EA004629B1

EA004629B1 - ШТАММЫ ДРОЖЖЕЙ, ЛИШЕННЫЕ АЦЕТИЛ-СоА-ПРЕГНЕНОЛОН-АЦЕТИЛТРАНСФЕРАЗНОЙ АКТИВНОСТИ, И СПОСОБЫ ОКИСЛЕНИЯ СТЕРИНОВ И СТЕРОИДОВ ПРИ ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИИ

Info

Publication number: EA004629B1
Application number: EA199900903A
Authority: EA
Inventors: Тильман Ахштеттер; Жилль Коэ; Эрик Дегриз
Original assignee: Хехст Марион Руссель
Priority date: 1998-02-05
Filing date: 1999-02-04
Publication date: 2004-06-24
Also published as: DK0977868T3; ID22741A; IL132151A; JP2001524838A; ZA99676B; US6218139B1; HU226657B1; ATE271610T1; ES2221353T3; BR9904771A; JP4443636B2; UA72438C2; US20010012630A1; SK286279B6; KR100599346B1; PT977868E; WO1999040203A1; AR015225A1; ME00670B; HUP0002858A3

Abstract

Объектом изобретения является штамм дрожжей, лишенный ацетил-СоА-прегненолон-ацетилтрансферазной активности (АРАТ) за счет модификации гена ATF2 или YGR 177с, или его гомолога, что приводит к стабилизации 3β-гидроксистероидов. Также объектом изобретения является способ окисления in vivo субстрата, выбранного из эндогенного стерина, экзогенного стерина и экзогенного стероида, в котором используют штамм дрожжей согласно изобретению.

Description

Образование 3-оксо-дельта⁴-стероидов из 3в-гидрокси-делыа⁵-предшественников в биосинтезе всех классов стероидных гормонов у млекопитающих катализируется ферментативной системой 3в-гидрокси-дельта⁵-стероиддегидрогеназа (ЕС 1.1.1.145) и дельта⁵-дельта⁴стероид-изомераза (ЕС 5.3.3.1), называемой 3βΗ8Ό. 3β-Η8Ό катализирует, например, трансформацию прегненолона в прогестерон, 17αгидроксипрегненолона в 17а-гидроксипрогес4 терон, дегидроэпиандростерона в дельта андростендион или 5-андростен-3в-17в-диола в тестостерон (81тагб и др., 1996).

Следовательно, 3β-Η8Ό представляет собой один из ключевых ферментов пути биосинтеза гидрокортизона из холестерина в коре надпочечников млекопитающих (фиг. 1).

Использование рекомбинантных микроорганизмов, в частности, трансформированных дрожжей, позволяющих осуществлять гетерологичную экспрессию одного или нескольких ферментов млекопитающих этого пути биосинтеза для продуцирования гидрокортизона или промежуточных продуктов этого биосинтеза, описывается, например, в заявке на европейский патент 340878, в патенте США 5137822, Цитаз и др., 1994, и Саие! и др., 1994.

В случае экспрессии функциональной системы 3β-Η8Ό в дрожжах, трансформированные клетки дрожжей не превращают полностью 3βгидроксистероиды в соответствующие 3-оксостероиды, например прегненолон в прогестерон, но аккумулируют соединение, обнаруживаемое также в случае клеток нетрансформированных дрожжей. Идентификация аккумулированного соединения со сложным 3β-уксусным эфиром исходного стероида и характеристика фермента, обладающего ацилтрансферазной активностью и ответственного за эту этерификацию (далее обозначается АРАТ: «ацетил-кофермент-Апрегненолонацетилтрансфераза») описываются в настоящей заявке. С другой стороны, аккумуляция прегненолонацетата трансформированным штаммом дрожжей, продуцирующим прегненолон, описывается в заявке на европейский патент 727489. Эти данные позволяют считать, что осуществляемая дрожжами этерификация 3β-гидроксистероидов является нежелательной, так как она ответственна за вторичные реакции и побочные продукты, приводящие к снижению выхода аккумулируемых 3β-гидроксистероидов, например, прегненолона, или к снижению выхода от биоконверсии 3β-гидрокси-дельта⁵стероидов в 3-оксо-дельта⁴-стероиды, особенно при продуцировании прогестерона или 17αгидроксипрогестерона, что приводит к уменьшению дальнейшей продукции гидрокортизона уже описанным путем биосинтеза.

В связи с полученными вышеуказанными результатами, настоящее изобретение относится к конструированию штаммов дрожжей, лишен ных нежелательной активности АРАТ, путем изменения гена, кодирующего эту активность, что приводит к стабилизации 3β-гидроксистероидов в их присутствии. Эти штаммы, следовательно, используются как исходные штаммы для конструирования рекомбинантных штаммов, способных трансформировать 3βгидроксистероиды в последующие продукты с улучшенным выходом.

Изобретение также относится к конструированию штаммов дрожжей, лишенных активности АРАТ, путем изменения гена, кодирующего эту активность, и либо экспрессирующих 3β-Η8Ό или цито-хром Р₄₅₀ 1 7а, либо коэкспрессирующих 3β-Η8Ό и цитохром Р₄₅₀ 1 7а пути биосинтеза гидрокортизона из холестерина. Штаммы, экспрессирующие, например, 3β-Η8Ό, позволяют улучшать выход от биоконверсии 3βгидрокси-дельта⁵-стероидов в 3-оксо-дельта⁴стероиды и, следовательно, используются в усовершенствованных способах получения гидрокортизона или промежуточных продуктов в дрожжах.

Таким образом, объектом настоящего изобретения является модифицированный штамм дрожжей, лишенный ацетил-СоА-прегненолонацетилтрансферазной активности (АРАТ) за счет изменения гена, кодирующего эту активность, что приводит к стабилизации 3βгидроксистероидов.

Изменение кодирующего активность АРАТ гена можно осуществлять, например, путем вставки, делеции или замены последовательности ДНК в функциональных элементах гена, например, промоторе или последовательности, кодирующей протеин с активностью АРАТ. Затем может быть осуществлена интеграция измененной таким образом последовательности ДНК в дрожжевой штамм-хозяин, например, методом гомологичной рекомбинации, что приводит к генерации хромосомных мутантов дрожжей, соответствующих модифицированным штаммам согласно изобретению, в которых исчезновение активности АРАТ и стабилизация 3β-гидроксистероидов выявляются, например, путем культивирования клеток в присутствии прегненолона и определения содержания прегненолона в зависимости от времени согласно рабочим условиям, описанным далее в экспериментальной части.

В качестве используемых согласно изобретению дрожжевых штаммов-хозяев можно, в частности, назвать штаммы 8ассйаготусез, такие как 8.сегеу151ае, штаммы СапбИа, такие как С.таНоза, штаммы К1иууеготусез, такие как, К.1ас115, или штаммы РкЫа, такие как Р.раз1ог1з.

Объектом изобретения в частности является вышеуказанный модифицированный штамм дрожжей, в котором измененным геном является ген АТЕ2 8.сегеу151ае или его гомолог.

Под геном ЛТР2 понимают ген З.есгсуыас. идентифицированный в геноме дрожжей под локусом ЛТР2 или УОЯ177с «базы данных геномов 8ассйатотусе5» (8ΟΌ); (Сйепу и др., 11ир://депоте-\\л\л\·. 51апГогб. еби/ Зассйатотусек/), открытая рамка считывания которого, обозначаемая УСР177с. выражается в виде аминокислотной последовательности в банке данных Μίρκ, находящейся под присвоенным номером по каталогу 864491 (НеЫтд и., НоГтапп В. и Эе1ш8 Н. (май 1996), и последовательность которого представлена на фиг. 4. Этот ген кодирует протеин с активностью АРАТ, как это показано далее в экспериментальной части.

Под геном, гомологичным гену АТР2, понимают ген, который кодирует протеин, обладающий активностью АРАТ и имеющий идентичность последовательности примерно на 60% и более с последовательностью протеина УОЯ177с.

В особенности, объектом изобретения является вышеуказанный модифицированный штамм дрожжей, в котором измененным геном является ген АТР2 8.сегеуыае и который далее называется мутантным штаммом аГ2.

Особенно объектом изобретения является вышеуказанный модифицированный штамм дрожжей, в котором ген АТБ2 изменен путем вставки последовательности ДНК, включающей по крайней мере один нуклеотид.

Последовательность ДНК, которая встроена в ген АТР2 так, чтобы исчезла активность АРАТ, может представлять собой, например, ауксотрофный селекционный ген, дополняющий питательную потребность штамма-хозяина, такой, как ген ИКА3, ген ЬЕи2, ген ТЯР1, ген Н183 или ген АЭЕ2, например, доминантный селекционный ген, такой как ген устойчивости к антибиотику, как 0418, флеомицин или гигромицин В, или, например, репортерный ген, такой как ген ЗОАЕ.

Последовательность ДНК, которую встраивают в ген АТР2, может представлять собой также блок экспрессии дрожжей, образованный промотором и терминальной последовательностью транскрипции, например, промотором дрожжей, таким как РОК, ТЭН3, СУС1 или ТЕБ1, например, терминальной последовательностью дрожжей, такой как СУС1, ТЭН3, ТЕБ1 или РОК. Блок экспрессии может представлять собой сочетание вышеуказанных элементов, например, как блок ТЕБ1_ргот/РОК_1епп.

Объектом изобретения более конкретно является вышеуказанный модифицированный штамм дрожжей, в котором ген АТБ2 изменен путем вставки селекционного гена ИЯА3 или блока экспрессии ТЕБ1_ргот/РОК_1епп.

Объектом изобретения, в частности, является вышеуказанный модифицированный штамм дрожжей, в котором ген АТБ2 изменен путем вставки селекционного гена ИЯА3.

Мутантные штаммы аГ2 согласно изобретению, лишенные активности АРАТ и в которые встроен ген ИЯА3, называемые далее аЯ2-Д:: ИЯА3, также могут быть селекционированы путем прототрофии с урацилом.

В особенности, объектом изобретения являются модифицированные штаммы

8.сетеу151ае, называемые ТОУ156 и ТОУ158, конструкция которых детально приводится далее в экспериментальной части.

Частным объектом изобретения также является вышеуказанный модифицированный штамм дрожжей, в котором ген АТР2 изменен путем вставки блока экспрессии ТЕБ1_ргот/ РОК_1епт Мутантные штаммы а(Г2 согласно изобретению, лишенные активности АРАТ и в которые встроен блок экспрессии ТЕБ1_ргот/ РОК_1епп, называемые далее а1Г2-Д:: ТЕБ1_ргот/ РОК_1епп, могут быть селекционированы в направлении отсутствия функционального гена ИЯА3, замещенного блоком экспрессии, по их устойчивости к 5-фтороротовой кислоте.

В особенности, объектом изобретения является модифицированный штамм 8.сетеущ1ае, называемый ТОУ186, подробное конструирование которого представлено далее в экспериментальной части.

Объектом изобретения также является трансформированный штамм дрожжей, лишенный ацетил-СоА-прегненолонацетилтрансферазной активности (АРАТ) за счет изменения гена, кодирующего эту активность, и экспрессирующий по крайней мере один из ферментов млекопитающих пути биосинтеза гидрокортизона из холестерина, выбираемый среди следующих ферментов:

фермент расщепления боковой цепи холестерина (Р4508СС)

3З-гидрокси-дельта⁵-стероид-дегидрогеназа/дельта⁵-дельта⁴-стероид-изомераза (3 βН8Э); и

17а-стероид-гидроксилаза (Р₄₅₀17а).

