KR100599346B1

KR100599346B1 - 중단된 ａｔｆ2 유전자를 가진 효모 균주 및 그의 용도

Info

Publication number: KR100599346B1
Application number: KR1019997009076A
Authority: KR
Inventors: 틸만 아슈테터; 길르 꼬에; 에릭 데그리쓰
Original assignee: 아벤티스 파마 소시에떼아노님
Priority date: 1998-02-05
Filing date: 1999-02-04
Publication date: 2006-07-12
Anticipated expiration: 2019-02-04
Also published as: BR9904771A; US6503749B2; ME00670B; HUP0002858A1; JP2001524838A; EA004629B1; HUP0002858A3; AU748129B2; SK286279B6; CA2285686C; HRP990303B1; PL336301A1; ID22741A; ES2221353T3; US20010012630A1; EP0977868A1; ZA99676B; CZ351299A3; AR015225A1; DE69918752T2

Abstract

본 발명은 아세틸-CoA 프레그네놀론 아세틸트랜스퍼라제 (APAT) 활성을 코딩하는 유전자를 변경시킴으로써 상기 APAT 활성을 제거하여, 3β-히드록시스테로이드가 안정화시킨 변형 효모 주에 관한 것이다.

아세틸-CoA 프레그네놀론 아세틸트랜스퍼라제 (APAT) 활성, 유전자 변경, 변형 효모 주

Description

중단된 ＡＴＦ2 유전자를 가진 효모 균주 및 그의 용도{Yeast Strains with Interrupted ATF2 Gene and Uses}

포유동물에서의 모든 스테로이드계 호르몬의 생합성에 있어서 3β-히드록시-델타⁵전구체로부터 3-옥소-델타⁴-스테로이드의 형성은, 3β-HSD 로 명명되는 효소계 3β-히드록시-델타⁵-스테로이드 탈수소효소 (EC 1.1.1.145) 및 델타⁵-델타⁴-스테로이드 이소머라제 (EC 5.3.3.1) 에 의해 촉매된다. 예를들면, 3β-HSD 는 프레그네놀론의 프로게스테론으로의 변환, 17α-히드록시프레그네놀론의 17α-히드록시프로게스테론으로의 변환, 데히드로에피안드로스테론의 델타⁴-안드로스텐디온으로의 변환, 또는 5-안드로스텐-3β-17β-디올의 테스토스테론으로의 변환을 촉매한다 (Simard 등, 1996).

즉, 3β-HSD 는 포유동물의 부신피질에서 콜레스테롤로부터 출발하여 하이드로코르티존을 생합성하기 위한 경로에서의 키 효소중의 하나이다 (도 1).

하이드로코르티존 또는 이 생합성의 중간체를 생성하기 위하여 이 생합성 경로의 하나 이상의 포유류 효소를 이종발현할 수 있는 재조합 미생물, 특히 변형 효모를 사용하는 것이 예를들어 유럽특허출원 EP 340878 호, 미국 특허 제5,137,822 호, Dumas 등의 문헌 (1994) 및 Cauet 등의 문헌 (1994) 에 기재되어 있다.

기능성 3β-HSD 가 효모에서 발현될 때, 형질전환된 효모 세포는 3β-히드록시스테로이드를 상응하는 3-옥소스테로이드, 예를들어 프레그네놀론을 프로게스테론으로 완전히 전환시키지 않지만, 비형질전환된 효모 세포의 경우에 관찰되는 화합물을 축적시킨다. 출발 스테로이드의 3β-아세테이트 에스테르로서 축적된 화합물의 확인 및 이 에스테르화반응을 초래하는 아실트랜스퍼라제 활성을 가진 효소 (이하, "아세틸-조효소 A 프레그네놀론 아세틸트랜스퍼라제" 를 의미하는 APAT 로서 명명함) 의 특징화는 본 출원에 기재되어있다. 또한, 프레그네놀론을 생성하는 형질전환된 효모 주에 의한 프레그네놀론 아세테이트의 축적은 유럽특허출원 EP727489 호에 기재되어 있다. 이러한 관찰을 근거로 하여, 효모에 의해 생성되는 3β-히드록시스테로이드의 에스테르화는, 축적된 3β-히드록시스테로이드, 예를들어 프레그네놀론의 수율을 감소시키거나 또는 3β-히드록시-델타⁵-스테로이드의 3-옥소-델타⁴-스테로이드로의 생체전환의 수율을 감소시키고, 특히 프로게스테론 또는 17α-히드록시-프로게스테론의 생성에 있어서 이미 언급된 생합성 경로에 의한 하이드로코르티존의 연속 생성을 감소시킬 수 있는 부반응 및 부산물을 초래할 수 있기 때문에, 바람직하지 않은 것으로 생각될 수 있다.

상기 언급된 결과를 근거로 하여, 본 발명은 APAT 활성을 코딩하는 유전자를 변경함으로써 이러한 바람직하지 않은 활성을 소실한 효모 주를 구축하고, 그 결과 이 효모 주의 존재하에서 3β-히드록시스테로이드가 안정화됨을 기술하고 있다. 따라서, 이러한 주는 3β-히드록시스테로이드를 향상된 수율로 다른 산물로 전환시킬수 있는 재조합 주를 구축하기 위한 출발 주로서 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 APAT 활성을 코딩하는 유전자를 변경하고, 콜레스테롤로부터 하이드로코르티존의 생합성 경로의 3β-HSD 또는 치토크롬 P₄₅₀17α를 발현시키거나 또는 3β-HSD 및 치토크롬 P₄₅₀17α를 동시-발현시킴으로써 APAT 활성을 소실한 효모 주를 구축하는 것을 기술하고 있다. 예를들어 3β-HSD 를 발현하는 주는 3β-히드록시-델타⁵-스테로이드의 3-옥소-델타⁴-스테로이드로의 생체전환의 수율을 향상시킬 수 있고, 따라서 효모에서 하이드로코르티존 또는 그의 중간체의 개선된 제조 방법에서 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명의 주제는 APAT 활성을 코딩하는 유전자를 변경함으로써 얻어지는 아세틸-CoA 프레그네놀론 아세틸트랜스퍼라제(APAT) 활성이 제거된 변형 효모 주이고, 그결과 3β-히드록시스테로이드의 안정화가 달성된다.

APAT 활성을 코딩하는 유전자는, 예를들면 유전자의 기능성 인자, 예컨대 APAT 활성을 가진 단백질을 코딩하는 프로모터 또는 서열에 DNA 서열을 삽입, 결실 또는 치환함으로써 변경될 수 있다. 이어서, 효모의 숙주 주에 상기 방식으로 변경된 DNA 서열을 통합하는 것은 예를들면 동종 재조합 기술에 의해 수행될 수 있고, 이로써 본 발명의 변형 주에 상응하는 효모의 염색체 돌연변이주가 생성될 수 있으며, 이 주에서의 APAT 활성의 소실 및 3β-히드록시스테로이드의 안정화는 프레그네놀론의 존재하에 세포 배양하고, 이하 실험 부분에 기술된 조업 조건에 따 라 프레그네놀론 함량을 시간의 함수로서 측정함으로써 증명될 수 있다.

본 발명에서 특히 사용되는 숙주 효모 주로서는 다음과 같은 것을 언급할 수 있다: 에스. 세레비지애 (S. cerevisiae)와 같은 사카로마이세스속 주, 씨.말토사 (C. malotsa)와 같은 칸디다 속 균주, 케이.락티스 (K. lactis)와 같은 클라이베로마이세스속 주, 또는 피. 파스토리스 (P. pastoris)와 같은 피키아속 주.

본 발명의 특별한 주제는 변경된 유전자가 에스. 세레비지애의 ATF2 유전자 또는 그의 상동체인 상기 변형된 효모 주이다.

유전자 ATF2 란, 효모 게놈에서 "사카로마이세스 게놈 데이터베이스" (SGD) 의 ATF2 또는 YGR177c 부위에서 확인되는 에스.세레비지애의 유전자를 의미하며(Cherry 등, http://genome-www.stanford.edu/Saccharomyces/); YGR177c 로 명명되는 그의 개방 해독 프레임 (ORF)은 수탁번호 S64491 (Hebling U., Hofmann B. 및 Delius H. (1996 년 5 월))로 입수할 수 있는 Mips 데이터베이스에서 아미노산 서열로 번역되고, 그의 서열은 도 4 에 나타낸다. 이 유전자는 이하 실험 부분에서 나타낸 바와 같이 APAT 활성을 가진 단백질을 코딩한다.

ATF2 유전자의 상동체인 유전자란, APAT 활성을 갖고, 또한 단백질 YGR177c 의 서열과 약 60% 이상의 서열 동일성을 가진 단백질을 코딩하는 유전자를 의미한다.

본 발명의 더욱 특별한 주제는, 변경된 유전자가 에스.세레비지애의 ATF2 유전자인 상기 언급된 변형 효모 주이며, 이는 이하 atf2 변이주로서 명명된다.

본 발명의 특히 특별한 주제는, ATF2 유전자가 하나 이상의 뉴클레오티드를 가진 DNA 서열의 삽입에 의해 변경된, 상기 언급된 변형 효모 주이다.

모든 APAT 활성을 소실하기 위하여 ATF2 유전자에 삽입된 DNA 서열은, 예를들면 유전자 URA3, 유전자 LEU2, 유전자 TRP1, 유전자 HIS3 또는 유전자 ADE2 와 같이 숙주 주의 영양 요구성을 공급하는 영양요구 선택 유전자, 예를들면 G418, 플레오마이신 또는 히그로마이신 B 와 같은 항생물질 내성 유전자와 같은 우성 선택 유전자 또는 예를들면 βGAL 유전자와 같은 리포터 유전자일 수 있다.

ATF2 유전자에 삽입된 DNA 서열은 프로모터 및 전사 터미네이터, 예를들면 PGK, TDH3, CYC1 또는 TEF1 과 같은 효모 프로모터, 및 예를들면 CYC1, TDH3, TEF1 또는 PGK 과 같은 효모 터미네이터로 이루어진 효모 발현 블록일 수 있다. 발현 블록은 상기 언급된 인자들의 조합, 예를들면 블록 TEF1 _prom /PGK _term 일 수 있다.

본 발명의 더욱 특별한 주제는, ATF2 유전자가 URA3 선택 유전자의 삽입 또는 발현 블록 TEF1 _prom /PGK _term 의 삽입에 의해 변경된 상기와 같은 변형 효모 주이다.

본 발명의 특별한 주제는 ATF2 유전자가 URA3 선택 유전자의 삽입에 의해 변경된 상기와 같은 변형 효모 주이다.

APAT 활성이 없고 URA3 유전자가 삽입된 본 발명의 atf2 변이주 (이하, atf2-Δ::URA3 으로 명명) 는 우라실과의 원영양성에 의해 선택될 수 있다.

