CN101646766B

CN101646766B - △17去饱和酶及其用于制备多不饱和脂肪酸的用途

Info

Publication number: CN101646766B
Application number: CN2007800139991A
Authority: CN
Inventors: Z·薛; Q·Q·朱
Original assignee: EI Du Pont de Nemours and Co
Current assignee: EIDP Inc
Priority date: 2006-04-20
Filing date: 2007-04-19
Publication date: 2013-03-27
Anticipated expiration: 2027-04-19
Also published as: US20070249026A1; ATE542892T1; EP2010648B1; JP2009534032A; WO2007123999A3; AU2007240741B2; WO2007123999A2; MX2008013306A; EP2010648A2; US7465793B2; DK2010648T3; AU2007240741A1; CN101646766A

Abstract

本发明涉及Δ17去饱和酶，其具有将ω-6脂肪酸转变为其ω-3对应物的能力(即转变花生四烯酸[20:4，ARA]为二十碳五烯酸[20:5，EPA])。公开了编码Δ17去饱和酶的分离核酸片段和含有该类片段的重组构建体，以及使用这些Δ17去饱和酶在植物和油脂酵母中制备长链多不饱和脂肪酸(PUFA)的方法。

Description

△17去饱和酶及其用于制备多不饱和脂肪酸的用途

本申请要求于2006年4月20日申请的美国临时专利申请60/793575的权益。

发明领域

本发明属于生物技术领域。更具体地说，本发明涉及编码Δ17脂肪酸去饱和酶的核酸片段的鉴定以及这些去饱和酶制备长链多不饱和脂肪酸(PUFA)的用途。

发明背景

PUFA的重要性是无可置疑的。例如，某些PUFA是健康细胞的重要生物组分，被看成是：“必需”脂肪酸，其无法在哺乳动物中重新从头合成，而是必须在饮食中获得，或者来自亚油酸(LA；18:2ω-6)或α-亚麻酸(ALA；18:3ω-3)的进一步去饱和和延长；细胞胞质膜组分，在胞质膜中它们可以以诸如磷脂或者三酰甘油的形式存在；正常发育(尤其是正在发育的婴儿大脑)以及组织形成与修复所必需的；以及，哺乳动物中几种重要的生物活性类二十烷酸的前体(例如环前列腺素、类二十烷酸、白三烯、前列腺素)。另外，长链ω-3PUFA的高摄入产生心血管保护作用(Dyerberg，J.等，Amer.J.Clin.Nutr.，28：958-966(1975)；Dyerberg，J.等，Lancet，2(8081)：117-119(1978年7月15日)；Shimokawa，H.，World Rev.Nutr.Diet，88：100-108(2001)；von Schacky，C.和Dyerberg，J.，World Rev.Nutr.Diet，88：90-99(2001))。再者，众多的其它研究以文件形式记录了由ω-3和/或ω-6PUFA给药赋予的针对多种症状和疾病(例如哮喘、银屑病、湿疹、糖尿病、癌症)的广泛范围的健康利益。

正在研究包括植物、藻类、真菌和酵母在内的多种不同宿主作为工业化PUFA生产的手段。遗传工程已表明，某些宿主(即便是天然限于LA和ALA脂肪酸生产的那些宿主)的天然能力可被显著改变，导致高水平生产花生四烯酸(ARA；20:4ω-6)、二十碳五烯酸(EPA；20:5ω-3)和二十二碳六烯酸(DHA；22:6ω-3)。无论ω-3/ω-6PUFA生产是天然能力还是重组技术的结果，两种策略都可能需要将ω-6PUFA转变为其ω-3对应物。具体地说，Δ15去饱和酶负责将LA转变为ALA，而Δ17去饱和酶负责将ARA转变为EPA(尽管某些Δ17去饱和酶还可以使用二均γ亚麻酸(DGLA；20:3ω-6)作为底物来产生二十碳四烯酸(ETA；20:4ω-3))。这两种酶在下列途径中都具有作用：Δ6去饱和酶/Δ6延长酶途径(该途径主要存在于藻类、藓类、真菌、线虫和人中，以生产γ亚油酸(GLA；18:3ω-6)和/或十八碳四烯酸(STA；18:4ω-3)为特征)和Δ9延长酶/Δ8去饱和酶途径(该途径在某些生物(例如眼虫物种)中运行，以生产二十碳二烯酸(EDA；20:2ω-6)和/或二十碳三烯酸(ETrA；20:3ω-3)为特征)(图1)。

基于Δ17去饱和酶所起的作用，由此能够有效地进行ω-3脂肪酸合成，已付出了相当大的努力由多种来源鉴定和表征这些酶。然而，目前仅已知少数Δ17去饱和酶。具体地说，美国专利公布号2003/0190733描述了来自异枝水霉(Saprolegnia diclina)的Δ17去饱和酶的分离和表征(另参见GenBank登录号AY373823)。PCT公布号WO2005/083053提供了致病疫霉(Phytophthora infestans)的“ω3去饱和酶”的序列(另参见GenBank登录号CAJ30870)，而PCT公布号WO2006/100241提供了大豆疫霉(Phytophthora sojae)“ω3去饱和酶”的序列，这二者似乎均编码Δ17去饱和酶。另外，获得临时申请号60/855177的共同拥有的共同未决申请公开了来自瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)的Δ17去饱和酶的氨基酸和核酸序列。因此，需要鉴定和分离编码Δ17去饱和酶的其它基因，这些基因适于在多种用于生产ω-3脂肪酸的宿主生物中异源表达。

申请人已通过由卵菌、栎树猝死病菌(Phytophthora ramorum)和大豆疫霉(Phytophthora sojae)分离编码Δ17去饱和酶的基因解决了所述问题。

发明概述

本发明涉及编码具有Δ17去饱和酶活性的多肽的新的遗传构建体，以及它们在植物和酵母中用于生产PUFA和尤其是ω-3脂肪酸的用途。

因此，本发明提供选自以下的分离的核酸分子：

a)编码Δ17去饱和酶的分离的核苷酸序列，其选自SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：7；或

b)与(a)完全互补的分离的核苷酸序列。

在又一个实施方案中，本发明提供本发明的遗传构建体，其为了在耶氏酵母属(Yarrowia sp.)中表达而进行了密码子优化。另外，本发明提供用本发明的遗传构建体转化的宿主细胞，用于表达和生产ω-3脂肪酸。

在又一个实施方案中，本发明提供用于生产二十碳五烯酸的方法，所述方法包括：

a)提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包含：

i)一种编码Δ17去饱和酶多肽的分离的核苷酸分子，所述分离的核苷酸分子选自：

1)编码Δ17去饱和酶多肽的分离的核苷酸分子，所述Δ17去饱和酶多肽在基于Clustal比对方法与具有示于SEQID NO：2的氨基酸序列的多肽对比时具有至少90.9％的同一性；

2)编码Δ17去饱和酶多肽的分离的核苷酸分子，所述Δ17去饱和酶多肽在基于Clustal比对方法与具有示于SEQID NO：4的氨基酸序列的多肽对比时具有至少91.4％的同一性；和

3)编码Δ17去饱和酶多肽的分离的核苷酸分子，所述Δ17去饱和酶多肽在基于Clustal比对方法与具有示于SEQID NO：6的氨基酸序列的多肽对比时具有至少89.5％的同一性；和

ii)花生四烯酸的来源；

b)在其中表达编码Δ17去饱和酶多肽的核酸分子和花生四烯酸转变为二十碳五烯酸的条件下培养步骤(a)的宿主细胞；和

c)任选地回收步骤(b)的二十碳五烯酸。

在一个替代性实施方案中，本发明提供用于生产二十碳四烯酸的方法，所述方法包括：

a)提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包含：

ii)二均γ亚麻酸的来源；

b)在其中表达编码Δ17去饱和酶多肽的核酸分子和二均γ亚麻酸转变为二十碳四烯酸的条件下培养步骤(a)的宿主细胞；和

c)任选地回收步骤(b)的二十碳四烯酸。

在又一个实施方案中，本发明提供用于生产α-亚麻酸的方法，所述方法包括：

a)提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包含：

i)一种编码双功能Δ17去饱和酶多肽的分离的核苷酸分子，所述分离的核苷酸分子选自：

ii)亚油酸的来源；

b)在其中表达编码双功能Δ17去饱和酶多肽的核酸分子和亚油酸转变为α-亚麻酸的条件下培养步骤(a)的宿主细胞；和

c)任选地回收步骤(b)的α-亚麻酸。

生物保藏

以下生物物质已保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801University Boulevard，Manassas，VA20110-2209，并有以下名称、保藏号及保藏日期。

生物材料	保藏号	保藏日期
			解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)Y2047	ATCCPTA-7186	2005年10月26日

以上列出的生物材料按照国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约的条款保藏。所列出的保藏物在所示国际保藏机构保持至少30年，公众可在授予公开其的专利时获得。保藏物的可用性不构成在废除通过政府行为授予的专利权时实施本主题发明的许可。

附图和序列表的简述

图1图解了ω-3/ω-6脂肪酸的生物合成途径。

图2显示了大豆疫霉Δ17去饱和酶基因(称为“PsD17”；SEQ IDNO：1)和为了在解脂耶氏酵母(Y.lipolytica.)中表达而进行了密码子优化的合成基因(称为“PsD17S”；SEQ ID NO：3)的DNA序列的比较。

图3提供了以下的质粒图谱：(A)pPsD17S；(B)pKUNF1-KEA；(C)pDMW214；和(D)pFmPs17S。

图4A图示了解脂耶氏酵母菌株Y2047的发育，其产生全脂质级分11％的ARA。图4B提供了pKUNF12T6E的质粒图谱，而图4C提供了pDMW271的质粒图谱。

图5提供了pZP3-P7U的质粒图谱。

图6A图示了解脂耶氏酵母菌株Y4070的发育，其产生全脂质级分12％的ARA。图6B提供了pZKLeuN-29E3的质粒图谱，而图6C提供了pY116的质粒图谱。

图7提供了以下的质粒图谱：(A)pKO2UF8289；和(B)pZKSL-555R。

图8显示了栎树猝死病菌Δ17去饱和酶基因(称为“PrD17”；SEQID NO：5)和为了在解脂耶氏酵母中表达而进行了密码子优化的合成基因(称为“PrD17S”；SEQ ID NO：7)的DNA序列的比较。

图9提供了以下的质粒图谱：(A)pPrD17S；(B)pZUFPrD17S；和(C)pZUF17。

由以下构成本申请组成部分的详述和随附的序列描述可更完整地理解本发明。

以下序列遵照37C.F.R.§1.821-1.825(“含有核苷酸序列和/或氨基酸序列的专利申请的相关要求公告-序列规则”)，并与世界知识产权组织(WIPO)标准ST.25(1998)以及EPO与PCT的序列表要求(行政指导的规则5.2与49.5(a-bis)，以及208节与附件C)相一致。用于核苷酸及氨基酸序列数据的符号与格式遵照37C.F.R.§1.822所示的规则。

SEQ ID NO：1-40为如在表1中所确定的编码基因、蛋白或质粒的ORF。

表1

基因和蛋白质SEQ ID标号的概述

描述和缩写	核酸SEQ ID NO.	蛋白质SEQ ID NO.
			大豆疫霉Δ17去饱和酶(“PsD17”)	1(1092bp)	2(363AA)
来源于大豆疫霉、为在解脂耶氏酵母中表达而进行了密码子优化的合成Δ17去饱和酶(“PsD17S”)	3(1086bp)	4(361AA)
			栎树猝死病菌Δ17去饱和酶(“PrD17”)	5(1086bp)	6(361AA)
来源于栎树猝死病菌、为在解脂耶氏酵母中表达而进行了密码子优化的合成Δ17去饱和酶(“PrD17S”)	7(1086bp)	6(361AA)
			致病疫霉Δ17去饱和酶(“PiD17”)	8(1086bp)	9(361AA)
质粒pPsD17S	10(3806bp)	--
			质粒pKunF1-KEA	11(6619bp)	--
质粒pDMW214	12(9513bp)	--

质粒pFmPsD17S	13(8727bp)
			质粒pKUNF12T6E	14(12,649bp)
来源于金黄色破囊壶菌(Thraustochytrium aureum)(美国专利号6,677,145)、为在解脂耶氏酵母中表达而进行了密码子优化的合成C_18/20延长酶(“EL2S”)	15(819bp)	16(272AA)
			质粒pDMW271	17(13,034bp)
来源于人(Homo sapiens)的合成Δ5去饱和酶(GenBank登录号NP_037534)，其为在解脂耶氏酵母中表达而进行了密码子优化	18(1335bp)	19(444AA)
			质粒pZP3-P7U	20(8867bp)	--
大肠杆菌LoxP重组位点，由Cre重组酶识别	21(34bp)	--
			质粒pZKLeuN-29E3	22(14,655bp)	--
纤细裸藻(Euglena gracilis)Δ9延长酶(美国专利申请号11/601563和11/601564)(“EgD9e”)	31(777bp)	24(258AA)
			来源于纤细裸藻的合成Δ9延长酶(美国专利申请号11/601563和11/601564)，其为在解脂耶氏酵母中表达而进行了密码子优化(“EgD9eS”)	23(777bp)	24(258AA)
来源于高山被孢霉(Mortierella alpina)	25	26

ELO3的合成C_16/18延长酶(美国专利申请号11/253882)，其为在解脂耶氏酵母中表达而进行了密码子优化(“ME3S”)	(828bp)	(275AA)
			质粒pY116	27(8739bp)	--
质粒pKO2UF8289	28(15,304bp)	--
			来源于纤细裸藻的合成突变Δ8去饱和酶(美国专利申请号11/635258)(“突变EgD8S-23”)	29(1272bp)	30(422AA)
质粒pZKSL-555R	32(13,707bp)	--
			纤细裸藻Δ5去饱和酶(美国专利申请号60/801172)(“EgD5”)	37(1350bp)	34(449AA)
来源于纤细裸藻(美国专利申请号60/801172)、为在解脂耶氏酵母中表达而进行了密码子优化的合成Δ5去饱和酶(“EgD5S”)	33(1350bp)	34(449AA)
			来源于多甲藻属(Peridinium sp.)CCMP626(美国专利申请号60/801119)、为在解脂耶氏酵母中表达而进行了密码子优化的合成Δ5去饱和酶(“RD5S”)	35(1392bp)	36(463AA)
质粒pPrD17S	38(3806bp)	--
			质粒pZUF17	39(8165bp)	--
质粒pZUFPrD17S	40(8174bp)	--

发明详述

本文援引的所有专利、专利申请和出版物都整体引入本文作为参考。这具体地包括以下申请人的代理人的共同未决申请：美国专利7,125,672、美国专利7,189,559、美国专利7,192,762、美国专利申请号10/840579和10/840325(2004年5月6日申请)、美国专利申请号10/869630(2004年6月16日申请)、美国专利申请号10/882760(2004年7月1日申请)、美国专利申请号10/985254和10/985691(2004年11月10日申请)、美国专利申请号10/987548(2004年11月12日申请)、美国专利申请号11/024545和11/024544(2004年12月29日申请)、美国专利申请号11/166993(2005年6月24日申请)、美国专利申请号11/183664(2005年7月8日申请)、美国专利申请号11/185301(2005年7月20日申请)、美国专利申请号11/190750(2005年7月27日申请)、美国专利申请号11/198975(2005年8月8日申请)、美国专利申请号11/225354(2005年9月13日申请)、美国专利申请号11/253882(2005年10月19日申请)、美国专利申请号11/264784和11/264737(2005年11月1日申请)、美国专利申请号11/265761(2005年11月2日申请)、美国专利申请号60/795810(2006年4月28日申请)、美国专利申请号60/793575(2006年4月20日申请)、美国专利申请号60/796637(2006年5月2日申请)、美国专利申请号60/801172和60/801119(2006年5月17日申请)、美国专利申请号60/853563(2006年10月23日申请)、美国专利申请号60/855177(2006年10月30日申请)、美国专利申请号11/601563和11/601564(2006年11月16日申请)、美国专利申请号11/635258(2006年12月7日申请)和美国专利申请号11/613420(2006年12月20日申请)。

按照本发明，申请人鉴定出新颖的卵菌门Δ17去饱和酶和编码该酶的基因，可使用该酶操控生成有益于健康的PUFA的生化途径。因此，本发明具有很多应用。通过本文公开的方法制备的PUFA或其衍生物可作为饮食代用品或添加剂，尤其是婴儿配方食品，用于进行静脉营养或者预防或治疗营养不良的患者。或者，纯化的PUFA(或其衍生物)可被掺入到食用油、脂肪或配制的人造黄油中，使得在正常使用时接受者会接受所需量的饮食补充。PUFA还可以被掺入到婴儿配方食品、营养添加剂或其它食物产品中，并可以用作抗炎或降低胆固醇的试剂。任选地，所述组合物可用于药学用途(人类的或兽医的)。

对人或动物补充通过重组方式生产的PUFA可以使所加入的PUFA及其代谢产物的水平增加。例如，用EPA治疗不仅可以使EPA水平提高，还可以提高EPA下游产物如类二十烷酸(即前列腺素、白三烯、凝血線烷)的水平。复杂的调控机制会使其需要组合多种PUFA或添加不同的PUFA缀合物，以便预防、控制或克服这样的机制，以在个体中获得期望水平的特定PUFA。

定义

在本文公开内容中使用大量术语和缩写。提供以下的定义。.

“可读框”缩写为ORF。

“聚合酶链式反应”缩写为PCR。

“美国典型培养物保藏中心”缩写为ATCC。

“多不饱和脂肪酸”缩写为PUFA。

“三酰甘油”缩写为TAG。

本文使用的术语“发明”或“本发明”是指如在本文的权利要求书和说明书中描述的本发明的所有方面和实施方案，并且不应被解读为限于任何具体的实施方案或方面。

术语“脂肪酸”是指可变链长的长链脂肪族酸(烷酸)，其长度从约C₁₂至C₂₂(尽管已知有更长及更短链长的酸)。多数链长在C₁₆和C₂₂之间。脂肪酸的结构可以通过一个简单的符号体系“X:Y”来表示，其中X是特定脂肪酸中碳(C)原子的总数，而Y是双键的数目。涉及“饱和脂肪酸”对“不饱和脂肪酸”、“单不饱和脂肪酸”对“多不饱和脂肪酸”(或“PUFA”)以及“ω-6脂肪酸”(ω-6或n-6)对“ω-3脂肪酸”(ω-3或n-3)之间差异的其它细节提供于PCT公布号WO2004/101757。

在本文公开内容中用于描述PUFA的命名法示于以下表2。在标题为“简化符号”的列中，使用ω参照系统来指明碳原子数、双键数以及由ω碳(为此该碳被编号为1)计数最接近ω碳的双键位置。表中其余部分总结了ω-3与ω-6脂肪酸及其前体的常用名、在说明书全文中将使用的缩写及每种化合物的化学名。

表2

多不饱和脂肪酸和前体的命名

常用名	缩写	化学名	简化符号
				肉豆蔻酸	--	十四酸	14:0
棕榈酸	棕榈酸	十六酸	16:0
				棕榈油酸	--	9-十六碳烯酸	16:1
硬脂酸	--	十八酸	18:0
				油酸	--	顺式-9-十八烯酸	18:1
亚油酸	LA	顺式-9，12-十八碳二烯酸	18:2ω-6
				γ-亚油酸	GLA	顺式-6，9，12-十八碳三烯酸	18:3ω-6
二十碳二烯酸	EDA	顺式-11，14-二十碳二烯酸	20:2ω-6
				二均-γ-亚油酸	DGLA	顺式-8，11，14-二十碳三烯酸	20:3ω-6
二十碳四烯酸	ARA	顺式-5，8，11，14-二十碳四烯酸	20:4ω-6
				α-亚油酸	ALA	顺式-9，12，15-十八碳三烯酸	18:3ω-3
十八碳四烯酸	STA	顺式-6，9，12，15-十八碳四烯酸	18:4ω-3
				二十碳三烯酸	ETrA	顺式-11，14，17-二十碳三烯酸	20:3ω-3
二十碳四烯酸	ETA	顺式-8，11，14，17-二十碳四烯酸	20:4ω-3

二十碳五烯酸	EPA	顺式-5，8，11，14，17-二十碳五烯酸	20:5ω-3
				二十二碳五烯酸	DPA	顺式-7，10，13，16，19-二十二碳五烯酸	22:5ω-3
二十二碳六烯酸	DHA	顺式-4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸	22:6ω-3

术语“三酰甘油”、“油”和“TAG”是指由3个脂肪酰基残基和其酯化的甘油分子组成的中性脂质(这些术语在本公开内容全文中可交互使用)。这些油可含有长链PUFA以及较短的饱和与不饱和脂肪酸和较长链的饱和脂肪酸。因此，“油生物合成”一般是指细胞中的TAG合成。“微生物油”或“单细胞油”是由微生物在其存活期间自然产生的那些油。

“总脂质和油质级分中的PUFA百分率(％)”是指在那些级分中PUFA相对于总脂肪酸的百分率。术语“总脂质级分”或“脂质级分”均是指产油生物中所有脂质(即中性的和极性的)的总和，因此包括位于磷脂酰胆碱(PC)级分、磷脂酰乙醇胺(PE)级分和三酰甘油(TAG或油质)级分中的那些脂质。然而，术语“脂质”和“油质”在本说明书全文中可交互使用。

“代谢途径”或“生物合成途径”在生物化学意义上可被看作是在细胞中发生、由酶催化的一系列化学反应，以实现由细胞使用或储存的代谢产物的形成，或启动另一个代谢途径(因而叫做流动产生步骤)。这些途径有许多是非常精细的，包括初始物质的逐步修饰，以将其定型为具有所需的精确化学结构的产物的步骤。

术语“PUFA生物合成途径”是指将油酸转变为LA、EDA、GLA、DGLA、ARA、ALA、STA、ETrA、ETA、EPA、DPA和DHA的代谢过程。该过程在文献中已被充分描述(例如参见PCT公布号WO2006/052870)。简而言之，该过程包括经由在内质网膜中存在的一系列专用的去饱酶和延长酶(即“PUFA生物合成途径酶”)通过添加碳原子延长碳链和通过添加双键去饱和该分子。更具体地说，“PUFA生物合成途径酶”是指与PUFA的生物合成相关的下列酶中的任一种(和编码所述酶的基因)，包括：Δ4去饱和酶、Δ5去饱和酶、Δ6去饱和酶、Δ12去饱和酶、Δ15去饱和酶、Δ17去饱和酶、Δ9去饱和酶、Δ8去饱和酶、Δ9延长酶、C_14/16延长酶、C_16/18延长酶、C_18/20延长酶和/或C_20/22延长酶。

术语“ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径”指的是一系列基因，当它们在适当条件下表达时，所编码的酶催化ω-3及ω-6这两种脂肪酸的产生。典型地，涉及ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径的基因编码PUFA生物合成途径酶。代表性的途径如图1所示，提供了油酸通过多种中间体向DHA的转变，该图展示了如何可以从普通来源生产ω-3和ω-6这两种脂肪酸。该途径被自然分成两部分，其中一部分产生ω-3脂肪酸，另一部分仅产生ω-6脂肪酸。仅产生ω-3脂肪酸的那部分在本文中被称为ω-3脂肪酸生物合成途径，而仅产生ω-6脂肪酸的那部分在本文中被称为ω-6脂肪酸生物合成途径。

本文在ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径背景中使用的术语“功能性的”是指在途径中的部分(或全部)基因表达活性酶，产生体内催化或底物转变。应当理解的是，“ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径”或“功能性ω-3/ω-6脂肪酸生物合成途径”并不暗示以上段落中列出的所有基因都是必需的，因为很多脂肪酸产物仅需要该途径中的部分基因表达。

术语“去饱和酶”是指可以在一种或多种脂肪酸中去饱和(即引入双键)而生成目标脂肪酸或前体的多肽。尽管在本说明书全文中使用ω-参照系统指示特定脂肪酸，但使用Δ-系统从底物的羧基末端计数指示去饱和酶活性更为便利。本文中令人关注的是：1)Δ8去饱和酶，其催化EDA转变为DGLA和/或ETrA转变为ETA；2)Δ5去饱和酶，其催化DGLA转变为ARA和/或ETA转变为EPA；3)Δ6去饱和酶，其催化LA转变为GLA和/或ALA转变为STA；4)Δ4去饱和酶，其催化DPA转变为DHA；5)Δ12去饱和酶，其催化油酸转变为LA；6)Δ15去饱和酶，其催化LA转变为ALA和/或GLA转变为STA；和7)Δ9去饱和酶，其催化棕榈酸转变为棕榈油酸(16:1)和/或硬脂酸转变为油酸(18:1)。

在本文中尤其令人感兴趣的是Δ17去饱和酶，其去饱和由分子的羧基末端编号的第17个和第18个碳原子之间的脂肪酸，并例如催化ARA转变为EPA(和任选地DGLA转变为ETA)。在本领域中，Δ17去饱和酶(还有Δ15去饱和酶)基于其将ω-6脂肪酸转变为其ω-3对应物的能力(例如分别为LA转变成ALA，或DGLA转变成ETA，以及ARA转变成EPA)，有时也被称为“Ω-3去饱和酶”、“w-3去饱和酶”和/或“ω-3去饱和酶”。

某些去饱和酶对两种或更多种底物具有活性。基于该能力，针对这些酶的去饱和酶活性还可以将这些酶分类为“单功能的”或“双功能的”。在某些实施方案中，最理想的是如下凭经验确定脂肪酸去饱和酶的特异性：用脂肪酸去饱和酶的基因转化适宜的宿主，并确定其对宿主脂肪酸谱的影响。

更具体地说，Δ17去饱和酶在本文被定义为具有单功能或双功能的Δ17去饱和酶活性的那些脂肪酸去饱和酶，其中Δ17去饱和酶活性是ARA转变为EPA和/或DGLA转变为ETA。术语“单功能Δ17去饱和酶”、“单功能Δ17去饱和酶活性”或“独有的Δ17去饱和酶活性”是指能够将ARA转变为EPA和/或DGLA转变为ETA但不能将LA转变为ALA的Δ17去饱和酶。相对应地，“双功能Δ17去饱和酶”、“双功能Δ17去饱和酶活性”或“主要的Δ17去饱和酶活性”是指优先将ARA转变为EPA和/或DGLA转变为ETA但额外具有将LA转变为ALA的有限能力的Δ17去饱和酶(由此表现出主要的Δ17去饱和酶活性和有限的Δ15去饱和酶活性)。

应当指出的是，Δ17去饱和酶可具有在该类别中不相关的、非Δ17和Δ15去饱和的特异性。还应当指出的是，单功能和双功能的Δ17去饱和酶之间的区别在于事实区别且不是绝对的；例如该酶可发挥单功能的或双功能的Δ17去饱和酶活性，这取决于其表达水平或生长条件。

对本文目的来说，术语“PsD17”是指分离自大豆疫霉、由SEQ IDNO：1编码的Δ17去饱和酶(SEQ ID NO：2)。相对应地，术语“PsD17S”是指来源于大豆疫霉的合成的Δ17去饱和酶，其为了在解脂耶氏酵母中表达而进行了密码子优化(即SEQ ID NO；3和4)。基于本文所述的分析，PsD17和PsD17S被进一步分类为双功能Δ17去饱和酶。

同样，术语“PrD17”是指分离自栎树猝死病菌、由SEQ IDNO：5编码的Δ17去饱和酶(SEQ ID NO：6)。相对应地，术语“PrD17S”是指来源于栎树猝死病菌的合成的Δ17去饱和酶，其为了在解脂耶氏酵母中表达而进行了密码子优化(即SEQ ID NO：7和6)。基于本文所述的分析，PrD17和PrD17S被进一步分类为单功能Δ17去饱和酶。

术语“转化率”和“底物转化百分率”是指特定酶(例如去饱和酶)可将底物转化为产物的效率。转化率根据下式计算：([产物]/[底物+产物])*100，其中“产物”包括中间产物以及在途径中由中间产物衍生的所有产物。

术语“延长酶”是指能够延长脂肪酸碳链以产生比延长酶所作用的脂肪酸底物长两个碳的酸的多肽。此延长过程是同脂肪酸合成酶相关的多步机制，描述于PCT公布号WO2004/101757。由延长酶系统催化的反应实例是GLA转变为DGLA、STA转变为ETA和EPA转变为DPA。一般而言，延长酶的底物选择性略微宽广，但以链长以及不饱和的程度和类型这二者来区分。例如，C_14/16延长酶利用C₁₄底物(例如肉豆蔻酸)，C_16/18延长酶利用C₁₆底物(例如棕榈酸)，C_18/20延长酶(也称为Δ6延长酶，这些术语可交互使用)利用C₁₈底物(例如GLA、STA)，C_20/22延长酶利用C₂₀底物(例如EPA)。以类似的方式，Δ9延长酶能够催化LA和ALA分别向EDA和ETrA转变。要重点指出的是，某些延长酶具有广泛的特异性，因此单个酶能够催化几种延长酶反应(例如由此同时用作C_16/18延长酶和C_18/20延长酶)。

术语“卵菌”是指一组通常称为水霉和霜霉的异养生物。它们是丝状原生生物，必须由周围的水或土壤吸收它们的食物，或者可以侵入另一种生物的机体来进食。因此，卵菌在降解和再循环腐烂物质方面起重要作用。疫霉(Phytophthora)是一种卵菌属，包含59个不同物种。尽管卵菌通过趋同进化与真菌类似，但它们不是真菌(先前认为是)；相反，卵菌是原生藻菌界的组成部分，由此与植物、真菌和动物不同。硅藻属以及金褐藻和褐藻(例如海藻)也包括在原生藻菌界中。

术语“油脂(的)(oleaginous)”是指那些倾向于以脂质形式储备它们的能量源的生物(Weete，载于：Fungal Lipid Biochemistry，第2版，Plenum，1980)。术语“油脂酵母(oleaginous yeast)”是指那些被分类为酵母的可产油微生物。通常，油脂微生物的细胞油质或TAG含量符合S形曲线，其中脂质浓度升高，至对数期晚期或生长稳定期早期达到最大，然后在稳定期晚期和死亡期当中逐渐降低(Yongmanitchai和Ward，Appl.Environ.Microbiol.，57：419-25(1991))。累积油超过其干细胞重量约25％对油脂微生物并不罕见。油脂酵母的实例包括但不限于以下属：耶氏酵母属(Yarrowia)、假丝酵母属(Candida)、红酵母属(Rhodotorula)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、隐球酵母属(Cryptococcus)、丝孢酵母属(Trichosporon)和油脂酵母属(Lipomyces)。

本文所用的“分离的核酸片段”或“分离的核酸分子”可交互使用，是指为单或双链形式并任选地含有合成、非天然或改变的核苷酸碱基的RNA或DNA聚合体。DNA聚合体形式的分离核酸片段可包括cDNA、基因组DNA或合成DNA的一个或多个区段。

当单链形式的核酸片段可在合适的温度和溶液离子强度条件下与另一个核酸片段(例如cDNA、基因组DNA或RNA分子)退火时，该核酸片段与所述另一个核酸片段是“可杂交的”。杂交和洗涤条件是众所周知的，例举于Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring HarborLaboratory：Cold Spring Harbor，NY(1989)，尤其是第11章和其中的表11.1(完整引入本文作为参考)。温度和离子强度的条件决定了杂交的“严格性”。可调整严格条件，以筛选中度相似片段(诸如远缘相关生物的同源序列)至高度相似片段(诸如由近缘相关生物复制功能酶的基因)。杂交后洗涤决定严格条件。一组优选条件使用一系列洗涤：首先于室温用6X SSC，0.5％SDS洗涤15分钟，接着于45℃用2X SSC，0.5％SDS重复洗涤30分钟，再重复2次于50℃用0.2X SSC，0.5％SDS洗涤30分钟。更优选的严格条件组使用更高温度，其中洗涤除了最后两次用0.2X SSC，0.5％SDS洗涤30分钟的温度提高为60℃外，其它条件与上述一致。另一组优选的高度严格条件使用的最后两次洗涤是于65℃用0.1X SSC，0.1％SDS进行。另一组严格条件包括例如于65℃在0.1X SSC，0.1％SDS中杂交，用2X SSC，0.1％SDS洗涤，接着用0.1X SSC，0.1％SDS洗涤。

杂交要求两个核酸含有互补序列，但根据杂交严格性，碱基间有可能错配。适用于杂交核酸的严格性取决于核酸长度及互补程度这些本领域众所周知的变量。两个核苷酸序列之间的相似性或同源性的程度越高，具有这些序列的核酸杂合体的Tm值就越大。核酸杂交的相对稳定性(对应于较高的Tm)按下列顺序递减：RNA:RNA、DNA:RNA、DNA:DNA。对于长度大于100个核苷酸的杂合体，已得到计算Tm的公式(参见Sambrook等，出处同上，9.50-9.51)。对于与较短的核酸(即寡核苷酸)杂交，错配的位置变得更为重要，寡核苷酸的长度决定了它的特异性(参见Sambrook等，出处同上，11.7-11.8)。在一个实施方案中，可杂交核酸的长度至少为约10个核苷酸。优选地，可杂交核酸的最小长度为至少约15个核苷酸；更优选地为至少约20个核苷酸；最优选地长度为至少约30个核苷酸。此外，熟练技术人员知晓，必要时可以根据诸如探针长度等因素来调整温度及洗涤溶液盐浓度。

氨基酸或核苷酸序列的“实质部分(substantial portion)”是指包含多肽中的足够氨基酸序列或基因中的足够核苷酸序列的部分，以根据本领域技术人员的手工序列估算或使用诸如BLAST(基本局部比对检索工具；Altschul，S.F.等，J.Mol.Biol.215：403-410(1993))的算法通过计算机自动序列对比和鉴定来推测鉴定该多肽或基因。一般而言，为了推测鉴定与已知蛋白或基因同源的多肽或核酸序列，必需10个以上连续氨基酸或30个以上核苷酸的序列。此外，对于核苷酸序列，包含20-30个连续核苷酸的基因特异性寡核苷酸探针可用于序列依赖性基因鉴定(例如DNA杂交)和分离(例如细菌菌落或噬菌斑的原位杂交)方法。另外，12-15个碱基的短寡核苷酸可用作PCR扩增引物，以获得包含所述引物的特定核酸片段。因此，核苷酸序列的“实质部分”含有足以特异性鉴定和/或分离含该序列的核酸片段的序列。本说明书讲授了编码特定卵菌蛋白的完整氨基酸序列和核苷酸序列。由于本文报道了这些序列的益处，技术人员现在可使用公开序列的全部或实质部分用于本领域技术人员已知的用途。因此，本发明包含随附序列表中报告的完整序列，以及如上定义的那些序列的实质部分。

术语“互补的”用于描述能够相互杂交的核苷酸碱基间的关系。例如，关于DNA，腺苷同胸腺嘧啶互补，胞嘧啶同鸟嘌呤互补。因此，本发明也包括与随附序列表中报告的完整序列互补的分离核酸片段，以及那些显著相似的核酸序列。

术语“同源性”和“同源的”在本文可互换使用。它们是指其中一个或多个核苷酸碱基的改变不影响核酸片段介导基因表达或产生某些表型的能力的核酸片段。这些术语也指本发明中核酸片段的修饰，譬如相对于初始的、未修饰的片段基本上未改变所产生核酸片段的功能特性的一个或多个核苷酸的缺失或插入。因此，要理解的是，正如本领域的技术人员所意识到的，本发明包含比具体例举序列更多的序列。

此外，技术人员公认，本发明所包含的同源核酸序列也由其在适度严格条件下(例如0.5X SSC，0.1％SDS，60℃)下与本文例举的序列、或与本文公开的和在功能上等同于本文公开的任何核酸序列的核苷酸序列的任何一部分杂交的能力来定义。

“密码子简并性”是指在不改变编码多肽的氨基酸序列的情况下允许核苷酸序列变异的遗传密码的性质。技术人员很了解特定宿主细胞在指定给定氨基酸的核苷酸密码使用方面所表现出的“密码子偏倚”。因此，当合成用于在宿主细胞中改善表达的基因时，期望所设计的基因使其密码子使用频率接近宿主细胞中优选密码子使用的频率。

与DNA序列关联的“化学合成的”是指组成核苷酸在体外组装。DNA的人工化学合成可以使用已充分确定的方法来完成，或者可使用众多市售机器中的一种进行自动化学合成。“合成基因”可以由使用本领域技术人员已知的程序化学合成的寡核苷酸结构单元来组装。连接并退火这些结构单元，以形成基因区段，随后酶促组装这些基因区段，以构建完整基因。因此，基于反映宿主细胞的密码子偏倚的核苷酸序列的优化，可使基因适于最佳基因表达。技术人员知晓在密码子使用偏向于宿主偏爱的密码子的情况下成功进行基因表达的可能性。基于对来源于宿主细胞的、其中序列信息可用的基因的调查，可以确定优选密码子。

“基因”是指表达特定蛋白的核酸片段，其可指单独编码区，或者可包括编码序列之前(5′非编码序列)和之后(3′非编码序列)的调节序列。“天然基因”是指与其自身调节序列一起天然存在的基因。“嵌合基因”是指不是天然基因的任何基因，其包含非天然一起存在的调节和编码序列。因此，嵌合基因可包含来源于不同来源的调节序列和编码序列，或者来源于相同来源但以不同于天然存在形式的方式排列的调节序列和编码序列。“内源基因”是指在生物基因组中处于其天然位置的天然基因。“外源”基因是指通过基因转移导入宿主生物中的基因。外源基因可以包含插入非天然生物中的天然基因、导入天然宿主中的新位置的天然基因或嵌合基因。“转基因”是已通过转化步骤导入基因组中的基因。“密码子优化基因”是其密码子使用频率设计成模拟宿主细胞中的优选密码子使用频率的基因。

“编码序列”是指编码特定氨基酸序列的DNA序列。“合适的调控序列”是指位于编码序列上游(5′非编码序列)、当中或下游(3′非编码序列)并影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或翻译的核苷酸序列。调节序列可以包括启动子、翻译前导序列、内含子、多聚腺苷酸识别序列、RNA加工位点、效应子结合位点和茎环结构。

“启动子”是指能够控制编码序列或功能RNA表达的DNA序列。一般而言，编码序列位于启动子序列的3′。启动子可以整体来源于天然基因，或者由来源于天然存在的不同启动子的不同元件所组成，或者甚至含有合成的DNA区段。本领域的技术人员知道，不同的启动子可以在不同的组织或细胞类型中、或在发育的不同阶段、或响应于不同的环境或生理条件指导基因表达。使基因在大多数时刻在大多数细胞类型中表达的启动子通常称为“组成型启动子”。还要认识到，由于在大多数情况下调节序列的精确边界并未完全确定，因此不同长度的DNA片段可以具有相同的启动子活性。

术语“3′非编码序列”及“转录终止子”是指位于编码序列下游的DNA序列。它包括聚腺苷酸识别序列以及编码能够影响mRNA加工或基因表达的调节信号的其它序列。聚腺苷酸信号通常以影响聚腺苷酸序列段添加至mRNA前体的3′末端为特征。3′区可影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或翻译。

“RNA转录物”是指由RNA聚合酶催化的DNA序列转录产生的产物。当RNA转录物为DNA序列的完全互补拷贝时，其被称为初级转录物，或者其可为来源于初级转录物的转录后加工的RNA序列，被称为成熟RNA。“信使RNA”或“mRNA”是指没有内含子、可被细胞翻译成蛋白的RNA。“cDNA”是指来源于mRNA并与之互补的双链DNA。“有义”RNA是指包括mRNA的RNA转录物，所以可被细胞翻译为蛋白。“反义RNA”是指同全部或部分的目标初始转录物或者mRNA互补的RNA转录物，其阻断靶基因的表达(美国专利号5,107,065；PCT公布号WO99/28508)。反义RNA的互补物可以是特定基因转录物的任一部分，即处于5′非编码序列、3′非编码序列或编码序列。“功能RNA”是指反义RNA、核酶RNA或其它未被翻译但仍对细胞过程有影响的RNA。

术语“操作性连接(的)(operably linked)”是指单个核酸片段上核酸序列连接，使得一个序列的功能受另一个序列影响。例如，启动子与编码序列操作性连接或有效连接时，启动子能够影响编码序列的表达(即编码序列处于启动子的转录控制下)。编码序列可与调节序列以有义或反义方向有效连接或操作性连接。

本文所用的术语“表达”是指来源于本发明核酸片段的有义(mRNA)或反义RNA的转录和稳定累积。表达还可以指mRNA翻译为多肽。

“成熟”蛋白是指翻译后加工的多肽，即初级翻译产物中存在的任何前肽或原肽均已被除去的多肽。“前体”蛋白是指mRNA翻译的初级产物，即仍存在前肽和原肽。前肽和原肽可以是(但不限于)胞内定位信号。

“转化”是指将核酸分子转入宿主生物中，产生遗传学上稳定的遗传。核酸分子可以是例如自主复制或可整合到宿主生物的基因组中的质粒。含有转化核酸片段的宿主生物被称为“转基因”或“重组”或“转化”生物。

术语“质粒”、“载体”和“表达盒”是指通常携带不是细胞核心代谢部分的基因的染色体外元件，通常为环状双链DNA片段的形式。这类元件可以是自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列、线性或环状的单链或双链DNA或RNA，其来自任何来源，其中许多核苷酸序列已连接或重组为独特的构建体，它能够将用于选定基因产物的启动子片段和DNA序列与合适的3′非翻译序列一起导入细胞中。“表达盒”是指含有外源基因并在外源基因之外还具有增强该基因在外源宿主中的表达的元件的特定载体。

如本领域中所知，术语“同一性百分率”是两个或更多个多肽序列或者两个或更多个多核苷酸序列之间的关系，该关系通过比较这些序列来确定。在本领域中，“同一性”也指多肽或多核苷酸序列之间的序列相关度，视情况由这些序列的字串之间的匹配程度来确定。“同一性”和“相似性”通过已知方法可容易地算出，包括但不限于描述于以下的方法：1)Computational Molecular Biology(Lesk，A.M.编辑)Oxford University：NY(1988)；2)Biocomputing：Informatics and Genome Projects(Smith，D.W.编辑)Academic：NY(1993)；3)Computer Analysis of Sequence Data，Part I(Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编辑.)Humania：NJ(1994)；4)Sequence Analysis in Molecular Biology(vonHeinje，G.编辑)Academic(1987)；和5)Sequence Analysis Primer(Gribskov，M.和Devereux，J.编辑)Stockton：NY(1991)。

