JP3161770B2 - クロマトグラフィーによるインスリンの精製方法 - Google Patents
クロマトグラフィーによるインスリンの精製方法Info
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- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
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- C07K14/62—Insulins
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Description
【０００１】本発明は、水混和性有機溶媒を含有する水
性、緩衝溶媒中、親油性に改質したシリカゲル上でのク
ロマトグラフィーによるインスリンおよび／またはイン
スリン誘導体の精製方法に関し、水性、緩衝溶媒中には
両性イオンを溶解させることおよび／または溶媒のpHを
精製すべきインスリンもしくはインスリン誘導体の等電
点の近傍とすることを特徴とするものである。
性、緩衝溶媒中、親油性に改質したシリカゲル上でのク
ロマトグラフィーによるインスリンおよび／またはイン
スリン誘導体の精製方法に関し、水性、緩衝溶媒中には
両性イオンを溶解させることおよび／または溶媒のpHを
精製すべきインスリンもしくはインスリン誘導体の等電
点の近傍とすることを特徴とするものである。
【０００２】インスリンまたはインスリン誘導体の、親
油性に改質した（逆相）シリカゲル上での精製は、分析
的分離方法として知られていて、何年も前から高圧液体
クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の形で使用して好結果
が得られている（WS Welinderら：J. Chromatogr., 36
1, 357〜367, 1986)。分析のスケールでは、μgの範囲
の蛋白量が、改質シリカゲルを充填し、スチール、ガラ
スまたはプラスチックで作られたカラム上に負荷され、
ついで流動液体混合物（通常は、一定のまたは変動する
濃度で有機溶媒を含有する酸性の、水性緩衝溶液）によ
って溶出される。この場合負荷される蛋白質は、カラム
容量１mlあたり３０μgよりもはるかに少ない。
油性に改質した（逆相）シリカゲル上での精製は、分析
的分離方法として知られていて、何年も前から高圧液体
クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の形で使用して好結果
が得られている（WS Welinderら：J. Chromatogr., 36
1, 357〜367, 1986)。分析のスケールでは、μgの範囲
の蛋白量が、改質シリカゲルを充填し、スチール、ガラ
スまたはプラスチックで作られたカラム上に負荷され、
ついで流動液体混合物（通常は、一定のまたは変動する
濃度で有機溶媒を含有する酸性の、水性緩衝溶液）によ
って溶出される。この場合負荷される蛋白質は、カラム
容量１mlあたり３０μgよりもはるかに少ない。
【０００３】現時点での精製方法は、実験室で採用され
る、比較的毒性の強い（アセトニトリル）溶媒や、腐蝕
性の、高価な緩衝成分たとえばテトラアルキルアンモニ
ウム塩、アルキルスルホネート、ヘキサフルオロアセト
ン、トリフルオロアセテートを使うことが多い(E.P. Kr
oeffら、J. Chromatogr, 461, 45〜61, 1989)。これら
の移動相では、混合物にインスリン様物質がさらに強度
に夾雜している場合、品質、主要成分の収量および総回
収率の点で満足できる分取による分離を達成できない
（J. River，R. McClintock，J. Chromatogr，268，112
〜119，1983；Peterら、J. Chromatogr，408、43〜52，
1987)。
る、比較的毒性の強い（アセトニトリル）溶媒や、腐蝕
性の、高価な緩衝成分たとえばテトラアルキルアンモニ
ウム塩、アルキルスルホネート、ヘキサフルオロアセト
ン、トリフルオロアセテートを使うことが多い(E.P. Kr
oeffら、J. Chromatogr, 461, 45〜61, 1989)。これら
の移動相では、混合物にインスリン様物質がさらに強度
に夾雜している場合、品質、主要成分の収量および総回
収率の点で満足できる分取による分離を達成できない
（J. River，R. McClintock，J. Chromatogr，268，112
〜119，1983；Peterら、J. Chromatogr，408、43〜52，
1987)。
【０００４】前段階での化学的変換たとえば強酸性エス
テル切断、酵素的ペプチド交換、結晶化による精製等か
らのインスリンは通常、類似の性質の付随物を含有す
る。これらは、電荷の差が十分であればイオン交換クロ
マトグラフィーにより、特定のpH値を選ぶことによって
精製できる（米国特許第４ １２９ ５６０号）。この方
法の欠点は、その希釈効果でしたがって沈殿の後処理時
における貴重な物質の上清中への喪失、比較的長いサイ
クル時間、または総回収率したがって収率が低いことで
ある。
テル切断、酵素的ペプチド交換、結晶化による精製等か
らのインスリンは通常、類似の性質の付随物を含有す
る。これらは、電荷の差が十分であればイオン交換クロ
マトグラフィーにより、特定のpH値を選ぶことによって
精製できる（米国特許第４ １２９ ５６０号）。この方
法の欠点は、その希釈効果でしたがって沈殿の後処理時
における貴重な物質の上清中への喪失、比較的長いサイ
クル時間、または総回収率したがって収率が低いことで
ある。
【０００５】カラムの含量、負荷量および溶出液の通過
量を拡大することにより、原理的には分取による分離を
達成することは可能である。この場合に必要な有機溶媒
の量は、たとえば直径２０cmを越えるカラムの場合、m3
の規模である。分析的ＨＰＬＣに用いられる溶媒（たと
えば、アセトニトリル、ＤＭＦ、メタノール、ジオキサ
ン等）は毒性があるので、これらの方法を工業的な分取
規模で使用するためには、念入りな保護手段の準備が要
求される。
量を拡大することにより、原理的には分取による分離を
達成することは可能である。この場合に必要な有機溶媒
の量は、たとえば直径２０cmを越えるカラムの場合、m3
の規模である。分析的ＨＰＬＣに用いられる溶媒（たと
えば、アセトニトリル、ＤＭＦ、メタノール、ジオキサ
ン等）は毒性があるので、これらの方法を工業的な分取
規模で使用するためには、念入りな保護手段の準備が要
求される。
【０００６】本発明の目的は、インスリンおよびインス
リン誘導体のクロマトグラフィーによる精製方法を開発
することであった。すなわち、インスリンの生物活性が
維持され、１回のクロマトグラフィー工程で高純度が達
成され、サイクル時間は短く、カラムは５０クロマトグ
ラフィーサイクル以上の有効寿命、時間のかかる充填過
程を要しない固定シリカゲル相の再生および非毒性溶媒
の使用が達成され、したがって工業的分取規模を可能に
する方法である。
リン誘導体のクロマトグラフィーによる精製方法を開発
することであった。すなわち、インスリンの生物活性が
維持され、１回のクロマトグラフィー工程で高純度が達
成され、サイクル時間は短く、カラムは５０クロマトグ
ラフィーサイクル以上の有効寿命、時間のかかる充填過
程を要しない固定シリカゲル相の再生および非毒性溶媒
の使用が達成され、したがって工業的分取規模を可能に
する方法である。
【０００７】本発明は、水混和性有機溶媒を含有する水
性緩衝溶媒中、親油性に改質したシリカゲル上でのクロ
マトグラフィーにおいて、両性イオンを緩衝溶液中に溶
解させるか、または溶媒混合物のpHを精製すべきインス
リンもしくはインスリン誘導体の等電点の近傍とし、両
性イオンを存在させる方法により、インスリンまたはイ
ンスリン誘導体の精製が可能であることを発見したもの
である。
性緩衝溶媒中、親油性に改質したシリカゲル上でのクロ
マトグラフィーにおいて、両性イオンを緩衝溶液中に溶
解させるか、または溶媒混合物のpHを精製すべきインス
リンもしくはインスリン誘導体の等電点の近傍とし、両
性イオンを存在させる方法により、インスリンまたはイ
ンスリン誘導体の精製が可能であることを発見したもの
である。
【０００８】両性イオンの存在、または精製すべきイン
スリンもしくはインスリン誘導体の等電点の近傍におけ
