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JPS63101757A - 分析物濃度の定量方法 - Google Patents

分析物濃度の定量方法

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JPS63101757A
JPS63101757A JP62200079A JP20007987A JPS63101757A JP S63101757 A JPS63101757 A JP S63101757A JP 62200079 A JP62200079 A JP 62200079A JP 20007987 A JP20007987 A JP 20007987A JP S63101757 A JPS63101757 A JP S63101757A
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LifeScan Inc
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Publication date
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、水性流体、特に全血液中の化学成分及び生化
学成分（分析物）の比色定量用試薬装置及び試験方法に
関する。好ましい一態様によれば、本発明は、全血液中
のグルコース濃度を比色的に測定する為の試験装置及び
試験方法に関する。
〔従来の技術及び発明が解決すべき問題点〕着色水性流
体中、特に全血液及び尿素などの着色生体液並びに血清
及び血漿などの着色生体液誘導体中の化学成分及び生化
学成分の定量化が、益々重要性を増している。これにつ
いての重要な用途としては、医療における診断及び治療
、並びに治療用薬物、中毒物、危険化学薬品等への暴露
に関する定量化が挙げられる。ある場合には、測定物質
の量が、１デシリツトル当たり１マイクログラム以下の
範囲といったように非常に少量であるか、あるいは正確
に定量するのが困難な程度の量であり、従って、用いら
れる装置が、複雑であり且つ熟練した研究員のみしか用
いることが出来ないことがある。この場合には、一般に
、試料採取後数時間ないしは数日間は、結果を入手する
ことができない。又、他の場合には、迅速あるいは即時
情報表示装置を据えつけである実験室外で、素人のオペ
レーターが、この試験を日常的に、迅速に且つ再現性良
く行う為の技量に重点が置かれることがある。医療にお
いて一般的に行われる試験のひとつとして、糖尿病患者
による血中グルコース濃度の測定が挙げられる。現在で
は、糖尿病患者が個々の場合に応じて種類及び重度によ
って１日２〜７回血中グルコース濃度を測定することを
勧めている。このようにして得られたグルコース濃度の
パターンに基づいて、患者と医者が協議のうえ、食事、
運動及びインシュリン摂取量を調整して、糖尿病をより
よく治療する。このような場合には、明らかに、患者が
測定値についての情報を直ちに入手できるようでなくて
はならない。
現在米国で広く用いられている方法では、１９６７年１
月１７日発行されたマスト（Ｍａｓ　ｔ）による米国特
許第３．２９８．７８９号に記載されている種類の試験
用品が用いられている。この方法では、まず、採取した
ばかりの全血液の試料（一般に２０〜４０ｔ１１）を、
グルコースオキシダーゼ及びペルオキシダーゼ活性を有
する酵素系含有のエチルセルロースで被覆した試薬パッ
ド上に置く。この酵素系をゲルコートと反応させ過酸化
水素を放出させる。パッドには、指示薬も含有されてお
り、ペルオキシダーゼの存在下で過酸化水素と反応して
、試料中のグルコース濃度に比例した強度で発色する。
他の良く用いられている方法では、同様の化学反応を利
用しているが、エチルセルロースで被覆したパッドの代
わりに、酵素と指示薬を分散した耐水性フィルムを用い
ている。この種の装置は、１９７１年１２月２８日発行
されたレイ（Ｒａｙ）等による米国特許第３，６３０．
９５７号に記載されている。
上記の両方の場合において、試料は、特定の時間（一般
に１分間）、試薬パッドと接触状態に置かれる。その後
、前者の場合血液試料を水流で洗浄して落とし、一方、
後者の場合フィルムをぬぐい取る。次に、パッドあるい
はフィルムを吸い取って乾燥し、評価する。評価は、発
生した色をカラーチャートと比較するか、パッドあるい
はフィルムを拡散反射率測定器中に入れ、色の強度を読
み取ることにより行う。
上述の方法は、長年グルコース濃度監視用に用いられて
きたが、幾つかの限界がある。例えば、フィンガーステ
ィック（ｆｉｎｇｅｒ　５ｔｉｃｋ）試験の割りには、
必要な試料のかさがかなり大きく、毛細血管の血液が容
易に出ないある人々の場合には、それだけの試料を採取
することが困難である。
更に、これらの方法では、結果が、試料と試験試薬との
反応の絶対的な程度に関係する色の読み取りの絶対値に
基づいて出されるために、他の素人オペレータ用簡便比
色定量法と同様の限界事項がある。即ち、決められた時
間間隔で反応後、試料を洗い流すか、あるいは試薬パッ
ドを拭い取らねばならず、使用者は、決められた時間間
隔の終わりには待機して必要な時間に拭い取るか、ある
いは水流をかけなければならない。又、試料を取り出し
て反応を停止するために、得られる結果、特に家庭での
使用者の手法に曖昧さが生ずる。つまり、洗浄し過ぎる
と結果が低くなり、一方、洗浄が足りないと結果が高く
でる。
素人オペレータ用箇便比色定量法によくある他の問題は
、血液を試料パッドに塗布するときにタイミングシーケ
ンースを行う必要があることである。使用者は、一般に
、フィンガースティック（ｆｉｎｇｅｒ　５ｔｉｃｋ）
を行って血液試料を得、指から得た血液を試薬パッドに
塗布すると同時に他の手でタイミングサーキット（ｔｉ
ｍｉｎｇ　ｃｉｒｃｕｉｔ）を始動する必要があり、従
って、両方の手を同時に使用する必要がある。血液を試
薬パッドに塗布するちょうどそのときに、確実にタイミ
ングサーキットの始動が必要なこともあり、このことは
とりわけ困難である。従来の方法全てにおいて、測定結
果を得るために付加的操作あるいは付加的サーキットリ
ーが必要である。従って、反射率読み取り器をこの面に
おいて簡素化することが望ましい。
赤血球等の着色成分が存在すると絶対値の測定を妨害す
ることがあり、従って、最も広〈実施されている上記の
二つの従来法においては、赤血球を排除する必要がある
。米国特許第３．２９８．７８９号に記載されている装
置では、エチルセルロース膜により、赤血球が試薬パッ
ドに入り込むのを防止している。同様に、米国特許第３
．６３０．９５７号では、耐水性フィルムにより、赤血
球の侵入を防止している０両方の場合において、洗浄あ
るいは拭い取りの操作も、妨害の可能性のある赤血球を
、測定前に除去する働きをする。
従って、反射率の読み取りを行う反射率ストリップから
、液体の過剰分を除去する必要のない、血液等の着色液
中の分析物を検出するシステムの必要性が残されている
。
〔問題点を解決するための手段〕 本発明によれば、シグナル生成系を含有する親水性多孔
質マトリックスと流体マトリックスに浸透してマトリッ
クスの反射率が変化すると始動する反射率測定装置から
構成される、診断測定用の新規な方法、組成物及び装置
が提供される。本発明の方法は、試料、−ｉ的には全血
液を、赤血球などの大きな粒子を濾去するマトリックス
に、−般的にはマトリックスを装置に存在させた状態で
添加することからなる。シグナル生成系は、試料中の分
析物の存在に関係するマトリックスの反射率をさらに変
化させる生成物を生じる。
本発明による診断測定システムの代表例としては、血液
に由来する妨害及び使用誤差を生じる複雑なプロトコー
ルなしに行うことができる全血液中のグルコースの定量
が挙げられる。
拭１翌素 本発明により、特に酵素生成物として過酸化水素を生成
する酵素基質を含むグルコースなどの分析物の定量用の
信頼性があり且つ操作の容易な装置を用いる、迅速性及
び簡便性の面で改善された方法が提供される。本発明の
方法は、少量の全血液を多孔質のマトリックスに塗布し
、マトリックスを十分に浸す工程を包含する。マトリッ
クスには、マトリックスの反射率の最初の変化をもたら
す生成物を生じるシグナル生成系の一種又はそれ以上の
試薬が結合している。血液が塗布される時には、マトリ
ックスは一般的に反射率測定装置中に存在する。液体試
料がマトリックスに浸透し、測定表面で最初の反射率の
変化が生じる。最初の反射率の変化の後、−回又はそれ
以上の回数読み取りを行い、反応生成物の生成の結果起
こる測定表面あるいはマトリックスにおける反射率の更
なる変化と試料中の分析物の量とを関連づける。
血液における測定、特にグルコースの測定の場合には、
一般的に、測定媒体として全血液を用いる。
マトリックスには、過酸化水素を生成するオキシダーゼ
酵素が含有されている。又、マトリックスには、更に第
二酵素、特にペルオキシダーゼ、及びペルオキシダーゼ
に結合した吸光生成物を生じる色素系が含有されている
。吸光生成物が反射率シグナルを変化させる。全血液の
場合、二つの波長で読み取りを行うが、そのうちの一つ
は、ヘマトクリット、血液の酸化や、他の結果に影響を
及ぼす変数によって生じるバックグランドを差し引（為
