JPS63152400A - 高純度牛ラクトフェリンの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は高純度牛ラクトフェリンの製造法に関する。

［技術の背景及び従来技術］ ラクトフェリンは乳汁、唾液等の外分泌液中に存在する
鉄結合性の蛋白質であり、乳児や子牛の授乳において鉄
を運搬する蛋白質として栄養学的に重要な働きを担って
いること、及びその鉄結合性の特性ゆえに鉄要求性の高
い病原性細菌に対して強い静菌作用を有することが知ら
れている。即ちラクトフェリンは、乳中に存在する免疫
グロブリンやリゾチーム等と共に、栄養学的見地のみな
らず感染予防の見地からも重要な乳蛋白質である。

ラクトフェリンの乳中における存在形態は鉄の結合の有
無によって２種のものが知られている。また、ラクトフ
ェリンは初乳には比較的多く含有されているものの、常
乳中の含有は少なく、例えば牛乳１１中のラクトフェリ
ンは約２５０ｍｇと微量台まれているに過ぎない。

このようにラクトフェリンは有益な生理作用を有してい
るにもかかわらず、乳中の含量が少ないため、その工業
的な分離・精製は困難とされてきた。

しかしながら一方では、この有益なラクトフェリンを乳
から分離精製しようとする種々の試みが従来から行なわ
れている。

たとえば、牛乳から脂肪を分離した脱脂乳において、カ
ゼインをｐＨ４，，６で等電点沈澱させたカゼイン画分
或はホエー画分を硫酸アンモニウムで分画し、数種のイ
オン交換体でカラム分画して精製する方法（Ｍ、Ｌ、Ｇ
ｒｏｖｒｓ、　Ｊ、八ｍ、ｃｈｅｍ、ｓｏｃ、　、　８
２巻、　３３４５〜３３５０頁、　１９６０年；　Ｍ、
Ｌ、Ｇｒｏｖｅｓ、Ｂｉｏｃｈｅ＋ｎ。

Ｂｉｏｐｌ＋ｙｓ、Δｅｔａ、、　１００巻、　１５４
〜１６２頁、　１９６５年）、ラクトパーオキシターゼ
を精製する方法において、レンネットホエーをｐｌ＋７
．０に調整し、弱酸性陽イオン交換樹脂に接触させて吸
着させ、樹脂を分取した後、脱離液で脱離させ、硫酸ア
ンモニウムて分画し、次いで弱酸性陽イオン交換樹脂或
は燐酸カルシウムのカラム分画を行った際に、不純物と
して混合されているラクトフェリンが副次的に分画され
る方法（Ｍ、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ　ｅｔ　ａｔ、　　Ｊ、
Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ＋ｎ、。

２２８巻、　７６７〜．７７６頁、　　１９５７年：Ｌ
［；、Ｇｏｒｄｏｎ　ｅｔ　ａｌ。

Ｂｉｏｃｌ＋ｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、＾ｅｔａ、、　　
６０巻、　４１０〜．．４１１頁、１９６２年）、 母乳を硫酸アンモニウムで分画し、その上澄画分に硫酸
アンモニウム鉄を添加し、次いで弱酸性陽イオン交換体
に接触させてカラム分画し、精製する方法（Ｐ、Ｑｕｅ
ｒｉｎｊｅａｎ　ｅｔ　ａｌ、　Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ、。

２０巻、４２０〜４２５頁、１９７１年）、また硫酸ア
ンモニウム鉄を含有する水にて母乳を３倍に希釈し、弱
酸性陽イオン交換体に接触させてカラム分画し、精製す
る方法（Ｂ、Ｇ。

Ｊ　ｏｈａｎｓｓｏｎ　、　　八ｅｔａ　　Ｃｈｅｍ、
５ｃａｎｄ、、　　　２３巻、　６８３〜６８４頁、　
１９６９年）等のラクトフェリン分離製法が報告されて
いる。

また、モノクロナール抗生ラクトフェリン抗体を固定し
て利用するアフィニティークロマトグラフィー法も知ら
れている（特開昭６１−１４５２００号公報）。

［発明が解決しようとする問題点］ しかしながら、上記した従来のラクトフェリン分離精製
法は、効率が悪いので、工業的規模でラクトフェリンを
大量に製造するには不適当である。

また、これら従来法では、その工程中において何等かの
物質を原料乳中に添加するので、大量の原料乳の品質を
必然的に変化させてしまうと言う欠点を持っていた。例
えば、分画のための硫酸アンモニウムの添加、硫酸ラク
トフェリンの存在形態を鉄結合型に変えるための鉄含有
溶液の添加、ｐＨ値の調整のための酸、アルカリ液の添
加などである。更に、ラクトフェリンを精製する上にお
いても、数種のイオン交換体を用いたり、カラムの脱離
条件を種々変化させたり、硫酸アンモニウム分画を用い
たりすることによって、ラクトフェリン以外の物質を除
去して、大量の原料液の品質を変化させ、あるいは複雑
な工程を必要とさせていた。

また、アフィニティークロマトグラフィー法を工業的に
利用するためには抗体を大量に生産することが必要とさ
れるためコスト高となること、及び抗体の安定性が非常
に限られていることから、その工業的な実施は、事実上
きわめて困難であった。

［発明の目的及び発明の要約］ 本発明の目的は、従って、ラクトフェリンの乳からの分
離精製に関する上記従来技術の欠点を改善した新規な牛
ラクトフェリンの製造法を提供することにある。即ち、
原料乳の組成・品質に大きな変化を与えることなく、ま
た複雑な工程を用いることなく、ラクトフェリン（以下
単なるラフ１へフェリンとの記載は、牛うク１−フェリ
ンをいう。）を分離精製することのできる工業的製造法
を提供することにある。

本発明の方法は、基本的な３工程を含んている。

即ち、イオン交換基としてカルボキシメチル基を有し、
且つヘモグロビン吸着能が３．５ｇ／１００川β以上で
ある弱酸性陽イオン交換体と原料乳とを接触させて、ラ
クトフェリンを選択的に吸着させる吸着処理、上記イオ
ン交換体を水で洗浄して、上記イオン交換体に吸着され
ていない物質を除去する水洗処理、及び１種類以上の塩
類溶液で上記イオン交換体から吸着された物質を脱離さ
せる脱離処理である。

