JP3161846B2 - 牛乳ホエ−中のシアル酸結合ペプタイドの分離法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は改良ホエーの製造法に関
するものである。更に詳細には、本発明は牛乳ホエーか
らシアル酸結合ペプタイドを分離剤を用いて吸着分離す
る方法に関するものである。更に詳細には、牛乳ホエー
中のシアル酸結合ペプタイドを、親水性の樹脂母体に弱
塩基性交換基を導入した陰イオン交換体に吸着させ、ア
ルカリや塩類で溶離させる方法に関するものである。

【０００２】本発明によれば、各種のすぐれた生理作用
を有するシアル酸結合ペプタイドを効率的に分離採取す
ることができるので、本発明は、機能性食品、特定保健
用食品、健康食品、栄養食品、その他各種飲食品の技術
分野のほか、医薬品や化粧品の技術分野でも重要な役割
を果すものである。

【０００３】

【従来の技術】一般にチーズ製造において生成する牛乳
ホエーは、牛乳中の脂肪とカゼインを除く大部分の有効
水溶性成分を含有している。牛乳ホエーに大量に含まれ
る乳糖は、牛乳ホエーから容易に結晶化され、分離され
て食用や薬用に利用されてきた。

【０００４】しかしながら乳糖を分離した後の牛乳ホエ
ーは多くの場合そのままの状態で、すなわち低乳糖ホエ
ー、又はこれを各種の脱塩処理した脱塩低乳糖ホエーあ
るいは限外濾過処理（ＵＦ）したホエーたんぱく質濃縮
物の状態で、食品素材として利用されている程度であ
る。そしてホエー中のたんぱく質やペプタイドを個々の
成分に分別して利用することは、現在まで特別な例、た
とえばラクトフェリンを牛乳から選択的に分離すること
などを除いて、商業規模ではほとんど実用化されておら
ず、牛乳ホエーに含有されている各種たんぱく質やペプ
タイドの特徴を生かした高度の有効利用はなされていな
いのが現状である。

【０００５】牛乳ホエーには、赤血球の代謝、脳の重要
な機能を担うガングリオシドの構成、ある種の病原菌毒
素の受容等に関与するといわれる（小倉治夫，化学と生
物，２９（４），２４８−２５１，１９９１）シアル酸
が含有されており、その多くはたんぱく質やペプタイド
に結合した形で存在している。一例を挙げればκ−カゼ
インやそのレンネット分解物であるグリコマクロペプタ
イド（ＧＭＰ）、プロテオース・ペプトン（ＰＰ）等で
ある。遊離のシアル酸は、水処理等に用いられている合
成高分子系強塩基性陰イオン交換体に吸着し、容易に溶
離回収できるが（阿南巧一他、基礎生化学実験法５巻，
ｐ１５７，丸善（株），１９７６）たんぱく質やペプタ
イドに結合したものは吸着しにくいことが確認されてい
る。

【０００６】従来、ホエーからシアル酸結合ペプタイド
を分離する試みが多くなされているが、それらの公知技
術及びその問題点を列挙する。

【０００７】（１）ＵＦを用いる方法 １）ジャン−マリ・ウスタシュ、公告特許公報 昭５８
−２３４００ 分画分子量１０，０００〜５０，０００のＵＦでホエー
を処理し、濃縮液側にシアル酸結合たんぱく質を、透過
液側に同低分子物質を分離するものであるが、濃縮液側
には脂肪やシアル酸を含有していないたんぱく質が、透
過液側には乳糖やミネラルが大量に含まれるため、シア
ル酸の純度に問題がある。シアル酸結合ペプタイドの純
度を上げるには、煩雑な後工程が必要である。

【０００８】２）谷本守正ら、公開特許公報 平２−２
７６５４２ ＧＭＰが低ｐＨで分画分子量１０，０００〜５０，００
０のＵＦ膜を透過しやすくなる性質を利用したものであ
るが、ホエーたんぱく質の一部がＧＭＰと挙動を共にす
るため、得られる製品のＧＭＰ純度、すなわちシアル酸
含量には限界がある。

【０００９】（２）クロマトグラフィーを用いる方法 以下にいくつかのシアル酸結合ペプタイド（ＧＭＰ及び
ＰＰ）のクロマトグラフィーによる分離例を示す。これ
らは、主として実験室規模での実験、分析手法であり、
コストや安全性の観点から工業化には無理がある。ま
た、種々の緩衝液を使用しており、簡便な操作とは言え
ない。

