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KR100278513B1 - 이중 코팅을 갖는 철-함유 나노입자 및 진단 및 치료에 있어서의 그의 용도 - Google Patents

이중 코팅을 갖는 철-함유 나노입자 및 진단 및 치료에 있어서의 그의 용도 Download PDF

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KR100278513B1
KR100278513B1 KR1019970700649A KR19970700649A KR100278513B1 KR 100278513 B1 KR100278513 B1 KR 100278513B1 KR 1019970700649 A KR1019970700649 A KR 1019970700649A KR 19970700649 A KR19970700649 A KR 19970700649A KR 100278513 B1 KR100278513 B1 KR 100278513B1
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Abstract

본 발명은 모듈 구조를 갖는 철-함유 나노입자, 그의 제조방법 및 진단 및 치료 목적에 있어서 그의 용도에 관한 것이다.
본 발명에 따른 나노입자는 철-함유 코어, 제 1 코트(합성 중합체) 및 제 2 코트(표적 중합체), 및 임의로 약제학적 보조제, 약제 및/또는 흡착 매체/증강제로 구성됨을 특징으로 한다.

Description

[발명의 명칭]
이중 코팅을 갖는 철-함유 나노입자 및 진단 및 치료에 있어서 그의 용도
[발명의 상세한 설명]
본 발명은 모듈(module) 구조를 갖는 철-함유 나노입자, 그의 제조방법 및 진단 및 치료에 있어서 그의 용도에 관한 것이다.
낮은 장 세기에서도 극대 자화를 나타내지만(고포화 자화), 외부 자장이 사라진 후에는 잔류 자기를 띠지 않는 물질은 열에너지가 자발적으로 자화된 바이스(weiss) 영역의 영구 배열을 방해하기 때문에 초상자성(superparamagnetic) 물질로 불려진다. 이러한 범주는 비경구적 MR 조영 물질로서 개발된 철-함유 결정을 포함한다. 이러한 물질의 특성은 양성자 완화 시간에 강한 영향을 주고, 따라서 이러한 진단 방법에 있어서 조영제로서 상당히 유효하다는 것이다. 의학적 진단의 경우에, 초상자성 물질을 조사하는데 있어서 마그네타이트 또는 마그헤마이트(스피넬, 역 스피넬)에서 발견되는 종류의 "마그네타이트-유사" 결정 구조를 갖는 산화철에 관심을 집중시켰다.
MR 조영 물질로서 사용되는 초상자성 산화철은 이들이 그의 근거리에서 양성자 완화에 강력하게 영향을 주고(높은 완화성), "마그네타이트-유사" 결정 구조를 갖는 입자라는 점에서 유사한 성질을 갖는다.
초상자성을 갖는 철-함유 결정(산화철)을 제조하는 많은 방법이 알려져 있다. 이들 방법은 여러 일면에 따라 분류될 수 있다. 초상자성 결정을 제조하는 두가지 기초적인 방법은 고온에서 소결시키고, 계속해서 기계적으로 분쇄하거나, 또는 용액에서 습식적으로 화학 합성하는 것으로 구분될 수 있다. 지금까지, 습식 합성방법에 의해 제조된 입자만이 의학용으로 연구되었으며, 소결 방법에 의해서는 자력 분리 방법과 같이 생물공학용 및 공학용(소리 매체, 페인트 안료 및 토너)를 위해 산화철을 제조하는 것으로 알려져 있다[참조: Schostek S, Beer A; DE 3,729,697 Al; Borelli NF, Luderer AA, Panzarino JN; US 4,323,056, Osamu I, Takeshi H, Toshihiro M et al.; JP 60,260,463 A2]. 습식 화학 합성방법은 두 부류로 나뉘어질 수 있다. 여기에는, 우선 철-함유 코어(산화철)를 제조하고, 여기에 안정화제를 첨가하여 물리적 및 갈레닉(galenic) 품질을 확증시키는 "이중-포트합성방법"이 있다. 이온 교환체를 사용하여 철 코어를 제조하는 방법은 "이중-포트 합성방법"을 변형시킨 것이다. "단일-포트 합성방법"에 의해서는, 철 염의 침전 및 핵화 동안에 코어를 이미 코팅한 안정화제의 존재하에서 산화철이 제조되고, 따라서 나노입자가 응집되거나 침강하는 것이 방지된다.
포함된 방법에 따른 특징적인 "이중-포트" 및 "단일-포트" 방법과는 별개로, 사용된 용매 형태에 따라, 즉 수성 방법[참조: Hasegawa M, Hokukoku S; US 4,101,435; Fuji Rebio K.K.; JP 59,195,161] 및 비수성 방법[참조: Porath J, Mats L; EP 179,039 A2; Shigeo A, Mikio K, Toshikatzu M; J. Mater. Chem. 2(3); 277-280; 1992; Norio H, Saturo O; JP 05,026,879 A2] 사이에 차이가 있다.
비수성 용매를 사용하여 "이중-포트"방법으로 제조된 입자는 주로 엔지니어링에 사용된다. 인간을 진단하는데 있어서 조영 물질로 사용되는 자기 산화철은 의학적 및 독물학적인 이유로 수성 분산제를 필요로 한다. 비수성 용매로 제조되었지만 제조후 수성 매질에 분산될 경우 안정할 수 있는 비수성 용매중에서 제조된 입자가 이 범주에서 특별한 경우인 것으로 여겨진다. 이러한 입자는 일반적으로, 예를 들어 자기 분리 엔지니어링에서 탈체(ex-vivo) 진단제를 널리 사용[참조: Chagnon MS, Groman EV, Josephson L, et al.; US 4,554,088]되지만, 또한 생체내 진단제로도 제안되었다[참조: Pilgrimm H; US 5,160,725].
초기에 1980 년 중반까지 실험적인 연구에 "이중-포트"방법으로 제조된 입자가 주로 사용되었지만, 산화철을 포함한 오늘날의 시험은 "단일-포트 합성방법"에 의해 제조된 물질에 대해서만 기술하였다. "단일-포트" 방법에 의해 제조된 초상자성 철-함유 산화물은 그의 물리적 및 화학적 품질뿐 아니라 약제학적/갈레닉 안정성이 "이중-포트" 방법에 의해 제조된 것보다 뛰어나기 때문에 일반적으로 인간을 진단하기 위한 초상자성 철-함유 산화물을 제조하는데 사용된다.
"단일-포트 방법"에 따라 수성 매질에서 제조된 입자의 약제학적으로 안정한 현탁액/용액은 상이한 크기의 산화철로 나눌수 있다. 마이크로미터 범위의 입자가 생체공학적 적용을 위해 제안되었으며[참조: Schr
Figure kpo00001
der U, Mosbach K; WO 83/01738 또는 Schr
Figure kpo00002
der U; WO 83/03426], 심지어 생체내 진단용 및 치료를 위한 용도로 제안되었다[참조: Widder KJ, Senyei AE; US 4,247,406 또는 Jacobsen T, Klaveness J; WO 85/04330]. 그러나, 의학적 진단용도로 접근하기 위하여, 나노미터 범위의 입자가 오늘날 제시하고 있는 주요 입자이다. 이러한 범위는 또한 바람직한 용도에 따라 "크거나"(총 직경 약 > 50nm) 또는 "작은"(총 직경 약 < 50nm) 입자로 나뉘어질 수 있다. 간 및 비장의 MR 진단법은 상기 크기의 입자가 급속히 그리고 거의 완전히 상기 장기의 마크로파지에 의해 흡수되기 때문에 이들의 주 적용 범위이다[참조: Kresse M, Pfefferer D, Lawaczeck R; EP 516,252 A2 또는 Groman EV, Josephson L; US 4,770,183]. 추가로, 임상적 과온증에서 보강 물질로서 사용하는 것에 대해서도 제안되었다[참조: Hasegawa M, Hirose K, Hokukoku S, et al.; WO 92/22586 A1 및 Gordon RP; US 4,731,239].
의학적 용도로 일반적으로 제안된 거의 모든 입자는 안정화 물질로서 덱스트란[참조: Bacic G, Niesmann MR, Magin RL et al.; SMRM - Book of abstracts 328; 1987; Ohgushi M, Nagayama K, Wada A et al.; J. Magnetic Resonance 29; 599-601; 1978; Pouliqurn D, Le Jeune JJ, Perdrisot R et al.; Magnetic Resonance Imaging 9; 275-283; 1991 또는 Ferrucci JT and Stark DD; AJR 155; 311-325; 1990]의 존재하에서 제조된 산화철이며, 다른 폴리사카라이드, 예를 들어 아라비노갈락탄[참조: Josephson L, Groman EV, Menz E et al; Magnetic Resonance Imaging 8; 616-637; 1990], 전분[참조: Fahlvik AK, Holtz E, Schr
Figure kpo00003
der U et al; Invest. Radiol. 25; 793-797; 1990], 글리코스아미노글리칸[참조: Pfefferer D, Schimpfky C, Lawaczeck R; SMRM - Book of abstracts 773; 1993] 및 프로테인[참조: Widder DJ, Grief WL, Widder KJ et al.; AJR 148; 399-404; 1987]을 사용한 것도 또한 알려져 있다.
철 염, 온도, 코팅 중합체(안정화제), 적정율, 알칼리 선택, 정제화 등을 포함한 합성에 대한 추출 조건은 생성물의 화학적 및 물리적 성질, 및 따라서 그의 약제학적 및 갈레닉 품질뿐 아니라 의학적 가치에 영향을 미친다.
특정 적용에서 효과적으로 사용될 수 있도록 개발하는 과정에서 중요한 단계는 Weissleader 및 Papisov[참조: Weissleader R; Papisov MI; Reviews of Magnetic Resonance in Medicine 4; 1-20; 1992]에 의해 이루어졌는데, 이들은 자기 산화철의 "표적화가능성"이 입자크기에 반비례하는 것을 입증하였다. 이와 관련하여 문제점은 입자 크기가 작아질수록 효율(MR 효과)이 감소한다는 것이다. 분별 단계없이 특히 작은 자기 산화철을 제조하는 방법이 최근에 알려졌다[참조: Hasegawa M, Ito Y, Yamada H, et al.; JP 4,227,792]. "기능적 이미지화"에 대한 실험이 MIONs라 불리는 특히 작은 입자에 대해 보고되었다. 상기 입자의 덱스트란 코팅(자기 라벨)을 과요오드산염을 사용하여 산화시킨 후, 특정 분자(안티마이오신; 다클론 항체)와 커플링시킨다[참조: Weissleder R, Lee AS, Khaw BA et al.; Radiology 182; 381-385; 1992, 또는 Weissleder R, Lee As, Fishman A et al.; Radiology 181; 245-249; 1991].
특별한 과정이 Menz 등[참조: Menz ET, Rothenberg JM, Groman EV, et al.; Wo 90/01295]에 의해 수행되었는데, 이들은 큰 나노미터 입자를 생리학적 이펙터 셀(effector cell)을 갖는 중합체(아라비노갈락탄)로 코팅시키고, Gordon 등[참조: Gordon RT; US 4,735,796]과 같이 수용체-개재된 세포내이입을 이용한 특정 흡수 메카니즘을 청구하였으며, 덱스트란-안정화된 입자를 과요오드산염을 사용하여 산화시킨 후, 이들을 환원적 아민화에 의해 트랜스페린과 결합시켰다.
간 및 비장의 MR 진단에서 조영 물질로서 사용되는 "큰" 초상자성 산화철을 제조하는 것은 당해기술에서 수행되고 있으며, 상기 물질을 진단학적으로 사용하는데 있어서 이점은 입증되었다. 이들 산화철의 일부는 임상적 목적으로 개발되었다(AMI-25; Advanced Magnetics Inc.; Cambridge; Mass.; USA; Phase Ⅲ/Ⅳ) 및 SHU 555A; Schering AG Berlin; Germany; Phase Ⅱ). MR 림포그래피(lymphography) 또는 MR 안지오그래피(gngiography)와 같은 특별한(간외) 접근에 대한 산화철의 유체역학적 직경의 중요점은 공지되었으며, 실험되었다. 혈액에서 반감기는 다른 조건은 동일한 입자의 직경이 작을수록 증가한다. 작은 산화철을 제조하는데 있어서 합성 변수는 문헌에 공지되어 있다.
초상자성 산화철을 기본으로 한 특정 조영 물질을 개발하는데 있어서 직면하는 필수적인 문제는 철-함유 코어를 제조하기에 매우 적합한 안정화제가 표적으로 하는 목적에 매우 제한적이기 때문에, 물리적 화학적 파라미터에 동시적으로 결점을 제공하지 않으면서 목적하는 성질, 즉 목표로 하는 조직에서 분포 및 축적을 개선시키는 것이 불가능하다는 것이다. 또한, 합성동안에 반응조건(산-알칼리성 pH, 온도, 산화환원반응 및 철염)은 중요하고 매우 특이적인 분자(프로테인, 펩타이드, 올리고뉴클레오타이드, 또한 대부분의 올리고- 및 폴리사카라이드)의 전체 그룹이 합성후 어떤 목적하는 성질(생체활성)을 가져야 할때는 언제나 상을 제조하는데 있어서 안정화제로서 사용될 수 없기 때문에 가능한 안정화제의 선택성을 감소시킨다.
현재까지 사용된 (화학적으로) "불감성" 중합체, 주로 덱스트란으로 부터 각종 비-조절가능한 반응, 예를 들어 산성 범위의 pH 값에서 탈중합화(저분자량 덱스트란은 예를 들어 산 가수분해에 의해 기술적인 품질로 수득된다) 및 알칼리 범위에서 (글리코-)중합체의 완전한 파괴(침전 단계)를 일으킬 수 있는 여러 다른 반응이 합성조건에서 발생할 수 있음은 알려져 있다. 슈크로/글리코화학 및 필요한 반응 조건을 고려하여 볼 때, 당해기술의 "덱스트란 마그네타이트"는 덱스트란이 안정화에 사용되지만 합성후 남아있지 않기 때문에 전혀 덱스트란 마그네타이트가 아닌 것으로 가정될 수 있다. 이것을 약제학적 및 승인 견지에서 본다면, 안정화제가 코트를 형성하고, 따라서 생물학적 행동을 주요 수준까지 결정하기 때문에 필수성분은 공지되지 않았거나 보고되지 않은 것임을 의미한다.
이로부터 결과되는 또 다른 실제적인 문제점은 표면 그 자체가 공지되지 않는다면 표면 성질이 앞으로의 개발동안에 최적화될 수 없다는 것이다.
최대로 연구되왔던 MR 림포그래피와 같은 특정 적용은 안정화제로서 덱스트란을 사용한 당해 기술의 크기 최적화가(작은 산화철의 제조에 있어서 다른 중합체는 알려지지 않았다), 한편으로는 임파 조직에서 상당한 입자가 축적되도록 하기 때문에 적용성을 개선시키고, 다른 한편으로는 림프절을 통한 그의 분포가 임상적 적용을 위해 충분히 균질하지 않다는 것을 나타내는데 사용될 수 있다[참조: Taupitz, M et al.; SMRM - Book of abstracts 500; New York; USA; 1993]. 이와 같은 강력하지만 불균질한 축적은, 매우 있음직하지 않지만, 유체역학적 직경의 반복적인 최적화에 의해 또 다른 개선을 이룬다.
표적 기관의 작은 크기는 특이적인 진단 물질을 개발하는데 있어서 중요한 문제이다. 림프절의 총 중량은 예를 들어 체중의 1% 미만이다. 따라서 진단 물질은 표적 조직에서 상당한 축적 가능성을 가져야 하며(특이성), 저농도에서도 강력한 콘트라스트-증강 효과를 제공하여야 한다.
현재 사용되고 있는 초상자성 산화철은 MR에서 가장 강한 콘트라스트를 갖는 물질 그룹을 나타내며, 이들 입자는 특정 적용에 대해 특히 적합한 것으로 나타났다. 그러나, 상기 물질의 특정 성질을 제공하는 산화철의 결정 코어는 입자 크기가 생물학적 행동에 실질적으로 영향을 주기 때문에 문제를 일으킨다. 작은 입자 크기는 표적가능성을 개선시키지만, 입자 크기 및 자기 모멘트의 상호의존성에 의해 조영 물질의 효율은 떨어져 (물리적인) 콘트라스트 효과 및 (생물학적) 표적가능성 간의 절충을 찾아야 한다. 일반적으로, 철-함유 코어는 총 직경은 작은 상태로 유지하면서 고효율성을 이룰만큼 커야한다.
본 발명에 따라 다루어진 문제는 특정 나노입자로 물리적 및 생물학적 요구를 최적의 방식으로 성취시키는 철-함유 나노입자를 제공하는 것이다.
놀랍게도, 본 발명에 따른 나노입자의 목표로 하는 능력은 당해 기술의 산화철 입자보다 훨씬 뛰어나다. 전례없는 "표적가능성"의 조영 물질 및/또는 치료 물질/지지 시스템은 물리적 성질과 나노입자의 개선된 표적 능력을 조합함으로써 달성될 수 있다.
