KR100191699B1

KR100191699B1 - 크로마토그래피에 의해 인슐린을 정제하는 방법

Info

Publication number: KR100191699B1
Application number: KR1019910015402A
Authority: KR
Inventors: 디크하르트 라이너; 웅게르 베른하르트; 헤프너 레온하르트
Original assignee: 무명씨; 훽스트 악티엔게젤샤프트
Priority date: 1990-09-05
Filing date: 1991-09-04
Publication date: 1999-06-15
Anticipated expiration: 2011-09-04
Also published as: FI98216C; NZ239650A; YU147591A; HUT59418A; CZ283356B6; ATE128145T1; SK278099B6; PL291616A1; CA2050644C; LV10105B; IL99384A; RU2037500C1; PT98864A; PT98864B; EP0474213A1; CS271791A3; LTIP713A; NO913476D0; FI98216B; US5245008A

Abstract

본 발명은 양쪽성 이온을 함유하거나, 용매 혼합물의 pH가 정제시키고자 하는 인슐린 또는 인슐린 유도체의 등전점(isoelectric point)에 근접한 값을 가지며 양쪽성 이온이 존재하는, 수-혼화성 유기 용매를 함유하는 수성의 완충 용매 중에서, 친유적으로 개질된 실리카겔상하에 크로마토그래피시킴으로써 인슐린 및 인슐린 유도체를 정제하는 방법에 관한 것이다.

Description

크로마토그래피에 의해 인슐린을 정제하는 방법

본 발명은 양쪽성 이온이 수성 완충 용매에 용해되어 있고/있거나, 용매의 pH가 정제시키고자 하는 인슐린 또는 인슐린 유도체의 등전점(isolectric point)에 근접한 값을 갖는, 수-혼화성 유기 용매를 함유하는 수성의 완충 용매중에서, 친유적으로 개질된(lipophilically modified) 실리카겔상하에 크로마토그래피시킴으로써, 인슐린 및/또는 인슐린 유도체를 정제하는 방법에 관한 것이다.

친유적으로 개질된(가역상) 실리카겔상에서 인슐린 또는 인슐린 유도체를 정제하는 방법은 분석 분리법으로부터 공지되어 있으며, 수년 동안 고압 액체 크로마토그래피(HPLC)로 성공적으로 이용되어져 왔다[참조 : WS Welinder 등, J Chrom., 361, 1986, 357 - 367]. 분석적 규모로, 1㎍ 범위의 양의 단백질을, 개질된 실리카겔로 충전되어 있으며, 강철, 유리 또는 플라스틱으로 제조된 컬럼에 적하시킨 후, 유동액 혼합물(통상적으로, 유기 용매 농도가 일정하거나 가변적인 산성 완충 수용액)로 용출시킨다. 이러한 경우에 있어서, 적하되는 단백질은 컬럼 용적의 301㎍/ml 보다 훨씬 적다.

종래의 정제 공정에서는 실험실에서 사용되며 상당한 유독성(아세토니트릴) 및 부식성을 갖는 비경제적 완충 성분(예 : 테트라알킬암모늄염, 알킬설포네이트, 헥사플루오로아세톤, 트리플루오로아세테이트 등)인 용매가 종종 사용되어졌다[참조 : E. P. Kroeff 등, J. Chrom., 461, (1989), 45-61]. 상기한 이동상은, 혼합물에 인슐린-유사 물질이 보다 많이 함입될 경우, 품질, 주성분의 수율 및 최종 수율면에서 만족스러울 정도로 예비 분리시키지 못한다[참조 : J. Rivier, R. McClintock; J. Chrom., 268 (1983) 112-119; Peter et al., J. Chrom. 408 (1987) 43-52].

