34500

caaggcggtc gccactgata attatgattg gaatatcaga ctttgccgcc agatttcgaa 34560

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cggaagagag tactctagtg aactgggtgc tgtcggctac cgcggtcact ttgaaggcgt 34680

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aattttcacg tgaaggatgt acaatcatct ccagctaaat gggcagttcg tcagaattgc 34860

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caaccaagct ggctcctagc ggcgattcca gaacatgctc tggttgctgc gttgccagta 40980

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tcaaccgtcg gcatcgacaa cagcgtgaat cttggtggtc aaaccgccac gggaacgtcc 44940

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cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc 47160

gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc 47220

cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag 47280

agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag gacagtattt ggtatctgcg 47340

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cggatcaccg gaaaggaccc gtaaagtgat aatgattatc atctacatat cacaacgtgc 48240

gtggaggcca tcaaaccacg tcaaataatc aattatgacg caggtatcgt attaattgat 48300

ctgcatcaac ttaacgtaaa aacaacttca gacaatacaa atcagcgaca ctgaatacgg 48360

ggcaacctca tgtccccccc cccccccccc ctgcaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt 48420

ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca 48480

tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg 48540

ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag cactgcataa ttctcttact gtcatgccat 48600

ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta 48660

tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt caacacggga taataccgcg ccacatagca 48720

gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct 48780

taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat 48840

cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa 48900

agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact cttccttttt caatattatt 48960

gaagcattta tcagggttat tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa 49020

ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc cccgaaaagt gccacctgac gtctaagaaa 49080

ccattattat catgacatta acctataaaa ataggcgtat cacgaggccc tttcgtcttc 49140

aagaattggt cgacgatctt gctgcgttcg gatattttcg tggagttccc gccacagacc 49200

cggattgaag gcgagatcca gcaactcgcg ccagatcatc ctgtgacgga actttggcgc 49260

gtgatgactg gccaggacgt cggccgaaag agcgacaagc agatcacgct tttcgacagc 49320

gtcggatttg cgatcgagga tttttcggcg ctgcgctacg tccgcgaccg cgttgaggga 49380

tcaagccaca gcagcccact cgaccttcta gccgacccag acgagccaag ggatcttttt 49440

ggaatgctgc tccgtcgtca ggctttccga cgtttgggtg gttgaacaga agtcattatc 49500

gtacggaatg ccaagcactc ccgaggggaa ccctgtggtt ggcatgcaca tacaaatgga 49560

cgaacggata aaccttttca cgccctttta aatatccgtt attctaataa acgctctttt 49620

ctcttaggtt tacccgccaa tatatcctgt caaacactga tagtttaaac tgaaggcggg 49680

aaacgacaat ctgatcatga gcggagaatt aagggagtca cgttatgacc cccgccgatg 49740

acgcgggaca agccgtttta cgtttggaac tgacagaacc gcaacgttga aggagccact 49800

cagcaagctg gtacgattgt aatacgactc actatagggc gaattgagcg ctgtttaaac 49860

gctcttcaac tggaagggcg gttacccgga ccgaagcttg catgcctgca g 49911

<210>32

<211>36909

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>载体

<400>32

tctagagctc gttcctcgag gcctcgaggc ctcgaggaac ggtacctgcg gggaagctta 60

caataatgtg tgttgttaag tcttgttgcc tgtcatcgtc tgactgactt tcgtcataaa 120

tcccggcctc cgtaacccag ctttgggcaa gctcacggat ttgatccggc ggaacgggaa 180

tatcgagatg ccgggctgaa cgctgcagtt ccagctttcc ctttcgggac aggtactcca 240

gctgattgat tatctgctga agggtcttgg ttccacctcc tggcacaatg cgaatgatta 300

cttgagcgcg atcgggcatc caattttctc ccgtcaggtg cgtggtcaag tgctacaagg 360

cacctttcag taacgagcga ccgtcgatcc gtcgccggga tacggacaaa atggagcgca 420

gtagtccatc gagggcggcg aaagcctcgc caaaagcaat acgttcatct cgcacagcct 480

ccagatccga tcgagggtct tcggcgtagg cagatagaag catggataca ttgcttgaga 540

gtattccgat ggactgaagt atggcttcca tcttttctcg tgtgtctgca tctatttcga 600

gaaagccccc gatgcggcgc accgcaacgc gaattgccat actatccgaa agtcccagca 660

ggcgcgcttg ataggaaaag gtttcatact cggccgatcg cagacgggca ctcacgacct 720

tgaacccttc aactttcagg gatcgatgct ggttgatggt agtctcactc gacgtggctc 780

tggtgtgttt tgacatagct tcctccaaag aaagcggaag gtctggatac tccagcacga 840

aatgtgcccg ggtagacgga tggaagtcta gccctgctca atatgaaatc aacagtacat 900

ttacagtcaa tactgaatat acttgctaca tttgcaattg tcttataacg aatgtgaaat 960

aaaaatagtg taacaacgct tttactcatc gataatcaca aaaacattta tacgaacaaa 1020

aatacaaatg cactccggtt tcacaggata ggcgggatca gaatatgcaa cttttgacgt 1080

tttgttcttt caaagggggt gctggcaaaa ccaccgcact catgggcctt tgcgctgctt 1140

tggcaaatga cggtaaacga gtggccctct ttgatgccga cgaaaaccgg cctctgacgc 1200

gatggagaga aaacgcctta caaagcagta ctgggatcct cgctgtgaag tctattccgc 1260

cgacgaaatg ccccttcttg aagcagccta tgaaaatgcc gagctcgaag gatttgatta 1320

tgcgttggcc gatacgcgtg gcggctcgag cgagctcaac aacacaatca tcgctagctc 1380

aaacctgctt ctgatcccca ccatgctaac gccgctcgac atcgatgagg cactatctac 1440

ctaccgctac gtcatcgagc tgctgttgag tgaaaatttg gcaattccta cagctgtttt 1500

gcgccaacgc gtcccggtcg gccgattgac aacatcgcaa cgcaggatgt cagagacgct 1560

agagagcctt ccagttgtac cgtctcccat gcatgaaaga gatgcatttg ccgcgatgaa 1620

agaacgcggc atgttgcatc ttacattact aaacacggga actgatccga cgatgcgcct 1680

catagagagg aatcttcgga ttgcgatgga ggaagtcgtg gtcatttcga aactgatcag 1740

caaaatcttg gaggcttgaa gatggcaatt cgcaagcccg cattgtcggt cggcgaagca 1800

cggcggcttg ctggtgctcg acccgagatc caccatccca acccgacact tgttccccag 1860

aagctggacc tccagcactt gcctgaaaaa gccgacgaga aagaccagca acgtgagcct 1920

ctcgtcgccg atcacattta cagtcccgat cgacaactta agctaactgt ggatgccctt 1980

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caagtgtcga aaacatatga caacctcgtt cggcaataca gtccctcgaa gtcgctacaa 2100

atgattttaa ggcgcgcgtt ggacgatttc gaaagcatgc tggcagatgg atcatttcgc 2160

gtggccccga aaagttatcc gatcccttca actacagaaa aatccgttct cgttcagacc 2220

tcacgcatgt tcccggttgc gttgctcgag gtcgctcgaa gtcattttga tccgttgggg 2280

ttggagaccg ctcgagcttt cggccacaag ctggctaccg ccgcgctcgc gtcattcttt 2340

gctggagaga agccatcgag caattggtga agagggacct atcggaaccc ctcaccaaat 2400

attgagtgta ggtttgaggc cgctggccgc gtcctcagtc accttttgag ccagataatt 2460

aagagccaaa tgcaattggc tcaggctgcc atcgtccccc cgtgcgaaac ctgcacgtcc 2520

gcgtcaaaga aataaccggc acctcttgct gtttttatca gttgagggct tgacggatcc 2580

gcctcaagtt tgcggcgcag ccgcaaaatg agaacatcta tactcctgtc gtaaacctcc 2640

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acgacatcga ccgtcgcgga agagagtact ctagtgaact gggtgctgtc ggctaccgcg 3120

gtcactttga aggcgtggat cgtaaggtat tcgataataa gatgccgcat agcgacatcg 3180

tcatcgataa gaagaacgtg tttcaacggc tcacctttca atctaaaatc tgaacccttg 3240

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agttcgtcag aattgcggct gaccgcggat gacgaaaatg cgaaccaagt atttcaattt 3360

tatgacaaaa gttctcaatc gttgttacaa gtgaaacgct tcgaggttac agctactatt 3420

gattaaggag atcgcctatg gtctcgcccc ggcgtcgtgc gtccgccgcg agccagatct 3480

cgcctacttc ataaacgtcc tcataggcac ggaatggaat gatgacatcg atcgccgtag 3540

agagcatgtc aatcagtgtg cgatcttcca agctagcacc ttgggcgcta cttttgacaa 3600

gggaaaacag tttcttgaat ccttggattg gattcgcgcc gtgtattgtt gaaatcgatc 3660

ccggatgtcc cgagacgact tcactcagat aagcccatgc tgcatcgtcg cgcatctcgc 3720

caagcaatat ccggtccggc cgcatacgca gacttgcttg gagcaagtgc tcggcgctca 3780

cagcacccag cccagcaccg ttcttggagt agagtagtct aacatgatta tcgtgtggaa 3840

tgacgagttc gagcgtatct tctatggtga ttagcctttc ctgggggggg atggcgctga 3900

tcaaggtctt gctcattgtt gtcttgccgc ttccggtagg gccacatagc aacatcgtca 3960

gtcggctgac gacgcatgcg tgcagaaacg cttccaaatc cccgttgtca aaatgctgaa 4020

ggatagcttc atcatcctga ttttggcgtt tccttcgtgt ctgccactgg ttccacctcg 4080

aagcatcata acgggaggag acttctttaa gaccagaaac acgcgagctt ggccgtcgaa 4140

tggtcaagct gacggtgccc gagggaacgg tcggcggcag acagatttgt agtcgttcac 4200

caccaggaag ttcagtggcg cagagggggt tacgtggtcc gacatcctgc tttctcagcg 4260

cgcccgctaa aatagcgata tcttcaagat catcataaga gacgggcaaa ggcatcttgg 4320

taaaaatgcc ggcttggcgc acaaatgcct ctccaggtcg attgatcgca atttcttcag 4380

tcttcgggtc atcgagccat tccaaaatcg gcttcagaag aaagcgtagt tgcggatcca 4440

cttccattta caatgtatcc tatctctaag cggaaatttg aattcattaa gagcggcggt 4500

tcctcccccg cgtggcgccg ccagtcaggc ggagctggta aacaccaaag aaatcgaggt 4560

cccgtgctac gaaaatggaa acggtgtcac cctgattctt cttcagggtt ggcggtatgt 4620

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gctgtatttc gccaacaacg gtggtgccac gatcaagaag cacgatattg ttcgttgttc 4980

cacgaatatc ctgaggcaag acacacttta catagcctgc caaatttgtg tcgattgcgg 5040

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gcgtggcgct gctgggctgc agctcggtgg gtttcatacg tatcgacaaa tcgttctcgc 5160

cggacacttc gccattcggc aaggagttgt cgtcacgctt gccttcttgt cttcggcccg 5220

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caggctgaac agcctcttga accgctggag gatccggcgg cacctcaatc ggagctggat 5400