나노입자는 개개 블록으로 부터 제조되며(모듈 디자인), 이것은 철-함유 코어(물리적 효과; 콘트라스트)가 표적 성분(생물학적 행동)과 결합될 때 최대 융통성을 보장한다. 이러한 모듈 구조는 매우 민감할 수 있는 표적 분자 및 저장될 수 있는(철-함유 코어) 성분으로 부터 제시간(just-in-time)에 완전한 나노입자의 어셈블리를 가능하게 한다는 점에서 유리하다. 임상적 방사성 약물로 부터 공지된 냉각 키트와 상기의 유사성은 또한 예를 들어 표적 분자(예를 들어 자원성 항체)로서 개개 환자의 혈청 성분을 사용할 수 있도록 해 준다.
본 발명의 나노입자는 또한 그의 강렬한 색깔때문에 육안적으로 관찰될 수 있으며, 이는 수술시 눈에 보이는 표지 물질로서 사용될 때 바람직하다.
추가로, 기술된 나노입자는 또한, 예를 들어 외부 자석을 사용하여 자기적으로 결합된 활성 물질의 방출과 함께 상기 표적 부피를 자기적으로 표적화시키켜 치료적으로 사용하는데 적합하다. 나노입자는 예를 들어 종양에서 축적될 수 있으며, 따라서 국부적인 과온증에서 특이적인 강화제로서 사용될 수 있다.
본 발명의 나노입자는 철-함유 코어, 최적 크기의 나노입자를 확신하는 제 1 코트(합성 중합체) 및 제 2 코트(표적 중합체), 및 임의로 약제학적 보조제, 약제 및/또는 흡수 매체/증강제를 포함한다.
철-함유 코어는 입자, 콜로이드 또는 결정 형태를 가질 수 있다. 나노입자는 물리적 및/또는 약제학적 및/또는 갈레닉 품질의 조절을 위해 제조동안에 필요하고, 코어 제조시 1 차 코트로서 코어를 코팅하는 합성 중합체를 함유한다. 그후 철에 대한 합성 중합체의 비를 탈착(desorption) 수단에 의해 목적하는 값으로 조정한다. 나노입자의 표면을 나타내고, 코어 및 1 차 코트의 기본 구조 유니트를 포위하는 표적 중합체를 특정 진단에 사용하기 위해 흡착시킨다. 흡착 매체/증강제가 향상된 흡착을 위해 제 1 및 제 2 코트 사이에 존재할 수 있다. 그밖의 다른 나노입자의 성분은 약제학적 보조제 또는 약제일 수 있다.
제 1 도는 본 발명에 따른 나노입자 구조의 단면도를 나타낸다.
용액중의 상기 기본 구조 유니트(철-함유 코어 + 1 차 코트)의 유체역학적 직경은 100 nm 미만, 바람직하게는 50 nm 미만이고, 철-함유 코어 직경의 5 배를 넘으면 않된다.
본 발명에 따른 나노입자는 추가로 바람직한 안정한 콜로이드상 졸 형태가 가능하고, 또한 의약에 일반적인 용매를 사용하여 용액(전해질 용액, 혈장 팽창제, 글루코스 용액, 생리식염수 등)에 용이하게 재도입될 수 있는 동결건조된 분말로서 제형화시킬 수 있거나, 또는 기본 분자 구조, 표적 성분 및 임의의 보조제가 목적하는 시점에 혼합되어 투여용 용액을 제공할 수 있는 동결건조물 또는 분리된 용액인 특징을 갖는다.
철-함유 코어는 철(Ⅱ) 또는 철(Ⅲ) 이온보다 큰 자기 모멘트를 갖는다. 철-함유 코어는 그의 자기 성질때문에 물질이 MR 토모그래피(tomography)에서 조영 물질로서 사용될 때 콘트라스트-증강 효과를 촉진시킨다. 최적 콘트라스트를 위하여 초상자성이거나, 또는 적어도 초상자성 부분을 함유하여야 한다. 이것은 이러한 유형의 자성만이 고체 물질에서 발생하기 때문에 코어가 결정이거나 또는 다원자 컴플렉스("입자")이어야 함을 의미한다.
본 발명의 철-함유 코어는 마그네타이트 또는 마그헤마이트로 구성되거나 이를 함유할 수 있다.
코어에 함유된 25 중량% 이하의 철이 다른 금속 이온으로 대체될 수 있다.
상기 비-철 금속 이온은 상자성, 반자성 또는 이둘의 혼합 형태이다.
본 발명에 따른 나노입자는 추가로 철-함유 코어가 전자현미경으로 측정된 것으로 30 nm 미만, 바람직하게는 15 nm 미만의 직경을 갖고, 적어도 90%의 철-함유 코어가 0.7x평균 내지 1.3x평균 범위의 입자 크기 분포를 갖는 금속 원자를 최소 50 개 함유하는 특징을 갖는다.
나노입자는 합성 중합체를 존재하는 금속 이온의 총 중량의 0.01 내지 1배로 함유한다. 바람직한 함량 범위는 중량의 0.25 내지 0.75 배이다.
100,000 Da 미만의 분자량을 갖는 모노머 또는 중합체 물질, 또는 이들 물질 또는 유도체의 혼합물, 또는 기능 그룹을 함유하는 유도체의 혼합물, 또는 부가적으로 치환된 유도체의 혼합물이 합성 중합체로 사용된다. 바람직한 물질은 10,000 또는 5000 Da 미만의 분자량을 갖는다.
덱스트란 유도체 또는 덱스트란 및/또는 덱스트란 유도체의 혼합물이 합성 중합체로 사용하기에 특히 바람직하다.
합성 중합체는 그의 분자내에 수개의 산 그룹, 또는 수개의 기능 그룹을 함유하며, 바람직하게는 N,S,P 또는 O 원자를 함유한다.
표적 및 합성 중합체로서 사용된 물질 또는 물질의 혼합물은 동일하거나 상이할 수 있고, 표적 중합체는 합성동안에 합성 중합체의 합성 및 부반응에 노출되지 않기 때문에 그의 생리적 상태를 유지한다.
1 차 코트 및 철-함유 코어의 모(parent) 물질은 나노입자의 물리적인 성질을 결정하며, 반면 표적 중합체는 상기 나노입자의 생물학적 행동을 결정한다.
나노입자에 함유된 표적 중합체의 중량은 존재하는 금속 이온 중량의 0.5 내지 50 배, 바람직하게는 1 내지 25 배이다.
본 발명에 따른 나노입자는 함유된 금속 이온의 총 중량보다 작거나 이와 동일한 양의 흡착 매체/증강제를 함유할 수 있다. 이들 흡착 매체/증강제는 철-함유 코어/(존재하는)합성 중합체를 구성하는 기본 구조 유니트에 의해 표적 중합체의 흡착을 가능하게 하거나, 이를 보강한다.
바람직한 흡착 매체/증강제는 PRTVKHHVN, PRSRHH 또는 RSKRGR[아미노산의 한-글자 코드], 또는 그의 부분 구조를 갖는 펩타이드이다.
나노입자의 모든 성분을 포함한 유체역학적 직경은 철-함유 코어 직경의 10 배 이하이고, 기본 구조 유니트 직경의 20% 이하이다.
본 발명에 따른 나노입자는 어느 시점에서도 배합될 수 있는 기본 구조 유니트, 표적 중합체, 약제 및 흡착 매체와 같은 개개 모듈로 구성된다.
나노입자 제제는 나노미터 범위의 안정화된 철-함유 입자의 저-점도 수성 콜로이드 용액 또는 현탁액이다. 나노입자 용액은 큰 응집체를 함유하지 않으며, 정맥내로 주입될 수 있고, 이는 국제 약전에 씌여진 비경구에 필요한 입자 크기를 만족한다.
일반적으로, 기본 구조 유니트는 열처리에 의해 멸균시킬 수 있다. 최종 나노입자의 "멸균화"는 2 차 코트의 민감도에 의존하지만, 멸균에 의한 무균상태는 어느 경우에도 충족된다. 여과에 의한 멸균은 작은 입자 크기때문에 항상 가능하다. 실제적인 투여용 멸균 용액을 만들 수 있는 또 다른 방법은 민감한 표적 중합체를 사용 직전에 멸균화될 수 있는 기본 구조 유니트와 결합시키는 것으로, 선택적이다.
나노입자는 사용이 용이하고, 예를 들어 MR 조영제로서 사용되는 경우에, 진단상 용량 및 치사량 사이에 매우 유리한 안전 범위를 갖는다. 진단상 용량은 특정한 적용에 따라 체중 kg 당 5 μmol 내지 200 μmol(철) 이고, 대략적인 치사량은 마우스에서 체중 kg 당 20 mmol 내지 50 mmol 이다. 물질은 완전히 생분해된다. 철-함유 코어를 용해시키고, 철을 생리적인 철 풀(pool)에 혼입시킨다. 합성 및 표적 중합체로서 사용된 분자는 일반적으로 분해가능한 기본 유니트(당, 아미노산)로 대사분해된다.
나노입자 용액은 매우 안정하며; 그의 제조후 물리적인 파라미터(입자 크기, 자기 성질)에서 검출될만한 변화는 없다. 용액은 멸균 조건에서 제조되는 경우 장기간동안 저장될 수 있으며, 예를 들어 응집 또는 침강과 같은 불안정성은 12개월내에 관찰되지 않는다.
용액 또는 현탁액은 철-함유 결정의 강렬한 색으로 인해 적갈색에서 흑색을 띤다. 이러한 특징적인 색깔은 상기 물질이 외과 의학에서 표지화에 사용될 수 있도록 하는 육안 관찰 목적으로 사용될 수 있다. 나노입자는 MR 토모그래피에서 조영제로서 사용되는 경우에 초상자성이거나, 초상자성 부분을 함유한다. 입자는 심지어 낮은 장 세기에서도 높은 포화 자화를 나타내고, 외부 자장이 사라진 후에는 잔류 자기를 띠지 않는다.
나노입자는 용액(현탁액)으로 제형화시킬 수 있고, 추가의 제제화없이 적용시킬 수 있다. 나노입자 용액은 생리식염수, 전해질 용액 또는 글루코스 용액과 같은 일반적인 의학 용매와 양립하기 때문에, 입자를 목적하는 정도까지 희석시킬 수 있고, 특정 적용을 위해 주사하거나 주입시킬 수 있다.
동결건조물은 저장면에서 볼 때 용액을 제형화시키는 대안적인 방법이다. 기본 구조 유니트를 동결건조시키고, 그 후에 용해된 표적 중합체에 재현탁시키거나, 또는 기본 구조 유니트 및 나노입자를 흡착후 동결건조시키고 생리식염수 또는 멸균 주사용 증류수에 사용하기 전에 재용해시킨다. 상기 물질을 저장하는 또 다른 방법은 기본 구조 유니트 및 표적 중합체를 개별 용액에 저장하고, 사용전에 이들을 혼합하는 것이다.
특정한 또는 콜로이드성 철-함유 코어는 일분자적으로 용해시킨 철 전구체를 단일-포트 합성후 그의 pH를 변경시키고, 안정화 물질(합성 중합체)의 존재하에서 침전시킴으로써 제조된다. 합성 중합체는 제조동안에 결정 코어를 분리시키고, 따라서 입자 크기를 조절하는데 사용될 수 있다. 합성 중합체는 결정 코어 및 전체 나노입자의 물리적 및 약제학적/갈레닉 성질을 좌우한다. 합성 중합체는 코어가 응집이 발생할 수 없는 정도로 분리(멸균 안정화)되기 때문에 안정한 용액(현탁액)을 제공한다.
철-함유 코어 입자가 수득되면, 합성 중합체를 탈착에 의해 제시된 함성 중합체 대 철 비율로 조정한다. 철-함유 코어를 1 차 코팅으로 안정화시키고, 피복시킨 철 코어 및 합성 중합체 잔류물의 용액(현탁액)은 모듈 시스템의 기본 구조 유니트를 나타낸다. 이러한 기본 구조 유니트는 뛰어난 물리적 및 갈레닉 성질을 특징으로 한다.
제 2 주요 성분은 합성후 기본 구조 유니트에 의해 흡착되고, 2 차 코트로서 제 1 코트 및 코어를 피복하는 표적 중합체이다. 제 2 코트는 나노입자의 표면이고, 생체내 행동을 결정한다. 기본 구조 유니트 및 표적 중합체를 아무때에나 혼합할 수 있으며, 이것은 또한 "제시간" 제조를 가능하게 한다.
합성 중합체 잔류물 및 표적 중합체 간의 흡착 과정은 중간 단계(흡착매체/증강제의 첨가)에 의해 향상되거나 용이해 질 수 있다. 흡착 매체/증강제는 또한 표적 중합체와 함께 혼합물에 첨가될 수 있다. 약제학적 보조제 또는 약제는 유사한 방법으로 아무때나 첨가될 수 있다.
본 발명의 특별한 이점은 본 발명에 따른 제조방법이 처음으로 특정 나노입자에 필요한 물리적 및 생물학적 요구를 최적의 방법으로 만족시킬 수 있도록 함으로써 명백하다.
입자의 모듈 구조때문에 가장 적합한 물리적 성질을 갖는 합성 중합체가 합성을 위해 선택될 수 있으며, 즉 나노입자의 목적하는 생물학적 표적성의 제한없이 기본 구조 유니트(철-함유 코어 + 제 1 코트) 및 표적 중합체(제 2 코트)를 별개로 제조함으로써 처음으로 나노입자의 물리적 및 약제학적 성질 및 그의 목적하는 생물학적 효과에 대한 절충을 고려할 필요가 없게 되었다. 표적 중합체는 파괴적인 합성 조건에 노출되지 않는다. 이것은 제 1 코트로서 배제된 많은 물질을 표적을 위해 사용할 수 있도록 해준다. 유사하게, 정확한 반응 조건을 필요로 하고 리간드의 완전성을 감소시키는 후-합성적 화학 반응이 필요없다; 예를 들어 과요오드산염 산화에서와 같이 디설파이드 브릿지를 함유하는 프로테인을 포함한 산화환원반응 및 후속하는 환원적 아미드화는 필요없으며, 생물학적 활성은 유지된다.
또 다른 중요한 이점은 과요오드산염과 같은 반응 용액을 분리하지 않아도 되기 때문에 기본 구조 유니트/표적 중합체를 정제할 필요가 없다는 것이다. 이 방법은, 예를 들어 "개개" 조영제(예를 들어 자원성 항체)에 필요하거나 바람직할 수 있거나, 또는 표적 중합체가 단시만 동안만 용액에 안정하게 유지되는 경우에 사용직전 나노입자의 "제시간" 제조를 포함한 순간 제조를 가능하게 한다.
본 발명에 따른 방법은 나노입자의 표면이 별개로 개선/최적화되기 때문에 추가의 최적화에 대한 이점을 가지며, 분석은 NMR 또는 IR 분광학과 같은 진보된 분석 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 이들 방법은 특정 코어가 존재하면 적용할 수 없다.
표면이 규정된 방법으로 제조되고, 적절하게 분석될 수 있기 때문에 표면 성질의 계통적인 최적화가 가능한 반면, 선행기술의 제조방법은 입자가 전체로서 처리되고, 표면이 알려지지 않았으며, 시행착오적인 방법으로만 최적화될 수 있다.
따라서, 나노입자는 몇개의 단계로 제조된다. 철-함유 코어는 일반적으로 "단일-포트" 방법에 의해, 즉 안정화제(합성 중합체)의 존재하에서 합성된다. 안정화제(합성 중합체)를 물에 용해시키고, 일분자 철 화합물과 혼합한다. 철염을 pH 값을 증가시킴에 의해 바람직한 산화물로 전환시킨다. 또 다르게, 안정화제 용액을 알칼리화시킨 후, 철 염과 혼합할 수 있다. 혼합물을 환류하에 가열하고, 중화시키거나, 이 순서를 바꾸어 수행할 수 있다. 조 물질을 정제하고, 나머지 또는 단단하게 흡착/결합되지 않은 합성 중합체를 탈착 수단에 의해 정확한 철-대-안정화제 중량비로 조정한다. 산화철 코어 및 (잔류) 합성 중합체로 구성된 이와 같은 정제된 탈착 베이스 물질은 나노입자의 기본 구조(모듈 구조)를 나타낸다. 열에 의한 멸균화를 임의로 수행할 수 있다. 저장시 유지를 위해 또는 필요한 경우, 선택된 표적 중합체를 기본 구조 유니트에 의해 흡착시킨다(임의로 흡착 매체/증강제의 중간 흡착 또는 공동-흡착과 함께). 약제학적 보조제 또는 약제를 임의로 첨가할 수 있다. 일반적인 제조방법의 개략도를 제 2 도에 나타내었다.
이후 철-함유 코어의 설명에 대해 "단일-포트"방법에 따른 합성은 항상 안정화제의 존재하에서 일어남을 주목하여라.
화학양론적 양의 철(Ⅱ) 및 철(Ⅲ) 염을 전구체로서 혼합하여 철-함유 코어를 제조한다. 생성된 결정의 성질은 사용된 염에 의해 영향을 받으며; 문헌에 따라 염산의 염, 즉 염화제1철 및 제2철이 주로 사용된다. 그러나, 일반적으로 설페이트 및 나이트레이트를 포함한 모든 강산염이 사용될 수 있다. 이들 염이 사용되는 경우, 철(Ⅱ)염은 산화에 매우 민감하기 때문에 정확한 화학양론을 확신하는 것은 어렵다. 여기에서는 산화에 덜 민감한 모어(Mohr)염과 같은 더 복잡한 염을 사용하는 것이 유리하다.