【００１０】１）桑田ら、日本農芸化学会誌，４３
（３），１８３−１８８，１９６９ 弱塩基性陰イオン交換体（ＤＥＡＥ−Ｃｅｌｌｕｌｏｓ
ｅ：Ｗｈａｔｍａｎ社）カラムを用いてＧＭＰを分離し
ているが、溶媒にピリジンを使用しているため食品とし
ては安全性に問題がある。また、実験室規模での分離を
前提としており、前処理にゲル濾過カラムやトリクロル
酢酸（ＴＣＡ）処理を行っている。

【００１１】２）Ｃ．Ｖ．Ｍｏｒｒら，Ｊ．Ｆｏｏｄ
Ｓｃｉ．，５３（１），８０−８７，１９８８ ゲル濾過、弱塩基性陰イオン交換（ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈ
ａｄｅｘ：Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ社）、アフィニ
ティクロマトグラフィーを組み合わせることにより、Ｇ
ＭＰを分離しているが操作が煩雑である。陰イオン交換
時にトリス−塩酸−イミダゾール緩衝液を使用してお
り、食品としては安全性に問題がある。

【００１２】３）Ｋａｎｎｏら，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｚｏｏｔ
ｅｃｈ．Ｓｃｉ．，５２（４），２８２−２９６，１９
８１ ゲル濾過と弱塩基性陰イオン交換（ＤＥＡＥ−Ｃｅｌｌ
ｕｌｏｓｅ ＤＥ５２：Ｗｈａｔｍａｎ社）を併用し、
ＰＰを分離している。ゲル濾過にトリス−塩酸緩衝液、
弱塩基性陰イオン交換にトリス−リン酸緩衝液を使用し
ており、食品としては安全性に問題がある。また、前処
理に硫酸アンモニウム分画を行っており、それを除去す
るのに手間がかかる。

【００１３】４）Ｓ．Ｗ．Ｌｅｅら，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５１（６），１５３５−１５４０，
１９８７ カルボキシメチル（ＣＭ）基を導入した弱酸性陽イオン
交換体（ＣＭ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｃ−２５：Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ ＬＫＢ社）カラムを用い、ＧＭＰを分離し
ている。展開溶媒にイミダゾール−塩酸緩衝液を使用し
ているため、食品としては安全性に問題がある。

【００１４】５）Ｃ．Ｏｌｉｅｍａｎら，Ｎｅｔｈ．Ｍ
ｉｌｋ Ｄａｉｒｙ Ｊ．，３７，２７−３６，１９８
３ ゲル濾過高速液体クロマトグラフィーを用いてＧＭＰを
分離している。ＧＭＰの検出を目的としている。前処理
として、試料にＴＣＡを添加しているため、食品として
は安全性に問題が残る。

【００１５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、このような
技術の現状に鑑みてなされたものであって、牛乳ホエー
中からシアル酸結合ペプタイドを効率的に、簡便に分離
するシステムを新たに開発するためになされたものであ
る。

【００１６】

【課題を解決するための手段】本発明は、上記目的を達
成するため各方面から検討した結果完成されたものであ
って、その基本的技術思想は、牛乳ホエーをｐＨ４−６
に調整した後、親水性の樹脂母体に弱塩基性の交換基を
導入した陰イオン交換体に接触させた後、該イオン交換
体にアルカリ金属塩、又はアルカリ土類金属塩の溶液を
通液すること、を特徴とする牛乳ホエー中のシアル酸結
合ペプタイドの分離方法である。

【００１７】また、本発明における牛乳ホエーとして
は、チーズホエー、レンネットホエー、それらを電気透
析等で脱塩したもの、ＵＦ等で濃縮したＷＰＣ、あるい
は加熱処理等を行って得られる除たんぱく質ホエーやＷ
ＰＣ、又はそれらの乾燥物を水で還元したものから選ば
れた１種以上が用いられる。

【００１８】また、本発明においては、親水性の樹脂母
体に弱塩基性交換基を導入した陰イオン交換体にシアル
酸結合ペプタイドを吸着せしめ、吸着したシアル酸結合
ペプタイドはアルカリ金属塩、又はアルカリ土類金属塩
の溶液で溶離せしめることにより、牛乳ホエー中のシア
ル酸結合ペプタイドを分離するものである。

【００１９】本発明においては、各種牛乳ホエーをｐＨ
４−６に調整した後、親水性の樹脂母体に弱塩基性交換
基を導入した陰イオン交換体に接触させてシアル酸結合
ペプタイドのみを陰イオン交換体に吸着させ、該イオン
交換体にアルカリ金属塩、又はアルカリ土類金属塩の溶
液を通液し、シアル酸結合ペプタイドを分離するもので
ある。