gaaatggctt ggtgtttgtt gcgatcaaag ttgacggcga tgcgttctca ttcaccttct 5460

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ggtgttccag atacatagta ctgtgtggcc atccctcaga cgccaacctc gggaaaccga 5760

agaaatctcg acatcgctcc ctttaactga atagttggca acagcttcct tgccatcagg 5820

attgatggtg tagatggagg gtatgcgtac attgcccgga aagtggaata ccgtcgtaaa 5880

tccattgtcg aagacttcga gtggcaacag cgaacgatcg ccttgggcga cgtagtgcca 5940

attactgtcc gccgcaccaa gggctgtgac aggctgatcc aataaattct cagctttccg 6000

ttgatattgt gcttccgcgt gtagtctgtc cacaacagcc ttctgttgtg cctcccttcg 6060

ccgagccgcc gcatcgtcgg cggggtaggc gaattggacg ctgtaataga gatcgggctg 6120

ctctttatcg aggtgggaca gagtcttgga acttatactg aaaacataac ggcgcatccc 6180

ggagtcgctt gcggttagca cgattactgg ctgaggcgtg aggacctggc ttgccttgaa 6240

aaatagataa tttccccgcg gtagggctgc tagatctttg ctatttgaaa cggcaaccgc 6300

tgtcaccgtt tcgttcgtgg cgaatgttac gaccaaagta gctccaaccg ccgtcgagag 6360

gcgcaccact tgatcgggat tgtaagccaa ataacgcatg cgcggatcta gcttgcccgc 6420

cattggagtg tcttcagcct ccgcaccagt cgcagcggca aataaacatg ctaaaatgaa 6480

aagtgctttt ctgatcatgg ttcgctgtgg cctacgtttg aaacggtatc ttccgatgtc 6540

tgataggagg tgacaaccag acctgccggg ttggttagtc tcaatctgcc gggcaagctg 6600

gtcacctttt cgtagcgaac tgtcgcggtc cacgtactca ccacaggcat tttgccgtca 6660

acgacgaggg tccttttata gcgaatttgc tgcgtgcttg gagttacatc atttgaagcg 6720

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tctacttcct tatagtgctc ggcaaggctt tcgcgcgcca ctagcatggc atattcaggc 7200

cccgtcatag cgtccacccg aattgccgag ctgaagatct gacggagtag gctgccatcg 7260

ccccacattc agcgggaaga tcgggccttt gcagctcgct aatgtgtcgt ttgtctggca 7320

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gacaatgagc gcatcccctg tcagaaaaaa catatcgagt tcgtaaagac caatgatctt 7560

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ctggtcgttc atcggaccga tttcggatgc gattttctga aaaacggcct gggtcacggc 7920

gaacattgta tccaactgtg ccggaacagt ctgcagaggc aagccggtta cactaaactg 7980

ctgaacaaag tttgggaccg tcttttcgaa gatggaaacc acatagtctt ggtagttagc 8040

ctgcccaaca attagagcaa caacgatggt gaccgtgatc acccgagtga taccgctacg 8100

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ggcgatcaat ggcgcactca ccgcctcctg gatagtctca agcatcgagt ccaagcctgt 8220

cgtgaaggct acatcgaaga tcgtatgaat ggccgtaaac ggcgccggaa tcgtgaaatt 8280

catcgattgg acctgaactt gactggtttg tcgcataatg ttggataaaa tgagctcgca 8340

ttcggcgagg atgcgggcgg atgaacaaat cgcccagcct taggggaggg caccaaagat 8400

gacagcggtc ttttgatgct ccttgcgttg agcggccgcc tcttccgcct cgtgaaggcc 8460

ggcctgcgcg gtagtcatcg ttaataggct tgtcgcctgt acattttgaa tcattgcgtc 8520

atggatctgc ttgagaagca aaccattggt cacggttgcc tgcatgatat tgcgagatcg 8580

ggaaagctga gcagacgtat cagcattcgc cgtcaagcgt ttgtccatcg tttccagatt 8640

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ttcagcatca ctacccacga ctgcacgatc tgtatcgctg gtgatcgcac gtgccgtggt 8760

cgacattggc attcgcggcg aaaacatttc attgtctagg tccttcgtcg aaggatactg 8820

atttttctgg ttgagcgaag tcagtagtcc agtaacgccg taggccgacg tcaacatcgt 8880

aaccatcgct atagtctgag tgagattctc cgcagtcgcg agcgcagtcg cgagcgtctc 8940

agcctccgtt gccgggtcgc taacaacaaa ctgcgcccgc gcgggctgaa tatatagaaa 9000

gctgcaggtc aaaactgttg caataagttg cgtcgtcttc atcgtttcct accttatcaa 9060

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tgtgcctcgc gtagtcgagt tgcaaagcgc accgtgttgg cacgccccga aagcacggcg 9180

acatattcac gcatatcccg cagatcaaat tcgcagatga cgcttccact ttctcgttta 9240

agaagaaact tacggctgcc gaccgtcatg tcttcacgga tcgcctgaaa ttccttttcg 9300

gtacatttca gtccatcgac ataagccgat cgatctgcgg ttggtgatgg atagaaaatc 9360

ttcgtcatac attgcgcaac caagctggct cctagcggcg attccagaac atgctctggt 9420

tgctgcgttg ccagtattag catcccgttg ttttttcgaa cggtcaggag gaatttgtcg 9480

acgacagtcg aaaatttagg gtttaacaaa taggcgcgaa actcatcgca gctcatcaca 9540

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catacttcct cgtattcgag aagatgcgtc atgtcgaagc cggtaatcga cggatctaac 9660

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aatgctccat gcaattgcac cgcacaagct tggggcgcag ctcgatatca cgcgcatcat 12060

cgcattcgag agcgagaggc gatttagatg taaacggtat ctctcaaagc atcgcatcaa 12120

tgcgcacctc cttagtataa gtcgaataag acttgattgt cgtctgcgga tttgccgttg 12180

tcctggtgtg gcggtggcgg agcgattaaa ccgccagcgc catcctcctg cgagcggcgc 12240

tgatatgacc cccaaacatc ccacgtctct tcggatttta gcgcctcgtg atcgtctttt 12300

ggaggctcga ttaacgcggg caccagcgat tgagcagctg tttcaacttt tcgcacgtag 12360

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aggtcaggct cagaacgaaa atgctcggcg aggttacgct gtctgtaaac ccattcgatg 13140

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acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa 16080

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tcatggtgat ttctcacttg ataaccttat ttttgacgag gggaaattaa taggttgtat 17700

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cctcggtgag ttttctcctt cattacagaa acggcttttt caaaaatatg gtattgataa 17820

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tacgggcgtc tgacgcggtg gaaaggggga ggggatgttg tctacatggc tctgctgtag 18300

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gtgcgcccgg tcgcgtgccg gcatggatgc gcgcgccatc gcggtaggcg agcagcgcct 18720

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caacttatca gtgataaaga atccgcgcgt tcaatcggac cagcggaggc tggtccggag 19080

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cccgctcgct tcgttccggt gggcccgggg catgaccgtc gtcgccgccc tgatggcggt 19740

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aatagccaag ggaagcaata ccgatgatcc aagcaattgc gattgcaatc gcgggcctcg 25620

gcgcgcttct gttgttcatc ctctttgccc gcatccgcgc ggtcgatgcc gaactgaaac 25680

tgaaaaagca tcgttccaag gacgccggcc tggccgatct gctcaactac gccgctgtcg 25740

tcgatgacgg cgtaatcgtg ggcaagaacg gcagctttat ggctgcctgg ctgtacaagg 25800

gcgatgacaa cgcaagcagc accgaccagc agcgcgaagt agtgtccgcc cgcatcaacc 25860

aggccctcgc gggcctggga agtgggtgga tgatccatgt ggacgccgtg cggcgtcctg 25920

ctccgaacta cgcggagcgg ggcctgtcgg cgttccctga ccgtctgacg gcagcgattg 25980

aagaagagcg ctcggtcttg ccttgctcgt cggtgatgta cttcaccagc tccgcgaagt 26040

cgctcttctt gatggagcgc atggggacgt gcttggcaat cacgcgcacc ccccggccgt 26100

tttagcggct aaaaaagtca tggctctgcc ctcgggcgga ccacgcccat catgaccttg 26160

ccaagctcgt cctgcttctc ttcgatcttc gccagcaggg cgaggatcgt ggcatcaccg 26220

aaccgcgccg tgcgcgggtc gtcggtgagc cagagtttca gcaggccgcc caggcggccc 26280

aggtcgccat tgatgcgggc cagctcgcgg acgtgctcat agtccacgac gcccgtgatt 26340

ttgtagccct ggccgacggc cagcaggtag gccgacaggc tcatgccggc cgccgccgcc 26400

ttttcctcaa tcgctcttcg ttcgtctgga aggcagtaca ccttgatagg tgggctgccc 26460

ttcctggttg gcttggtttc atcagccatc cgcttgccct catctgttac gccggcggta 26520

gccggccagc ctcgcagagc aggattcccg ttgagcaccg ccaggtgcga ataagggaca 26580

gtgaagaagg aacacccgct cgcgggtggg cctacttcac ctatcctgcc cggctgacgc 26640

cgttggatac accaaggaaa gtctacacga accctttggc aaaatcctgt atatcgtgcg 26700

aaaaaggatg gatataccga aaaaatcgct ataatgaccc cgaagcaggg ttatgcagcg 26760

gaaaagcgct gcttccctgc tgttttgtgg aatatctacc gactggaaac aggcaaatgc 26820

aggaaattac tgaactgagg ggacaggcga gagacgatgc caaagagcta caccgacgag 26880

ctggccgagt gggttgaatc ccgcgcggcc aagaagcgcc ggcgtgatga ggctgcggtt 26940

gcgttcctgg cggtgagggc ggatgtcgag gcggcgttag cgtccggcta tgcgctcgtc 27000

accatttggg agcacatgcg ggaaacgggg aaggtcaagt tctcctacga gacgttccgc 27060

tcgcacgcca ggcggcacat caaggccaag cccgccgatg tgcccgcacc gcaggccaag 27120

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gacaaaaagg atctactgta atggcgaaaa ttcacatggt tttgcagggc aagggcgggg 27300