用于确定同一性的优选方法设计用于在检验序列之间产生最佳匹配。用于确定同一性和相似性的方法已编程为公开可获得的计算机程序。序列比对及同一性百分率的计算可以使用LASERGENE生物信息学计算套件(DNASTAR Inc.，Madison，WI)的MegAlign^TM程序进行。序列的多重比对使用“Clustal比对法”进行，该方法包含几个变通算法，包括对应于标识为Clustal V(描述于Higgins和Sharp，CABIOS.5：151-153(1989)；Higgins，D.G.等，(1992)Comput.Appl.Biosci.8：189-191)并存在于生物信息学计算套件(DNASTAR Inc.，Madison，WI)的MegAlign程序中的比对法的“Clustal V比对法”。对于多重比对，默认值对应于空位罚分＝10和空位长度罚分＝10。成对比对和使用Clustal法计算蛋白序列的同一性百分率的默认参数为KTUPLE＝1、空位罚分＝3、比较窗＝5和DIAGONALS SAVED＝5。对于核酸，这些参数为KTUPLE＝2、空位罚分＝5、比较窗＝4和DIAGONALS SAVED＝4。在使用Clustal V程序比对序列后，有可能通过查看相同程序中的“序列距离”表获得“同一性百分率”。另外，可利用“Clustal W比对法”，其对应于标识为Clustal W(描述于Higgins和Sharp，CABIOS.5：151-153(1989)；Higgins，D.G.等，(1992)Comput.Appl.Biosci.8：189-191)并存在于LASERGENE生物信息学计算套件(DNASTARInc.，Madison，WI)的MegAlign v6.1程序中的算法。用于多重比对的默认参数(空位罚分＝10，空位长度罚分＝0.2，Delay Divergen Seqs(％)＝30，DNA转变权重＝0.5，蛋白质权重矩阵＝Gonnet Series，DNA权重矩阵＝IUB)。在使用Clustal V程序比对序列后，有可能通过查看相同程序中的“序列距离”表获得“同一性百分率”。

“BLASTN比对法”是由国立生物技术信息中心(NCBI)提供的算法，使用默认参数比较核苷酸序列。

本领域技术人员会充分理解的是，许多序列同一性水平可用于鉴定来自其它物种的多肽，其中这些多肽具有相同或类似的功能或活性。合适的核酸片段(本发明的分离多核苷酸)编码与本文所报道的氨基酸序列具有至少约70％同一性、优选至少约75％同一性、更优选至少约80％同一性的多肽。优选的核酸片段编码与本文报道的氨基酸序列具有至少约85％同一性的氨基酸序列。更优选的核酸片段编码与本文报道的氨基酸序列具有至少约90％同一性的氨基酸序列。最优选的核酸片段编码与本文报道的氨基酸序列具有至少约95％同一性的氨基酸序列。实际上，70％至100％的任何整数氨基酸同一性均可用于描述本发明，例如71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。合适的核酸片段不仅具有上述同源性，还典型地编码具有至少50个氨基酸、优选至少100个氨基酸、更优选至少150个氨基酸、再更优选至少200个氨基酸和最优选至少250个氨基酸的多肽。

术语“序列分析软件”是指用于分析核苷酸或氨基酸序列的任何计算机算法或软件程序。“序列分析软件”可通过商业渠道或独立研发获得。典型的序列分析软件包括但不限于：1)GCG程序套件(WisconsinPackage9.0版，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，WI)；2)BLASTP、BLASTN、BLASTX(Altschul等，J.Mol.Biol.，215：403-410(1990))；3)DNASTAR(DNASTAR，Inc.Madison，WI)；4)Sequencher(Gene Codes Corporation，Ann Arbor，MI)；和5)编入Smith-Waterman算法的FASTA程序(W.R.Pearson，Comput.Methods Genome Res.，[Proc.Int.Symp.](1994)，Meeting Date1992，111-20.编辑：Suhai，Sandor.Plenum：New York，NY)。在本申请的上下文中，应当理解的是，除非另有说明，否则序列分析软件均被用于分析，分析结果基于所提及程序的“默认值”。本文所用的“默认值”指软件在首次初始化时原始加载的任何数值组或参数组。

本文所用的标准重组DNA和分子克隆技术在本领域众所周知，描述于Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，Molecular Cloning： A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory：ColdSpring Harbor，NY(1989)(后文称为“Maniatis”)；Silhavy，T.J.，Bennan，M.L.和Enquist，L.W.，Experiments with Gene Fusions，Cold SpringHarbor Laboratory：Cold Spring Harbor，NY(1984)；和Ausubel，F.M.等，Current Protocols in Molecular Biology，由Greene Publishing Assoc.和Wiley-Interscience，Hoboken，NJ(1987)出版。

综述：脂肪酸和三酰甘油的微生物生物合成

一般而言，油脂微生物中的脂类累积响应于生长培养基中的总碳氮比而被触发。该过程导致在油脂微生物中从头合成游离棕榈酸(16:0)，详述于PCT公布号WO2004/101757。棕榈酸是长链饱和及不饱和脂肪酸衍生物的前体，其通过延长酶和去饱和酶的作用形成(图1)。

TAG(脂肪酸的主要储存单位)通过一系列反应形成，这些反应包括：1)经由酰基转移酶将1个酰基-CoA分子酯化为甘油-3-磷酸，产生溶血磷脂酸；2)经由酰基转移酶酯化第二个酰基-CoA分子，产生1，2-二酰基甘油磷酸(通常鉴定为磷脂酸)；3)通过磷脂酸磷酸酶除去磷酸，产生1，2-二酰基甘油(DAG)；和4)通过酰基转移酶的作用加入第三种脂肪酸，形成TAG。可将广谱脂肪酸掺入TAG中，包括饱和及不饱和脂肪酸以及短链和长链脂肪酸。

Ω脂肪酸的生物合成

其中油酸被转变为ω-3/ω-6脂肪酸的代谢过程包括通过添加碳原子延长碳链和通过加入双键使分子去饱和。这需要一系列存在于内质网膜中的专用去饱和酶和延长酶。然而，如在图1中所见和下文所述，经常有多个替代途径来生产特定的ω-3/ω-6脂肪酸。

具体地说，所有途径都需要通过Δ12去饱和酶将油酸初始转变为第一种ω-6脂肪酸LA。然后，使用“Δ6去饱和酶/Δ6延长酶途径”，如下形成ω-6脂肪酸：(1)通过Δ6去饱和酶将LA转变为GLA；(2)通过C_18/20延长酶将GLA转变为DGLA；和(3)通过Δ5去饱和酶将DGLA转变为ARA。或者，“Δ6去饱和酶/Δ6延长酶途径”可如下用于形成ω-3脂肪酸：(1)通过Δ15去饱和酶将LA转变为第一种ω-3脂肪酸ALA；(2)通过Δ6去饱和酶将ALA转变为STA；(3)通过C_18/20延长酶将STA转变为ETA；(4)通过Δ5去饱和酶将ETA转变为EPA；(5)通过C_20/22延长酶将EPA转变为DPA；和(6)通过Δ4去饱和酶将DPA转变为DHA。任选地，ω-6脂肪酸可被转变为ω-3脂肪酸；例如，通过Δ17去饱和酶活性分别由DGLA和ARA产生ETA和EPA。

用于生物合成ω-3/ω-6脂肪酸的替代途径利用Δ9延长酶和Δ8去饱和酶。更具体地说，可通过Δ9延长酶将LA和ALA分别转变为EDA和ETrA；然后，Δ8去饱和酶将EDA转变为DGLA，和/或将ETrA转变为ETA。

预期需要在用于生产ω-3/ω-6脂肪酸的特定宿主生物中表达的具体功能性取决于宿主细胞(及其天然PUFA谱和/或去饱和酶/延长酶谱)、底物的可利用性和所需的终产物。本领域技术人员能够鉴定编码ω-3/ω-6脂肪酸生物合成所需的每种酶的多种候选基因。有用的去饱和酶和延长酶序列可来自任何来源，例如分离自天然来源(细菌、藻类、真菌、卵菌、植物、动物等)、经半合成途径产生或从头合成。尽管导入到宿主中的去饱和酶和延长酶基因的具体来源并不关键，但选择具有去饱和酶或延长酶活性的特定多肽的考虑因素包括：1)多肽的底物特异性；2)多肽或其组分是否为限速酶；3)去饱和酶或延长酶是否是合成所需PUFA必需的；和/或4)多肽所需的辅因子。表达的多肽优选具有与其在宿主细胞中的位置的生物化学环境相适的参数(关于其余细节，参见PCT公布号WO2004/101757)。

在其它实施方案中，考虑每个具体的去饱和酶和/或延长酶的转化效率也是有用的。更具体地说，因为每种酶很少以100％的效率将底物转变为产物，所以在宿主细胞中产生的未纯化油类物质的最终脂质谱通常为由所需的ω-3/ω-6脂肪酸组成的多种PUFA以及多种上游中间体PUFA的混合物。因此，在优化所需脂肪酸的生物合成时，每种酶的转化效率的考虑因素也是一个考虑变量。

由于考虑了以上的每种考虑因素，可按照具有PUFA生产能力的生物的公开可用的文献(例如GenBank)、专利文献和实验分析鉴定具有合适的去饱和酶和延长酶活性的候选基因(例如Δ6去饱和酶、C_18/20延长酶、Δ5去饱和酶、Δ17去饱和酶、Δ15去饱和酶、Δ9去饱和酶、Δ12去饱和酶、C_14/16延长酶、C_16/18延长酶、Δ9延长酶、Δ8去饱和酶、Δ4去饱和酶和C_20/22延长酶)。这些基因适于导入到特定宿主生物中，以使生物能合成PUFA或增强生物的PUFA合成。

Δ17去饱和酶的鉴定

本发明的Δ17去饱和酶序列分离自大豆疫霉和栎树猝死病菌(P.ramorum)，并如本文所述首先由美国能源部联合基因组研究所(JGI；Walnut Creek，CA)报告。然而，应当指出的是，尽管所述序列是已知的，但它们作为Δ17去饱和酶的功能在本文描述的发现之前未被阐述。申请人首先识别出这些多肽的特定Δ17去饱和酶活性。

为获取这些序列的正确活性，致病疫霉(P.infestans)去饱和酶(“PiD17”；SEQ ID NO：9)在针对JGI数据库的BLAST检索中用作查询字段。这导致鉴定出2个PiD17同源物；具体地说为本文称为“PsD17”(SEQ ID NO：1和2)的大豆疫霉(P.sojae)同源物和本文称为“PrD17”(SEQ ID NO：5和6)的栎树猝死病菌同源物。

尽管进行了密码子优化，但需要修饰野生型PsD17和PrD17去饱和酶，以优化在替代宿主中使用的每种酶的表达。应用宿主优选密码子可显著增强编码多肽的外源基因的表达。一般而言，可通过检验蛋白质中的密码子选择(优选以最大量表达的那些)，并确定哪种密码子以最高频率使用，确定在特定目标宿主物种中的宿主优选密码子。随后，可使用在宿主物种中优选的密码子，整体或部分地合成具有例如去饱和酶活性的目标多肽的编码序列。

野生型PsD17和PrD17去饱和酶为在解脂耶氏酵母中表达进行了密码子优化，如在表3中所示。

表3

在解脂耶氏酵母中进行ω-3生物合成的密码子优化的Δ17去饱和酶

野生型(WT)Δ17

WTΔ17的SEQID NO

在密码子优化的基因中修饰的总碱基

在密码子优化的基因中修饰的总密码子

由野生型至密码子优化的基因的GC含量改变

密码子优化的Δ17

密码子优化的Δ17的SEQ IDNO

PsD17(大豆疫霉)

1，2

1092bp中的175bp(16.0％)

364个密码子中的168个(46.2％)

65.1％-54.5％

PsD17S

3，4

PrD17(栎树猝死病

5，6

1086bp中的168bp

362个密码子中的160个

64.4％-54.5％

PrD17S

7，6

菌)

(15.5％)

(44.2％)

本领域技术人员应能够使用本文的教导，基于野生型PsD17和PrD17序列，产生多种其它的适于在替代宿主(即非解脂耶氏酵母)中最优表达的密码子优化的Δ17去饱和酶。因此，本发明涉及来源于野生型PsD17和PrD17(即分别由SEQ ID NO：2和6编码)的任何密码子优化的Δ17去饱和酶。这包括但不限于示于SEQ ID NO：3和7的核苷酸序列，其编码为了在解脂耶氏酵母中表达而进行了密码子优化的合成Δ17去饱和酶蛋白(即分别示于SEQ ID NO：4和6的PsD17S和PrD17S)。

更具体地说，使用Clustal W比对算法(MegAlign^TM，DNASTAR，出处同上)在361个氨基酸的长度内将PsD17S核苷酸碱基和推导的氨基酸序列与公共数据库对比揭示，大部分相似的已知序列(即PCT公布号WO2005/083053的致病疫霉“ω3去饱和酶”；另参见GenBank登录号CAJ30870)与本文报告的PsD17S氨基酸序列(SEQ ID NO：4)约91.4％相同。相比之下，致病疫霉“ω3去饱和酶”的氨基酸序列和PsD17(SEQ ID NO：2)之间具有90.9％的同一性。

使用Clustal W比对算法(出处同上)在361个氨基酸的长度内将PrD17S核苷酸碱基和推导的氨基酸序列与公共数据库对比揭示，大部分相似的已知序列(即致病疫霉“ω3去饱和酶”，出处同上)与本文报告的PrD17S的氨基酸序列(SEQ ID NO：6)约89.5％相同。

在本发明范围内，优选的氨基酸片段与本文的PsD17S和PrD17S序列至少约70％-80％相同，其中至少约85％-90％相同的序列特别合适，最优选至少约95％相同的那些序列。编码对应于本发明的ORF的核酸序列的优选的PsD17S和PrD17S是编码活性蛋白的那些，分别与本文报告的PsD17S和PrD17S的核酸序列至少约70％-80％相同，其中至少85％-90％相同的那些序列特别合适，最优选至少约95％相同的那些序列。

在鉴定上述卵菌多肽时，每个密码子优化的脂肪酸去饱和酶的特异性通过转化入合适的宿主(即解脂耶氏酵母)中并测定其对宿主脂肪酸谱的影响来确定(实施例5、8和12)。正如所料，PsD17S和PrD17S均具有Δ17去饱和酶活性，使得所述酶能够催化ARA向EPA的转变。具体地说，PsD17S的ARA向EPA的转变效率为40％和98％(基于在两个不同的解脂耶氏酵母菌株中和在不同的生长条件下确定)，而PrD17S的ARA向EPA的转变效率为49％。转变效率按照下式检测：([产物]/[底物+产物])*100，其中‘产物’包括直接产物和在途径中由其衍生的所有产物。

然而，出乎意料的是，PsD17S额外具有有限的Δ15去饱和酶活性(即LA向ALA的转变效率为15％)，而PrD17S没有(即LA向ALA的转变效率小于1％)。因此，大豆疫霉去饱和酶在本文被定义为双功能Δ17去饱和酶，而栎树猝死病菌去饱和酶在本文被定义为单功能Δ17去饱和酶。

同源物的鉴定和分离

任何本发明的去饱和酶序列(即PsD17、PrD17、PsD17S、PrD17S)或其部分均可用于在相同或其它的细菌、藻类、真菌、卵菌或植物物种中使用序列分析软件检索Δ17去饱和酶同源物。一般而言，该计算机软件通过指定多种取代、缺失和其它修饰的同源程度匹配相似的序列。

或者，本发明的去饱和酶序列中的任一种或其部分还可以用作Δ17同源物鉴定中的杂交试剂。核酸杂交实验的基本组分包括探针、怀疑含有目标基因或基因片段的样品和特异性杂交方法。本发明的探针通常是单链核酸序列，其与待检测的核酸序列互补。探针与待检测的核酸序列是“可杂交的”。尽管探针长度可从5个碱基至数万个碱基不等，但通常约15个碱基至约30个碱基的探针长度是合适的。仅部分探针分子需要与待检测的核酸序列互补。此外，探针和靶序列之间不必完全互补。杂交的确在不完全互补的分子之间发生，结果是杂交区中一定部分的碱基不与正确互补的碱基配对。

杂交方法是非常成熟确定的。通常，探针和样品必须在允许核酸杂交的条件下混合。这包括在无机盐或有机盐存在下在适当的浓度和温度条件下使探针和样品接触。探针和样品核酸必须接触足够长的时间，使得可以在探针和样品核酸之间发生任何可能的杂交。混合物中探针或靶标的浓度将决定发生杂交所必需的时间。探针或靶标浓度越高，需要的杂交温育时间越短。任选地，可以加入离液剂(例如氯化胍、硫氰酸胍、硫氰酸钠、四氯乙酸锂、高氯酸钠、四氯乙酸铷、碘化钾、三氟乙酸铯)。如有需要，可以将甲酰胺加至杂交混合物，通常为30-50％(体积/体积)。

可以使用多种杂交溶液。通常，这些包含约20-60％体积、优选30％的极性有机溶剂。常用的杂交溶液使用约30-50％(体积/体积)甲酰胺、约0.15-1M氯化钠、约0.05-0.1M缓冲液(例如柠檬酸钠、Tris-HCl、PIPES或HEPES(pH范围约6-9))、约0.05-0.2％去污剂(例如十二烷基硫酸钠)或0.5-20mM EDTA、FICOLL(Pharmacia Inc.)(约300-500kdal)、聚乙烯吡咯烷酮(约250-500kdal)和血清白蛋白。典型杂交溶液中还包括约0.1-5mg/mL未标记的载体核酸、片段化核DNA(例如小牛胸腺或鲑精DNA或酵母RNA)和任选约0.5-2％(重量/体积)的甘氨酸。还可以包括其它添加剂，如体积排阻剂，其包括多种极性水溶剂或膨胀剂(例如聚乙二醇)、阴离子聚合物(例如聚丙烯酸酯或聚丙烯酸甲酯)和阴离子糖类聚合物(例如硫酸葡聚糖)。

核酸杂交适于多种测定形式。一种最适宜的形式是夹心测定形式。夹心测定尤其适于在非变性条件下杂交。夹心型测定的主要组分是固相支持体。固相支持体已吸附或共价偶联的固定化核酸探针未被标记，并与序列的一部分互补。

在其它实施方案中，本文描述的任何Δ17去饱和酶核酸片段(或鉴定的其任何同源物)都可用于分离编码相同或其它细菌、藻类、真菌、卵菌或植物物种的同源蛋白的基因。使用序列依赖性方法分离同源基因在本领域众所周知。序列依赖性方法的实例包括但不限于：1)核酸杂交方法；2)DNA和RNA扩增方法，以核酸扩增技术的多种应用为例[例如聚合酶链式反应(PCR)，Mullis等，美国专利号4,683,202；连接酶链式反应(LCR)，Tabor，S.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，82：1074(1985)；或链置换扩增(SDA)，Walker等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，89：392(1992)]；和3)通过互补进行文库构建和筛选的方法。

例如，可使用本领域技术人员众所周知的方法，通过使用本发明核酸片段的全部或部分作为DNA杂交探针筛选来自任何所需酵母、真菌或卵菌的文库(其中生产EPA[或其衍生物]的那些酵母或真菌应是优选的)，可直接分离编码与本文所述的Δ17去饱和酶类似的蛋白或多肽的基因。可通过本领域已知的方法设计和合成基于本发明核酸序列的特异性寡核苷酸探针(Maniatis，出处同上)。而且，可直接使用完整序列通过技术人员已知的方法合成DNA探针(例如随机引物DNA标记、缺口翻译或末端标记技术)，或使用可用的体外转录系统合成RNA探针。另外，可设计特异性引物，并用于扩增本发明序列的一部分(或全长)。所获扩增产物可在扩增反应当中直接标记或在扩增反应后标记，并用作探针，以在适宜的严格性条件下分离全长DNA片段。

通常，在PCR型扩增技术中，引物具有不同序列且彼此不互补。根据所需的测试条件，应设计引物序列，以提供既有效又可靠的靶核酸复制。PCR引物设计方法是本领域常见并众所周知的(Thein和Wallace，“The use of oligonucleotide as specific hybridization probes inthe Diagnosis of Genetic Disorders”，载于Human Genetic Diseases：APractical Approach，K.E.Davis编辑，(1986)33-50页，IRL：Herndon，VA；和Rychlik，W.，载于Methods in Molecular Biology，White，B.A.编辑，(1993)15卷，31-39页，PCR Protocols：Current Methods andApplications.Humania：Totowa，NJ)。

通常，本发明序列的两种短区段可用于PCR方案，以由DNA或RNA扩增编码同源基因的更长核酸片段。还可以对所克隆的核酸片段文库进行PCR，其中一种引物的序列来自本发明的核酸片段，另一种引物的序列利用了编码真核生物基因的mRNA前体的3′末端存在的聚腺苷酸序列段。

或者，第二种引物序列可以基于来自克隆载体的序列。例如，技术人员可以通过使用PCR扩增转录物的单个点和3′或5′末端之间区域的拷贝，按照RACE方案(Frohman等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，85：8998(1988))来产生cDNA。可以从本发明序列设计以3′和5′方向定向的引物。使用市售3′RACE或5′RACE系统(Gibco/BRL，Gaithersburg，MD)，可以分离特异性3′或5′cDNA片段(Ohara等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，86：5673(1989)；Loh等，Science，243：217(1989))。

在其它实施方案中，本文描述的任何Δ17去饱和酶核酸片段(或鉴定的其任何同源物)都可以用于产生新的和改进的脂肪酸去饱和酶。如本领域众所周知的，可使用体外诱变和选择、化学诱变、“基因改组”法或其它方法获得天然去饱和酶基因的突变。或者，可通过结构域交换合成改进的脂肪酸，其中来自本文所述的任何Δ17去饱和酶核酸片段的功能结构域都可与替代去饱和酶基因中的功能结构域交换，由此产生新蛋白。

生产不同ω-3和/或ω-6脂肪酸的方法

预期引入处于适当启动子控制下的、编码本文描述的Δ17去饱和酶(即PsD17、PrD17、PsD17S、PrD17S或其它突变酶、密码子优化的酶或其同源物)的嵌合基因将分别导致所转化的宿主生物中的EPA产量增加。因此，本发明包括指导PUPA生产的方法，其包括使脂肪酸底物(即ARA)与本文描述的去饱和酶(例如PsD17、PrD17、PsD17S、PrD17S)接触，使得底物被转变为所需脂肪酸产物(即EPA)。

更具体地说，本发明的一个目的是提供在宿主细胞(例如油脂酵母)中产生EPA的方法，其中宿主细胞包含：

a)一种编码Δ17去饱和酶多肽的分离的核苷酸分子，其选自：

i)编码Δ17去饱和酶多肽的分离的核苷酸分子，所述Δ17去饱和酶多肽在基于Clustal比对方法与具有示于SEQ IDNO：2的氨基酸序列的多肽对比时具有至少90.9％的同一性；

ii)编码Δ17去饱和酶多肽的分离的核苷酸分子，所述Δ17去饱和酶多肽在基于Clustal比对方法与具有示于SEQ IDNO：4的氨基酸序列的多肽对比时具有至少91.4％的同一性；

iii)编码Δ17去饱和酶多肽的分离的核苷酸分子，所述Δ17去饱和酶多肽在基于Clustal比对方法与具有示于SEQ IDNO：6的氨基酸序列的多肽对比时具有至少89.5％的同一性；和

b)ARA的来源；

其中，宿主细胞在使Δ17去饱和酶基因表达和ARA转变为EPA的条件下生长，其中任选地回收EPA。

本领域技术人员将认识到，Δ17去饱和酶的广泛底物范围将允许使用该酶将二均γ亚麻酸转变为二十碳四烯酸。因此，本发明提供用于生产二十碳四烯酸的方法，该方法包括提供含以下的宿主细胞：

a)一种编码Δ17去饱和酶多肽的分离的核苷酸分子，其选自：

b)二均γ亚麻酸的来源；

c)在其中表达编码Δ17去饱和酶多肽的核酸分子和二均γ亚麻酸被转变为二十碳四烯酸的条件下培养包含步骤(a)的核苷酸分子的宿主细胞；和

d)任选地回收步骤(c)的二十碳四烯酸。

在一个替代实施方案中，基于大豆疫霉Δ17去饱和酶的双功能性，本发明的一个目标是提供在宿主细胞(例如油脂酵母)中生产ALA的方法，其中宿主细胞含有：

a)一种编码双功能Δ17去饱和酶多肽的分离的核苷酸分子，其选自：

i)编码Δ17去饱和酶多肽的分离的核苷酸分子，所述Δ17去饱和酶多肽在基于Clustal比对方法与具有示于SEQ IDNO：2的氨基酸序列的多肽对比时具有至少90.9％的同一性；和

b)LA的来源；

其中，宿主细胞在使双功能Δ17去饱和酶基因表达并将LA转变为ALA的条件下生长，其中任选地回收ALA。

或者，本文描述的每种Δ17去饱和酶基因及其相应的酶产物可以间接用于生产ω-3脂肪酸(参见PCT公布号WO2004/101757)。进行ω-3/ω-6PUFA的间接生产，其中脂肪酸底物通过中间步骤或途径中间体间接转化成期望的脂肪酸产物。因此，预期本文描述的Δ17去饱和酶(例如PsD17、PrD17、PsD17S、PrD17S或其它突变酶、密码子优化的酶或其同源物)可与编码PUFA生物合成途径的酶(例如Δ6去饱和酶、C_18/20延长酶、Δ5去饱和酶、Δ15去饱和酶、Δ9去饱和酶、Δ12去饱和酶、C_14/16延长酶、C_16/18延长酶、Δ9延长酶、Δ8去饱和酶、Δ4去饱和酶、C_20/22延长酶)的其它基因一起表达，导致较高水平地生产长链ω-3脂肪酸(例如EPA、DPA和DHA)。包含在具体表达盒中的具体基因取决于宿主细胞(及其PUFA谱和/或去饱和酶/延长酶谱)、底物的可利用性和所需的终产物。

在备选实施方案中，基于本文描述的完整序列、那些完整序列的互补物、那些序列的实质部分、来源于这些序列的密码子优化的去饱和酶和与这些序列基本同源的那些序列破坏宿主生物的天然Δ17去饱和酶可能有用。例如，宿主生物中Δ17去饱和酶(和任选的Δ15去饱和酶)的定向破坏产生合成ω-3脂肪酸的能力下降的突变菌株。该突变菌株可用于生产“纯的”ω-6脂肪酸(没有共合成ω-3脂肪酸)。

表达系统、表达盒和载体

可以在异源宿主细胞中表达本文描述的本发明序列的基因和基因产物。重组宿主中的表达可用于产生多种PUFA途径中间体，或者可用于调节宿主中已有的PUFA途径，用以合成迄今使用该宿主还不可能合成的新产物。

含有指导外源蛋白质高水平表达的调节序列的表达系统和表达载体是本领域技术人员众所周知的。这些表达系统和表达载体中的任一种都可以用于构建嵌合基因，用以产生本发明序列的任何基因产物。然后，这些嵌合基因可以通过转化导入适宜的宿主细胞中，以提供所编码酶的高水平表达。

用于转化适宜的宿主细胞的载体或DNA表达盒在本领域众所周知。构建体中存在的序列的具体选择取决于所需表达产物(见上文)、宿主细胞的性质和所建议的分离转化细胞与未转化细胞的方法。然而，通常，载体或表达盒含有指导相关基因转录和翻译的序列、选择性标记和允许自主复制或染色体整合的序列。适宜的载体包含控制转录起始的基因5′区(例如启动子)和控制转录终止的DNA片段的3′区(即终止子)。当两个控制区都来自转化宿主细胞的基因时是最优选的，尽管一般认为此类控制区不必来自选择作为生产宿主的特定物种的天然基因。

用于驱动本发明的ORF在期望宿主细胞中表达的起始控制区或启动子为数众多，且是本领域技术人员熟知的。实际上，能够指导这些基因在选定宿主细胞中表达的任何启动子都适于本发明。可以以瞬时或稳定的方式实现在宿主细胞中的表达。通过诱导与目的基因有效连接的可调节启动子的活性可以实现瞬时表达。通过使用与目的基因有效连接的组成型启动子可以实现稳定表达。作为实例，当宿主细胞是酵母时，提供了在酵母细胞中有功能的转录和翻译区，尤其来自宿主物种的(关于用于解脂耶氏酵母的优选转录起始调节区，例如参见美国专利申请号11/265761，其对应于PCT公布号WO2006/052870)。可以使用多种调节序列的任一种，这取决于是需要组成型转录还是诱导型转录、启动子表达目的ORF的效率、构建的容易性等。

终止区可以来自获得起始区的基因的3′区或来自不同的基因。众多的终止区是已知的，并且在多种宿主中令人满意地发挥功能(当用于与它们所来源的属和种相同或不同的属和种时)。通常选择终止区更多地是为了方便起见，而不是因为任何具体性质。终止控制区还可以来自优选宿主的多种天然基因。任选地，终止位点可为不必要的；然而，最优选包括终止位点。

如本领城技术人员所知，仅仅将基因插入到克隆载体不能确保基因将以所需水平成功表达。为响应高表达率的需要，通过操作许多不同的遗传元件已产生了许多专门的表达载体，所述遗传元件控制转录、翻译、蛋白质稳定性、氧限制和从宿主细胞分泌的方面。更具体地说，已被操作而控制基因表达的一些分子特征包括：1)相关转录启动子和终止子序列的性质；2)所克隆基因的拷贝数以及该基因是质粒携带的还是整合到宿主细胞的基因组中；3)所合成的外源蛋白的最终细胞定位；4)蛋白在宿主生物中翻译和正确折叠的效率；5)宿主细胞中所克隆基因的mRNA和蛋白质的内在稳定性；和6)所克隆基因中的密码子选择，使得其频率接近宿主细胞的优选密码子选择的频率。这些修饰类型的每一种都包括在本发明中，作为进一步优化本文所述的Δ17去饱和酶表达的手段。

宿主细胞的转化

一旦已经得到了编码适于在合适的宿主细胞中表达的多肽的DNA，就将其置于能够在宿主细胞中自主复制的质粒载体中，或者将其直接整合到宿主细胞的基因组中。表达盒的整合可以在宿主基因组内随机发生，或者可以通过使用含有宿主基因组的同源区域、足以与宿主基因座靶向重组的构建体靶向。当构建体靶向内源基因座时，通过内源基因座可以提供所有或者部分的转录和翻译调节区。

当由分开的复制载体表达两种和更多种基因时，希望每种载体都具有不同的选择方式，并且与其它构建体应当没有同源性，以保持稳定表达和防止元件在构建体间再分配。可以通过实验确定调节区的明智选择、选择方法和导入构建体的增殖方法，使得所有导入的基因都以必要的水平表达，以提供目的产物的合成。

可以通过任何标准技术将包含目标基因的构建体导入宿主细胞中。这些技术包括转化(例如乙酸锂转化[Methods in Enzymology，194：186-187(1991)])、原生质体融合、生物粒子轰击(biolistic impact)、电穿孔、微注射或者将目标基因导入宿主细胞中的任何其它方法。

为方便起见，已通过任意方法操作而吸收DNA序列(例如表达盒)的宿主细胞在本文将被称作“转化的”或“重组的”。转化宿主将具有表达构建体的至少一个拷贝，并可具有两个或更多个拷贝，这取决于所述基因是整合到基因组中、扩增还是存在于具有多个拷贝数的染色体外元件上。可以通过多种选择技术鉴定转化的宿主细胞，如在PCT公布号WO2004/101757和PCT公布号WO2005/003310中所述。

转化后，适于本发明的Δ17去饱和酶(和任选地在宿主细胞内共表达的其它PUFA酶)的底物可以由宿主天然产生或转基因产生，或者它们可以外源提供。

ω-3和/或ω-6脂肪酸生物合成的代谢工程

本发明的Δ17去饱和酶的序列信息可用于在多种宿主细胞中操作ω-3和/或ω-6脂肪酸生物合成。这可能需要在PUFA生物合成途径内直接代谢工程，或者贡献碳给PUFA生物合成途径的其它操作途径。用于上调所需生物化学途径和下调不需要的生物化学途径的方法是本领域技术人员众所周知的。例如，与ω-3和/或ω-6脂肪酸生物合成途径竞争能量或碳的生物化学途径，或者干扰特定PUFA终产物生产的天然PUFA生物合成途径酶，可通过基因破坏消除，或者可通过其它方法(例如反义mRNA)下调。

作为增加ARA、EPA或DHA的手段在PUFA生物合成途径中操作(及其相关技术)的详细讨论分别提供于PCT公布号WO2006/055322[美国专利公布号2006-0094092-A1]、PCT公布号WO2006/052870[美国专利公布号2006-0115881-A1]和PCT公布号WO2006/052871[美国专利公布号2006-0110806-A1]，还提供了在TAG生物合成途径和TAG降解途径中所需的操作(及其相关技术)。

用于重组表达Δ17去饱和酶的优选宿主

用于表达本发明基因和核酸片段的宿主细胞可以包括在多种原料(包括简单或复杂的糖、脂肪酸、有机酸、油类和醇类和/或烃类)上于宽范围内温度和pH值生长的宿主。基于申请人的代理人的需要，首先分离出用于在油脂酵母(尤其是解脂耶氏酵母)中表达的本发明所述基因；然而，预计因为转录、翻译和蛋白质生物合成装置是高度保守的，所以任何细菌、酵母、藻类、卵菌和/或丝状真菌都将是用于表达本发明的核酸片段的适宜宿主。

优选宿主为油脂生物，例如油脂酵母。这些油脂生物天然地能够进行油合成和累积，其中油质可以占细胞干重的约25％以上，更优选地占细胞干重的约30％以上，最优选地占细胞干重的约40％以上。通常鉴定为油脂酵母的属包括但不限于：耶氏酵母属(Yarrowia)、假丝酵母属(Candida)、红酵母属(Rhodotorula)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、隐球酵母属(Cryptococcus)、丝孢酵母属(Trichosporon)和油脂酵母属(Lipomyces)。更具体地说，示例性油质合成酵母包括：红冬孢酵母菌(Rhodosporidium toruloides)、Lipomycesstarkeyii、L.lipoferus、Candida revkaufi、铁红假丝酵母(C.pulcherrima)、热带念珠菌(C.tropicalis)、产朊假丝酵母(C.utilis)、Trichosporonpullans、皮肤毛孢子菌(T.cutaneum)、Rhodotorula glutinus、牧草红酵母(R.graminis)和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)(以前分类为Candida lipolytica)。

最优选的是油脂酵母解脂耶氏酵母；在又一个实施方案中，最优选的是称为ATCC#76982、ATCC#20362、ATCC#8862、ATCC#18944和/或LGAMS(7)1的解脂耶氏酵母菌株(Papanikolaou S.和Aggelis G.，Bioresour.Technol.，82(1)：43-9(2002))。

适用于在解脂耶氏酵母中工程化EPA和DHA的具体技术分别提供于美国专利申请号11/265761和11/264737。用于在油脂酵母(即解脂耶氏酵母)中合成和转化含有Δ17去饱和酶的表达载体的详细方法提供于PCT公布号WO2004/101757和WO2006/052870。在该酵母中表达基因的优选方法是通过将线性DNA整合入宿主基因组中；以及，在需要高水平表达基因时，整合入基因组内的多个基因座中可能尤其有用[例如在Ura3基因座(GenBank登录号AJ306421)、Leu2基因座(GenBank登录号AF260230)、Lys5基因座(GenBank登录号M34929)、Aco2基因座(GenBank登录号AJ001300)、Pox3基因座(Pox3：GenBank登录号XP_503244；或Aco3：GenBank登录号AJ001301)、Δ12去饱和酶基因座(PCT公布号WO2004/104167)、Lip1基因座(GenBank登录号Z50020)和/或Lip2基因座(GenBank登录号AJ012632)]。

用于解脂耶氏酵母的优选选择方法是针对卡那霉素、潮霉素和氨基糖苷G418的抗性，以及在没有尿嘧啶、亮氨酸、赖氨酸、色氨酸或组氨酸的培养基上生长的能力。在替代的实施方案中，使用5-氟乳清酸(5-氟尿嘧啶-6-羧酸一水合物；“5-FOA”)选择酵母Ura^-突变体。该化合物对具有编码乳清酸核苷5’-一磷酸脱羧酶(OMP脱羧酶)的功能性URA3基因的酵母细胞有毒；因此，基于该毒性，5-FOA尤其可用于选择和鉴定Ura^-突变酵母菌(Bartel，P.L.和Fields，S.，Yeast2-Hybrid System，Oxford University：New York，第7卷，109-147页，1997)。

其它优选微生物宿主包括油脂细菌、藻类、卵菌和其它真菌；以及，在该广泛的微生物宿主类别中，特别令人感兴趣的是合成ω-3/ω-6脂肪酸的微生物。因此，例如，用处于诱导型或调节型启动子控制下的任何本发明的Δ17去饱和酶基因转化高山被孢霉(其在商业上用于生产ARA)可产生能够合成EPA的转化生物。转化高山被孢霉(M.alpina)的方法描述于Mackenzie等(Appl.Environ.Microbiol.，66:4655(2000))。同样，用于转化破囊壶菌目(Thraustochytriales)微生物的方法公开于美国专利号7,001,772。

在替代的优选实施方案中，本发明提供用本文所述的Δ17去饱和酶转化的多种植物宿主。如此转化的植物可为单子叶植物或双子叶植物，优选地，它们属于一类被鉴定为含油的植物(例如油籽植物)。优选的油籽植物宿主的实例包括但不限于：大豆(Glycine和Soja sp.)、玉米(Zea mays)、亚麻(Linum sp.)、油菜籽(Brassica sp.)、樱草、油菜、玉米、红花(Carthamus sp.)和向日葵(Helianthus sp.)。在油籽植物中过表达脂肪酸去饱和酶的方法(例如构建表达盒、转化、选择等)描述于PCT公布号WO2005/047479。

不管选择哪种具体宿主表达本文所述的Δ17去饱和酶，都必须筛选多种转化体，以便获得展现出所需的表达水平和模式的菌株。此筛选可通过下列方式来进行：DNA印迹的DNA分析(Southern，J.Mol.Biol.，98：503(1975))、mRNA表达的RNA分析(Kroczek，J.Chromatogr.Biomed.Appl.，618(1-2)：133-145(1993))、蛋白质表达的蛋白质和/或Elisa分析、PUFA产物的表型分析或GC分析。

用于Ω脂肪酸生产的发酵方法

转化的宿主细胞在优化嵌合去饱和酶基因表达并产生最大和最经济的所需PUFA产量的条件下生长。通常，可以优化的培养基条件包括碳源的类型和量、氮源的类型和量、碳-氮比率、不同矿物离子的量、氧水平、生长温度、pH、生物量生产期的长度、油累积期的长度以及细胞收获的时间和方法。解脂耶氏酵母一般生长在复杂培养基(例如酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖培养基(YPD))中，或者生长在缺少生长必需组分的限定基本培养基中，由此强迫选择所需表达盒(例如酵母氮源(DIFCO Laboratories，Detroit，MI))。

本发明中的发酵培养基必须含有适宜的碳源。适宜的碳源讲述于PCT公布号WO2004/101757。尽管预计本发明可利用的碳源可包括各种各样的含碳来源，但优选的碳源为糖、甘油和/或脂肪酸。最优选含有10-22个碳的葡萄糖和/或脂肪酸。

可以从无机来源(例如(NH₄)₂SO₄)或有机来源(例如尿素或谷氨酸)提供氮。除了适宜的碳源和氮源以外，发酵培养基必须还含有适宜的矿物质、盐、辅因子、缓冲剂、维生素和本领域技术人员已知的其它组分，它们适于油脂宿主的生长和促进PUFA生产必需的酶促途径。特别要关注促进脂质和PUFA合成的一些金属离子(例如Fe⁺²、Cu⁺²、Mn⁺²、Co⁺²、Zn⁺²、Mg⁺²)(Nakahara，T.等，Ind.Appl.Single Cell Oils，D.J.Kyle和R.Colin编辑，61-97页(1992))。

本发明中优选的生长培养基是通常商业制备的培养基，例如酵母氮源(DIFCO Laboratories，Detroit，MI)。还可以使用其它限定或合成生长培养基，用于转化体宿主细胞生长的适宜培养基是微生物学或发酵科学领域的技术人员已知的。发酵适宜的pH范围通常为约pH4.0至pH8.0，其中pH5.5至pH7.5优选为最初生长条件的范围。发酵可以在需氧或厌氧条件下进行，其中优选微需氧条件。

通常，油脂酵母细胞中的高水平PUFA累积需要两步法，因为代谢状态必须在脂肪的生长和合成/贮存之间“平衡”。因此，最优选地，在解脂耶氏酵母中生产PUFA必需两步发酵法。该方法描述于PCT公布号WO2004/101757，还描述了多种适宜的发酵过程设计(即分批、补料-分批和连续)和生长过程中的考虑因素。

实施例

在下面实施例中进一步限定本发明。应当理解的是，这些实施例尽管指出了本发明的优选实施方案，但是仅作为示例给出。本领域技术人员由以上讨论和这些实施例可以确定本发明的基本特征，并可以在不背离本发明的精神和范围的情况下，对本发明做出多种使其适于多种用法和条件的改变和修改。

一般方法

实施例中使用的标准重组DNA和分子克隆技术在本领城众所周知，描述于：1)Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.MolecularCloning：ALaboratory Manual；Cold Spring Harbor Laboratory：ColdSpring Harbor，NY(1989)(Maniatis)；2)T.J.Silhavy，M.L Bennan，和L.W.Enquist，Experiments with Gene Fusions；Cold Spring HarborLaboratory：Cold Spring Harbor，NY(1984)；和3)Ausubel，F.M.等，Current Protocols in Molecular Biology，由Greene Publishing Assoc.和Wiley-Interscience，Hoboken，NJ(1987)出版。

适于维持和生长微生物培养物的材料和方法在本领域众所周知。适用于以下实施例的技术可见于在Manual of Methods for GeneralBacteriology(Phillipp Gerhardt，R.G.E.Murray，Ralph N.Costilow，Eugene W.Nester，Willis A.Wood，Noel R.Krieg和G.Briggs Phillips编辑)，American Society for Microbiology：Washington，D.C.(1994))；或ThomasD.Brock in Biotechnology：A Textbook of IndustrialMicrobiology，第2版，Sinauer Associates：Sunderland，MA(1989)中的陈述。除非另外指出，否则用于生长和维持微生物细胞的所有试剂、限制酶和材料都得自Aldrich Chemicals(Milwaukee，WI)、DIFCOLaboratories(Detroit，MI)、GIBCO/BRL(Gaithersburg，MD)或SigmaChemical Company(St.Louis，MO)。大肠杆菌(XL1-Blue)感受态细胞购自Stratagene Company(San Diego，CA)。大肠杆菌菌株通常在37℃于Luria Bertani(LB)板上生长。