本発明は、原料乳に何等の物質も添加することなく、直
接にイオン交換体で処理するので、大量の原料乳の品質
を変化させることがない。また、イオン交換体を選択す
ることにより、ラクトフェリンを選択的に吸着させるの
で、高純度でラクトフェリンを分離回収することができ
る。

上記の基本的方法において、脱離処理を２段階で行うこ
とができる。第１の脱離処理においては、上記水洗処理
の後に、相対的に低濃度の１種類以上の塩類溶液を用い
て、上記イオン交換体を処理して、吸着された物質の内
、低濃度溶液で脱離され得る不純物を除去する。この第
１の脱離処理を行う場合には、第２の脱離処理は相対的
に高濃度の塩類溶液を用いて行う。

本発明の基本的方法によれば、回収された蛋白質中、８
０重量％以上の高純度でラクトフェリンが得られる。

また、脱離処理を２段階で行うことにより、回収された
全蛋白質中、９８重量％以上の高純度の牛ラクトフェリ
ンが得られる。

本発明において用いられるイオン交換体は、イオン交換
基としてカルボキシメチル基を有し、且つヘモグロビン
吸着能が３　、５ｇ／　１００＋ｎ１以上の弱酸性陽イ
オン交換体を用いることが重要である。尚、上記ヘモグ
ロビン吸着能の基準については、後に詳述する。

また、体積変化率が１．５以下のいわゆるハードタイプ
の弱酸性陽イオン交換体を用いるのが望ましく、本発明
方法がカラｌ＼を用いて連続的に行なわれる場合には、
特に望ましい。本明細書において用いられている体積変
化率の基準は、Ｎａ形におけるイオン交換体を水で膨潤
させたときのベッドボリューｌ＼を、該交換体をイオン
強度Ｑ、５の塩化ナトリウｌ、溶液と平衡化したときの
ベッドボリュームで除した値である。

また、吸着処理は、０〜６０°Ｃの温度て行なわれるの
が望ましい。

脱離液としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化
カルシウム、塩化マクネシウノ＼、またはそれらの混合
物よりなる群から選択された塩の溶液を用いることがで
きる。

上記の脱離処理を２段階で行う場合には、上記相対的に
低濃度の溶液は、０．４〜２．５％（重量、以下同じ）
の範囲から選択し、上記相対的に高濃度の溶液は、１．
５〜１２％の範囲から選択される。

［本発明の詳細な説明」 以下に本発明の技術構成について詳述する。

本発明は、とりわけ高純度の牛ラクトフェリンを工業的
に製造するのに適している。

この目的から、本発明においては、ラクトフェリンが存
在している牛乳由来の脱脂乳又はホエーを原料として用
いる。なお、ホエーはせ性ホエー、酸ホエーのいずれて
あってもよい、以下、これらの材料を単に［原料乳Ｊと
言う。望ましくは、原料乳は加熱によって殺菌されてい
ないものを用いる。

その理由は牛ラクトフェリンは高温殺菌により大きく変
性する傾向が見られるからである。

ラクトフェリンはその等電点が７，８であるといわれて
おり、従ってこれより低いｐＨ域の原料乳においては（
＋）帯電している。即ち、ｐＨ６７の脱脂乳、ｐＨ６，
４のせ性ホエー及びｐＨ４゜６の酸ホエーのいずれにお
いても、ラクトフェリンは（＋）帯電している。その（
＋）帯電の傾向は、原料乳のｐＨが低い程、強い帯電性
を示す。一方、原料乳中の他の多くの蛋白質の等電点は
ラクトフェリンよりも低く、５前後である。従って、脱
脂乳やせ性ホエーのｐＨにおいては、これらの蛋白質は
く−）帯電しており、酸ホエーのｐＨにおいては等電点
付近にあるか又は弱い（＋）帯電をしている。

本発明は、これらの蛋白質の帯電性の違いを利用してラ
クトフェリンの分離を行おうとするものである。即ち、
原料乳に含まれる蛋白質中のラクトフェリンとその蛋白
質の帯電性の正負或は帯電性の強弱を利用して、原料乳
から（＋）に帯電したラクトフェリンを選択的にイオン
交換体に吸着させる。従って、本発明においては、陽イ
オン交換体を用いることが必須である。

また、ラクトフェリンは分子量約８万の大きな蛋白質で
ある。本発明方法を工業的に行う場合には、ポーラスな
陽イオン交換体を用いて、ラクトフェリン分子がポーラ
ス構造内に自由に入り得るようにし、大量に吸着される
ようにすることが必要である。

本発明においては、上記の交換体の多孔性又は吸着性は
、ラクトフェリンに匹敵する大きい分子量を有する典型
的な蛋白質であるヘモグロビン吸着能を指標とすること
ができる。このヘモグロビン吸着能は下記に説明する方
法によって求められた。

即ち、ｐＨ５，０に調整した０、０５Ｍクエン酸−クエ
ン酸ナトリウムの緩衝液に、ヘモグロビン４００ｍｇを
溶解して１００ｍｆのヘモグロビン溶液を調整した。水
にて膨潤したナトリウム形のイオン交換体２ｒ１１を同
緩衝液にて平衡化した後、該溶液中に投入した。２５℃
にて２時間撹拌した後、該イオン交換体を分取、同緩衝
液にて洗浄して未吸着のヘモグロビンを回収し、上記回
収液中のヘモグロビン及び上記ヘモグロビン溶液中に残
存するヘモグロビン量を測定して吸着量を求めた。本明
細書では、この値を、水にて膨潤したナトリウム形のイ
オン交換体１００１当たりのヘモグロビン吸着量（ｇ）
として用いている。

以下に、若干の試験例を説明して、本発明の有効性を例
証する。

区１１ この試験の目的は、本発明で用いられるのに適した交換
体を例証することである。

表１に記載した１０種の市販の陽イオン交換体について
、次の要領にてバッチ処理し、ラクトフェリン分離回収
性を試験した。

ナトリウム形のイオン交換体を水で膨潤させて１０ｎ＋
ｆとしたものを生の脱脂牛乳ＩＫｇ（ｐＨ６，７）に投
入した。この混合液を、４℃で１６時間撹拌した後、該
イオン交換体を分取して水洗した。

