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KR101242669B1 - 리포테이코익산 유래 당지질 및 이를 포함하는 조성물 - Google Patents

리포테이코익산 유래 당지질 및 이를 포함하는 조성물 Download PDF

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KR101242669B1
KR101242669B1 KR1020100083196A KR20100083196A KR101242669B1 KR 101242669 B1 KR101242669 B1 KR 101242669B1 KR 1020100083196 A KR1020100083196 A KR 1020100083196A KR 20100083196 A KR20100083196 A KR 20100083196A KR 101242669 B1 KR101242669 B1 KR 101242669B1
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주식회사 알엔에이
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Abstract

본 발명은 리포테이코익산 유래의 당지질 및 이를 포함하는 약학, 식품, 화장품 조성물 및 백신 어쥬번트에 관한 것이다.
본 발명에 따른 리포테이코익산 유래의 당지질은 염증성 사이토카인의 생산을 억제함으로써 항염증 효과를 가지므로 이를 포함하는 약학, 식품 및 화장품 조성물을 염증성 질환의 예방 및 치료 목적으로 사용할 수 있으며, 이를 백신 어쥬번트로도 사용할 수 있다.

Description

리포테이코익산 유래 당지질 및 이를 포함하는 조성물 {Glycolipid from Lipoteichoic Acid and Composition Comprising the Same}
본 발명은 리포테이코익산 유래의 당지질 및 이를 포함하는 약학, 식품, 화장품 조성물 및 백신 어쥬번트에 관한 것이다.
리포테이코익산 (LTA)은 그람양성균의 세포벽 성분 중 하나이다. 리포테이코익산은 일반적으로 글루코스 또는 D-알라닌 치환체를 갖는 폴리인산글리세롤 및 당 단위와 지방산 사슬을 포함하는 당지질의 두 개의 구조체로 구분되어 지는데, 이 중 폴리인산글리세롤의 D-알라닌 함량에 따라서 TNF-α와 같은 염증성 사이토카인의 발현이 조절된다고 알려져 있다 (Morath, S., A. Geyer, et al. 2001, Structure-function relationship of cytokine induction by lipoteichoic acid from Staphylococcus aureus. J. Exp. Med. 193:393-397).
특히 Staphylococcus aureus로부터 분리한 LTA (aLTA)의 경우 그람양성균에서 패혈증을 유발시키는 물질로 알려져 있는데, aLTA는 대식세포와 같은 면역세포의 Toll-like receptor 2 (TLR2) 와 세포막 연관성 CD14에 의하여 인지되어 NF-κB 및 MAP 키나아제의 활성을 통한 염증성 사이토카인의 발현 증가를 유도한다.
그러나 유산균인 락토바실러스(Lactobacillus)로부터 분리한 LTA의 경우 aLTA와는 다른 면역활성을 가지고 있다 (de Vos, W. J. 2005. Lipoteichoic acid in lactobacilli: D-alanine makes the differences. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (31):10763-4). 즉, aLTA는 면역세포로부터 과도한 염증반응을 유도시키는 반면 락토바실러스로부터 분리한 LTA는 면역세포의 염증반응을 억제시키는 작용을 한다. 이러한 LTA의 면역활성의 차이는 두 LTA의 구조적인 차이에서 기인하는 것으로 여겨지는데, 따라서 LTA의 구조를 분석하는 것은 LTA의 기능을 규명하여 면역활성을 조절함에 있어 매우 중요하다.
본 발명은 항염증 효과를 갖는 당지질 및 이를 포함하는 약학, 식품, 화장품 조성물 및 백신 어쥬번트를 제공함을 목적으로 한다.
상기 과제의 해결을 위해, 본 발명은 리포테이코익산 유래의 당지질 및 이를 포함하는 약학, 식품, 화장품 조성물 및 백신 어쥬번트를 제공한다.
본 발명에 따른 리포테이코익산 유래의 당지질은 염증성 사이토카인의 생산을 억제함으로써 항염증 효과를 가지므로 이를 포함하는 약학, 식품 및 화장품 조성물을 염증성 질환의 예방 및 치료 목적으로 사용할 수 있으며, 이를 백신 어쥬번트로도 사용할 수 있다.
도 1은 L. plantarum LTA의 1H, 13C 및 2D-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 2는 L. plantarum LTA의 COSY스펙트럼을 나타낸다.
도 3은 L. plantarum LTA의 HMQC 스펙트럼을 나타낸다. (A: 올레핀 탄소에 연결된 α-메틸렌과 메틸렌, B: α-D-갈락토스와 α-D-글루코스의 아노머 양성자)
도 4는 LTA 가수분해물의 GC/MS 분석결과를 나타낸다.
도 5는 LTA 당지질의 MALDI-TOF MS 스펙트럼을 나타낸다. (A: S. aureus, B: L. plantarum)
도 6은 (A) aLTA 및 (B) pLTA의 intact 당지질 및 O-아세틸화된 당지질의 MALDI-TOF MS 스펙트럼을 나타낸다.
도 7은 pLTA의 당지질의 구조를 나타낸다.
도 8은 pLTA 당지질의 질량을 분석한 표를 나타낸다.
도 9는 (A) aLTA 당지질 및 (B) pLTA 당지질의 LTQ-Orbitrap FTMS 스펙트럼을 나타낸다.
도 10은 LTA 당지질의 음이온 CID 스펙트럼을 나타낸다. (A: 다이헥소실-다이아실-글리세롤, B: 트리헥소실-다이아실-글리세롤)
도 11은 aLTA 당지질의 질량을 분석한 표를 나타낸다.
도 12는 aLTA의 탈아실화된 당지질의 MALDI-TOF MS 스펙트럼을 나타낸다. (a: intact 당지질, b: NaOH 처리한 당지질, c: Ca(OH)2 처리한 당지질)
도 13은 pLTA, dLTA, rLTA 및 sLTA의 당지질 부위에 대한 MALDI-TOF 분석 결과를 나타낸다.
도 14는 intact aLTA와 pLTA, 이들로부터 유래한 당지질 및 폴리인산글리세롤의 TNF-α 발현 유도 실험 결과를 나타낸다.
도 15는 intact aLTA, de-alanine aLTA 및 de-acyl aLTA 의 TNF-α 발현 억제 실험 결과를 나타낸다.
도 16는 intact pLTA, de-alanine pLTA 및 de-acyl pLTA 의 TNF-α 발현 억제 실험 결과를 나타낸다.
도 17은 pLTA 유래 당지질을 전 처리한 세포에서 TNF-α의 발현이 감소함을 나타낸다.
도 18은 서로 다른 LTA에서 분리한 당지질의 TNF-α의 발현 억제 효과를 보여준다.
도 19는pLTA 처리에 따른 S. flexneri 펩티도글리칸-유도 TNF-α 및 IL-1β의 발현 억제 효과를 나타낸다. (A: TNF-α의 발현 측정, B: IL-1β의 발현 측정, C: 폴리믹신 B 처리후 TNF-α의 발현 측정)
도 20은 S. flexneri 펩티도글리칸-유도 염증반응에 있어서 pLTA 처리에 따른 (A) NOD2 mRNA의 발현양 변화, (B) NOD2 단백질의 발현양 변화, 및 (C) NF- κB 의 활성 변화를 나타낸다.
도 21은 S. flexneri 펩티도글리칸-유도 염증반응에 있어서 pLTA 처리에 따른 TNF-α의 발현 변화를 측정한 결과를 나타낸다. (A: 컨트롤 siRNA를 형질전환시킨 THP-1 세포, B: TLR2 siRNA를 형질전환시킨 THP-1 세포, C: 정상 마우스로부터 분리한 BMM, D: TLR2 녹아웃 마우스로부터 분리한 BMM)
도 22는 pLTA 처리에 따른 MAP 키나아제 및 NF-κB의 활성의 변화를 나타낸다. (A: phosphor-ERK 및 phosphor-SAPK/JNK 활성, B: IκB-α 분해 활성, C: 면역형광 염색법에 의한 NF-κB 활성 측정)
도 23은 PBS 또는 pLTA를 복강주사한 패혈증 유발 마우스의 (A) 생존율 및 (B) 혈액내 TNF-α의 함유량을 나타낸다.
도 24는 pLTA의 처리에 따른 (A) DNCB-유발 아토피 마우스의 피부병변 및 (B) 피부조직 내 IL-4 분포를 나타낸다.
도 25는 rLTA 를 전처리한 세포에서 TNF-α의 발현이 감소함을 나타낸다.
도 26은 다양한 LTA의 TNF-α의 발현 억제 효과를 보여준다.
도 27은 특정한 신호 억제제 처리에 따른 다양한 LTA의 TNF-α의 발현 억제 효과를 보여준다.
유산균 유래의 리포테이코익산은 염증성 사이토카인의 발현을 억제하는 항염증 활성을 유도한다. 본 발명자들은 본 발명을 통해 유산균인 락토바실러스 플랜타륨(Lactobacillus plantarum) 유래의 리포테이코익산 (pLTA) 이 염증반응을 유도하는 aLTA와는 다른 당지질 구조를 가짐을 밝혀내었다. 특히 pLTA 자체뿐만 아니라, pLTA의 폴리인산글리세롤 부분을 제거한 당지질 부분만으로도 염증성 사이토카인의 발현을 억제하는 항염증 효과가 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다. 즉, pLTA의 당지질 구조를 기초로 하여 이와 유사한 다양한 당지질 변이체들을 제조함으로써 항염증 효과를 갖는 다양한 당지질 변이체들을 효과적으로 활용할 수 있다.
본 발명은 알파 결합으로 연결된 이중 또는 삼중 헥소스의 C1, C3, C4 및 C6번 위치 중 어느 한 곳 이상에 C10 내지 C 30 의 포화 또는 불포화된 2 내지 6개의 아실 사슬이 결합되어 있는 당지질을 제공한다.
이때 상기 헥소스는 글루코스, 갈락토스, 마노스 또는 프룩토스일 수 있으며, 바람직하게는 글루코스 또는 갈락토스일 수 있다.
또한 상기 당지질은 하나 이상의 불포화된 아실 사슬을 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 당지질은 하기 화학식 I 의 구조를 갖는 당지질일 수 있다.
[화학식 I]
Figure 112012066997015-pat00070
상기 식에서, R1 내지 R4는 각각 독립적으로 하이드록시,
Figure 112010055377316-pat00002
,
Figure 112010055377316-pat00003
,
Figure 112010055377316-pat00004
또는
Figure 112010055377316-pat00005
일 수 있다. 이때 R'는 각각 독립적으로 C10 내지 C 30 의 포화 또는 불포화된 아실 사슬일 수 있으며, 구체적으로는 C14 내지 C 26 의 포화 또는 불포화된 아실 사슬, C14 내지 C24 의 포화 또는 불포화된 아실 사슬, C14 내지 C 22 의 포화 또는 불포화된 아실 사슬, C14 내지 C 20 의 포화 또는 불포화된 아실 사슬, C14 내지 C 18 의 포화 또는 불포화된 아실 사슬, C16 내지 C 20 의 포화 또는 불포화된 아실 사슬, 또는 C16 내지 C 18 의 포화 또는 불포화된 아실 사슬일 수 있다. n은 0 또는 1 일 수 있으며, Cm은 C4 내지 C 30 의 알킬, 구체적으로는 C6 내지 C 26 의 알킬 또는 C10 내지 C 24 의 알킬일 수 있고, 상기 당지질 내 아실 사슬의 총 수는 2 내지 6, 구체적으로는 2 내지 4 또는 2 내지 3일 수 있다.
더욱 구체적으로, 상기 화학식 I에서 R1 은
Figure 112010055377316-pat00006
