CN103397060B - 一种磷酸化肽聚糖的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种磷酸化肽聚糖的制备方法，特点是包括将嗜酸乳杆菌接种于培养基培养，离心收集菌体反复洗涤，将菌体悬浮于氢氟酸溶液中4℃过夜，离心收集细胞壁沉淀洗涤至中性；将沉淀溶于糜胰蛋白酶磷酸缓冲液中沸水灭活，取上清液离心后沉淀洗涤；将沉淀溶于乙醚中，搅拌离心收集沉淀用水洗涤至无乙醚味得肽聚糖的步骤；将肽聚糖溶于溶菌酶磷酸缓冲液中酶解离心取上清液，再将上清液离心取沉淀用水离心洗涤得到小分子肽聚糖的步骤；最后将小分子肽聚糖溶于混合磷酸盐溶液中反应后用乙醇沉淀，将醇沉肽聚糖冷冻干燥复溶，复溶后的溶液置于透析袋中透析浓缩后冷冻干燥得磷酸化肽聚糖的步骤，优点是溶解性显著增加、免疫效应有所提高。
Description
技术领域
本发明涉及一种肽聚糖的制备方法，尤其是涉及一种磷酸化肽聚糖的制备方法。
背景技术
乳酸菌作为一种重要的肠道益生菌，在调节肠道微生物菌群、增强机体免疫力及预防肿瘤等疾病中具有重要作用。近年来国内外除了关注长期研究的双歧杆菌、枯草杆菌外，又开始将目标锁定于另一重要成员——嗜酸乳杆菌。此类细菌利用特有的肽聚糖成分诱导各种细胞因子的释放进而调节宿主的免疫功能。
肽聚糖，是细菌细胞壁的主要组成成分之一。它的单体是由一个四肽尾和一个双糖单位构成。这种微生物多糖因其肽段结构的特殊性、糖类聚合链的长短性，而具有不同的免疫效用。如《微生物学通报》2007年34卷第1期的姚光国等人就以小鼠为模型研究乳酸菌肽聚糖的免疫增强作用，结果表明肽聚糖能提高鸡新城疫疫苗免疫效果；张悦等人在2006年13卷第4期的《中国水产科学》中对肽聚糖分子量的大小与免疫关系进行研究，最后发现低分子量肽聚糖的增加有利于免疫效应的增强。虽然肽聚糖具有良好的免疫增强作用，但目前对于它的研究和产品开发甚是少见，究其原因在于它本身的低溶解性，由于溶解性问题也使肽聚糖只局限在固体免疫增强佐剂领域。
磷酸化分子修饰是一种共价修饰，是支链上的羟基被磷酸根取代的过程，从而有助于糖类的免疫效应、抗肿瘤能力、抗凝血能力的进一步增强。但是目前关于磷酸化修饰主要集中在淀粉、壳聚糖和纤维素等，肽聚糖磷酸化修饰方面的研究至今未见有报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种溶解性显著增加、免疫效应有所提高的磷酸化肽聚糖的制备方法。
本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种磷酸化肽聚糖的制备方法，具体包括以下步骤：
（1）肽聚糖的制备
a.菌体收集：将活化的嗜酸乳杆菌按体积百分比3-5%的接种量接种于MRS液体培养基，37-40℃恒温培养箱静置培养16-24h，5000-8000r/min离心10-20min收集菌体，并用蒸馏水反复洗涤直至菌体呈乳白色；
b.去磷壁酸：将步骤a得到的菌体按1g:9ml的固液比悬浮于浓度为40-50%的氢氟酸溶液中，4℃放置过夜，7000-9000 r/min离心10-20min收集不含磷壁酸的细胞壁沉淀，并用蒸馏水洗涤沉淀至中性；
c.酶解破壁：将步骤b得到的沉淀按2g:5ml的固液比溶于糜胰蛋白酶磷酸缓冲液中，37-40℃摇床110-130r/min振荡15-17h，沸水浴灭活4-6min，于1500-2500r/min的转速下离心4-6min，弃去未溶解的蛋白酶沉淀，将上清液于8000-12000r/min离心10-20min，得到的沉淀用蒸馏水离心洗涤；
d.除脂：将步骤c洗涤后得到的沉淀按1g:1ml的固液比溶于乙醚中，搅拌3-5h后，7000-9000r/min离心10-20min收集沉淀，用蒸馏水洗涤至无乙醚味得到肽聚糖；
（2）降低分子量：