Трансформированные штаммы дрожжей согласно изобретению можно получить, например, путем трансформации мутантных штаммов аГ2 согласно изобретению с помощью известных способов, например, путем трансформации с помощью вектора экспрессии Р₄₅₀8СС, а также АЭХ и А ЭЯ вектора экспрессии 3β-Π8Ό или вектора экспрессии Р₄₅₀ 1 7а. Мутантные штаммы а(Г2 также могут быть, в случае необходимости, котрансформированы, например, с помощью вектора экспрессии 3в-Н8Э и вектора экспрессии Р₄₅₀ 1 7а, или могут быть трансформированы с помощью вектора коэкспрессии 3в-Н8Э и Р₄₅₀17а и могут быть использованы, например, в способе биоконверсии прегненолона в 17αгидроксипрогестерон.

Сконструированные векторы экспрессии Р₄₅₀8СС, а также АЭХ и АЭЯ, 3в-Н8Э или Р₄₅₀ 1 7а бычьего или человеческого происхож дения в штаммах дрожжей описываются, например, Эншах и др., 1994, в заявке на европейский патент 340878 или в патенте США 5137822.

Изобретение относится, в частности, к вышеуказанному трансформированному штамму дрожжей, в котором измененным геном является ген АТР2 8.сеге\зх1ае или его гомолог. В особенности объектом изобретения является вышеуказанный трансформированный штамм дрожжей, в котором измененный ген представляет собой ген АТР2 8.сеге\зх1ае и который соответствует трансформированному штамму а!12.

В особенности, объектом изобретения является вышеуказанный трансформированный штамм дрожжей, в котором ген АТР2 изменен за счет вставки последовательности ДНК, включающей по крайней мере один нуклеотид, и, конкретно, объектом является трансформированный штамм дрожжей, в котором ген АТР2 изменен за счет вставки селекционного гена ИВА3 и который соответствует трансформированному штамму а1Г2-Д::иКА3.

Изменение гена с целью ликвидации активности АРАТ, ген АТР2 или его гомолог, а также штаммы-хозяева имеют вышеуказанные значения.

Изобретение преимущественно относится к вышеуказанному трансформированному штамму дрожжей а1Г2-А::иКА3. экспрессирующему 3β-Η8Ό, и в особенности к трансформированному штамму З.сетеуШае, называемому ТС¥158/рТС10862, подробное конструирование которого описывается далее в экспериментальной части.

Объектом изобретения также в особенности является вышеуказанный трансформированный штамм дрожжей, в котором ген АТР2 изменен за счет вставки блока экспрессии ТЕР1_ргот/РОК_1егт и который соответствует трансформированному штамму а1Г2-Д:: ТЕР1р_Гот/ РОКепп..

Изобретение также преимущественно относится к вышеуказанному трансформированному штамму а1Г2-Д:: ТЕР1_ргот/РОК_1епп, экспрессирующему Р₄₅₀ 1 7а, в особенности к трансформированному штамму З.сетеуШае, называемому ТОУ186/рТО10435.

Изобретение относится в частности к вышеуказанному трансформированному штамму дрожжей а1Г2-Д:: ТЕР1_ргот/РОК_1егт, коэкспрессирующему 3β-Η8Ό и Р₄₅₀17а, и преимущественно к трансформированному штамму З.сегеуШае, называемому ТОУ186/рТО10417.

Объектом изобретения также является способ окисления ин виво субстрата, выбираемого среди эндогенного стерина, экзогенного стерина или экзогенного стероида, согласно которому используют вышеуказанный трансформированный штамм дрожжей, который либо культивируют индивидуально, когда штамм генерирует эндогенный стерин, либо инкубируют с экзогенным стерином или стероидом, и, в случае необходимости, выделяют полученное окисленное соединение.

Под эндогенным стерином понимают стерин, аккумулируемый в штамме дрожжей и который представляет собой субстрат фермента расщепления боковой цепи (Р₄₅₀8СС), когда дрожжи, после трансформации, например, с помощью вектора экспрессии Р₄₅₀8СС, АЭХ и АИВ, культивируют в отсутствие экзогенного стерина. Эндогенными стеринами, используемыми для осуществления способа согласно изобретению, могут быть, например, эргоста-5-ен3-ол, эргоста-5,24 (28)-диен-3-ол или эргоста5,22-диен-3-ол. В заявке на европейский патент 727489 описывается аккумуляция таких стеролов в штамме дрожжей и расщепление их боковой цепи в культуре штамма после трансформации с помощью вектора экспрессии Р₄₅₀8СС, АЭХ и АИВ. Такой штамм дрожжей, который также обладает активностью АРАТ, может быть предварительно модифицирован для получения мутантного штамма а1Г2 согласно изобретению, затем его можно трансформировать с помощью вектора экспрессии Р₄₅₀8СС, АЭХ и АЭВ для получения трансформированного мутантного штамма аЙ2 согласно изобретению.

Под экзогенным стерином понимают стерин, который представляет собой субстрат фермента расщепления Р₄₅₀8СС, получаемый путем инкубации со штаммом дрожжей, трансформированным с помощью вектора экспрессии Р₄₅₀8СС, АЭХ и АИВ, например, холестерин или ситостерин. Таким штаммом может быть, например, мутантный штамм а1Г2, трансформированный с помощью вектора экспрессии Р₄₅₀8СС, АЭХ и АИВ.

3в-Гидроксистероид, полученный путем расщепления боковой цепи эндогенного или экзогенного стерина, используемого в качестве субстрата, находится полностью в свободной форме, то есть не сопровождается соответствующим сложным 3 β-уксусным эфиром, в культурах трансформированных штаммов аЙ2, экспрессирующих Р₄₅₀8СС, АЭХ и АИВ.

Под стероидом понимают стероид, который представляет собой субстрат фермента 3βΗ8Ό при инкубации со штаммом дрожжей, трансформированным, например, с помощью вектора экспрессии 3β-Η8Ό, как прегненолон, 17а-гидроксипрегненолон или дегидроэпиандростерон, или стероид, который представляет собой субстрат фермента Р₄₅₀17а при инкубации со штаммом дрожжей, трансформированным, например, с помощью вектора экспрессии Р₄₅₀ 1 7а, как прогестерон или прегненолон. Таким штаммом может быть, например, мутантный штамм аЙ2, трансформированный с помощью вектора экспрессии 3β-Η8Ό или с помо щью вектора экспрессии Р₄₅₀17а согласно изобретению.

Объектом изобретения в особенности является вышеуказанный способ окисления ин виво, согласно которому субстратом является ββ-гидроксистероид и в котором используют трансформированный штамм дрожжей а1Г2-А:: иВЛЗ, экспрессирующий 3β-Η8Ό, и в случае необходимости, выделяют полученный 3-оксодельта⁴-стероид, и особенно объектом изобретения является способ, согласно которому 3βгидроксистероид выбирают из прегненолона или 17а-гидроксипрегненолона.

Используемый в качестве субстрата 3βгидроксистероид является стабильным, когда его инкубируют со штаммом акГ2-Д::иК.Л3 согласно изобретению, трансформированным с помощью вектора экспрессии 3β-Η8Ό.

Таким образом, изобретение относится к улучшенному способу получения 3-оксо4 дельта -стероида в дрожжах, поскольку все количество 3в-гидроксисубстрата может быть 4 окислено до 3-оксо-дельта -стероида, как это показано дальше в экспериментальной части.

Также в особенности объектом изобретения является вышеуказанный способ окисления ин виво, согласно которому субстратом является стероид и в котором используют трансформированный штамм дрожжей акГ2-Д:: ТЕТ1_ргот/ РОК_1егт, экспрессирующий Р₄₅₀17а, и, в случае необходимости, выделяют полученный 17αгидроксилированный стероид, и особенно объектом изобретения является способ, согласно которому стероидным субстратом является прегненолон или прогестерон.

Используемый в качестве субстрата прегненолон является стабильным, когда его инкубируют со штаммом а1Г2-А:: ТЕТ1_ргот/РОК_1егт, трансформированным с помощью вектора экспрессии Р₄₅₀ 1 7а.

Следовательно, изобретение также относится к улучшенному способу получения 17αгидроксистероидов из 3в-гидроксистероидов, поскольку все количество 3в-гидроксисубстрата может быть 17а-гидроксилировано.

Также в особенности объектом изобретения является вышеуказанный способ окисления ин виво, согласно которому субстратом является 3в-гидроксистероид и в котором используют трансформированный штамм дрожжей акГ2-Д:: ТЕР1_ргот/РОК_1егт, коэкспрессирующий 3β-Η8Ό и Р₄₅₀ 1 7а, и, в случае необходимости, выделяют полученный 17а-гидроксилированный 3-оксодельта⁴-стероид. Особенно объектом изобретения является вышеуказанный способ, согласно которому субстратом является прегненолон.

Трансформированные мутантные штаммы дрожжей а(Г2 и способ согласно изобретению позволяют предусматривать их предпочтительное использование для улучшенного продуци рования гидрокортизона или его промежуточных продуктов в дрожжах.

Примеры конструирования штаммов согласно изобретению и осуществление предлагаемого в изобретении способа описываются далее в экспериментальной части.

Материалы и общие методы

1. Штаммы и среды.

Штаммы 8. еетеу151ае, используемые для осуществления изобретения, представляют собой штамм ТОУ73.4 (МАТа, иЯЛ3-Л5. рга-1-1, ргЬ-1-1, ргс1-1, ср§1-3, Ы§), изогенный производный Ьеи⁺ С13ЛБ¥886, описанный Лсйбейет и др., 1992, и штамм Ту1679 (МАТа, иКА3-52, 1тр1-Д63, 1еи2-Д1, Ы§3-Д200, Геп 1, ОЛЬ), описанный ТЫетгу и др., 1990. Культивирование штаммов осуществляют в полной среде УРИ (И|Гсо ЬаЬотакпек), содержащей 2% глюкозы, при температуре 28°С, согласно условиям, описанным Р.8йеттап, 1991.

Для трансформации 8.сетеу1бае, клеткам придают компетентность по способу с использованием ацетата лития (Йо и др., 1983). Дрожжи обычно культивируют в минимальной синтетической среде 8И, содержащей 2 % глюкозы (Р.8йеттап, 1991) с добавкой необходимых питательных веществ в концентрации 100 мкг/мл.

Штамм Е.сой В65183 (И.Напайап, 1983) используют для рекомбинации ин виво и штамм Е.сой С600, йкбК. (НиЬасек и др., 1970) используют в качестве штамма-реципиента для классических реакций лигирования.

2. Манипулирование с ДНК и рекомбинация ин виво в Е.сой.

Используемые общие методы молекулярной биологии описываются 8атЬгоок и др., 1989. Метод рекомбинации ин виво описывается Е.Иедтуке, 1995, и Е.Иедтуке, 1996.

3. Тестирование ферментной активности АРАТ.

Ацетилтрансферазную активность АРАТ устанавливают путем определения включения [³Н]-ацетата в прегненолон из [³Н]-ацетил-СоА (Иете ЕпДапб Иис1еаг). Реакционная среда (500 мкл) содержит [³Н]-ацетил-СоА (20 ммоль; 25 Ки/моль) и прегненолон (30 ммоль; 8щта). Прегненолон добавляют в виде раствора в 2 мкл смеси тилоксапола (81дта) с этанолом в соотношении 1:1 в буфер на основе фосфата калия (20 мкмоль) с рН = 7,0. После инкубации в течение 15 мин при температуре 30°С реакцию прекращают путем добавления 2 мл дихлорметана.

Стероиды экстрагируют дихлорметаном, затем разделяют путем высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенной фазой (далее называется ВЭЖХ с обращенной фазой) в изократических условиях элюирования с помощью ацетонитрила при использовании колонки ИЙтакрйете ОИ8 (Весктап) при температуре 45°С на хроматографе НР 1090 (НеМей Раскатб), который соединен с радиодетектором

ЕЬО-Опе 500 (Раскатб), который позволяет определять количество образовавшегося [³Н]ацетата прегненолона.

