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KR100847171B1 - 에피갈로카테친 갈레이트의 제조 방법 - Google Patents

에피갈로카테친 갈레이트의 제조 방법 Download PDF

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KR100847171B1
KR100847171B1 KR1020000047107A KR20000047107A KR100847171B1 KR 100847171 B1 KR100847171 B1 KR 100847171B1 KR 1020000047107 A KR1020000047107 A KR 1020000047107A KR 20000047107 A KR20000047107 A KR 20000047107A KR 100847171 B1 KR100847171 B1 KR 100847171B1
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디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이.
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Abstract

에피갈로카테친 갈레이트(EGCG: epigallocatechin gallate)는 녹차 추출물을 대공극성(macroporous) 극성 수지상에서 크로마토그래피시키고, 극성 용출 용매로 수지로부터 EGCG를 용출시키고, 선택적으로 용출액을 농축시키고, 선택적으로 잔류하는 카테친을 탈착시킴으로써 상기 수지를 재생시키고, 선택적으로 탈착된 카테친을 농축시킴으로써 수득된다.

Description

에피갈로카테친 갈레이트의 제조 방법{PROCESS FOR THE PRODUCTION OF EPIGALLOCATECHIN GALLATE}
본 발명은 (-)-에피갈로카테친 갈레이트의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명은, 특히 대공극성 극성 수지로 처리함을 포함하는 차 카테친으로부터의 분리에 의한 EGCG의 제조 방법에 관한 것이다.
녹차 식물 차나무(카멜리아 시넨시스; camellia sinensis)의 잎은 건조 중량 기준으로 폴리페놀 36% 이하를 함유하지만, 이의 조성은 기후, 계절, 다양성 및 성장 상태에 따라 다양하다. 녹차 카테친은 녹차 폴리페놀의 주요 그룹이다. 카테친의 예로는 (-)-에피카테친(EC), (-)-에피갈로카테친 갈레이트(EGCG), 에피갈로카테친(EGC) 및 에피카테친 갈레이트(ECG)를 들 수 있다.
EGCG는 강한 항산화 효과를 나타내기 때문에 상기 언급된 카테친중 가장 흥미있는 화합물이다. 더욱이, EGCG가 항돌연변이 효과, 항균 효과를 가지며, 또한 혈중 콜레스테롤 농도에도 유익한 효과를 가지는 것으로 입증되었다. 차에 존재하는 다른 카테친은 훨씬 덜 효과적이다. 녹차는 또한 카페인, 단백질, 펙틴 및/또는 바람직하지 않은 금속 이온과 같은 다른 성분을 함유한다.
따라서, 간단하고 경제적인 방법에 의해 높은 수율로서 순수한 형태의 EGCG를 분리해야 한다. 그러나, 각종 차 카테친의 구조적 유사성으로 인해 개개의 카테친의 분리가 어려워진다. 더욱이, 차 카테친은 일반적으로 녹차 잎의 건조 중량 기준으로 4% 이하로 존재하는 카페인을 함유한다. 카페인은 카테친과 결합하는 것으로 알려져 있으며, 이의 제거는 쉽지 않다.
녹차 추출물의 제조는 당해 분야에 잘 알려져 있다. 미국 특허 제5,879,733호는 개선된 투명도와 색채를 가지는 녹차 추출물의 제법을 개시하고 있다. 이 차 추출물은 25 내지 60℃의 온도에서 추출물에 존재하는 금속 이온을 제거하는데 효과적인 일정량의 식품 등급 양이온 교환 수지로 녹차 추출물을 처리하여 수득된다. 이어서, 처리된 추출물을 나노여과막(nanofiltration membrane)과 접촉시킨다. 그러나, 미국 특허 제5,879,733호에 개시된 방법은 차 카테친의 혼합물로부터 EGCG를 분리하는데 적합하지 않다.
미국 특허 제 4,613,672 호는 순수한 EGCG의 제조 방법을 기술하고 있는데, 이 방법은 차잎을 온수, 또는 40 내지 75% 메탄올, 40 내지 75% 에탄올 또는 30 내지 80% 아세톤의 수용액으로 추출하는 단계를 포함한다. 수득된 추출물을 클로로포름으로 세척하고, 세척된 추출물을 유기 용매에 용해시킨다. 유기 용매를 증류 제거하고, 아세톤/테트라하이드로푸란/물(0 내지 25:0 내지 35:65 내지 85부피%)의 전개제를 이용하는 역상 분배 칼럼을 사용하여 상기 농축된 추출물 성분을 고속 액체 크로마토그래피시키고, 이를 통해 (-)-에피카테친, (-)-에피갈로카테친, (-)-에피카테친 갈레이트 및 (-)-에피갈로카테친 갈레이트를 각각 분리시킨다. 미국 특허 제4,613,672호에 기술된 방법은 고가의 칼럼 충진물을 사용하기 때문에 기술적 규모의 EGCG를 경제적으로 생산할 수 없다. 또한, 미국 특허 제4,613,672호에 기재된 방법은 사용된 혼합 용매(아세톤/테트라하이드로푸란/클로로포름)가 식품 승인받지 못했기 때문에 식품 생성물에 첨가될 수 있는 EGCG을 생산할 수 없다.
종래 문헌은 혼합물로서의 카테친의 제조를 기재하고 있지만, 보조제 및 식료품 성분으로서 혼입되기 위한 순수한 형태의 EGCG를 간단하고 안전하고 경제적으로 제조하는 방법이 여전히 요구된다.
본 발명은 순수한 형태의 EGCG를 제조하는 방법을 제공하고자 한다.
본 발명에 의해, 대공극성 극성 수지 및 적당한 극성 용출 용매를 사용하여 분리를 수행할 때, 개선된 선택성으로 차 카테친 및/또는 카페인의 혼합물로부터 EGCG를 분리할 수 있는 것으로 밝혀졌다.
따라서, 본 발명은 에피갈로카테친 갈레이트의 제조 방법에 관한 것이고, 이 방법은 a) 녹차 추출물을 제공하는 단계, b) 약 10 내지 약 80℃의 온도에서, 대공극성 극성 수지상에서 상기 녹차 추출물을 크로마토그래피시키는 단계, c) 약 10 내지 약 80℃의 온도 및 약 0.1 내지 약 50바의 압력하에서 극성 용출 용매를 사용하여 상기 대공극성 극성 수지로부터 EGCG를 용출시키는 단계, d) 선택적으로, 상기 단계 c)의 용출액을 농축시키는 단계, e) 선택적으로, 잔류하는 카테친을 탈착시켜 상기 대공극성 극성 수지를 재생시키는 단계, 및 f) 선택적으로, 상기 단계 e)의 탈착된 카테친을 농축시키는 단계를 포함한다.
출발 물질로 사용된 녹차 추출물의 제조는 당해 분야에 잘 알려져 있다. 예컨대, 녹차잎을 온수 또는 냉수로 추출하여 차 카테친 및 카페인을 함유하는 용액을 제조하는 것이 전형적이다. 이 녹차 용액은 추가로 농축시켜 농축된 추출 용액 또는 건조 분말로 제조할 수 있다. 이 추출 용액 또는 분말은 식품 승인된 산(예컨대, 시트르산, 아스코르브산 또는 이소아스코르브산 등)과 같은 안정화제를 함유할 수 있다.
또한, 차 추출물 분말은 예컨대, 귀조우 하이귄 바이올로지칼 프로덕트 캄파니(Guizhou Highyin Biological Product Co.)(중국 귀양(Guiyang)) 또는 제양 종크 플랜트 테크니칼 캄파니 리미티드(Zhejang Zhongke Plant Technical Co. Ltd.)(중국 제양(Zhejang))에서 시판된다.
EGCG의 분리는 녹차 추출물을 대공극성 극성 수지로 충진된 칼럼에 적용시킴으로써 수행되는 것이 전형적이다.