将肽聚糖按1g:5ml的固液比溶于溶菌酶磷酸缓冲液中，36-38℃搅拌酶解6-10h，于1500-2500r/min的转速下离心4-6min，取上清液，再将上清液于8000-12000r/min离心10-20min，取沉淀用蒸馏水离心洗涤，得到小分子肽聚糖；
（3）混合磷酸盐修饰
将小分子肽聚糖按1g:10ml的固液比溶于浓度为0.003-0.006g/ml的复合磷酸盐溶液中，75-85℃反应4-6h后，再将反应液用8倍反应液体积的95%乙醇沉淀20-28h，将醇沉肽聚糖冷冻干燥，再于55-65℃水浴中复溶，复溶后的溶液置于截留分子量为7000的透析袋中，以蒸馏水为透析液透析2-3天后，将透析袋内液体浓缩到2-5ml后，进行冷冻干燥得到磷酸化肽聚糖。
所述的MRS液体培养基的配制方法如下：将蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母浸膏5g，葡萄糖10g，柠檬酸三胺2g，磷酸氢二钾2g，醋酸钠5g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25，吐温80 1ml，加蒸馏水定容至1000ml，调节pH 至7.2-7.4即可。
所述的糜胰蛋白酶磷酸缓冲液的配制方法如下：将150mg胰蛋白酶和25mg α-糜蛋白酶溶于50mL的0.1mol/L磷酸钠缓冲液中即可，其pH为8.0。
所述的溶菌酶磷酸缓冲液的配制方法如下：将10mg溶菌酶和200μg变溶菌素溶于50mL的0.1mol/L磷酸钠缓冲液中即可，其pH为5.8。
所述的复合磷酸盐由三聚磷酸钠和三偏磷酸钠按5:1的质量比混合而成。
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明一种磷酸化肽聚糖的制备方法，首先将嗜酸乳杆菌菌体作为原料提取原肽聚糖，其次在温和条件下使氢氟酸先除去磷壁酸再酶解破壁，然后采用酶解法降低其分子聚合度，增加其在溶剂中的溶解性；最后利用混合磷酸盐的方法对其结构进行修饰，以促进它在免疫效应中的发挥。优点如下：
（1）肽聚糖提取过程中采用氢氟酸先去除磷壁酸再酶解的方法，这样既在不损坏其他物质的基础上增加了细胞壁的通透性又促进了糜胰蛋白酶酶解效能的发挥，省力高效；
（2）酶解破壁中加入α-糜蛋白酶，能增强胰蛋白酶效用的发挥，α-糜蛋白酶活力较胰蛋白酶高，可首先酶解一部分附着或粘附在细胞壁表面的结构蛋白，进而增加其通透性，使胰蛋白酶可专一的对肽聚糖骨架周围的蛋白发挥效用，提高酶解效率；
（3）采用变溶菌素与溶菌酶以1:50的质量比配伍制成溶菌酶缓冲液。首先是因为变溶菌素具有高效广谱的酶切范围，它的加入不仅能使溶菌酶作用的糖苷键断裂，还能使一些糖肽键与肽键断裂，这样就提高了溶菌酶缓冲液的酶切范围；并且混合酶解液在相同时间内比溶菌酶酶解速度更快，效果更好。其次以1:50的质量比配伍是通过响应面法优化后得出的最佳酶解比例，在此条件下酶解效用将达到最充分的发挥；
（4）采用三聚磷酸钠与三偏磷酸钠的混合溶液作为磷酸化修饰方法，既无毒无害又能使磷酸根得到最大的取代率；磷酸化分子修饰的反应条件温和、试剂安全、免疫效用显著。
综上所述，本发明的提取流程优化了各步骤条件，以使试剂利用最大化；采用磷酸化的方法修饰肽聚糖后，不仅解决了肽聚糖的低溶解性问题，而且因磷酸根的引入还赋予肽聚糖更好的免疫效应，这为肽聚糖在医药保健、免疫佐剂方面的研究开辟了一条新的思路。本发明的制备方法具有低成本、高产出，实用性强，操作合理等优点，非常适合工厂规模化生产。
附图说明
图1为本发明未经磷酸化的肽聚糖的红外光谱扫描谱图；
图2为本发明磷酸化肽聚糖的红外光谱扫描谱图；
图3为生理盐水组小鼠脾切片图；
图4为肽聚糖组（未磷酸化）小鼠脾切片图；
图5为磷酸化肽聚糖组小鼠脾切片图；
图6为生理盐水组小鼠胸腺切片图；
图7为肽聚糖组小鼠胸腺切片图；
图8为磷酸化肽聚糖组小鼠胸腺切片图。
具体实施方式
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
一、具体实施例
实施例1