tcggcaagtc ggccatcgcc gcgatcattg cgcagtacaa gatggacaag gggcagacac 27360

ccttgtgcat cgacaccgac ccggtgaacg cgacgttcga gggctacaag gccctgaacg 27420

tccgccggct gaacatcatg gccggcgacg aaattaactc gcgcaacttc gacaccctgg 27480

tcgagctgat tgcgccgacc aaggatgacg tggtgatcga caacggtgcc agctcgttcg 27540

tgcctctgtc gcattacctc atcagcaacc aggtgccggc tctgctgcaa gaaatggggc 27600

atgagctggt catccatacc gtcgtcaccg gcggccaggc tctcctggac acggtgagcg 27660

gcttcgccca gctcgccagc cagttcccgg ccgaagcgct tttcgtggtc tggctgaacc 27720

cgtattgggg gcctatcgag catgagggca agagctttga gcagatgaag gcgtacacgg 27780

ccaacaaggc ccgcgtgtcg tccatcatcc agattccggc cctcaaggaa gaaacctacg 27840

gccgcgattt cagcgacatg ctgcaagagc ggctgacgtt cgaccaggcg ctggccgatg 27900

aatcgctcac gatcatgacg cggcaacgcc tcaagatcgt gcggcgcggc ctgtttgaac 27960

agctcgacgc ggcggccgtg ctatgagcga ccagattgaa gagctgatcc gggagattgc 28020

ggccaagcac ggcatcgccg tcggccgcga cgacccggtg ctgatcctgc ataccatcaa 28080

cgcccggctc atggccgaca gtgcggccaa gcaagaggaa atccttgccg cgttcaagga 28140

agagctggaa gggatcgccc atcgttgggg cgaggacgcc aaggccaaag cggagcggat 28200

gctgaacgcg gccctggcgg ccagcaagga cgcaatggcg aaggtaatga aggacagcgc 28260

cgcgcaggcg gccgaagcga tccgcaggga aatcgacgac ggccttggcc gccagctcgc 28320

ggccaaggtc gcggacgcgc ggcgcgtggc gatgatgaac atgatcgccg gcggcatggt 28380

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aaagcccggc gttgccgggc tttgtttttg cgttagctgg gcttgtttga caggcccaag 28500

ctctgactgc gcccgcgctc gcgctcctgg gcctgtttct tctcctgctc ctgcttgcgc 28560

atcagggcct ggtgccgtcg ggctgcttca cgcatcgaat cccagtcgcc ggccagctcg 28620

ggatgctccg cgcgcatctt gcgcgtcgcc agttcctcga tcttgggcgc gtgaatgccc 28680

atgccttcct tgatttcgcg caccatgtcc agccgcgtgt gcagggtctg caagcgggct 28740

tgctgttggg cctgctgctg ctgccaggcg gcctttgtac gcggcaggga cagcaagccg 28800

ggggcattgg actgtagctg ctgcaaacgc gcctgctgac ggtctacgag ctgttctagg 28860

cggtcctcga tgcgctccac ctggtcatgc tttgcctgca cgtagagcgc aagggtctgc 28920

tggtaggtct gctcgatggg cgcggattct aagagggcct gctgttccgt ctcggcctcc 28980

tgggccgcct gtagcaaatc ctcgccgctg ttgccgctgg actgctttac tgccggggac 29040

tgctgttgcc ctgctcgcgc cgtcgtcgca gttcggcttg cccccactcg attgactgct 29100

tcatttcgag ccgcagcgat gcgatctcgg attgcgtcaa cggacggggc agcgcggagg 29160

tgtccggctt ctccttgggt gagtcggtcg atgccatagc caaaggtttc cttccaaaat 29220

gcgtccattg ctggaccgtg tttctcattg atgcccgcaa gcatcttcgg cttgaccgcc 29280

aggtcaagcg cgccttcatg ggcggtcatg acggacgccg ccatgacctt gccgccgttg 29340

ttctcgatgt agccgcgtaa tgaggcaatg gtgccgccca tcgtcagcgt gtcatcgaca 29400

acgatgtact tctggccggg gatcacctcc ccctcgaaag tcgggttgaa cgccaggcga 29460

tgatctgaac cggctccggt tcgggcgacc ttctcccgct gcacaatgtc cgtttcgacc 29520

tcaaggccaa ggcggtcggc cagaacgacc gccatcatgg ccggaatctt gttgttcccc 29580

gccgcctcga cggcgaggac tggaacgatg cggggcttgt cgtcgccgat cagcgtcttg 29640

agctgggcaa cagtgtcgtc cgaaatcagg cgctcgacca aattaagcgc cgcttccgcg 29700

tcgccctgct tcgcagcctg gtattcaggc tcgttggtca aagaaccaag gtcgccgttg 29760

cgaaccacct tcgggaagtc tccccacggt gcgcgctcgg ctctgctgta gctgctcaag 29820

acgcctccct ttttagccgc taaaactcta acgagtgcgc ccgcgactca acttgacgct 29880

ttcggcactt acctgtgcct tgccacttgc gtcataggtg atgcttttcg cactcccgat 29940

ttcaggtact ttatcgaaat ctgaccgggc gtgcattaca aagttcttcc ccacctgttg 30000

gtaaatgctg ccgctatctg cgtggacgat gctgccgtcg tggcgctgcg acttatcggc 30060

cttttgggcc atatagatgt tgtaaatgcc aggtttcagg gccccggctt tatctacctt 30120

ctggttcgtc catgcgcctt ggttctcggt ctggacaatt ctttgcccat tcatgaccag 30180

gaggcggtgt ttcattgggt gactcctgac ggttgcctct ggtgttaaac gtgtcctggt 30240

cgcttgccgg ctaaaaaaaa gccgacctcg gcagttcgag gccggctttc cctagagccg 30300

ggcgcgtcaa ggttgttcca tctattttag tgaactgcgt tcgatttatc agttactttc 30360

ctcccgcttt gtgtttcctc ccactcgttt ccgcgtctag ccgacccctc aacatagcgg 30420

cctcttcttg ggctgccttt gcctcttgcc gcgcttcgtc acgctcggct tgcaccgtcg 30480

taaagcgctc ggcctgcctg gccgcctctt gcgccgccaa cttcctttgc tcctggtggg 30540

cctcggcgtc ggcctgcgcc ttcgctttca ccgctgccaa ctccgtgcgc aaactctccg 30600

cttcgcgcct ggtggcgtcg cgctcgccgc gaagcgcctg catttcctgg ttggccgcgt 30660

ccagggtctt gcggctctct tctttgaatg cgcgggcgtc ctggtgagcg tagtccagct 30720

cggcgcgcag ctcctgcgct cgacgctcca cctcgtcggc ccgctgcgtc gccagcgcgg 30780

cccgctgctc ggctcctgcc agggcggtgc gtgcttcggc cagggcttgc cgctggcgtg 30840

cggccagctc ggccgcctcg gcggcctgct gctctagcaa tgtaacgcgc gcctgggctt 30900

cttccagctc gcgggcctgc gcctcgaagg cgtcggccag ctccccgcgc acggcttcca 30960

actcgttgcg ctcacgatcc cagccggctt gcgctgcctg caacgattca ttggcaaggg 31020

cctgggcggc ttgccagagg gcggccacgg cctggttgcc ggcctgctgc accgcgtccg 31080

gcacctggac tgccagcggg gcggcctgcg ccgtgcgctg gcgtcgccat tcgcgcatgc 31140

cggcgctggc gtcgttcatg ttgacgcggg cggccttacg cactgcatcc acggtcggga 31200

agttctcccg gtcgccttgc tcgaacagct cgtccgcagc cgcaaaaatg cggtcgcgcg 31260

tctctttgtt cagttccatg ttggctccgg taattggtaa gaataataat actcttacct 31320

accttatcag cgcaagagtt tagctgaaca gttctcgact taacggcagg ttttttagcg 31380

gctgaagggc aggcaaaaaa agccccgcac ggtcggcggg ggcaaagggt cagcgggaag 31440

gggattagcg ggcgtcgggc ttcttcatgc gtcggggccg cgcttcttgg gatggagcac 31500

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gtcgcgcgct aggtcctccc tggtgggcac caggggcatg aactcggcct gctcgatgta 31620

ggtccactcc atgaccgcat cgcagtcgag gccgcgttcc ttcaccgtct cttgcaggtc 31680

gcggtacgcc cgctcgttga gcggctggta acgggccaat tggtcgtaaa tggctgtcgg 31740

ccatgagcgg cctttcctgt tgagccagca gccgacgacg aagccggcaa tgcaggcccc 31800

tggcacaacc aggccgacgc cgggggcagg ggatggcagc agctcgccaa ccaggaaccc 31860

cgccgcgatg atgccgatgc cggtcaacca gcccttgaaa ctatccggcc ccgaaacacc 31920

cctgcgcatt gcctggatgc tgcgccggat agcttgcaac atcaggagcc gtttcttttg 31980

ttcgtcagtc atggtccgcc ctcaccagtt gttcgtatcg gtgtcggacg aactgaaatc 32040

gcaagagctg ccggtatcgg tccagccgct gtccgtgtcg ctgctgccga agcacggcga 32100

ggggtccgcg aacgccgcag acggcgtatc cggccgcagc gcatcgccca gcatggcccc 32160

ggtcagcgag ccgccggcca ggtagcccag catggtgctg ttggtcgccc cggccaccag 32220

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tcggtgttcc ttcttcggct cgcgcagctt gaacagcatg atcgcggaaa ccagcagcaa 32460

cgccgcgcct acgcctcccg cgatgtagaa cagcatcgga ttcattcttc ggtcctcctt 32520

gtagcggaac cgttgtctgt gcggcgcggg tggcccgcgc cgctgtcttt ggggatcagc 32580

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cctcgtactt caaccaggca tagccttccg ccggcggccg acggttgagg ataaggcggg 32700

cagggcgctc gtcgtgctcg acctggacga tggccttttt cagcttgtcc gggtccggct 32760

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cgtcgccggc ctccgcgtca cgctcggcat cagtctggcc gttgaaggca tcgacggtgt 32880

tgggatcgcg gcccttctcg tccaggaact cgcgcagcag cttgaccgtg ccgcgcgtga 32940

tttcctgggt gtcgtcgtca agccacgcct cgacttcctc cgggcgcttc ttgaaggccg 33000

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tttccttggc gatatcgcct ttcttcttgc ccttcgccag ctcgcggcca atgaagtcgg 33180

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tgtagtcgtt gtcgatgaac gccgggatgg acttcttgcc ggcccacttc gagccacggt 33300

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gatcacggca acccgcaagc cgcgctcgaa aaagtcgaag gcaagatgca caagggtcga 34380

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tgttttttct tggcgtccgc ttcccacttc cggacgatgt acgcctgatg ttccggcaga 34500

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ccgacttggc tccacgcgcc tcgatcagct cttgcactcg cgcgaaatcc ttggcctcca 35340

cggccgccat gaatcgcgca cgcggcgaag gctccgcagg gccggcgtcg tgatcgccgc 35400

cgagaatgcc cttcaccaag ttcgacgaca cgaaaatcat gctgacggct atcaccatca 35460

tgcagacgga tcgcacgaac ccgctgaatt gaacacgagc acggcacccg cgaccactat 35520

gccaagaatg cccaaggtaa aaattgccgg ccccgccatg aagtccgtga atgccccgac 35580

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gtctcgcaca cggcttcgac ggcgtttctg gcgcgtttgc agggccatag acggccgcca 36420

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ggttctcgca aggacgagaa tttccctgcg gtgcccctca agtgtcaatg aaagtttcca 36600

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ccagttggtg attttgaact tttgctttgc cacggaacgg tctgcgttgt cgggaagatg 36720

