CN115505035B - 一种司美格鲁肽中间体多肽的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于纯化方法技术领域，公开了一种司美格鲁肽中间体多肽Arg34GLP‑1(9‑37)的纯化方法。本发明通过一步阳离子交换层析和一步反相层析完成了司美格鲁肽中间体多肽的纯化，最后经过冻干，获得了纯度≥99.3％的司美格鲁肽中间体多肽成品。在纯化过程中，第一步采用阳离子交换层析法主要用于减少酶切后标签蛋白含量及去除残留核酸、宿主蛋白、抗生素等非特异性杂质；第二步反相层析能够完全去除残留的标签蛋白和第一步纯化未能去除的一些和目的肽性质接近的有关杂质。另外本发明采用离子交换层析和反相层析相结合的纯化方式，在减少有机溶剂使用，缩短工艺周期的同时，有效提高了司美格鲁肽中间体多肽的纯度和收率，有利于工业化的放大生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种多肽的纯化方法，具体涉及司美格鲁肽中间体多肽Arg34GLP-1(9-37)的纯化方式，属于医药技术领域。
背景技术
糖尿病是一组以高血糖为特点的代谢性疾病。近年来，全球糖尿病患病率呈逐年上升趋势。目前，治疗2型糖尿病的药物有双胍类、格列奈类、磺脲类等，尽管有一定的治疗效果，但副作用也比较明显，容易引起低血糖和肠胃不适等。人胰高血糖素-1(GLP-1)及其类似物作为一种新型治疗2型糖尿病药物，因其治疗效果明显、作用时间长、不良副作用少等特点而备受青睐。
司美格鲁肽注射液是由诺和诺德公司通过基因重组技术生产的GLP-1类似物。司美格鲁肽可以刺激人体胰腺分泌胰岛素，并抑制胰高血糖素分泌，从而达到控制血糖的目的。司美格鲁肽是以血糖浓度依赖的方式起效：即血糖越高，司美格鲁肽降糖越明显，血糖不高则不影响胰岛素分泌。这种脉冲式起效方式大大降低了低血糖的风险。所以司美格鲁肽的市场应用前景非常广阔。
诺和诺德公司通过基因敲除技术，解决了酵母表达系统中的自身蛋白酶降解外源蛋白问题，实现了生物法制备司美格鲁肽中间体多肽Arg34GLP-1(9-37)，但该技术难度较大。所以目前利用化学合成法制备的较多，但中间体多肽Arg34GLP-1(9-37)的纯化工艺报道较少。在专利CN114057886A中利用融合蛋白法制备了Boc基团保护的司美格鲁肽中间体多肽，再通过一步反相层析法，上样量≤10g/L，制得的中间体多肽纯度≥90％，收率≥80％。专利 CN110498849A公开使用离子交换法得到中间体多肽纯度89％以上，收率大于82％，但未公开离子交换类型(如阳离子或阴离子)以及使用的洗脱剂。专利CN111378027A公开使用阴离子纯化结合反相纯化的方法进行纯化。现有技术中关于司美格鲁肽中间体多肽的纯化，所得中间体多肽成品纯度不高。
基于现有技术存在的问题，因此迫切需要寻找到一种中间体多肽纯度更高、纯化工艺过程更加环保、更适合工业化生产的纯化方法。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种司美格鲁肽中间体多肽的纯化方法。在本发明中，对中间体多肽Arg34GLP-1(9-37)的纯化方式采用阳离子交换层析和反相层析相结合的纯化方法，最终经过冻干得到纯度为99.42％的司美格鲁肽中间体多肽。
为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：
一种司美格鲁肽中间体多肽Arg34GLP-1(9-37)的纯化方法，使用阳离子交换色谱法和反相色谱法，其包括以下步骤：