일 수 있다. 이때 R'는 각각 독립적으로 C10 내지 C 30 의 포화 또는 불포화된 아실 사슬, 구체적으로는 C14 내지 C 26 의 포화 또는 불포화된 아실 사슬, C14 내지 C24 의 포화 또는 불포화된 아실 사슬, C14 내지 C 22 의 포화 또는 불포화된 아실 사슬, C14 내지 C 20 의 포화 또는 불포화된 아실 사슬, C14 내지 C 18 의 포화 또는 불포화된 아실 사슬, C16 내지 C 20 의 포화 또는 불포화된 아실 사슬, 또는 C16 내지 C 18 의 포화 또는 불포화된 아실 사슬일 수 있으며, R2 내지 R4 는 하이드록시일 수 있고, n은 1이며, 1 내지 14개의 이중결합, 구체적으로는 1 내지 10개의 이중결합, 1 내지 8개의 이중결합, 1 내지 6개의 이중결합, 1 내지 4개의 이중결합, 1 내지 3개의 이중결합 또는 1 내지 2개의 이중결합을 갖는 아실 사슬을 하나 이상 포함할 수 있다.
또한 구체적으로, 상기 화학식 I에서 R1 은
Figure 112010055377316-pat00007
일 수 있고, 이때 R2 , R3 또는 R4 중 어느 하나는
Figure 112010055377316-pat00008
이고, 나머지는 하이드록시일 수 있다. 이때 R'는 각각 독립적으로 C10 내지 C 30 의 포화 또는 불포화된 아실 사슬, 구체적으로는 C14 내지 C 26 의 포화 또는 불포화된 아실 사슬, C14 내지 C24 의 포화 또는 불포화된 아실 사슬, C14 내지 C 22 의 포화 또는 불포화된 아실 사슬, C14 내지 C 20 의 포화 또는 불포화된 아실 사슬, C14 내지 C 18 의 포화 또는 불포화된 아실 사슬, C16 내지 C 20 의 포화 또는 불포화된 아실 사슬, 또는 C16 내지 C 18 의 포화 또는 불포화된 아실 사슬일 수 있으며, n은 1이고, 1 내지 14개의 이중결합, 구체적으로는 1 내지 10개의 이중결합, 1 내지 8개의 이중결합, 1 내지 6개의 이중결합, 1 내지 4개의 이중결합, 1 내지 3개의 이중결합 또는 1 내지 2개의 이중결합을 갖는 아실 사슬을 하나 이상 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 화학식 I의 당지질은 하기 화학식 I-1 또는 화학식 I-2의 구조를 갖는 당지질일 수 있다.
[화학식 I-1]
Figure 112010055377316-pat00009
[화학식 I-2]
Figure 112010055377316-pat00010
이 때 상기 화학식 I-1 또는 화학식 I-2에 나타난 이중결합의 위치는 달라질 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 당지질은 유산균 유래의 당지질일 수 있으며, 상기 유산균은 이에 제한되는 것은 아니지만 락토바실러스 (Lactobacillus), 비피도박테리움 (Bifidobacterium), 스트렙토코커스 (streptococcus) 또는 락토코커스 (Lactococcus) 속 일 수 있다. 락토바실러스는 예를 들어 락토바실러스 플랜타륨(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 람노서스 (Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 델브르키(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실러스 엑시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 락토바실러스 존스니(Lactoacillus johnsonni), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei)일 수 있으며, 비피도박테리움은 예를 들어 비피도박테리움 비피도(Bifidobacterium bifido), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis), 비피도박테리움 아니말리스(bifidobacterium animalis)일 수 있고, 스트렙토코커스는 예를 들어 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus)일 수 있으며, 락토코커스는 예를 들어 락토코커스 락티스 (Lactococcus lactis) 일 수 있다.
리포테이코익산 (LTA) 중 구조가 가장 잘 밝혀진 것은 스트렙토코커스 아우레우스(S. aureus)의 LTA (aLTA)이다. 병원성 미생물인 S. aureus 유래의 aLTA는 면역증강활성을 유도하여 염증성 사이토카인의 발현을 증가시킨다. 하기 화학식 III에 나타나듯이, aLTA의 백본은 두 개의 글루코스가 베타 결합으로 연결되어 있는 겐티오비오스 [β1→6 연결]로 알려져 있으며, 글루코스의 C6 와 1,3-포스포디에스테르 결합된 폴리인산글리세롤 사슬이 연결되어 있다. 또한 평균 15개의 탄소를 갖는 두 개의 포화 지방산 사슬(C15 :0) 이 에스테르 결합에 의하여 글루코스의 C1에 연결되어 있다.
[화학식 III]
Figure 112010055377316-pat00011
반면 유산균인 pLTA 유래의 리포테이코익산은 염증성 사이토카인의 발현을 억제하는 항염증 활성을 유도하는데, 본 발명에서 밝혀낸 pLTA 당지질의 구조는 알파 결합으로 연결된 세 개의 헥소스를 백본으로 가지며, 지방산 아실 사슬이 결합되어 있는 헥소스의 반대쪽 말단 헥소스의 C6위치에 1,3-포스포디에스테르 결합된 폴리인산글리세롤 사슬이 연결되어 있는 것을 특징으로 한다. 또한 pLTA의 당지질은 첫번째 헥소스의 C1 또는 C6 위치에 두 개 또는 세 개의 지방산 아실 사슬이 에스테르 결합에 의하여 연결되어 있는 것을 특징으로 한다. pLTA 유래의 당지질은 구체적으로는 화학식 I-1 또는 화학식 I-2의 구조를 가질 수 있으며, 다만 상기 화학식에서 이중 결합의 위치는 달라질 수 있다. 화학식 I-1 은 헥소스의 C1위치에 탄소수 18의 포화 지방산 아실 사슬과 (C18 :0) 탄소수 18의 불포화 지방산 아실 사슬(C18 :2)이 결합되어 있는 pLTA의 그룹 I당지질을 나타낸다. 화학식 I-2는 상기 화학식 I-1의 당지질의 헥소스의 C6위치에 탄소수 16의 포화 지방산 사슬(C16 :0)을 추가로 포함하는 것으로서, pLTA의 그룹 II 당지질을 나타낸다. 헥소스의 결합, 지방산 사슬의 수, 이들의 결합 위치, 탄소수, 및 불포화 지방산의 유무는 TLR2가 리포테이코익산을 인지하는데 있어서 중요한 역할을 하며, 따라서 이러한 구조적 특성이 LTA의 항염증 활성을 유도하는 중요한 요인이 된다.
종래에 리포테이코익산의 폴리인산글리세롤의 D-알라닌 함량에 따라서 TNF-α와 같은 염증성 사이토카인의 발현이 조절된다고 알려진 것과 달리, 하기 실시예에 따르면 pLTA의 경우 폴리인산글리세롤의 D-알라닌 보다 지방산 아실 사슬을 포함하는 당지질 구조체가 염증성 사이토카인의 발현 조절에 더욱 중요한 역할을 하는 것을 알 수 있으며, 본 발명자들은 pLTA 유래의 당지질이 그 자체로서 염증성 사이토카인인 TNF-α의 발현을 억제함으로써 항염증 효과를 가짐을 밝혀내었다. pLTA 유래의 당지질 외에도 pLTA와 유사한 구조를 갖는 락토바실러스 람노서스 (L. rhamnosus) 유래의 rLTA 및 락토바실러스 델브르키(L. delbreukii) 유래의 dLTA의 경우도 마찬가지로 당지질 부분만으로 염증성 사이토카인인 TNF-α의 발현을 억제함으로써 항염증 효과를 가짐을 확인하였다.
또한 본 발명은 아실 사슬이 결합되어 있는 헥소스의 반대쪽 말단 헥소스의 C6 위치에 폴리인산글리세롤이 추가로 결합된 당지질을 제공한다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 당지질은 하기 화학식 II의 구조를 갖는 당지질일 수 있다.
[화학식 II]
Figure 112010055377316-pat00012
상기 식에서,
R1 내지 R4는 각각 독립적으로 하이드록시,
Figure 112010055377316-pat00013
,
Figure 112010055377316-pat00014
,
Figure 112010055377316-pat00015
또는
Figure 112010055377316-pat00016
일 수 있다. 이때 R'는 각각 독립적으로 C10 내지 C 30 의 포화 또는 불포화된 아실 사슬일 수 있으며, 구체적으로는 C14 내지 C 26 의 포화 또는 불포화된 아실 사슬, C14 내지 C24 의 포화 또는 불포화된 아실 사슬, C14 내지 C 22 의 포화 또는 불포화된 아실 사슬, C14 내지 C 20 의 포화 또는 불포화된 아실 사슬, C14 내지 C 18 의 포화 또는 불포화된 아실 사슬, C16 내지 C 20 의 포화 또는 불포화된 아실 사슬, 또는 C16 내지 C 18 의 포화 또는 불포화된 아실 사슬일 수 있다. R''는 각각 독립적으로 N-아세틸글루코사민, D-알라닌 또는 하이드록시일 수 있다. n은 0 또는 1 이고, Cm은 C4 내지 C 30 의 알킬, 구체적으로는 C6 내지 C 26 의 알킬 또는 C10 내지 C 24 의 알킬일 수 있으며, l 은 0 내지 80, 구체적으로는 0 내지 60, 0 내지 40, 또는 0 내지 20일 수 있다. 상기 당지질 내 아실 사슬의 총 수는 2 내지 6, 구체적으로는 2 내지 4, 또는 2 내지 3일 수 있다.
구체적으로, 상기 화학식 II에 있어서, R1 은
Figure 112010055377316-pat00017
일 수 있다. 이때 R'는 각각 독립적으로 C10 내지 C 30 의 포화 또는 불포화된 아실 사슬, 구체적으로는 C14 내지 C 26 의 포화 또는 불포화된 아실 사슬, C14 내지 C24 의 포화 또는 불포화된 아실 사슬, C14 내지 C 22 의 포화 또는 불포화된 아실 사슬, C14 내지 C 20 의 포화 또는 불포화된 아실 사슬, C14 내지 C 18 의 포화 또는 불포화된 아실 사슬, C16 내지 C 20 의 포화 또는 불포화된 아실 사슬, 또는 C16 내지 C 18 의 포화 또는 불포화된 아실 사슬일 수 있으며, R''는 각각 독립적으로 N-아세틸글루코사민, D-알라닌 또는 하이드록시일 수 있고, R2 내지 R4 는 하이드록시일 수 있다. n은 1이고, l은 0 내지 80, 구체적으로는 0 내지 60, 0 내지 40, 또는 0 내지 20일 수 있으며, 1 내지 14개의 이중결합, 구체적으로는 1 내지 10개의 이중결합, 1 내지 8개의 이중결합, 1 내지 6개의 이중결합, 1 내지 4개의 이중결합, 1 내지 3개의 이중결합 또는 1 내지 2개의 이중결합을 갖는 아실 사슬을 하나 이상 포함할 수 있다.
또한 구체적으로, 상기 화학식 II 에 있어서, R1 은
Figure 112010055377316-pat00018
일 수 있고, 이때 R2 , R3 또는 R4 중 어느 하나는
Figure 112010055377316-pat00019
이고, 나머지는 하이드록시일 수 있다. 이때 R'는 각각 독립적으로 C10 내지 C 30 의 포화 또는 불포화된 아실 사슬, 구체적으로는 C14 내지 C 26 의 포화 또는 불포화된 아실 사슬, C14 내지 C24 의 포화 또는 불포화된 아실 사슬, C14 내지 C 22 의 포화 또는 불포화된 아실 사슬, C14 내지 C 20 의 포화 또는 불포화된 아실 사슬, C14 내지 C 18 의 포화 또는 불포화된 아실 사슬, C16 내지 C 20 의 포화 또는 불포화된 아실 사슬, 또는 C16 내지 C 18 의 포화 또는 불포화된 아실 사슬일 수 있으며, R''는 각각 독립적으로 N-아세틸글루코사민, D-알라닌 또는 하이드록시일 수 있다. n은 1이고, l은 0 내지 80, 구체적으로는 0 내지 60, 0 내지 40, 또는 0 내지 20일 수 있으며, 1 내지 14개의 이중결합, 구체적으로는 1 내지 10개의 이중결합, 1 내지 8개의 이중결합, 1 내지 6개의 이중결합, 1 내지 4개의 이중결합, 1 내지 3개의 이중결합 또는 1 내지 2개의 이중결합을 갖는 아실 사슬을 하나 이상 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 화학식 II는 하기 화학식 II-1 또는 화학식 II-2일 수 있다.
[화학식 II-1]
Figure 112010055377316-pat00020