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tcaaaatctc tgatgttaca ttgcacaaga taaaaatata tcatcatgaa caataaaact 36840

gtctgcttac ataaacagta atacaagggg tgttatgagc catattcaac gggaaacgtc 36900

ttgctcgac 36909

<210>33

<211>825

<212>DNA

<213>玉米

<400>33

aaatccttac agaattgctg tagtttcata gtgctagatg tggacagcaa agcgccgctg 60

tatgcttctg cttttctttt ttggtgtgtg tagccacatc ctttgttcct gcccggcgcc 120

atcccacttg gttgtttttt tttatgattg aaagccttca tgcttcctcg gtcaatcacc 180

ggtgcgcact gggagcatcg ccggaaaaaa aattcttcgg ctaagagtaa cttctttctc 240

cttttcttct ctgatctcgc gagcagtgct gataacgtgt tgtaatctac ttagcggtaa 300

cgagattgag agagacaaaa tgacagaact attgtcttta ttgcagagtg tcatgtattt 360

atacagggga tacaaagtct cccaaggggt gtgtcccttg ggagtaactg ccagttgatc 420

acaggacaat attttgtaac aaaacgtaca catcgtcaaa atagcgaggc atgaaactgg 480

ccttggccat ggacgcgtga agcgcgccat gcgttggata tgtggtcaat aagtatatac 540

aatacaatgt ttaacagagc tgatagtact gctttggcac atttttgtcc acgcttcatg 600

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tacagcatcc gatcccaaac tgcaactgta gcagcgacaa ctgcc 825

<210>34

<211>860

<212>DNA

<213>玉米

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ctggtaatta ttggctgtag gattctaaac agagcctaaa tagctggaat agctctagcc 60

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tatttcattt ttgtcaacga gattctctac tctattccac aatcttttga agcaatattt 180

accttaaatc tgtactctat accaataatc atatattcta ttatttattt ttatctctct 240

cctaaggagc atccccctat gtctgcatgg cccccgcctc gggtcccaat ctcttgctct 300

gctagtagca cagaagaaaa cactagaaat gacttgcttg acttagagta tcagataaac 360

atcatgttta cttaacttta atttgtatcg gtttctacta tttttataat atttttgtct 420

ctatagatac tacgtgcaac agtataatca acctagttta atccagagcg aaggattttt 480

tactaagtac gtgactccat atgcacagcg ttccttttat ggttcctcac tgggcacagc 540

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gtgcagcgtg acccggtcgt gcccctctct agagataatg agcattgcat gtctaagtta 60

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ctgatttata tgggtataaa tgggctcgcg ataatgtcgg gcaatcaggt gcgacaatct 4680

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<210>42

<211>13019

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>载体

<400>42

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tacgaataat ataatctata gtactacaat aatatcagtg ttttagagaa tcatataaat 240

gaacagttag acatggtcta aaggacaatt gagtattttg acaacaggac tctacagttt 300

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cttcatccat tttattagta catccattta gggtttaggg ttaatggttt ttatagacta 420

atttttttag tacatctatt ttattctatt ttagcctcta aattaagaaa actaaaactc 480

tattttagtt tttttattta ataatttaga tataaaatag aataaaataa agtgactaaa 540

aattaaacaa atacccttta agaaattaaa aaaactaagg aaacattttt cttgtttcga 600

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cgctcgtcct cccccccccc ccctctctac cttctctaga tcggcgttcc ggtccatggt 1080

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cgatttcatg attttttttg tttcgttgca tagggtttgg tttgcccttt tcctttattt 1320

caatatatgc cgtgcacttg tttgtcgggt catcttttca tgcttttttt tgtcttggtt 1380

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acctggtgga tttattaatt ttggatctgt atgtgtgtgc catacatatt catagttacg 1500

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tactgatgca tatacagaga tgctttttgt tcgcttggtt gtgatgatgt ggtgtggttg 1620

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aaacaagtat gttttataat tattttgatc ttgatatact tggatgatgg catatgcagc 1920

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tgttttagag aatcatataa atgaacagtt agacatggtc taaaggacaa ttgagtattt 3900

tgacaacagg actctacagt tttatctttt tagtgtgcat gtgttctcct ttttttttgc 3960

aaatagcttc acctatataa tacttcatcc attttattag tacatccatt tagggtttag 4020

ggttaatggt ttttatagac taattttttt agtacatcta ttttattcta ttttagcctc 4080

taaattaaga aaactaaaac tctattttag tttttttatt taataattta gatataaaat 4140

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aacctcgtgt tgttcggagc gcacacacac acaaccagat ctcccccaaa tccacccgtc 4620

ggcacctccg cttcaaggta cgccgctcgt cctccccccc ccccctctct accttctcta 4680

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cggagacggt cacagcttgt ctgtaagcgg atgccgggag cagacaagcc cgtcagggcg 9660

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agaggaaatc cttgccgcgt tcaaggaaga gctggaaggg atcgcccatc gttggggcga 11760

ggacgccaag gccaaagcgg agcggatgct gaacgcggcc ctggcggcca gcaaggacgc 11820

aatggcgaag gtaatgaagg acagcgccgc gcaggcggcc gaagcgatcc gcagggaaat 11880

cgacgacggc cttggccgcc agctcgcggc caaggtcgcg gacgcgcggc gcgtggcgat 11940

gatgaacatg atcgccggcg gcatggtgtt gttcgcggcc gccctggtgg tgtgggcctc 12000

gttatgaatc gcagaggcgc agatgaaaaa gcccggcgtt gccgggcttt gtttttgcgt 12060

tagctgggct tgtttgacag gcccaagctc tgactgcgcc cgcgctcgcg ctcctgggcc 12120

tgtttcttct cctgctcctg cttgcgcatc agggcctggt gccgtcgggc tgcttcacgc 12180

atcgaatccc agtcgccggc cagctcggga tgctccgcgc gcatcttgcg cgtcgccagt 12240

tcctcgatct tgggcgcgtg aatgcccatg ccttccttga tttcgcgcac catgtccagc 12300

cgcgtgtgca gggtctgcaa gcgggcttgc tgttgggcct gctgctgctg ccaggcggcc 12360

tttgtacgcg gcagggacag caagccgggg gcattggact gtagctgctg caaacgcgcc 12420

tgctgacggt ctacgagctg ttctaggcgg tcctcgatgc gctccacctg gtcatgcttt 12480

gcctgcacgt agagcgcaag ggtctgctgg taggtctgct cgatgggcgc ggattctaag 12540

agggcctgct gttccgtctc ggcctcctgg gccgcctgta gcaaatcctc gccgctgttg 12600

ccgctggact gctttactgc cggggactgc tgttgccctg ctcgcgccgt cgtcgcagtt 12660

cggcttgccc ccactcgatt gactgcttca tttcgagccg cagcgatgcg atctcggatt 12720

gcgtcaacgg acggggcagc gcggaggtgt ccggcttctc cttgggtgag tcggtcgatg 12780

ccatagccaa aggtttcctt ccaaaatgcg tccattgctg gaccgtgttt ctcattgatg 12840

cccgcaagca tcttcggctt gaccgccagg tcaagcgcgc cttcatgggc ggtcatgacg 12900

gacgccgcca tgaccttgcc gccgttgttc tcgatgtagc cgcgtaatga ggcaatggtg 12960

ccgcccatcg tcagcgtgtc atcgacaacg atgtacttct ggccggggat cacctccccc 13020

tcgaaagtcg ggttgaacgc caggcgatga tctgaaccgg ctccggttcg ggcgaccttc 13080

tcccgctgca caatgtccgt ttcgacctca aggccaaggc ggtcggccag aacgaccgcc 13140

atcatggccg gaatcttgtt gttccccgcc gcctcgacgg cgaggactgg aacgatgcgg 13200

ggcttgtcgt cgccgatcag cgtcttgagc tgggcaacag tgtcgtccga aatcaggcgc 13260

tcgaccaaat taagcgccgc ttccgcgtcg ccctgcttcg cagcctggta ttcaggctcg 13320

ttggtcaaag aaccaaggtc gccgttgcga accaccttcg ggaagtctcc ccacggtgcg 13380

cgctcggctc tgctgtagct gctcaagacg cctccctttt tagccgctaa aactctaacg 13440

agtgcgcccg cgactcaact tgacgctttc ggcacttacc tgtgccttgc cacttgcgtc 13500

ataggtgatg cttttcgcac tcccgatttc aggtacttta tcgaaatctg accgggcgtg 13560

cattacaaag ttcttcccca cctgttggta aatgctgccg ctatctgcgt ggacgatgct 13620

gccgtcgtgg cgctgcgact tatcggcctt ttgggccata tagatgttgt aaatgccagg 13680

tttcagggcc ccggctttat ctaccttctg gttcgtccat gcgccttggt tctcggtctg 13740

gacaattctt tgcccattca tgaccaggag gcggtgtttc attgggtgac tcctgacggt 13800

tgcctctggt gttaaacgtg tcctggtcgc ttgccggcta aaaaaaagcc gacctcggca 13860

gttcgaggcc ggctttccct agagccgggc gcgtcaaggt tgttccatct attttagtga 13920

actgcgttcg atttatcagt tactttcctc ccgctttgtg tttcctccca ctcgtttccg 13980

cgtctagccg acccctcaac atagcggcct cttcttgggc tgcctttgcc tcttgccgcg 14040

cttcgtcacg ctcggcttgc accgtcgtaa agcgctcggc ctgcctggcc gcctcttgcg 14100

ccgccaactt cctttgctcc tggtgggcct cggcgtcggc ctgcgccttc gctttcaccg 14160

ctgccaactc cgtgcgcaaa ctctccgctt cgcgcctggt ggcgtcgcgc tcgccgcgaa 14220

gcgcctgcat ttcctggttg gccgcgtcca gggtcttgcg gctctcttct ttgaatgcgc 14280

gggcgtcctg gtgagcgtag tccagctcgg cgcgcagctc ctgcgctcga cgctccacct 14340

cgtcggcccg ctgcgtcgcc agcgcggccc gctgctcggc tcctgccagg gcggtgcgtg 14400

cttcggccag ggcttgccgc tggcgtgcgg ccagctcggc cgcctcggcg gcctgctgct 14460

ctagcaatgt aacgcgcgcc tgggcttctt ccagctcgcg ggcctgcgcc tcgaaggcgt 14520

cggccagctc cccgcgcacg gcttccaact cgttgcgctc acgatcccag ccggcttgcg 14580

ctgcctgcaa cgattcattg gcaagggcct gggcggcttg ccagagggcg gccacggcct 14640

ggttgccggc ctgctgcacc gcgtccggca cctggactgc cagcggggcg gcctgcgccg 14700

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ccttacgcac tgcatccacg gtcgggaagt tctcccggtc gccttgctcg aacagctcgt 14820

