JPS62502338A - 立体規則性ポリヌクレオチド結合ポリマ− - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 立　１１　ポリヌクレオチド出入ポリマー１、光里■吸血分団 本発明は塩基特異性のポリヌクレオチド結合ポリマーに関する。

２、発Ｊ坏ど１最 ポリヌクレオチド中の標的塩基配列を認識しかつこれと特異的に結合し得る化合 物は、多くの潜在的に有益な応用がある。例えば、治療用途では、この化合物は 、ウィルス性のゲノムまたは他の一末鎖ポリヌクレオチド種と結合して感染性微 生物の特性を不活性化する作用があるだろう。診断上の応用では、この化合物は 、−末鎖ポリヌクレオチドの分析の際に、ウィルスまたはバクテリアに特異的な 核酸種の存在を検出するべく“ハイブリダイズ”するのに用いられるだろう。

ポリヌクレオチドの塩基特異的な標的領域に特異的に結合し得る試薬を得る最も 初期の試みは、　（ベリコツ（Ｂｅｌｉｋｏｖ）　。

ツァロトバ（Ｚａｒｏｔｏｖａ）　、グリネフ（Ｇｒｉｎｅｖ）　）の概念に基 づいていた。この概念では、アルキル化試薬を用いて標的特異的なポリヌクレオ チドを誘導し、この誘導された化合物を標的の一本鎖Ｒへ４またはＤＮＡと結合 させる（スメルトン（Ｓｕｍｍｅｒ　ｔｏｎ）およびパルトレッド（Ｂａｒｔｌ ｅｔｔ）（１９７８）、　Ｊ、　Ｍｏ１ｅｃ、　Ｂｉｏｌ、　１２２　：１４５ ）。次いで、この標的鎖をアルキル化すれば、この化合物がこの標的に不可逆的 に結合するだろう。この方法には。

主として２つの困難な点がある。１つは、この誘導されたポリヌクレオチドの負 に荷電したバックボーンが９重要なことに、生体細胞の移動を制限している。２ 番目には、この試薬中のホスホジエステル連鎖は、特に、試薬を不活性化する遺 伝子がエンドサイト−シスを経て細胞内に入るときに、細胞ヌクレアーゼにより 急速な開裂を受ける。

より最近では、アンチセンス遺伝子（このＲＮＡ転写は特定の標的−末鎖ポリヌ クレオチドを認識しかつこれと結合し得る）を運ぶプラスミドの設計には１組換 えＤＮＡ方法が与えられている。このようなプラスミドを細胞中に導入すれば、 アンチセンスｍＲＮＡが継続的に生成する。このアンチセンスｍＲＮＡは、相補 的な標的ｍＲＮＡと対になり、それにより翻訳を阻害することは明らかである（ イツアンド（Ｉｚａｎｔ）およびパイントララブ（Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ）（１９ ８４）　、　Ｃｅ１１．３６　：　１００７　：イツアントおよびパイントララ ブ（１９８５）＋　５ｃｉｅｎｃｅ、韮：　３４５）。この方法の特有の長所は 以下にある。このような単一のプラスミドでさえ、うまく導入すれば、この標的 化された遺伝子活性の継続的な不活性化および／またはこの標的化された遺伝子 配列を含む病原体に対する永久的な抵抗性に潜在的な効果があるだろう。しかし ながら、この方法は、このプラスミド構造を用いて、大量の組繊細胞または器官 細胞を形質転換するという問題により、厳密に制約されている。

細胞に容易に取り込まれるだけでなく細胞内分解に対しても安定なポリヌクレオ チド結合試薬を設計する試みは、荷電されていないかまたは実質的に荷電されて いないバソクボーンを有するポリヌクレオチド類似物に焦点がある。このような 非荷電の化合物についての最も初期のある報文には、多くのポリヌクレオチド類 似物が包含されていた。この類似物中では２通常の核酸の糖−リン酸エステルバ ックボーンがポリビニルバックボーンにより置換されていた。このような核酸類 似物は、相補的なポリヌクレオチドとともに正規のワトソン／クリック対特異性 を有することが示された。しかし、これは、実質的にＴｍ値の低下を伴っている （ピサ（Ｐｉｔｈａ）　（１９７０）　。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ＋　２０４　：　３９）。