に用いられる波長での読み取りである。
用いられる試薬要素は、マトリックスとマトリックス内
に含有されるシグナル生成系部材からなっている。又、
この試薬要素には、個々の用途に応じて他の成分を含有
させてもよい、この方法では、一般的に、必要に応じて
行う抗凝固剤以外の前処理をしない少量の血液をマトリ
ックスに塗布する必要がある。測定の時間的調節は装置
により行われ、流体がマトリックスに浸透すると、自動
的にマトリックスの反射率の変化を検出する。その後、
反応生成物の生成の結果生じる所定の時間にわたる反射
率の変化を、試料中の分析物の量と関連づける。
本発明において考慮すべき最初の成分は、好ましくはパ
ッドの形状をしている試薬要素である。
この試薬要素は、不活性の多孔質マトリックスと、分析
物と反応して吸光反応生成物を生成し、多孔質マトリッ
クスの孔中に浸透することのできるシグナル生成系から
なる。このシグナル生成系は、マトリックスを通る液体
の流れをあまり妨げないものである。
容易に反射率の読み取りが出来るように、マトリックス
が実質的に滑らかで且つ平らな少なくとも一つの面を有
することが好ましい。一般的には、マトリックスは、少
なくとも一つの滑らかな平らな面を有する薄板状に成形
したものである。使用の際、分析すべき液体試料をこの
薄板の一つの面に塗布すると、存在する測定物質が、毛
管作用、吸い上げ作用、重力流動作用及び／又は拡散作
用により試薬要素を通って進む。マトリックスに存在す
るシグナル生成系が反応し、吸光反応生成物を生じる。
入射光は、試薬要素の試料を塗布した以外の位置に当た
る。光は、試薬要素の表面から拡散反射光として反射す
る。この拡散光を集め、例えば、反射率分光光度計の検
出器で測定する。
次に、反射光の量を、通常試料中の分析物の量の逆関数
である試料中の分析物の量と関連づける。
ヱ上ユヱ久久 試薬要素を生成するのに必要な各成分について以下説明
する。まず最初に、マトリックス自体について説明する
。
マトリックスは、場合により試薬が共有結合あるいは非
共有結合により結合する親水性マトリソクスである。こ
のマトリックスは、水性媒体がそこを通って流れること
のできるものである。又、マトリックスは、タンパク質
成分がタンパク質の生物学的活性、例えば、酵素の酵素
活性にあまり悪影響を与えることなく結合することので
きるものである。マトリックスは、タンパク質が共有結
合する程度に応じて、共有結合の活性部位を有するか、
あるいはこの分野において公知の手段で活性化してもよ
い。このマトリックス組成物は、反射性であり、且つマ
トリックスからの反射に十分影響を与えることのできる
吸光色素を、空隙部あるいは表面に生成させるに十分な
厚みを有するものである。又、マトリックスは、必要と
される構造及び物性を与える均一組成物あるいは基板上
に形成した被膜の形態でもよい。
マトリックスは、通常ぬれても変形せず、従って、最初
の形状及び大きさを維持する。又、マトリックスは、所
定の吸収性を有し、吸収容量は適当な限度内に設定され
、吸収容量の差は、通常約５０％未満、好ましくは１０
％以下に保たれる。
このマトリックスは、通常の方法で製造できる程度に十
分な湿潤強度を有するものである。又、マトリックスは
、非共有的に結合した試薬がマトリックス表面に比較的
均一に分布できるものである。
マトリックス表面を構成するものの代表例としては、特
に全血液を含有する試料の場合には、ポリアミドが挙げ
られる。ポリアミドは、好ましくは炭素数４〜８の単量
体の縮合重合体であり、この場合の単量体は、ラクタム
類、あるいはジアミンとジカルボン酸の組み合わせから
なるものである。又、これらに匹敵する性質を有する他
の重合組成物も使用することができる。これらのボッア
ミド組成物は、変性して帯電構造を与える他の官能基を
導入し、マトリックス表面を中性、正、あるいは負に帯
電させたり中性、塩基性あるいは酸性状態にしてもよい
、好ましいマトリックス表面は、正に帯電したものであ
る。
全血液を使用する場合には、好ましくは０．１〜２、　
Ｏｔｓ　ｓより好ましくは０．６〜１．０　ｔａの平均
孔径を有する多孔質マトリックスが好ましい。
このような多孔質マトリックスを製造する好ましい方法
としては、親水性ボタマーを不織布コアーにキャストす
る方法がある。このコアー繊維は、ポリエステル類及び
ポリアミド類などの上記の結合性及び強度を生じる繊維
状物質であればよい。
後で詳細に説明する吸光性反応生成物を生成する試薬は
、マトリックスの孔中に存在するが、マトリックスを封
止せず、分析すべき血液などの測定媒体の液状部分がマ
トリックスの孔を通って流れ、一方、赤血球などの粒子
は表面で保持される。
マトリックスは、実質的に反射性のものであり、反射性
基地を用いなくとも拡散反射を生ずる。好ましくは少な
くとも２５％、より好ましくは少なくとも５０％のマト
リックスへの入射光が反射し、拡散反射として放出され
るものがよい。マトリックスの厚さは、通常約０．５鶴
未満、好ましくは約０．０１〜０．３　ｗである。０．
１〜０．２　ｗの厚さが、特にナイロン製マトリックス
の場合には、最も好ましい。
マトリックスは、必須条件ではないが、一般的に、物理
的形態と剛性を付与するためにホルダーに取りつけられ
る。第１図は、本発明の一態様であり、薄い親水性マト
リックスパッド１１を接着剤１３によりプラスチック製
ホルダー１２の一端に配置する。この接着剤により、試
薬パッドは直接且つ堅固にホルダーのハンドルにとりつ
けられる。試薬が試薬パッドの一つの面に塗布され、光
が地面から反射されるように、試薬パッド１１が取りつ
けられるプラスチック製ホルダー１２の部分に穴１４が
設けられる。
試験されるべき液体試料は、パット１１に塗布される。
一般的に、試料が、本発明で用いられる代表例である血
液である場合には、試薬パッドの表面積は、５〜１０ｍ
の試料が十分にしみ込む容積でり、約１０　ｍ　”〜１
００ｍ”　、特に好ましくは１０鶴２〜５０鶴８のオー
ダーである。
従来技術では、拡散反射率測定を、反射性裏地をマトリ
ックスに取りつけるが、あるいはマトリックスの裏面に
配置して行ってきた。しかしながら、本発明の実施にあ
たっては、試薬要素の一部分としてでも、そのような裏
地は必要とせず通常は配置しない。
第１図かられかるように、支持体に試薬パッド１１が保
持され、試料が試薬パッドの一つの面に塗布され、また
、光の反射率が試薬を塗布した位置と逆の試薬パッドの
面から測定されるようになっている。
第２図は、裏のハンドルに穴がある面に試料を塗布し、
一方、試薬パッドの他面で光を反射させ測定するシステ
ムを示す、これに関連して、図に示したちの以外の構造
のものを用いてもよい。パッドは、図示したように照ら
される種々の形状及び形態のものであってもよい、この
パッドは、少なくとも一表面、通常は二表面上で近接で
きる。
親木性Ｎ（試薬要素）は、従来のいずれの手段、例えば
、ホルダー、クランプあるいは接着剤で支持体に取りつ
けることができる。しかしながら、裏地に接着するが好
ましい、この接着は、非反応性接着剤を用いて、親水性
層に用いている材料の一部を取り込むに十分な程度に裏
地表面を融解させる熱的方法、あるいは同様に親水性試
料パッドを融解して裏地と一体にするマイクロ波又は超
音波接着法により行うことができる。これに関連して、
読み取りを行う位置では接着剤の必要性がないのでこの
ようなεとが起こりそうにないが、上記の接着それ自体
が拡散反射率の測定あるいは測定すべき反応を実質的に
訪客しないように行うことが重要である。例えば、接着
剤１３を裏地ストリップ１２に塗布し、その後、まず穴
１４をストリップと接着剤との結合体にあけ、その後、
試薬パッド１１を、穴１４に近接した接着剤に貼り付け
て、試薬パッドの周囲部分が裏地ストリップに結合する
ようにすることができる。
化学試薬 シグナル生成系としては、試料中の分析物と反応し、測
定媒体が十分な吸収を示す波長以外の波長で特徴的な吸
収を示す化合物を直接的ないしは間接的に生成すること
のできるものであればいずれのものも用いることができ
る。基質（分析物）が酸素を利用するオキシダーゼ酵素
と反応するような反応方法を実施するには、ポリアミド
マトリックスが特に有効である。これらの反応において
は、生ずる生成物が、更に色素中間体と反応し所定の範
囲の波長を吸収する色素を、直接的あるいは間接的に生
成する。例えば、オキシダーゼ酵素が基質を酸化し、反
応生成物として酸化水素を生ずる。次に、この過酸化水
素を触媒反応あるいは非触媒反応において、色素中間体
ないしは色素前駆体と反応させ、この中間体ないしは前
駆体の酸化体が着色生成物を生成したり、又は第２前駆
体と反応して最終色素を形成する場合もある。
分析物及び代表的試薬の例としては、次に示す物質を挙
げることができるが、本発明は、これらのものに限定さ
れるものではない。
備考：下記に示す文献に記載のものが用いられる。
（１）クリニカル・ケミストリー（ＣｌｉｎｉｃａｌＣ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ）、リヒテリヒ及びコロンボ（Ｌｉｃ
ｈｔｅｒｉｃｈ　ａｎｄ　Ｃｏｌｕｍｂｏ）、第３６７
頁に記載のもの及びそこに引用されている文献に記載の
もの （２）アナリスト（Ａｎａｌｙｓｔ）　、９７　（１９