【００２０】牛乳ホエーをあらかじめｐＨ４−６に調整
しておくことは、親水性の樹脂母体に弱塩基性交換基を
導入した陰イオン交換体へのシアル酸結合ペプタイドの
吸着にとってきわめて重要であって、この条件からはず
れるとシアル酸結合ペプタイドの吸着率が低下し、本発
明の目的が達成されないことになる。本発明で使用する
親水性の樹脂母体に弱塩基性交換基を導入した陰イオン
交換体は、アガロース、デキストラン、セルロース、キ
トサン等の天然高分子多糖類、水酸基等の親水性官能基
を多数有する合成ポリビニル等を母体とする担体に、ジ
エチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基、アミノ基等の弱塩
基性の陰イオン交換基を導入したものであり、一般に市
販されているので、市販品を使用すればよい。４級アミ
ンや４級アミノエチル基といった強塩基性の交換基を導
入した強塩基性陰イオン交換体でも、シアル酸結合ペプ
タイドは吸着するが、吸着率が劣るため交換基は弱塩基
性のものが望ましい。

【００２１】本発明において、親水性の樹脂母体に弱塩
基性交換基を導入した陰イオン交換体を使用するに際し
ては、通常のイオン交換樹脂と同様にカラム式、バッチ
式での処理が可能である。作業効率を考えた場合、操作
は断続的なものより連続的なものがよい。また、吸着率
を上げるには試料をあらかじめ脱塩し、シアル酸結合ペ
プタイドの陰イオン交換体への吸着に対して競合的に作
用する塩類を除くことが好ましい。

【００２２】バッチ式の場合は、親水性の樹脂母体に弱
塩基性交換基を導入した陰イオン交換体と牛乳ホエーを
混合し、ｐＨを所定の値に調節するだけでシアル酸結合
ペプタイドが吸着される。ただし、ホエーたんぱく質、
例えばβ−ラクトグロブリンやα−ラクトアルブミンが
共存する場合は、その１部も同時に吸着するので、シア
ル酸純度を高めるにはカラム式での処理が望ましい。

【００２３】カラム式の場合、親水性の樹脂母体に弱塩
基性交換基を導入した陰イオン交換体を充填したカラム
に、ｐＨ４−６に調整した牛乳ホエーを通液するだけで
シアル酸結合ペプタイドのみが吸着され、共存するホエ
ーたんぱく質はほとんど吸着されない。吸着されたシア
ル酸結合ペプタイドはカラムに苛性ソーダ、苛性カリ等
のアルカリ液、又は塩化ナトリウム等の塩溶液を流すこ
とによって溶離させ、カラムを洗浄し、再び牛乳ホエー
の処理に使用できるものである。特に、アルカリ液をシ
アル酸結合ペプタイドの溶離に使用した場合は、イオン
交換体の再生の手間が省略できる。

【００２４】次に本発明の試験例及び実施例を示す。な
お、シアル酸の定量は、チオバルビツール酸を用いる比
色法（阿南巧一他、基礎生化学実験法５巻，ｐ１５７，
丸善（株），１９７６）で行った。

【００２５】

【試験例１（分離剤のスクリーニング）】分離剤１０ｍ
ｌに対して１２％（ｗ／ｗ）濃度で還元したＥＤＷＰ
（ゴーダチーズホエーを電気透析脱塩し乾燥した物）を
５０ｍｌ混合し、所定のｐＨで２０分間攪拌保持した
後、濾紙で反応液と分離剤を分離し、濾液をシアル酸結
合ペプタイドの１つであるＧＭＰの定量に供した。

【００２６】（濾液中のＧＭＰ濃度／反応前のＧＭＰ濃
度）を指標に、各種分離剤のＧＭＰ吸着量を比較したと
ころ、表１〜表４の結果が得られた。表には示さなかっ
たが、カルボキシメチル基やスルホプロピル基等を交換
基とする陽イオン交換体には、いずれのｐＨにおいても
ＧＭＰはほとんど吸着されなかった。

【００２７】

【表１】

【００２８】

【表２】

【００２９】

【表３】

【００３０】

【表４】分離剤のスクリーニング（４） 注）各メーカーの分離剤毎に試験を実施した。試験試料
としたＥＤＷＰのロットが異なるため、原液のＧＭＰ濃
度は各実験で相違する。 注）交換基略号 ＤＥＡＥ：ジエチルアミノエチル； ＱＡ：４級アミン； ＱＡＥ：４級アミノエチル； ＴＡ：３級アミン； ＰＡ ：１，２級ポリアミン ＊１：１００−（濾液中のＧＭＰ濃度／反応前試料中の
ＧＭＰ濃度）×１００ ＊２：弱塩基性陰イ オン交換基 ＊３：強弱塩基性陰イオン交換基