본 발명의 특히 특별한 주제는 TGY156 및 TGY158 로 명명되는 에스.세레비지애의 변형 주이며, 이의 상세한 구축은 이하 실험 부분에서 나타낸다.

본 발명의 특별한 주제는 또한 ATF2 유전자가 발현 블록 TEF1 _prom /PGK _term 의 삽입에 의해 변경된 상기와 같은 변형 효모 주이다. ATAP 활성이 없고 발현 블록 TEF1 _prom /PGK _term 가 삽입된 본 발명의 atf2 변이주 (이하, atf2-Δ::TEF1 _prom /PGK _term 로 명명)는, 발현 블록으로 치환된 기능성 URA3 유전자의 부재로 인하여, 5-플루오로-오로틴산 (5-FO) 에 대한 내성에 의해 선별될수 있다.

본 발명의 특별한 주제는 TGY186 으로 명명되는 에스.세레비지애의 변형 주이며, 이것의 상세한 구축은 이하 실험 부분에서 주어진다.

본 발명의 주제는 또한, 아세틸-CoA 프레그네놀론 아세틸트랜스퍼라제 (APAT) 활성을 코딩하는 유전자의 변경에 의해 상기 APAT 활성이 제거되고, 콜레스테롤로부터 출발하여 하이드로코르티존의 생합성 경로에서

- 콜레스테롤 측쇄 절단 효소 (P₄₅₀SCC),

- 3β-히드록시-델타⁵-스테로이드 데히드로게나제/델타⁵-델타⁴-스테로이드 이소머라제 (3β-HSD) 및

- 17α-스테로이드 히드록실라제 (P₄₅₀17α)

중에서 선택되는 하나 이상의 포유류 효소를 발현하는 형질전환된 효모 주이다.

예를들면 본 발명의 형질전환된 효모 주는, 공지의 방법, 예를들어 ADX 및 ADR 뿐만 아니라 P₄₅₀SCC 의 발현 벡터에 의한 형질전환, 3β-HSD 의 발현 벡터에 의 한 형질전환, 또는 P₄₅₀17α의 발현 벡터에 의한 형질 전환에 의해 본 발명의 atf2 변이주를 형질전환시킴으로써 수득될 수 있다. 또한 필요하다면, atf2 변이주는 예를들어 3β-HSD 의 발현 벡터 및 P₄₅₀17α의 발현 벡터에 의해 동시-형질전환될 수도 있거나, 또는 3β-HSD 및 P₄₅₀17α의 동시-발현 벡터에 의해 형질전환될 수도 있으며, 이는 프레그네놀론의 17α-히드록시프로게스테론으로의 생체전환 과정에서 사용될 수 있다.

효모 주내에서 소 또는 인간 유래의 ADX 및 ADR, 3β-HSD 또는 P₄₅₀17α 뿐만 아니라 P₄₅₀SCC 의 발현을 위해 구축된 벡터는 예를들면 Dumas 등의 문헌 (1994), 유럽특허출원 EP340878 호 및 미국특허 제5,137,822호에 기재되어 있다.

본 발명의 특별한 주제는, 변경된 유전자가 에스.세레비지애의 ATF2 유전자 또는 그의 상동체인 상기와 같은 형질전환된 효모 주이다. 본 발명의 더욱 특별한 주제는 변경된 유전자가 에스.세레비지애의 ATF2 유전자 이고 형질전환된 atf2 주에 상응하는 상기와 같은 형질전환된 효모 주이다.

본 발명의 특히 특별한 주제는, 하나 이상의 뉴클레오티드를 가진 DNA 서열의 삽입에 의해 ATF2 유전자가 변경된 상기와 같은 형질전환된 효모 주이며, 특히 ATF2 유전자가 URA3 선택 유전자의 삽입에 의해 변경되고 변형된 atf2-Δ::URA3 주에 상응하는 형질전환된 효모 주이다.

모든 APAT 활성을 소실시키기 위한 유전자의 변경, ATF2 유전자 또는 그의 상동체 및 숙주 주는 상기 나타낸 것과 같은 의미를 갖는다.

본 발명의 특히 특별한 주제는, 3β-HSD를 발현하는 상기와 같은 형질전환된 효모 주 atf2-Δ::URA3 및 특히 TGY158/pTG10862 로 명명된 에스.세레비지애의 형질전환된 주이며, 그의 상세한 구축은 이하 실험 부분에 기재되어 있다.

본 발명의 특히 특별한 주제는, ATF2 유전자가 발현 블록 TEF1 _prom /PGK _term 의 삽입에 의해 변경되고, 형질전환된 주 atf2-Δ::TEF1 _prom /PGK _term 에 상응하는 상기와 같은 형질전환된 효모 주이다.

또한 본 발명의 특히 특별한 주제는, P₄₅₀17α를 발현하는 상기와 같은 형질전환된 주 atf2-Δ::TEF1 _prom /PGK _term , 및 특히 TGY186/pTG10435 로 명명된 에스.세레비지애의 형질전환된 주이다.

본 발명의 특별한 주제는 3β-HSD 및 P₄₅₀17α를 동시-발현하는 상기와 같은 변형 효모 주 atf2-Δ::TEF1 _prom /PGK _term 및 특히 TGY186/pTG10417 로 명명된 에스.세레비지애의 형질전환된 주이다.

또한 본 발명의 주제는, 상기 형질전환된 효모 주를 사용하는 내인성 스테롤, 외인성 스테롤 또는 외인성 스테로이드중에서 선택된 기질의 생체내 산화방법이며, 이 방법에서 상기 주가 내인성 스테롤을 생성할 경우에는 이를 단독 배양하거나 스테롤 또는 외인성 스테로이드와 함께 배양하며 필요에 따라 수득된 산화 생성물을 단리한다.

내인성 스테롤이란, 효모 주내에 축적되고, 효모가 예를들어 P₄₅₀SCC, ADX 및 ADR 의 발현벡터에 의한 형질전환후에 외인성 스테롤의 부재하에서 배양때 얻어지는 측쇄 절단 효소 (P₄₅₀SCC)의 기질인 스테롤을 의미한다. 본 발명의 방법을 적용하기 위해 사용되는 내인성 스테롤은 예를들면 에르고스타-5-엔-3-올, 에르고스타-5,24(28)-디엔-3-올 또는 에르고스타-5,22-디엔-3-올일 수 있다. 유럽특허출원 EP 727489 호는, 효모 주내에서의 이러한 스테롤의 축적, 및 P₄₅₀SCC, ADX 및 ADR 의 발현벡터에 의한 형질전환후에 주의 배양액중에서 그들의 측쇄의 절단에 대해 기술하고 있다. APAT 활성이 여전히 존재하는 이러한 효모 주를 미리 변형시켜 본 발명에 따른 atf2 변이주를 수득한 다음, 이를 P₄₅₀SCC, ADX 및 ADR 의 발현벡터에 의해 형질 전환시켜 본 발명에 따라 형질전환된 atf2 변이주를 수득할 수 있다.

외인성 스테롤이란, P₄₅₀SCC, ADX 및 ADR 의 발현벡터에 의해 형질전환된 효모 주의 배양에 의해 얻어지는 P₄₅₀SCC 절단 효소의 기질인 스테롤, 예를들어 콜레스테롤 또는 시토스테롤을 의미한다. 이러한 주는 예를들면 P₄₅₀SCC, ADX 및 ADR 의 발현벡터에 의해 형질전환된 atf2 변이주일 수 있다.

기질로서 사용되는 내인성 또는 외인성 스테롤의 측쇄의 절단에 의해 수득되는 3β-히드록시스테로이드는, P₄₅₀SCC, ADX 및 ADR를 발현하는 형질전환된 atf2 주의 배양액중에서 완전히 유리된 형태, 즉 상응하는 3β-아세테이트 에스테르가 동반되지 않은 형태로 존재한다.

스테로이드란, 예를들면 프레그네놀론, 17α-히드록시프레그네놀론 또는 데히드로에피안드로스테론과 같은 3β-HSD 의 발현 벡터에 의해 형질전환된 효모 주의 배양에 의해 얻어지는 3β-HSD 효소의 기질인 스테로이드, 또는 예를들면 프로게스테론 또는 프레그네놀론과 같은 P₄₅₀17α 의 발현 벡터에 의해 형질전환된 효모 주의 배양에 의해 얻어지는 P₄₅₀17α 효소의 기질인 스테로이드를 의미한다. 예를들면, 이러한 주는 본 발명에 따른 3β-HSD 의 발현 벡터 또는 P₄₅₀17α의 발현 벡터에 의해 형질전환된 atf2 변이주일 수 있다.

본 발명의 특별한 주제는, 기질이 3β-히드록시스테로이드이고, 3β-HSD를 발현하는 형질전환된 효모 주 atf2-Δ::URA3 이 사용되며, 필요하다면 수득된 3-옥소-델타⁴-스테로이드를 단리시키는 것으로 구성된 상기와 같은 생체내 산화 방법이며, 특히 3β-히드록시스테로이드가 프레그네놀론 또는 17α-히드록시프레그네놀론으로부터 선택되는 방법이다.

기질로서 사용되는 3β-히드록시스테로이드는, 3β-HSD 의 발현 벡터로 형질전환된 본 발명의 atf2-Δ::URA3 주와 배양될 때 안정하다. 즉, 본 발명은, 이하 실험 부분에서 나타내는 바와 같이 모든 3β-히드록시 기질이 3-옥소-델타⁴-스테로이드로 산화될 수 있기 때문에, 효모내에서 3-옥소-델타⁴-스테로이드의 개선된 제조 방법을 제공한다.

또한 본 발명의 특별한 주제는, 기질이 스테로이드이고, P₄₅₀17α을 발현하는 형질전환된 효모 주 atf2-Δ::TEF1 _prom /PGK _term 가 사용되며, 필요에 따라 수득된 17α-히드록실 스테로이드를 단리하는 것으로 구성된 상기와 같은 생체내 산화 방법, 특히 스테로이드 기질이 프레그네놀론 또는 프로게스테론인 방법이다.

기질로서 사용되는 프레그네놀론은 P₄₅₀17α 의 발현 벡터에 의해 형질전환된 주 atf2-Δ::TEF1 _prom /PGK _term 와 배양될 때 안정하다. 즉, 본 발명은 모든 3β-히드록시 기질이 17α-히드록실화될 수 있기 때문에 3β-히드록시스테로이드로부터 출발하여 17α-히드록시스테로이드를 제조하는 개선된 방법을 제공한다.

