KR100827292B1

KR100827292B1 - 실리콘-포함 수용성 고분자로 코팅된 나노입자 및 그의조영제로서의 용도

Info

Publication number: KR100827292B1
Application number: KR1020060048622A
Authority: KR
Inventors: 전상용; 정용연; 이혜림; 김재일; 이은혜; 장남규; 김도경
Original assignee: 애니젠 주식회사
Priority date: 2006-05-30
Filing date: 2006-05-30
Publication date: 2008-05-07
Anticipated expiration: 2026-05-30
Also published as: KR20070114943A

Abstract

본 발명은 복수의 나노입자를 포함하는 조영제에 관한 것으로서, 상기 나노입자는 다음을 포함하는 것을 특징으로 하는 조영제에 관한 것이다: (a) 신호 발생 코어(signal generating core); 및 (b) 실리콘이 포함된 수용성 고분자를 포함하며, 상기 신호 발생 코어의 표면에 코팅되어 있고, 나노입자의 항-바이오파울링(anti-biofouling) 특성 및 수 분산성(water dispersibility)을 증가시키며, 나노입자의 조영 능력을 증가시키는 작용을 하는 수용성 외부 쉘(water soluble outer shell).

조영제, 산화철, 초상자성, 실리콘, 폴리에틸렌글리콜, 종양, MRI

Description

실리콘-포함 수용성 고분자로 코팅된 나노입자 및 그의 조영제로서의 용도{Nanoparticles Coated with Silicon-Containing Polymers and Their Use as Contrast Agents}

도 1은 본 발명의 실리콘이 함유된(silicone-containing) 수용성 고분자로 코팅된 초상자성 산화철 나노 입자(superparamagnetic iron oxide nanoparticles: SPION) 및 실리콘이 함유된 고분자가 서로 가교결합 되어있는 코팅 부분을 확대하여 도식화한 개략도이다.

도 2는 본 발명의 IS-SPION 및 SW-SPION을 코팅하고 있는 수용성의 폴리에틸렌글리콜-실리콘(PEG-silicone) 공중합체에 대한 FT-IR 스펙트럼이다.

도 3은 본 발명의 IS-SPION 및 SW-SPION의 코어가 되는 초상자성 산화철 나노 입자에 대한 X-선 회절(X-ray diffraction: XRD) 분석 결과를 보여준다.

도 4는 자기장 변화에 따른 본 발명의 IS-SPION(솔리드 선) 및 SW-SPION(점선)의 자성 변화를 보여주는 그래프이다.

도 5는 인산완충식염수(phosphate buffered saline: PBS, pH 7.4) 내에 분산된 본 발명의 IS-SPION 및 SW-SPION의 안정성을 보여주는 사진이다.

도 6은 본 발명의 IS-SPION(위 패널) 및 SW-SPION(아래 패널)의 산화철 나노 입자의 크기를 투사전자현미경(TEM)을 이용하여 측정한 결과이다. 크기 막대는 10 nm를 나타낸다.

도 7은 0.6 mg Fe의 각각의 조영제로 처리한 후, 대식세포 RAW 264.7의 인 비트로 프루시안 블루 염색 결과이다. (a) 대조군(조영제 비처리), (b) Feridex, (c) IS-SPION, (d) SW-SPION. 크기 막대는 50 ㎛를 나타낸다.

도 8은 마우스의 등쪽에 이식된 종양에 15 mg/kg의 IS-SPION(패널 a, b 및 c) 또는 13 mg/kg의 SW-SPION(패널 d, e 및 f) 주입 후 0, 1 및 4시간이 경과한 다음, 촬영된 T2-웨이티드 패스트-스핀 에코 이미지(4,200 ms/102 ms의 TR/TE)이다. SPION 주입 후 1시간째의 T2-웨이티드 이미지(패널 b 및 e)는 0시간째의 이미지(패널 a 및 d)와 비교하여 종양 부위에서 시그널 감소가 크게 나타났다. 화살표는 이식된 종양을 지시한다.

도 9는 IS-SPION(패널 a) 및 SW-SPION(패널 b)의 주입 후 4시간이 경과된 마우스의 종양조직에 대한 엑스 비보 프루시안 블루 염색 결과이다.

도 10은 본 발명의 IS-SPION 및 SW-SPION의 수유동성(hydrodynamic) 크기 분포를 보여 주는 그래프이다.

도 11은 본 발명의 IS-SPION(패널 a) 및 SW-SPION(패널 b)의 증류수(클로즈드 원), PBS(클로즈드 사각형) 및 10% FBS-함유 RPMI 배지 내에서 인큐베이션 시간에 따른 수유동성(hydrodynamic) 크기 분포를 보여 주는 그래프이다.

도 12는 본 발명의 IS-SPION 및 SW-SPION의 pH 변화에 따른 안정성을 보여준다.

본 발명은 실리콘-포함 수용성 고분자로 코팅된 나노입자 및 그의 조영제로서의 용도에 관한 것이다.

초상자성 산화철 나노입자(superparamagnetic iron oxide nanoparticles: SPION)은, 자기공명영상(MRI) 진단(1-8), 약물 운반(9, 10) 및 치료(발양성 변조기분, 11)와 같은 생물의학 분야에서 최근에 각광을 받고 있다. SPION(12)은 그의 초상자성 특성 때문에, 종래의 상자성 Gd-계열의 조영제 보다 MRI에서 높은 조영능력을 발휘할 수 있다(13-15).

그러나 in vivo MRI 조영제로서 SPION을 직접적으로 사용하게 되면 SPION 입자들이 혈류 중에 세포나 단백질 등의 생체 물질들을 흡착하는 바이오파울링(biofouling)을 초래하여 응집체(aggregates)를 형성하게 되면, 이는 대식세포와 같은 RES(reticular endothelial system) 세포들에 의해 빠르게 이격된다(18, 19). 또한, 응집된 SPION은 초상자성 특성이 약화된다(11).

SPION의 이러한 신속한 소거는, 나노-자성 입자들 사이의 인력 및 높은 표면적-대-부피 비율에 의해 보다 효과적으로 발생되는 입자 표면으로의 혈장 단백질들의 비특이적 흡착(11, 21)에 의해 이루어지는 식균작용 증진(opsonization) 과정에 의해 촉발되는 것으로 알려져 있다(20). 따라서 생리학적 조건(즉, 높은 염 농도 및 단백질 농도) 하에서 바이오 파울링과 SPION 입자들의 응집을 장기간 최소화할 수 있도록 SPION의 표면을 적절한 고분자로 코팅하는 것이 중요하다(22-24).