ついで１０％食塩水１５０社でラクトフェリンをイオン
交換体から脱離し、この回収液中のラクトフェリン含量
をラウレル（Ｌａｕｒｅｌｌ）法（Ｃ−Ｂ、　Ｌａｕｒ
ｅｌｌ、＾ｎａ１．Ｂｉｏｃｂｅｍ、、　’１５巻、４
５頁、　１９６６年）により測定した。その測定結果は
表１に併せて示す通りである。

また、イオン交換体による吸着処理後の脱脂乳のｐＨも
併せて表１に示した。

更に、回収液に含まれる蛋白質に占めるラクトフェリン
含有比率（％）を、回収液の２８Ｏｎ＋ｎにおける総蛋
白質の吸光度に占めるラクトフェリンの吸光度比率（ラ
クトフェリン１％液の２８０ｎｍにおける吸光度を１２
．７として計算）から近似的に求められる。この値を、
ラクトフェリンの純度として表１に示した。

なお、上記２８Ｏｒ＋ｍにおける吸光度を用いて蛋白質
濃度を測定する手法は広く行なわれている。

事実、本発明の回収液においては、それに含有される全
蛋白質に対するラクトフェリンの含有率が高いので、上
記２８０ｎｍにおける吸光度比率（％）から近似的に求
めた値は、他の精密な測定方法によって求めた値と殆ど
等しかった。（例えば後記実施例２参照）。

表１の結果から明らかなように、イオン交換基としてカ
ルボキシメチル基を有し、かつヘモグロビン吸着能力が
３　、５ｇ／　１００ｍｆ以上である弱酸性陽イオン交
換体を用いた実験Ｎ０１７〜１０においては、いずれも
、ラクトフェリン回収量が大きく、またラクトフェリン
の純度も９０％以上であって高純度のラクトフェリンが
得られた。これに対し、カルボキシメチル基以外のイオ
ン交換基を有する弱酸性陽イオン交換体（実験Ｎｏ、１
〜４）ではいずれもラクトフェリン回収量が極めて小さ
いか、或は少量回収されてもラクトフェリン純度の低い
ものであった。また、イオン交換基としてカルボキシメ
チル基を有するものであっても、ヘモグロビン吸着能力
が３．５ｇ／　１００ｍｌに満たない場合（実験Ｎｏ、
５〜６）には、ラクトフェリン回収量もその純度も低い
ものであった。

これらの試験結果により、本発明に用いるべき弱酸性陽
イオン交換体は、上記２つの条件、即ちイオン交換基と
してカルボキシメチル基を有すること、ヘモグロビン吸
着能が３　、５ｇ／　１００ｍｌ１以上出あ６こと、を
共に満足するものでなければならないことが判明した。

また、実験Ｎｏ、７〜１０においては、ラクトフェリン
を吸着処理した後の脱脂乳のｐＨは殆ど変化せず、また
風味的にも変化が認められなかった。

従って、本発明方法は原料乳の品質を損なうことなく、
ラクトフェリンを高純度で製造できることが判明した。

区１λ この試験の目的は、本発明において用いられる弱酸性陽
イオン交換体に対して適用し得る対イオンを例証するこ
とである。

上記試験１において、本発明で使用し得ることが判明し
た、ＣＭ−セロファースＦＦ（ファルマシア製）３０ｍ
Ｚに、表２記載の対イオン置換用溶液釜５００ｇを通じ
た後、水洗して各対イオンを有するイオン交換体を調製
した。次いで、これらイオン交換体を脱脂乳１ｋｇに投
入して４℃で１６時間接触、撹拌し、バッチ処理した後
、樹脂を分取して水洗し、後１０％食塩水３００＋Ｊ！
でラクトフェリンを脱離した。この回収液中のラクトフ
ェリン回収量、ラクトフェリンの純度及びイオン交換体
処理後の脱脂乳＋）Ｈを測定した結果は、表２に示す通
りである。

表２の結果から明らかなように、対イオンの形がＨ、Ｎ
ａ、Ｋ　、Ｃａ、Ｍｇのいずれの形であっても、ラフｌ
−フェリンの回収率は大きく、また回収液の蛋白質に占
めるラクトフェリン純度も８０％以上であって高純度の
ラクトフェリンが得られた。またラクトフェリンを吸着
処理した後の脱脂乳ｐＨには殆ど変化が見られず、また
風味的にも変化が認められなっかな。

従って、本発明に用いる弱酸性陽イオン交換体の対イオ
ンの形は特に問題とはならず、Ｈ、Ｎａ。

Ｋ　、　Ｃａ　、　Ｍ　ｇ等のいずれの形であってもよ
いことが判明した。

以上の試験結果から、本発明の基本的方法によって、高
純度のラクトフェリンが製造できることが例証された。

試１し赴 この試験の目的は、本発明の基本方法における脱離処理
を２段階で行うことの有利性を例証することである。

イオン交換基としてカルボキシメチル基を有し、ヘモグ
ロビン吸着能力が３　、９ｇ／　１００ｍｌであるＣト
セファデックスＣ−５０（ファルマシア製）０゜４ｇを
水で膨潤し、１８ｍｆのＮａ型のイオン交換体に変換し
、これをｐＨ６，７の生の牛脱脂乳２゜０ｋｇに投入し
、４℃で撹拌・接触させた。１６時間後、訓布にてイオ
ン交換体を回収し、カラムに充填し、水洗して脱脂乳分
を除いた後、図１のグラフの横軸に示す各濃度の塩化ナ
トリウノ＼溶液５０ｍｌを低濃度から順次通液し、各流
出液を分画し２８０ｎｍにおける吸光度及びラクトフェ
リン濃度を測定し、その結果を同図に示した。

同図の２８Ｏｎ＋ｎの吸光度変化から、イオン交換体の
蛋白質の脱離は、通液した流出液の食塩濃度の上昇に伴
い２つの両分として分画されることが判る。低濃度の塩
化す１〜リウノ＼溶液で脱離される第１の画分は、主と
してラクトフェリン以外の成分であり、高濃度の塩化ナ
トリウム溶液で脱離される第２の両分は、ラクトフェリ
ンが主たる成分である。そしてこの２つの画分の境界と
なる塩化ナトリウム溶液の濃度は１．４〜１．６％であ
ることが知れる。