[화학식 II-2]
Figure 112010055377316-pat00021

상기 식에서, R''는 각각 독립적으로 N-아세틸글루코사민, D-알라닌 또는 하이드록시일 수 있고, l은 0 내지 80, 구체적으로는 0 내지 60, 0 내지 40 또는 0 내지 20일 수 있다.
또한 상기 화학식 I-1 또는 화학식 I-2에 나타난 이중결합의 위치는 달라질 수 있다. 본 발명의 한 구체예에서, 폴리인산글리세롤이 추가로 결합된 당지질은 유산균 유래의 리포테이코익산일 수 있으며, 상기 유산균은 이에 제한되는 것은 아니지만 락토바실러스 (Lactobacillus), 비피도박테리움 (Bifidobacterium), 스트렙토코커스 (streptococcus) 또는 락토코커스 (Lactococcus) 속 일 수 있다. 락토바실러스는 예를 들어 락토바실러스 플랜타륨(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 람노서스 (Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 델브르키(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실러스 엑시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 락토바실러스 존스니(Lactoacillus johnsonni), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei)일 수 있으며, 비피도박테리움은 예를 들어 비피도박테리움 비피도(Bifidobacterium bifido), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis), 비피도박테리움 아니말리스(bifidobacterium animalis)일 수 있고, 스트렙토코커스는 예를 들어 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus)일 수 있으며, 락토코커스는 예를 들어 락토코커스 락티스 (Lactococcus lactis) 일 수 있다.
본 발명은 또한 상기의 당지질을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 당지질은 하기 실시예를 통하여 알 수 있듯이, 내성독소 LPS 자극에 의한 NF-kB의 활성 및 IkB-α의 분해를 억제하고 TLR2의 발현을 억제함으로써 염증성 사이토카인 TNF-α 및 IL-8의 발현을 억제하는 항염증 효과를 갖는다.
본 발명에 따른 당지질을 포함하는 약학 조성물은 통상적인 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사액제의 형태로 제형화하여 사용할 수 있으며, 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 항생제, 담체, 부형제 및 희석제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.
구체적으로 담체, 부형제 및 희석제는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 사용할 수 있으며, 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 있으며 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기재로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학조성물에서 당지질은 약학조성물 100 중량부에 대해 0.01 내지 99.9 중량부, 0.1 내지 90 중량부, 1 내지 80 중량부, 또는 10 내지 80 중량부로 포함될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니고, 환자의 상태 및 질환의 종류 및 진행 정도에 따라 변할 수 있다.
본 발명에 따른 당지질은 항염증 활성을 갖는바 염증성 질환 또는 면역관련 질환의 예방 및 치료에 사용될 수 있다. 따라서 본 발명은 상기의 당지질을 포함하는 염증성 질환 또는 면역관련 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물, 염증성 질환 또는 면역관련 질환의 예방 및 치료용 의약의 제조를 위한 상기 당지질의 용도 및 치료상 유효량의 당지질을 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 염증성 질환의 예방 및 치료 방법을 제공한다.
구체적으로 상기 염증성 질환 또는 면역관련 질환은 패혈증, 동맥경화, 균혈증, 전신염증반응증후군, 다장기기능부전, 암, 골다공증, 치주염, 전신성 홍반성 루푸스, 류마티스성 관절염, 골관절염, 유년형 만성 관절염, 척추관절증, 전신성 경화증, 특발성 염증성 근장애, 쇼그렌 증후군 (Sjoegren's syndrome), 전신성 맥관염, 유육종증 (sarcoidosis), 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역성 혈소판감소증, 갑상선염, 진성당뇨병, 면역 매개성 신장 질환, 중추신경계 또는 말초신경계의 탈수초 질환, 특발성 탈수초 다발성 신경염, 길랑-바레 증후군 (Guillain-Barre syndrome), 만성 염증성 탈수초 다발성 신경염, 간담즙성 질환, 감염성 또는 자가면역성 만성 활성 간염, 원발성 담즙성 간경변, 육아종성 간염, 경화성 담관염, 염증성 장질환 (Inflammatory bowel disease, IBD), 궤양성 대장염 (Ulcerative colitis), 크론병 (Crohn's disease), 과민성 대장 증후군 (Irritable Bowel Syndrome), 글루텐 (gluten) 민감성 장질환, 휘플병 (Whipple's disease), 자가면역성 또는 면역 매개성 피부 질환, 수포성 피부 질환 다형홍반, 접촉성 피부염, 건선, 알레르기성 질환, 천식, 알레르기성 비염, 아토피성 피부염, 음식물 과민증, 두드러기, 폐의 면역질환, 호산구성 폐렴, 특발성 폐 섬유증, 과민성 폐렴, 이식 관련 질환 이식 거부 또는 이식 편대숙주질환 등일 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서 상기 당지질은 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 대상체로 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 당지질의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질환의 종류 및 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 달라질 수 있으며 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 1일 투여량이 0.01 내지 1,000 mg/kg, 구체적으로는 0.1 내지 1,000 mg/kg인 것이 바람직하다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고 수회로 나누어 투여할 수도 있으며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, '대상체'는 인간, 오랑우탄, 침팬지, 마우스, 랫트, 개, 소, 닭, 돼지, 염소, 양 등을 포함하나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 또한 상기 당지질을 포함하는 식품 조성물을 제공한다. 상기 식품 조성물은 패혈증, 동맥경화, 균혈증, 전신염증반응증후군, 다장기기능부전, 암, 골다공증, 치주염, 전신성 홍반성 루푸스, 류마티스성 관절염, 골관절염, 유년형 만성 관절염, 척추관절증, 전신성 경화증, 특발성 염증성 근장애, 쇼그렌 증후군 (Sjoegren's syndrome), 전신성 맥관염, 유육종증 (sarcoidosis), 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역성 혈소판감소증, 갑상선염, 진성당뇨병, 면역 매개성 신장 질환, 중추신경계 또는 말초신경계의 탈수초 질환, 특발성 탈수초 다발성 신경염, 길랑-바레 증후군 (Guillain-Barre syndrome), 만성 염증성 탈수초 다발성 신경염, 간담즙성 질환, 감염성 또는 자가면역성 만성 활성 간염, 원발성 담즙성 간경변, 육아종성 간염, 경화성 담관염, 염증성 장질환 (Inflammatory bowel disease, IBD), 궤양성 대장염 (Ulcerative colitis), 크론병 (Crohn's disease), 과민성 대장 증후군 (Irritable Bowel Syndrome), 글루텐 (gluten) 민감성 장질환, 휘플병 (Whipple's disease), 자가면역성 또는 면역 매개성 피부 질환, 수포성 피부 질환 다형홍반, 접촉성 피부염, 건선, 알레르기성 질환, 천식, 알레르기성 비염, 아토피성 피부염, 음식물 과민증, 두드러기, 폐의 면역질환, 호산구성 폐렴, 특발성 폐 섬유증, 과민성 폐렴, 이식 관련 질환 이식 거부 또는 이식 편대숙주질환 등의 염증성 질환 또는 면역관련 질환의 예방 및 치료 효과를 나타낼 수 있는 기능성 식품 및 일반 식품의 제조에 사용될 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기 식품 조성물은 이에 제한되는 것은 아니지만 유기산, 인산염, 항산화제, 유당 카제인, 덱스트린, 포도당, 설탕 및 솔비톨로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다. 유기산은 이에 제한되는 것은 아니지만 구연산, 후말산, 아디픽산, 젖산 또는 사과산일 수 있으며, 인산염은 이에 제한되는 것은 아니지만 인산나트륨, 인산칼륨, 산성피로인산염 또는 폴리인산염(중합인산염)일 수 있으며, 항산화제는 이에 제한되는 것은 아니지만 폴리페놀, 카테킨, 알파-토코페롤, 로즈마리 추출물, 감초 추출물, 키토산, 탄닌산 또는 피틴산 등의 천연 항산화제일 수 있다.
본 발명에 있어서 당지질은 식품 조성물 100 중량부에 대해 0.01 내지 99.9 중량부로 포함될 수 있으며, 구체적으로는 1 내지 90 중량부 또는 30 내지 80 중량부로 포함될 수 있다.
또한 본 발명의 한 구체예에서 식품 조성물의 제형은 이에 제한되는 것은 아니지만 고형, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 액상 형태일 수 있다.
본 발명에 따른 당지질을 포함하는 식품 조성물은 이에 제한되는 것은 아니지만 과자류, 당류, 아이스크림 제품류, 유가공품, 식육제품, 어육제품, 두부류 또는 묵류, 식용유지류, 면류, 다류, 음료류, 특수영양식품, 건강보조식품, 조미식품, 얼음, 인삼제품류, 김치절임식품, 건포류, 과일, 야채, 과일 또는 야채의 건조제품, 절단제품, 과일쥬스, 야채쥬스, 이들의 혼합쥬스, 칩류, 면류, 축산가공식품, 수산가공식품, 유가공식품, 발효유식품, 두류식품, 곡류식품, 미생물발효식품, 제과제빵, 양념류, 육가공류, 산성음료수, 감초류, 허브류 등의 식품의 제조에 사용될 수 있다. 상기 식품의 형태는 이에 제한되는 것은 아니지만 고형, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 액상 또는 음료 형태를 포함한다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 당지질을 포함하는 조성물을 건강기능식품의 제조에 사용할 경우에는 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 사용될 수 있으며, 음료의 제조에 사용할 경우에는 전체 음료 중량의 0.02 내지 10 중량%, 또는 0.3 내지 1 중량%로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 식품 조성물은 상기 당지질 이외에도 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 식품 조성물은 천연 과일 주스, 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 이에 제한되는 것은 아니지만 본 발명의 조성물 100 중량부당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