본원에 사용된 용어 "대공극성 극성 수지"는, 예컨대 롬 앤드 하스(Rohm and Haas)사(미국 펜실베니아주 필라델피아 소재)에서 시판하는 암베라이트(AMBERLITE, 등록상표) XAD-7과 같은 폴리아크릴레이트, 토소 하스(Toso Haas)사에서 시판하는 암베르크롬(AMBERCHROM, 등록상표) CG-71 또는 미쓰비시 케미칼 코포레이션(Mitsubishi Chem. Corp.)(미국 펜실베니아주 필라델피아 소재)에서 시판하는 디아이온(DIAION) HP 2MG와 같은 폴리메타크릴레이트, 메르크(Merck)사(독일 다름스타트(Darmstadt))에서 시판하는 폴리아미드 11, 플루카(Fluka)사 (스위스 부치스(Buchs)소재)에서 시판하는 폴리아미드 6 및 나일론 6,6(각각의 카탈로그 번호 02395 및 74712) 및 EMS 케미(Chemie)(스위스 도마트(Domat)소재)에서 시판하는 그릴아미드 L 25 나뚜르(Grilamid L 25 natur)와 같은 폴리아미드 12와 같은 폴리아미드, 시그마(Sigma)사에서 시판하는 폴리비닐피롤리돈 P 6755, 또는 방향족 폴리아미드 및 폴리에스테르와 같은 아크릴계 수지를 말한다.
상기 수지는 기체를 제거하고 용출 용매로 평형화시킨 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 방법은 약 10 내지 약 80℃, 바람직하게는 약 40 내지 약 60℃의 온도에서 수행된다. 예컨대, 가열 재킷(heating jacket)과 같은 항온 조절된 영역에 칼럼을 둠으로써 항온 조절할 수 있다.
이동상이 칼럼을 통해 통과하는 유압(hydraulic pressure)은 넓은 한도내에서 변화할 수 있다. 이동상은 약 0.1 내지 약 50바, 바람직하게는 약 0.1 내지 약 20바, 더욱 바람직하게는 약 0.1 내지 약 10바의 압력하에서 칼럼을 통해 펌프되는 것이 바람직하다.
이동상은 물과 유기 용매의 혼합물인 극성 용출 용매를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "유기 용매"는 메탄올, 에탄올 또는 이소프로판올 등과 같은 알콜, 아세톤과 같은 케톤 또는 에틸아세테이트와 같은 에스테르, 또는 그의 혼합물을 말한다. 에탄올 및 이소프로판올과 같은 식품 등급 알콜을 사용하는 것이 바람직하다. 약 70 내지 약 95부피%, 바람직하게는 약 90부피%의 물과 약 5 내지 약 30부피%, 바람직하게는 약 10부피%의 유기 용매의 혼합물을 포함하는 이동상을 사용할 때, 특히 양호한 결과가 수득된다. 이것이 기체 제거 및 이동상에 유익하고, 질소 또는 아르곤과 같은 불활성 대기하에 유지시킨다.
칼럼은 이동상으로 조건화한다. 칼럼을 통과하는 이동상의 유속은 넓은 범위내에서 변화할 수 있다. 유속은 약 0.5 내지 약 20충전부피/시간, 바람직하게는 약 0.5 내지 약 10충전부피/시간, 더욱 바람직하게는 약 0.8 내지 약 5충전부피/시간의 범위이다(1충전부피는 1m3 수지당 1m3 용액 또는 용매에 상응한다).
정지상과 이동상사이에 평형이 형성된 후, 차 추출물 용액이 이동상내로 도입되고, 이어서, 녹차 추출물을 대공극성 극성 수지상에서 크로마토그래피시킨다. 만약 녹차 추출 분말이 출발 물질로서 사용된다면, 분말을 이동상에 용해시킨다. 만약 수성 녹차 추출물이 사용된다면, 추출물중 물 대 유기 용매의 비율을 유기 용매를 첨가하여 이동상의 물 대 유기 용매의 비율로 조정하면 유리하다.
본 발명의 주요 태양은 약 10 내지 약 80℃, 바람직하게는 약 40 내지 약 60℃의 온도에서 대공극성 극성 수지로 녹차 추출물을 처리하여 극성 용출 용매로 EGCG를 용출시키는 것이다. 이러한 수지, 용출액 및 온도의 세가지 특징의 특별한 상호작용이 본 발명의 중요한 태양이며, 차 카테친 및/또는 카페인의 혼합물로부터 EGCG를 특정 분리시키고, 용출후 추출물 또는 농축물에 존재하는 카테친의 총량으로 계산하여 75% 이상, 바람직하게는 85% 초과, 더욱 바람직하게는 약 90 내지 약 97%의 EGCG를 함유하는 EGCG 분획이 수득된다.
대공극성 극성 수지가 카페인, EGCG 및 잔류하는 카테친을 흡착하는 능력은 사용된 용출액 및 온도에 따라 또한 상이하다. 카페인에 대한 친화성은 EGCG에 대한 친화성보다 적고, 따라서 카페인이 존재한다면 카페인이 먼저 용출되고 분리될 수 있다. 적절하다면, 또한 경제적 이익이 될 수 있는 카페인을 순수한 형태로 회수하는 것도 가능하다. EGCG가 존재하는 제2 분획이 분리된다. 잔류하는 차 카테친은 EGCG보다 강한 친화성을 나타내고, 따라서, 잔류하는 카테친을 탈착할 수 있는 용매를 사용하여 수지를 재생시킬때까지 흡착되어 잔류한다. 예컨대, 잔류하는 카테친은 순수한 유기 용매로 용출시키거나, 또는 이동상중 물 대 유기 용매의 비율을 변화시켜 탈착될 수 있다. 적당한 재생 용매는 예컨대, 순수 유기 용매, 또는 약 10 내지 약 60부피%의 물과 약 40 내지 약 90부피%의 유기 용매, 바람직하게는 약 40부피%의 물과 약 60부피%의 유기 용매의 혼합물이다.
용출액중 EGCG의 농축은 당해 분야에서 공지된 방법(예: 증발)에 의해 수행될 수 있다. EGCG 용출액을 증발 건고시켜 EGCG를 고순도로 함유하는 분말을 형성하거나, 또는 농축시켜 결정을 형성할 수 있다. 농축은 용출액에 시트르산, 아스코르브산 또는 이소아스코르브산 등과 같은 식품 승인된 산을 안정화제로 첨가하여 수행될 수 있다. 산은 EGCG에 대해 약 0.1 내지 약 2.5%의 양으로 첨가하는 것이 바람직하다.
카페인을 함유하는 예비분획 및 잔류하는 카테친을 함유하는 단계 e)의 분획을 상기와 같이 농축할 수 있다.
이 방법은 다중 크로마토그래피 칼럼 시스템 또는 단일 칼럼을 사용하여 수행될 수 있다. 또한, 이 방법은 당해 분야에서 "자극된 이동층 크로마토그래피" 또는 "환상 크로마토그래피"로 언급되는 기술을 사용하여 수행될 수 있다.
본 발명의 방법은 간단하고 경제적인 조작으로 수행될 수 있으므로, 수율 및 취급상의 면에서 대규모 생산에 적용될 수 있다.
상기와 같이 제조된 EGCG는 강한 항산화 활성을 가지고, 따라서, 다양한 식료품, 화장품 또는 기름 등에 항산화제로서 사용될 수 있다. 또한, EGCG는 항돌연변이 효과, 항균 효과를 가지며, 또한 혈중 콜레스테롤 농도에도 유익한 효과를 가진다. 따라서, 농축물 또는 순수한 EGCG는 건강 관리 제품으로 유용하다.
본 발명은 하기 실시예를 참고로 하여 더욱 자세히 설명된다.
(하기 실시예의 표에서 구성 성분들의 상대 백분율의 총 합은 100%이지만, 소수점 1자리 또는 2자리의 유효 숫자를 맞추기 위해 반올림되는 과정에서 발생한 오차에 의해 이들 상대 백분율의 산술적 합이 100 %보다 작거나 커질 수 있다)
실시예 1
EGCG의 분리
상이한 카테친 및 카페인을 함유한 녹차 추출물(중국 귀양의 귀조오 하이귄 바이올로지칼 캄파니에서 제조한 "녹차 추출물, 폴리페놀 95% 이상")을 출발 물질로서 사용했다. 차 성분의 농도는 UV 흡광기를 사용한 HPLC로 결정했고, 중량%로 나타내었다. 갈산뿐만 아니라 EGCG, 카페인, 다른 카테친의 함량을 하기 표 1에 나타내었다:
출발 물질중 차 성분의 농도
화합물 실시예 1의 차 추출물 HPLC/중량% 실시예 1의 차 추출물 상대 백분율/%
갈산 0.01 0.02
카테친 2.3 3.11
카페인 11.0 15.10
EGCG 38.1 52.34
에피카테친 5.2 7.11
GCG 6.6 8.99
ECG 9.7 13.35
전체 72.8 100.00