続いて、荷電されていないおよび実質的に荷電されていないヘテロ重合性ポリヌ クレオチド類似物（これは核酸とほとんど等構造である）は、標的化された一本 鎖遺伝子配列をインビボで不活性化するために調製されている。これらの物質は 、アリール窒素マスタードを誘導したオリゴヌクレオチド（カルポバ（Ｋａｒｐ ｏｖａ）　ら（１９８０）、　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、　１２２　：　２１ ）およびこれを誘導していないオリゴヌクレオチド（リチャード　ツリス（Ｒｉ ｃｈａｒｄ　Ｔｕｌｌｉｓ）、Ｐｅｒｓｏｎａｌ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ 、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａ＋旧ｏｓｙｓｔｅｍｓ、　Ｉｎｃ、、サンジエゴ）の両方 を含んでいる。これらのヌクレオチドは、荷電されていないトリエステル状態で 。

そのリン酸塩を有している。最近報告されているポリヌクレオチド類似物の新規 なりラスには、主として荷電されていないアククチツクなメチルホスホネートバ ックボーン連鎖、またはホモキラルなメチルホスホネート連鎖（これには、荷電 されたアキ今ルなホスホジエステル連鎖が交互に組み込まれている）が含まれる （Ｍｉｌｌｅｒ、　Ｙａｎｏ、　Ｃａｒｏｌｌ、　Ｊａｙａｒａｍａｎ、　ａｎ ｄＴｓ’　ｏ（１９７９）、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１８　：　５１３４　；　Ｍｉｌ ｌｅｒ、Ｄｒｅｏｎ＋　Ｐｕ１ｆｏｒｄ。

ａｎｄ　Ｐａｒｌａｎｄ　（１９８０）＋　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ−＋　 ２５５　：　９６５９　；　Ｍｕｒａｋａｍｉ。

Ｂｌａｋｅ、ａｎｄ　Ｍｉｌｌｅｒ　（１９８５）、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、２４　 ：　４０４１　：　Ｂｌａｋｅ。

Ｍｕｒａｋａｍｉ＋　５ｐｉｔｚ、Ｇｌａｖｅ、Ｒｅｄｄｙ、Ｔｓ’　０１　ａ ｎｄ　Ｍｉｌｌｅｒ　（１９８５）＋２４　：　６１３２　；　Ｍｉｌｌｅｒ、 　Ａｇｒｉｓ、　Ａｕｒｅｌｉａｎ＋　Ｂｌａｋｅ、　ＦＩｕｒａｋａｍｉ。

Ｒｅｄｄｙ、５ｐｉｔｚ、ａｎｄ　Ｔｓ’　ｏ　（１９８５Ｌ　Ｂｉｏｃｈｉｍ ｉｅ、６７　ニア６９　）　。

上記荷電されていないまたは実質的に（？Ｊ電されていないオリゴヌクレオチド 類似物は、生体細胞内に入り、その中の相補的な遺伝子配列と対になることが報 告されている。特に。

この化合物が１分子当たり１つまたは２〜３のイオン性基で設計されているなら 、水性媒質中の溶解性を高めるために。

この細胞による最適な取り込みが達成されることが見出されている。しかしなが ら、このバックボーン上での荷電密度が著しく増すと、細胞膜を通る輸送が不充 分になるという問題が生じる。また、ホスホジエステル連鎖が離されると、ヌク １ｒレアーゼの安定性がより大きくなる。。

上記荷電されていないおよび実質的に荷電されていないポリヌクレオチド類似物 は、すべて、キラルなバンクボーン連鎖、すなわち２つの可能な立体異性体形状 を与える連鎖を有する。結果として、サブユニットを連結することにより生じる ポリマーのバックボーンは、左巻き形状および右巻き形状のランダム配列を有す る。このタイプのバックボーン構造は。

また、アククチヌクバックポーンとして述べられている。この構造は、類似物／ 標的結合定数が広範囲なところに特徴がある。正規の相補的なポリヌクレオチド 間の結合定数に関しては、この平均の結合定数は著しく低減され得る。