놀랍게도, 유기 음이온은 안정화제 또는 보조 안정화제로 작용하기 때문에 유기염이 무기염보다 우수한 것으로 입증되었다. 철(Ⅱ) 글루코네이트 또는 철(Ⅲ) 시트레이트가 특히 적합한 것으로 입증되었지만, 푸마레이트, 타르트레이트, 락테이트 또는 살리실레이트와 같은 그밖의 다른 유기 음이온도 마찬가지로 사용될 수 있다.
철(Ⅲ) 염에만 좌우되는 합성 변법은 산화에 매우 민감한 철(Ⅱ) 염에 의지하지 않고 제조를 용이하게 하며, "이종 이온"의 수를 감소시킨다. 이 합성 변법은 철(Ⅲ) 염으로 부터 출발하며, 이로부터 철(Ⅱ) 염은 반응동안에 계산량의 환원제에 의해서만 동일계에서 생성된다. 일반적으로, 화학양론적 정확도로 철(Ⅲ)을 환원시키는 모든 환원제를 사용하는 것이 가능하더라도, 반응 하이드록실아민이 아산화질소로 정량적으로 전환되고, 따라서 반응 혼합물로 부터 용이하고 완전하게 제거되기 때문에 하이드록실아민이 바람직하다.
4 Fe3++ 2 NH2OH → 4 Fe2++ N2O +4 H++H2O
전술한 방법의 단점은 철 염을 화학적인 입장에서 면밀히 볼 때 명백해진다. 화학양론적 조성물중의 철(Ⅱ) 및 철(Ⅲ)을 규정된 구조를 갖는 결정으로 전환시키는 것이 침전 단계의 목적이다. 각각의 산화물은 pH 값을 증가시킴으로써 형성된다. 그러나, 철(Ⅲ) 이온[pKLFe(OH)3약 371](여기에서 pKL값은 농도에 의존한다. 데이타는 10-2 mol/ℓ 용액에 대한 값이다) 이 약 2 의 pH 값에서 다소 가용성의 하이드록사이드를 형성하는 반면, 철(Ⅱ) 이온은 pH 8 에서 하이드록사이드[pKLFe(OH)2약 13.5]로서 침전하기 시작하는 것을 고려해 볼때, 목적하는 결정의 직접적인 형성이 거의 가능하지 않고, 반응 경로가 하이드록사이드의 연속적인 반응을 포함하는 것은 명백하다. 그러나, 적당한 착화제(complexing agent)를 사용하여 철 화합물의 침전점을 서로에 대해 이동시키는 것이 가능하고, 따라서 산화철의 여러 격자 위치에서 동시 침전 및 삽입을 이룰 수 있다. 사용된 철 화합물의 침전점은 적합한 착화제를 선택함으로써 광범하게 조절할 수 있다.
표 1에 따른 "고전적인" 물질은 별개로, 상기 유기 음이온을 착화제로 사용할 수 있다. 철(Ⅱ) 및 철(Ⅲ) 이온의 무기염, 유기 음이온염 및 착물 염을 목적하는 바대로 배합시킬 수 있다.
Figure kpo00004
표 1에 기재된 킬레이트는 적합한 화합물의 범위를 알려주기 위한 것이며, 이들 물질로만 제한되는 것은 아니다.
합성 변법에서, 수산화철(Ⅱ) 및 수산화철(Ⅲ)을 우선 각각 제조한다. 놀랍게도, 산화철 결정은 개별적으로 제조한 하이드록사이드 용액을 배합시킴으로써 성공적으로 제조되며; 변형 및 결정화는 배합시킨 용액을 가열하면 촉진된다.
침전은 철-함유 코어의 제조에 있어서 중요한 단계이다. 특정 철 화합물은 pH 값을 증가시킴으로써 저분자량 철 화합물로 부터 형성되며; 콜로이드상 산화철은 입자 형성동안에 임의적인 중간체 생성물일 수 있다. 용해된 산성 철 전구체의 pH 값을 상승시킬 수 있는 물질이 pH를 증가시키는데 적합하다. 소다라이(soda lye)는 별개로 하고, pH 값은 바람직하게는 가스 또는 염으로서 암모니아, 또는 알칼리성 아민 및 휘발성 완충액을 사용하여 증가시킨다. 놀랍게도, 침전에 사용된 염기는 "생물학적" 효과가 예를 들어 몸체 기관을 통해 입자 분포 차이로서 나타나는 방식으로 전체 성질에 영향을 주는 것으로 판명되었다.
알칼리성 물질의 농도는 0.1 내지 10 N 이어야 하며; pH 증가가 빠른 속도로 일어나는 경우 작은 코어 크기를 갖는 입자가 바람직하게는 형성되기 때문에 약 1 내지 4 N의 농축 용액이 바람직하다.
철 화합물을 0 내지 120℃, 바람직하게는 50 내지 80℃의 온도범위에서 입자위에 침전시킨다. 일반적으로, 산화철이 직접 형성될 때 온도는 낮을 수 있으며, 형성이 중간 단계로서 하이드록사이드를 포함하는 경우에는 온도가 높아야한다. 생성물을 침전후 중화시키고, 계속해서, 특히 하이드록사이드가 중간체 생성물로서 형성되는 경우에, 조 생성물을 환류시키는데, 가열 기간은 0 분 내지 24시간, 바람직하게는 30 분 내지 1 시간이어야 한다. 중화 및 환류는 순서를 바꾸어 수행할 수 있다.
물질의 자체-발색은 수술시 육안 검출을 위해 조영제(광학적 표지 물질)로서 사용하는데 바람직하다.
MR 토모그래피로 적용하기 위해서는 나노입자의 자기 성질에 의해 측정되는 것으로 고효율성을 필요로 한다. 나노입자가 MR 조영 물질로서 사용되는 경우에 산화철 마그네타이트 및 마그헤마이트는 임상적 MR 토모그래피에 적용된 장 세기에서 고포화 자화를 나타내기 때문에 특히 적합한 것으로 여겨진다. 특별한 자기 성질은 특정 철 코어의 결정 구조에 의해 결정된다. 그러나, 놀랍게도, 마그네타이트-유사 결정 구조가 여전히 도착함에 따라 이종 이온이 이 결정 코어에 삽입될 수 있다. 비-철금속 이온에 의한 상기와 같은 도핑은 일반적으로 두가지 방식으로 수행될 수 있다. 한편으로, 철(Ⅱ) 및/또는 철(Ⅲ) 이온이 그의 격자 위치에서 다른 상자성 금속 이온에 의해 치환되고, 다른 한편으로, 반자성 이온이 치환에 사용될 수 있다. 철(Ⅲ) 이온은 평행/역평행 격자 위치를 차지함으로써 그의 개별 자기 벡터가 중화되기 때문에 마그네타이트 결정에서 자화는 철(Ⅱ) 이온으로 부터만 유래된다. 자화의 실(net) 양은 이온보다 더 큰 자기 모멘트를 가지는 이온을 사용하거나, 또는 상자성 또는 반자성 이온을 사용하여 철(Ⅲ) 이온에 의해 차지된 평행/역평행 격자 위치의 평형을 변경시킴으로써 증가시킬 수 있다. 치환이 가돌리늄과 같이 고자기 모멘트를 갖는 상자성 금속을 포함하는 경우, 치환된 철과 비교하여 자기 모멘트의 차이와 맞먹는 증가가 얻어질 수 있다. 철(Ⅲ)이 반자성 금속에 의해 치환되는 경우, 철(Ⅲ) 이온의 보상 모멘트는 더 이상 전체 모멘트에 기여하지 않을 수 있다. 별법으로서, 반자성 및 상자성 이온을 마그네타이트-유사 결정 격자에 함께 삽입시킬 수 있다. 비-철 이온에 의한 도핑은 합성동안에 저분자량 철-함유 모 화합물의 부분 치환에 의해 수행된다.
철-함유 코어를 제조하는 일반적인 방법은 마그네타이트-유사 결정 격자를 합성하는 것이다. 이 목적을 위해 철(Ⅱ) 및 철(Ⅲ) 이온을 1:1 내지 1:20의 비율로 사용한다. 합성은 정확히 1:2의 화학양론적 비를 사용하여 가장 쉽게 수행된다. 철(Ⅱ) 대 철(Ⅲ) 비는 합성동안 환원제에 의해 유지시킬 수 있다. 철(Ⅱ) 및 철(Ⅲ) 이온은 총 철 함량(중량)의 25% 이하로 다른 금속 이온에 의해 대체될 수 있다. 가돌리늄 또는 망간과 같은 상자성 이온은 제외하고, 리튬, 마그네슘 또는 칼슘과 같은 반자성 이온, 또는 상자성 및 반자성 이온의 혼합물을 사용할 수 있다. 마그네타이트 또는 마그네타이트-유사 구조가 바람직한 결정 구조이다. 예를 들어 우선 하이드록사이드가 제조되거나, 예를 들어 마그네타이트가 산화에 의해 마그헤마이트로 전환되는 것과 같이 마그네타이트 결정이 다른 결정으로 전환되면 상기 소위 스페닐 또는 역-스피넬 결정이 2 차 생성물로서 형성될 수 있다. MRT에 대한 조영 물질로서 사용된 나노입자의 특성은 초상자성 성질을 필요로 한다. 초상자성은 고체 물질에서만 발생되며, 따라서 다른 요구조건은 결정이 고체 성질을 갖는 것, 즉 결정이 특별한 결정 또는 적어도 다원자군이라는 것이다. 최소 이온 함량은 결정당 50 철 원자(또는 금속 원자)이어야 한다. 철-함유 코어의 크기는 합성동안에 변수에 의해 광범(1 내지 약 30 nm)하게 조절될 수 있지만, 직경이 15 nm 미만이고 최소 90%의 입자가 0.7x평균 < 평균 < 1.3x평균(평균은 전자 현미경에 의해 측정된 평균 직경이다)의 범위내에 있는 작은 코어를 합성하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 제조방법의 한가지 특별한 장점은 합성 중합체를 선택하는데 있어서 매우 융통적이라는 것이다; 용어 "중합체"는 저분자량 물질 및 저분자량 물질과 고분자량 물질의 혼합물이 철-함유 코어를 제조하는데 사용될 수 있기 때문에 글자그대로 받아들여져서는 안된다. 그의 분자에 음전하 운반체(carrier)를 함유하는 저분자량 및 고분자량 물질을 사용하는 것이 특히 바람직하다. 카복실레이트 또는 유사체, 포스페이트(또는 다른 P-함유 그룹) 및 설페이트(또는 다른 S-함유 그룹)가 바람직하다. 이들 유도체는 단순히 하나의 단일 기능 그룹을 갖거나 수개의 기능 그룹을 함유할 수 있다. 이들이 바탕으로 하는 이론은 철-함유 코어의 표면에 대한 친화성이 합성 중합체의 음전하 및 양성 산화철 표면의 상호작용 때문인 것으로 가정한다. 합성 중합체가 이들 그룹을 수개 함유하는 경우에, 상호작용이 특히 뚜렷하다(여러-자리 결합(multi-side attachment)). 적합한 물질들이 상당히 많기 때문에 이들을 모두 열거할 수는 없다. 합성동안에 안정화에 특히 적합한 물질 그룹은 다음과 같다:
저분자량 물질, 예를 들어 카복시폴리알콜, 폴리카복시폴리알콜, 폴리카복시알콜, 카복시알콜, 알콜, 단당, 올리고당, 및 합성 중합체, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 및 혼합물(블럭- 및 코폴리머), 폴리아크릴산, 폴리비닐 알콜, 폴리락트산(폴리락타이드 및 폴리락타이드 글리사이드), 및 천연 또는 특히 부분적으로 합성되거나 또는 화학적으로 및/또는 효소적으로 개질된 천연 중합체, 예를 들어 덱스트란 및 그의 유도체, 아라빈산, 글리코스아미노글리칸 및 합성 유사체, 전분 및 그의 유도체, 및 젤라틴 유도체.
음전하 운반체를 함유하는 덱스트란의 저분자량 유도체를 사용하는 것이 특히 바람직하다. 여기에서는 (모노)카복시덱스트란이 예로서 제공될 수 있다; 그의 제조방법은 예를 들어 Bremner 등에 의한 [Bremner, I.; Cox, JSG; Moss, Gf; Carbohydrate Research 11; 77-84; 1969]. 다른 바람직한 예는 덱스트란의 하이드록시 그룹 및 6-브로모헥산산사이의 에테르 결합에 의해 형성된 폴리카복시덱스트란을 사용하는 것이다[참조: Noguchi, A.; Takahashi, T; Yamaguchi, T.; Kita mura, Y.; Takakura, T.; Hashida, M.; Sezaki, H.; Bioconjugate chemistry 3; 132-137; 1992]. 여러-자리 결합을 통해 산화철 표면과 상호작용하는데 있어서 폴리-카복시덱스트란이 그의 많은 음전하 때문에 가능하다.
제조동안에 안정화에 필요한 합성 중합체의 양은 배치에 함유된 금속 이온의 총 중량의 0.5 내지 20 배이고; 반응 혼합물에서 그의 총 퍼센트는 중합성 합성 중합체가 사용되는 경우(<50% g/V) 배치의 혼합을 통해 여전히 점착성을 가능케 하도록 선택된다. 사용된 합성 중합체의 중량은 바람직하게는 금속 이온의 총 중량을 3 내지 15 배 능가해야 한다.
조 물질을 제조한 후, 배치중의 합성 중합체 성분을 탈착 방법에 의해 감소시킨다. 크로마토그래피 방법, 자기 분리 방법, 투석, 원심분리 또는 초원심분리, 또는 그밖의 다른 적합한 방법을 탈착에 사용할 수 있다. 탈착을 한가지 탈착 방법과 함께 승온에서 수행할 수 있다. 탈착 정도에 영향을 주는 다른 방법은 완충용액 또는 텐사이드와 같은 탈착 물질을 사용하는 것이다. 조 물질을 탈착시킨 후, 특정 나노입자를 제조하는데 기본 구조 유니트를 나타내는 안정하고 물리적으로 최상인 용액/현탁액을 수득한다. 기본 구조 유니트는 철-함유 코어 및(잔류) 합성 중합체로 구성된다. 잔류 합성 중합체의 양은 탈착 방법에 의해 조정된 비에 따라 0.01 내지 1 이다. 0.25 내지 0.75 범위가 기본 구조 유니트의 안정성 및 흡착성에 가장 적절한 조화를 제공하기 때문에 이 범위가 바람직하다. 기본 구조 유니트의 전체 크기(유체역학적 직경)는 사용된 철-함유 코어 및 합성 중합체의 크기에 따라 달라지며, 따라서 100 nm, 바람직하게는 50 nm 보다 작아야 한다. 총 직경이 코어 직경의 5 배를 넘지않는 기본 구조 유니트를 수득하는 것이 바람직하다.
기본 구조 유니트 및 표적 중합체를 배합하여 최종 나노입자를 수득한다. 흡착된 표적 중합체가 합성 중합체/철-함유 코어 유니트 주위에 제 2 코트를 형성하고, 따라서 입자의 특정 성질을 제외하고 생체내 행동을 주로 결정하는 것은 시스템의 표면이다. 이러한 제조방법의 특별한 장점은 기본 구조 유니트에 의해 흡착될 수 있는 실제적으로 모든 물질이 나노입자의 생물학적 행동을 조절하는데 사용될 수 있다는 것이다. 표적 중합체는 합성 과정에 노출되지 않고, 따라서 민감한 물질 및 지금까지 사용할 수 없었던 물질이 생물학적 행동을 조절하기 위한 지지 물질로서 작용할 수 있다.
적합한 표적 중합체는 다음과 같다.
천연 올리고- 및 폴리사카라이드, 예를 들어 분자량 100,000 Da 미만의 덱스트란, 여러 덱스트란의 혼합물, 상이한 기원의 덱스트란, 특히 정제된 덱스트란(FP = 발열물질 없는 품질), 푸코이단, 아라비노갈락탄, 콘드로이틴 및 그의 설페이트, 더만탄, 헤파린, 헤파리틴, 히알루론산, 케라탄, 폴리갈락투론산, 폴리글루쿠론산, 폴리만누론산, 이눌린, 폴리락토스, 폴리락토스아민, 폴리이노신산, 폴리수크로스, 아밀로스, 아밀로펙틴, 글리코겐, 글루칸, 니게란, 풀루란, 이리신, 아스파라고신, 시니스트린, 트리시틴, 크리테신, 그라미닌, 시토신, 리케닌, 이소리케난, 갈락탄, 갈락토카오로스, 루테오스, 만나스, 만노카롤로스, 푸스툴란, 라미나린, 크산텐, 크실란 및 코폴리머, 아라복실란, 아라비노갈락탄, 아라반, 래이반스(프룩토산스), 테이키닌산, 혈액 그룹 폴리사카라이드, 구아란, 카루빈, 알팔파, 글루코만나스, 갈락토글루코만나스, 포스포만나스, 푸칸스, 펙틴, 사이클로-덱스트린, 알기닌산, 트라라칸트 및 다른 검, 키틴, 키토산, 아가, 푸르셀라란, 카라게난, 셀룰로스, 셀룰론산 또는 아라빈산. 추가로, 상술된 물질의 화학적으로 및/또는 효소적으로 생산된 유도체 및 고분자 화합물의 저분자량 분해 생성물이 가능하다. 임의로, 상기 물질 또는 유도체를 다른 물질로 치환시킬 수 있다. 폴리아미노- 및 슈도폴리아미노가 마찬가지로 적합하다.