(1)第一步纯化：以含无机盐的酸性缓冲液作为洗杂流动相SP-A1，以含有机溶剂的酸性缓冲液作为洗杂流动相SP-A2，以含有无机盐和有机溶剂的酸性缓冲液作为洗脱流动相 SP-A3，以阳离子交换树脂填料为固定相；
(2)第二步纯化：以碱性缓冲液作为流动相RP-A，以有机溶剂作为流动相RP-B，以聚合物树脂或C8/C18填料作为固定相。
作为本发明的一种实施方式，所述第一次纯化中使用的酸性缓冲液的pH≤5，如可选为 3.0-5.0，进一步可选为3.5-4.5。洗杂流动相SP-A1、洗杂流动相SP-A2和洗脱流动相SP-A3 中的酸性缓冲液种类和pH可以相同，也可以不相同；优选酸性缓冲液的种类相同，可以引入较少的离子；优选酸性缓冲液的pH不相同。
作为本发明的一种实施方式，所述酸性缓冲液选自柠檬酸、甲酸、乙酸、甘氨酸或三氟乙酸等有机酸中的一种或几种。所述酸性缓冲液的浓度为0.1-1000，如可选为20-100mM，如进一步可选为50mM。
作为本发明的一种实施方式，所述第一次纯化中洗杂流动相SP-A1和洗脱流动相SP-A3 中使用的无机盐可以相同，也可以不相同；优选无机盐相同，可以引入较少的离子。
作为本发明的一种实施方式，所述无机盐选自氯化钠、氯化钾、氯化铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸铵、乙酸钠、乙酸钾、乙酸铵、甲酸铵等中的一种或几种；所述无机盐的浓度为0.05-10M，可选为0.7-1.2M，如进一步可选为1M。
作为本发明的一种实施方式，所述第一次纯化中洗杂流动相SP-A2和洗脱流动相SP-A3 中使用的有机溶剂可以相同，也可以不相同；优选有机溶剂相同，可以引入较少的溶剂。
作为本发明的一种实施方式，所述第一次纯化时使用流动相SP-A0平衡色谱柱，所述流动相可选为与洗杂流动相SP-A1中的酸性缓冲液相同。
作为本发明的一种实施方式，所述有机溶剂选自异丙醇、甲醇、乙醇或乙腈中的一种或多种。所述有机溶剂浓度可选为1％-50％，进一步可选为20％-30％。
作为本发明的一种实施方式，所述洗杂流动相SP-A1为含NaCl的柠檬酸溶液。
作为本发明的一种实施方式，所述洗杂流动相SP-A2为含有异丙醇的柠檬酸溶液。
作为本发明的一种实施方式，所述洗脱流动相SP-A3为含有NaCl、异丙醇的柠檬酸溶液。
作为本发明的一种实施方式，洗杂流动相SP-A1和洗脱流动相SP-A3中NaCl的浓度为 0.05-10M，可选为0.7-1.2M，如进一步可选为1M；
作为本发明的一种实施方式，洗杂流动相SP-A1、SP-A2和洗脱流动相SP-A3中一水合柠檬酸的浓度为0.1-1000，如可选为20-100mM，如进一步可选为50mM。
作为本发明的一种实施方式，洗杂流动相SP-A2和洗脱流动相SP-A3中异丙醇的浓度为 20％-30％，如可选为25％。
作为本发明的一种实施方式，所述第二次纯化中使用的碱性缓冲液RP-A的pH≥7.5，如可选为7.5-10.0，进一步可选为8.0-9.0。
作为本发明的一种实施方式，所述碱性缓冲液RP-A选自Tris或磷酸盐，优选Tris。
作为本发明的一种实施方式，所述Tris的浓度可选为0.1mM-1000mM，如可选为20mM-100mM，如进一步可选为50mM。
作为本发明的一种实施方式，所述第二次纯化中使用的有机溶剂RP-B选自异丙醇、甲醇、乙醇或乙腈中的一种或多种，优选乙腈，如60％乙腈。
作为本发明的一种实施方式，所述第二次纯化使用线性洗脱梯度，其中流动相B的起始梯度可选为30％-40％，优选为35％；流动相B的终止梯度可选为40％-50％，优选为45％。