る溶媒のpHで両性イオンの存在下でのクロマトグラフィ
ーは、驚くべきことに、所望の生成物と不純物の良好な
分離のみでなく、固定相（親油性に改質したシリカゲ
ル）からの蛋白質の良好な脱着をも生じる。この分離方
法はインスリン様成分が著しく夾雑してインスリン溶液
でも精製することを可能にし、たとえばインスリンまた
はインスリン誘導体からＡ２１−デアミドインスリンを
分離することもできる。しかも、固相からの蛋白質の好
都合な脱着は、カラム充填剤が長い有効寿命をもつこと
と、インスリンの高い総収率の達成が可能になることを
意味する。
スリンもしくはインスリン誘導体の等電点の近傍におけ
る溶媒のpHで両性イオンの存在下でのクロマトグラフィ
ーは、驚くべきことに、所望の生成物と不純物の良好な
分離のみでなく、固定相（親油性に改質したシリカゲ
ル）からの蛋白質の良好な脱着をも生じる。この分離方
法はインスリン様成分が著しく夾雑してインスリン溶液
でも精製することを可能にし、たとえばインスリンまた
はインスリン誘導体からＡ２１−デアミドインスリンを
分離することもできる。しかも、固相からの蛋白質の好
都合な脱着は、カラム充填剤が長い有効寿命をもつこと
と、インスリンの高い総収率の達成が可能になることを
意味する。
【０００９】本発明はしたがって、水混和性有機溶媒を
含有する水性、緩衝溶媒中、親油性に改質したシリカゲ
ル上でのクロマトグラフィーによるインスリンおよび／
またはインスリン誘導体の精製方法において、両性イオ
ンを緩衝溶媒中に溶解させるか、または溶媒混合物のpH
を精製すべきインスリンもしくはインスリン誘導体の等
電点の近傍とし、両性イオンを存在させる方法に関す
る。
含有する水性、緩衝溶媒中、親油性に改質したシリカゲ
ル上でのクロマトグラフィーによるインスリンおよび／
またはインスリン誘導体の精製方法において、両性イオ
ンを緩衝溶媒中に溶解させるか、または溶媒混合物のpH
を精製すべきインスリンもしくはインスリン誘導体の等
電点の近傍とし、両性イオンを存在させる方法に関す
る。
【００１０】本発明の方法には、すべてのインスリン、
たとえば動物もしくはヒト起源のあらゆる種のインスリ
ン、インスリン前駆体たとえばプロインスリンもしくは
プレプロインスリン、または遺伝子的に修飾した微生物
によって発現される組換えインスリンもしくはインスリ
ン誘導体を使用できる。さらに、たとえば化学的または
酵素的誘導化によって製造されたインスリン誘導体、た
とえばＤｅ−Ｐｈｅ−Ｂ１−インスリン、インスリン−
β−ケテン−スルホネート、ジアルギニン−インスリン
(Ｂ３１、Ｂ３２)、モノアルギニン−インスリンまたは
ジフェニルアラニン−インスリン(Ｂ３１、Ｂ３２)（米
国特許第４ ６０１ ８５２号）も使用できる。
たとえば動物もしくはヒト起源のあらゆる種のインスリ
ン、インスリン前駆体たとえばプロインスリンもしくは
プレプロインスリン、または遺伝子的に修飾した微生物
によって発現される組換えインスリンもしくはインスリ
ン誘導体を使用できる。さらに、たとえば化学的または
酵素的誘導化によって製造されたインスリン誘導体、た
とえばＤｅ−Ｐｈｅ−Ｂ１−インスリン、インスリン−
β−ケテン−スルホネート、ジアルギニン−インスリン
(Ｂ３１、Ｂ３２)、モノアルギニン−インスリンまたは
ジフェニルアラニン−インスリン(Ｂ３１、Ｂ３２)（米
国特許第４ ６０１ ８５２号）も使用できる。
【００１１】使用が好ましいインスリン誘導体は式Ｉ
【化２】 で示される。式中、Ｒ30は遺伝子でコードできるＬ−ア
ミノ酸の残基であり、Ｘは、ヒドロキシル基、本来塩基
性であって５０個までの炭素原子を有する生理的に許容
される有機基、遺伝子でコードできるＬ−アミノ酸であ
って存在するその末端カルボキシル基は適宜遊離、エス
テル官能基、アミド官能基、ラクトンまたはＣＨ2ＯＨ
に還元された形のＬ−アミノ酸であり、ｎは０〜１０の
整数であり、ｙは水素またはＬ−フェニルアラニンであ
り、ＡおよびＢ鎖は動物またはヒトインスリンの配列で
ある。
ミノ酸の残基であり、Ｘは、ヒドロキシル基、本来塩基
性であって５０個までの炭素原子を有する生理的に許容
される有機基、遺伝子でコードできるＬ−アミノ酸であ
って存在するその末端カルボキシル基は適宜遊離、エス
テル官能基、アミド官能基、ラクトンまたはＣＨ2ＯＨ
に還元された形のＬ−アミノ酸であり、ｎは０〜１０の
整数であり、ｙは水素またはＬ−フェニルアラニンであ
り、ＡおよびＢ鎖は動物またはヒトインスリンの配列で
ある。
【００１２】使用がとくに好ましいインスリン誘導体は
式Ｉにおいて、Ｒ30がＬ−アラニンまたはＬ−スレオニ
ンであり、ＸはＬ−アルギニン、Ｌ−リジンまたはＬ−
フェニルアラニンからなる群よりのＬ−アミノ酸１個ま
た２個以上のインスリン誘導体である。
式Ｉにおいて、Ｒ30がＬ−アラニンまたはＬ−スレオニ
ンであり、ＸはＬ−アルギニン、Ｌ−リジンまたはＬ−
フェニルアラニンからなる群よりのＬ−アミノ酸１個ま
た２個以上のインスリン誘導体である。
【００１３】インスリンおよびインスリン誘導体は、比
較的不純な状態および精製前の形（たとえばゲルクロマ
トグラフィーによる）のいずれでも使用できる。結晶化
を何回も反復した後でも、またゲルクロマトグラフィー
後にも、インスリンはまだ、分子量がきわめて類似した
インスリン様の夾雜物を含んでいる。適当に選ばれたpH
ではそれらの電荷状態は互いにまたはインスリンと異な
るが、インスリンと複合体を形成する。このような物質
の例には、デアミノインスリン、アルギニン−およびジ
アルギニン−インスリン、インスリンエチルエステル等
がある。
較的不純な状態および精製前の形（たとえばゲルクロマ
トグラフィーによる）のいずれでも使用できる。結晶化
を何回も反復した後でも、またゲルクロマトグラフィー
後にも、インスリンはまだ、分子量がきわめて類似した
インスリン様の夾雜物を含んでいる。適当に選ばれたpH
ではそれらの電荷状態は互いにまたはインスリンと異な
るが、インスリンと複合体を形成する。このような物質
の例には、デアミノインスリン、アルギニン−およびジ
アルギニン−インスリン、インスリンエチルエステル等
がある。
【００１４】親油性に改質されたシリカゲルとは、疎水
性マトリックスを表面上に付着させたシリカゲルを意味
する。疎水性マトリックスの例には、鎖長３〜２０の炭
素原子をもつアルカンがある。親油性に改質されたシリ
カゲルのとくに好ましい例には以下の物質がある。
性マトリックスを表面上に付着させたシリカゲルを意味
する。疎水性マトリックスの例には、鎖長３〜２０の炭
素原子をもつアルカンがある。親油性に改質されたシリ
カゲルのとくに好ましい例には以下の物質がある。
【００１５】RNucleosil：Macherey ＆ Nagelによって
供給されている。球形および非球形物質、粒子径は４５
μmまで多様、孔径１００Å、Ｃ８−またはＣ１８−改
質。RLichroprep：Merckによつて供給されている。球形
および非球形物質、粒子径は４０μmまで多様、孔径６
０〜２５０Å、Ｃ８〜Ｃ１８−改質。
供給されている。球形および非球形物質、粒子径は４５
μmまで多様、孔径１００Å、Ｃ８−またはＣ１８−改
質。RLichroprep：Merckによつて供給されている。球形
および非球形物質、粒子径は４０μmまで多様、孔径６
０〜２５０Å、Ｃ８〜Ｃ１８−改質。
【００１６】RLichrospher Select B：Merckによって供
給されている。球状物質、粒子径２５μmまで、Ｃ８−
改質。RWaters Prep：Ｃ１８−改質、５０〜１０５μm
非球状、孔径１００Å。
給されている。球状物質、粒子径２５μmまで、Ｃ８−
改質。RWaters Prep：Ｃ１８−改質、５０〜１０５μm
非球状、孔径１００Å。
【００１７】RZorbax Pro １０：DuPontによって供給さ
れている。Ｃ８−改質、１０μm、球状、孔径１００
Å。RKromasil：EKA Nobelによって供給されている。Ｃ
４−、Ｃ８〜Ｃ１８−改質、１６μmまで、球状、孔径
１００、１５０または２００Å。
れている。Ｃ８−改質、１０μm、球状、孔径１００
Å。RKromasil：EKA Nobelによって供給されている。Ｃ
４−、Ｃ８〜Ｃ１８−改質、１６μmまで、球状、孔径
１００、１５０または２００Å。
【００１８】両性イオンは、プロトンを取り込みそれを
消失させることができる化合物、すなわち酸性溶液にお