本发明以普通市售嗜酸乳杆菌菌粉作为原料进行肽聚糖的提取。首先将2mg菌粉接种于200mL MRS液体培养基，37℃静置培养24h以活化菌种，本发明一种磷酸化肽聚糖的制备方法，具体包括以下步骤：
（1）肽聚糖的制备
a.菌体收集：将活化的嗜酸乳杆菌按体积百分比4%的接种量接种于MRS液体培养基，38.5℃恒温培养箱静置培养20h，6500r/min离心15min收集菌体，并用蒸馏水反复洗涤直至菌体呈乳白色；其中MRS液体培养基的配制方法如下：将蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母浸膏5g，葡萄糖10g，柠檬酸三胺2g，磷酸氢二钾2g，醋酸钠5g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25，吐温80 1ml，加蒸馏水定容至1000ml，调节pH 至7.2-7.4即可；
b.去磷壁酸：将步骤a得到的菌体按1g:9ml的固液比悬浮于浓度为45%的氢氟酸溶液中，4℃放置过夜，8000r/min离心15min收集不含磷壁酸的细胞壁沉淀，并用蒸馏水洗涤沉淀至中性；
c.酶解破壁：将步骤b得到的沉淀按2g:5ml的固液比溶于糜胰蛋白酶磷酸缓冲液中，38.5℃摇床120r/min振荡16h，沸水浴灭活5min，于2000r/min的转速下离心5min，弃去未溶解的蛋白酶沉淀，将上清液于10000r/min离心15min，得到的沉淀用蒸馏水离心洗涤；其中糜胰蛋白酶磷酸缓冲液的配方如下：将150mg胰蛋白酶和25mg α-糜蛋白酶溶于50mL的0.1mol/L磷酸钠缓冲液中即可，其pH为8.0；
d.除脂：将步骤c洗涤后得到的沉淀按1g:1ml的固液比溶于乙醚中，搅拌4h后，8000r/min离心15min收集沉淀，用蒸馏水洗涤至无乙醚味得到肽聚糖；
（2）降低分子量：
将肽聚糖按1g:5ml的固液比溶于溶菌酶磷酸缓冲液中，37℃搅拌酶解8h，于2000r/min的转速下离心5min，取上清液，再将上清液于10000r/min离心15min，取沉淀用蒸馏水离心洗涤得到小分子肽聚糖；其中溶菌酶磷酸缓冲液的配方如下：将10mg溶菌酶和200μg变溶菌素溶于50mL的0.1mol/L磷酸钠缓冲液中即可，其pH为5.8；
（3）混合磷酸盐修饰
将小分子肽聚糖按1g:10ml的固液比溶于0.0045g/ml的复合磷酸盐溶液（复合磷酸盐由三聚磷酸钠和三偏磷酸钠按5:1的质量比混合而成）中，80℃反应5h后，再将反应液用8倍反应液体积的95%乙醇沉淀24h，将醇沉肽聚糖冷冻干燥，再于60℃水浴中复溶，复溶后的溶液置于截留分子量为7000的透析袋中，以蒸馏水为透析液透析2.5天后，将透析袋内液体浓缩到3.5mL后,进行冷冻干燥得磷酸化肽聚糖。
实施例2
同实施例1，其区别在于：
（1）肽聚糖的制备
将活化的嗜酸乳杆菌按体积百分比3%的接种量接种于MRS液体培养基，37℃恒温培养箱静置培养16h，5000r/min离心20min收集菌体，并用蒸馏水反复洗涤直至菌体呈乳白色；将菌体按1g:9ml的固液比悬浮于浓度为40%的氢氟酸溶液中，4℃放置过夜，7000 r/min离心20min收集不含磷壁酸的细胞壁沉淀，并用蒸馏水洗涤沉淀至中性；将沉淀按2g:5ml的固液比溶于糜胰蛋白酶磷酸缓冲液中，37℃摇床110r/min振荡17h，沸水浴灭活4min，于1500r/min的转速下离心6min，弃去未溶解的蛋白酶沉淀，将上清液于8000r/min离心20min，得到的沉淀用蒸馏水离心洗涤；将步骤c洗涤后得到的沉淀按1g:1ml的固液比溶于乙醚中，搅拌3h后，7000r/min离心20min收集沉淀，用蒸馏水洗涤至无乙醚味得到肽聚糖；
（2）降低分子量
将肽聚糖按1g:5ml的固液比溶于溶菌酶磷酸缓冲液中，36℃搅拌酶解10h，于1500r/min的转速下离心6min，取上清液，再将上清液于8000r/min离心20min；