합성 올리고- 및 중합체, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌 에테르, 폴리아네톨 설폰산, 폴리에틸렌 이민, 폴리말레이미드, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 클로라이드, 폴리비닐 아세테이트, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리비닐 설페이트, 폴리아크릴산, 폴리메타크릴산, 폴리락타이드, 폴리락타이드 글리사이드.
단당 내지 올리고당 및 관련 물질, 예를 들어 알도- 및 케토트리오스 내지 알도- 및 케토헵토스, 케토옥토스 및 케토노노스, 무수당, 모노카복실산 및 그의 주쇄에 5 또는 6개의 탄소원자를 함유하는 유도체, 사이클라이트, 아미노 및 디아미노당, 데속시 당, 아미노데속시 당 및 아미노당 카복실산, 아미노사이클라이트, 단당 내지 올리고당의 인-함유 유도체.
하나 또는 그 이상의 β-2,6-프룩탄, β-1,3-글루칸, 만노글루칸, 만난, 글루코만난, β-1,3/1,6-글루칸, β-1,6-글루칸, β-1,3/1,4-글루칸, 아라비녹실란, 헤미셀룰로스, β-1,4-크실란, 아라비노글루칸, 아라비노갈락탄, 아라비노푸코글루칸, α-1,6/1,3-글루칸, α-1,5-아라비난, α-1,6-글루칸, β-2,1/2,6-프룩탄, β-2,1-프룩탄 구조를 함유하거나, 또는 리포폴리사카라이드와 같은 항종양 성질(고등 식물, 진균, 태선 및 박테리아)을 갖는 모노머 또는 올리고머탄수화물.
항종양 폴리사카라이드의 효과에 대한 중요한 필요조건은 수-가용성이며, 이것은 6 위치에서 가지를 통해 β-1,3/1,6-글루칸에 의해 만족된다. 수불용성인 폴리사카라이드의 가용성은 친수성 및 이미 수화된 그룹을 도입시킴으로써 향상시킬 수 있다. 치환체로서 메틸 및 에틸과 같은 다른 그룹중에서 아미노, 아세틸, 카복시메틸 또는 설페이트 그룹이 사용될 수 있다.
텐사이드 및 표면-활성 물질, 예를 들어 니오텐사이드, 알킬 글루코사이드, 글루카마이드, 알킬 말토사이드, 단일- 및 다분산 폴리옥시에틸렌, 4급 암모늄염, 담즙산, 알킬 설페이트, 베타인, CHAP 유도체.
예로서, 그리고 다수의 조절 선택권 및 모듈 시스템의 장점을 설명하기 위한 것으로, 생체내 행동을 조절하는 분자(특이성)는 또한 세포 단편, 세포, 박테리아 단편, 거대 렉틴 그룹으로 부터 수득한 물질, 호르몬 및 매개 물질, 프로테인 및 네오프로테인, 펩타이드 및 폴리펩타이드, 항체, 항체 단편 또는 인테그린(ELAM, LECAM, VCAM 등)의 "분자 인식 단위" 또는 수용체-특이적 물질(예를 들어 루이스-X, 살리실-루이스-X 등) 또는 다수의 혈액/혈장/혈청 성분 및 옵소닌, 리포폴리사카라이드, 리포프로테인, 글리세롤 에스테르, 콜레스테롤 및 에스테르 그룹으로부터 유도된 올리고뉴클레오타이드 및 합성 올리고뉴클레오타이드, DNA 및 RNA 또는 그의 유도체 또는 단편 또는 유사체(PNA) 및 동족체, 또는 대사물질 및 대사길항물질, 세포증식 억제제, 의약 물질, 의약 물질의 콘쥬게이트, 화학요법물질 및 세포증식 억제제일 수 있다.
상기 물질 이외에 또는 이에 대신하여 화학적 및/또는 효소적으로 생성된 유도체 또는 분해 생성물을 표적 중합체로 사용할 수 있다.
유도체 또는 "원(native) 표적 중합체"는 추가의 기능 그룹을 포함할 수 있다. 이들 기능 그룹은 기본 표적 분자의 하나 또는 양쪽 말단 또는 그밖의 다른 어느 위치에도 위치할 수 있다. 기능 그룹은 동일할 수 있거나, 또는 상이한 그룹의 배합물일 수 있다. 유도체 그 자체 및 기능 그룹중에서 바람직한 것은 N, S, O 또는 P 원자, 산 또는 유사체, 하이드록시, 에테르 또는 에스테르 그룹을 함유하는 것이다.
나노입자의 정확한 조성은 제시된 조건에 따라 달라진다. 표적 중합체는 개개 물질 또는 합성 및 비-합성, 저분자량 및 고분자량, 유도체화 및 비-유도체화와 같이 표적 중합체의 조합물일 수 있다.
제조에 있어서 특별한 변수는 합성 및 표적 중합체로서 동일한 중합체를 사용하는 것이다. 이것은 합성후 존재하는 합성 중합체가 기술한 바와 같이 더이상 합성에 사용된 중합체와 동일하지 않을 것이기 때문에 표적 중합체가 합성에 사용된 중합체와 동일함을 의미한다. 표적 중합체는 언급된 합성 중합체와 동일하지만, 이것은 합성 동안에 발생하는 중요한 격렬한 조건에 노출되지 않고 따라서 그의 "생리학적" 상태를 유지한다.
최종 나노입자 용액에서 표적 중합체의 양은 광범하게 변할 수 있다. 일반적으로, 이것은 함유된 금속 이온의 총 중량의 0.5 내지 50 배 사이로 변할 수 있지만, 1 내지 약 25 배가 바람직한 양이다. 흡착 매체/증강제는 철-함유 코어 또는 철-함유 코어 및 제 1 코트의 표면에 의해 표적 중합체 또는 표적 중합체의 혼합물의 흡착을 향상시키거나 촉진하는 모든 물질이다. 일반적으로, 흡착 매체/증강제는 두가지 기능적 성질을 가져야 한다: 즉, 하나의 분자 부분은 기본 구조 유니트에 대해 친화성을 갖고, 제 1 기능 부분과 동일할 수 있는 다른 분자 부분은 표적 분자에 대해 친화성을 일으킨다. 적합한 물질은 두 기능 그룹, 또는 소수성 및 친수성 분자 부분을 갖는 물질이다. 철 코어에 대해, 또는 철 코어 + 제 1 코트에 대해 친화성을 갖는 펩타이드가 바람직한 흡착 매체/증강제이다. 이러한 펩타이드는 진보된 생화학적 방법을 사용하여 펩타이드 라이브러리(library)로 부터 선택될 수 있다. 그의 분자에 RRTVKHHVN 또는 RRSRHH 또는 RSKRGR 서열 또는 그의 부분을 함유하는 펩타이드가 바람직하다[아미노산의 한-글자 코드; 참조: Stryer, Biochemistry; Freeman and Comp.; New York; 1988].
흡착 매체/증강제로서 펩타이드를 사용하는 경우 또 다른 장점은 친화에 필요하지 않은 분자 부분을 임의로 표적 중합체(들)와 공유적으로 결합시킬 수 있으며, 표적 중합체에 대한 친화성으로 임의적인 성질을 제공할 수 있다는 것이다. 필요한 흡착 매체의 양은 사용한 물질(흡착 매개의 세기) 및 표적 중합체(들)의 성질에 따라 달라지며; 총 양은 코어에 함유된 금속 이온의 총 중량보다 작거나 이와 같다.
나노입자 용액에 함유될 수 있는 약제학적 첨가제 또는 보조제는 그의 기능에 따라 다섯 부류로 나눌 수 있다: 방부제, pH 안정화제, 항산화제, 등장화 첨가제, 펩티세이터(peptisator) 및 솔류타이저(solutizer). 다른 보조제는 당 용액, 혈장 팽창제, 전해질 용액, 생리식염수 또는 주사용 증류수 뿐만 아니라 비경구적으로 적용될 수 있는 오일 "용매"와 같은 의학적으로 가능한 용매일 수 있다.
나노입자 용액에 함유될 수 있는 의약품 또는 약제의 예는 다음과 같은 그룹일 수 있다: 항앨러지제, 항아나필락시성 또는 예방제, 혈관확장제 또는 혈관수축제, 혈류에 영향을 주는 물질, 나노입자 대사에 영향을 주는 물질, 나노입자의 약력학에 영향을 주는 물질, 철 밸런스를 변화시키는 물질, 효소 유도원 및 억제제의 그룹중에서 선택된 물질, 또는 일반적인 매체 및 항매체. 치료용도의 의학 물질중에서 주로 관심있는 것은 세포증식 억제제, 화학요법제, 호르몬 및 당뇨병 치료제이다.
의약품 또는 약제를 임의 성분으로서 나노입자 용액에 첨가할 수 있거나, 표적 중합체에 결합시킬 수 있다; 그후 중합체 및 의약 물질의 콘쥬게이트를 표적 중합체로 사용한다.
나노입자의 생리학적 분포는 혈류, 림프류(flow) 및 림프 생성 등과 같은 "생리학적" 요인에 영향을 미치는 의약품에 의해 변화될 수 없으며; 생체내 분포는 단순한 물리요법 처치에 의해 변화될 수 있다. 에르고미터(ergometer) 상에서 수행함으로써 직접 "적용"될 수 있는 운동(movement), 및 그의 대응부로서 예를 들어 실내 환자 및/또는 마취 등의 적용으로 관찰되는 정지(immobility)는 완전히 다른 분포 행동 및 패턴을 나타낸다. 또한, 여기에서는 전신에 단순히 적외선을 사용하거나, 또는 부분 배쓰(bath)를 사용함으로써 수행될 수 있는 열 투입이 언급되어야 한다. 보조제 종양 처리에 있어서 목적하는 열 투입을 위해 많은 임상에서 사용된 과온증이 특히 바람직하다. 의도된 국소 가열은 수반하는 물리요법 처치에서 "선택성"을 향상시킨다.
모듈 제조 디자인의 상당한 융통성은 표적 중합체(들), 흡착 매체(들), 약제학적 보조제 및 의약품의 자유로운 조합을 가능하게 할 뿐만 아니라 물리요법 처치와 함께 각종 나노입자 조성물의 적용을 가능하게 한다.
나노입자 또는 용액은 많은 상이한 성분들로 구성될 수 있으며, 특정 적용에 따라 달라지는 정확한 조성에 대해서는 일반적인 것에 대해서만 언급될 수 있다.
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모든 첨가제를 포함한 나노입자의 총 직경(다이내믹 레이저 광 산란, DLS 로 측정)은 철-함유 코어 직경(투과 전자 현미경; TEM 으로 측정)의 10배를 넘지 않는다. 기본 구조 유니트(코어 + 1 차 코트)의 직경이 표적 중합체 또는 표적 중합체와 임의의 보조제의 배합물에 의해 단지 조금 증가되는 배합물이 바람직하다. DLS-측정된 직경은 최고 20% 까지 기본 구조 유니트의 직경을 능가할 수 있다.
높은 생물학적 특이성 및 뛰어난 물리적 성질(입자 크기, 자기 성질)을 필요로 하는 적용에 적합한 전례없던 융통성 및 품질의 나노입자는 최적 물리적 성질의 기본 구조 유니트를 다수의 가능한 표적 중합체와 배합함으로써 제조될 수 있다. 모듈 디자인 및 많은 배합은 광범한 적용을 가능하게 한다.
나노입자는 표적 중합체(제 2 코트)를 문제있는 해당 부위에 융통적으로 조정(모듈 디자인)하여 뛰어난 물리적 성질과 우수한 표적성을 결합시키기 때문에, 정맥내 또는 국소적인 간질성 투여후 MR 림포그래피, 종양 가시화, 기능 또는 기능 부전, 플라크(아테롬성경화증 이미지화), 혈전 및 혈관폐색, MR 안지오그래피, 관류이미지화, 경색 가시화, 내피 손상 가시화, 수용체 이미지화, 혈액-뇌장벽 보전 등등과 같은 많은 특별한 적용 뿐만 아니라 분화 진단, 특히 증식 조직으로 부터 종양/전이를 구별하는데 적용될 수 있다.
입자는 또한 그의 특별한 제조 융통성에 의해 가장 변화 있는 시험관내 진단 적용에 적합하다. 예를 들어, 이들은 EIAs(효소-면역분석)에 대해 자기 분리 조사에 사용된 특이적인 커리어(carrier)로서 사용될 수 있다. 혈액으로 부터 특이적 인자의 선택적인 방혈(혈액의 탈체 해독)은 시험관내 방법과 치료적인 접근의 조합이다.
본 발명에 따른 나노입자는 뚜렷한 자체-발색을 나타낸다. 림프절에서의 특히 높은 농도에 의해 표적 중합체와 결합되는 경우, 이들 입자는 림프절 염색을 위한 수술중 표지 물질로서 매우 적합하다. 림프절은 종종 종양과 함께 외과적으로 제거되기 때문에, 나노입자를 사전 투여함으로써 수술중인 의사에게 주위조직중의 다소 작을 수 있는 이 림프절을 더 쉽게 확인시켜 준다. 나노입자는 이 목적을 위해 특히 넓은 시간창을 가지며, 수술전에 약 60 분 내지 25 시간 이상 적용될 수 있다.
림프절의 가시화와는 별개로, 종양내 적용 또는 종양 주변에의 적용은 종양 주변의 염색을 용이하게 함으로써 주위 조직으로 부터 종양의 구별을 확실하게해 주며; 또한 종양 부위중의 입자는 종양 세포가 전이적으로 퍼지는 동일한 림프관을 통해 운반된다. 따라서 입자는 전이적 확산에 바람직한 림프관 또는 림프절을 염색한다.
정맥에 적용되는 조영 물질로서의 그의 용도와 함께, 입자는 국소적으로 적용될 수 있다. 국소적 적용은 나머지 계를 포함하지 않고 표적 부위에서 조영제의 높은 농도를 가능하게 하고 제한 부위만이 가시화되어야 하기 때문에, 예를들어 유방암의 경우에 유리할 수 있다. 특정 림프절 주위의 간질적 조직에 대한 의도하는 직접적인 적용은 정맥내 투여후 관찰이 의심스러운 진단을 확실하게 하기위해 필요할 수 있다.
나노입자의 또 다른 적용분야는 자화 또는 자장/플럭스 밀도를 측정하기 위하여 매우 민감한 측정 방법(SQUID)에 기초한 생체내 진단에 있어서 보강 물질로서의 그의 용도이다. 아 분야에서 매우 민감한 측정 방법의 개발은 자기 입자의 생체내 추적을 용이하게 함으로써 신티그래피에 사용된 방사활성 물질이 기능부전 및 병변의 진단에 사용될 수 있도록 한다.
입자는 치료분야에서 비히클(vehicle) 또는 의약 물질로서 사용될 수 있다. 나노입자의 특이성은 의약 물질을 그의 작용 부위에 운반시키는데 사용된다. 의약 물질은 철-함유 코어에 혼입시키거나 또는 합성 중합체 및/또는 표적 중합체에 화학적으로 결합시킬 수 있다. 의약 물질 및 중합체의 콘쥬게이트의 흡착, 또는 흡착 매체/증강제에 대한 의약 물질의 결합이 또 다른 방법일 수 있다. 따라서, 예를 들어 산화철 표면에 매우 친화적인 특이적인 펩타이드 서열이 형성될 수 있다.
가능한 현상은, 예를 들어 RES 세포에 존재하는 미생물을 포함한 많은 질병에 대해 치료적으로 필요한 식세포에서 고농도의 저분자량 화학요법제의 축적일 수 있다. 모든 치료 접근법에서, 의약 물질 및 나노입자의 시스템은 외부 자장을 사용하여 그의 표적 부위에 선택적으로 축적될 수 있다. 매우 특별한 문제를 다루는데 있어서, 표적 부위, 예를 들어 종양 부위에서 국소적인 조절을 위하여 작은 자석을 이식하는 선택권이 있다.
특이 조직에 의약 물질을 목적하는 바 대로 운송시키기 위하여 비히클로서 나노입자를 사용하는 것은 별도로, 활성제의 개선된 방출을 특징으로 하는 약제 타입이 제공될 수 있다. 활성제의 방출은 생물학적으로 분해될 수 있는 콘쥬게이트를 사용하거나, 또는 의약 물질을 상이한 생분해성을 갖는 나노입자의 여러 성분에 삽입시킴으로써 조절될 수 있다. 가능한 현상은 투여 호르몬에 대한 저장소로서 나노입자를 사용하는 것이다.
나노입자의 자기 성질이 외부로 부터 조작될 수 있는 "자기 스위치"를 통해 의약 물질의 방출을 유도하고 조절하는 신규한 치료 시스템에 나노입자를 사용하는 것이 또한 고려된다. 중요한 적용 분야는 췌성당뇨병을 치료하는데 있어서 당뇨병 치료제의 방출을 조절하기 위하여 치료 시스템을 개발하는 것이다.