７２）（３）アナル・バイオケム（Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ）、」並、（１９８０）　３８９−３９７ （４）アナル・バイオケム（Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ
）、■、（１９７７）　５９７−６０１ （５）クリ二カ・ケミ力・アクタ（ＣｌｉｎｉｃａＣｈ
ｅｍｉｃａ　Ａｃｔａ）　、７５　（１９７７）３８７
−３９１立扼立広 本発明の分析方法は、拡散反射率により測定したときの
吸光度の変化に基づくものであり、この変化は、測定す
べき試料中に存在する分析物の量に依存する。又、この
変化は、時間をおいて２回以上測定した場合の分析試料
の吸光度の変化を測定することにより定量することがで
きる。
測定において考慮すべき最初の工程は、マトリックスへ
の試料の塗布である。実施に当たっては、分析を次のよ
うに行うことができる。まず、分析物を含有する水性流
体の試料を得る。血液の場合には、例えば、フィンガー
・スティック（ｆｉｎｇｅｒｓｔｉｃｋ）により得るこ
とができる。マトリックスの反射率を測定する部分を浸
潤するに必要な量以上のこの流体（即ち、約５〜１０ｍ
）を試料要素あるいは試験装置の要素に塗布する。この
際、下記より明らかなように、従来技術において一般的
に必要とされているような、同時にタイマーを始動する
ことは必要ない、流体の過剰分は、軽く吸い取って除去
することができるが、このような除去も必ずしも必要な
い、試験装置は、一般に、試料の塗布に先立ち、吸光度
、例えば、反射率による発色強度読み取り用機器の中に
取りつけられる。
試料の塗布後ある時点で吸光度を測定する０本明細書に
おいて「吸光度」とは、単に可視波長範囲内の光のみで
はてく、赤外線や紫外線などの可視波長範囲外の光にも
当てはまる。これらの吸光度測定値から、発色率を検定
して分析物濃度を求めることが出来る。
皿定Ｎ里 適当なソフトウェアを搭載した拡散反射率吸光光度計な
どの好ましい機器では、ある所定の時間に反射率を読み
取り、反射率の変化率を計算し、アッセイ要因を用いて
、水性流体中の分析物の濃度を自動的に出力する。この
ような装置の略図を第２図に示す。第２図には、裏地１
２とそこに貼られている試薬パッド１１から構成される
本発明の試験装置を示す。光源１４、例えば、高強度発
光ダイオード（Ｌ　Ｅ　Ｄ）により試薬パッド上に光線
が投射される。この光のかなりの部分が反応生成物の不
存在下において（少なくとも２５％、好ましくは少なく
とも３５％、より好ましくは少なくとも５０％）試薬パ
ッドから拡散して反射され、光検出器１５、例えば、受
ける光に比例した出力電流を生じるホトトランジスタに
より検出される。
必要に応じて、光源１４及び／又は検出器１５が特定の
波長光を発生したり、それに応答したりするようにする
ことができる。検出器１５の出力が、増幅器１６、例え
ば、ホトトランジスタ電流を電圧に変換するリニアＩＣ
へ供給される。増幅器１６の出力が軌道・保持回路１７
に供給される。
この回路は、増幅器１６からのアナログ電圧を追跡し、
マイクロプロセッサ２０からの指令を受けると、その時
のレベルで電圧を固定し保持する。
アナログ・ディジタル変換器１９は、軌道保持回路１７
からのアナログ電圧を捕らえ、マイクロプロセッサ２０
の指令を受けるとそれを、例えば、１２ビツトの２進デ
イジタル数に変換する。マイクロプロセッサ２０は、デ
ィジタル集積回路でよい。これは、次のような制御機能
を行う：１）システム全体の時間調節；２）アナログ／
ディジタル変換器１９の出力の読み取り；３）プログラ
ム・アンド・データメモリ２１とともに、所定の時間間
隔で測定される反射率に対応するデータを記憶すする；
４）記憶した反射率から分析物濃度を計算する；及び５
）分析物濃度のデータを表示装置２２に出力する。メモ
リ２１は、データ及びマイクロプロセッサ操作プログラ
ムを記憶するディジタル集積回路でよい、報告装置２２
は、種々の形態のハードコピー及びソフトコピーをとる
ことができる。通常は、この装置は液晶あるいは発光ダ
イオード表示装置などの視覚的表示装置であるが、テー
ププリンター、可聴信号などあってもよい。
又、この機器に、必要に応じて、始動・停止スイッチを
つけたり、試料塗布、読み取りなどの時間を示す可聴あ
るいは可視時間出力を出すようにしてもよい。
「　・　　　　え等″″ 本発明において、試薬パッドに塗布した懸濁液の水性部
分（例えば、血液）が反射率を測定するパッド表面に移
動した時に生ずる反射率の降下を測定することにより、
反射率回路自体を、計時を開始するのに使用することが
できる。一般的には、測定装置は「レディ」モードで始
動し、一般的にオフホワイトの実質的に乾燥状態にある
未反応試薬ストリップからの反射率を近接した時間間隔
（一般的に約０．２秒）で自動的に読み取る。最初の測
定は、通常、分析すべき流体がマトリックスに浸透する
前であって、且つ流体を試薬要素の反射率を測定する以
外の位置に塗布した後に行われる。得られる反射率の値
は、マイクロプロセッサで評価される。この際、一般に
、連続したデータをメモリに記憶し、その後各値を最初
の未反応の値と比較して評価が行われる。水溶液が試薬
マトリックスに浸透すると、反射率の降下により測定時
間間隔の開始の信号が送られる。５〜５０％、−ａには
約１０％の反射率の降下により計時が開始されるように
なっている。このような筒便な方法により、使用者が何
ら操作を行わなくても、測定媒体が反射率測定が行われ
る表面への到達時と一連の読み取りの開始時との正確な
同調がなされる。
本明細書に述べられているシステムが、特にポリアミド
マトリックスを使用した物と、このようなマトリックス
をグルコース及び他の生物由来物πなどの種々の糖の濃
度の定量に使用したものに向けられているが、本発明の
反射率切り換え装置はこれらのものに何ら限定されるも
のでない。例えば、反射率切り換え装置で用いられるマ
トリックスは、水不溶性の親水性物質のいずれから形成
してもよく、又、このシステムを他の反射率アッセイに
用いてもよい。
グルコースアーセイへの　　の１ 赤血球の存在下におけるグルコースの検出に関する特定
な一例を以下に示し、本発明の詳細な説明するとともに
、その特有の利点について説明する。以下の例は、本発
明の好ましい一態様であるが、本発明は、血中のグルコ
ースの検出に限定されるものではない。
試薬要素の形成にポリアミド表面を用いると、本発明に
おける多数の好ましい特性が得られる。
即ち、試薬が親水性あり（つまり、試薬及び試料を容易
に吸収する）、ぬれても変形せず（従って、反射率読み
取りに適した平らな表面である）、酵素と相溶性があり
（良好な保存性を付与するのに必要である）、膜の単位
容積当たりの試料吸収容量が限定されており（大きなダ
イナミックレンジで測定値を表すのに必要である）、及
び通常の方法で製造できるに十分な湿潤強度を示す。
一般的な構成では、この方法は、プラスチック製ホルダ
ー及び試薬要素（シグナル生成系を含浸させたマトリッ
クス）からなる装置を用いて行われる。試薬要素を製造
用として好ましく用いられるマトリックスとしては、ナ
イロン製精密濾過膜、特に、ポリエステルの不織布繊維
のコアーにナイロン６６をキャストして製造した膜を挙
げることが出来る。この種のナイロン製精密濾過膜で平
均孔径が０．１〜３．０−のものが非常に数多（ポール
・ウルトラファイン・フィルトレージョン・コーポレー
ション（Ｐａ１１υＩｔｒａｆｊｎｅ　Ｆｉｌｔｒａｔ
ｉｏｎ　Ｃｏｒｐｏ−ｒａｔｉｏｎ）から市販されてい
る。これらの材料は、高強度を示し、且つ水に暴露した
り、急速にぬらしても良好な柔軟性及び寸法安定性を示
す。
ナイロンの特定の化学構造を変えた種々のものも使用可
能である。これらのものとしては、例えば、帯電した末
端基を有する非官能性ナイロン６６〔ポール・ウルトラ
ファイン・フィルトレージョン・コーポレーション（以
下「ポール社」と称する）によりアルチポーア（υ１ｔ
ｉｐｏｒｅ）の商標で販売されている〕が挙げられる。
正の電荷ではｐＨ６未満となり、−力負の電荷ではｐ）
１６以上となる。
他の膜の場合、膜生成に先立ち、ナイロンに官能基を導
入し、膜に異なった特性を付与する場合もある。カルボ
キシ基により官能性を付与したナイロン〔ポール社によ
り「カルボキシジン（Ｃａｒｂｏｘｙ−ｄｙｎｅ）　Ｊ
として販売されている〕の場合、広いｐＨ範囲にわたっ
て負に帯電する。又、ナイロンの表面を高密度の正に帯
電した基、−ａ的には第４アミン基により官能性を付与
することもでき（ポール社により［ポジジン（Ｐｏｓｉ
ｄｙｎｅ）　Ｊとして販売されている〕、その場合、広
いｐｔｔ範囲にわたってほとんど電荷の変化を示さない
。このような材料は、本発明を実施するのに特に適して
いる。又、タンパク質を共有的に固定出来るように設計
された反応性官能基を有する膜〔ボール社によりバイオ
ジン・イムノ・アフィニティ・メンブレン（Ｂｉｏｄｙ
ｎｅ１ｏｖ＋ｕｎｏ　Ａｆｆｉｎｉｔｙ　ｍｅｍｂｒａ
ｎｅ）として販売されている〕を使用することもできる
。このような材料は、試薬として使用するタンパク質、
例えば、酵素を共有結合するのに用いることができる。
これらの材料は全て使用可能であるが、正に帯電した高
密度の基を表面に有するナイロンを使用すると、乾燥試
薬パッドに形成した時に最も優れた安定性が得られる。
非官能性ナイロンが次に安定性に優れ、カルボキシ化ナ