본 발명의 특별한 주제는 또한 기질이 3β-히드록시스테로이드이고 3β-HSD 및 P₄₅₀-17α를 동시-발현하는 형질전환된 효모 주 atf2-Δ::TEF1 _prom /PGK _term 가 사용되며, 필요하다면 수득된 17α-히드록실-3-옥소-델타⁴-스테로이드를 단리시키는 것으로 구성된 상기 생체내 산화 방법이다. 본 발명의 특히 특별한 주제는 스테로이드 기질이 프레그네놀론인 상기 방법이다.

본 발명의 형질전환된 atf2 효모 변이주 및 본 발명의 방법은, 효모에서의 하이드로코르티존 또는 그의 중간체의 개선된 제조에서 유리하게 사용될 수 있다.

본 발명의 주의 구축 및 본 발명의 방법의 적용의 실시예는 이하 실험 부분에 기재되어 있다.

일반적 재료 및 방법

1. 주 및 배지

본 발명을 수행하기 위해 사용되는 에스.세레비지애 주는, Achstetter 등 (1992) 에 의해 기재된 c13ABYS86 의 동질유전자 유도체 Leu⁺ 인 주 TGY73.4 (MATα, URA3-Δ5, pral-1, prb1-1, prc1-1, cps1-3, his) 및 Thierry 등 (1990) 에 의해 기재된 주 Fy1679 (MATa, URA3-52, trp1-Δ63, leu2-Δ1, his3-Δ200, fen1, GAL) 이다. 주는 F.Sherman (1991) 에 의해 기재된 조건에 따라 28℃에서 2 % 의 글루코스를 함유하는 YPD 완전 배지 (Difco Laboratories)에서 생육된다.

에스.세레비지애의 형질전환을 위하여, 리튬 아세테이트 방법 (Ito 등 (1983)) 에 의해 세포를 수용능이 있도록 만든다. 효모를 필요한 영양소가 100㎍/ml 의 농도로 첨가된 2 % 글루코스 함유 합성 최소 배지 SD (F.Sherman, 1991) 상에서 통상적으로 배양시킨다.

생체내 재조합을 위하여 E.coli 균주 BJ5183 (D.Hanahan (1993))를 사용하고, 고전적 결찰 반응을 위한 수용 균주로서 E.coli 균주 C600, hsdR (Hubacek 등, 1970)을 사용한다.

2. DNA 조작 및 E.coli 내에서의 생체내 재조합

사용되는 일반적 분자생물학 방법은 Sambrook 등 (1989) 에 기재되어 있다. 생체내 재조합 방법은 E. Degryse (1995) 및 E. Degryse (1996) 에 기재되어 있다.

3. APAT 효소 활성 시험

APAT 아세틸트랜스퍼라제 활성은, [³H]아세틸-CoA 로부터 프레그네놀론으로의 [³H]아세테이트 혼입을 측정함으로써 결정되었다 (New England Nuclear). 반 응 배지(500 ㎕)는 [³H]아세틸-CoA (20μM, 25Ci/몰) 및 프레그네놀론 (Sigma)(30 μM)을 함유한다. 프레그네놀론을 인산칼륨 완충액 (20 mM)중의 2㎕ 의 틸옥사폴 (Sigma)/에탄올 혼합물 (1:1) 의 pH 7.0 용액에 첨가한다. 30 ℃에서 15 분 배양후, 2 ml의 디클로로메탄을 첨가함으로써 반응을 중지시킨다.

스테로이드를 디클로로메탄으로 추출한 다음, FLO-One 500 방사능감지기 (Packard)에 연결된 HP 1090 크로마토그래피 (Hewlett-Packard)상에서 45℃에서 울트라스피어 ODS 컬럼 (Beckman)으로 아세토니트릴을 사용한 일정한 용출 조건하에 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (이하, RP-HPLC) 를 수행하여 이를 분리하면, 형성된 프레그네놀론 [³H]아세테이트의 양을 측정할 수 있다.

1 APAT 단위는 상기 기재된 조건하에 30 ℃에서 1 분당 프레그네놀론 아세테이트 1nmol을 생성하는 효소의 양으로서 정의된다.

4. 단백질의 농도 결정

단백질 농도는 소 혈청 알부민을 표준으로 하여 "단백질 분석 키트" (Bio-Rad)를 사용하여 측정하였다.

본 발명의 일부 양태는 첨부된 도면에 의해 예증된다.

도 1 은 포유동물에서 콜레스테롤로부터 하이드로코르티존의 생합성 경로를 나타낸다.

도 2a 및 2b 는 에스.세레비지애에서 프레그네놀론의 프레그네놀론 아세테이트로의 생체전환을 나타낸다. 분석은 205 nm에서 RP-HPLC 에 의해 수행된다: 도 2a 는 12 시간의 배양에서 시간간격당 프레그네놀론 아세테이트의 형성 및 프레그네놀론의 소실 속도를 나타낸다. 도 2b 는 t=0 및 t=10 에서 프레그네놀론 및 프레그네놀론 아세테이트 표준의 양상에 대한 스테로이드 양상을 나타낸다.

도 3 은 MonoP HR 5/20 상에서 크로마토그래피에 의한 APAT 의 정제를 예증한다:

(A) 는 분획 10 내지 20 에 존재하는 APAT 활성의 양상을 나타낸다.

(B) 는 분자량 마커 (라인 1) 의 존재하에 쿠마시 블루 (라인 2)로 염색함으로써 조합 및 농축된 분획 14, 15 및 16 의 SDS-PAGE 분석을 나타낸다. 화살표는 62 kDa 의 겉보기 MW 의 띠를 나타내는 것이다.

도 4 는 단백질 YGR177c 의 아미노산 서열을 단문자 코드로 나타낸 것이다. 정제되고 트립신에 의해 소화된 APAT 단백질을 기준으로하여 서열결정된 펩티드를 밑줄로 표시하였다.

도 5 는 이중-융합 PCR 기술에 의해 URA3 유전자와 조합시킴으로써 ATF2 유전자를 분열시키는 기술을 나타낸다. 비어있는 바아 및 채워진 바아는 각각 ATF2 및 URA3 유전자의 서열을 나타낸다.

도 6 은 프레그네놀론의 아세틸화에 미치는 에스.세레비지애의 ATF2 유전자의 분열 효과를 나타낸다. 프레그네놀론 아세테이트의 존재는 친주 TGY73.4 (A) 또는 변이주 TGY158 (B) 의 16 시간 배양액을 기준으로하여 205nm에서 RP-HPLC 에 의해 검출된다.

도 7a,7b 및 7c 는 효모, pTG10832 및 pTG10862에서 인간 3β-HSD 의 발현 플라스미드의 구축을 도식적으로 나타낸 것이다. 도 7a 는 인간 3β-HSD를 코딩하 는 서열을 함유하는 MscI-MluI 단편의 제조를 나타낸다. 도 7b 는 CYClp/3β-HSD/PGK_t 발현 블록을 함유하는 NotI 단편의 제조를 나타낸다. 도 7c 는 pTG10832 플라스미드 및 pTG10862 플라스미드의 제조를 나타낸다.

도 8 은 플라스미드 pTG10832 의 제한효소 지도를 나타낸다.

도 9 는 플라스미드 pTG10862 의 제한효소 지도를 나타낸다.

도 10 은 발현 플라스미드 pTG10435 의 구축을 위한 계획을 나타낸다.

도 11 은 플라스미드 pTG10058 의 구축을 위한 계획을 나타낸다.

도 12 는 플라스미드 pTG10058 의 제한효소 지도를 나타낸다.

도 13 은 플라스미드 pTG10293 의 제한효소 지도를 나타낸다.

도 14 는 플라스미드 pTG10435 의 제한효소 지도를 나타낸다.

도 15a 및 15b 는 플라스미드 pTG10274 의 구축을 위한 계획을 나타낸다.

도 15a 는 플라스미드 pTG10214 의 제조를 나타낸다. 도 15b 는 플라스미드 pTG10274 의 제조를 나타낸다.

도 16 은 플라스미드 pTG10274 의 제한효소 지도를 나타낸다.

도 17 은 플라스미드 pTG10401 의 제한효소 지도를 나타낸다.

도 18 은 발현 벡터 pTG10262 의 구축을 위한 계획을 나타낸다.

도 19 는 플라스미드 pTG10262 의 제한효소 지도를 나타낸다.

도 20 은 플라스미드 pTG10403 의 제한효소 지도를 나타낸다.

도 21 은 플라스미드 pTG10417 의 제한효소 지도를 나타낸다.

(제한 효소의 약자: S, SalI; N, NotI; BII, BglII; M, MluI, C, ClaI; N°, 소실된 NcoI 부위; XbaI°, 소실된 XbaI 부위; E, EcoRI).

실시예 1 : 효모의 APAT 활성의 확인

A - 효모에 의한 프레그네놀론의 생체내 아세틸화

TGY73.4 주를 24 시간 전배양액으로부터 A600 = 0.1로 접종시켜 10 ml 의 YPD 배지 (Difco)에서 28℃에서 배양시키고, 여기에 테르기톨 (Sigma)/에탄올 혼합물 (1:1) 중에 10 mg/ml 로 용해시킨 프레그네놀론의 용액 100 ㎕를 첨가하였다. 10 시간동안 1 시간 간격으로 취한 250 ㎕ 분량의 브로쓰에 대해 형성된 스테로이드를 확인하였다. 2 ml 의 디클로로메탄으로 추출후에, 유기상을 질소 대기하에 증발시킨 다음 수득된 잔류물을 아세토니트릴에 재용해시켰다. 스테로이드를 울트라스피어 ODS 컬럼 (Beckman) 상에서 하기 용리제: 10 분동안 수중 60% 의 아세토니트릴, 이어서 5 분동안 수중 60% 에서 80 % 로 변하는 아세토니트릴, 이어서 5 분 동안 수중 80% 의 아세토니트릴을 1 ㎖/분의 유속으로 연속적으로 사용하여 45℃, 205 nm 에서 RP-HPLC 에 의해 분석하였다.

수득된 크로마토그램 (도 2b)은, 프레그네놀론이 프레그네놀론 아세테이트 표준의 것과 동일한 TR을 갖는 더욱 비극성의 생성물로 대사됨을 나타낸다. 도 2a 는 프레그네놀론이 효모에 의해 그의 대사물로 빠르게 전환됨을 나타낸다.

알칼리 처리 (메탄올중 6% 의 KOH)후에, 관찰된 대사물은 프레그네놀론의 것과 동일한 TR을 갖는 생성물을 방출한다. 이어서 질량 분광측정법에 의해 프레그 네놀론 아세테이트로서의 대사물의 동정을 확인하였다.