Единицу АРАТ определяют как количество фермента, которое продуцирует 1 нмоль ацетата прегненолона в минуту при температуре 30°С в вышеуказанных условиях.

4. Определение концентрации протеина.

Концентрацию протеина определяют путем использования набора «набор для количественного анализа протеина» (Βίο-Каб) с бычьим сывороточным альбумином в качестве стандарта.

На прилагаемых к данному описанию фигурах иллюстрируются некоторые аспекты изобретения.

На фиг. 1 представлен путь биосинтеза гидрокортизона из холестерина у млекопитающих.

Фиг. 2А и 2В иллюстрируют биоконверсию прегненолона в ацетат прегненолона в З.сегеуыае. Анализ осуществляется путем высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенной фазой при 205 нм:

На фиг. 2А представлена кинетика образования ацетата прегненолона и исчезновение прегненолона в отдельные интервалы времени в течение 12 ч инкубации.

На фиг. 2В представлен профиль стероидов во время 0 (1 = 0) и 10 ч (1 = 10 ч) по отношению к профилю стандартов прегненолона и ацетата прегненолона.

Фиг. 3 иллюстрирует очистку АРАТ путем хроматографии на МопоР НК 5/20: на (А) представлен профиль активности АРАТ, имеющейся во фракциях 10-20; на (В) представлен анализ путем электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия очищенных и концентрированных фракций 14, 15 и 16 путем окрашивания с помощью кумасси-голубого (линия 2) в присутствии маркеров молекулярной массы (линия 1). Стрелка указывает на полосу с кажущейся молекулярной массой 62 кДа.

На фиг. 4 представлена аминокислотная последовательность в виде рамки считывания протеина УОК177с. Секвенированные пептиды из очищенного и гидролизованного трипсином протеина АРАТ подчеркнуты.

На фиг. 5 представлена стратегия прерывания гена АТР2 путем ассоциации с геном иКАЗ согласно методу двойного слияния полимеразной цепной реакции (ПЦР). Пустые бруски и заполненные бруски означают, соответственно, последовательности АТР2 и ИКАЗ.

Фиг. 6 иллюстрирует влияние прерывания гена АТЕ2 в З.сегеуыае на ацетилирование прегненолона. Присутствие прегненолонацетата выявляется с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенной фазой при 205 нм из шестнадцатичасовых культур родительского штамма ТОУ73,4 (А) или мутантного штамма ТОУ158(В).

На фиг. 7А, 7В и 7С представлена схема конструирования плазмид экспрессии человеческого 3β-ΗδΌ в дрожжах рТО10832 и рТО10862. На фиг. 7А описывается получение фрагмента М5с1-М1и1, содержащего последовательность, кодирующую человеческий 3β-ΗδΌ. На фиг. 7В представлено получение фрагмента ΝοΐΙ, содержащего блок экспрессии ΟΥΟ1_ρ/3βН8И/РОК₁. На фиг. 7С описывается получение плазмиды рТО10832 и плазмиды рТО10862.

На фиг. 8 представлена рестрикционная карта плазмиды РТО10832.

На фиг. 9 представлена рестрикционная карта плазмиды РТО10862.

На фиг. 10 представлена схема конструирования плазмиды экспрессии рТО10435.

На фиг. 11 представлена схема конструирования плазмиды РТС10058.

На фиг. 12 представлена рестрикционная карта плазмиды РТ610058.

На фиг. 13 представлена рестрикционная карта плазмиды РТО10293.

На фиг. 14 представлена рестрикционная карта плазмиды РТО10435.

На фиг. 15А и 15В представлена схема конструирования плазмиды рТО10274: на фиг. 15А описывается получение плазмиды рТО10214; на фиг. 15В описывается получение плазмиды РТО10274.

На фиг. 16 представлена рестрикционная карта плазмиды РТО10274.

На фиг. 17 представлена рестрикционная карта плазмиды РТС10401.

На фиг. 18 представлена схема конструирования вектора экспрессии рТО10262.

На фиг. 19 представлена рестрикционная карта плазмиды РТО10262.

На фиг. 20 представлена рестрикционная карта плазмиды РТ610403.

На фиг. 21 представлена рестрикционная карта плазмиды РТО10417.

(Аббревиатуры рестрикционных ферментов: δ = 8а11; Ν=ΝοίΙ; ВП=В§Ш; М = М1и1; С=С1а1; №=без сайта ΝοοΙ; ХЬа1°=без сайта ХЬа1/ Е=ЕсоК1).

Пример 1. Идентификация активности АРАТ дрожжей.

А-Ацетилирование ин виво прегненолона с помощью дрожжей.

Штамм ΤΟΥ73.4 культивируют при температуре 28°С в 10 мл среды ΥΡ^ (ИКсо), инокулированной из расчета А600=0,1, исходя из двадцатичетырехчасовой исходной культуры, и в которые добавляют 100 мкл раствора прегненолона с концентрацией 10 мг/мл в смеси тергитола (8щша) с этанолом в соотношении 1:1. Образовавшиеся стероиды идентифицируют при использовании аликвот объемом 250 мкл бульона, отобранных в различные интервалы времени в течение 10 ч. После экстракции с помощью 2 мл дихлорметана органические фазы выпаривают в атмосфере азота, затем полученные остатки снова растворяют в ацетонитриле. Стероиды анализируют с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой на колонке Ы-йакрИеге ΘΌ8 (Весктап), используя последовательно в качестве элюирующего средства: 60%-ный раствор ацетонитрила в воде в течение 10 мин, затем 60-80%-ный раствор ацетонитрила в воде в течение 5 мин, после этого 80%-ный раствор ацетонитрила в воде в течение 5 мин, с расходом 1 мл/мин, при температуре 45°С и с детекцией при 205 нм.

Полученные хроматограммы (фиг. 2В) показывают, что прегненолон метаболизирован в более аполярный продукт, который имеет время удерживания, идентичное таковому стандартного прегненолонацетата. На фиг. 2А показано, что прегненолон быстро превращается дрожжами в его метаболит.

После щелочной обработки (6%-ный раствор КОН в метаноле) обнаруженный метаболит высвобождает продукт с временем удерживания, идентичным таковому прегненолона. Идентификацию метаболита с прегненолонацетатом затем подтверждают методом массспектрометрии.

Б - Очистка фермента, обладающего активностью АРАТ.

Штамм ΤΟΥ73.4 культивируют в ферментере емкостью 10 л в среде Кэппели (НесЫег и др., 1981), дополненной глюкозой в количестве 160 г/л, при температуре 30°С вплоть до А600=30. Клетки отделяют путем центрифугирования, промывают водой, затем снова суспендируют в 4 л буфера на основе 20 ммоль ТрисНС1, рН =8,0, при температуре 4°С (буфер А), содержащего 1 ммоль фенилметилсульфонилфторида. Клетки подвергают дроблению в гомогенизаторе МаШоп Саи1ш под давлением 69 бар. Полученный клеточный лизат центрифугируют с ускорением 12000 д в течение 15 мин при температуре 4°С, затем к супернатанту добавляют хлорид цинка до конечной концентрации 40 ммоль. Значение рН доводят до 5,5 с помощью 1 н. соляной кислоты и преципитацию осуществляют в течение 30 мин при температуре 4°С. После центрифугирования с ускорением 10000 д в течение 10 мин при температуре 4°С, выделенный преципитат снова суспендируют в 3 л буфера А, содержащего 100 ммоль этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТУ) и 1 ммоль фенилметилсульфонилфторида. После удаления ЭДТУ путем диафильтрации через фильтрующий элемент Υ10810 (Атюоп) против 30 л буфера А, ретентат загружают со скоростью 35 мл/мин и при температуре 4°С в колонку объемом 1,5 л с диэтиламиноэтилсефацелем (Рйаттас1а), предварительно уравновешенную буфером А. После промывки колонки буфером А, затем буфером А, содержащим 0,15 моль хлорида натрия, фермент с активностью АРАТ элюируют с помощью буфера А, содержащего 0,4 моль хлорида натрия. Фракции диэтилами ноэтилсефацеля, содержащие фермент с активностью АРАТ, которую определяют как указано выше в разделе «Материалы и общие методы», объединяют, дополняют хлоридом натрия до конечной концентрации 2 моль, затем со скоростью 15 мл/мин и при температуре 4°С загружают в колонку объемом 500 мл с фенилсефарозой (Рйаттааа), предварительно уравновешенную буфером А, содержащим 2 моль хлорида натрия. После промывки колонки с помощью буфера А, содержащего 0,5 моль хлорида натрия, фермент с активностью АРАТ элюируют с помощью 1,5 л линейного градиента холята натрия, изменяющегося от 0 до 1%, в буфере А. Фракции, содержащие фермент с активностью АРАТ, объединяют, затем концентрируют путем ультрафильтрации через мембрану ΥΜ10 (Ат1соп), затем хранят при температуре -80°С вплоть до использования.

Всю совокупность операций способа повторяют один раз, чтобы получить материал в количестве, достаточном для продолжения очистки.

Очищенный материал из двух вышеуказанных приготовлений размораживают, затем со скоростью 4 мл/мин и при температуре 4°С загружают в колонку объемом 100 мл с Рсефарозой Ра§1 Ε1ο\ν (Рйаттааа), предварительно уравновешенную буфером А. После промывки колонки тем же самым буфером, фермент с активностью АРАТ элюируют с помощью 500 мл линейного градиента хлорида натрия, изменяющегося от 0 до 1 моль, в том же самом буфере. Фракции О-сефарозы. содержащие фермент с активностью АРАТ, объединяют, затем со скоростью 2,5 мл/мин и при температуре 4°С загружают непосредственно в колонку объемом 7 мл с холятом натрия, иммобилизированным на шариках сефарозы (Рйатташа), предварительно уравновешенной буфером А, содержащим 0,5 моль хлорида натрия. После промывки колонки тем же самым буфером, фермент с активностью АРАТ элюируют с помощью 100 мл линейного градиента холята натрия, изменяющегося от 0 до 1%, в том же самом буфере. Фракции, содержащие фермент с активностью АРАТ, объединяют, концентрируют путем ультрафильтрации через мембрану ΥΜ10 (Атюоп) вплоть до концентрации протеина 1,8 мг/мл, затем хранят при температуре -80°С.

Фермент, обладающий активностью АРАТ, таким образом очищают примерно 500 раз на основании удельной активности и с выходом около 16%, как показано в следующей таблице 1:

Таблица 1

Стадия	Активн. АРАТ ^(ед.⁾	Протеин ^(мг)	Уд. активы. (ед./мг)	Очи- стка	Выход
Супернатант, 12000 д	8057	42242	0,19	1	100
Преципитация с цинком	10453	28040	0,37	1,9	129

ДЭАЭ-сефацель	6399	5009	1,28	6,7	79
Фенилсефароза	3316	489	6,78	35,7	41
0-сефароза	1712	39	43,9	231	21
Холят-сефароза	1300	13	100	526	16

(где ДЭАЭ означает диэтиламиноэтил)

Половину вышеполученного полуочищенного материала (около 6 мг протеина) затем размораживают, после чего добавляют ПЭГ 4000 (Рго1аЬо) до конечной концентрации 20% (масса/объем) для удаления холята и хлорида натрия. После перемешивания в течение 30 мин при температуре 4°С преципитат собирают путем центрифугирования с ускорением 12000 д в течение 30 мин при температуре 4°С, затем снова растворяют в 4 мл буфера А. Таким образом полученный раствор затем со скоростью 1 мл/мин загружают в колонку МопоР НК.5/20 (Рйагтас1а), предварительно уравновешенную 25 мМ бис-Трис-буфером, рН = 6,3. Фермент с активностью АРАТ элюируют с помощью буфера Ро1уЬиГГсг 74, рН = 4,0 (Рйагтас1а). Фракции по 1 мл собирают, каждую, в присутствии 50 мкл 2М буфера Трис-НС1, рН = 8,0, чтобы ограничить инактивацию фермента при кислом значении рН. Фракции 14, 15 и 16 (фиг. 3(А)), содержащие фермент с более высокой активностью АРАТ, которую определяют как указано выше, объединяют, концентрируют путем ультрафильтрации через мембрану ΥΜ10, затем хранят при температуре -80°С до использования. Полученную таким образом активную фракцию подвергают электрофорезу в 10%-ном полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия. Несколько полос обнаруживают путем окрашивания кумасси-голубым с преобладающей полосой кажущейся молекулярной массы 62 кДа (фиг. 3(В)), которая идентична молекулярной массе, определенной путем фильтрации через гель Бнрего^е 6 (Рйагтас1а) и соответствующей ферменту с активностью АРАТ.