또한 본 발명은 상기 당지질을 포함하는 화장품 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서 당지질은 화장품 조성물 100 중량부에 대해 0.01 내지 99.9 중량부로 포함될 수 있으며, 구체적으로는 1 내지 90 중량부 또는 30 내지 80 중량부로 포함될 수 있다.
본 발명에 의한 화장품 조성물이 사용되는 화장품은 그 제형에 있어서 이에 한정되는 것은 아니지만 예를 들어 유연화장수, 영양화장수, 마사지크림, 영양크림, 팩, 젤, 에센스, 립스틱, 메이크업 베이스, 파운데이션, 로션, 연고, 겔, 크림, 클렌징, 세안제, 비누, 샴푸, 린스, 트리트먼트 및 미용액 등에 포함될 수 있다. 이러한 화장품은 수성 비타민, 유성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 스핑고 지질 등의 통상의 성분들을 포함할 수 있으며, 당업자에게 널리 공지된 기술에 따라 용이하게 제조될 수 있다.
또한 상기 성분과 더불어 화장품에 통상 사용되는 첨가제, 예를 들어, 비타민, 아미노산, 단백질, 계면활성제, 유화제, 향료, 색소, 안정제, 방부제, 항산화제, 자외선 차단제, pH 조정제 및 킬레이트제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.
또한 본 발명은 상기 당지질로 이루어지거나 이를 포함하는 백신 어쥬번트를 제공한다.
본 발명에 따른 당지질은 다양한 목적으로 이용될 수 있다. 하나의 바람직한 용도는 면역원성 폴리뉴클레오티드(immunogenic polynucleotide), 폴리펩타이드, 항체, T-세포, 또는 항원-제공 세포(APC)를 포함하는 의약 조성물 용의 면역자극제 또는 어쥬번트로 사용되는 것이다.
어쥬번트는 백신의 보다 빠른 항체 형성을 유도함으로써 항원에 대한 면역 반응을 강력하게 하는 기질을 의미한다. 본 발명에 따른 당지질은 염증성 사이토카인의 발현에 영향을 줄 뿐만 아니라 adherent molecule의 발현 등 면역 작용에도 영향을 미침으로써 항원에 대한 면역 반응을 증가시킬 수 있다. 또한 그 자체로서 면역원성(immunogenicity)이 없기 때문에 백신 어쥬번트로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 당지질이 자극할 수 있는 하나의 면역 반응은 Th1 또는 Th2 유형이며, 따라서 본 발명에 따른 어쥬번트는 Th1 또는 Th2 유형의 면역 반응을 우점적으로 유도하도록 디자인할 수 있다. 고농도의 Th1-유형 사이토카인(예컨대, TNF-α, IFN-γ, IL-2 및 IL-12)은 투여된 항원에 대한 세포 매개된 면역 반응의 유도를 조력하는 경향이 있다. 대조적으로, 고농도의 Th2-유형 사이토카인(예, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 및 TNF-β)은 체액성 면역 반응의 유도를 조력하는 경향이 있다. 본 발명에 따른 당지질을 포함하는 백신의 적용 후 환자는 Th1- 및 Th2-유형의 반응을 포함하는 면역 반응을 유지할 것이다. 반응이 주로 Th1-유형인 경우, Th1-유형 사이토카인의 농도는 Th2-유형 사이토킨의 농도보다 큰 정도로 증가할 것이다. 이들 사이토카인의 농도는 표준 분석법을 사용하여 용이하게 평가할 수 있다. 사이토카인 패밀리의 조사를 위해서 문헌[Mosmann and Coffman, Ann. Rev. Immunol. 7:145-173, 1989]을 참조할 수 있다. (CpG 디뉴클레오타이드가 비메틸화된) CpG-함유 올리고뉴클레오타이드가 또한 주로 Th1 반응을 유도하는데, 이러한 올리고뉴클레오타이드는 익히 공지되어 있으며, 예를 들어 WO 제96/02555호에 기술되어 있다.
우세한 Th1 또는 Th2 유형 반응을 유도하기 위해 사용하기에 바람직한 어쥬번트는 알루미늄 염과 함께 상기 당지질을 포함할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
< 실험예 >
하기의 실험예는 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.
LTA 및 LTA 유래 당지질과 폴리인산글리세롤의 분리·정제
LTA의 분리는 기존에 보고된 (Morath, S., A. Geyer, et al. 2001. Structure-function relationship of cytokine induction by lipoteichoic acid from Staphylococcus aureus. J. Exp. Med. 193(3):393-7.) 방법을 참고하여 수행하였다. 100g의 세포 (wet weight)를 0.1 M 구연산나트륩 버퍼 (pH 4.7) 400 ml로 현탁 시킨 후 초음파 처리하여 세포를 파쇄하였다. 동량의 n-부탄올을 첨가하여 30분간 섞어준 후 원심분리를 통하여 LTA가 포함된 수용층을 분리하였다. 15% n-프로판올과 0.1 M 구연산나트륨 버퍼 (pH 4.7)를 첨가 하여 LTA 절편을 분리한 후 반투과막을 이용하여 투석하였다. 이후 옥틸-세파로즈 컬럼 CL-4B (2.5 cm x 10 cm)을 이용한 소수성 상호작용 크로마토그래피를 수행하였다. 15% n-프로판올과 0.1 M 아세트산나트륨 버퍼 (pH 4.7)가 포함된 버퍼 200 ml을 이용하여 컬럼을 세척 한 후 300 ml의 용출 버퍼 (35% n-프로판올, 0.1 M 아세트산나트륨, pH 4.7)를 이용하여 LTA를 채집하였다. LTA가 포함된 절편은 다시 DEAE-세파로즈 이온교환크로마토그래피(1.5 cm x 10 cm)를 위하여 평형 버퍼 (30% n-프로판올, 0.1 M 아세테이트 버퍼, pH 4.7)를 첨가 한 후 컬럼에 충전하였다. 300 ml의 일련의 NaCl (0~1 M)이 포함된 평형 버퍼를 이용하여 LTA를 채집하였다.
LTA 유래 당지질의 분리는 30 mg의 intact LTA를 500㎖ 의 98% (v/v) 아세트산 수용액에 녹인 후 30분간 초음파 처리하고 100℃에서 3시간 동안 가열함으로써 수행하였다. vacuum을 이용하여 용매를 제거 시킨 후 클로로폼/메탄올/물 (1:1:0.9, v/v/v)을 이용하여 당지질을 분리하였다. 당지질은 유기층에서 추출하였으며, 폴리인산글리세롤은 용매층에서 추출하였다.
핵자기공명( NMR ) 분광법
NMR 실험은 x,y,z-shielded gradient triple resonance 프로브 또는 z-shielded gradient triple resonance cryo 프로브를 갖추고 있는 Avance-600 MHz 와 Avance-800 MHz 고해상도 NMR 분광기를 사용하였다. 10 mg의 LTA를 0.5 ml의 2H2O 용액에 녹였다. 2H2O는 기준 신호(4.75 ppm, 1H)로 사용하였다. Homonuclear assignment는 correlation spectroscopy (COSY), double-quantum filtered correlation spectroscopy (DQF-COSY), total correlation spectroscopy (TOCSY), rotating frame Overhauser enhancement spectroscopy (ROSEY) 스펙트럼으로부터 얻었다. 13C assignment는 heteronuclear multiple-quantum correlation (HMQC)와 heteronuclear multiple-bond correlation (HMBC) 실험에 기초하였다. 모든 스펙트럼은 300 K에서 기록하였으며, NMR 데이터는 programs nmrPipe28을 이용하여 처리하였고 Sparky를 사용하여 시각화 하였다.
당지질의 마일드 알칼리 가수분해( Mild alkaline hydrolysis )
당지질의 mild alkali-labile component를 결정하기 위하여 50 μg의 시료를 200 μl의 0.5 M NaOH을 이용하여 56℃에서 60분간 용해시켰다. 이 후 3 N HCl을 이용하여 산성화를 시킨 후 헥산(hexane)과 섞었다. 지방산이 포함되어 있는 상층액을 제거 시킨 후 염을 제거하기 위하여 하층액을 건조 시켰다. 잔기를 클로로폼/메탄올/물 (8:4:3, v/v) 용액으로 구획시킨 후 원심분리를 통하여 층을 분리하고 상층액을 제거하였다. 다시 염을 제거하기 위하여 하층액을 건조시킨 후 잔기를 클로로폼/메탄올 (1:1, v/v) 용액에 녹인 후 MALDI-TOF MS 분석에 사용하였다.
엑소글리코시다아제 ( Exoglycosidase ) 처리
당지질을 0.1% 소듐 타우로데옥시콜레이트를 포함하는 50 μl의 50 mM NH4HCO3 버퍼로 현탁한 후 α-글루코시다아제 (Saccharomyces cerevisiae), β-글루코시다아제 (아몬드), α-갈락토시다아제 (커피 생두), 또는 β-갈락토시다아제 (E. coli)를 첨가하여 37℃에서 48시간 동안 처리하였다. 이 후 클로로폼:메탄올 (1:1, v/v) 1.35 ml과 100 μl의 DW를 첨가하여 층을 분리하고, 하층을 건조 시켜 연계 분석(linkage analysis) 하였다.
MALDI - TOF MS
0.5 μl의 당지질 용액을 매트리스 용액(2,5-디하이드록시벤조산 용액, 30 mg/ml in 70% 아세토니트릴/30% 물 [v/v], 0.5 μl)에 첨가한 후 MALDI 프로브에 적용하였다. 정제된 당지질을 직접 또는 O-아세틸레이션 후 MALDI-TOF MS를 통하여 분석하였다. 정제된 당지질을 80℃에서 2시간 동안 피리딘:아세트산무수물 (1:1, v/v) 200 μl로 O-아세틸레이션 시켰다. 이 후 용매를 제거 시킨 후 MALDI-TOF MS로 분석을 수행하였다.
플루오린화수소산을 이용한 LTA 의 부분적 가수분해
폴리인산글리세롤 백본의 부분적 또는 완벽한 가수분해를 위하여, 1 mg의 LTA를 100 μl의 48% 플루오린화수소산(HF)에 첨가 후 4℃에서 5~48시간 동안 처리하였다. 이 후 포화된 리튬 하이드록사이드(LiOH)로 중화 시킨 후 원심분리 (12,000 x g, 10 min)를 통하여 침전물을 제거하였다. 상층액을 수집하여 TLC 및 ESI-LIT MS 분석에 사용하였다.
가스 크로마토그래피/질량분석법( GC / MS )
LTA 가수분해물로부터 단당류 구성을 분석하기 위하여 GC/MS 분석을 수행하였다. Authentic reference compound (갈락토스, 글루코스, 만노스, N-아세틸글루코사민) 또는 LTA 가수분해물 시료를 피리딘에 녹인 후 상온에서 48시간 동안 방치하였다. 50 μl의 트리메틸실릴이미다졸을 첨가한 후 67℃에서 30분간 가열을 하였다. 시료를 200 μl의 클로로폼으로 녹인 후 Finnigan MAT system (가스 크로마토그래피 모델 GCQ, HP19091J-433)에 적용하였다. 시료를 nonplar capillary column (5% phenyl methyl siloxane capillary 30 m x 250 μm i.d., 0.25 μm film thickness, HP-5)에 적용하였다. 컬럼을 100℃에서 2분간 놓아 둔 후 분당 4℃의 속도로 220℃까지 증가시켜 5분간 유지하였다. 이후 분당 15℃의 속도로 300℃까지 증가시켜 5분간 유지하였다. 질량 분석계는 85℃의 ion 시료 온도, 65 eV의 전자 에너지, 300 mA의 emission current를 갖는 positive ion chemical ionization mode 하에서 사용되었다. 메탄은 분석 기체(analyte gas)로 사용되었으며 0.5 torr를 유지하였다.
당지질의 지방산구성은 0.1 μg의 트리데칸산을 200 μg의 LTA 시료에 첨가 한 다음 4 N KOH (100℃, 4 h)로 가수분해 시킴으로써 결정하였다. 가수분해물의 pH를 1에 가깝게 만든 후 자유지방산을 클로로폼 (3 times, 1 ml)으로 extract 시킨 다음 N2 gas로 건조 시켰다. 건조된 지방산을 아세토나이트릴 (30 μl)로 녹인 후 35% 펜타플루오로벤질 브로마이드 (in 아세토나이트릴) 10 μl와 다이이소프로필에틸아민 (10 μl)로 처리 하였다. 용액을 40℃에서 20분간 가열한 후 N2 기체로 건조시켰다. 결과물인 펜타플루오로벤질에스터를 N,O-비스(트리메틸실릴)-트리플루오로아세틸아마이드로 O/N 처리 하였다. 컬럼은 85℃를 유지하였으며 분당 7℃의 속도로 265℃까지 온도를 상승시킨 후 10분간 유지하였다. 하시드록시 지방산의 양은 베이스 피크 이온의 선택이온검출 방법을 사용하여 결정하였으며 트리데칸산 내위 표준 방법을 사용하여 추출물 손실을 보정하였다.