0.3 내지 1.2mm의 입자 크기를 가지는 암베라이트 XAD-7수지 33.5ℓ(26kg)를 내경 150mm, 길이 2m 및 부피 35.4ℓ의 파일로트 규모 칼럼내로 충진했다. 칼럼에 가열 재킷을 장치했다. 수지를 물로 철저히 세척하고 물/이소프로판올(부피비 9:1)의 혼합물로 평형화했다. 사용된 기구 및 용매는 기체를 제거하고, 사용하기 전에 불활성 질소 대기하에 유지시켰다.
충진된 칼럼을 60℃로 항온 유지시켰다. 순수한 EGCG 152.5g을 함유하는 상기 녹차 추출물(상기 표 1) 0.4kg을 물/이소프로판올(부피비 9:1)의 혼합물 1.8kg에 용해시키고 칼럼의 상부에 도입했다. 0.5바의 압력 및 60℃의 온도하에서 50kg/시간의 일정한 유속으로 물/이소프로판올(부피비 9:1)의 혼합물을 펌프하여 칼럼으로부터 EGCG가 용출되었다. 144kg의 초기 용출(예비분획)후, 주요 폴리페놀 성분으로서 EGCG 112g을 함유하는 주요 용출액 174kg을 회수했다. 주요 용출액중 EGCG의 농도는 0.064%였다. 차 추출물중 152.5g EGCG로부터 출발하여 분리된 EGCG의 수율은 73.5%였다.
수지를 재생시키기 위해, 잔류하는 카테친을 물/이소프로판올(부피비 4:6)의 혼합물 78.3kg으로 용출시켜 탈착했다. 다음 분리하기 전에, 유속 120kg/시간에서 역세척 형태로 물/이소프로판올(부피비 9:1)의 혼합물 86kg으로 칼럼을 조건화하였다.
하기 표 2는 분리 효과를 EGCG의 상대 백분율로 나타낸 것이다. 주요 용출액중 차 성분의 농도는 UV 흡광기를 사용한 HPLC에 의해 결정하여 중량% 또는 ppm으로 나타내었다:
주요 용출액중 차 성분의 농도
화합물 실시예 1의 주요 분획 HPLC/ppm 상대 백분율 /%
갈산 0 0.0
카테친 21 3.1
카페인 1 0.2
EGCG 644 92.1
에피카테친 29 4.2
GCG 3 0.4
ECG 1 0.2
전체 699 100.0

