ES2131067T5

ES2131067T5 - Composicion que contiene particulas ultrafinas de oxido metalico magnetico.

Info

Publication number: ES2131067T5
Application number: ES92903328T
Authority: ES
Inventors: Kyoji Kito; Hideo Nagae; Masakatsu Hasegawa; Yoshio Ito; Akihiro Mizutani; Kimio Hirose; Masahiro Ohgai; Yasuji Yamashita; Nahoko Tozawa; Keiko Yamada; Shusaburo Hokukoku
Original assignee: Meito Sangyo KK
Current assignee: Meito Sangyo KK
Priority date: 1991-01-19
Filing date: 1992-01-17
Publication date: 2004-10-16
Anticipated expiration: 2012-01-17
Also published as: NO305636B1; US5328681A; CA2078679C; WO1992012735A1; DE69229150T2; CA2078679A1; DE10199065I2; DE69229150T3; NO923584D0; EP0525199A4; EP0525199B1; NO2002003I2; JP2921984B2; AU1168992A; DE69229150D1; ES2131067T3; EP0525199A1; DK0525199T3; NO923584L; LU91003I2

Abstract

SE PRESENTA UNA COMPOSICION QUE CONTIENE PARTICULAS ULTRAFINAS DE UN OXIDO DE METAL MAGNETICO QUE SE CARACTERIZA POR COMPRENDER UNA SUSPENSION COLOIDAL DE UN COMPUESTO QUE CONSTA DE LAS PARTICULAS ULTRAFINAS Y DE UN POLISACARIDO, SUS DERIVADOS Y / O UNA PROTEINA, Y UN ACIDO MONOCARBOXILICO ORGANICO. ESTE COMPUESTO ES UTIL EN LOS CAMPOS DE LA MEDICINA, LOS PRODUCTOS QUIMICOS PARA DIAGNOSIS Y ACTIVIDADES RELATIVAS, A CAUSA DE QUE ESTA LIBRE DE EFECTOS COLATERALES TALES COMO LA AGLUTINACION DE PLAQUETAS, ES EXCELENTE EN SEGURIDAD PARA LOS ORGANISMOS VIVOS Y NO PRESENTA EFECTOS ADVERSOS EN ORGANISMOS VIVOS INCLUSO CUANDO SE ADMINISTRA EN LOS VASOS SANGUINEOS.

Description

Composición que contiene partículas ultrafinas de oxido metálico magnético.

Campo técnico

Esta invención se refiere a una composición que contiene partículas ultrafinas de un óxido metálico magnético, que es útil en los campos de las medicinas y de los fármacos para diagnóstico, especialmente como agente de contraste para MRI.

Técnica de base

Una composición que comprende partículas ultrafinas de óxido metálico magnético, por ejemplo el llamado fluido magnético, tiene diversos usos y cabe mencionar, como uno de los campos para las mismas, el uso como base de fármacos para diagnóstico.

Sin embargo, es necesaria la formulación en la que entren en consideración varios puntos, para administrar con seguridad a organismos vivos partículas finas de óxidos metálicos que tienen un tamaño mucho mayor que el de los niveles moleculares, y ejercer su actividad eficazmente. Los preparados conocidos hasta ahora tienen varios inconvenientes, observándose en particular problemas en el tema de la biocompatibilidad, y se han hecho varias propuestas para su mejora. Por ejemplo, el documento japonés Tokuhyosho 500196/1989 (PCT/W088/00060) describe un fluido superparamagnético recubierto con dextrano dispersado en un tampón de ácido policarboxílico. Para el uso de estos preparados de fluido magnético en el campo médico, aún han de mejorarse algunos aspectos, incluyendo el de la toxicidad.

En la aplicación de fluidos magnéticos a los fármacos para medicinas y para diagnóstico, en particular como resultado de investigaciones en cuanto a su toxicidad, los presentes inventores han encontrado que el fluido magnético, como sustancia extraña contra los organismos vivos, tiene una mala influencia sobre dichos organismos vivos, por ejemplo, agrega las plaquetas, importante constituyente de la sangre, y esta es una causa de la toxicidad del fluido magnético.

Así, los presentes inventores realizaron estudios intensos intentando desarrollar un fluido magnético que esté libre de efectos secundarios tales como la agregación de las plaquetas, que sea excelente en cuanto a seguridad para los organismos vivos, y, cuando se administra intravascularmente, que no tenga una mala influencia sobre los organismos vivos. Como resultado de ello, los autores han encontrado que cuando un ácido orgánico monocarboxílico que tiene uno o más grupos hidroxilo y/o uno o más grupos amino, por ejemplo el ácido láctico, se incorpora en un sol acuoso de un complejo de partículas ultrafinas de óxido metálico magnético con un polisacárido, un derivado de polisacárido y/o una proteína, la propiedad del sol acuoso de agregar las plaquetas puede verse notablemente reducida sin cambios sustanciales en las propiedades intrínsecas del sol acuoso, tal como las propiedades magnéticas, las propiedades metabólicas y la especificidad del tejido, llevando a cabo esta invención.

Descripción de la invención

Así pues, esta invención proporciona una composición que contiene partículas ultrafinas de óxido metálico magnético, que comprende un sol acuoso de un complejo de partículas ultrafinas de óxido metálico magnético con un polisacárido, un derivado de polisacárido y/o una proteína, y un ácido orgánico monocarboxílico que tiene uno o más grupos hidroxilo y/o uno o más grupos amino.

La composición que contiene partículas ultrafinas de óxido metálico magnético proporcionada por esta invención tiene solamente una débil toxicidad, apenas muestra un efecto de reducción de la presión sanguínea, lo que difiere del caso de los fluidos magnéticos habituales, incluso cuando se administra directamente a los vasos sanguíneos de animales, y, además, solamente tiene una actividad agregante de plaquetas muy escasa y por tanto es excelente en cuanto a seguridad como fármaco y, por ejemplo, puede usarse como agente de contraste de MRI, agente hipertérmico o vehículo para suministro de fármacos.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 es una imagen de MR de una porción del hígado de una rata de raza Wistar en cuyo hígado se había implantado un tumor de Novikoff. En la Fig. 1, (A) y (B) son imágenes de MR antes de la administración del preparado de sol de complejo de esta invención, obtenido en el Ejemplo 10 que se describe más adelante, y (C) y (D) son imágenes de MR a los 60 minutos después de la administración del preparado. Aunque la porción del tumor no puede ser reconocida en absoluto en (A) ni en (B), la forma y el tamaño del tumor pueden reconocerse con claridad en (C) y en (D).

La Fig. 2 (A) y (B) son microfotografías de los pulmones de ratones de raza dd a los cuales se administró el preparado de sol acuoso de complejo obtenido en el Ejemplo Comparativo 1 y Ejemplo 2-3, respectivamente, que se describen más adelante. Aunque en la Fotografía (A) se observan en el pulmón émbolos acusados (Ejemplo Comparativo 1), no se observan émbolos en el pulmón en la Fotografía (B) (Ejemplo 2-3).

Descripción detallada de la invención

La composición de esta invención se describe con más detalle a continuación.

El complejo, como componente que forma parte de la composición de esta invención, de partículas ultrafinas de óxido metálico magnético con un polisacárido, un derivado de polisacárido (en adelante, el polisacárido y el derivado de polisacárido se expresan ambos abreviadamente como polisacáridos) y/o una proteína, es al menos en parte conocido y puede ser preparado, por ejemplo, por un método que comprende hacer reaccionar un sol acuoso previamente preparado de partículas ultrafinas de óxido metálico magnético, con polisacáridos y/o una proteína (en adelante denominado primer método), o por un método que comprende formar partículas ultrafinas de óxido metálico magnético en presencia de polisacáridos y/o de una proteína (en adelante denominado segundo método), o similar.

Como óxidos metálicos magnéticos que forman partículas ultrafinas de óxido metálico magnético pueden ponerse por ejemplo los representados por la fórmula siguiente

(I)(M^{II}O)_{I}\cdot M_{2}{}^{III}O_{3}

en la que M^{II} representa un átomo de metal divalente, M^{III} representa un átomo de metal trivalente y l es un número en el intervalo de 0 \leq l \leq 1.

En la fórmula (I), son ejemplos de átomo de metal divalente M^{II} el magnesio, calcio, manganeso, hierro, níquel, cobalto, cobre, zinc, estroncio, bario, etc., y pueden usarse solos o en combinación de dos o más de ellos. Además, son ejemplos de átomo de metal trivalente M^{lII} aluminio, hierro, itrio, neodimio, samario, europio, gadolinio, etc., y pueden usarse solos o en combinación de dos o más de ellos.

Se prefieren óxidos de metales magnéticos en los que M^{III} en la fórmula (I) es un hierro trivalente, a saber ferritas representadas por la fórmula siguiente

(II)(M^{II}O)_{m}\cdot Fe_{2}O_{3}

en la que M^{II} es como se definió anteriormente y m es un número en el intervalo de 0 \leq m \leq 1.

Como M^{II} cabe mencionar los mismos metales que se ejemplificaron en la fórmula (I) anterior. En particular, los óxidos metálicos magnéticos de fórmula (II) en la que M^{II} es hierro divalente, a saber óxidos de hierro magnéticos representados por la fórmula siguiente

(III)(FeO)_{n}\cdot Fe_{2}O_{3}

en la que n es un número en el intervalo de 0 \leq n \leq 1,

pueden ser también mencionados como otros óxidos metálicos magnéticos preferidos de esta invención. En la fórmula (III), el caso en que n=0 indica óxido de hierro \gamma (\gamma-Fe_{2}O_{3}) y el caso de n=1 indica magnetita (Fe_{3}O_{4}).

Preferidos entre ellos en esta invención son los óxidos de hierro magnéticos cuyo contenido en hierro divalente es 10 por ciento en peso o menos, en particular de 2 a 7 por ciento en peso.

Además, también es posible usar, como óxidos metálicos magnéticos de esta invención, óxidos metálicos magnéticos representados por las siguientes fórmulas

(IV)M^{II}M^{IV}O_{3}

y

(V)M^{IV}O_{2}

en las que M^{II} representa un átomo de metal divalente y M^{IV} representa un átomo de metal tetravalente.

Como átomos de metal divalente M^{II}, cabe poner por ejemplo los descritos anteriormente, y como átomos de metal tetravalente M^{IV}cabe mencionar, por ejemplo, el vanadio, cromo, manganeso, etc.

Ejemplos específicos de óxidos metálicos magnéticos representados por la fórmula (IV) o (V) son, por ejemplo, NiMnO_{3}, CoMnO_{3}, CrO_{2}, etc. Los óxidos metálicos magnéticos de esta invención incluyen también óxidos metálicos magnéticos que tienen agua de cristalización.

Además, como polisacáridos que son capaces de formar complejos con las anteriores partículas ultrafinas de óxido metálico magnético, se prefieren los que son solubles en agua, y son ejemplos de polisacáridos los polímeros de glucosa tales como dextrano, almidón, glicógeno, pululano, curdlano, esquizofilano y pestalotiano; polímeros de fructosa tales como inulina y levano; polímeros de manosa tales como manano; polímeros de galactosa tales como agarosa y galactano; polímeros de xilosa tales como xilano; polímeros de L-arabinosa tales como arabinano; etc., y son ejemplos de derivado de polisacárido los polisacáridos modificados obtenidos tratando térmicamente los anteriores polisacáridos con un álcali tal como hidróxido sódico (es decir, carboxi polisacárido); éteres carboxialquilo de los anteriores polisacáridos o celulosa; etc. Además, como proteínas pueden ponerse como ejemplo proteínas solubles en agua tales como, por ejemplo, albúmina y globulina.