このホスホトリエステルおよびメチルホスホネートが結合した核酸類似物に関し 、この結合定数の減少および広がりは。

おそら（、近接した塩基のワトソン／クリック対を助けるある鎖状異性体、およ び近接した塩基のワトソン／クリック対をｍ害する他の鎖状異性体に由来する。

この連鎖の塩基対上のキラリティー効果は、メチルホスホネートを連結したジデ オキシリボヌクレオシドの２つの分かれた異性体形状を包括する研究により、う まく確立されている。これらの２量体の各々は、その相補的なポリリボヌクレオ チドと混合された。

ある異性体は１９．８℃のＴｍで結合することが見出された。これに対して、他 の異性体は、　１５．４℃の対応するＴｍ値しか有していなかった（Ｍｉｌｌｅ ｒ、　Ｄｒｅｏｎ、　Ｐｕ１ｆｏｒｄ、　ａｎｄ　Ｐａｒｌａｎｄ　（１９８０ ）＋Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５５　：９６５９）　ｏこの異性体のメ チルホスホネート２量体を通常のホスホジエステル連鎖と連結することにより形 成される同種の異性化１０量体についてτｍ結合値を調べるために、これらの研 究はさらに拡大された。好ましい異性化メチルホスホネート連鎖を有する２量体 から形成されたこの１０量体は、３３°ＣのＴｍで相補的な遺伝子配列と対にな った。

対照では、メチルホスホネート連鎖の他の異性体形状を含む対応する１０量体は 、０℃でもその相補的な遺伝子配列と対にはならなかった（？１ｉｌｌｅｒ、　 Ｄｒｅｏｎ＋　Ｐｕ１ｆｏｒｄ、　ａｎｄ　Ｐａｒｌａｎｄ　（１９８０）、　 Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、２５５　：　９６５９　）。

理論的な領域では、治療上および／または診断上の価値のある配列特異的なポリ ヌクレオチド結合試薬に関し、これが実質的に一定の結合定数をもった相補的な 標的配列と対になると信ずべき理由がある。ここでの理由づけは、以下のとおり である。与えられた調製物が多数の分子種を含むなら、その各々はそれ自体の標 的結合定数に分かれる。次いで、低い結合定数を有する分子種は、はとんど標的 結合活性を与えない。これに対して、著しく高い結合定数を有するいくつかの分 子種も、また、標的でない配列に誤って対になった比較的安定な複合体を形成す る。治療上の状況では、標的でない配列に著しく結合すれば、有害な副作用の生 じる可能性がある。

これに対して２診断上の状況では、このような結合によれば。

高いバンクグラウンドおよび／または誤った正電荷が生じるだろう。

原則として、現在利用できる方法を用いれば、あらかじめ荷電されるかまたは一 部荷電され、かつキラリ−に連結された核酸類似物（これは実質的に一定の標的 結合定数を存する）を調製できるだろう。このことを達成する１つの方法りこは 。

ポリマー溶液をアフィニティーカラムに結合させることが包含されるだろう。こ のポリマー溶液は、与えられた標的配列に対し広範囲のＴｍ値をもったポリマー 種を含有する。このアフィニティーカラムは、一定の形式で標的配列を有してい る。

次いで、この類似物゛は、ホルムアミドのような溶離液に濃度勾配を設けて溶出 されるかおよび／または徐々に温度を上げて溶出することにより溶出される。こ の溶離液は、より強固に結合された類似物を、より高い溶離液濃度でしだいに放 出する。この溶離液を狭い範囲でカントすれば、そこには、実質的に一定の標的 結合定数を有する分子が主として含まれるだろう。この方法で結合の同質性をよ り大きくすれば、実質的に使用可能なポリマーの最終的な収量が明らかに減少す る。