【００３１】上記結果から明らかなように、ＧＭＰ吸着
量の大きい分離剤としてＤＥＡＥ基を交換基とするＤＥ
ＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ２５、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈ
ａｃｅｌ、ＤＥＡＥ−Ｃｅｌｌｕｌｏｆｉｎｅ Ａ２０
０、同Ａ５００、ＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５
０ｓ、アミノ基を交換基とするＣｈｉｔｏｐｅａｒｌＥ
Ｐ−０３、同ＥＰ−０５等が挙げられた。これらはいず
れもデキストラン、セルロース、キトサンといった親水
性天然高分子多糖類や、水酸基を有する親水性ポリビニ
ルを母体とする弱塩基性陰イオン交換体であり、親水性
の母体に４級アンモニウム基を導入した強塩基性陰イオ
ン交換体よりＧＭＰ吸着量は全体的に大きい傾向が認め
られた。

【００３２】上述した分離剤をカラムに充填後、水及び
ＥＤＷＰ還元液を通液し、カラム内圧力損失、流速の変
化を調ベたところ、バッチ式反応での分離剤と反応液の
分離性（濾過性）や、カラムの大型化に伴うカラム内圧
力損失の上昇、分離剤層の圧密化等の観点から、操作性
に優れる分離剤としてＤＥＡＥ−Ｃｈｉｔｏｐｅａｒｌ
ＥＰ−０３、同ＥＰ−０５、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄ
ｅｘ Ａ２５が挙げられた。

【００３３】

【試験例２（試料のＰＨ及び脱塩の影響）】試験例１に
示した方法で、ＧＭＰ吸着量に及ぼすｐＨ及び脱塩の影
響を調べた。試料はＥＤＷＰ還元液と電気透析処理を行
っていないホエー粉（ＷＰ）還元液とした。ＥＤＷＰ、
及びＷＰの組成を表５に示した。ＤＥＡＥ−Ｃｅｌｌｕ
ｌｏｆｉｎｅ Ａ２００、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ
Ａ２５、及びＣｈｉｔｏｐｅａｒｌ ＥＰ−０３を使用
した場合のＧＭＰ分離例を図１に示した。非吸着液中の
ＧＭＰ濃度は、試料のｐＨが４〜６近辺が大きく、ま
た、ＥＤＷＰ還元液の場合よりＷＰ還元液のほうが大き
く、脱塩によりＧＭＰ吸着量が増大することが示され
た。

【００３４】

【表５】

【００３５】

【試験例３（試料の濃度の影響：カラム処理）】ＧＭＰ
含量の異なる２種ホエー素材の還元液を、分離剤１５０
ｍｌ充填したカラムに通液し、処理の比較を行った。Ｅ
ＤＷＰ、及びＷＰＣの相対ＧＭＰ含量を表６に示した。
ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ２５を用いた場合のＧ
ＭＰ分離例を表７に示した。試料の濃度（Ａ）、処理量
（Ｂ）、及び還元前の粉体試料中の相対ＧＭＰ含有量
（Ｃ）を乗じ、ＥＤＷＰとＷＰＣの場合のそれぞれのＧ
ＭＰ吸着量を比較したところ、ＧＭＰ吸着量はＷＰＣ還
元液の方が大きかった。このことは、試料中の灰分濃度
が低ければ、ＧＭＰ濃度が高くても分離剤に対するＧＭ
Ｐの絶対吸着量は低下しないことを意味している。カラ
ム処理時間の短縮の観点から、試料はＥＤＷＰよりＷＰ
Ｃの方が好ましいことが確認された。

【００３６】

【表６】

【００３７】

【表７】

【００３８】ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ２５、及
びＣｈｉｔｏｐｅａｒｌ ＥＰ−０５を充填したカラム
を用い、ＷＰＣ溶液からＧＭＰを分離した例を図２、３
にそれぞれ示した。その結果、β−ラクトグロブリンや
α−ラクトアルブミンはほとんど吸着されないことが確
認された。