몇 종의 천연 또는 합성 고분자들이, SPION의 표면을 변형시켜 그의 인 비보 기능을 개선하는 데 사용되고 있다(11). 이러한 고분자로는 덱스트란(25, 26), 폴리에틸렌글리콜(10, 23, 27) 및 폴리비닐피롤리돈(28)등이 있으며, 이들은 생체적합성을 나타내고 장기간 SPION 혈액 순행을 가능케 하는 것으로 알려져 있다. 마이온 (monocrystalline iron oxide nanoparticles: MION) 혹은 클라이온(crosslinked iron oxide nanoprticles: CLION)은, 덱스트란으로 코팅된 자철광 코어(Fe₃O₄ 화학조성)를 갖는 SPION의 대표적인 예이며, 이들은 인 비트로 MRI와 인 비보 MRI에서 널리 이용되고 있다(29-33).

합성 고분자 중에서, SPION의 PEG 코팅이 생체 적합성이 높고 혈액내 순환 시간을 증가시키는 것으로 잘 알려져 있다(10, 20 및 34). 하지만, 종전의 PEG 코팅은 비공유 결합에 의한 상호 작용을 통해 이루어지기 때문에, 생체 내의 생리학적 미디엄에서 PEG 코팅이 안정하게 유지되는 데에는 한계가 있다(23, 25). 또한, 본 발명자들의 지식 범위에서, PEG-코팅 SPION이 인 비보 암 영상화를 위해 MRI 조영제로서 이용된 경우는 없다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시 되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 상술한 종래기술의 문제점을 해결하고자 예의 연구 노력한 결과, 실리콘이 포함된 수용성 고분자를 신호 발생 코어의 표면에 코팅하여 나노입자를 제조하면 항-바이오파울링(anti-biofouling) 특성, 안정성 및 조영 능력이 크게 개선됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 신규한 조영제를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 조영제의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 복수의 나노입자를 포함하는 조영제로서, 상기 나노입자는 다음을 포함하는 것을 특징으로 하는 조영제를 제공한다: (a) 신호 발생 코어(signal generating core); 및 (b) 실리콘이 포함된 수용성 고분자를 포함하며, 상기 신호 발생 코어의 표면에 코팅되어 있고, 나노입자의 항-바 이오파울링(anti-biofouling) 특성 및 수 분산성(water dispersibility)을 증가시키며, 나노입자의 조영 능력을 증가시키는 작용을 하는 수용성 외부 쉘(water soluble outer shell).

본 발명의 나노입자에서, 다양한 신호 발생 코어가 이용될 수 있다. 바람직하게는, 신호 발생 코어는 상자성(paramagnetic), 초상자성(superparamagnetic) 또는 양성자 밀도(proton density) 신호 발생 코어이며, 가장 바람직하게는 초상자성 신호 발생 코어이다.

본 발명에 적합한 예시적인 상자성 신호 발생 코어는 안정된 자유 라디칼(예컨대, 안정된 니트록사이드(nitroxides)), 전이원소, 란탄족 원소 및 악티늄족 원소를 포함한다. 바람직한 원소는, Gd(Ⅲ), Mn(Ⅱ), Cu(Ⅱ), Cr(Ⅲ), Fe(Ⅱ), Fe(Ⅲ), Co(Ⅱ), Er(Ⅱ), Ni(Ⅱ), Eu(Ⅲ) 및 Dy(Ⅲ)를 포함한다.

본 발명에 적합한 예시적인 초상자정 신호 발생 코어는 페로-(ferro-) 또는 페리마그네틱 화합물(ferrimagnetic compounds), 예컨대, 순수 철, 자성 산화철(예컨대, 마그네타이트, Fe₃O₄),γ-Fe₂O₃, 망간 페라이트, 코발트 페라이트 및 니켈 페라이트를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명에 이용되는 초상자정 신호 발생 코어는 Fe₃O₄ 또는 γ-Fe₂O₃이고, 가장 바람직하게는 Fe₃O₄이다.

본 발명에 적합한 예시적인 양성자 밀도 신호 발생 코어는 퍼플루오로카본이다.

신호 발생 코어의 표면에는 수용성 외부 쉘(water soluble outer shell)이 코팅되어 있다. 이 수용성 외부 쉘은 본 발명의 조영제가 수용성을 나타내도록 할 뿐만 아니라, 나노입자의 항-바이오파울링(anti-biofouling) 특성을 부여하며, 코팅되지 않은 나노입자와 비교하여 증가된 안정성 및 조영 능력을 발휘하도록 하는 작용을 한다.

외부 쉘은 실리콘이 포함된 수용성 고분자로 이루어져 있다. 본 발명에서 이용되는 실리콘이 포함된 수용성 고분자는 실리콘이 공유결합된 다양한 수용성 고분자를 포함한다. 바람직하게는, 상기 수용성 고분자는 폴리아크릴산(poly(acrylic acid)) 또는 그 유도체, 폴리메타아크릴산(poly(meta)acrylic acid)) 또는 그 유도체, 폴리아크릴아미드(poly(acrylic amide)) 또는 그 유도체, 또는 폴리언데세노산(poly(undecenoic acid)) 또는 그 유도체, 또는 상기 고분자의 공중합체를 주골격(main backbone)으로 갖는다. 보다 바람직하게는, 상기 수용성 고분자는 폴리아크릴산(poly(acrylic acid)) 또는 그 유도체, 또는 폴리메타아크릴산(poly(meta)acrylic acid)) 또는 그 유도체, 또는 상기 고분자의 공중합체를 주골격으로 갖는다.