나노입자에 의한 그의 작용 부위에 직접적인 운숭에 적합한 의약 물질은 무엇보다도 화학요법제 및 세포증식억제제이다. 또한, 항균 치료는 종종 그의 작용 부위(예를 들어 결핵, 대식세포에 존재하는 미생물)에 의약 물질을 목적하는 바대로 운송하는 것을 필요로 한다. 나노입자의 자기 성질에 의한 방출에 적합한 의약 물질은 특히 항균제, 호르몬, 당뇨병 치료제, 세포증식억제제 및 화학요법제이다.
나노입자는 의약 물질 그 자체로서, 예를 들어 과온증 또는 M
Figure kpo00006
sbauer 핵 흡수 치료에서 흡수제로서, 또는 중성자 포착 치료에서 붕소 또는 가돌리늄으로 적절히 도핑된다면 그의 직접적인 치료용도 이상으로 사용될 수 있다. 또 다른 적용은 동위원소 또는 분자로 적합한 분자를 흡착하는 기본 구조 유니트에 의해 또는 그의 코어에서 나노입자가 방사활성 원소로 도핑되는 의학적 방사 치료법이다.
방사 치료에서 나노입자의 바람직한 적용은, 예를 들어 나노입자가 방사활성55Fe 동위원소를 통해 "오토라디에이터(autoradiator)"를 함유하는 경우이거나, 또는 나노입자가 외부 "활성화"에 의해 방사 동위원소가 되도록 유도될 수 있는 동위원소를 함유하는 경우이다. 예를 들어, 코어는 중성자에 의해 외부적으로 활성화될 수 있는157Gd를 함유할 수 있다.
방사 치료에서 나노입자의 또 다른 적용은 그의 코어, 합성 또는 표적 중합체, 또는 흡착 매체가123I 또는125I와 같은 오토라디에이터를 함유하도록 변형될수 있다는 사실로 부터 기인한다. 또한, 나노입자는 외부 트리거링(triggering)에 의해 방사 동위원소로 전환되는 동위원소를 함유할 수 있다. 한 예는 자기 X-선방사를 사용한 요오드-K-끝의 외부 활성화 및 요오드로 표적 중합체를 표지화하는 것이다.
본 발명의 나노입자는 또한 콘쥬게이트/흡수제를 확인하기 위한 RES 와 나노입자의 상호작용에 의하거나, 또는 나노입자 그 자체의 상호작용에 의한 불활성화 및 계속해서 세포내 불활성화에 의해 맥관 공간으로 부터 박테리아, 바이러스, 엔도- 및 엑소톡신을 제거하는데 사용될 수 있다.
본 발명은 실시예 및 첨부된 도면 제1도 내지 35도를 참조로 하여 더욱 상세히 설명될 것이다.
제1도는 철-함유 코어, 제 1 코트(합성 중합체) 및 제 2 코트(표적 중합체)를 갖는 나노입자의 단면 구조이다.
제2도는 본 발명에 따른 나노입자의 합성을 나타내는 일반적인 다이아그램이다.
제3도는 모노카복시덱스트란 및 그의 모 화합물 덱스트란 4의 FTIR 스펙트럼이다.
제4도는 폴리카복시덱스트란 및 그의 모 화합물 덱스트란 T10 및 6-브로모헥산산의 FTIR 스펙트럼이다.
제5도는 랫트의 아가로스-투여된 림프절의 MR 토모그램이다.
제6도는 랫트의 여러 림프절에서 SE 2000/15에 대한 상대적인 시그널 세기를 정량적으로 평가한 것이다(제5도로 부터).
제7도는 랫트의 여러 림프절에서 GE 135/15/15°에 대한 상대적인 시그널 세기를 정량적으로 평가한 것이다(제5도로 부터).
제8도는 양성자-밀도 가중된 스핀 에코 시퀀스(SE 2000/15)에서 토끼의 골반 부위의 정면부 콘트라스트 전 및 후 MR 토모그램을 나타낸 것이다.
제9도는 양성자-밀도 가중된 스핀 에코 서열(SE 2000/15) 에서 토끼의 골반 부위의 정면부 콘트라스트 전 및 후 MR 토모그램을 나타낸 것이다.
제10도는 주입(p.i.) 24 시간후 토끼의 여러 림프절에서 SE 2000/15에 대한 상대적인 시그널 세기를 나타낸다.
제11도는 T2*-가중된 구배 에코 서열(GE 135/15/15°) 에서 토끼의 골반 부위의 정면부 콘트라스트 전 및 후 MR 토모그램을 나타낸 것이다.
제12도는 T2*-가중된 구배 에코 서열(GE 135/15/15°) 에서 토끼의 골반 부위의 정면부 콘트라스트 전 및 후 MR 토모그램을 나타낸 것이다.
제13도는 개선된 배치에 대한 원(original) 물질의 주입 24 시간후 토끼의 여러 림프절에서 GE 135/15/15°에 대한 상대적인 시그널 세기를 나타낸다.
제14도는 토끼의 아가로스-투여된 림프절의 탈체 MR 토모그램(GE 시퀀스)이다.
제15도는 주입 24 시간후 토끼의 여러 림프절에서 GE 135/15/15°에 대한 상대적인 시그널 세기를 나타낸다.
제16도는 나노입자 투여 24 시간후 적용된 투약량의 함수로서 랫트의 여러 림프절에서 SE 2000/15에 대한 상대적인 시그널 세기를 나타낸다.
제17도는 나노입자 적용 24 시간후 랫트의 여러 림프절에서 GE 135/15/15°에 대한 투약량의 함수로서 상대적인 시그널 세기를 나타낸다.
제18도는 적용(기준 물질)후 시간의 함수로서 랫트의 여러 림프절에서 SE 2000/15 에 대한 상대적인 시그널 세기를 나타낸다.
제19도는 특정 나노입자의 적용후 시간의 함수로서 랫트의 여러 림프절에서 SE 2000/15에 대한 상대적인 시그널 세기를 나타낸다.
제20도는 적용(기준 물질)후 시간의 함수로서 랫트의 여러 림프절에서 GE 135/15/15°에 대한 상대적인 시그널 세기를 나타낸다.
제21도는 특정 나노입자의 적용후 시간의 함수로서 랫트의 여러 림프절에서 GE 135/15/15°에 대한 상대적인 시그널 세기를 나타낸다.
제22도는 열 적용에 의해 유발된 림프절에서의 축적에 대한 효과를 나타낸다.
제23도는 실시예 D2에 따른 특정 나노입자를 환괴로 적용(투여량: 20 μmol Fe/kg)한 후 T1-가중된 SE 시퀀스(TR: 200 ms, TE: 10 ms)를 사용하여 랫트의 복부를 횡단하여 역학 관찰한 결과이다.
제24도는 실시예 C2에 따른 비특정 기준 물질 및 실시예 D2에 따른 특정 나노입자에 대한 간 실질 및 정맥관에서 SE TR/TE 200ms/10ms에 대한 상대적인 시그날 세기를 비교한 것이다.
제25도는 기준 물질 C2 및 실시예 D2 에 따른 특정 나노입자에 대한 3D 플래쉬 토모그램(TR: 40ms, TE: 6ms, FA 60°)의 관상 MIPS(최대-세기 투영)이다.
제26도는 림프절을 육안관찰하기 위한 "수술중" 표지 물질로서 본 발명에 따른 나노입자이다(일반적인 도면).
제27도는 림프절을 육안관찰하기 위한 "수술중" 표지 물질로서 본 발명에 따른 나노입자이다(상세한 도면).
제28도는 토끼의 전이성 림프절에서 육안관찰에 의해 림프절의 전이를 나타낸 것이다.
제29도는 비특이적 기준 물질(트랜스페린을 함유하지 않는 나노입자)과 비교한 특이적 나노입자(트랜스페린 함유)의 세포 토모그램이다.
제30도는 변형 D7 (투여량: 200 μmol Fe/kg; 주입 5 시간 후 대동맥 절개)을 갖는 토끼 대동맥의 아테롬성경화 플라크의 탈체 MR 토모그래피 다이아그램이다.
제31도는 프루시안 블루 염색한 토끼 대동맥의 아테롬성경화막에서 철을 조직학적으로 검사한 것이다.
제32도는 와타나베 토끼의 대동맥에서 실시예 E6에 따른 축적 나노입자를 조직화학적으로 검사한 것이다(프루시안 블루 염색).
제33도는 실시예 D2에 따른 나노입자를 환괴로 적용(투여량: 200 μmol Fe/kg)한 후 종양 시그널 행동을 횡단하여 T1-가중된 스핀 에코 역학적으로 관찰한 것이다(TR: 300ms, TE: 15ms).
제34도는 종양에서 상대적인 시그날 세기(축적)의 커브를 나타낸다.
제35도는 실시예 D2에 따른 나노입자의 적용후 시간 의존성 양성자-밀도 가중된(SE 2000/15) 토모그램을 횡단으로 나타낸 것이다.
[제조 및 적용 실시예]
A: 합성 중합체의 제조
A1: (모노)카복시덱스트란(CDx)의 합성
100g의 덱스트란 4(Serva, Germany)를 500 ㎖의 물에 용해시키고, 60℃로 가열한다. 대략 10N 소다 라이 약 55 ㎖를 교반하면서 가한다. 5 시간의 반응후, 용액을 pH 8로 중화시킨다(부분적으로). 그후 갈색 용액을 혼합-층 이온 교환기(Amberlite IRA-400 및 IR-120) 상에서 정제한다. 산 성질을 갖는 부분을 풀링하고, 40℃, 회전 증발기중에서 진공상태로 농축시킨다. 그후 동결건조시킨다.
Figure kpo00007
개질된 덱스트란(카복시덱스트란)의 FTIR 스펙트럼(브롬화칼륨)을 제 3 도에 나타내었다.
A2: 폴리카복시덱스트란(P-CDx)의 합성
10 g의 덱스트란 T10(Pharmacia, Germany)를 250 ㎖ 2-목(neck) 플라스크에 투입하고, 100 ㎖의 4N NaOH와 혼합한다. 플라스크의 한쪽 목에 환류응축기를 장치하고, 용액을 약 80℃로 가열한다. 30 g의 6-브로모헥산산(Aldrich, Germany)을 계속 교반하면서(자석 교반) 제 2 목을 통해 조금씩 투입한다. 물질을 가한 후, 목을 막고, 반응 혼합물을 3 시간동안 계속 교반한다. 반응후, 배치를 6N HCl을 사용하여 증기 후드하에서 중화시킨 다음, 회전 필름 증발기(60℃, 진공)를 사용하여 예비 농축에 의해 부피를 감소시킨다. 비전환 반응물의 분리, 또는 개질된 카복시덱스트란의 세정은 에탄올에 의한 침전으로 수행한다. 백색 침전을 세척하고, 이중 증류수에 재용해시킨 후, 마지막으로, 0.22 μm(Schleicher and Sch
Figure kpo00008
ll, Germany) 필터를 통해 여과한 다음, 동결건조시킨다.
Figure kpo00009
폴리카복시덱스트란의 FTIR 스펙트럼을 제 4 도에 나타내었다(첨부 도면 참조).
B: 조 물질의 제조
B1: 암모니아 기체를 사용하여 CDx로 부터 제조
분자량 약 2000 Da를 갖는 5.0 g의 모노카복시덱스트란(CDx, 실시예 A1)을 17.5 ㎖의 이중 증류수(double distillated water)에 용해시킨다. 질소를 불어 넣어 용액을 탈기체화시킨다. 6.7 ㎖의 1-몰 염화철(Ⅲ) 육수화물 용액을 시험관내에서 제조하고, 질소 스트림을 사용하여 탈기체화시킨다. 648 mg의 염화철(Ⅱ)육수화물을 철(Ⅲ) 용액에 가하고, 질소 스트림에 용해시킨다. 중합체 용액을 약 75℃로 가열하고, 철 용액을 가한다(질소 기체에 노출). 가열된 반응 혼합물을 균일하게 혼합하면서 기체 실린더로 부터 암모니아를 재빨리 도입함으로써 알칼리로 조정한다. 그후, 반응 용액을 약 1 시간동안 환류시킨다. 이어서 개방된 플라스크에서 10 분동안 가열하여 비전환 암모니아를 제거한다. 2500 g에서 30 분동안 원심분리하고, 냉각후, 여액을 회전 증발기를 사용하여 약 7 ㎖로 부피를 줄인다; pH 값을 검사하고, 필요에 따라 중화시킨다. 농도를 측정한 후, 용액을 이중 증류수를 사용하여 약 1-몰 철 농도로 조정하고, 0.22 μm 필터를 사용하여 여과한다. 용액을 오토클레이브에서 멸균시킬 수 있다(방법 A121).
Figure kpo00010
주 1 내지 3: 혈액에서 반감기 측정
·혈액으로 부터 클리어란스(clearance)의 반감기
헤파린화된 염화나트륨 용액 (0.2 ㎖) 이 충전된 50.5 cm 길이의 카테터를 에테르 마취시킨 실험 동물(랫트, 약 200 g)의 보통 경동맥에 삽입하고, 심장에서 약 1.5 cm 전방으로 민다. 카테터의 비어 있는 끝을 끌어내고, 히스토아크릴레이트로 고정한다.
상기 조작후 약 1 시간이 지나 시험 물질을 꼬리 정맥을 통해 정맥내 투여한다(약 1 ㎖/분). 동물이 깨어 있을때 시험 물질의 기대되는 배출 속도에 따라 여러 시간에서 혈액 샘플을 취한다. 시험 마지막에 동물을 에테르 마취하에 대정맥으로 부터 혈액을 빼냄으로써 안락사시킨다.
·T1 및 T2의 반감기 효과
혈액 샘플을 2900 rpm(1000 g)으로 15 분동안 원심분리시킨다. 상등 용액 0.250 ㎖를 빼낸다. 샘플을 이중 증류수로 2.0 ㎖로 만들고, 그후 혼합물을 40℃로 온도조절한다.
pc120 릴랙소미터(relaxometer)(Bruker, Germany)를 사용하여 T1,2 완화 시간을 측정함으로써 혈액 농도의 감소를 측정한다. 측정을 180°-90°-IR-(역 회수) 시퀀스(T1) 또는 CPMG 시퀀스(T2)로 수행한다.
결과를 약력학적 2-격실 모델에 기초하여 분석하고; TOPFIT 약력학 컴퓨터 프로그램을 사용하여 T1,2 시간(완화 시간)의 역수에서 블랭크 리딩(blank leading)을 뺀 항으로 시간에 대해 농도를 연장하여 데이타를 계산하였다. TOPFIT 는 먼저 "농도"와 시간의 이동 소수점 표기로 부터 선형 회귀법으로 직선의 기울기를 계산하고, 이 값으로 부터 효과적인 반감기를 구한다.
·철 함량에 대한 반감기
완화 시간을 결정하는데 사용된 용액 800 ㎕를 피펫으로 빼내고, 농질산에 용해시킨 후, 이중 증류수로 10.0 ㎖ 되게 채운다. 그후 철 함량을 원자 방출분광학(AES)을 사용하여 정량화한다. 결과를 혈액 농도로 전환시키고, 관련 희석 인자를 고려하면서 TOPFIT를 사용하여 농도-시간 다이아그램의 수단으로 분석한다.
B2: NaOH 및 Fe(Ⅲ) 시트레이트 및 Fe(Ⅱ) 글루코네이트를 사용하여 P-CDx를 제조하는 방법
분자량 약 2000 Da를 갖는 5.0 g의 폴리카복시덱스트란(실시예 A2)을 17.5 ㎖의 이중 증류수에 용해시킨다. 질소를 불어 넣어 용액을 탈기체화시킨다. 6.7 ㎖의 1-몰 염화철(Ⅲ) 일수화물 용액을 시험관내에서 제조하고, 질소 스트림을 사용하여 탈기체화시킨다. 1.635 g의 철(Ⅱ) 글루코네이트 삼수화물을 철(Ⅲ) 용액에 가하고, 질소 스트림에 용해시킨다. 중합체 용액을 약 75℃로 가열하고, 철 용액을 가한다(질소 기체에 노출). 약 12 ㎖의 3N 소다 라이를 가열된 반응 혼합물에 균일하게 혼합하면서 30 초 내에 가한다. 그후 반응 용액을 약 6N 염산으로 중화시키고, 약 1 시간동안 환류시킨다. 이어서 개방된 플라스크에서 10 분동안 가열하여 비전환 암모니아를 제거한다. 2500 g 에서 30 분동안 원심분리하고, 냉각후, 여액을 회전 증발기를 사용하여 약 7 ㎖로 부피를 줄인다; pH 값을 검사하고, 필요에 따라 중화시킨다. 농도를 측정한 후, 용액을 이중 증류수를 사용하여 약 1-몰 철 농도로 조정하고, 0.22 μm 필터를 사용하여 여과한다. 용액을 오토클레이브에서 멸균시킬 수 있다(방법 A121).