Se prefieren en esta invención los polisacáridos y derivados de polisacáridos. Entre ellos, se prefiere como polisacárido el dextrano y se prefieren como derivado de polisacárido los derivados del dextrano, almidón y pululano modificados con un álcali (carboxi polisacáridos), y derivados carboxi eterificados con alquilo inferior de los mismos, especialmente carboximetildextrano. La viscosidad intrínseca de los polisacáridos puede estar en el intervalo de generalmente 0,02 a 0,5 dl/g, preferentemente aproximadamente 0,04 a 0,2 dl/g.

En el primer método para preparar el complejo de esta invención, se prepara primeramente un sol acuoso de partículas ultrafinas de óxido metálico magnético. Como método de preparación del sol acuoso puede ponerse como ejemplo un método de coprecipitación con álcali, un método con resina de intercambio fónico, o similar. El método de coprecipitación con álcali comprende, por ejemplo, mezclar una solución acuosa 0,1 a 2 M que contiene una sal metálica divalente, preferentemente una sal de hierro divalente, y una sal metálica trivalente, preferentemente una sal de hierro trivalente, en una relación en moles de 1:3 a 2:1, con una base tal como NaOH, KOH o NH_{4}OH de forma que el pH venga a estar en el intervalo de 7 a 12; si es necesario, calentar y madurar; después de separar y lavar con agua el precipitado de óxido metálico magnético, redispersar el óxido metálico magnético en agua; y añadir un ácido mineral tal como ácido clorhídrico hasta que el pH del líquido esté en el intervalo de 1 a 3, para obtener un sol acuoso de óxido metálico magnético. Por otra parte, el método del intercambio iónico comprende, por ejemplo, añadir una solución acuosa 0, 1 a 2 M que contiene una sal ferrosa y una sal férrica en una relación en moles de aproximadamente 1:2, a una suspensión de una resina de intercambio fónico fuertemente básica, bajo agitación, manteniendo el pH en el intervalo de 8 a 9; añadir un ácido mineral tal como ácido clorhídrico hasta que el pH del líquido esté en el intervalo de 1 a 3; y separar la resina mediante filtración para obtener un sol acuoso de óxido de hierro magnético.

Si es necesario, estos soles acuosos puede ser purificados y/o concentrados por diálisis, ultrafiltración, centrifugación, etc.

El sol acuoso de óxido metálico magnético así obtenido y una solución acuosa de polisacáridos y/o proteína se mezclaron en una proporción tal que la relación en peso de óxido metálico magnético a los polisacáridos y/o a la proteína queda en el intervalo de 1:1 a 1:6 en términos de metal o metales, y se lleva a cabo la reacción con calentamiento. La concentración de óxido metálico magnético en la solución de reacción no está particularmente limitada, pero normalmente puede estar en el intervalo de 0,1 a 10 p/v, preferentemente de 1 a 5 p/v como metal. La reacción puede llevarse a cabo generalmente a una temperatura en el intervalo entre la temperatura ambiente y 120ºC durante aproximadamente 10 minutos a 10 horas, pero normalmente es suficiente llevar a cabo el reflujo calentando durante aproximadamente una hora. Después puede llevarse a cabo la purificación, etc., por métodos ya conocidos. Por ejemplo, puede obtenerse un sol acuoso de complejo que tiene la pureza y la concentración deseadas repitiendo una operación para separar los polisacáridos y/o proteína no reaccionados y los compuestos de bajo peso molecular del complejo formado, mediante ultrafiltración; o puede obtenerse un sol acuoso de complejo añadiendo a la solución de reacción resultante un disolvente pobre para el complejo tal como metanol, etanol o acetona, para precipitar y depositar el complejo preferentemente, separar el depósito, redisolver el depósito en agua, dializar la solución resultante frente a agua en circulación y, si es necesario, concentrar la solución interna bajo presión reducida; o puede obtenerse un sol acuoso de complejo que tiene la pureza y la concentración deseadas haciendo pasar la solución de reacción resultante a través de una columna de filtración en gel y, si es necesario, concentrar la solución resultante bajo presión reducida. En esta ocasión, es también posible, si se desea, añadir etapas de ajuste del pH, centrifugación y/o filtración en el curso de las etapas anteriores y/o en la última de ellas.

El segundo método para la preparación del complejo de esta invención es un método para obtener el complejo en una etapa, que comprende mezclar y hacer reaccionar, en presencia de polisacáridos y/o de una proteína, una solución acuosa de sal metálica mixta que contiene una sal de metal divalente, preferentemente una sal de hierro divalente, y una sal de metal trivalente, preferentemente una sal de hierro trivalente, con una solución básica acuosa. Este segundo método puede clasificarse además, de acuerdo con el orden de adición, en (A) un método que comprende añadir la solución acuosa de sal metálica mixta a una solución acuosa de polisacáridos y/o de proteína, y después añadir la solución acuosa básica para llevar a cabo la reacción; (B) un método que comprende añadir la solución acuosa básica a la solución acuosa de polisacáridos y/o de proteína y después añadir la solución acuosa de sal metálica mixta, para llevar a cabo la reacción; (C) un método que comprende añadir a la solución acuosa básica una solución mixta de la solución acuosa de polisacáridos y/o de proteína con la solución acuosa de sal metálica mixta; (D) un método que comprende añadir a la solución acuosa de sal mixta mixta una solución mixta de la solución acuosa de polisacáridos y/o de proteína con la solución acuosa básica; etc.

Estos métodos (A), (B), (C) y (D) difieren entre sí solamente en el orden de adición, y otras condiciones de reacción no son esencialmente diferentes de las otras.

La preparación de la solución acuosa de sal metálica mixta anterior puede llevarse a cabo disolviendo en un medio acuoso una sal de metal divalente, preferentemente una sal de hierro divalente, y una sal de metal trivalente, preferentemente una sal de hierro trivalente, en una relación en moles de 1:4 a 3:1, preferentemente de 1:3 a 1:1. La concentración de esta solución acuosa de sal metálica puede variarse en un amplio margen, pero adecuadamente está en el intervalo de normalmente 0,1 a 3 M, preferentemente 0,5 a 2 M.

Como sales metálicas, cabe mencionar por ejemplo las sales con ácidos minerales tales como ácido clorhídrico, ácido sulfúrico y ácido nítrico, y como bases pueden usarse, por ejemplo, al menos una base elegida entre hidróxidos de metal alcalino tales como NaOH y KOH; aminas tales como amoníaco, trietilamina y trimetilamina; y similares. La concentración de la solución acuosa de base puede variarse también en un amplio margen, pero es adecuada en el margen de normalmente 0,1 a 10 N, preferentemente 1 a 5 N. La cantidad de base usada puede ser una cantidad tal que el pH de la solución de reacción después de terminar la adición quede en el intervalo de alrededor de la neutralidad a aproximadamente 12, o sea una cantidad tal que la relación de sal metálica a base se haga de 1:1 a 1:1,5 (relación normal).

Además, la cantidad de polisacáridos y/o proteína que se usa puede ser de 1 a 15 veces, preferentemente de 3 a 10 veces, el peso del metal o metales en la sal metálica. Además, la concentración de la solución acuosa de polisacáridos y/o proteína no está limitada de un modo estricto, pero es adecuada en un intervalo normal de 1 a 40% p/v, preferentemente aproximadamente 5 a 30% p/v. La adición de cada solución acuosa y el mezclado pueden llevarse a cabo agitando a temperatura ambiente a aproximadamente 100ºC con calentamiento, y, después de ajustar el pH si es necesario mediante la adición de una base o un ácido, la reacción se lleva a cabo a una temperatura de 120ºC durante un tiempo de 10 minutos a 5 horas, normalmente calentando a reflujo la mezcla durante aproximadamente 1 hora. La solución de reacción resultante puede ser purificada de la misma manera que en el primer método anterior y, si se desea, puede ser sometida a ajuste del pH, concentración y posterior filtración.

Como complejos en esta invención pueden usarse igualmente, además de los preparados como se indicó antes, por ejemplo, un complejo de dextrano o dextrano modificado obtenido mediante tratamiento térmico de dextrano con hidróxido sódico (a saber, carboxidextrano, que en adelante se denominará abreviadamente CDX) con un óxido de hierro magnético que tiene un tamaño de partículas de 3 a 20 nm, descrito en la publicación de Patente Japonesa nº 13521/1984 (Patente de EE.UU. nº 4.101.435); microesferas de hierro magnético-dextrano de estructura compleja molecular que comprenden partículas de óxido de hierro magnético que tienen un diámetro coloidal, recubiertas con moléculas de dextrano, descritas en la Patente de EE.UU. nº 4.452.773; microesferas complejas que comprenden partículas de óxido de hierro magnético que tienen un diámetro coloidal, recubiertas con moléculas de dextrano o con moléculas de proteína, descritas en el documento japonés Tokuhyo-sho 500196/1989 (PCT/W088/00060) ; polisacáridos carboxialquilados y óxidos metálicos magnéticos que tienen un tamaño de partículas de 2 a 30 nm, descritos en la Solicitud de Patente Japonesa nº 271784/1989 (PCT/JP90/01346); etc.

Además, en esta invención, cuando el óxido metálico magnético en el complejo obtenido como se indicó anteriormente es un óxido de hierro magnético, se prefiere además que sea un óxido de hierro magnético oxidado, de solamente un escaso contenido de hierro divalente, preferentemente cuyo contenido de hierro divalente sea 10 por ciento en peso del hierro total, o menos, en términos de hierro metal, y se prefieren los polisacáridos, en particular dextrano y/o carboxidextrano, como estabilizantes del complejo de las partículas de óxido de hierro magnético. Tal complejo de polisacáridos con óxido de hierro magnético (en adelante denominado abreviadamente como óxido complejo) puede ser preparado haciendo actuar un agente oxidante adecuado sobre un sol acuoso de un complejo preparado por el primer o segundo método, preferentemente por el segundo método. El agente oxidante usado para ello es preferentemente un agente oxidante que oxida al óxido de hierro magnético para reducir el contenido de hierro divalente pero sustancialmente no oxida ni descompone los polisacáridos, y, por ejemplo, puede ser ejemplificado por peróxidos tales como peróxido de hidrógeno, gases oxidantes tales como gas oxígeno, y un gas mixto de gas oxígeno y un gas inerte.

Primeramente, en la oxidación con peróxido, el peróxido de hidrógeno, ozono, etc., puede ejemplificarse como peróxidos usados, pero se prefiere el peróxido de hidrógeno. Aunque la concentración del sol acuoso de complejo materia prima en la reacción de oxidación no está particularmente limitada, puede estar generalmente en el intervalo de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 4 M, preferentemente de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 2 M como hierro. El peróxido se añade a este sol acuoso en una cantidad de aproximadamente 0, 5 a aproximadamente 10 veces, preferentemente aproximadamente 1 a aproximadamente 5 veces la de este último, en una relación en moles a hierro divalente. La reacción se lleva a cabo, preferentemente con agitación, a una temperatura de aproximadamente 0 a aproximadamente 80ºC, preferentemente de aproximadamente 15 a aproximadamente 40ºC, durante aproximadamente 10 minutos a aproximadamente 24 horas, preferentemente de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 horas. Si se desea, después de la adición de un agente de descomposición de peróxido tal como sulfito sódico, la purificación, etc., se llevan a cabo de la misma forma que en el caso del complejo anterior para obtener un sol acuoso de complejo de óxido de hierro de esta invención que tiene la pureza, la concentración y el pH deseados. En esta ocasión, dado que el contenido de polisacáridos del complejo se hace demasiado pequeño, especialmente cuando la purificación se lleva a cabo por un método de ultrafiltración, para aumentar la estabilidad se prefiere añadir los polisacáridos hasta la concentración deseada. El diámetro de partículas del complejo de óxido de hierro completo obtenido es algo más pequeño que el del complejo materia prima, y generalmente aproximadamente el 70% del mismo, el diámetro de partículas del óxido de hierro magnético en el óxido complejo es casi el mismo que el del complejo materia prima, y la magnetización del complejo oxidado resultante en 1 tesla es generalmente el 80% del mismo, en comparación con la del complejo materia prima.