試験３の結果から、脱離工程において、先ずラクトフェ
リン以外の蛋白質を低濃度の塩化ナトリウム溶液で脱離
・分離し、次いで吸着されているラクトフェリンを高濃
度の塩化ナトリウム溶液で回収すれば、高純度のラクト
フェリンを得ることが示唆される。

筬１先 この試験の目的は、上述の示唆が正しいことを例証する
ことである。

試験３と同様に膨潤させたＣトモファデックス０．４ｇ
を生の牛脱脂乳２、Ｏｋｇに投入し、４°Ｃで１６時間
撹拌・接触させ、バッチ処理し、２戸布にてイオン交換
体を回収してカラムに充填し、水洗して脱脂乳分を除い
た後１００＋Ｊの１．６％塩化ナトリウム溶液をカラム
に通液し、イオン交換体に吸着した第１の両分を脱離・
分離させた。その後１００社の５％塩化ナトリウム溶液
をカラムに通液して回収液１００ｍＮを得た。回収液の
ラクトフェリン濃度は、１７６ｍｇ／　１００ｍｎであ
り、２８０ｎｍにおける吸光度は２．２５であった。従
って、回収液中にラクトフェリンが１７６ｍｇ得られ、
その純度は、９９％（１７６ｘ０．０１２７ｘｌＯＯ／
２．２５）であった。

この結果から、比較的低濃度の塩類で、ラクトフェリン
以外の蛋白質を予め脱離・除去し、ついで比較的高濃度
の塩類溶液で脱離処理することにより、更に高純度のラ
クトフェリンが製造できることが確認された。

以上の試験１〜４から、本発明方法により高純度のラク
トフェリンが製造できることが判明した９２段階の脱離
処理は、ラクトフェリンの純度向上（９８％以上）に有
効であることもまた判明した。

また、以上の試験から、低濃度及び高濃度の塩類溶液は
、共に上記の塩化ナトリウム以外に塩化カリウム、塩化
カルシウム、塩化マグネシウム及びこれらの任意の混合
物の内から選ばれた物質を用いて実施することができる
ことも明らかである。

また、低濃度及び高濃度の塩類は互いに異なる種類の塩
類を使用できる。そしてこれら物質の低濃度及び高濃度
の範囲としては、塩類により若干具なるが、それぞれお
よそ０．４〜２．５％及び２゜０〜１２％である。

本発明における原料乳とイオン交換体との接触、即ち吸
着処理は、使用するイオン交換体の後述する通液特性を
考慮したうえでバッチ撹拌法、カラム連続法等の適宜の
方法で行うことができ、原料乳とイオン交換体を十分に
接触させることのできる方法であればいずれも実施可能
である。

原料乳とイオン交換体の混合体積比率は、イオン交換体
の吸着能力に応じ、またバッチ法においては目的に応じ
て任意に、調製することができる。

即ち、バッチ法においては、一定量の原料乳から多くの
収量を望む場合には多くのイオン交換体を用い、また一
定量のイオン交換体で多くの収量を望む場合には多くの
原料乳を用いることが適当である。

原料乳とイオン交換体の接触時の温度は、６０°Ｃを越
える高温ではラクトフェリンが次第に変性する傾向を持
つため、０〜６０℃とすることが必要である。また、未
殺菌の原料乳にあっては、細菌の繁殖を防ぐため、０〜
１０℃で実施することが望ましい。

原料乳とイオン交換体の接触時間については、接触時の
温度、採用する接触方式（バッチ法又はカラム連続法）
等を勘案して適宜条件を選択する。

この接触方式の採用にあたっては、イオン交換体の通液
特性の１つを規定するタイプの相違を考慮することが望
ましい。

即ち、弱酸性陽イオン交換体は、特性上２つのタイプが
ある。いわゆるハードタイプ及びソフトタイプと呼ばれ
るものである。ハードタイプのイオン交換体は、イオン
強度又はｐＨによってベッドボリュームはほとんど変化
せず、また処理後の流速を上げるなどによりイオン交換
体に圧力を加えても樹脂の圧密ｆヒはほとんどなく、イ
オン交換体をカラム内に保持して高速流で通液すること
が可能である。即ち、ハードタイプのものはバッチ法に
も使用し得るが、特にカラム連続法に適する。

一方、ソフトタイプのイオン交換体はイオン強度又はｐ
Ｈによってベッドボリュームは大きく変化し、また処理
液の流速を上げるなどにより、イオン交換体に圧力を加
えると樹脂は容易に圧宮化し、イオン交換体をカラム内
に保持して高速流で通液することは困難であり、特に脱
脂乳やホエー通液時は他の塩類溶液通液時に比べてイオ
ン交換体層内で大きな圧力損失を示す。従って、原料乳
とイオン交換体の接触方式としてソフトタイプのイオン
交換体はカラム連続法には不適当であり、専らバッチ法
に適する。

そして、ハードタイプ及びソフトタイプの性質を表す指
標として、イオン強度の変化に基づくイオン交換体のベ
ッドボリューム変化を用いることができ、本発明ではＮ
ａ形の弱酸性陽イオン交換体を水で膨潤させたときのヘ
ッドボリュームを、該弱酸性陽イオン交換体がイオン強
度０．５の塩化ナトリウム溶液と平衡化したときのベッ
ドボリュームで除した値（以下体積変化率という）を用
いる。

またＮａ型のイオン交換体は、単に水で完全に湿潤させ
ればよく、Ｎａ型でないイオン交換体の場きには、１０
％塩化す１〜リウム溶液を通液してＮａ型とした後、洗
液中に塩素イオンが検出されなくなるまで水洗すればよ
い。

例えば、表１に掲げたイオン交換体のうちハードタイプ
のものはＣＭ−）ヨパール６５０．　ＣＭ−セロファー
スＦＦ、セパビーズＦＰ−ＣＭ１３であり、体積変化は
すべて１．０であった。またソフトタイプのものは開セ
デックスＣ−５０であり、その体積変化は３．０であっ
た。