いては陽イオンを、アルカリ性溶液においては陰イオン
を形成する化合物で、たとえばα−アミノ酸、ベタイン
またはベタイン誘導体である。好ましい両性イオンは、
グリシン、グルタミンまたはベタイン（Ｎ,Ｎ,Ｎ−トリ
メチルグリシン）である。グリシンはとくに好ましい。
消失させることができる化合物、すなわち酸性溶液にお
いては陽イオンを、アルカリ性溶液においては陰イオン
を形成する化合物で、たとえばα−アミノ酸、ベタイン
またはベタイン誘導体である。好ましい両性イオンは、
グリシン、グルタミンまたはベタイン（Ｎ,Ｎ,Ｎ−トリ
メチルグリシン）である。グリシンはとくに好ましい。
【００１９】インスリンまたはインスリン誘導体の等電
点（ＩＥＰ）は、溶解したインスリンの陽イオン性電荷
と陰イオン性電荷の数が０に等しくになるそのインスリ
ン溶液のpHである。たとえば、ブタインスリンのＩＥＰ
はpH５.３と５.４の間である(H. Neurath, K. Bailey,
Protein Hormones, Vol.II／A,The Proteins, 636
頁）。「等電点の近傍」の語は、とくに、精製すべきイ
ンスリンのＩＥＰの上下約１pH単位のpH値を意味する。
とくに好ましいpH値はＩＥＰの上下０.５pH単位までの
値である。
点（ＩＥＰ）は、溶解したインスリンの陽イオン性電荷
と陰イオン性電荷の数が０に等しくになるそのインスリ
ン溶液のpHである。たとえば、ブタインスリンのＩＥＰ
はpH５.３と５.４の間である(H. Neurath, K. Bailey,
Protein Hormones, Vol.II／A,The Proteins, 636
頁）。「等電点の近傍」の語は、とくに、精製すべきイ
ンスリンのＩＥＰの上下約１pH単位のpH値を意味する。
とくに好ましいpH値はＩＥＰの上下０.５pH単位までの
値である。
【００２０】溶出液には、溶出液のpHを一定に保持する
ために、緩衝物質を含有させる。適当な緩衝物質は文献
に知られていて、たとえばリン酸塩、アルカリ金属もし
くはアルカリ土類金属塩たとえばクエン酸ナトリウムま
たは酢酸カリウム、クエン酸、酢酸、硫酸もしくは塩化
アンモニウムである。溶出液にはさらに、水混和性有機
溶媒たとえばアルコール類、ケトン類、酢酸メチル、ジ
オキサン、ジメチルスルホキシドまたはアセトニトリル
が添加される。アルコールたとえばｎ−、iso−プロパ
ノール、メタノールもしくはエタノール、または酢酸メ
チルが好ましい。
ために、緩衝物質を含有させる。適当な緩衝物質は文献
に知られていて、たとえばリン酸塩、アルカリ金属もし
くはアルカリ土類金属塩たとえばクエン酸ナトリウムま
たは酢酸カリウム、クエン酸、酢酸、硫酸もしくは塩化
アンモニウムである。溶出液にはさらに、水混和性有機
溶媒たとえばアルコール類、ケトン類、酢酸メチル、ジ
オキサン、ジメチルスルホキシドまたはアセトニトリル
が添加される。アルコールたとえばｎ−、iso−プロパ
ノール、メタノールもしくはエタノール、または酢酸メ
チルが好ましい。
【００２１】水混和性有機溶媒の濃度は１〜９０％、好
ましくは１０〜６０％、とくに好ましくは１０〜３５％
である。緩衝物質の濃度は、溶媒としての水に基づいて
１mmol／l〜２mmol／l、好ましくは２５mmol／l〜１mmo
l／lである。両性イオンの濃度は広範囲に変動させるこ
とができる。有利な量は、溶媒としての水に基づいて１
０mmol／l〜１mmol／l、好ましくは２０mmol／l〜５０
０mmol／lである。
ましくは１０〜６０％、とくに好ましくは１０〜３５％
である。緩衝物質の濃度は、溶媒としての水に基づいて
１mmol／l〜２mmol／l、好ましくは２５mmol／l〜１mmo
l／lである。両性イオンの濃度は広範囲に変動させるこ
とができる。有利な量は、溶媒としての水に基づいて１
０mmol／l〜１mmol／l、好ましくは２０mmol／l〜５０
０mmol／lである。
【００２２】クロマトグラフィー時の温度は、０℃〜５
０℃、好ましくは１５〜３０℃、とくに好ましくは１５
〜２０℃である。クロマトグラフィー時の操作圧は実質
的に一定とする。クロマトグラフィーは可変圧力で実施
できる。たとえばクロマトグラフィーは５〜４００バー
ルの圧力下に、とくに２０〜１００バール下に行うこと
ができる。
０℃、好ましくは１５〜３０℃、とくに好ましくは１５
〜２０℃である。クロマトグラフィー時の操作圧は実質
的に一定とする。クロマトグラフィーは可変圧力で実施
できる。たとえばクロマトグラフィーは５〜４００バー
ルの圧力下に、とくに２０〜１００バール下に行うこと
ができる。
【００２３】インスリンおよびインスリン誘導体のカラ
ムへの負荷、クロマトグラフィーおよび溶出は、既知
の、慣用の工業的方法によって実施される。精製すべき
インスリンの溶液のカラムへの負荷は、含アルコール水
性または純粋な水性緩衝溶液を用いて行うのが好まし
い。インスリン溶液の蛋白含量は１〜１０％、好ましく
は３％である。
ムへの負荷、クロマトグラフィーおよび溶出は、既知
の、慣用の工業的方法によって実施される。精製すべき
インスリンの溶液のカラムへの負荷は、含アルコール水
性または純粋な水性緩衝溶液を用いて行うのが好まし
い。インスリン溶液の蛋白含量は１〜１０％、好ましく
は３％である。
【００２４】本発明の方法におけるインスリンの溶出
は、緩衝物質の濃度を一定にして（アイソクラクティッ
クに）または緩衝液中の水混和性有機溶媒の含量を変化
させて行われる。有機溶媒の含量は、使用した有機溶媒
の濃度が溶出容量の関数として、とくに好ましくは直線
関数として増加するように変動させる。
は、緩衝物質の濃度を一定にして（アイソクラクティッ
クに）または緩衝液中の水混和性有機溶媒の含量を変化
させて行われる。有機溶媒の含量は、使用した有機溶媒
の濃度が溶出容量の関数として、とくに好ましくは直線
関数として増加するように変動させる。
【００２５】クロマトグラフィー後の溶出液からのイン
スリンの除去は、亜鉛による沈殿または結晶化によって
行われる。これは、真空蒸留によって溶媒を溶液から実
質的に除去するか、またはその濃度を水で希釈して低下
させるかのいずれかによって可能になる。いずれにして
も、上清中の蛋白質含量を＜５０mg／lに保持するため
に、沈殿または結晶化前の溶媒濃度は１０％またはそれ
以下にしなければならない。生成した純粋なインスリン
の沈殿は、傾瀉、遠心分離または濾過によって単純し、
乾燥することができる。
スリンの除去は、亜鉛による沈殿または結晶化によって
行われる。これは、真空蒸留によって溶媒を溶液から実
質的に除去するか、またはその濃度を水で希釈して低下
させるかのいずれかによって可能になる。いずれにして
も、上清中の蛋白質含量を＜５０mg／lに保持するため
に、沈殿または結晶化前の溶媒濃度は１０％またはそれ
以下にしなければならない。生成した純粋なインスリン
の沈殿は、傾瀉、遠心分離または濾過によって単純し、
乾燥することができる。
【００２６】本発明の方法は、分析的クロマトグラフィ
ーの場合のみでなく、分取クロマトグラフィー、とくに
本発明の方法を分取ＨＰＬＣシステムで行う場合にも適
している。
ーの場合のみでなく、分取クロマトグラフィー、とくに
本発明の方法を分取ＨＰＬＣシステムで行う場合にも適
している。
【００２７】「分取クロマトグラフィー」の語は、純粋
な生成物の単なる分析ではなく、その取得の目的での精
製方法を意味する。純粋な生成物の量は広い限界内で、
たとえば１mg〜５０kg、好ましくは５０mg〜１５kgで変
動させることができる。
な生成物の単なる分析ではなく、その取得の目的での精
製方法を意味する。純粋な生成物の量は広い限界内で、
たとえば１mg〜５０kg、好ましくは５０mg〜１５kgで変
動させることができる。
【００２８】本発明の方法を以下の実施例において詳細
に記述する。とくに指示のない限り、百分率のデータは
重量に関するものである。
に記述する。とくに指示のない限り、百分率のデータは
重量に関するものである。
【００２９】実施例１ 緩衝液Ａ：０.２Ｍ硫酸アンモニウム、０.１Ｍグリシ
ン、０.０５Ｍクエン酸ナトリウム、pH５.５、純水溶液 緩衝液Ｂ：０.１Ｍ硫酸アンモニウム、０.１Ｍグリシ
ン、０.０５Ｍクエン酸ナトリウム、pH５.５、水／ｎ−
プロパノール １：１ 吸着体：Nucleosil Ｃ１８、１５〜２５μm球状、孔径