실시예 2
하기 표 3에 나타낸 바와 같은 조성을 가지는 귀조우 하이귄 바이올로지칼 프로덕츠 캄파니의 다른 로트의 "녹차 추출물, 폴리페놀 95% 이상"을 사용하여 실시예 1을 반복했다:
출발 물질중 차 성분의 농도
화합물 실시예 2의 차 추출물 HPLC/중량% 실시예 2의 차 추출물 상대 백분율/%
갈산 <0.1 0.05
카테친 1.4 1.94
카페인 13.8 18.89
EGCG 35.1 47.95
에피카테친 3.3 4.47
GCG 8.2 11.20
ECG 11.4 15.49
전체 73.2 100.00

실시예 1의 세척된 칼럼은 60℃로 항온 유지하고 분리를 수행하기 위해 사용했다. 순수한 EGCG 140.5g을 함유하는 상기 녹차 추출물(상기 표 3) 0.4kg을 물/이소프로판올(부피비 9:1)의 혼합물 1.8kg에 용해시키고 칼럼의 상부에 적용시켰다. 칼럼을 실시예 1과 같이 용출시켰다. 200kg의 초기 용출(예비분획)후, 주요 폴리페놀 성분으로서 EGCG 72.8g을 함유하는 주요 용출액 117kg을 회수했다. 주요 용출액중 EGCG의 농도는 0.062%였다. 차 추출물중 EGCG 140.5g으로부터 출발하여 분리된 EGCG의 수율은 51.8%였다.
수지를 재생시키기 위해, 잔류하는 카테친을 물/이소프로판올(부피비 4:6)의 혼합물 100kg으로 용출시켜 탈착했다. 다음 분리하기 전에, 유속 120kg/시간에서 역세척 형태로 물/이소프로판올(부피비 9:1)의 혼합물 100kg으로 칼럼을 조건화하였다.
하기 표 4는 분리 효과를 EGCG의 상대 백분율로 나타낸 것이다. 주요 용출액중 차 성분의 농도는 UV 흡광기를 사용한 HPLC에 의해 결정하여 ppm으로 나타내었다. 실시예 1에 비해, 더 높은 백분율로 EGCG를 수득했다:
주요 용출액중 차 성분의 농도
화합물 실시예 2의 주요 분획 HPLC/ppm 상대 백분율 /%
갈산 <0.1 0.01
카테친 10 1.49
카페인 1 0.17
EGCG 622 96.53
에피카테친 2 0.27
GCG 6 0.95
ECG 4 0.57
합계 645 100.00

실시예 3
용출액의 농도
실시예 2에 기술된 바와 같이, 반복된 수행에 의해 제조된 흡착/탈착 칼럼의 용출액 9008kg에, EGCG양으로 계산된 2% 시트르산을 첨가하여 안정화하였다. 40℃의 온도 및 55밀리바의 압력에서 1.1m2의 열교환 표면적을 가진 스테인레스 강으로 제조된 강하 경막 증발기(falling film evaporator)를 사용하여 용출액을 농축했다. 증발 장치에 적용시킨 공급 용액중 카테친 및 카페인의 양을 하기 표 5에 나타내었다:
증발에 적용시킨 정제된 EGCG 용액중 차 성분의 농도
화합물 공급물 강하 경막 증발기 HPLC/ppm 상대 백분율/%
갈산 0.1 0.01
카테친 10 1.30
카페인 1 0.14
EGCG 712 96.20
에피카테친 7 0.96
GCG 7 0.97
ECG 3 0.41
전체 740 100.00

증발기로 도입되는 공급물 흐름을 300kg/시간의 재순환 유속에서 120 내지 130kg/시간의 범위의 유속으로 조절했다. 따라서, 0.52kg/시간의 하부 생성물 제거 속도에서 증류물 유속은 123.5kg/시간이었다. 농축 공정을 하는 동안, 제1 분획을 샘플로 취해서 분석하고, 이어서 제2 분획을 또한 분석했다. EGCG 농축물중 이 두 분획은 전체 중량 63.5kg이었다.
하기 표 6은 하부 생성물의 차 성분의 농도를 나타낸 것이다. EGCG의 회수율은 95.9%였다. 분석 결과는 용액을 농축하는 동안 분리된 EGCG가 고순도로 유지됨을 나타낸다.
분무 건조 또는 결정화에 의해 농축된 용액으로부터 EGCG를 고체 형태로 분리할 수 있다.
강하 경막 증발기로 농축된 EGCG 농축물중 차 성분의 농도
화합물 강하 경막 증발기의 하부 생성물
제1 분획의 조성물 제2 분획의 조성물
HPLC/중량% 상대 백분율 HPLC/중량% 상대 백분율
갈산 0.00 0.00 0.00 0.00
카테친 0.17 1.55 0.14 1.59
카페인 0.01 0.12 0.02 0.28
EGCG 10.70 95.36 8.07 94.93
에피카테친 0.16 1.39 0.11 1.24
GCG 0.13 1.14 0.13 1.52
ECG 0.05 0.44 0.04 0.44
합계 11.23 100.00 8.50 100.00
용액의 전체 중량 39.0kg 24.5kg