また本発明ては、ハードタイプ及びソフ１へタイプいず
れのもてあっても、ラクトフェリンを選択的に吸着する
イオン交換体を用いるため、本発明では脱離工程は単一
の操作で実施でき、更に高純度のラクトフェリンを得る
場合においても、２回の操作で実施することができる。

そして、本発明では回収液中の塩類と水の除去は常法に
従って行うことができる。即ち、限外ｉ濾過法、電気透
析法或は他の透析法により所望の程度まで塩類を除去し
た後、凍結乾燥或は噴霧乾燥等により水を除去すること
によって行なわれる。

以下に本発明の若干の実施例を説明する。

Ｋ厩匠−１ イオン交換基としてカルボキシメチル基を有し、ヘモク
ロビン吸着能力が４　、６ｇ／　］−００＋ｎＮ、体積
変化が１．０であるＣトトヨバール６５０（東洋ソーダ
製）５００社を内径ＬｏｃｍＯカラムに充填し、１０％
食塩水２１を通した後水洗して、Ｎａ型のイオン交換体
を調製した。続いてｐＨ□　、　７の牛の牛脱脂乳６０
ρを温度−１°Ｃ、４１／　ｌ＋の流速てカラ１、通液
した。カラム通過後の脱脂乳はｐＨ６，７であって変化
はなく、外観、風味等にも変化は認められなかった。脱
脂乳通過後、カラムに水を通して水洗いし、脱脂乳分を
除いた後、１０％食塩水５ｅを５ｆｆｉ／ｌ＋の流速で
通液してイオン交換体吸着成分を脱離し、回収液５．Ｏ
ｆを得た。この間ベラドボリユームの変化は認められな
かった。

回収液のラクトフェリン濃度は３６＋＋＋ｇ／　１００
ｍｌであり、２８０ｎｉにおける吸光度は０．４９７で
あった。従って回収液中にラクトフェリンが１８００ｍ
ｇ得られ、そのラクトフェリンの純度は９２％（３６ｘ
０．０１２７ｘｌＯＯ１０，４９７）であった。

火將匠−λ イオン交換基としてカルボキシメチル基を有し、ヘモグ
ロビン吸着能力が、６．１ｇ／１００ｍｆｆ、体積変化
が１．０であるＣトセファロースＦＦ（ファルマシア製
）１ｐをカラムに充填し、２１の０．１Ｎ　１ｌｃ１を
通液した後水洗して、Ｈ形のイオン交換体を調製した。

次いで該イオン交換体を取り出し、ｐＨ６，７の生の牛
脱脂乳１００１に投入し、４℃で６時間撹拌、接触させ
バッチ処理した。６時間経過後、Ｊ過布にてイオン交換
体を除去した。イオン交換体除去後の脱脂乳はｐＨ６，
７であって全く変化はなく、また外観、風味等の変化も
認められなかった。

取り出したイオン交換体はカラムに充填し、水−２８＝ を通じて牛脱脂乳分を除いた後、１０％食塩水５１を５
１／ｈの流速で通液してイオン交換体吸着成分を脱離し
、回収液５．Ｏｉを得た。なおこの工程中のベッドボリ
ュームの変化はほとんどみとめられなっかな。回収液の
ラクトフェリン濃度は１１０ｍｇ／　１００ｍｆｆ１で
あり、２８０ｎｍにおける吸光度は１．４７であった。

従って回収液中にラクトフェリン５５００＋ｎｇが得ら
れ、そのラクトフェリンの純度は９５％（１１０ｘ０．
０１２７ｘｌＯＯ／１．４７）であった。

次いで、この回収液４．９１を分画分子量２０゜０００
を有するＤＩＰＳ社製限外？濾過膜ＣＲ６１ＰＰを装着
したラボモジュールを用いて循環流量８ｆ／ｍｉｎ、平
均圧力３０ｋｇ／ｃ＋ｎ２で限外Ｊ過し、次いで水を加
えてダイアフィルトレージョンを行って食塩除去を実施
した後、食塩除去濃縮液を凍結乾燥し、凍結乾燥品４．
１ｇを得た。この凍結乾燥品を精密に分析したところ、
水分３．２％、ラクトフェリン９２％、及び灰分０．３
％の組成を有していた。この凍結乾燥品の蛋白質の占め
るラクトフェリンの重比率は、９５％（９２Ｘ１００／
（１００−３，２−０，３）であり、回収液の吸光度比
率から求めたラクトフェリンの純度と等しいことが判っ
た。

夫殿匠−１ 脂肪含有量３．０％に調製した牛の乳を７５℃にて１５
秒間殺菌し、後３０℃に冷却し、殺菌乳１００ｋｇを得
た。これに’５０ｔｎｌｌの水に溶解された５ｇの塩化
カルシウムを添加し、１１のスターター（ストレプトコ
ッ力スラクティス；　５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓＩａ
ｃｔｉｓを使用）を添加した後、５００ｍｊ！の水に溶
解されたレンネット２ｇを添加した。凝固後、カッティ
ング、クツキングを行いホエーを排出した。

得られたホエーを浄化後、７５°Ｃ９１５秒の殺菌を行
い、殺菌チーズホエーを製造した。得られた殺菌チーズ
ホエーは１）Ｈ６，４，ラクトフェリン濃度１９ｔｎｇ
／　１００ｍ６であった。

イオン交換基としてカルボキシメチル基を有し、ヘモグ
ロビン吸着能力が、３　、９ｇ／　１００ｍ４、体積変
化が３．０であるＣトセファデックスＣ−５０（ファル
マジア製＞２．’５ｇを水に膨潤し、Ｎａ形のイオン交
換体とし、これを上記殺菌チーズホエー５０ｋｇに投入
し、４°Ｃにて１６時間接触、撹拌し、バッチ処理した
。１６時間経過後、」過布にてイオン交換体を除去した
。イオン交換体を除去した後の殺菌チーズホエーのｐＨ
は６．４であって変化はなく、また外観、風味等の変化
も認められなかった。