실리콘은 상술한 수용성 고분자에 다양한 형태 또는 방식으로 결합되어 있을 수 있으며, 예를 들어, 모노에스테르 결합을 통해 결합되어 있을 수 있다. 실리콘이 모노에스테르 결합을 통해 상기 수용성 고분자에 결합되는 경우, 실리콘은 모노에스테르 결합에 직접 결합될 수도 있지만, 탄소수 1-5의 탄화수소 모이어티(예컨대, 프로필기)가 개입되어 간접적으로 결합될 수도 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 실리콘이 포함된 수용성 고분자는 실리콘 원소를 통하여 신호 발생 코어에 공유결합 되어 있다. 즉, 실리콘 원소와 신호 발생 코어의 표면에 있는 작용기 사이에 공유결합이 형성될 수 있다. 종래의 코팅은 비공유결합으로 되어 있어, 코팅의 안정성이 문제가 되었다. 본 발명에서 실리콘을 통한 신호 발생 코어와의 공유결합은 외부 쉘 코팅의 안정성을 크게 증대시킨다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 실리콘이 포함된 수용성 고분자는 실리콘 원소 사이의 결합을 통하여 가교결합(crosslinking)되어 있다. 이러한 가교결합은 합성된 고분자에 열(예컨대, 80℃)을 가하여 만들 수 있다. 상기 가교결합은 실리콘-포함 수용성 고분자 코팅의 안정성을 더욱 더 증가시키는 작용을 한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 실리콘이 포함된 수용성 고분자는 폴리에틸렌글리콜(PEG), 덱스트란, 폴리비닐피롤리돈, 폴리프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜과 폴리프로필렌글리콜의 공중합체, 또는 이들의 모노에스테르화 유도체를 추가적으로 포함한다. 상기 추가적인 고분자도 수용성을 나타내며, 생체 내의 단백질 및 세포가 나노입자에 결합하는 것을 막는 항-바이오파울링 작용을 한다. 상기 추가적인 고분자, 예를 들어, PEG는 다양한 결합 방식으로 실리콘이 포함된 수용성 고분자에 결합되어 있으며, 예를 들어, 모노에스테르 결합을 통해 결합되어 있을 수 있다. PEG가 모노에스테르 결합을 통해 상기 수용성 고분자에 결합되는 경우, 실리콘은 모노에스테르 결합에 직접 결합될 수도 있지만, 탄소수 1-5 의 탄화수소 모이어티가 개입되어 간접적으로 결합될 수도 있다.

또한, PEG가 수용성 고분자에 추가적으로 결합되어 있는 경우, 친수성의 PEG 층이 나노입자의 표면에 노출되어 우수한 수 분산성(water dispersibility)을 발휘하게 된다.

PEG 등의 추가적인 고분자가 실리콘-포함 수용성 고분자에 추가적으로 결합된 경우, PEG 등은 나노입자의 가장 바깥쪽에 제시 되며(presented), 실리콘은 안쪽에서 신호 발생 코어와 공유결합을 형성한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 실리콘이 포함된 수용성 고분자는 다음 화학구조식 1로 표시 된다:

상기 화학식에서, R₁, R₂ 및 R₃는 서로 독립적으로, H 또는 C₁-C₅ 알킬기이고, X는 산소, 황 또는 질소 원자이며, Y는 폴리에틸렌글리콜, 덱스트란 또는 폴리비닐피롤리돈이고, m 및 n은 1-10,000의 정수이며, 그리고 p는 1-20의 정수이다.

상기 화학식 1에서, 바람직하게는 R₁은 C₁-C₃ 수소 또는 알킬기이고, 가장 바람직하게는 수소 와 메틸기이다. 상기 화학식 1에서, 바람직하게는 R₂는 수소 또는 C₁-C₃ 알킬기이고, 가장 바람직하게는 수소 와 메틸기이다. 화학식 1에서, 바람직하게는 R₃는 수소 또는 C₁-C₃ 알킬기이고, 가장 바람직하게는 메틸기 이다. 상기 화학식 1에서, X는 가장 바람직하게는 산소 원자이고, Y는 폴리에틸렌글리콜이다.

상기 화학식 1의 바람직한 구조는 다음 화학식 2로 표시되는 수용성 고분자이다:

상기 화학식에서, R₁ 및 R₂는 서로 독립적으로, H 또는 C₁-C₅ 알킬기이고, PEG는 폴리에틸렌글리콜이며, m 및 n은 1-10,000의 정수이다.

보다 바람직하게는, 상기 화학식 2에서 R₁은 H이고, R₂는 메틸기이다.

본 발명의 실리콘-포함 수용성 고분자는 실리콘을 포함하는 반복단위(repeating unit)와 PEG와 같은 고분자를 포함하는 반복단위가 순서대로 배열되어 있는 블록 공중합체의 형태를 가질 수도 있으나, 바람직하게는 랜덤 공중합체이다.

본 발명의 실리콘-포함 수용성 고분자에는 타깃팅 리간드가 추가적으로 결합될 수 있다. 상기 타깃팅 리간드의 예는 앱타머, 단백질, 펩타이드, 항체 및 당을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 실리콘-포함 수용성 고분자에는 형광물질과 같은 표지물질(labels)이 추가적으로 결합될 수 있다. 상기 형광물질의 예는, 플루오리신(fluorescein), 피코에리트린(phycoerythrin), 로다민, 리사민(lissamine), 그리고 Cy3와 Cy5를 포함한다. 이러한 타깃팅 리간드 및 표지물질의 결합은 상기 화학식 1의 고분자에 직접 결합시킬 수도 있지만, 바람직하게는 상기 화학식 1의 고분자에 추가적인 작용기성(functionality)을 부가한 다음, 이 추가적인 작용기에 결합시킨다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 화학구조식 1의 고분자 내에 있는 실리콘은 신호 발생 코어와 공유결합 되어 있거나 또는 다른 실리콘 원소와 가교결합 되어 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조영제는 자기공명영상(magnetic resonance imaging: MRI)에 이용된다. 본 발명의 조영제는, 다양한 생체 조직을 자기공명영상화에 이용될 수 있지만, 특히 인 비보 암 자기공명영상화에 서 매우 우수한 조영 작용을 한다. 본 발명의 조영제의 특징 중 하나는, 비록 암세포 특이적인 타겟팅 리간드(targeting ligand, 예컨대, 항체)를 가지지 않는 경우에도 인 비보 암 자기공명영상화를 효율적으로 할 수 있다는 것이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 고분자-코팅된 나노입자들의 평균 직경은 5-50 nm이고, 보다 바람직하게는 5-30 nm이며, 가장 바람직하게는 약 10-20 nm이다. 이러한 나노입자들의 크기는 CLION 및 MION와 같은 종래의 덱스트란-코팅 SPIONs(45, 46) 보다 훨씬 작은 값이다. 또한, 본 발명의 고분자-코팅된 나노입자들은 좁은 크기 분포를 나타낸다. 이러한 작은 입자 크기는 본 발명의 나노입자가 목적의 조직(예컨대, 종양 조직)으로 침투하는 것을 용이하게 하여 조직 내에 나노입자가 축적되는 것을 증가시킨다. 결국, 이러한 침투 용이성은 본 발명의 나노입자의 조영 능력을 향상시키는 작용을 한다. 또한, 본 발명의 고분자-코팅된 나노입자들의 작은 크기 및 좁은 크기 분포는 자성 시그널 및 이 시그널의 균질성(homogeneity)를 강화시키데 기여를 한다.