作为本发明的一种实施方式，在第二次纯化前使用含有Tris的碱性缓冲液和乙腈溶液溶解纯化一锌沉样品。Tris的浓度为可选为0.1mM-1000mM，如可选为20mM-100mM，如进一步可选为50mM；溶解过程中需调pH为8.0-9.0，优选为8.5。
作为本发明的一种实施方式，第一次纯化时样品的上样载量可选为50-90g/Lresin，优选为70g/L resin。
作为本发明的一种实施方式，第二次纯化时样品上样载量可选为15-40g/Lresin，优选为 20g/L resin。
作为本发明的一种实施方式，所述阳离子交换树脂填料固定相可选为SP-650M、DEAE-650M、UniGel-80SP、UniGel-30SP、HC60-SP、NanoSP、SP Bestarose FF、Diamond MMC，优选SP-650M和NanoSP中的一种；所述聚合物树脂填料或C8/C18填料可选为Poly RP-300、UniPS 10-300、Sepax GP-C18、BR-C18(2)、Sepax BR-C18、Unisil 15-100C18、Sepax Bio-C8(2)，优选Poly RP-300和Sepax BR-C18中的一种。
作为本发明的一种实施方式，可选在第一次纯化和第二次纯化后使用锌盐沉淀，所述锌盐选自氯化锌、溴化锌、氧化锌、硫酸锌、乙酸锌中的一种或多种。
作为本发明的一种实施方式，加入锌盐溶液的终浓度可选为0-6mM，优选为4mM；沉淀时调节pH可选为4.3-5.5，优选为4.7。
作为本发明的一种实施方式，在纯化之后经过分离得到司美格鲁肽中间体多肽Arg34GLP-1(9-37)成品，所述分离方法选自冻干、加入抗溶剂结晶和等电点沉淀中的一种或其组合。
在本发明中溶解条件、流动相、浓度、pH、梯度洗脱等都是经过实验筛选所得，通过比较纯度、收率、对杂质的去除效果等决定最优体系。本发明中的所用纯化流动相体系对中间体多肽的纯化效果均优于其他体系。
本发明提供的一种司美格鲁肽中间体多肽的纯化方法，相对于现有技术具有以下有益效果：
(1)本发明所纯化的司美格鲁肽中间体多肽Arg34GLP-1(9-37)通过生物重组法获得，与化学合成相比，对环境友好、工艺简单可控制且从源头处减少了同分异构体、消旋等杂质的产生。
(2)本发明通过一步阳离子交换层析和一步反相层析完成了美格鲁肽中间体多肽的纯化。离子交换层析使用的有机溶剂较少，更为环保；离子交换层析的载量大于反相层析，可减少工艺周期；再通过高分辨率的反相层析，获得了纯度≥99.3％的司美格鲁肽中间体多肽。
(3)本发明的第一步阳离子交换层析能去除残留的核酸、杂蛋白、抗生素等非特异性杂质及大大减少酶切后标签蛋白含量；第二步反相层析能够完全去除残留的标签蛋白和第一步纯化未能去除的一些和目的肽性质接近的其他杂质。
附图说明
图1是实施例1中司美格鲁肽中间体多肽酶切后混合液的HPLC图谱。
图2是实施例1中司美格鲁肽纯化一样品的HPLC图谱。
图3是实施例1中司美格鲁肽纯化二样品的HPLC图谱。
图4是实施例1中司美格鲁肽中间体多肽Arg34GLP-1(9-37)成品的HPLC图谱。
图5是实施例2中司美格鲁肽中间体多肽Arg34GLP-1(9-37)成品的HPLC图谱。
图6是实施例3中司美格鲁肽中间体多肽Arg34GLP-1(9-37)成品的HPLC图谱。
图7是实施例4中司美格鲁肽中间体多肽Arg34GLP-1(9-37)成品的HPLC图谱。
图8是实施例5中司美格鲁肽中间体多肽Arg34GLP-1(9-37)成品的HPLC图谱。