ccgcagccgc aaaaatgcgg tcgcgcgtct ctttgttcag ttccatgttg gctccggtaa 14880

ttggtaagaa taataatact cttacctacc ttatcagcgc aagagtttag ctgaacagtt 14940

ctcgacttaa cggcaggttt tttagcggct gaagggcagg caaaaaaagc cccgcacggt 15000

cggcgggggc aaagggtcag cgggaagggg attagcgggc gtcgggcttc ttcatgcgtc 15060

ggggccgcgc ttcttgggat ggagcacgac gaagcgcgca cgcgcatcgt cctcggccct 15120

atcggcccgc gtcgcggtca ggaacttgtc gcgcgctagg tcctccctgg tgggcaccag 15180

gggcatgaac tcggcctgct cgatgtaggt ccactccatg accgcatcgc agtcgaggcc 15240

gcgttccttc accgtctctt gcaggtcgcg gtacgcccgc tcgttgagcg gctggtaacg 15300

ggccaattgg tcgtaaatgg ctgtcggcca tgagcggcct ttcctgttga gccagcagcc 15360

gacgacgaag ccggcaatgc aggcccctgg cacaaccagg ccgacgccgg gggcagggga 15420

tggcagcagc tcgccaacca ggaaccccgc cgcgatgatg ccgatgccgg tcaaccagcc 15480

cttgaaacta tccggccccg aaacacccct gcgcattgcc tggatgctgc gccggatagc 15540

ttgcaacatc aggagccgtt tcttttgttc gtcagtcatg gtccgccctc accagttgtt 15600

cgtatcggtg tcggacgaac tgaaatcgca agagctgccg gtatcggtcc agccgctgtc 15660

cgtgtcgctg ctgccgaagc acggcgaggg gtccgcgaac gccgcagacg gcgtatccgg 15720

ccgcagcgca tcgcccagca tggccccggt cagcgagccg ccggccaggt agcccagcat 15780

ggtgctgttg gtcgccccgg ccaccagggc cgacgtgacg aaatcgccgt cattccctct 15840

ggattgttcg ctgctcggcg gggcagtgcg ccgcgccggc ggcgtcgtgg atggctcggg 15900

ttggctggcc tgcgacggcc ggcgaaaggt gcgcagcagc tcgttatcga ccggctgcgg 15960

cgtcggggcc gccgccttgc gctgcggtcg gtgttccttc ttcggctcgc gcagcttgaa 16020

cagcatgatc gcggaaacca gcagcaacgc cgcgcctacg cctcccgcga tgtagaacag 16080

catcggattc attcttcggt cctccttgta gcggaaccgt tgtctgtgcg gcgcgggtgg 16140

cccgcgccgc tgtctttggg gatcagccct cgatgagcgc gaccagtttc acgtcggcaa 16200

ggttcgcctc gaactcctgg ccgtcgtcct cgtacttcaa ccaggcatag ccttccgccg 16260

gcggccgacg gttgaggata aggcgggcag ggcgctcgtc gtgctcgacc tggacgatgg 16320

cctttttcag cttgtccggg tccggctcct tcgcgccctt ttccttggcg tccttaccgt 16380

cctggtcgcc gtcctcgccg tcctggccgt cgccggcctc cgcgtcacgc tcggcatcag 16440

tctggccgtt gaaggcatcg acggtgttgg gatcgcggcc cttctcgtcc aggaactcgc 16500

gcagcagctt gaccgtgccg cgcgtgattt cctgggtgtc gtcgtcaagc cacgcctcga 16560

cttcctccgg gcgcttcttg aaggccgtca ccagctcgtt caccacggtc acgtcgcgca 16620

cgcggccggt gttgaacgca tcggcgatct tctccggcag gtccagcagc gtgacgtgct 16680

gggtgatgaa cgccggcgac ttgccgattt ccttggcgat atcgcctttc ttcttgccct 16740

tcgccagctc gcggccaatg aagtcggcaa tttcgcgcgg ggtcagctcg ttgcgttgca 16800

ggttctcgat aacctggtcg gcttcgttgt agtcgttgtc gatgaacgcc gggatggact 16860

tcttgccggc ccacttcgag ccacggtagc ggcgggcgcc gtgattgatg atatagcggc 16920

ccggctgctc ctggttctcg cgcaccgaaa tgggtgactt caccccgcgc tctttgatcg 16980

tggcaccgat ttccgcgatg ctctccgggg aaaagccggg gttgtcggcc gtccgcggct 17040

gatgcggatc ttcgtcgatc aggtccaggt ccagctcgat agggccggaa ccgccctgag 17100

acgccgcagg agcgtccagg aggctcgaca ggtcgccgat gctatccaac cccaggccgg 17160

acggctgcgc cgcgcctgcg gcttcctgag cggccgcagc ggtgtttttc ttggtggtct 17220

tggcttgagc cgcagtcatt gggaaatctc catcttcgtg aacacgtaat cagccagggc 17280

gcgaacctct ttcgatgcct tgcgcgcggc cgttttcttg atcttccaga ccggcacacc 17340

ggatgcgagg gcatcggcga tgctgctgcg caggccaacg gtggccggaa tcatcatctt 17400

ggggtacgcg gccagcagct cggcttggtg gcgcgcgtgg cgcggattcc gcgcatcgac 17460

cttgctgggc accatgccaa ggaattgcag cttggcgttc ttctggcgca cgttcgcaat 17520

ggtcgtgacc atcttcttga tgccctggat gctgtacgcc tcaagctcga tgggggacag 17580

cacatagtcg gccgcgaaga gggcggccgc caggccgacg ccaagggtcg gggccgtgtc 17640

gatcaggcac acgtcgaagc cttggttcgc cagggccttg atgttcgccc cgaacagctc 17700

gcgggcgtcg tccagcgaca gccgttcggc gttcgccagt accgggttgg actcgatgag 17760

ggcgaggcgc gcggcctggc cgtcgccggc tgcgggtgcg gtttcggtcc agccgccggc 17820

agggacagcg ccgaacagct tgcttgcatg caggccggta gcaaagtcct tgagcgtgta 17880

ggacgcattg ccctgggggt ccaggtcgat cacggcaacc cgcaagccgc gctcgaaaaa 17940

gtcgaaggca agatgcacaa gggtcgaagt cttgccgacg ccgcctttct ggttggccgt 18000

gaccaaagtt ttcatcgttt ggtttcctgt tttttcttgg cgtccgcttc ccacttccgg 18060

acgatgtacg cctgatgttc cggcagaacc gccgttaccc gcgcgtaccc ctcgggcaag 18120

ttcttgtcct cgaacgcggc ccacacgcga tgcaccgctt gcgacactgc gcccctggtc 18180

agtcccagcg acgttgcgaa cgtcgcctgt ggcttcccat cgactaagac gccccgcgct 18240

atctcgatgg tctgctgccc cacttccagc ccctggatcg cctcctggaa ctggctttcg 18300

gtaagccgtt tcttcatgga taacacccat aatttgctcc gcgccttggt tgaacatagc 18360

ggtgacagcc gccagcacat gagagaagtt tagctaaaca tttctcgcac gtcaacacct 18420

ttagccgcta aaactcgtcc ttggcgtaac aaaacaaaag cccggaaacc gggctttcgt 18480

ctcttgccgc ttatggctct gcacccggct ccatcaccaa caggtcgcgc acgcgcttca 18540

ctcggttgcg gatcgacact gccagcccaa caaagccggt tgccgccgcc gccaggatcg 18600

cgccgatgat gccggccaca ccggccatcg cccaccaggt cgccgccttc cggttccatt 18660

cctgctggta ctgcttcgca atgctggacc tcggctcacc ataggctgac cgctcgatgg 18720

cgtatgccgc ttctcccctt ggcgtaaaac ccagcgccgc aggcggcatt gccatgctgc 18780

ccgccgcttt cccgaccacg acgcgcgcac caggcttgcg gtccagacct tcggccacgg 18840

cgagctgcgc aaggacataa tcagccgccg acttggctcc acgcgcctcg atcagctctt 18900

gcactcgcgc gaaatccttg gcctccacgg ccgccatgaa tcgcgcacgc ggcgaaggct 18960

ccgcagggcc ggcgtcgtga tcgccgccga gaatgccctt caccaagttc gacgacacga 19020

aaatcatgct gacggctatc accatcatgc agacggatcg cacgaacccg ctgaattgaa 19080

cacgagcacg gcacccgcga ccactatgcc aagaatgccc aaggtaaaaa ttgccggccc 19140

cgccatgaag tccgtgaatg ccccgacggc cgaagtgaag ggcaggccgc cacccaggcc 19200

gccgccctca ctgcccggca cctggtcgct gaatgtcgat gccagcacct gcggcacgtc 19260

aatgcttccg ggcgtcgcgc tcgggctgat cgcccatccc gttactgccc cgatcccggc 19320

aatggcaagg actgccagcg ctgccatttt tggggtgagg ccgttcgcgg ccgaggggcg 19380

cagcccctgg ggggatggga ggcccgcgtt agcgggccgg gagggttcga gaaggggggg 19440

cacccccctt cggcgtgcgc ggtcacgcgc acagggcgca gccctggtta aaaacaaggt 19500

ttataaatat tggtttaaaa gcaggttaaa agacaggtta gcggtggccg aaaaacgggc 19560

ggaaaccctt gcaaatgctg gattttctgc ctgtggacag cccctcaaat gtcaataggt 19620

gcgcccctca tctgtcagca ctctgcccct caagtgtcaa ggatcgcgcc cctcatctgt 19680

cagtagtcgc gcccctcaag tgtcaatacc gcagggcact tatccccagg cttgtccaca 19740

tcatctgtgg gaaactcgcg taaaatcagg cgttttcgcc gatttgcgag gctggccagc 19800

tccacgtcgc cggccgaaat cgagcctgcc cctcatctgt caacgccgcg ccgggtgagt 19860

cggcccctca agtgtcaacg tccgcccctc atctgtcagt gagggccaag ttttccgcga 19920

ggtatccaca acgccggcgg ccgcggtgtc tcgcacacgg cttcgacggc gtttctggcg 19980

cgtttgcagg gccatagacg gccgccagcc cagcggcgag ggcaaccagc ccggtgagcg 20040

tcggaaaggc gctggaagcc ccgtagcgac gcggagaggg gcgagacaag ccaagggcgc 20100

aggctcgatg cgcagcacga catagccggt tctcgcaagg acgagaattt ccctgcggtg 20160

cccctcaagt gtcaatgaaa gtttccaacg cgagccattc gcgagagcct tgagtccacg 20220

ctagatgaga gctttgttgt aggtggacca gttggtgatt ttgaactttt gctttgccac 20280

ggaacggtct gcgttgtcgg gaagatgcgt gatctgatcc ttcaactcag caaaagttcg 20340

atttattcaa caaagccacg ttgtgtctca aaatctctga tgttacattg cacaagataa 20400

aaatatatca tcatgaacaa taaaactgtc tgcttacata aacagtaata caaggggtgt 20460

tatgagccat attcaacggg aaacgtcttg ctcgactcta gagctcgttc ctcgaggcct 20520

cgaggcctcg aggaacggta cctgcgggga agcttacaat aatgtgtgtt gttaagtctt 20580

gttgcctgtc atcgtctgac tgactttcgt cataaatccc ggcctccgta acccagcttt 20640

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cgatccgtcg ccgggatacg gacaaaatgg agcgcagtag tccatcgagg gcggcgaaag 20940

cctcgccaaa agcaatacgt tcatctcgca cagcctccag atccgatcga gggtcttcgg 21000

cgtaggcaga tagaagcatg gatacattgc ttgagagtat tccgatggac tgaagtatgg 21060

cttccatctt ttctcgtgtg tctgcatcta tttcgagaaa gcccccgatg cggcgcaccg 21120

caacgcgaat tgccatacta tccgaaagtc ccagcaggcg cgcttgatag gaaaaggttt 21180

catactcggc cgatcgcaga cgggcactca cgaccttgaa cccttcaact ttcagggatc 21240

gatgctggtt gatggtagtc tcactcgacg tggctctggt gtgttttgac atagcttcct 21300

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agtctagccc tgctcaatat gaaatcaaca gtacatttac agtcaatact gaatatactt 21420

gctacatttg caattgtctt ataacgaatg tgaaataaaa atagtgtaac aacgctttta 21480

ctcatcgata atcacaaaaa catttatacg aacaaaaata caaatgcact ccggtttcac 21540

aggataggcg ggatcagaat atgcaacttt tgacgttttg ttctttcaaa gggggtgctg 21600

gcaaaaccac cgcactcatg ggcctttgcg ctgctttggc aaatgacggt aaacgagtgg 21660

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ctcgagcgag ctcaacaaca caatcatcgc tagctcaaac ctgcttctga tccccaccat 21900

gctaacgccg ctcgacatcg atgaggcact atctacctac cgctacgtca tcgagctgct 21960

gttgagtgaa aatttggcaa ttcctacagc tgttttgcgc caacgcgtcc cggtcggccg 22020

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gaaaaagccg acgagaaaga ccagcaacgt gagcctctcg tcgccgatca catttacagt 22440