본 발명의 나노입자의 포화자성은 바람직하게는, 20-100 emu/g Fe, 보다 바람직하게는 40-90 emu/g Fe, 보다 더 바람직하게는 60-85 emu/g Fe, 가장 바람직하게는 75-85 emu/g Fe이다. 종래의 고분자-코팅 SPION의 포화자성이 30-50 emu/g Fe(48)인 것을 고려하면, 본 발명의 나노입자의 포화자성이 크게 개선되었음을 알 수 있다. 본 발명의 나노입자의 큰 포화자성은 시그널 발생에 매우 유리하며, 이는 조영능력을 증가시키는 데 기여한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 나노입자는 신호 발생 코어를 형성한 후에 코어의 표면에 실리콘이 포함된 수용성 고분자를 코팅하여 제조된 것이다. 즉, 단계적으로 나노입자를 제조하는 방식으로 제조된 것이다. 나노입자의 제조방법은 아래에 상세하게 기재되어 있다.

본 발명의 조영제는 항-바이오파울링 특성이 우수할 뿐만 아니라, 안정된 고분자 코팅을 유지할 수 있다. 또한, 본 발명의 조영제는 비교적 작은 입자 크기를 나타낸다. 이러한 특성들은 본 발명의 조영제의 혈액 내 순환시간을 증가시키고, 목적의 조직에 침투하는 것을 용이하게 하며, 결국 조영제가 목적의 조직(예컨대, 종양 조직)에 축적될 수 있는 가능성을 더 증가시키는 결과를 가져온다. 또한, 본 발명의 조영제는 적합한 시간(예컨대, 1일) 내에 적용된 인체에서 배출된다. 따라서 본 발명의 조영제는 EPR(enhanced permeability and retention) 효과를 통하여 크게 개선된 조영 능력을 나타낼 뿐만 아니라, 인체에 대해 안전하게 적용할 수 있다. 특히, 본 발명의 조영제는 MRI로 암을 진단하는 데 있어서 매우 우수한 작용을 보인다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 상술한 본 발명의 조영제의 제조방법을 제공한다: (a) Fe³ ⁺ 및 Fe² ⁺의 염을 이용하여 산화철 코어로 이루어진 신호 발생 코어를 형성시키는 단계; (b) 신호 발생 코어와 실리콘 이 포함된 수용성 고분자를 혼합 및 교반시켜 상기 수용성 고분자를 신호 발생 코어에 코팅시키는 단계; 및 (c) 상기 (b)의 결과물에 열을 가하여 상기 수용성 고분자 내의 실리콘이 가교결합 되도록 하는 단계.

종래의 방법에 따르면, 자성 나노 입자 형성 과정 동안에 고분자를 동시에 코팅한다(29, 44). 그러나 본 발명의 방법은 자성 나노 입자를 형성한 이후에 고분자를 코팅하게 된다. 본 발명의 방법은 단계적(stepwise) 방법으로, "SW 방법"이라 명명한다. 종래의 방법은 동시(In situ) 방법으로, “IS 방법"이라 명명한다.

본 발명의 방법과 상술한 본 발명의 조영제에서 공통되는 내용은, 중복기재에 따른 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명의 방법에서 첫 번째 단계는 Fe³ ⁺ 및 Fe² ⁺의 염을 이용하여 산화철 코어로 이루어진 신호 발생 코어를 형성시키는 단계이다. 상세하게는, 물에 Fe³⁺ 및 Fe² ⁺의 염(예컨대, FeCl₃ 및 FeCl₂)을 첨가하고 교반하여 혼합한 다음, 알칼리 용액(예컨대, 암모늄 수용액)을 첨가하여 용액의 pH를 10 이상으로 조정한다. 이어, 혼합물을 강하게 교반하여 산화철 입자를 제조한다.

그런 다음, 산화철 입자로 이루어진 신호 발생 코어 및 실리콘이 포함된 수용성 고분자를 혼합 및 교반시켜 상기 수용성 고분자를 신호 발생 코어에 코팅시킨다. 그리고 나서, 고분자 코팅된 산화철에 열을 가하여 고분자 내의 실리콘들이 공유결합을 형성되도록 함으로써 고분자들끼리 서로 얽히는 구조가 되는 가교결합을 형성시킨다. 가교결합 형성을 위한 가열 처리는, 바람직하게는 50-90℃, 보다 바람직하게는 70-85℃, 가장 바람직하게는 약 80℃에서 실시된다.

본 발명의 SW 방법은 IS 방법과 비교하여, 증가된 포화자성(예컨대, 80 emu/g Fe), 감소된 입자 크기(약 12 nm)를 가지는 초상자성 나노입자를 제조하게 한다.

즉, 본 발명의 SW 방법에 따르면, 이미 제조된 산화철 코어에 고분자 층이 형성되기 때문에, 코팅 과정에서 자성이 변화되지 않는다. 반면에, IS 방법은 산화철 나노입자가 형성되는 과정에서 고분자의 간섭(interference)이 있기 때문에, 포화자성이 SW 방법 보다 작게 된다. 본 발명의 SW 방법에 의해 제조된 초상자성 나노입자는 매우 큰 포화자성을 나타내기 때문에 시그널을 발생시키는 데 있어서 매우 유리하며, 이는 결국 매우 우수한 조영 능력을 발휘하도록 한다.

또한, 본 발명의 SW 방법에 의해 제조된 초상자성 나노입자는 그 크기도 매우 작은데, 이는 목적의 조직에 나노입자가 침투하는 것을 용이하게 하며, 결국 나노입자가 목적의 조직(예컨대, 종양 조직)에 축적될 수 있는 가능성을 더 증가시키는 결과를 가져온다.

따라서 본 발명의 SW 방법은 IS 방법 보다 개선된 성능(performance)을 나타내는 조영제를 제공할 수 있다.