【００３９】

【試験例４（溶離条件）】分離剤５０ｍｌを充填したカ
ラムにＷＰＣ溶液を十分量通液し、ＧＭＰが吸着飽和に
達した時点で分離剤を水洗した後、分離剤を４ｍｌずつ
分取し、種々濃度の塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、又は
苛性ソ−ダ（ＮａＯＨ）溶液の１６ｍｌを混合してＧＭ
Ｐのバッチ溶離を試みた。０．５Ｍ 塩化ナトリウム
（ｐＨ６）のＧＭＰ溶離力を１．００としたときの各種
実験条件下での相対ＧＭＰ溶離力を表８に示した。ＧＭ
Ｐは塩酸や希苛性ソ−ダでｐＨをそれぞれ３又は９程度
とすることにより一部溶離されることが予備実験で確認
されているが、溶離力は十分ではなかった。０．５Ｍ程
度の塩化ナトリウムや０．１Ｎ程度の苛性ソ−ダを用い
ることにより、ＧＭＰの溶離率は大幅に上昇することが
表８から知ることができる。ＧＭＰを効率的に回収する
には、高濃度の苛性ソ−ダを使用すればよいが、ＧＭＰ
の安定性、分離剤の耐薬品性等を考慮すると、溶離は
０．１Ｎ程度の苛性ソ−ダを用いるのがよいと考えられ
る。

【００４０】

【表８】

【００４１】

【実施例】内径５０ｍｍ、高さ２００ｍｍのアクリル樹
脂製カラムにＣｈｉｔｏｐｅａｒｌ ＥＰ−０５を１５
０ｍｌ充填し、金網積層型フィルターを介して５段積層
した多段カラムを作製した（総分離剤量７５０ｍｌ）。
ＷＰＣ５％（ｗ／ｗ）溶液のｐＨを４．４とし、６０℃
で６０分間加熱後、３，０００Ｇで遠心分離してＷＰＣ
中の脂肪、凝集した変性たんぱく質を除き、上清のｐＨ
を５．５に調節して上記カラムに通液した（２０００〜
２５００ｍｌ／ｈ）。ＷＰＣ液２２．５ｌを通液後、脱
塩水でカラムを洗浄し、０．１Ｎ 苛性ソ−ダを延ベ
４．５ｌ循環して吸着物を溶離させた。更にカラム内液
を脱塩水で押し出し、溶離液を回収した。溶離液は中和
後分画分子量１０，０００のＵＦ膜で８倍に濃縮し、電
気透析で脱塩後凍結乾燥した。得られた粉体の収率、シ
アル酸含量はそれぞれ８．３、７．１９％であり、回収
されたシアル酸結合ペプタイドはほとんどがＧＭＰとＰ
Ｐであった。

【００４２】

【発明の効果】本発明によってはじめて、シアル酸結合
ペプタイドを工業的に分離することが可能となり、生理
的機能にすぐれたシアル酸結合ペプタイド、ひいてはシ
アル酸の効率的製造がはじめて可能となった。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＧＭＰの吸着性に及ぼすｐＨ及び脱塩の影響を
図示したグラフである。

【図２】ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ２５によるＧ
ＭＰの分離例を示す。

【図３】Ｃｈｉｔｏｐｅａｒｌ ＥＰ−０５によるＧＭ
Ｐの分離例を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 植田 智子 東京都東村山市栄町一丁目21番３号 明 治乳業株式会社中央研究所内 (72)発明者 池田 温美 東京都東村山市栄町一丁目21番３号 明 治乳業株式会社中央研究所内 (72)発明者 松下 武志 東京都千代田区丸の内三丁目２番３号 日本錬水株式会社内 (72)発明者 菊池 隆 東京都千代田区丸の内三丁目２番３号 日本錬水株式会社内 (72)発明者 栗原 一郎 東京都千代田区丸の内三丁目２番３号 日本錬水株式会社内 (72)発明者 宇佐美 仁 東京都千代田区丸の内三丁目２番３号 日本錬水株式会社内 (56)参考文献 特開 平４−243898（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−104246（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) A23J 1/20 A23L 1/305 C07K 1/16 - 1/22 A23C 21/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 シアル酸結合ペプタイドを含有する牛乳
   ホエーをｐＨ４〜６に調整して、該牛乳ホエーを親水性
   の樹脂母体に弱塩基性交換基を導入した陰イオン交換体
   に接触させた後、該陰イオン交換体にアルカリ金属塩、
   又はアルカリ土類金属塩の溶液を通液すること、を特徴
   とする牛乳ホエー中のシアル酸結合ペプタイドの分離
   法。
2. 【請求項２】 牛乳ホエーが、レンネットホエー、それ
   らを電気透析等で脱塩したもの、限外濾過等で濃縮した
   ホエーたんぱく質濃縮物（ＷＰＣ）、あるいは加熱処理
   等を行って得られる除たんぱく質ホエーやＷＰＣ、及び
   それらの乾燥物を水で還元したものから選ばれた１種以
   上である請求項１に記載の牛乳ホエー中のシアル酸結合
   ペプタイドの分離法。