인슐린에는, 예를 들어 강한 산성 에스테르 분해 공정 또는 효소성(트란스-)펩티드화 공정과 같은 예비 화학적 변형 또는 결정화 등에 의한 정제 공정으로부터, 통상적으로 이와 유사한 특성을 갖는 부수물이 함입된다. 이들은, 전하량 차가 충분할 경우, 이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제하거나 특정 pH치를 선택함으로써 정체할 수 있다[참조 : 미합중국 특허 제4,129,560호]. 상기한 방법의 단점은 침전물의 후처리시 상등액 중의 유용물이 희석되고 이에 따라 손실되며, 공정 시간이 상당히 길고, 최종 회수량 및 수율이 낮다는 사실에 있다.

원칙적으로, 컬럼 함유물, 적하량 및 용출제의 도입량을 증가시킴으로써 예비 분리할 수 있다. 여기에 필요한 유기 용매의 양은 예를 들어, 직경이 20cm 이상인 컬럼의 경우 ㎥ 규모로 존재한다. 분석 HPLC용 용매(예 : 아세토니트릴, DMF, 메탄올 및 디옥산 등)는 독성이어서, 상기 방법을 공업적 제조 규모로 이용할 경우 정교한 보호성 측정이 요구된다.

본 발명의 목적은 인슐린의 생물학적 활성이 유지되고, 일회의 크로마토그래피 단계, 짧은 주기 시간 및 50회 이상의 크로마토그래피 주기 중에서도 유용하게 사용가능한 컬럼을 사용하여 시간이 지연되는 충전 공정없이 실리카겔 정지상이 재생되면서 고순도가 수득되며, 비독성 용매를 사용할 수 있어서, 공업적 제조 규모가 가능한, 인슐린 및 인슐린 유도체를 크로마토그래피로 정제하는 방법을 개발하는 것이다.

본 발명에 의해, 양쪽성 이온이 완충 용매에 용해되어 있거나, 용매의 pH가 정제시키고자 하는 인슐린 또는 인슐린 유도체의 등전점에 근접한 값을 갖고 양쪽성 이온이 존재하는 수-혼화성 유기 용매를 함유하는 수성의 완충 용매중에서 친유적으로 개질된 실리카겔상하에 크로마토그래피함으로써 인슐린 및 인슐린 유도체를 정제할 수 있음이 밝혀졌다.

놀랍게도, 양쪽성 이온이 존재하거나, 정제시키고자 하는 인슐린 또는 인슐린 유도체의 등전점 pH에 근접하고 양쪽성 이온이 존재하는 용매중에서 크로마토그래피하면, 목적하는 생성물과 불순물이 양호하게 분리될 뿐만 아니라, 정지상(친유적으로 개질된 실리카겔)으로부터 단백질이 양호하게 분리된다. 이러한 분리 공정은 정제되어야 할 인슐린-유사 성분이 매우 많이 혼입된 인슐린 용액의 경우에도 수행되는데, 예를 들어 인슐린 및 인슐린 유도체로부터 A21-데아미도인슐린을 분리할 수 있다. 또한, 고체상으로부터 단백질을 양호하게 분리할 수 있다는 것은, 컬럼 충전물이 유용 수명이 길며 인슐린의 최종 회수율을 높게 만들 수 있다는 사실을 의미한다.

따라서, 본 발명은 양쪽성 이온이 완충 용매에 용해되어 있거나, 용매 혼합물의 pH가 정제시키고자 하는 인슐린 또는 인슐린 유도체의 등전점에 근접한 값을 가지며 양쪽성 이온이 존재하는, 수-혼화성 유기용매를 함유하는 수성의 완충 용매중에서, 친유적으로 개질된 실리카겔상하에 크로마토그래피함으로써 인슐린 및/또는 인슐린 유도체를 정제하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 공정에서는, 예를 들어 동물 또는 사람을 포함한 모든 종의 인슐린, 프로인슐린(proinsulin) 또는 프리프로인슐린(preproinsulin)과 같은 인슐린 전구체 또는 유전적으로 변형된 미생물에 의해 발현되는 재조합 인슐린 또는 인슐린 유도체와 같은 모든 인슐린을 사용할 수 있다. 또한, 예를 들어 화학적 또는 효소적 유도체화에 의해 제조된, 예를 들어 De-Phe-B1-인슐린, 인슐린-β-케텐-설포네이트, 디아르기닌-인슐린(B31, B32), 모노아르기닌-인슐린 또는 디페닐알라닌-인슐린(B31, B32)과 같은 인슐린 유도체도 사용할 수 있다[참조 : 미합중국 특허 제4,601,852호].