图9是对比例1中司美格鲁肽纯化一样品的HPLC图谱。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和有益效果能有更加清楚的理解，现结合具体实施例对本发明的技术方案进行以下详细说明，但本发明的保护内容不局限以下实施例。
下述实施例中所用的原料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
司美格鲁肽中间体多肽原料Arg34GLP-1(9-37)肽链由南京汉欣医药科技有限公司自制，中间体多肽原料Arg34GLP-1(9-37)肽链的制备工艺可参考本公司申报的已经公开的发明专利 CN 114292338A，其全部内容可直接引入到本发明中。
本实施例中所用的流动相配方如下:
SP-A0流动相配方为：50mM一水合柠檬酸，用NaOH调节pH至3.5。
SP-A1流动相配方为：50mM一水合柠檬酸和1M的NaCl，用NaOH调节pH至4.5。
SP-A2流动相配方为：50mM一水合柠檬酸和25％异丙醇，用NaOH调节pH至4.0。
SP-A3流动相配方为：50mM一水合柠檬酸、1M的NaCl和25％异丙醇，用NaOH调节 pH至4.0。
RP-A流动相配方为：50mM Tris，10％乙腈，用HCl调节pH至8.5。
RP-B流动相配方为：60％乙腈。
实施例1：
(1)司美格鲁肽中间体多肽Arg34GLP-1(9-37)的阳离子交换层析
样品处理：将包含中间体多肽Arg34GLP-1(9-37)的酶切混合液(公司自制，采用专利 CN 114292338A公开的酶切方法得到，HPLC纯度为27.40％，其中标签蛋白杂质的出峰时间为8.246min，含量为54.96％，具体图谱如图1所示)用磷酸调pH3.0终止酶切后，离心收集上清液，再将上清液用孔径为0.45μm的滤膜过滤后，待纯化。
纯化过程：以处理后的酶切上清液为上样样品，以SP-650M型阳离子交换树脂填料为固定相，流速为200cm/hr，检测波长为280nm。用SP-A0流动相平衡离子交换柱2个CV；按照上样样品总蛋白70g/L resin的载量进行上样；上样后，用SP-A0流动相平衡离子交换柱2个CV；用SP-A1流动相进行第一次洗杂，直到基线平衡；用SP-A2流动相进行第二次洗杂，直到基线平衡；最后用SP-A3进行洗脱，收集的主峰段即为司美格鲁肽中间体多肽 Arg34GLP-1(9-37)纯化一样品。经HPLC检测，纯化一样品的纯度为89.31％(标签蛋白杂质的出峰时间为8.363min，含量为2.24％)，纯化收率为84.32％。HPLC图谱如图2所示。
(2)司美格鲁肽中间体多肽Arg34GLP-1(9-37)纯化一样品的锌沉
在司美格鲁肽中间体多肽Arg34GLP-1(9-37)纯化一样品中加入0.5倍体积的水，再加入终浓度为4mM的氯化锌溶液，用NaOH调节pH至4.7，放入4℃中静置4h后离心，得到的沉淀即为司美格鲁肽中间体多肽Arg34GLP-1(9-37)纯化一锌沉样品，放入-20℃中待用。
(3)司美格鲁肽中间体多肽Arg34GLP-1(9-37)纯化一锌沉样品的溶解
将上述得到的司美格鲁肽中间体多肽Arg34GLP-1(9-37)纯化一锌沉样品，分别加入20倍质量表1中所示的溶剂进行样品溶解，结果如表1所示。
表1不同溶剂对纯化一锌沉样品溶解性能的影响
由以上结果可以看出，司美格鲁肽中间体多肽Arg34GLP-1(9-37)纯化一锌沉样品在水中不溶解；在10％乙腈中溶解不完全，在25℃条件下50mM Tris+10％乙腈(pH8.5)中溶解不完全；在1％乙酸和10％乙腈混合体系中呈现凝胶状；在30℃、pH8.5或9.0条件下，50mMTris+10％乙腈都能很好的溶解司美格鲁肽中间体多肽Arg34GLP-1(9-37)纯化一锌沉样品，形成的溶液澄清透明而且放置后稳定好也不会析出，能够为上样提供便利，避免色谱柱堵塞，延长色谱柱使用寿命。