박층크로마토그래피 ( TLC )
당지질 분석을 위하여, pre-coated silica gel HPTLC 플레이트 상에서 클로로폼-메탄올-아세트산-물 (100:20:12:5, v/v/v/v)을 이용하여 수행하였다. TLC 상의 당지질은 5% 황산을 처리 후 120℃에서 가열함으로써 검출하였다.
인산글리세롤 분석을 위하여, n-부탄올-피리딘-물 (15:30:20, v/v/v)를 이용하여 TLC를 수행하였다. TLC 상에서 알라닌과 당 치환체를 검출하기 위하여 0.5% 닌하이드린 (in 부탄올)과 5% 황산 (in 메탄올)를 각각 사용하였다. 이 후 인산글리세롤을 120℃에서 가열함으로써 시각화 시켰다. TLC 플레이트로부터 시각화된 spot을 모은 후 메탄올을 사용하여 실리카겔 파우더로부터 시료를 추출하여 MS 분석에 사용하였다.
ESI - LIT MS
Ultimate 3000 nano LC coupled to a LTQ-Orbitrap hybride linear ion trap 질량 분석계를 이용하여 액체 크로마토그래피-이중질량분석을 수행하였다. 5 μl의 시료를 주입한 후 Ultimate 3000 nano LC를 이용하여 Zorbax 300 Extended-C18 컬럼 (3.5 μm, 0.3 mm i.d x 150 length)에 주입하였다. 이동상 A는 0.1%의 포름산을 포함하는 100% 물이고 이동상 B는 0.1% 포름산을 포함하고 있는 100% 아세토나이트릴이다. 분리는 C18 컬럼을 사용하였다. LC 시스템으로부터 분리된 시료는 electrospray ionization (ESI) technique을 사용하여 분석하였다. 시료 용액은 고압 (5 kV 인산글리세롤 및 4.5 kV 당지질)에서 metal capillary를 통하여 분당 3 μl의 속도로 ion source안으로 주입하였다. Capillary는 180℃를 유지하였으며 sheath gas (at a flow rate of 8 arbitrary)로써 nitrogen을 사용하였다. 분석기기는 negative ion mode에서 작동되었다. ion entrance capillary voltage와 tube lens offset은 -45와 -206 V 이다. MSn fragmentation을 위하여 35~37%의 normalized collision energy 와 2.5~3 Da 의 isolation width를 사용하였다. maximum ion collection 시간은 50 ms로 설정하였으며, 3개의 마이크로스캔을 이용하여 평균값을 구하였다.
< 실시예 1> LTA 및 LTA 당지질의 구조 분석
1 H, 13 C 및 2D- NMR 스펙트럼에 의한 pLTA 의 전체적인 구조 규명
aLTA의 1H-NMR 스펙트럼에서 α-D-N-아세틸글루코사민 (GlcNAc)의 아세틸기의 공명 신호(resonance signal)가 chemical shift (δH) 2.1인 것으로 보고되었다. 그러나 pLTA의 1H-NMR 스펙트럼에서 chemical shift (δH) 2.1에서의 피크 모양이 aLTA와는 다르게 나타났다. pLTA의 공진 모양은 aLTA에 비하여 보다 넓게 분포하며 자유 아세틸기 (δH 1.9)으로부터의 신호를 보이지 않았다 (도 1). COSY 스펙트럼을 이용하여 분석한 결과 δH 2.01이 (γ-ω)-메틸렌-(-CH2-; δH 1.28)과 올레핀 양성자(-CH=CH-; δH 5.38)와 관련이 있는 것을 확인하였다(도 2). 또한 HMQC 스펙트럼 분석 결과 δH 2.01에서의 양성자들이 메틸렌 (CH2; δc 27)으로부터 할당되었다는 것을 확인하였다(도 3A). COSY와 HMQC 스펙트럼 분석에 기초할 때, chemical shift (δH) 2.01은 지방산에 있는 알케닐 탄소 (-CH2-CH 2-CH=CH-CH 2-CH2-)에 붙어있는 메틸렌의 신호인 것을 확인하였다. 결과적으로 pLTA는 어떠한 GlcNAc 치환체도 인산글리세롤 백본에 가지고 있지 않음을 알 수 있다.
불포화 지방산의 존재 역시 δH 2.01 (CH 2-CH=CH)와 δH 5.38 (CH=CH)의 신호의 상호관계를 통하여 규명하였다 (도 2). 또한 1H 및 13C NMR 스펙트럼의 두 개의 아노머 양성자 신호[δH 5.08 (d, J=Hz) 및 5.17 (d, J=3 Hz)]와 두 개의 아노머 탄소 신호 [δc 96.5 and 97.7 ppm)를 통하여 당지질에 두 개의 당 단위가 존재하는 것을 확인하였다. 당의 측정은 LTA 가수 분해물의 GC/MS 분석을 통하여 수행하였으며 (도 4) pLTA의 당지질이 글루코스와 갈락토스와 같은 당으로 치환되어져 있는 것을 확인하였다. 마지막으로 두 개의 당 단위의 아노머의 J값(J value)은 D-피라노스의 아노머 중심이 α 방향임을 보여주며, δH 5.08과 5.17의 신호는 각각 δc 96.5와 97.7에서 공명하는 아노머 탄소에 상응하는 α-D-글루코스와 α-D-갈락토스의 아노머 양성자임을 확인하였다(그림 3B). 이를 통하여 pLTA의 당지질의 헥소스가 알파 결합으로 연결되어 있음을 알 수 있다.
pLTA 의 당지질 구조 분석
LTA의 당지질 시료를 MALDI-TOF MS 방법을 통하여 분석하였다.
pLTA의 당지질의 질량 스펙트럼은 두 개의 그룹으로 나뉜다 (도 5B). 그룹 I의 이온 신호는 m/z 1103에서 m/z 1227의 범위로 나타났으며, 그룹 II에서는 m/z 1368에서 m/z 1464의 범위에서 나타났다. 그룹 I에 속하는 당지질은 트리헥소실-디아실-글리세롤(Hex3-DAG)로 판명되었는데 C16에서 C22의 아실 사슬을 가지고 있다. 그룹 II의 당지질은 추가적인 헥소스 잔기 또는 아실 사슬을 가지고 있는 것으로 나타났다. 추가적인 헥소스 잔기는 당지질의 O-아세틸화를 통하여 확인하였다 (도 6A).
하이드록실 잔기의 아세틸화는 42 질량 단위의 증가를 유발한다. pLTA의 그룹 I 당지질은 420 질량 단위 (10 하이드록실 잔기)의 증가를 보였으며 트리헥소스 그룹인 것으로 판명되었다 (도 6B). 또한 그룹 II에 있는 대부분의 당지질이 378 질량 단위 (9 하이드록실 잔기)만큼 증가 하였다. O-아세틸화 분석에 따르면, 그룹 II의 당지질은 헥소스 잔기에 추가적인 아실 사슬을 갖는 것을 알 수 있다(도 7).
추가적으로 스펙트럼에서 12 질량 단위의 차이를 보였는데, 이것은 알케닐 탄소의 추가 또는 감소를 의미하는 것으로써 당지질이 불포화 지방산 사슬을 가지고 있다는 것으로 판단할 수 있다. 이러한 가능성은 COSY NMR을 통하여 확인하였다 (도 2). pLTA 당지질의 분자구성에 대한 예측은 도 8에 표시하였다. 다음으로 이중 MS 분석을 위하여 ESI-FT MS (음이온 모드)를 이용하여 당지질을 분석하였고 (도 9), 이로부터 대표적인 피크를 선택, 분석하여 아실 사슬 분포를 결정하였다 (도 10A 및 B).
결과적으로 pLTA의 당지질의 구조는 도 9에 나타난 바와 같이 세 개의 헥소스 백본을 가지고 있으며, 불포화 지방산을 포함하는 트리헥소실-다이아실글리세롤(그룹 I)과 트리헥소실-트리아실글리세롤(그룹 II)로 되어 있고, 아실 사슬들은 평균 18개의 탄소수를 갖는 것을 알 수 있다.
aLTA 의 당지질 구조 분석
aLTA의 경우 당지질의 질량 대 전하 (m/z) 비율이 C15에서 C21의 사슬 길이를 갖는 지방산인 것을 확인하였다 (도 5A, 도 11). aLTA의 당지질에서 거의 모든 m/z 신호는 294 질량 단위가 증가되었다. 이것은 7개의 하이드록실 그룹의 아세틸화가 발생하였음을 의미하는 것이고 두 개의 헥소스에 해당한다. 결과적으로 aLTA의 당지질은 다이헥소실 그룹을 가지고 있는 것으로 판명되었다. 또한 당지질의 지방산 아실 사슬의 존재는 마일드 알칼리 가수분해를 통하여 확인할 수 있었다 (도 12).
dLTA , rLTA 및 sLTA 의 당지질 구조 분석
dLTA, rLTA 및 sLTA의 당지질 부위의 구조 분석을 위하여 MALDI-TOF 분석을 수행하였다. dLTA는 락토바실러스 델브르키(L. delbreukii), rLTA는 락토바실러스 람노서스 (L. rhamnosus), sLTA는 락토바실러스 사케이(L. sakei) 유래의 LTA를 각각 나타낸다.
도 13에서 보듯이 MALDI-TOF 분석 결과, dLTA 유래 당지질은 pLTA와 마찬가지로 트리헥소실-다이아실글리세롤과 트리헥소실-트리아실글리세롤을 갖는 두 그룹으로 나누어지며, 이외에도 네 개의 아실 사슬을 갖는 세 번째 그룹이 존재하는 것으로 관찰되었고, 아실 사슬의 평균 탄소수는 18개인 것으로 관찰되었다. rLTA 유래 당지질은 pLTA보다 전체적으로 분자량이 작은 두 그룹으로 관찰되었으며, 당 하나의 분자량이 160 Da이므로 세 개의 헥소스가 아닌 두 개의 헥소스 백본으로 이루어진 다이헥소실-다이아실글리세롤과 다이헥소실-트리아실글리세롤을 갖는 것으로 관찰되었고, 아실 사슬의 평균 탄소수는 15개인 것으로 관찰되었다. sLTA 유래 당지질도 다이헥소실-다이아실글리세롤과 다이섹소실-트리아실글리세롤로서 평균 탄소수가 18개로 아실 사슬의 길이가 rLTA보다 긴 것으로 관찰되었다.
< 실시예 2> LTA 유래 당지질의 항염증 효과
LTA 유래 당지질의 TNF -α 발현 억제 효과
Intact LTA, 이로부터 분리한 LTA 유래 당지질 및 LTA 유래 폴리인산글리세롤을 각각 100 μg/ml씩 THP-1 세포에 4시간 동안 처리한 후 배양액으로부터 TNF-α의 발현 양을 ELSIA 방법을 통하여 측정하였다.
도 14에서 볼 수 있는 바와 같이 intact aLTA는 높은 TNF-α의 발현을 유도한 반면 intact pLTA는 TNF-α의 발현을 유도하지 못하였다. 또한 aLTA 유래의 당지질 및 폴리인산글리세롤 역시 intact aLTA보다 발현양은 적지만 TNF-α의 발현을 상당히 유도한 반면 pLTA 유래의 당지질 및 폴리인산글리세롤은 TNF-α의 발현을 거의 유도하지 못하였다. 이를 통하여 intact pLTA 뿐만 아니라 pLTA 유래의 당지질도 aLTA와 달리 TNF-α의 발현을 유도하지 못함을 알 수 있다.
LTA 변형에 의한 항염증 효과 실험
aLTA 및 pLTA를 변형(modification)한 후 활성을 측정하기 위한 실험을 수행하였다. 우선 폴리인산글리세롤의 D-알라닌을 제거하기 위하여 Tris-HCl pH 8.5에 LTA를 O/N으로 배양시켰다. 또한 당지질의 지방산 아실 사슬을 제거하기 위하여 0.1N NaOH를 사용하여 LTA를 처리하였다. 이 후 pH를 중화 시킨 후 옥틸 크로마토그래피를 이용하여 변형된 LTA를 정제하고, 동결건조 후 정량하여 실험에 사용하였다. THP-1 세포에 100㎍/ml의 D-알라닌을 제거한 LTA(de-alanine)와 지방산 아실 사슬을 제거한 LTA(de-acyl)를 18시간 동안 전처리한 후에 0.5㎍/ml의 LPS를 4시간 동안 재처리 하였다. 이후 배양액으로부터 TNF-α의 발현 정도를 ELISA 방법을 통하여 측정하였다.
도 15는 aLTA를 이용한 실험 결과를 보여준다. aLTA의 경우 intact aLTA를 전처리한 THP-1 세포에서 LPS에 의한 TNF-α 발현을 억제하는 효과가 다소 나타났으나, D-알라닌과 지방산 아실 사슬을 제거한 aLTA(de-alanine, de-acyl)는 이러한 효과를 거의 나타내지 않았다.
도 16은 pLTA를 이용한 동일한 실험의 수행 결과를 보여준다. aLTA와 달리 intact pLTA는 LPS에 의한 TNF-α의 발현을 거의 억제하였으며, 폴리인산글리세롤의 알라닌을 제거시킨 pLTA(de-alanine)의 경우에도 동일한 효과를 나타낸 반면, 당지질의 아실 사슬을 제거한 pLTA(de-acyl)는 TNF-α의 발현 억제 효과를 보이지 않았다.
이러한 결과는 aLTA와 pLTA가 서로 다른 생물학적 특성을 가지고 있음을 보여주며, 특히 pLTA의 TNF-α 발현 억제 효과에 있어서 폴리인산글리세롤 내의 D-알라닌 보다는 당지질의 아실 사슬이 더욱 중요하게 작용하고 있음을 보여준다.
pLTA 유래 당지질의 항염증 효과