실시예 4
120마이크론의 평균 입자경을 가지는 암베르크롬 CG-71c 450ml을 내경 2.2cm 및 길이 103cm의 스테인레스 강으로 만든 실험용 크로마토그래피 칼럼내로 충진했다. 칼럼에 가열 재킷을 장치했다. 수지를 세척하고 물/에탄올(부피비 9:1)의 혼합물로 평형화했다.
농축된 카테친 분말(귀조우 하이귄 바이올로지칼 프로덕츠 캄파니로부터 구입한 "녹차 추출물, 폴리페놀 95% 이상") 20g(출발 물질)을 물/에탄올(부피비 9:1)의 혼합물 20ml에 용해시켰다. 이어서, 이 용액 14g(EGCG 2.99g에 해당)을 칼럼 상부에 도입했다. 2 내지 3바의 압력 및 60℃의 온도하에서 16ml/분의 일정한 유속으로 물/에탄올(부피비 9:1)의 혼합물로 크로마토그래피 펌프하여 EGCG가 용출되었다. 용출액은 기체를 제거하고 사용하기 전에 질소 대기하에 유지시켰다. 2.48ℓ의 초기 용출(예비분획)후, 유속을 25.5ml/분으로 바꾸고, 0.627g/ℓ의 농도로 EGCG을 함유하는 주요 용출액 5.40ℓ를 회수했다. 다른 카테친 및 카페인에 대해, HPLC로 결정해서 상대 백분율로 나타낸 주요 용출액중 EGCG의 순도는 97.13%였다. 실험하는 동안, 시스템의 압력은 도입되는 유속에 따라 2 내지 3바로 변화되었다. 하기 표 7은 용출액과 출발 물질중 차 성분의 농도를 비교하여, 분리 효과를 EGCG의 상대 백분율로 나타낸 것이다. 출발 물질과 주요 분획중 차 성분의 농도는 UV 흡광기를 사용한 HPLC로 결정하여 중량% 또는 ppm으로 나타내었다:
암베르크롬 CG-71c, 60℃, 용매 시스템: 물/에탄올상의 분리
화합물 실시예 4의 차 농축물(출발 물질) 실시예 4의 주요 분획
HPLC/중량% 상대 백분율/% HPLC/ppm 상대 백분율/%
갈산 0.08 0.10 0 0.00
카테친 0.50 0.61 1 0.22
카페인 9.29 11.31 5 1.29
EGCG 42.23 51.41 407 97.13
에피카테친 4.24 5.17 3 0.78
GCG 8.09 9.85 1 0.20
ECG 17.70 21.55 2 0.38
전체 82.15 100.00 419 100.00

실시예 5
0.3 내지 1.2mm의 입자경을 가지는 암베라이트 XAD-7 450ml를 내경 2.4cm 및 길이 100cm를 가지는 유리로 만든 실험용 크로마토그래피 칼럼내로 충진했다. 칼럼에 가열 재킷 및 바닥에 유리 소결 프릿(sinter frit) P3을 장치했다. 수지를 탈이온수로 철저히 세척하고 사용하기 전에 물/에탄올(부피비 9:1)의 혼합물로 평형화했다.
농축된 카테친 분말(귀조우 하이귄 바이올로지칼 프로덕츠 캄파니로부터 구입한 "녹차 추출물, 폴리페놀 95% 이상") 20g(출발 물질)을 물/에탄올(부피비 9:1)의 혼합물 20ml에 용해시켰다. 이어서, 이 용액 14g(EGCG 2.91g에 해당)을 칼럼 상부에 도입했다. 0.5 내지 1바의 압력 및 60℃의 온도하에서 16.9ml/분의 일정한 유속의 물/에탄올(부피비 9:1)의 혼합물로 EGCG가 용출되었다. 용출액은 기체를 제거하고 사용하기 전에 질소 대기하에 유지시켰다. 2.48ℓ의 초기 용출(예비분획)후, 유속을 23.6ml/분으로 바꾸고, 0.470g/ℓ의 농도로 EGCG을 함유하는 주요 용출액 4.95ℓ를 회수했다. 다른 카테친 및 카페인에 대해, HPLC로 결정한 주요 분획중 EGCG의 순도는 86.22%였다(하기 표 8 참조). EGCG를 기준으로한 수율은 79.8%였다. 실험하는 동안, 시스템의 압력은 도입되는 유속에 따라 0.5 내지 1바로 변화되었다.
수지를 재생시키기 위해, 잔류하는 카테친을 22.5ml/분의 흐름에서 물/에탄올(부피비 4:6)의 혼합물 1.35ℓ로 용출시켜 탈착했다. 또한, 이 분획은 추가로 정제 또는 탈착된 카테친을 분리하기 위해 사용될 수 있다. 하기 표 8은 용출액과 출발 물질중 차 성분의 농도를 비교하여, 분리 효과를 EGCG의 상대 백분율로 나타낸 것이다. 출발 물질과 주요 분획중 차 성분의 농도는 UV 흡광기를 사용한 HPLC로 결정하여 중량% 또는 ppm으로 나타내었다:
암베라이트 XAD-7, 60℃, 용매 시스템: 물/에탄올상의 분리
화합물 실시예 5의 차 농축물(출발 물질) 실시예 5의 주요 분획
HPLC/중량% 상대 백분율/% HPLC/ppm 상대 백분율/%
갈산 0.09 0.11 0 0.00
카테친 0.50 0.62 2 0.32
카페인 9.17 11.47 7 1.22
EGCG 41.16 51.46 470 86.22
에피카테친 4.16 5.20 5 0.98
GCG 7.75 9.69 22 3.97
ECG 17.16 21.46 40 7.28
합계 79.99 100.00 545 100.00

실시예 6
수지를 통해 물/에탄올(부피비 9:1)의 혼합물로 펌프하여 실시예 5에 기술된 실험용 칼럼에서 실시예 5의 재생된 수지를 평형화했다.
농축된 카테친 분말(귀조우 하이귄 바이올로지칼 프로덕츠 캄파니로부터 구입한 "녹차 추출물, 폴리페놀 95% 이상") 20g(출발 물질)을 물/에탄올(부피비 9:1)의 혼합물 20ml에 용해시켰다. 이어서, 이 용액 14g(EGCG 3.04g에 해당)을 칼럼 상부에 도입했다. 1 내지 2바의 압력 및 40℃의 칼럼 온도하에서 22.5ml/분의 일정한 유속의 물/에탄올(부피비 9:1)의 혼합물로 EGCG가 용출되었다. 용출액은 기체를 제거하고 사용하기 전에 질소 대기하에 유지시켰다. 3.60ℓ의 초기 용출(예비분획)후, 유속을 26.3ml/분으로 바꾸고, 주요 용출액 4.73ℓ를 회수했다. 주요 용출액중 EGCG의 농도는 0.278g/ℓ였다. 다른 주요 카테친 및 카페인에 대해, HPLC로 결정한 주요 용출액중 EGCG의 순도는 93.2%였다. EGCG를 기준으로한 수율은 42.8%였다. 실험하는 동안, 시스템의 압력은 도입되는 유속에 따라 1 내지 2바로 변화되었다.
수지를 재생시키기 위해, 잔류하는 카테친을 26.3ml/분의 흐름에서 물/에탄올(부피비 4:6)의 혼합물 1.98ℓ로 용출시켜 탈착했다. 또한, 이 분획은 추가로 정제 또는 탈착된 카테친을 분리하기 위해 사용될 수 있다. 하기 표 9는 용출액과 출발 물질중 차 성분의 농도를 비교하여, 분리 효과를 EGCG의 상대 백분율로 나타낸 것이다. 출발 물질과 주요 분획중 차 성분의 농도는 UV 흡광기를 사용한 HPLC로 결정하여 중량% 또는 ppm으로 나타내었다:
암베라이트 XAD-7, 40℃, 용매 시스템: 물/에탄올상의 분리
화합물 실시예 6의 차 농축물(출발 물질) 실시예 6의 주요 분획
HPLC/중량% 상대 백분율/% HPLC/ppm 상대 백분율/%
갈산 0.08 0.10 0 0.00
카테친 0.51 0.61 3 1.00
카페인 9.48 11.33 4 1.43
EGCG 43.01 51.40 276 93.24
에피카테친 4.34 5.18 9 3.15
GCG 8.23 9.83 2 0.51
ECG 18.03 21.54 2 0.66
전체 83.68 100.00 296 100.00