Por otra parte, en el caso de la oxidación con gas oxidarte, como gas oxidante utilizable puede ponerse por ejemplo el gas oxígeno o un gas mixto de un gas inerte, tal como gas nitrógeno, gas argón o gas helio, con gas oxígeno, pero el gas oxígeno es particularmente preferido. En la reacción de oxidación con gas oxidante, la concentración del sol acuoso de complejo no está particularmente limitada, y puede estar en el intervalo de 0,1 o 4 M, preferentemente de 0,5 a 2 M, como anteriormente. La reacción puede llevarse a cabo en una atmósfera de gas oxidante, si se desea bajo presión creciente, con calentamiento a una temperatura entre la temperatura ambiente y aproximadamente 120ºC, preferentemente de 60ºC a 100ºC, con un ajuste tal que el pH quede entre 3 y 8, preferentemente entre 4 y 6, durante un tiempo entre 0,5 horas y 3 días, preferentemente entre 2 y 16 horas. Después, si es necesario, se llevan a cabo la purificación, etc., de la misma forma que antes, para obtener un sol acuoso de óxido de complejo para ser usado en esta invención, que tiene la pureza, la concentración y el pH deseados. En esta ocasión, dado que el contenido de polisacáridos del complejo se hace demasiado pequeño, especialmente cuando la purificación se lleva a cabo por un método de ultrafiltración, se prefiere igualmente añadir los polisacáridos hasta que se alcanza la concentración deseada. Se prefiere el gas oxidante, en particular gas oxígeno, por la razón de que las reacciones secundarias tienen lugar solamente en menor cuantía en comparación con el caso en el que se usa peróxido. Las propiedades del óxido complejo resultante muestran la misma tendencia al cambio que en el caso en que se usa peróxido.

En esta invención, en complejos obtenidos por cualquiera de los métodos, la relación de los polisacáridos y/o proteína a las partículas ultrafinas de óxido metálico magnético depende del diámetro de las partículas ultrafinas del óxido metálico magnético y/o el peso molecular de la proteína, etc., y puede variar en un amplio margen, pero generalmente es adecuado que el complejo contenga los polisacáridos y/o la proteína en el intervalo de 0,1 a 5 partes en peso, preferentemente 0,3 a 2 partes en peso de metal o metales en el óxido metálico magnético.

El contenido de metal del complejo en esta invención (todos los metales que derivan del óxido metálico magnético están contenidos en este metal) es un valor medido de acuerdo con un método general de análisis, el método descrito en el elemento 17 de espectrofotometría de absorción atómica en la Farmacopea Japonesa (11ª revisión, 1986). A saber, el contenido de metal se determina añadiendo ácido clorhídrico concentrado a un sol acuoso o polvo del complejo, después de cambiar completamente el óxidos o los óxidos metálicos por cloruro o cloruros metálicos, diluyendo adecuada-mente la mezcla y comparando la dilución con una solución patrón de cada metal.

Además, el contenido de polisacáridos del complejo es un valor que se mide por el método del ácido sulfúrico-antrona de acuerdo con Analytical Chem., 25, 1656 (1953). A saber, una dilución obtenida diluyendo adecuadamente la solución descompuesta con ácido clorhídrico usada en la medida del contenido de metal anterior, se añade a reactivo de ácido sulfúrico-antrona para desarrollar color, y después se mide la absorbancia. Al mismo tiempo, el mismo desarrollo de color y medida de la absorbancia de antes se hacen usando como sustancia patrón los polisacáridos usados en la preparación del complejo, y se determina el contenido de polisacáridos basándose en la relación de ambas absorbancias. Por otra parte, el contenido de proteína del complejo es un valor que se mide de acuerdo con método general de análisis, el método descrito en el elemento 26 método de determinación de nitrógeno en la Farmacopea Japonesa (11ª revisión, 1986). A saber, se determina el contenido de nitrógeno en el complejo y en la proteína usada en la preparación del mismo, y el contenido de proteína se determina a partir de la relación de ambos.

Además, en esta invención, se prefiere usar un complejo que comprende óxido de hierro magnético y en este caso se prefiere en particular un complejo oxidado que comprende polisacáridos y óxido de hierro magnético, y se prefiere particularmente que su contenido de hierro divalente sea aproximadamente el 10 por ciento en peso o menos, preferentemente de 2 a 7 por ciento en peso del hierro total en términos de hierro metal. La cuantía de la oxidación del óxido complejo puede expresarse por el contenido de hierro divalente y el contenido de hierro divalente puede determinarse mediante un método de análisis colorimétrico usando o-fenantrolina. A saber, tomando las suficientes precauciones para prevenir la oxidación durante la medida, tal como el desplazamiento con nitrógeno, se añade ácido clorhídrico a un sol acuoso o polvo del complejo, y después de cambiar completamente el óxido de hierro por cloruros de hierro, la mezcla se diluye adecuadamente para dar una solución de ensayo. A 1 ml de esta solución de ensayo se añaden 8 ml de solución de reactivo o-fenantrolina al 0,1% en tampón de acetato 0, 4 M (pH 4) y después 1 ml de fluoruro potásico 1 M, y se mide la absorbancia a una longitud de onda de 510 nm. Por otra parte, se mide igualmente la absorbancia en la solución patrón de hierro divalente y el agua usada para la medida, y el contenido de hierro divalente se determina a partir de su relación.

Además, en esta invención, el diámetro medio de las partículas ultrafinas de óxido metálico magnético en el complejo usado puede estar en el intervalo de generalmente 2 a 30 nm, preferentemente de 4 a 15 nm. En esta memoria, el diámetro de partícula de las partículas ultrafinas de óxido metálico magnético es un valor que se determina por un método de difracción de rayos X. A saber, cuando se lleva a cabo la difracción de rayos X en polvos de un complejo materia prima y la composición de esta invención liofilizada, pueden observarse varios picos de difracción correspondientes a compuestos particulares y así puede verse que el óxido metálico magnético (partículas magnéticas) contenido en el complejo existe en forma cristalina. El pico de difracción obtenido se hace más ancho, es decir, más pequeño en proporción a la disminución del diámetro de las partículas magnéticas contenidas en el complejo. Por consiguiente, en el caso en que el tamaño de las partículas del óxido metálico magnético contenido en el complejo es 0,1 \mum o menos, el tamaño de las partículas puede ser medido por difracción de rayos X. A saber, el tamaño de las partículas (diámetro) puede ser calculado de acuerdo con la ecuación de Scherrer que sigue, basándose en el pico más intenso en la difracción de rayos X.

D = k\lambda/\beta \cdot cos \theta

\beta = \sqrt{B^{2} - b^{2}}

en donde D es el tamaño de las partículas (\ring{A}), k es una constante 0,9, \lambda es la longitud de onda de los rayos X (1,790 \ring{A}), \theta es el ángulo de Bragg (grados), B es la anchura mitad de una muestra (radianes) y b es la anchura mitad de una muestra estándar (radianes).

La muestra estándar usada es la misma sustancia que tiene un tamaño de partículas de 1 \mum o más. Los valores así obtenidos se corresponden relativamente bien con los valores obtenidos mediante un microscopio electrónico del tipo de transmisión.

Además, en esta invención, el diámetro de partículas de un complejo es un valor medido mediante un método de dispersión de luz [por ejemplo, véase Polymer J., 13, 1037-1043 (1981)], y los complejos usados en esta invención pueden tener un diámetro de partículas en el intervalo de generalmente 10 a 500 nm, preferentemente de 20 a 200
nm.

Además, en esta descripción, las propiedades magnéticas de un complejo (por ejemplo magnetización y fuerza coercitiva) pueden determinarse a partir de una curva de magnetización-campo magnético (la llamada curva M-H) obtenida usando un magnetómetro de muestra vibrante. La magnetización en 1 tesla de un complejo usado en esta invención puede estar en el intervalo de generalmente 10 a 150 emu, preferentemente de 30 a 150 emu por g de metal o metales. Además la fuerza coercitiva de un complejo utilizable en esta invención puede ser de aproximadamente 30 oersteds o menos, y, preferentemente, es esencialmente superparamagnética.

Además, en esta descripción, la relajabilidad T_{2} [unidad: (seg.mM)^{-1}] de la composición de esta invención y/o su complejo materia prima puede ser determinada a partir de la pendiente de una línea recta determinada por el método de mínimos cuadrados basado en un gráfico obtenido dibujando curvas de resonancia del protón del agua en soles acuosos que comprenden cada complejo diluido con agua en varias concentraciones y en agua usada para la dilución, usando (CW-NMR de 60 MH_{Z} (el campo magnético es aproximadamente 1,4 tesla), determinando la anchura mitad \Delta \lambda_{1/2} (unidad: Hz) del pico resultante, calculando 1/T_{2} (unidad: seg^{-1}) = \pi \cdot \Delta v_{1/2}, y representando la relación entre 1/T_{2} y la concentración de hierro (unidad: mM) en el sol acuoso de la muestra de medida. La relajabilidad T_{2} de un complejo materia prima utilizable en esta invención calculada como anteriormente puede estar en el intervalo de generalmente 5 a 1000 (seg.mM)^{-1}, preferentemente de 10 a 500 (seg.mM)^{-1}, más preferentemente de 20 a 300 (seg.mM)^{-1}.

El sol acuoso así descrito de un complejo de partículas ultrafinas de óxido metálico magnético-polisacáridos y/o proteína, preferentemente un complejo de partículas ultrafinas de óxido metálico magnético-polisacáridos, puede ser mezclado con un ácido orgánico monocarboxílico para dar la composición de esta invención. En esta ocasión, aunque tal composición puede ser preparada añadiendo y mezclando un sol acuoso del complejo con una solución acuosa de ácido orgánico monocarboxílico, tal como solución de Ringer de ácido láctico, normalmente es conveniente prepararla añadiendo un ácido orgánico monocarboxílico o una solución acuosa del mismo a un sol acuoso del complejo. Además, en algunos casos puede también prepararse eliminando impurezas contenidas en un sol acuoso del complejo y al mismo tiempo incorporando un ácido orgánico monocarboxílico, de acuerdo con un método de ultrafiltración o un método de diálisis.

La concentración del sol acuoso de complejo usado no está limitada de modo estricto, pero puede estar en el intervalo de generalmente 0,05 a 6 M, preferentemente de 0,2 a 2 M en términos del metal o metales, y su pH está adecuadamente en el intervalo de 4 a 10, preferentemente de 5 a 9. Es posible mezclar tal ácido monocarboxílico con el sol acuoso de complejo en el intervalo de 1 mmol a 30 moles, preferentemente 5 mmoles a 100 mmoles por mol de metal o metales en el complejo. El ácido orgánico monocarboxílico usado puede ser añadido en forma de una sal con un catión monovalente tal como litio, sodio, potasio, amonio o una alquilamina inferior, o un catión divalente tal como magnesio, calcio o bario, preferentemente sodio, pero más preferentemente se añade en forma de ácido libre. La concentración de la solución acuosa de ácido orgánico monocarboxílico en el momento de la adición no está limitada en particular, pero puede ser, por ejemplo, generalmente 0,01 M o más, preferentemente puede estar en el intervalo de 0,2 a 2 M.