根据标准方法(Sambrook等，出处同上)进行常规分子克隆。DNA序列在ABI自动测序仪上使用染料终止物技术(美国专利号5,366,860；EP272,007)使用载体和插入片段特异性引物的组合产生。用DNASTAR软件(DNA Star，Inc.)完成基因序列的比较。

除非另有说明，否则进行BLAST(基本局部算法检索工具；Altschul，S.F.等，J.Mol.Biol.，215：403-410(1993)和Nucleic AcidsRes.，25：3389-3402(1997))检索来鉴定与在BLAST“nr”数据库(包含所有的非冗余GenBank CDS翻译，来源于3维结构Brookhaven蛋白质数据库的序列，SWISS-PROT蛋白质序列数据库、EMBL和DDBJ数据库)中包含的序列具有相似性的分离序列。翻译所有读框中的序列，并使用由国立生物技术信息中心(NCBI)提供的BLASTX算法(Gish，W.和States，D.J.Nature Genetics，3：266-272(1993))对“nr”数据库中包含的所有公众可用的蛋白质序列比较相似性。概述了与查询序列具有最高相似性的序列的BLAST比较结果根据％同一性、％相似性和期望值报告。“％同一性”被定义为两个蛋白之间相同的氨基酸的百分率。“％相似性”被定义为两个蛋白之间相同或保守的氨基酸的百分率。“期望值”估计匹配的统计学显著性，以给定记分指定预期在该大小的数据库检索中完全偶然的匹配数。

缩写的含义如下：“sec”表示秒；“min”表示分钟；“h”表示小时；“d”表示天，“μL”表示微升，“mL”表示毫升，“L”表示升，“μM”表示微摩尔，“mM”表示毫摩尔，“M”表示摩尔，“mmol”表示毫摩尔，“μmole”表示微摩尔，“g”表示克，“μg”表示微克，“ng”表示纳克，“U”表示单位，“bp”表示碱基对，而“kB”表示千碱基。

解脂耶氏酵母的转化和培养

解脂耶氏酵母菌株ATCC#20362购自美国典型培养物保藏中心(Rockville，MD)。解脂耶氏酵母菌株通常于28℃在YPD琼脂(1％酵母提取物、2％细菌用蛋白胨、2％葡萄糖、2％琼脂)上生长。

除非另有说明，否则按照Chen，D.C.等的方法(Appl.MicrobiolBiotechnol.，48(2)：232-235(1997))进行解脂耶氏酵母的转化。简而言之，将耶氏酵母在YPD平板上划线，并于30℃生长约18小时。由该板刮出若干大接种环细胞，并重悬浮在1mL转化缓冲液中，该缓冲液含有：2.25mL50％PEG，平均分子量3350；0.125mL2M乙酸锂，pH6.0；0.125mL2M DTT；和50μg已剪切鲑精DNA。然后，将约500ng的线性化质粒DNA在100μl重悬浮细胞中温育，并保持于39℃达1小时，以15分钟间隔涡旋混合。将细胞铺板在选择培养基板上，并于30℃保持2-3天。

对于转化体选择，一般使用基础培养基(“MM”)；MM的组成如下：0.17％无硫酸铵或氨基酸的酵母氮源(DIFCO Laboratories，Detroit，MI)、2％葡萄糖、0.1％脯氨酸，pH6.1。适宜时加入亮氨酸、赖氨酸和/或尿嘧啶的添加物至终浓度0.01％(由此产生“MMLe”、“MMLys”和“MMU”选择培养基，每个均用20g/L琼脂制备)。

或者，在5-氟乳清酸(“FOA”；又为5-氟尿嘧啶-6-羧酸一水合物)选择培养基上选择转化体，该培养基含有：0.17％无硫酸铵或氨基酸的酵母氮源(DIFCO Laboratories)、2％葡萄糖、0.1％脯氨酸、75mg/L尿嘧啶、75mg/L尿苷、900mg/L FOA(Zymo Research Corp.，Orange，CA)和20g/L琼脂。

如下制备高葡萄糖培养基(“HGM”)：6.3g/L KH₂PO₄、27g/LK₂HPO₄和80g/L葡萄糖(pH7.5)。

解脂耶氏酵母的脂肪酸分析

对于脂肪酸分析，通过离心收集细胞，如Bligh，E.G.和Dyer，W.J.(Can.J.Biochem.Physiol.，37：911-917(1959))所述提取脂质。用甲醇钠进行脂质提取物的酯基转移反应制备脂肪酸甲酯(Roughan，G.和Nishida I.Arch Biochem Biophys.，276(1)：38-46(1990))，然后用配备30-m×0.25mm(内径)HP-INNOWAX(Hewlett-Packard)柱的Hewlett-Packard6890GC进行分析。烤箱温度以3.5℃/分钟的速率从170℃(维持25分钟)升到185℃。

对于直接的碱性酯基转移反应，收获耶氏酵母培养物(3mL)，在蒸馏水中洗涤一次，然后在Speed-Vac中真空干燥5-10分钟。向样品中加入甲醇钠(100μl，1％)，然后涡旋并振荡20分钟。在加入3滴1MNaCl和400μl己烷后，涡旋样品并离心。取出上层，如上所述通过GC分析。

实施例1

编码Δ17去饱和酶的大豆疫霉基因的鉴定

美国能源部联合基因组研究所(“JGI”；Walnut Creek，CA)建立了1.0版的大豆疫霉基因组(估计基因组大小为95Mbp)。该基因组序列使用全基因组鸟枪法策略产生，含有总共19,276个基因模型。

使用致病疫霉的Δ17去饱和酶的氨基酸序列(GenBank登录号CAJ30870；本文称为“PiD17”，对应于SEQ ID NO；9)作为查询序列，对JGI的大豆疫霉数据库进行TBLASTN(BLAST蛋白对翻译的核苷酸)检索(使用得自JGI的默认参数)。发现一个位于骨架17：338148-339167的大豆疫霉ORF与PiD17共有广泛同源性(即在期望值为0的情况下具有91.8％同一性和95.6％相似性)。基于该同源性，大豆疫霉ORF被暂时鉴定为Δ17去饱和酶，称为“PsD17”。当由该数据库得到PsD17的1092bp的DNA序列(SEQ IDNO：1)时，发现其编码长度为363个氨基酸的多肽(SEQ ID NO：2)。使用ClustalW分析(DNASTAR软件的MegAlign^TM程序)进行氨基酸序列比对表明，在PiD17和PsD17之间具有90.9％的同一性；相比之下，核苷酸序列共有仅86.6％的同一性。

还使用PsD17(SEQ ID NO：2)作为查询序列进行蛋白质-蛋白质BLAST检索来测定PsD17与包含在“nr”数据库(参见一般方法)中的所有公共可用的蛋白序列的序列同源性。基于该分析，发现PsD17与异枝水霉的ω-3脂肪酸去饱和酶(GenBank登录号AAR20444)具有最大同源性；具体地说，在预期值为7E-117的情况下，PsD17与GenBank登录号AAR20444的氨基酸序列具有60％的同一性和74％的相似性。另外，在预期值为4E-57的情况下，PsD17与多变鱼腥藻(Anabaenavariabilis)ATCC#29413(GenBank登录号ABA23809)的脂肪酸去饱和酶的氨基酸序列具有39％的同一性和57％的相似性。

实施例2

解脂耶氏酵母的密码子优化的Δ17去饱和酶基因(“PsD17S”)的合成

以和在美国专利7,125,672中所述类似的方式，将大豆疫霉的Δ17去饱和酶基因的密码子选择针对在解脂耶氏酵母中表达进行优化。具体地说，基于PsD17的编码序列(SEQ ID NO：1和2)，按照耶氏酵母密码子选择模式(PCT公布号WO2004/101753)、‘ATG’翻译起始密码子周围的共有序列和RNA稳定性的一般规则(Guhaniyogi，G.和J.Brewer，Gene，265(1-2)：11-23(2001))，设计密码子优化的Δ17去饱和酶基因(称为“PsD17S”，SEQ ID NO：3和4)。除了翻译起始位点的修饰以外，还修饰1092bp编码区的175bp(16.0％)，并优化168个密码子(46.2％)。GC含量由野生型基因(即PsD17)中的65.1％下降至合成基因(即PsD17S)中的54.5％。NcoI位点和NotI位点分别掺入到PsD17S(SEQ ID NO：3)的翻译起始密码子周围和终止密码子之后。图2显示了PsD17和PsD17S的核苷酸序列的对比。在氨基酸水平上，与野生型PsD17相比，PsD17S没有第3个和第4个氨基酸；因此，PsD17S的总长为361个氨基酸(SEQ ID NO：4)。设计的PsD17S基因由GenScriptCorporation(Piscataway，NJ)合成，并克隆入pUC57(GenBank登录号Y14837)中，以产生pPsD17S(SEQ ID NO：10；图3A)。

实施例3

构建体pFmPsD17S的产生

本发明的实施例描述了质粒pFmPsD17S的构建，其含有嵌合FBAINm::PsD17S::XPR基因。使用来自质粒pKUNF1-KEA、pDMW214和pPsD17S的片段通过3向连接构建质粒pFmPsD17S(SEQ ID NO：13；图3D)。如在下文实施例5中所述利用质粒pFmPsD17S测试PsD17S的功能表达。

质粒pKUNF1-KEA

pKUNF1-KEA(SEQ ID NO：11；图3B)包含嵌合FBAINm::E1S::Pex20基因。该嵌合基因中的“FBAINm”启动子(PCT公布号WO05/049805；在图3B中也被标识为“Fbal+内含子”)是指合成启动子加具有fbal基因的内含子的5’编码区的一部分，所述合成启动子来源于“FBAIN”启动子，是表达必需的，其中FBAIN启动子是指在由fbal基因编码的果糖二磷酸醛缩酶(E.C.4.1.2.13)上的‘ATG’翻译起始密码子之前的5’上游非翻译区。FBAINm启动子由FBAIN修饰，即FBAINm在ATG翻译起始密码子和FBAIN启动子的内含子之间具有52bp缺失(由此包含N-末端的仅22个氨基酸)和内含子之后的新翻译共有基序。此外，尽管FBAIN启动子在与要表达的基因的编码区融合时产生融合蛋白，但FBAINm启动子不产生这样的融合蛋白。

表4概述了质粒pKUNF1-KEA的组成。

表4

质粒DKUNF1-KEA(SEQ ID NO：11)的描述

SEQ ID NO：11中的限制性位点和核苷酸	片段和嵌合基因组分的描述
		PmeI/PacI(360-2596)	FBAINm::EL1S::Pex20，其含有：●FBAINm：解脂耶氏酵母FBAINm启动子(PCT公布号WO2005/049805)●EL1S：密码子优化的延长酶1基因(PCT公布号WO2004/101753)，其来源于高山被孢霉(GenBank登录号AX464731)●Pex20：耶氏酵母Pex20基因的Pex20终止子序列(GenBank登录号AF054613)
AscI/BsiWI3387-2596	耶氏酵母Ura3基因(GenBank登录号AJ306421)的5’部分
		PacI/SphI6617-6095	耶氏酵母Ura3基因(GenBank登录号AJ306421)的3’部分

质粒pDMW214

pDMW214(SEQ ID NO：12；图3C)是在大肠杆菌和解脂耶氏酵母中均可复制的穿梭质粒。其含有以下组分：

表5

质粒pDMW214(SEQ ID NO：12)的描述

SEQ ID NO：12中的限制性位点和核苷酸	片段和嵌合基因组分的描述
		1150-270	ColE1质粒复制起点
2080-1220	氨苄青霉素抗性基因(Amp^R)
		2979-4256	耶氏酵母自主复制序列(ARS18；GenBank登录号A17608)
PmeI/SphI6501-4256	耶氏酵母Leu2基因(GenBank登录号AF260230)
		6501-1	FBAIN::GUS::XPR，其含有：●FBAIN：解脂耶氏酵母FBAIN启动子(PCT公布号WO2005/049805)●GUS：编码β-葡糖醛酸酶的大肠杆菌基因(Jefferson，R.A.Nature，14；342:837-838(1989))●XPR：耶氏酵母Xpr基因(GenBank登录号M17741)的约100bp的3’区

质粒pFmPsD17S的最终构建

质粒pKUNF1-KEA的PmeI/NcoI片段(图3B；含有FBAINm启动子)和质粒pPsD17S的NcoI/NotI片段(图3A；含有合成的Δ17去饱和酶基因PsD17S)定向用于置换pDMW214的PmeI/NotI片段(图3C)。这导致产生pFmPsD17S(SEQ ID NO：13；图3D)，其含有嵌合FBAINm::PsD17S::XPR基因。因此，pFmPsD17S的组分如下表6所述。

表6

质粒pFmPsD17S(SEQ ID NO：13)的描述

SEQ ID NO：13中的限制性位点和核苷酸	片段和嵌合基因组分的描述
		5551-1305	耶氏酵母自主复制序列(ARS18；GenBank登录号A17608)
7769-1269	FBAINm::PsD17S::XPR，其含有：●FBAINm：解脂耶氏酵母FBAINm启动子(PCT公布号WO2005/049805)●PsD17S：密码子优化的Δ17去饱和酶基因(SEQ IDNO:3)，其来源于大豆疫霉●XPR：耶氏酵母Xpr基因(GenBank登录号M17741)的约100bp的3’区
		2418-1538	ColE1质粒复制起点
3348-2488	氨苄青霉素抗性基因(Amp^R)
		PmeI/SphI7769-5524	耶氏酵母Leu2基因(GenBank登录号AF260230)，

实施例4

经Δ6去饱和酶/Δ6延长酶途径生产总脂质的约11％的ARA的

解脂耶氏酵母菌株Y2047的产生

本实施例描述了菌株Y2047的构建，该菌株来自解脂耶氏酵母ATCC#20362，能够经由Δ6去饱和酶/Δ6延长酶途径的表达生产相对于总脂质为11％的ARA(图4A)。Y2047已按照布达佩斯公约的条款保藏，得到ATCC编号PTA-7186。另外，Y2047的构建已描述于共同未决的美国专利申请号11/265761，该专利通过引用结合到本文中。

菌株Y2047的开发首先需要构建菌株M4(产生8％的DGLA)。

生产总脂质的约8％的DGLA的M4菌株的产生

产生构建体pKUNF12T6E(图4B；SEQ ID NO：14)，以将4个嵌合基因(含有Δ12去饱和酶、Δ6去饱和酶和两个C_18/20延长酶)整合入野生型耶氏酵母菌株ATCC#20362的Ura3基因座，由此能够生产DGLA。pKUNF12T6E质粒含有以下组分：

表7

质粒DKUNF12T6E(SEQ ID NO：14)的描述

SEQ ID NO：14中的限制性位点和核苷酸	片段和嵌合基因组分的描述
		AscI/BsiWI(9420-8629)	耶氏酵母Ura3基因(GenBank登录号AJ306421)的784bp的5’部分
SphI/PacI(12128-1)	耶氏酵母Ura3基因(GenBank登录号AJ306421)的516bp的3’部分
		SwaI/BsiWI(6380-8629)	FBAIN::EL1S::PEX20，其含有：●FBAIN：解脂耶氏酵母FBAIN启动子(PCT公布号WO2005/049805)●EL1S：密码子优化的延长酶1基因(PCT公布号WO2004/101753)，其来源于高山被孢霉(GenBank登录号AX464731)●Pex20：来自耶氏酵母Pex20基因的Pex20终止子序列(GenBank登录号AF054613)
BglII/SwaI(4221-6380)	TEF::Δ6S::Lip1，其含有：●TEF：解脂耶氏酵母TEF启动子(GenBank登录号AF054508)●Δ6S：密码子优化的Δ6去饱和酶基因(PCT公布号WO2004/101753)，其来源于高山被孢霉(GenBank登录号AF465281)●Lip1：来自耶氏酵母Lip1基因的Lip1终止子序列(GenBank登录号Z50020)

PmeI/ClaI(4207-1459)	FBA::F.Δ12::Lip2，其含有：●FBA：解脂耶氏酵母FBA启动子(PCT公布号WO2005/049805)●F.Δ12：串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)Δ12去饱和酶基因(PCT公布号WO2005/047485)●Lip2：来自耶氏酵母Lip2基因的Lip2终止子序列(GenBank登录号AJ012632)
		ClaI/PacI(1459-1)	TEF::EL2S::XPR，其含有：●TEF：解脂耶氏酵母TEF启动子(GenBank登录号AF054508)●EL2S：密码子优化的延长酶基因(SEQ ID NO：15)，其来源于金黄色破囊壶菌(美国专利号6,677,145)●XPR：耶氏酵母Xpr基因(GenBank登录号M17741)的约100bp的3’区

用AscI/SphI消化pKUNF12T6E质粒，然后按照一般方法用于转化野生型解脂耶氏酵母ATCC#20362。将转化体细胞铺板在FOA选择培养基平板上，并于30℃保持2-3天。拣选FOA抗性菌落，并在MM和MMU选择平板上划线。选择可在MMU平板上生长但不在MM平板上生长的菌落作为Ura-菌株。然后将单个菌落的Ura-菌株接种入30℃的液态MMU，并以250rpm/分钟振摇2天。通过离心收集细胞，提取脂质，并通过酯基转移反应制备脂肪酸甲酯，随后用Hewlett-Packard6890GC分析。

GC分析表明，DGLA存在于含有pKUNF12T6E的4个嵌合基因的转化体中，但不存在于野生型耶氏酵母对照菌株中。选定的32个Ura-菌株的大部分产生总脂质的约6％的DGLA。有2个菌株(即菌株M4和13-8)产生总脂质的约8％的DGLA。

产生总脂质的约11％的ARA的Y2047菌株的产生

产生构建体pDMW271(图4C；SEQ ID NO：17)，以将3个Δ5嵌合基因整合入耶氏酵母菌株M4的Leu2基因中。质粒pDMW271包含如在下表8中所述的组分：

表8

质粒pDMW271(SEQ ID NO：17)的描述

SEQ ID NO：17中的限制性位点和核苷酸	片段和嵌合基因组分的描述
		AscI/BsiWI(5520-6315)	耶氏酵母Leu2基因(GenBank登录号AF260230)的788bp的5’部分
SphI/PacI(2820-2109)	耶氏酵母Leu2基因(GenBank登录号AF260230)的703bp的3’部分
		SwaI/Bsi WI(8960-6315)	FBAIN::MAΔ5::Pex20，其含有：●FBAIN：解脂耶氏酵母FBAIN启动子(PCT公布号WO2005/049805)●MAΔ5：高山被孢霉Δ5去饱和酶基因(GenBank登录号AF067654)●Pex20：来自耶氏酵母Pex20基因的Pex20终止子序列(GenBank登录号AF054613)
SwaI/ClaI(8960-11055)	TEF::MAΔ5::Lip1，其含有：●TEF：解脂耶氏酵母TEF启动子(GenBank登录号AF054508)●MAΔ5：高山被孢霉Δ5去饱和酶基因(GenBank登录号AF067654)●Lip1：耶氏酵母Lip1基因的Lip1终止子序列(GenBank登录号Z50020)
		PmeI/ClaI(12690-11055)	耶氏酵母Ura3基因(GenBank登录号AJ306421)

ClaI/PacI(1-2109)

TEF::HΔ5S::Pex16，其含有：●TEF：解脂耶氏酵母TEF启动子(GenBank登录号AF054508)●HΔ5S：密码子优化的Δ5去饱和酶基因(SEQ IDNO：18)，其来源于人(Homo sapiens)(GenBank登录号NP_037534)●Pex16：耶氏酵母Pex16基因的Pex16终止子序列(GenBank登录号U75433)

用AscI/SphI消化质粒pDMW271，然后按照一般方法用于转化菌株M4。在转化后，将细胞铺板在MMLe平板上，并于30℃保持2-3天。拣选在MMLe平板上生长的单个菌落，并在MM和MMLe平板上划线。选择可以在MMLe平板上生长但不在MM平板上生长的那些菌落作为Leu2^-菌株。然后将Leu2^-菌株的单个菌落接种入30℃的液体MMLe培养基，并以250rpm/分钟振摇2天。通过离心收集细胞，提取脂质，并通过酯基转移反应制备脂肪酸甲酯，随后用Hewlett-Packard6890GC分析。

GC分析表明，ARA存在于pDMW271转化体中，但不存在于亲本M4菌株中。具体地说，在48个选定的具有pDMW271的Leu2^-转化体中，有35个菌株产生少于总脂质5％的ARA，12个菌株产生6-8％ARA，1个菌株产生工程化耶氏酵母中总脂质的约11％的ARA。产生11％ARA的菌株被命名为“Y2047”。

实施例5

密码子优化的Δ17去饱和酶基因(“PsD17S”)

在解脂耶氏酵母菌株Y2047中的表达

如在一般方法中所述，将质粒pFmPsD17S(图3D；实施例3)转化入解脂耶氏酵母菌株Y2047(实施例4)中。将转化体细胞铺板在MM选择培养基平板上，并于30℃保持2-3天。拣选在MM平板上生长的8个转化体，并在新鲜MM平板上再划线。一旦生长，就将这些菌株单独接种入30℃的3mL液体MM中，并以250rpm/分钟振摇2天。通过离心收集细胞，提取脂质，并通过酯基转移反应制备脂肪酸甲酯，随后用Hewlett-Packard6890GC分析。

GC结果表明，在全部8个转化体中都产生总脂质的约3％ARA和2％EPA。在这8个菌株中PsD17S将ARA转变为EPA的转变效率为约40％的平均速率。按照下式测定转变效率：([产物]/[底物+产物])*100，其中‘产物’包括中间产物和途径中由中间产物衍生的所有产物。因此，该实验数据证实，来源于大豆疫霉的密码子优化的Δ17去饱和酶基因(SEQ ID NO：3)将ARA有效去饱和为EPA。

实施例6

构建体pZP3-P7U的产生

本实施例描述了含有嵌合YAT::PsD17S::Lip1基因的质粒pZP3-P7U的构建，该质粒设计用于整合入耶氏酵母基因组的Pox3基因座(GenBank登录号XP_503244)中。如在下文的实施例8中所述，质粒pZP3-P7U用于检验PsD17S的功能表达。pZP3-P7U的组分描述于下表9。

表9

质粒pZP3-P7U(SEQ ID NO：20)的描述

SEQ ID NO：20中的限制性位点和核苷酸	片段和嵌合基因组分的描述
		AscI/BsiWI(4030-4800)	耶氏酵母Pox3基因(GenBank登录号AJ001301)的770bp的5’部分
PacI/SphI(504-1300)	耶氏酵母Pox3基因(GenBank登录号AJ001301)的826bp的3’部分
		ClaI/SwaI	YAT::PsD17S::Lip1，其含有：

7133-4960	●YAT：耶氏酵母YAT启动子(PCT公布号WO2006/052754)●PsD17S：密码子优化的Δ17去饱和酶基因(SEQIDNO:3)，其来源于大豆疫霉●Lip1：耶氏酵母Lip1基因的Lip1终止子序列(GenBank登录号Z50020)
		ClaI/EcoRI7133-1	LoxP::Ura3::LoxP，其含有：●LoxP序列(SEQ ID NO：21)●耶氏酵母Ura3基因(GenBank登录号AJ306421)●LoxP序列(SEQ ID NO：21)

实施例7

经Δ9延长酶/Δ8去饱和酶途径生产总脂质的约12％的ARA的

解脂耶氏酵母菌株Y4070的产生

本实施例描述了菌株Y4070的构建，该菌株来源于解脂耶氏酵母ATCC#20362，能够经由Δ9延长酶/Δ8去饱和酶途径的表达生产相对于总脂质约12％的ARA(图6A)。菌株Y4070用于检验下文实施例8中的PsD17S和实施例12中的PrD17S的功能表达。

菌株Y4070的开发需要构建菌株Y2224(来自野生型耶氏酵母菌株ATCC#20362的Ura3基因的自发突变的FOA抗性突变体)、菌株Y4001(产生17％EDA，具有Leu-表型)、菌株Y4001U(产生17％EDA，具有Leu-和Ura-表型)、菌株Y4036(产生18％DGLA，具有Leu-表型)和菌株Y4036U(产生18％DGLA，具有Leu-和Ura-表型)。

菌株Y2224的产生

以下述方式分离菌株Y2224：将来自YPD琼脂平板(1％酵母提取物、2％细菌用蛋白胨、2％葡萄糖、2％琼脂)的解脂耶氏酵母ATCC#20362细胞在含有250mg/L5-FOA(Zymo Research)的MM平板(各75mg/L的尿嘧啶和尿苷、6.7g/L含硫酸铵但无氨基酸的YNB以及20g/L葡萄糖)上划线。将平板于28℃温育，将所获菌落中的4个单独贴在含有200mg/mL5-FOA的MM平板上以及没有尿嘧啶和尿苷的MM平板上，以证实尿嘧啶Ura3营养缺陷型。

产生总脂质的约17％的EDA的菌株Y4001的产生

经整合构建体pZKLeuN-29E3产生菌株Y4001(图6B)。将含有4个嵌合基因(即Δ12去饱和酶、C_16/18延长酶和2个Δ9延长酶)的该构建体整合入菌株Y2224的Leu2基因座中，由此能够生产EDA。

构建体pZKLeuN-29E3含有表10中所示组分。

表10

质粒pZKLeuN-29E3(SEQ ID NO：22)的描述

SEQ ID NO：22中的限制性位点和核苷酸	片段和嵌合基因组分的描述
		BsiW I/Asc I(7797-7002)	耶氏酵母Leu2基因(GenBank登录号AF260230)的788bp的3’部分
Sph I/Pac I(4302-3591)	耶氏酵母Leu2基因(GenBank登录号AF260230)的703bp的5’部分
		Swa I/BsiW I(10500-7797)	GPD::F.D12::Pex20，其含有：●GPD：解脂耶氏酵母GPD启动子(PCT公布号WO2005/003310)●F.D12：串珠镰刀菌Δ12去饱和酶基因(PCT公布号WO2005/047485)●Pex20：耶氏酵母Pex20基因的Pex20终止子序列(GenBank登录号AF054613)
Bgl II/Swa I(12526-10500)	Exp pro::EgD9E::Lip1，其含有：●Exp pro：解脂耶氏酵母输出蛋白(EXP1)启动子

	(PCT公布号WO2006/052870和美国专利申请号11/265761)●EgD9E：来源于纤细裸藻的密码子优化的Δ9延长酶(SEQ ID NO：23)(“EgD9eS”；美国专利申请号11/601563和11/601564)●Lip1：耶氏酵母Lip1基因的Lip1终止子序列(GenBank登录号Z50020)
		Pme I/Cla I(12544-1)	FBAINm::EgD9S::Lip2，其含有：●FBAINm：解脂耶氏酵母FBAINm启动子(PCT公布号WO2005/049805)●EgD9S：来源于纤细裸藻的密码子优化的Δ9延长酶基因(SEQ ID NO：23)(“EgD9eS”；美国专利申请号11/601563和11/601564)●Lip2：耶氏酵母Lip2基因的Lip2终止子序列(GenBank登录号AJ012632)
Cla I/EcoR I(1-1736)	LoxP::Ura3::LoxP，其含有：●LoxP序列(SEQ ID NO：21)●耶氏酵母Ura3基因(GenBank登录号AJ306421)●LoxP序列(SEQ ID NO：21)
		EcoR I/Pac I(1736-3591)	NT::ME3S::Pex16，其含有：●NT：解脂耶氏酵母YAT1启动子(专利公布号U.S.2006/0094102-A1)●ME3S：来源于高山被孢霉的密码子优化的C_16/18延长酶基因(SEQ ID NO：25)(美国专利申请号11/253882还有PCT公布号WO2006/052870)●Pex16：耶氏酵母Pex16基因的Pex16终止子序列(GenBank登录号U75433)

用Asc I/Sph I消化质粒pZKLeuN-29E3，然后按照一般方法用于转化解脂耶氏酵母菌株Y2224(即ATCC #20362 Ura3-)。将转化体细胞铺板在MMLeu培养基平板上，并于30℃保持2-3天。拣选菌落，并在MM和MMLeu选择平板上划线。选择可以在MMLeu平板上生长但不在MM平板上生长的菌落作为Leu-菌株。然后将Leu-菌株的单个菌落接种入30℃的液体MMLeu培养基，并以250rpm/分钟振摇2天。通过离心收集细胞，提取脂质，并通过酯基转移反应制备脂肪酸甲酯，随后用Hewlett-Packard6890GC分析。

GC分析表明，EDA存在于含有pZKLeuN-29E3的4个嵌合基因的转化体中，但不存在于耶氏酵母Y2224对照菌株中。选定的36个Leu-菌株大部分产生总脂质的约12-16.9％的EDA。有3个菌株(即菌株#11、#30和#34)产生总脂质的约17.4％、17％和17.5％的EDA；它们分别被称为菌株Y4001、Y4002和Y4003。

生产总脂质的约17％的EDA的菌株Y4001U(Leu-，Ura-)的产生

经在菌株Y4001的质粒pY116(图6C)中短暂表达Cre重组酶建立菌株Y4001U，以产生Leu-和Ura-表型。构建体pY116含有以下组分：

表11

质粒pY116(SEQ ID NO：27)的描述

SEQ ID NO：27中的限制性位点和核苷酸	片段和嵌合基因组分的描述
		1328-448	ColE1质粒复制起点
2258-1398	用于在大肠杆菌中选择的氨苄青霉素抗性基因(Amp^R)
		3157-4461	耶氏酵母自主复制序列(ARS18；GenBank登录号A17608)

PacI/SawI6667-4504	耶氏酵母Leu2基因(GenBank登录号AF260230)
		Swa I/Pme I(6667-218	GPAT::Cre::XPR2，其含有：●GPAT：解脂耶氏酵母GPAT启动子(PCT公布号WO2006/031937)●Cre：用于重组酶蛋白的肠细菌噬菌体P1Cre基因(GenBank登录号X03453)●XPR2：耶氏酵母Xpr基因(GenBank登录号M17741)的约100bp的3’区

按照一般方法将质粒pY116用于新鲜生长的Y4001细胞的转化。将转化体细胞铺板在含有280μg/mL磺酰脲的MMLeu+Ura平板(MMU加亮氨酸)上，并于30℃保持3-4天。拣选4个菌落，并接种入30℃的3mL液体YPD培养基中，以250rpm/分钟振摇1天。用液体MMLeu+Ura培养基将培养物稀释至1:50,000，将100μL铺板在新的YPD平板上，并于30℃保持2天。拣选菌落，并在MMLeu和MMLeu+Ura选择平板上划线。选择可在MMLeu+Ura平板上生长但不在MMLeu平板上生长的菌落，并通过GC分析，以证实存在C20:2(EDA)。1个具有Leu-和Ura-表型的菌株产生总脂质的约17％的EDA，称为Y4001U。

产生总脂质的约18％的DGLA的Y4036菌株的产生

产生构建体pKO2UF8289(图7A；SEQ ID NO：28)，以将4个嵌合基因(包含Δ12去饱和酶、1个Δ9延长酶和2个突变Δ8去饱和酶)整合入菌株Y4001U1的Δ12基因座中，由此能够产生DGLA。构建体pKO2UF8289包含以下组分：

表12

质粒pKO2UF8289(SEQ ID NO：28)的描述

SEQ ID NO：28中的限制性位点和核苷酸	片段和嵌合基因组分的描述
		AscI/BsiWI(10304-9567)	耶氏酵母Δ12去饱和酶基因(PCT公布号WO2004/104167)的5’部分
EcoRI/SphI(13568-13012)	耶氏酵母Δ12去饱和酶基因(PCT公布号WO2004/104167)的3’部分
		SwaI/BsiWI(7055-9567)	FBAINm::EgD8M::Pex20，其含有：●FBAINm：解脂耶氏酵母FBAINm启动子(PCT公布号WO2005/049805)●EgD8M：来源于纤细裸藻的合成的Δ8去饱和酶突变体EgD8S-23(SEQ ID NO：29)(美国专利申请号11/635258)●Pex20：耶氏酵母Pex20基因的Pex20终止子序列(GenBank登录号AF054613)
SwaI/PmeI(7055-4581)	YAT::F.D12::OCT，其含有：●YAT：解脂耶氏酵母YAT1启动子(专利公布号US2006/0094102-A1)●F.D12：串珠镰刀菌Δ12去饱和酶基因(PCT公布号WO2005/047485)●耶氏酵母OCT基因的OCT终止子序列(GenBank登录号X69988)
		PmeI/PacI(4581-2124)	EXP::EgD8M::Pex16，其含有：●EXP：解脂耶氏酵母输出蛋白(EXP1)启动子(PCT公布号WO2006/052870和美国专利申请号11/265761)●EgD8M：来源于纤细裸藻的合成的Δ8去饱和酶突变体EgD8S-23(SEQ ID NO：29)(美国专利申请

	号11/635258)●Pex16：耶氏酵母Pex16基因的Pex16终止子(GenBank登录号U75433)
		PmeI/ClaI(2038-1)	GPAT::EgD9e::Lip2，其含有：●GPAT：解脂耶氏酵母GPAT启动子(PCT公布号WO2006/031937)●EgD9e：纤细裸藻Δ9延长酶基因(SEQ IDNO：31)(美国专利申请号11/601563和11/601564)●Lip2：耶氏酵母Lip2基因的Lip2终止子序列(GenBank登录号AJ012632)
ClaI/EcoRI(13568-1)	LoxP::Ura3::LoxP，其含有：●LoxP序列(SEQ ID NO：21)●耶氏酵母Ura3基因(GenBank登录号AJ306421)●LoxP序列(SEQ ID NO：21)

用AscI/SphI消化pKO2UF8289质粒，然后按照一般方法用于转化菌株Y4001U1。将转化体细胞铺板在MMLeu平板上，并于30℃保持2-3天。拣选菌落，并在MMLeu选择平板上划线，于30℃保持2天。然后将这些细胞接种入30℃的液体MMLeu，并以250rpm/分钟振摇2天。通过离心收集细胞，提取脂质，并通过酯基转移反应制备脂肪酸甲酯，随后用Hewlett-Packard6890GC分析。

GC分析表明，DGLA存在于含有pKO2UF8289的4个嵌合基因的转化体中，但不存在于亲本Y4001U1菌株中。选定的96个菌株中大部分产生总脂质的7-13％的DGLA。有6个菌株(即#32、#42、#60、#68、#72和#94)产生总脂质的约15％、13.8％、18.2％、13.1％、15.6％和13.9％的DGLA。这6个菌株分别被称为Y4034、Y4035、Y4036、Y4037、Y4038和Y4039。

产生总脂质的约18％DGLA的菌株Y4036U(Leu-，Ura3-)的产生

构建体pY116(图6C；SEQ ID NO：27)用于在菌株Y4036中瞬时表达Cre重组酶。这由基因组释放出夹在LoxP之间的Ura3基因。

按照一般方法将质粒pY116用于转化菌株Y4036。在转化后，将细胞铺板在MMLeu+Ura平板(MMU加亮氨酸)上，并于30℃保持2-3天。拣选在MMLeu+Ura平板生长的单个菌落，并于30℃划线入YPD液体培养基中，以250rpm/分钟振摇1天，以分离出(cure)pY116质粒。将生长培养物划线在MMLeu+Urau平板上。在于30℃生长两天后，将单个菌落再划线在MMLeu+Ura、MMU和MMLeu平板上。选择那些可以在MMLeu+Ura上生长但不在MM或MMLeu平板上生长的菌落。这些菌株中的1个具有Leu-和Ura-表型的菌株被称为Y4036U(Ura-，Leu-)。

产生总脂质的约12％的ARA的Y4070菌株的产生

产生构建体pZKSL-555R(图7B；SEQ ID NO：32)，以将3个Δ5去饱和酶基因整合入菌株Y4036U的Lys基因座中，由此能够生产ARA。pZKSL-555R质粒含有以下组分：

表13

质粒pZKSL-555R(SEQ ID NO：32)的描述

SEQ ID NO：32中的限制性位点和核苷酸	片段和嵌合基因组分的描述
		AscI/BsiWI(3321-2601)	耶氏酵母Lys5基因(GenBank登录号M34929)的720bp的5’部分
PacI/SphI(6716-6029)	耶氏酵母Lys5基因(GenBank登录号M34929)的687bp的3’部分
		BglII/BsiWI(15-2601)	EXP::EgD5S::Pex20，其含有：●EXP：解脂耶氏酵母输出蛋白(EXP1)启动子(WO

	2006/052870和美国专利申请号11/265761)●EgD5S：来源于纤细裸藻的密码子优化的Δ5去饱和酶(SEQ ID NO：33)(美国临时申请序号60/801172)●Pex20：耶氏酵母Pex20基因的Pex20终止子序列(GenBank登录号AF054613)
		ClaI/PmeI(11243-1)	YAT::RD5S::OCT，其含有：●YAT：解脂耶氏酵母YAT1启动子(专利申请US2006/0094102-A1)●RD5S：来源于多甲藻属CCMP626的密码子优化的Δ5去饱和酶(SEQ ID NO：35)(美国临时申请序号60/801119)●OCT：耶氏酵母OCT基因(GenBank登录号X69988)的OCT终止子序列
EcoRI/PacI(9500-6716)	FBAIN::EgD5WT::Aco，其含有●FBAIN：解脂耶氏酵母FBAIN启动子(WO2005/049805)●EgD5WT：纤细裸藻Δ5去饱和酶(SEQ ID NO：35；美国临时申请序号60/801172)，除去了内部的BglII、HindIII和NcoI限制酶位点●Aco：耶氏酵母Aco基因(GenBank登录号AJ001300)的Aco终止子
		EcoR/ClaI(9500-11243)	耶氏酵母Leu2基因(GenBank登录号M37309)

用AscI/SphI消化pZKSL-555R质粒，然后按照一般方法用于转化菌株Y4036U。将转化体细胞铺板在MMLeuLys平板(MMLeu加亮氨酸)上，并于30℃保持2-3天。然后将单个菌落再划线在MMLeuLys平板上，接着将这些细胞接种入30℃的液体MMLeuLys中，并以250rpm/分钟振摇2天。通过离心收集细胞，提取脂质，并通过酯基转移反应制备脂肪酸甲酯，随后用Hewlett-Packard6890GC分析。

GC分析表明，ARA存在于含有pZKSL-555R的3个嵌合基因的转化体中，但不存在于亲本Y4036菌株中。选定的96个菌株大部分产生总脂质的约10％的ARA。有4个菌株(即#57、#58、#69和#75)产生总脂质的约11.7％、11.8％、11.9％和11.7％的ARA。这4个菌株分别被称为Y4068、Y4069、Y4070和Y4071。进一步的分析表明，pZKSL-555R的3个嵌合基因没有整合入Y4068、Y4069、Y4070和Y4071菌株的Lys5位点中。所有菌株都具有Lys+表型。菌株Y4070相对于野生型解脂耶氏酵母ATCC#20362的最终表型为Ura3-、Leu+、Lys+、GPD::F.D12::Pex20、YAT::F.D12::OCT、YAT::ME3S::Pex16、GPAT::EgD9e::Lip2、Exp::EgD9eS::Lip1、FBAINm::EgD9eS::Lip2、FBAINm::EgD8M::Pex20、EXP::EgD8M::Pex16、FBAIN::EgD5WT::Aco、EXP::EgD5S::Pex20、YAT::RD5S::OCT。

实施例8

密码子优化的Δ17去饱和酶基因(“PsD17S”)

在解脂耶氏酵母菌株Y4070中的表达

用AscI/SphI消化质粒pZP3-P7U(图5；实施例6)，然后按照一般方法用于转化解脂耶氏酵母菌株Y4070。在转化后，将细胞铺板在MM平板上，并于30℃保持2-3天。拣选在MM平板上生长的12个转化体，并再划线在新鲜MM平板上。一旦生长，就将这些菌株单独接种入30℃的3mL液体MM中，并以250rpm/分钟振摇2天。通过离心收集细胞，并重悬浮在高葡萄糖培养基中，然后于30℃生长5天，并以250rpm/分钟振摇。通过离心收集细胞，提取脂质，并通过酯基转移反应制备脂肪酸甲酯，随后用Hewlett-Packard6890GC分析。

GC结果示于以下的表14。脂肪酸被鉴定为16:0、16:1、18:0、18:1(油酸)、LA(18:2)、ALA、EDA(20:2)、DGLA、ARA、ETrA(20:3)、ETA和EPA；每个的组成都表示为总脂肪酸的％。“Δ17活性”按照下式计算：([EPA]/[ARA+EPA])*100，代表底物转变为EPA的百分率。“Δ15活性”按照下式计算：([ALA]/[LA+ALA])*100，代表底物转变为ALA的百分率。

GC结果证实，在12个转化体中产生总脂质的平均0.3％的ARA和11.5％的EPA。在这12个菌株中PsD17S将ARA转变为EPA的转变效率为约98％的平均速率。按照下式测定转变效率：([产物]/[底物+产物])*100，其中‘产物’包括中间产物和途径中由中间产物衍生的所有产物。因此，该实验数据证实，来自大豆疫霉的密码子优化的Δ17去饱和酶基因(SEQ ID NO：3)将ARA有效去饱和为EPA。

在12个转化体中产生总脂质的平均5％的ALA和29.1％的LA。在这12个菌株中PsD17S将LA转变为ALA的转变效率为约15％的平均速率。另外，在全部12个菌株中都产生EtrA和ETA，提示PsD17可能会将EDA转变为EtrA和将DGLA转变为ETA；然而，在这两种情况下难以计算转变效率，因为菌株Y4070中的Δ9延长酶可将ALA转变为EtrA，Δ8去饱和酶可将EtrA转变为ETA。

显然，PsD17同时具有Δ17和Δ15去饱和酶活性，因此用作如本文定义的双功能去饱和酶。

实施例9

编码Δ17去饱和酶的栎树猝死病菌基因的鉴定

美国能源部联合基因组研究所(“JGI”；Walnut Creek，CA)建立了1.0版的栎树猝死病菌基因组(估计基因组大小为65Mbp)。该基因组序列使用全基因组鸟枪法策略产生，含有总共16,066个基因模型。

以类似于实施例1所述的方式，将PiD17的氨基酸序列(SEQ IDNO：9)用作查询序列，对JGI的栎树猝死病菌数据库进行TBLASTN检索(使用得自JGI的默认参数)。

发现在栎树猝死病菌的基因组序列中有两个ORF与PiD17共有广泛的同源性。具体地说，在预期值为0的情况下，ORF80222与SEQID NO：9共有89％的同一性和94％的相似性。同样，在预期值为6E-44的情况下，ORF48790与SEQ ID NO：9共有40％的同一性和61％的相似性。基于这些结果，ORF80222被暂时鉴定为Δ17去饱和酶，被称为“PrD17”。

当由该数据库得到PrD17的1086bp DNA序列(SEQ ID NO：5)时，发现其编码长度为361个氨基酸的多肽(SEQ ID NO：6)。使用ClustalW分析(DNASTAR软件的MegAlign^TM程序)进行氨基酸序列比对表明，在PiD17和PrD17之间具有89.5％的同一性；相比之下，核苷酸序列仅共有85.7％的同一性。