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gcgataaaat cacttgctcc tagctcgagt gcaacaactt tatccgtctc ctcaaggcgg 23460

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cgtgaaggat gtacaatcat ctccagctaa atgggcagtt cgtcagaatt gcggctgacc 23820

gcggatgacg aaaatgcgaa ccaagtattt caattttatg acaaaagttc tcaatcgttg 23880

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aggcacggaa tggaatgatg acatcgatcg ccgtagagag catgtcaatc agtgtgcgat 24060

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tacgcagact tgcttggagc aagtgctcgg cgctcacagc acccagccca gcaccgttct 24300

tggagtagag tagtctaaca tgattatcgt gtggaatgac gagttcgagc gtatcttcta 24360

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tcaggcggag ctggtaaaca ccaaagaaat cgaggtcccg tgctacgaaa atggaaacgg 25080

tgtcaccctg attcttcttc agggttggcg gtatgttgat ggttgcctta agggctgtct 25140

cagttgtctg ctcaccgtta ttttgaaagc tgttgaagct catcccgcca cccgagctgc 25200

cggcgtaggt gctagctgcc tggaaggcgc cttgaacaac actcaagagc atagctccgc 25260

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actttacata gcctgccaaa tttgtgtcga ttgcggtttg caagatgcac ggaattattg 25560

tcccttgcgt taccataaaa tcggggtgcg gcaagagcgt ggcgctgctg ggctgcagct 25620

cggtgggttt catacgtatc gacaaatcgt tctcgccgga cacttcgcca ttcggcaagg 25680

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cgtatccata gatatacggg cacaagcctg ctcaacggca ccattgtggc tatagcgaac 27540

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taaaataccc tgaacaataa tccaaagagt gacacaggcg atcaatggcg cactcaccgc 28680

ctcctggata gtctcaagca tcgagtccaa gcctgtcgtg aaggctacat cgaagatcgt 28740

atgaatggcc gtaaacggcg ccggaatcgt gaaattcatc gattggacct gaacttgact 28800

ggtttgtcgc ataatgttgg ataaaatgag ctcgcattcg gcgaggatgc gggcggatga 28860

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catttcattg tctaggtcct tcgtcgaagg atactgattt ttctggttga gcgaagtcag 29340

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ctggctccta gcggcgattc cagaacatgc tctggttgct gcgttgccag tattagcatc 29940

ccgttgtttt ttcgaacggt caggaggaat ttgtcgacga cagtcgaaaa tttagggttt 30000

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aaatgatgtg agcccataac gaattcgttg ctcgcaagtg cgtcctcagc ctcggataat 31020

ttgccgattt gagtcacggc tttatcgccg gaactcagca tctggctcga tttgaggcta 31080

agtttcgcgt gcgcttgcgg gcgagtcagg aacgaaaaac tctgcgtgag aacaagtgga 31140

aaatcgaggg atagcagcgc gttgagcatg cccggccgtg tttttgcagg gtattcgcga 31200

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ggtgtgaacc gaccagtcat gatcaaccgt agcgcttcgc caatttcggt gaagagcaca 31380

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ttcaggctag cggcgaaaac actacggaag tgtcgcggcg ccgatgatgg cacgtcggca 31680

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tggccaatat aagggagata gatctcaccg gatctttcgg tcgttccact cgcgccgagc 31920

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gtctcttcgg attttagcgc ctcgtgatcg tcttttggag gctcgattaa cgcgggcacc 32820

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tcgccgcctg cataacgact tttcagcatg tttgcagcgg cagataatga tgtgcacgcc 33000

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aggccaacat ccagcgaatg ccgtgcatcg agacggtgcc tgacgacttg ggttgcttgg 33120

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aaggagacca tcaaggcaag agaaagcgac cccgatctct taagcatacc ttatctcctt 33360

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tgactggcca ggacgtcggc cgaaagagcg acaagcagat cacgcttttc gacagcgtcg 38280

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caaataccct ttaagaaatt aaaaaaacta aggaaacatt tttcttgttt cgagtagata 43020

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<210>44

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<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>载体

<400>44

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tgatataaat atcaatatat taaattagat tttgcataaa aaacagacta cataatactg 120

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ctttccccaa cctcgtgttg ttcggagcgc acacacacac aaccagatct cccccaaatc 2640