En esta invención, los ácidos monocarboxílicos que pueden ser añadidos son preferentemente solubles en agua, y en este caso se prefieren los ácidos monocarboxílicos que están en forma de ácido libre y son solubles en agua, pero también pueden usarse las sales de ácidos monocarboxílicos solubles en agua. Como tales ácidos monocarboxílicos solubles en agua, se prefieren los que tienen 10 átomos de carbono o menos. Los ejemplos específicos de ácidos orgánicos monocarboxílicos usados adecuadamente en esta invención son como sigue.

(i): Ácidos orgánicos monocarboxílicos que contienen uno o varios grupos hidroxilo: por ejemplo, ácido glicólico, ácido 3-hidroxipropiónico, ácido láctico, ácido \beta-hidroxibutírico, ácido 4-hidroxibutírico, ácido glicérico, ácido mevalónico, ácido glucónico, ácido gulónico, ácido glicoheptoico, etc.

(ii): Ácidos orgánicos monocarboxílicos que contienen uno o varios grupos amina: por ejemplo, glicina, alanina, ácido \alpha-aminobutírico, valina, norvalina, leucina, norleucina, iooleucina, fenilalanina, tirosina, surinamina, treonina, serina, prolína, oxiprolina, triptófano, tiroxina, diyodotirosina, dibromotirosina, metionina, cistina, cisteína, lisina, arginina, histidina, \alpha-alanina, ácido \beta-aminobutírico, ácido \gamma-aminobutírico, ácido \delta-aminovalérico, etc.

Estos ácidos orgánicos monocarboxílicos puede ser usados respectivamente solos o en combinación de dos o más de ellos. Entre estos ácidos orgánicos monocarboxílicos se prefieren los ácidos monocarboxílicos alifáticos inferiores que tienen 6 átomos de carbono o menos, que tienen uno o varios grupos hidroxilo o grupos amino, y el ácido láctico es particularmente preferido

Aunque el pH de una mezcla del sol acuoso de complejo con el ácido orgánico monocarboxílico no está limitado particularmente, es adecuado que el pH esté en el intervalo de generalmente 4 a 11, preferentemente de 5 a 9, más preferentemente de 6 a 8. Además, la composición de esta invención puede ser sometida a un ajuste de concentración y filtración, si se desea, y después sometida a tratamiento térmico, si se desea. Es adecuado llevar a cabo el tratamiento térmico generalmente a una temperatura de 60 a 140ºC durante 5 minutos a 5 horas, y en particular, incluyendo esterilización, a 121ºC durante 20 a 30 minutos.

También es posible, si se desea, añadir como agentes isotónicos antes o después del tratamiento térmico, por ejemplo, sales inorgánicas tales como cloruro sódico, monosacáridos tales como glucosa, o sucroalcoholes tales como manitol o sorbitol; o como agentes de mantenimiento del pH varios coadyuvantes aceptables fisiológicamente tales como tampones de fosfato o tampones de Tris. Además, la composición de esta invención, al margen de que contenga o no estas sustancias auxiliares, puede ser convertida en polvo por un método conocido en sí mismo, preferentemente un método de liofilización, y el polvo resultante se convierte en un sol acuoso con la adición de agua.

La composición de esta invención así obtenida llega a no tener una acción hipotensora y/o a mostrar una actividad de agregación plaquetaria, en comparación con el complejo usado como materia prima, pero no hay muchos cambios en las propiedades químicas, físicas u otras propiedades biológicas, y se produce el efecto extraordinariamente preferido de que aumenta la seguridad de la composición de esta invención, y no cambia el efecto, p.ej., como agente de contraste de MRI, toxicidad aguda, etc. Hasta ahora, ya se ha propuesto una composición que comprende un ácido policarboxílico tal como ácido cítrico y un complejo similar al usado en esta invención, y en esta composición con un ácido policarboxílico indudablemente se han reducido efectos secundarios tales como la disminución de la presión sanguínea, y la actividad de agregación de las plaquetas, pero la composición tiene un grave inconveniente de su fuerte toxicidad aguda. En cambio, la composición de esta invención que contiene un ácido monocarboxílico no tiene más que una débil toxicidad aguda. Por ejemplo, los valores de LD_{50} de los complejos del Ejemplo 2-3 como realización preferida de esta invención, el Ejemplo Comparativo 1 y el Ejemplo de Referencia 4 como materia prima del mismo, son 28 mmoles de Fe/kg, 9 mmoles de Fe/kg y 22 mmoles de Fe/kg, y la composición de esta invención que contiene un ácido monocarboxílico es extraordinariamente útil como medicina o como fármaco para diagnós-
tico.

Además, por ejemplo cuando la composición de esta invención es administrada a un animal y se realiza un examen histopatológico de sus pulmones, no se observan émbolos, como se demuestra en el Ejemplo de Ensayo 4 descrito más adelante [véase Fig. 2(B)], y por tanto la composición tiene una seguridad extraordinariamente elevada.

La composición de esta invención muestra solamente una débil actividad hipotensora. En la presente descripción, la medida de la presión sanguínea se hace administrando a cada conejo por vía intravenosa un sol acuoso de complejo tal como la composición de esta invención, por ejemplo en una cantidad de 0,2 mmol/kg como metal o metales. Cuando tiene una acción hipotensora, el descenso de la presión sanguínea se observa generalmente en el intervalo de 2 a 10 minutos después de la administración. La composición de esta invención tiene una acción hipotensora más débil que la del sol acuoso de complejo usado como materia prima para ella. Por ejemplo, la composición del Ejemplo 1 como realización preferida de esta invención no muestra acción hipotensora, pero el sol acuoso de complejo del Ejemplo de Referencia 2, como materia prima para ella, muestra acción hipotensora.

Además, la composición de esta invención muestra solamente una débil acción de agregación de las plaquetas. En la presente descripción, la propiedad agregante de las plaquetas se expresa por las plaquetas residuales. A saber, un sol acuoso de complejo como la composición de esta invención se administra por vía intravenosa a un conejo, por ejemplo en una cantidad de 0, 1 mmoles/kg de metal o metales, y se denomina plaquetas residuales (%) a la relación del número de plaquetas a los 5 minutos después de la administración respecto al número de plaquetas inmediatamente antes de la administración. Los soles acuosos de complejos usados como materia prima en esta invención muestran generalmente plaquetas residuales de 1 a 50%, mientras que las composiciones de esta invención muestran generalmente plaquetas residuales mejoradas de 2 a 10 veces. Por ejemplo, las plaquetas residuales de los complejos del Ejemplo 1 como realización preferida de esta invención, y del Ejemplo de Referencia 2 como materia prima de la anterior, son 38 y 3% respectivamente, y además las plaquetas residuales de los complejos del Ejemplo 2-3, Ejemplo Comparativo 1 y Ejemplo de Referencia 4 como materia prima de los mismos, son 102, 97 y 56% respectivamente.

Se encontró que al menos la parte de partículas magnéticas del complejo en cada sol acuoso de complejo incluido en la composición de esta invención tiende a acumularse, poco después de la administración intravenosa, en órganos internos en los que se desarrolla el retículo endoplasmático, por ejemplo hígado, bazo y médula ósea, y en particular, en una dosis baja (por ejemplo 0,1 mmol/kg como metal o metales), la mayoría y probablemente sustancialmente todo el complejo administrado se acumula en las células estrelladas de Kupfer en el hígado. Basándose en este hecho, las propiedades metabólicas de estos complejos fueron evaluadas como sigue midiendo el grado de magnetización de los hígados usando CW-NMR.

Porciones de cada uno de los soles acuosos de complejo se administran por vía intravenosa, respectivamente, a ratas en una cantidad de 0,1 mmol/kg cada uno como metal o metales; los valores de 1/T_{2} (unidad: seg^{-1}) de la misma manera que en la medida de la relajabilidad T_{2} en el hígado de cada rata a tiempos, por ejemplo, de 1 hora, 2 horas, 4 horas, 1 día, 3 días, 7 días y 14 días después de la administración; y después de hacer correcciones mediante los valores de 1/T_{2} de los hígados del grupo de ratas no administradas, se calcula la propiedad metabólica de cada complejo como su vida mitad a partir de la relación con los tiempos después de la administración. En una realización preferida de esta invención, como es el Ejemplo 2-3, la vida mitad de las composiciones de muestra es de 3,6 días, mientras que la del complejo materia prima indicado en el Ejemplo de Referencia 4 es 3,9 días, y así puede afirmarse que la propiedad metabólica de la composición es bastante mejor que la del complejo materia prima.

Además, las propiedades físicas con respecto a la composición de esta invención, tales como el diámetro de partículas del óxido metálico magnético, y el diámetro de partícula, propiedades magnéticas y relajabilidad T_{2}, caen en el intervalo de 80 a 120% de las del complejo usado como materia prima, respectivamente, y por tanto apenas cambian.

La composición de esta invención tiene varias características excelentes establecidas antes y puede ser usada con seguridad en el campo biológico y en el campo médico, por ejemplo como agente de suplementación de hierro, como agente de contraste para rayos X y como agente de contraste para MRI, para la medida del torrente circulatorio, como agente hipertérmico, y además como vehículo en caso de administración intensiva de un fármaco a una parte tópica utilizando un campo magnético, etc., y entre ellos, puede ser usado ventajosamente en usos para administración a los vasos sanguíneos.

La composición de esta invención preferentemente utilizable como agente de contraste para MRI, es una realización preferida de esta invención. En esta realización preferida, como polisacáridos y/o proteína que forman el sol acuoso de complejo, como componente de la composición de esta invención, se prefieren los polisacáridos, en particular dextrano, almidón o pululano, y, sobre todo, se prefiere un carboxi-polisacárido o un carboxi-alquil-éter de un polisacárido. Las viscosidades intrínsecas de estos polisacáridos pueden estar en el intervalo de 0,02 a 0,5 dl/g, preferentemente de 0,04 a 0,2 dl/g. Por otra parte, el óxido metálico magnético es preferentemente óxido de hierro magnético, más preferentemente óxido de hiero magnético tratado por oxidación, el diámetro de partículas de este óxido metálico magnético puede estar en el intervalo de aproximadamente 2 a aproximadamente 30 nm, preferentemente de 4 a 15 nm, y la combinación más preferida es un complejo o complejo oxidado de CDX con un óxido de hierro magnético. Además, es deseable que la magnetización de un complejo utilizable para la composición de esta invención por g de metal o metales en 1 tesla esté en el intervalo de 10 a 150 emu, preferentemente de 30 a 150 emu, y es adecuado que la relajabilidad T_{2} del complejo esté en el intervalo de generalmente 5 a 1000 (seg.mM)^{-1}, preferentemente de 10 a 500 (seg.mM)^{-1}, preferentemente de 20 a 300 (seg.mM)^{-1}.

Además, en la composición de esta invención preferentemente utilizable como agente de contraste de MRI, como ácido orgánico monocarboxílico incorporable en el anterior sol acuoso de complejo, el ácido láctico es particularmente preferido entre los descritos anteriormente.