실시예 7
물/이소프로판올(부피비 9:1)의 혼합물로 실시예 6의 재생된 수지를 평형화했다.
농축된 카테친 분말(귀조우 하이귄 바이올로지칼 프로덕츠 캄파니로부터 구입한 "녹차 추출물, 폴리페놀 95% 이상") 20g(출발 물질)을 물/이소프로판올(부피비 9:1)의 혼합물 20ml에 용해시켰다. 이어서, 이 용액 14g(EGCG 3.21g에 해당)을 칼럼 상부에 도입하고, 60℃의 칼럼 온도하에서 18ml/분의 일정한 유속의 물/이소프로판올(부피비 9:1)의 혼합물로 용출되었다. 용출액은 기체를 제거하고 사용하기 전에 질소 대기하에 유지시켰다. 1.35ℓ의 초기 용출(예비분획)후, 유속을 16.5ml/분으로 바꾸고, 주요 용출액 2.03ℓ를 회수했다. 주요 용출액중 EGCG의 농도는 0.998g/ℓ였다. 다른 주요 카테친 및 카페인에 대해, HPLC로 결정한 주요 분획중 EGCG의 순도는 85.7%였다. EGCG를 기준으로한 수율은 62.8%였다. 실험하는 동안, 시스템의 압력은 도입되는 유속에 따라 1 내지 2바로 변화되었다.
수지를 재생시키기 위해, 잔류하는 카테친을 16.5ml/분의 흐름 및 40℃의 온도에서 물/이소프로판올(부피비 4:6)의 혼합물 2.03ℓ로 용출시켜 탈착했다. 또한, 이 분획은 추가로 정제 또는 탈착된 카테친을 분리하기 위해 사용될 수 있다. 하기 표 10은 용출액과 출발 물질중 차 성분의 농도를 비교하여, 분리 효과를 EGCG의 상대 백분율로 나타낸 것이다. 출발 물질과 주요 분획중 차 성분의 농도는 UV 흡광기를 사용한 HPLC로 결정하여 중량% 또는 ppm으로 나타내었다:
암베라이트 XAD-7, 60℃, 용매 시스템: 물/이소프로판올상의 분리
화합물 실시예 7의 차 농축물(출발 물질) 실시예 7의 주요 분획
HPLC/중량% 상대 백분율/% HPLC/ppm 상대 백분율/%
갈산 0.05 0.06 0 0.01
카테친 0.38 0.44 8 0.69
카페인 9.48 10.82 28 2.39
EGCG 45.42 51.83 998 85.68
에피카테친 4.38 5.00 16 1.38
GCG 8.80 10.04 35 3.02
ECG 19.12 21.81 80 6.84
전체 87.63 100.00 1165 100.00

실시예 8
물/이소프로판올(부피비 9:1)의 혼합물로 실시예 7의 재생된 수지를 평형화했다.
농축된 카테친 분말(귀조우 하이귄 바이올로지칼 프로덕츠 캄파니로부터 구입한 "녹차 추출물, 폴리페놀 95% 이상") 20g(출발 물질)을 물/이소프로판올(부피비 9:1)의 혼합물 20ml에 용해시켰다. 이어서, 이 용액 14g(EGCG 3.10g에 해당)을 칼럼 상부에 도입했다. 40℃의 칼럼 온도하에서 16.9ml/분의 일정한 유속의 물/이소프로판올(부피비 9:1)의 혼합물로 용출되었다. 용출액은 기체를 제거하고 사용하기 전에 질소 대기하에 유지시켰다. 2.48ℓ의 초기 용출(예비분획)후, 유속을 23.66ml/분으로 바꾸고, 4.95ℓ의 주요 용출액을 회수했다. 주요 용출액중 EGCG의 농도는 0.370g/ℓ였다. 다른 주요 카테친 및 카페인에 대해, HPLC로 결정한 주요 분획중 EGCG의 순도는 86.6%였다. EGCG를 기준으로한 수율은 59.2%였다. 실험하는 동안, 시스템의 압력은 도입되는 유속에 따라 1 내지 2바로 변화되었다.
수지를 재생시키기 위해, 잔류하는 카테친을 16.5ml/분의 흐름 및 40℃의 온도에서 물/이소프로판올(부피비 4:6)의 혼합물 2.03ℓ로 용출시켜 탈착했다. 또한, 이 분획은 추가로 정제 또는 탈착된 카테친을 분리하기 위해 사용될 수 있다. 하기 표 11은 용출액과 출발 물질중 차 성분의 농도를 비교하여, 분리 효과를 EGCG의 상대 백분율로 나타낸 것이다. 출발 물질과 주요 분획중 차 성분의 농도는 UV 흡광기를 사용한 HPLC로 결정하여 중량% 또는 ppm으로 나타내었다:
암베라이트 XAD-7, 40℃, 용매 시스템: 물/이소프로판올상의 분리
화합물 실시예 8의 차 농축물(출발 물질) 실시예 8의 주요 분획
HPLC/중량% 상대 백분율/% HPLC/ppm 상대 백분율/%
갈산 0.20 0.23 0 0.00
카테친 0.49 0.58 4 0.83
카페인 9.21 10.85 6 1.50
EGCG 43.74 51.52 370 86.62
에피카테친 4.23 4.99 14 3.21
GCG 8.50 10.02 11 2.49
ECG 18.52 21.82 23 5.35
전체 84.91 100.00 428 100.00