pLTA에서 분리한 당지질의 항염증 효과를 알아보기 위하여 THP-1 세포에 다양한 농도의 당지질을 20시간 동안 전 처리한 후에 10㎍/ml의 flexPGN을 4시간 동안 재처리 하였다. 이후 배양액으로부터 TNF-α의 발현 정도를 ELISA 방법을 통하여 측정하였다.
도 17에서 보듯이, 10㎍/ml의 flexPGN 만을 처리한 세포의 경우 높은 농도의 TNF-α 발현을 유도하였다. 그러나 당지질을 전 처리한 세포에서 전 처리 농도에 따라서 TNF-α의 발현이 감소하는 것을 관찰할 수 있었다. 이러한 발현 억제 효과는 같은 농도의 intact pLTA에 비하여는 다소 낮은 것이지만 pLTA의 당지질 부위만으로도 충분한 TNF-α의 발현 억제 효과를 유발함을 보여준다.
다른 LTA 유래 당지질의 항염증 효과
THP-1 세포(5×105cells/ml)에 LPS (LPS from E. coli 111:B4)와 실험예에기재된 방법으로 각각의 LTA (aLTA, rLTA, pLTA, dLTA, sLTA)로부터 분리한 당지질 0.1ug/ml을 6시간 처리한 후 배양액으로부터 TNF-α의 발현 양을 ELSIA 방법을 통하여 측정하였다.
도 18은 서로 다른 LTA에서 분리한 당지질의 TNF-α의 발현 억제 효과를 보여준다. aLTA 및 sLTA 유래의 당지질은 TNF-α의 발현 억제 효과가 거의 없는 반면, rLTA, pLTA 및 dLTA 유래의 당지질은 매우 효과적으로 TNF-α의 발현을 억제함을 알 수 있다.
< 실시예 3> pLTA 의 항염증 효과에 대한 in vitro 실험
pLTA 에 의한 Shigella flexneri 펩티도글리칸 ( PGN )-유도 TNF -α 및 IL -1β의 발현 억제 효과 실험
인간 단핵구 세포의 하나인 THP-1 세포를 열처리 한 10% 비활성 FBS와 100U/ml 페니실린과 100 ug/ml 스트렙토마이신이 포함된 RPMI 1640 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 조건 하에서 배양하였다. THP-1 세포를 이용한 사이토카인 유도 실험을 수행하기 위하여 4 x 105개 세포/well를 96-well 플레이트로 옮긴 후 37℃, 5% CO2 조건 하에서 24시간 동안 배양하여 세포를 안정화시켰다. 다양한 농도 (0~100 ㎍/ml)의 pLTA을 24시간 동안 전 처리 한 후, 10 ㎍/ml의 펩티도글리칸을 4시간 동안 재처리 하였다.
TNF-α 및 IL-1β의 발현양 측정은 세포배양물로부터 원심분리를 통하여 세포 상등액을 수거한 후 일반적인 샌드위치 ELISA 방법을 이용하여 수행하였다. ELISA 실험은 R & D systems로부터 구입한 anti-TNF-α monoclonal mouse IgG1 (clone #28410)/biotinylated anti-human TNF-α specific goat IgG와 anti-human IL-1β monoclonal mouse IgG1 (clone 2805)/biotinylated anti-human IL-1β specific goat IgG를 각각 사용하였고, 스트렙타비딘 HRP를 처리 한 후 서브스트레이트로써 O-페닐렌다이아민을 사용하여 발광시켰다. ELISA 리더를 사용하여 OD 450 nm의 측정값에서 OD 550 nm의 측정값을 뺀 값을 유효 값으로 사용하였다.
도 19에서 보듯이 LTA를 전 처리할 경우 펩티도클리칸에 의해 발현이 증가하는 TNF-α (도 19A)와 IL-1β (도 19B)의 발현이 LTA의 농도가 증가함에 따라 감소되는 것으로 나타났다. 이러한 염증성 사이토카인의 발현 억제가 내독소에 의한 것인지를 확인하기 위하여 폴리믹신 B를 이용한 실험을 수행하였다. 폴리믹신 B는 LPS의 lipid A와 결합하여 LPS의 활성을 억제 시키는 역할을 한다. 따라서 상기의 실험결과가 내독소에 의한 것이라면 폴리믹신 B를 처리할 경우 염증성 사이토카인의 발현 억제현상이 나타나지 않아야 한다. 그러나 pLTA에 의한 TNF-α의 발현 억제는 폴리믹신(polymyxin) B가 포함된 배지 하에서도 유도되었으며, 이러한 결과는 LTA에 의한 내성유도가 내독소 (LPS)에 의하여 유도되지 않는다는 것을 의미하는 것이다 (도 19C).
그람음성균의 펩티도글리칸은 면역세포의 NOD2를 자극시킴으로써 이들 세포로부터 다량의 프로-염증성 사이토카인의 발현을 증가시킨다. 그러나 pLTA를 면역세포에 전 처리 함으로써 그람음성균의 펩티도글리칸에 의한 프로-염증성 사이토카인의 특이적인 발현을 억제시킬 수 있다.
pLTA 에 의한 펩티도글리칸 -유도 NOD2 의 발현 억제 효과 실험
pLTA에 의한 패혈증 관련 수용체 NOD2의 발현 변화 측정을 다음과 같이 수행하였다. 8 x 105개 THP-1 세포/well를 24-well 플레이트로 옮긴 후 37℃, 5% CO2 조건 하에서 24시간 동안 배양하여 세포를 안정화 시켰다. 100 ㎍/ml의 pLTA를 24시간 동안 전 처리 한 후 10 ㎍/ml의 S. flexneri 펩티도글리칸을 재처리 하여 2시간 동안 배양하였다. 원심분리를 통하여 각각의 세포를 채취한 후 전체 RNA로부터 cDNA를 합성 한 후 real-time PCR을 사용하여 NOD2의 발현 변화를 측정하였다. NOD2의 단백질 변화는 웨스턴 블로팅을 사용하여 측정하였다. 상기에서 서술한 조건으로 pLTA를 전 처리한 THP-1 세포에 펩티도글리칸을 2시간 동안 처리하였다. 세포를 파쇄 한 후 SDS-PAGE 로딩 염료를 첨가 하여 5분간 끓이고, 12% SDS-PAGE를 통하여 단백질을 분리 하였다. 분리된 단백질을 나일론 맴브레인으로 옮긴 후 항-TLR2, -TLR4, -NOD2 항체를 이용하여 웨스턴 블로팅을 수행하였다.
S. flexneri 펩티도글리칸에 의한 과도한 염증반응 유도에서 NOD2의 역할을 규명하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다. NOD2 발현 벡터와 pNF-κB-Luc/pRL-SV40 벡터를 U937 세포에 형질 전환 시켰다. 24시간 후 형질 전환된 각각의 세포에 100 ㎍/ml의 pLTA로 24시간 동안 전 처리 하고, 10 ㎍/ml의 펩티도글리칸을 12시간 동안 재처리 하였다. 마이크로플레이트 리더기를 이용하여 측정된 NF-κB의 활성을 Renilla의 활성값으로 나누어 NOD2 발현양에 따른 NF-κB의 활성변화를 측정하였다.
도 20에 따르면, S. flexneri 펩티도글리칸은 THP-1 세포에서 NOD2의 발현을 현저히 증가시킨다. 반면 pLTA를 전 처리한 세포에서의 NOD2 mRNA의 발현은 pLTA의 전 처리 농도가 증가함에 따라서 감소하는 경향을 보였으며(도 20A), pLTA를 전 처리한 세포에서의 NOD2 단백질 발현양 또한 pLTA를 전 처리하지 않은 세포에 비하여 크게 감소하는 것으로 나타났다 (도 20B). 이러한 결과는 pLTA가 패혈증 관련 수용체인 NOD2의 발현을 억제시킴으로써 NOD2와 펩티도글리칸과의 상호작용을 통한 신호전달을 억제시킬 수 있다는 것을 의미하는 것이다.
또한 pLTA를 전 처리한 세포에서의 펩티도글리칸-유도 NF-κB 활성이 pLTA를 전 처리하지 않은 세포에 비하여 크게 감소하는 것을 확인 할 수 있다 (도 20C). 그러나 NOD2 발현 벡터를 형질전환 시킴으로써 이러한 NF-κB의 활성 억제가 사라지는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 NOD2가 펩티도글리칸의 주요한 수용체로 작용을 하고 있다는 것을 의미하며, 또한 pLTA를 전 처리함으로써 NOD2의 주요한 전사인자인 NF-κB의 활성을 억제시키고 결과적으로 NOD2의 mRNA 발현을 저해 시킬 수 있다는 것을 의미한다.
pLTA 와 TLR2 의 관련성 실험
pLTA에 의한 사이토카인의 발현 억제 작용에 있어서 TLR2와의 관련성을 시험하기 위하여, TLR2 siRNA 실험을 수행하였다. TLR2를 타깃으로 하는 siRNA duplex는 Santacruz Biotechnology (Santa Cruz, SA)로부터 구입을 하였다. TLR2 siRNA와 컨트롤 siRNA를 TransIT-TKO 감염 시약(Mirus, WI)을 사용하여 THP-1 세포로 형질전환 시킨 후 72시간 동안 배양하였다. TLR2 siRNA와 Control siRNA가 형질전환된 세포에 100 ㎍/ml의 pLTA를 24시간 동안 전 처리한 후 10 ㎍/ml의 펩티도글리칸을 4시간 동안 재처리하여 배양액으로부터 TNF-α의 발현양을 ELISA 방법을 사용하여 측정하였다.
또 다른 실험으로써 TLR2가 녹아웃된 마우스 (C57BL/6)로부터 골수유래 대식세포 (BMM)를 분리한 뒤 96 well 플레이트에 분주하여 37℃, 5% CO2 하에서 24시간 동안 배양하였다. BMM에 100 ㎍/ml의 pLTA를 24시간 동안 전 처리한 후 10 ㎍/ml의 펩티도글리칸을 4시간 동안 재처리하여 배양액으로부터 TNF-α의 발현양을 ELISA 방법을 통하여 측정하였다.
도 21에서 보듯이 컨트롤 siRNA를 형질전환 시킨 THP-1 세포에서는 pLTA 전처리에 의한 내성유도가 발생함으로써 펩티도글리칸-유도 TNF-α의 발현이 감소하였다 (도 21A). 반면 TLR2 siRNA를 형질전환 시킨 THP-1 세포에서는 이러한 발현 감소가 나타나지 않았다 (도 21B). 이러한 결과는 TLR2가 녹아웃된 BMM에서도 나타나는데, 정상적인 마우스로부터 분리한 BMM의 경우 펩티도글리칸의 농도에 따라 TNF-α의 발현이 증가였으며 이러한 발현 증가는 pLTA의 전 처리에 의하여 감소하였다 (도 21C). 반면 TLR2-/- BMM의 경우 pLTA의 전 처리 여부에 관계없이 펩티도글리칸의 농도에 따라서 TNF-α의 발현이 증가하는 것으로 나타났다 (도 21D). 이러한 결과는 펩티도글리칸-유도 TNF-α의 과발현에 대한 pLTA의 내성유도는 TLR2가 필수적인 수용체로 작용하고 있다는 것을 의미하는 것이다.
pLTA 에 의한 NF -κB의 활성 및 TNF -α 의 발현 억제
내독소 LPS의 처리에 의한 TNF-α의 과발현은 MAP 키나아제의 인산화와 NF-κB의 활성증가에 의하여 발생한다. pLTA가 이러한 MAP 키나아제의 인산화와 NF-κB의 활성에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위하여, 다음과 같이 웨스턴 블로팅 및 면역형광 염색 실험을 수행하였다.
웨스턴 블로팅: 8 x 105개 THP-1 세포/well를 24-well 플레이트로 옮긴 후 37℃, 5% CO2 조건 하에서 24시간 동안 배양하여 세포를 안정화시켰다. 100 ㎍/ml의 pLTA를 24시간 동안 전 처리 한 후 0.1 ㎍/ml의 LPS를 첨가하여 1시간 동안 추가 배양하였다. 원심분리를 통하여 세포를 채취한 후 Laemmli 버퍼로 세포를 파쇄하였다. SDS-PAGE 로딩 염료를 첨가 하여 5분간 끓인 후 12% SDS-PAGE를 통하여 단백질을 분리하였다. 분리된 단백질을 나일론 맴브레인으로 옮긴 후 항 포스포릴레이티드-MAP 키나아제 항체 (anti-phospho ERK 및 anti-phospho JNK), 항 NF-κB 항체, 항 β-actin 항체를 이용하여 웨스턴 블로팅을 수행하였다.
면역형광 염색 (immunofluorescence staining): 8 x 105개 THP-1 세포/well를 24-well 플레이트로 옮긴 후 37℃, 5% CO2 조건 하에서 24시간 동안 배양하여 세포를 안정화 시켰다. 100 ㎍/ml의 pLTA 또는 배지만을 24시간 동안 전 처리 한 후 0.5 ㎍/ml의 LPS를 재처리 하여 2시간 동안 배양 하였다. 배양한 세포를 15분간 3,500 rpm으로 원심 분리를 하여 슬라이드글라스 위에 부착시킨 후 4% 파라포름알데하이드로 세포 고정을 시켰다. 이후 0.5% 트리톤 X-100 (Triton X-100)으로 세포막의 투과성을 증가시키고, 항-NF-κB p50 과 항-NF-κB p65 항체를 2시간 동안 처리 하였다. 다시 donkey 유래 항-마우스 IgG-FITC 항체를 90분간 처리 한 후 공초점현미경을 사용하여 세포 내에서의 NF-κB p50 과 NF-κB p65의 인산화 정도를 측정하였다.