Además, cuando la composición de esta invención se usa como agente de contraste para MRI, es deseable usar la composición en forma de sol acuoso. En esta relación, la concentración del complejo en la composición puede variarse en un amplio margen, pero normalmente puede estar, por ejemplo, en el intervalo de 1 mmol/l a 4 mol/l, preferentemente de 0,01 a 2 mol/1 en términos del metal o metales. Además, en la preparación de soles acuosos, también pueden añadirse varios aditivos aceptables fisiológicamente, por ejemplo sales inorgánicas tales como cloruro sódico, monosacáridos tales como glucosa, sucroalcoholes tales como manitol o sorbitol, tampones de fosfato, tampones de Tris, etc. La dosis de la composición de esta invención cuando se usa como agente de contraste de MRI varía dependiendo de los sitios de diagnóstico, y no puede ser descrita de forma concreta, pero normalmente está en el intervalo de 1 \mumol/kg a 10 mmol/kg de peso corporal, preferentemente aproximadamente 2 \mumol/kg a 1 mmol/kg de peso corporal. Como métodos de administración, cabe mencionar por ejemplo la inyección intravenosa, intraarterial, intravesical, intramuscular, subcutánea, intracutánea, etc., pero en algunos casos es también posible la administración oral o la administración directa. Por ejemplo cuando la composición de esta invención en una realización preferida es administrada por vía intravenosa, la mayor parte se acumula en el sistema retículo-endotelial, en particular en el hígado, de forma comparativamente rápida, por ejemplo en un tiempo entre unas decenas de minutos y varias horas, y como consecuencia se hace adecuadamente la toma fotográfica mediante MRI del hígado. En esta ocasión, cuando en el hígado hay una parte lesionada, por ejemplo un cáncer que carece de células del sistema retículo-endotelial o que tiene solamente una pequeña distribución de las mismas, nada o tan sólo una pequeña parte del complejo contenido en la composición de esta invención se acumula en la parte de la lesión en comparación con otras partes normales, y así puede llevarse a cabo fácilmente la especificación de la parte de la lesión mediante fotografías de MRI [véase el Ejemplo de Ensayo 3 descrito más adelante y la Figura 1 (A) a (D)]. La composición de esta invención tiene efectos como agente de contraste no sólo frente a imágenes T_{2} sino también a imágenes T_{1}.

Modo mejor de llevar a cabo la invención

Esta invención se describe más específicamente más adelante de acuerdo con Ejemplos.

Ejemplo de referencia 1

Se disuelven 105 g de dextrano que tiene una viscosidad intríseca de 0,051 dl/g en 350 ml de agua, se añade una solución acuosa que comprende 140 ml de solución acuosa de cloruro férrico 1 M (correspondiente a 37,8 g de cloruro férrico hexahidrato) en la que están disueltos 27,2 g de cloruro ferroso tetrahidrato, bajo una corriente de nitrógeno, y, calentando, se añaden 305 ml de solución acuosa de hidróxido sódico 3 N, con agitación. Después se añade ácido clorhídrico 6 N para ajustar el pH en 7,0, y la mezcla se somete a reflujo calentando durante 1 hora y 30 minutos. Después de enfriar, se centrifuga a 2.100 x g durante 30 minutos, se añade el 92,8 del volumen de sobrenadante de etanol para precipitar un complejo, el precipitado obtenido se disuelve en agua y la solución se dializa frente a agua circulante durante 16 horas. La solución dializa se ajusta a pH 7,2 con hidróxido sódico, se concentra bajo presión reducida y se filtra con un filtro de membrana (tamaño de poro: 0,2 \mum) para obtener 40 ml del sol acuoso de complejo deseado (Ejemplo de Referencia 1) . Concentración de hierro: 144 mg/ml, tamaño de partícula del óxido de hierro magnético: 6, 2 nm, tamaño de partícula del conjunto: 89 nm, relación en peso poli sacárido/hierro: 0,63; magnetización en 1 tesla: 64 emu/l g de hierro, relajabilidad T_{2}: 130 (mM.seg)^{-1}, tasa de hierro divalente en el hierro total: 21%.

Ejemplo de referencia 2

Se disuelven 105 g de CDX que tiene una viscosidad intrínseca de 0,050 dl/g en 350 ml de agua, se añade a ello una solución acuosa que comprende 140 ml de solución acuosa de cloruro férrico 1 M (correspondiente a 37,8 g de cloruro férrico hexahidrato) en la que están disueltos 13,6 g de cloruro ferroso tetrahidrato bajo una corriente de nitrógeno y, calentando, se añaden mientras se agita 242 ml de solución acuosa de hidróxido sódico 3 N. Después se añade ácido clorhídrico 6 N para ajustar el pH en 7,0 y la mezcla se somete a reflujo con calentamiento durante 1 hora y 30 minutos. Después de enfriar, se lleva a cabo el mismo tratamiento que en el Ejemplo de Referencia 1 para obtener 190 ml del sol acuoso de complejo deseado (Ejemplo de Referencia 2). Concentración de hierro: 56 mg/ml, tamaño de partícula del óxido de hierro magnético: 8,8 nm, tamaño de partícula del total: 70 nm, relación en peso polisacárido/hierro: 1,08, magnetización en 1 tesla: 91 emu/1 g de hierro, relajabilidad T_{2}: 230 (mM.seg)^{-1}, tasa de hierro divalente en el hierro total: 21%.

Ejemplo de referencia 3

Se disuelven 1.050 g de CDX que tiene una viscosidad intrínseca de 0,050 dl/g en 3.500 ml de agua, se añade a ello una solución acuosa que comprende 1.400 ml de solución acuosa de cloruro férrico 1 M (correspondiente a 378 g de cloruro férrico hexahidrato) en la que están disueltos 136 g de cloruro ferroso tetrahidrato, bajo una corriente de nitrógeno y, calentando, se añaden mientras se agita 2.420 ml de solución acuosa de hidróxido sódico 3 N. Después se añade ácido clorhídrico 6 N para ajustar el pH en 7,1 y la mezcla se somete a reflujo con calentamiento durante 2 horas. Después de enfriar, se centrifuga a 2.100 x g durante 30 minutos, se filtra el sobrenadante con un filtro de membrana (tamaño de poro: 0,2 \mum), se añade agua al filtrado hasta 10 1, se concentra mediante ultrafiltración (peso molecular de fraccionamiento: 100.000 daltons) hasta 1,5 l y, mientras se añade agua al concentrado, se lleva a cabo la ultrafiltración (peso molecular de fraccionamiento: 100.000 daltons) hasta que la cantidad de solución expulsada es 12 l. Se añade una cantidad predeterminada de CDX a la solución interna de filtración de forma que la relación en peso de CDX a hierro sea 1:1, se ajusta el pH en 7, 0 con hidróxido sódico, se centrifuga a 2.100 x g durante 1 hora y 30 minutos, y el sobrenadante se filtra con un filtro de membrana (tamaño de poro: 0,2 \mum) para obtener 1,9 l del sol acuoso de complejo deseado (Ejemplo de Referencia 3). Concentración de hierro: 57 mg/ml, tamaño de partícula del óxido de hierro magnético: 8,6 nm, tamaño de partícula del conjunto: 64 nm, relación en peso polisacárido/hierro: 1,03; magnetización en 1 tesla: 89 emu/1 g de hierro, relajabilidad T_{2}: 220 (mM.seg)^{-1}, tasa de hierro divalente en el hierro total: 23%.

Ejemplo de referencia 4

De acuerdo con el Ejemplo de Referencia 3, se disuelven 1.050 g de CDX que tiene una viscosidad intrínseca de 0,050 dl/g en 3.500 ml de agua, se añade a ello una solución acuosa que comprende 1.400 ml de solución acuosa de cloruro férrico 1 M (correspondiente a 378 g de cloruro férrico hexahidrato) en la que están disueltos 136 g de cloruro ferroso tetrahidrato bajo una corriente de nitrógeno y, calentando, se añaden mientras se agita 2.420 ml de solución acuosa de hidróxido sódico 3 N. Después se añade ácido clorhídrico 6 N para ajustar el pH en 7,1 y la mezcla se somete a reflujo con calentamiento durante 2 horas. Después de enfriar, se concentra a 2.100 x g durante 30 minutos, se filtra el sobrenadante con un filtro de membrana (tamaño de poro: 0,2 \mum), se añade agua al filtrado hasta 10 l, se concentra mediante ultrafiltración (peso molecular de fraccionamiento: 100.000 daltons) hasta 1,5 l y, mientras se añade agua al concentrado, se lleva a cabo la ultrafiltración (peso molecular de fraccionamiento: 100.000 daltons) hasta que la cantidad de solución expulsada es 1,5 l. 1,9 l del sol acuoso de complejo de CDX resultante que tiene una viscosidad intrínseca de 0,050 dl/g con el óxido de hierro magnético (concentración de hierro: 57 mg/ml) en el que la relación en peso de CDX con el hierro es 0,4:1 se ajustan a pH 7,5 con hidróxido sódico, y se lleva a cabo una oxidación con gas oxígeno a 95ºC durante 3 horas y 30 minutos, mientras el pH de la reacción se ajusta con hidróxido sódico sin que llegue a 4,2 o menos. Después de enfriar, la solución de reacción se concentra mediante ultrafiltración (peso molecular de fraccionamiento: 100.000 daltons) hasta 1 l y, mientras se añade agua al concentrado, se lleva a cabo la ultrafiltración (peso molecular de fraccionamiento: 100.000 daltons) hasta que la cantidad de solución expulsada es 12 l. Se añade una cantidad predeterminada de CDX a la solución interna de filtración de forma que la relación en peso de CDX a hierro sea 1:1, se ajusta el pH en 7,0 con hidróxido sódico, se centrifuga y el sobrenadante se filtra con un filtro de membrana (tamaño de poro: 0,2 \mum) para obtener 1,75 l del sol acuoso de complejo deseado (Ejemplo de Referencia 4) . Concentración de hierro: 56 mg/ml, tamaño de partícula del óxido de hierro magnético: 8,5 nm, tamaño de partícula del conjunto: 67 nm, relación en peso polisacárido/hierro: 1,08; magnetización en 1 tesla: 87 emu/1 g de hierro, relajabilidad T_{2}: 210 (mM.seg)^{-1}, tasa de hierro divalente en el hierro total: 3,4%.

Ejemplo de referencia 5

Se disuelven 167 g de CDX que tiene una viscosidad intrínseca de 0,120 dl/g en 700 ml de agua, se añade a ello una solución acuosa que comprende 280 ml de solución acuosa de cloruro férrico 1 M (correspondiente a 75,6 g de cloruro férrico hexahidrato) en la que están disueltos 27,2 g de cloruro ferroso tetrahidrato, bajo una corriente de nitrógeno y, calentando, se añaden mientras se agita 484 ml de solución acuosa de hidróxido sódico 3 N. Después se añade ácido clorhídrico 6 N para ajustar el pH en 7,0 y la mezcla se somete a reflujo con calentamiento durante 1 hora y 30 minutos. Después de enfriar, se centrifuga a 2.100 x g durante 30 minutos, se añade etanol en una cantidad de 54,9% del volumen del sobrenadante para precipitar el complejo, y se centrifuga a 2.100 x g durante 10 minutos. El precipitado resultante se disuelve en agua, se añade etanol en una cantidad de 57,1% del volumen de la solución para reprecipítar el complejo, se centrifuga a 2.100 x g durante 10 minutos, el precipitado resultante se disuelve en agua, y la solución de dializa frente a agua en circulación durante 16 horas. La solución dializada se ajusta a pH 7,2 con hidróxido sódico, se concentra bajo presión reducida y se filtra con un filtro de membrana (tamaño de poro: 0,2 \mum), para obtener 390 ml de un sol acuoso de complejo de óxido magnético (concentración de hierro : 56 mg/ml). 300 ml de este sol acuoso de complejo (concentración de hierro : 56 mg/ml) se oxidan con gas oxígeno a 95ºC durante 3 horas y 30 minutos de la misma manera que en el Ejemplo de Referencia 4, y, después de enfriar, se dializan frente a agua en circulación durante 16 horas. La solución dilaizada se ajusta a pH 7,2 con hidróxido sódico, se concentra bajo presión reducida y se filtra con un filtro de membrana (tamaño de poro: 0,2 \mum) para obtener 285 ml del sol acuoso de complejo deseado (Ejemplo de Referencia 5). Concentración de hierro: 55 mg/ml, tamaño de partícula del óxido de hierro magnético: 7,7 nm, tamaño de partícula del conjunto: 78 nm, relación en peso polisacárido/hierro: 0,97; magnetización en 1 tesla: 84 emu/1 g de hierro, relajabilidad T_{2}: 205 (mM.seg)^{-1}, tasa de hierro divalente en el hierro total: 1,7%.