（3）混合磷酸盐修饰
将小分子肽聚糖按1g:10ml的固液比溶于浓度为0.006g/ml的复合磷酸盐溶液中，75℃反应6h后，用8倍体积的95%乙醇沉淀20h，将醇沉肽聚糖冷冻干燥，再于55℃水浴中复溶，于透析袋中透析2天，将透析袋内液体浓缩到2mL后，进行冷冻干燥得磷酸化肽聚糖。
实施例3
同实施例1，其区别在于：
（1）肽聚糖的制备
将活化的嗜酸乳杆菌按体积百分比5%的接种量接种于MRS液体培养基，40℃恒温培养箱静置培养24h，8000r/min离心10min收集菌体，并用蒸馏水反复洗涤直至菌体呈乳白色；将菌体按1g:9ml的固液比悬浮于浓度为50%的氢氟酸溶液中，4℃放置过夜，9000 r/min离心10min收集细胞壁沉淀，并用蒸馏水洗涤沉淀至中性；将沉淀按2g:5ml的固液比溶于糜胰蛋白酶磷酸缓冲液中，40℃摇床130r/min振荡15h，沸水浴灭活6min，于2500r/min的转速下离心4min，将上清液于12000r/min离心10min，得到的沉淀用蒸馏水离心洗涤；将沉淀按1g:1ml的固液比溶于乙醚中，搅拌5h后，9000r/min离心10min收集沉淀，用蒸馏水洗涤至无乙醚味得到肽聚糖；
（2）降低分子量：
将肽聚糖按1g:5ml的固液比溶于溶菌酶磷酸缓冲液中，38℃搅拌酶解6h，于2500r/min的转速下离心4min，取上清液，再将上清液于12000r/min离心10min；
（3）混合磷酸盐修饰
将小分子肽聚糖按1g:10ml的固液比溶于浓度为0.003g/ml的复合磷酸盐溶液中，85℃反应4h后，将反应液用8倍反应液体积的95%乙醇沉淀28h，将醇沉肽聚糖冷冻干燥，再于65℃水浴中复溶，置于透析袋中透析3天后，将透析袋内液体浓缩到5mL后，进行冷冻干燥得磷酸化肽聚糖。
二、实验测定
1、实验测定方法
1.1红外光谱检测：将原肽聚糖和磷酸化肽聚糖采用KBr压片，400-4000cm-1之间扫描，测定红外光谱。
1.2免疫效应
1.2.1 免疫器官指数：选取正常雄性昆明小鼠24只，体重均在30±2g。将小鼠随机分为对照组（生理盐水）、肽聚糖组和磷酸化肽聚糖组这3组，每组8只。并采用一次性灭菌注射器以20mg/kg·d的剂量对小鼠进行灌胃处理，连续注射一周，停止注射次日将所有老鼠称重并处死，记录各组小鼠的胸腺、脾脏重量，统计小鼠免疫器官（胸腺、脾）增重情况，公式如下：免疫器官指数=免疫器官鲜重(mg)/体重(g)，并用SPSS软件对统计数据进行方差分析。
1.2.2 组织切片：在取出的新鲜免疫器官中每组各挑选一个用锡纸包被，投于液氮中速冻5min，然后立即放入切片机中固定切片，切片后用HE法染色，在光学显微镜下观察细胞变化情况。
2、实验结果
2.1 红外光谱扫描谱图
由图1和图2可知，原肽聚糖和磷酸化肽聚糖均有3415.1cm-1、3395cm-1的-0H伸缩振动，2960.9cm-1、2927cm-1的C-H伸缩振动等糖类物质的特征吸收峰，而且在905cm-1-
876cm-1处有β-D-葡萄吡喃糖的特征峰。在磷酸化肽聚糖的结构图中可以发现存在1290cm-1的P=O键，证明磷酸根已被接枝于肽聚糖上。
2.2 免疫效应
2.2.1 免疫器官指数
由下表1可知，与对照组比较，肽聚糖组和磷酸化肽聚糖组对小鼠的胸腺指数、脾脏指数均有显著提高（P<0.05)；磷酸化肽聚糖组对小鼠的胸腺指数较肽聚糖组也有一定增加（P<0.05)。
表1 肽聚糖对小鼠免疫器官的影响
| 组别 | 脾脏指数（mg/g） | 胸腺指数（mg/g） |
| 对照组 | 4.0436±0.2015a | 2.1450±0.2299c |
| 肽聚糖组 | 4.8978±0.5238b | 2.5268±0.0892d |
| 磷酸化肽聚糖组 | 5.0506±0.5464b | 2.8093±0.1747e |
注：在同一测定项目中，不同字母间差异显著( P < 0. 05)；相同字母间差异不显著(P>0.05)。