본 발명의 일 구현예로서, 폴리에틸렌글리콜/실리콘 중합체가 코팅된 초상자성 산화철 나노입자를 제조하는 방법을 설명하면 다음과 같다:

우선, 폴리에틸렌글리콜/실리콘 중합체를 제조한다. 중합체 형성을 위하여다양한 모노머를 이용할 수 있으며, 가장 바람직하게는, 3-트리메톡시실릴 프로필 메타아크릴레이트(3-(trimethoxysilyl) propyl methacrylate: TMSMA) 및 폴리에틸렌글리콜 메틸에테르 메타아크릴레이트(polyethyleneglycol methylether methacrylate: PEGMA)를 이용한다. 상기 두 모노머를 혼합하고, 이 혼합물에 라디칼 반응 개시제, 예컨대 아조비스아이소부틸로나이트릴 (azobisisobutyronitrile: AIBN)을 첨가하고 중합반응을 진행시킨다. 이 과정을 통하여, 실리콘-포함 수용성 폴리에틸렌글리콜/실리콘(PEG/Silicone) 중합체의 일례인 poly(TMSMA-r-PEGMA) 랜덤 공중합체가 형성된다. 상기 중합체 제조 과정을 반응식으로 나타내면 다음과 같다:

상기의 poly(TMSMA-r-PEGMA)는 자성 나노 입자의 코팅을 위한 고분자로 사용되는데, 자성 나노 입자의 제조와 그 코팅 방법은 두 가지 방식으로 할 수 있다. 한 방법은 자성 나노 입자를 형성시킨 후에, 고분자를 코팅하는 방법이다. 다른 한 방법은 종래에 사용하던 기술로서 자성 나노 입자 형성 과정 동안에 고분자를 동시에 코팅하는 방법이다(29, 44). 첫 번째 방법은 단계적(stepwise) 방법으로, "SW 방법"이라 명명한다. 두 번째 방법은 동시(In situ) 방법으로, “IS 방법"이라 명명한다.

SW 방법을 설명하면 다음과 같다:

증류수에 Fe³ ⁺ 및 Fe² ⁺의 염(예컨대, FeCl₃ 및 FeCl₂)을 첨가하고 교반하여 혼합한 다음, NH₄OH (암모늄 수용액)을 첨가하여 용액의 pH를 10 이상으로 조정한다. 이어, 혼합물을 강하게 교반하여 산화철 입자를 제조한다. 그런 다음, 산화철 입자를 포함하는 수용액에 수용성의 poly(TMSMA-r-PEGMA)를 첨가하고 일정시간 동안 교반하여 산화철 입자를 고분자로 코팅한다. 그리고 나서, 고분자 코팅된 산화철에 열(예컨대, 80℃)을 가하여 고분자 내의 실리콘들이 공유결합을 형성되도록 함으로써 고분자들끼리 서로 얽히는 구조가 되는 가교결합을 형성시킨다(도 1). 이러한 가교결합은 초상자성 산화철 나노 입자의 고분자 코팅을 더욱 견고하게 한다.

두 번째 방법인 IS 방법은, 고분자 수용액에 Fe³ ⁺ 및 Fe² ⁺의 염을 첨가하고 교반하여 자성 나노 입자의 합성과 동시에 이 입자를 코팅하는 방법이다. 그 외 방법의 상세한 설명은 SW 방법과 동일하다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: 폴리에틸렌글리콜 /실리콘(PEG/Silicone) 공중합체의 합성

TMSMA(3-트라이메톡시실릴프로필메타아크릴레이트, Sigma-Aldrich Chemical Co.) 1.25 g (5 mmol) 및 PEGMA(폴리에틸렌글리콜메틸에테르메타아크릴레이트, Sigma-Aldrich) 2.37 g (5mmol)을 THF(테트라하이드로퓨란) (Sigma-Aldrich) 5 ml에 용해시켰다. 이 용액을 20분 간 질소 가스를 흘려주어서 가스를 제거하였다. AIBN(아조비스아이소부틸로나이트릴, Sigma-Aldrich) 10 mg (0.1 mmol)을 라디칼 고분자화 반응 개시제로 상기 용액에 첨가한 후, 70℃에서 24시간 동안 고분자 합성 반응을 진행하여 수용성의 폴리에틸렌글리콜-실리콘(PEG-Silicone) 공중합체를 합성하였다.

실시예 2: 단계적(Stepwise) 방법으로 코팅된 자성나노입자 (SW- SPION )

증류수 30 ml에 FeCl₃ㆍ6H₂O(Sigma-Aldrich)0.5 g 및 FeCl₂ㆍ4H₂O(Sigma-Aldrich)0.184 g을 첨가하고 교반하여 혼합하였다. NH₄OH(암모늄 수용액, Fluka) 7.5 ml을 첨가하여 용액의 pH를 약 1.8 근처에서 10 이상으로 맞춘 후 30분간 강하게 교반하여 검은색의 산화철 입자를 합성하였다. 이 합성물을 희토류 자석(Daehan-magnet Co.)을 이용하여 자기장에 노출시켜서 대부분의 검은 입자들을 자석 쪽으로 모은 후 상층의 수용액을 제거하였다. 증류수 30 ml을 첨가한 후 약하게 교반하여 가라앉은 검은 입자들을 분산시킨 후 다시 자기장에 노출시켜서 상층의 수용액을 제거하였다. THF가 제거된 수용성의 폴리에틸렌글리콜-실리콘(PEG-Silicone) 공중합체 250 mg이 용해되어 있는 증류수 30 ml을 첨가한 후 30분간 교반하면서 자성 입자를 고분자로 코팅하였다. 고분자 코팅된 검은 입자의 합성물을 15분간 고주파 처리하였다. 이 수용액을 약 12시간 동안 자기장에 노출시켜서 가라앉은 극소량의 입자들은 제거한 후, 검은색의 상층액을 수득하였다. 이 수용액을 80℃에서 30분간 가열하여서 고분자가 더 단단히 결합될 수 있도록 하였다. 이 용액을 6,000 rpm에서 10분간 원심분리하고, 이어 10,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 용액에 존재할 수 있는 미소의 응집체를 제거하였다. 최종적으로 얻은 상등액을 분리하여 SW(stepwise)-SPION을 얻었다.

실시예 3: 동시적 (In situ) 방법으로 코팅된 자성나노입자 (IS- SPION )

증류수 30 ml에 FeCl₃ㆍ6H₂O0.5 g, FeCl₂ㆍ4H₂O0.184 g 및 THF가 제거된 수용성의 폴리에틸렌글리콜-실리콘(PEG-Silicone) 공중합체 250 mg을 첨가하고, 교반하여 혼합하였다. NH₄OH (암모늄 수용액) 7.5 ml을 첨가하여 용액의 pH를 약 1.8 근처에서 10 이상으로 맞춘 후, 30분간 강하게 교반하여 검은색의 고분자 코팅된 산화철 입자를 합성하였다. 이 합성물을 희토류 자석을 이용하여 자기장에 노출시켜서 대부분의 검은 입자들을 자석쪽으로 모은 후 상층의 고분자 수용액을 제거하였다. 30 ml의 증류수를 첨가한 후 약하게 교반하여 가라앉은 검은 입자들을 분산시킨 후 다시 자기장에 노출시켜서 앞에서와 같은 고분자 수용액 제거 과정을 여러번 거친 후, 30 ml의 증류수가 첨가된 검은 입자의 합성물을 15분간 고주파 처리하였다. 다음 과정은 상술한 SW-SPION의 합성 방법과 같다. 최종적으로, IS-SPION을 얻었다.