１００Å、Macherey ＆ Nagel(Dueren)より供給 カラム寸法：４０mm×２５０mm ヒトインスリンＢ３０−ジ−tertブチルエステル／エー
テルからトリフルオロ酢酸で切断して得られたヒトイン
スリン（蛋白質含量７９.１％）３.５gをカラムに負荷
する。インスリンは、適当な高圧ポンプを混合装置とと
もに使用し、混合緩衝液ＡおよびＢで、プロパノール勾
配１４〜２０％が生じるように溶出する。インスリン
は、４６ml／分のポンプ作用下に、約１７.５％プロパ
ノール、２３分後に溶出される。
ン、０.０５Ｍクエン酸ナトリウム、pH５.５、純水溶液 緩衝液Ｂ：０.１Ｍ硫酸アンモニウム、０.１Ｍグリシ
ン、０.０５Ｍクエン酸ナトリウム、pH５.５、水／ｎ−
プロパノール １：１ 吸着体：Nucleosil Ｃ１８、１５〜２５μm球状、孔径
１００Å、Macherey ＆ Nagel(Dueren)より供給 カラム寸法：４０mm×２５０mm ヒトインスリンＢ３０−ジ−tertブチルエステル／エー
テルからトリフルオロ酢酸で切断して得られたヒトイン
スリン（蛋白質含量７９.１％）３.５gをカラムに負荷
する。インスリンは、適当な高圧ポンプを混合装置とと
もに使用し、混合緩衝液ＡおよびＢで、プロパノール勾
配１４〜２０％が生じるように溶出する。インスリン
は、４６ml／分のポンプ作用下に、約１７.５％プロパ
ノール、２３分後に溶出される。
【００３０】結晶化したヒトインスリン（ＨＩ）の分画
化および単離により、主分画中に蛋白質含量９７％の生
成物が８８.５％の収率で、第二分画中に蛋白質含量８
５.７％の生成物が７.５％の収率で得られる。したがっ
て、総回収率は最初のインスリンの９６.０％である。
化および単離により、主分画中に蛋白質含量９７％の生
成物が８８.５％の収率で、第二分画中に蛋白質含量８
５.７％の生成物が７.５％の収率で得られる。したがっ
て、総回収率は最初のインスリンの９６.０％である。
【００３１】実施例２ 緩衝液Ａ：０.１Ｍ硫酸アンモニウム、０.１Ｍグリシ
ン、０.０２５Ｍクエン酸ナトリウム、pH５.５、純水溶
液 緩衝液Ｂ：０.０５Ｍ硫酸アンモニウム、０.１Ｍグリシ
ン、０.０２５Ｍクエン酸ナトリウム、pH５.５、水／ｎ
−プロパノール １：１ 吸着体：Nucleosil Ｃ１８−Ｐ、１５〜２５μm球状、
孔径１００Å、Macherey ＆ Nagel 社より供給 カラム寸法：４０mm×２５０mm ヒトインスリンジ−tertブチルエステル／エーテルのエ
ステル切断からのヒトインスリン（ＨＩ）（蛋白質含量
８６.１％）７.０ｇを０.１Ｍグリシン／ＨＣｌ緩衝
液、pH２.８中３％濃度の溶液の形で、高圧ポンプを用
いて、カラムに負荷する。ついで、上述の緩衝液で高圧
下、ｎ−プロパノール勾配で溶出を行う。プロパノール
濃度を１４から１７.５％に６０分間を要して上昇させ
る。上述したと同じ様式で分画化および結晶化を行う
と、蛋白質含量９８.７％の生成物が得られる。精製ヒ
トインスリンの収率は使用したインスリンの９１％であ
る。
ン、０.０２５Ｍクエン酸ナトリウム、pH５.５、純水溶
液 緩衝液Ｂ：０.０５Ｍ硫酸アンモニウム、０.１Ｍグリシ
ン、０.０２５Ｍクエン酸ナトリウム、pH５.５、水／ｎ
−プロパノール １：１ 吸着体：Nucleosil Ｃ１８−Ｐ、１５〜２５μm球状、
孔径１００Å、Macherey ＆ Nagel 社より供給 カラム寸法：４０mm×２５０mm ヒトインスリンジ−tertブチルエステル／エーテルのエ
ステル切断からのヒトインスリン（ＨＩ）（蛋白質含量
８６.１％）７.０ｇを０.１Ｍグリシン／ＨＣｌ緩衝
液、pH２.８中３％濃度の溶液の形で、高圧ポンプを用
いて、カラムに負荷する。ついで、上述の緩衝液で高圧
下、ｎ−プロパノール勾配で溶出を行う。プロパノール
濃度を１４から１７.５％に６０分間を要して上昇させ
る。上述したと同じ様式で分画化および結晶化を行う
と、蛋白質含量９８.７％の生成物が得られる。精製ヒ
トインスリンの収率は使用したインスリンの９１％であ
る。
【００３２】実施例３ 緩衝液Ａ：０.１Ｍ硫酸アンモニウム、０.１Ｍグリシ
ン、０.０２５Ｍ酢酸ナトリウム、pH５.５、純水溶液 緩衝液Ｂ：０.０５Ｍ硫酸アンモニウム、０.１Ｍグリシ
ン、０.０２５Ｍ酢酸ナトリウム、pH５.５、水／ｎ−プ
ロパノール １：１ 吸着剤：Lichrospher Select B、Ｃ８、１５〜２５μ
m、孔径６０Å、Merck社より供給 カラム寸法：５０mm×２５０mm ブタインスリンのトリプシンによるアミド基交換からの
反応混合物１０ｇを２００mlの０.１Ｍグリシン／ＨＣ
ｌ緩衝液、pH２.８に溶解した溶液をカラムに負荷す
る。個々の蛋白質成分は、流速４０ml／分で１２０分を
要し、この間プロパノール濃度を１４から３０％に上昇
させると、分離して溶出される。結晶化または沈殿およ
び乾燥後に得られる主分画は、純度＞９７％のヒトイン
スリンＢ３０−ジ−tertブチルスレオニンエステル／エ
ーテルであり、使用したインスリンに基づく収率は９３
％である。
ン、０.０２５Ｍ酢酸ナトリウム、pH５.５、純水溶液 緩衝液Ｂ：０.０５Ｍ硫酸アンモニウム、０.１Ｍグリシ
ン、０.０２５Ｍ酢酸ナトリウム、pH５.５、水／ｎ−プ
ロパノール １：１ 吸着剤：Lichrospher Select B、Ｃ８、１５〜２５μ
m、孔径６０Å、Merck社より供給 カラム寸法：５０mm×２５０mm ブタインスリンのトリプシンによるアミド基交換からの
反応混合物１０ｇを２００mlの０.１Ｍグリシン／ＨＣ
ｌ緩衝液、pH２.８に溶解した溶液をカラムに負荷す
る。個々の蛋白質成分は、流速４０ml／分で１２０分を
要し、この間プロパノール濃度を１４から３０％に上昇
させると、分離して溶出される。結晶化または沈殿およ
び乾燥後に得られる主分画は、純度＞９７％のヒトイン
スリンＢ３０−ジ−tertブチルスレオニンエステル／エ
ーテルであり、使用したインスリンに基づく収率は９３
％である。
【００３３】実施例４ 緩衝液Ａ：０.１Ｍ塩化ナトリウム、０.１Ｍグリシン、
０.０２５Ｍ酢酸ナトリウム、pH５.５、純水溶液 緩衝液Ｂ：０.０５Ｍ塩化ナトリウム、０.１Ｍグリシ
ン、０.０２５Ｍ酢酸ナトリウム、pH５.５、水／ｎ−プ
ロパノール １：１ 吸着剤：Zorbax Pro １０、Ｃ８、１０μm、DuPont社
より供給 カラム寸法：５cm×２５cm ヒトインスリンＢ３０−ジ−tertブチルスレオニンエス
テル／エーテルの０.１Ｍグリシン／ＨＣｌ溶液１００m
l中トリフルオロ酢酸による切断で得られたＨＩ ７.５
ｇをポンプでカラム上に送り、８０ml／分の流速で溶出
させた。緩衝液Ｂの濃度を６０分間を要して１８から２
５％に上昇させた。この場合の保持時間（ＲＴ）は約３
７分であった。最初のＨＩの９６.８％が主分画から、
結晶化および乾燥後に、＞９７％の純度で単離され、第
二の分画は純度＜５０％のＨＩ ２.２％を含有した。
０.０２５Ｍ酢酸ナトリウム、pH５.５、純水溶液 緩衝液Ｂ：０.０５Ｍ塩化ナトリウム、０.１Ｍグリシ
ン、０.０２５Ｍ酢酸ナトリウム、pH５.５、水／ｎ−プ
ロパノール １：１ 吸着剤：Zorbax Pro １０、Ｃ８、１０μm、DuPont社
より供給 カラム寸法：５cm×２５cm ヒトインスリンＢ３０−ジ−tertブチルスレオニンエス
テル／エーテルの０.１Ｍグリシン／ＨＣｌ溶液１００m
l中トリフルオロ酢酸による切断で得られたＨＩ ７.５
ｇをポンプでカラム上に送り、８０ml／分の流速で溶出
させた。緩衝液Ｂの濃度を６０分間を要して１８から２
５％に上昇させた。この場合の保持時間（ＲＴ）は約３
７分であった。最初のＨＩの９６.８％が主分画から、
結晶化および乾燥後に、＞９７％の純度で単離され、第
二の分画は純度＜５０％のＨＩ ２.２％を含有した。
【００３４】実施例５ 緩衝液Ａ：０.２Ｍ硫酸ナトリウム、０.１Ｍグリシン、
０.０３Ｍ酢酸アンモニウム、pH５.５、１０％酢酸メチ
ル 緩衝液Ｂ：０.０５Ｍ硫酸ナトリウム、０.１Ｍグリシ
ン、０.０３Ｍ酢酸アンモニウム、pH５.５、２０％酢酸
メチル 吸着剤：Kromasil Ｃ８、１３μm、孔径１００Å、EKA
Nobel社により供給 カラム寸法：５cm×２５cm カラム容量１ｌあたりウシインスリン８ｇを、３０％緩
衝液Ｂで平衡化したカラムに、０.１Ｍグリシン／ＨＣ
ｌ緩衝液の補助により適用した。緩衝液Ｂの濃度を、９
０分を要して８０％（＝１８％酢酸メチル）まで上昇さ
せた。ウシインスリンは６５分後に主画分中に＞９７.