Figure kpo00011
B3: Fe(Ⅲ) NTA 및 수산화암모늄을 사용하여 CDx로 부터 제조하는 방법
분자량 약 2000 Da를 갖는 5.0 g의 (모노)카복시덱스트란(CDx, 실시예 A1) 을 35 ㎖의 이중 증류수에 용해시킨다. 질소를 불어 넣어 용액을 탈기체화시킨다. 농 수산화암모늄 용액(32 %)을 가열 및 혼합하면서 pH 값이 11로 조정될 때까지 반응 혼합물에 가한다. 6.85 ㎖의 1-몰 철(Ⅲ) 용액을 시험관내에서 제조하고, 동몰량의 NTA와 혼합한 다음, 질소를 사용하여 탈기체화시킨다. 667 mg의 염화철(Ⅱ) 사수화물을 철(Ⅲ) 용액에 가하고, 질소 스트림에 용해시킨다. 철 용액을 20 초 내에 알칼리 중합체 용액에 가한다. 그후 반응 용액을 약 6N 염산으로 중화시키고, 약 1 시간동안 환류시킨다. 2500 g 에서 30 분동안 원심분리하고, 냉각후, 여액을 회전 증발기를 사용하여 약 6 ㎖로 부피를 줄인다; pH 값을 검사한다. 농도를 측정한 후, 용액을 이중 증류수를 사용하여 약 1-몰 철 농도로 조정하고, 0.22 μm 필터를 사용하여 여과한다. 용액을 오토클레이브에서 멸균시킬 수 있다(방법 A121).
Figure kpo00012
B4: 철(Ⅲ) 및 소다 라이 환원제를 사용하여 P-CDx로 부터 제조하는 방법
분자량 약 12000 Da를 갖는 5.0 g의 폴리카복시덱스트란(실시예 A2)을 17.5 ㎖의 이중 증류수에 용해시킨다. 질소를 불어 넣어 용액을 탈기체화시킨다. 10 ㎖의 1-몰 염화철(Ⅲ) 육수화물 용액을 중합체 용액에 가한 후, 질소를 사용하여 탈기체화를 계속한다. 중합체 용액을 약 75℃로 가열하고, 113.6 mg의 하이드록실아민 HCl을 질소 기체하에 가한다. 약 12 ㎖의 3N 소다 라이를 가열 반응 혼합물에 균질하게 교반하면서 30 초 내에 가한다. 그후 반응 용액을 약 6N 염산으로 중화시키고, 약 1 시간동안 환류시킨다. 2500 g 에서 30분동안 원심분리하고, 냉각후, 여액을 회전 증발기를 사용하여 약 7 ㎖로 부피를 줄인다; pH 값을 검사한다. 농도를 측정한 후, 용액을 이중 증류수를 사용하여 약 1-몰 철 농도로 조정하고, 0.22 μm 필터를 사용하여 여과한다. 용액을 오토클레이브에서 멸균시킬 수 있다(방법 A121).
Figure kpo00013
B5: 덱스트란 4 와 덱스트란 15의 혼합물을 사용하여 제조하는 방법
각각 분자량 약 4,000 내지 6,000 Da 및 15,000 내지 20,000 D를 갖는 덱스트란 4 및 덱스트란 15의 1:1 혼합물(모두 Serva, Germany) 5.0 g을 20 ㎖의 이중 증류수에 용해시킨다. 무색 중합체 용액을 3N 소다 라이를 사용하여 pH 약 12로 조정하고, 1 시간동안 환류시킨 다음, 6N HCl로 중화시킨다. 질소를 불어 넣어 암적갈색 용액을 탈기체화시킨다. 6.7 ㎖의 1-몰 염화철(Ⅲ) 육수화물 용액을 시험관에서 제조하고, 질소 스트림을 사용하여 탈기체화시킨다. 648 mg의 염화철(Ⅱ)사수화물을 철(Ⅲ) 용액에 가하고, 질소 스트림에 용해시킨다. 중합체 용액을 약 75℃로 가열하고, 철 용액을 가한다(질소 기체에 노출). 11.5 ㎖의 3N 소다 라이를 가열 반응 혼합물에 균질하게 교반하면서 30 초 내에 가한다. 그후 반응 용액을 약 1 시간동안 환류시킨다. 2500 g에서 30 분동안 원심분리하고, 냉각후, 여액을 회전 증발기를 사용하여 약 8 ㎖로 부피를 줄인다; pH 값을 검사한다. 농도를 측정한 후, 용액을 이중 증류수를 사용하여 약 1-몰 철농도로 조정하고, 0.22 μm 필터를 사용하여 여과한다. 용액을 방법 A121에 따라 오토클레이브에서 멸균시킬 수 있다.
Figure kpo00014
C: 기본 물질의 제조
C1: 물에 대한 투석
실시예 B1 에 따른 용액 5 ㎖를 Visking 투석관(Serva, Germany)에 도입하고, 1 ℓ의 신선한 이중 증류수에 대해 5 회(매회 6 시간동안씩) 투석시킨다. 잔류물을 이중 증류수로 희석시킴으로써 200 mmol/ℓ의 철 농도로 조정하고, 5 ㎖를 0.22 μm 필터(셀룰로스 아세테이트, "Rotrand", Fa, Schleicher & Sch
Figure kpo00015
ll, Germany)를 통해 10 ㎖의 무균 바이알에 투입한다. 탈착 용액을 오토클레이브에서 멸균시킬 수 있다.
C2: 20 mMol 나트륨 시트레이트에 대한 투석
실시예 B1에 따른 용액 5 ㎖를 Visking 투석관에 도입하고, 1 ℓ의 신선한 나트륨 락테이트 용액(20 mmol/ℓ, pH 7)에 대해 5 회(매회 6 시간동안씩) 투석시킨다. 투석을 11 ℓ의 신선한 이중 증류수에 대해 2 회(매회 5 시간동안씩) 반복한다. 잔류물을 이중 증류수로 희석시킴으로써 200 mmol/ℓ의 철 농도로 조정하고, 5 ㎖를 0.22 μm 필터를 통해 10 ㎖의 무균 바이알에 투입한다.
C3: 아미콘으로 한외여과
실시예 B1에 따른 용액 5 ㎖를 예비 한외여과 장치에 피펫팅하고, 이중 증류수를 15 ㎖ 까지 충전(Centriprep 100, Cut off 100 kDa, Fa. Amicon, Germany)한 후, 1000 g 에서 1 시간동안 한외여과한다. 그후, 여액을 제거하고, 잔류물의 용기에 새로운 이중 증류수를 15 ㎖ 까지 충전한 후, 다시 한외여과한다. 이 과정을 2 회 반복한다. 잔류물을 이중 증류수로 희석시킴으로써 200 mmol/ℓ의 철 농도로 조정하고, 5 ㎖를 0.22 μm 필터(셀룰로스 아세테이트)를 통해 10 ㎖의 무균 바이알에 투입한다.
C4: 크로마토그래피에 의한 분리
실시예 B1에 따른 용액 5 ㎖를 S400HR 세파크릴 칼럼(100 × 5 cm) 상에서 10 ㎖의 수퍼루프(Fa. Pharmacia)에 충전하고, 50 mM의 시트르산/250 mM의 만니트를 300 ㎖/시간의 유량으로 용출시킨다. 450 ㎖ 내지 840 ㎖의 분획을 수집하고, 회전 증발기를 사용하여 60℃, 진공중에서 약 50 ㎖ 까지 농축시킨다. 농축물을 이중 증류수에 대해 6 시간동안 3 회 투석시키고, 회전 증발기 상에서 다시 농축시킨 후, 철 함량 측정후 200 mmol/ℓ의 농도로 조정한다. 용액 5 ㎖를 0.22 μm 셀룰로스 아세테이트 필터를 통해 10 ㎖의 무균 바이알에 투입한다. 탈착된 용액을 오토클레이브에서 멸균시킬 수 있다.
Figure kpo00016
자기 성질 및 크기 파라미터를 고려한 물리-화학적 데이타는 모 화합물(실시예 B1)의 값에 대한 것이다.
D: 적용 용액
D1: 덱스트란 T10
200 mmol Fe/ℓ 농도(총 철 함량 56 ㎖에 해당)의 실시예 C1에 따른 용액 5.0 ㎖를 10 ㎖의 바이알에서 제조한다. 표적 중합체로서 33.6 mg의 덱스트란 T10을 6.0 ㎖의 증류수에 용해시키고, 이 용액 5.0 ㎖를 필터(0.22 μm)가 부착된 시린지를 사용하여 무균 조건하에서 산화철 용액에 가한다. 중합체 대철 중량비는 1 (잔류 합성 중합체 = 28 mg + 표적 중합체 = 28 mg)이다.
제조물은 정맥내 MR 림포그래피에 곧바로 적용하기에 적합한 10 ㎖의 100 밀리몰(철)용액을 함유한다.
D2: 덱스트란 FP1: 2 용액으로 부터 제조
200 mmol Fe/ℓ 농도(총 철 함량 56 mg에 해당)의 실시예 C1에 따른 용액 5.0 ㎖를 10 ㎖의 바이알에서 제조한다. 표적 중합체로서 302.4 mg의 덱스트란 FP1을 6.0 ㎖의 증류수에 용해시키고, 이 용액 5.0 ㎖를 필터(0.22 μm)가 부착된 시린지를 사용하여 무균 조건하에서 산화철 용액에 가한다. 중합체 대철 중량비는 5 (잔류 합성 중합체 = 28 mg + 표적 중합체 =252 mg)이다.
제조물은 정맥내 MR 림포그래피에 곧바로 적용하기에 적합한 10 ㎖의 100 밀리몰(철)용액을 함유한다.
D3: 동결건조물로서 덱스트란 FP1
200 mmol Fe/ℓ 농도(총 철 함량 56 mg에 해당)의 실시예 C1에 따른 용액 5.0 ㎖를 10 ㎖의 바이알에서 제조한다. 표적 중합체로서 302.4 mg의 덱스트란 FP1을 6.0 ㎖의 증류수에 용해시키고, 이 용액 5.0 ㎖를 필터(0.22 μm)가 부착된 시린지를 사용하여 무균 조건하에서 산화철 용액에 가한다. 중합체 대철 중량비는 5 (잔류 합성 중합체 = 28 mg + 표적 중합체 = 252 mg)이다.
용액을 주사용 용기에 동결건조시키고, 용기를 마개로 막는다.
생리식염수 10 ㎖를 가하여 적용 용액을 제조한다; 용기는 정맥내 MR림포그래피에 곧바로 적용하기에 적합한 10 ㎖의 100 밀리몰(철)용액을 함유한다.
D4: 덱스트란 FP1
표적 중합체로서 252 mg의 덱스트란 FP1을 5 ㎖의 주사용 용기에 투입하고, 200 mmol Fe/ℓ 농도(총 철 함량 56 mg에 해당)의 실시예 C1에 따른 용액 5.0 ㎖를 가한 후, 플라스크를 마개로 막는다. 주사용 용기를 진탕하여 덱스트란 FP1 울 용해시킨다. 중합체 대 철 중량비는 5 (잔류 합성 중합체 = 28 mg + 표적 중합체 = 252 mg)이다.
제조물은 정맥내 MR 림포그래피에 곧바로 적용하기에 적합한 5 ㎖의 200 밀리몰(철)용액을 함유한다.
D5: 라미나린
200 mmol Fe/ℓ 농도(총 철 함량 56 mg에 해당)의 실시예 C1에 따른 용액 5.0 ㎖를 10 ㎖의 바이알에서 제조한다. 표적 중합체로서 33.6 mg의 라미나린을 6.0 ㎖의 증류수에 용해시키고, 이 용액 5.0 ㎖를 필터(0.22 μm)가 부착된 시린지를 사용하여 무균 조건하에서 산화철 용액에 가한다. 중합체 대 철 중량비는 1 (잔류 합성 중합체 = 28 mg + 표적 중합체 = 28 mg)이다.
제조물은 정맥내 MR 림포그래피에 곧바로 적용하기에 적합한 10 ㎖의 100 밀리몰(철)용액을 함유한다.
D6: 트랜스페린에 의한 방법
200 mmol Fe/ℓ 농도(총 철 함량 56 mg에 해당)의 실시예 C1에 따른 용액 5.0 ㎖를 10 ㎖의 바이알에서 제조한다. 표적 중합체로서 33.6 mg의 인간 Fe2트랜스페린을 6.0 ㎖의 증류수에 용해시키고, 이 용액 5.0 ㎖를 필터(0.22 μm)가 부착된 시린지를 사용하여 무균 조건하에서 산화철 용액에 가한다. 중합체 대 철 중량비는 1 (잔류 합성 중합체 = 28mg + 표적 중합체 = 28 mg)이다.
제조물은 증식 세포(암)를 영상화하기 위한 특정 조영제로서 적용하기에 적합한 10 ㎖의 100 밀리몰(철)용액을 함유한다.
D7: 엔도텔린 아고니스트에 의한 방법
200 mmol Fe/ℓ 농도(총 철 함량 56 mg에 해당)의 실시예 C1에 따른 용액 5.0 ㎖를 10 ㎖의 바이알에서 제조한다. 표적 중합체로서 33.6 mg의 엔도텔린-수용체-특이 헵타펩타이드 [cys-his-leu-asp-ile-ile-trp]를 6.0 ㎖의 이중 증류수에 용해시키고, 이 용액 5.0 ㎖를 필터(0.22 μm)가 부착된 시린지를 사용하여 무균 조건하에서 산화철 용액에 가한다. 중합체 대 철 중량비는 1 (잔류 합성 중합체 = 28 mg + 표적 중합체 = 28 mg)이다.
제조물은 정맥내 MR 플라크 이미지화(아테롬성경화증 이미지화)에 적용하기에 적합한 10 ㎖의 100 밀리몰(철)용액을 함유한다.
E: 적용
적용 실시예 E1
·랫트에서 MR 림포그래피
목적: 랫트에서 탈착-흡착 방법(합성 중합체 ≠ 표적 중합체)에 따라 형성된 변형 및 모 화합물(합성 중합체 = 표적 중합체) 간의 여러 림프절/림프절 그룹에서의 상대 시그날 세기 비교.
물질: 특정 나노입자(실시예 D5);
비교 = 실시예 C1에 따른 기본 구조 유니트(= 표적 중합체를 갖지 않는 D5).
투여량: 100 μmol Fe/체중 kg.
시간: 주입후 24 시간(24 h p.i.(post injectionem))
MR 방법:
장치: 시멘즈 마그네톰 1.5 T MR.
익스트레머티 코일(extremity coil)를 갖는 신체용 MR 스캐너 MR 파라미터: FOV(Field of view) = 150 mm, 매트릭스 = 256 × 256 ;
슬라이스 두께 = 3mm, 절개 방향 = 전방.
시퀀스 1: 양성자-밀도-가중된 스핀 에코 시퀀스(SE)(TR = 2000 ms 및 TE = 15 ms).
시퀀스 2: T2-가중된 구배 에코 시퀀스(GE)(TR = 135 ms, TE = 15 ms 및 FA= 15°)
탈체 모델:
·랫트 및 토끼의 림프절에서 축적
여러 림프절/림프절 그룹에서 물질의 축적 및 분포를 조사하기 위해 탈체 아가 팬텀을 사용하였다. 이 탈체 모델은 여러 중심부 및 말초부 림프절 또는 림프절 그룹에서의 축적이 작은 실험 동물(마우스, 랫트, 토끼)에서도 평가될 수 있는 장점을 갖는다; 그것은 또한 분포 균질성에 대해서도 결론을 내릴 수 있도록 도와 주며; 시그날 간섭이 정량화될 수 있다.
나노입자 용액을 꼬리 정맥(마우스, 랫트) 또는 귀 정맥(토끼)를 통해 실험 동물에 주입한다(환괴). 동물을 24 시간후 죽이고, 여러 림프절 또는 림프절 그룹을 회수한다(슬와부, 장골, 액와, 하악골, 서혜부 림프절). 그후 림프절을 아가 팬텀에 도입하고, MR 측정을 수행할 때까지 냉장고에 보관한다(최대 24 시간).
·탈체 아가 팬텀의 제조
10 g의 미생물학적 아가-아가를 MR 토모그램의 균일한 시그날 백그라운드를 위해 0.5 ㎖의 마그네비스트(0.5 mol/ℓ 가돌리늄 DTPA 디메글루민) 가 첨가된 50 ㎖의 이중 증류수에 현탁시킨다. 현탁액을 비등시킨 후, 80℃로 냉각시키고, 이 온도를 유지시킨다. 아가 용액의 약 반을 플라스틱 접시에 부어 0.5 내지 1 cm의 두께를 갖는 층을 형성시킨다. 용액을 냉각시킨 후, 시료를 아가-아가 상에 배치하고(몸체의 반쪽 좌측/우측에 따라, 또는 상부에서 하부에 이르기까지 "생리학적 순서로"), 소량의 아가 용액(Pasteur 피펫)으로 고정시킨다. 마지막으로, 아가 용액의 제 2 층을 조직 샘플상에 붓는다. 팬텀을 24 시간내에 측정하고, 측정을 수행할 때까지 냉장고에 보관한다. 나노입자를 주입하지 않은 동물을 기준 물질로 선택하고, 조직을 동일하게 제조하거나, 또는 해당 팬텀을 제조한다.
육안 관찰은 별개로 하고, 각 조직에서의 상대적인 시그날 감소를 다음과 같이 정량화 한다:
Figure kpo00017
측정후, 조직 샘플을 아가 용액으로 부터 조심스럽게 제거하고, 농염산에서 분해시킨 후, ICP AES(유도적으로 커플된 플라즈마 원자 방출 분광학)를 사용하여 그의 철 함량을 정량화하였다. 나노입자의 적용없이 적절히 처리된 대조 동물로 부터 블랭크 값(조영제 없는)을 측정하고, 샘플의 철 함량을 결정할 때 고려한다.