실험예 1: IS- SPION 및 SW- SPION 의 표면을 코팅하고 있는 수용성의 폴리에틸렌글리콜 -실리콘(PEG-Silicone) 공중합체의 합성 확인

본 발명의 IS-SPION 및 SW-SPION을 코팅하고 있는 수용성의 폴리에틸렌글리콜-실리콘(PEG-Silicone) 공중합체가 도 1과 같은 구조로 합성되었음을 확인하기 위해 poly(TMSMA-r-PEGMA)@SPION에 대한 FT-IR 스펙트럼을 분석하였다(SPECTRUM 2000, PERKIN ELMER). 도 2에서 볼 수 있듯이, 1720, 1105 및 627 cm^-1 근처에서, 각각 C=O, C-O 및 Si-O의 스트레칭 밴드에 해당되는poly(TMSMA-r-PEGMA)의 특징적인 피크들을 확인할 수 있다. 따라서 IS-SPION 및 SW-SPION의 표면에 코팅되어 있는 고분자는 그의 특징적 구조를 가지고 있음을 알 수 있다.

실험예 2: IS- SPION 및 SW- SPION 의 코어가 되는 초상자성 산화철 나노입자 (superparamagnetic iron oxide nanoparticle : SPION ) 분석

본 발명의 IS-SPION 및 SW-SPION의 코어가 되는 초상자성 산화철 나노 입자 (superparamagnetic iron oxide nanoparticle: SPION)가 잘 합성되었음을 확인하기 위해 X-선 회절분석장치(X-ray diffraction: XRD, Ultma 3, Rigaku)로 이를 확인하였다(도 3). 도 3에서 왼쪽 그래프는 IS-SPION의 XRD이고, 오른쪽 그래프는 SW-SPION의 XRD이다. 도 3에서 확인할 수 있듯이, IS-SPION 및 SW-SPION 모두 산화철(Fe₃O₄)이 나타내는 특징적인 피크(48)를 확인할 수 있어, 산화철 코어가 잘 합성되었음을 알 수 있다.

또한, 산화철 나노 입자가 초상자성을 가짐을 확인하기 위해, 스퀴트(SQUID) 기법으로 절대 온도 300 K에서 자성을 측정하였다(도 4). 포화 자성(saturation magnetization: Ms)은 Quantum Design의 MPMS(Magnetic Property Measurement System)으로 측정하였다.

도 4에서 볼 수 있듯이, IS-SPION 및 SW-SPION 모두 초상자성을 보이는 그래프를 나타내었고, IS-SPION 및 SW-SPION의 포화 자성은 각각 65 emu/g Fe 및 80 emu/g Fe의 높은 값을 나타내어, 종전의 고분자로 코팅된 SPION이 30-50 emu/g Fe(48)의 포화 자성을 가지는 것에 비해 큰 값을 가짐을 알 수 있었다.

한편, SW-SPION의 경우 이미 제조된 산화철 코어에 고분자 층이 형성되기 때문에, 코팅 과정에서 자성이 변화되지 않는다. 반면에, IS-SPION의 경우 산화철 나노입자가 형성되는 과정에서 고분자의 간섭(interference)이 있기 때문에, IS-SPION의 자성은 SW-SPION 보다 작다.

상기 포화 자성 값을 보면, SW-SPION의 경우 종래의 값 보다 매우 큰 값을 나타내는 데, 이는 단계적 코팅 방법(SW)이 코어의 자성의 측면에서 동시 코팅 방법(IS) 보다 매우 유리하다는 것을 보여준다.

실험예 3: IS- SPION 및 SW- SPION 의 인산완충식염수 (phosphate buffered saline, PBS pH7 .4) 내에서 안정성 측정 및 크기 측정 실험

본 발명의 IS-SPION 및 SW-SPION이 생리적인 조건 하에서의 안정성을 조사하기 위하여, 인산완충식염수(phosphate buffered saline: PBS pH 7.4) 5 ml에 IS-SPION 및 SW-SPION을 각각 0.2 ml씩 첨가하고, 잘 분산시켜 장기간 정치해 두었다. 도 5에 나타난 바와 같이, 이 용액은 한달 여 동안 침전물 없이 안정한 상태로 유지됨을 확인할 수 있다. 이러한 안정성은 pH 1-10의 범위에서도 나타났다(도 12). 반면에, 네이키드 SPION은 정치 1시간 이내에 침전물을 형성시켰다. 이러한 실험 결과는, 본 발명의 공중합체 코팅 시스템이 SPION의 표면 전하를 패시베이션(passivation)할 수 있을 뿐만 아니라 수용액에서 현탁될 수 있는 자성 나노입자를 제공할 수 있다는 것을 보여 준다.

또한, 생리적 조건 하에서 본 발명의 SPION의 안정성을 추가적으로 확인하기 위하여, 인 비보 혈장 환경과 유사한 10% FBS(fetal bovine serum)을 포함하는 세포 배지에서 SPION의 크기 변화를 관찰하였다(도 11). 그 결과, 10% FBS를 포함 하는 RPMI 배지에서 24시간을 정치한 경우에도 5 nm 이하의 크기 변화를 나타내었다. 또한, 증류수 및 PBS 완충액에서 오래 동안 정치하여도 크기 변화가 매우 작았다.

상술한 본 발명의 SPION의 안정성은 코팅층을 형성하는 poly(TMSMA-r-PEGMA)가 비특이적인 단백질 또는 염의 흡착을 막아 응집체가 형성되는 것을 억제하기 때문이며, 또한, 친수성의 PEG 층이 나노입자의 표면에 노출되어 우수한 수 분산성(water dispersibility)를 발휘하기 때문이다.

ELS 8000(Otsuka Electronics Korea)을 이용하여 다이나믹 광 스캐터링(DLS) 측정을 실시하여, 본 발명의 IS-SPION 및 SW-SPION의 수유동성(hydrodynamic) 크기를 측정하였다. 도 10에서 볼 수 있듯이, IS-SPION 및 SW-SPION은 각각 16.0± 2.2 nm 및 12.3± 1.2 nm의 평균 입자 크기를 나타내었고, 좁은 크기 분포도를 나타내었다. 이러한 입자 크기는 CLION 및 MION와 같은 종래의 덱스트란-코팅 SPIONs(45, 46) 보다 훨씬 작은 값이다.