2.2.2 免疫切片分析
观察图3-图5三个组灌胃后小鼠脾脏的切面情况和图6-图8三个组灌胃后小鼠胸腺的切面情况，相较于生理盐水对照组而言，两组试验组脾脏白髓、红髓分界明显（白髓：黑点排列密集且颜色较深；红髓：黑点排列疏散且颜色较浅），白髓面积增大，淋巴小节和脾小体（位于白髓内，可见生发中心）增多；胸腺则表现为皮质/髓质（皮质：黑点排列密集，颜色较深区域；髓质：黑点分布疏散，颜色较浅区域）比例显著提高。相较于未磷酸化修饰肽聚糖组，磷酸化修饰组的脾脏、胸腺变化情况更加明显。另外，各组小鼠免疫器官切片未见异常组织结构变化出现。可见磷酸化肽聚糖对免疫力起到一定增强作用。
当然，上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护范围。
Claims (2)
1.一种磷酸化肽聚糖的制备方法，其特征具体包括以下步骤：
(1)肽聚糖的制备
a.菌体收集：将活化的嗜酸乳杆菌按体积百分比3-5％的接种量接种于MRS液体培养基，37-40℃恒温培养箱静置培养16-24h，5000-8000r/min离心10-20min收集菌体，并用蒸馏水反复洗涤直至菌体呈乳白色；
b.去磷壁酸：将步骤a得到的菌体按1g:9ml的固液比悬浮于浓度为40-50％的氢氟酸溶液中，4℃放置过夜，7000-9000r/min离心10-20min收集不含磷壁酸的细胞壁沉淀，并用蒸馏水洗涤沉淀至中性；
c.酶解破壁：将步骤b得到的沉淀按2g:5ml的固液比溶于糜胰蛋白酶磷酸缓冲液中，37-40℃摇床110-130r/min振荡15-17h，沸水浴灭活4-6min，于1500-2500r/min的转速下离心4-6min，弃去未溶解的蛋白酶沉淀，将上清液于8000-12000r/min离心10-20min，得到的沉淀用蒸馏水离心洗涤；其中所述的糜胰蛋白酶磷酸缓冲液的配制方法如下：将150mg胰蛋白酶和25mgα-糜蛋白酶溶于50mL的0.1mol/L磷酸钠缓冲液中即可，其pH为8.0；
d.除脂：将步骤c洗涤后得到的沉淀按1g:1ml的固液比溶于乙醚中，搅拌3-5h后，7000-9000r/min离心10-20min收集沉淀，用蒸馏水洗涤至无乙醚味得到肽聚糖；
(2)降低分子量：
将肽聚糖按1g:5ml的固液比溶于溶菌酶磷酸缓冲液中，36-38℃搅拌酶解6-10h，于1500-2500r/min的转速下离心4-6min，取上清液，再将上清液于8000-12000r/min离心10-20min，取沉淀用蒸馏水离心洗涤得到小分子肽聚糖；其中所述的溶菌酶磷酸缓冲液的配制方法如下：将10mg溶菌酶和200μg变溶菌素溶于50mL的0.1mol/L磷酸钠缓冲液中即可，其pH为5.8；
(3)混合磷酸盐修饰
将小分子肽聚糖按1g:10ml的固液比溶于浓度为0.003-0.006g/ml的复合磷酸盐溶液中，75-85℃反应4-6h后，再将反应液用8倍反应液体积的95％乙醇沉淀20-28h，将醇沉肽聚糖冷冻干燥，再于55-65℃水浴中复溶，复溶后的溶液置于截留分子量为7000的透析袋中，以蒸馏水为透析液透析2-3天后，将透析袋 内液体浓缩到2-5ml后，进行冷冻干燥得到磷酸化肽聚糖，其中所述的复合磷酸盐溶液由三聚磷酸钠溶液和三偏磷酸钠溶液按5:1的质量比混合而成。
2.根据权利要求1所述的一种磷酸化肽聚糖的制备方法，其特征在于所述的MRS液体培养基的配制方法如下：将蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母浸膏5g，葡萄糖10g，柠檬酸三胺2g，磷酸氢二钾2g，醋酸钠5g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25，吐温801ml，加蒸馏水定容至1000ml，调节pH至7.2-7.4即可。
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