収り出したイオン交換体はカラムに充填し、水を通じて
ホエー分を除いた後、０．０５Ｍクエン酸−クエン酸ナ
トリウムでＩ］Ｈ８，Ｏに調製した０、５Ｎ塩化カリウ
ム溶液５００＋ｎβを５００＋ｏＺ／ｈの流速で通液し
てイオン交換体吸着成分を脱離し、回収液５５０社を得
た。回収液のラクトフェリン濃度は２３５　ｍｇ／　１
００　ｍｆであり、２８０ｎｍにおける吸光度は３１っ
であった。従って回収液中にラクトフェリン１２９０ｍ
ｇが得られ、そのラクトフェリンの純度は９４％（２３
５ｘ　０．０１２７ｘ　１００／３．１９）であった。

火度広−士 脂肪含有量３０％に調製した牛の乳を７５℃にて１５秒
間殺菌し、後３０℃に冷却し、殺菌乳１００ｋｇを得た
。これに５０＋ｎｐの水に溶解された５ｇの塩化カルシ
ウムを添加し、１１のスターター〈ス）〜レプトコッ力
スラクティス；　５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔ
ｉｓを使用）を添加した後、５００＋ｎｆの水に溶解さ
れたレンネット２ｇを添加した。凝固後、カッティング
、クツキングを行いホエーを排出した。

得られたホエーを浄化後、７５°Ｃ２１５秒の殺菌を行
い、殺菌チーズホエーを製造した。得られた殺菌チーズ
ホエーはｐＨ６，４，ラクトフェリン濃度１９１ｏｇ／
　１００ｍｌであった。

イオン交換基としてカルボキシメチル基を有し、ヘモグ
ロビン吸着能力が、３．９Ｆｌ／　１００ｍｌ、及び体
積変化が３．０であるＣトセファデックスＣ−５０（フ
ァルマシア製）２．５ｇを水に膨潤し、１１３＋Ｊのベ
ッドボリュームを有するＮａ形のイオン交換体とし、こ
れを上記殺菌チーズホエー５０ｋｇに投入し、４℃にて
１６時間接触、撹拌し、バッチ処理した。１６時間経過
後、２濾過布にてイオン交換体を除去した。イオン交換
体を除去した後の殺菌チーズホエーのＩ）　Ｈは６．４
であって変化はなく、また外観、風味等の変化も認、め
られなかった。

取り出したイオン交換体はカラムに充填し、水を通して
ホエー分を除いた。この時のへットボリュｂは８７ｍｆ
ｆであり、体積変化率は１　、３　（１１３／８７）で
あった。その後塩化すトリウノ、１０％溶液５００ｍｆ
を２５０　ｍｌ／　ｈの流速で通液してイオン交換体吸
着成分を脱離し、回収液５５０ｍ＋！を得た。

この時のへッドホリューノ＼は２−’１．　ｍ／Ｊであ
り、体積変化率は４　、７　（１，１３／２４．）であ
った。回収液のラクトフェリン濃度は２２１１　ｍｇ／
′］、　ＯＯｍＪであり、２８０ｎｍにおける吸光度は
３，０５てあった。従って回収液中にラクトフェリンが
１２３０Ｌｏｇ得られ、そのラクトフェリンの純度は９
３％（２２４ｘ０．０１２７ｘ　１００／３．０５）て
あった。

実施例　５ 生の牛脱脂乳を３５℃に加温し、よく撹拌しながら９倍
に希釈した塩酸を滴下してｐＨ４，６に調整し、凝集し
たカードを分離解除して酸ホエーを製造しな。得られた
酸ホエーはＩ）Ｈ４，６でラクトフェリン濃度は２６　
ｍｇ／　１００　ｍｊ！であった。

カルボキシルメチル基のイオン交換基を有し、ヘモグロ
ビン吸着能力が、４　、　’３ｇ７１００ｍｌ、及び体
積変化率が１．０であるセパビーズＦＰ−ＣＭ１３（三
菱化成製）１００ｍＮをカラムに充填し０．１Ｎ　Ｈｆ
Ｊ！　２００ｍｌを通液した後、水洗し、Ｈ形のイオン
交換体を調製した。次いで該イオン交換体を取り出し、
上記酸ホエー１０１に投入し、４℃で１６時間撹拌、接
触させバッチ処理した。１６時間後、イオン交換体を取
り出しカラｌ＼に充填した。

イオン交換体を除去後の酸ホエーはｐＨ４，７であって
ｐＨ変化は極く僅かであって、また外観、風味等の変化
は全く認められなかった。

充填したイオン交換体は水を通じてホエー分を除いた後
、１０％食塩水５００ｍｐを５００＋ｎＮ／ｈの流速て
カラム通液して回収液５００ｍｌを得た。

これまでの工程中でベッドボリュームの変化はみとめら
れなっかな。回収液のラクトフェリン濃度は２８０＋ｎ
ｇ／　１００＋ｎｆであり、２８０ｎｍにおける吸光度
は３．７８であった。従って回収液中にラクトフェリン
１４００ｍｇが得られ、そのラクトフェリンの純度は９
４％（２８０ｘ０．０１２７ｘｌＯＯ／３．７８）であ
った。

大徳忽−」− イオン交換基としてカルボキシメチル基を有し、ヘモグ
ロビン吸着能が３　、９ｇ／　１００ｍ４！、体積変化
率が３．０であるＯＭ−セファデクスＣ−５０（ファル
マシア製）２５ｇを水にて膨潤させ、Ｎａ形の１１３０
ｍｎのイオン交換体を得た。これを、５５°Ｃに加温し
たｐＩ（６，７の生の生脱脂乳１００ｋｇに投入し、同
温度にて１時間接触・撹拌した。

１時間経過後、過布にてイオン交換体を除去した。

イオン交換体を除去した脱脂乳のＩＩＨは６７てあって
変化はなく、また外観、風味等の変化は何等認められな
かった。

取り出したイオン交換体はカラムに充填し、水を通じて
脱脂乳分を除いた。この時のベッドボリューム＼は８０
０ｍｌであり、体積変ｒヒ率は１．−４（１１３０７８
００）であった。その後５％食塩水７１を７１／ｈの流
速でカラム通液してイオン交換体吸着成分を脱離し、回
収液７．６１を得た。この時のベッドボリュームは３４
０ｍｌであり、体積変化率は３゜３　（１１３０／３４
０）であった。回収液のラクトフェリン濃度は１３０ｍ
ｇ／　１００「Ｉｌｌであり、２８Ｏｒ＋ｎ＋における
吸光度は１．９７であった。従って回収液中にラクトフ
ェリンが９．９ｇ得られ、そのラクトフェリンの純度は
８４％（１３０ｘ　０．０１２７ｘ　１００／１．９７
）であった。