B- APAT 활성을 가진 효소의 정제

10 리터 발효조내에서 160 g/l 의 글루코스로 강화된 카펠리(Kappeli) 배지 (Fiechter 등, 1981) 중, 30 ℃에서 TGY73.4 주를 A600 = 30 까지 배양하였다. 세포를 원심분리에 의해 분리하고, 물로 세척한 다음, 1mM 의 PMSF를 함유하는 pH 8.0, 4℃ 의 20 mM 트리스-HCl 완충액 (완충액 A) 4 리터에 재현탁시켰다. 세포를 1000psi 의 압력에서 만톤 골린 (Manton Gaulin) 균질기에서 파괴하였다. 수득된 세포 용해물을 40℃에서 15 분동안 12,000 ×g로 원심분리한 다음, 상층액에 염화아연을 40 mM 의 최종농도로 첨가하였다. 1N HCl 로 pH를 5.5 까지 조정하고 4℃에서 30 분동안 침전을 수행하였다. 4℃에서 10 분동안 10,000 ×g 로 원심분리한 후에, 침전물을 단리하고 100 mM EDTA 및 1mM PSFM을 함유하는 3 리터의 완충액 A 에 재현탁시켰다. 30 리터의 완충액A 에 대해 Y10S10 카트리지 (Amicon) 상에서 투석여과에 의해 EDTA를 제거한 후, 잔류물을 미리 완충액 A 로 평형화시킨 1.5 리터의 DEAE-세파셀 (Pharmacia)의 컬럼에 4℃에서 35 ml/분의 속도로 충진하였다. 컬럼을 완충액 A 로, 이어서 0.15 M NaCl을 함유한 완충액 A 로 세척한 후, 0.4 M NaCl을 함유하는 완충액A 로 APAT 활성을 용출하였다. 상기 "일반적 재료 및 방법"에 나타낸 바와 같이 측정된, APAT 활성을 함유하는 DEAE-세파셀의 분획을 합하고, 2M 의 최종 농도까지 NaCl을 첨가한 다음, 이를 2M NaCl을 함유하는 완충액 A로 미리 평형화시킨 500 ml 의 페닐-세파로스 (Pharmacia)의 컬럼에 4℃에서 15 ml/분의 속도로 충진시켰다. 컬럼을 0.5 M NaCl을 함유하는 완충액 A 로 세척 한 후, 완충액 A 중에서 0 에서 1 % 로 변하는 선형 구배의 소듐 콜레이트 1.5 리터로 APAT 활성을 용출하였다. APAT 활성을 함유한 분획을 합한 다음, YM10 막 (Amicon) 상에서 한외여과에 의해 농축한후, 사용시까지 -80 ℃에서 보관하였다.

충분한 양의 재료를 제조하고 정제를 계속하기 위해서는 전체 공정을 1 회 반복한다.

2 개의 상기언급된 제법으로부터 정제된 재료를 녹인다음, 완충액A 중에 미리 평형화시킨 100 ㎖ 의 Q-Sepharose Fast Flow (Pharmacia)의 컬럼에 4 ℃에서 4 ml/분의 속도로 충진하였다. 컬럼을 동일한 완충액으로 세척한 후, 동일한 완충액중에서 0 에서 1 M 로 변하는 선형구배의 NaCl 500 ml 로 APAT 활성을 용출하였다. APAT 활성을 함유하는 Q-Sepharose 분획을 합한 다음, 0.5 M NaCl을 함유하는 완충액 A 로 미리 평형화한 세파로스 비드 (Pharmacia) 상에 고정화시킨 7㎖ 의 소듐 콜레이트의 컬럼에 4℃에서 2.5ml/분의 속도로 직접 충진하였다. 동일한 완충액으로 컬럼을 세척한 후, 동일한 완충액에서 0 에서 1 % 로 변하는 선형구배의 소듐 콜레이트 100 ml 로 APAT 활성을 용출하였다. APAT 활성을 함유하는 분획을 합하고, YM10 막 (Amicon) 상에서 한외여과에 의해 1.8 mg/ml 의 단백질 농도까지 농축한 다음, -80℃에서 보관하였다.

이렇게하여, 하기 표 1 에 나타낸 바와 같이, 비활성을 기준으로하여 약 500 배 및 약 16% 의 수율로 APAT 활성이 정제되었다.

단계	APAT 활성 (단위)	단백질 (mg)	비활성 (단위/mg)	정제	수율
상층액 12,000g	8.057	42.242	0.19	1	100
아연으로 침전	10.453	28.040	0.37	1.9	129
DEAE-세파셀	6.399	5.009	1.28	6.7	79
페닐-세파로스	3.316	489	6.78	35.7	41
Q-세파로스	1.712	39	43.9	231	21
콜레이트-세파로스	1.300	13	100	526	16

상기 수득된 반-정제 재료의 1/2 (약 6 mg 의 단백질)을 녹인 다음, PEG 4000 (Prolabo)를 20% (w/v) 의 최종 농도까지 첨가하여 콜레이트 및 NaCl을 제거하였다. 4℃에서 30 분동안 교반한 후, 4℃에서 30 분간 12,000 ×g 로 원심분리하여 침전물을 수집한 다음, 4 ml 의 완충액 A 에 재용해시켰다. 이어서, 수득된 용액을 비스-트리스 25 mM pH6.3 완충액으로 미리 평형화시킨 MonoP HR5/20 (Pharmacia) 의 컬럼에 1ml/분의 속도로 충진시켰다. APAT 활성을 완충액 Polybuffer 74 pH4.0 (Pharmacia) 로 용출하였다. 산성 pH에서 효소의 불활성화를 제한하기 위하여, 각각 50 ㎕ 의 트리스-HCl 2M, pH 8.0 완충액 존재하에서 1 ml 분획들을 수집하였다. 상기 나타낸 바와 같이 측정된, 가장높은 APAT 활성을 가진 분획 14, 15 및 16 (도 3A)을 합하고, YM10 막상에서 한외여과에 의해 농축한 다음 사용전에 -80℃에서 보관하였다. 이렇게 수득된 활성 분획을 10% 폴리아크릴아미드 겔상에서 SDS-PAGE 하였다. 쿠마시 블루로 염색하면 몇개의 띠가 나타나며 (도 3A), 이중에서 62 kDa 의 겉보기 MW를 가진 큰 띠는 슈퍼로스6 (Pharmacia) 겔 상에서의 여과에 의해 결정된 MW 와 동일하고 APAT 활성에 상응하는 것이다.

C- APAT 의 특성

a) 기질 특이성

아세틸-CoA 및 프레그네놀론에 대해 상기 언급된 방법에 따라서, 상이한 아실 공여체 또는 상이한 스테로이드 기질을 사용하여 시험을 수행하면, 반-정제된 APAT 는 3β-올, 델타⁴ 또는 델타⁵-스테로이드상에 아세테이트를 필적할만한 효율로 운반하는 반면, 에스트로겐상에 대한 운반은 적고 스테롤상에서는 검출되지 않으며, 아실 공여체로서 아세틸-CoA를 두드러지게 선호함을 알수 있다.

a) 각각의 시험 스테로이드 30 μM 및 [³H]아세틸-CoA 100 μM을 사용하여 시험을 수행하고, b) 각각의 아실 공여체 100 μM 및 [³H] 프레그네놀론 30μM을 사용하여 시험을 수행하여, 수득된 결과를 하기 표 2 에 나타낸다.

기질 a) 상대활성 (%)	기질 b) 상대활성 (%)
프레그네놀론 100	아세틸-CoA 100
17α-OH 프레그네놀론 89	프로피오닐-CoA 33
DHEA 104	부티릴-CoA 16
4-프레그넨-3β올-20-온 70	헥사노일-CoA 18
5β-프레그난-3β올-20-온 1.8	올레오일-CoA 비검출
17β-에스트라디올 5
에스트론 2.5
콜레스테롤 0.6
에르고스테롤 0.4

b) 저해

APAT 활성은 NEM 및 DTNB 와 같은 술프히드릴기의 시약에 의해 강력히 저해된다. 염화아연 (1mM) 의 존재하에서 완전히 저해된다.

D - 부분 아미노산 서열

Rosenfeld 등 (1992) 에 의해 기재된 방법에 따라 겔 절편상에서 트립신으로 소화시킨후 부분 아미노산 서열을 결정하였다.

상기 수득된 농축물의 2/3를 사용하여, SDS-PAGE 로 분리시켜 62 kDa 띠를 잘라낸 다음, 트립신 (Promega) 과 배양한다. 이어서, 생성된 펩타이드를 Vydac 218TP 컬럼 (1.5 × 125 mm) 상에서 0.1 % TFA 수용액중에서 80분간 0 에서 60% 로 변하는 선형 구배의 아세토니트릴, 이어서 20분간 60 에서 100% 로 변하는 선형 구배의 아세토니트릴을 용리제로 사용하여, 100 ㎕/분의 속도로 RP-HPLC 에 의해 분리한 다음, 아미노산 배열결정하였다.

PTH-아미노산의 HPLC 분석기에 연결된 모델 477a 단백질 서열결정기 (Applied Biosystems) 상에서 N-말단 서열을 결정하였다.

배열결정된 시료중에서, 두 개의 피크 x 및 y 는 각각 하기의 10 개 및 16 개 아미노산으로 이루어진 명백한 서열을 나타낸다:

피크 x: ISEQFKKDDF

피크 y: LIELISPVIIPLGNPK

이렇게 수득된 두 개의 펩타이드 서열을 에스. 세레비지애의 게놈 데이터베이스를 검색하기 위해 사용하였다. 실제적으로 상기 2 개의 펩타이드의 서열을 함유하는 서열을 가진 62 kDa의 단백질이 확인되었다 (Mips, 수탁번호 S64491, Hebling 등, 1996년 5 월). 이 단백질은 도 4 에 나타낸 서열을 가지고 있고, 그의 기능은 기재되지 않았으나, YGR177c 좌의 유전자에 의해 코딩된다. 아실트랜스퍼라제 활성을 가진 본 발명의 단백질과 Fujii 등 (1994) 에 의해 기재된 에스.세레비지애에서의 ATF1 유전자의 산물과의 사이에 약 37 % 의 아미노산 서열의 동일성이 존재하고 알콜 아세틸트랜스퍼라제가 이것에 기인한 것임을 근거로 하여, 에스.세레비지애에서의 APAT 활성과 관련된 단백질을 코딩하는 유전자에 대하여 ATF2 라고 명명해야 한다.

실시예 2 : URA3 유전자에 의해 분열된 ATF2 유전자를 갖고 APAT 활성이 소실된 효모 주 ( atf2-Δ :: URA3 ) 의 구축

A) ATF2 유전자의 표적화

에스.세레비지애의 ATF2 유전자의 선택된 일부를 치환함으로써 에스.세레비지애의 URA3 유전자를 도입하였으며, 이는 이후에 우라실과의 원영양성에 의해 변이주를 선별가능케 한다.