하기 일반식(I)의 인슐린 유도체를 사용하는 것이 바람직하다:

상기식에서,

R³⁰은 유전적으로 암호화될 수 있는 L-아미노산의 잔기이며,

X는 하이드록실 그룹, 원래 염기성이고 탄소수가 50 이하인

생리학적으로 허용되는 유기 그룹, 또는 존재하는 말단 카복실작용기가 적당히 에스테르 작용기, 아미드 작용기 또는 락톤으로서 유리되거나 CH₂OH으로 환원될 수 있는, 유전적으로 암호화될 수 있는 L-아미노산이고,

n은 0 내지 10의 정수이며,

Y는 수소 또는 L-페닐알라닌이고,

A쇄 및 B쇄는 동물 또는 사람 인슐린의 서열이다.

R³⁰이 L-알라닌 또는 L-트레오닌이고, X가 L-아르기닌, L-리신 또는 L-페닐알라닌으로 이루어진 그룹중에서 선택된 하나 이상의 L-아미노산인 일반식(I)의 인슐린 유도체를 사용하는 것이 특히 바람직하다.

인슐린 및 인슐린 유도체는 상당히 불순한 상태 또는 예비 정제된(예를 들어, 겔 크로마토그래피에 의해) 형태로 사용할 수 있다. 수희의 결정화 및 겔 크로마토그래피 후에도, 인슐린에는, 분자량이 매우 유사하고, 적당히 선택된 pH에서 전하 상태가 서로 다르고 인슐린과도 다르나 인슐린과 착물을 형성하는 인슐린-유사 부수물이 여전히 함입되어 있다[참조 : 미합중국 특허 제4,129,560호]. 이러한 물질의 예에는 데아미도인슐린, 아르기닌인슐린, 디아르기닌인슐린, 인슐린 에틸 에스테르 등이 있다.

친유적으로 개질된 실리카겔은 소수성 매트릭스가 부착된 실리카겔을 의미한다. 소수성 매트릭스의 예에는 쇄 길이가 탄소수 3 내지 20인 알칸이 있다. 특히 바람직한 친유적으로 개질된 실리카겔 기재의 예에는, 각종 입자 크기가 451μm 이하이고 기공폭이 100Å이며 C8- 또는 C18-개질된 구형 및 비구형 물질인^(R)뉴클레오실[^(R)Nucleosil; Macherey Nagel 시판]; 각종 입자 크기가 401μm 이하이고 기공폭이 60 내지 250Å이며 C8-C18-개질된 구형 및 비구형 기재인^(R)리크로프레프[^(R)Lichroprep; Merck 시판]; 입자 크기가 251μm 이하이고 C8-개질된 구형 기재인^(R)리크로스페어 셀렉트 B[^(R)Lichrospher Select B; Merck 시판]; 입자 크기가 50 내지 1051μm이고 기공폭이 100Å이며 C18-개질된 비구형 물질인^(R)워터 프레프[^(R)Water-Prep]; 입자 크기가 101μm 이하이고 기공폭이 100Å이며 C8-개질된 구형 기재인^(R)졸박스 프로 10[^(R)Zorbax Pro10; Dupont 시판]; 및 입자 크기가 161μm 이하이고 기공폭이 100, 150 또는 200Å이며 C4-, C8-, C18-개질된 구형 기재인^(R)크로마실[^(R)Kromasil; EKA Nobel 시판]이 있다.