実１引−１− カルボキシルメチル基のイオン交換基を有し、ヘモグロ
ビン吸着能力が、４　、５ｇ／　１００ｍｌ、及び体積
変化が１，０であるセパビーズＦＰ　−ＣＭ１３（三菱
化成製）１００ｍｌを内径１’Ｏｃ’ｍのカラムに充填
し、１２％塩化カリウム溶液２１を通液した後、水洗し
、Ｉ（型のイオン交換体を調製した。続いてｐＨ６，７
の生の牛脱脂乳９６ｋｇを温度４℃、６１／ｈの流速で
カラム通液した。カラム通過後の脱脂乳はｐＨ６，７で
あって変化なく、また外観、風味等にも変化は認められ
なかった。脱脂乳通液後、カラムに水を通じて水洗し、
脱脂乳分を除いた後、２，５％塩化カリウム溶液２０１
を通じて洗浄不純物を分離した。次いで１２％塩化カリ
ウム１ＯＮを通じてイオン交換体吸着成分を脱離し、回
収液１０．０１を得た。なおこれらの工程中における体
積変化はみとめられなつかな。

回収液のラクトフェリン濃度は６２１＋１１？／　１０
０ｍｌであり、２８０ｎｍにおける吸光度は０．７９で
あった。従って回収液中にラクトフェリン６．２ｇが得
られ、そのラクトフェリンの純度は９９゜７％（６２ｘ
０．０１２７ｘｌＯＯ７０，７９）であった。

夾胤匠−隻 カルボキシメチル基のイオン交換基を有し、ヘモグロビ
ン吸着能力が３　、９ｇ／　１００ｍｌおよび体積変化
が３．０であるＣトセファデックスＣ−５０（ファルマ
シア製＞２．５ｇを水に膨潤し、Ｎａ型の１１３ｔｎｌ
のイオン交換体とし、これをｐＨ６，７の生脱脂乳１０
１に投入し、４℃にて接触・撹拌しバッチ処理した。１
６時間後、濾過布にてイオン交換体を分離　除去した。

イオン交換体除去した後の脱脂乳の１１１−１は６７て
あって変化なく、またこの時点でのヘッドボリュームは
８２＋Ｊであり、体積変化率は１　、４　（１１３／８
２）であった。次いで１゜６％塩化ナトリウム溶液２．
Ｏｎを通じて洗浄し不純物を分離した後、５．０％塩化
ナトリウム溶液１、Ｏｐを通してイオン交換体吸着成分
を脱離し、回収液１．ＩＩを得た。この時点てのベッド
ボリュームは３５ｍ（！であり、体積変化率は３．２（
１１３／３５）であった。

回収液のラクトフェリン濃度は６１＋ｎｇ／　１００ｔ
ｎ１であり、２８０ｎｍにおける吸光度は０．７８であ
った。従って回収液中にラクトフェリンが６７０＋ｎｇ
得られ、そのラクトフェリンの純度は９９゜３％（６１
ｘ　Ｏ，０１２７ｘ　１００１０．７８）であった。

次いで、回収液を透析チューブに入れてイオン交換水に
て透析し、塩化ナトリウム除去を実施した後、凍結乾燥
し、凍結乾燥品を６５０ｍｌＢ得た。

凍結乾燥品は水分２，９％、ラクトフェリン９６゜２％
、及び灰分０．５％の組成を有していた。この凍結乾燥
品の蛋白質に占めるラクトフェリンの重量比率は９９６
％（９６，２ｘ　１００（１００−２，９−０，５））
であり、回収液の吸光度比率から求めたラクトフェリン
の純度とほぼ等しいことが分かった。

夫度匠−文 イオン交換基としてカルボキシメチル基を有し、ヘモグ
ロビン吸着能力が、４．６ｇ／　１００Ｉｏｌ及び体積
変化が１．０であるＣトトヨパール６５０Ｃ５００ｍｌ
をカラムに充填し、２．０％塩化マグネシウム水溶液５
βを通液した後、水洗し、Ｍｇ型のイオン交換体を調整
した。次いて該イオン交換体を取り出し、ｐＨ６，７の
生の牛脱脂乳５０ｆに投入し、５５℃で１時間撹拌、接
触させバッチ処理した。ｉ濾過布にてイオン交換体を除
去した。イオン交換体除去後の脱脂乳のｐＨは６．７で
あって全く変化はなく、また外観、風味等の変化も認め
られなかった。

取り出したイオン交換体はカラムに充填し、水を通じて
脱脂乳分を除いた後、０．５５％塩化マグネシウム溶液
１０Ｉｌを通じて洗浄し不純物を分離した後、２０％塩
化マグネシウム水溶液５゜０１を通液してイオン交換体
吸着成分を脱離し、回収液５．Ｏｒを得な。これまての
工程中におけるイオン交換体のベッドボリュームの変化
は認められなかった。回収液のラフ１〜フエリン濃度は
４５　ｍｇ／　１００　Ｊであり、２８０　＋ｏｎにお
ける吸光度は０５８であった。従って回収液中にラクト
フェリンが２２５０＋ｎｇ得られ、そのラクトフェリン
の純度は９８．５％（４５Ｘ０．０１２７ｘｌＯＯ１０
，５８）であった。

夾雑１α 生の牛脱脂乳を３５℃に加温し５、よく撹拌しながら９
倍に希釈した塩酸を滴下してｐＴ−１４，６に調整し、
凝集したカードを分離除去して酸ホエーを調製した。得
られた酸ホエーはｐ［−１４，６てラクトフェリン濃度
は２５　ｍｇ／　１００　ｍｆであった。

イオン交換基としてカルボキシメチル基を有し、ヘモグ
ロビン吸着能力が、３　、９ｇ／　１００＋ｎｆ、及び
体積変化が３．０であるＣＭ−セファデックスＣ−５０
（ファルマシア製）２．５ｇを水に膨潤して、１１３ｍ
（！のＮａ形のイオン交換体とし、更にこの水に塩酸を
加えて０．ＩＮ塩酸溶液とした後、水洗し、１１形のイ
オン交換体を調製した。