В-Свойства АРАТ.

а) Специфичность субстрата.

Согласно вышеуказанному методу для ацетил-СоА и прегненолона, используя различные ацильные доноры или различные стероидные субстраты, полуочищенная АРАТ переносит ацетат в 3р-ол, дельта⁴- или дельта⁵стероиды со сравнимой эффективностью, тогда как перенос является незначительным в случае эстрогенов и недектируемым в случае стеролов и с заметным предпочтением для ацетил-СоА в качестве ацильного донора.

В следующей табл. 2, в которой в случае а) опыты осуществляют с 30 мкмоль каждого испытуемого стероида и 100 мкмоль [³Н]-ацетилСоА, а для б) опыты осуществляют со 100 мкмоль каждого ацильного донора и 30 мкмоль [³Н]-прегненолона, представлены полученные результаты:

Таблица 2

Субстрат а)	Отн. активн. (%)	Субстрат б)	Отн. активн. (%)
Прегненолон	100	Ацетил-СоА	100
17а-ОН- Прегненолон	89	Пропионил-СоА	33
ЭНЕА	104	Бутирил-СоА	16
4-Прегнен-3 рол- 20-он	70	Гексаноил-СоА	18
5р-Прегнан- 3рол-20-он	1.8	Олеоил-СоА	Не детектируется
17р-Эстрадиол	5
Эстрон	2,5
Холестерин	0,6
Эргостерин	0,4

б) Ингибирование.

Активность АРАТ сильно ингибируется реагентами сульфгидрильных групп, такими как Ν-этилмалеимид и 5,5'-дитиобис (2-нитробензойная кислота). Ингибирование является полным в присутствии хлорида цинка (1 ммоль).

Г - Частичная аминокислотная последовательность.

Частичную аминокислотную последовательность определяют после гидролиза трипсином на срезах геля согласно методу, описанному Ко§епГе16 и др. (1992).

Из двух третей концентрата, полученного выше, затем подвергнутого разделению путем электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия, вырезают полосу с молекулярной массой 62 кДа, затем инкубируют с трипсином (Рго те да). Полученные пептиды после этого разделяют путем ВЭЖХ с обращенной фазой на колонке Уубас 218ТР (1.5 х 125 мм) со скоростью 100 мкл/мин, используя линейный градиент ацетонитрила, изменяющийся от 0 до 60% в течение 80 мин, затем от 60 до 100% в течение 20 мин, в 0,1%-ном растворе трифторуксусной кислоты (ТФУК) в воде, затем проводят секвенирование аминокислот.

Ν-Концевую последовательность определяют в секвенаторе протеинов, модель 477А, связанным с ВЭЖХ-анализатором РТНаминокислот (АррНеб Вю5У51ет5).

Из секвенированных образцов, два пика х и у представляют однозначную последовательность, образованную, соответственно, следующими 10 и 16 аминокислотами: для пика х: 18ЕОРККЭЭР; для пика у: Р1ЕР18РУ11РР0\'РК.

Обе таким образом полученные пептидные последовательности используют для «просеивания» базы данных генома Б.сегеуыае. Протеин с молекулярной массой 62 кДа, последовательность которого содержит точные последовательности двух вышеуказанных пептидов, может быть идентифицирован (Μίρκ, номер по каталогу 864491, НеЬйпд и др., май 1996). Этот протеин, последовательность которого представлена на фиг. 4 и функция которого не описана, кодирует ген в локусе УОК177с. На основании идентичности примерно на 37% аминокислотной последовательности между протеи ном согласно изобретению, обладающим активностью ацилтрансферазы, и генным продуктом ΆΤΕ1 в случае Б.ссгссыас. описанным Еищ и др. (1994) и для которого обнаружена спиртацетилтрансферазная активность, авторы используют обозначение ΆΤΕ2 для гена, кодирующего протеин, ответственный за активность АРАТ у §.сетеу181ае.

Пример 2. Конструирование штаммов дрожжей, содержащих ген ΑΤΓ2, прерванный геном υΚΑ3, и лишенных активности АРАТ (аЙ2-Д::ИКА3).

А) Ген-мишень ΑΤΓ2.

Ген ИКА3 8.сегеуыае вводят путем замены выбранной части гена ΑΤΕ2 8.сетеу151ае, что позволяет осуществлять дальнейшую селекцию мутантных штаммов путем протографии с урацилом.

Селекционный маркер ИК.А3 объединяют с геном ΑΤΕ2 путем двойного слияния за счет полимеразной цепной реакции (ПЦР) согласно способу, описанному ΑтЬе^д и др., 1995. Следующая стратегия, представленная на фиг. 5, включает в целом 4 полимеразные цепные реакции. Две первые реакции (обозначаемые ПЦР1) позволяют, соответственно, амплифицировать участки 5' и 3', фланкирующие инсерционный сайт маркера υΚΑ3 в прерванном гене-мишени ΑΤΕ2, и третья реакция (обозначаемая ПЦР2) позволяет амплифицировать ген-маркер υΚΑ3. В результате двойного слияния (обозначаемого ПЦР3), наконец, участки 5' и 3' гена-мишени ΑΤΕ2 соединяются с геном-маркером υΚΑ3 (обозначается 5'ΑΤΕ2-υΚΑ3-3'ΑΤΕ2) .

Сначала образец целых клеток штамма Гу1679, используемого в качестве источника ДНК гена-мишени ΑΤΕ2, амплифицируют в ПЦР-буфере, содержащем 2 ммоль άΝΤΡ (Рйатшааа), в следующих условиях: 25 циклов; 93°С - 30 с; 54°С - 2 мин; 68°С - 3 мин; с последующим удлинением на 5 мин при 72°С; полимераза Αιηρίί Της (Реткш Е1тег).

С одной стороны, участок 5' гена ΑΤΓ2 амплифицируют путем ПЦР, используя в качестве прямого и непрямого праймеров олигонуклеотиды, имеющие следующие последовательности:

ΘΤΟ10841:

ААΑΑСΤССΑСΑΑΑΑΤССΑΑСΑΤΑΤΑСΑΑС ΟΑΤΑΕΟΑΑΕΕΑΕΑΤΑΤΕΑΕΤΕ (последовательность № 1); и

ΘΤΟ10844: ΑΤΟΑΑΤΟΤΟΟΑΑΤΤΑΟΟΟΟΤΟΤΤΟΟΟΑΤΤΑ ССС (последовательность № 2), которые содержат участок, гомологичный участку 5' последовательности гена ΑΤΓ2 (8СП:¥СК177с), и с добавлением сайта рестрикции 8а11 для ΘΤΟ10841.

С другой стороны, область 3' гена ΑΤΓ2 амплифицируют путем ПЦР, используя в качестве прямого и непрямого праймеров олиго нуклеотиды, имеющие следующие последовательности:

ΘΤΟ10846: СΑΤΤС6ΑСΑΤΤССССΑΑССΤСΑСΑΑΤСΑСΑ ΑΟ (последовательность № 3) ; и

ΘΤΟ10842: ΑΑΑΑΑССССΤΑΑСΤΑΤΤΑΑΑСССΑСССΑΑ ΑΤΤСССССΑΤССΤΤΤСС (последовательность № 4), которые содержат участки, гомологичные участку 3' последовательности гена ΑΤΡ2 (8СП:¥СК177с), и с добавлением сайта рестрикции М1и1 для ΘΤΟ10842.

Затем, ген υΚΑ3 8.сегеуыае амплифицируют путем ПЦР, используя в качестве прямого праймера олигонуклеотид, имеющий последовательность:

ΘΤΟ10843:

ΟΟσΓΑΑΤ^ΟΑΑΟΑΟΟ^ΤΑΑΤΤΟΟΑΟΑΤ ΤСΑΤΑΑССΤΤΤΤСΑΑΤΤСΑΑΤΤСΑΤСΑΤΤΤΤ ΤΤΤΤΤΤΑπΌΤΤΤΤΤΤΤΤΟ (последовательность №5), который содержит последовательность, гомологичную участку 5' опубликованной последовательности гена υΚΑ3 (Коке и др., 1984; банк генов: Υ8ί.ΌΌί.Ό; номер по каталогу: КО2207; 8ΟΌ: ¥ЕЬО2ТС), объединенную с последовательностью, которая гомологична участку 5' гена ΑΤΓ2 (комплементарная ΘΤΟ10844), и в качестве непрямого праймера олигонуклеотид, имеющий последовательность: ΘΤΟ10845:

СΤΤСΤСΑΤΤСΤСΑССΤΤССССΑΑΤСΤССΑΑΤССССΤΑΑΤΑΑСΤСΑΤΑΤΑΑΤΤΑΑΑΤΤСΑΑС

ТС (последовательность № 6), который содержит последовательность, гомологичную участку 3' гена υΚΑ3, объединенную с последовательностью, которая гомологична участку 3' гена ΑΤΓ2 (комплементарная ΘΤΟ1084 6). Образец массой 20 нг ДНК гена υΚΑ3, выделенный из шаттл-вектора Е.сойдрожжи ρΤ010021 (Оедтуке и др., 1995) путем гидролиза с помощью рестрикционного фермента ΗίηάΙΙΙ, амплифицируют в вышеуказанных условиях.

Полученные, соответственно, продукты ПЦР очищают, используя набор под названием «Набор для очистки генов» (Βίο 101 1пс., Ьа 1о11а, США), затем подвергают реакции двойного слияния, используя в качестве праймеров вышеуказанные олигонуклеотиды ΘΤΟ10841 и ΘΤΟ10842, в условиях амплификации, используемых для предварительных полимеразных цепных реакций с программой 20 циклов.

После очистки конечного продукта слияния, который содержит фланкирующие участки гена ΑΤΓ2, слитые с функциональным геном υΚΑ3, наличие гена υΚΑ3 подтверждают путем гидролиза с помощью рестрикционного фермента ЕсоКУ, который показывает присутствие этого сайта в амплифицированном материале.

Б) Генерация штаммов дрожжей а1Г2Д::ИКА3.

Вышеполученный продукт слияния трансформируют непосредственно в компетентных клетках штамма Еу1679 или штамма ТСУ73.4 и трансформанты селекционируют путем культивирования в среде 8Ό (Е. 8Негтап. 1991) в присутствии необходимых питательных веществ штамма и в отсутствие урацила.

В выделенных клонах обнаруживают новое соединение между участком 5' гена АТЕ2 и гена ЦКА8 (5'АТЕ2-ЦКА3-3'АТЕ2) путем амплификации с помощью ПЦР в целых клетках, используя вышеуказанные праймеры ОТО10841 и ОТО 10845. Отсутствие активности АРАТ затем определяют ин витро согласно описанному тесту, исходя из клеточного гомогената, в сравнении с родственным штаммом, который имеет ярко выраженную активность АРАТ.