URA3 선택 마커를 Amberg 등 (1995) 에 의해 기재된 방법에 따른 이중 융합 PCR 에 의해 ATF2 유전자와 결합시켰다. 도 5 에 나타낸 바와 같이, 이후의 방법은 총 4 개의 PCR 반응을 포함한다. 첫 번째 두 개의 반응들 (PCR1으로 명명) 은, 각각, 분열되어지는 ATF2 표적 유전자에서 URA3 마커의 삽입 부위에 인접한 5' 및 3' 영역을 증폭시키는 것이고, 세 번째 반응 (PCR2 로 명명) 은 URA3 마커 유전자를 증폭시키는 것이다. 마지막으로, 이중 융합 (PCR3 으로 명명) 은 ATF2 표적 유전자의 5' 및 3' 영역을 URA3 마커 유전자와 결합시키는 것이다 (5'ATF2-URA3-3'ATF2 로 명명).

먼저, ATF2 표적 유전자의 DNA 원으로 사용되는 Fy1679 주의 온전한 세포 시료를 하기 조건하에 2mM dNTP (Pharmacia)를 함유하는 PCR 완충액중에서 증폭시켰다: 25 사이클; 93℃, 30초; 54℃, 2분; 68℃, 3분 이어서 72℃에서 5 분간 연장; 폴리머라제 Ampli Taq (Perkin Elmer).

한편, 직접 및 간접 프라이머로서, 하기 서열:

및

을 갖고 ATF2 유전자 (SGD: YGR177c) 서열의 5' 영역에 상동하는 영역을 함유하는 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR을 행하고, OTG10841 에 대한 제한효소 부위 SalI을 첨가함으로써, ATF2 유전자의 5' 영역을 증폭시켰다.

다른한편, 직접 및 간접 프라이머로서, 하기 서열:

및

을 갖고 ATF2 유전자 (SGD: YGR177c) 서열의 3' 영역에 상동하는 영역을 함유하는 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR을 행하고, OTG10842 에 대한 제한효소 부위 MluI을 첨가함으로써, ATF2 유전자의 3' 영역을 증폭시켰다.

두 번째로, 직접 프라이머로서, 하기 서열:

을 갖고, ATF2 유전자의 5'영역 (OTG10844 에 상보적임) 에 상동하는 서열과 조합된, URA3 유전자의 공지된 서열 (Rose 등, 1984; GenBank: YSCODCD 수탁번호: K02207; SGD:YEL021W)의 5' 영역에 상동하는 서열을 함유하는 올리고뉴클레오티드를 사용하고, 간접 프라이머로서 하기 서열:

을 갖고, ATF2 유전자의 3'영역 (OTG10846 에 상보적임) 에 상동하는 서열과 조합된, URA3 유전자의 3' 영역에 상동하는 서열을 함유하는 올리고뉴클레오티드를 사용하여, PCR 에 의해 에스. 세레비지애의 URA3 유전자를 증폭시켰다. 제한효소 HindIII 로의 소화에 의해 셔틀 벡터 E.coli-효모 pTG10021 (Degryse 등, 1995) 로부터 단리된, URA3 유전자의 DNA 시료 20ng을 상기와 동일한 조건하에서 증폭시켰다.

각각 수득된 PCR 산물을 "Geneclean kit" (Bio 101 Inc., La Jolla, USA)를 사용하여 정제한 다음, 상기 PCR 반응에 사용되는 증폭 조건하에서 상기 언급된 올리고뉴클레오티드 OTG10841 및 OTG10842를 프라이머로 사용하여 20 사이클의 프로그램으로 이중 융합 반응시켰다.

기능성 URA3 유전자에 융합된 ATF2 유전자에 인접한 영역을 함유하는 최종 융합 산물을 정제한 후에, EcoRV 제한효소로의 소화에 의하여 URA3 유전자의 존재가 확인되었으며, 이는 증폭된 물질내에서 이 제한효소 부위가 존재함을 나타내는 것이다.

B) 효모 주 atf2-Δ :: URA3 의 생성

상기 수득된 융합 산물을 주 Fy1679 또는 주 TGY73.4 의 컴피턴트 세포에서 직접 형질전환시키고, 형질전환체를 주의 영양 요구성의 존재 및 우라실 부재하에 서 SD 배지 (F.Sherman, 1991) 상에서 생육시킴으로써 선택하였다.

단리된 클론으로부터, ATF2 유전자 및 URA3 유전자의 5' 영역 사이의 새로운 조합 (5'ATF2-URA3-3'ATF2)은, 상기 언급된 프라이머 OTG10841 및 OTG10845를 사용하여 온전한 세포상에서의 PCR 증폭에 의해 증명되었다. 이어서, APAT 활성의 부재는, 뚜렷한 APAT 활성을 나타내는 친주와 비교하여, 세포 균질화물에 대해 기재된 시험 방법에 따라서 시험관내에서 증명되었다.

이러한 기준을 충족하는 주는 atf2 변이주로서 특징화되며, atf2-Δ::URA3 로 명명된다. 친주 Fy1679 로부터 출발하여 이렇게 수득된 변이주는 TGY156 으로 명명되고, 친주 TGY73.4 로부터 출발하여 수득된 변이주는 TGY158 로 명명된다.

주 TGY156 의 시료는 프랑스공화국 75724 파리 세덱스 15 뤼 뒤 독뙤르 루 25 에 위치한 Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) INSTITUT PASTEUR 에 1998 년 2 월 2 일에 수탁번호 I-1977 로 기탁되었다.

주 TGY158 의 시료는 프랑스공화국 75724 파리 세덱스 15 뤼 뒤 독뙤르 루 25 에 위치한 Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) INSTITUT PASTEUR 에 1998 년 2 월 2 일에 수탁번호 I-1976 로 기탁되었다.

C) 효모 주 atf2-Δ :: URA3 의 배양액중에서 프레그네놀론의 생체내 안정화

상기 수득된 주 TGY158 의 세포를 100 ㎍/ml 의 프레그네놀론을 함유하는 YPD 배지 (Difco) 에 A600 = 0.1 로 접종하였다. 28 ℃에서 16 시간 배양후에, 디클로로메탄으로 스테로이드를 추출하고 상기 언급된 바와 같은 RP-HPLC 로 분석하였다. 도 6B 는 변이주 TGY158 이 프레그네놀론을 에스테르화하는 능력을 소실하 였음을 나타내고, 반면 동일한 배양 조건에서 친주 TGY73.4 는 프레그네놀론을 프레그네놀론 아세테이트로 전환시킨다 (도 6A).

이러한 결과를 근거로 하여, ATF2 유전자의 생성물이 효모에 의한 프레그네놀론의 에스테르화의 원인이 되는 반면, ATF2 유전자가 분할되더라도 정상 조건에서의 세포 생육에 명확한 변화를 일으키지 않는다는 결론을 얻을 수 있다.

실시예 3 : URA 3 유전자에 의해 분열된 ATF2 유전자를 갖고 3β-HSD 를 발현하는 효모 주의 구축

에스.세레비지애의 CYC1 프로모터 또는 에스. 세레비지애의 TEF1 프로모터의 제어하에 인간 3β-HSD 를 코딩하는 cDNA 서열을 갖고, G418 저항 유전자를 갖는 2 μ플라스미드를 도 7a 내지 7c 에 나타낸 계획에 따라 구축한 다음, 효모 변이주 atf2-Δ::URA3 로 형질전환시켰다.

먼저, SalI 및 MluI 부위에 인접하고 효모 프로모터 GAL10/CYC1 의 하류에 위치한, E.Rheaume 등의 문헌 (1991) 에 기재된 II형 인간 3β-HSD 을 코딩하는 cDNA 서열을 함유하는 운반 벡터 pTG10095 를 하기 방법으로 생성하였다:

3β-HSD 를 코딩하는 서열을, 벡터 Bluescript II (Stratagene) 의 동일 부위에서의 제한효소 단편 SalI-NotI 으로써 E.Rheaume 등 (1991) 의 방법에 따라 서브크로닝하였다. E.Rheaume 등(1991) 에 의해 기재된 수득된 벡터는 3β-HSD 를 코딩하는 서열의 3'말단에 위치한 NotI 부위를 함유한다. 이어서 이 벡터를 NotI 제한효소로 소화시키고, 부착 말단을 채우기 위해 dNTP 의 존재하에서 클레노우 단편으로 처리한 다음, 하기 서열:

OTG4461:CACACGCGTGTG (서열 번호 7)

을 갖고 미리 그 자체상에 인산화 및 하이브리드 형성시킨 올리고뉴클레오티드의 존재하에서 재결찰시켜, MluI 부위를 도입하였다. 이렇게 수득된 벡터 pTG10082 (도 7a) 는 BalII 부위를 함유하고 SalI 및 MluI 부위로 둘러진 3β-HSD 를 코딩하는 서열을 함유하는 반면, NotI 부위는 소실되었다. 이 벡터는 BalII 부위의 존재로 확인되는 자연 비-코딩 영역 5'를 여전히 함유하고 있다.

SalI 부위를, GAL10/CYC1 프로모터를 도입하고자 하는 개시인자 ATG 상류쪽에 근접한 곳에 제공하기 위하여, 벡터 pTG10082 를 절단부위가 비-코딩 5' 영역 및 개시인자 ATG 의 상류에 위치하는 MscI 제한 효소로 소화시키고, MluI 제한 효소로 소화시켰다. 이어서, 3β-HSD 를 코딩하는 서열을 함유하는 1.8kb 의 MscI-MluI 단편 (도 7a) 을 단리한 다음, SalI 제한 효소로 미리 소화되고 GAL10/CYC1 프로모터를 함유하는 pTG10033 플라스미드 (E.Degryse 등, 1995) 에 결찰시킨 다음, MluI 제한 효소로 소화시켰다. 이렇게하여 pTG10095 벡터 (도 7b) 가 수득된다.

두번째로, 효모의 2μ플라스미드, E.coli의 레플리콘, CYC1 _prom -PGK _term 발현 카세트 및 선택 마커 LEU2 를 함유하는 재조합 벡터 pTG10268 (도 7b) 을 구축하였다. 이 벡터는, 2μ영역내에 함유된 XbaI 부위가, 클레노우 단편의 존재하에 자연 부위 XbaI 를 채운다음 재-결찰시킴으로써 수득되는 마커 XbaI° 로 치환되어 있다는 것을 제외하고는, E.Degryse 등 (1995) 에 기재된 벡터 pTG10159 와 동일하 다.

이어서, 상기 제조된 플라스미드 pTG10095 로부터 출발하여 이를 NotI 제한 효소로 소화시킴으로써 수득되는 프로모터 GAL10/CYC1p 를 함유한 발현 블록을, 제한 효소 SalI 및 MluI 로 미리 소화시킨 플라스미드 pTG10260 에 도입함으로써, 동종 재조합에 의해 pTG10268 발현 플라스미드를 제조하였다. 플라스미드 pTG10268 (도 7b) 는 프로모터 CYC1 의 제어하에서 II 형 인간 3β-HSD 를 코딩하는 서열을 함유한다.