イロンがその次に安定性に優れている。
全血液の分析に用いる場合には、約０．２〜２．０趨の
範囲、好ましくは約０．５〜１，２−の範囲、最も好ま
しくは約０．８趨の孔径を有するものから所望の結果が
得られる。
試薬要素を取り付けるハンドルの形状については、あま
り重要ではなく、試料が試薬要素の一面にアクセスでき
、又、反射率を測定する入射光が試薬要素の他面にアク
セスできればよい、又、ハンドルは、試薬要素を光学系
と位置合わせして吸光度測定装置に挿入するのに役立つ
、好ましいハンドルの一例として３Ｍ４６５あるいはＹ
　９４６０転写接着剤などの転写接着剤を塗布したマイ
ラーあるいは他のプラスチックストリップが挙げられる
。転写接着剤を介してプラスチックに穴をあける。次に
、一般的に薄いパッドの形状をしており、試薬を含有し
ているか、あるいは後で試薬を添加する試薬要素を転写
接着剤により貼り付ける。この際試薬要素は、ハンドル
におけるハンドルと転写接着剤を貫通して形成した穴の
周囲の部分にしっかりと取りつける。このような装置を
第１図に示す。
第１図は、接着剤１３によりマイラー製ハンドル１２に
取り付けた試薬パッド１１を示す。穴１４により、試料
あるいは入射光が試薬パッドの一面にアクセスできると
ともに、試薬パッドの他面へのアクセスも自由である。
試薬パッド及びハンドルに関する全ての寸法は、試薬バ
ンドが、反射率読み取り機器の光源及び反射光検出器に
近接した位置にしっかりとはめ込めるように選択する。
ナイロンマトリックスが試薬パッドを形成するのに用い
られ、上記した厚さで使用する場合には、試薬パッドを
ホルダーで支持する際、試料を塗布し光の反射率を測定
する位置において、ホルダーによって支持されていない
部分がいずれの方向でも６１ｍ以下であることが好まし
い。支持されていない部分が、それ以上であると、膜の
寸法安定性が不十分となり、膜表面での反射率測定に悪
影響を及ぼす１頃向がある。第１図に示すような試薬ス
トリップにおいて、穴１４の直径が５１−ｍの場合、非
常によい結果が得られる。このような穴の最小直径につ
いては特に限定はないが、製造、試料塗布及び光の反射
率の読み取りの容易性の面で、直径が少なくとも２鶴以
上であることが好ましい。
種々の色素がインジケータとして使用することができる
が、その選択は、試料の性質による。アッセイ媒体とし
て全血液を用いたり、あるいは他のアッセイ媒体を用い
て溶液中の不純物を分析するような場合には、赤血球が
光を吸収する波長とは異なる波長で吸収性を有する色素
を選択するのが好ましい。ＭＢＴＨ−ＤＭＡＢ色素カッ
プル（３−メチル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン
塩酸塩と３−ジメチルアミノ安息香酸）は、酵素イムノ
アッセイにおけるペルオキシダーゼ標識用の発色に適し
ていることが以前に記載されたことがあるが、商業的な
グルコース測定試薬においては使用されていなかった。
しかしながら、この色素カップルは、従来グルコース測
定に用いられていたベンジジン誘導体などの色素に比較
して、ダイナミックレンジが大きいだけでなく酵素安定
性の面でも優れている。更に、ＭＢＴＨ−ＤＭＡ８色素
カップルは、ベンジジン誘導体のほとんどに特有の発が
ん性がない。
グルコースの測定に用いることのできる他の色素カップ
ルとしては、八ＡＰ　−ＣＴＡ　（４−アミノアンチピ
リンとクロモトロープ酸）カップルがある。
このカップルは、ＭＢＴ）ｌ　−ＤＭＡ８はどダイナミ
ックレンジは広くないが、安定であり、グルコースを測
定する場合における本発明の実施に用いるのに適してい
る。更に、ＡＡＰ　−ＣＴＡ色素カップルは、より広く
用いられているベンジジン色素よりもダイナミックレン
ジが大きく且つ酵素活性の安定性に優れている。
ＭＢＴＨ−ＤＭＡ８カツプルを使用すると、血液のヘマ
トクリット及び酵素化度についての補正がただひとつの
補正率で可能となる。より一般的に用いられているベン
ジジン色素の場合には、そのような補正はできない。上
記色素は、約６３５ｎｍで吸収を示すが、７００ｎｍで
は大きな吸収を示さない発色団を生成する。測定波長が
わずかに変化（士約１０ｎｍ）　してもかまわない。７
００ｎｍで血液の色を測定することで、ヘマトクリット
及び酸素化度の両方が、測定できる。更に、６３５ｎｍ
及び７００ｎｍ両方での測定用の発光ダイオード（ＬＥ
Ｄ）が市販されており、簡単に装置の量産ができる。上
述した好ましい孔径を有する膜を用い、且つ必要な試薬
配合を行うことにより、ヘマトクリット及び酸素化の作
用の両方が、７００ｎｍの単一波長で測定することによ
り補正できる。
次に示す更に２つの条件により、ポリアミドマトリック
スについてのグルコースオキシダーゼ／ペルオキシダー
ゼ配合物の安定性及び保存性の面で特に向上が見られる
ことが判明した。これらの条件とは、ひとつは、ｐＨ値
を３．８〜５．０、好ましくは３．８〜４．３最も好ま
しくは４．０とすることであり、もうひとつは、試薬を
マトリックスに塗布する際、高濃度緩衝液を用いること
である。これに関して、１０重量％クエン酸塩緩衝液が
最も効果があり、５〜１５％の濃度で有効であることが
わかった。これらは、試薬がマトリックスに塗布される
際の緩衝液の重ｉｔ／容積百分率である。他の緩衝液も
上記と同様の重量／容積百分率基準で用いることができ
る。低いｐＨ，好ましくは約ｐＨ４でＭＢＴ）ｌ　−Ｄ
ＭＡ８色素系を用い、且つ塗布溶液１１１Ｉｌ当たり約
５００〜１０００単位（Ｕ）の高酵素濃度の場合に最も
優れた安定性が得られる。
ＭＢＴＨ−ＤＭＡＢ試薬及びシグナル生成系の残部であ
る酵素系を調製する際、下記に示す容積及び比率により
良好な結果が得られるけれども、正確にそれらの値を維
持する必要はない、グルコースオキシダーゼが溶液中に
約２７〜５４容積％で存在し、ペルオキシダーゼが約２
．７．〜５．４■／ｄの濃度で存在し、ＭＢＴＨが約４
〜８ｍｇ／−の濃度で存在し、且つＤＭＡＢが約８〜１
６■／ｉの濃度で存在するときには、試薬は容易にマト
リックスパッドにより吸収される。　ＤＭＡＢ　−ＭＢ
ＴＩ＋の重量比は、好ましくは（１〜４）：１、好まし
くは約（１，５〜２．５）：１、最も好ましくは約２：
１に維持される。
試薬要素の基本的な製造方法は、一度確立されると、容
易である。膜自体は丈夫で安定であり、好ましい態様で
あるナイロン膜を用いた場合には、特にそのことが言え
る。試薬塗布には二種の溶液が必要なだけであり、これ
らの溶液は、両方とも容易に配合され、且つ安定である
。第一の溶液には一般に色素成分が含有され、一方、第
二溶液には一般に酵素が含有される。　ＭＢＴＨ−ＤＭ
Ａ８色素カップルを用いる場合、例えば、個々の色素を
有機溶媒水溶液、一般に、アセトニトリルと水とのｌ：
１混合物に溶解する。マトリックスを溶液に浸漬し、液
体の過剰分を吸い取って除去し、その後マトリックスを
一般に５０〜６０℃で１０〜２０分間乾燥する。次に色
素含有マトリックスを酵素を含有する水溶液に浸漬する
。配合物の一般的なものとしては、ペルオキシダーゼ及
びグルコースオキシダーゼ酵素の他に所望の緩衝液、防
腐剤、安定剤等を含有したものが挙げられる。マトリッ
クスから液体の過剰分を吸い取り、前記のようにして乾
燥する。グルコース試薬の代表的配合例を下記に示す。
色素■漫遺 下記の試薬を混合する。
−ＢＴＨ４０■ Ｄ杓Ａ８　　　　　　　　　　　８０■アセトニトリル
　　　　　　５− 水　　　　　　　　　　　　　　　　　５Ｗ１１全ての
固体が溶解するまで攪拌し、ガラス板あるいは他の平ら
な表面にそそぐ。ポジジン（Ｐｏｓｉｄｙｎｅ）膜（ボ
ール社製）の−片を浸漬し、液体の過剰分を吸い取り、
その後５６℃で１５分間乾燥する。
ＭｌＩ克漬 下記の試薬を混合する。
水　　　　　　　　　　　　　　　　６−ＩＥＤＴＡの
ニナトリウム塩　　　ｌＯ■低粘性ボリベブ（Ｐｏｌｙ Ｐｅｐ）　（シグマ社製）　　　　　２００■クエン酸
ナトリウム　　　　０．６６８　ｇクエン酸　　　　　
　　　　０．５２３　ｇ６重！％ガントレッツ （Ｇａｎｔｒｅｚ）　ＡＮ−１３９水 溶液（ジー・エイ・エフ （ＧＡＦ）社製］　　　　　　　　２．Ｏｄセイヨウワ
サビペルオキ シターゼ（１００単位／ｄ）　　　３．Ｏａｄグルコー
スオキシダーゼ （２０００単位／ｄ）　　　　　　３．０ｄ全ての固体
が溶解するまで攪拌し、ガラス板あるいは他の平らな表
面にそそぐ、上記において色素で浸漬した膜を浸漬し、
液体の過剰分を吸い取り、その後５６℃で１５分間乾燥
する。
反射率の読み取りを行うのに使用する電子装置には、少
なくとも、光源、反射率検出器、増幅器、アナログ・デ
ィジタル変換器、メモリ、及びプログラムを搭載したマ
イクロプロセッサ及び表示装置が内蔵されている。
光源は、一般には、発光ダイオード（ＬＥＤ）から構成
されている。多色光源、及び二つの異なる波長で測定す
ることのできる光検出器を使用することは可能であるが
、装置が、二つのＬＥＤ源あるいは二つの異なる波長の
光を放出することのできる一個のダイオードを内蔵して
いることが好ましい。本明細書において、好ましい波長
として記載されている波長を生ずる市販のＬＥＤとして
は、例えば、最大発光波長が６３５ｎｓであるヒユーレ
ットパンカード（Ｈｅｗｌｅｔ　Ｐａｃｋａｒｄ）ＨＬ
ＭＰ−１３４０及び最大強帯域発光波長が７０ｏｎ鵬で
あるヒユーレットパンカードＯＥＭＴ−１０４５が挙げ