又使用PrD17(SEQ ID NO：6)作为查询序列进行蛋白质-蛋白质BLAST检索来测定PrD17与包含在“nr”数据库(参见一般方法)中的所有公共可用的蛋白序列依次相比的序列同源性。显示出具有最高相似性程度的序列为异枝水霉的ω-3脂肪酸去饱和酶(GenBank登录号AAR20444)，在预期值为E-124的情况下，共有59％的同一性和74％的相似性。另外，在预期值为6E-61的情况下，PrD17与多变鱼腥藻ATCC#29413(GenBank登录号ABA23809)的脂肪酸去饱和酶的氨基酸序列具有38％的同一性和57％的相似性。

实施例10

用于解脂耶氏酵母的密码子优化的

Δ17去饱和酶基因(“PrD17S”)的合成

以和实施例2中所述类似的方式，将栎树猝死病菌的Δ17去饱和酶基因的密码子选择针对在解脂耶氏酵母中表达进行优化。具体地说，基于PrD17的编码序列(SEQ ID NO：5和6)，按照耶氏酵母密码子选择模式(PCT公布号WO2004/101753)、‘ATG’翻译起始密码子周围的共有序列和RNA稳定性的一般规则(Guhaniyogi，G.和J.Brewer，Gene，265(1-2)：11-23(2001))，设计密码子优化的Δ17去饱和酶基因(称为“PrD17S”，SEQ ID NO：7)。除了翻译起始位点的修饰以外，还修饰1086bp编码区的168bp(15.5％)，并优化160个密码子(44.2％)。GC含量由野生型基因(即PrD17)中的64.4％下降至合成基因(即PrD17S)中的54.5％。NcoI位点和NotI位点分别被掺入到PrD17S(SEQID NO：7)的翻译起始密码子周围和终止密码子之后。图8显示了PrD17和PrD17S的核苷酸序列的对比。密码子优化的基因中的修饰没有一个改变所编码蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：6)。设计的PrD17S基因通过GenScript Corporation(Piscataway，NJ)合成，并克隆入pUC57(GenBank登录号Y14837)中，以产生pPrD17S(图9A；SEQ ID NO：38)。

实施例11

构建体pZuFPrD17S的产生

本实施例描述了含有嵌合FBAIN::PrD17S::Pex20基因的质粒pZuFPrD17S(图9B)的构建。质粒pZuFPrD17S如在下文实施例12中所述用于测试PrD17S的功能表达。

具体地说，通过使用含有质粒pPrD17S的PrD17S编码区的NcoI/NotI片段置换pZuF17的NcoI/NotI片段构建质粒pZuFPrD17S(图9C；SEQ ID NO：39)。因此，pZuFPrD17S的组分如在下表15中所述。

表15

质粒pZuFPrD17S(SEQ ID NO：40)的描述

SEQ ID NO：40中的限制性位点和核苷酸	片段和嵌合基因组分的描述
		EcoRI/ClaI4203--5599	耶氏酵母自主复制序列(ARS18；GenBank登录号A17608)
EcoRI/BsiWI7152-1407	FBAIN::PrD17S::Pex20，含有：●FBAIN：解脂耶氏酵母FBAINm启动子(PCT公布号WO2005/049805)●PrD17S：来源于栎树猝死病菌的密码子优化的Δ17去饱和酶基因(SEQ ID NO：7)●耶氏酵母Pex20基因的Pex20：Pex20终止子序列(GenBank登录号AF054613)

2443-1563	ColE1质粒复制起点
		3373-2513	氨苄青霉素抗性基因(Amp^R)
EcoRI/PacI7130-5619	耶氏酵母Ura3基因(GenBank登录号AJ306421)

实施例12

密码子优化的Δ17去饱和酶基因PrD17S

在解脂耶氏酵母菌株Y4070中的表达

如在一般方法中所述将质粒pZuFPrD17S(图9B；实施例11)转化入解脂耶氏酵母菌株Y4070中(实施例8)。将转化体细胞铺板在MM选择培养基平板上，并于30℃保持2-3天。拣选在MM平板上生长的10个转化体，并再划线在新鲜MM平板上。一旦生长，就将这些菌株单独接种入30℃的3mL液体MM中，并以250rpm/分钟振摇2天。通过离心收集细胞，并重悬浮在高葡萄糖培养基中，然后于30℃生长5天，并以250rpm/分钟振摇。通过离心收集细胞，提取脂质，并通过酯基转移反应制备脂肪酸甲酯，随后用Hewlett-Packard6890GC分析。

GC结果示于下表16。脂肪酸被鉴定为16:0、16:1、18:0、18:1(油酸)、LA(18:2)、ALA、EDA(20:2)、DGLA、ARA、ETrA(20:3)、ETA和EPA；每个的组成都表示为总脂肪酸的％。“Δ17活性”按照下式计算：([EPA]/[ARA+EPA])*100，代表底物转变为EPA的百分率。“Δ15活性”按照下式计算：([ALA]/[LA+ALA])*100，代表底物转变为ALA的百分率。

表16表明，在10个转化体中产生总脂质的平均7.5％的ARA和7.2％的EPA。在这10个菌株中PrD17S将ARA转变为EPA的转变效率为约49％的平均速率。转变效率如在实施例8中所述检测。因此，该实验数据证实，来自栎树猝死病菌的密码子优化的Δ17去饱和酶基因(SEQ ID NO：5)将ARA有效去饱和为EPA。

在10个转化体中产生总脂质的平均0.4％的ALA和39.6％的LA(C18:2)。在这10个菌株中PrD17S将LA转变为ALA的转变效率为约仅1％的平均速率。

因此，PrD17S在本文被鉴定为单功能的Δ17去饱和酶，其催化ARA向EPA的转变。

序列表

<110>纳幕尔杜邦公司

<120>Δ-17去饱和酶及其用于制备多不饱和脂肪酸的用途

<130>CL3479PCT

<160>40

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>1092

<212>DNA

<213>大豆疫霉

<400>1

atggcgtcca agcaggagca gccgtaccag ttcccgacgc tgacggagat caagcgctcg 60

ctgcccagcg agtgtttcga ggcgtccgtg ccgctctcgc tctactacac ggtgcgctgc 120

ctggtgatcg ccgtgtcgct ggccttcggg ctccaccacg cgcgctcgct gcccgtggtc 180

gagggcctct gggcgctgga cgccgcgctc tgcacgggct acgtgctgct gcagggcatc 240

gtgttctggg gcttcttcac cgtgggccat gacgccggcc acggcgcctt ctcgcgctac 300

cacctgctca acttcgtgat cggcaccttc atccactcgc tcatcctgac gcccttcgag 360

tcgtggaagc tcacgcaccg ccaccaccac aagaacacgg gcaacatcga ccgcgacgag 420

atcttctacc cgcagcgcaa ggccgacgac cacccgctct cgcgtaacct catcctggcg 480

ctgggcgccg cgtggttcgc ctacctggtc gagggcttcc cgccgcgcaa ggtcaaccac 540

ttcaacccgt tcgagccgct gttcgtccgc caggtgtccg ccgtggtcat ctcgctggcc 600

gcgcacttcg gcgtggccgc gctgtccatc tacctgagcc tgcagttcgg cttcaagacc 660

atggctatct actactacgg gcccgtgttc gtgttcggca gcatgctggt catcaccacc 720

ttcctgcacc acaacgacga ggagaccccc tggtacgccg actcggagtg gacctacgtc 780

aagggcaacc tctcgtcggt cgaccgctcc tacggcgcgc tcatcgacaa cctgagccac 840

aacatcggca cgcaccagat ccaccacctc ttccccatca tcccgcacta taagctcaag 900

cgcgccaccg aggccttcca ccaggcgttc cccgagctcg tgcgcaagag cgacgagccc 960

atcattaagg ccttcttccg cgtcggccgc ctctacgcca actacggcgt cgtggactcg 1020

gacgccaagc tcttcacgct caaggaggcc aaggccgtgt ccgaggcggc gaccaagact 1080

aaggccaact ga 1092

<210>2

<211>363

<212>PRT

<213>大豆疫霉

<400>2

Met Ala Ser Lys Gln Glu Gln Pro Tyr Gln Phe Pro Thr Leu Thr Glu

1 5 10 15

Ile Lys Arg Ser Leu Pro Ser Glu Cys Phe Glu Ala Ser Val Pro Leu

20 25 30

Ser Leu Tyr Tyr Thr Val Arg Cys Leu Val Ile Ala Val Ser Leu Ala

35 40 45

Phe Gly Leu His His Ala Arg Ser Leu Pro Val Val Glu Gly Leu Trp

50 55 60

Ala Leu Asp Ala Ala Leu Cys Thr Gly Tyr Val Leu Leu Gln Gly Ile

65 70 75 80

Val Phe Trp Gly Phe Phe Thr Val Gly His Asp Ala Gly His Gly Ala

85 90 95

Phe Ser Arg Tyr His Leu Leu Asn Phe Val Ile Gly Thr Phe Ile His

100 105 110

Ser Leu Ile Leu Thr Pro Phe Glu Ser Trp Lys Leu Thr His Arg His

115 120 125

His His Lys Asn Thr Gly Asn Ile Asp Arg Asp Glu Ile Phe Tyr Pro

130 135 140

Gln Arg Lys Ala Asp Asp His Pro Leu Ser Arg Asn Leu Ile Leu Ala

145 150 155 160

Leu Gly Ala Ala Trp Phe Ala Tyr Leu Val Glu Gly Phe Pro Pro Arg

165 170 175

Lys Val Asn His Phe Asn Pro Phe Glu Pro Leu Phe Val Arg Gln Val

180 185 190

Ser Ala Val Val Ile Ser Leu Ala Ala His Phe Gly Val Ala Ala Leu

195 200 205

Ser Ile Tyr Leu Ser Leu Gln Phe Gly Phe Lys Thr Met Ala Ile Tyr

210 215 220

Tyr Tyr Gly Pro Val Phe Val Phe Gly Ser Met Leu Val Ile Thr Thr

225 230 235 240

Phe Leu His His Asn Asp Glu Glu Thr Pro Trp Tyr Ala Asp Ser Glu

245 250 255

Trp Thr Tyr Val Lys Gly Asn Leu Ser Ser Val Asp Arg Ser Tyr Gly

260 265 270

Ala Leu Ile Asp Asn Leu Ser His Asn Ile Gly Thr His Gln Ile His

275 280 285

His Leu Phe Pro Ile Ile Pro His Tyr Lys Leu Lys Arg Ala Thr Glu

290 295 300

Ala Phe His Gln Ala Phe Pro Glu Leu Val Arg Lys Ser Asp Glu Pro

305 310 315 320

Ile Ile Lys Ala Phe Phe Arg Val Gly Arg Leu Tyr Ala Asn Tyr Gly

325 330 335

Val Val Asp Ser Asp Ala Lys Leu Phe Thr Leu Lys Glu Ala Lys Ala

340 345 350

Val Ser Glu Ala Ala Thr Lys Thr Lys Ala Asn

355 360

<210>3

<211>1086

<212>DNA

<213>大豆疫霉

<220>

<221>其它特征

<223>合成的Δ17去饱和酶(密码子优化的)

<400>3

atggctacca agcagcccta ccagttccct actctgaccg agatcaagcg atctctgccc 60

tccgagtgtt tcgaggcctc cgtgcctctc tctctgtact acaccgttcg atgcctggtc 120

attgctgtgt cgctcgcctt cggacttcac catgcacgat ctctgcccgt tgtcgaaggc 180

ctctgggctc tggatgccgc tctctgcacc ggttacgtgc tgctccaggg catcgtcttc 240

tggggattct ttactgttgg tcacgacgct ggacatggtg ccttctcccg ataccacctg 300

ctcaactttg tcatcggaac cttcattcac tctctcatcc ttacaccctt cgagtcctgg 360

aagctcaccc acagacacca tcacaagaac actggcaaca tcgaccgaga cgaaatcttc 420

taccctcaac gaaaggccga cgatcatcct ctgtctcgaa acctcattct ggctttgggt 480

gcagcctggt ttgcctacct ggtcgaaggc tttcctcccc gaaaggtcaa ccacttcaac 540

cccttcgagc ctctctttgt tcgacaggtc tctgccgtgg tcatttcgct ggctgcgcac 600

tttggagtgg ctgccctgtc catctacctc agcctgcagt tcggcttcaa gactatggcc 660

atctactact atggtcccgt ctttgtgttc ggatccatgc tcgtcattac tacctttctt 720

catcacaacg acgaagagac accttggtac gcagattcgg agtggaccta cgtcaaaggc 780

aacctgtcct ctgtcgaccg atcctacggt gccctcatcg acaacctttc tcacaacatc 840

ggaacccacc agattcatca cctctttccc atcattcctc actacaagct caagcgagct 900

accgaggcct tccatcaagc ctttcccgag ctggttcgaa agtccgacga acccatcatc 960

aaggcctttt tcagagtcgg ccgactctac gcaaactacg gtgtggtcga ctcggatgcc 1020

aagctgttca ctctcaagga ggccaaggct gtttccgaag ccgctaccaa gactaaggcc 1080

acctaa 1086

<210>4

<211>361

<212>PRT

<213>大豆疫霉

<220>

<221>其它特征

<223>合成的Δ17去饱和酶(密码子优化的)

<400>4

Met Ala Thr Lys Gln Pro Tyr Gln Phe Pro Thr Leu Thr Glu Ile Lys

1 5 10 15

Arg Ser Leu Pro Ser Glu Cys Phe Glu Ala Ser Val Pro Leu Ser Leu

20 25 30

Tyr Tyr Thr Val Arg Cys Leu Val Ile Ala Val Ser Leu Ala Phe Gly

35 40 45

Leu His His Ala Arg Ser Leu Pro Val Val Glu Gly Leu Trp Ala Leu

50 55 60

Asp Ala Ala Leu Cys Thr Gly Tyr Val Leu Leu Gln Gly Ile Val Phe

65 70 75 80

Trp Gly Phe Phe Thr Val Gly His Asp Ala Gly His Gly Ala Phe Ser

85 90 95

Arg Tyr His Leu Leu Asn Phe Val Ile Gly Thr Phe Ile His Ser Leu

100 105 110

Ile Leu Thr Pro Phe Glu Ser Trp Lys Leu Thr His Arg His His His

115 120 125

Lys Asn Thr Gly Asn Ile Asp Arg Asp Glu Ile Phe Tyr Pro Gln Arg

130 135 140

Lys Ala Asp Asp His Pro Leu Ser Arg Asn Leu Ile Leu Ala Leu Gly

145 150 155 160

Ala Ala Trp Phe Ala Tyr Leu Val Glu Gly Phe Pro Pro Arg Lys Val

165 170 175

Asn His Phe Asn Pro Phe Glu Pro Leu Phe Val Arg Gln Val Ser Ala

180 185 190

Val Val Ile Ser Leu Ala Ala His Phe Gly Val Ala Ala Leu Ser Ile

195 200 205

Tyr Leu Ser Leu Gln Phe Gly Phe Lys Thr Met Ala Ile Tyr Tyr Tyr

210 215 220

Gly Pro Val Phe Val Phe Gly Ser Met Leu Val Ile Thr Thr Phe Leu

225 230 235 240

His His Asn Asp Glu Glu Thr Pro Trp Tyr Ala Asp Ser Glu Trp Thr

245 250 255

Tyr Val Lys Gly Asn Leu Ser Ser Val Asp Arg Ser Tyr Gly Ala Leu

260 265 270

Ile Asp Asn Leu Ser His Asn Ile Gly Thr His Gln Ile His His Leu

275 280 285

Phe Pro Ile Ile Pro His Tyr Lys Leu Lys Arg Ala Thr Glu Ala Phe

290 295 300

His Gln Ala Phe Pro Glu Leu Val Arg Lys Ser Asp Glu Pro Ile Ile

305 310 315 320

Lys Ala Phe Phe Arg Val Gly Arg Leu Tyr Ala Asn Tyr Gly Val Val

325 330 335

Asp Ser Asp Ala Lys Leu Phe Thr Leu Lys Glu Ala Lys Ala Val Ser

340 345 350

Glu Ala Ala Thr Lys Thr Lys Ala Thr

355 360

<210>5

<211>1086

<212>DNA

<213>栎树猝死病菌

<400>5

atggcgacta agcagccgta ccagttcccg accctgacgg agatcaagcg gtcgctgccc 60

agcgagtgct ttgaggcctc ggtgccgctg tcgctctact acacggtgcg catcgtggcc 120

atcgccgtgg cgctggcgtt cggcctcaac tacgcgcgcg cgctgcccgt ggtcgagagc 180

ttgtgggcgc tggacgctgc gctctgctgc ggttacgtgc tgctgcaggg catcgtgttc 240

tggggcttct tcacggtggg ccatgacgcc ggccacggcg ccttctcgcg ttaccacctg 300

ctcaacttcg tggtgggcac cttcatccac tcgctcatcc tcacgccctt cgagtcgtgg 360

aagctcacgc accgccacca ccacaagaac acgggcaaca ttgaccgcga cgagatcttc 420

tacccgcagc gcaaggccga cgaccacccg ctgtcgcgca acctcgtgct ggcgctcggc 480

gccgcgtggt tcgcctacct ggtcgagggc ttcccgcccc gcaaggtcaa ccacttcaac 540

ccattcgagc cgctgtttgt gcgccaggtg gccgccgtcg tcatctcgct ctccgcgcac 600

ttcgccgtgt tggcgctgtc cgtgtatctg agcttccagt tcggtctcaa gaccatggcg 660

ctctactact acggccccgt cttcgtgttc ggcagcatgc ttgtgatcac caccttcctg 720

catcacaatg acgaggagac cccatggtac ggagactceg actggaecta cgtcaagggc 780

aacctgtcgt ccgtggaccg gtcctacggc gcgttcatcg acaacctgag ccacaacatc 840

ggcacgcacc agatccacca cctcttcccc atcatcccgc actacaagct caaccgcgct 900

acggcggcat tccaccaggc cttccccgag ctcgtgcgca agagcgacga gccgatcctc 960

aaggccttct ggcgcgtcgg ccgactgtac gccaactacg gcgtcgtgga cccggacgcc 1020

aagctcttca cgctcaagga ggccaaggcg gcgtccgagg cggcgaccaa gaccaaggcc 1080

acctaa 1086

<210>6

<211>361

<212>PRT

<213>栎树猝死病菌

<400>6

Met Ala Thr Lys Gln Pro Tyr Gln Phe Pro Thr Leu Thr Glu Ile Lys

1 5 10 15

Arg Ser Leu Pro Ser Glu Cys Phe Glu Ala Ser Val Pro Leu Ser Leu

20 25 30

Tyr Tyr Thr Val Arg Ile Val Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Phe Gly

35 40 45

Leu Asn Tyr Ala Arg Ala Leu Pro Val Val Glu Ser Leu Trp Ala Leu

50 55 60

Asp Ala Ala Leu Cys Cys Gly Tyr Val Leu Leu Gln Gly Ile Val Phe

65 70 75 80

Trp Gly Phe Phe Thr Val Gly His Asp Ala Gly His Gly Ala Phe Ser

85 90 95

Arg Tyr His Leu Leu Asn Phe Val Val Gly Thr Phe Ile His Ser Leu

100 105 110

Ile Leu Thr Pro Phe Glu Ser Trp Lys Leu Thr His Arg His His His

115 120 125

Lys Asn Thr Gly Asn Ile Asp Arg Asp Glu Ile Phe Tyr Pro Gln Arg

130 135 140

Lys Ala Asp Asp His Pro Leu Ser Arg Asn Leu Val Leu Ala Leu Gly

145 150 155 160

Ala Ala Trp Phe Ala Tyr Leu Val Glu Gly Phe Pro Pro Arg Lys Val

165 170 175

Asn His Phe Asn Pro Phe Glu Pro Leu Phe Val Arg Gln Val Ala Ala

180 185 190

Val Val Ile Ser Leu Ser Ala His Phe Ala Val Leu Ala Leu Ser Val

195 200 205

Tyr Leu Ser Phe Gln Phe Gly Leu Lys Thr Met Ala Leu Tyr Tyr Tyr

210 215 220

Gly Pro Val Phe Val Phe Gly Ser Met Leu Val Ile Thr Thr Phe Leu

225 230 235 240

His His Asn Asp Glu Glu Thr Pro Trp Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Thr

245 250 255

Tyr Val Lys Gly Asn Leu Ser Ser Val Asp Arg Ser Tyr Gly Ala Phe

260 265 270

Ile Asp Asn Leu Ser His Asn Ile Gly Thr His Gln Ile His His Leu

275 280 285

Phe Pro Ile Ile Pro His Tyr Lys Leu Asn Arg Ala Thr Ala Ala Phe

290 295 300

His Gln Ala Phe Pro Glu Leu Val Arg Lys Ser Asp Glu Pro Ile Leu

305 310 315 320

Lys Ala Phe Trp Arg Val Gly Arg Leu Tyr Ala Asn Tyr Gly Val Val

325 330 335

Asp Pro Asp Ala Lys Leu Phe Thr Leu Lys Glu Ala Lys Ala Ala Ser

340 345 350

Glu Ala Ala Thr Lys Thr Lys Ala Thr

355 360

<210>7

<211>1086

<212>DNA

<213>栎树猝死病菌

<220>

<221>其它特征

<223>合成的Δ17去饱和酶(密码子优化的)

<400>7

atggctacca agcagcccta ccagttccct actctgaccg agatcaagcg atctcttccc 60

tccgagtgct ttgaagcctc ggtccctctg tccttgtact acaccgtgcg aatcgtcgct 120

attgccgttg ctctggcctt cggactcaac tacgctcgag cccttcccgt ggtcgagtct 180

ctgtgggcac tcgacgctgc cctttgttgc ggttacgttc tgctccaagg cattgtcttc 240

tggggattct ttaccgtggg tcacgatgct ggacatggtg ccttctctcg ataccacctg 300

ctcaactttg tcgttggcac ctttatccac tccctcattc ttactccctt cgagtcgtgg 360

aagctcacac atcgacacca tcacaagaac accggaaaca tcgaccgaga cgaaatcttc 420

taccctcagc gaaaggccga cgatcatcct ctgtctcgaa acctcgtcct ggctctcggt 480

gccgcttggt ttgcctacct tgtcgagggc tttcctcccc gaaaggtcaa ccacttcaac 540

cccttcgaac ctctgtttgt gcgacaggtg gctgccgttg tcatttccct ctctgctcac 600

ttcgccgtcc tggcactgtc cgtgtatctg agctttcagt tcggtctcaa gacaatggct 660

ctgtactact atggacccgt cttcgtgttc ggctccatgc tcgtcattac tacctttctg 720

catcacaatg acgaggaaac tccttggtac ggagattccg actggaccta cgtcaagggc 780

aacttgtctt ccgtggaccg atcttacggt gccttcatcg acaacctctc gcacaacatt 840

ggcacacacc agatccacca tctgtttccc atcattcctc actacaagct caaccgagcc 900

accgctgcct tccaccaggc ctttcccgaa cttgtccgaa agagcgacga gcccattctc 960

aaggctttct ggagagttgg tcgactttac gccaactacg gagtcgtgga tcccgacgca 1020

aagctgttta ctctcaagga ggccaaagct gcctccgagg ctgccaccaa gaccaaggct 1080

acttaa 1086

<210>8

<211>1086

<212>DNA

<213>致病疫霉(GenBank登录号CAJ30870)

<400>8

atggcgacga aggaggcgta tgtgttcccc actctgacgg agatcaagcg gtcgctacct 60

aaagactgtt tcgaggcttc ggtgcctctg tcgctctact acaccgtgcg ttgtctggtg 120

atcgcggtgg ctctaacctt cggtctcaac tacgctcgcg ctctgcccga ggtcgagagc 180

ttctgggctc tggacgccgc actctgcacg ggctacatct tgctgcaggg catcgtgttc 240

tggggcttct tcacggtggg ccacgatgcc ggccacggcg ccttctcgcg ctaccacctg 300

cttaacttcg tggtgggcac tttcatgcac tcgctcatcc tcacgccctt cgagtcgtgg 360

aagctcacgc accgtcacca ccacaagaac acgggcaaca ttgaccgtga cgaggtcttc 420

tacccgcaac gcaaggccga cgaccacccg ctgtctcgca acctgattct ggcgctcggg 480

gcagcgtggc tcgcctattt ggtcgagggc ttccctcctc gtaaggtcaa ccacttcaac 540

ccgttcgagc ctctgttcgt gcgtcaggtg tcagctgtgg taatctctct tctcgcccac 600

ttcttcgtgg ccggactctc catctatctg agcctccagc tgggccttaa gacgatggca 660

atctactact atggacctgt ttttgtgttc ggcagcatgc tggtcattac caccttccta 720

caccacaatg atgaggagac cccatggtac gccgactcgg agtggacgta cgtcaagggc 780

aacctctcgt ccgtggaccg atcgtacggc gcgctcattg acaacctgag ccacaacatc 840

ggcacgcacc agatccacca ccttttccct atcattccgc actacaaact caagaaagcc 900

actgcggcct tccaccaggc tttccctgag ctcgtgcgca agagcgacga gccaattatc 960

aaggctttct tccgggttgg acgtctctac gcaaactacg gcgttgtgga ccaggaggcg 1020

aagctcttca cgctaaagga agccaaggcg gcgaccgagg cggcggccaa gaccaagtcc 1080

acgtaa 1086

<210>9

<211>361

<212>PRT

<213>致病疫霉

<300>

<302>用于以转基因生产不饱和ω3脂肪酸的方法

<308>CAJ30870

<309>2005-09-21

<310>WO 2005083053

<311>2005-02-23

<312>2005-09-09

<313>(1)..(361)

<400>9

Met Ala Thr Lys Glu Ala Tyr Val Phe Pro Thr Leu Thr Glu Ile Lys

1 5 10 15

Arg Ser Leu Pro Lys Asp Cys Phe Glu Ala Ser Val Pro Leu Ser Leu

20 25 30

Tyr Tyr Thr Val Arg Cys Leu Val Ile Ala Val Ala Leu Thr Phe Gly

35 40 45

Leu Asn Tyr Ala Arg Ala Leu Pro Glu Val Glu Ser Phe Trp Ala Leu

50 55 60

Asp Ala Ala Leu Cys Thr Gly Tyr Ile Leu Leu Gln Gly Ile Val Phe

65 70 75 80

Trp Gly Phe Phe Thr Val Gly His Asp Ala Gly His Gly Ala Phe Ser

85 90 95

Arg Tyr His Leu Leu Asn Phe Val Val Gly Thr Phe Met His Ser Leu

100 105 110

Ile Leu Thr Pro Phe Glu Ser Trp Lys Leu Thr His Arg His His His

115 120 125

Lys Asn Thr Gly Asn Ile Asp Arg Asp Glu Val Phe Tyr Pro Gln Arg

130 135 140

Lys Ala Asp Asp His Pro Leu Ser Arg Asn Leu Ile Leu Ala Leu Gly

145 150 155 160

Ala Ala Trp Leu Ala Tyr Leu Val Glu Gly Phe Pro Pro Arg Lys Val

165 170 175

Asn His Phe Asn Pro Phe Glu Pro Leu Phe Val Arg Gln Val Ser Ala

180 185 190

Val Val Ile Ser Leu Leu Ala His Phe Phe Val Ala Gly Leu Ser Ile

195 200 205

Tyr Leu Ser Leu Gln Leu Gly Leu Lys Thr Met Ala Ile Tyr Tyr Tyr

210 215 220

Gly Pro Val Phe Val Phe Gly Ser Met Leu Val Ile Thr Thr Phe Leu

225 230 235 240

His His Asn Asp Glu Glu Thr Pro Trp Tyr Ala Asp Ser Glu Trp Thr

245 250 255

Tyr Val Lys Gly Asn Leu Ser Ser Val Asp Arg Ser Tyr Gly Ala Leu

260 265 270

Ile Asp Asn Leu Ser His Asn Ile Gly Thr His Gln Ile His His Leu

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Phe Pro Ile Ile Pro His Tyr Lys Leu Lys Lys Ala Thr Ala Ala Phe

290 295 300

His Gln Ala Phe Pro Glu Leu Val Arg Lys Ser Asp Glu Pro Ile Ile

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Lys Ala Phe Phe Arg Val Gly Arg Leu Tyr Ala Asn Tyr Gly Val Val

325 330 335

Asp Gln Glu Ala Lys Leu Phe Thr Leu Lys Glu Ala Lys Ala Ala Thr

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Glu Ala Ala Ala Lys Thr Lys Ser Thr

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accccagccg gccgggagta tgtcggaggg gacatacgag atcgtcaagg gtttgtggcc 7740

aactggtaaa taaatgatgt cgacgtttaa acagtgtacg cagatctact atagaggaac 7800

atttaaattg ccccggagaa gacggccagg ccgcctagat gacaaattca acaactcaca 7860

gctgactttc tgccattgcc actagggggg ggccttttta tatggccaag ccaagctctc 7920

cacgtcggtt gggctgcacc caacaataaa tgggtagggt tgcaccaaca aagggatggg 7980

atggggggta gaagatacga ggataacggg gctcaatggc acaaataaga acgaatactg 8040

ccattaagac tcgtgatcca gcgactgaca ccattgcatc atctaagggc ctcaaaacta 8100

cctcggaact gctgcgctga tctggacacc acagaggttc cgagcacttt aggttgcacc 8160

aaatgtccca ccaggtgcag gcagaaaacg ctggaacagc gtgtacagtt tgtcttaaca 8220

aaaagtgagg gcgctgaggt cgagcagggt ggtgtgactt gttatagcct ttagagctgc 8280

gaaagcgcgt atggatttgg ctcatcaggc cagattgagg gtctgtggac acatgtcatg 8340

ttagtgtact tcaatcgccc cctggatata gccccgacaa taggccgtgg cctcattttt 8400

ttgccttccg cacatttcca ttgctcggta cccacacctt gcttctcctg cacttgccaa 8460

ccttaatact ggtttacatt gaccaacatc ttacaagcgg ggggcttgtc tagggtatat 8520

ataaacagtg gctctcccaa tcggttgcca gtctcttttt tcctttcttt ccccacagat 8580

tcgaaatcta aactacacat cacagaattc cgagccgtga gtatccacga caagatcagt 8640

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ctacacaaac taacccagct ctggtac 8727

<210>14

<211>12649

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>质粒pKUNF12T6E

<220>

<221>其它特征

<222>(2507)..(2507)

<223>n为a、c、g或t

<220>

<221>其它特征

<222>(2512)..(2515)

<223>n为a、c、g或t

<400>14

taaccctcac taaagggaac aaaagctgga gctccaccgc ggacacaata tctggtcaaa 60

tttcagtttc gttacataaa tcgttatgtc aaaggagtgt gggaggttaa gagaattatc 120

accggcaaac tatctgttaa ttgctaggta cctctagacg tccacccggg tcgcttggcg 180

gccgaagagg ccggaatctc gggccgcggt ggcggccgct tagttggtct tggacttctt 240

gggcttcttc aggtaggact ggacaaagaa gttgccgaac agagcgagca gggtgatcat 300

gtacacgccg agcagctgga ccagagcctg agggtagtcg caggggaaga ggtagtcgta 360

cagggactgc accagcatag ccatgaactg ggtcatctgc agagtggtga tgtagggctt 420

gatgggcttg acgaagccga agccctgaga ggaaaagaag tagtaggcgt acatgacggt 480

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aatagcccac cagatggcga agatggtggc atggtggtac acgtgcagga aggagacctg 600

gttgaacttc ttgcacagga tcatgatagc ggtgtccagg aactcgtagg ccttggagac 660

gtagaacacg tagacgattc gggacatgcc ctgagcgtgg gactcgttgc ccttctccat 720

gtcgttgccg aagaccttgt agccacccag gatagcctgt cggatggtct cgacgcacat 780

gtagagggac agtccgaaga ggaacaggtt gtggagcagc ttgatggtct tcagctcgaa 840

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ctcgaaggcg agcatggtgg agacgtccat catgggcaga ccgtcggtca gagcgtaggg 960

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gacagaggag ttggccatgg tgaatgattc ttatactcag aaggaaatgc ttaacgattt 1080

cgggtgtgag ttgacaagga gagagagaaa agaagaggaa aggtaattcg gggacggtgg 1140

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catcagtatc caaggcacca ttgcaaggat tcaaggcttt gaacccgtca tttgccattc 1560

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agctgcctga ctatcaggac attgatcaac ttcggaagaa acttttgtat gccattcgat 1680

cacatgctgg tttcgatttg tcttagagga acgcatatac agtaatcata gagaataaac 1740

gatattcatt tattaaagta gatagttgag gtagaagttg taaagagtga taaatagcgg 1800

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tgcggaagaa cagaacaccc ttaccagcac cctcggcacc agcgctgggc tcaacccact 1920

ggcacatacg cgcactgcgg tacatggcgc ggatgaagcc acgaggacca tcctggacat 1980

cagcccggta gtgcttgccc atgatgggct taatggcctc ggtggcctcg tccgcgttgt 2040

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cgtcagtaac aggcattgtg tgatgtgtag tttagatttc gaatctgtgg ggaaagaaag 3420

gaaaaaagag actggcaacc gattgggaga gccactgttt atatataccc tagacaagcc 3480

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gcaaggtgtg ggtaccgagc aatggaaatg tgcggaaggc aaaaaaatga ggccacggcc 3600

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cggacgcaaa atagactact gaaaattttt ttgctttgtg gttgggactt tagccaaggg 4560

tataaaagac caccgtcccc gaattacctt tcctcttctt ttctctctct ccttgtcaac 4620

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gctccctctg tgcgaacctt tacccgagcc gaggttctga acgctgaggc tctgaacgag 4740

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tacgttggag acattgacga gtccgaccga gacatcaaga acgatgactt tgccgctgag 4980

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gtccccgatg aggagctgac ccgaatgtgg tctcgattca tggtcctgaa ccagacctgg 5460

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ctctgatgaa ccccttccac gtgctcctga tcgtgctcgc ctacctggtc accgtgtttg 7620

tgggtatgca gatcatgaag aactttgaac gattcgaggt caagaccttc tccctcctgc 7680

acaacttctg tctggtctcc atctccgcct acatgtgcgg tggcatcctg tacgaggctt 7740

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tggctaagat gatctggctc ttctacttct ccaagatcat ggagtttgtc gacaccatga 7860

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<211>819

<212>DNA

<213>金黄色破囊壶菌

<220>

<221>其它特征

<223>合成的延长酶(密码子优化的)

<400>15

atggccaact cctctgtctg ggacgacgtg gtcggacgag tcgagaccgg tgtcgaccag 60

tggatggacg gagctaagcc ctacgctctg accgacggtc tgcccatgat ggacgtctcc 120

accatgctcg ccttcgaggt cggctacatg gccatgctgc tcttcggcat tcccatcatg 180

aagcagatgg agaagccctt cgagctgaag accatcaagc tgctccacaa cctgttcctc 240

ttcggactgt ccctctacat gtgcgtcgag accatccgac aggctatcct gggtggctac 300

aaggtcttcg gcaacgacat ggagaagggc aacgagtccc acgctcaggg catgtcccga 360

atcgtctacg tgttctacgt ctccaaggcc tacgagttcc tggacaccgc tatcatgatc 420

ctgtgcaaga agttcaacca ggtctccttc ctgcacgtgt accaccatgc caccatcttc 480

gccatctggt gggctattgc caagtacgct cctggtggcg acgcctactt ctccgtcatc 540

ctcaactcct tcgtccacac cgtcatgtac gcctactact tcttttcctc tcagggcttc 600

ggcttcgtca agcccatcaa gccctacatc accactctgc agatgaccca gttcatggct 660

atgctggtgc agtccctgta cgactacctc ttcccctgcg actaccctca ggctctggtc 720

cagctgctcg gcgtgtacat gatcaccctg ctcgctctgt tcggcaactt ctttgtccag 780

tcctacctga agaagcccaa gaagtccaag accaactaa 819

<210>16

<211>272

<212>PRT

<213>金黄色破囊壶菌

<400>16

Met Ala Asn Ser Ser Val Trp Asp Asp Val Val Gly Arg Val Glu Thr

1 5 10 15

Gly Val Asp Gln Trp Met Asp Gly Ala Lys Pro Tyr Ala Leu Thr Asp

20 25 30

Gly Leu Pro Met Met Asp Val Ser Thr Met Leu Ala Phe Glu Val Gly

35 40 45

Tyr Met Ala Met Leu Leu Phe Gly Ile Pro Ile Met Lys Gln Met Glu

50 55 60

Lys Pro Phe Glu Leu Lys Thr Ile Lys Leu Leu His Asn Leu Phe Leu

65 70 75 80

Phe Gly Leu Ser Leu Tyr Met Cys Val Glu Thr Ile Arg Gln Ala Ile

85 90 95

Leu Gly Gly Tyr Lys Val Phe Gly Asn Asp Met Glu Lys Gly Asn Glu

100 105 110

Ser His Ala Gln Gly Met Ser Arg Ile Val Tyr Val Phe Tyr Val Ser

115 120 125

Lys Ala Tyr Glu Phe Leu Asp Thr Ala Ile Met Ile Leu Cys Lys Lys

130 135 140

Phe Asn Gln Val Ser Phe Leu His Val Tyr His His Ala Thr Ile Phe

145 150 155 160

Ala Ile Trp Trp Ala Ile Ala Lys Tyr Ala Pro Gly Gly Asp Ala Tyr

165 170 175

Phe Ser Val Ile Leu Asn Ser Phe Val His Thr Val Met Tyr Ala Tyr

180 185 190

Tyr Phe Phe Ser Ser Gln Gly Phe Gly Phe Val Lys Pro Ile Lys Pro

195 200 205

Tyr Ile Thr Thr Leu Gln Met Thr Gln Phe Met Ala Met Leu Val Gln

210 215 220

Ser Leu Tyr Asp Tyr Leu Phe Pro Cys Asp Tyr Pro Gln Ala Leu Val

225 230 235 240

Gln Leu Leu Gly Val Tyr Met Ile Thr Leu Leu Ala Leu Phe Gly Asn

245 250 255

Phe Phe Val Gln Ser Tyr Leu Lys Lys Pro Lys Lys Ser Lys Thr Asn

260 265 270

<210>17

<211>13034

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>质粒pDMW271

<400>17

cgatgcagaa ttcaggagag accgggttgg cggcgtattt gtgtcccaaa aaacagcccc 60

aattgcccca attgacccca aattgaccca gtagcgggcc caaccccggc gagagccccc 120

ttcaccccac atatcaaacc tcccccggtt cccacacttg ccgttaaggg cgtagggtac 180

tgcagtctgg aatctacgct tgttcagact ttgtactagt ttctttgtct ggccatccgg 240

gtaacccatg ccggacgcaa aatagactac tgaaaatttt tttgctttgt ggttgggact 300

ttagccaagg gtataaaaga ccaccgtccc cgaattacct ttcctcttct tttctctctc 360

tccttgtcaa ctcacacccg aaatcgttaa gcatttcctt ctgagtataa gaatcattca 420

ccatggatgg ctcccgaccc tgtcgctgcc gagaccgctg cccagggtcc cactccccga 480

tacttcacct gggacgaggt cgcccagcga tccggttgcg aggaacgatg gctggtcatc 540

gaccgaaagg tgtacaacat ctctgagttc acccgacgac atcccggtgg ctcccgagtg 600

atctcgcact acgctggaca ggacgccact gaccccttcg ttgcctttca cattaacaag 660

ggcctggtta agaagtacat gaactccctg ctcattggag agctgtctcc cgaacagcct 720

tcgtttgagc ctaccaagaa caaggagctg accgacgagt ttcgagagct ccgagccacc 780

gttgagcgaa tgggactgat gaaggccaac catgtcttct ttctgctcta cctgctccac 840

attcttctcc ttgacggagc tgcctggctt accctgtggg tcttcggcac ttcctttctg 900

ccctttcttc tctgcgccgt cctgctctct gccgtgcagg ctcaggctgg ttggcttcag 960

catgactttg gtcacctttc cgtgttctct acctccaagt ggaaccacct gctccatcac 1020

ttcgtgatcg gccacctcaa gggtgctcct gcctcgtggt ggaaccacat gcatttccag 1080

caccatgcca agcccaactg ttttcgaaag gatcccgaca tcaacatgca ccccttcttt 1140

ttcgctcttg gcaagatcct gtccgtcgag ctcggaaagc agaagaagaa gtacatgccc 1200

tacaaccacc agcacaagta cttcttcctg attggacctc ccgctctcct gcctctttac 1260

tttcagtggt acatctttta ctttgttatt cagcgaaaga agtgggttga tcttgcctgg 1320

atgatcacct tctacgtccg attcttcctg acctacgtcc ctctccttgg actgaaggcc 1380

tttctcggtc tgttctttat cgtccgattc ctggagtcca actggttcgt gtgggtgacc 1440

cagatgaacc acattcccat gcacattgac catgatcgaa acatggactg ggtgtcgact 1500

cagctgcagg ccacctgcaa cgttcacaag tctgctttca acgactggtt ttccggtcac 1560

ctcaactttc agattgagca ccatctgttt cccaccatgc ctcgacacaa ctaccacaag 1620

gttgctcccc tggtccagtc gctctgtgcc aagcatggca tcgagtacca gtccaagccc 1680

ctgctctctg ccttcgctga catcattcac tcgctgaagg aatctggcca gctctggctc 1740

gatgcctacc tgcaccagta agcggccgca ttgatgattg gaaacacaca catgggttat 1800

atctaggtga gagttagttg gacagttata tattaaatca gctatgccaa cggtaacttc 1860

attcatgtca acgaggaacc agtgactgca agtaatatag aatttgacca ccttgccatt 1920

ctcttgcact cctttactat atctcattta tttcttatat acaaatcact tcttcttccc 1980

agcatcgagc tcggaaacct catgagcaat aacatcgtgg atctcgtcaa tagagggctt 2040

tttggactcc ttgctgttgg ccaccttgtc cttgctgtct ggctcattct gtttcaacgc 2100

cttttaatta acggagtagg tctcggtgtc ggaagcgacg ccagatccgt catcctcctt 2160

tcgctctcca aagtagatac ctccgacgag ctctcggaca atgatgaagt cggtgccctc 2220

aacgtttcgg atgggggaga gatcggcgag cttgggcgac agcagctggc agggtcgcag 2280

gttggcgtac aggttcaggt cctttcgcag cttgaggaga ccctgctcgg gtcgcacgtc 2340

ggttcgtccg tcgggagtgg tccatacggt gttggcagcg cctccgacag caccgagcat 2400

aatagagtca gcctttcggc agatgtcgag agtagcgtcg gtgatgggct cgccctcctt 2460

ctcaatggca gctcctccaa tgagtcggtc ctcaaacaca aactcggtgc cggaggcctc 2520

agcaacagac ttgagcacct tgacggcctc ggcaatcacc tcggggccac agaagtcgcc 2580

gccgagaaga acaatcttct tggagtcagt cttggtcttc ttagtttcgg gttccattgt 2640

ggatgtgtgt ggttgtatgt gtgatgtggt gtgtggagtg aaaatctgtg gctggcaaac 2700

gctcttgtat atatacgcac ttttgcccgt gctatgtgga agactaaacc tccgaagatt 2760

gtgactcagg tagtgcggta tcggctaggg acccaaacct tgtcgatgcc gatagcatgc 2820

gacgtcgggc ccaattcgcc ctatagtgag tcgtattaca attcactggc cgtcgtttta 2880

caacgtcgtg actgggaaaa ccctggcgtt acccaactta atcgccttgc agcacatccc 2940

cctttcgcca gctggcgtaa tagcgaagag gcccgcaccg atcgcccttc ccaacagttg 3000

cgcagcctga atggcgaatg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg 3060

tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt 3120

tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc 3180

tccctttagg gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg 3240

gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg 3300

agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct 3360

cggtctattc ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg 3420

agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgctt acaatttcct 3480

gatgcggtat tttctcctta cgcatctgtg cggtatttca caccgcatca ggtggcactt 3540

ttcggggaaa tgtgcgcgga acccctattt gtttattttt ctaaatacat tcaaatatgt 3600

atccgctcat gagacaataa ccctgataaa tgcttcaata atattgaaaa aggaagagta 3660

tgagtattca acatttccgt gtcgccctta ttcccttttt tgcggcattt tgccttcctg 3720

tttttgctca cccagaaacg ctggtgaaag taaaagatgc tgaagatcag ttgggtgcac 3780

gagtgggtta catcgaactg gatctcaaca gcggtaagat ccttgagagt tttcgccccg 3840

aagaacgttt tccaatgatg agcactttta aagttctgct atgtggcgcg gtattatccc 3900

gtattgacgc cgggcaagag caactcggtc gccgcataca ctattctcag aatgacttgg 3960

ttgagtactc accagtcaca gaaaagcatc ttacggatgg catgacagta agagaattat 4020

gcagtgctgc cataaccatg agtgataaca ctgcggccaa cttacttctg acaacgatcg 4080

gaggaccgaa ggagctaacc gcttttttgc acaacatggg ggatcatgta actcgccttg 4140

atcgttggga accggagctg aatgaagcca taccaaacga cgagcgtgac accacgatgc 4200

ctgtagcaat ggcaacaacg ttgcgcaaac tattaactgg cgaactactt actctagctt 4260

cccggcaaca attaatagac tggatggagg cggataaagt tgcaggacca cttctgcgct 4320

cggcccttcc ggctggctgg tttattgctg ataaatctgg agccggtgag cgtgggtctc 4380

gcggtatcat tgcagcactg gggccagatg gtaagccctc ccgtatcgta gttatctaca 4440

cgacggggag tcaggcaact atggatgaac gaaatagaca gatcgctgag ataggtgcct 4500

cactgattaa gcattggtaa ctgtcagacc aagtttactc atatatactt tagattgatt 4560

taaaacttca tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat aatctcatga 4620

ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca 4680

aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac 4740

caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg 4800

taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgttct tctagtgtag ccgtagttag 4860

gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac 4920

cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt 4980

taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg 5040

agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc 5100

ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc 5160

gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc 5220

acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa 5280

acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt gctcacatgt 5340

tctttcctgc gttatcccct gattctgtgg ataaccgtat taccgccttt gagtgagctg 5400

ataccgctcg ccgcagccga acgaccgagc gcagcgagtc agtgagcgag gaagcggaag 5460

agcgcccaat acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa tgcagctggc 5520

gcgcccactg agctcgtcta acggacttga tatacaacca attaaaacaa atgaaaagaa 5580

atacagttct ttgtatcatt tgtaacaatt accctgtaca aactaaggta ttgaaatccc 5640

acaatattcc caaagtccac ccctttccaa attgtcatgc ctacaactca tataccaagc 5700

actaacctac caaacaccac taaaacccca caaaatatat cttaccgaat atacagtaac 5760

aagctaccac cacactcgtt gggtgcagtc gccagcttaa agatatctat ccacatcagc 5820

cacaactccc ttcctttaat aaaccgacta cacccttggc tattgaggtt atgagtgaat 5880

atactgtaga caagacactt tcaagaagac tgtttccaaa acgtaccact gtcctccact 5940

acaaacacac ccaatctgct tcttctagtc aaggttgcta caccggtaaa ttataaatca 6000

tcatttcatt agcagggcag ggcccttttt atagagtctt atacactagc ggaccctgcc 6060

ggtagaccaa cccgcaggcg cgtcagtttg ctccttccat caatgcgtcg tagaaacgac 6120

ttactccttc ttgagcagct ccttgacctt gttggcaaca agtctccgac ctcggaggtg 6180

gaggaagagc ctccgatatc ggcggtagtg ataccagcct cgacggactc cttgacggca 6240

gcctcaacag cgtcaccggc gggcttcatg ttaagagaga acttgagcat catggcggca 6300

gacagaatgg tggcgtacgc aactaacatg aatgaatacg atatacatca aagactatga 6360

tacgcagtat tgcacactgt acgagtaaga gcactagcca ctgcactcaa gtgaaaccgt 6420

tgcccgggta cgagtatgag tatgtacagt atgtttagta ttgtacttgg acagtgcttg 6480

tatcgtacat tctcaagtgt caaacataaa tatccgttgc tatatcctcg caccaccacg 6540

tagctcgcta tatccctgtg ttgaatccat ccatcttgga ttgccaattg tgcacacaga 6600

accgggcact cacttcccca tccacacttg cggccgctta gctgcctact cttccttggg 6660

acggagtcca agaacacgca agtgctccaa atgtgaagca aatgcttgcc aaaacgtatc 6720

cttgacaagg tatggaacct tgtactcgct gcaggtgttc ttgatgatgg ccagaatatc 6780

gggataatgg tgctgcgaca cgttggggaa cagatggtgc acagcctggt agttcaagct 6840

gccagtgatg ctggtccaga ggtgcgaatc gtgtgcgtaa tcctgcgtag tctcgacctg 6900

catagctgcc cagtcctttt ggatgatccc gttctcgtca ggcaacggcc actgaacttc 6960

ctcaacaacg tggttcgcct ggaaggtcag cgccagccag taagacgaca ccatgtccgc 7020

gaccgtgaac aagagcagca ccttgcccag gggcagatac tgcaggggaa caatcaggcg 7080

ataccagaca aagaaagcct tgccgcccca gaacatcaca gtgtgccatg tcgagatggg 7140

attgacacga atagcgtcat tggtcttgac aaagtacaaa atgttgatgt cctgaatgcg 7200

caccttgaac gccagcagtc cgtacaggaa aggaacaaac atgtgctggt tgatgtggtt 7260

gacaaaccac ttttggttgg gcttgatacg acgaacatcg ggctcagacg tcgacacgtc 7320

gggatctgct ccagcaatgt tggtgtaggg gtgatggccg agcatatgtt ggtacatcca 7380

caccaggtac gatgctccgt tgaaaaagtc gtgcgtggct cccagaatct tccagacagt 7440

ggggttgtgg gtcactgaaa agtgagacgc atcatgaaga gggttgagtc cgacttgtgc 7500

gcacgcaaat cccatgatga ttgcaaacac cacctgaagc catgtgcgtt cgacaacgaa 7560

aggcacaaag agctgcgcgt agtaggaagc gatcaaggat ccaaagataa gagcgtatcg 7620

tccccagatc tctggtctat tcttgggatc aatgttccga tccgtaaagt agccctcgac 7680

tctcgtcttg atggttttgt ggaacaccgt tggctccggg aagatgggca gctcattcga 7740

gaccagtgta ccgacatagt acttcttcat aatggcatct gcagccccaa acgcgtgata 7800

catctcaaag accggagtaa catctcggcc agctccgagc aggagagtgt ccactccacc 7860

aggatggcgg ctcaagaact ttgtgacatc gtacaccctg ccgcggatgg ccaagagtag 7920

gtcgtccttg gtgttatggg ccgccagctc ttcccaggtg aaggtttttc cttggtccgt 7980

tcccatggag agctgggtta gtttgtgtag agagtgtgtg ttgctagcga ctttcggatt 8040

gtgtcattac acaaaacgcg tcgtctcgac actgatcttg tcgtggatac tcacggctcg 8100

gacatcgtcg ccgacgatga caccggactt tcgcttaagg acgtcagtaa caggcattgt 8160

gtgatgtgta gtttagattt cgaatctgtg gggaaagaaa ggaaaaaaga gactggcaac 8220

cgattgggag agccactgtt tatatatacc ctagacaagc cccccgcttg taagatgttg 8280

gtcaatgtaa accagtatta aggttggcaa gtgcaggaga agcaaggtgt gggtaccgag 8340

caatggaaat gtgcggaagg caaaaaaatg aggccacggc ctattgtcgg ggctatatcc 8400

agggggcgat tgaagtacac taacatgaca tgtgtccaca gaccctcaat ctggcctgat 8460

gagccaaatc catacgcgct ttcgcagctc taaaggctat aacaagtcac accaccctgc 8520

tcgacctcag cgccctcact ttttgttaag acaaactgta cacgctgttc cagcgttttc 8580

tgcctgcacc tggtgggaca tttggtgcaa cctaaagtgc tcggaacctc tgtggtgtcc 8640

agatcagcgc agcagttccg aggtagtttt gaggccctta gatgatgcaa tggtgtcagt 8700

cgctggatca cgagtcttaa tggcagtatt cgttcttatt tgtgccattg agccccgtta 8760

tcctcgtatc ttctaccccc catcccatcc ctttgttggt gcaaccctac ccatttattg 8820

ttgggtgcag cccaaccgac gtggagagct tggcttggcc atataaaaag gcccccccct 8880

agtggcaatg gcagaaagtc agctgtgagt tgttgaattt gtcatctagg cggcctggcc 8940

gtcttctccg gggcaattta aattccttca cttcaagttc attcttcatc tgcttctgtt 9000

ttactttgac aggcaaatga agacatggta cgacttgatg gaggccaaga acgccatttc 9060

accccgagac accgaagtgc ctgaaatcct ggctgccccc attgataaca tcggaaacta 9120

cggtattccg gaaagtgtat atagaacctt tccccagctt gtgtctgtgg atatggatgg 9180

tgtaatcccc tttgagtact cgtcttggct tctctccgag cagtatgagg ctctctaatc 9240

tagcgcattt aatatctcaa tgtatttata tatttatctt ctcatgcggc cgcttagctg 9300

cctactcttc cttgggacgg agtccaagaa cacgcaagtg ctccaaatgt gaagcaaatg 9360

cttgccaaaa cgtatccttg acaaggtatg gaaccttgta ctcgctgcag gtgttcttga 9420

tgatggccag aatatcggga taatggtgct gcgacacgtt ggggaacaga tggtgcacag 9480

cctggtagtt caagctgcca gtgatgctgg tccagaggtg cgaatcgtgt gcgtaatcct 9540

gcgtagtctc gacctgcata gctgcccagt ccttttggat gatcccgttc tcgtcaggca 9600

acggccactg aacttcctca acaacgtggt tcgcctggaa ggtcagcgcc agccagtaag 9660

acgacaccat gtccgcgacc gtgaacaaga gcagcacctt gcccaggggc agatactgca 9720

ggggaacaat caggcgatac cagacaaaga aagccttgcc gccccagaac atcacagtgt 9780

gccatgtcga gatgggattg acacgaatag cgtcattggt cttgacaaag tacaaaatgt 9840

tgatgtcctg aatgcgcacc ttgaacgcca gcagtccgta caggaaagga acaaacatgt 9900

gctggttgat gtggttgaca aaccactttt ggttgggctt gatacgacga acatcgggct 9960

cagacgtcga cacgtcggga tctgctccag caatgttggt gtaggggtga tggccgagca 10020

tatgttggta catccacacc aggtacgatg ctccgttgaa aaagtcgtgc gtggctccca 10080

gaatcttcca gacagtgggg ttgtgggtca ctgaaaagtg agacgcatca tgaagagggt 10140

tgagtccgac ttgtgcgcac gcaaatccca tgatgattgc aaacaccacc tgaagccatg 10200

tgcgttcgac aacgaaaggc acaaagagct gcgcgtagta ggaagcgatc aaggatccaa 10260

agataagagc gtatcgtccc cagatctctg gtctattctt gggatcaatg ttccgatccg 10320

taaagtagcc ctcgactctc gtcttgatgg ttttgtggaa caccgttggc tccgggaaga 10380

tgggcagctc attcgagacc agtgtaccga catagtactt cttcataatg gcatctgcag 10440

ccccaaacgc gtgatacatc tcaaagaccg gagtaacatc tcggccagct ccgagcagga 10500

gagtgtccac tccaccagga tggcggctca agaactttgt gacatcgtac accctgccgc 10560

ggatggccaa gagtaggtcg tccttggtgt tatgggccgc cagctcttcc caggtgaagg 10620

tttttccttg gtccgttccc atggtgaatg attcttatac tcagaaggaa atgcttaacg 10680

atttcgggtg tgagttgaca aggagagaga gaaaagaaga ggaaaggtaa ttcggggacg 10740

gtggtctttt atacccttgg ctaaagtccc aaccacaaag caaaaaaatt ttcagtagtc 10800

tattttgcgt ccggcatggg ttacccggat ggccagacaa agaaactagt acaaagtctg 10860

aacaagcgta gattccagac tgcagtaccc tacgccctta acggcaagtg tgggaaccgg 10920

gggaggtttg atatgtgggg tgaagggggc tctcgccggg gttgggcccg ctactgggtc 10980

aatttggggt caattggggc aattggggct gttttttggg acacaaatac gccgccaacc 11040

cggtctctcc tgatcgatgg gctgcaggaa ttctacaata cgtgagtcag aagggctgac 11100

ggtggtggtt cccaaggaaa aggtcgacga gtatctgtct gactcgtcat tgccgccttt 11160

ggagtacgac tccaactatg agtgtgcttg gatcactttg acgatacatt cttcgttgga 11220

ggctgtgggt ctgacagctg cgttttcggc gcggttggcc gacaacaata tcagctgcaa 11280

cgtcattgct ggctttcatc atgatcacat ttttgtcggc aaaggcgacg cccagagagc 11340

cattgacgtt ctttctaatt tggaccgata gccgtatagt ccagtctatc tataagttca 11400

actaactcgt aactattacc ataacatata cttcactgcc ccagataagg ttccgataaa 11460

aagttctgca gactaaattt atttcagtct cctcttcacc accaaaatgc cctcctacga 11520

agctcgagct aacgtccaca agtccgcctt tgccgctcga gtgctcaagc tcgtggcagc 11580

caagaaaacc aacctgtgtg cttctctgga tgttaccacc accaaggagc tcattgagct 11640

tgccgataag gtcggacctt atgtgtgcat gatcaaaacc catatcgaca tcattgacga 11700

cttcacctac gccggcactg tgctccccct caaggaactt gctcttaagc acggtttctt 11760

cctgttcgag gacagaaagt tcgcagatat tggcaacact gtcaagcacc agtaccggtg 11820

tcaccgaatc gccgagtggt ccgatatcac caacgcccac ggtgtacccg gaaccggaat 11880

cattgctggc ctgcgagctg gtgccgagga aactgtctct gaacagaaga aggaggacgt 11940

ctctgactac gagaactccc agtacaagga gttcctagtc ccctctccca acgagaagct 12000

ggccagaggt ctgctcatgc tggccgagct gtcttgcaag ggctctctgg ccactggcga 12060

gtactccaag cagaccattg agcttgcccg atccgacccc gagtttgtgg ttggcttcat 12120

tgcccagaac cgacctaagg gcgactctga ggactggctt attctgaccc ccggggtggg 12180

tcttgacgac aagggagacg ctctcggaca gcagtaccga actgttgagg atgtcatgtc 12240

taccggaacg gatatcataa ttgtcggccg aggtctgtac ggccagaacc gagatcctat 12300

tgaggaggcc aagcgatacc agaaggctgg ctgggaggct taccagaaga ttaactgtta 12360

gaggttagac tatggatatg taatttaact gtgtatatag agagcgtgca agtatggagc 12420

gcttgttcag cttgtatgat ggtcagacga cctgtctgat cgagtatgta tgatactgca 12480

caacctgtgt atccgcatga tctgtccaat ggggcatgtt gttgtgtttc tcgatacgga 12540

gatgctgggt acagtgctaa tacgttgaac tacttatact tatatgaggc tcgaagaaag 12600

ctgacttgtg tatgacttat tctcaactac atccccagtc acaataccac cactgcacta 12660

ccactacacc agatctgcgt acactgttta aacggtaggt tagtgcttgg tatatgagtt 12720

gtaggcatga caatttggaa aggggtggac tttgggaata ttgtgggatt tcaatacctt 12780

agtttgtaca gggtaattgt tacaaatgat acaaagaact gtatttcttt tcatttgttt 12840

taattggttg tatatcaagt ccgttagacg agctcagtgc cttggctttt ggcactgtat 12900

ttcattttta gaggtacact acattcagtg aggtatggta aggttgaggg cataatgaag 12960

gcaccttgta ctgacagtca cagacctctc accgagaatt ttatgagata tactcgggtt 13020

cattttaggc tcat 13034

<210>18

<211>1335

<212>DNA

<213>人

<220>

<221>其它特征

<223>合成的Δ-5去饱和酶(密码子优化的)

<400>18

atggctcccg accctgtcgc tgccgagacc gctgcccagg gtcccactcc ccgatacttc 60

acctgggacg aggtcgccca gcgatccggt tgcgaggaac gatggctggt catcgaccga 120

aaggtgtaca acatctctga gttcacccga cgacatcccg gtggctcccg agtgatctcg 180

cactacgctg gacaggacgc cactgacccc ttcgttgcct ttcacattaa caagggcctg 240

gttaagaagt acatgaactc cctgctcatt ggagagctgt ctcccgaaca gccttcgttt 300

gagcctacca agaacaagga gctgaccgac gagtttcgag agctccgagc caccgttgag 360

cgaatgggac tgatgaaggc caaccatgtc ttctttctgc tctacctgct ccacattctt 420

ctccttgacg gagctgcctg gcttaccctg tgggtcttcg gcacttcctt tctgcccttt 480

cttctctgcg ccgtcctgct ctctgccgtg caggctcagg ctggttggct tcagcatgac 540

tttggtcacc tttccgtgtt ctctacctcc aagtggaacc acctgctcca tcacttcgtg 600

atcggccacc tcaagggtgc tcctgcctcg tggtggaacc acatgcattt ccagcaccat 660

gccaagccca actgttttcg aaaggatccc gacatcaaca tgcacccctt ctttttcgct 720

cttggcaaga tcctgtccgt cgagctcgga aagcagaaga agaagtacat gccctacaac 780

caccagcaca agtacttctt cctgattgga cctcccgctc tcctgcctct ttactttcag 840

tggtacatct tttactttgt tattcagcga aagaagtggg ttgatcttgc ctggatgatc 900

accttctacg tccgattctt cctgacctac gtccctctcc ttggactgaa ggcctttctc 960

ggtctgttct ttatcgtccg attcctggag tccaactggt tcgtgtgggt gacccagatg 1020

aaccacattc ccatgcacat tgaccatgat cgaaacatgg actgggtgtc gactcagctg 1080

caggccacct gcaacgttca caagtctgct ttcaacgact ggttttccgg tcacctcaac 1140

tttcagattg agcaccatct gtttcccacc atgcctcgac acaactacca caaggttgct 1200

cccctggtcc agtcgctctg tgccaagcat ggcatcgagt accagtccaa gcccctgctc 1260

tctgccttcg ctgacatcat tcactcgctg aaggaatctg gccagctctg gctcgatgcc 1320

tacctgcacc agtaa 1335

<210>19

<211>444

<212>PRT

<213>人

<400>19

Met Ala Pro Asp Pro Val Ala Ala Glu Thr Ala Ala Gln Gly Pro Thr

1 5 10 15

Pro Arg Tyr Phe Thr Trp Asp Glu Val Ala Gln Arg Ser Gly Cys Glu

20 25 30

Glu Arg Trp Leu Val Ile Asp Arg Lys Val Tyr Asn Ile Ser Glu Phe

35 40 45

Thr Arg Arg His Pro Gly Gly Ser Arg Val Ile Ser His Tyr Ala Gly

50 55 60

Gln Asp Ala Thr Asp Pro Phe Val Ala Phe His Ile Asn Lys Gly Leu

65 70 75 80

Val Lys Lys Tyr Met Asn Ser Leu Leu Ile Gly Glu Leu Ser Pro Glu

85 90 95

Gln Pro Ser Phe Glu Pro Thr Lys Asn Lys Glu Leu Thr Asp Glu Phe

100 105 110

Arg Glu Leu Arg Ala Thr Val Glu Arg Met Gly Leu Met Lys Ala Asn

115 120 125

His Val Phe Phe Leu Leu Tyr Leu Leu His Ile Leu Leu Leu Asp Gly

130 135 140

Ala Ala Trp Leu Thr Leu Trp Val Phe Gly Thr Ser Phe Leu Pro Phe

145 150 155 160

Leu Leu Cys Ala Val Leu Leu Ser Ala Val Gln Ala Gln Ala Gly Trp

165 170 175

Leu Gln His Asp Phe Gly His Leu Ser Val Phe Ser Thr Ser Lys Trp

180 185 190

Asn His Leu Leu His His Phe Val Ile Gly His Leu Lys Gly Ala Pro

195 200 205

Ala Ser Trp Trp Asn His Met His Phe Gln His His Ala Lys Pro Asn

210 215 220

Cys Phe Arg Lys Asp Pro Asp Ile Asn Met His Pro Phe Phe Phe Ala

225 230 235 240

Leu Gly Lys Ile Leu Ser Val Glu Leu Gly Lys Gln Lys Lys Lys Tyr

245 250 255

Met Pro Tyr Asn His Gln His Lys Tyr Phe Phe Leu Ile Gly Pro Pro

260 265 270

Ala Leu Leu Pro Leu Tyr Phe Gln Trp Tyr Ile Phe Tyr Phe Val Ile

275 280 285

Gln Arg Lys Lys Trp Val Asp Leu Ala Trp Met Ile Thr Phe Tyr Val

290 295 300

Arg Phe Phe Leu Thr Tyr Val Pro Leu Leu Gly Leu Lys Ala Phe Leu

305 310 315 320

Gly Leu Phe Phe Ile Val Arg Phe Leu Glu Ser Asn Trp Phe Val Trp

325 330 335

Val Thr Gln Met Asn His Ile Pro Met His Ile Asp His Asp Arg Asn

340 345 350

Met Asp Trp Val Ser Thr Gln Leu Gln Ala Thr Cys Asn Val His Lys

355 360 365

Ser Ala Phe Asn Asp Trp Phe Ser Gly His Leu Asn Phe Gln Ile Glu

370 375 380

His His Leu Phe Pro Thr Met Pro Arg His Asn Tyr His Lys Val Ala

385 390 395 400

Pro Leu Val Gln Ser Leu Cys Ala Lys His Gly Ile Glu Tyr Gln Ser

405 410 415

Lys Pro Leu Leu Ser Ala Phe Ala Asp Ile Ile His Ser Leu Lys Glu

420 425 430

Ser Gly Gln Leu Trp Leu Asp Ala Tyr Leu His Gln

435 440

<210>20

<211>8867

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>质粒pZP3-P7U

<400>20

aattcaggag agaccgggtt ggcggcgtat ttgtgtccca aaaaacagcc ccaattgccc 60

caattgaccc caaattgacc cagtagcggg cccaaccccg gcgagagccc ccttcacccc 120

acatatcaaa cctcccccgg ttcccacact tgccgttaag ggcgtagggt actgcagtct 180

ggaatctacg cttgttcaga ctttgtacta gtttctttgt ctggccatcc gggtaaccca 240

tgccggacgc aaaatagact actgaaaatt tttttgcttt gtggttggga ctttagccaa 300

gggtataaaa gaccaccgtc cccgaattac ctttcctctt cttttctctc tctccttgtc 360

aactcacacc cgaaatcgtt aagcatttcc ttctgagtat aagaatcatt caccatggac 420

ttcctggagg cagaagaact tgttatggaa aagctcaaga gagagaagcc aagatactat 480

caagacatgt gtcgcaactt aattaagatg acgacatttg cgagctggac gaggaataga 540

tggagcgtgt gttctgagtc gatgttttct atggagttgt gagtgttagt agacatgatg 600

ggtttatata tgatgaatga atagatgtga ttttgatttg cacgatggaa ttgagaactt 660

tgtaaacgta catgggaatg tatgaatgtg ggggttttgt gactggataa ctgacggtca 720

gtggacgccg ttgttcaaat atccaagaga tgcgagaaac tttgggtcaa gtgaacatgt 780

cctctctgtt caagtaaacc atcaactatg ggtagtatat ttagtaagga caagagttga 840

gattctttgg agtcctagaa acgtattttc gcgttccaag atcaaattag tagagtaata 900

cgggcacggg aatccattca tagtctcaat tttcccatag gtgtgctaca aggtgttgag 960

atgtggtaca gtaccaccat gattcgaggt aaagagccca gaagtcattg atgaggtcaa 1020

gaaatacaca gatctacagc tcaatacaat gaatatcttc tttcatattc ttcaggtgac 1080

accaagggtg tctattttcc ccagaaatgc gtgaaaaggc gcgtgtgtag cgtggagtat 1140

gggttcggtt ggcgtatcct tcatatatcg acgaaatagt agggcaagag atgacaaaaa 1200

gtatctatat gtagacagcg tagaatatgg atttgattgg tataaattca tttattgcgt 1260

gtctcacaaa tactctcgat aagttggggt taaactggag atggaacaat gtcgatatct 1320

cgacgcatgc gacgtcgggc ccaattcgcc ctatagtgag tcgtattaca attcactggc 1380

cgtcgtttta caacgtcgtg actgggaaaa ccctggcgtt acccaactta atcgccttgc 1440

agcacatccc cctttcgcca gctggcgtaa tagcgaagag gcccgcaccg atcgcccttc 1500

ccaacagttg cgcagcctga atggcgaatg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg 1560

gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct 1620

cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta 1680

aatcgggggc tccctttagg gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa 1740

cttgattagg gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct 1800

ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc 1860

aaccctatct cggtctattc ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg 1920

ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgctt 1980

acaatttcct gatgcggtat tttctcctta cgcatctgtg cggtatttca caccgcatca 2040

ggtggcactt ttcggggaaa tgtgcgcgga acccctattt gtttattttt ctaaatacat 2100

tcaaatatgt atccgctcat gagacaataa ccctgataaa tgcttcaata atattgaaaa 2160

aggaagagta tgagtattca acatttccgt gtcgccctta ttcccttttt tgcggcattt 2220

tgccttcctg tttttgctca cccagaaacg ctggtgaaag taaaagatgc tgaagatcag 2280

ttgggtgcac gagtgggtta catcgaactg gatctcaaca gcggtaagat ccttgagagt 2340

tttcgccccg aagaacgttt tccaatgatg agcactttta aagttctgct atgtggcgcg 2400

gtattatccc gtattgacgc cgggcaagag caactcggtc gccgcataca ctattctcag 2460

aatgacttgg ttgagtactc accagtcaca gaaaagcatc ttacggatgg catgacagta 2520

agagaattat gcagtgctgc cataaccatg agtgataaca ctgcggccaa cttacttctg 2580

acaacgatcg gaggaccgaa ggagctaacc gcttttttgc acaacatggg ggatcatgta 2640

actcgccttg atcgttggga accggagctg aatgaagcca taccaaacga cgagcgtgac 2700

accacgatgc ctgtagcaat ggcaacaacg ttgcgcaaac tattaactgg cgaactactt 2760

actctagctt cccggcaaca attaatagac tggatggagg cggataaagt tgcaggacca 2820

cttctgcgct cggcccttcc ggctggctgg tttattgctg ataaatctgg agccggtgag 2880

cgtgggtctc gcggtatcat tgcagcactg gggccagatg gtaagccctc ccgtatcgta 2940

gttatctaca cgacggggag tcaggcaact atggatgaac gaaatagaca gatcgctgag 3000

ataggtgcct cactgattaa gcattggtaa ctgtcagacc aagtttactc atatatactt 3060

tagattgatt taaaacttca tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat 3120

aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta 3180

gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa 3240

acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt 3300

tttccgaagg taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgttct tctagtgtag 3360

ccgtagttag gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta 3420

atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca 3480

agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag 3540

cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa 3600

agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga 3660

acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc 3720

gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc 3780

ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt 3840

gctcacatgt tctttcctgc gttatcccct gattctgtgg ataaccgtat taccgccttt 3900

gagtgagctg ataccgctcg ccgcagccga acgaccgagc gcagcgagtc agtgagcgag 3960

gaagcggaag agcgcccaat acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa 4020

tgcagctggc gcgccaccaa tcacaattct gaaaagcaca tcttgatctc ctcattgcgg 4080

ggagtccaac ggtggtctta ttcccccgaa tttcccgctc aatctcgttc cagaccgacc 4140

cggacacagt gcttaacgcc gttccgaaac tctaccgcag atatgctcca acggactggg 4200

ctgcatagat gtgatcctcg gcttggagaa atggataaaa gccggccaaa aaaaaagcgg 4260

aaaaaagcgg aaaaaaagag aaaaaaaatc gcaaaatttg aaaaataggg ggaaaagacg 4320

caaaaacgca aggagggggg agtatatgac actgataagc aagctcacaa cggttcctct 4380

tatttttttc ctcatcttct gcctaggttc ccaaaatccc agatgcttct ctccagtgcc 4440

aaaagtaagt accccacagg ttttcggccg aaaattccac gtgcagcaac gtcgtgtggg 4500

gtgttaaaat gtgggggggg ggaaccagga caagaggctc ttgtgggagc cgaatgagag 4560

cacaaagcgg gcgggtgtga taagggcatt tttgcccatt ttcccttctc ctgtctctcc 4620

gacggtgatg gcgttgtgcg tcctctattt ctttttattt ctttttgttt tatttctctg 4680

actaccgatt tggtttgatt tcctcaaccc cacacaaata agctcgggcc gaggaatata 4740

tatatacacg gacacagtcg ccctgtggac aacacgtcac tacctctacg atacacaccg 4800

tacgttgtgt ggaagcttgt gagcggataa caatttcaca caggaaacag ctatgaccat 4860

gattacgcca agctcgaaat taaccctcac taaagggaac aaaagctgga gctccaccgc 4920

ggacacaata tctggtcaaa tttcagtttc gttacattta aattccttca cttcaagttc 4980

attcttcatc tgcttctgtt ttactttgac aggcaaatga agacatggta cgacttgatg 5040

gaggccaaga acgccatttc accccgagac accgaagtgc ctgaaatcct ggctgccccc 5100

attgataaca tcggaaacta cggtattccg gaaagtgtat atagaacctt tccccagctt 5160

gtgtctgtgg atatggatgg tgtaatcccc tttgagtact cgtcttggct tctctccgag 5220

cagtatgagg ctctctaatc tagcgcattt aatatctcaa tgtatttata tatttatctt 5280

ctcatgcggc cgcttaggtg gccttagtct tggtagcggc ttcggaaaca gccttggcct 5340

ccttgagagt gaacagcttg gcatccgagt cgaccacacc gtagtttgcg tagagtcggc 5400

cgactctgaa aaaggccttg atgatgggtt cgtcggactt tcgaaccagc tcgggaaagg 5460

cttgatggaa ggcctcggta gctcgcttga gcttgtagtg aggaatgatg ggaaagaggt 5520

gatgaatctg gtgggttccg atgttgtgag aaaggttgtc gatgagggca ccgtaggatc 5580

ggtcgacaga ggacaggttg cctttgacgt aggtccactc cgaatctgcg taccaaggtg 5640

tctcttcgtc gttgtgatga agaaaggtag taatgacgag catggatccg aacacaaaga 5700

cgggaccata gtagtagatg gccatagtct tgaagccgaa ctgcaggctg aggtagatgg 5760

acagggcagc cactccaaag tgcgcagcca gcgaaatgac cacggcagag acctgtcgaa 5820

caaagagagg ctcgaagggg ttgaagtggt tgacctttcg gggaggaaag ccttcgacca 5880

ggtaggcaaa ccaggctgca cccaaagcca gaatgaggtt tcgagacaga ggatgatcgt 5940

cggcctttcg ttgagggtag aagatttcgt ctcggtcgat gttgccagtg ttcttgtgat 6000

ggtgtctgtg ggtgagcttc caggactcga agggtgtaag gatgagagag tgaatgaagg 6060

ttccgatgac aaagttgagc aggtggtatc gggagaaggc accatgtcca gcgtcgtgac 6120

caacagtaaa gaatccccag aagacgatgc cctggagcag cacgtaaccg gtgcagagag 6180

cggcatccag agcccagagg ccttcgacaa cgggcagaga tcgtgcatgg tgaagtccga 6240

aggcgagcga cacagcaatg accaggcatc gaacggtgta gtacagagag agaggcacgg 6300

aggcctcgaa acactcggag ggcagagatc gcttgatctc ggtcagagta gggaactggt 6360

agggctgctt ggtagccatg gttgtgaatt agggtggtga gaatggttgg ttgtagggaa 6420

gaatcaaagg ccggtctcgg gatccgtggg tatatatata tatatatata tatacgatcc 6480

ttcgttacct ccctgttctc aaaactgtgg tttttcgttt ttcgtttttt gctttttttg 6540

atttttttag ggccaactaa gcttccagat ttcgctaatc acctttgtac taattacaag 6600

aaaggaagaa gctgattaga gttgggcttt ttatgcaact gtgctactcc ttatctctga 6660

tatgaaagtg tagacccaat cacatcatgt catttagagt tggtaatact gggaggatag 6720

ataaggcacg aaaacgagcc atagcagaca tgctgggtgt agccaagcag aagaaagtag 6780

atgggagcca attgacgagc gagggagcta cgccaatccg acatacgaca cgctgagatc 6840

gtcttggccg gggggtacct acagatgtcc aagggtaagt gcttgactgt aattgtatgt 6900

ctgaggacaa atatgtagtc agccgtataa agtcatacca ggcaccagtg ccatcatcga 6960

accactaact ctctatgata catgcctccg gtattattgt accatgcgtc gctttgttac 7020

atacgtatct tgcctttttc tctcagaaac tccagacttt ggctattggt cgagataagc 7080

ccggaccata gtgagtcttt cacactctac atttctccct tgctccaact atcgattgtt 7140

gtctactaac tatcgtacga taacttcgta tagcatacat tatacgaagt tatcgcgtcg 7200

acgagtatct gtctgactcg tcattgccgc ctttggagta cgactccaac tatgagtgtg 7260

cttggatcac tttgacgata cattcttcgt tggaggctgt gggtctgaca gctgcgtttt 7320

cggcgcggtt ggccgacaac aatatcagct gcaacgtcat tgctggcttt catcatgatc 7380

acatttttgt cggcaaaggc gacgcccaga gagccattga cgttctttct aatttggacc 7440

gatagccgta tagtccagtc tatctataag ttcaactaac tcgtaactat taccataaca 7500

tatacttcac tgccccagat aaggttccga taaaaagttc tgcagactaa atttatttca 7560

gtctcctctt caccaccaaa atgccctcct acgaagctcg agctaacgtc cacaagtccg 7620

cctttgccgc tcgagtgctc aagctcgtgg cagccaagaa aaccaacctg tgtgcttctc 7680

tggatgttac caccaccaag gagctcattg agcttgccga taaggtcgga ccttatgtgt 7740

gcatgatcaa aacccatatc gacatcattg acgacttcac ctacgccggc actgtgctcc 7800

ccctcaagga acttgctctt aagcacggtt tcttcctgtt cgaggacaga aagttcgcag 7860

atattggcaa cactgtcaag caccagtacc ggtgtcaccg aatcgccgag tggtccgata 7920

tcaccaacgc ccacggtgta cccggaaccg gaatcattgc tggcctgcga gctggtgccg 7980

aggaaactgt ctctgaacag aagaaggagg acgtctctga ctacgagaac tcccagtaca 8040

aggagttcct agtcccctct cccaacgaga agctggccag aggtctgctc atgctggccg 8100

agctgtcttg caagggctct ctggccactg gcgagtactc caagcagacc attgagcttg 8160

cccgatccga ccccgagttt gtggttggct tcattgccca gaaccgacct aagggcgact 8220

ctgaggactg gcttattctg acccccgggg tgggtcttga cgacaaggga gacgctctcg 8280

gacagcagta ccgaactgtt gaggatgtca tgtctaccgg aacggatatc ataattgtcg 8340

gccgaggtct gtacggccag aaccgagatc ctattgagga ggccaagcga taccagaagg 8400

ctggctggga ggcttaccag aagattaact gttagaggtt agactatgga tatgtaattt 8460

aactgtgtat atagagagcg tgcaagtatg gagcgcttgt tcagcttgta tgatggtcag 8520

acgacctgtc tgatcgagta tgtatgatac tgcacaacct gtgtatccgc atgatctgtc 8580

caatggggca tgttgttgtg tttctcgata cggagatgct gggtacagtg ctaatacgtt 8640

gaactactta tacttatatg aggctcgaag aaagctgact tgtgtatgac ttattctcaa 8700

ctacatcccc agtcacaata ccaccactgc actaccacta caccaaaacc atgatcaaac 8760

cacccatgga cttcctggag gcagaagaac ttgttatgga aaagctcaag agagagatca 8820

taacttcgta tagcatacat tatacgaagt tatcctgcag gtaaagg 8867

<210>21

<211>34

<212>DNA

<213>大肠杆菌

<400>21

ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttat 34

<210>22

<211>14655

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>质粒pZKLeuN-29E3

<220>

<221>其它特征

<222>(8822)..(8822)

<223>n为a、c、g或t

<220>

<221>其它特征

<222>(8827)..(8830)