실시예 9
유기 용매를 사용한 폴리아미드 11상의 EGCG의 분리
하기 표 12에 나타낸 바와 같은 양의 카테친 및 카페인을 함유하는 시판 녹차 추출물(귀조우 하이귄 바이올로지칼 프로덕츠 캄파니로부터 구입, 로트 번호 960328, "녹차 추출물, 폴리페놀 95% 이상")을 출발 물질로 사용하였다. 차 성분의 농도는 UV 흡광기를 사용한 HPLC로 결정하였다:
출발 물질중 차 성분의 농도
화합물 차 추출물 HPLC/중량% 차 추출물 상대 백분율/%
갈산 0.01 0.01
EGC 2.02 2.99
카테친 0.78 1.15
카페인 8.48 12.54
EGCG 36.87 54.52
에피카테친 4.48 6.62
GCG 4.77 7.05
ECG 10.22 15.11
전체 67.63 100.00

5 내지 40마이크론의 입자 크기를 가지는 시판 폴리아미드 11(독일 다름스타트의 메르크사제, 카달로그 번호 1.07435.0100) 250g을 에틸 아세테이트 300ml에 현탁시키고, 내경 5cm 및 길이 36cm인 칼럼내로 옮겼다. 칼럼에 가열 재킷을 장치하고 40℃로 항온 유지했다. 상기 표 12로 특징되는, 순수한 EGCG 1.11g을 함유하는 출발 녹차 추출물 3g을 에틸 아세테이트 153ml에 용해시키고, 칼럼 상부에 도입했다. 0.3바의 압력하의 에틸 아세테이트/에탄올 구배 용출액(500ml 에틸 아세테이트, 1000ml 에틸 아세테이트/에탄올(8.5:1.5 부피/부피), 1000ml 에틸 아세테이트/에탄올(7:3 부피/부피), 2000ml 에틸 아세테이트/에탄올(1:1 부피/부피))은 주요 분획 550ml를 제공하였고, 용매 증발 후 주요 카테친 성분으로서 EGCG 0.87g을 함유하는 고체 1.12g을 수득했다. 주요 용출액중 EGCG 농도는 0.186%였다. 출발 차 추출물중 존재하는 EGCG 1.106g으로부터 계산한 분리된 EGCG의 수율은 76%였다.
수지를 재생시키기 위해, 에탄올 500ml로 용출시켜 잔류하는 카테친을 탈착시켰다. 다음 분리 전에, 칼럼을 에틸 아세테이트 500ml로 조건화했다.
하기 표 13은 분리 효과를 나타낸 것이다. 주요 용출액중 차 성분의 농도는 UV 흡광기를 사용한 HPLC에 의해 결정되었다:
주요 용출액의 잔류물중 차성분의 농도(용매 증발후)
화합물 주요 분획의 잔류물 HPLC/중량% 주요 분획의 잔류물 상대 백분율/%
갈산 0 0
EGC 0 0
카테친 0 0
카페인 0 0
EGCG 77.4 96.50
에피카테친 0.05 0.06
GCG 0.74 0.92
ECG 2.07 2.58
전체 80.21 100.00

실시예 10
수성 용매 혼합물를 사용한 폴리아미드 11상의 EGCG의 분리
하기 표 14에 나타낸 바와 같은 양의 카테친 및 카페인을 함유하는 수성 녹차 추출물 용액을 출발 물질로 사용하였다. 차 성분의 농도는 UV 흡광기를 사용한 HPLC로 결정하여 중량%로 나타내었다:
출발 차 추출물 용액의 잔류물중 차 성분의 농도(용매 증발후)
화합물 차 추출물 HPLC/중량% 차 추출물 상대 백분율/%
갈산 1.36 4.77
EGC 3.61 12.65
카테친 1.45 5.08
카페인 6.89 24.14
EGCG 10.14 35.53
에피카테친 1.59 5.57
GCG 0.99 3.47
ECG 2.51 8.79
전체 28.54 100.00

5 내지 40마이크론의 입자 크기를 가지는 폴리아미드 11(독일 다름스타트의 메르크사제, 카달로그 번호 1.07435.0100) 25g을 물 100ml에 현탁시키고, pH를 6.5로 조정하였다. 이 현탁액을 내경 3cm 및 길이 8cm인 칼럼내로 옮겼다. 순수한 EGCG 0.078g을 함유하는 상기 녹차 추출물 10ml(상기 표 14)을 칼럼 상부에 도입했다. 5ml/분의 유속으로 물/에탄올 구배 용출액(500ml 물, 600ml 물/에탄올(7:3 부피/부피), 350ml 물/에탄올(6:4 부피/부피), 500ml 물/에탄올(1:1 부피/부피))은 EGCG 0.046g을 함유하는 주요 분획 110ml(0.072g)를 제공하였다. 주요 용출액중 EGCG 농도는 0.06%였다. EGCG 0.078g으로부터 출발하여 분리된 EGCG의 수율은 59%였다.
수지를 재생시키기 위해, 에탄올 500ml로 용출시켜 잔류하는 카테친을 탈착시켰다. 다음 분리 전에, 칼럼을 물 500ml로 조건화했다.
하기 표 15는 분리 효과를 나타낸 것이다. 주요 용출액중 차 성분의 농도는 UV 흡광기를 사용한 HPLC에 의해 결정되었다:
주요 용출액의 잔류물중 차 성분의 농도(용매 증발후)
화합물 주요 분획의 잔류물 HPLC/중량% 주요 분획의 잔류물 상대 백분율/%
갈산 1.10 1.59
EGC 0.00 0.00
카테친 1.29 1.86
카페인 0.00 0.00
EGCG 63.53 91.70
에피카테친 0.00 0.00
GCG 0.16 0.23
ECG 3.20 4.62
전체 69.28 100.00

실시예 11
암베라이트 XAD-7, 용매 시스템: 물/에탄올상의 EGCG의 분리
0.3 내지 1.2mm의 평균 입자경을 가지는 암베라이트 XAD-7 수지 416ml을 내경 2.5cm 및 길이 100cm의 유리로 만든 실험용 크로마토그래피 칼럼(스위스 발리셀렌 소재의 스타그로마 아게(Stagroma AG)로부터 구입한 ECO 25/999 M3V-K)내로 충진했다. 칼럼에 가열 재킷을 장치하고 60℃로 항온 유지했다. 수지를 세척하고 물/에탄올(부피비 9:1)의 혼합물로 평형화했다.
하기 표 16에 나타낸 바와 같은 양의 카테친 및 카페인을 함유하는 시판 녹차 추출물(중국 제양 항조우의 제양 종크 플랜트 테크니칼 캄파니 리미티드사로부터 구입한 "차 폴리페놀 TP-80")을 출발 물질로 사용했다.
차 성분의 농도는 UV 흡광기를 사용한 HPLC에 의해 결정하여 중량%로 나타내었다:
출발 물질중 차 성분의 농도
화합물 실시예 13의 차 추출물 HPLC/중량% 실시예 13의 차 추출물 상대 백분율/%
갈산 0.1 0.1
EGC 8.6 10.1
카테친 1.9 2.2
카페인 6.2 7.3
EGCG 40.3 47.4
에피카테친 10.4 12.2
GCG 0.9 1.1
ECG 16.6 19.5
전체 85.0 100.00