られる。好ましい市販の光検出器としては、例えば、浜
松（Ｉｌａｓｎａ＊ａｔｓｕ）５８７４−１８　Ｋ及び
リトロニクス（Ｌｉｔｒｏｎｉｘ）　ＢＰχ−６５が挙
げられる。
他の方法でも測定可能であるが、下記の方法により好ま
しい結果が得られる。即ち、計時開始後、所定の時間間
隔で光検出器により読み取りを行う。
６３５ｎ■ＬＥＤは、反射率切り換え装置により示され
る開始時間約２０秒後に始まる短い測定時間スパンの間
だけ作動させる。もしこの読み取りにおいて、試料中に
高濃度のグルコースが存在することが示された場合には
、３０秒の読み取りを行い、その結果を最終の計算に用
いて精度を向上させる。
一般的には、約２５０■／ｄ１以上の場合に高濃度であ
るとみなす。測定時間の開始約１５秒後に７０Ｏｎ鴫で
読み取りを行い、バックグラウンドの補正を行う、適当
なＬＥＤを通常１秒未満作動させながら、光検出器から
の読み取り値をその間隔で記録する。信号が増幅され、
ディジタル信号に変換した後、反射率の生の読み取り値
をマイクロプロセッサによる計算に用いる。多くのマイ
クロプロセッサをこの計算に用いることができるが、ロ
ックウェルインターナショナル社製のシングルボードマ
イクロコンピュータＡＩＭ　６５が満足のいくものであ
ることがわかった０本発明の方法及び装置により、手順
を非常に簡単にすることが出来るとともに、使用者側の
操作工程を最少にすることができる。使用に際して、試
薬ストリップを、ストリップの穴と検出系の光学素子と
を位置合わせするようにして検出器中に配置する。取り
外し可能なキャップなどのカバーを、光学素子及びスト
リップにかぶせ、組立品を周囲光から遮蔽する。その後
、測定装置上のボタンを押して測定シーケンスを開始し
、マイクロコンピュータを作動させて、Ｒ４ｒｙ読み取
りと称する未反応試薬パッドからの反射光の測定を行う
０次に、キャップを外し、−滴の血液を試薬パッドに塗
布するとともに、一般に、試薬パッドを光学素子及び読
み取り装置と位置合わせする。この際、試薬ストリップ
を光学素子と正確に重ね合わせておくことが、操作を最
少にする上で好ましい。血液などの試料が塗布されたこ
とは、試料が、マトリックスを通過し、反射光を反対側
で測定したときの反射率が減少するので、測定器により
検知されることができる０反射率の減少があったときは
、本明細書の他の部分において詳細に説明しであるタイ
ムシーケンスを開始する。
測定すべき試料の種類にもよるが、カバーは、試料塗布
後１５秒以内に置かなければならない。血液試料中のグ
ルコース濃度の測定の場合、一般に、血液を塗布してか
ら約３０秒後に結果が表示される。これに関して、試料
中のグルコース濃度が２５０■／ｄ１未満の場合には、
２０秒の反応であってもよい。測定試料が、他のもので
ある場合には、結果を表示する時点は、それぞれ異なっ
てもよく、選択される試薬／試料の組み合わせの特性か
ら容易に決定することができる。
バックグラウンド電流、即ち、作動しているが試薬パッ
ドからの反射光がない状態での光検出器からの電流を用
いて、バンクグラウンドの補正を行い、グルコース濃度
（あるいは他の測定すべき分析物）の特に正確な評価を
行うことができる。
本発明の好ましい態様に準じて製造した特定の測定器の
場合には、２〜３力月の期間においても、この値は変化
せず、従って、このバックグラウンドの読み取り値を定
数としてコンピュータメモリにプログラムすることが可
能であることがわかった。しかしながら、この方法をわ
ずかに変更することにより、各分析でこの値を測定し、
より正確な結果を得ることができる。変法では、試料ス
トリップを所定の位置に置く前に、蓋を閉めた状態で測
定器のスイッチを入れ、バックグラウンド電流を測定す
る。その後、カバーを閉めた状態で試験ストリップを測
定器中に挿入し、Ｒ４１，測定を行い、その後、前記の
操作を継続する。この変法では、バックグラウンド電流
は、測定器の寿命を通して安定である必要はなく、従っ
て、より正確な結果が得られる。グルコースアッセイの
結果を計算するのに必要な生データは、前記のバックグ
ラウンド反射率として報告されるバックグラウンド電流
、Ｒｂ、前記の未反多成験ストリップの読み取り値、Ｒ
ａｒｖ、及び終点の測定値である０本明細書に記載の好
ましい態様を用いた場合、終点はあまり安定ではなく、
最初の血液塗布から正確に計時しなければならない、し
かしながら、ここに述べる測定器では、この計時を自動
的に行う。
２５０■／ｊ未満のグルコース濃度の場合、２０秒以内
で十分に安定な終点に達し、最終反射率、Ｒ２゜、が測
定される。又、４５０■／ｄ１以下のグルコース濃度の
場合には、３０秒での反射率の読み取り、Ｒ１゜、が適
している。ここに述べるシステムでは、最大８００■Ｚ
ｄｌ迄のグルコース濃度では、明瞭な表示が可能である
が、４５０■／ｄ１を越える濃度では、重大な問題を生
じるほどではないが、いくらかノイズが多くなり不正確
になる。このようにグルコース濃度が高い場合には、反
応時間を長くすることで、読み取り値の精度が良くなる
。
二波長測定用の７００ｎｓ＋での反射率の読み取りは、
一般に、１５秒（Ｒ＋ｓ）で行われる。この時までに、
血液は、完全に試薬パッドにしみ込む。１５秒以上の間
色素反応は継続し、少しだけ７００ｎａ＋での読み取り
で検知される。従って、７００ｎａ＋での色素の吸収信
号は、悪影響を及ぼすので、１５秒を越える場合の読み
取り値は、計算では無視される。
前記の生データは、反射率測定値よりも容易に視覚化で
きる、グルコース濃度に比例するパラメータを計算する
のに用いられる。必要に応じて、透過率分光分析法（ベ
ールの法則）における吸光係数と分析物濃度との関係に
類似した、反射率の対数変換を用いることができる。即
ち、反射率分光分析法に関して具体的に導き出されたク
ベルカ・モンクの式の簡略化したものが、特に有効であ
ることが判明した０式１により定義される導関数に／Ｓ
が、分析物濃度に関連する。
Ｘ／Ｓ　−ｔ　　−（１−Ｒａｔ）”　　／　（２ｘＲ
＊ｔ）　　　　　　　　（１）但し、Ｒａｔは、特定の
終点時、ｔ、に測定された反射能であり、式２に述べる
入射光線の吸収率である。
Ｒｔ　ｔ　＝　（Ｒｔ　　Ｒｂ）／（Ｒ４ｒｙ　−Ｒｈ
）　　　　　　（２）但し、Ｒｔは終点時の反射率、Ｒ
２゜又はＲ５゜である。
Ｉｈｔは、反射光が無い場合のゼロ（Ｒｈ　）から全反
射光の場合の１（Ｒｄ、、ｙ）の範囲で変化する。
計算に反射能を用いると、高度に安定な光源及び検出回
路が不必要となるので、測定器の設計が非常に簡単にな
る。この理由は、これらの成分は、Ｒｏ、及びＲ５の測
定により制御できるからである。
単−波長読み取り値に／Ｓは、２０秒（Ｋ／Ｓ−２０）
又は３０秒（Ｋ／Ｓ−３０）で計算できる。これらのパ
ラメータをＹＳＩ（イエロー・スプリングス・インスト
ルメンツ（Ｙｅｌｌｏｗ　ＳｐｒｉｎｇＩｎｓｔｒｕ＋
＋＋ｅｎｔｓ）　）グルコース測定値と関連づける検量
線は、式３の３次多項式によって明確に表すことができ
る。
ＹＳＩ−ａ＊＋ａ　ｌ　（Ｋ／Ｓ）　＋ａｚ　（Ｋ／Ｓ
）　”＋ａｓ　（Ｋ／Ｓ）　’　　　　　（３）これら
の多項式の係数を表１に示す。
Ｋ／Ｓ　−２０Ｋ／Ｓ　−３０ ａ　ｏ　　　　　５５．７５　　　　　　５５．２５ａ
ｌＯ・１６３２０・１３３４ ａ　＊　　　　５．７６５　Ｘｌ０−’　　　−２，２
４１Ｘｌ０−’ａ　ｓ　　　　２．５８Ｘ１０−”　　
　　　Ｌ、２ＱＸ１０−”好ましい態様において測定さ
れる単一化学種は、？ＩＢＹ）ｌ　−Ｄ）’ＩＡＢイン
ダミン色素であり、分析されるマトリックス複合体は、
０．８　ｔｓのポジジン（Ｐｏｓ　ｉｄｙｎｅｍｅｍｂ
ｒａｎｅ）に分布した全血液である。
シーアールシー、クリティカル・レビューズ・イン・フ
ード・サイエンス・アンド・ニュートリジョン（ＣＲＣ
Ｃｒ１ｔｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｖｓ　ｉｎ　Ｆｏｏｄ　
５ｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ）、１ｆ
ｉ（３）２０３−３０　（１９８３）に記載されている
「アプリケージぢン・オブ・ニア・インフラ・レッド・
スペクトロフォトメトリー・トウ・ザ・ノンデストラク
チイブ・アナリシス・オブ・ツース（＾ｐｐｌｉｃａｔ
ｉｏｎ　ｏｆ　Ｎｅａｒ　Ｉｎｆｒａ　Ｒｅｄ　Ｓｐｅ
ｃｔｒｏ−ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ　ｔｏ　ｔｈｅ　Ｎｏ
ｎｄｅｓｔｒｕｃｔｉｖｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆＦ
ｏｏｄｓ）　ニア、レビュー・オプ・エクスペリメンタ
ル・リザルツ（Ａ　Ｒｅｖｉｅｗ　ｏｆ　ｔ！ｘｐｅｒ
ｉａｅｅｎｔａｌＲｅｓｕｌｔｓ）　Ｊと題した報告で
は、光学密度差Δ００（λ、−λｈ）の測定を基盤とし
た測定器の使用についての記載がある。ここで、ＯＤＡ
、は、測定すべき成分の最大吸収に相当する波長の光学
密度であり、ＯＤＡ、は、該成分があまり吸収を示さな
い波長の光学密度である。
三波長測定の場合の計算法は、当然のことながら、単一
波長測定の場合よりも複雑であるが、はるかに効果的で
ある。　　７００ｎｍの読み取りによっておこなう第１
次補正により、血液に起因するバンクグランド色を差し