<223>n为a、c、g或t

<400>22

cgattgttgt ctactaacta tcgtacgata acttcgtata gcatacatta tacgaagtta 60

tcgcgtcgac gagtatctgt ctgactcgtc attgccgcct ttggagtacg actccaacta 120

tgagtgtgct tggatcactt tgacgataca ttcttcgttg gaggctgtgg gtctgacagc 180

tgcgttttcg gcgcggttgg ccgacaacaa tatcagctgc aacgtcattg ctggctttca 240

tcatgatcac atttttgtcg gcaaaggcga cgcccagaga gccattgacg ttctttctaa 300

tttggaccga tagccgtata gtccagtcta tctataagtt caactaactc gtaactatta 360

ccataacata tacttcactg ccccagataa ggttccgata aaaagttctg cagactaaat 420

ttatttcagt ctcctcttca ccaccaaaat gccctcctac gaagctcgag ctaacgtcca 480

caagtccgcc tttgccgctc gagtgctcaa gctcgtggca gccaagaaaa ccaacctgtg 540

tgcttctctg gatgttacca ccaccaagga gctcattgag cttgccgata aggtcggacc 600

ttatgtgtgc atgatcaaaa cccatatcga catcattgac gacttcacct acgccggcac 660

tgtgctcccc ctcaaggaac ttgctcttaa gcacggtttc ttcctgttcg aggacagaaa 720

gttcgcagat attggcaaca ctgtcaagca ccagtaccgg tgtcaccgaa tcgccgagtg 780

gtccgatatc accaacgccc acggtgtacc cggaaccgga atcattgctg gcctgcgagc 840

tggtgccgag gaaactgtct ctgaacagaa gaaggaggac gtctctgact acgagaactc 900

ccagtacaag gagttcctag tcccctctcc caacgagaag ctggccagag gtctgctcat 960

gctggccgag ctgtcttgca agggctctct ggccactggc gagtactcca agcagaccat 1020

tgagcttgcc cgatccgacc ccgagtttgt ggttggcttc attgcccaga accgacctaa 1080

gggcgactct gaggactggc ttattctgac ccccggggtg ggtcttgacg acaagggaga 1140

cgctctcgga cagcagtacc gaactgttga ggatgtcatg tctaccggaa cggatatcat 1200

aattgtcggc cgaggtctgt acggccagaa ccgagatcct attgaggagg ccaagcgata 1260

ccagaaggct ggctgggagg cttaccagaa gattaactgt tagaggttag actatggata 1320

tgtaatttaa ctgtgtatat agagagcgtg caagtatgga gcgcttgttc agcttgtatg 1380

atggtcagac gacctgtctg atcgagtatg tatgatactg cacaacctgt gtatccgcat 1440

gatctgtcca atggggcatg ttgttgtgtt tctcgatacg gagatgctgg gtacagtgct 1500

aatacgttga actacttata cttatatgag gctcgaagaa agctgacttg tgtatgactt 1560

attctcaact acatccccag tcacaatacc accactgcac taccactaca ccaaaaccat 1620

gatcaaacca cccatggact tcctggaggc agaagaactt gttatggaaa agctcaagag 1680

agagatcata acttcgtata gcatacatta tacgaagtta tcctgcaggt aaaggaattc 1740

tggagtttct gagagaaaaa ggcaagatac gtatgtaaca aagcgacgca tggtacaata 1800

ataccggagg catgtatcat agagagttag tggttcgatg atggcactgg tgcctggtat 1860

gactttatac ggctgactac atatttgtcc tcagacatac aattacagtc aagcacttac 1920

ccttggacat ctgtaggtac cccccggcca agacgatctc agcgtgtcgt atgtcggatt 1980

ggcgtagctc cctcgctcgt caattggctc ccatctactt tcttctgctt ggctacaccc 2040

agcatgtctg ctatggctcg ttttcgtgcc ttatctatcc tcccagtatt accaactcta 2100

aatgacatga tgtgattggg tctacacttt catatcagag ataaggagta gcacagttgc 2160

ataaaaagcc caactctaat cagcttcttc ctttcttgta attagtacaa aggtgattag 2220

cgaaatctgg aagcttagtt ggccctaaaa aaatcaaaaa aagcaaaaaa cgaaaaacga 2280

aaaaccacag ttttgagaac agggaggtaa cgaaggatcg tatatatata tatatatata 2340

tatacccacg gatcccgaga ccggcctttg attcttccct acaaccaacc attctcacca 2400

ccctaattca caaccatgga gtctggaccc atgcctgctg gcattccctt ccctgagtac 2460

tatgacttct ttatggactg gaagactccc ctggccatcg ctgccaccta cactgctgcc 2520

gtcggtctct tcaaccccaa ggttggcaag gtctcccgag tggttgccaa gtcggctaac 2580

gcaaagcctg ccgagcgaac ccagtccgga gctgccatga ctgccttcgt ctttgtgcac 2640

aacctcattc tgtgtgtcta ctctggcatc accttctact acatgtttcc tgctatggtc 2700

aagaacttcc gaacccacac actgcacgaa gcctactgcg acacggatca gtccctctgg 2760

aacaacgcac ttggctactg gggttacctc ttctacctgt ccaagttcta cgaggtcatt 2820

gacaccatca tcatcatcct gaagggacga cggtcctcgc tgcttcagac ctaccaccat 2880

gctggagcca tgattaccat gtggtctggc atcaactacc aagccactcc catttggatc 2940

tttgtggtct tcaactcctt cattcacacc atcatgtact gttactatgc cttcacctct 3000

atcggattcc atcctcctgg caaaaagtac ctgacttcga tgcagattac tcagtttctg 3060

gtcggtatca ccattgccgt gtcctacctc ttcgttcctg gctgcatccg aacacccggt 3120

gctcagatgg ctgtctggat caacgtcggc tacctgtttc ccttgaccta tctgttcgtg 3180

gactttgcca agcgaaccta ctccaagcga tctgccattg ccgctcagaa aaaggctcag 3240

taagcggccg cattgatgat tggaaacaca cacatgggtt atatctaggt gagagttagt 3300

tggacagtta tatattaaat cagctatgcc aacggtaact tcattcatgt caacgaggaa 3360

ccagtgactg caagtaatat agaatttgac caccttgcca ttctcttgca ctcctttact 3420

atatctcatt tatttcttat atacaaatca cttcttcttc ccagcatcga gctcggaaac 3480

ctcatgagca ataacatcgt ggatctcgtc aatagagggc tttttggact ccttgctgtt 3540

ggccaccttg tccttgctgt ctggctcatt ctgtttcaac gccttttaat taacggagta 3600

ggtctcggtg tcggaagcga cgccagatcc gtcatcctcc tttcgctctc caaagtagat 3660

acctccgacg agctctcgga caatgatgaa gtcggtgccc tcaacgtttc ggatggggga 3720

gagatcggcg agcttgggcg acagcagctg gcagggtcgc aggttggcgt acaggttcag 3780

gtcctttcgc agcttgagga gaccctgctc gggtcgcacg tcggttcgtc cgtcgggagt 3840

ggtccatacg gtgttggcag cgcctccgac agcaccgagc ataatagagt cagcctttcg 3900

gcagatgtcg agagtagcgt cggtgatggg ctcgccctcc ttctcaatgg cagctcctcc 3960

aatgagtcgg tcctcaaaca caaactcggt gccggaggcc tcagcaacag acttgagcac 4020

cttgacggcc tcggcaatca cctcggggcc acagaagtcg ccgccgagaa gaacaatctt 4080

cttggagtca gtcttggtct tcttagtttc gggttccatt gtggatgtgt gtggttgtat 4140

gtgtgatgtg gtgtgtggag tgaaaatctg tggctggcaa acgctcttgt atatatacgc 4200

acttttgccc gtgctatgtg gaagactaaa cctccgaaga ttgtgactca ggtagtgcgg 4260

tatcggctag ggacccaaac cttgtcgatg ccgatagcat gcgacgtcgg gcccaattcg 4320

ccctatagtg agtcgtatta caattcactg gccgtcgttt tacaacgtcg tgactgggaa 4380

aaccctggcg ttacccaact taatcgcctt gcagcacatc cccctttcgc cagctggcgt 4440

aatagcgaag aggcccgcac cgatcgccct tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgaa 4500

tggacgcgcc ctgtagcggc gcattaagcg cggcgggtgt ggtggttacg cgcagcgtga 4560

ccgctacact tgccagcgcc ctagcgcccg ctcctttcgc tttcttccct tcctttctcg 4620

ccacgttcgc cggctttccc cgtcaagctc taaatcgggg gctcccttta gggttccgat 4680

ttagtgcttt acggcacctc gaccccaaaa aacttgatta gggtgatggt tcacgtagtg 4740

ggccatcgcc ctgatagacg gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata 4800

gtggactctt gttccaaact ggaacaacac tcaaccctat ctcggtctat tcttttgatt 4860

tataagggat tttgccgatt tcggcctatt ggttaaaaaa tgagctgatt taacaaaaat 4920

ttaacgcgaa ttttaacaaa atattaacgc ttacaatttc ctgatgcggt attttctcct 4980

tacgcatctg tgcggtattt cacaccgcat caggtggcac ttttcgggga aatgtgcgcg 5040

gaacccctat ttgtttattt ttctaaatac attcaaatat gtatccgctc atgagacaat 5100

aaccctgata aatgcttcaa taatattgaa aaaggaagag tatgagtatt caacatttcc 5160

gtgtcgccct tattcccttt tttgcggcat tttgccttcc tgtttttgct cacccagaaa 5220

cgctggtgaa agtaaaagat gctgaagatc agttgggtgc acgagtgggt tacatcgaac 5280

tggatctcaa cagcggtaag atccttgaga gttttcgccc cgaagaacgt tttccaatga 5340

tgagcacttt taaagttctg ctatgtggcg cggtattatc ccgtattgac gccgggcaag 5400

agcaactcgg tcgccgcata cactattctc agaatgactt ggttgagtac tcaccagtca 5460

cagaaaagca tcttacggat ggcatgacag taagagaatt atgcagtgct gccataacca 5520

tgagtgataa cactgcggcc aacttacttc tgacaacgat cggaggaccg aaggagctaa 5580

ccgctttttt gcacaacatg ggggatcatg taactcgcct tgatcgttgg gaaccggagc 5640

tgaatgaagc cataccaaac gacgagcgtg acaccacgat gcctgtagca atggcaacaa 5700

cgttgcgcaa actattaact ggcgaactac ttactctagc ttcccggcaa caattaatag 5760

actggatgga ggcggataaa gttgcaggac cacttctgcg ctcggccctt ccggctggct 5820

ggtttattgc tgataaatct ggagccggtg agcgtgggtc tcgcggtatc attgcagcac 5880

tggggccaga tggtaagccc tcccgtatcg tagttatcta cacgacgggg agtcaggcaa 5940

ctatggatga acgaaataga cagatcgctg agataggtgc ctcactgatt aagcattggt 6000

aactgtcaga ccaagtttac tcatatatac tttagattga tttaaaactt catttttaat 6060

ttaaaaggat ctaggtgaag atcctttttg ataatctcat gaccaaaatc ccttaacgtg 6120

agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc 6180

ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg 6240

tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag 6300

cgcagatacc aaatactgtt cttctagtgt agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact 6360

ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc taatcctgtt accagtggct gctgccagtg 6420

gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact caagacgata gttaccggat aaggcgcagc 6480

ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg 6540

aactgagata cctacagcgt gagctatgag aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg 6600

cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag 6660

ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc 6720

gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct 6780

ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt ttgctcacat gttctttcct gcgttatccc 6840

ctgattctgt ggataaccgt attaccgcct ttgagtgagc tgataccgct cgccgcagcc 6900

gaacgaccga gcgcagcgag tcagtgagcg aggaagcgga agagcgccca atacgcaaac 6960

cgcctctccc cgcgcgttgg ccgattcatt aatgcagctg gcgcgcccac tgagctcgtc 7020

taacggactt gatatacaac caattaaaac aaatgaaaag aaatacagtt ctttgtatca 7080

tttgtaacaa ttaccctgta caaactaagg tattgaaatc ccacaatatt cccaaagtcc 7140

acccctttcc aaattgtcat gcctacaact catataccaa gcactaacct accaaacacc 7200

actaaaaccc cacaaaatat atcttaccga atatacagta acaagctacc accacactcg 7260

ttgggtgcag tcgccagctt aaagatatct atccacatca gccacaactc ccttccttta 7320

ataaaccgac tacacccttg gctattgagg ttatgagtga atatactgta gacaagacac 7380

tttcaagaag actgtttcca aaacgtacca ctgtcctcca ctacaaacac acccaatctg 7440

cttcttctag tcaaggttgc tacaccggta aattataaat catcatttca ttagcagggc 7500

agggcccttt ttatagagtc ttatacacta gcggaccctg ccggtagacc aacccgcagg 7560

cgcgtcagtt tgctccttcc atcaatgcgt cgtagaaacg acttactcct tcttgagcag 7620

ctccttgacc ttgttggcaa caagtctccg acctcggagg tggaggaaga gcctccgata 7680

tcggcggtag tgataccagc ctcgacggac tccttgacgg cagcctcaac agcgtcaccg 7740

gcgggcttca tgttaagaga gaacttgagc atcatggcgg cagacagaat ggtggcgtac 7800

gcaactaaca tgaatgaata cgatatacat caaagactat gatacgcagt attgcacact 7860

gtacgagtaa gagcactagc cactgcactc aagtgaaacc gttgcccggg tacgagtatg 7920

agtatgtaca gtatgtttag tattgtactt ggacagtgct tgtatcgtac attctcaagt 7980

gtcaaacata aatatccgtt gctatatcct cgcaccacca cgtagctcgc tatatccctg 8040

tgttgaatcc atccatcttg gattgccaat tgtgcacaca gaaccgggca ctcacttccc 8100

catccacact tgcggccgcg cctacttaag caacgggctt gataacagcg gggggggtgc 8160

ccacgttgtt gcggttgcgg aagaacagaa cacccttacc agcaccctcg gcaccagcgc 8220

tgggctcaac ccactggcac atacgcgcac tgcggtacat ggcgcggatg aagccacgag 8280

gaccatcctg gacatcagcc cggtagtgct tgcccatgat gggcttaatg gcctcggtgg 8340

cctcgtccgc gttgtagaag gggatgctgc tgacgtagtg gtggaggaca tgagtctcga 8400

tgatgccgtg gagaaggtgg cggccgatga agcccatctc acggtcaatg gtagcagcgg 8460

caccacggac gaagttccac tcgtcgttgg tgtagtgggg aagggtaggg tcggtgtgct 8520

ggaggaaggt gatggcaacg agccagtggt taacccagag gtagggaaca aagtaccaga 8580

tggccatgtt gtagaaaccg aacttctgaa cgaggaagta cagagcagtg gccatcagac 8640

cgataccaat atcgctgagg acgatgagct tagcgtcact gttctcgtac agagggctgc 8700

ggggatcgaa gtggttaaca ccaccgccga ggccgttatg cttgcccttg ccgcgaccct 8760

cacgctggcg ctcgtggtag ttgtggccgg taacattggt gatgaggtag ttgggccagc 8820

cnacgannnn ctcagtaaga tgagcgagct cgtgggtcat ctttccgaga cgagtagcct 8880

gctgctcgcg ggttcgggga acgaagacca tgtcacgctc catgttgcca gtggccttgt 8940

ggtgctttcg gtgggagatt tgccagctga agtaggggac aaggagggaa gagtgaagaa 9000

cccagccagt aatgtcgttg atgatgcgag aatcggagaa agcaccgtga ccgcactcat 9060

gggcaataac ccagagacca gtaccgaaaa gaccctgaag aacggtgtac acggcccaca 9120

gaccagcgcg ggcgggggtg gaggggatat attcgggggt cacaaagttg taccagatgc 9180

tgaaagtggt agtcaggagg acaatgtcgc ggaggatata accgtatccc ttgagagcgg 9240

agcgcttgaa gcagtgctta gggatggcat tgtagatgtc cttgatggta aagtcgggaa 9300

cctcgaactg gttgccgtag gtgtcgagca tgacaccata ctcggacttg ggcttggcga 9360

tatcaacctc ggacatggac gagagcgatg tggaagaggc cgagtggcgg ggagagtctg 9420

aaggagagac ggcggcagac tcagaatccg tcacagtagt tgaggtgacg gtgcgtctaa 9480

gcgcagggtt ctgcttgggc agagccgaag tggacgccat ggttgatgtg tgtttaattc 9540

aagaatgaat atagagaaga gaagaagaaa aaagattcaa ttgagccggc gatgcagacc 9600

cttatataaa tgttgccttg gacagacgga gcaagcccgc ccaaacctac gttcggtata 9660

atatgttaag ctttttaaca caaaggtttg gcttggggta acctgatgtg gtgcaaaaga 9720

ccgggcgttg gcgagccatt gcgcgggcga atggggccgt gactcgtctc aaattcgagg 9780

gcgtgcctca attcgtgccc ccgtggcttt ttcccgccgt ttccgccccg tttgcaccac 9840

tgcagccgct tctttggttc ggacaccttg ctgcgagcta ggtgccttgt gctacttaaa 9900

aagtggcctc ccaacaccaa catgacatga gtgcgtgggc caagacacgt tggcggggtc 9960

gcagtcggct caatggcccg gaaaaaacgc tgctggagct ggttcggacg cagtccgccg 10020

cggcgtatgg atatccgcaa ggttccatag cgccattgcc ctccgtcggc gtctatcccg 10080

caacctctaa atagagcggg aatataaccc aagcttcttt tttttccttt aacacgcaca 10140

cccccaacta tcatgttgct gctgctgttt gactctactc tgtggagggg tgctcccacc 10200

caacccaacc tacaggtgga tccggcgctg tgattggctg ataagtctcc tatccggact 10260

aattctgacc aatgggacat gcgcgcagga cccaaatgcc gcaattacgt aaccccaacg 10320

aaatgcctac ccctctttgg agcccagcgg ccccaaatcc ccccaagcag cccggttcta 10380

ccggcttcca tctccaagca caagcagccc ggttctaccg gcttccatct ccaagcaccc 10440

ctttctccac accccacaaa aagacccgtg caggacatcc tactgcgtcg acatcattta 10500

aattccttca cttcaagttc attcttcatc tgcttctgtt ttactttgac aggcaaatga 10560

agacatggta cgacttgatg gaggccaaga acgccatttc accccgagac accgaagtgc 10620

ctgaaatcct ggctgccccc attgataaca tcggaaacta cggtattccg gaaagtgtat 10680

atagaacctt tccccagctt gtgtctgtgg atatggatgg tgtaatcccc tttgagtact 10740

cgtcttggct tctctccgag cagtatgagg ctctctaatc tagcgcattt aatatctcaa 10800

tgtatttata tatttatctt ctcatgcggc cgctcactga atctttttgg ctcccttgtg 10860

cttcctgacg atatacgttt gcacatagaa attcaagaac aaacacaaga ctgtgccaac 10920

ataaaagtaa ttgaagaacc agccaaacat cctcatccca tcttggcgat aacagggaat 10980

gttcctgtac ttccagacaa tgtagaaacc aacattgaat tgaatgatct gcattgatgt 11040

aatcagggat tttggcatgg ggaacttcag cttgatcaat ctggtccaat aataaccgta 11100

catgatccag tggatgaaac cattcaacag cacaaaaatc caaacagctt catttcggta 11160

attatagaac agccacatat ccatcggtgc ccccaaatga tggaagaatt gcaaccaggt 11220

cagaggcttg cccatcagtg gcaaatagaa ggagtcaata tactccagga acttgctcaa 11280

atagaacaac tgcgtggtga tcctgaagac gttgttgtca aaagccttct cgcagttgtc 11340

agacataaca ccgatggtgt acatggcata tgccattgag aggaatgatc ccaacgaata 11400

aatggacatg agaaggttgt aattggtgaa aacaaacttc atacgagact gaccttttgg 11460

accaaggggg ccaagagtga acttcaagat gacaaatgcg atggacaagt aaagcacctc 11520

acagtgactg gcatcactcc agagttgggc ataatcaact ggttgggtaa aacttcctgc 11580

ccaattgaga ctatttcatt caccacctcc atggccattg ctgtagatat gtcttgtgtg 11640

taagggggtt ggggtggttg tttgtgttct tgacttttgt gttagcaagg gaagacgggc 11700

aaaaaagtga gtgtggttgg gagggagaga cgagccttat atataatgct tgtttgtgtt 11760

tgtgcaagtg gacgccgaaa cgggcaggag ccaaactaaa caaggcagac aatgcgagct 11820

taattggatt gcctgatggg caggggttag ggctcgatca atgggggtgc gaagtgacaa 11880

aattgggaat taggttcgca agcaaggctg acaagacttt ggcccaaaca tttgtacgcg 11940

gtggacaaca ggagccaccc atcgtctgtc acgggctagc cggtcgtgcg tcctgtcagg 12000

ctccacctag gctccatgcc actccataca atcccactag tgtaccgcta ggccgctttt 12060

agctcccatc taagaccccc ccaaaacctc cactgtacag tgcactgtac tgtgtggcga 12120

tcaagggcaa gggaaaaaag gcgcaaacat gcacgcatgg aatgacgtag gtaaggcgtt 12180

actagactga aaagtggcac atttcggcgt gccaaagggt cctaggtgcg tttcgcgagc 12240

tgggcgccag gccaagccgc tccaaaacgc ctctccgact ccctccagcg gcctccatat 12300

ccccatccct ctccacagca atgttgttaa gccttgcaaa cgaaaaaata gaaaggctaa 12360

taagcttcca atattgtggt gtacgctgca taacgcaaca atgagcgcca aacaacacac 12420

acacacagca cacagcagca ttaaccacga tgaacagcat gacattacag gtgggtgtgt 12480

aatcagggcc ctgattgctg gtggtgggag cccccatcat gggcagatct gcgtacactg 12540

tttaaacagt gtacgcagat ctactataga ggaacattta aattgccccg gagaagacgg 12600

ccaggccgcc tagatgacaa attcaacaac tcacagctga ctttctgcca ttgccactag 12660

gggggggcct ttttatatgg ccaagccaag ctctccacgt cggttgggct gcacccaaca 12720

ataaatgggt agggttgcac caacaaaggg atgggatggg gggtagaaga tacgaggata 12780

acggggctca atggcacaaa taagaacgaa tactgccatt aagactcgtg atccagcgac 12840

tgacaccatt gcatcatcta agggcctcaa aactacctcg gaactgctgc gctgatctgg 12900

acaccacaga ggttccgagc actttaggtt gcaccaaatg tcccaccagg tgcaggcaga 12960

aaacgctgga acagcgtgta cagtttgtct taacaaaaag tgagggcgct gaggtcgagc 13020

agggtggtgt gacttgttat agcctttaga gctgcgaaag cgcgtatgga tttggctcat 13080

caggccagat tgagggtctg tggacacatg tcatgttagt gtacttcaat cgccccctgg 13140

atatagcccc gacaataggc cgtggcctca tttttttgcc ttccgcacat ttccattgct 13200

cgatacccac accttgcttc tcctgcactt gccaacctta atactggttt acattgacca 13260

acatcttaca agcggggggc ttgtctaggg tatatataaa cagtggctct cccaatcggt 13320

tgccagtctc ttttttcctt tctttcccca cagattcgaa atctaaacta cacatcacag 13380

aattccgagc cgtgagtatc cacgacaaga tcagtgtcga gacgacgcgt tttgtgtaat 13440

gacacaatcc gaaagtcgct agcaacacac actctctaca caaactaacc cagctctggt 13500

accatggagg tcgtgaacga aatcgtctcc attggccagg aggttcttcc caaggtcgac 13560

tatgctcagc tctggtctga tgcctcgcac tgcgaggtgc tgtacctctc catcgccttc 13620

gtcatcctga agttcaccct tggtcctctc ggacccaagg gtcagtctcg aatgaagttt 13680

gtgttcacca actacaacct gctcatgtcc atctactcgc tgggctcctt cctctctatg 13740

gcctacgcca tgtacaccat tggtgtcatg tccgacaact gcgagaaggc tttcgacaac 13800

aatgtcttcc gaatcaccac tcagctgttc tacctcagca agttcctcga gtacattgac 13860

tccttctatc tgcccctcat gggcaagcct ctgacctggt tgcagttctt tcaccatctc 13920

ggagctccta tggacatgtg gctgttctac aactaccgaa acgaagccgt ttggatcttt 13980

gtgctgctca acggcttcat tcactggatc atgtacggct actattggac ccgactgatc 14040

aagctcaagt tccctatgcc caagtccctg attacttcta tgcagatcat tcagttcaac 14100

gttggcttct acatcgtctg gaagtaccgg aacattccct gctaccgaca agatggaatg 14160

agaatgtttg gctggttttt caactacttc tacgttggta ctgtcctgtg tctgttcctc 14220

aacttctacg tgcagaccta catcgtccga aagcacaagg gagccaaaaa gattcagtga 14280

gcggccgcat gtacatacaa gattatttat agaaatgaat cgcgatcgaa caaagagtac 14340

gagtgtacga gtaggggatg atgataaaag tggaagaagt tccgcatctt tggatttatc 14400

aacgtgtagg acgatacttc ctgtaaaaat gcaatgtctt taccataggt tctgctgtag 14460

atgttattaa ctaccattaa catgtctact tgtacagttg cagaccagtt ggagtataga 14520

atggtacact taccaaaaag tgttgatggt tgtaactacg atatataaaa ctgttgacgg 14580

gatccccgct gatatgccta aggaacaatc aaagaggaag atattaattc agaatgctag 14640

tatacagtta gggat 14655

<210>23

<211>777

<212>DNA

<213>纤细裸藻

<220>

<221>其它特征

<223>合成的Δ-9延长酶(密码子优化的)

<400>23

atggaggtcg tgaacgaaat cgtctccatt ggccaggagg ttcttcccaa ggtcgactat 60

gctcagctct ggtctgatgc ctcgcactgc gaggtgctgt acctctccat cgccttcgtc 120

atcctgaagt tcacccttgg tcctctcgga cccaagggtc agtctcgaat gaagtttgtg 180

ttcaccaact acaacctgct catgtccatc tactcgctgg gctccttcct ctctatggcc 240

tacgccatgt acaccattgg tgtcatgtcc gacaactgcg agaaggcttt cgacaacaat 300

gtcttccgaa tcaccactca gctgttctac ctcagcaagt tcctcgagta cattgactcc 360

ttctatctgc ccctcatggg caagcctctg acctggttgc agttctttca ccatctcgga 420

gctcctatgg acatgtggct gttctacaac taccgaaacg aagccgtttg gatctttgtg 480

ctgctcaacg gcttcattca ctggatcatg tacggctact attggacccg actgatcaag 540

ctcaagttcc ctatgcccaa gtccctgatt acttctatgc agatcattca gttcaacgtt 600

ggcttctaca tcgtctggaa gtaccggaac attccctgct accgacaaga tggaatgaga 660

atgtttggct ggtttttcaa ctacttctac gttggtactg tcctgtgtct gttcctcaac 720

ttctacgtgc agacctacat cgtccgaaag cacaagggag ccaaaaagat tcagtga 777

<210>24

<211>258

<212>PRT

<213>纤细裸藻

<220>

<221>其它特征

<222>(1)..(258)

<223>Δ-9延长酶(EgD9e)

<400>24

Met Glu Val Val Asn Glu Ile Val Ser Ile Gly Gln Glu Val Leu Pro

1 5 10 15

Lys Val Asp Tyr Ala Gln Leu Trp Ser Asp Ala Ser His Cys Glu Val

20 25 30

Leu Tyr Leu Ser Ile Ala Phe Val Ile Leu Lys Phe Thr Leu Gly Pro

35 40 45

Leu Gly Pro Lys Gly Gln Ser Arg Met Lys Phe Val Phe Thr Asn Tyr

50 55 60

Asn Leu Leu Met Ser Ile Tyr Ser Leu Gly Ser Phe Leu Ser Met Ala

65 70 75 80

Tyr Ala Met Tyr Thr Ile Gly Val Met Ser Asp Asn Cys Glu Lys Ala

85 90 95

Phe Asp Asn Asn Val Phe Arg Ile Thr Thr Gln Leu Phe Tyr Leu Ser

100 105 110

Lys Phe Leu Glu Tyr Ile Asp Ser Phe Tyr Leu Pro Leu Met Gly Lys

115 120 125

Pro Leu Thr Trp Leu Gln Phe Phe His His Leu Gly Ala Pro Met Asp

130 135 140

Met Trp Leu Phe Tyr Asn Tyr Arg Asn Glu Ala Val Trp Ile Phe Val

145 150 155 160

Leu Leu Asn Gly Phe Ile His Trp Ile Met Tyr Gly Tyr Tyr Trp Thr

165 170 175

Arg Leu Ile Lys Leu Lys Phe Pro Met Pro Lys Ser Leu Ile Thr Ser

180 185 190

Met Gln Ile Ile Gln Phe Asn Val Gly Phe Tyr Ile Val Trp Lys Tyr

195 200 205

Arg Asn Ile Pro Cys Tyr Arg Gln Asp Gly Met Arg Met Phe Gly Trp

210 215 220

Phe Phe Asn Tyr Phe Tyr Val Gly Thr Val Leu Cys Leu Phe Leu Asn

225 230 235 240

Phe Tyr Val Gln Thr Tyr Ile Val Arg Lys His Lys Gly Ala Lys Lys

245 250 255

Ile Gln

<210>25

<211>828

<212>DNA

<213>高山被孢霉

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(828)

<223>合成的C16/18延长酶(密码子优化的)

<400>25

atg gag tct gga ccc atg cct gct ggc att ccc ttc cct gag tac tat 48

Met Glu Ser Gly Pro Met Pro Ala Gly Ile Pro Phe Pro Glu Tyr Tyr

1 5 10 15

gac ttc ttt atg gac tgg aag act ccc ctg gcc atc gct gcc acc tac 96

Asp Phe Phe Met Asp Trp Lys Thr Pro Leu Ala Ile Ala Ala Thr Tyr

20 25 30

act gct gcc gtc ggt ctc ttc aac ccc aag gtt ggc aag gtc tcc cga 144

Thr Ala Ala Val Gly Leu Phe Asn Pro Lys Val Gly Lys Val Ser Arg

35 40 45

gtg gtt gcc aag tcg gct aac gca aag cct gcc gag cga acc cag tcc 192

Val Val Ala Lys Ser Ala Asn Ala Lys Pro Ala Glu Arg Thr Gln Ser

50 55 60

gga gct gcc atg act gcc ttc gtc ttt gtg cac aac ctc att ctg tgt 240

Gly Ala Ala Met Thr Ala Phe Val Phe Val His Asn Leu Ile Leu Cys

65 70 75 80

gtc tac tct ggc atc acc ttc tac tac atg ttt cct gct atg gtc aag 288

Val Tyr Ser Gly Ile Thr Phe Tyr Tyr Met Phe Pro Ala Met Val Lys

85 90 95

aac ttc cga acc cac aca ctg cac gaa gcc tac tgc gac acg gat cag 336

Asn Phe Arg Thr His Thr Leu His Glu Ala Tyr Cys Asp Thr Asp Gln

100 105 110

tcc ctc tgg aac aac gca ctt ggc tac tgg ggt tac ctc ttc tac ctg 384

Ser Leu Trp Asn Asn Ala Leu Gly Tyr Trp Gly Tyr Leu Phe Tyr Leu

115 120 125

tcc aag ttc tac gag gtc att gac acc atc atc atc atc ctg aag gga 432

Ser Lys Phe Tyr Glu Val Ile Asp Thr Ile IleIle Ile Leu Lys Gly

130 135 140

cga cgg tcc tcg ctg ctt cag acc tac cac cat gct gga gcc atg att 480

Arg Arg Ser Ser Leu Leu Gln Thr Tyr His His Ala Gly Ala Met Ile

145 150 155 160

acc atg tgg tct ggc atc aac tac caa gcc act ccc att tgg atc ttt 528

Thr Met Trp Ser Gly Ile Asn Tyr Gln Ala Thr Pro Ile Trp Ile Phe

165 170 175

gtg gtc ttc aac tcc ttc att cac acc atc atg tac tgt tac tat gcc 576

Val Val Phe Asn Ser Phe Ile His Thr Ile Met Tyr Cys Tyr Tyr Ala

180 185 190

ttc acc tct atc gga ttc cat cct cct ggc aaa aag tac ctg act tcg 624

Phe Thr Ser Ile Gly Phe His Pro Pro Gly Lys Lys Tyr Leu Thr Ser

195 200 205

atg cag att act cag ttt ctg gtc ggt atc acc att gcc gtg tcc tac 672

Met Gln Ile Thr Gln Phe Leu Val Gly Ile Thr Ile Ala Val Ser Tyr

210 215 220

ctc ttc gtt cct ggc tgc atc cga aca ccc ggt gct cag atg gct gtc 720

Leu Phe Val Pro Gly Cys Ile Arg Thr Pro Gly Ala Gln Met Ala Val

225 230 235 240

tgg atc aac gtc ggc tac ctg ttt ccc ttg acc tat ctg ttc gtg gac 768

Trp Ile Asn Val Gly Tyr Leu Phe Pro Leu Thr Tyr Leu Phe Val Asp

245 250 255

ttt gcc aag cga acc tac tcc aag cga tct gcc att gcc gct cag aaa 816

Phe Ala Lys Arg Thr Tyr Ser Lys Arg Ser Ala Ile Ala Ala Gln Lys

260 265 270

aag gct cag taa 828

Lys Ala Gln

275

<210>26

<211>275

<212>PRT

<213>高山被孢霉

<400>26

Met Glu Ser Gly Pro Met Pro Ala Gly Ile Pro Phe Pro Glu Tyr Tyr

1 5 10 15

Asp Phe Phe Met Asp Trp Lys Thr Pro Leu Ala Ile Ala Ala Thr Tyr

20 25 30

Thr Ala Ala Val Gly Leu Phe Asn Pro Lys Val Gly Lys Val Ser Arg

35 40 45

Val Val Ala Lys Ser Ala Asn Ala Lys Pro Ala Glu Arg Thr Gln Ser

50 55 60

Gly Ala Ala Met Thr Ala Phe Val Phe Val His Asn Leu Ile Leu Cys

65 70 75 80

Val Tyr Ser Gly Ile Thr Phe Tyr Tyr Met Phe Pro Ala Met Val Lys

85 90 95

Asn Phe Arg Thr His Thr Leu His Glu Ala Tyr Cys Asp Thr Asp Gln

100 105 110

Ser Leu Trp Asn Asn Ala Leu Gly Tyr Trp Gly Tyr Leu Phe Tyr Leu

115 120 125

Ser Lys Phe Tyr Glu Val Ile Asp Thr Ile Ile Ile Ile Leu Lys Gly

130 135 140

Arg Arg Ser Ser Leu Leu Gln Thr Tyr His His Ala Gly Ala Met Ile

145 150 155 160

Thr Met Trp Ser Gly Ile Asn Tyr Gln Ala Thr Pro Ile Trp Ile Phe

165 170 175

Val Val Phe Asn Ser Phe Ile His Thr Ile Met Tyr Cys Tyr Tyr Ala

180 185 190

Phe Thr Ser Ile Gly Phe His Pro Pro Gly Lys Lys Tyr Leu Thr Ser

195 200 205

Met Gln Ile Thr Gln Phe Leu Val Gly Ile Thr Ile Ala Val Ser Tyr

210 215 220

Leu Phe Val Pro Gly Cys Ile Arg Thr Pro Gly Ala Gln Met Ala Val

225 230 235 240

Trp Ile Asn Val Gly Tyr Leu Phe Pro Leu Thr Tyr Leu Phe Val Asp

245 250 255

Phe Ala Lys Arg Thr Tyr Ser Lys Arg Ser Ala Ile Ala Ala Gln Lys

260 265 270

Lys Ala Gln

275

<210>27

<211>8739

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>质粒pY116

<400>27

ggccgccacc gcggcccgag attccggcct cttcggccgc caagcgaccc gggtggacgt 60

ctagaggtac ctagcaatta acagatagtt tgccggtgat aattctctta acctcccaca 120

ctcctttgac ataacgattt atgtaacgaa actgaaattt gaccagatat tgtgtccgcg 180

gtggagctcc agcttttgtt ccctttagtg agggtttaaa cgagcttggc gtaatcatgg 240

tcatagctgt ttcctgtgtg aaattgttat ccgctcacaa ttccacacaa cgtacgagcc 300

ggaagcataa agtgtaaagc ctggggtgcc taatgagtga gctaactcac attaattgcg 360

ttgcgctcac tgcccgcttt ccagtcggga aacctgtcgt gccagctgca ttaatgaatc 420

ggccaacgcg cggggagagg cggtttgcgt attgggcgct cttccgcttc ctcgctcact 480

gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc aaaggcggta 540

atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc aaaaggccag 600

caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag gctccgcccc 660

cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc gacaggacta 720

taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt tccgaccctg 780

ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct ttctcatagc 840

tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg ctgtgtgcac 900

gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct tgagtccaac 960

ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat tagcagagcg 1020

aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg ctacactaga 1080

aggacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa aagagttggt 1140

agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt ttgcaagcag 1200

cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc tacggggtct 1260

gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt atcaaaaagg 1320

atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta aagtatatat 1380

gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc 1440

tgtctatttc gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg 1500

gagggcttac catctggccc cagtgctgca atgataccgc gagacccacg ctcaccggct 1560

ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg agcgcagaag tggtcctgca 1620

actttatccg cctccatcca gtctattaat tgttgccggg aagctagagt aagtagttcg 1680

ccagttaata gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctacag gcatcgtggt gtcacgctcg 1740

tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt tacatgatcc 1800

cccatgttgt gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt cagaagtaag 1860

ttggccgcag tgttatcact catggttatg gcagcactgc ataattctct tactgtcatg 1920

ccatccgtaa gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa ccaagtcatt ctgagaatag 1980

tgtatgcggc gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaatac gggataatac cgcgccacat 2040

agcagaactt taaaagtgct catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa actctcaagg 2100

atcttaccgc tgttgagatc cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa ctgatcttca 2160

gcatctttta ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca 2220

aaaaagggaa taagggcgac acggaaatgt tgaatactca tactcttcct ttttcaatat 2280

tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat acatatttga atgtatttag 2340

aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccacc tgacgcgccc 2400

tgtagcggcg cattaagcgc ggcgggtgtg gtggttacgc gcagcgtgac cgctacactt 2460

gccagcgccc tagcgcccgc tcctttcgct ttcttccctt cctttctcgc cacgttcgcc 2520

ggctttcccc gtcaagctct aaatcggggg ctccctttag ggttccgatt tagtgcttta 2580

cggcacctcg accccaaaaa acttgattag ggtgatggtt cacgtagtgg gccatcgccc 2640

tgatagacgg tttttcgccc tttgacgttg gagtccacgt tctttaatag tggactcttg 2700

ttccaaactg gaacaacact caaccctatc tcggtctatt cttttgattt ataagggatt 2760

ttgccgattt cggcctattg gttaaaaaat gagctgattt aacaaaaatt taacgcgaat 2820

tttaacaaaa tattaacgct tacaatttcc attcgccatt caggctgcgc aactgttggg 2880

aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg 2940

caaggcgatt aagttgggta acgccagggt tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg 3000

ccagtgaatt gtaatacgac tcactatagg gcgaattggg taccgggccc cccctcgagg 3060

tcgatggtgt cgataagctt gatatcgaat tcatgtcaca caaaccgatc ttcgcctcaa 3120

ggaaacctaa ttctacatcc gagagactgc cgagatccag tctacactga ttaattttcg 3180

ggccaataat ttaaaaaaat cgtgttatat aatattatat gtattatata tatacatcat 3240

gatgatactg acagtcatgt cccattgcta aatagacaga ctccatctgc cgcctccaac 3300

tgatgttctc aatatttaag gggtcatctc gcattgttta ataataaaca gactccatct 3360

accgcctcca aatgatgttc tcaaaatata ttgtatgaac ttatttttat tacttagtat 3420

tattagacaa cttacttgct ttatgaaaaa cacttcctat ttaggaaaca atttataatg 3480

gcagttcgtt catttaacaa tttatgtaga ataaatgtta taaatgcgta tgggaaatct 3540

taaatatgga tagcataaat gatatctgca ttgcctaatt cgaaatcaac agcaacgaaa 3600

aaaatccctt gtacaacata aatagtcatc gagaaatatc aactatcaaa gaacagctat 3660

tcacacgtta ctattgagat tattattgga cgagaatcac acactcaact gtctttctct 3720

cttctagaaa tacaggtaca agtatgtact attctcattg ttcatacttc tagtcatttc 3780

atcccacata ttccttggat ttctctccaa tgaatgacat tctatcttgc aaattcaaca 3840

attataataa gatataccaa agtagcggta tagtggcaat caaaaagctt ctctggtgtg 3900

cttctcgtat ttatttttat tctaatgatc cattaaaggt atatatttat ttcttgttat 3960

ataatccttt tgtttattac atgggctgga tacataaagg tattttgatt taattttttg 4020

cttaaattca atcccccctc gttcagtgtc aactgtaatg gtaggaaatt accatacttt 4080

tgaagaagca aaaaaaatga aagaaaaaaa aaatcgtatt tccaggttag acgttccgca 4140

gaatctagaa tgcggtatgc ggtacattgt tcttcgaacg taaaagttgc gctccctgag 4200

atattgtaca tttttgcttt tacaagtaca agtacatcgt acaactatgt actactgttg 4260

atgcatccac aacagtttgt tttgtttttt tttgtttttt ttttttctaa tgattcatta 4320

ccgctatgta tacctacttg tacttgtagt aagccgggtt attggcgttc aattaatcat 4380

agacttatga atctgcacgg tgtgcgctgc gagttacttt tagcttatgc atgctacttg 4440

ggtgtaatat tgggatctgt tcggaaatca acggatgctc aaccgatttc gacagtaatt 4500

aattaatttg aatcgaatcg gagcctaaaa tgaacccgag tatatctcat aaaattctcg 4560

gtgagaggtc tgtgactgtc agtacaaggt gccttcatta tgccctcaac cttaccatac 4620

ctcactgaat gtagtgtacc tctaaaaatg aaatacagtg ccaaaagcca aggcactgag 4680

ctcgtctaac ggacttgata tacaaccaat taaaacaaat gaaaagaaat acagttcttt 4740

gtatcatttg taacaattac cctgtacaaa ctaaggtatt gaaatcccac aatattccca 4800

aagtccaccc ctttccaaat tgtcatgcct acaactcata taccaagcac taacctacca 4860

aacaccacta aaaccccaca aaatatatct taccgaatat acagtaacaa gctaccacca 4920

cactcgttgg gtgcagtcgc cagcttaaag atatctatcc acatcagcca caactccctt 4980

cctttaataa accgactaca cccttggcta ttgaggttat gagtgaatat actgtagaca 5040

agacactttc aagaagactg tttccaaaac gtaccactgt cctccactac aaacacaccc 5100

aatctgcttc ttctagtcaa ggttgctaca ccggtaaatt ataaatcatc atttcattag 5160

cagggcaggg ccctttttat agagtcttat acactagcgg accctgccgg tagaccaacc 5220

cgcaggcgcg tcagtttgct ccttccatca atgcgtcgta gaaacgactt actccttctt 5280

gagcagctcc ttgaccttgt tggcaacaag tctccgacct cggaggtgga ggaagagcct 5340

ccgatatcgg cggtagtgat accagcctcg acggactcct tgacggcagc ctcaacagcg 5400

tcaccggcgg gcttcatgtt aagagagaac ttgagcatca tggcggcaga cagaatggtg 5460

gcaatggggt tgaccttctg cttgccgaga tcgggggcag atccgtgaca gggctcgtac 5520

agaccgaacg cctcgttggt gtcgggcaga gaagccagag aggcggaggg cagcagaccc 5580

agagaaccgg ggatgacgga ggcctcgtcg gagatgatat cgccaaacat gttggtggtg 5640

atgatgatac cattcatctt ggagggctgc ttgatgagga tcatggcggc cgagtcgatc 5700

agctggtggt tgagctcgag ctgggggaat tcgtccttga ggactcgagt gacagtcttt 5760

cgccaaagtc gagaggaggc cagcacgttg gccttgtcaa gagaccacac gggaagaggg 5820

gggttgtgct gaagggccag gaaggcggcc attcgggcaa ttcgctcaac ctcaggaacg 5880

gagtaggtct cggtgtcgga agcgacgcca gatccgtcat cctcctttcg ctctccaaag 5940

tagatacctc cgacgagctc tcggacaatg atgaagtcgg tgccctcaac gtttcggatg 6000

ggggagagat cggcgagctt gggcgacagc agctggcagg gtcgcaggtt ggcgtacagg 6060

ttcaggtcct ttcgcagctt gaggagaccc tgctcgggtc gcacgtcggt tcgtccgtcg 6120

ggagtggtcc atacggtgtt ggcagcgcct ccgacagcac cgagcataat agagtcagcc 6180

tttcggcaga tgtcgagagt agcgtcggtg atgggctcgc cctccttctc aatggcagct 6240

cctccaatga gtcggtcctc aaacacaaac tcggtgccgg aggcctcagc aacagacttg 6300

agcaccttga cggcctcggc aatcacctcg gggccacaga agtcgccgcc gagaagaaca 6360

atcttcttgg agtcagtctt ggtcttctta gtttcgggtt ccattgtgga tgtgtgtggt 6420

tgtatgtgtg atgtggtgtg tggagtgaaa atctgtggct ggcaaacgct cttgtatata 6480

tacgcacttt tgcccgtgct atgtggaaga ctaaacctcc gaagattgtg actcaggtag 6540

tgcggtatcg gctagggacc caaaccttgt cgatgccgat agcgctatcg aacgtacccc 6600

agccggccgg gagtatgtcg gaggggacat acgagatcgt caagggtttg tggccaactg 6660

gtatttaaat gtagctaacg gtagcaggcg aactactggt acatacctcc cccggaatat 6720

gtacaggcat aatgcgtatc tgtgggacat gtggtcgttg cgccattatg taagcagcgt 6780

gtactcctct gactgtccat atggtttgct ccatctcacc ctcatcgttt tcattgttca 6840

caggcggcca caaaaaaact gtcttctctc cttctctctt cgccttagtc tactcggacc 6900

agttttagtt tagcttggcg ccactggata aatgagacct caggccttgt gatgaggagg 6960

tcacttatga agcatgttag gaggtgcttg tatggataga gaagcaccca aaataataag 7020

aataataata aaacaggggg cgttgtcatt tcatatcgtg ttttcaccat caatacacct 7080

ccaaacaatg cccttcatgt ggccagcccc aatattgtcc tgtagttcaa ctctatgcag 7140

ctcgtatctt attgagcaag taaaactctg tcagccgata ttgcccgacc cgcgacaagg 7200

gtcaacaagg tggtgtaagg ccttcgcaga agtcaaaact gtgccaaaca aacatctaga 7260

gtctctttgg tgtttctcgc atatatttwa tcggctgtct tacgtatttg cgcctcggta 7320

ccggactaat ttcggatcat ccccaatacg ctttttcttc gcagctgtca acagtgtcca 7380

tgatctatcc acctaaatgg gtcatatgag gcgtataatt tcgtggtgct gataataatt 7440

cccatatatt tgacacaaaa cttccccccc tagacataca tctcacaatc tcacttcttg 7500

tgcttctgtc acacatctcc tccagctgac ttcaactcac acctctgccc cagttggtct 7560

acagcggtat aaggtttctc cgcatagagg tgcaccactc ctcccgatac ttgtttgtgt 7620

gacttgtggg tcacgacata tatatctaca cacattgcgc caccctttgg ttcttccagc 7680

acaacaaaaa cacgacacgc taaccatggc caatttactg accgtacacc aaaatttgcc 7740

tgcattaccg gtcgatgcaa cgagtgatga ggttcgcaag aacctgatgg acatgttcag 7800

ggatcgccag gcgttttctg agcatacctg gaaaatgctt ctgtccgttt gccggtcgtg 7860

ggcggcatgg tgcaagttga ataaccggaa atggtttccc gcagaacctg aagatgttcg 7920

cgattatctt ctatatcttc aggcgcgcgg tctggcagta aaaactatcc agcaacattt 7980

gggccagcta aacatgcttc atcgtcggtc cgggctgcca cgaccaagtg acagcaatgc 8040

tgtttcactg gttatgcggc ggatccgaaa agaaaacgtt gatgccggtg aacgtgcaaa 8100

acaggctcta gcgttcgaac gcactgattt cgaccaggtt cgttcactca tggaaaatag 8160

cgatcgctgc caggatatac gtaatctggc atttctgggg attgcttata acaccctgtt 8220

acgtatagcc gaaattgcca ggatcagggt taaagatatc tcacgtactg acggtgggag 8280

aatgttaatc catattggca gaacgaaaac gctggttagc accgcaggtg tagagaaggc 8340

acttagcctg ggggtaacta aactggtcga gcgatggatt tccgtctctg gtgtagctga 8400

tgatccgaat aactacctgt tttgccgggt cagaaaaaat ggtgttgccg cgccatctgc 8460

caccagccag ctatcaactc gcgccctgga agggattttt gaagcaactc atcgattgat 8520

ttacggcgct aaggatgact ctggtcagag atacctggcc tggtctggac acagtgcccg 8580

tgtcggagcc gcgcgagata tggcccgcgc tggagtttca ataccggaga tcatgcaagc 8640

tggtggctgg accaatgtaa atattgtcat gaactatatc cgtaacctgg atagtgaaac 8700

aggggcaatg gtgcgcctgc tggaagatgg cgattaagc 8739

<210>28

<211>15304

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>质粒pK02UF8289

<220>

<221>其它特征

<222>(5601)..(5601)