결과:
제 5 도: 랫트의 아가로스-투여된 림프절의 MR 토모그램; 실시예 D2에 따른 변형 물질(우측) 또는 기준물질(실시예 C2, 좌측)을 적용하고 24 시간후 절개를 수행; 각 경우에 투여량은 100 μmol Fe/kg.
제 6 도: 원래 물질과 변형된 물질의 비교: 마그네타이트(100 μmol Fe/kg)를 적용하고 24 시간 후 랫트의 여러 림프절에서 SE 2000/15에 대한 상대적인 시그널 세기를 정량적으로 평가(제 5 도로 부터).
제 7 도: 원래 물질과 변형된 물질의 비교: 마그네타이트(100 μmol Fe/kg)를 적용하고 24 시간 후 랫트의 여러 림프절에서 GE 135/15/15°에 대한 상대적인 시그널 세기를 정량적으로 평가(제 5 도로 부터).
특정 나노입자(제 6 도 = SE; 제 7 도 = GE)의 상대적인 림프절 시그날 세기에 대한 간섭효과의 분석은 변형된 물질이 원래 물질보다 림프절에서 더 균질하게 축적됨을 명백히 입증한다. 하악골, 액와, 장골, 슬와부 림프절의 림프절 시그날 감소 및 덱스트란 FP1의 제 2 코트를 갖는 변형된 배치에 의한 모든 림프절 그룹을 통한 평균 축적은 변형되지 않은 모 화합물(제 6 도 및 7 도)과 상당히 다르다(t-테스트, p < 0.05).
특정 나노입자의 우수성은 제 5 도에서 각 림프절의 "블랙화" (제 5 도)에서 보듯이 인상적으로 예증된다. 조사된 모든 림프절에 대한 균질한 분포가 특히 주목할만 하다.
적용 실시예 E2
·랫트에서 MR 림포그래피
목적: 토끼에서 탈착-흡착 방법(합성 중합체 ≠ 표적 중합체)에 따라 형성된 변형 및 모 화합물(합성 중합체 = 표적 중합체) 간의 여러 림프절/림프절 그룹에서의 상대 시그날 세기 비교.
물질: 특정 나노입자(실시예 D2);
비교 = 실시예 C2에 따른 기본 구조 유니트(= 표적 중합체를 갖지 않는 D2).
투여량: 150 μmol Fe/체중 kg.
시간: 주입후 24 시간.
MR 방법: MR 토모그래피(SE 및 GE 방법)(실시예 E1 참조).
생체내 모델: 자극 받은 림프절 증식을 갖는 토끼.
탈체 모델: 아가로스 팬텀
결과:
제 8 도: 양성자-밀도 가중된 스핀 에코 시퀀스(SE 2000/15)에서 토끼의 골반 부위의 정면부 콘트라스트 전 및 후 MR 토모그램. (좌측: 콘크라스트 전; 우측: 특정 물질 D2(150 μmol Fe/kg).
제 9 도: 양성자-밀도 가중된 스핀 에코 시퀀스(SE 2000/15)에서 토끼의 골반 부위의 정면부 콘트라스트 전 및 후 MR 토모그램. (좌측: 콘크라스트 전; 우측: 모 화합물 C2(150 μmol Fe/kg).
제 10 도: 특정 나노입자와 비특정 나노입자 비교: 주입(150 μmol Fe/kg, n-3) 24 시간후 토끼의 여러 림프절에서 SE 2000/15에 대한 상대적인 시그널 세기. (제 8 도 및 9 도에 따른 정량적 평가).
제 11 도: T2*-가중된 구배 에코 서열(GE 135/15/15°)에서 토끼의 골반 부위의 정면부 콘트라스트 전 및 후 MR 토모그램(좌측: 콘트라스트 전; 우측: 특정 물질 D2(150 μmol Fe/kg).
제 12 도: T2*-가중된 구배 에코 서열(GE 135/15/15°)에서 토끼의 골반 부위의 정면부 콘트라스트 전 및 후 MR 토모그램(좌측: 콘트라스트 전; 우측: 모화합물 C2(150 μmol Fe/kg).
제 13 도: 특정 나노입자와 비특정 나노입자 비교; 주입(150 μmol Fe/kg, n=3) 24 시간후 토끼의 여러 림프절에서 GE 135/15/15°에 대한 상대적인 시그널 세기. (제 11 도 및 12 도에 따른 정략적 평가)
제 14 도: 토끼의 아가로스-투여된 림프절의 탈체 MR 토모그램(GE 시퀀스); 투여량: 150 μmol Fe/kg; 좌측: 비특정 기준 물질; 우측: 특정 나노입자.
제 15 도: 특정 나노입자와 비특정 나노입자 비교: 주입(150 μmol Fe/kg, n=3) 24 시간후 토끼의 여러 림프절에서 GE 135/15/15°에 대한 상대적인 시그널 세기.
특정 나노입자(제 8, 9 도 = SE; 제 11, 12 도 = GE)의 상대적인 림프절시그날 세기에 대한 간섭효과의 분석은 변형된 물질이 원래 물질보다 림프절에서 더 균질하게 축적됨을 명백히 입증한다. 장골하부, 장골, 슬와부 림프절의 림프절 시그날 감소(GE 시퀀스) 및 FP1-변형된 나노입자에 의해 변형된 모든 림프절 그룹을 통한 평균 축적은 변형되지 않은 기준 입자(제 13 도)와 상당히 다르다(페어드(paired) t-테스트, p < 0.05). 더욱 균질한 림프절간 시그날 간섭은 아가로스-투입된 림프절의 MR 토모그래피 이미지(제 14 도)에서 명백히 관찰되며; 유사한 결과가 랫트에서도 관찰될 수 있으며, 기준 물질은 장간막 림프절에 한정된 강한 시그날 감소를 나타낸다.
적용 실시예 E3
·랫트에서 투여량에 대한 림포절 축적의 의존관계
목적: 적용된 투여량의 함수로서 탈착-흡착 방법(합성 중합체 ≠ 표적 중합체)에 따라 형성된 변형 및 모 화합물(합성 중합체 = 표적 중합체) 간의 여러 림프절/림프절 그룹에서의 상대 시그날 세기 비교.
물질: 특정 나노입자(실시예 D2);
비교 = 실시예 C2에 따른 기본 구조 유니트(= 표적 중합체를 갖지 않는 D2).
투여량: 50 내지 200 μmol Fe/체중 kg (n은 투여량당 3).
시간: 주입후 24 시간.
MR 방법: MR 토모그래피 (SE 및 GE 방법) (적용 실시예 E1 참조).
탈체 모델: 아가로스 팬텀 (적용 실시예 E1 참조).
결과:
제 16 도: 실시예 D2에 따른 특정 나노입자와 비특정 나노입자 비교: 입자를 정맥내 투여하고 24 시간후 랫트의 여러 림프절에서 SE 2000/15에 대한 상대적인 시그널 세기를 적용된 투여량의 함수로서 표시.
제 17 도: 실시예 D2에 따른 특정 나노입자와 비특정 나노입자 비교: 조영제를 투여하고 24 시간후 랫트의 여러 림프절에서 GE 135/15/15°에 대한 상대적인 시그널 세기를 적용된 투여량의 함수로서 표시.
실시예 D2에 따라 변형된 모 화합물에 의해 상당히 향상된 시그날 감소(p < 0.05)가 절반 투여량(200 μmol Fe/kg (C2) 대 100 μmol Fe/kg (D2)) 에서 장간막 및 서혜부 림프절을 제외한 모든 림프절 그룹에서 발견되었다. 이와 같은 명확한 차이는 또한 모든 림프절 부위에 대한 평균 시그날 간섭을 관찰할 때 분명하다.
Figure kpo00018
적용 실시예 E4
·랫트에서 림프절 축적의 시간-의존성
목적: 적용후 시간의 함수로서 탈착-흡착 방법(합성 중합체 ≠ 표적 중합체)에 따라 형성된 변형 및 모 화합물(합성 중합체 = 표적 중합체) 간의 여러 림프절/림프절 그룹에서의 상대 시그날 세기 비교.
물질: 특정 나노입자(실시예 D2);
비교 = 실시예 C2에 따른 기본 구조 유니트(= 표적 중합체를 갖지 않는 D2).
투여량: 200 μmol Fe/체중 kg (n = 3/타임포인트(timepoint)).
시간: 주입후 4 내지 168 시간.
MR 방법: MR 토모그래피(SE 및 GE 방법) (실시예 E1 참조).
탈체 모델: 아가로스 팬텀(실시예 E1 참조).
결과:
제 18 도: 실시예 C2에 따른 기준 물질: 적용후 시간의 함수로서 랫트의 여러 림프절에서 SE 2000/15에 대한 상대 시그날 세기.
제 19 도: 실시예 D2에 따른 특정 나노입자: 적용후 시간의 함수로서 랫트의 여러 림프절에서 SE 2000/15에 대한 상대 시그날 세기.
제 20 도: 실시예 C2에 따른 기준 물질: 적용후 시간의 함수로서 랫트의 여러 림프절에서 GE 135/15/15°에 대한 상대 시그날 세기.
제 21 도: 실시예 D2에 따른 특정 나노입자: 적용후 시간의 함수로서 랫트의 여러 림프절에서 GE 135/15/15°에 대한 상대 시그날 세기.
물질의 정맥내 적용후 림프절 시그날 감소에 대한 시간-의존 MR 토모그래피 조사는 비특이적 모 물질이 실시예 D2에 따른 특정 변형체보다 림프절에서의 시그날 감소가 불량함을 명백히 나타낸다.
적용 실시예 E5
·물리요법 처치: 온도 결합
목적: 열 배쓰(thermobath)에 의해 조절된 체온의 함수로서 여러 림프절/림프절 그룹에서의 상대 시그날 세기 비교.
물질: 특정 나노입자(실시예 D2);
투여량: 100 μmol Fe/체중 kg (n = 7/그룹).
시간: 주입후 24.
방법: MR 토모그래피(SE 및 GE 방법).
과온증 모델:
·열의 적용
여러 림프절 그룹에서 조영제의 축적에 대한 열의 영향을 조사하기 위하여, 랫트를 3 내지 4 시간동안 마취시키고, 부분적으로 수욕에 2 시간동안 놓아 둔다. 랫트 몸체의 좌측부를 히터 플레이트상에 올려 놓고, 우측부를 가열되지 않은 동일 높이의 합성 절연 플레이트 상에 올려 놓는다. 이러한 배열은 랫트 몸체의 좌측 및 우측부 상의 수온에 차이가 나도록 유발한다. 랫트의 좌측 어깨 부위하의 수온은 초기에 41.0 내지 41.5℃이고, 30 분후 41.5 내지 42.0℃의 일정한 값에 도달한다. 랫트의 좌측 어깨 부위하의 수온은 초기에 37.0 내지 37.5℃이고, 30 분후 37.5 내지 38.0℃의 일정한 값에 도달한다. 수욕에서 30분 경과후, 랫트에 나노입자를 체중 kg 당 100 μmol의 용량으로 정맥내 주사하였다(환괴). 항온 수욕에서 1.5 시간동안 유지한 후, 랫트를 그의 우리로 돌려 보내고, 림프절을 정맥내 주사후 24 시간이 지난 다음 수거하여 MR 토모그래피를 사용하여 조사하였다.
결과:
제 22 도: 의도하는 열의 적용에 의해 나타나는 림프절에서의 축적에 대한 영향, 슬와부 림프절만이 좌측 콘트라스트-전 사진에서 밝은 점으로 나타날 것으로 추측될 수 있다. 우측 사진은 열 처리의 영향을 인상적으로 설명한다. 마취된 랫트의 좌측부는 절연 합성 플레이트 상에 놓여 지고, 정상적인 체온을 가지는 반면, 우측부는 수욕에서 41.5 내지 42.0℃로 가열된다. "차거운" 부위는 축적을 거의 나타내지 않거나 전혀 나타내지 않고, 가열된 부위는 나노입자의 높고 균질한 림프절내 축적을 나타낸다.(실시예 D2에 따른 나노입자; 1000 μmol/체중 kg; 주입후 24 시간; GE 135/15/15).
생체내 토모그램은 열 처리의 효과를 명확히 나타낸다. 렛트 몸체의 가열되지 않은 차거운 좌측부는 슬와부 림프절에서 뚜렷한 축적을 나타내지 않는 반면, 가열된 우측부는 조사된 슬와부 림프절에서 높고 균질한 시그날 감소(축적)를 나타내었다.
랫트를 마취시키고, 열 욕에 넣어 가열 효과가 특히 뚜렷한 지를 알아 보았다. 마취는 말초근의 활성을 정지시키고, 림프 플럭스를 감소시키며, 혈관 침투성을 감소시킨다. 결과로서, 열없이 나노입자의 축적은 실제적으로 검출될 수 없다.
적용 실시예 E6
·MR 안지오그래피
물질: 특정 나노입자(실시예 D2).
동물: 랫트(적용 실시예 E1 참조)
투여량: 20 μmol Fe/kg i.v.
시간; 주입후 0 내지 2 시간.
MR 장치:
장치: 시멘즈 마그네톰 1.5 T MR.
익스트레머티 코일(extremity coil)를 갖는 신체용 토모그래피
MR 파라미터: T-가중된 SE 시퀀스를 사용하여 횡단하여 역학 관찰(TR = 200 ms, TE = 10 ms), FOV 170 mm, 매트릭스 256×256; SD: 3mm).
3D 플래쉬로 부터 관상 MIPS(TR: 40(60) ms, TE: 6 ms, FA 60(40)°) 및 3D FISP 시퀀스(TR: 40 ms, TE: 7 ms, FA 35°)FOV 240 mm, 매트릭스 256×256; SD: 17mm; MR 평가: 혈관(대정맥관), 간, 지방 및 근육에서 사용자가 규정한 범위의 시그날 세기. 시그날 세기는 백그라운드에 대해 표준화된다.
결과:
제 23 도: 실시예 D2에 따른 특정 나노입자를 환괴로 적용(투여량: 20 μmol Fe/kg)한 후 T1-가중된 SE 시퀀스(TR: 200 ms, TE: 10 ms)를 사용하여 랫트의 복부를 횡단하여 역학 관찰한 결과; 간내 혈관 및 대정맥에서 분면한 시그날 상승(주입후 1 분).
제 24 도: 실시예 C2에 따른 비특정 기준 물질 및 실시예 D2에 따른 특정 나노입자에 대한 간 실질 및 정맥관에서 SE TR/TE 200ms/10ms에 대한 상대적인 시그날 세기를 비교; 투여량: 20 μmol Fe/kg.
제 25 도: 3D 플래쉬 토모그램(TR: 40ms, TE: 6ms, FA 60°)의 관상 MIPS(최대-세기 투영); 기준 물질 C2(우측) 및 실시예 D2에 따른 특정 나노입자(좌측)의 비교; 투여량: 20 μmol Fe/kg.
제 23 도 및 제 25 도는 실시예 C2에 따른 모 물질과 비교할 때 특정 나노입자(실시예 D2에 따른)의 장점을 나타낸다. 대정맥관 또는 간 실질에서 시그날의 시간에 따른 변화를 요약한 그래프는 MR 안지오그래피에서 조영제로서 사용하기 위한 특정 나노입자의 우수한 성질을 입증한다. 향상 효과는 기준 물질에 비해 3 배 높으며, 브라이트닝 효과(brightening effect)는 장시간 지속되고 매우 일정하다(진단 시간 창 > 60 분).
적용 실시예 E7
·건강한 랫트 및 종양을 갖는 토끼에서 림프절의 가시화
목적: 수술 분야에서 가시화 표지 물질로서 사용하기 위한 본 발명에 따른 나노입자의 적합성 입증.
물질: 특정 나노입자(실시예 D2)
동물: 랫트, SPE Han-Wistar; 약 150 g
이식 VX2 종양(Deutsches Krebsforschungszentrum의 종양 은행, Heidelberg)을 갖는 러시아, 토끼; 약 2.6 kg. 꼬리측면쪽 대퇴부 근육에 3 × 106생존 종양 세포를 주입하여 종양을 이식한다.
이식하고 20 일후 흡수.
투여량: 랫트: 체중 kg 당 500 μmol Fe를 정맥내 주사.
토끼: paw 당 20 μmol을 간질적으로 적용.
시간: 랫트: 주입후 1,4 및 24 시간.
토끼: 주입후 12 시간.
결과:
제 26 도: 림프절을 육안관찰하기 위한 "수술중" 표지 물질로서 본 발명에 따른 나노입자(일반적인 도면).
제 27 도: 림프절을 육안관찰하기 위한 "수술중" 표지 물질로서 본 발명에 따른 나노입자(상세한 도면).
제 28 도: 토기의 전이성 림프절에서 육안관찰에 의해 림프절의 전이를 나타낸 것. 전이는 림프절에서 밝은 오목부로서 확인될 수 있다(그렇지 않은 것은 검은색).
랫트의 이미지(제 26 도 및 27 도)는 대부분 변형된 림프절/림프절 그룹의 상당수가 나노입자 용액의 단일 정맥내 적용으로 염색될 수 있음을 나타낸다. 림프절은 주위 조직과 명확히 구분되며, 따라서, 필요에 따라 수술 집도의에 의해 제거하기에 용이하게 검출될 수 있다.