도 22에 의하면, pLTA 처리에 의해 MAP 키나아제의 활성이 감소하는 것으로 나타났다 (도 22A). 즉, pLTA 내성을 주지 않은 세포의 경우 LPS 처리 후 60분이 되었을 때 ERK와 JNK의 활성 (인산화)이 급격하게 증가하는 것을 관찰 하였다. 반면 pLTA 내성을 준 세포의 경우 이러한 활성이 내성을 주지 않은 세포에 비해 낮게 나타나는 것을 확인 할 수 있었다.
LPS-유도 NF-κB 활성은 IKK 키나아제의 인산화를 필요로 한다. 활성화된 IKK는 I-κB 단백질군의 인산화를 유발 시켜 NF-κB로부터 I-κB가 분리된다. NF-κB는 핵 내로 이동하여 세포부착, 사이토카인, 사이토카인 수용체 등에 대한 유전자의 전사를 증가 시킨다. 본 실험 결과 pLTA 내성을 주지 않은 세포의 경우 I-κBα의 분해가 LPS를 처리한 후 빠르게 나타나는 것을 볼 수 있었다. 그러나 pLTA 내성을 준 세포의 경우 이러한 I-κBα 분해가 적게 발생하는 것을 확인하였다 (도 22B). 이러한 결과는 pLTA 내성을 준 세포에서 NF-κB의 활성이 내성을 주지 않은 세포에 비하여 억제된다는 것을 의미하는 것이다.
이를 확인하기 위하여 항 NF-κB 항체를 이용한 면역형광 염색법을 수행하여 pLTA 내성에 의한 NF-κB 활성의 억제를 확인하였다 (도 22C). 이러한 일련의 신호전달 관련 요소들의 활성 억제는 pLTA가 LPS에 의해 유도된 TNF-α의 과발현을 억제시키는 주요 원인으로 작용한다는 것을 의미한다.
< 실시예 4> pLTA 의 항염증 효과에 대한 in vivo 실험
pLTA 의 패혈증 억제 효과
4주령 수컷 마우스 (BALB/c, 15 마리)에 300 mg/kg의 pLTA 또는 PBS를 복강 주사한 후, 24시간 뒤 200 μl의 패혈증 유발 수용액 (250 mg/kg aLTA + 25 mg/kg MDP)을 복강 주사하여 내독소성 쇼크를 유발하였다. 마우스의 생존율은 패혈증 유발 후 4일째 까지 관찰하였다.
또 다른 실험으로써 pLTA를 복강 주사한 마우스와 PBS를 복강 주사한 마우스 (각 5마리)에 패혈증 유발 물질을 주사하였다. 12 시간 후 심장 채혈을 통하여 세럼을 분리, ELISA 방법을 통하여 혈액 내 TNF-α의 함유량을 측정하였다.
도 23에서 보듯이, PBS를 전 처리한 마우스의 경우 패혈증 유발물질을 복강주사 했을 때 48시간 이내에 모두 패사하는 것으로 나타났다. 반면, pLTA를 전 처리한 마우스의 경우 4일째까지 약 90%의 생존율을 보였다 (도 23A). 또한 pLTA를 전 처리한 마우스의 경우 혈액 내에서 발견되는 TNF-α의 양이 PBS를 전 처리한 마우스의 혈액 내 TNF-α 양에 비하여 현저히 낮게 측정되는 것을 확인하였다 (도 23B).
이러한 결과는 pLTA가 aLTA+MDP에 의하여 생체 내에서 유도되는 과도한 염증반응을 억제시키고, 또한 그람 양성균-유래 패혈증을 억제시키는데 효과적이라는 것을 의미하는 것이다.
pLTA 처리에 의한 아토피성 피부질환의 완화 효과
아토피성 피부질환은 박테리아의 감염, 화학약품에 대한 노출 등 다양한 원인에 의하여 발생한다. 4주령의 SPF (Specifirc pathogen free) 수컷 ICR 마우스(중앙실험동물) 및 4주령의 SPF 수컷 NC/Nga 마우스 (중앙실험동물)를 구입하여 7일간 실험동물 사육실에서 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 시험군당 ICR 마우스 20마리, NC/Nga 마우스 5마리씩 두 군으로 나누었다. 모든 시험군의 경우, 시험물질 도포 전날 등 부위를 제모하였으며 아토피성 피부염 유발은 이전 연구를 참고하여 1% DNCB를 4일 간격으로 2회 도포 하였고 이후 3일 간격으로 4주간 0.2% DNCB 용액을 등에 도포하였다. 아토피의 형성 후 350 μg/kg의 pLTA를 복강 주사한 후 피부병변을 관찰하였다. 혈액 내 Th2 편향성과 관련하여 피부염 소양 근처의 피부조직 내에 피부염증 및 아토피 관련 사이토카인 (IL-4)의 분포와 수준을 측정하기 위해서 IHC (Immuno-histochemistry)법을 사용하였다.
도 24에서 보듯이 DNCB의 도포 결과, ICR 모델 및 NC/Nga 모델 모두 육안적으로 전체 등부위에서 홍반, 부종뿐만 아니라 가피탈피와 농양성 구진 및 개체에 따라 심한 경우 출혈소견까지 보여 사람의 아토피 피부염의 증상과 매우 흡사한 피부병변을 나타내었고, 피부염 정도에 있어서도 다른 모델에 비해 강하게 유발되었다. 그러나 이러한 현상은 pLTA를 주사함으로써 완화되는 것을 관찰할 수 있었다 (도 24A). 아토피성 피부염의 원인이라고 할 수 있는 Th2 편향현상을 보기 위해 발병된 피부조직내의 관련 cytokine 의 수준을 측정하기 위해 IHC를 측정 하였다. ICR 및 NC 2개의 군 모두에서 피부조직 내의 IL-4가 유의적으로 상승된 분포를 보였으며 IFN-r 의 경우는 별 차이가 없는 것으로 나타났다. 반면 pLTA를 처리한 마우스의 경우 피부조직 내의 IL-4의 분포가 감소하는 것을 확인할 수 있는데 (도 24B), 이러한 결과는 pLTA가 Th2 반응을 유도하는 IL-4의 발현을 억제시킴으로써 아토피의 증상을 감소시켰음을 보여주는 것이다.
< 실시예 5> 다른 LTA 의 항염증 효과 실험
rLTA 의 항염증 효과
다른 종류의 유산균 L. rhamnosus (rLTA)로부터 분리한 LTA의 항염증 효과를 조사하기 위하여 THP-1 세포에 100㎍/ml 농도의 rLTA 를 처리하고 4시간 동안 자극하였다. 이후 배양액으로부터 TNF-α의 발현양을 ELISA 방법을 통하여 측정하였다.
도 25에서 보듯이, rLTA의 전 처리 농도가 증가함에 따라 TNF-α의 발현양은 감소하였다.
aLTA , rLTA , pLTA , dLTA , sLTA 의 항염증 효과 비교
THP-1 cell에 LPS와 각각의 LTA를 처리하여 TNF-α의 발현양을 확인하였다.
도 26에서 보듯이, 10㎍/ml 농도 처리시 aLTA 및 sLTA는 TNF-α의 발현을 억제시키지 못하였으나, 나머지 LTA는 효과적으로 TNF-α의 발현을 억제함을 알 수 있다.
또한 LTA별로 서로 다른 TNF-α의 발현 양상을 보이는 것은 각각의 LTA가 그 구조적 차이로 인해 세포신호 경로(cell signal pathway) 활성에 서로 다른 영향을 미치고 있을 것이라는 가정을 세우고, 이를 확인하기 위하여 세포 신호 경로에 관련된 신호 억제제(signal inhibitor)를 처리한 후 LTA별 TNF-α의 생성을 확인하였다.
그 결과 도 27 및 각 LTA의 TNF-a 발현 억제율을 정량화하여 나타낸 하기 표 1에서 보듯이 특정 신호 억제제를 처리하였을 때 TNF-a 발현이 줄어들거나 늘어나는 것을 확인하였으며, 이를 통해 LTA의 구조적인 차이가 특정한 세포 신호 경로에 서로 다른 영향을 준다는 것을 확인하였다.
Figure 112010055377316-pat00022
< 실시예 6> pLTA 유래 당지질을 이용한 항체 반응의 유발
마우스를 B형 간염 바이러스 표면 항원("HBsAg") 2.5㎍으로 0일째에 1차 면역화()시켰다. 21일째에 상기 마우스를 2차 면역화시켰다(200㎕/주입). 상기 1차 면역화 후 제 20일과 2차 면역화 후 제 27일에 마우스로부터 채혈하였다. 혈청을 수집하여 항-HBsAg 항체에 대한 표준 ELISA로 검사하였다. 하기 표 2는 본 발명의 당지질이 HBsAg과 함께 동물에 투여되었을 때, 항-HBsAg 항체의 생산을 유도함을 보여준다.
항-HBsAg 역가 -1
IgG1-특이적 IgG2a-특이적
1차 면역화 후 20일 2차 면역화 후 27일 1차 면역화 후 20일 2차 면역화 후 27일
pLTA 당지질 30 ㎍ 21,000 360,000 43,000 540,000
pLTA 당지질 10 ㎍ 6000 190,000 10,000 250,000
비히클 3,000 90,000 2,000 70,000
PBS 1,000 20,000 1,000 25,000
< 제조예 1> pLTA 를 포함하는 의약
산제의 제조
pLTA 또는 pLTA 유도체 (analogues) 10 mg
유당 100 ㎎
탈크 10 ㎎
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.
정제의 제조
pLTA 또는 pLTA 유도체 (analogues) 5 mg
옥수수전분 100 ㎎
유당 100 ㎎
스테아린산 마그네슘 2 ㎎
상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.
캅셀제의 제조
pLTA 또는 pLTA 유도체 (analogues) 10 mg
결정성 셀룰로오스 3 ㎎
락토오스 14.8 ㎎
마그네슘 스테아레이트 0.2 ㎎
통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.
주사제의 제조
pLTA 또는 pLTA 유도체 (analogues) 50 mg
만니톨 180 ㎎
주사용 멸균 증류수 2974 ㎎
Na2HPO4·12H2O 26 ㎎
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2 ㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.
액제의 제조
pLTA 또는 pLTA 유도체 (analogues) 10 mg
이성화당 10 g
만니톨 5 g
정제수 적량
통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.
< 제조예 2> pLTA 를 포함하는 건강 식품
pLTA 또는 pLTA 유도체 (analogues) 100 mg
비타민 혼합물 적량
비타민 A 아세테이트 70 ㎍
비타민 E 1.0 ㎎
비타민 B1 0.13 ㎎
비타민 B2 0.15 ㎎
비타민 B6 0.5 ㎎
비타민 B12 0.2 ㎍
비타민 C 10 ㎎
비오틴 10 ㎍
니코틴산아미드 1.7 ㎎
엽산 50 ㎍
판토텐산 칼슘 0.5 ㎎
무기질 혼합물 적량
황산제1철 1.75 ㎎
산화아연 0.82 ㎎
탄산마그네슘 25.3 ㎎
제1인산칼륨 15 ㎎
제2인산칼슘 55 ㎎
구연산칼륨 90 ㎎
탄산칼슘 100 ㎎
염화마그네슘 24.8 ㎎
상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.
< 제조예 3> pLTA 를 포함하는 음료
pLTA 또는 pLTA 유도체 (analogues) 100 mg
비타민 C 15 g
비타민 E(분말) 100 g
젖산철 19.75 g
산화아연 3.5 g
니코틴산아미드 3.5 g
비타민 A 0.2 g
비타민 B1 0.25 g
비타민 B2 0.3g
물 정량
통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85 ℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.
상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.
< 제조예 4> pLTA 를 포함하는 음료
유연 화장수( 스킨 )의 제조
pLTA 또는 pLTA 유도체 (analogues) 0.1 중량%
글리세린 3.0 중량%
부틸렌 글리콜 2.0 중량%
프로필렌 글리콜 2.0 중량%
폴리옥시에칠렌(60)경화 마자유 1.00 중량%
에탄올 10.0 중량%
트리에탄올아민 0.1 중량%
방부제 미량
색소 미량
향료 미량
정제수 잔량
영양화장수(로션)의 제조
pLTA 또는 pLTA 유도체 (analogues) 0.1 중량%
시토 스테롤 1.70 중량%
폴리글리세릴 2-올레이트 1.50 중량%
세테아레스-4 1.2 중량%
콜레스테롤 1.5 중량%
디세틸포스페이트 0.4 중량%
농글리세린 5.0 중량%
선플라우어오일 10.0 중량%
카르복시비닐 폴리머 0.2 중량%
산탄검 0.3 중량%
방부제 미량
향료 미량
정제수 잔량
< 제조예 5> pLTA 를 포함하는 어쥬번트
pLTA 를 포함하는 어쥬번트의 제조
pLTA 또는 pLTA 유도체 (analogues) 25㎍
디올레오일 포스파티딜콜린(DOPC) 500㎍
콜레스테롤 125㎍
포스페이트 NaCl 완충용액 및 물 잔량
합계 0.5ml
상기의 성분으로 이루어진 어쥬번트를 WO96/33739에 기술된 바와 같이 제조한다.
pLTA 어쥬번트를 포함하는 인플루엔자 백신 조성물의 제조
성분 투여량당 양
활성 성분
불활성화된 스플릿 비리온
- A/뉴 칼리도니아/20/99 (H1N1)
IVR-116
- A/뉴욕/55/2004 (H3N2)
NYMC X-157
- B/강소/10/2003		 15 ㎍ HA