<223>n为a、c、g或t

<220>

<221>其它特征

<222>(5606)..(5609)

<223>n为a、c、g或t

<400>28

cgatcgagga agaggacaag cggctgcttc ttaagtttgt gacatcagta tccaaggcac 60

cattgcaagg attcaaggct ttgaacccgt catttgccat tcgtaacgct ggtagacagg 120

ttgatcggtt ccctacggcc tccacctgtg tcaatcttct caagctgcct gactatcagg 180

acattgatca acttcggaag aaacttttgt atgccattcg atcacatgct ggtttcgatt 240

tgtcttagag gaacgcatat acagtaatca tagagaataa acgatattca tttattaaag 300

tagatagttg aggtagaagt tgtaaagagt gataaatagc ggccgctcac tgaatctttt 360

tggctccctt gtgcttcctg acgatatacg tttgcacata gaaattcaag aacaaacaca 420

agactgtgcc aacataaaag taattgaaga accagccaaa catcctcatc ccatcttggc 480

gataacaggg aatgttcctg tacttccaga caatgtagaa accaacattg aattgaatga 540

tctgcattga tgtaatcagg gattttggca tggggaactt cagcttgatc aatctggtcc 600

aataataacc gtacatgatc cagtggatga aaccattcaa cagcacaaaa atccaaacag 660

cttcatttcg gtaattatag aacagccaca tatccatcgg tgcccccaaa tgatggaaga 720

attgcaacca ggtcagaggc ttgcccatca gtggcaaata gaaggagtca atatactcca 780

ggaacttgct caaatagaac aactgcgtgg tgatcctgaa gacgttgttg tcaaaagcct 840

tctcgcagtt gtcagacata acaccgatgg tgtacatggc atatgccatt gagaggaatg 900

atcccaacga ataaatggac atgagaaggt tgtaattggt gaaaacaaac ttcatacgag 960

actgaccttt tggaccaagg gggccaagag tgaacttcaa gatgacaaat gcgatggaca 1020

agtaaagcac ctcacagtga ctggcatcac tccagagttg ggcataatca actggttggg 1080

taaaacttcc tgcccaattg agactatttc attcaccacc tccatggtta gcgtgtcgtg 1140

tttttgttgt gctggaagaa ccaaagggtg gcgcaatgtg tgtagatata tatgtcgtga 1200

cccacaagtc acacaaacaa gtatcgggag gagtggtgca cctctatgcg gagaaacctt 1260

ataccgctgt agaccaactg gggcagaggt gtgagttgaa gtcagctgga ggagatgtgt 1320

gacagaagca caagaagtga gattgtgaga tgtatgtcta gggggggaag ttttgtgtca 1380

aatatatggg aattattatc agcaccacga aattatacgc ctcatatgac ccatttaggt 1440

ggatagatca tggacactgt tgacagctgc gaagaaaaag cgtattgggg atgatccgaa 1500

attagtccgg taccgaggcg caaatacgta agacagccga twaaatatat gcgagaaaca 1560

ccaaagagac tctagatgtt tgtttggcac agttttgact tctgcgaagg ccttacacca 1620

ccttgttgac ccttgtcgcg ggtcgggcaa tatcggctga cagagtttta cttgctcaat 1680

aagatacgag ctgcatagag ttgaactaca ggacaatatt ggggctggcc acatgaaggg 1740

cattgtttgg aggtgtattg atggtgaaaa cacgatatga aatgacaacg ccccctgttt 1800

tattattatt cttattattt tgggtgcttc tctatccata caagcacctc ctaacatgct 1860

tcataagtga cctcctcatc acaaggcctg aggtctcatt tatccagtgg cgccaagcta 1920

aactaaaact ggtccgagta gactaaggcg aagagagaag gagagaagac agtttttttg 1980

tggccgcctg tgaacaatga aaacgatgag ggtgagatgg agcaaaccat atggtttaaa 2040

cagtcagagg agtacacgct gcttacataa tggcgcaacg accacatgtc ccacagatac 2100

gcatcgattc gattcaaatt aattaaaagg cgttgaaaca gaatgagcca gacagcaagg 2160

acaaggtggc caacagcaag gagtccaaaa agccctctat tgacgagatc cacgatgtta 2220

ttgctcatga ggtttccgag ctcgatgctg ggaagaagaa gtgatttgta tataagaaat 2280

aaatgagata tagtaaagga gtgcaagaga atggcaaggt ggtcaaattc tatattactt 2340

gcagtcactg gttcctcgtt gacatgaatg aagttaccgt tggcatagct gatttaatat 2400

ataactgtcc aactaactct cacctagata taacccatgt gtgtgtttcc aatcatcaat 2460

gcggccgctt actgagcctt ggcaccgggc tgcttctcgg ccattcgagc gaactgggac 2520

aggtatcgga gcaggatgac gagaccttca tggggcagag ggtttcggta ggggaggttg 2580

tgcttctggc acagctgttc cacctggtag gaaacggcag tgaggttgtg tcgaggcagg 2640

gtgggccaga gatggtgctc gatctggtag ttcaggcctc caaagaacca gtcagtaatg 2700

atgcctcgtc gaatgttcat ggtctcatgg atctgaccca cagagaagcc atgtccgtcc 2760

cagacggaat caccgatctt ctccagaggg tagtggttca tgaagaccac gatggcaatt 2820

ccgaagccac cgacgagctc ggaaacaaag aacaccagca tcgaggtcag gatggagggc 2880

ataaagaaga ggtggaacag ggtcttgaga gtccagtgca gagcgagtcc aatggcctct 2940

ttcttgtact gagatcggta gaactggttg tctcggtcct tgagggatcg aacggtcagc 3000

acagactgga aacaccagat gaatcgcagg agaatacaga tgaccaggaa atagtactgt 3060

tggaactgaa tgagctttcg ggagatggga gaagctcgag tgacatcgtc ctcggaccag 3120

gcgagcagag gcaggttatc aatgtcggga tcgtgaccct gaacgttggt agcagaatga 3180

tgggcgttgt gtctgtcctt ccaccaggtc acggagaagc cctggagtcc gttgccaaag 3240

accagaccca ggacgttatt ccagtttcgg ttcttgaagg tctggtggtg gcagatgtca 3300

tgagacagcc atcccatttg ctggtagtgc ataccgagca cgagagcacc aatgaagtac 3360

aggtggtact ggaccagcat gaagaaggca agcacgccaa gacccagggt ggtcaagatc 3420

ttgtacgagt accagagggg agaggcgtca aacatgccag tggcgatcag ctcttctcgg 3480

agctttcgga aatcctcctg agcttcgttg acggcagcct ggggaggcag ctcggaagcc 3540

tggttgatct tgggcattcg cttgagcttg tcgaaggctt cctgagagtg cataaccatg 3600

aaggcgtcag tagcatctcg tccctggtag ttctcaatga tttcagctcc accagggtgg 3660

aagttcaccc aagcggagac gtcgtacacc tttccgtcga tgacgagggg cagagcctgt 3720

cgagaagcct tcaccatggc cattgctgta gatatgtctt gtgtgtaagg gggttggggt 3780

ggttgtttgt gttcttgact tttgtgttag caagggaaga cgggcaaaaa agtgagtgtg 3840

gttgggaggg agagacgagc cttatatata atgcttgttt gtgtttgtgc aagtggacgc 3900

cgaaacgggc aggagccaaa ctaaacaagg cagacaatgc gagcttaatt ggattgcctg 3960

atgggcaggg gttagggctc gatcaatggg ggtgcgaagt gacaaaattg ggaattaggt 4020

tcgcaagcaa ggctgacaag actttggccc aaacatttgt acgcggtgga caacaggagc 4080

cacccatcgt ctgtcacggg ctagccggtc gtgcgtcctg tcaggctcca cctaggctcc 4140

atgccactcc atacaatccc actagtgtac cgctaggccg cttttagctc ccatctaaga 4200

cccccccaaa acctccactg tacagtgcac tgtactgtgt ggcgatcaag ggcaagggaa 4260

aaaaggcgca aacatgcacg catggaatga cgtaggtaag gcgttactag actgaaaagt 4320

ggcacatttc ggcgtgccaa agggtcctag gtgcgtttcg cgagctgggc gccaggccaa 4380

gccgctccaa aacgcctctc cgactccctc cagcggcctc catatcccca tccctctcca 4440

cagcaatgtt gttaagcctt gcaaacgaaa aaatagaaag gctaataagc ttccaatatt 4500

gtggtgtacg ctgcataacg caacaatgag cgccaaacaa cacacacaca cagcacacag 4560

cagcattaac cacgatgttt aaacagtgta cgcagatccc gtcaacagtt ttatatatcg 4620

tagttacaac catcaacact ttttggtaag tgtaccattc tatactccaa ctggtctgca 4680

actgtacaag tagacatgtt aatggtagtt aataacatct acagcagaac ctatggtaaa 4740

gacattgcat ttttacagga agtatcgtcc tacacgttga taaatccaaa gatgcggaac 4800

ttcttccact tttatcatca tcccctactc gtacactcgt actctttgtt cgatcgcgat 4860

tcatttctat aaataatctt gtatgtacat gcggccgcgc ctacttaagc aacgggcttg 4920

ataacagcgg ggggggtgcc cacgttgttg cggttgcgga agaacagaac acccttacca 4980

gcaccctcgg caccagcgct gggctcaacc cactggcaca tacgcgcact gcggtacatg 5040

gcgcggatga agccacgagg accatcctgg acatcagccc ggtagtgctt gcccatgatg 5100

ggcttaatgg cctcggtggc ctcgtccgcg ttgtagaagg ggatgctgct gacgtagtgg 5160

tggaggacat gagtctcgat gatgccgtgg agaaggtggc ggccgatgaa gcccatctca 5220

cggtcaatgg tagcagcggc accacggacg aagttccact cgtcgttggt gtagtgggga 5280

agggtagggt cggtgtgctg gaggaaggtg atggcaacga gccagtggtt aacccagagg 5340

tagggaacaa agtaccagat ggccatgttg tagaaaccga acttctgaac gaggaagtac 5400

agagcagtgg ccatcagacc gataccaata tcgctgagga cgatgagctt agcgtcactg 5460

ttctcgtaca gagggctgcg gggatcgaag tggttaacac caccgccgag gccgttatgc 5520

ttgcccttgc cgcgaccctc acgctggcgc tcgtggtagt tgtggccggt aacattggtg 5580

atgaggtagt tgggccagcc nacgannnnc tcagtaagat gagcgagctc gtgggtcatc 5640

tttccgagac gagtagcctg ctgctcgcgg gttcggggaa cgaagaccat gtcacgctcc 5700

atgttgccag tggccttgtg gtgctttcgg tgggagattt gccagctgaa gtaggggaca 5760

aggagggaag agtgaagaac ccagccagta atgtcgttga tgatgcgaga atcggagaaa 5820

gcaccgtgac cgcactcatg ggcaataacc cagagaccag taccgaaaag accctgaaga 5880

acggtgtaca cggcccacag accagcgcgg gcgggggtgg aggggatata ttcgggggtc 5940

acaaagttgt accagatgct gaaagtggta gtcaggagga caatgtcgcg gaggatataa 6000

ccgtatccct tgagagcgga gcgcttgaag cagtgcttag ggatggcatt gtagatgtcc 6060

ttgatggtaa agtcgggaac ctcgaactgg ttgccgtagg tgtcgagcat gacaccatac 6120

tcggacttgg gcttggcgat atcaacctcg gacatggacg agagcgatgt ggaagaggcc 6180

gagtggcggg gagagtctga aggagagacg gcggcagact cagaatccgt cacagtagtt 6240

gaggtgacgg tgcgtctaag cgcagggttc tgcttgggca gagccgaagt ggacgccatg 6300

gttgtgaatt agggtggtga gaatggttgg ttgtagggaa gaatcaaagg ccggtctcgg 6360

gatccgtggg tatatatata tatatatata tatacgatcc ttcgttacct ccctgttctc 6420

aaaactgtgg tttttcgttt ttcgtttttt gctttttttg atttttttag ggccaactaa 6480

gcttccagat ttcgctaatc acctttgtac taattacaag aaaggaagaa gctgattaga 6540

gttgggcttt ttatgcaact gtgctactcc ttatctctga tatgaaagtg tagacccaat 6600

cacatcatgt catttagagt tggtaatact gggaggatag ataaggcacg aaaacgagcc 6660

atagcagaca tgctgggtgt agccaagcag aagaaagtag atgggagcca attgacgagc 6720

gagggagcta cgccaatccg acatacgaca cgctgagatc gtcttggccg gggggtacct 6780

acagatgtcc aagggtaagt gcttgactgt aattgtatgt ctgaggacaa atatgtagtc 6840

agccgtataa agtcatacca ggcaccagtg ccatcatcga accactaact ctctatgata 6900

catgcctccg gtattattgt accatgcgtc gctttgttac atacgtatct tgcctttttc 6960

tctcagaaac tccagacttt ggctattggt cgagataagc ccggaccata gtgagtcttt 7020

cacactctac atttctccct tgctccaact atttaaattg ccccggagaa gacggccagg 7080

ccgcctagat gacaaattca acaactcaca gctgactttc tgccattgcc actagggggg 7140

ggccttttta tatggccaag ccaagctctc cacgtcggtt gggctgcacc caacaataaa 7200

tgggtagggt tgcaccaaca aagggatggg atggggggta gaagatacga ggataacggg 7260

gctcaatggc acaaataaga acgaatactg ccattaagac tcgtgatcca gcgactgaca 7320

ccattgcatc atctaagggc ctcaaaacta cctcggaact gctgcgctga tctggacacc 7380

acagaggttc cgagcacttt aggttgcacc aaatgtccca ccaggtgcag gcagaaaacg 7440

ctggaacagc gtgtacagtt tgtcttaaca aaaagtgagg gcgctgaggt cgagcagggt 7500

ggtgtgactt gttatagcct ttagagctgc gaaagcgcgt atggatttgg ctcatcaggc 7560

cagattgagg gtctgtggac acatgtcatg ttagtgtact tcaatcgccc cctggatata 7620

gccccgacaa taggccgtgg cctcattttt ttgccttccg cacatttcca ttgctcggta 7680

cccacacctt gcttctcctg cacttgccaa ccttaatact ggtttacatt gaccaacatc 7740

ttacaagcgg ggggcttgtc tagggtatat ataaacagtg gctctcccaa tcggttgcca 7800

gtctcttttt tcctttcttt ccccacagat tcgaaatcta aactacacat cacagaattc 7860

cgagccgtga gtatccacga caagatcagt gtcgagacga cgcgttttgt gtaatgacac 7920

aatccgaaag tcgctagcaa cacacactct ctacacaaac taacccagct ctggtaccat 7980

ggtgaaggct tctcgacagg ctctgcccct cgtcatcgac ggaaaggtgt acgacgtctc 8040

cgcttgggtg aacttccacc ctggtggagc tgaaatcatt gagaactacc agggacgaga 8100

tgctactgac gccttcatgg ttatgcactc tcaggaagcc ttcgacaagc tcaagcgaat 8160

gcccaagatc aaccaggctt ccgagctgcc tccccaggct gccgtcaacg aagctcagga 8220

ggatttccga aagctccgag aagagctgat cgccactggc atgtttgacg cctctcccct 8280

ctggtactcg tacaagatct tgaccaccct gggtcttggc gtgcttgcct tcttcatgct 8340

ggtccagtac cacctgtact tcattggtgc tctcgtgctc ggtatgcact accagcaaat 8400

gggatggctg tctcatgaca tctgccacca ccagaccttc aagaaccgaa actggaataa 8460

cgtcctgggt ctggtctttg gcaacggact ccagggcttc tccgtgacct ggtggaagga 8520

cagacacaac gcccatcatt ctgctaccaa cgttcagggt cacgatcccg acattgataa 8580

cctgcctctg ctcgcctggt ccgaggacga tgtcactcga gcttctccca tctcccgaaa 8640

gctcattcag ttccaacagt actatttcct ggtcatctgt attctcctgc gattcatctg 8700

gtgtttccag tctgtgctga ccgttcgatc cctcaaggac cgagacaacc agttctaccg 8760

atctcagtac aagaaagagg ccattggact cgctctgcac tggactctca agaccctgtt 8820

ccacctcttc tttatgccct ccatcctgac ctcgatgctg gtgttctttg tttccgagct 8880

cgtcggtggc ttcggaattg ccatcgtggt cttcatgaac cactaccctc tggagaagat 8940

cggtgattcc gtctgggacg gacatggctt ctctgtgggt cagatccatg agaccatgaa 9000

cattcgacga ggcatcatta ctgactggtt ctttggaggc ctgaactacc agatcgagca 9060

ccatctctgg cccaccctgc ctcgacacaa cctcactgcc gtttcctacc aggtggaaca 9120

gctgtgccag aagcacaacc tcccctaccg aaaccctctg ccccatgaag gtctcgtcat 9180

cctgctccga tacctgtccc agttcgctcg aatggccgag aagcagcccg gtgccaaggc 9240

tcagtaagcg gccgcaagtg tggatgggga agtgagtgcc cggttctgtg tgcacaattg 9300

gcaatccaag atggatggat tcaacacagg gatatagcga gctacgtggt ggtgcgagga 9360

tatagcaacg gatatttatg tttgacactt gagaatgtac gatacaagca ctgtccaagt 9420

acaatactaa acatactgta catactcata ctcgtacccg ggcaacggtt tcacttgagt 9480

gcagtggcta gtgctcttac tcgtacagtg tgcaatactg cgtatcatag tctttgatgt 9540

atatcgtatt cattcatgtt agttgcgtac gggtgaagct tccactggtc ggcgtggtag 9600

tggggcagag tggggtcggt gtgctgcagg taggtgatgg ccacgagcca gtggttgacc 9660

cacaggtagg ggatcaggta gtagagggtg acggaagcca ggccccatcg gttgatggag 9720

tatgcgatga cggacatggt gataccaata ccgacgttag agatccagat gttgaaccag 9780

tccttcttct caaacagcgg ggcgttgggg ttgaagtggt tgacagccca tttgttgagc 9840

ttggggtact tctgtccggt aacgtaagac agcagataca gaggccatcc aaacacctgc 9900

tgggtgatga ggccgtagag ggtcatgagg ggagcgtcct cagcaagctc agaccagtca 9960

tgggcgcctc ggttctccat aaactccttt cggtccttgg gcacaaacac catatcacgg 10020

gtgaggtgac cagtggactt gtggtgcatg gagtgggtca gcttccaggc gtagtaaggg 10080

accagcatgg aggagtgcag aacccatccg gtgacgttgt tgacggtgtt agagtcggag 10140

aaagcagagt ggccacactc gtgggcaaga acccacagac cggtgccaaa cagaccctgg 10200

acaatggagt acatggccca ggccacagct cggccggaag ccgagggaat aagaggcagg 10260

tacgcgtagg ccatgtaggc aaaaacggcg ataaagaagc aggcgcgcca gctgcattaa 10320

tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc cgcttcctcg 10380

ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag 10440

gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa 10500

ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc 10560

cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca 10620

ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg 10680

accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct 10740

catagctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt 10800

gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag 10860

tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc 10920

agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac 10980

actagaagaa cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga 11040

gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc 11100

aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg 11160

gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gagattatca 11220

aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt 11280

atatatgagt aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca 11340

gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg 11400

atacgggagg gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca 11460

ccggctccag atttatcagc aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt 11520

cctgcaactt tatccgcctc catccagtct attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt 11580

agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg ctacaggcat cgtggtgtca 11640

cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca 11700

tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga 11760

agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag cactgcataa ttctcttact 11820

gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa gtcattctga 11880

gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt caatacggga taataccgcg 11940

ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc 12000

tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga 12060

tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat 12120

gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact cttccttttt 12180

caatattatt gaagcattta tcagggttat tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt 12240

atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc cccgaaaagt gccacctgat 12300

gcggtgtgaa ataccgcaca gatgcgtaag gagaaaatac cgcatcagga aattgtaagc 12360

gttaatattt tgttaaaatt cgcgttaaat ttttgttaaa tcagctcatt ttttaaccaa 12420

taggccgaaa tcggcaaaat cccttataaa tcaaaagaat agaccgagat agggttgagt 12480

gttgttccag tttggaacaa gagtccacta ttaaagaacg tggactccaa cgtcaaaggg 12540

cgaaaaaccg tctatcaggg cgatggccca ctacgtgaac catcacccta atcaagtttt 12600

ttggggtcga ggtgccgtaa agcactaaat cggaacccta aagggagccc ccgatttaga 12660

gcttgacggg gaaagccggc gaacgtggcg agaaaggaag ggaagaaagc gaaaggagcg 12720

ggcgctaggg cgctggcaag tgtagcggtc acgctgcgcg taaccaccac acccgccgcg 12780

cttaatgcgc cgctacaggg cgcgtccatt cgccattcag gctgcgcaac tgttgggaag 12840

ggcgatcggt gcgggcctct tcgctattac gccagctggc gaaaggggga tgtgctgcaa 12900

ggcgattaag ttgggtaacg ccagggtttt cccagtcacg acgttgtaaa acgacggcca 12960

gtgaattgta atacgactca ctatagggcg aattgggccc gacgtcgcat gcttgaatct 13020

acaagtagga gggttggagt gattaagtga aacttcttta acggctctat gccagttcta 13080

ttgatatccg aaacatcagt atgaaggtct gataagggtg acttcttccc acagattcgt 13140

atcagtacga gtacgagacc ggtacttgta acagtattga tactaaaggg aaactacaac 13200

ggttgtcagc gtaatgtgac ttcgcccatg aacgcagaca cgcagtgccg agtgcggtga 13260

tatcgcctac tcgttacgtc catggactac acaacccctc ggcttcgctt ggcttagcct 13320

cgggctcggt gctgttcagt taaaacacaa tcaaataaca tttctacttt ttagaaggca 13380

ggccgtcagg agcaactccg actccattga cgtttctaaa catctgaatg ccttccttac 13440

cttcaacaaa ctggcaggtt cgggcgacag tgtaaagaga cttgatgaag ttggtgtcgt 13500

cgtgtcggta gtgcttgccc atgaccttct tgatcttctc agtggcgatt cgggcgttgt 13560

agaagggaat tcctttacct gcaggataac ttcgtataat gtatgctata cgaagttatg 13620

atctctctct tgagcttttc cataacaagt tcttctgcct ccaggaagtc catgggtggt 13680

ttgatcatgg ttttggtgta gtggtagtgc agtggtggta ttgtgactgg ggatgtagtt 13740

gagaataagt catacacaag tcagctttct tcgagcctca tataagtata agtagttcaa 13800

cgtattagca ctgtacccag catctccgta tcgagaaaca caacaacatg ccccattgga 13860

cagatcatgc ggatacacag gttgtgcagt atcatacata ctcgatcaga caggtcgtct 13920

gaccatcata caagctgaac aagcgctcca tacttgcacg ctctctatat acacagttaa 13980

attacatatc catagtctaa cctctaacag ttaatcttct ggtaagcctc ccagccagcc 14040

ttctggtatc gcttggcctc ctcaatagga tctcggttct ggccgtacag acctcggccg 14100

acaattatga tatccgttcc ggtagacatg acatcctcaa cagttcggta ctgctgtccg 14160

agagcgtctc ccttgtcgtc aagacccacc ccgggggtca gaataagcca gtcctcagag 14220

tcgcccttag gtcggttctg ggcaatgaag ccaaccacaa actcggggtc ggatcgggca 14280

agctcaatgg tctgcttgga gtactcgcca gtggccagag agcccttgca agacagctcg 14340

gccagcatga gcagacctct ggccagcttc tcgttgggag aggggactag gaactccttg 14400

tactgggagt tctcgtagtc agagacgtcc tccttcttct gttcagagac agtttcctcg 14460

gcaccagctc gcaggccagc aatgattccg gttccgggta caccgtgggc gttggtgata 14520

tcggaccact cggcgattcg gtgacaccgg tactggtgct tgacagtgtt gccaatatct 14580

gcgaactttc tgtcctcgaa caggaagaaa ccgtgcttaa gagcaagttc cttgaggggg 14640

agcacagtgc cggcgtaggt gaagtcgtca atgatgtcga tatgggtttt gatcatgcac 14700

acataaggtc cgaccttatc ggcaagctca atgagctcct tggtggtggt aacatccaga 14760

gaagcacaca ggttggtttt cttggctgcc acgagcttga gcactcgagc ggcaaaggcg 14820

gacttgtgga cgttagctcg agcttcgtag gagggcattt tggtggtgaa gaggagactg 14880

aaataaattt agtctgcaga actttttatc ggaaccttat ctggggcagt gaagtatatg 14940

ttatggtaat agttacgagt tagttgaact tatagataga ctggactata cggctatcgg 15000

tccaaattag aaagaacgtc aatggctctc tgggcgtcgc ctttgccgac aaaaatgtga 15060

tcatgatgaa agccagcaat gacgttgcag ctgatattgt tgtcggccaa ccgcgccgaa 15120

aacgcagctg tcagacccac agcctccaac gaagaatgta tcgtcaaagt gatccaagca 15180

cactcatagt tggagtcgta ctccaaaggc ggcaatgacg agtcagacag atactcgtcg 15240

acgcgataac ttcgtataat gtatgctata cgaagttatc gtacgatagt tagtagacaa 15300

caat 15304

<210>29

<211>1272

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>突变EgD8S-23

<220>

<221>其它特征

<222>(2)..(1270)

<223>突变EgD8S-23Δ-8去饱和酶CDS

<400>29

catggtgaag gcttctcgac aggctctgcc cctcgtcatc gacggaaagg tgtacgacgt 60

ctccgcttgg gtgaacttcc accctggtgg agctgaaatc attgagaact accagggacg 120

agatgctact gacgccttca tggttatgca ctctcaggaa gccttcgaca agctcaagcg 180

aatgcccaag atcaaccagg cttccgagct gcctccccag gctgccgtca acgaagctca 240

ggaggatttc cgaaagctcc gagaagagct gatcgccact ggcatgtttg acgcctctcc 300

cctctggtac tcgtacaaga tcttgaccac cctgggtctt ggcgtgcttg ccttcttcat 360

gctggtccag taccacctgt acttcattgg tgctctcgtg ctcggtatgc actaccagca 420

aatgggatgg ctgtctcatg acatctgcca ccaccagacc ttcaagaacc gaaactggaa 480

taacgtcctg ggtctggtct ttggcaacgg actccagggc ttctccgtga cctggtggaa 540

ggacagacac aacgcccatc attctgctac caacgttcag ggtcacgatc ccgacattga 600

taacctgcct ctgctcgcct ggtccgagga cgatgtcact cgagcttctc ccatctcccg 660

aaagctcatt cagttccaac agtactattt cctggtcatc tgtattctcc tgcgattcat 720

ctggtgtttc cagtctgtgc tgaccgttcg atccctcaag gaccgagaca accagttcta 780

ccgatctcag tacaagaaag aggccattgg actcgctctg cactggactc tcaagaccct 840

gttccacctc ttctttatgc cctccatcct gacctcgatg ctggtgttct ttgtttccga 900

gctcgtcggt ggcttcggaa ttgccatcgt ggtcttcatg aaccactacc ctctggagaa 960

gatcggtgat tccgtctggg acggacatgg cttctctgtg ggtcagatcc atgagaccat 1020

gaacattcga cgaggcatca ttactgactg gttctttgga ggcctgaact accagatcga 1080

gcaccatctc tggcccaccc tgcctcgaca caacctcact gccgtttcct accaggtgga 1140

acagctgtgc cagaagcaca acctccccta ccgaaaccct ctgccccatg aaggtctcgt 1200

catcctgctc cgatacctgt cccagttcgc tcgaatggcc gagaagcagc ccggtgccaa 1260

ggctcagtaa gc 1272

<210>30

<211>422

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>突变EgD8S-23，其含有M1、M2、M3、M8、M12、M15、M16、M18、M21、M26、M45、

M46、M68和M70突变位点

<400>30

Met Val Lys Ala Ser Arg Gln Ala Leu Pro Leu Val Ile Asp Gly Lys

1 5 10 15

Val Tyr Asp Val Ser Ala Trp Val Asn Phe His Pro Gly Gly Ala Glu

20 25 30

Ile Ile Glu Asn Tyr Gln Gly Arg Asp Ala Thr Asp Ala Phe Met Val

35 40 45

Met His Ser Gln Glu Ala Phe Asp Lys Leu Lys Arg Met Pro Lys Ile

50 55 60

Asn Gln Ala Ser Glu Leu Pro Pro Gln Ala Ala Val Asn Glu Ala Gln

65 70 75 80

Glu Asp Phe Arg Lys Leu Arg Glu Glu Leu Ile Ala Thr Gly Met Phe

85 90 95

Asp Ala Ser Pro Leu Trp Tyr Ser Tyr Lys Ile Leu Thr Thr Leu Gly

100 105 110

Leu Gly Val Leu Ala Phe Phe Met Leu Val Gln Tyr His Leu Tyr Phe

115 120 125

Ile Gly Ala Leu Val Leu Gly Met His Tyr Gln Gln Met Gly Trp Leu

130 135 140

Ser His Asp Ile Cys His His Gln Thr Phe Lys Asn Arg Asn Trp Asn

145 150 155 160

Asn Val Leu Gly Leu Val Phe Gly Asn Gly Leu Gln Gly Phe Ser Val

165 170 175

Thr Trp Trp Lys Asp Arg His Asn Ala His His Ser Ala Thr Asn Val

180 185 190

Gln Gly His Asp Pro Asp Ile Asp Asn Leu Pro Leu Leu Ala Trp Ser

195 200 205

Glu Asp Asp Val Thr Arg Ala Ser Pro Ile Ser Arg Lys Leu Ile Gln

210 215 220

Phe Gln Gln Tyr Tyr Phe Leu Val Ile Cys Ile Leu Leu Arg Phe Ile

225 230 235 240

Trp Cys Phe Gln Ser Val Leu Thr Val Arg Ser Leu Lys Asp Arg Asp

245 250 255

Asn Gln Phe Tyr Arg Ser Gln Tyr Lys Lys Glu Ala Ile Gly Leu Ala

260 265 270

Leu His Trp Thr Leu Lys Thr Leu Phe His Leu Phe Phe Met Pro Ser

275 280 285

Ile Leu Thr Ser Met Leu Val Phe Phe Val Ser Glu Leu Val Gly Gly

290 295 300

Phe Gly Ile Ala Ile Val Val Phe Met Asn His Tyr Pro Leu Glu Lys

305 310 315 320

Ile Gly Asp Ser Val Trp Asp Gly His Gly Phe Ser Val Gly Gln Ile

325 330 335

His Glu Thr Met Asn Ile Arg Arg Gly Ile Ile Thr Asp Trp Phe Phe

340 345 350

Gly Gly Leu Asn Tyr Gln Ile Glu His His Leu Trp Pro Thr Leu Pro

355 360 365

Arg His Asn Leu Thr Ala Val Ser Tyr Gln Val Glu Gln Leu Cys Gln

370 375 380

Lys His Asn Leu Pro Tyr Arg Asn Pro Leu Pro His Glu Gly Leu Val

385 390 395 400

Ile Leu Leu Arg Tyr Leu Ser Gln Phe Ala Arg Met Ala Glu Lys Gln

405 410 415

Pro Gly Ala Lys Ala Gln

420

<210>31

<211>777

<212>DNA

<213>纤细裸藻

<220>

<221>其它特征

<223>Δ-9延长酶

<400>31

atggaggtgg tgaatgaaat agtctcaatt gggcaggaag ttttacccaa agttgattat 60

gcccaactct ggagtgatgc cagtcactgt gaggtgcttt acttgtccat cgcatttgtc 120

atcttgaagt tcactcttgg cccccttggt ccaaaaggtc agtctcgtat gaagtttgtt 180

ttcaccaatt acaaccttct catgtccatt tattcgttgg gatcattcct ctcaatggca 240

tatgccatgt acaccatcgg tgttatgtct gacaactgcg agaaggcttt tgacaacaac 300

gtcttcagga tcaccacgca gttgttctat ttgagcaagt tcctggagta tattgactcc 360

ttctatttgc cactgatggg caagcctctg acctggttgc aattcttcca tcatttgggg 420

gcaccgatgg atatgtggct gttctataat taccgaaatg aagctgtttg gatttttgtg 480

ctgttgaatg gtttcatcca ctggatcatg tacggttatt attggaccag attgatcaag 540

ctgaagttcc ccatgccaaa atccctgatt acatcaatgc agatcattca attcaatgtt 600

ggtttctaca ttgtctggaa gtacaggaac attccctgtt atcgccaaga tgggatgagg 660

atgtttggct ggttcttcaa ttacttttat gttggcacag tcttgtgttt gttcttgaat 720

ttctatgtgc aaacgtatat cgtcaggaag cacaagggag ccaaaaagat tcagtga 777

<210>32

<211>13707

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>质粒pZKSL-555R

<400>32

aaacagtgta cgcagatctg cccatgatgg gggctcccac caccagcaat cagggccctg 60

attacacacc cacctgtaat gtcatgctgt tcatcgtggt taatgctgct gtgtgctgtg 120

tgtgtgtgtt gtttggcgct cattgttgcg ttatgcagcg tacaccacaa tattggaagc 180

ttattagcct ttctattttt tcgtttgcaa ggcttaacaa cattgctgtg gagagggatg 240

gggatatgga ggccgctgga gggagtcgga gaggcgtttt ggagcggctt ggcctggcgc 300

ccagctcgcg aaacgcacct aggacccttt ggcacgccga aatgtgccac ttttcagtct 360

agtaacgcct tacctacgtc attccatgcg tgcatgtttg cgcctttttt cccttgccct 420

tgatcgccac acagtacagt gcactgtaca gtggaggttt tgggggggtc ttagatggga 480

gctaaaagcg gcctagcggt acactagtgg gattgtatgg agtggcatgg agcctaggtg 540

gagcctgaca ggacgcacga ccggctagcc cgtgacagac gatgggtggc tcctgttgtc 600

caccgcgtac aaatgtttgg gccaaagtct tgtcagcctt gcttgcgaac ctaattccca 660

attttgtcac ttcgcacccc cattgatcga gccctaaccc ctgcccatca ggcaatccaa 720

ttaagctcgc attgtctgcc ttgtttagtt tggctcctgc ccgtttcggc gtccacttgc 780

acaaacacaa acaagcatta tatataaggc tcgtctctcc ctcccaacca cactcacttt 840

tttgcccgtc ttcccttgct aacacaaaag tcaagaacac aaacaaccac cccaaccccc 900

ttacacacaa gacatatcta cagcaatggc catggctctc tcccttacta ccgagcagct 960

gctcgagcga cccgacctgg ttgccatcga cggcattctc tacgatctgg aaggtcttgc 1020

caaggtccat cccggaggcg acttgatcct cgcttctggt gcctccgatg cttctcctct 1080

gttctactcc atgcaccctt acgtcaagcc cgagaactcg aagctgcttc aacagttcgt 1140

gcgaggcaag cacgaccgaa cctccaagga cattgtctac acctacgact ctccctttgc 1200

acaggacgtc aagcgaacta tgcgagaggt catgaaaggt cggaactggt atgccacacc 1260

tggattctgg ctgcgaaccg ttggcatcat tgctgtcacc gccttttgcg agtggcactg 1320

ggctactacc ggaatggtgc tgtggggtct cttgactgga ttcatgcaca tgcagatcgg 1380

cctgtccatt cagcacgatg cctctcatgg tgccatcagc aaaaagccct gggtcaacgc 1440

tctctttgcc tacggcatcg acgtcattgg atcgtccaga tggatctggc tgcagtctca 1500

catcatgcga catcacacct acaccaatca gcatggtctc gacctggatg ccgagtccgc 1560

agaaccattc cttgtgttcc acaactaccc tgctgccaac actgctcgaa agtggtttca 1620

ccgattccag gcctggtaca tgtacctcgt gcttggagcc tacggcgttt cgctggtgta 1680

caaccctctc tacatcttcc gaatgcagca caacgacacc attcccgagt ctgtcacagc 1740

catgcgagag aacggctttc tgcgacggta ccgaaccctt gcattcgtta tgcgagcttt 1800

cttcatcttt cgaaccgcct tcttgccctg gtatctcact ggaacctccc tgctcatcac 1860

cattcctctg gtgcccactg ctaccggtgc cttcctcacc ttctttttca tcttgtctca 1920

caacttcgat ggctcggagc gaatccccga caagaactgc aaggtcaaga gctccgagaa 1980

ggacgttgaa gccgatcaga tcgactggta cagagctcag gtggagacct cttccaccta 2040

cggtggaccc attgccatgt tctttactgg cggtctcaac ttccagatcg agcatcacct 2100

ctttcctcga atgtcgtctt ggcactatcc cttcgtgcag caagctgtcc gagagtgttg 2160

cgaacgacac ggagttcggt acgtcttcta ccctaccatt gtgggcaaca tcatttccac 2220

cctcaagtac atgcacaaag tcggtgtggt tcactgtgtc aaggacgctc aggattccta 2280

agcggccgca agtgtggatg gggaagtgag tgcccggttc tgtgtgcaca attggcaatc 2340

caagatggat ggattcaaca cagggatata gcgagctacg tggtggtgcg aggatatagc 2400

aacggatatt tatgtttgac acttgagaat gtacgataca agcactgtcc aagtacaata 2460

ctaaacatac tgtacatact catactcgta cccgggcaac ggtttcactt gagtgcagtg 2520

gctagtgctc ttactcgtac agtgtgcaat actgcgtatc atagtctttg atgtatatcg 2580

tattcattca tgttagttgc gtacgctgtg ttgttgtatg tggtgaagct tgacaatgga 2640

tggtgtgtcg tatcaggctg gggaacaatt gtgcttaagt atgctgcagt tgagtaagag 2700

tcatcgctcc accaaaataa agtttgccat tagggttgga gagagagatg gtggctggaa 2760

gaattaaatg acatcaagct gaggattgtg ggtgtgcaat aacacatgtt aggggtgacc 2820

tgtggctcga aatctgataa ttattttgta actttatgat tattcttaga ttttttaata 2880

ttcctctata taacacataa gtagctgtcg tctagttgtt catagcctga ctcctgcaat 2940

agattagtgc agagtgattt tgtgcaattg agagccacgg ttgagtcaag tgactttgtg 3000

tgtgaagtca tcttacgttt caagtctcac aggttactca attggttggt tgtctgccct 3060

ttacagatat ttacagtacc tgagcgtaaa gtcgttcatc cacggaatga ctgttcctgt 3120

cacgcagtca tgatcatgga tgtggctggt caggaaccat tttggatagg agacttaggg 3180

attggactat tattgaaaaa actgagccga atatgatata gttctatttg aatgcagaac 3240

ttctgatggt caattcactt atttcaggca tatcggtcat ggtggcagct gccacgatgt 3300

tatctcgttg gaaacctcgg cgcgccagct gcattaatga atcggccaac gcgcggggag 3360

aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt 3420

cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga 3480

atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg 3540

taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa 3600

aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt 3660

tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct 3720

gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct 3780

cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc 3840

cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt 3900

atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc 3960

tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaagaacag tatttggtat 4020

ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa 4080

acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa 4140

aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga 4200

aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct 4260

tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga 4320

cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc 4380

catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg 4440

ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat 4500

aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat 4560

ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg 4620

caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc 4680

attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa 4740

agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc 4800

actcatggtt atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg taagatgctt 4860

ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag 4920

ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt 4980

gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac cgctgttgag 5040

atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt ttactttcac 5100

cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc 5160

gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa tattattgaa gcatttatca 5220

gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg 5280

ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc acctgatgcg gtgtgaaata ccgcacagat 5340

gcgtaaggag aaaataccgc atcaggaaat tgtaagcgtt aatattttgt taaaattcgc 5400

gttaaatttt tgttaaatca gctcattttt taaccaatag gccgaaatcg gcaaaatccc 5460

ttataaatca aaagaataga ccgagatagg gttgagtgtt gttccagttt ggaacaagag 5520

tccactatta aagaacgtgg actccaacgt caaagggcga aaaaccgtct atcagggcga 5580

tggcccacta cgtgaaccat caccctaatc aagttttttg gggtcgaggt gccgtaaagc 5640

actaaatcgg aaccctaaag ggagcccccg atttagagct tgacggggaa agccggcgaa 5700

cgtggcgaga aaggaaggga agaaagcgaa aggagcgggc gctagggcgc tggcaagtgt 5760

agcggtcacg ctgcgcgtaa ccaccacacc cgccgcgctt aatgcgccgc tacagggcgc 5820

gtccattcgc cattcaggct gcgcaactgt tgggaagggc gatcggtgcg ggcctcttcg 5880

ctattacgcc agctggcgaa agggggatgt gctgcaaggc gattaagttg ggtaacgcca 5940

gggttttccc agtcacgacg ttgtaaaacg acggccagtg aattgtaata cgactcacta 6000

tagggcgaat tgggcccgac gtcgcatgca ttccatagcc acacctttgc ctatggcttc 6060

acaaccgaag gcaattcgag aggtcgcgct tatggaatcg actcgtataa agctgaaggg 6120

aaagggagac gttccgagcg ctcagatgca atagtcgtcc agctaatgtg gattcaaaaa 6180

caaccccaac agtaatcttg aaaatttgaa cggatcaatc tgaacactct tgctccaggt 6240

cattcttcta acgcacatcc ccagagtcta gagggagttg tgttgtgaac atcctaataa 6300

acaatgcaat ggattcggga tatcttctgt ctcgccccct actcgatgtc gagtaaaccg 6360

atcaccaact aacaatactc ctccgcgttc tgccattgac tctcaaacag acatcgctat 6420

caacggaaca gcatatttta gcttcttagg acaataaata ttgataatgc cggctctccc 6480

tcggtatatt aagcaatcca ttcatacact cattcatcag gttaatttta tatatataat 6540

ttgtctattc aaacaccgta aattactggt accatcatct cctccttttc aaatacacgt 6600

ctatttgcat taatgaaatt actcgccaat tcgcagaacg tgtttgtcga acagagcctt 6660

agctcgggtc cagacaggag cagtgtctcg ctgaggaagc tgcaggagag ttaattaact 6720

cacctgcagg attgagacta tgaatggatt cccgtgcccg tattactcta ctaatttgat 6780

cttggaacgc gaaaatacgt ttctaggact ccaaagaatc tcaactcttg tccttactaa 6840

atatactacc catagttgat ggtttacttg aacagagagg acatgttcac ttgacccaaa 6900

gtttctcgca tctcttggat atttgaacaa cggcgtccac tgaccgtcag ttatccagtc 6960

acaaaacccc cacattcata cattcccatg tacgtttaca aagttctcaa ttccatcgtg 7020

caaatcaaaa tcacatctat tcattcatca tatataaacc catcatgtct actaacactc 7080

acaactccat agaaaacatc gactcagaac acacgctcca tgcggccgct taggaatcct 7140

gtgcgtcctt cacgcagtgg acgacaccca ccttatgcat gtacttcagg gtggagatga 7200

tgttgccgac gatggtaggg tagaaaacat atcgcactcc atgtcgttcg caacactccc 7260

ggaccgcctg ctggacgaag gggtagtgcc aagacgacat ccggggaaag aggtggtgct 7320

cgatctggaa attgagaccg ccagtgaaga acatggcgat ggggccaccg tatgtggagg 7380

acgtctccac ctgcgcccga taccagtcaa tttggtcagc ctcaacgtcc ttctcagatc 7440

gcttaacctt gcagttcttg tcggggatcc gttcggagcc atcaaaattg tgggacaaaa 7500

tgaagaagaa cgtcaagaag gcaccagttg cggtgggcac cagaggaatg gtgatcagca 7560

atgaggtccc agtgaggtac cagggcaaga atgcggtccg gaagatgaag aaagctcgca 7620

tcacgaatgc aagtgtgcgg tagcgccgca gaaagccatt ttcccgcatg gccgtgacag 7680

actctgggat ggtgtcattg tgctgcatcc ggaaaatgta gagcgggttg tacaccagcg 7740

ataccccgta tgcccccagc acaaggtaca tgtaccaagc ctggaagcgg tggaaccact 7800

ttcgggcggt gtttgcggcg gggtagttgt ggaacaccag gaacggctct gccgactccg 7860

catccaggtc gaggccgtgc tggttggtgt aggtgtggtg ccgcatgatg tgcgactgca 7920

gccaaatcca ccgggacgat ccgatgacgt caatgccgta ggcgaagagg gcgttgaccc 7980

aaggcttctt gctgatggcc ccgtgggacg catcatgctg gatggataag ccgatctgca 8040

tgtgcatgaa tccagtcaac aggccccaca gcaccatccc cgtggtagcc cagtgccact 8100

cgcaaaaggc cgtcacggcg atgatcccaa cggtgcgcag ccagaagcca ggggttgcgt 8160

accagttcct ccctttcatc acctcgcgca ttgtccgctt aacgtcttgt gcgaagggag 8220

aatcatacgt gtagacaatg tccttcgagg tgcggtcatg cttccctcgg acgaactgtt 8280

gaagcaattt ggagttctcc ggtttgacgt atggatgcat tgaataaaag agaggggagg 8340

catcagaggc accagaagcg agaatcaaat ctcctcctgg atgaactttg gcaagccctt 8400

caaggtcgta gaggatgcca tcaatcgcaa ccaaatcagg gcgttctaac agctgttctg 8460

tggtaagact gagagccatg gagagctggg ttagtttgtg tagagagtgt gtgttgctag 8520

cgactttcgg attgtgtcat tacacaaaac gcgtcgtctc gacactgatc ttgtcgtgga 8580

tactcacggc tcggacatcg tcgccgacga tgacaccgga ctttcgctta aggacgtcag 8640

taacaggcat tgtgtgatgt gtagtttaga tttcgaatct gtggggaaag aaaggaaaaa 8700

agagactggc aaccgattgg gagagccact gtttatatat accctagaca agccccccgc 8760

ttgtaagatg ttggtcaatg taaaccagta ttaaggttgg caagtgcagg agaagcaagg 8820

tgtgggtacc gagcaatgga aatgtgcgga aggcaaaaaa atgaggccac ggcctattgt 8880

cggggctata tccagggggc gattgaagta cactaacatg acatgtgtcc acagaccctc 8940

aatctggcct gatgagccaa atccatacgc gctttcgcag ctctaaaggc tataacaagt 9000

cacaccaccc tgctcgacct cagcgccctc actttttgtt aagacaaact gtacacgctg 9060

ttccagcgtt ttctgcctgc acctggtggg acatttggtg caacctaaag tgctcggaac 9120

ctctgtggtg tccagatcag cgcagcagtt ccgaggtagt tttgaggccc ttagatgatg 9180

caatggtgtc agtcgctgga tcacgagtct taatggcagt attcgttctt atttgtgcca 9240

ttgagccccg ttatcctcgt atcttctacc ccccatccca tccctttgtt ggtgcaaccc 9300

tacccattta ttgttgggtg cagcccaacc gacgtggaga gcttggcttg gccatataaa 9360

aaggcccccc cctagtggca atggcagaaa gtcagctgtg agttgttgaa tttgtcatct 9420

aggcggcctg gccgtcttct ccggggcaat tggggctgtt ttttgggaca caaatacgcc 9480

gccaacccgg tctctcctga attccgtcgt cgcctgagtc gacatcattt atttaccagt 9540

tggccacaaa cccttgacga tctcgtatgt cccctccgac atactcccgg ccggctgggg 9600

tacgttcgat agcgctatcg gcatcgacaa ggtttgggtc cctagccgat accgcactac 9660

ctgagtcaca atcttcggag gtttagtctt ccacatagca cgggcaaaag tgcgtatata 9720

tacaagagcg tttgccagcc acagattttc actccacaca ccacatcaca catacaacca 9780

cacacatcca caatggaacc cgaaactaag aagaccaaga ctgactccaa gaagattgtt 9840

cttctcggcg gcgacttctg tggccccgag gtgattgccg aggccgtcaa ggtgctcaag 9900

tctgttgctg aggcctccgg caccgagttt gtgtttgagg accgactcat tggaggagct 9960

gccattgaga aggagggcga gcccatcacc gacgctactc tcgacatctg ccgaaaggct 10020

gactctatta tgctcggtgc tgtcggaggc gctgccaaca ccgtatggac cactcccgac 10080

ggacgaaccg acgtgcgacc cgagcagggt ctcctcaagc tgcgaaagga cctgaacctg 10140

tacgccaacc tgcgaccctg ccagctgctg tcgcccaagc tcgccgatct ctcccccatc 10200

cgaaacgttg agggcaccga cttcatcatt gtccgagagc tcgtcggagg tatctacttt 10260

ggagagcgaa aggaggatga cggatctggc gtcgcttccg acaccgagac ctactccgtt 10320

cctgaggttg agcgaattgc ccgaatggcc gccttcctgg cccttcagca caacccccct 10380

cttcccgtgt ggtctcttga caaggccaac gtgctggcct cctctcgact ttggcgaaag 10440

actgtcactc gagtcctcaa ggacgaactc ccccagctcg agctcaacca ccagctgatc 10500

gactcggccg ccatgatcct catcaagcag ccctccaaga tgaatggtat catcatcacc 10560

accaacatgt ttggcgatat catctccgac gaggcctccg tcatccccgg ttctctgggt 10620

ctgctgccct ccgcctctct ggcttctctg cccgacacca acgaggcgtt cggtctgtac 10680

gagccctgtc acggatctgc ccccgatctc ggcaagcaga aggtcaaccc cattgccacc 10740

attctgtctg ccgccatgat gctcaagttc tctcttaaca tgaagcccgc cggtgacgct 10800

gttgaggctg ccgtcaagga gtccgtcgag gctggtatca ctaccgccga tatcggaggc 10860

tcttcctcca cctccgaggt cggagacttg ttgccaacaa ggtcaaggag ctgctcaaga 10920

aggagtaagt cgtttctacg acgcattgat ggaaggagca aactgacgcg cctgcgggtt 10980

ggtctaccgg cagggtccgc tagtgtataa gactctataa aaagggccct gccctgctaa 11040

tgaaatgatg atttataatt taccggtgta gcaaccttga ctagaagaag cagattgggt 11100

gtgtttgtag tggaggacag tggtacgttt tggaaacagt cttcttgaaa gtgtcttgtc 11160

tacagtatat tcactcataa cctcaatagc caagggtgta gtcggtttat taaaggaagg 11220

gagttgtggc tgatgtggat atcgatagtt ggagcaaggg agaaatgtag agtgtgaaag 11280

actcactatg gtccgggctt atctcgacca atagccaaag tctggagttt ctgagagaaa 11340

aaggcaagat acgtatgtaa caaagcgacg catggtacaa taataccgga ggcatgtatc 11400

atagagagtt agtggttcga tgatggcact ggtgcctggt atgactttat acggctgact 11460

acatatttgt cctcagacat acaattacag tcaagcactt acccttggac atctgtaggt 11520

accccccggc caagacgatc tcagcgtgtc gtatgtcgga ttggcgtagc tccctcgctc 11580

gtcaattggc tcccatctac tttcttctgc ttggctacac ccagcatgtc tgctatggct 11640

cgttttcgtg ccttatctat cctcccagta ttaccaactc taaatgacat gatgtgattg 11700

ggtctacact ttcatatcag agataaggag tagcacagtt gcataaaaag cccaactcta 11760

atcagcttct tcctttcttg taattagtac aaaggtgatt agcgaaatct ggaagcttag 11820

ttggccctaa aaaaatcaaa aaaagcaaaa aacgaaaaac gaaaaaccac agttttgaga 11880

acagggaggt aacgaaggat cgtatatata tatatatata tatataccca cggatcccga 11940

gaccggcctt tgattcttcc ctacaaccaa ccattctcac caccctaatt cacaaccatg 12000

gctcccgacg ccgacaagct gcgacagcga aaggctcagt ccatccagga cactgccgat 12060

tctcaggcta ccgagctcaa gattggcacc ctgaagggtc tccaaggcac cgagatcgtc 12120

attgatggcg acatctacga catcaaagac ttcgatcacc ctggaggcga atccatcatg 12180

acctttggtg gcaacgacgt tactgccacc tacaagatga ttcatcccta ccactcgaag 12240

catcacctgg agaagatgaa aaaggtcggt cgagtgcccg actacacctc cgagtacaag 12300

ttcgatactc ccttcgaacg agagatcaaa caggaggtct tcaagattgt gcgaagaggt 12360

cgagagtttg gaacacctgg ctacttcttt cgagccttct gctacatcgg tctcttcttt 12420

tacctgcagt atctctgggt taccactcct accactttcg cccttgctat cttctacggt 12480

gtgtctcagg ccttcattgg cctgaacgtc cagcacgacg ccaaccacgg agctgcctcc 12540

aaaaagccct ggatcaacaa tttgctcggc ctgggtgccg actttatcgg aggctccaag 12600

tggctctgga tgaaccagca ctggacccat cacacttaca ccaaccatca cgagaaggat 12660

cccgacgccc tgggtgcaga gcctatgctg ctcttcaacg actatccctt gggtcacccc 12720

aagcgaaccc tcattcatca cttccaagcc ttctactatc tgtttgtcct tgctggctac 12780

tgggtgtctt cggtgttcaa ccctcagatc ctggacctcc agcaccgagg tgcccaggct 12840

gtcggcatga agatggagaa cgactacatt gccaagtctc gaaagtacgc tatcttcctg 12900

cgactcctgt acatctacac caacattgtg gctcccatcc agaaccaagg cttttcgctc 12960

accgtcgttg ctcacattct tactatgggt gtcgcctcca gcctgaccct cgctactctg 13020

ttcgccctct cccacaactt cgagaacgca gatcgggatc ccacctacga ggctcgaaag 13080

ggaggcgagc ctgtctgttg gttcaagtcg caggtggaaa cctcctctac ttacggtggc 13140

ttcatttccg gttgccttac aggcggactc aactttcagg tcgagcatca cctgtttcct 13200

cgaatgtcct ctgcctggta cccctacatc gctcctaccg ttcgagaggt ctgcaaaaag 13260

cacggcgtca agtacgccta ctatccctgg gtgtggcaga acctcatctc gaccgtcaag 13320

tacctgcatc agtccggaac tggctcgaac tggaagaacg gtgccaatcc ctactctggc 13380

aagctgtaag cggccgcatg tacatacaag attatttata gaaatgaatc gcgatcgaac 13440

aaagagtacg agtgtacgag taggggatga tgataaaagt ggaagaagtt ccgcatcttt 13500

ggatttatca acgtgtagga cgatacttcc tgtaaaaatg caatgtcttt accataggtt 13560

ctgctgtaga tgttattaac taccattaac atgtctactt gtacagttgc agaccagttg 13620

gagtatagaa tggtacactt accaaaaagt gttgatggtt gtaactacga tatataaaac 13680

tgttgacggg atctgcgtac actgttt 13707

<210>33

<211>1350

<212>DNA

<213>纤细裸藻

<220>

<221>其它特征

<223>用于解脂耶氏酵母的合成的Δ-5去饱和酶(密码子优化的)

<400>33

atggctctct cccttactac cgagcagctg ctcgagcgac ccgacctggt tgccatcgac 60

ggcattctct acgatctgga aggtcttgcc aaggtccatc ccggaggcga cttgatcctc 120

gcttctggtg cctccgatgc ttctcctctg ttctactcca tgcaccctta cgtcaagccc 180

gagaactcga agctgcttca acagttcgtg cgaggcaagc acgaccgaac ctccaaggac 240

attgtctaca cctacgactc tccctttgca caggacgtca agcgaactat gcgagaggtc 300

atgaaaggtc ggaactggta tgccacacct ggattctggc tgcgaaccgt tggcatcatt 360

gctgtcaccg ccttttgcga gtggcactgg gctactaccg gaatggtgct gtggggtctc 420

ttgactggat tcatgcacat gcagatcggc ctgtccattc agcacgatgc ctctcatggt 480

gccatcagca aaaagccctg ggtcaacgct ctctttgcct acggcatcga cgtcattgga 540

tcgtccagat ggatctggct gcagtctcac atcatgcgac atcacaccta caccaatcag 600

catggtctcg acctggatgc cgagtccgca gaaccattcc ttgtgttcca caactaccct 660

gctgccaaca ctgctcgaaa gtggtttcac cgattccagg cctggtacat gtacctcgtg 720

cttggagcct acggcgtttc gctggtgtac aaccctctct acatcttccg aatgcagcac 780

aacgacacca ttcccgagtc tgtcacagcc atgcgagaga acggctttct gcgacggtac 840

cgaacccttg cattcgttat gcgagctttc ttcatctttc gaaccgcctt cttgccctgg 900

tatctcactg gaacctccct gctcatcacc attcctctgg tgcccactgc taccggtgcc 960

ttcctcacct tctttttcat cttgtctcac aacttcgatg gctcggagcg aatccccgac 1020

aagaactgca aggtcaagag ctccgagaag gacgttgaag ccgatcagat cgactggtac 1080

agagctcagg tggagacctc ttccacctac ggtggaccca ttgccatgtt ctttactggc 1140

ggtctcaact tccagatcga gcatcacctc tttcctcgaa tgtcgtcttg gcactatccc 1200

ttcgtgcagc aagctgtccg agagtgttgc gaacgacacg gagttcggta cgtcttctac 1260

cctaccattg tgggcaacat catttccacc ctcaagtaca tgcacaaagt cggtgtggtt 1320

cactgtgtca aggacgctca ggattcctaa 1350

<210>34

<211>449

<212>PRT

<213>纤细裸藻

<400>34

Met Ala Leu Ser Leu Thr Thr Glu Gln Leu Leu Glu Arg Pro Asp Leu

1 5 10 15

Val Ala Ile Asp Gly Ile Leu Tyr Asp Leu Glu Gly Leu Ala Lys Val

20 25 30

His Pro Gly Gly Asp Leu Ile Leu Ala Ser Gly Ala Ser Asp Ala Ser

35 40 45

Pro Leu Phe Tyr Ser Met His Pro Tyr Val Lys Pro Glu Asn Ser Lys

50 55 60

Leu Leu Gln Gln Phe Val Arg Gly Lys His Asp Arg Thr Ser Lys Asp

65 70 75 80

Ile Val Tyr Thr Tyr Asp Ser Pro Phe Ala Gln Asp Val Lys Arg Thr

85 90 95

Met Arg Glu Val Met Lys Gly Arg Asn Trp Tyr Ala Thr Pro Gly Phe

100 105 110

Trp Leu Arg Thr Val Gly Ile Ile Ala Val Thr Ala Phe Cys Glu Trp

115 120 125

His Trp Ala Thr Thr Gly Met Val Leu Trp Gly Leu Leu Thr Gly Phe

130 135 140

Met His Met Gln Ile Gly Leu Ser Ile Gln His Asp Ala Ser His Gly

145 150 155 160

Ala Ile Ser Lys Lys Pro Trp Val Asn Ala Leu Phe Ala Tyr Gly Ile

165 170 175

Asp Val Ile Gly Ser Ser Arg Trp Ile Trp Leu Gln Ser His Ile Met

180 185 190

Arg His His Thr Tyr Thr Asn Gln His Gly Leu Asp Leu Asp Ala Glu

195 200 205

Ser Ala Glu Pro Phe Leu Val Phe His Asn Tyr Pro Ala Ala Asn Thr

210 215 220

Ala Arg Lys Trp Phe His Arg Phe Gln Ala Trp Tyr Met Tyr Leu Val

225 230 235 240

Leu Gly Ala Tyr Gly Val Ser Leu Val Tyr Asn Pro Leu Tyr Ile Phe

245 250 255

Arg Met Gln His Asn Asp Thr Ile Pro Glu Ser Val Thr Ala Met Arg

260 265 270

Glu Asn Gly Phe Leu Arg Arg Tyr Arg Thr Leu Ala Phe Val Met Arg

275 280 285

Ala Phe Phe Ile Phe Arg Thr Ala Phe Leu Pro Trp Tyr Leu Thr Gly

290 295 300

Thr Ser Leu Leu Ile Thr Ile Pro Leu Val Pro Thr Ala Thr Gly Ala

305 310 315 320

Phe Leu Thr Phe Phe Phe Ile Leu Ser His Asn Phe Asp Gly Ser Glu

325 330 335

Arg Ile Pro Asp Lys Asn Cys Lys Val Lys Ser Ser Glu Lys Asp Val

340 345 350

Glu Ala Asp Gln Ile Asp Trp Tyr Arg Ala Gln Val Glu Thr Ser Ser

355 360 365

Thr Tyr Gly Gly Pro Ile Ala Met Phe Phe Thr Gly Gly Leu Asn Phe

370 375 380

Gln Ile Glu His His Leu Phe Pro Arg Met Ser Ser Trp His Tyr Pro

385 390 395 400

Phe Val Gln Gln Ala Val Arg Glu Cys Cys Glu Arg His Gly Val Arg

405 410 415

Tyr Val Phe Tyr Pro Thr Ile Val Gly Asn Ile Ile Ser Thr Leu Lys

420 425 430

Tyr Met His Lys Val Gly Val Val His Cys Val Lys Asp Ala Gln Asp

435 440 445

Ser

<210>35

<211>1392

<212>DNA

<213>多甲藻CCMP626

<220>

<221>其它特征

<223>用于解脂耶氏酵母的合成的Δ-5去饱和酶(密码子优化的)

<400>35

atggctcccg acgccgacaa gctgcgacag cgaaaggctc agtccatcca ggacactgcc 60

gattctcagg ctaccgagct caagattggc accctgaagg gtctccaagg caccgagatc 120

gtcattgatg gcgacatcta cgacatcaaa gacttcgatc accctggagg cgaatccatc 180

atgacctttg gtggcaacga cgttactgcc acctacaaga tgattcatcc ctaccactcg 240

aagcatcacc tggagaagat gaaaaaggtc ggtcgagtgc ccgactacac ctccgagtac 300

aagttcgata ctcccttcga acgagagatc aaacaggagg tcttcaagat tgtgcgaaga 360

ggtcgagagt ttggaacacc tggctacttc tttcgagcct tctgctacat cggtctcttc 420

ttttacctgc agtatctctg ggttaccact cctaccactt tcgcccttgc tatcttctac 480

ggtgtgtctc aggccttcat tggcctgaac gtccagcacg acgccaacca cggagctgcc 540

tccaaaaagc cctggatcaa caatttgctc ggcctgggtg ccgactttat cggaggctcc 600

aagtggctct ggatgaacca gcactggacc catcacactt acaccaacca tcacgagaag 660

gatcccgacg ccctgggtgc agagcctatg ctgctcttca acgactatcc cttgggtcac 720

cccaagcgaa ccctcattca tcacttccaa gccttctact atctgtttgt ccttgctggc 780

tactgggtgt cttcggtgtt caaccctcag atcctggacc tccagcaccg aggtgcccag 840

gctgtcggca tgaagatgga gaacgactac attgccaagt ctcgaaagta cgctatcttc 900

ctgcgactcc tgtacatcta caccaacatt gtggctccca tccagaacca aggcttttcg 960

ctcaccgtcg ttgctcacat tcttactatg ggtgtcgcct ccagcctgac cctcgctact 1020

ctgttcgccc tctcccacaa cttcgagaac gcagatcggg atcccaccta cgaggctcga 1080

aagggaggcg agcctgtctg ttggttcaag tcgcaggtgg aaacctcctc tacttacggt 1140

ggcttcattt ccggttgcct tacaggcgga ctcaactttc aggtcgagca tcacctgttt 1200

cctcgaatgt cctctgcctg gtacccctac atcgctccta ccgttcgaga ggtctgcaaa 1260

aagcacggcg tcaagtacgc ctactatccc tgggtgtggc agaacctcat ctcgaccgtc 1320

aagtacctgc atcagtccgg aactggctcg aactggaaga acggtgccaa tccctactct 1380

ggcaagctgt aa 1392

<210>36

<211>463

<212>PRT

<213>多甲藻CCMP626

<400>36

Met Ala Pro Asp Ala Asp Lys Leu Arg Gln Arg Lys Ala Gln Ser Ile

1 5 10 15

Gln Asp Thr Ala Asp Ser Gln Ala Thr Glu Leu Lys Ile Gly Thr Leu

20 25 30

Lys Gly Leu Gln Gly Thr Glu Ile Val Ile Asp Gly Asp Ile Tyr Asp

35 40 45

Ile Lys Asp Phe Asp His Pro Gly Gly Glu Ser Ile Met Thr Phe Gly

50 55 60

Gly Asn Asp Val Thr Ala Thr Tyr Lys Met Ile His Pro Tyr His Ser

65 70 75 80

Lys His His Leu Glu Lys Met Lys Lys Val Gly Arg Val Pro Asp Tyr

85 90 95

Thr Ser Glu Tyr Lys Phe Asp Thr Pro Phe Glu Arg Glu Ile Lys Gln

100 105 110

Glu Val Phe Lys Ile Val Arg Arg Gly Arg Glu Phe Gly Thr Pro Gly

115 120 125

Tyr Phe Phe Arg Ala Phe Cys Tyr Ile Gly Leu Phe Phe Tyr Leu Gln

130 135 140

Tyr Leu Trp Val Thr Thr Pro Thr Thr Phe Ala Leu Ala Ile Phe Tyr

145 150 155 160

Gly Val Ser Gln Ala Phe Ile Gly Leu Asn Val Gln His Asp Ala Asn

165 170 175

His Gly Ala Ala Ser Lys Lys Pro Trp Ile Asn Asn Leu Leu Gly Leu

180 185 190

Gly Ala Asp Phe Ile Gly Gly Ser Lys Trp Leu Trp Met Asn Gln His

195 200 205

Trp Thr His His Thr Tyr Thr Asn His His Glu Lys Asp Pro Asp Ala

210 215 220

Leu Gly Ala Glu Pro Met Leu Leu Phe Asn Asp Tyr Pro Leu Gly His

225 230 235 240

Pro Lys Arg Thr Leu Ile His His Phe Gln Ala Phe Tyr Tyr Leu Phe

245 250 255

Val Leu Ala Gly Tyr Trp Val Ser Ser Val Phe Asn Pro Gln Ile Leu

260 265 270

Asp Leu Gln His Arg Gly Ala Gln Ala Val Gly Met Lys Met Glu Asn

275 280 285

Asp Tyr Ile Ala Lys Ser Arg Lys Tyr Ala Ile Phe Leu Arg Leu Leu

290 295 300

Tyr Ile Tyr Thr Asn Ile Val Ala Pro Ile Gln Asn Gln Gly Phe Ser

305 310 315 320

Leu Thr Val Val Ala His Ile Leu Thr Met Gly Val Ala Ser Ser Leu

325 330 335

Thr Leu Ala Thr Leu Phe Ala Leu Ser His Asn Phe Glu Asn Ala Asp

340 345 350

Arg Asp Pro Thr Tyr Glu Ala Arg Lys Gly Gly Glu Pro Val Cys Trp

355 360 365

Phe Lys Ser Gln Val Glu Thr Ser Ser Thr Tyr Gly Gly Phe Ile Ser

370 375 380

Gly Cys Leu Thr Gly Gly Leu Asn Phe Gln Val Glu His His Leu Phe

385 390 395 400

Pro Arg Met Ser Ser Ala Trp Tyr Pro Tyr Ile Ala Pro Thr Val Arg

405 410 415

Glu Val Cys Lys Lys His Gly Val Lys Tyr Ala Tyr Tyr Pro Trp Val

420 425 430

Trp Gln Asn Leu Ile Ser Thr Val Lys Tyr Leu His Gln Ser Gly Thr

435 440 445

Gly Ser Asn Trp Lys Asn Gly Ala Asn Pro Tyr Ser Gly Lys Leu

450 455 460

<210>37

<211>1350

<212>DNA

<213>纤细裸藻

<220>

<221>其它特征

<222>(1)..(1350)

<223>Δ-5去饱和酶

<400>37

atggctctca gtcttaccac agaacagctg ttagaacgcc ctgatttggt tgcgattgat 60

ggcatcctct acgaccttga agggcttgcc aaagttcatc caggaggaga tttgattctc 120

gcttctggtg cctctgatgc ctcccctctc ttttattcaa tgcatccata cgtcaaaccg 180

gagaattcca aattgcttca acagttcgtc cgagggaagc atgaccgcac ctcgaaggac 240

attgtctaca cgtatgattc tcccttcgca caagacgtta agcggacaat gcgcgaggtg 300

atgaaaggga ggaactggta cgcaacccct ggcttctggc tgcgcaccgt tgggatcatc 360

gccgtgacgg ccttttgcga gtggcactgg gctaccacgg ggatggtgct gtggggcctg 420

ttgactggat tcatgcacat gcagatcggc ttatccatcc agcatgatgc gtcccacggg 480

gccatcagca agaagccttg ggtcaacgcc ctcttcgcct acggcattga cgtcatcgga 540

tcgtcccggt ggatttggct gcagtcgcac atcatgcggc accacaccta caccaaccag 600

cacggcctcg acctggatgc ggagtcggca gagccgttcc tggtgttcca caactacccc 660

gccgcaaaca ccgcccgaaa gtggttccac cgcttccaag cttggtacat gtaccttgtg 720

ctgggggcat acggggtatc gctggtgtac aacccgctct acattttccg gatgcagcac 780

aatgacacca tcccagagtc tgtcacggcc atgcgggaga atggctttct gcggcgctac 840

cgcacacttg cattcgtgat gcgagctttc ttcatcttcc ggaccgcatt cttgccctgg 900

tacctcactg ggacctcatt gctgatcacc attcctctgg tgcccactgc aactggtgcc 960

ttcttgacgt tcttcttcat tttgtcccac aattttgatg gctccgaacg gatccccgac 1020

aagaactgca aggttaagag ctctgagaag gacgttgagg ctgaccaaat tgactggtat 1080

cgggcgcagg tggagacgtc ctccacatac ggtggcccca tcgccatgtt cttcactggc 1140

ggtctcaatt tccagatcga gcaccacctc tttccccgga tgtcgtcttg gcactacccc 1200

ttcgtccagc aggcggtccg ggagtgttgc gaacgccatg gagtgcgata tgttttctac 1260

cctaccatcg tcggcaacat catctccacc ctgaagtaca tgcataaggt gggtgtcgtc 1320

cactgcgtga aggacgcaca ggattcctga 1350

<210>38

<211>3806

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>质粒pPrD17S

<400>38

ggccgcatcg gatcccgggc ccgtcgactg cagaggcctg catgcaagct tggcgtaatc 60

atggtcatag ctgtttcctg tgtgaaattg ttatccgctc acaattccac acaacatacg 120

agccggaagc ataaagtgta aagcctgggg tgcctaatga gtgagctaac tcacattaat 180

tgcgttgcgc tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc tgcattaatg 240

aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg cgctcttccg cttcctcgct 300

cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc 360

ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg 420

ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg 480

cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg 540

actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac 600

cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca 660

tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt 720

gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc 780

caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag 840

agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac 900

tagaagaaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt 960

tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa 1020

gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg 1080

gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa 1140

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ccggttccca acgatcaagg cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta 2940

gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg 3000

ttatggcagc actgcataat tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga 3060

ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt 3120

gcccggcgtc aatacgggat aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca 3180

ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt accgctgttg agatccagtt 3240

cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc ttttactttc accagcgttt 3300

ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga 3360

aatgttgaat actcatactc ttcctttttc aatattattg aagcatttat cagggttatt 3420

gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc 3480

gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg cgccctgtag cggcgcatta agcgcggcgg 3540

gtgtggtggt tacgcgcagc gtgaccgcta cacttgccag cgccctagcg cccgctcctt 3600

tcgctttctt cccttccttt ctcgccacgt tcgccggctt tccccgtcaa gctctaaatc 3660

gggggctccc tttagggttc cgatttagtg ctttacggca cctcgacccc aaaaaacttg 3720

attagggtga tggttcacgt agtgggccat cgccctgata gacggttttt cgccctttga 3780

cgttggagtc cacgttcttt aatagtggac tcttgttcca aactggaaca acactcaacc 3840

ctatctcggt ctattctttt gatttataag ggattttgcc gatttcggcc tattggttaa 3900

aaaatgagct gatttaacaa aaatttaacg cgaattttaa caaaatatta acgcttacaa 3960

tttccattcg ccattcaggc tgcgcaactg ttgggaaggg cgatcggtgc gggcctcttc 4020

gctattacgc cagctggcga aagggggatg tgctgcaagg cgattaagtt gggtaacgcc 4080

agggttttcc cagtcacgac gttgtaaaac gacggccagt gaattgtaat acgactcact 4140

atagggcgaa ttgggtaccg ggccccccct cgaggtcgat ggtgtcgata agcttgatat 4200

cgaattcatg tcacacaaac cgatcttcgc ctcaaggaaa cctaattcta catccgagag 4260

actgccgaga tccagtctac actgattaat tttcgggcca ataatttaaa aaaatcgtgt 4320

tatataatat tatatgtatt atatatatac atcatgatga tactgacagt catgtcccat 4380

tgctaaatag acagactcca tctgccgcct ccaactgatg ttctcaatat ttaaggggtc 4440

atctcgcatt gtttaataat aaacagactc catctaccgc ctccaaatga tgttctcaaa 4500

atatattgta tgaacttatt tttattactt agtattatta gacaacttac ttgctttatg 4560

aaaaacactt cctatttagg aaacaattta taatggcagt tcgttcattt aacaatttat 4620

gtagaataaa tgttataaat gcgtatggga aatcttaaat atggatagca taaatgatat 4680

ctgcattgcc taattcgaaa tcaacagcaa cgaaaaaaat cccttgtaca acataaatag 4740

tcatcgagaa atatcaacta tcaaagaaca gctattcaca cgttactatt gagattatta 4800

ttggacgaga atcacacact caactgtctt tctctcttct agaaatacag gtacaagtat 4860

gtactattct cattgttcat acttctagtc atttcatccc acatattcct tggatttctc 4920

tccaatgaat gacattctat cttgcaaatt caacaattat aataagatat accaaagtag 4980

cggtatagtg gcaatcaaaa agcttctctg gtgtgcttct cgtatttatt tttattctaa 5040

tgatccatta aaggtatata tttatttctt gttatataat ccttttgttt attacatggg 5100

ctggatacat aaaggtattt tgatttaatt ttttgcttaa attcaatccc ccctcgttca 5160

gtgtcaactg taatggtagg aaattaccat acttttgaag aagcaaaaaa aatgaaagaa 5220

aaaaaaaatc gtatttccag gttagacgtt ccgcagaatc tagaatgcgg tatgcggtac 5280

attgttcttc gaacgtaaaa gttgcgctcc ctgagatatt gtacattttt gcttttacaa 5340

gtacaagtac atcgtacaac tatgtactac tgttgatgca tccacaacag tttgttttgt 5400

ttttttttgt tttttttttt tctaatgatt cattaccgct atgtatacct acttgtactt 5460

gtagtaagcc gggttattgg cgttcaatta atcatagact tatgaatctg cacggtgtgc 5520

gctgcgagtt acttttagct tatgcatgct acttgggtgt aatattggga tctgttcgga 5580

aatcaacgga tgctcaatcg atttcgacag taattaatta agtcatacac aagtcagctt 5640

tcttcgagcc tcatataagt ataagtagtt caacgtatta gcactgtacc cagcatctcc 5700

gtatcgagaa acacaacaac atgccccatt ggacagatca tgcggataca caggttgtgc 5760

agtatcatac atactcgatc agacaggtcg tctgaccatc atacaagctg aacaagcgct 5820

ccatacttgc acgctctcta tatacacagt taaattacat atccatagtc taacctctaa 5880

cagttaatct tctggtaagc ctcccagcca gccttctggt atcgcttggc ctcctcaata 5940

ggatctcggt tctggccgta cagacctcgg ccgacaatta tgatatccgt tccggtagac 6000

atgacatcct caacagttcg gtactgctgt ccgagagcgt ctcccttgtc gtcaagaccc 6060

accccggggg tcagaataag ccagtcctca gagtcgccct taggtcggtt ctgggcaatg 6120

aagccaacca caaactcggg gtcggatcgg gcaagctcaa tggtctgctt ggagtactcg 6180

ccagtggcca gagagccctt gcaagacagc tcggccagca tgagcagacc tctggccagc 6240

ttctcgttgg gagaggggac taggaactcc ttgtactggg agttctcgta gtcagagacg 6300

tcctccttct tctgttcaga gacagtttcc tcggcaccag ctcgcaggcc agcaatgatt 6360

ccggttccgg gtacaccgtg ggcgttggtg atatcggacc actcggcgat tcggtgacac 6420

cggtactggt gcttgacagt gttgccaata tctgcgaact ttctgtcctc gaacaggaag 6480

aaaccgtgct taagagcaag ttccttgagg gggagcacag tgccggcgta ggtgaagtcg 6540

tcaatgatgt cgatatgggt tttgatcatg cacacataag gtccgacctt atcggcaagc 6600

tcaatgagct ccttggtggt ggtaacatcc agagaagcac acaggttggt tttcttggct 6660

gccacgagct tgagcactcg agcggcaaag gcggacttgt ggacgttagc tcgagcttcg 6720

taggagggca ttttggtggt gaagaggaga ctgaaataaa tttagtctgc agaacttttt 6780

atcggaacct tatctggggc agtgaagtat atgttatggt aatagttacg agttagttga 6840

acttatagat agactggact atacggctat cggtccaaat tagaaagaac gtcaatggct 6900

ctctgggcgt cgcctttgcc gacaaaaatg tgatcatgat gaaagccagc aatgacgttg 6960

cagctgatat tgttgtcggc caaccgcgcc gaaaacgcag ctgtcagacc cacagcctcc 7020

aacgaagaat gtatcgtcaa agtgatccaa gcacactcat agttggagtc gtactccaaa 7080

ggcggcaatg acgagtcaga cagatactcg tcgactcagg cgacgacgga attcctgcag 7140

cccatctgca gaattcagga gagaccgggt tggcggcgta tttgtgtccc aaaaaacagc 7200

cccaattgcc ccggagaaga cggccaggcc gcctagatga caaattcaac aactcacagc 7260

tgactttctg ccattgccac tagggggggg cctttttata tggccaagcc aagctctcca 7320

cgtcggttgg gctgcaccca acaataaatg ggtagggttg caccaacaaa gggatgggat 7380

ggggggtaga agatacgagg ataacggggc tcaatggcac aaataagaac gaatactgcc 7440

attaagactc gtgatccagc gactgacacc attgcatcat ctaagggcct caaaactacc 7500

tcggaactgc tgcgctgatc tggacaccac agaggttccg agcactttag gttgcaccaa 7560

atgtcccacc aggtgcaggc agaaaacgct ggaacagcgt gtacagtttg tcttaacaaa 7620

aagtgagggc gctgaggtcg agcagggtgg tgtgacttgt tatagccttt agagctgcga 7680

aagcgcgtat ggatttggct catcaggcca gattgagggt ctgtggacac atgtcatgtt 7740

agtgtacttc aatcgccccc tggatatagc cccgacaata ggccgtggcc tcattttttt 7800

gccttccgca catttccatt gctcggtacc cacaccttgc ttctcctgca cttgccaacc 7860

ttaatactgg tttacattga ccaacatctt acaagcgggg ggcttgtcta gggtatatat 7920

aaacagtggc tctcccaatc ggttgccagt ctcttttttc ctttctttcc ccacagattc 7980

gaaatctaaa ctacacatca cacaatgcct gttactgacg tccttaagcg aaagtccggt 8040

gtcatcgtcg gcgacgatgt ccgagccgtg agtatccacg acaagatcag tgtcgagacg 8100

acgcgttttg tgtaatgaca caatccgaaa gtcgctagca acacacactc tctacacaaa 8160

ctaacccagc tctc 8174

Claims

1.一种分离的核酸分子，所述分离的核酸分子选自：

a)编码Δ17去饱和酶的分离的核苷酸序列，所述分离的核苷酸序

列如SEQ ID NO：7所示；和

b)与(a)完全互补的分离的核苷酸序列。

2.一种嵌合基因，其包含操作性连接在一起的权利要求1的分离的核酸分子和适宜的调节序列。

3.一种转化的耶氏酵母属物种(Yarrowia sp.)，其包含权利要求1的分离的核酸分子。

4.权利要求3的转化耶氏酵母属物种，其选自解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)ATCC#20362、解脂耶氏酵母ATCC#8862、解脂耶氏酵母ATCC#18944和解脂耶氏酵母ATCC#76982。

5.一种生产二十碳五烯酸的方法，所述方法包括：

a)提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包含：

i)编码SEQ ID NO：6所示的Δ17去饱和酶多肽的分离的核苷酸分子；和

ii)花生四烯酸的来源；

b)在其中表达编码Δ17去饱和酶多肽的核苷酸分子和花生四烯酸转变为二十碳五烯酸的条件下培养步骤(a)的宿主细胞；和

c)任选地回收步骤(b)的二十碳五烯酸。

6.一种生产二十碳四烯酸的方法，所述方法包括：

a)提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包含：

ii)二均γ亚麻酸的来源；

b)在其中表达编码Δ17去饱和酶多肽的核苷酸分子和二均γ亚麻酸转变为二十碳四烯酸的条件下培养步骤(a)的宿主细胞；和

c)任选地回收步骤(b)的二十碳四烯酸。

7.权利要求5或6的方法，其中：

a)所述分离的核酸分子如SEQ ID NO：7的核酸序列所示；和

b)所述宿主细胞为解脂耶氏酵母。

8.权利要求5或6的方法，其中所述宿主细胞选自：藻类、细菌、卵菌和真菌。

9.权利要求5或6的方法，其中所述宿主细胞是酵母。

10.权利要求8的方法，其中所述宿主细胞为选自以下的真菌：破囊壶菌属物种(Thraustochytrium sp.)、裂殖壶菌属物种(Schizochytrium sp.)和被孢霉菌属物种(Mortierella sp.)。

11.权利要求9的方法，其中所述酵母为油脂酵母。

12.权利要求11的方法，其中所述油脂酵母选自：耶氏酵母属(Yarrowia)、假丝酵母属(Candida)、红酵母属(Rhodotorula)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、隐球酵母属(Cryptococcus)、丝孢酵母属(Trichosporon)和油脂酵母属(Lipomyces)。

13.权利要求12的方法，其中所述耶氏酵母选自：解脂耶氏酵母ATCC #20362、解脂耶氏酵母ATCC #8862、解脂耶氏酵母ATCC#18944和解脂耶氏酵母ATCC #76982。