Ejemplo de referencia 6

A una solución mixta de 50 ml de sulfato de zinc 1 M con 150 ml de sulfato férrico 0,5 M se añade gota a gota, bajo agitación y calentando, 210 ml de solución acuosa de hidróxido sódico 3 N, y la mezcla se somete a reflujo calentando durante 3 horas. Después de enfriar se repite un total de cuatro veces una operación de centrifugación de la mezcla de reacción y de lavado del precipitado con 450 ml de agua. A la suspensión de ferrita resultante (volumen de líquido: 300 ml) se añaden aproximadamente 2,5 ml de ácido clorhídrico concentrado para ajustar el pH en 1,7, y la mezcla se agita durante 16 horas. A 300 ml del sol acuoso de ferrita resultante (pH 2, 1) se añade una solución que comprende 90 ml de agua en la que están disueltos 45 g de CDX que tiene una viscosidad intrínseca de 0,120 dl/g, y la mezcla se ajusta a un pH de aproximadamente 7 con hidróxido sódico, y después se somete a reflujo calentando durante 1 hora. Después se enfriar, se añade metanol a esta solución de reacción hasta el 46%, el precipitado depositado se disuelve en 150 ml de agua, después se lleva a cabo una centrifugación a 2.100 x g durante 30 minutos, y el sol acuoso de complejo obtenido eliminando el precipitado se dializa frente a agua en circulación durante 16 horas. La solución dializada se ajusta a pH 8,0 con hidróxido sádico, se concentra bajo presión reducida y se filtra con un filtro de membrana (tamaño de poro: 0,45 \mum) para obtener 168 ml del sol acuoso de complejo deseado (Ejemplo de Referencia 6) . Concentración de hierro: 42 mg/ml, concentración de zinc: 16 mg/ml, tamaño de partícula del metal magnético: 10,3 nm, tamaño de partícula del conjunto: 120 nm, relación en peso polisacárido/metal: 1, 33, magnetización en 1 tesla: 27 emu/1 g de metal, relajabilidad T_{2}: 22 (mM. seg)^{-1}.

Ejemplo de referencia 7

86 g de sal sódica de dextrano carboximetilado (viscosidad intrínseca: 0,115 dl/g, grado de sustitución: 0,26 moles/unidad de glucosa) se disuelven en 240 ml de agua, a esto se añade una solución que comprende 160 ml de agua en los que están disueltos 45,4 g de cloruro férrico hexahidrato y 21,6 g de cloruro ferroso tetrahidrato bajo atmósfera de nitrógeno, y, calentando, se añade agitando una solución acuosa de hidróxido sódico 3 N hasta pH 11. Después se añade ácido clorhídrico para ajustar el pH en 7, 0, y la mezcla se somete a reflujo con agitación durante 1 hora. Después de enfriar, se centrifuga a 2.100 x g durante 30 minutos, se añade metanol al sobrenadante hasta el 46% para precipitar el complejo, el precipitado resultante se disuelve en agua, y la solución se dializa frente a agua en circulación durante 16 horas. La solución dializada se ajusta a pH 8,0 con hidróxido sódico, se concentra bajo presión reducida y se filtra con un filtro de membrana (tamaño de poro: 0,45 \mum) para obtener 249 ml del sol acuoso de complejo deseado (Ejemplo de Referencia 7) . Concentración de hierro: 56 mg/ml, tamaño de partícula del óxido de hierro magnético: 7,3 nm, tamaño de partícula del conjunto: 73 nm, relación en peso polisacárido/hierro: 2,11, magnetización en 1 tesla: 85 emu/1 g de hierro, relajabilidad T_{2}: 130 (mM.seg)^{-1},tasa de hierro divalente en el hierro total: 19%.

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Ejemplo de referencia 8

162 g de CDX que tiene una viscosidad intrínseca de 0,050 dl/g se disuelven en 1.080 ml de agua, a esto se añaden 353 ml de solución acuosa de hidróxido sódico 3 N, y, calentando, una solución acuosa que comprende 222 ml de solución acuosa de cloruro férrico 1 M (correspondientes a 60,0 g de cloruro férrico hexahidrato) en la que están disueltos 21,6 g de cloruro ferroso tetrahidrato, bajo atmósfera de nitrógeno. Después se añade ácido clorhídrico 6 N para ajustar el pH en 7,0, y la mezcla se somete a reflujo con calentamiento durante 1 hora y 30 minutos. Después de enfriar, se lleva a cabo el mismo tratamiento que en el Ejemplo de Referencia 1, para obtener 160 ml del sol acuoso de complejo deseado (Ejemplo de Referencia 8) . Concentración de hierro: 55 mg/ml, tamaño de partícula del óxido de hierro magnético: 4,5 nm, tamaño de partícula del conjunto: 36 nm, relación en peso polisacárido/hierro: 1,08, magnetización en 1 tesla: 73 emu/1 g de hierro, relajabilidad T_{2}: 68 (mM.seg) ^{-1}, tasa de hierro divalente en el hierro total 13%.

Ejemplo comparativo 1

Se añaden 4 ml de solución de ácido cítrico 1 M a 200 ml de sol acuoso de complejo de CDX que tiene una viscosidad intrínseca de 0,050 dl/g con el óxido de hierro magnético oxidado (concentración de hierro: 56 mg/ml) preparado de acuerdo con el Ejemplo de Referencia 4, se ajusta el pH en 8 con solución acuosa de hidróxido sódico 3 N, se agita la mezcla durante 10 minutos y se filtra con un filtro de membrana (tamaño de poro: 0,2 \mum) y el filtrado se pone en autoclave a 121ºC durante 20 minutos para obtener 210 ml del sol acuoso de complejo deseado (Ejemplo Comparativo 1). Concentración de hierro: 54 mg/ml, tamaño de partícula del óxido de hierro magnético: 8,3 nm, tamaño de partícula del conjunto: 60 nm, relación en peso polisacárido/hierro: 1,00, magnetización en 1 tesla: 85 emu/1 g de hierro, relajabilidad T_{2}: 200 (mM.seg)^{-1}, tasa de hierro divalente en el hierro total: 5,7%.

Ejemplo comparativo 2

10 ml de solución de ácido cítrico 0,4 M ajustada a pH 8 con una solución acuosa de hidróxido sódico se añaden a 100 ml de sol acuoso de complejo de CDX que tiene una viscosidad intrínseca de 0, 050 dl/g con el óxido de hierro magnético oxidado (concentración de hierro: 56 mg/ml) preparado de acuerdo con el Ejemplo de Referencia 4, se agita la mezcla durante 10 minutos, se ajusta el pH en 8 con solución acuosa de hidróxido sódico 3 N, se lleva el volumen total hasta 200 ml añadiendo agua, se filtra con un filtro de membrana (tamaño de poro: 0,2 \mum) y el filtrado se pone en autoclave a 121ºC durante 20 minutos para obtener 200 ml del sol acuoso de complejo deseado (Ejemplo Comparativo 2). Concentración de hierro: 29 mg/ml, tamaño de partícula del óxido de hierro magnético: 8,4 nm, tamaño de partícula del conjunto: 60 nm, relación en peso polisacárido/hierro: 1,03, magnetización en 1 tesla: 85 emu/1 g de hierro, relajabilidad T_{2}: 215 (mM.seg)^{-1}, tasa de hierro divalente en el hierro total: 5,1%.

Ejemplo comparativo 3

A 500 ml de agua amoniacal al 16% en la que están disueltos 250 g de dextrano que tiene una viscosidad intrínseca de 0,075 dl/g, se añaden gradualmente con agitación vigorosa a lo largo de un periodo de 5 minutos 500 ml de una solución que contiene 75,5 g de cloruro férrico hexahidrato y 32 g de cloruro ferroso tetrahidrato. La suspensión formada se somete a pulverización ultrasónica (30 minutos), se calienta (100ºC, 10 minutos), se enfría y se centrifuga a 1.000 x g durante 20 minutos. El líquido sobrenadante se diluye con agua hasta 2 l y se concentra hasta 500 ml mediante ultrafiltración (peso molecular de fraccionamiento: 100.000 daltons). Se añaden al concentrado 1,6 l de agua y la mezcla se concentra hasta 500 ml. Esta operación de adición de agua y concentración se repite cinco veces en total, se añaden 500 ml de solución de citrato sódico 1 M al concentrado resultante, y la mezcla se dializa durante 16 horas frente a tampón de citrato amónico 10 mM ajustado a pH 8,2 con agua amoniacal. La solución dializada se concentra hasta 120 ml mediante ultrafiltración (peso molecular de fraccionamiento: 100.000 daltons) y se filtra con un filtro de membrana (tamaño de poro: 0,2 \mum), y el filtrado se pone en autoclave a 121ºC durante 30 minutos para obtener 115 ml del sol acuoso de complejo deseado (Ejemplo Comparativo 3) . Concentración de hierro: 57 mg/ml, tamaño de partícula del óxido de hierro magnético: 8,1 nm, tamaño de partícula del conjunto: 220 nm, relación en peso polisacárido/hierro: 0,36, magnetización en 1 tesla: 83 emu/1 g de hierro, relajabilidad T_{2}: 255 (mM.seg)^{-1}, tasa de hierro divalente en el hierro total: 6,5%.

Ejemplo 1

Se añaden 2 ml de solución de ácido L-láctico 1 M a 100 ml de sol acuoso de complejo de CDX que tiene una viscosidad intrínseca de 0,050 dl/g con el óxido de hierro magnético oxidado (concentración de hierro: 57 mg/ml) preparado de acuerdo con el Ejemplo de Referencia 2, y la mezcla se trata de la misma manera que en el Ejemplo Comparativo 1, para obtener 103 ml de la composición deseada (Ejemplo 1). Concentración de hierro: 55 mg/ml, tamaño de partícula del óxido de hierro magnético: 8,8 nm, tamaño de partícula del conjunto: 81 nm, relación en peso polisacárido/hierro: 1,01, magnetización en 1 tesla: 89 emu/1 g de hierro, relajabilidad T_{2}: 270 (mM.seg)^{-1}, tasa de hierro divalente en el hierro total: 24%.

Ejemplo 2

Se añaden porciones de 1, 2 y 4 ml de solución de ácido L-láctico 1 M, y porciones de 4 y 8 ml de solución de ácido L-láctico 2 M a porciones de 200 ml del sol acuoso de complejo de CDX que tiene una viscosidad intrínseca de 0,050 dl/g con el óxido de hierro magnético oxidado (concentración de hierro: 56 mg/ml) preparado de acuerdo con el Ejemplo de Referencia 4, respectivamente, y las mezclas se tratan de la misma manera que en el Ejemplo 1, respectivamente para obtener aproximadamente 200 ml de cada una de las composiciones deseadas (Ejemplos 2-1-5).