必要に応じて、タクチックな連鎖（すなわち、すべての分子は、キラル中心の同 じ配列を有する）をもった荷電されていないオリゴヌクレオチド類似物は、幾何 学的な集合手順により調製され得る可能性がある。この手順では、各サブユニッ トの添加段階で形成される２つの立体異性体のうちの１つが保持され、そしても う１つが除かれる。この方法では、もちろん１次のような制約がある。これは、 各サブユニットの添加段階において、物質の少なくとも半分が捨てられ、その結 果、収量がせいぜい出発物質の１７２ｎとされ得ることである。

ここで、　ｎは合成に要するカンプリングの繰り返し数である。

それゆえ、キラルなサブユニット間連鎖（これは、実質的に一定の結合定数で相 補的な標的配列と対になる）を有する荷電されていないポリヌクレオチド類似物 を調製することが可能になるけれども、それにもかかわらず、このようなキラリ −に連結されたポリマーを合成および精製すれば９時間がかかるうえにどうして も収量が少なくなるだろう。

３、光里■！ｌ それゆえ９本発明の１つの一般的な目的は、従来技術のポリヌクレオチド結合試 薬に関連した問題点および制約を実質的に解決する塩基特異的なポリヌクレオチ ド結合組成物を提供することにある。

本発明の関連した目的には、以下の事項が包含される：（ａ）ポリマーの分子成 分が、−末鎖ポリヌクレオチド中の標的配列に関し、全て実質的に同じ結合親和 性を有するような組成物を提供すること。

（１））約５〜３０塩基対の間の長さ範囲内にあるほとんどのヌクレオチド標的 配列に対し標的化するべく設計され得、かつ相対的に高収率で調製され得るよう な組成物を提供すること。

（Ｃ）選択された標的配列に対し所望の結合親和性を有するような結合組成物を 提供すること。

（ｄ１種々の治療上および診断上の応用に適当な結合化合物を提供すること。こ の応用は、この化合物中のバンクボーン連鎖の立体規則的で荷電されていないか または実質的に荷電されていない性質を利用する。

本発明は２選択された結合親和性をもって、塩基の標的配列を含む一本鎖ポリヌ クレオチドと結合するべく設計されたポリマー組成物を包含する。この組成物は ３次の式の非単独重合性で実質的に立体規則的なポリマー分子を含む：Ｒ，Ｒ２ Ｒ３Ｒ１１ Ｂ〜Ｂ−Ｂ〜　・・・Ｂ。

ここで。

（ａ）Ｒ１−Ｒ，は、プリン、プリン類似物、ピリミジン、およびピリミジン類 似の複素環化合物から選択された認識部分であり、この部分は、標的配列内の対 応する内部配列塩基とワトソン／クリック対により効果的に結合する；（ｂ）　 ｎは、ポリマー分子と標的配列との間で形成されるワトソン／クリック水素結合 の全数が少なくとも約１５であるような数である； （ＣＡＢ　−Ｂは、化学的に安定であり実質的に荷電されておらず主としてアキ ラルな連鎖により連結されるバンクボーン部分である； （（１）バンクボーン部分が環状構造であれば、バンクボーン部分のユニット長 は５〜７原子であり、そしてバンクボーン部分が非環状構造であれば、そのユニ ット長は４〜６原子である；そして。

（ｅ）このバンクボーン部分は、この標的配列の対応する内部配列塩基とこの認 識部分との間にワトソン／クリック塩基対を入れる位置において、この認識部分 を支持している。

診断上の応用に用いるより好ましい実施態様では、このポリマー分子は、水性媒 質中での化合物の溶解性を増すべく。

少数の電荷を有している。この電荷は２分子の末端領域またはアキラルに荷電さ れたバンクボーン鎖で付加され得る。

このポリマー分子は１本発明の合成方法に従って、まず標的ポリヌクレオチド中 の塩基配列を選択することにより、構成される。この配列は、最終的な結合ポリ マー中のサブユニット数に対応して、典型的には約５−３２塩基、好ましくは約 ８−２０塩基である。この結合ポリマーの標的ポリヌクレオチドに対する結合親 和性は、標的配列塩基の数（そして、対応していえば、この結合ポリマー中のサ ブユニット数）の増加により、増やされ得る。次いで、このＢ−Ｒ，および／ま たはＢ−Ｒ，形状のポリマーサブユニットが、標的特異的な配列中の塩基配列に 対応して、規定された配列で結合される。ここで＋　ＲｉおよびＲｊは、上記に 定義されるごとく、認識部分であり、これは、それぞれ２つまたは３つのいずれ かの水素結合を介して、対応するポリヌクレオチドとともに、ワトソン／クリッ ク塩基対を形成し得る。この結合ポリマーの標的ポリヌクレオチドに対する結合 親和性またはＴｍは、このポリマーの形成に用いられるＲ、認識部分とＲｉ認識 部分との比に従って。