Штаммы, отвечающие этим критериям, таким образом были охарактеризованы как мутантные штаммы аГ2, обозначаемые аГ2Д::ИКА3. Мутантный штамм, полученный таким образом из родственного штамма Еу1679, обозначают ТСУ156, а мутантный штамм, полученный из родственного штамма ТСУ73.4, обозначают Т6У158.

Образец штамма ТСУ156 депонирован в Национальной коллекции культур микроорганизмов, Институт Пастера, 25, улица Цос!еиг Коих. 75724, РАК18 СЕЦЕХ 15, Франция, 2 февраля 1998 г. под номером 1-1977.

Образец штамма Т6У158 депонирован в Национальной коллекции культур микроорганизмов, Институт Пастера, 25, улица Цос!еиг Коих, 75724, РАК18 СЕЦЕХ 15, Франция, 2 февраля 1998 г. под номером 1-1976.

В) Стабилизация прегненолона ин виво в культурах штаммов дрожжей а1Г2-Д::ЦКА3.

Клетки полученного штамма ТСУ158 вносят, из расчета А600=0,1, в среду УРЦ (ШГсо), содержащую 100 мкг/мл прегненолона. После инкубации в течение 16 ч при температуре 28°С стероиды экстрагируют дихлорметаном и анализируют с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой, как указано выше. Из фиг. 6(В) видно, что мутант ТСУ158 лишен способности этерифицировать прегненолон, тогда как в тех же условиях культивирования родственный штамм ТСУ73.4 превращает прегненолон в прегненолонацетат (фиг. 6 (А)).

Эти результаты позволяют сделать вывод о том, что генный продукт АТЕ2 является ответственным за этерификацию прегненолона дрожжами, тогда как прерывание гена АТЕ2 не приводит к заметным изменениям роста клеток в нормальных условиях.

Пример 3. Конструирование штамма дрожжей, содержащего ген АТЕ2, прерванный геном иКА3, и экспрессирующего 3β-Η8Π.

Плазмиды 2 μ, содержащие последовательность кДНК, кодирующую человеческий 3βΗ3ϋ под контролем промотора СУС1 8.сегеуыае или промотора ТЕЕ1 8.сегеу131ае и включающие ген устойчивости к О418, конструируют согласно представленной на фиг. 7А 7С схеме, затем трансформируют в мутантных штаммах дрожжей а1Г2-Д::ЦКА3.

Сначала вектор переноса рТО 10095, содержащий последовательность ДНК, кодирующую человеческий 3β-Η8Π типа II, описанную Е.Кйеаите и др., 1991, фланкированную сайтами 8аИ и М1и1 и расположенную ниже промотора дрожжей 6АЕ10/СУС1, получают следующим образом:

Кодирующую 3β-Η8Π последовательность субклонируют согласно Е.Кйеаите и др., 1991, как рестрикционный фрагмент 8аП-ЦоИ в тех же сайтах вектора Ыиезспр! II (81га1адепе). Полученный вектор, описанный Е.Кйеаите и др., 1991, содержит сайт ЦоП, локализованный у конца 3' последовательности, кодирующей 3βΗ3ϋ. Этот вектор затем гидролизуют с помощью рестрикционного фермента ЦоП, после чего обрабатывают фрагментом Кленова в присутствии ЙЦТР, чтобы заполнить «липкие» концы, затем снова подвергают лигатуре в присутствии олигонуклеотида, имеющего следующую последовательность:

ОТО4461:

САСАС6С6Т6Т6 (последовательность № 7), предварительно фосфорилированного и гибридизованного с самим собой, чтобы ввести сайт М1иГ Полученный таким образом вектор рТО 10082 (фиг. 7А) содержит последовательность, кодирующую 3β-Η8Π, содержащую сайт Вд1П и «окаймленную» сайтами 8аЛ и М1и1 тогда как сайт ЦоП утрачен. Этот вектор содержит также природный некодирующий участок 5', идентифицируемый по наличию сайта Вд1П.

Для того, чтобы приблизить сайт 8аП к АТО (антитимоцитарный глобулин) - инициатору, выше которого хотят ввести промотор 6АЕ10/СУС1, вектор рТО 10082 гидролизуют с помощью рестрикционного фермента Мзсф сайт которого находится в некодирующей области 5' и непосредственно перед АТО-инициатором, и с помощью рестрикционного фермента М1иГ Фрагмент МзсЕМЫ длиной 1,8 т.н., содержащий последовательность, кодирующую 3β-Η8Π (фиг. 7А), выделяют, затем лигируют в плазмиде рТО10033 (Е. Цедгузе и др., 1995), содержащей промотор 6АЕ10/СУС1, предварительно гидролизованный с помощью рестрикционного фермента 8аЛ, после чего обрабатывают фрагментом Кленова в присутствии ЙЦТР и потом гидролизуют с помощью рестрикционного фермента М1иГ Таким образом получают вектор рТО10095.

Затем конструируют рекомбинационный вектор рТО 10268, содержащий плазмиду 2μ дрожжей, репликон Ε.οοίί, полигенный экспрессирующий кластер СУС1_ргот - Р6К_1егт и селекционный маркер ЬЕИ2. Этот вектор идентичен вектору рТ610159, описанному Е.Эедгуке и др. (1995), за исключением сайта ХЬа1, содержащегося в области 2 μ, который заменен маркером ХЬа1^о, получаемым путем заполнения природного сайта ХЬа1 в присутствии фрагмента Кленова, затем путем повторной лигатуры.

Затем получают плазмиду экспрессии рТ610268 путем гомологичной рекомбинации за счет введения блока экспрессии, содержащего промотор 6АЫ0/С.УС1р, который получен из сконструированной выше плазмиды рТ610095, затем гидролизованной с помощью рестрикционного фермента ΝοΐΙ, в плазмиду рТ610260, предварительно гидролизованную с помощью рестрикционных ферментов 8аИ и М1и1. Плазмида рТ610268 (фиг. 7В) содержит последовательность, кодирующую человеческий зр-ΗδΌ типа II под контролем промотора СУС1.

Затем плазмиду экспрессии рТ610862, содержащую последовательность, которая кодирует 3β-Η8Ό под контролем промотора ТЕЕ1, конструируют следующим образом (фиг. 7С).

Сначала конструируют плазмиду рТС10832 (фиг. 8) путем гомологичной рекомбинации между фрагментом ΝοΐΙ, полученным из сконструированной выше плазмиды рТС10268, затем гидролизованной с помощью рестрикционного фермента ΝοΐΙ, и рекомбинационной плазмидой рТС10164 (Е. Эедгуке и др., 1995), предварительно гидролизованной с помощью рестрикционных ферментов 8аИ и М1и1.

Затем получают плазмиду экспрессии рТС10862 путем введения промотора ТЕЕ1, содержащегося в фрагменте С1а1-8а11, выделенном из плазмиды рТ610085 (Е.Эедгуке и др., 1995), вместо промотора СУС1, удаленного путем гидролиза сконструированной выше плазмиды рТС10832 с помощью рестрикционных ферментов С1а1 и 8аИ.

Таким образом полученную плазмиду рТС10862 (фиг. 9), которая содержит последовательность кДНК, кодирующую человеческий 3β-Η8Ό типа II, трансформируют, соответственно, в родственном штамме ТСУ73/4 или в его мутанте аЙ2-Д::иКА3, соответствующем полученному в примере 2 штамму ТСУ158, также, как в родственном штамме ЕУ1679 или в его мутанте а1Г2-А::иК.А3, соответствующем полученному в примере 2 штамму ТСУ156. Трансформанты выделяют как указано выше в среде ΥΡΟ(ΌίΓοο), содержащей 250 мкг/мл 6418.

Далее полученные таким образом колонии«кандидаты» предварительно культивируют в среде 8Ό, содержащей необходимые для каждого штамма питательные элементы (гистидин и урацил для штамма Т6Υ73,4; гистидин для Т6Υ158; триптофан, гистидин, лейцин и урацил для штамма ΕΥ1679; триптофан, гистидин и лейцин для штамма Т6Υ156; в концентрации по 100 мкг/мл каждого), затем вносят в среду, содержащую 100 мкг/мл прегненолона. После культивирования и биоконверсии в течение 24-х ч при температуре 28°С, стероиды экстрагируют и анализируют с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой, как указано выше. Полученные результаты, определенные в случае трех клонов каждого штамма, представлены в следующей таблице 3:

Таблица 3

Штамм	Плазмида	Прегненолон (мкг/мл)	Прогестерон (мкг/мл)
ТΟΥ73.4	рТО10862	1	0
ТΟΥ158		94	15,2
ΡΥ1679		1	1,3
ТΟΥ156		100	13

Эти результаты показывают, что прегненолоновый субстрат практически полностью рекуперируют в случае мутантных штаммов Т6Υ156 или Т6Υ158, в которых наблюдают начало биоконверсии прегненолона в прогестерон, тогда как исчезновение прегненолона является полным в родственных штаммах Т6Υ73.4 или ΕΥ1679, которые не продуцируют или очень мало продуцируют прогестерон, но аккумулируют ацетат прегненолона, как это показано в примере 2.

Образец трансформированного штамма Т6Υ158/рТ610862 депонирован в Национальной коллекции культур микроорганизмов, Институт Пастера, 25, улица Οοο^ιΐΓ Κοιιχ 75724, РАК18 СЕЭЕХ 15, Франция, 2 февраля 1998 г, под номером ГО1978.

Пример 4. Конструирование штамма дрожжей, содержащего ген АТЕ2, прерванный с помощью ТЕЕ1_ргот/Р6К_1егт (аД2-Д:: ТЕЕ1/Р6К).

Штамм Т6Υ186, который представляет собой штамм, происходящий от штамма Т6Υ156 (аГ2-Д::иКА3), описанного в примере 2, в котором ген ИКА.3 в локусе АТЕ2 заменен блоком экспрессии ТЕЕ1_ргот/Р6К_1егт, конструируют следующим образом:

Сначала блок экспрессии ТЕЕ1_ргот/Р6К_1егтобъединяют с геном АТЕ2 путем двойного слияния с помощью ПЦР согласно условиям, описанным в примере 2, но используя блок экспрессии ТЕЕ1_ргот/Р6К_1егт З.сегесЫае, описанный Е.Эедгуке и др. (1995), вместо селекционного маркера ИКА3.

Две первые полимеразные цепные реакции (ПЦР1), позволяющие, соответственно, амплифицировать кодирующие участки 5' и 3' гена АТЕ2, фланкирующего инсерционный сайт блока ТЕШртст/РбК^ в прерванном гене-мишени АТЕ2, осуществляют при использовании, соответственно, в качестве прямого и непрямого праймеров для участка 5', олигонуклеотиды, имеющие следующие последовательности:

ОТ611049: СТСТСТ6ТС6АСААААТ66АА6АТАТА6А

АССАТАССААССАСАТАТСАСТС (последовательность №8); и

ОТС10844: АТСААТСТССААТТАССССТСТТСССАТТА ССС (последовательность № 9);

а для участка 3' - олигонуклеотиды, имеющие следующие последовательности:

ОТС10846: САТТССАСАТТССССААССТСАСААТСАС ААС (последовательность № 10) и

ОТС11050: ААСААСАССССТААСТАТТАААСССАСС САААТТСССССАТССТТТСС (последовательность № 11).

Праймеры ОТС11049 и ОТС11050 предназначены для введения, соответственно, сайтов рестрикции 8а11 и М1и1.