DLS 측정은 전체 클러스터(즉, 자성 코어와 코팅 폴리머)의 수유동성 입자 크기에 대한 정보를 제공하는 것이기 때문에, TEM 이미지를 통하여 산화철 코어만의 크기를 측정하였다. 본 발명의 IS-SPION 및 SW-SPION의 산화철 나노 입자의 크기를 투사전자현미경(TEM, Philips TECNAI F20)을 이용하여 측정하였다. 현미경 관찰을 위해서, 증류수로 희석한 IS-SPION 및 SW-SPION을 탄소로 코팅된 구리 격자(carbon-coated copper grid) 위에 한 방울 떨어뜨리고 24시간 동안 건조시켰다. 도 6에 나타난 바와 같이, IS-SPION 및 SW-SPION의 산화철 나노 입자는 약 4-8 nm 정도의 크기를 가짐을 확인하였다.

실험예 4: 대식세포에 의한 IS- SPION 및 SW- SPION 의 인 비트로 섭취 정도의 측정

본 발명의 IS-SPION 및 SW-SPION이 암 조영제로서의 용도로서의 유용성을 갖기 위해서는, 대식세포와 같은 RES(reticular endothelial system) 세포에 의해 SPION이 낮은 섭취 정도를 가져 EPR(enhanced permeability and retention) 효과에 의해 종양 내로 축적될 수 있을 정도로 장기간 순화될 수 있어야 한다.

IS-SPION 및 SW-SPION의 인 비트로 대식세포(macrophage) 섭취 정도를 조사하였다. 젤라틴 코팅된 커버슬립들을 DMEM을 포함하는 35 II 디쉬에 놓았다. RAW 264.7 대식세포를 각각의 커버슬립에 10⁵세포/커버슬립으로 씨딩하였다. 20시간 동안 배양한 다음, 각각의 커버슬립에 0.6 mg 철/coverslip의 농도로 IS-SPION, SW-SPION 또는 Feridex I.V.™(Advanced Magnetics Inc.)를 첨가하였다. Feridex I.V.는 MRI 조영제로 현재 임상적으로 이용되고 있는 것이며, 그의 크기(>100 nm) 때문에 대식세포에 의해 섭취되는 것으로 알려져 있다. 다시 2시간 동안 배양한 후, 각각의 coverslip 위의 세포들을 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde: PFA)로 고정하였고, 프루시안 블루 염색법(prussian blue staining)을 이용해서 세포 안으로 섭취된 철을 파란색으로 염색하였다. 조영제를 처리하지 않은 대식세포와 현재 시판되는 조영제인 Feridex를 처리한 대식세포를 대조군으로 하여 비교하였다.

도 7에서 볼 수 있듯이, 조영제를 처리하지 않은 대식세포의 경우, 프루시안 블루 염색을 한 후에도 파란색으로 염색된 세포가 존재하지 않았다(패널 a). 반면 Feridex를 처리한 대식세포의 경우, Feridex가 높은 정도로 섭취되어 대부분의 세포에서 진한 블루 염색이 관찰되었다(패널 b). 한편, IS-SPION(패널 c) 및 SW-SPION(패널 d)의 경우에는, Feridex의 경우 보다 훨씬 연하게 파란색으로 염색된 세포들이 관찰되었는 데, 이는 IS-SPION 및 SW-SPION의 낮은 섭취 정도를 나타내는 것이다.

상기 실험 결과들은 본 발명의 poly(TMSMA-r-PEGMA)에 의한 항-바이오파울링 코팅은 대식세포에 의한 나노자성체의 인식 및 식세포작용을 크게 감소시킨다는 것을 보여 준다.

실험예 5: IS- SPION 및 SW- SPION 을 이용한 생체내 종양 조직에서 MRI 조영능 실험

IS-SPION 및 SW-SPION을 MRI 조영제로 사용하였을 때, 종양 조직을 조영할 수 있음을 확인하기 위하여, 다음의 실험을 수행하였다. 루이스 폐암 세포(Lewis lung carcinoma cell line, ATCC)를 등에 이식시킨 C57BL/6 웅성 마우스를 테스트 동물로 사용하였다. 마우스를 일반적인 흡식 마취 방법(O₂/N₂의 1:2 혼합물 내의 1.5% 이소플루란)으로 마취시켜 MR 조영에 이용하였다. PBS 내의 IS-SPION 및 SW-SPION(각각, 15 mg/kg 및 13 mg/kg)을 마우스 꼬리의 정맥 혈관으로 직접 주사하였다. MR 촬영은 동물 코일(4.3 cm Quadrature Volume Coil, Nova Medical System)을 이용하여 1.5 T imager(GE Signa Exite Twin-speed, GE Health Care)로 실시하였다. 마우스의 MR 촬영을 위하여, T2-웨이티드 패스트-스핀 에코(4,200/102의 반복 시간 ms/echo time ms, 플립각 90°, 10의 에코 트레인 길이, 5 cm 뷰 필드, 2 mm 단면 두께, 0.2-mm 단면간 갭, 256160 매트릭스) 및 T1-웨이티드 스포일드 그래디언트 에코(185/minimum, 60° 플립각, 2 mm 단면 두께, 0.2-mm 단면간 갭, 256160 매트릭스) 시퀀스를 수행하였다.

모든 MR 촬영에 대한 정량적 분석은 한 사람의 방사선전문의사가 수행하였다. 시그널 강도(SI)는, 종양 중앙의 비교 위치들에 있는 목적의 특정 부위(ROI)에 대하여 측정 되었다. 또한, 종양에 인접한 후방 근육의 ROI 내의 SI를 측정하였다. ROI의 크기는 종양의 최대 지름의 2/3로 선택되었다. 상대적 시그널 강화는 조영제의 주입 전(SI pre) 및 주입 후(SI post)에서 SI 측정값으로부터 다음 수학식으로 계산하였다: [(SI post - SI pre)/SI pre] x 100, SI pre는 강화 전 스캔(대조군)에서 리젼 시그널 세기, SI post는 1 hr, 2.5 hr 및 4 hr 강화 후 스캔에서 리젼 시그널 세기.

SPION을 주입하기 전에, 종양은 T2-웨이티드 MR 이미지에서 높은 강도 부위(hyperintensive area)로 나타났다(도 8에서 화살표 표시). T2-웨이티드 이미지에서 상대적 시그널 세기(SI)를 상술한 바와 같이 계산하였다. SPION을 주입하고 1시간이 경과한 경우, 종양 부위에서 T2-웨이티드 MR 이미지에서 어두운 부위가 나타났으며, IS-SPION에 대해서는 37%, SW-SPION에 대해서는 42%의 T2 시그널 감소를 보였고, 이러한 결과는 종양 내에 본 발명의 IS-SPION 및 SW-SPION이 검출 가능한 양이 축적되었음을 보여주는 것이다. SPION을 주입하고 4시간이 경과한 경우, SW-SPION에 대해서는 대조군과 비교하여 32%의 T2 시그널 감소(시그널 세기 32%)를 나타내었고, 반면에 IS-SPION은 단지 19%의 시그널 감소를 나타내었는 바, 이러한 결과는 IS-SPION이 SW-SPION 보다 훨씬 빠르게 종양으로부터 제거됨을 가리킨다. IS-SPION에 비하여 SW-SPION이 종양 내에서 더 많이 축적되는 이유는, 그의 작은 크기 때문에 종양 내로 더 잘 침투할 수 있기 때문인 것으로 판단된다.