５％の純度で溶出し（収率６３.５％）、水で希釈後、
塩化亜鉛で沈殿させた。総回収率は９２.５％であっ
た。
０.０３Ｍ酢酸アンモニウム、pH５.５、１０％酢酸メチ
ル 緩衝液Ｂ：０.０５Ｍ硫酸ナトリウム、０.１Ｍグリシ
ン、０.０３Ｍ酢酸アンモニウム、pH５.５、２０％酢酸
メチル 吸着剤：Kromasil Ｃ８、１３μm、孔径１００Å、EKA
Nobel社により供給 カラム寸法：５cm×２５cm カラム容量１ｌあたりウシインスリン８ｇを、３０％緩
衝液Ｂで平衡化したカラムに、０.１Ｍグリシン／ＨＣ
ｌ緩衝液の補助により適用した。緩衝液Ｂの濃度を、９
０分を要して８０％（＝１８％酢酸メチル）まで上昇さ
せた。ウシインスリンは６５分後に主画分中に＞９７.
５％の純度で溶出し（収率６３.５％）、水で希釈後、
塩化亜鉛で沈殿させた。総回収率は９２.５％であっ
た。
【００３５】実施例６ 緩衝液Ａ：０.１Ｍ硫酸アンモニウム、０.１Ｍグリシ
ン、０.０２５Ｍ酢酸ナトリウム、pH５.５、５％ｎ−プ
ロパノール 緩衝液Ｂ：０.０５Ｍ硫酸アンモニウム、０.１Ｍグリシ
ン、０.０２５Ｍ酢酸ナトリウム、pH５.５、水／ｎ−プ
ロパノール １：１ 吸着剤：Kromasil Ｃ８、１３μm、孔径１００Å、EKA
Nobel社により供給 カラム寸法：５cm×２５cm ヒトインスリンＢ３０−ジ−tertブチルスレオニンエス
テル／エーテルのトリフルオロ酢酸による切断からのヒ
トインスリン（純度約９２％）４ｇ（＝８ｇ／ｌ）を、
カラムに負荷した。９０分を要して１８から２５％への
緩衝液Ｂの勾配を流すと、ヒトインスリンは４５分後に
主分画中に＞９７％の純度で（収率９１.８％）、第二
の分画中に８０.５％の純度で（収率４.７％）溶出し
た。
ン、０.０２５Ｍ酢酸ナトリウム、pH５.５、５％ｎ−プ
ロパノール 緩衝液Ｂ：０.０５Ｍ硫酸アンモニウム、０.１Ｍグリシ
ン、０.０２５Ｍ酢酸ナトリウム、pH５.５、水／ｎ−プ
ロパノール １：１ 吸着剤：Kromasil Ｃ８、１３μm、孔径１００Å、EKA
Nobel社により供給 カラム寸法：５cm×２５cm ヒトインスリンＢ３０−ジ−tertブチルスレオニンエス
テル／エーテルのトリフルオロ酢酸による切断からのヒ
トインスリン（純度約９２％）４ｇ（＝８ｇ／ｌ）を、
カラムに負荷した。９０分を要して１８から２５％への
緩衝液Ｂの勾配を流すと、ヒトインスリンは４５分後に
主分画中に＞９７％の純度で（収率９１.８％）、第二
の分画中に８０.５％の純度で（収率４.７％）溶出し
た。
【００３６】実施例７ 緩衝液Ａ：０.１Ｍ硫酸アンモニウム、０.１Ｍグリシ
ン、０.０２５Ｍ酢酸ナトリウム、pH５.５、１０％ｎ−
プロパノール 緩衝液Ｂ：０.０５Ｍ硫酸アンモニウム、０.１Ｍグリシ
ン、０.０２５Ｍ酢酸ナトリウム、pH５.５、水／ｎ−プ
ロパノール １：１ 吸着剤：Kromasil Ｃ８、１３μm、孔径１００Å、EKA
Nobel社により供給 カラム寸法：１０cm×４０cm １８ｇのブタインスリンを、５％ｎ−プロパノール含有
０.１Ｍグリシン／ＨＣｌ緩衝液、pH３.０、１.８ｌ
中、カラムに導入した。勾配は、７０分で９％緩衝液Ｂ
（＝１３.６％ｎ−プロパノール）から１１％緩衝液Ｂ
（＝１４.４％ｎ−プロパノール）に変化させた。ブタ
インスリンは５０分後に、主分画中、蛋白質含量＞９８
％で溶出した（収率８９％）。総回収率は初期量の９
６.８％であった。
ン、０.０２５Ｍ酢酸ナトリウム、pH５.５、１０％ｎ−
プロパノール 緩衝液Ｂ：０.０５Ｍ硫酸アンモニウム、０.１Ｍグリシ
ン、０.０２５Ｍ酢酸ナトリウム、pH５.５、水／ｎ−プ
ロパノール １：１ 吸着剤：Kromasil Ｃ８、１３μm、孔径１００Å、EKA
Nobel社により供給 カラム寸法：１０cm×４０cm １８ｇのブタインスリンを、５％ｎ−プロパノール含有
０.１Ｍグリシン／ＨＣｌ緩衝液、pH３.０、１.８ｌ
中、カラムに導入した。勾配は、７０分で９％緩衝液Ｂ
（＝１３.６％ｎ−プロパノール）から１１％緩衝液Ｂ
（＝１４.４％ｎ−プロパノール）に変化させた。ブタ
インスリンは５０分後に、主分画中、蛋白質含量＞９８
％で溶出した（収率８９％）。総回収率は初期量の９
６.８％であった。
【００３７】実施例８ 緩衝液Ａ：０.２Ｍ塩化アンモニウム、０.１Ｍグリシ
ン、０.０２５Ｍクエン酸ナトリウム、５％ｎ−プロパ
ノール、pH５.５ 緩衝液Ｂ：緩衝液Ａと同じ、ただし５０％ｎ−プロパノ
ールを添加 吸着剤：Kromasil Ｃ８、１３μm、孔径１００Å、EKA
Nobel社(スェーデン)により供給 カラム寸法：５０mm×２５０mm 遺伝子操作で得られたヒトインスリン（蛋白質含量８
９.５％）４ｇを、０.１Ｍグリシン緩衝液、pH３.０中
に２％蛋白質溶液として溶解し、高圧ポンプでカラム上
に負荷する。溶出は、流速８０ml／分で７０分かけて、
１３％から１６％ｎ−プロパノールの直線勾配によって
行う。分画化および結晶化により、主分画中に蛋白質含
量９８％のヒトインスリンが９３％の収率で得られる。
総回収率は初期量に対して９８％である。
ン、０.０２５Ｍクエン酸ナトリウム、５％ｎ−プロパ
ノール、pH５.５ 緩衝液Ｂ：緩衝液Ａと同じ、ただし５０％ｎ−プロパノ
ールを添加 吸着剤：Kromasil Ｃ８、１３μm、孔径１００Å、EKA
Nobel社(スェーデン)により供給 カラム寸法：５０mm×２５０mm 遺伝子操作で得られたヒトインスリン（蛋白質含量８
９.５％）４ｇを、０.１Ｍグリシン緩衝液、pH３.０中
に２％蛋白質溶液として溶解し、高圧ポンプでカラム上
に負荷する。溶出は、流速８０ml／分で７０分かけて、
１３％から１６％ｎ−プロパノールの直線勾配によって
行う。分画化および結晶化により、主分画中に蛋白質含
量９８％のヒトインスリンが９３％の収率で得られる。
総回収率は初期量に対して９８％である。
【００３８】実施例９ 緩衝液Ａ：０.２Ｍ硫酸アンモニウム、０.１Ｍグリシ
ン、０.０２５Ｍクエン酸アンモニウム、５％エタノー
ル、pH５.５ 緩衝液Ｂ：緩衝液Ａと同じ、ただし５０％エタノールを
添加 吸着剤：Kromasil Ｃ８、１０μm、孔径１００Å、EKA
Nobel社(スェーデン)により供給 カラム寸法：５０mm×２５０mm 遺伝子操作で得られたヒトインスリン（蛋白質含量８
６.２％）４.５ｇを２５０mlのグリシン緩衝液、pH３.