(4)司美格鲁肽中间体多肽Arg34GLP-1(9-37)的反相层析
样品处理：称取1g上述得到的司美格鲁肽中间体多肽Arg34GLP-1(9-37)纯化一锌沉样品，加入20倍质量50mM Tris+10％乙腈(pH8.5)溶液，再放入磁力搅拌器中30℃恒温搅拌25min 后，用孔径为0.22μm的滤膜过滤后，待纯化。
纯化过程：以处理后的滤液为上样样品，以Poly RP-300型聚合物树脂填料为固定相，流速为200cm/hr，检测波长为280nm。用RP-A流动相平衡色谱柱2个CV；按照上样样品总蛋白20g/L resin的载量进行上样；上样后，用RP-A流动相平衡色谱柱2个CV；最后用RP-A和RP-B进行线性梯度洗脱(RP-B从35％-45％，洗脱45min)，收集的主峰段即为司美格鲁肽中间体多肽Arg34GLP-1(9-37)纯化二样品。经HPLC检测，纯化二样品的纯度为99.43％(标签蛋白杂质已被完全去除)，纯化收率为91.02％。HPLC图谱如图3所示。
(5)司美格鲁肽中间体多肽Arg34GLP-1(9-37)纯化二样品的锌沉、水洗及冻干
在上述得到的司美格鲁肽中间体多肽Arg34GLP-1(9-37)纯化二样品中加入1倍体积的水，再加入终浓度为4mM的氯化锌溶液，用HCl调节pH至4.9，放入4℃中静置4h，离心，得到的沉淀即为司美格鲁肽中间体多肽Arg34GLP-1(9-37)纯化二锌沉样品。
称取1g的司美格鲁肽中间体多肽Arg34GLP-1(9-37)纯化二锌沉样品，加入10倍质量纯化水中，再放入磁力搅拌器中搅拌1h后取出离心，离心所得的湿固体即为司美格鲁肽中间体多肽Arg34GLP-1(9-37)纯化二水洗样，放入-20℃中进行预冻。
将预冻好的司美格鲁肽中间体多肽Arg34GLP-1(9-37)纯化二水洗样品放入冷冻干燥机中进行冻干，冻干后得到的样品即为司美格鲁肽中间体多肽Arg34GLP-1(9-37)成品。经HPLC 检测，司美格鲁肽中间体多肽Arg34GLP-1(9-37)的纯度为99.42％。HPLC图谱如图4所示，结果表明该产品在冻干条件下很稳定，纯度及杂质含量几乎不受影响。
实施例2
用乙酸替换柠檬酸，氯化铵替换氯化钠，乙醇替换异丙醇，其余条件和操作步骤均同实施例1，得到司美格鲁肽中间体多肽Arg34GLP-1(9-37)的纯度为99.30％，HPLC图谱如图5 所示。
实施例3
NaCl浓度变为1.2M，异丙醇浓度变为30％，Tris浓度变为100mM，其余条件和操作步骤均同实施例1，得到司美格鲁肽中间体多肽Arg34GLP-1(9-37)的纯度为99.30％，HPLC图谱如图6所示。
实施例4
SP-A1流动相的pH变为4.0，SP-A2流动相的pH变为3.5，SP-A3流动相的pH变为3.5，RP-A流动相的pH变为7.5，其余条件和操作步骤均同实施例1，得到司美格鲁肽中间体多肽Arg34GLP-1(9-37)的纯度为99.36％，HPLC图谱如图7所示。
实施例5
用NanoSP填料代替实施例1中的阳离子交换层析用的SP-650M填料，用Sepax BR-C18 填料代替实施例1中的反相层析用的Poly RP-300型聚合物树脂填料，其余条件和操作步骤均同实施例1，得到司美格鲁肽中间体多肽Arg34GLP-1(9-37)的纯度为99.29％，HPLC图谱如图8所示。
对比例1