Третью полимеразную цепную реакцию (ПЦР2), позволяющую амплифицировать блок ТЕЕ1_ргот/РСК_1епп, осуществляют при использовании, соответственно, в качестве прямого и непрямого праймеров, олигонуклеотиды, имеющие следующие последовательности: ОТС11052: СССТААТСССААСАССССТААТТССАСА ТТСАТАТССАТСАСАСАССАТАССТТСАА ААТСТТТСТАС (последовательность № 12) и

ОТС11053: СТТСТСАТТСТСАССТТССССААТСТССАА ССТТССАААСССАСААТТТТССАСТТАТТА ААСТТАА (последовательность № 13), которые вводят сайты рестрикции С1а1 и ΗίηάΙΙΙ.

Наконец, объединение осуществляют путем двойного слияния вышеполученных продуктов ПЦР, используя в качестве праймеров олигонуклеотиды, имеющие последовательности ОТС11049 (последовательность № 8) и ОТС11050 (последовательность № 11), которые вводят сайты рестрикции 8аИ и МЫ в сайты связывания АТЕ2.

Затем, после очистки, конечный продукт слияния рекомбинируют с геном АТР2, содержащимся в плазмиде рТС10885, сконструированной как указано выше и предварительно гидролизованной с помощью рестрикционных ферментов ВЫ и δΙιιΙ. Таким образом получают плазмиду рТС10888, содержащую сигнал ТЕЕ1_ргот/РСК_1епп в сайтах СЫ и ΗίηάΙΙΙ, окаймленный фланкирующими участками гена АТЕ2.

Получение плазмиды рТС10885 включает амплификацию гена АТР2 из штамма ΕΥ1679 согласно описанным в примере 2 условиям, но при использовании, соответственно, в качестве прямого и непрямого праймеров вышеуказанные олигонуклеотиды, имеющие последовательности ОТС11049 (последовательность № 8) и ОТС11050 (последовательность № 11), которые вводят сайты рестрикции 8аИ и М1иЕ В полученном продукте ПЦР эти сайты затем удаляют путем гидролиза с помощью рестрикционных ферментов 8аИ и Мйй. затем путем обра ботки с помощью фрагмента Кленова полимеразы Ι Е.сой, чтобы заполнить «липкие» концы. Полученный фрагмент затем лигируют в экспрессионном векторе рТС10031, описанном ЕГОедгуке и др. (1995), предварительно гидролизованном с помощью ферментов СЫ и ΗίηάΙΙΙ, затем обработанном с помощью фрагмента Кленова. Путем трансформации в Е.сой таким образом получают плазмиду рТС10885 в результате лигирования сайта 8аП продукта ПЦР, дополненного за счет использования фрагмента Кленова, чтобы получить последовательность СТССА, с сайтом ΗίηάΙΙΙ вектора, который дополнен за счет использования фрагмента Кленова, чтобы получить последовательность АССТТ, так, чтобы реконструировать сайт ΗίηάΙΙΙ (СТССААССТТ) (последовательность № 14) и исключить сайт С1аЕ Сайт СЫ вектора, дополненный за счет использования фрагмента Кленова, чтобы получить последовательность АТСС, исчезает после лигирования с продуктом ПЦР.

Сигнал ТЕЕ1_ргот/РСК_1епп затем удаляют из плазмиды рТС10888 в виде фрагмента длиной 1,8 т.н., затем заменяют маркером ИКАЗ в штамме ТСΥ156 (а!£2-А::ИКА3).

Полученный в примере 2 и используемый в качестве штамма-хозяина штамм ТСΥ156 котрансформируют с ДНК, удаленной из плазмиды рТС10888, и с вектором дрожжей, содержащим источник АК8 (СПИД-ассоциированный комплекс), называемый ΥΕρ7, описанный 8!гий1 и др. (1979), который позволяет выполнить потребность в триптофане штамма ТСΥ156 и осуществлять селективную детекцию колоний по их устойчивости к 5-фтороротовой кислоте.

2-5 мкг ДНК, удаленной из плазмиды рТС10888 путем гидролиза с помощью рестрикционного фермента №Й, и плазмиды ΥΕρ7 вводят в штамм ТСΥ156 по методу с ацетатом лития (Йо и др., 1983). Затем осуществляют селекцию по выполнению потребности штамма в триптофане после образования монослоев в чашках с агаром в среде ΥΝΟΒ (Ойсо), дополненной гистидином и лейцином (по 100 мкг/мл каждого). Колонии-«кандидаты», отобранные с помощью зубочистки, затем помещают в среду, содержащую 5-фтороротовую кислоту, получаемую согласно Воеке и др. (1984), затем устойчивость к 5-фтороротовой кислоте подтверждают при использовании той же самой среды, причем возможная потеря вектора УКр7 в устойчивых к 5-фтороротовой кислоте колониях указывает на потребность в триптофане. Среди отобранных таким образом клонов объединение гена АТЕ2 с ТЕЕ1_ргот/РСК_1епп контролируется с помощью ПЦР. Таким образом получают штамм ТСΥ186.

Пример 5. Конструирование штамма дрожжей, содержащего ген АТР2, прерванный с помощью ТЕР1_ргот/РОК_1егт, и экспрессирующего Р₄₅₀17а.

Плазмиду (рТО10435), содержащую участок инициации репликации дрожжей АВЗШ/ СЕЖ, селекционный маркер ИВА3 и включающую последовательность кДНК, кодирующую бычий цитохром Р₄₅₀ 1 7а под контролем промотора ТЕР1 §.сегеу181ае, конструируют согласно приведенной на фиг. 10 схеме, затем трансфомируют в мутантном штамме дрожжей а1Г2-Д::ТЕР1/РОК (ТОУ186). Сначала плазмиду рТО10058, содержащую последовательность кДНК, кодирующую бычий цитохром Р₄₅₀ 1 7а, описанный 2иЬег и др. (1986), фланкированную сайтами 8а11 и М1и1 и расположенную ниже промотора дрожжей СУС1, получают согласно представленной на фиг. 11 схеме: Плазмиду рОВ17а-5, описанную в международной заявке на патент 89/10963 и содержащую последовательность, кодирующую бычий цитохром Р₄₅₀ 1 7а, раскрывают путем гидролиза с помощью рестрикционного фермента Х1юЕ затем обрабатывают щелочной фосфатазой.

После фосфорилирования и гибридизации, олигонуклеотиды, имеющие следующие последовательности:

ОТО4511:

ТСОАСООАСОСОТОО (последовательность №

15) и

ОТО4512:

ТСОАССАСОСОТССО (последовательность №

16) , вводят в сайт Х1ю1 с получением плазмиды рТО10104. Плазмиду рТО10104 затем обрабатывают рестрикционными ферментами 8а11 и М1и1, потом вводят в плазмиду рТО10031, описанную Е.Эедгуке и др. (1995), содержащую промотор дрожжей СУС1, предварительно гидролизованную с помощью рестрикционных ферментов 8а11 и М1и1 и обработанную щелочной фосфатазой. Таким образом получают вектор рТО 10058, содержащий кДНК, кодирующую бычий цитохром Р₄₅₀ 1 7а (фиг. 12). Плазмиду рТО10058 затем гидролизуют с помощью рестрикционных ферментов 8а 11 и М1и1 и обрабатывают щелочной фосфатазой. Фрагмент 8а11М1и1 длиной 1,7 т.н., содержащий последовательность, кодирующую бычий цитохром Р₄₅₀ 1 7а, выделяют, затем лигируют в экспрессионном векторе рТО10085, описанном Е.Эедгуке и др. (1995) и содержащем промотор дрожжей ТЕР1, предварительно гидролизованном с помощью ферментов 8а11 и М1и1. Таким образом получают плазмиду рТО10293 (фиг. 13), в которой кодирующая цитохром Р₄₅₀ 1 7а последовательность находится под контролем промотора ТЕР1.

Затем плазмиду экспрессии рТО 10435 получают путем гомологичной рекомбинации между рекомбинационной плазмидой рТО10434, описанной Е.Эедгуке и др. (1995) и содержащей последовательность АКБШ/СЕЖ, предварительно гидролизованной с помощью ферментов 8а11 и М1и1, и фрагментом ЖО длиной 2,8 т.н., полученным из сконструированной выше плазмиды рТО10293.

Полученную таким образом плазмиду рТО10435 (фиг. 14), которая содержит последовательность, кодирующую бычий цитохром Р₄₅₀17а под контролем промотора ТЕР1, затем трансформируют, соответственно, в родственном штамме ΡΥ1679 или в штамме ТОУ186 (а1Г2-Д::ТЕР1/РОК), полученном в примере 4.

Трансформанты выделяют как указано выше в среде ΥΝΒΟ (ЭНсо), дополненной триптофаном, гистидином и лейцином (по 100 мкг/мл каждого). Затем полученные таким образом колонии предварительно культивируют в течение 16 ч в среде ΥΝΒ (ЭНсо), содержащей 2% глюкозы и 0,5% сак-аминокислот, после чего разбавляют свежей средой до А600=0,2. После культивирования в течение 6 ч добавляют 100 мкг/мл прегненолона или прогестерона. После инкубации и биоконверсии в течение 48 ч при температуре 28°С стероиды экстрагируют и анализируют с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой, как указано в примере 1, используя, соответственно, стандарты прегненолона и 17αгидроксипрегненолона или прогестерона и 17αгидроксипрогестерона.

Полученные результаты, выраженные в мкг/мл, представлены в следующей табл. 4:

Таблица 4

Штамм	РУ1679/ рТО10435	ТОУ186/ рТО10435
Субстрат: прегненолон	0	67,1
прегненолон 17а-гидроксипрегненолон	0	42,0
Субстрат: прогестерон	46,5	41,4
прогестерон 17а-гидроксипрогестерон	29,3	33,1

Эти результаты показывают, что способность к биоконверсии цитохрома Р₄₅₀17а, экспрессия которого осуществляется вектором рТО10435, почти такая же в штамме дикого типа (РУ) или его мутанте а1Г2 (ТОУ186) при использовании прогестерона в качестве субстрата. С другой стороны, при использовании прегненолона в качестве субстрата достигают такой же конверсии по сравнению с прогестероном, но только с мутантом а 112 (ТОУ186). В штамме дикого типа РУ одновременно субстрат и продукт ацетилированы, и свободный гидроксипрогестерон не обнаруживается.

Образец трансформированного штамма ТОУ186/рТО10435 депонирован в Национальной коллекции культур микроорганизмов, Институт Пастера, 25, улица Эос1еиг Воих 75724, РАВ18 СЕЭЕХ 15, Франция, 20 января 1999 г. под номером 1-2119.

Пример 6. Конструирование штамма дрожжей, содержащего ген АТР2, прерванный с помощью ТЕЕ1_ргот/РОК_1егт, и коэкспрессирующего 3в-Н8И и Р₄₅₀ 1 7а.

Плазмиду рТО10417 (фиг. 21), содержащую репликон дрожжей 2 μ и два блока экспрессии, из которых один кодирует человеческий 3в-Н8П, а другой кодирует бычий цитохром Р₄₅₀ 1 7а, причем оба находятся под контролем промотора СУС1 8.сегеуыае и содержат селекционный маркер ИЯА3, конструируют последовательно согласно нижеописанным стадиям 1-3 (фиг. 15А и В), затем нижеописанным стадиям 4-6, после чего трансформируют в мутантном штамме дрожжей а!Г2-Д:: ТЕЕ1_ргот/ РОК_1епп(ТОУ186).

Стадия 1: конструирование плазмиды рТ010210.