０に溶解し、ついでカラム上にポンプで負荷する。蛋白
質は、２個の高圧ポンプを用い２種の緩衝液ＡとＢから
直線勾配を生成させて、クロマトグラフィーに付す。溶
出は、１００分後、エタノール濃度３３％、一定流速８
０ml／分で起こる。分画化および結晶化により、主分画
中、蛋白質含量９６％のヒトインスリンが得られる。総
回収率は初期物質に対して９３％である。
ン、０.０２５Ｍクエン酸アンモニウム、５％エタノー
ル、pH５.５ 緩衝液Ｂ：緩衝液Ａと同じ、ただし５０％エタノールを
添加 吸着剤：Kromasil Ｃ８、１０μm、孔径１００Å、EKA
Nobel社(スェーデン)により供給 カラム寸法：５０mm×２５０mm 遺伝子操作で得られたヒトインスリン（蛋白質含量８
６.２％）４.５ｇを２５０mlのグリシン緩衝液、pH３.
０に溶解し、ついでカラム上にポンプで負荷する。蛋白
質は、２個の高圧ポンプを用い２種の緩衝液ＡとＢから
直線勾配を生成させて、クロマトグラフィーに付す。溶
出は、１００分後、エタノール濃度３３％、一定流速８
０ml／分で起こる。分画化および結晶化により、主分画
中、蛋白質含量９６％のヒトインスリンが得られる。総
回収率は初期物質に対して９３％である。
【００３９】実施例１０ 緩衝液Ａ：０.２Ｍ塩化アンモニウム、０.１Ｍグリシ
ン、０.０２５Ｍクエン酸ナトリウム、１０％酢酸メチ
ル、pH５.５ 緩衝液Ｂ：緩衝液Ａと同じ塩濃度、ただし２０％酢酸メ
チル 吸着剤：Kromasil Ｃ８、１０μm、孔径１００Å、EKA
Nobel社(スェーデン)により供給 遺伝子操作によるインスリンの後処理から誘導された粗
製ヒトインスリン４.６ｇを２００mlの水性グリシン緩
衝液に溶解し、ついで５０×２５０mmのクロマトグラフ
ィー用ＨＰＬＣカラム上にポンプで負荷する。カラム材
料は、２個の高圧ポンプを用い、緩衝液ＡとＢを混合す
ることにより酢酸メチル濃度１３％に予め平衡化する。
負荷後、ヒトインスリンは、９０分を要して酢酸メチル
１３％から１７％の直線勾配によって溶出する。主生成
物は溶出溶液から結晶化によって単離される。これによ
り蛋白質含量９６％のヒトインスリン３.８ｇが得られ
る。出発原料に基づく総回収率はこの場合、９０％であ
る。
ン、０.０２５Ｍクエン酸ナトリウム、１０％酢酸メチ
ル、pH５.５ 緩衝液Ｂ：緩衝液Ａと同じ塩濃度、ただし２０％酢酸メ
チル 吸着剤：Kromasil Ｃ８、１０μm、孔径１００Å、EKA
Nobel社(スェーデン)により供給 遺伝子操作によるインスリンの後処理から誘導された粗
製ヒトインスリン４.６ｇを２００mlの水性グリシン緩
衝液に溶解し、ついで５０×２５０mmのクロマトグラフ
ィー用ＨＰＬＣカラム上にポンプで負荷する。カラム材
料は、２個の高圧ポンプを用い、緩衝液ＡとＢを混合す
ることにより酢酸メチル濃度１３％に予め平衡化する。
負荷後、ヒトインスリンは、９０分を要して酢酸メチル
１３％から１７％の直線勾配によって溶出する。主生成
物は溶出溶液から結晶化によって単離される。これによ
り蛋白質含量９６％のヒトインスリン３.８ｇが得られ
る。出発原料に基づく総回収率はこの場合、９０％であ
る。
【００４０】実施例１１ 緩衝液Ａ：０.２Ｍ硫酸アンモニウム、０.１Ｍベタイ
ン、０.０５Ｍクエン酸、水酸化ナトリウム溶液によりp
H５.５（純水溶液） 緩衝液Ｂ：０.１Ｍ硫酸アンモニウム、０.１Ｍベタイ
ン、０.０５Ｍクエン酸、水酸化ナトリウム溶液によりp
H５.５（水／イソプロパノール １：１） 吸着剤：Nucleosil Ｃ１８、１５〜２５μm球状、１０
０Å カラム：４０mm×２５０mm 流速：４５ml／分 ヒトインスリンジ−tertブチルエステル／エーテルのエ
ステル切断からのヒトインスリン３ｇ（蛋白質含量７９
％）を０.１Ｍベタイン／ＨＣｌ緩衝液、pH３.０中３％
濃度の溶液の形で、高圧ポンプを用いてカラムに負荷し
た。ついで、上述の緩衝液系により４４％緩衝液Ｂでの
アイソクラティックな溶出を行った。保持時間は約３５
分であった。分画化により、主分画中に９８.１％のヒ
トインスリンが８０.５％の収率で得られた。総回収率
は９０.５％であった。
ン、０.０５Ｍクエン酸、水酸化ナトリウム溶液によりp
H５.５（純水溶液） 緩衝液Ｂ：０.１Ｍ硫酸アンモニウム、０.１Ｍベタイ
ン、０.０５Ｍクエン酸、水酸化ナトリウム溶液によりp
H５.５（水／イソプロパノール １：１） 吸着剤：Nucleosil Ｃ１８、１５〜２５μm球状、１０
０Å カラム：４０mm×２５０mm 流速：４５ml／分 ヒトインスリンジ−tertブチルエステル／エーテルのエ
ステル切断からのヒトインスリン３ｇ（蛋白質含量７９
％）を０.１Ｍベタイン／ＨＣｌ緩衝液、pH３.０中３％
濃度の溶液の形で、高圧ポンプを用いてカラムに負荷し
た。ついで、上述の緩衝液系により４４％緩衝液Ｂでの
アイソクラティックな溶出を行った。保持時間は約３５
分であった。分画化により、主分画中に９８.１％のヒ
トインスリンが８０.５％の収率で得られた。総回収率
は９０.５％であった。
【００４１】実施例１２ 緩衝液Ａ：０.１Ｍ硫酸アンモニウム、０.１Ｍグルタミ
ン酸、０.０５Ｍクエン酸、水酸化ナトリウム溶液でpH
５.５（純水溶液） 緩衝液Ｂ：０.１Ｍ硫酸アンモニウム、０.１Ｍグルタミ
ン酸、０.０５Ｍクエン酸、水酸化ナトリウム溶液でpH
５.５（水／ｎ−プロパノール １：１） 吸着剤：Nucleosil Ｃ１８−Ｐ、１５〜２５μm球状、
１００Å カラム：５０mm×２５０mm 流速：６０ml／分 ヒトインスリンジ−tertブチルエステル／エーテルのエ
ステル切断からのヒトインスリン６ｇ（蛋白質含量７３
％）を、０.１Ｍ酢酸、pH３.０中３％濃度の溶液の形
で、高圧ポンプを用いてカラムに負荷した。ついで、上
述の緩衝液系を用い、緩衝液Ｂ ２５％〜２８％の勾配
で溶出を行った。保持時間は約２５分であった。分画化
により、主分画中に９８.６％のヒトインスリンが６５
％の収率で得られた。総回収率は８８.５％であった。
ン酸、０.０５Ｍクエン酸、水酸化ナトリウム溶液でpH
５.５（純水溶液） 緩衝液Ｂ：０.１Ｍ硫酸アンモニウム、０.１Ｍグルタミ
ン酸、０.０５Ｍクエン酸、水酸化ナトリウム溶液でpH
５.５（水／ｎ−プロパノール １：１） 吸着剤：Nucleosil Ｃ１８−Ｐ、１５〜２５μm球状、
１００Å カラム：５０mm×２５０mm 流速：６０ml／分 ヒトインスリンジ−tertブチルエステル／エーテルのエ
ステル切断からのヒトインスリン６ｇ（蛋白質含量７３
％）を、０.１Ｍ酢酸、pH３.０中３％濃度の溶液の形
で、高圧ポンプを用いてカラムに負荷した。ついで、上
述の緩衝液系を用い、緩衝液Ｂ ２５％〜２８％の勾配
で溶出を行った。保持時間は約２５分であった。分画化
により、主分画中に９８.６％のヒトインスリンが６５
％の収率で得られた。総回収率は８８.５％であった。
【００４２】実施例１３（比較例） 緩衝液Ａ：０.１５Ｍ硫酸アンモニウム、０.１０Ｍトリ