IS-SPION 및 SW-SPION은 주입 후 11시간이 경과하였을 때, 완전하게 종양 위치로부터 제거되었다. 추가적으로, 본 발명자들은 SPION 주입 후 1시간째에 신장에서 나노자성입자가 축적되는 것을 관찰하였다. 이 나노입자는 1일 내에 신장으로부터 제거되었다(49-51). 이러한 특성은 안전하고 효과적인 MR 조영제의 개발에 매우 유리한 데, 그 이유는 배출되기 전에 수시간 내에 효과적으로 암을 진단하면서도 독성의 산화철이 하루 만에 신체 외로 배출되기 때문이다.

종양 부위에 본 발명의 SPION이 존재하는 것을 추가적으로 증명하기 위하여, 프루시안 블루 염색(52-55)를 실시하였다. 도 9에서 볼 수 있듯이, 종양 조직의 어떤 부분이 청색으로 염색되었고, 이는 종양 부위에 산화철이 존재 또는 축적되었음을 가리키는 것이다. 상술한 인 비보 MRI 촬영 결과와 일치되게, IS-SPION 보다 SW-SPION에서 산화철의 더욱 더 많은 양이 관찰되었다.

상기의 인 비보 MRI 및 조직 염색 결과는, 본 발명의 IS-SPION 및 SW-SPION은 EPR 효과를 통하여 종양 조직으로 성공적으로 타겟팅 될 수 있으며, 이는 결국 암의 효율적인 진단을 가능하게 한다는 것을 보여 준다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

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Claims

나노입자를 포함하는 조영제로서, 상기 나노입자는 다음을 포함하는 것을 특징으로 하는 조영제:

(a) 신호 발생 코어(signal generating core); 및

(b) 실리콘 원소 사이의 결합을 통하여 가교결합된 실리콘이 포함된 수용성 고분자를 포함하며, 상기 신호 발생 코어의 표면에 코팅되어 있고, 나노입자의 항-바이오파울링(anti-biofouling) 특성 및 수 분산성(water dispersibility)을 증가시키며, 나노입자의 조영 능력을 증가시키는 작용을 하는 수용성 외부 쉘(water soluble outer shell).
제 1 항에 있어서, 상기 신호 발생 코어는 상자성(paramagnetic), 초상자성(superparamagnetic) 또는 양성자 밀도(proton density) 신호 발생 코어인 것을 특징으로 하는 조영제.
제 2 항에 있어서, 상기 신호 발생 코어는 산화철을 포함하는 초상자성 신호 발생 코어인 것을 특징으로 하는 조영제.
제 1 항에 있어서, 상기 실리콘이 포함된 수용성 고분자는 폴리아크릴산(poly(acrylic acid)) 또는 그 유도체, 폴리메타아크릴산(poly(meta)acrylic acid)) 또는 그 유도체, 폴리아크릴아미드(poly(acrylic amide)) 또는 그 유도체, 폴리언데세노산(poly(undecenoic acid)) 또는 그 유도체, 또는 이들의 공중합체를 주골격으로 가지는 것을 특징으로 하는 조영제.
제 1 항에 있어서, 상기 실리콘이 포함된 수용성 고분자는 실리콘 원소를 통하여 신호 발생 코어에 공유결합된 것을 특징으로 하는 조영제.
삭제
제 1 항에 있어서, 상기 실리콘이 포함된 수용성 고분자는 폴리에틸렌글리콜, 덱스트란, 폴리비닐피롤리돈, 폴리프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜과 폴리프로필렌글리콜의 공중합체, 또는 이들의 모노에스테르화 유도체를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 조영제.
제 1 항에 있어서, 상기 실리콘이 포함된 수용성 고분자는 다음 화학구조식 1로 표시되는 것을 특징으로 하는 조영제:

화학식 1

상기 화학식에서, R₁, R₂ 및 R₃는 서로 독립적으로, H 또는 C₁-C₅ 알킬기이고, X는 산소, 황 또는 질소 원자이며, Y는 폴리에틸렌글리콜, 덱스트란 또는 폴리비닐피롤리돈이고, m 및 n은 1-10,000의 정수이며, 그리고 p는 1-20의 정수이다.
제 8 항에 있어서, 상기 화학구조식 1의 고분자 내에 있는 실리콘은 신호 발생 코어와 공유결합 되어 있거나 또는 다른 실리콘 원소와 가교결합 되어 있는 것을 특징으로 하는 조영제.
제 1 항에 있어서, 상기 조영제는 자기공명영상(magnetic resonance imaging)에 이용되는 것을 특징으로 하는 조영제.
제 1 항에 있어서, 상기 조영제는 인 비보 암 자기공명영상화에 이용되는 것을 특징으로 하는 조영제.
삭제
제 1 항에 있어서, 상기 고분자가 코팅된 나노입자들의 평균 직경은 5-50 nm인 것을 특징으로 하는 조영제.
제 1 항에 있어서, 상기 나노입자의 포화자성은 20-100 emu/g Fe인 것을 특징으로 하는 조영제.
제 1 항에 있어서, 상기 나노입자는 상기 신호 발생 코어를 형성한 후에 상기 코어의 표면에 실리콘이 포함된 수용성 고분자를 코팅하여 제조된 것을 특징으로 하는 조영제.
다음의 단계를 포함하는 상기 제 1 항 내지 제 5 항, 제 7 항 내지 제 11 항 및 제 13 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항의 조영제의 제조방법:

(a) Fe³⁺ 및 Fe²⁺의 염을 이용하여 산화철 코어로 이루어진 신호 발생 코어를 형성시키는 단계;

(b) 신호 발생 코어와 실리콘이 포함된 수용성 고분자를 혼합 및 교반시켜 상기 수용성 고분자를 신호 발생 코어에 코팅시키는 단계; 및

(c) 상기 (b)의 결과물에 열을 가하여 상기 수용성 고분자 내의 실리콘이 가교결합 되도록 하는 단계.