15 ㎍ HA

15 ㎍ HA
어쥬번트
- 리포솜
· 디올레일 포스파티딜콜린 (DOPC)
· 콜레스테롤
1000 ㎍
250 ㎍
pLTA 또는 pLTA 유도체 (analogues) 50 ㎍
상기 인플루엔자 백신의 1회 투여량은 1 mL에 해당한다.

Claims (31)

  1. 알파 결합으로 연결된 삼중 헥소스의 C1, C3, C4 및 C6번 위치 중 어느 한 곳 이상에 C10 내지 C 30 의 포화 또는 불포화된 2 내지 6개의 아실 사슬이 결합되어 있는 당지질.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 당지질은 하기 화학식 I의 구조를 갖는 당지질:
    [화학식 I]
    Figure 112012066997015-pat00071

    상기 식에서,
    R1 내지 R4는 각각 독립적으로 하이드록시,
    Figure 112012066997015-pat00024
    ,
    Figure 112012066997015-pat00025
    ,
    Figure 112012066997015-pat00026
    또는
    Figure 112012066997015-pat00027
    이고,
    이때 R'는 각각 독립적으로 C10 내지 C 30 의 포화 또는 불포화된 아실 사슬이며,
    n은 1 이고,
    Cm은 C4 내지 C 30 의 알킬이며,
    상기 당지질 내 아실 사슬의 총 수는 2 내지 6이다.
  3. 제2항에 있어서,
    R1 은
    Figure 112010055377316-pat00028
    이고,
    이때 R'는 각각 독립적으로 C10 내지 C 30 의 포화 또는 불포화된 아실 사슬이며,
    R2 내지 R4 는 하이드록시이고,
    n은 1이며,
    1 내지 14개의 이중결합을 갖는 아실 사슬을 하나 이상 포함하는 당지질.
  4. 제2항에 있어서,
    R1 은
    Figure 112010055377316-pat00029
    이고;
    R2 , R3 또는 R4 중 어느 하나는
    Figure 112010055377316-pat00030
    이고, 나머지는 하이드록시이며,
    이때 R'는 각각 독립적으로 C10 내지 C 30 의 포화 또는 불포화된 아실 사슬이고,
    n은 1이며,
    1 내지 14개의 이중결합을 갖는 아실 사슬을 하나 이상 포함하는 당지질.
  5. 제2항에 있어서,
    상기 화학식 I은 하기 화학식 I-1 또는 화학식 I-2인 것을 특징으로 하는 당지질:
    [화학식 I-1]
    Figure 112010055377316-pat00031

    [화학식 I-2]
    Figure 112010055377316-pat00032
  6. 제1항에 있어서,
    상기 당지질은 유산균 유래인 당지질.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 유산균은 락토바실러스, 비피도박테리움, 스트렙토코커스 또는 락토코커스 속인 당지질.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 유산균은 락토바실러스 플랜타륨, 락토바실러스 람노서스, 락토바실러스 델브르키, 락토바실러스 엑시도필러스, 락토바실러스 가세리, 락토바실러스 존스니, 락토바실러스 헬베티쿠스, 락토바실러스 카세이, 비피도박테리움 비피도, 비피도박테리움 롱검, 비피도박테리움 인판티스, 비피도박테리움 아니말리스, 스트렙토코커스 써모필러스 또는 락토코커스 락티스인 당지질.
  9. 제1항에 있어서,
    아실 사슬이 결합되지 않은 헥소스의 C6 위치에 폴리인산글리세롤이 추가로 결합된 당지질.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 당지질은 하기 화학식 II의 구조를 갖는 당지질:
    [화학식 II]
    Figure 112012066997015-pat00033

    상기 식에서,
    R1 내지 R4는 각각 독립적으로 하이드록시,
    Figure 112012066997015-pat00034
    ,
    Figure 112012066997015-pat00035
    ,
    Figure 112012066997015-pat00036
    또는
    Figure 112012066997015-pat00037
    이고,
    이때 R'는 각각 독립적으로 C10 내지 C 30 의 포화 또는 불포화된 아실 사슬이며,
    R''는 각각 독립적으로 N-아세틸글루코사민, D-알라닌 또는 하이드록시이고,
    n은 1 이며,
    Cm은 C4 내지 C 30 의 알킬이고,
    l은 0 내지 80 이며,
    상기 당지질 내 아실 사슬의 총 수는 2 내지 6 이다.
  11. 제10항에 있어서,
    R1 은
    Figure 112010055377316-pat00038
    이고,
    이때 R'는 각각 독립적으로 C10 내지 C 30 의 포화 또는 불포화된 아실 사슬이며,
    R''는 각각 독립적으로 N-아세틸글루코사민, D-알라닌 또는 하이드록시이고,
    R2 내지 R4 는 하이드록시이며,
    n은 1이고,
    l은 0 내지 80 이며,
    1 내지 14개의 이중결합을 갖는 아실 사슬을 하나 이상 포함하는 당지질.
  12. 제10항에 있어서,
    R1 은
    Figure 112010055377316-pat00039
    이고;
    R2 , R3 또는 R4 중 어느 하나는
    Figure 112010055377316-pat00040
    이고, 나머지는 하이드록시이며,
    이때 R'는 각각 독립적으로 C10 내지 C 30 의 포화 또는 불포화된 아실 사슬이고,
    R''는 각각 독립적으로 N-아세틸글루코사민, D-알라닌 또는 하이드록시이며,
    n은 1이고,
    l은 0 내지 80 이며,
    1 내지 14개의 이중결합을 갖는 아실 사슬을 하나 이상 포함하는 당지질.
  13. 제10항에 있어서,
    상기 화학식 II는 하기 화학식 II-1 또는 화학식 II-2인 것을 특징으로 하는 당지질:
    [화학식 II-1]
    Figure 112010055377316-pat00041


    [화학식 II-2]
    Figure 112010055377316-pat00042

    상기 식에서,
    R''는 각각 독립적으로 N-아세틸글루코사민, D-알라닌 또는 하이드록시이고,
    l은 0 내지 80 이다.
  14. 제9항에 있어서,
    상기 당지질은 유산균 유래의 리포테이코익산인 당지질.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 유산균은 락토바실러스, 비피도박테리움, 스트렙토코커스 또는 락토코커스 속인 당지질.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 유산균은 락토바실러스 플랜타륨, 락토바실러스 람노서스, 락토바실러스 델브르키, 락토바실러스 엑시도필러스, 락토바실러스 가세리, 락토바실러스 존스니, 락토바실러스 헬베티쿠스, 락토바실러스 카세이, 비피도박테리움 비피도, 비피도박테리움 롱검, 비피도박테리움 인판티스, 비피도박테리움 아니말리스, 스트렙토코커스 써모필러스 또는 락토코커스 락티스인 당지질.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 당지질을 포함하는 패혈증 또는 아토피성 피부염의 예방 및 치료용 약학 조성물.
  18. 제17항에 있어서,
    항생제, 담체, 부형제 및 희석제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함하는 약학 조성물.
  19. 제17항에 있어서,
    약학 조성물의 제형은 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사액제인 약학 조성물.
  20. 제17항에 있어서,
    당지질은 약학 조성물 100 중량부에 대해 0.01 내지 99.9 중량부로 포함되는 약학 조성물.
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 제17항에 있어서,
    약학 조성물의 투여 형태는 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사인 약학 조성물.
  24. 제17항에 있어서,
    당지질은 1일 투여량이 0.01 내지 1,000 mg/kg 인 약학 조성물.
  25. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 당지질을 포함하는 식품 조성물.
  26. 제25항에 있어서,
    유기산, 인산염, 항산화제, 유당 카제인, 덱스트린, 포도당, 설탕 및 솔비톨로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함하는 식품 조성물.
  27. 제25항에 있어서,
    당지질은 식품조성물 100 중량부에 대해 0.01 내지 99.9 중량부로 포함되는 식품 조성물.
  28. 제25항에 있어서,
    식품 조성물의 제형은 고형, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 액상 형태인 식품 조성물.
  29. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 당지질을 포함하는 화장품 조성물.
  30. 제29항에 있어서,
    비타민, 아미노산, 단백질, 계면활성제, 유화제, 향료, 색소, 안정제, 방부제, 항산화제, 자외선 차단제, pH 조정제 및 킬레이트제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함하는 화장품 조성물.
  31. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 당지질로 이루어지거나 당지질을 포함하는 어쥬번트.
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