Экспрессионный вектор рТ010033, описанный Е.Иедгуке и др. (1995) и содержащий гибридный промотор дрожжей ОАЬ10/СУС1, предварительно гидролизованный с помощью рестрикционного фермента РуцП, обрабатывают щелочной фосфатазой, затем снова лигируют в присутствии олигонуклеотида, имеющего следующую последовательность:

0Т01050:ССС0ААТТС000 (последовательность № 17), предварительно фосфорилированного и гибридизованного с самим собой, чтобы ввести сайты ЕсоЯ1 в виде «окаймления» блока экспрессии, содержащего промотор ОАЫ0/СУС1. Таким образом получают вектор рТ010210.

Стадия 2: конструирование плазмиды рТО10214.

Блок экспрессии, содержащий промотор ОАЫ0/СУС1, имеющийся в векторе рТ010210, затем вводят в шаттл-вектор Е.сой-дрожжи РТ010013, описанный Е.Иедгуке и др. (1995) и содержащий селекционный маркер ИЯА3-6.

Вектор рТ010013, после гидролиза с помощью рестрикционного фермента ЕсоЯ1 и обработки щелочной фосфатазой, лигируют с полученным в стадии 1 вектором рТ010210, предварительно гидролизованным с помощью фермента ЕсоЯ1. Полученный таким образом вектор рТО10214 содержит блок экспрессии, включающий промотор ОАЬ10/СУС1, направленный к репликону 2μ.

Стадия 3. Конструирование плазмиды рТО10274. В плазмиде рТО10214 промотор САЙ10/СУС1 заменяют промотором СУС1 путем гомологичной рекомбинации после удаления плазмиды за счет обработки рестрикционными ферментами С1а1 и 8а11. Экспрессионный вектор рТО 10031, описанный Е.Иедгуке и др. (1995) и содержащий промотор СУС1, гидролизуют с помощью рестрикционных ферментов НтбШ и Екр1, затем рекомбинируют с плазмидой рТО10214, полученной в стадии 2 и предварительно гидролизованной с помощью рестрикционных ферментов С1а1 и 8а11, получая таким образом плазмиду рТО10274 (фиг. 16).

Стадия 4. Конструирование плазмиды рТО10401.

Из плазмиды рТО10274, содержащей промотор СУС1, и плазмиды рТО10293, содержащей последовательность, кодирующую цитохром Р₄₅₀ 1 7а под контролем промотора ТЕЕ1, путем гомологичной рекомбинации получают новую плазмиду рТО10401, содержащую последовательность, кодирующую цитохром Р₄₅₀ 1 7а под контролем промотора ТЕЕ1.

Промотор СУС1 и часть репликона Е.сой удаляют из плазмиды рТО10274, полученной в стадии 3, путем гидролиза с помощью рестрикционных ферментов М1и1 и Ига1. Полученную в примере 5 плазмиду рТО10293 гидролизуют с помощью рестрикционных ферментов НтбШ и РуцП, затем рекомбинируют с плазмидой рТО10274, гидролизованной с помощью рестрикционных ферментов М1и1 и Ига1, получая плазмиду рТО10401 (фиг. 17).

Стадия 5. Конструирование плазмиды рТО10403.

кДНК, кодирующую человеческий 3в-Н8И типа II, вводят в плазмиду рТ010401 под контролем промотора СУС1.

Сначала вектор экспрессии рТО10262, содержащий кДНК, кодирующую человеческую 3в-Н8И типа II, конструируют согласно представленной на фиг. 18 схеме, из векторапереносчика рТО10095, полученного в примере 3, и рекомбинационного вектора рТО10257, содержащего репликон дрожжей 2 μ, репликон Е.сой, полигенный экспрессирующий кластер дрожжей СУС1_ргот - РОК_1егт и селекционный маркер ИЯА3-6. Этот вектор рТО10257 идентичен рекомбинационному вектору рТО10042, описанному Е.Иедгуке и др. (1995), за исключением сайта ХЬаф содержащегося в области 2 μ, который заменен маркером ХЬаЕ, полученным путем дополнения природного сайта XЬаI фрагментом Кленова, затем повторной лигатуры.

Блок экспрессии человеческого 3в-Н8И типа II удаляют из вектора-переносчика рТО10095 путем гидролиза с помощью рестрикционного фермента ИоП, затем вводят в рекомбинационный вектор рТО10257, предварительно гидролизованный с помощью рестрикционных ферментов 8аИ и М1и[, получая вектор экспрессии рТО10262 (фиг. 19). Следует заметить, что в результате рекомбинации блока ОАЬ10/СУС1кДНК, происходящего из плазмиды рТО10095, в рекомбинационном векторе рТО10257, содержащем промотор СУС1, получают вектор экспрессии, содержащий блок СУС1-кДНК.

Затем сконструированный выше вектор экспрессии рТО10262 гидролизуют с помощью рестрикционного фермента Хтпй Полученный фрагмент, содержащий кДНК, кодирующую 3βН8И, рекомбинируют с фрагментом плазмиды рТО10401, полученной в стадии 4, содержащей кДНК, кодирующую цитохром Р₄₅₀17а, в свою очередь полученный путем гидролиза с помощью рестрикционного фермента 8са11. Полученная таким образом плазмида рТС10403 (фиг. 20) содержит два блока экспрессии, из которых один кодирует 3β-Η8Ό под контролем промотора СУС1, а другой кодирует цитохром Р₄₅₀ 1 7а под контролем промотора ТЕЕ1.

Стадия 6. Конструирование плазмиды рТС10417.

Наконец, в вышеуказанной плазмиде рТС10403 промотор ТЕЕ1 заменяют промотором СУС1.

С одной стороны, описанную в примере 5 плазмиду рТО 10058 гидролизуют с помощью рестрикционного фермента РуиП, что позволяет высвобождать часть последовательности, кодирующей цитохром Р₄₅₀ 1 7а, ассоциированной с промотором СУС1, также, как преобладающую часть репликона Е.сой. С другой стороны, часть репликона Е.сой удаляют из полученной в стадии 5 плазмиды рТО 10403 путем гидролиза с помощью рестрикционного фермента Итак Путем рекомбинации двух плазмид, предварительно гидролизованных таким образом, наконец, получают плазмиду рТО10417. Плазмида рТС10417 содержит репликон дрожжей 2μ, селекционный маркер ИКА3-б и два блока экспрессии, из которых один кодирует человеческий 3β-Η8Ό, а другой кодирует цитохром Р₄₅₀ 1 7а бычьего происхождения, причем оба находятся под контролем промотора дрожжей СУС1 (фиг. 21).

Плазмиду рТО10417 затем трансформируют, соответственно, в родственном штамме ЕУ1679 или в штамме Т6У186 (акГ2-Д: : ТЕЕ1_ргот/РСК_4гет ), полученном в примере 4.

Трансформанты выделяют в агаровой среде ΥΝΒ (Ийсо), содержащей 0,5% глюкозы и дополненной триптофаном, гистидином и лейцином (по 100 мкг/мл каждого).

Полученные таким образом колонии затем предварительно культивируют в течение 24-х ч при температуре 28°С в среде ΥΝΒ (Ийсо), содержащей 0,5% глюкозы и 0,1% сакаминокислот, затем разбавляют до А600=0,1 и добавляют 100 мг/мл прегненолона, при использовании либо той же самой свежей среды (среда 1), либо среды ΥΝΒ (Ийсо), содержащей 0,1% глюкозы, 2% глицерина и 0,2% сак-аминокислот (среда 2). После культивирования и биоконверсии в течение 48 ч стероиды экстрагируют и анализируют с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой как указано в примере 1, используя стандарты прегненолона, 17а-гидроксипрегненолона, прогестерона и 17а-гидроксипрогестерона.

Полученные результаты, выраженные в мкг/мл, представлены в следующих табл. 5 (среда 1) и 6 (среда 2).

Таблица 5

Штамм	ΕΥ1679/	ТСУ186/
рТС10417	рТС10417
Прегненолон	0	58,1

Прегненолонацетат	87,3	0
17а-Гидроксипрегненолон	0	3,1
17а-Гидроксипрегненолон- ацетат	0	0
Прогестерон	10,6	1,4
17а-Гидроксипрогестерон	1,3	23,4

Таблица 6

Штамм	РУ1679/рТС 10417	ТСУ186/рТС 10417
Прегненолон	0	54,0
Прегненолонацетат	52,1	0
17а-Гидроксипрегненолон	0	3,4
17а-Гидроксипрегненолон- ацетат	12,8	0
Прогестерон	0	1,4
17а-Гидроксипрогестерон	8,6	31,4

Эти результаты показывают, что биоконверсия в штамме дикого типа (ΕΥ), трансформированном плазмидой рТО10417, приводит к аккумуляции прегненолонацетата и 17а-гидроксипрегненолонацетата, которые не трансформируются в дальнейшем ферментами 3β-Η8Ό или Р₄₅₀ 1 7а, и баланс биоконверсии хуже такового, наблюдаемого при использовании трансформированного мутанта а!Г2 (Γ6Υ186).

Образец трансформированного штамма ТСΥ186/рТС10417 депонирован в национальной коллекции культур микроорганизмов, Институт Пастера, 25, улица Иос1еиг Коих 75724, РАК18 СЕИЕХ 15, 20 января 1999 г. под номером ί-2118.

Библиографические ссылки

Асйбейег Т., Nдиуеη-^и^11е^еΐ М., Ешбей А., Мегкатт М. апб Ьетоше Υ. (1992), Сепе 110, 25-31.

АтЬегд И.С., Во1к1ет Ό. апб Веак1еу Е.М., (1995), Υеакΐ 11: 1275-1280.

Воеке бек И., Ьасгои1е Е. апб Ешк О К., (1984) Мо1 Сеп Сепе! 197 : 345-346.

Сане! С., Иитак В., Иедгуке Е., 8радпой К. апб Асйк!ейег Т. (1994) т Су!осйготе Р-450 Ьюсйет181гу, Ьюрйубск апб то1еси1аг Ью1оду (Ьесйпег М.С., еб.) рр. 583-586, бойп ЫЬЬеу Еиго1ех1.

Сйеггу 6.М., Аб1ег С, Ва11 С, И^1дй! 8., Сйегуйх 8., йа Υ., биу1к С., Кое Т., \Уепд 8. апб Во1к1ет Ό., 8ассйаготусек Сепоте ИШаЬаке 1Шр://депоте-\\л\л\\51апГогб.еби/ 8ассйаготусек/

Иедгуке Е., б. Вю1есй 39 (1995) 181-187.

Иедгуке Е., Иитак В., И1е1г1сй М., Ьагиейе Ь. апб Асййейег Т. (1995). Υеакΐ 11 : 629-640.

Иедгуке Е. (1996), Сепе 170, 45-50.

Иитак В., Сане! С., Иедгуке Е., 8радпой К. & Асй!ейег Т. (1994). Су!осйготе Р450.8‘^ь 1п!егпабопа1 СопГегепсе. Еб. М. С. Ьесйпег. бойп ЫЬЬеу Еиго!ех!, Рапк рр. 527-530.

Е1есй1ег А., Еийгтапп С.Е. апб Каррей О., (1981). Абу. МюгоЬ. РЬуяоГ 22, 123-183.

ЕиЩ Т., №1дака\уа Ν., Ыата!ки А., Водак1 Т., Тата Υ. апб Η атасЫ М. (1994) Арр1. Епу1гоп. МкгоЬюГ 60, 2786-2792.

Папайю Ό., б. Мо1. Вю1. 166 (1983) 557580.

НиЬасек I. апб С1о\сг 8.XV., (1970), 1. Мок ΒίοΙ. 50 : 111-127.

Ио Н., Рикиба Υ., Мига1а К. апб Кппига А., 1983,1оита1 о£ Вас1спо1о§у. 163-168.