样品处理：将包含中间体多肽Arg34GLP-1(9-37)的酶切混合液(公司自制，采用专利CN 114292338A公开的酶切方法得到，HPLC纯度为27.40％，其中标签蛋白杂质的出峰时间为8.246min，含量为54.96％，具体图谱如图1所示)用磷酸调pH3.0终止酶切后，离心收集上清液，再将上清液用孔径为0.45μm的滤膜过滤后，待纯化。
纯化过程：以处理后的酶切滤液为上样样品，以阴离子交换树脂填料为固定相，流速为 200cm/hr，检测波长为280nm。用25mM Tris-HCl(pH8.5)流动相平衡离子交换柱2个CV；按照上样样品总蛋白70g/L resin的载量进行上样；上样后，用25mM Tris-HCl(pH8.5)流动相平衡离子交换柱2个CV；用25mM Tris-HCl+1M NaCl(pH8.5)流动相进行第一次洗杂，直到基线平衡；用25mM Tris-HCl+25％异丙醇(pH8.5)流动相进行第二次洗杂，直到基线平衡；最后用25mM Tris-HCl+1M NaCl+25％异丙醇(pH8.5)流动相进行洗脱，收集的主峰段即为司美格鲁肽中间体多肽Arg34GLP-1(9-37)纯化一样品。经HPLC检测，纯化一样品的纯度为81.24％(标签蛋白杂质出峰时间为8.370min，含量为8.21％)，纯化收率为71％。HPLC图谱如图9所示。此对比例中的所采用的阴离子交换层析方法所获得司美格鲁肽中间体多肽Arg34GLP-1(9-37) 纯化一样品的纯度和收率明显低于实施例1的阳离子交换层析，且标签蛋白杂质明显增多。
Claims (1)
1.一种司美格鲁肽中间体多肽Arg34GLP-1(9-37)的纯化方法，其特征在于：使用阳离子交换色谱法和反相色谱法，其包括以下步骤：
(1)第一步纯化：以含1M氯化钠的50mM柠檬酸缓冲液作为洗杂流动相SP-A1，以含25％异丙醇的50mM柠檬酸缓冲液作为洗杂流动相SP-A2，以含有1M氯化钠和25％异丙醇的50mM柠檬酸缓冲液作为洗脱流动相SP-A3，以SP-650M型或NanoSP型阳离子交换树脂填料为固定相；或者
以含1M氯化铵的50mM乙酸缓冲液作为洗杂流动相SP-A1，以含25％乙醇的50mM乙酸缓冲液作为洗杂流动相SP-A2，以含有1M氯化铵和25％乙醇的50mM乙酸缓冲液作为洗脱流动相SP-A3，以SP-650M型阳离子交换树脂填料为固定相；或者
以含1.2M氯化钠的50mM柠檬酸缓冲液作为洗杂流动相SP-A1，以含30％异丙醇的50mM柠檬酸缓冲液作为洗杂流动相SP-A2，以含有1.2M氯化钠和30％异丙醇的50mM柠檬酸缓冲液作为洗脱流动相SP-A3，以SP-650M型阳离子交换树脂填料为固定相；
所述第一步纯化中使用的酸性缓冲液的pH≤5；
(2)第二步纯化：以含有50mM Tris和10％乙腈或100Mm Tris和10％乙腈碱性缓冲液作为流动相RP-A，以60％乙腈作为流动相RP-B，以Poly RP-300型聚合物树脂或Sepax BR-C18填料作为固定相；所述第二步纯化使用线性洗脱梯度，其中流动相RP-B的起始梯度可选为35％；流动相RP-B的终止梯度可选为45％；
所述第二步纯化中使用的碱性缓冲液RP-A的pH≥7.5；
在第一步纯化和第二步纯化后使用锌盐沉淀，所述锌盐选自氯化锌、溴化锌、氧化锌、硫酸锌、乙酸锌中的一种或多种，摩尔浓度控制在4mM；在第二步纯化前使用含有50mMTris的碱性缓冲液和10％乙腈溶液在30℃、pH8.5或9.0条件下溶解纯化一锌沉样品。
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