VX-2 종양을 갖는 토끼를 조사한 결과는 지류(tributary) 부위의 림프절이 간헐적 적용후 특정 나노입자에 의해 균일하게 염색되고, 작은 전이가 검게 염색된 건강한 림프절 조직에서 밝은 오목부로서 육안적으로 구분될 수 있음을 나타낸다(제 28 도 참조).
적용 실시예 E8
·나노입자의 특이성을 증명하기 위한 세포 실험
목적: 트랜스페린의 제 2 코트를 갖는 나노입자의 특이적 세포 흡수(수용체-개재된 세포내이입)의 입증.
물질: 특정 나노입자(실시예 D6);
비교: 실시예 C1에 따른 기본 물질(트랜스페린을 갖지 않는 D6).
농도: 0.5 mmol Fe/매체 ℓ
시간: 37℃(5% CO2- 95% 공기)에서 배양후 18 시간.
세포 배양:
·인간 골수종 세포에 의한 흡수
인간 골수종 세포(ATCC CRL 9068; 세포주 NCI 929)를 0.05 mmol/2-머캅토메탄올 L 및 RPMI 1640 10% FCS(송아지 태자 혈청) 중 적어도 1 × 106 세포/㎖의 농도로 배양한다(37 ℃, 5% 이산화탄소; 225 ㎠ 배양 플라스크). 세포가 약 1.5 × 106세포/㎖ 의 농도에 도달하면 세포를 원심분리하고, 신선한 배지에 재현탁시킨다. 세포를 0.5 mmol/l 농도(철에 대해 계산)의 나노입자와 18 시간동안 배양한다.
세포를 펠렛화하고, PBS로 2 회 세척한다. 그후 분취량중의 세포수(Neubauer 계수 챔버)를 측정한다. 세포 펠렛을 500 ㎕의 농 질산/100 ㎕의 과산화수소에서 가열함으로써 용해시키고, 5.0 ㎖의 부피로 충전한다. 그후 철농도를 원자 방출 분광학(AES, 검출 한도 0.1 ppm)을 이용하여 측정한다.
결과:
제 29도: 비특이적 기준 물질(트랜스페린을 함유하지 않는 나노입자)과 비교한 특이적 나노입자(트랜스페린 함유)의 세포 토모그램, NCI 세포(인간 골수종 세포주)는 기준 입자보다 거의 두배 가까운 특정 입자를 축적한다.
특정 나노입자는 명백히 NCI 골수종 세포에 의해 상당한 정도로 흡수된다. 본 발명에 따른 특정 나노입자 디자인의 장점은 표적 중합체없이 50% 미만의 나노입자가 흡수된다는 사실로 설명된다.
적용 실시예 E9
·와타나베 토끼에서 아테롬성경화증 이미지화(플라크 가시화)
목적: 플라크에 대해 흡착성을 갖는 펩타이드를 탈착-흡착 방법(제 2 코트, 표적 중합체)에 따라 적용시킨 나노입자를 사용하여 토끼에서 아테롬성경화증플라크를 가시화하는 방법.
물질: 특정 나노입자(실시예 D7).
투여량: 200 μmol Fe/체중 kg
시간: 주입후 5 시간.
MR 방법:
장치: 시멘즈 마그네톰 1.5 T MR.
익스트레머티 코일을 갖는 신체용 토모그래피
MR 파라미터: FOV(Field of view) = 150 mm, 매트릭스 =256 × 256; 슬라이스 두께 = 3mm, 절개 방향 = 전방.
시퀀스 1: 양성자-밀도-가중된 스핀 에코 시퀀스(SE)(TR = 2000 ms 및 TE = 15 ms).
시퀀스 2: T2-가중된 구배 에코 시퀀스(GE)(TR = 135 ms, TE = 15 ms 및 FA= 15°).
탈체 모델: 아가로스 팬텀(적용 실시예 E1 참조).
대동맥을 절개하고, 조심스럽게 잘라내 냉 PBS 용액으로 헹구어 결합되지 않은 나노입자 또는 흡수되지 않은 나노입자를 제거한다. 그후 대동맥을 이등분하고, 아가로스 팬텀에 부은 후 MR 토모그래피를 사용하여 조사한다.
조직학: 프루시안 블루 염색
결과:
제 30 도: 변형 D7 (투여량: 200 μmol Fe/kg; 주입 5 시간 후 대동맥 절개)을 갖는 토끼 대동맥의 아테롬성경화 플라크의 탈체 MR 토모그래피 다이아그램; 좌측: 양성자-밀도-가중된 스핀 에코 시퀀스; 우측: T2*-가중된 구배 에코 시퀀스.
제 31 도: 프루시안 블루 염색한 토끼 대동맥의 아테롬성경화막에서 철을 조직학적으로 검사한 것. Mr 토모그램(GE 135/15/15°)과 비교하였을 때 조직학적으로 검출된 철이 특정 나노입자의 축적으로 인해 이미지가 분명한 시그날 감소를 보이는 부위에 위치해 있음을 나타낸다. 대동맥을 D7에 따른 특정 나노입자 200 μmol Fe/kg를 정맥내 투여한 후 5 시간 경과한 다음 절개한다.
제 32 도: 와타나베 토끼의 대동맥에서 실시예 E6에 따른 축적 나노입자를 조직화학적으로 검사한 것(프루시안 블루 염색). 도면의 상부는 아가상에서 준비된 대동맥의 일반적인 도면이고, 하부는 대동맥궁에서 특히 상당한 정도로 변화되는 육안적으로 검출될 수 있는 플라크와 철 염색(블루 염색) 사이의 양호한 상관관계를 입증한다.
준비된 대동맥의 MR 토모그램("탈체 토모그램")은 까만점(시그날 감소)으로서 플라크를 나타내었다. MR 토모그램과 비교하였을 때, 프루시안 블루 염색(철)의 수단에 의한 조직학적 판명은 검출된 철이 특정 나노입자의 축적으로 인해 이미지가 분명한 시그날 감소를 보이는 부위에 위치해 있음을 나타낸다. MR 토모그램의 조사는 명백히 보이는 플라크와 상관관계에 있다. 가장 광범한 플라크가 대동맥궁에 위치해 있으며(이는 MR 토모그램 및 조직학적 관찰로 확인된다), 작은 플라크가 또한 MR 토모그램 및 조직학적 도면 모두에서 검출될 수 있다.
적용 실시예 E10
·종양을 갖는 마우스에서 조사된 종양의 축적
목적: 나노입자가 종양에 축적될 수 있음을 증명. 시험은, 한편으로는 입자가 화학요법제에 적합한 비히클이며, 또 다른 한편으로는 입자가 치료제가 그의 목적하는 작용 부위, 즉 종양에 도달할 수 있는 지를 검사하는데 도움을 줄 수 있음으로 해서 이는 진단 및 치료적인 적용의 조합 형태임을 나타낸다.
물질: 특정 나노입자(실시예 D2).
동물: 이식 종양을 갖는 스위스 누드 마우스
(n = 5/투여량)
(LS 174T, s.c.: 실험전 10 일 적용)
마취: Rompun/Ketavet(1:1), 체중 kg 당 약 0.5 ㎖ i.m.
투여량: 200 μmol Fe/체중 kg
시간: 적용후 0 내지 120 분 및 12 또는 24 시간.
MR 방법:
장치: 시멘즈 마그네톰 1.5 T MR.
익스트레머티 코일(extremity coil)를 갖는 신체용 토모그래피 MR 파라미터: FOV(Field of view) = 150 mm, 매트릭스 = 256 × 256; 슬라이스 두께 = 3mm, 절개 방향 = 전방.
시퀀스 1: 양성자-밀도-가중된 스핀 에코 시퀀스(SE)(TR = 2000 ms 및 TE = 15 ms).
시퀀스 2: 역학 관찰: SE 시퀀스(TR/TE = 300 ms/15 ms).
MR 평가: 종양, 근육, 지방 및 백그라운드에서 사용자가 규정한 범위의 시그날 세기. 여기 조직에서 상대적인 시그날 세기는 지방에서의 시그날 세기에 대한 것이고 표준화된다.
결과:
제 33 도: 실시예 D2에 따른 나노입자를 환괴로 적용(투여량: 200 μmol Fe/kg)한 후 종양 시그널 행동을 횡단하여 T1-가중된 스핀 에코 역학적으로 관찰한 것이다(TR: 300ms, TE: 15ms). 토모그램은 공간 구분이 점점 더 명확해지면서 종양에서의 시그날 상승(축적)이 천천히 시간-의존적으로 증가함을 나타낸다.
제 34 도: 종양에서 상대적인 시그날 세기(축적)의 커브. 200 μmol Fe/체중 kg의 투여량에 대한 시그날(상승)의 시간 변화는 종양에서 시간에 따라 증가하는(축적 증가) 강한 상승을 나타낸다(SE 2000/15).
제 35 도: 실시예 D2에 따른 나노입자의 적용(200 μmol Fe/체중 kg)후 시간 의존성 양성자-밀도 가중된(SE 2000/15) 토모그램을 횡단으로 나타낸 것이다.
시간에 따른 시그날 상승의 선형 증가와 함게 종양에서 나노입자의 축적 증가는 T1-가중 및 양성자-밀도-가중된 스핀 에코 시퀀스에서 확인되었다(제 33 도; 35 도). 주입후 135 분까지 35 내지 40% 상승이 관찰되었으며, 이는 건강한 조직으로 부터 종양을 명확하게 구분되도록 하며, 나노입자의 축적을 확증한다. 여기에서 행해진 조사와는 달리, 안지오그래피에서는 관류에 의해서만 유발된 종양이 최대 30 분(p.i) 후 완전히 사라질 것으로 조사되었다.

Claims (33)

  1. 철-함유 코어; 제 1 코트(합성 중합체); 및 제 1 코트에 물리흡착된 제 2 코트(표적 중합체); 및 임의로 약제학적 보조제, 약제 및/또는 흡착 매체/증강제로 구성됨을 특징으로 하는 나노입자.
  2. 제1항에 있어서, 제 1 코트 및 철-함유 코어의 기본 구조 유니트의 유체역학적 직경이 용액중에서 100 nm 보다 작으며, 철-함유 코어의 직경보다 5 배 이상 크지 않음을 특징으로 하는 나노입자.
  3. 제1항 또는 2항에 있어서, 철-함유 코어가 마그네타이트 및/또는 마그헤마이트로 구성되거나, 또는 이들 두 성분중의 적어도 하나를 함유함을 특징으로 하는 나노입자.
  4. 제1항에 있어서, 철-함유 코어중의 철 25 중량% 이하가 다른 금속 이온으로 대체됨을 특징으로 하는 나노입자.
  5. 제4항에 있어서, 비-철 금속 이온이 상자성 또는 반자성이거나, 상자성 및 반자성 금속 이온의 혼합물임을 특징으로 하는 나노입자.
  6. 제1항에 있어서, 철-함유 코어가 전자 현미경을 사용하여 측정한 것으로 30 nm 미만의 직경을 갖고, 최소 50 개의 금속 이온을 함유하며, 입자 크기 분포가 적어도 90% 의 철-함유 코어가 0.7x평균 내지 1.3x평균 범위에 있도록 되어 있음을 특징으로 하는 나노입자.
  7. 제1항에 있어서, 존재하는 금속 이온의 총 합의 0.01 배 내지 1 배 양(w/w)의 합성 중합체를 함유함을 특징으로 하는 나노입자.
  8. 제1항에 있어서, 합성 중합체가 모노머 또는 폴리머 물질, 또는 이들 물질 또는 유도체의 혼합물, 또는 기능 그룹을 갖는 유도체의 혼합물, 또는 부가적으로 치환된 유도체의 혼합물이며, 10,000 Da 미만의 분자량을 가짐을 특징으로 하는 나노입자.
  9. 제1항에 있어서, 합성 중합체가 덱스트란, 그의 유도체, 또는 덱스트란 및/또는 덱스트란 유도체의 혼합물임을 특징으로 하는 나노입자.
  10. 제1항에 있어서, 합성 중합체가 그의 분자내에 하나 또는 다수의 산 그룹, 또는 N,S,P 또는 O 원자를 함유하는 수개의 기능 그룹을 포함함을 특징으로 하는 나노입자.
  11. 제1항에 있어서, 표적 및 합성 중합체가 동일하거나 상이한 물질 또는 이들 물질의 혼합물임을 특징으로 하는 나노입자.
  12. 제1항에 있어서, 함유된 표적 중합체의 중량이 존재하는 금속 이온 중량의 0.5 배 내지 50 배 임을 특징으로 하는 나노입자.
  13. 제1항에 있어서, 함유된 금속 이온 총 중량보다 작거나 또는 이와 동일한 양으로 흡착 매체/증강제를 함유함을 특징으로 하는 나노입자.
  14. 제13항에 있어서, 흡착 매체/증강제로서 펩타이드를 함유함을 특징으로 하는 나노입자.
  15. 제1항에 있어서, 모든 성분의 유체역학적 직경의 그의 철-함유 코어의 직경의 10 배를 넘지 않으며, 그의 기본 구조 유니트의 직경보다 최대 20% 큼을 특징으로 하는 나노입자.
  16. 제1항에 있어서, 어떤 시기에나 배합될 수 있는 기본 구조 유니트, 표적 중합체, 약제 및 흡착 매체와 같은 개개 모듈로 구성됨을 특징으로 하는 나노입자.
  17. 제 1 단계에서 합성 중합체의 존재하에 염기 처리하여 철-함유 코어를 제조하고, 제 2 단계에서 탈착 방법에 의해 철 대 합성 중합체 비를 변화시키고, 제 3 단계에서 표적 중합체를 물리흡착시키고, 임의로 흡착 매체/증강제, 약제학적 보조제 및/또는 약제를 첨가함을 특징으로 하여, 제 1 항에 따르는 나노입자를 제조하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 철 (Ⅱ) 및 철(Ⅲ) 염의 혼합물을 사용하여 철-함유 코어를 제조하고, 여기에서 2가 대 3가 철의 비는 1:1 내지 1:20 임을 특징으로 하는 방법.
  19. 제17항 또는 18항에 있어서, 철(Ⅲ) 염 혼합물을 환원제와 함게 사용하여 철-함유 코어를 제조하고, 철 (Ⅱ) 대 철(Ⅲ) 비가 1:1 내지 1:20이 되도록 환원제의 양을 선택함을 특징으로 하는 방법.
  20. 제17항에 있어서, 사용된 철 화합물이 무기 및 유기 염과 그의 착물의 혼합물임을 특징으로 하는 방법.
  21. 제17항에 있어서, 철-함유 결정이 각각 제조된 수산화철(Ⅱ) 및 수산화철(Ⅲ) 용액을 혼합함으로써 제조됨을 특징으로 하는 방법.
  22. 제17항에 있어서, 사용한 금속 이온의 25% 이하가 비-철 이온임을 특징으로 하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 비-철 금속 이온이 상자성 또는 반자성이거나, 상자성 및 반자성 금속 이온의 혼합물임을 특징으로 하는 방법.
  24. 제17항에 있어서, 물질 또는 물질의 배합물이 상호 침전에 의해 생성된 결정을 분리하는 합성 중합체로서 사용되고, 반응 혼합물중의 합성 중합체의 양이 함유된 금속 이온의 중량의 0.5 내지 20 배를 초과하지만 반응 혼합물의 50%(g/v)를 초과하지 않음을 특징으로 하는 방법.
  25. 제17항에 있어서, 0.1 내지 10N 염기를 사용하여 신속히 첨가되는 철화합물을 침전시킴을 특징으로 하는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 암모니아 기체 또는 염, 아민 또는 아민 유도체, 또는 휘발성 완충액을 사용하여 철 화합물을 침전시킴을 특징으로 하는 방법.
  27. 제17항에 있어서, 기본 구조 유니트가 0℃ 내지 120℃의 온도 범위에서 합성됨을 특징으로 하는 방법.
  28. 제17항에 있어서, 철 대 합성 중합체의 비가 1:0.01 내지 1:1(w/w)로 고정됨을 특징으로 하는 방법.
  29. 제17항에 있어서, 첨가된 표적 중합체의 양이 표적 중합체에 대한 존재하는 금속 이온의 비가 1:0.5 내지 1:50이 되도록 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  30. 제17항에 있어서, 나노입자가 안정한 콜로이드상졸이거나 동결건조되고, 단순한 용매를 사용하여 용액으로 되돌아갈 수 있거나, 또는 기본 구조 유니트, 표적 성분 및 임의의 보조제가 적용 용액을 제조하는 특정 시간에 혼합되는 분리 용액 또는 동결건조물로서 사용될 수 있음을 특징으로 하는 방법.
  31. 제17항에 있어서, 나노입자가 개개 모듈이 어떤 시기에나 배합될 수 있음을 특징으로 하는 방법.
  32. 진단시 조영제로서, 수술과 같은 의약 분야에서 가시화 표지 물질로서 및 활성제용 비히클 또는 치료용 활성제로서 사용하기 위한 제1항에 따른 나노입자.
  33. 생리학적으로 허용되는 제1항에 따른 나노입자를 포함하는, 아테롬성경화증을 영상화하기 위한 잔단 조성물.
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