양쪽성 이온은 양자를 포획하고 제거할 수 있는 화합물, 즉 산성용액 중에서는 양이온을 형성하고 알칼리성 용액중에서는 음이온을 형성하는 화합물(예 : α-아미노산, 베타인 또는 베타인 유도체)이다. 바람직한 양쪽성 이온은 글리신, 글루타민 또는 베타인(N,N,N-트리메틸글리신)이다. 글리신이 특히 바람직하다.

인슐린 또는 인슐린 유도체의 등전점(IEP)은 용해된 인슐린의 양이온 전하수와 음이온 전하수가 0인 인슐린 용액의 pH이다. 예를 들어, 돼지 인슐린의 IEP는 pH 5.3 내지 5.4이다[참조 : H. Neurath, K. Bailey, Protein Hormones, Vo. II/A, The Proteins, p 636]. 용어 등전점에 근접한은 특히 정제되어야 할 인슐린의 등전점 전후로 약 1pH 단위의 pH 값을 의미한다. 특히 바람직한 pH 값은 등전점 전후로 0.5 pH 단위 이하에 상당하는 pH 값이다.

용출제는 pH를 일정하게 유지하기 위해 완충제를 함유한다. 적합한 완충제에 대해서는 문헌에 공지되어 있으며, 예를 들어 인산염, 알칼리금속 또는 알칼리토금속 염(예 : 시트르산나트륨, 아세트산칼륨, 암모늄 시트레이트, 아세테이트, 설페이트 또는 클로라이드)이 있다. 용출제는 추가로 예를 들어 알콜, 케톤, 메틸 아세테이트, 디옥산, 디메틸 설폭사이드 또는 아세토니트릴과 같은 수-혼화성 유기 용매를 함유한다. n-또는 이소-프로판을, 메탄올 또는 에탄올, 또는 메틸아세테이트와 같은 알콜류가 바람직하다.

수-혼화성 유기 용매의 농도는 1 내지 90%, 바람직하게는 10 내지 60%, 특히 바람직하게는 10 내지 35%이다. 완충제의 농도는, 용매로서의 물을 기준으로 하여, 1mmol/ℓ 내지 2mol/ℓ, 바람직하게는 25mmol/ℓ 내지 1mol/ℓ이다. 양쪽성 이온의 농도는 넓은 범위내에서 다양할 수 있다. 유리하게는, 용매로서의 물을 기준으로 하여, 10mmol/ℓ 내지 1mol/ℓ, 바람직하게는 20 내지 500mmol/ℓ이다.

크로마토그래피시키는 동안의 온도는 0 내지 50℃, 바람직하게는 15 내지 30℃, 특히 바람직하게는 15 내지 20℃이다. 크로마토그래피 시키는 동안의 작동압은 거의 일정하다. 크로마토그래피는 각종 압력에서 수행할 수 있는데, 예를 들어 크로마토그래피는 5 내지 400bar, 특히 20 내지 100bar의 압력하에서 수행할 수 있다.

인슐린 및 인슐린 유도체의 컬럼 적하, 크로마토그래피 및 용출을 공지된 통상의 산업적 방법으로 수행한다. 정제되어야 할 인슐린 용액의 컬럼 적하는 수성-알코올 완충액 또는 순수한 수성완충액을 사용하여 수행하는 것이 바람직하다. 인슐린 용액의 단백질 함량은 1 내지 10%, 바람직하게는 3%이다.

본 발명에 따른 공정에 있어서, 인슐린은 일정 농도의 완충제의 이소크레틱한(isocratical) 존재하에서 용출시키거나 완충제중의 수-혼화성 유기 용매의 함량을 변화시키면서 용출시킨다. 유기 용매의 함량은 사용되는 유기 용매의 농도를 용출 용적의 함수, 특히 바람직하게는 선형 함수로서 증가시키도록 변화시킨다.