引く。この補正を行ために、血液の色に起因する６３５
ｎｍと７０ｏｎ−での吸光度の間の関係が、広範囲の血
液の色にわたって、グルコースを含まない血液試料を測
定して求めた。この色の範囲は、ヘマトクリットを変化
させて作り出したところ、かなりの直線関係が観察され
た。
これらの直線より、７００ｎ−〇に／５−１５を標準化
して、６３５ｎｍのに／５−３０と等価にした。この関
係を式４に示すが、ここでに／Ｓ−１５ｎは標準化した
７００ｎ−のに／Ｓ−１５である。
Ｋ／Ｓ−１５ｎ　−（Ｋ／Ｓ−１５Ｘ１．５４）　−０
，１３３（４）これに関連して、標準化した７００ｎｍ
の信号と６３５ｎ−の信号の等個性は、グルコース濃度
がゼロの時のみにあてはまることに留意しなければなら
ない。検量線を作成するための式が式５及び式６により
示される。
Ｋ／５−２０／１５＝（Ｋ／Ｓ−２０）　−（Ｋ／Ｓ−
１５ｎ）　　（５）に／５−３０／１５＝（Ｋ／Ｓ−３
０）　−（Ｋ／Ｓ−１５ｎ）　　（６）これらの曲線は
第４次長項式に最もよく適合しており、Ｋ／Ｓにおける
第４次項を式３に追加したものに類似している。これら
の式に関する、コンピュータに適合した係数を表２に示
す。
Ｋ／５−２０／１５　　　　Ｋ／５−３０／１５ａ、　
　　　−０，１３８８１，０９９ａ　＋　　　　　０．
１０６４　　　　　　０．０５２３５ａ　ｚ　　　　　
６．２５９Ｘ１０−’　　　　１．２２９ｘｌＯ−’ａ
　ｓ　　　　　６．１２Ｘ１０−”　　　　　５．８３
ＸＩＯ−”ａ４　　　　３．２１Ｘ１０−”　　　　１
．３０ＸＩＯ−”クロマトグラフィー効果に起因する誤
差を排除するための第２次補正の方法も開発された。ヘ
マトクリットの低い試料は、同様の６３５ｎｍの読み取
り値を有するヘマトクリットの高い試料に比較して、７
００ｎｍの読み取り値が低い特徴を有している。
（Ｋ／Ｓ−３０）　／（に／Ｓ　−１５）の比を、広範
囲のヘマトクリット及びグリコース濃度にわたって、Ｋ
／５−３０に対してプロットすると、得られるグラフの
線が、クロマトグラフィー効果を示す試料（曲線より上
）と示さない試料（曲線より下）との間の境界を示して
いる。曲線より上の試料の場合のに／５−３０は、同様
の（Ｋ／Ｓ−３０）　／（Ｋ／Ｓ−１５）比を有する曲
線上の点に一致するまで読み取り値を上昇させて補正す
る。
上記の補正率は、ひとつの測定器を種々の配合物に適合
させるようにしたものであった。この計算方法は、個々
の測定器及び試薬ごとに、上記と同様の方法により最適
化することができる。
要するに、本発明のシステムにより、オペレータの動作
をできる限り少なくでき、従来の反射率読み取り法に対
して多数の利点がある。例えば、血中のグルコースを定
量する場合について、従来法と比較した場合、次のよう
な明らかな利点がいくつかある。まず、薄い試薬パッド
にしみ込まずために必要な試料の量が少なくてすむ（一
般に５〜１０パ）。第２に、オペレータに必要な時間は
、試料を薄い親水性層に塗布するのに要する時間とふた
を閉めるのに要する時間だけである（一般に４〜７秒）
、第３に、同時に計時する必要がない。
第４に、全血を使用することができる。すなわち、本発
明の方法では、赤血球の分離あるいは赤血球を含まない
試料を使用する必要がなく、更に、他の着色の程度の大
きい試料も使用できる。
又、全血液について本発明を実施すると１．いくつかの
予期できない利点が生じる。即ち、通常、水溶液（血液
のような）は、親水性膜に浸透し、膜の反対側に液層を
生じ、従って、表面が反射率測定には適さないものとな
る。しかしながら、血中の赤血球及びタンパク質とマト
リックスとの明らかな相互作用により、血液はポリアミ
ドマトリックスを湿潤させるが、過剰の液体が多孔質マ
トリックスに浸透せず、従って、このマトリックスの反
対側での反射率の読み取りを訪客しないことを見い出し
た。
更に、本発明において使用される薄膜は、湿潤すると光
を透過し、反射率測定装置に反射するのは弱い信号のみ
であると考えられる。一方、従来、光を十分に反射させ
るために、マトリックスの裏面に反射層を設けることが
必要であると一般に考えられていた。他の場合には、測
色に先立ち、試薬パッドの裏面に白色パッドを配置して
いた。本発明においては、反射層も白色パッドも必要と
しない、実際上、本発明は、一般的には、入射光がマト
リックスに衝突する時には試薬要素の裏面に吸光性表面
が存在する状態で実施される。試薬要素の裏面の吸光性
表面と二つの異なる波長での反射率の測定との組み合わ
せの採用により、マトリックスから液体の過剰分を除去
しなくとも満足のいく反射率の測定がなされ、従って、
従来の方法では必要とされていた工程をなくすることが
できる。
以下余白 〔実施例〕 本発明を一般的な観点から説明したが、本発明は、以下
に示す具体的な実施例により、更によく理解できるであ
ろう。しかしながら、以下に示す実施例は、本発明を説
明する目的のみで述べるものであり、特記のない限り、
本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
一人の男性の血液試料（ＪＧ、ヘマトクリット＝４５）
を用いて、表３〜５に示す再現性に関するデータを得た
。
以下余白 ２５　　　　　２５　　２７　　　　１．３４１．５５
　　５．４　　５．７５５　　　　　５５　　５７．４
　　　２，５８２．６２　　４．７　　４．６１０１　
　　　１０１　　１０１．５　　　２．５５２．１８　
　２．５　　２．１３２６　　　　３３２　　３３０　
　　　１５．０　　　？、１　　　４．５　　２．１５
０１　　　　　　　　５０５　　　　　　　２１．３　
　　　　　　４．２６９０　　　　　　　　６８７　　
　　　　　２２．８　　　　　　　３．３８１０　　　
　　　　　８１？　　　　　　　　　３０．４　　　　
　　　３．７５５−１００　　　　　４．８　　　　４
．９３００　　　　　３．０　　　　５，９６００　　
　　　　　３．８　　　　５．５平均　　　　３．９　
　　５．１ 血液をアリコートに分けて、グルコースが２５〜８００
■／ａの範囲で含有するようにした。５００個のストリ
ップ試料（ロットＮａ　ＦＪ４−４９Ｂ）からランダム
に取ったストリップでの各グルコースレベルで、測定を
２０回づつ行った。この試験の結果、次のような結論が
得られた。
１、　　ｌ：ｊ　　と二゛　の　″′：二波長波長合、
３０秒でＣ，Ｖ、値は３．７％であったのに対し、単一
波長の場合は３０秒でＣ，Ｖ、値は４８％であり、２５
〜８１０■／ｄ１のグルコース濃度範囲で２３％の向上
が見られた。又、２５〜３２６■／ｄ１のグルコース濃
度範囲では、Ｃ，Ｖ、値が３３％向上した。この時、Ｃ
，Ｖ、値が５．４％から３．６％に減少し、使用したゲ
ルコール濃度範囲において、顕著な向上が見られた。三
波長２０秒の場合も、２５〜３２５■／ｄ！の範囲にお
ける単一波長測定に比較して、Ｃ，Ｖ、値において同様
の向上が見られたく表３及び表４参照）。
２、二ゞ　におしる２０　゛と３０　との　′：２５〜
１００■／ｄ１の範囲において得られた２０秒の場合の
平均Ｃ，Ｖ、値は４．２％であり、３０秒の場合の読み
取り値４．１％とほぼ同じであった。しかしながら、３
２６ｍｇ／ｄ１において、３０秒の読み取り値が２．１
％のＣ，Ｖ、であったのに対し、２０秒の場合Ｃ，Ｖ、
値は４．５％であった。に／５−２０応答曲線から明ら
かなように、２５０■／ａを越えると匂配が急激に減少
し始める。このため、２０秒の場合、３００■／ｄ１を
越えるグルコース濃度での再現性が悪い。この再現性の
データから、２０秒の場合のカットオフ（（ｕｔｏｆｆ
）値が１００＋ａｇ／ｄ！と３２６ｍｇ／ｄ１の間にあ
ることがわかる。後述する実施例２における回復性につ
いての検討の結果から、カフ）オフ値が２５０■／ｄ１
であることがわかった。
３、旦止夏犬生立：上述したように、３．０ｍ（５−Ｏ
ａ＋ｉｎ、）の小口径光学素子について検討した。
１０回反復して手動浸漬した円板状試料を用いて行った
最初の実験では、３．　Ｏｖｍの口径の場合、Ｃ，Ｖ、
値の向上が見られた。これは明らかに、光学系との位置
合わせが容易であることによるものである。しかしなが
ら、機械で作製したロール膜を使用した時、４．７鶴の
大きな口径の場合の平均Ｃ，Ｖ、値（表５）は、上述し
たように３．９％であり、一方、口径３．　Ｏｘ＊の場
合の平均Ｃ，Ｖ、値は５．１％であった。このＣ，Ｖ、
値における３０％の増加は、下記において述べるように
、ロール膜の表面がでこぼこしていたためと思われる。
１隻１ 皿！＝本発明の方法（ＭＰＸ）とイエロー・スプリング
ス・インストルメント社（Ｙｅｌｌｏｗ　Ｓｐｒｉｎｇ
ｓＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔ　Ｃｏ、）　（オハイオ州イエ
ロースプリンゲス）製のイエロー・スプリングス・イン
ストルメント２３Ａ型グルコースアナライザーを用いる
代表的な従来方法とを比較するために、３６人の献血者
の血液を試験した。献血者の人数は男性と女性が同数で
あり、又、血液のヘマトクリット値は３５〜５５％の範
囲であった。血液試料は採血後３０時間以内に、抗凝血
剤としてのリチウムヘパリンとともに使用した。各血液
試料をアリコートに分け、グルコース濃度０−７００■
／ｄＩの範囲となるようにして１５２の分析試料を調製
した。各試料２回づつ試験を行い、合計で３０４のデー
タを得た。