1

Ejemplo 3

Se añaden 5 ml de una solución de ácido L-láctico 1 M ajustada a pH 8 con solución acuosa de hidróxido sódico, a 200 ml del sol acuoso de complejo de CDX que tiene una viscosidad intrínseca de 0,050 dl/g con el óxido de hierro magnético oxidado (concentración de hierro: 56 mg/ml) preparado de acuerdo con el Ejemplo de Referencia 4, y la mezcla se trata de la misma manera que en el Ejemplo Comparativo 2, para obtener 205 ml de la composición deseada (Ejemplo 3). Concentración de hierro: 54 mg/ml, tamaño de partícula del óxido de hierro magnético: 8, 6 nm, tamaño de partícula del conjunto: 63 nm, relación en peso polisacárido/hierro: 1,00, magnetización en 1 tesla: 88 emu/1 g de hierro, relajabilidad T_{2}: 210 (mM.seg)^{-1}, tasa de hierro divalente en el hierro total: 5,5%.

Ejemplo 4

Se añaden 2 ml de una solución de ácido L-láctico 2 M a 100 ml del sol acuoso de complejo de dextrano que tiene una viscosidad intrínseca de 0,051 dl/g con el óxido de hierro magnético (concentración de hierro: 56 mg/ml) preparado de acuerdo con el Ejemplo de Referencia 1, y la mezcla se trata de la misma forma que en el Ejemplo 1 para obtener 103 ml de la composición deseada (Ejemplo 4). Concentración de hierro: 54 mg/ml, tamaño de partícula del óxido de hierro magnético: 6,2 nm, tamaño de partícula del conjunto: 83 nm, relación en peso polisacárido/hierro: 0,61, magnetización en 1 tesla: 63 emu/1 g de hierro, relajabilidad T_{2}: 140 (mM.seg)^{-1}, tasa de hierro divalente en el hierro total: 15%.

Ejemplo 5

Se añaden 4 ml de cada una de las soluciones 0,5 M de ácidos monocarboxílicos o de sales solubles en agua de ácidos monocarboxílicos, respectivamente, a porciones de 50 ml del sol acuoso de complejo de CDX que tiene una viscosidad intrínseca de 0,050 dl/g con el óxido de hierro magnético oxidado (concentración de hierro: 56 mg/ml) preparado de acuerdo con el Ejemplo de Referencia 4, y las mezclas se agitan durante 10 minutos, se ajusta el pH en 8 con solución acuosa de hidróxido sódico, se llevan a 100 ml añadiendo agua, se filtran con un filtro de membrana (tamaño de poro: 0,2 \mum) y se ponen en autoclave a 121ºC durante 20 minutos, respectivamente, para obtener 100 ml de las composiciones deseadas (Ejemplos 5-1 a 5-6). Ninguno de los preparados resultantes muestra actividad hipotensora.

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2

Ejemplo 6

Se añaden 2 ml de solución de ácido L-láctico 1 M a 100 ml del sol acuoso de complejo de CDX que tiene una viscosidad intrínseca de 0,120 dl/g con el óxido de hierro magnético oxidado (concentración de hierro: 55 mg/ml) preparado de acuerdo con el Ejemplo de Referencia 5, y la mezcla se trata de la misma manera que en el Ejemplo Comparativo 1, para obtener 103 ml de la composición deseada (Ejemplo 6) . Concentración de hierro: 51 mg/ml, tamaño de partícula del óxido de hierro magnético: 7,7 nm, tamaño de partícula del conjunto: 93 nm, relación en peso polisacárido/hierro: 0,97, magnetización en 1 tesla: 85 emu/1 g de hierro, relajabilidad T_{2}: 245 (mM.seg)^{-1},tasa de hierro divalente en el hierro total: 3,5%.

Ejemplo 7

Se añaden 1,5 ml de solución de ácido L-láctico 1 M a 100 ml del sol acuoso de complejo de CDX que tiene una viscosidad intrínseca de 0,120 dl/g con la ferrita de zinc (concentración de hierro: 42 mg/ml, concentración de zinc: 16 mg/ml) preparada de acuerdo con el Ejemplo de Referencia 6, y la mezcla se trata de la misma manera que en el Ejemplo Comparativo 1, para obtener 102 ml de la composición deseada (Ejemplo 7) . Concentración de hierro: 40 mg/ml, concentración de zinc: 15 mg/ml, tamaño de partícula del metal magnético: 10,1 nm, tamaño de partícula del conjunto: 110 nm, relación en peso polisacárido/metal: 1,31, magnetización en 1 tesla: 29 emu/1 g de hierro, relajabilidad T_{2}: 25 (mM.seg)^{-1}.

Ejemplo 8

Se añaden 2 ml de solución de ácido L-láctico 1 M a 100 ml del sol acuoso de complejo de dextrano carboximetilado que tiene una viscosidad intrínseca de 0,115 dl/g y un grado de sustitución de 0,26 moles/unidad de glucosa con el óxido de hierro magnético (concentración de hierro: 56 mg/ml) preparado de acuerdo con el Ejemplo de Referencia 7, y la mezcla se trata de la misma manera que en el Ejemplo Comparativo 1, para obtener 103 ml de la composición deseada (Ejemplo 8) . Concentración de hierro: 54 mg/ml, tamaño de partícula del óxido de hierro magnético: 7,4 nm, tamaño de partícula del conjunto: 70 nm, relación en peso polisacárido/hierro: 2,11, magnetización en 1 tesla: 83 emu/1 g de hierro, relajabilidad T_{2}: 140 (mM.seg)^{-1}, tasa de hierro divalente en el hierro total: 15%.

Ejemplo 9

Se añaden 2 ml de solución de ácido L-láctico 1 M a 100 ml del sol acuoso de complejo de CDX que tiene una viscosidad intrínseca de 0,050 dl/g con el óxido de hierro magnético (concentración de hierro: 55 mg/ml) preparado de acuerdo con el Ejemplo de Referencia 8, y la mezcla se trata de la misma manera que en el Ejemplo 1, para obtener 100 ml de la composición deseada (Ejemplo 9). Concentración de hierro: 54 mg/ml, tamaño de partícula del óxido de hierro magnético: 4,5 nm, tamaño de partícula del conjunto: 39 nm, relación en peso polisacárido/hierro: 1,07, magnetización en 1 tesla: 74 emu/1 g de hierro, relajabilidad T_{2}: 70 (mM.seg)^{-1},tasa de hierro divalente en el hierro total: 9,3%.

Ejemplo 10

Se añaden 4,5 ml de solución de ácido L-láctico 1 M y 7,8 g de manitol a 100 ml de la composición obtenida en el Ejemplo de Referencia 4 (concentración de hierro: 56 mg/ml), se añade solución de hidróxido sódico 3 N para llevar el pH a 9, y después se añade agua para llevar el volumen total a 224 ml (concentración de hierro: 25 mg/ml). Mientras se lleva a cabo la filtración con filtro de membrana (tamaño de poros: 0,2 \mum), se vierten en ampollas porciones de la mezcla de 3 ml, se introduce nitrógeno en las ampollas, y el contenido se pone en autoclave y se esteriliza a 121ºC durante 20 minutos, respectivamente, para obtener el preparado de sol acuoso complejo deseado (Ejemplo 10) . Este preparado puede utilizarse como agente de contraste de MRI.

Ejemplo 11

Se añaden 11 ml de tampón de fosfato 1 M a 100 ml de la composición obtenida en el Ejemplo 2-5 (concentración de hierro: 53 mg/ml), se añade solución de hidróxido sódico 3 N para llevar el pH a 7, y después se añade agua para llevar el volumen total a 530 ml (concentración de hierro: 10 mg/ml). Mientras se lleva a cabo la filtración con filtro de membrana (tamaño de poros: 0,2 \mum), se vierten en frascos esterilizados porciones de la mezcla de 10 ml, respectivamente, para obtener el preparado de sol acuoso complejo deseado (Ejemplo 10). Este preparado puede utilizarse como agente de contraste de MRI.

Ejemplo 12

Se añaden 4,3 g de dextrano 40 a 100 ml de la composición obtenida en el Ejemplo 2-4 (concentración de hierro: 54 mg/ml), se añade solución de hidróxido sódico 3 N para llevar el pH a 7, y después se añade agua para llevar el volumen total a 216 ml (concentración de hierro: 25 mg/ml). Mientras se lleva a cabo la filtración con filtro de membrana (tamaño de poros: 0,2 \mum), se vierten en frascos esterilizados porciones de la mezcla de 4 ml, respectivamente, se lleva a cabo la liofilización, y se introduce gas argón en los mismos para obtener el preparado en polvo de complejo deseado. Este preparado puede utilizarse como agente de contraste de MRI disolviéndolo en solución salina fisiológica en el momento de su uso.

Ejemplo 13

Se añaden 110 g de hidroxipropilcelulosa a 100 ml de la composición obtenida en el Ejemplo 1 (concentración de hierro: 55 mg/ml), se añade solución de hidróxido sódico 3 N para llevar el pH a 7, y después se añade agua para llevar el volumen total a 5.500 ml (concentración de hierro: 1 mg/ml). Mientras se lleva a cabo la filtración con filtro de membrana (tamaño de poros: 0,45 \mum), se vierten en recipientes de material plástico esterilizados porciones de la mezcla de 100 ml, respectivamente, para obtener el preparado de sol acuoso de complejo deseado. Este preparado puede utilizarse oralmente como agente de contraste de MRI.

Ejemplo de ensayo 1

Se investigó el efecto sobre el número de plaquetas, respectivamente, mediante los soles acuosos de complejo preparados en los Ejemplos de Referencia, Ejemplos Comparativos y Ejemplos descritos anteriormente. La sangre para el testigo fue tomada de cada conejo de 2 a 3 kg de peso, y las soluciones de ensayo fueron administradas por vía intravenosa a los animales, respectivamente, en una cantidad de 5 mg de metal o metales/0,5 ml/kg cada uno. Se extrajo sangre de cada uno de los animales 5 minutos después, se añadió EDTA a la misma, se diluyó 101 veces con solución de oxalato amónico al 1%, la solución resultante se puso en un hemocitómetro, y se midió el número de plaquetas mediante un microscopio con contraste de fases (método de Brecher y Cronkite). Los resultados se muestran en la Tabla 3.

Ejemplo de ensayo 2

Se determinaron las toxicidades agudas (LD_{50}), respectivamente, de los soles acuosos de complejo preparados en los Ejemplos de Referencia, Ejemplos comparativos y Ejemplos descritos anteriormente. Porciones de 5, 10, 20, 40 y 80 mmol/kg, en términos de metal o metales, de cada sol acuoso de complejo, fueron administradas intravenosamente a grupos de ratones de raza dd de cinco semanas de edad (machos), consistiendo cada grupo en 5 animales, respectivamente, se observó su supervivencia o su muerte durante 2 semanas, y después se calcularon los valores de LD_{50} por el método de Litchfield y Wilcoxon. Los valores de LD_{50} de los soles acuosos de complejo se muestran en la Tabla 4.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 3

3

TABLA 4

4

Ejemplo de ensayo 3

Se fotografiaron imágenes de MR in vivo usando el preparado de sol acuoso de complejo obtenido en el Ejemplo 10. A saber, porciones de 20 \mumol/kg en términos de metal o metales de este preparado fueron administradas por vía intravenosa a ratas de raza Wistar que tenían implantado un tumor de Novikoff en el hígado, respectivamente, se fotografió usando el método de spín-eco a un tiempo de repetición de 400 mseg y un tiempo de eco de 25 mseg, usando un aparato de MRI para animales producido por Sisco Co. (California, EE.UU.), para obtener imágenes de MR en los sitios del hígado. Estas imágenes se muestran en las Figuras (A), (B), (C) y (D). (A) y (B) en la Fig. 1 son imágenes de MR antes de la administración de este preparado y (C) y (D) en la Fig. 1 son imágenes de MR a los 60 minutos después de la administración de este preparado.