選択的に変えられ得る。Ｒ，認識部分の割合が大きくなるほど、標的ポリヌクレ オチドに対する結合親和性がより低くなる。

このポリマーは、規定された標的塩基配列を有する分析ポリヌクレオチドを検出 するための診断システムに有用である。

このシステムは、固形担体と連結した本発明のポリマー分子からなる担体試薬を 含む。本発明の一実施態様では８分子をつなぐポリマーは、主として荷電されて いない。別の実施態様では、このバンクボーン部分は、アキラルで荷電された連 鎖（例えば、ホスホジエステル連鎖）により、１つまたはそれ以上の荷電されて いないアキラル連鎖を交互に伴って連結されている。

この検出方法を実施するに際し、ポリヌクレオチド分析物は、以下の条件でこの 診断試薬に加えられる。この条件では。

この分析物は一本鎖の形状であり、この分析物と試薬ポリマーとの間に配列特異 的な対が入れられる。この分析物質／ポリマーアニーリング反応の後、この試薬 は、結合していない試験物質を除去するべく洗浄される。この試薬および結合し た分析物は１次いで、オリゴカチオン性レポーターと反応する。このレポーター は、この結合した分析物の荷電されたホスホジエステル連鎖とは静電引力により 結合するが、荷電されていないかまたは実質的に荷電されていないポリマー分子 とは結合しないように設計されている。このシステムの１つの特徴は、結合した レポーターの結合した分析ポリヌクレオチドに対する比（分析分子光たりに結合 されたレポーター分子の数）は、高感度の検定では、１０２〜１０４とされ得る ところにある。

治療上の応用では、このポリマー組成物は１選択された標的一本領ポリヌクレオ チド（例えばＲＮＡウィルス）の発現を阻害するように設計されている。ここで 、このポリマーは。

好ましくは、非特異的結合効果を最小にするべく、標的発現の所望の阻害を生じ るのに要する最小の結合を伴って、この標的ポリヌクレオチドと特異的に結合す るように構成されている。

本発明のこれらの目的および他の目的および特徴は、以下の本発明の詳細な説明 を添付の図面と関連させて読むと、よりいっそう明らかとなるであろう。

皿皿企旦巣星説貝 第１図は９本発明のポリマー分子を形成する際に用いられるより好ましいプリン 構造およびピリミジン構造を示す。

第２図は、このポリマー分子を形成する際に用いられるより好ましいプリン類似 物認識部分およびピリミジン類似物認識部分を示す。

第３図は、このポリマー分子を形成する際に用いられるより好ましい環状バック ボーン部分を示す。

第４図は、このポリマー分子を形成する際に用いられるより好ましい非環状バッ クボーン部分を示す。

第５Ａ図および第５Ｂ図は、　Ｎ＋−−−−Ｎｚタイプのサブユニットバックボ ーンをカップリングするための２つのより好ましいサブユニット組立てスキーム を例示している。

第６図は、第５Ａ図および第５Ｂ図に例示の方法に従って形成されたＤ−Ｄを介 したサブユニットダイマーＡ−Ａのパンクポーン構造を示し、かつ第７Ａ図およ び第７Ｂ図に例示の方法に従って形成された２つの環状パンクポーン構造を示す 。

第７　Ａ−７Ｃ図は、　Ｎ＋−−−−Ｅタイプのサブユニットバックボーンをカ ンプリングするための３つのより好ましいサブユニット組立てスキームを例示し ている。そして。