エチルアミン、硫酸でpH６.５（純水溶液） 緩衝液Ｂ：０.０８Ｍ硫酸アンモニウム、０.０５Ｍトリ
エチルアミン、硫酸でpH６.５（水／ｎ−プロパノール
１：１） 吸着剤：Nucleosil Ｃ１８−Ｐ、１５〜２５μm球状、
１００Å カラム：５０mm×２５０mm 流速：６０ml／分 ヒトインスリンジ−tertブチルスレオニンエステル／エ
ーテルのトリフルオロ酢酸による切断からのヒトインス
リン５ｇを、３％濃度の溶液としてカラムに負荷し、つ
いで緩衝液Ｂ ３２〜４２％の間で溶出した。保持時間
は４０分であった。分画化および結晶化により、主分画
中に純度９２.７％の生成物７２％が得られた。総回収
率は初期量の７６％であった。
エチルアミン、硫酸でpH６.５（純水溶液） 緩衝液Ｂ：０.０８Ｍ硫酸アンモニウム、０.０５Ｍトリ
エチルアミン、硫酸でpH６.５（水／ｎ−プロパノール
１：１） 吸着剤：Nucleosil Ｃ１８−Ｐ、１５〜２５μm球状、
１００Å カラム：５０mm×２５０mm 流速：６０ml／分 ヒトインスリンジ−tertブチルスレオニンエステル／エ
ーテルのトリフルオロ酢酸による切断からのヒトインス
リン５ｇを、３％濃度の溶液としてカラムに負荷し、つ
いで緩衝液Ｂ ３２〜４２％の間で溶出した。保持時間
は４０分であった。分画化および結晶化により、主分画
中に純度９２.７％の生成物７２％が得られた。総回収
率は初期量の７６％であった。
【００４３】実施例１４（比較例） 緩衝液Ａ：０.１Ｍクエン酸、０.２Ｍ硫酸アンモニウ
ム、塩酸でpH２.５、純水溶液 緩衝液Ｂ：０.１Ｍクエン酸、０.１Ｍ硫酸アンモニウ
ム、塩酸でpH２.５、水／ｎ−プロパノール １：１ 吸着剤：Nucleosil Ｃ１８、Macherey ＆ Nagel 社に
より供給 カラム：４０×２５０mm 流速：４５ml／分 ヒトインスリンジ−tertブチルスレオニンエステル／エ
ーテルのトリフルオロ酢酸による切断からのヒトインス
リン３ｇを、０.１Ｍグリシン緩衝液、pH３.０中濃度の
溶液の形でカラムに負荷し、ついで緩衝液Ｂ ３４〜３
５％の間で溶出した。分画化し、結晶化し、乾燥する
と、主分画中に初期量の５７％が純度９４.８％で、第
二の分画中に１６％が純度８４％で単離された。
ム、塩酸でpH２.５、純水溶液 緩衝液Ｂ：０.１Ｍクエン酸、０.１Ｍ硫酸アンモニウ
ム、塩酸でpH２.５、水／ｎ−プロパノール １：１ 吸着剤：Nucleosil Ｃ１８、Macherey ＆ Nagel 社に
より供給 カラム：４０×２５０mm 流速：４５ml／分 ヒトインスリンジ−tertブチルスレオニンエステル／エ
ーテルのトリフルオロ酢酸による切断からのヒトインス
リン３ｇを、０.１Ｍグリシン緩衝液、pH３.０中濃度の
溶液の形でカラムに負荷し、ついで緩衝液Ｂ ３４〜３
５％の間で溶出した。分画化し、結晶化し、乾燥する
と、主分画中に初期量の５７％が純度９４.８％で、第
二の分画中に１６％が純度８４％で単離された。
【００４４】実施例１５（比較例） 緩衝液Ａ：０.１Ｍクエン酸、０.２Ｍ硫酸アンモニウ
ム、塩酸でpH３.５、純水溶液 緩衝液Ｂ：０.１Ｍクエン酸、０.１Ｍ硫酸アンモニウ
ム、塩酸でpH３.５、水／ｎ−プロパノール １：１ 吸着剤：Nucleosil Ｃ１８、Macherey ＆ Nagel 社に
より供給 カラム：４０×２５０mm 流速：４５ml／分 実施例１４の場合と同様にカラムに負荷した。保持時間
は約４０分であった。分画化、結晶化および乾燥によ
り、主分画中に使用した初期ヒトインスリンの５１％が
純度９７.５％で、第二の分画中に４％が純度６８％で
得られた。
ム、塩酸でpH３.５、純水溶液 緩衝液Ｂ：０.１Ｍクエン酸、０.１Ｍ硫酸アンモニウ
ム、塩酸でpH３.５、水／ｎ−プロパノール １：１ 吸着剤：Nucleosil Ｃ１８、Macherey ＆ Nagel 社に
より供給 カラム：４０×２５０mm 流速：４５ml／分 実施例１４の場合と同様にカラムに負荷した。保持時間
は約４０分であった。分画化、結晶化および乾燥によ
り、主分画中に使用した初期ヒトインスリンの５１％が
純度９７.５％で、第二の分画中に４％が純度６８％で
得られた。
【００４５】実施例１６ 緩衝液Ａ：０.１Ｍ tris、０.１Ｍグリシン、０.１Ｍ塩
化アンモニウム、塩酸でpH８.５、純水溶液 緩衝液Ｂ：０.１Ｍ tris、０.１Ｍグリシン、０.１Ｍ塩
化アンモニウム、塩酸でpH８.５、水／ｎ−プロパノー
ル １：１ 吸着剤：Kromasil Ｃ８、１３μm、１００Å カラム：５０mm×２５０mm 流速：６０ml／分 カラムを３３％緩衝液Ｂで平衡化し、トリフルオロ酢酸
による切断からのヒトインスリン（実施例１４参照）６
ｇを０.１Ｍ tris緩衝液、pH８.５中３％濃度の溶液の
形で負荷した。溶出は約３５分後に起こった。主分画
は、分画化および結晶化後、純粋なヒトインスリン９
６.６％を含有した（収率８６％）。総回収率は９５％
であった。
化アンモニウム、塩酸でpH８.５、純水溶液 緩衝液Ｂ：０.１Ｍ tris、０.１Ｍグリシン、０.１Ｍ塩
化アンモニウム、塩酸でpH８.５、水／ｎ−プロパノー
ル １：１ 吸着剤：Kromasil Ｃ８、１３μm、１００Å カラム：５０mm×２５０mm 流速：６０ml／分 カラムを３３％緩衝液Ｂで平衡化し、トリフルオロ酢酸
による切断からのヒトインスリン（実施例１４参照）６
ｇを０.１Ｍ tris緩衝液、pH８.５中３％濃度の溶液の
形で負荷した。溶出は約３５分後に起こった。主分画
は、分画化および結晶化後、純粋なヒトインスリン９
６.６％を含有した（収率８６％）。総回収率は９５％
であった。
【００４６】実施例１７ 緩衝液Ａ：０.１Ｍ塩化アンモニウム、０.０２５Ｍクエ
ン酸、アンモニアでpH５.５、ｎ−プロパノール５容量
％ 緩衝液Ｂ：０.１Ｍ塩化アンモニウム、０.０２５Ｍクエ
ン酸、アンモニアでpH５.５、ｎ−プロパノール５０容
量％ 吸着剤：Kromasil Ｃ８、１３μm、１００Å カラム：５０mm×２５０mm 流速：６０ml／分 トリフルオロ酢酸による切断からのヒトインスリン（実
施例１４参照）６ｇを既述のようにしてカラムに負荷し
た。インスリンは、６０分間での緩衝液Ｂ ２１％から
２５％の勾配内に保持時間４０分で溶出した。主分画は
初期生成物９１％を純度９７.５％で含有した。総回収
率は９６％であった。
ン酸、アンモニアでpH５.５、ｎ−プロパノール５容量
％ 緩衝液Ｂ：０.１Ｍ塩化アンモニウム、０.０２５Ｍクエ
ン酸、アンモニアでpH５.５、ｎ−プロパノール５０容
量％ 吸着剤：Kromasil Ｃ８、１３μm、１００Å カラム：５０mm×２５０mm 流速：６０ml／分 トリフルオロ酢酸による切断からのヒトインスリン（実
施例１４参照）６ｇを既述のようにしてカラムに負荷し
た。インスリンは、６０分間での緩衝液Ｂ ２１％から
２５％の勾配内に保持時間４０分で溶出した。主分画は
初期生成物９１％を純度９７.５％で含有した。総回収
率は９６％であった。