cacccgtcgg cacctccgct tcaaggtacg ccgctcgtcc tccccccccc ccctctctac 2700

cttctctaga tcggcgttcc ggtccatgca tggttagggc ccggtagttc tacttctgtt 2760

catgtttgtg ttagatccgt gtttgtgtta gatccgtgct gctagcgttc gtacacggat 2820

gcgacctgta cgtcagacac gttctgattg ctaacttgcc agtgtttctc tttggggaat 2880

cctgggatgg ctctagccgt tccgcagacg ggatcgattt catgattttt tttgtttcgt 2940

tgcatagggt ttggtttgcc cttttccttt atttcaatat atgccgtgca cttgtttgtc 3000

gggtcatctt ttcatgcttt tttttgtctt ggttgtgatg atgtggtctg gttgggcggt 3060

cgttctagat cggagtagaa ttctgtttca aactacctgg tggatttatt aattttggat 3120

ctgtatgtgt gtgccataca tattcatagt tacgaattga agatgatgga tggaaatatc 3180

gatctaggat aggtatacat gttgatgcgg gttttactga tgcatataca gagatgcttt 3240

ttgttcgctt ggttgtgatg atgtggtgtg gttgggcggt cgttcattcg ttctagatcg 3300

gagtagaata ctgtttcaaa ctacctggtg tatttattaa ttttggaact gtatgtgtgt 3360

gtcatacatc ttcatagtta cgagtttaag atggatggaa atatcgatct aggataggta 3420

tacatgttga tgtgggtttt actgatgcat atacatgatg gcatatgcag catctattca 3480

tatgctctaa ccttgagtac ctatctatta taataaacaa gtatgtttta taattatttt 3540

gatcttgata tacttggatg atggcatatg cagcagctat atgtggattt ttttagccct 3600

gccttcatac gctatttatt tgcttggtac tgtttctttt gtcgatgctc accctgttgt 3660

ttggtgttac ttctgcaggt cgactttaac ttagcctagg atccacacga caccatgata 3720

gaggtgaaac cgattaacgc agaggatacc tatgaactaa ggcatagaat actcagacca 3780

aaccagccga tagaagcgtg tatgtttgaa agcgatttac ttcgtggtgc atttcactta 3840

ggcggctatt acgggggcaa actgatttcc atagcttcat tccaccaggc cgagcactca 3900

gaactccaag gccagaaaca gtaccagctc cgaggtatgg ctaccttgga aggttatcgt 3960

gagcagaagg cgggatcgag tctaattaaa cacgctgaag aaattcttcg taagaggggg 4020

gcggacttgc tttggtgtaa tgcgcggaca tccgcctcag gctactacaa aaagttaggc 4080

ttcagcgagc agggagaggt attcgacacg ccgccagtag gacctcacat cctgatgtat 4140

aaaaggatca cataactagc tagtcagtta acctagactt gtccatcttc tggattggcc 4200

aacttaatta atgtatgaaa taaaaggatg cacacatagt gacatgctaa tcactataat 4260

gtgggcatca aagttgtgtg ttatgtgtaa ttactagtta tctgaataaa agagaaagag 4320

atcatccata tttcttatcc taaatgaatg tcacgtgtct ttataattct ttgatgaacc 4380

agatgcattt cattaaccaa atccatatac atataaatat taatcatata taattaatat 4440

caattgggtt agcaaaacaa atctagtcta ggtgtgtttt gcgaattcag agctcgaatt 4500

cattccgatt aatcgtggcc tcttgctctt caggatgaag agctatgttt aaacgtgcaa 4560

gcgctactag acaattcagt acattaaaaa cgtccgcaat gtgttattaa gttgtctaag 4620

cgtcaatttg tttacaccac aatatatcct gccaccagcc agccaacagc tccccgaccg 4680

gcagctcggc acaaaatcac cactcgatac aggcagccca tcagtccggg acggcgtcag 4740

cgggagagcc gttgtaaggc ggcagacttt gctcatgtta ccgatgctat tcggaagaac 4800

ggcaactaag ctgccgggtt tgaaacacgg atgatctcgc ggagggtagc atgttgattg 4860

taacgatgac agagcgttgc tgcctgtgat caaatatcat ctccctcgca gagatccgaa 4920

ttatcagcct tcttattcat ttctcgctta accgtgacag gctgtcgatc ttgagaacta 4980

tgccgacata ataggaaatc gctggataaa gccgctgagg aagctgagtg gcgctatttc 5040

tttagaagtg aacgttgacg atcgtcgacc gtaccccgat gaattaattc ggacgtacgt 5100

tctgaacaca gctggatact tacttgggcg attgtcatac atgacatcaa caatgtaccc 5160

gtttgtgtaa ccgtctcttg gaggttcgta tgacactagt ggttcccctc agcttgcgac 5220

tagatgttga ggcctaacat tttattagag agcaggctag ttgcttagat acatgatctt 5280

caggccgtta tctgtcaggg caagcgaaaa ttggccattt atgacgacca atgccccgca 5340

gaagctccca tctttgccgc catagacgcc gcgcccccct tttggggtgt agaacatcct 5400

tttgccagat gtggaaaaga agttcgttgt cccattgttg gcaatgacgt agtagccggc 5460

gaaagtgcga gacccatttg cgctatatat aagcctacga tttccgttgc gactattgtc 5520

gtaattggat gaactattat cgtagttgct ctcagagttg tcgtaatttg atggactatt 5580

gtcgtaattg cttatggagt tgtcgtagtt gcttggagaa atgtcgtagt tggatgggga 5640

gtagtcatag ggaagacgag cttcatccac taaaacaatt ggcaggtcag caagtgcctg 5700

ccccgatgcc atcgcaagta cgaggcttag aaccaccttc aacagatcgc gcatagtctt 5760

ccccagctct ctaacgcttg agttaagccg cgccgcgaag cggcgtcggc ttgaacgaat 5820

tgttagacat tatttgccga ctaccttggt gatctcgcct ttcacgtagt gaacaaattc 5880

ttccaactga tctgcgcgcg aggccaagcg atcttcttgt ccaagataag cctgcctagc 5940

ttcaagtatg acgggctgat actgggccgg caggcgctcc attgcccagt cggcagcgac 6000

atccttcggc gcgattttgc cggttactgc gctgtaccaa atgcgggaca acgtaagcac 6060

tacatttcgc tcatcgccag cccagtcggg cggcgagttc catagcgtta aggtttcatt 6120

tagcgcctca aatagatcct gttcaggaac cggatcaaag agttcctccg ccgctggacc 6180

taccaaggca acgctatgtt ctcttgcttt tgtcagcaag atagccagat caatgtcgat 6240

cgtggctggc tcgaagatac ctgcaagaat gtcattgcgc tgccattctc caaattgcag 6300

ttcgcgctta gctggataac gccacggaat gatgtcgtcg tgcacaacaa tggtgacttc 6360

tacagcgcgg agaatctcgc tctctccagg ggaagccgaa gtttccaaaa ggtcgttgat 6420

caaagctcgc cgcgttgttt catcaagcct tacagtcacc gtaaccagca aatcaatatc 6480

actgtgtggc ttcaggccgc catccactgc ggagccgtac aaatgtacgg ccagcaacgt 6540

cggttcgaga tggcgctcga tgacgccaac tacctctgat agttgagtcg atacttcggc 6600

gatcaccgct tccctcatga tgtttaactc ctgaattaag ccgcgccgcg aagcggtgtc 6660

ggcttgaatg aattgttagg cgtcatcctg tgctcccgag aaccagtacc agtacatcgc 6720

tgtttcgttc gagacttgag gtctagtttt atacgtgaac aggtcaatgc cgccgagagt 6780

aaagccacat tttgcgtaca aattgcaggc aggtacattg ttcgtttgtg tctctaatcg 6840

tatgccaagg agctgtctgc ttagtgccca ctttttcgca aattcgatga gactgtgcgc 6900

gactcctttg cctcggtgcg tgtgcgacac aacaatgtgt tcgatagagg ctagatcgtt 6960

ccatgttgag ttgagttcaa tcttcccgac aagctcttgg tcgatgaatg cgccatagca 7020

agcagagtct tcatcagagt catcatccga gatgtaatcc ttccggtagg ggctcacact 7080

tctggtagat agttcaaagc cttggtcgga taggtgcaca tcgaacactt cacgaacaat 7140

gaaatggttc tcagcatcca atgtttccgc cacctgctca gggatcaccg aaatcttcat 7200

atgacgccta acgcctggca cagcggatcg caaacctggc gcggcttttg gcacaaaagg 7260

cgtgacaggt ttgcgaatcc gttgctgcca cttgttaacc cttttgccag atttggtaac 7320

tataatttat gttagaggcg aagtcttggg taaaaactgg cctaaaattg ctggggattt 7380

caggaaagta aacatcacct tccggctcga tgtctattgt agatatatgt agtgtatcta 7440

cttgatcggg ggatctgctg cctcgcgcgt ttcggtgatg acggtgaaaa cctctgacac 7500

atgcagctcc cggagacggt cacagcttgt ctgtaagcgg atgccgggag cagacaagcc 7560

cgtcagggcg cgtcagcggg tgttggcggg tgtcggggcg cagccatgac ccagtcacgt 7620

agcgatagcg gagtgtatac tggcttaact atgcggcatc agagcagatt gtactgagag 7680

tgcaccatat gcggtgtgaa ataccgcaca gatgcgtaag gagaaaatac cgcatcaggc 7740

gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg 7800

tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa 7860

agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg 7920

cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga 7980

ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg 8040

tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg 8100

gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc 8160

gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg 8220

gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca 8280

ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt 8340

ggcctaacta cggctacact agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag 8400

ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg 8460

gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc 8520

ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt 8580

tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt 8640

ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca 8700

gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg 8760

tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac 8820

cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg 8880

ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc 8940

gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt gccattgctg 9000

cagggggggg gggggggggg gacttccatt gttcattcca cggacaaaaa cagagaaagg 9060

aaacgacaga ggccaaaaag cctcgctttc agcacctgtc gtttcctttc ttttcagagg 9120

gtattttaaa taaaaacatt aagttatgac gaagaagaac ggaaacgcct taaaccggaa 9180

aattttcata aatagcgaaa acccgcgagg tcgccgcccc gtaacctgtc ggatcaccgg 9240

aaaggacccg taaagtgata atgattatca tctacatatc acaacgtgcg tggaggccat 9300

caaaccacgt caaataatca attatgacgc aggtatcgta ttaattgatc tgcatcaact 9360

taacgtaaaa acaacttcag acaatacaaa tcagcgacac tgaatacggg gcaacctcat 9420

gtcccccccc cccccccccc tgcaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct 9480

tcattcagct ccggttccca acgatcaagg cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa 9540

aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta 9600

tcactcatgg ttatggcagc actgcataat tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc 9660

ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg 9720

agttgctctt gcccggcgtc aacacgggat aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa 9780

gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt accgctgttg 9840

agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc ttttactttc 9900

accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg 9960

gcgacacgga aatgttgaat actcatactc ttcctttttc aatattattg aagcatttat 10020

cagggttatt gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata 10080

ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tctaagaaac cattattatc 10140

atgacattaa cctataaaaa taggcgtatc acgaggccct ttcgtcttca agaattggtc 10200

gacgatcttg ctgcgttcgg atattttcgt ggagttcccg ccacagaccc ggattgaagg 10260

cgagatccag caactcgcgc cagatcatcc tgtgacggaa ctttggcgcg tgatgactgg 10320

ccaggacgtc ggccgaaaga gcgacaagca gatcacgctt ttcgacagcg tcggatttgc 10380

gatcgaggat ttttcggcgc tgcgctacgt ccgcgaccgc gttgagggat caagccacag 10440

cagcccactc gaccttctag ccgacccaga cgagccaagg gatctttttg gaatgctgct 10500

ccgtcgtcag gctttccgac gtttgggtgg ttgaacagaa gtcattatcg tacggaatgc 10560

caagcactcc cgaggggaac cctgtggttg gcatgcacat acaaatggac gaacggataa 10620

accttttcac gcccttttaa atatccgtta ttctaataaa cgctcttttc tcttaggttt 10680

acccgccaat atatcctgtc aaacactgat agtttaaact gaaggcggga aacgacaatc 10740

tgatcatgag cggagaatta agggagtcac gttatgaccc ccgccgatga cgcgggacaa 10800

gccgttttac gtttggaact gacagaaccg caacgttgaa ggagccactc agcaagctgg 10860

tacgattgta atacgactca ctatagggcg aattgagcgc tgtttaaacg ctcttcaact 10920

ggaagagcgg ttacccggac cgaagcttga agttcctatt ccgaagttcc tattctctag 10980

aaagtatagg aacttcagat ctcgatgctc accctgttgt ttggtgttac ttctgcaggt 11040

cgactctaga ggatccacca tgagcccaga acgacgcccg gccgacatcc gccgtgccac 11100

cgaggcggac atgccggcgg tctgcaccat cgtcaaccac tacatcgaga caagcacggt 11160

caacttccgt accgagccgc aggaaccgca ggactggacg gacgacctcg tccgtctgcg 11220

ggagcgctat ccctggctcg tcgccgaggt ggacggcgag gtcgccggca tcgcctacgc 11280

gggcccctgg aaggcacgca acgcctacga ctggacggcc gagtcgaccg tgtacgtctc 11340

cccccgccac cagcggacgg gactgggctc cacgctctac acccacctgc tgaagtccct 11400

ggaggcacag ggcttcaaga gcgtggtcgc tgtcatcggg ctgcccaacg acccgagcgt 11460

gcgcatgcac gaggcgctcg gatatgcccc ccgcggcatg ctgcgggcgg ccggcttcaa 11520

gcacgggaac tggcatgacg tgggtttctg gcagctggac ttcagcctgc cggtaccgcc 11580

ccgtccggtc ctgcccgtca ccgagatctg atccgtcgac caacctagac ttgtccatct 11640

tctggattgg ccaacttaat taatgtatga aataaaagga tgcacacata gtgacatgct 11700

aatcactata atgtgggcat caaagttgtg tgttatgtgt aattactagt tatctgaata 11760

aaagagaaag agatcatcca tatttcttat cctaaatgaa tgtcacgtgt ctttataatt 11820

ctttgatgaa ccagatgcat ttcattaacc aaatccatat acatataaat attaatcata 11880

tataattaat atcaattggg ttagcaaaac aaatctagtc taggtgtgtt ttgcgaattg 11940

cggccgcgat ctggggaatt cccatggaca ccggtaattc ccatgatctt ctctccttca 12000

tcaatggatg ccatgtttca taacaataac accaaatgtt tgatgagcta ccaacaattg 12060

cgcaaagact atggctaagc tcgagctcgc tcgctacaag ttgttgactt tcaaatacaa 12120

gtttgttttt ggaacaccaa atattctaca tgatctttca ctaagttgcg caccactatc 12180

aaaagattat ctaggccatt attcaagtaa agagtgaaca cgtctaagac ccacaaccac 12240

accaaataga atacgcatac atgcaacata ttgtgcaaga agtatccaac tggactccca 12300

tgtattctaa aactattttc gtagagttaa agttatgaca aacttatcaa ataaaaattt 12360

gaacgctgga ccaaaacttt catctttcaa atccaccatc gtctatcctc ataaattgtt 12420

ttgattataa cacatctacg taaatcattt gttttgaaca atactaattt aattttatta 12480

agtcaaataa cctgcttaga aaataatccc tccacctcat ttaacaattt cttgtcaaac 12540

acacaccaag aaaaaaatta atgaaagaga aaagaaatga aaaggacatg gagttgaata 12600

ctagcaaaat tgattgaagg aagattcaca attgaaattg aaaccattta atttattttc 12660

gggtccataa taataaattg gtaagaataa aaacccgatc aagtccggta cagtacaatt 12720

ccactccacc aactccttac ttaaacccct atttataccc actctcatcc tcactcttcc 12780

ttcacctctc acactctctt ctctctctca aaaccctcac acaaacgctg cgtttagtgt 12840

aagaaattca atccgg 12856

<210>45

<211>879

<212>DNA

<213>紫花苜蓿

<400>45

aattcccatg atcttctctc cttcatcaat ggatgccatg tttcataaca ataacaccaa 60

atgtttgatg agctaccaac aattgcgcaa agactatggc taagctcgag ctcgctcgct 120

acaagttgtt gactttcaaa tacaagtttg tttttggaac accaaatatt ctacatgatc 180

tttcactaag ttgcgcacca ctatcaaaag attatctagg ccattattca agtaaagagt 240

gaacacgtct aagacccaca accacaccaa atagaatacg catacatgca acatattgtg 300

caagaagtat ccaactggac tcccatgtat tctaaaacta ttttcgtaga gttaaagtta 360

tgacaaactt atcaaataaa aatttgaacg ctggaccaaa actttcatct ttcaaatcca 420

ccatcgtcta tcctcataaa ttgttttgat tataacacat ctacgtaaat catttgtttt 480

gaacaatact aatttaattt tattaagtca aataacctgc ttagaaaata atccctccac 540

ctcatttaac aatttcttgt caaacacaca ccaagaaaaa aattaatgaa agagaaaaga 600

aatgaaaagg acatggagtt gaatactagc aaaattgatt gaaggaagat tcacaattga 660

aattgaaacc atttaattta ttttcgggtc cataataata aattggtaag aataaaaacc 720

cgatcaagtc cggtacagta caattccact ccaccaactc cttacttaaa cccctattta 780

tacccactct catcctcact cttccttcac ctctcacact ctcttctctc tctcaaaacc 840

ctcacacaaa cgctgcgttt agtgtaagaa attcaatcc 879

Claims

1.在基因组中包含重组DNA构建体的植物，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，在与SEQ ID NO：13、17、19或21比较时，基于Clustal V比对方法，所述多肽的氨基酸序列具有至少50％的序列同一性，并且其中所述植物在与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时表现出改变的根构造。