프로모터 TEF1 의 제어하에서 3β-HSD 를 코딩하는 서열을 함유한 발현 플라스미드 pTG10862 는 다음과 같은 방법으로 구축되었다 (도 7c):

먼저, 상기 제조된 플라스미드 pTG10268 로 부터 수득되고 NotI 제한효소로 소화시킨 NotI 단편과 제한 효소 SalI 및 MluI 에 의해 미리 소화된 재조합 플라스미드 pTG10164 (E.Degryse 등, 1995) 과의 사이에서 동종 재조합에 의해 플라스미드 pTG10832 (도 8) 를 구축하였다.

이어서, 상기 구축된 플라스미드 pTG10832 를 제한 효소 ClaI 및 SalI 로 소화함으로써 제거되는 프로모터 CYC1 의 대신에, 플라스미드 pTG10085 (E.Degryse 등, 1995)로부터 단리된 ClaI-SalI 단편에 함유된 프로모터 TEF1 을 도입함으로써 발현 플라스미드 pTG10862 를 수득하였다.

II 형 인간 3β-HSD 를 코딩하는 cDNA 서열을 함유하는 상기 수득된 플라스미드 pTG10862 (도 9) 를 각각 친주 TGY73.4 또는 실시예 2 에서 수득된 주 TGY158 에 상응하는 그의 변이주 atf2-Δ::URA3 에 형질전환시키고, 또한 친주 FY1679 또 는 실시예 2 에서 수득된 주 TGY156 에 상응하는 그의 변이주 atf2-Δ::URA3 에 형질전환시켰다. 형질전환체는 250 ㎍/ml 의 G418 를 함유하는 YPD 배지 (Difco) 상에서 상기 언급된 바와 같이 단리되었다.

이어서, 이렇게 수득된 후보 콜로니들을 각각의 주에 필요한 영양소 (주 TGY73.4 를 위해서는 히스티딘 및 우라실; 주 TGY158 을 위해서는 히스티딘; 주 FY1679 를 위해서는 트립토판, 히스티딘, 류신 및 우라실; 주 TGY156 을 위해서는 트립토판, 히스티딘 및 류신; 각각 100 ㎍/ml 의 농도) 를 함유하는 SD 배지상에 전배양시킨 다음, 100 ㎍/ml 의 프레그네놀론을 함유하는 배지에 접종하였다. 28 ℃ 에서 24 시간 생육 및 생체전환후에, 스테로이드를 추출하고 상기 언급된 바와 같이 RP-HPLC 로 측정하였다. 각각의 주로부터 3 개의 콜로니에 대해 측정된 결과를 하기 표 3 에 나타낸다:

주	플라스미드	프레그네놀론 (㎍/㎖)	프로게스테론 (㎍/㎖)
TGY73.4	pTG10862	1	0
TGY158	〃	94	15.2
FY1679	〃	1	1.3
TGY156	〃	100	13

상기 결과는 기질 프레그네놀론이 변이주 TGY156 또는 TGY158 에서 거의 정량적으로 회수되고, 이들 변이주에서는 프레그네놀론의 프로게스테론으로의 생체전환의 개시가 관찰되는 반면, 친주 TGY73.4 또는 FY1679 에서는 프레그네놀론이 완전히 소멸되고, 만약 있다하더라도 친주 TGY73.4 또는 FY1679 는 프로게스테론을 거의 생성하지 않으며, 그 대신 실시예 2 에 나타낸 바와 같이 프레그네놀론 아세테이트를 축적함을 나타낸다.

변형된 주 TGY158/pTG10862 의 시료는 프랑스공화국 75724 파리 세덱스 15 뤼 뒤 독뙤르 루 25 에 위치한 Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) INSTITUT PASTEUR 에 1998 년 2 월 2 일에 수탁번호 I-1978 로 기탁되었다.

실시예 4: TEF1 _prom /PGK _term 으로 분열된 ATF2 유전자를 갖는 효모 주 ( atf2-Δ: : TEF1/PGK ) 의 구축

ATF2 좌의 URA3 유전자가 발현 블록 TEF1 _prom /PGK _term 으로 치환되어진, 실시예 2 에 기재된 주 TGY156 (atf2-Δ::URA3) 로 부터 유래된 주인 주 TGY186 을 다음과 같이 구축하였다:

먼저, URA3 선택 마커 대신에 에스. 세레비지애의 발현 블록 TEF1 _prom /PGK _term (E.Degryse 등 (1995) 에 의해 기재됨) 을 사용하는 것 이외에는, 실시예 2 에 기재된 조건에 따른 이중 융합 PCR 에 의하여 발현 블록 TEF1 _prom /PGK _term 을 ATF2 유전자와 조합하였다.

첫번째 두개의 PCR 반응 (PCR1) 은, 각각, ATF2 분열된 표적 유전자내에서 TEF1 _prom /PGK _term 블록의 삽입 부위에 인접한 ATF2 유전자의 5' 및 3' 코딩 영역을 증폭시키는 것으로서, 이들은 각각 5' 영역에 대한 직접 및 간접 프라이머로서 하기 서열:

및

를 갖는 올리고뉴클레오티드를 사용하고, 3' 영역에 대한 직접 및 간접 프라이머로서 하기 서열:

OTG10846:CATTCGACATTCCCGAAGGTGACAATGACAAG (서열 번호 10) 및

을 갖는 올리고뉴클레오티드를 사용하여 수행되었다.

프라이머 OTG11049 및 OTG11050 은 각각 제한효소 부위 SalI 및 MluI 을 도입하기 위해 사용되었다.

TEF1 _prom /PGK _term 블록을 증폭시키는 세번째 PCR 반응 (PCR2) 은 각각 직접 및 간접 프라이머로서 하기 서열:

및

을 갖고 제한효소 부위 ClaI 및 HindIII 을 도입하는 올리고뉴클레오티드를 사용하여 수행되었다.

마지막으로, 상기 서열 OTG11049 (서열 번호 8) 및 OTG11050 (서열 번호 11) 을 갖고, ATF2 접합 부위에 제한효소 부위 SalI 및 MluI 을 도입하는 올리고뉴클레오티드를 프라이머로서 사용하여, 상기 수득된 PCR 생성물의 이중 융합에 의해 조합을 수행하였다.

정제후에, 최종 융합 생성물을, 하기 나타낸 바와 같이 구축되고 제한 효소 BstI 및 StuI 로 미리 소화시킨 플라스미드 pTG10885 내에 함유된 ATF2 유전자와 재조합하였다. 이렇게하여, ATF2 유전자의 플랭킹 영역으로 둘러진 ClaI 및 HindIII 부위에 TEF1 _prom /PGK _term 시그날을 함유하는 플라스미드 pTG10888 이 수득된다.

플라스미드 pTG10885 의 제조는, 상기 서열 OTG11049 (서열 번호 8) 및 OTG 11050 (서열 번호 11) 을 갖고 제한효소 부위 SalI 및 MluI 을 도입하는 올리고뉴클레오티드를 각각 직접 및 간접 프라이머로서 사용하는 것 이외에는, 실시예 2 에 기재된 조건에 따라서 FY1679 주로부터 출발하여 ATF2 유전자를 증폭시키는 것을 포함한다. 이어서, 수득된 PCR 생성물에서, 제한 효소 SalI 및 MluI 로 소화시킴으로써 상기 제한효소 부위를 제거한 다음 E.coli의 폴리머라아제 I 의 클레노우 단편으로 처리하여 점착 말단을 완성하였다. 이어서 수득된 단편을 효소 ClaI 및 HindIII 로 미리 소화시킨 발현 벡터 pTG10031 (E. Degryse 등의 문헌 (1995) 에 기재됨) 에 결찰시키고, 클레노우 단편으로 처리하였다. E.coli 에 형질전환함으로써 플라스미드 pTG10885 가 수득되며, 이는 서열 GTCGA 를 얻기위해 클레노우 단편을 사용하여 채워진 PCR 생성물의 SalI 부위와 서열 AGCTT 를 얻기위해 클레 노우 단편을 사용하여 채워진 벡터의 HindIII 와를 결찰시켜, HindIII 부위 (GTCGAAGCTT) (서열 번호 14)를 재구축하고 ClaI 부위를 소실시킴으로써 얻어진 결과이다. 서열 ATCG 를 얻기위해 클레노우 단편을 사용하여 완성된 벡터의 ClaI 부위는 PCR 생성물로의 결찰후에 소실된다.

이어서, TEF1 _prom /PGK _term 시그날을 1.8kb 의 NotI 단편의 형태로 플라스미드 pTG10888 로 부터 절제한 다음, 이를 주 TGY156 의 URA3 마커 (atf2-Δ::URA3) 와 교환하였다.

실시예 2 에서 제조되고 숙주 주로서 사용되는 주 TGY156 을, 플라스미드 pTG10888 로 부터 절제된 DNA 및, ARS 개시점을 함유하는 효모 벡터 (YRp7로 명명; Struhl 등 (1979) 에 기재됨) 로 동시-형질전환시켰으며, 이로써 주 TGY156 의 트립토판 요구성을 보충할 수 있고 5-플루오로-오르틴산 (5-FO) 에 대한 내성에 의해 콜로니를 선택적으로 검출할 수 있다.

NotI 제한 효소로 소화된 플라스미드 pYG10888 로부터 및 플라스미드 YRp7 로부터 절제된 DNA 2 내지 5㎍을 리튬 아세테이트 방법 (Ito 등, 1983) 에 의해 주 TGY156 에 도입하였다. 히스티딘 및 류신 (각각 100 ㎍/ml) 으로 강화시킨 YNGB 배지 (Difco) 의 한천 디쉬상에 도말한 후에, 주의 트립토판 요구성에 대한 보충을 선별하였다. 이쑤시개를 사용하여 수집한 후보 콜로니들을 Boeke 등 (1984) 에 따라 제조된 5-FO 함유 배지상에 놓은 다음, 동일 배지상에서 5-FO 에 대한 내성을 확인하였으며, 5-FO 에 대한 내성을 갖는 콜로니내에서 YRp7 벡터의 소실은 트립 토판 요구성으로 표시된다. 이렇게 선택된 클론중에서, TEF1 _prom 및 PGK _term 과 ATF2 유전자의 조합을 PCR 에 의해 모니터하였다. 이렇게하여 주 TGY186 이 수득된다.