크로마토그래피시킨 후, 아연을 사용하여 침전시키거나 결정화시킴으로써, 인슐린을 용출제로부터 실제적으로 분리할 수 있다. 이와 관련해서, 용매는, 진공증류에 의해 용액으로부터 실제적으로 제거할 수 있어나, 물로 희석시킴으로써 그 농도를 감소시킬 수 있다. 모든 경우에 있어서, 침전시키거나 결정화시키기 전의 용매 농도는, 상등액 중의 단백질 함량을 50mg/ℓ 미만으로 유지시키기 위해, 10% 이하이어야 한다. 생성된 순수한 인슐린 침전물은 경사분리, 원심분리 또는 여과에 의해 분리할 수 있고, 건조시킬 수 있다.

본 발명에 따른 방법은 분석 크로마토그래피용으로 뿐만 아니라 예비 크로마토그래피용으로도 적합하며, 특히 본 발명에 따른 방법은 예비 HPLC 시스템으로 수행한다.

용어 예비 크로마토그래피는 단순히 분석하는 것이 아니라 순수한 생성물을 수득하는 것을 목적으로 하는 정제 방법을 의미한다. 순수한 생성물의 양은 넓은 범위내에서 다양할 수 있는데, 예를 들어 1mg 내지 50kg, 바람직하게는 50mg 내지 15kg일 수 있다.

본 발명에 다른 방법은 하기 실시예로 보다 상세하게 기술할 것이다. 다른 특정한 언급이 없는 한, 백분율 데이터는 중량에 대한 것이다.

[실시예 1]

트리플루오로아세트산을 사용하여 분해한 사람 인슐린 B 30-디-3급 부틸 에스테르/에테르로부터 수득한 단백질 함량이 79.1%인 사람 인슐린(HI) 3.5g을 컬럼에 적하시킨다. 혼합 장치가 장착된 적합한 고압 펌프를 사용하여 완충액 A 및 B를 혼합하여 인슐린을 용출시킴으로써 14 내지 20%의 프로판올 구배를 생성시킨다. 45ml/분으로 펌핑하면서, 23분 후에 프로판올 약 17.5%에서 인슐린을 용출시킨다.

결정화된 사람 인슐린(HI)을 분별화 및 분리시키면, 97% 단백질을 함유하는 생성물이 제1분획으로서 88.5%의 수율로 수득되고 단백질 함량이 85.7%인 제2분획이 7.5%의 수율로 수득된다. 이리하여, 총 회수율은 최초 인슐린의 96.0%가 된다.

[실시예 2]

고압 펌프를 사용하여, 사람 인슐린 디-3급-부틸 에스테르/에테르를 에스테르 분해 반응시킴으로써 수득한 사람 인슐린(HI; 단백질 함량 : 86.1%) 7.0g을 pH 2.8의 0.1M 글리신/HCl 완충제중의 3% 농도의 용액 형태로 컬럼에 적하시킨다. 그후, 가압하에서 n-프로판올 구배 중의 상기 완충액을 용출시킨다. 프로판올의 농도는 60분에 걸쳐 14 내지 17.5%로 증가된다. 상기한 방법으로 분별화 및 결정화시키면, 단백질 함량이 98.7%인 생성물이 생성된다. 정제된 사람 인슐린의 수율은 사용된 인슐린의 91%이다.

[실시예 3]

pH 2.8의 0.1M 글리신/HCl 완충제 200ml에 용해된, 트립신을 포함하는 돼지 인슐린의 아미드 교환반응(transamidation)으로부터 수득한 반응 혼합물 10g 용액을 컬럼에 적하시킨다. 각각의 단백질 성분을, 프로판올 농도를 14 내지 30%로 증가시키면서, 40ml/분의 유동속도에서 120분에 걸쳐 개별적으로 용출시킨다. 결정화시키거나 침전시키고 건조시킨 후에 수득된 제1분획은 순도가 97%이상이고 수율이 사용된 인슐린을 기준으로 하여 93%인 사람 인슐린 B30-디-3급 부틸 트레오닌 에스테르/에테르이다.