Ejemplo de ensayo 4

Se realizó el examen histopatológico de los pulmones administrando a los animales los dos soles acuosos de complejo preparados en el Ejemplo Comparativo 1 y el Ejemplo 2-3. A saber, porciones de 5 mmol/kg en términos de metal o metales de cada sol acuoso de complejo fueron administradas por vía intravenosa a grupos de ratones de raza dd de cinco semanas de edad (machos), consistiendo cada grupo en 5 animales, respectivamente, se realizó la autopsia 5 minutos después y se extirparon los pulmones, se obtuvieron preparados de los tejidos, se realizó tinción con azul de Berlin, y los preparados resultantes se observaron al microscopio óptico.

En el grupo al que se administró el sol acuoso de complejo del Ejemplo Comparativo 1, se observaron émbolos en el pulmón de cada uno de los ratones. En la Fig. 2 (A) se muestra una microfotografía de un ejemplo de estos. Por otra parte, en el grupo al que se administró el sol acuoso de complejo del Ejemplo 2-3, no se observaron émbolos en el pulmón de ninguno de los ratones. En la Fig. 2 (B) se muestra una microfotografía de un ejemplo de estos.

Además, se llevó a cabo el mismo ensayo que en el caso de los ratones en cobayas de raza Hartley (machos) y conejos blancos japoneses (hembras y machos) y se obtuvieron resultados similares.

Aplicabilidad industrial

Como se describió anteriormente, la composición que contiene partículas ultrafinas de óxido metálico magnético de esta invención, que no tiene efectos secundarios tales como la agregación de las plaquetas, es excelente en cuanto a seguridad para los organismos vivos, y no tiene una influencia nociva sobre los organismos vivos ni siguiera cuando se administra por vía intravascular, y por tanto es útil en campos tales como los fármacos para medicinas y para diagnóstico, en particular como agente de contraste de MRI.

Claims

1. Una composición que contiene partículas ultrafinas de óxido metálico magnético, que comprende un sol acuoso de un complejo de las partículas ultrafinas del óxido metálico magnético con al menos una sustancia elegida entre un polisacárido, un derivado de polisacárido y una proteína; y un ácido orgánico monocarboxílico, que tiene uno o más grupos hidroxilo y/o uno o más grupos amino.

2. La composición según la reivindicación 1, en la que el óxido metálico magnético es un óxido representado por la fórmula

(I)(M^{II}O)_{l}\cdot M_{2}{}^{III}O_{3}

3. La composición según la reivindicación 2, en la que el óxido metálico magnético es un óxido de hierro magnético en el que M^{II} de la fórmula (I) es hierro divalente y M^{III} es hierro trivalente.

4. La composición según la reivindicación 3, en la que el contenido de hierro divalente del óxido de hierro magnético es 10 por ciento en peso, o menos, del hierro total, en términos de metal hierro.

5. La composición según la reivindicación 1, en la que el complejo es un complejo del óxido metálico magnético con al menos una sustancia elegida entre dextrano y carboxidextrano.

6. La composición según la reivindicación 1, en la que el complejo contiene al menos una sustancia elegida entre el polisacárido, el derivado de polisacárido y la proteína en una cantidad de 0,1 a 5 partes en peso por peso de metal o metales en el óxido metálico magnético.

7. La composición según la reivindicación 1, en la que el tamaño medio de partícula de las partículas ultrafinas de óxido metálico magnético está en el intervalo de 2 a 30 nm.

8. La composición según la reivindicación 1, en la que el complejo tiene un diámetro de partículas en el intervalo de 10 a 500 nm.

9. La composición según la reivindicación 1, en la que la magnetización en 1 tesla del complejo está en el intervalo de 10 a 150 emu por g de metal.

10. La composición según la reivindicación 1, en la que el complejo es sustancialmente superparamagnético.

11. El complejo según la reivindicación 1, en el que el complejo tiene una relajabilidad T_{2} en el intervalo de 5 a 1.000 (seg.mM)^{-1}.

12. La composición según la reivindicación 1, en la que el ácido orgánico monocarboxílico es un ácido soluble en agua.

13. La composición según la reivindicación 1, en la que el ácido orgánico monocarboxílico es un ácido que tiene 10 átomos de carbono o menos.

14. La composición según la reivindicación 1, en la que el ácido orgánico monocarboxílico es un ácido que contiene uno o más grupos hidroxilo.

15. La composición según la reivindicación 1, en la que el ácido orgánico monocarboxílico es un ácido que contiene uno o más grupos amino.

16. La composición según la reivindicación 1, en la que el ácido orgánico monocarboxílico es un ácido monocarboxílico alifático que tiene 6 átomos de carbono o menos y que tiene uno o más grupos hidroxilo o uno o más grupos amino.

17. La composición según la reivindicación 1, en la que el ácido orgánico monocarboxílico es ácido láctico.

18. La composición según la reivindicación 1, que contiene el ácido orgánico monocarboxílico en una cantidad en el intervalo de 1 mmol a 30 moles por mol de metal o metales en el complejo.

19. La composición según la reivindicación 1, que tiene un pH en el intervalo de 4 a 11.

20. Un agente de contraste para MRI que consiste en la composición según la reivindicación 1.

21. La composición según la reivindicación 1, para ser usada en un método para diagnostico de lesiones, que comprende administrar dicha composición a una persona o un animal y hacer fotografías de contraste de MRI del sistema reticuloendotelíal de la persona o el animal.

22. El uso de la composición según la reivindicación 1, para la confección de un preparado para ser usado en un método para diagnosticar lesiones, que comprende administrar dicho preparado a una persona o un animal y hacer fotografías de contraste de MRI del sistema reticuloendotelial de la persona o el animal.

23. Un procedimiento para producir una composición que contiene partículas ultrafinas de óxido metálico magnético, que comprende un sol acuoso de un complejo de las partículas ultrafinas de óxido metálico magnético con al menos una sustancia elegida entre un polisacárido, un derivado de polisacárido y una proteína, y un ácido orgánico monocarboxílico, que tiene uno o más grupos hidroxilo y/o uno o más grupos amino, caracterizado porque dicho ácido orgánico monocarboxílico es mezclado con dicho sol acuoso de complejo.

24. El procedimiento según la reivindicación 23, en el que el óxido metálico magnético es un óxido representado por la fórmula

(I)(M^{II}O)_{1}\cdot M_{2}{}^{III}O_{3}

en la que M^{II} representa un átomo de metal divalente, M^{III} representa un átomo de metal trivalente y 1 es un número en el intervalo de 0 \leq 1 \leq 1.

25. El procedimiento según la reivindicación 24, en el que el óxido metálico magnético es un óxido de hierro magnético en el que M^{II} de la fórmula (I) es hierro divalente y M^{III} es hierro trivalente.

26. El procedimiento según la reivindicación 25, en el que el contenido de hierro divalente del óxido de hierro magnético es 10% en peso, o menos, del hierro total, en términos de metal hierro.

27. El procedimiento según la reivindicación 23, en el que el complejo es un complejo del óxido metálico magnético con al menos una sustancia elegida entre dextrano y carboxidextrano.

28. El procedimiento según la reivindicación 23, en el que el complejo es un complejo del óxido metálico magnético con al menos una sustancia elegida entre polisacáridos, derivados de polisacárido y proteínas, en una cantidad de 0,1 a 5 partes en peso por parte en peso del metal o metales en el óxido metálico magnético.

29. El procedimiento según la reivindicación 23, en el que el ácido orgánico monocarboxílico o la sal de ácido monocarboxílico, o una solución acuosa de los mismos, se añade al sol acuoso del complejo, en el que dicho ácido orgánico monocarboxílico se mezcla con dicho sol acuoso de complejo en una cantidad de 1 mmol a 30 moles por mol de metal o metales en dicho complejo, y en el que la composición se ajusta a un pH en el intervalo de 4 a 11.

30. El procedimiento según las reivindicaciones 23 ó 29, en el que el ácido orgánico monocarboxílico es un ácido que tiene 10 átomos de carbono o menos.

31. El procedimiento según las reivindicaciones 23 ó 29, en el que el ácido orgánico monocarboxílico es un ácido que contiene uno o más grupos hidroxilo.

32. El procedimiento según las reivindicaciones 23 ó 29, en el que el ácido orgánico monocarboxílico es un ácido que contiene uno o más grupos amino.

33. El procedimiento según las reivindicaciones 23 ó 29, en el que el ácido orgánico monocarboxílico es un ácido monocarboxílico alifático que tiene 6 átomos de carbono o menos y que tiene uno o más grupos hidroxilo o uno o más grupos amino.

34. El procedimiento según las reivindicaciones 23 ó 29, en el que el ácido orgánico monocarboxílico es ácido láctico.

35. El procedimiento según la reivindicación 23, en el que el tamaño medio de partícula de las partículas ultrafinas de óxido metálico magnético está en el intervalo de 2 a 30 nm, y en el que el complejo tiene un diámetro total en el intervalo de 10 a 500 nm, la magnetización a 1 (uno) tesla está en el intervalo de 10 a 150 emu por g de metal, es de propiedades sustancialmente superparamagnéticas, y la relajabilidad T_{2} está en el intervalo de 5 a 1.000 (seg.mM)^{-1}.

36. El procedimiento según la reivindicación 23, en el que el sol acuoso de partículas ultrafinas de óxido metálico magnético se prepara mediante un método de coprecipitación con álcali que comprende mezclar una solución acuosa que contiene una sal de metal divalente con una base de manera que el pH esté en el intervalo de 7 a 12, opcionalmente calentar y envejecer, redispersar el óxido metálico magnético en agua después de la separación y el lavado con agua del óxido metálico magnético precipitado; y añadir un ácido mineral hasta que el pH del líquido sea de 1 a 3;

o mediante un método de intercambio iónico que comprende añadir una solución acuosa que contiene una sal ferrosa y una sal férrica en una relación molar de 1:2 a una suspensión de una resina de intercambio iónico fuertemente básica, con agitación, manteniendo el pH en el intervalo de 8 a 9; añadir un ácido mineral hasta que el pH del líquido sea de 1 a 3; y separar por filtración la resina para obtener un sol acuoso de óxido de hierro magnético y opcionalmente purificar y/o concentrar dicho sol acuoso mediante diálisis, ultrafiltración o centrifugación; y en el que el sol acuoso de óxido metálico magnético así obtenido y un polisacárido, un derivado de polisacárido o una proteína, o una solución de los mismos, se mezclan en una cantidad tal que la relación en peso del óxido metálico magnético a polisacáridos y/o proteína está en el intervalo de 1:1 a 1:6 en términos de metal o metales, a una temperatura en el intervalo entre la temperatura ambiente y 120ºC, durante 10 minutos a 10 horas, seguido por purificación.

37. El procedimiento según la reivindicación 23, en el que el sol acuoso de partículas ultrafinas de óxido metálico magnético se prepara mezclando y haciendo reaccionar en presencia de un polisacárido y/o una proteína una solución acuosa de sal metálica mixta que contiene una sal de metal divalente con una solución acuosa básica.

38. Un procedimiento para preparar un agente de contraste para MRI que comprende añadir uno o varios coadyuventes aceptables fisiológicamente a la composición preparada según la reivindicación 23.