실시예 5: TEF1 _prom /PGK _term 으로 분열된 ATF2 유전자를 갖고 P ₄₅₀ 17α를 발현하는 효모 주의 구축

효모 복제 개시점 ARSH4/CEN6, URA3 선택 마커를 함유하고 에스.세레비지애의 TEF1 프로모터의 제어하에 소의 치토크롬 P₄₅₀17α를 코딩하는 cDNA 서열을 가진 플라스미드 (pTG10435)를 도 10 의 계획에 따라 구축한 다음, 효모 변이주 atf2-Δ::TEF1/PGK (TGY186) 에 형질전환하였다. 먼저, Zuber 등 (1986) 에 의해 기재된 소의 치토크롬 P₄₅₀17α를 코딩하는 cDNA 서열을 SalI 및 MluI 부위에 인접하고 효모 프로모터 CYC1 의 하류 위치에 함유하고 있는 플라스미드 pTG10058을 도 11 의 계획에 따라 생성하였다: 소 치토크롬 P₄₅₀17α을 코딩하는 서열을 함유하고 특허출원 WO 89/10963 에 기재된 플라스미드 pGB17α-5을 XhoI 제한 효소로 소화시켜 개방시킨 다음 알칼리 포스파타제로 처리하였다. 인산화 및 하이브리드형성 후에, 하기 서열:

OTG4511:TCGACGGACGCGTGG (서열 번호 15) 및

OTG4512:TCGACCACGCGTCCG (서열 번호 16)

을 갖는 올리고뉴클레오티드를 XhoI 부위에 도입하여 플라스미드 pTG10104을 생성하였다. 이어서, 플라스미드 pTG10104를 제한 효소 SalI 및 MluI 로 처리한 다음, 미리 제한효소 SalI 및 MluI 으로 소화시키고 알칼리 포스파타제로 처리한 효모 프로모터 CYC1을 함유하는 플라스미드 pTG10031 (E. Degryse등 (1995) 에 기재됨) 에 도입하였다. 이렇게 하여 소 치토크롬 P₄₅₀17α을 코딩하는 cDNA를 함유하는 pTG10058 벡터가 수득된다 (도12). 이어서 플라스미드 pTG10058을 제한 효소 SalI 및 MluI 로 소화시키고 알칼리 포스파타제로 처리하였다. 소 치토크롬 P₄₅₀17α를 코딩하는 서열을 함유하는 1.7kb 의 SalI-MluI 단편을 단리한 다음, 효소 SalI 및 MluI 으로 미리 소화시킨 효모 프로모터 TEF1을 함유하는 발현 벡터 pTG10085 (E. Degryse등 (1995) 에 기재됨) 에 결찰시켰다. 이렇게하여, 치토크롬 P₄₅₀17α를 코딩하는 서열이 프로모터 TEF1 의 제어하에 있는 플라스미드 pTG10293 (도 13) 이 수득된다.

두 번째로, 미리 제한효소 SalI 및 MluI 로 소화시킨, 서열 ARSH4/CEN6을 함유하는 재조합 플라스미드 pTG10434 (E. Degryse등 (1995) 에 기재됨) 와, 상기 제조된 플라스미드 pTG10293 으로부터 출발하여 수득된 2.8 kb 의 NotI 단편과의 사이에서 동종 재조합에 의해 발현 플라스미드 pTG10435을 생성하였다.

이어서, 프로모터 TEF1 의 제어하에서 소 치토크롬 P₄₅₀17α을 코딩하는 서열을 함유하는 상기 수득된 플라스미드 pTG10435를 친주 FY1679 또는 실시예 4에서 제조된 주 TGY 186 (atf2-Δ::TEF1/PGK) 에 각각 형질전환시켰다. 형질전환체를 트립토판, 히스티딘 및 류신 (각각 100 ㎍/ml) 으로 강화된 YNBG 배지 (Difco) 에 서 상기 언급된 바와 같이 단리하였다. 이렇게 수득된 콜로니를 2% 글루코스 및 0.5% 카사미노산을 함유하는 YNB 배지 (Difco)에서 16 시간 전배양한 다음, 새로운 배지에 A600 = 0.2 까지 희석하였다. 6 시간 생육후에, 100 ㎍/ml 의 프레그네놀론 또는 프로게스테론을 첨가하였다. 28 ℃에서 48 시간의 생육 및 생체전환후에, 스테로이드를 추출하고, 각각 프레그네놀론 및 17α-히드록시프레그네놀론 또는 프로게스테론 및 17α-히드록시프로게스테론의 표준을 사용하여, 실시예 1 에 나타낸 바와 같이 RP-HPLC 에 의해 측정하였다.

수득된 결과 (㎍/ml 로 표시)를 하기 표 4 에 나타낸다.

주	FY1679/pTG10435	TGY186/pTG10435
기질: 프레그네놀론
프레그네놀론	0	67.1
17α-히드록시프레그네놀론	0	42.0
기질: 프로게스테론
프로게스테론	46.5	41.4
17α-히드록시프로게스테론	29.3	33.1

상기 결과는, 프로게스테론을 기질로 사용하면, 벡터 pTG10435 로부터 출발하여 발현된 치토크롬 P₄₅₀17α 의 생체전환능이 야생형 주 (FY) 또는 그의 변이주 atf2 (TGY186) 에서 거의 동일함을 나타내고 있다. 한편, 기질로서 프레그네놀론을 사용하면, 단지 변이주 atf2 (TGY186)에서만 프로게스테론에 비해 동일한 생체전환이 수득된다. 야생형 주 FY 에서는, 기질과 생성물 모두 아세틸화되며 유리 히드록시프로게스테론은 검출되지 않는다.

변형 주 TGY186/pTG10435 의 시료는 프랑스공화국 75724 파리 세덱스 15 뤼 뒤 독뙤르 루 25 에 위치한 Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) INSTITUT PASTEUR 에 1999 년 1 월 20 일에 수탁번호 I-2119 로 기탁되었다.

실시예 6: TEF1 _prom /PGK _term 에 의해 분열된 ATF2 유전자를 갖고 3β-HSD 및 P ₄₅₀ 17α를 동시-발현하는 효모 주의 구축

효모 레플리콘 2μ 및 에스. 세레비지애의 프로모터 CYC1 의 제어하에 있고 URA3-d 선택 마커를 갖는 두 개의 발현 블록, 즉 인간 3β-HSD를 코딩하는 것과 소 치토크롬 P₄₅₀17α을 코딩하는 것을 함유하는 플라스미드 pTG10417 (도 21)을 하기 기재한 단계 1 내지 3 에 따라 연속적으로 구축한 다음 (도 15 A 및 B), 하기 기재한 단계 4 내지 6을 수행한 다음, 효모 변이주 atf2-Δ::TEF1 _prom /PGK _term (TGY186) 에 형질전환하였다.

단계 1: 플라스미드 pTG10210 의 구축

하이브리드 효모 프로모터 GAL10/CYC1을 함유하고 제한효소 PvuII 으로 미리 소화시킨 발현 벡터 pTG10033 (E. Degryse 등, 1995 에 기재됨)을 알칼리 포스파타제로 처리한 다음, 하기 서열:

OTG1050:CCCGAATTCGGG (서열 번호 17)

을 갖고, 그 자체상에 미리 인산화 및 하이브리드 형성시킨 올리고뉴클레오티드의 존재하에서 재-결찰시켜, 프로모터 GAL10/CYC1을 함유하는 발현 블록의 가장자리에 EcoRI 부위를 도입하였다. 이렇게하여 벡터 pTG10210 이 수득된다.

단계 2: 플라스미드 pTG10214 의 구축

벡터 pTG10210 에 존재하는 프로모터 GAL10/CYC1을 함유하는 발현 블록을 선택 마커 URA3-d를 함유하는 E.coli-효모 셔틀 벡터 pTG10013 (E.Degryse 등, 1995 에 기재됨)에 도입하였다.

EcoRI 제한효소로 소화후에 알칼리 포스파타제로 처리한 벡터 pTG10013을 미리 효소 EcoRI 으로 소화시킨 단계 1에서 제조된 벡터 pTG10210 에 결찰시켰다. 이렇게 수득된 벡터 pTG10214 는 2μ 레플리콘 방향 쪽에 프로모터 GAL10/CYC1을 함유하는 발현 블록을 함유한다.

단계 3: 플라스미드 pTG10274 의 구축

플라스미드 pTG10214 에서, 프로모터 GAL10/CYC1 을 제한 효소 ClaI 및 SalI 으로 처리하여 플라스미드를 절제한 후 동종 재조합함으로써 프로모터 CYC1 과 바꾸었다. 프로모터 CYC1을 함유하는 발현 벡터 pTG10031 (E.Degryse 등(1995) 에 의해 기재됨)을 제한 효소 HindIII 및 FspI 으로 소화시킨 다음, 단계 2에서 제조되고 제한 효소 ClaI 및 SalI 으로 미리 소화시킨 플라스미드 pTG10214 와 재조합하여 플라스미드 pTG10274 (도 16)를 생성하였다.

단계 4: 플라스미드 pTG10401 의 구축

프로모터 CYC1을 함유하는 플라스미드 pTG10274 및 프로모터 TEF1 의 제어하에서 치토크롬 P₄₅₀17α를 코딩하는 서열을 함유하는 플라스미드 pTG10293 으로부터 출발하여, 동종 재조합에 의해, 프로모터 TEF1의 제어하에서 치토크롬 P₄₅₀17α를 코딩하는 서열을 함유하는 새로운 플라스미드 pTG10401을 생성하였다.

단계 3 에서 제조된 플라스미드 pTG10274를 제한 효소 MluI 및 DraI 으로 소화시킴으로써 이로부터 프로모터 CYC1 및 E.coli 의 레플리콘의 일부를 절제하였다. 실시예 5에서 제조된 플라스미드 pTG10293 을 제한 효소 HindIII 및 PvuII 로 소화시킨 다음, 제한효소 MluI 및 DraI 으로 소화시킨 플라스미드 pTG10274 와 재조합하여 플라스미드 pTG10401을 생성하였다 (도 17).

단계 5: 플라스미드 pTG10403 의 구축

II 형 인간 3β-HSD를 코딩하는 cDNA를 프로모터 CYC1 의 제어하에 플라스미드 pTG10401 에 도입하였다.

먼저, 도 18 에 나타낸 도식에 따라서, 실시예 3에서 제조된 전달 벡터 pTG10095 및, 효모 레플리콘 2μ, E.coli 로부터의 레플리콘, 효모 CYC1 _prom -PGK _term 의 발현 카세트 및 URA3-d 선택 마커를 함유하는 재조합 벡터 pTG10257 로부터 출발하여, II 형 인간 3β-HSD를 코딩하는 cDNA를 함유하는 발현 벡터 pTG10262를 구축하였다. 이 벡터 pTG10257 은, 2μ 레플리콘 영역에 함유된 부위 XbaI이 자연 부위 XbaI을 클레노우 단편으로 채운다음 재결찰시킴으로써 수득되는 마커 XbaI°로 치환된 것 이외에는, E.Degryse 등 (1995) 에 의해 기재된 재조합 벡터 pTG10042 와 동일하다.