[실시예 4]

0.1M 글리신/HCl 용액 100ml 중의 트리플루오로아세트산을 사용하여 사람 인슐린 B30-디-3급 부틸 트레오닌 에스테르/에테르를 분리시킴으로써 수득한 HI 7.5g을 컬럼으로 펌핑시키고 80ml/분의 유동속도로 용출시킨다. 완충제 B의 농도는 60분에 걸쳐 18 내지 25%로 증가시킨다. 이 경우에 있어서, 보유시간(RT)은 약 37분이다. 결정화 및 건조시킨 후, 제1분획으로부터 초기 HI의 96.8%를 97% 이상의 순도로 분리하고, 제2분획으로부터 HI의 2.2%를 50% 미만의 순도로 분리한다.

[실시예 5]

컬럼 용적 1ℓ당 소 인슐린 8g을 0.1M 글리신/HCl 완충제와 함께 30% 완충제 B로 평형화된 컬럼에 가한다. 완충제 B의 농도는 90분에 걸쳐 80%(즉, 18% 메틸 아세테이트)로 증가시킨다. 65분 후에, 제1분획으로 순도가 97.5% 이상이고 수율이 63.5%인 용출된 소 인슐린을 물로 희석시킨 후, 염화아연으로 침전시킨다. 총 회수율은 92.5%이다.

[실시예 6]

트리플루오로아세트산을 사용하여 사람 인슐린 B30-디-3급 부틸트레오닌 에스테르/에테르를 분리시킴으로써 수득한, 순도가 약 92%인 사람 인슐린 4g(8g/ℓ)을 컬럼에 적하시킨다. 완충제 B 18 내지 25%를 90분에 걸쳐 적하시키면, 45분 후에, 사람 인슐린이 순도가 97% 이상이고 수율이 91.8%인 제1분획 및 수율이 4.7%인 제2분획으로 용출된다.

[실시예 7]

돼지 인슐린 18g을 pH 3.0의 0.1M 글리신/HCl 완충제 1.8ℓ로 용출시키는 컬럼상으로 5% n-프로판올과 함께 도입시킨다. 성분을 9% 완충제 B(13.6% n-프로판올)로부터 11% 완충제 B(14.4% n-프로판올)로 70분 내에 변화시킨다. 50분 후에, 돼지 인슐린은 단백질 함량이 98% 이상이고 수율이 89%인 제1분획으로 용출된다. 총 회수율은 초기량의 96.8%이다.

[실시예 8]

유전 공학적으로 생성된, 단백질 함량이 89.5%인 사람 인슐린 4g을 pH가 3.0인 0.1M 글리신 완충제에 용해시켜 2% 농도의 단백질 용액으로 만들고 고압 펌프에 의해 컬럼으로 펌핑한다. 13 내지 16% n-프로판올로부터 80ml/분의 유동 속도로 70분에 걸쳐 선상 경사 적하시킴으로써 용출시킨다. 분별화 및 결정화시키면, 단백질 함량이 98%인 사람 인슐린이 93% 수율의 제1분획으로 수득된다. 총 회수율은 초기량의 98%이다.

[실시예 9]

유전 공학적으로 생성된 단백질 함량이 86.2%인 사람 인슐린 4.5g을 pH가 3.0인 글리신 완충제 250ml에 용해시킨 후 컬럼으로 펌핑시킨다. 2개의 고압 펌프를 사용하여 2종류의 완충제 A 및 B로부터 선상 경사 적하시킴으로써 단백질을 크로마토그래피한다. 100분 후에, 33%의 에탄올 농도 및 80ml/분의 일정 유동 속도에서 용출시킨다. 분별화 및 결정화시키면, 단백질 함량이 96%인 사람 인슐린이 제1분획으로 생성되는데, 총 회수율은 출발물질을 기준으로 하여 93%이다.