Вкеаите Е., Ьаскапсе Υ., Ζΐιηο Н.-Е., Вге1оп Ν., Оитоп! М., бе ЬаипоИ Υ., Тгибе1 С., Ьии-Тке V., 81тагб 1. & ЬаЬпе Е. (1991). Мок Епбосппок 5, 1147-1157.

Возе М., бивай Р. апб Βοΐδΐείη Ό., Сепе 29, 113-124 (1984).

Возеп£е1б 1., Сарбс\1с11с 1., Сш11ето1 ЕС. апб Ееггага Р. (1992) Апа1. Вюскеш. 203, 173179.

8ашЬгоок 1., Рпйск Е.Е. апб МашаИз Т., (1989). Мо1еси1аг С1ошпд : А ЬаЬогаЮгу Мапиа1. Со1б 8рпп§ НагЬог ишуегзПу Ргезз, 2пб ебПюп, Со1б 8рпп§ НагЬог.

Зкеппап Е. (1991) Мебюбз ίη ΕηζνιηοΙοβν 194, 3-21.

81тагб 1., Оигоскег Е., МеЬагк1 Е., Тигдеоп С, Запскег В., ЬаЬпе Υ., Соие! 1., Тгибе1 С., Вкеаише Е., Моте1 Υ., Ьии-Тке V. Апб ЬаЬпе Е. (1996) 1. Епбосппок 150, 5189-5207.

81гик1 К., 8Ьпс1ютЬ ΌΤ., 8скегег 8. апб ϋηνίδ ВА., 1979, Ргос. Νηΰ. Асаб. 8οί. ЬГ8А Уо1. 76, №3, 1035-1039.

ТЫепу А., Еайкеаб С. апб Ои)оп В., Уеаз!; Уо1. 6 : 521-534 (1990).

гиЬег МХ., δίπιρβοη ЕВ. апб \Уа1сгтап МВ., (1986а) 8с1епсе 234, 1258-1261.

Список последовательностей

<110>	НоесЬзЕ	Маг1оп Ноиззе1
<120	ЗоисЬез	ве Ιβνυτβ ауапЕ 1е дёпе АТГ2 кпЕегготри еЕ
	1еигз аррПсаЕхопз.
<130>	2482 РСТ	2£0иЕЫСЕ5 ΕΝ ЕНАЫСА15
<14 0>
<141>
<160>	17
<170>	ΡβΕβηΕϊη	Уег. 2.1
<210>	1
<211>	50
<212>	ΑΟΝ
<213>	Зёдиепсе	βΓΕίίΐείβΙΙβ
<220>
<223>	ОЫСОиисЬЕОТЮЕ
<400>	1

аааадЕсдас ааааьддаад аЕвЕадаадд аЕасдаасса саЕаЕсасЕс <210> 2 <211> 33 <212> ΑΟΝ <213> 5ёдиепсе агЕ1£хс1е11е <220>

<223> ОЫСОИиСЬЕОТЮЕ <220>

<221> тх5С Теаьиге <222> СотрТетепЕ( (1) ..(33)) <400> 2 аЕсааьсьсс ааЕЕаддссЕ сЕЕсддаЕЕа ссс <210> 3 <211> 32 <212> ΑΟΝ <213> Зёдаепсе агЕ1£1с1е11е <220>

<223> ОЫООЫиСЬЕОТЮЕ <400> 3 саЕЕсдасаЕ Есссдааддь дасааьдаса ад <210> 4 <211> 46 <212> ΑΟΝ <213> 5ёдиепсе агЕ1£1схе11е <220>

<223> ОЫ5ОЫиСЬЕОТ1ОЕ <220>

<221> П115с_£еаьиге <222> СотрТетепЕ((1)..(46)) <400 4 ааааасдсдЕ аасЕаЕЕааа дсдасдсааа ЕЕсдссдаЕд дЕЕЕдд <210> 5 <211> 79 <212> ΑΟΝ <213> 5ёчиепсе агЫИсхеПе <220 <223> ОЫбОЫОСЬЕОТЮЕ <400 5 дддсаасссд аададдссса аЕЕддадаЕЕ даьаадсЕЕЕ ЕсааЕЕсааЕ ЕсассаСЕЕЕ сссЕЕсаЕсс ¢¢¢¢¢¢¢19 <210> 6 <2П> 63 <212> ΑΠΝ <213> бёдиепсе ΐΓΕίίίχΐβΙΙβ <220 <223> ОЫбОЫиСЬЕОТЮЕ <220 <221> Л113С £еасиге <222> СотрТетепЕ((1)..(63)) <400> 6 сЕЕдссаЕсд ссасссссдд дааЕдЕсдаа ЕддддЕааЕа асЕдаьасаа ЕЕаааЕЕдаа сес <210> 7 <211> 12 <212> ΑΟΝ <213> Зёфиепсе агИ£1с1е11е <220>

<223> оыеокисьЕотюЕ <400> 7 сасасдсдЕд Ед <210> 8 · <211> 52 <212> ΑϋΝ <213> Зёчиепсе βΓΕί£ίοί«11« <220>

<223> ОЫСОЫОСЬЕОТЮЕ <400 В сЕсЕссдЕсд асааааЕдда адаЕаЕадаа ддасасдаас сасаЕаЕсас ес <210> 9 <211> 33 <212> ΑΟΝ <213> Зёдиепсе βΓΕΐίίοϊβΙΙβ <220>

<223> ОЫООИисЬЕОТЮЕ <220>

<221> пйзс_£еаЕиге <222> Сотр1етепЕ((1)..(33)) <400 9 аЕсаагсЕсс аагхаддссЕ сЕЕсддаЕЕа ссс <210 10 <211> 32 <212> ΑΟΝ <213> 5έ<ρβηεβ «Γίίίΐοίβΐΐβ <220>

<223> ОЫСОКиСЕЕОТЮЕ <400> 10 саЕСсдасас ссседааддс дасааСдаса ад <210> 11 <211> 48 <212> ΑΟΝ <213> Зёдиепсе агьх£1с1е11е <220>

<22Э> ОЫСОЫиСЬЕОТЮЕ <220>

<221> тхас £еаСиге <222> СотрТетеп!((1) ..(48)) <400> 11 аасаасасдс дсаас^асьа аадсдасдса аасссдссда Ъдессьдд

<210> 12 <211> 68 <212> ΑΟΝ <213> δέςυβηοε агХхПсхеИе

<220>

<223> ОЫбОЫиСЬЕОТЮЕ

<4О0> 12

дддсаа^ссд аададдссЪа аССддадайС даСайсдаСс асасассаСа дсхссааааС дегсссас <210> 13 <211> 67 <212> ΑΟΝ· <213> Зёсиепсе агХх£хс1е11е <220>

<223> ОЫСОКиСЬЕОТЮЕ <220>

<221> 1м.5С_£еайиге <222> Сотр1етепС((1)..(67)) <400> 13 сссдссас^д Гсасссседд дааСд^сдаа дсгъсдааас дсадаагссс сдадЪСаСЪа аасСЬаа <210> 14 <211> 10 <212> ΑϋΝ <213> Зедиепсе βτΐ,ίίίοΐβΐΐβ <220>

<223> ОЫСОИиСЬЕОТЮЕ <4ОО> 14 дссдаадсье <210> 15 <211> 15 <212> ΑϋΝ <213> Зёдиепсе агЫ£1с1е!1е <220>

<223> ОЫСОШСЬЕОТЮЕ <400> 15 €сдасддасд сдСдд <210 16 <211> 15 <212> ΑΟΝ <213> δέςϋβηεβ аг€1£1с1е11е <220 <223> ОЫСОЫОСЬЕОТЮЕ <220>

<221> тхзс_£аа£иге <222> Согор1е®еп£((1}..(15)) <400> 16 есдассасдс дсссд <210 17 <211> 12 <212> ΑϋΝ <213> Бёдиепсе агс1£1е1е!1е <220>

<223> ОЫ6ОЫиС1ЕОТ10Е <400 17 сссдаасссд дд где:

<110> Хехст Марион Руссель <120> Штаммы дрожжей, содержащие прерванный геи АТЕ2, и их применение <130> 2482 РСТ Последовательности во Франции <212> ДНК <213> искусственная последовательность <221> признак ошибки <222> комплемент <223> олигонуклеотид

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Штамм дрожжей, лишенный ацетилСоА-прегненолон-ацетилтрансферазной активности (АРАТ) за счет модификации гена АТР2 или ΥΟΚ 177с, или его гомолога, что приводит к стабилизации 3 β-гидро ксистсроидов.
2. Штамм по п.1, представляющий собой 8.ссгс\ыас.
3. Штамм по п.2, в котором ген АТЕ2 модифицирован путем вставки последовательности ДНК, включающей по крайней мере один нуклеотид.
4. Штамм по п.З, в котором ген АТЕ2 модифицирован путем вставки селекционного гена иКАЗ.
5. Штамм по п.З, в котором ген АТЕ2 модифицирован путем вставки блока экспрессии ТЕЕ1_ргот/РСК_1егт.
6. Штамм по и.4, представляющий собой штамм З.ссгсуыас ΤΟΥ156.
7. Штамм по и.4, представляющий собой штамм З.ссгсуыас ΤΟΥ158.
8. Штамм по и.5, представляющий собой штамм 8. ссгсуыас ΤΟΥ186.
9. Штамм по любому из пи. 1-5 формулы, дополнительно экспрессирующий по крайней мере один из ферментов пути биосинтеза гидрокортизона из холестерина, выбираемый из группы, включающей фермент расщепления боковой цепи холестерина (Р₄₅о8СС);

33-гидрокси-дельта⁵-стероид-дегидрогеназу/дельта⁵-дельта⁴-стероид-изомеразу (3 βΗδϋ); и

17а-стероид-гидроксилазу (Р₄₅о17а).
10. Штамм по п.9, дополнительно экспрессирующий 3β-Η8ϋ.
11. Штамм З.ссгсуыас по пп.4 и 10, представляющий собой штамм З.ссгсуыас Τ6Υ158/ρΤ6Υ10862.
12. Штамм по п.9, дополнительно экспрессирующий Р₄₅о17а.
13. Штамм по пи.5 и 12, представляющий собой штамм З.ссгсуыас ΤΟΥ186/ρΤΟ10435.
14. Штамм по п.9, дополнительно экспрессирующий 3β-Η8ϋ и Р₄₅о17а.
15. Штамм по пи.5 и 14, представляющий собой штамм З.ссгсуыас ΤΟΥ186/ρΤΟ10417.
16. Способ получения окисленного стерина, согласно которому культивируют трансформированный штамм дрожжей по любому из пи. 9-15 и выделяют окисленный эндогенный стерин.
17. Способ получения окисленного стерина или стероида, согласно которому культивируют трансформированный штамм дрожжей по любому из пп.9-15, который инкубируют с экзогенным стерином или стероидом и выделяют полученное окисленное соединение.
18. Способ по и. 17, согласно которому субстратом является 3 β-гидроксистсроид и в котором используют трансформированный штамм дрожжей по и. 10 и выделяют полученный 3-оксо-дельта⁴-стероид.
19. Способ по и. 18, согласно которому 3βгидроксистероид выбирают среди прегненолона или 17а-гидроксипрегненолона.
20. Способ по п.17, согласно которому субстратом является стероид и в котором используют трансформированный штамм дрожжей по и. 12 и выделяют полученный 17агидроксилированный стероид.
21. Способ по п.20, согласно которому стероидным субстратом является прегненолон или прогестерон.
22. Способ по и. 17, согласно которому субстратом является ЗЗ-гидроксистероид и в котором используют трансформированный штамм дрожжей по и. 14 и выделяют полученный 17а-гидроксилированный 3-оксо-дельта⁴ стероид.
23. Способ по и.22, согласно которому стероидным субстратом является прегненолон.