2.权利要求1的植物，其中所述植物是玉米植物或大豆植物。

3.植物，所述植物在其基因组中包含：

重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含：

(a)可操作地连接至少一种调控元件的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，在与SEQ ID NO：13、17、19或21比较时，基于ClustalV比对方法，所述多肽的氨基酸序列具有至少50％的序列同一性，或

(b)抑制DNA构建体，所述构建体包含至少一种调控元件，所述调控元件可操作地连接至：

(i)以下序列的全部或部分：

(A)编码多肽的核酸序列，在与SEQ ID NO：13、17、19或21比较时，基于Clustal V比对方法，所述多肽的氨基酸序列具有至少50％的序列同一性，或

(B)所述(b)(i)(A)的核酸序列的全长互补序列；或

(ii)源自所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域，当与所述区域所来源的有义链或反义链的全部或部分比较时，基于Clustal V比对方法，所述区域的核酸序列具有至少50％的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码RT1或RT1样多肽，并且其中在与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时，所述植物表现出至少一种农学特性的改变。

4.权利要求3的植物，其中所述植物是玉米植物或大豆植物。

5.权利要求3的植物，其中在不同的环境条件下与所述未包含所述重组DNA构建体的所述对照植物比较时，所述植物表现出至少一种农学特性的所述改变。

6.权利要求5的植物，其中所述不同的环境条件为选自干旱、氮、土壤类型、昆虫或病害中的至少一种。

7.权利要求5的植物，其中所述植物是玉米植物或大豆植物。

8.权利要求6的植物，其中所述植物是玉米植物或大豆植物。

9.权利要求7的植物，其中所述植物是玉米植物或大豆植物。

10.权利要求3的植物，其中所述至少一种农学特性选自：绿度、产量、生长速率、生物量、成熟时的鲜重、成熟时的干重、果实产量、种子产量、总植物含氮量、果实含氮量、种子含氮量、营养组织含氮量、总植物游离氨基酸含量、果实游离氨基酸含量、种子游离氨基酸含量、营养组织游离氨基酸含量、总植物蛋白质含量、果实蛋白质含量、种子蛋白质含量、营养组织蛋白质含量、耐旱性、氮摄取、根穿透、根倒伏、茎倒状、植株高度、穗长和收获指数。

11.权利要求10的植物，其中所述植物是玉米植物或大豆植物。

12.权利要求3的植物，其中在与所述对照植物相比较时，所述植物表现出所述至少一种农学特性的增强。

13.权利要求12的植物，其中所述植物是玉米植物或大豆植物。

14.改变植物根构造的方法，所述方法包括：

(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，当与SEQ ID NO：13、17、19或21比较时，基于ClustalV比对方法，所述多肽的氨基酸序列具有至少50％的序列同一性；以及

(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体，并且在与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时表现出改变的根构造。

15.权利要求14的方法，所述方法还包括：

(c)获得源自所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体，并且在与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时表现出改变的根构造。

16.评价植物根构造的方法，所述方法包括：

(a)将重组DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，所述重组DNA构建体包含可操作地连接至少一种调控序列的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码多肽，当与SEQ ID NO：13、17、19或21比较时，基于ClustalV比对方法，所述多肽的氨基酸序列具有至少50％的序列同一性；

(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及

(c)评价与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较，所述转基因植物的根构造。

17.权利要求16的方法，所述方法还包括：

(d)获得源自所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及

(e)评价与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较，所述子代植物的根构造。

18.评价植物根构造的方法，所述方法包括：

(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；

(c)获得源自所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体；以及

(d)评价与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较，所述子代植物的根构造。

19.测定植物农学特性改变的方法，所述方法包括：

(c)测定所述转基因植物在与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。

20.权利要求19的方法，所述方法还包括：

(e)测定所述子代植物在与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。

21.权利要求19的方法，其中所述测定步骤包括：测定所述转基因植物在不同的环境条件下与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。

22.权利要求20的方法，其中所述不同的环境条件为选自干旱、氮、土壤类型、昆虫或病害中的至少一种。

23.权利要求20的方法，其中步骤(e)包括：测定所述子代植物在不同的环境条件下与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。

24.权利要求23的方法，其中所述不同的环境条件为选自干旱、氮、土壤类型、昆虫或病害中的至少一种。

25.测定植物农学特性改变的方法，所述方法包括：

(d)测定所述子代植物在与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。

26.权利要求25的方法，其中步骤(d)包括：测定所述转基因植物在不同的环境条件下与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。

27.测定植物农学特性改变的方法，所述方法包括：

(a)将抑制DNA构建体引入到可再生的植物细胞中，所述抑制DNA构建体包含至少一种调控元件，所述调控元件可操作地连接至：

(i)如下序列的全部或部分：

(B)所述(a)(i)(A)的核酸序列的全长互补序列；或

(ii)源自所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域，当与所述区域所来源的有义链或反义链的全部或部分比较时，基于Clustal V比对方法，所述区域的核酸序列具有至少50％的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码RT1或RT1样多肽；

(b)在步骤(a)之后，从可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述抑制DNA构建体；以及

(c)测定所述转基因植物在与未包含所述抑制DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。

28.权利要求27的方法，其中所述测定步骤包括：测定所述转基因植物在不同的环境条件下与未包含所述抑制DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。

29.权利要求28的方法，其中所述不同的环境条件为选自干旱、氮、土壤类型、昆虫或病害中的至少一种。

30.权利要求27的方法，所述方法还包括：

(d)获得源自所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述抑制DNA构建体；以及

(e)测定所述子代植物在与未包含所述抑制DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。

31.权利要求30的方法，其中步骤(e)包括：测定所述子代植物在不同的环境条件下与未包含所述抑制DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。

32.权利要求31的方法，其中所述不同的环境条件为选自干旱、氮、土壤类型、昆虫或病害中的至少一种。

33.测定植物农学特性改变的方法，所述方法包括：

(i)如下序列的全部或部分：

(B)所述(a)(i)(A)的核酸序列的全长互补序列；或

(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述抑制DNA构建体，并且当与未包含所述抑制DNA构建体的对照植物比较时表现出改变的根构造；

(c)获得源自所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述抑制DNA构建体；以及

(d)测定所述子代植物在与未包含所述抑制DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。

34.权利要求33的方法，其中步骤(d)包括：测定所述转基因植物在不同的环境条件下与未包含所述重组DNA构建体的对照植物比较时是否表现出至少一种农学特性的改变。

35.权利要求34的方法，其中所述不同的环境条件为选自干旱、氮、土壤类型、昆虫或病害中的至少一种。

36.改变植物根构造的方法，所述方法包括：

(i)如下序列的全部或部分：

(B)所述(a)(i)(A)的核酸序列的全长互补序列；或

(ii)源自所关注的靶基因的有义链或反义链的全部或部分的区域，当与所述区域所来源的有义链或反义链的全部或部分比较时，基于Clustal V比对方法，所述区域的核酸序列具有至少50％的序列同一性，并且其中所述所关注的靶基因编码RT1或RT1样多肽；以及

(b)在步骤(a)之后，从所述可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述抑制DNA构建体，并且其中当与未包含所述抑制DNA构建体的对照植物比较时，所述转基因植物表现出改变的根构造。

37.权利要求36的方法，所述方法还包括：

(c)获得源自所述转基因植物的子代植物，其中所述子代植物在其基因组中包含所述重组DNA构建体，并且其中当与未包含所述抑制DNA构建体的对照植物比较时，所述子代植物表现出改变的根构造。

38.评价植物根构造的方法，所述方法包括：

(i)如下序列的全部或部分：

(B)所述(a)(i)(A)的核酸序列的全长互补序列；或

(c)评价当与未包含所述抑制DNA构建体的对照植物相比较时，所述转基因植物的根构造。

39.权利要求38的方法，所述方法还包括：

(e)评价当与未包含所述抑制DNA构建体的对照植物比较时，所述子代植物的根构造。

40.评价植物根构造的方法，所述方法包括：

(i)如下序列的全部或部分：

(B)所述(a)(i)(A)的核酸序列的全长互补序列；或

(b)在步骤(a)之后，从可再生的植物细胞再生出转基因植物，其中所述转基因植物在其基因组中包含所述抑制DNA构建体；

(d)评价当与未包含所述抑制DNA构建体的对照植物比较时，所述子代植物的根构造。

41.分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含：

(i)编码多肽的核酸序列，当与SEQ ID NO：13或21比较时，基于Clustal V比对方法，所述多肽的氨基酸序列具有至少80％的序列同一性；或

(ii)(i)的核酸序列的全长互补序列。

42.分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含：

(i)编码多肽的核酸，当与SEQ ID NO：13或21比较时，基于ClustalV比对方法，所述多肽的氨基酸序列具有至少85％的序列同一性或

(ii)(i)的核酸序列的全长互补序列。

43.分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含：

(i)编码多肽的核酸序列，当与SEQ ID NO：13或21比较时，基于Clustal V比对方法，所述多肽的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性；或

(ii)(i)的核酸序列的全长互补序列。

44.分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含：

(i)编码多肽的核酸序列，当与SEQ ID NO：13或21比较时，基于Clustal V比对方法，所述多肽的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性；或

(ii)(i)的核酸序列的全长互补序列。

45.权利要求41的多核苷酸，其中所述多肽序列包含SEQ ID NO：13或21。

46.权利要求41的多核苷酸，其中所述核酸序列包含SEQ ID NO：12或20。

47.载体，所述载体包含权利要求41的多核苷酸。

48.重组DNA构建体，所述重组DNA构建体包含与至少一种调控序列可操作地连接的权利要求41的多核苷酸。

49.用于转化细胞的方法，所述方法包括用权利要求41的多核苷酸转化细胞。

50.细胞，所述细胞包含权利要求48的重组DNA构建体。

51.用于生产植物的方法，所述方法包括使用权利要求41的所述多核苷酸转化植物细胞以及从转化过的植物细胞再生植物。

52.权利要求41的分离的多核苷酸，其中所述多肽序列包含至少一种选自SEQ ID NO：22和23的基序，其中所述基序是基本上保守的亚序列。

53.编码多肽的分离的多核苷酸，其中所述多肽的表达导致改变的根构造，并且其中所述多肽序列包含至少一种选自SEQ ID NO：22和23的基序，其中所述基序是基本上保守的亚序列。