II 형 인간 3β-HSD 의 발현 블록을 제한 효소 NotI 으로의 소화에 의해 전달 벡터 pTG10095 로부터 절제한 다음, 제한 효소 SalI 및 MluI 으로 미리 소화시킨 재조합 벡터 pTG10257 에 도입하여, 발현 벡터 pTG10262를 생성하였다 (도 19). 프로모터 CYC1을 함유하는 재조합 벡터 pTG10257 내에 플라스미드 pTG10095 로부터 유래한 블록 GAL10/CYC1-cDNA 을 재조합하면, 블록 CYC1-cDNA을 함유하는 발현 블록을 생성됨을 주목해야 한다.

두 번째로, 상기 제조된 발현 벡터 pTG10262를 제한효소 XmnI 으로 소화시켰다. 3β-HSD를 코딩하는 cDNA를 함유하는 수득된 단편을, 단계 4에서 제조되고, 제한효소 ScalI 으로의 소화에 의해 수득된 치토크롬 P₄₅₀17α를 코딩하는 cDNA를 함유하는 플라스미드 pTG10401 의 단편과 재조합하였다. 이렇게 수득된 플라스미드 pTG10403 (도 20) 은 두 개의 발현 블록, 즉 프로모터 CYC1 의 제어하에서 3β-HSDH를 코딩하는 것과 프로모터 TEF1의 제어하에서 치토크롬 P₄₅₀17α를 코딩하는 것을 함유한다.

단계 6: 플라스미드 pTG10417 의 구축

마지막으로, 상기 플라스미드 pTG10403에서, 프로모터 TEF1을 프로모터 CYC1 으로 바꾸었다.

한편으로는, 실시예 5 에 기재된 플라스미드 pTG10058을 제한효소 PvuII 으로 소화시켰으며, 이에 의해 E.coli 의 대부분의 레플리콘 뿐만 아니라 프로모터 CYC1 과 결합된 치토크롬 P₄₅₀17α를 코딩하는 서열의 일부가 방출될 수 있다. 다른 한편으로는, 제한 효소 DraI 으로의 소화에 의해 단계 5에서 제조된 플라스미드 pTG10403 으로부터 E.coli 의 레플리콘의 일부를 제거하였다. 이러한 방법으로 미리 소화시킨 두 개의 플라스미드의 재조합에 의해, 플라스미드 pTG10417 이 최종적 으로 수득된다. 플라스미드 pTG10417 은 효모 레플리콘 2μ, URA3-d 선택 마커 및 두 개의 발현 블록, 즉 효모 프로모터 CYC1 의 제어하에서 인간 3β-HSD을 코딩하는 것과 소 유래의 치토크롬 P₄₅₀17α을 코딩하는 것을 함유한다 (도 21).

이어서, 플라스미드 pTG10417을 각각 친주 FY1679 또는 실시예 4에서 제조된 주 TGY186 (atf2-Δ::TEF1 _prom /PGK _term ) 에 형질전환시켰다. 형질전환체를 트립토판, 히스티딘 및 류신 (각각 100 ㎍/ml) 으로 강화되고 0.5% 글루코스를 함유하는 한천-처리된 YNB 배지 (Difco) 상에서 단리하였다. 이렇게 수득된 콜로니를 0.5% 글루코스 및 0.1% 카사미노산을 함유하는 YNB 배지 (Difco)에서 28 ℃에서 24 시간동안 전배양한 다음, A600 = 0.1 까지 희석하고, 동일한 새로운 배지 (배지 1)에 또는 0.1% 글루콜, 2% 글리세롤 및 0.2% 카사미노산을 함유하는 YNB 배지 (Difco) (배지 2)에 100 ㎍/ml으로 프레그네놀론을 보충하였다. 48 시간의 생육 및 생체전환후에, 스테로이드를 추출하고, 프레그네놀론, 17α-히드록시프레그네놀론, 프로게스테론 및 17α-히드록시프로게스테론의 표준을 사용하여 실시예 1 에 나타낸 것과 같이 RP-HPLC 에 의해 측정하였다.

수득된 결과 (㎍/ml 으로 표시)를 하기 표 5 (배지 1) 및 표 6 (배지 2)에 나타낸다:

주	FY1679/pTG10417	TGY186/pTG10417
프레그네놀론	0	58.1
프레그네놀론 아세테이트	87.3	0
17α-히드록시프레그네놀론	0	3.1
17α-히드록시프레그네놀론 아세테이트	0	0
프로게스테론	10.6	1.4
17α-히드록시프로게스테론	1.3	23.4

주	FY1679/pTG10417	TGY186/pTG10417
프레그네놀론	0	54.0
프레그네놀론 아세테이트	52.1	0
17α-히드록시프레그네놀론	0	3.4
17α-히드록시프레그네놀론 아세테이트	12.8	0
프로게스테론	0	1.4
17α-히드록시프로게스테론	8.6	31.4

이 결과들은, 플라스미드 pTG10417 에 의해 형질전환된 야생형 주 (FY) 에서의 생체전환이, 효소 3β-HSDH 또는 P₄₅₀17α 에 의해서는 연속적으로 형질전환되지 않는 프레그네놀론 아세테이트 및 17α-히드록시프레그네놀론 아세테이트를 축적할 수 있음을 나타내고, 또한 생체전환 밸런스가 형질전환된 atf2 변이주 (TGY186)에서 관찰되는 것보다 낮음을 나타낸다.

형질전환된 주 TGY186/pTG10417의 시료는 프랑스공화국 75724 파리 세덱스 15 뤼 뒤 독뙤르 루 25 에 위치한 Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) INSTITUT PASTEUR 에 1999 년 1 월 20 일에 수탁번호 I-2118 로 기탁되었다.

서지적 참고문헌

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Claims

에스. 세레비지애 (S. cerevisiae)의 ATF2 유전자를 변경시킴으로써 아세틸-CoA 프레그네놀론 아세틸트랜스퍼라제 (APAT) 활성을 제거한 변형 효모 주.
삭제
삭제
제1항에 있어서, ATF2 유전자가 하나 이상의 뉴클레오티드를 갖는 DNA 서열의 삽입에 의해 변경되는 것인 효모 주.
제4항에 있어서, ATF2 유전자가 URA3 선별 유전자, 또는 TEF1 프로모터 및 PGK 터미네이터로 구성되는 발현 블록의 삽입에 의해 변경되는 것인 효모 주.
제5항에 있어서, ATF2 유전자가 URA3 선별 유전자의 삽입에 의해 변경되는 것인 효모 주.
제6항에 있어서, TGY156(CNCM 수탁번호 I-1977) 또는 TGY158(CNCM 수탁번호 I-1976)로 기탁된 변형된 에스.세레비지애 주.
제5항에 있어서, ATF2 유전자가 TEF1 프로모터 및 PGK 터미네이터로 구성되는 발현 블록의 삽입에 의해 변경된 것인 효모 주.
삭제
에스. 세레비지애 (S. cerevisiae)의 ATF2 유전자의 변경에 의해 아세틸-CoA 프레그네놀론 아세틸트랜스퍼라제 (APAT) 활성이 제거되고, 콜레스테롤로부터 출발하는 하이드로코르티존의 생합성 경로에서

- 콜레스테롤 측쇄 절단 효소 (P₄₅₀SCC),

- 3β-히드록시-델타⁵-스테로이드 데히드로게나제/델타⁵-델타⁴-스테로이드 이소머라제 (3β-HSD) 및

- 17α-스테로이드 히드록실라제 (P₄₅₀17α)

중에서 선택되는 하나 이상의 효소를 발현하는 형질전환된 효모 주.
삭제
삭제
제10항에 있어서, ATF2 유전자가 하나 이상의 뉴클레오티드를 갖는 DNA 서열의 삽입에 의해 변경되는 것인 형질전환된 효모 주.
제10항에 있어서, ATF2 유전자가 URA3 선별 유전자의 삽입에 의해 변경되는 것인 형질전환된 효모 주.
제14항에 있어서, 3β-HSD 를 발현하는 형질전환된 효모 주.
제15항에 있어서, TGY158/pTG10862(CNCM 수탁번호 I-1978)로 기탁된 형질전환된 에스.세레비지애주.
제10항에 있어서, ATF2 유전자가 TEF1 프로모터 및 PGK 터미네이터로 구성되는 발현 블록의 삽입에 의해 변경되는 것인 형질전환된 효모 주.
제17항에 있어서, P₄₅₀17α를 발현하는 형질전환된 효모 주.
제18항에 있어서, TGY186/pTG10435(CNCM 수탁번호 I-2119)로 기탁된 형질전환된 에스. 세레비지애주.
제17항에 있어서, 3β-HSD 및 P₄₅₀17α를 동시발현하는 형질전환된 효모 주.
제20항에 있어서, TGY186/pTG10417(CNCM 수탁번호 I-2118)로 기탁된 형질전환된 에스. 세레비지애주.
제10항 및 제13항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 형질전환된 효모 주를 사용하고, 이 주가 내인성 스테롤을 생성할 경우 이를 단독 배양하거나, 또는 외인성 스테롤 또는 스테로이드와 함께 배양하고, 필요에 따라 수득된 산화 화합물을 단리하는 것으로 이루어지는, 내인성 스테롤, 외인성 스테롤 또는 외인성 스테로이드 중에서 선택된 기질의 생체내 산화 방법.
제22항에 있어서, 기질이 3β-히드록시스테로이드이고, 제15항에 따른 형질전환된 효모 주가 사용되며, 필요에 따라 수득된 3-옥소-델타⁴-스테로이드를 단리하는 생체내 산화 방법.
제23항에 있어서, 3β-히드록시스테로이드가 프레그네놀론 또는 17α-히드록시프레그네놀론에서 선택되는 것인 생체내 산화 방법.
제22항에 있어서, 기질이 스테로이드이고, 제18항에 따른 형질전환된 효모 주가 사용되며, 필요에 따라 수득된 17α-히드록실 스테로이드를 단리하는 생체내 산화 방법.
제25항에 있어서, 스테로이드 기질이 프레그네놀론 또는 프로게스테론인 생체내 산화 방법.
제22항에 있어서, 기질이 3β-히드록시스테로이드이고, 제20항에 따른 형질전환된 효모 주가 사용되며, 필요에 따라 수득된 17α-히드록실 3-옥소-델타⁴-스테로이드를 단리하는 생체내 산화 방법.
제27항에 있어서, 스테로이드 기질이 프레그네놀론인 생체내 산화 방법.