これらのデータから応答曲線を作製し、その後、適当な
式を用いて計算した（表１及び表２）、こ゛れらのＭＰ
Ｘのグルコース値をＹＳＩ値に対してプロットし、敗点
図を作製した。
ＭＰＸ系の比較：２０秒及び３０秒の測定時間の両方の
場合において、単−波長散点図の方が二波長敗点図より
も目で見たところではバラツキが大きかった。２０秒で
の読み取り値は、２５０■／ｄ１を越えると大きなバラ
ツキを示したが、３０秒での測定の場合には、グルコー
ス４度が５００■／ａ１以上となるまでは大きなバラツ
キを示さなかった。
これらの敗点図は、種々のグルコース濃度範囲で、ＹＳ
Ｉからの偏差を求めて定量化した。結果を表６に示す。
単一波長　　加　　　　　±５．６　　　　７．２　　
　　１４．５　　　　−単一波長　　３０　　　　　　
±６．９　　　　７．１　　　　　８．８　　　　１０
．２二波長　　　加　　　　　±２．３　　　　５．３
　　　　１２．８　　　　−三波長　　　３０　　　　
　　±２．１９　　　　５．５　　　　５．８　　　　
８．４備考：これらの値はインター法（Ｉｎｔｅｒ　ｍ
ｅｔｈｏｄ）によるｃ、ｙ、値である。
（イ）三波長系のＣ，Ｖ、値は単一波長系よりも３０％
低かった。
（ロ）０〜５０■／ｄ１において、単一波長系は、±６
〜７■／ｄＩのＳＪ、値を示したが、三波長系のＳ、Ｄ
、値は上２゜２■／ｄ１にすぎなかった。
（ハ）３０秒ＭＰＸ測定の場合、カットオフ値は２５０
■／ｄ１であった。５０〜２５０の範囲では、２０秒及
び３０秒測定のインター法Ｃ，Ｖ、値は近位していた（
単一波長の場合約７％、三波長の場合５．５％）、シか
しながら、２５０〜４５０■／ａの範囲において、２０
秒測定の読み取りが２倍を超えるインター法Ｃ，Ｖ、値
を示し、単一波長では１４．５％、三波長では１２．８
％であった。
（ニ）３０秒測定の読み取り値は、４５０■／ｃｆｊを
越える濃度では、単−波長及び三波長測定の両方（Ｃ，
Ｖ、値：　１０．２％及び８．４％）ニオイテ使用不可
能であった。
上記から明らかなように、上記の２つのＭＰＸ系におい
て、０〜４５０■／ｄ！の濃度範囲で最適な定量化を示
した。
１、ＭＰＸ３０二披１：この三波長系では、測定時間３
０秒で９５％の信頼限界（ＹＳＩＯ３Ｄ値の２倍以内の
測定値の確率）であり、５０〜４５０■／ｄ１の範囲テ
１１．３％のＣ，Ｖ、値を示し、０．５〜５０ｍｇ／ｄ
！（表７）の範囲で±４．４■／ｄ！のＳ、Ｄ、値を示
した。
２、　　ＭＰＸ　３０／２０二波長：この三波長系では
、測定時間２０秒でのグルコース濃度範囲が０〜２５０
■／ｄ１テあり、測定時間３０秒では２５０〜４５０■
／ａの範囲であった。この場合の９５％信顧限界はほぼ
ＭＰＸ　３０二波長とほぼ同じであり（表７）、５０〜
４５０■／ｄ！の濃度範囲で１１％のＣ，Ｖ、値を示し
、０〜５０■／ｄ１の濃度範囲において、±４．６■／
ａのＳ、Ｄ、値を示した。
以下余白 一表−ｊ− ＭＰＸ、グルコスキャン・プラス及びアク・チェクｂＧ
１試薬ストリップに関する９５％信０〜５０　　１１．
２　　１３．８　　　４．６　　４．４■／ｄ１　　■
／ｄ１　　　■／ｄ１　　■／ｄ１５０〜２５０　１４
．４％　１４．２％　　１０．６％　１１．０％２５０
〜４５０　　−　　１７．６％　　　−１１，６％７７
〜４０５アク・チェクｂＧ　（ドレク　　１０．７％ス
ラー・クリニカル） ５０〜４５０　ＭＰＸ　２０／３□二波長バイブ　　１
１．１％リッド ５０〜４５０ＭＰＸ二波長　　　　　　　１１．３％備
考：　＊ＭＰＸに関する信頼限界はＹＳＩから求めた。
グルコスキャン・プラス（Ｇｌｕｃｏ　５ｃａｎ　Ｐｌ
ｕｓ）及びアク・チェク（＾ｃｃ−Ｃｈｅｋ）　ｂＧに
関する信頼限界は、検量線作成における小さな差異によ
るかたよりを排除するために、回帰方程式とＹＳＩとの
対比から求めた。
災旌拠主 安定性の最適化についてのベンチスケール実験のほとん
どを、手動浸漬した０、　８　ｔｎｓの円板状ポジジン
膜（Ｐｏｓｉｄｙｎｅ　ｍｅａ＋ｂｒａｎｅ）を用いて
行った。上記した特定の色素／酵素配合を用いた。
１．１■支定圧：この実験は、０．８　ｔｎａのポジジ
ン膜試薬を１８〜２０℃でシリカゲル乾燥剤で乾燥しな
がら貯蔵した場合の変化を図表化するためのものである
。２．５力月後に、室温試料を５℃で貯蔵した試料を対
比して測定した結果、何ら顕著な変化を示さなかった０
作成した数点図から、０〜４５０■／ｄｌのグルコース
濃度範囲が得られた。
２、工しユｊど莞ΩＵ比：３７’Ｃでの安定性の実験を
室温（ＲＴ）安定性試験と同様の試薬を用いて行った。
接着剤を使用した場合と使用しない場合それぞれについ
てのストリップについて、３７℃で応力をかけた試薬の
グルコース値と室温で応力をかけた試薬のグルコース値
の差を時間に対してプロットした。その結果、手製のス
トリップのためたに再現性が悪いことから、データにば
らつきが見られたが、接着剤を使用して応力をかけたも
のも接着剤を使用しなかったものも両方とも優れた安定
性を示した。
３、　５工Δ二莞Ωｊツ旧に円板状膜について、同様の
銘柄であるが配合の異なる８種のもあを用いて（表８）
、５〜６日間の安定性試験を行った。グルコース濃度が
低い場合（８０〜１００■／ｄり、応力をかけると、平
均グルコース値は３．４％低下し、最大低下率は９．５
５％であった。一方、グルコース濃度が高い場合（２８
０〜３２０■／ｄ１）、グルコース値は平均で３．４％
低下し、このときの最大低下率は１０．０％であった。
以下余白 表−１ ｐＨ−４，０及び４．８のポジジン円板状試薬品にＦＪ
２２Ｂ　　　　　−６，２５＋５．４ＦＪ２７Ａ　　　
　　−４，０−５，１４ＦＪ２８Ｂ　　　　　−２，４
−５，３ＦＪ３０Ｈ−９，５５−１０，０ ＦＪ３１Ｃ＋４．４３　　　　　−１．２４ＦＪ３６　
　　　−３．２　　　　　−８．５ＦＪ４８Ｂ”　　　
　−３，００，Ｏ Ｇ？１４８Ａ″’　　　　−３，０二に８個のデー タの平均　　　−３，４−３，４ 備考二＊これらの２つの試料の酵素及び色素の濃度は、
通常のものの２倍である。
この膜を５６℃で１９日間応力をかけたところ、接着剤
の使用、不使用にかかわらず大きな差がなかった０両方
の場合において、１９日間におけるグルコース値の減少
は低濃度（８０〜１００■／ｄ１）及び３００■／ｄＩ
で１５％未満であった。
別に、通常の２倍の酵素及び色素濃度を有する手動浸績
した０、　８　ｔｎａポジジン膜を用いて５６℃での実
験を行った。同じ銘柄であるが異なる配合のものを作製
し、１４日間にわたって安定性を測定した。これら２つ
の実験の結果の平均値をプロットした。１４日間におけ
る変化は、高濃度及び低？】度グルコースの両方につい
て、±ｌθ％以内であった。これらのデータからこの銘
柄のものが特に安定であることがわかる。
ＭＰＸに関する試料サイズの要件を表９に示す。
以下余白 、表−」− 高グルコースＹＳＩ　−３６０ ３３０１２６０２７６２８６２Ｂ０　２７４　２３２　
２４４　２６０　２５２５　３９８　４０２　３８２　
３７０　３Ｂ８　３７８　３８７　３６６　３５１　３
７０１０　３６４　３６２　３７８　３６Ｂ　　３６８
　３５６　３５８　３７９　３６９　３６６上記の表に
示した容積の試料を第１′図に示す試薬パッドにマイク
ロピペットで移した。フイガースティックで血液をスト
リップに塗布したときは、試料の全量を移すことはでき
ない、従って、ここに示した容積は、分析のために指か
ら絞り出す必要のある試料サイズの合計量を表わすもの
ではない、試料パッドの円周を完全におおうに必要な試
料の最少Ｎ５ＩＪ１である。この程度の量では、試薬パ
ッドを完全に飽和させることができず、ＭＰＸ測定では
低い値となる。４ｄの試料量でようやく試料パッドを飽
和させることができ、５Ｉの試料量が飽和に十分な量で
ある。１０Ｉｉの試料量はぬれてひかる程度の液滴であ
り、２０ＩＪ１の試料量は非常に大きな液滴であり、ピ
ペットで血液をサンプリングする時にのみ用いる。
単一波長の場合、低グルコース濃度では、得られる結果
はいくぶん試料サイズに依存するが、三波長測定ではこ
のようなことは全くない。単一波長の場合のこのような
依存性は許容できる程度のものと考えられるが、好まし
くないことは明らかである。
以下余白 ス】ｌ生１ 上記の測定実験を、一点のデータ当り通常２゜３又は４
回測定をくり返した。これらの一連のデータは、例えば
、ヘマトクリットあるいは酸素濃度が極端に高い場合に
おいてさえ、よく近似していた。又、Ｃ，Ｖ、値は５％
をはるかに下まわっていた。従って、再現性が非常に良
好であると思われる。
〔発明の効果〕
本発明は、現在市販されているシステムや文献に記載さ
れているシステムに対して数多くの利点を有している。
即ち、プロトコールが簡単であり、はとんど技術的熟練
を要せず、且つオレベータにより発生する誤差が比較的
ない、又、このアッセイは、家庭において使用する物質
について考慮すべき重要な事柄を満足しており、迅速に
行うことができるばかりでなく、使用する試薬は、安価
で且つ比較的無害のものである。得られる結果は使用者
にとって理解可能なものであり、使用者はその結果を継
続治療に併せて利用することができる。
更に、試薬は保存性に優れているので、長期間にわたっ
て信頼性のある結果を得ることができる。
又、装置が簡単であり、信頼性に優れ且つ実質的に自動
である。
本明細書において具体的に言及した全ての特許及び文献