[실시예 10]

유전 공학적으로 생성된 인슐린을 가공함으로써 유도된 조 사람 인슐린 4.6g을 수성 글리신 완충제 200ml에 용해시킨 후, 크로마토그래피용 50x250mm HPLC 컬럼에 펌핑시킨다. 컬럼 기재는 2개의 고압 펌프를 사용하여 완충제 A와 완충제 B를 혼합함으로써 13%의 메틸 아세테이트 농도에서 예비 평형화시킨다. 적하시킨 후, 사람 인슐린은 13 내지 17%의 메틸 아세테이트로부터 90분에 걸쳐 선상 경사 적하시킴으로써 용출시킨다. 용출액을 결정화시킴으로써 제1분획을 분리한다. 단백질 함량이 96%인 사람 인슐린 3.8g이 수득된다. 이 경우에 있어서, 총 회수율은 출발물질을 기준으로 하여 90%이다.

[실시예 11]

고압 펌프를 사용하여, 사람 인슐린 디-3급 부틸 에스테르/에테르를 에스테르 분해반응시킴으로써 단백질 함량이 79%인 사람 인슐린 3g을 pH가 3.0인 0.1M 베타인/HCl 아세트산 중의 3% 농도의 용액 형태로 컬럼에 적하시킨다. 상기한 완충 시스템을 사용하여 44% 완충제 B에서 이소크래틱하게 용출시킨다. 보유 시간은 약 35분이다. 분별화시키면, 98.1%의 사람 인슐린이 수율 80.5%인 제1분획으로 수득된다. 총 회수율은 90.5%이다.

[실시예 12]

고압 펌프로 사용하여, 사람 인슐린 디-3급-부틸 에스테르/에테르를 에스테르 분해반응시킴으로써 수득한 단백질 함량이 73%인 사람 인슐린 6g을 pH가 3.0인 0.1M 아황산 중의 3% 농도액의 형태로 컬럼에 적하시킨다. 그후, 25% 내지 28%의 완충제 B를 경사 적하시킴으로써 상기한 완충 시스템으로 용출시킨다. 보유 시간은 약 25분이다. 분별화시키면, 98.6%의 사람 인슐린이 수율 65%인 제1분획으로 수득된다. 총 회수율은 88.5%이다.

[실시예 13]

트리플루오로아세트산을 사용하여 사람 인슐린 디-3급-부틸 트레오닌 에스테르/에테르를 분해반응시킴으로써 수득한 사람 인슐린 5g을 3% 농도액으로 컬럼에 적하시킨 후 32 내지 42% 완충제 B로 용출시킨다. 보유 시간은 40분이다. 분별화 및 결정화시키면, 순도가 92.7%인 제1분획 72%가 수득된다. 총 회수율은 초기량의 76%이다.

[실시예 14]

트리플루오로아세트산을 사용하여 사람 인슐린 디-3급-부틸 트레오닌 에스테르/에테르를 분해반응시킴으로써 수득한 사람 인슐린 3g을 pH가 3.0인 0.1M 글리신 완충제 중의 3% 농도액의 형태로 컬럼에 적하시킨 후, 34 내지 35%의 완충제 B를 용출시킨다. 보유 시간은 45분이다. 분별화, 결정화 및 건조시키면, 순도가 94.8%인 제1분획 57% 및 순도가 84%인 제2분획 16%가 수득된다.

[실시예 15]

컬럼을 실시예 14에서와 같이 적하시킨다. 보유 시간은 약 40분이다. 분별화, 결정화 및 건조시키면, 순도가 97.5%인 제1분획 중에서 사용된 초기 사람 인슐린의 51%가 수득되고 제2분획 중에서 사용된 초기 사람 인슐린의 4%가 수득된다.

[실시예 16]

컬럼을 33% 완충제 B로 평형화시키고, 트리플루오로아세트산을 사용하여 분해시킴으로써 수득한 사람 인슐린[실시예 14 참조] 6g을 pH가 8.5인 0.1M 트리스 완충제 중의 30% 농도액의 형태로 적하시킨다. 약 35분 후에 용출된다. 분별화 및 결정화시키면, 순도가 96.6%인 사람 인슐인이 수율 86%인 제1분획으로 수득된다. 총 회수율은 95%이다.