【００４７】実施例１８ 緩衝液Ａ：０.１Ｍ塩化カリウム、０.０２５Ｍクエン
酸、水酸化カリウム溶液でpH５.５、５容量％ｎ−プロ
パノール 緩衝液Ｂ：０.１Ｍ塩化カリウム、０.０２５Ｍクエン
酸、水酸化カリウム溶液でpH５.５、５０容量％ｎ−プ
ロパノール 吸着剤：Kromasil Ｃ８、１３μm、１００Å カラム：５０mm×２５０mm 流速：６０ml／分 負荷と勾配は実施例１７と同様にした。溶出は３５分後
に起こった。主分画は、初期量の９０％のヒトインスリ
ンを純度９６.５％で含有した。総回収率は９３％であ
った。
酸、水酸化カリウム溶液でpH５.５、５容量％ｎ−プロ
パノール 緩衝液Ｂ：０.１Ｍ塩化カリウム、０.０２５Ｍクエン
酸、水酸化カリウム溶液でpH５.５、５０容量％ｎ−プ
ロパノール 吸着剤：Kromasil Ｃ８、１３μm、１００Å カラム：５０mm×２５０mm 流速：６０ml／分 負荷と勾配は実施例１７と同様にした。溶出は３５分後
に起こった。主分画は、初期量の９０％のヒトインスリ
ンを純度９６.５％で含有した。総回収率は９３％であ
った。
【００４８】実施例１９〜２４ 実施例１９〜２４におけるクロマトグラフィーは、実施
例１４の場合と同じ条件下に実施した。緩衝液と両性イ
オンの量のみを変えた。
例１４の場合と同じ条件下に実施した。緩衝液と両性イ
オンの量のみを変えた。
【００４９】実施例１９（比較例） 緩衝液Ａ：０.１５Ｍ硫酸アンモニウム、０.１Ｍトリエ
チルアミン、硫酸でpH７.０ 緩衝液Ｂ：０.０８Ｍ硫酸アンモニウム、０.０５Ｍトリ
エチルアミン、硫酸でpH７.０ 結果：主分画の純度９５.２％、主分画における収率６
７％。
チルアミン、硫酸でpH７.０ 緩衝液Ｂ：０.０８Ｍ硫酸アンモニウム、０.０５Ｍトリ
エチルアミン、硫酸でpH７.０ 結果：主分画の純度９５.２％、主分画における収率６
７％。
【００５０】実施例２０（比較例） 緩衝液は０.１Ｍグリシンを含まないほかは実施例１６
と同じ。 結果：主分画の純度９６.１％；主分画における収率６
５％、第二分画における収率２５％
と同じ。 結果：主分画の純度９６.１％；主分画における収率６
５％、第二分画における収率２５％
【００５１】実施例２１ 緩衝液は実施例１５の緩衝液に０.１Ｍグリシンを添加
結果：主分画における純度９６％；主分画における収率
６６％、第二分画における収率６％
結果：主分画における純度９６％；主分画における収率
６６％、第二分画における収率６％
【００５２】実施例２２ 緩衝液Ａ：０.１Ｍ塩化アンモニウム、０.０２５Ｍクエ
ン酸、アンモニアでpH４.５、５容量％ｎ−プロパノー
ル、０.１Ｍグリシンベタイン 緩衝液Ｂ：５０％ｎ−プロパノールを添加するほかは緩
衝液Ａと同じ 結果：主分画における純度９８.１％；主分画における
収率８８％、第二分画における収率６％
ン酸、アンモニアでpH４.５、５容量％ｎ−プロパノー
ル、０.１Ｍグリシンベタイン 緩衝液Ｂ：５０％ｎ−プロパノールを添加するほかは緩
衝液Ａと同じ 結果：主分画における純度９８.１％；主分画における
収率８８％、第二分画における収率６％
【００５３】実施例２３ pH５.４とし、グリシンベタインを０.１％グリシンに変
えるほかは実施例２２と同じ緩衝液 結果：主分画における純度９７.９％；主分画における
収率９２％、第二分画における収率８％
えるほかは実施例２２と同じ緩衝液 結果：主分画における純度９７.９％；主分画における
収率９２％、第二分画における収率８％
【００５４】実施例２４ 緩衝液：pH６.０とし、０.１Ｍグリシンを加えるほかは
実施例１３の場合と同じ 結果：主分画における純度９４.３％；主分画における
収率７７％、第二分画における収率１３％
実施例１３の場合と同じ 結果：主分画における純度９４.３％；主分画における
収率７７％、第二分画における収率１３％
【００５５】実施例２５ 表１に、インスリンの収率と純度を溶出液におけるpHお
よび／または両性イオンの関数としてまとめる。
よび／または両性イオンの関数としてまとめる。
【００５６】
【表１】
フロントページの続き (72)発明者 ベルンハルト・ウンガー ドイツ連邦共和国デー−6233ケルクハイ ム／タウヌス．ケルクハイマーシユトラ ーセ12 (72)発明者 レーオンハルト・ヘフナー ドイツ連邦共和国デー−6240ケーニヒシ ユタイン／タウヌス．アム・エールトベ ールシユタイン26 (56)参考文献 国際公開89／1485（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07K 14/62 - 14/625 C07K 1/14 - 1/22 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (8)
- 【請求項１】 水混和性有機溶媒を含有する水性の緩衝
溶媒中、親油性に改質したシリカゲル上でのクロマトグ
ラフィーによるインスリンおよび／またはインスリン誘
導体の精製方法において、両性イオンを緩衝溶媒中に溶
解させるか、または溶媒混合物のpHを精製すべきインス
リンもしくはインスリン誘導体の等電点の近傍とし、両
性イオンを存在させる方法。 - 【請求項２】 溶媒混合物のpHは精製すべきインスリン
またはインスリン誘導体の等電点から１pH単位下または
上までとする請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 溶媒混合物のpHは等電点から０.５pH単
位下または上までとする請求項２記載の方法。 - 【請求項４】 両性イオンとしてα−アミノ酸またはベ
タイン類を使用する請求項１〜３のいずれかに記載の方
法。 - 【請求項５】 グリシン、グルタミン酸またはグリシン
ベタインを両性イオンとして使用する請求項４記載の方
法。 - 【請求項６】 式Ｉ 【化１】 （式中Ｒ30は、遺伝子でコードできるＬ−アミノ酸の残
基であり、Ｘは、ヒドロキシル基、本来塩基性であって
５０個までの炭素原子を有する生理的に許容される有機
基、遺伝子でコードできるＬ−アミノ酸であって存在す
るその末端カルボキシル基は適宜遊離、エステル官能
基、アミド官能基、ラクトンもしくはＣＨ2ＯＨに還元
された形のＬ−アミノ酸であり、ｎは０〜１０の整数で
あり、ｙは水素またはＬ−フェニルアラニンであり、Ａ
およびＢ鎖は動物またはヒトインスリンの配列である）
のインスリン誘導体を使用する請求項１〜５のいずれか
に記載の方法。 - 【請求項７】 式Ｉにおいて、Ｒ30はＬ−アラニンまた
はＬ−スレオニンであり、ＸはＬ−アルギニン、Ｌ−リ
ジンまたはＬ−フェニルアラニンからなる群よりのＬ−
アミノ酸１個または２個以上である請求項６記載の方
法。 - 【請求項８】 分取高圧液体クロマトグラフィーシステ
ムを使用する請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
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