は、本発明の属する分野における当業者の技術水準を示
すものであり、そこに記載されている事項は必要に応じ
て本発明に利用できる。
ここに詳述した本発明は、特許請求の範囲に記載した発
明の精神及びその範囲から逸脱することな（、数多くの
変形と変更を行うことができることは、当業者の当然と
するところである。
【図面の簡単な説明】
第１図は分析すべき流体を塗布した反応バンドを含む試
験装置の一態様の斜視図であり、第２図は本発、明の実
施に用いることのできる装置の概略を示すブロック図で
あり、第３図は本発明の実施に用いることのできる他の
装置の概略を示すブロック図である。 １１・・・試薬ハツト、　　　１２・・・ハンドル、１
３・・・接着剤、　　　　　１４・・・穴、１５・・・
光検出器、　　　１６・・・増幅器、１７・・・軌道・
保持回路、 １９・・・アナログ・ディジタル変換器、２０・・・マ
イクロプロセッサ−１ ２１・・・プログラム・アンド・データメモリ、２２・
・・表示装置。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、膜と、吸光性色素生成物を生成するシグナル生成系
    とを用いて血液試料中のグルコースを定量する方法であ
    って、該シグナル生成系が該膜に結合しており、該色素
    生成物の量を該膜の表面での反射率測定により定量する
    方法において、全血液を該膜の表面に塗布し、該膜の、
    該試料を塗布した表面以外の膜表面で反射率の測定を行
    うことを特徴とする血液試料中のグルコースの定量方法
    。 ２、該シグナル生成系が、赤血球が吸収する波長とは異
    なる波長で光を吸収する色素生成物を生成し、且つ該赤
    血球の吸収波長と該色素生成物の吸収波長の二つの異な
    る波長で反射率測定を行う特許請求の範囲第１項に記載
    の方法。 ３、該二つの波長が、それぞれ約６３５ｎｍ及び７００
    ｎｍである特許請求の範囲第２項に記載の方法。 ４、該シグナル生成系が、グルコースオキシダーゼ、ペ
    ルオキシダーゼ及びＭＢＴＨ−ＤＭＡＢインジケータか
    らなる特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ５、該膜の表面が、ポリアミドである特許請求の範囲第
    １項に記載の方法。 ６、該ポリアミドが正に滞電しており、且つグルコース
    オキシダーゼ、ペルオキシダーゼ及びＭＢＴＨ−ＤＭＡ
    Ｂインジケータが該方法の実施に先立ち、該膜に結合さ
    れる特許請求の範囲第５項に記載の方法。 ７、全血液試料を、グルコースオキシダーゼ、ペルオキ
    シダーゼ及び反応生成物を生成することのできる色素イ
    ンジケータが結合した親水性マトリックスからなる試薬
    要素に塗布し； 該試料を該膜に浸透させ； 該膜への該試料の浸透度の検出及び反射率の減少による
    所定の時限の反射率の読み取りの為の計時を開始し；及
    び 該色素生成物の吸光性から生じる反射率の追加的変化に
    より、該試料中のグルコースを定量する工程を包含する
    グルコースの定量方法。 ８、該色素インジケータが、ＭＢＴＨ−ＤＭＡＢインジ
    ケータである特許請求の範囲第７項に記載の方法。 ９、該親水性膜が、ポリアミド表面を有する特許請求の
    範囲第７項に記載の方法。 １０、該親水性膜が、正に帯電している特許請求の範囲
    第９項に記載の方法。 １１、多孔質マトリックスの第一表面で最初の反射率測
    定の読み取りを少なくとも一回行った後、該マトリック
    スの第二表面に試料を塗布し； 該第一表面で、追加の反射率の読み取りを少なくとも一
    回行い； 該追加の反射率の読み取り値を該最初の反射率の読み取
    り値と比較し、該試料が該第一表面に到達することによ
    り生じる反射率の降下が所定の値になったとき、計時測
    定を開始し；及び 該追加の反射率の読み取り値と該最初の反射率の読み取
    り値と差が所定の値になった後の所定の時間に、反射率
    の測定値の読み取りを行うことからなる、反射率測定装
    置での測定の計時を開始する方法。 １２、該表面は最初は乾燥状態にあり、且つ液状のアッ
    セイ媒体が該マトリックスの該第一表面まで浸透したと
    きに、該追加の反射率の読み取り値と該最初の反射率の
    読み取り値との間に差が生じる特許請求の範囲第１１項
    に記載の方法。 １３、該マトリックスが、色素前駆体を結合している特
    許請求の範囲第１２項に記載の方法。 １４、分析すべき吸収流体を含むことのできる多孔質マ
    トリックスを除去可能に含有するようにしてある、遮光
    用囲いを有する容器； 該マトリックスの表面を照明する手段； 該マトリックスから反射する二つの異なる波長の光を検
    出する手段； 反射光の読み取り値を集め、反射光の第一波長での分析
    物あるいは反応生成物の吸光度及び反射光の第二波長で
    のバックグラウンドの吸光度に基づいて該流体中の分析
    物の量値を計算する制御手段；及び 該量値を報告する手段、から構成される流体中の分析物
    の定量用測定装置。 １５、該装置が、更に該照明手段、検出手段、制御手段
    及び報告手段に作動可能に接続された自給式電源からな
    る特許請求の範囲第１４項に記載の装置。 １６、該照明手段及び二つの異なる波長の光を検出する
    手段が、共に： １）異なる波長の二つの光源と一つの光検出器；あるい
    は ２）多色光源と、異なる波長の光の検出に限定された二
    つの検出器からなる特許請求の範囲第１４項に記載の装
    置。 １７、該光の第一波長が、６９０〜７１０ｎｍであり、
    該光の第二波長が、６２５〜６４５ｎｍである特許請求
    の範囲第１４項に記載の装置。 １８、どちらかの波長の光の反射率の初期減少に基づい
    て時限回路が該制御手段により始動され、該減少が、該
    流体を該照明手段により照明される表面以外のマトリッ
    クス表面に塗布した後、該流体が該マトリックスに浸透
    することにより生じる特許請求の範囲第１４項に記載の
    装置。 １９、該制御手段により、該反射率の初期減少の後所定
    の間隔で少なくとも一回以上反射光の読み取りがなされ
    る特許請求の範囲第１４項に記載の装置。 ２０、該制御手段が、流体を該試薬パッドに塗布する前
    の該試薬パッドでの反射率の読み取り値を集め且つ記憶
    することができる特許請求の範囲第１９項に記載の装置
    。 ２１、該制御手段が、更に該試薬パッドからの反射光の
    不存在下でのバックグラウンド検出器電流の読み取り値
    を集め且つ記憶することができる特許請求の範囲第２０
    項に記載の装置。 ２２、分析物検出モードにおける該制御手段に電力を供
    給すると、該制御手段が、自動的に該検出器からの一連
    の反射率の読み取り値を集め且つ比較し、反射率の降下
    を検出するや時限回路を始動し、該反射率の降下後所定
    の間隔で反応反射率の読み取り値を集め、該反応反射率
    の読み取り値から該流体中の分析物の濃度値を計算し、
    且つ該濃度値を該報告手段に移行させる特許請求の範囲
    第２１項に記載の装置。 ２３、該分析物検出モードに先立つベース反射率モード
    において、該制御手段に電力を供給すると、該制御手段
    が、流体の該マトリックスへの塗布に先立ち、該マトリ
    ックスでのベース反射率の読み取り値を集め且つ記憶し
    、又、分析物検出モードにおける該制御手段に電力を供
    給すると、該制御手段により該反応反射率の読み取り値
    から該ベース反射率読み取り値が差し引かれ、得られる
    値を用いて該制御手段が計算を行う特許請求の範囲第２
    ０項に記載の装置。 ２４、不活性多孔質マトリックスと、分析物との相互作
    用により吸光性反応生成物を生成することのできる試薬
    系からなる試薬要素であって、該試薬系が分析すべき液
    体を該試薬要素に塗布する前に該マトリックスの孔に含
    浸させたものである該試薬要素の第一表面で、ベース反
    射率を定量し； 反応反射率を測定する第一表面以外の該試薬要素の第二
    表面に該液体を塗布した後であって、且つ該液体が該試
    薬要素を通って該第二表面から該第一表面に移行した後
    に、該試薬要素での反応反射率を定量し； 該液体の塗布の後、該反応反射率を測定するのに用いる
    光の波長とは異なる光の波長を用いて、該試薬要素の第
    一表面での干渉反射率を定量し；及び 該反射率の測定値から該液体中の分析物の濃度を表す値
    を計算で求めることからなる、液体中の分析物の濃度を
    測定する方法。 ２５、該マトリックスが、ポリアミドから形成された表
    面を有する特許請求の範囲第２４項に記載の方法。 ２６、該マトリックス中の孔の平均径が０．２〜１．０
    μｍであり、且つ該液体が全血液である特許請求の範囲
    第２４項に記載の方法。 ２７、該試薬が、グルコースと反応して吸光性反応生成
    物を生成する特許請求の範囲第２６項に記載の方法。
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