[실시예 17]

트리플루오로아세트산을 사용하여 분해시킴으로써 수득한 사람 인슐린[실시예 14 참조] 6g을 상기한 바와 같이 컬럼에 적하시킨다. 인슐린을 40분의 보유 시간으로 용출시키고, 21 내지 25%의 완충제 B를 60분 내에 경사 적하시킨다. 제1분획은 97.5%의 순도로 초기 생성물의 91%를 함유한다. 총 회수율은 96%이다.

[실시예 18]

실시예 17에서와 같이 적하시키고 경사 적하시킨다. 35분 후에 용출시킨다. 제1분획은 96.5%의 순도로 초기량의 사람 인슐린의 90%를 함유한다. 총 회수율은 93%이다.

[실시예 19 내지 24]

실시예 19 내지 24에서의 크로마토그래피는 실시예 14에서의 조건과 동일한 조건하에서 수행한다. 단지, 완충제 또는 양쪽성 이온의 양이 변할 뿐이다.

[실시예 19]

[실시예 20]

0.1M 글리신을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 16의 완충제와 동일.

[실시예 21]

0.1M 글리신을 가하는 것을 제외하고는 실시예 15의 완충제와 동일.

[실시예 22]

[실시예 23]

pH가 5.4이고, 글리신 베타인 대신 0.1M 글리신을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 22의 완충제와 동일.

[실시예 24]

pH가 6.0이고, 0.1M 글리신을 가하는 것을 제외하고는 실시예 13의 완충제와 동일.

[실시예 25]

표 1은 인슐린의 수율 및 순도를 pH 및/또는 용출제 중의 양쪽성 이온의 함수로서 요약한 것이다.

Claims

양쪽성 이온이 완충 용매에 용해되어 있거나, 용매 혼합물의 pH가 정제시키고자 하는 인슐린 또는 인슐린 유도체의 등전점(isoelectric point) 전후로 1pH 단위 이내이며 양쪽성 이온이 존재하는, 수-혼화성 유기 용매를 함유하는 수성의 완충 용매 중에서 친유적으로 개질된 실리카겔상하에 크로마토그래피시킴으로써, 인슐린 및/또는 인슐린 유도체를 정제하는 방법.
제1항에 있어서, 용매 혼합물의 pH가 정제시키고자 하는 인슐린 또는 인슐린 유도체의 등전점 전후로 0.5pH 단위 이내인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, α-아미노산 또는 베타인이 양쪽성 이온으로서 사용되는 방법.
제3항에 있어서, 글리신, 글루탐산 또는 글리신 베타인이 양쪽성 이온으로서 사용되는 방법.
제1항에 있어서, 하기 일반식(I)인 인슐린 유도체가 사용되는 방법.

상기식에서, R³⁰은 유전적으로 암호화될 수 있는 L-아미노산의 잔기이며, X는 하이드록실 그룹, 원래 염기성이고 탄소수가 50 이하인 생리학적으로 허용되는 유기 그룹, 또는 존재할 수도 있는 말단 카복실 작용기가 에스테르 작용기, 아미드 작용기 또는 락톤으로서 유리되거나 CH₂OH으로 환원될 수 있는, 유전적으로 암호화될 수 있는 L-아미노산이고, n은 0 내지 10의 정수이며, Y는 수소 또는 L-페닐알라닌이고, A쇄 및 B쇄는 동물 또는 사람 인슐린의 서열이다.
제5항에 있어서, 일반식(I)에서의 R³⁰이 L-알라닌 또는 L-트레오닌이고, X가 L-아르기닌, L-리신 또는 L-페닐알라닌으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 L-아미노산인 방법.
제1항에 있어서, 예비 고압 액체 크로마토그래피 시스템이 이용되는 방법.