この時点でのベッドボリューｌ＼は７３ｍｌ、体積変化
率は］、　、　５　（１１３／７３）であった。次いて
該イオン交換体を、上記酸ホエー１０１に投入し、４℃
で１６時間撹拌、接触させバッチ処理した。イオン交換
体を取り出しカラムに充填し、水を通してホエー分を除
いた。この時点でのヘットホリューｂは３９＋ｎ１、体
積変化率は２　、９　（１１３，／１４）てあった。

得られた回収液のラフ１〜フエリン濃度は６１ｍｇ、ｚ
ｚ　１００　＋ｎＮであり、２８０　＋１１１１にお（
つる吸光度は０゜７８であった。従って回収液中にラク
トフェリンが６１０　ｍｇ？＋られ、そのラフ１へフェ
リンの純度は９９．３％（６１，ｘｏ、０１２７ｘｌＯ
Ｏ１０，７８＞であった。

史巌鮭−１１ 実施例７において２．５％塩化カリウム溶液２０１を通
して洗浄し不純物を分離する工程までは、実施例７と同
様に実施した。次いて５％塩化ナトリウム１０ｆを通液
してイオン交換体吸着成分を脱離し、回収液１０．ＯＮ
を得た。なお、これらの工程におけるベッドボリューム
変化は認められなかった。

回収液のラクトフェリン濃度は６５ｍｇ／　１００ｍｌ
であり、２８０ｎｍにおける吸光度は０．８３であった
。従って回収液中にラクトフェリンが６゜５ｇ得られ、
そのラクトフェリンの純度は９９゜５％（６５ｘ　０．
０１２７ｘ　１００１０．８３）であった。

［発明の効果］ 本発明によれば次の効果が得られ、産業上の効果に優れ
たものである。

（１）原料乳である脱脂乳、ホエーの品質を何等損なう
ことなく、その中に含まれているラクトフェリンを、分
離回収することがてきる。

（２）単純な工程により、高純度のラクトフェリンを得
ることができる。

（３）原料乳を大量に処理することができ、ラクトフェ
リンの工業的製造に適した製造法を提供することが可能
となった。

【図面の簡単な説明】

添付図面は、異なった濃度の塩化ナトリウム溶液を、低
濃度から順次、水洗後のイオン交換体に通液し、各流出
液を分画して、各流出液の２８０ｎｍにおける吸光度と
、各流出液１００ｍｆ中のラクトフェリン濃度とを示す
グラフである。 特許出願人　　森永乳業株式会社 代理人　弁理士　　東　　原　　史　　生同　　　　同
　　　　　　竹　　　１）　　吉　　　部手続補正書 昭和６２年　８月１１日 １、事件の表示 昭和６２年特許願第１６９３３２号 ２、発明の名称 高純度牛ラクトフェリンの製造法 ３、補正をする者 事件との関係　　特　許　出　願　人 氏名又は名称　森永乳業株式会社 ４、代理人　〒１０２ 住　所　　　　　東京都千代田区飯田橋３丁目１１番５
号５　補正命令の日付　自発 ７、補正の内容 （１）明細書第２４頁、第７〜８行のｒ２．ｏＪをｒｌ
、５．と訂正する。 （２）同書第３０頁、第１４行の「３０Ｊを「３」と訂
正する。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）牛乳から調製された脱脂乳またはホエーを含有す
   る原料乳から牛ラクトフェリンを分離回収して高純度の
   牛ラクトフェリンを製造する方法において、 イオン交換基としてカルボキシルメチル基を有し、且つ
   ヘモグロビン吸着能が３．５ｇ／１００ｍｌ以上である
   弱酸性陽イオン交換体に対し、上記原料乳を０〜６０℃
   の温度にて接触させる吸着処理と、上記弱酸性陽イオン
   交換体を水洗する水洗処理と、上記弱酸性陽イオン交換
   体を塩類溶液で処理する脱離処理とを含むことを特徴と
   する、高純度牛ラクトフェリンの製造法。
2. （２）上記弱酸性陽イオン交換体の体積変化率が１．５
   以下であること（但し、体積変化率は、Ｎａ形における
   該交換体を水で膨潤させたときのベッド・ボリュームを
   、該交換体をイオン強度０．５の塩化ナトリウム溶液と
   平衡化したときのベッドボリュームで除した値）を特徴
   とする特許請求の範囲第１項に記載の高純度牛ラクトフ
   ェリンの製造法。
3. （３）ラクトフェリンが、回収された全蛋白質中８０％
   以上の純度で得られることを特徴とする特許請求の範囲
   第１項または第２項記載の高純度牛ラクトフェリンの製
   造法。
4. （４）上記脱離処理に用いられる塩類溶液が、塩化ナト
   リウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシ
   ウム及びこれらの混合物からなる群から選ばれた塩類の
   溶液であることを特徴とする特許請求の範囲第１項〜第
   ３項の内、何れか１項記載の高純度牛ラクトフェリンの
   製造方法。
5. （５）上記脱離処理が、上記群から選ばれた塩類の相対
   的に低濃度の水溶液で行なわれて、それによって上記低
   濃度塩類溶液によって脱離する成分を除去する第１の脱
   離処理と、上記群から選ばれた塩類の相対的に高濃度の
   水溶液で行なわれて、それによって上記高濃度の塩類溶
   液によって脱離する成分を回収する第２の脱離処理とを
   含むことを特徴とする、特許請求の範囲第４項記載の高
   純度牛ラクトフェリンの製造法。
6. （６）上記相対的に低濃度の水溶液の濃度が０．４〜２
   ．５重量％であり、上記相対的に高濃度の水溶液の濃度
   が１．５〜１２であることを特徴とする特許請求の範囲
   第５項記載の高純度牛ラクトフェリンの製造法。
7. （７）ラクトフェリンが、回収された全蛋白質中９８％
   の純度で得られることを特徴とする特許請求の範囲第５
   項又は第６項記載の高純度牛ラクトフェリンの製造法。