상기 표 16으로 특징되는, 순수한 EGCG 4.5g을 함유하는 출발 녹차 추출물 11.2g을 탈이온수 112.5ml에 용해시키고, 칼럼의 상부에 도입했다. 60℃의 칼럼 온도에서 0.6ℓ/시간의 일정한 유속으로 물/에탄올(부피비 9:1)의 혼합물로 카테친을 용출시켰다. 용출액은 가스를 제거하고 사용하기 전에 질소 대기하에서 유지시켰다.
1.2ℓ의 초기 용출후, 용출액의 조성을 물/에탄올 부피비 8:2로 바꾸었다. 총량 1.5ℓ의 이 용출액은 EGCG 2.115g을 함유하는 주요 분획 900ml를 제공했다. 주요 분획중 EGCG의 농도는 0.245%였다. 차 추출물중 EGCG 4.5g으로부터 출발하여 분리된 EGCG의 수율은 47%였다. 실험하는 동안, 시스템의 압력은 0.8 내지 1.5바로 변화했다.
수지를 재생시키기 위해, 물/에탄올(부피비 4:6)의 혼합물로 계속해서 용출시키고, 이어서 에탄올로 잔류하는 카테친을 탈착했다. 다음 분리하기 전에, 칼럼을 물/에탄올(부피비 9:1)로 조건화하였다.
하기 표 17은 분리 효과를 나타낸 것이다. 주요 분획의 잔류물중 차 성분의 농도(용매 증발후)는 UV 흡광기를 사용한 HPLC에 의해 결정하여 중량%로 나타내었다:
주요 분획의 잔류물중 차 성분의 농도(용매 증발후)
화합물 실시예 13의 주요 분획의 잔류물 HPLC/중량% 실시예 13의 주요 분획의 잔류물 상대 백분율/%
갈산 0 0
EGC 0 0
카테친 0.6 0.7
카페인 0.3 0.3
EGCG 81.4 94.5
에피카테친 1.7 2.0
GCG 0.2 0.2
ECG 1.9 2.2
전체 86.1 100.00

본 발명에 의해, 녹차 추출물을 대공극성 극성 수지 및 적당한 극성 용출 용매를 사용하여 분리함으로써 선택성이 개선된 EGCG의 제조 방법이 제공된다.

Claims (61)

  1. a) 녹차 추출물을 제공하는 단계,
    b) 10 내지 80℃의 온도에서, 폴리비닐피롤리돈, 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트, 폴리아미드 및 폴리에스테르로 구성된 군으로부터 선택된, 흡착 또는 크로마토그래피에 상용되는 대공극성(macroporous) 극성 수지상에서, 상기 녹차 추출물을 크로마토그래피시키는 단계, 및
    c) 10 내지 80℃의 온도 및 0.1 내지 50바의 압력하에서 상기 대공극성 극성 수지로부터 극성 용출 용매를 사용하여 에피갈로카테친 갈레이트(EGCG)를 용출시키는 단계를 포함하는,
    EGCG의 제조 방법.
  2. 삭제
  3. 제 1 항에 있어서,
    폴리아크릴레이트 수지가 암베라이트(AMBERLITE) XAD-7인 방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    폴리메타크릴레이트 수지가 암베르크롬(AMBERCHROM) CG-71인 방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    폴리아미드 수지가 폴리아미드 11인 방법.
  6. 제 1 항 및 제 3 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 b) 및 c)가 20 내지 60℃의 온도에서 수행되는 방법.
  7. 제 1 항 및 제 3 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 c)가 0.1 내지 20바의 압력하에서 수행되는 방법.
  8. 제 1 항 및 제 3 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    극성 용출 용매가 물과 유기 용매의 혼합물인 방법.
  9. 제 8 항에 있어서,
    용출 용매가 70 내지 95부피%의 물과 5 내지 35부피%의 유기 용매의 혼합물인 방법.
  10. 제 8 항에 있어서,
    유기 용매가 에탄올, 이소프로판올, 에틸 아세테이트 또는 아세톤인 방법.
  11. 제 1 항 및 제 3 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    용출 용매의 유속이 0.5 내지 20충전부피/시간인 방법.
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 제 1 항에 있어서,
    단계 c)의 용출액을 농축시키는 단계 d)를 추가로 포함하는 방법.
  17. 제 1 항에 있어서,
    잔류하는 카테친을 탈착시켜 대공극성 극성 수지를 재생시키는 단계 e)를 추가로 포함하는 방법.
  18. 제 17 항에 있어서,
    단계 e)의 탈착된 카테친을 농축시키는 단계 f)를 추가로 포함하는 방법.
  19. 제 16 항에 있어서,
    단계 d)가 시트르산, 아스코르브산 또는 이소아스코르브산을 첨가하여 수행되는 방법.
  20. 제 19 항에 있어서,
    EGCG에 대하여 0.1 내지 2.5%의 산을 첨가하는 방법.
  21. 제 17 항에 있어서,
    단계 e)가 유기 용매, 또는 10 내지 60부피%의 물과 40 내지 90부피%의 유기 용매의 혼합물을 사용하여 수행되는 방법.
  22. 제 1 항 및 제 3 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 c)가 0.1 내지 10바의 압력하에서 수행되는 방법.
  23. 제 8 항에 있어서,
    용출 용매가 90부피%의 물과 10부피%의 유기 용매의 혼합물인 방법.
  24. 제 1 항 및 제 3 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    용출 용매의 유속이 0.5 내지 10충전부피/시간인 방법.
  25. 제 1 항 및 제 3 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    용출 용매의 유속이 0.8 내지 5충전부피/시간인 방법.
  26. 제 17 항에 있어서,
    단계 e)가 유기 용매, 또는 40부피%의 물과 60부피%의 유기 용매의 혼합물을 사용하여 수행되는 방법.
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