第８図は、第７Ａ−７Ｃ図に例示の方法に従って形成されたサブユニットダイマ ーのより好ましい非環状バックボーン構造を示す。

日の蕾　なｉ゛ 本発明の診断システムは、多数のヌクレオチド結合ポリマー分子を備えた固体担 体からなる固体担体試薬を含んでいる。

本発明のポリマー組成物は１選択された結合親和性で、塩基の標的配列を含むポ リヌクレオチドと結合するように設計されている。この組成物は、非単独重合性 で実質的に立体規則的な分子または種（以下の形式である）からなっている：Ｒ ，Ｒ２Ｒ，Ｒ１１ Ｂ〜Ｂ〜Ｂ〜　・・・　Ｂ。

ここで、Ｂ−Ｒ，は、パックボーン部分Ｂおよび認識部分Ｒ。

を含む一連の塩基特異的なサブユニットである。この認識部分Ｒ，は、標的配列 中の対応する内部配列塩基と、ワトソン／クリック塩基対により特異的に結合す るように選択されている。このサブユニットは、これらパックボーン部分を介し て。

主としてアキラルであり実質的に非荷電の結合と連結されている。このポリマー 種を構成する際の使用に適当なサブユニットの設計および選択は、以下の第１節 に記述されるだろう。

アキラルな連鎖を介したサブユニー／　）のカップリング方法は。

第２節に記述されている。サブユニット保護基とともに、サブユニット合成の際 に包含される戦略は、第２節で論じられる。

このポリマー種は、連続して起こるサブユニットカップリングにより合成され２ 選択された長さおよび配列のポリマー分子が形成される。第４節に記述のように 、この標的配列およびポリマー配列の長さは、所望の結合特異性を達成するべく 選択される。このポリマーの標的に対する結合親和性は。

第４節に論じるいくつかの戦略により選択的に変えられ得る。

この戦略には認識部分の選択が含まれる。この認識部分は。

対応する標的塩基とともに、３つ（より大きな結合親和性のために）または２つ （より小さな結合親和性のために）のいずれかの塩基と対になった水素結合を形 成し得る。この得られた組成物は、ポリマー種またはポリマー分子を含む。これ らのすべては、実質的に同じサブユニット配列および実質的に同じ内部サブユニ ット連鎖のタイプを有している。機能的な言い方では、このポリマー種のすべて は、この標的ポリヌクレオチドに対し、実質的に同じ結合親和性を有している。

いったん所望のサブユニット配列が選択されると、このポリマーを組立てる方法 は第４節に示される。

このポリマー組成物は、第４節に記述の新規な固相診断システムに有用である。

このシステムは、各結合された分析分子に対し増幅されたレポーターシグナルを 与えるべ（１分析ポリヌクレオチド分子の担体結合ポリマー分子への結合および 続いて起こる多数のポリカチオン性レポーター分子のこのポリヌクレオチドへの 静電気的な付加に基づいている。このポリマーもまた２診断上の応用を含めた種 々の溶液への通用（これは第４節でも考察される）に有用である。

１．ヱブタゴヨ仁口１違 Ａ、認識那況 本発明のポリマー種を形成する際の使用に適当なサブユニットＢ−Ｒ，の設計に は、多数の構造上の規準および／または立体化学的な規準が包含される。この規 準は、バックボーン部分および認識部分だけでなく、この２つの間の連鎖によっ ても達成されるに違いない。この認識部分の設計上の必要条件がまず考慮される だろう。

各サブユニットの認識部分は１話かな立体配置で保持された２つまたは３つの水 素結合基を供給するに違いない。この立体配置は、標的遺伝子配列の特異化され た内部配列塩基上の２つまたは３つのワトソン／クリック水素結合部位に対する 水素結合に適合する。認識部分とそれに対応する標的塩基との間の望ましくない ミスベアリングを避けるために、使用条件下において、（１）この認識部分の互 変異性状態を相対的に安定化すべきであり、そして（２）この認識部分は、水素 結合基が相対的に固定した配置となる構造を有するべきである。このような固定 化は、最適には、極性の水素結合基を有する環構造により提供される。この極性 の水素結合基は、環の一部を形成するかあるいは環に直接付加されるかいずれか である。

このより好ましい認識部分の構造は、プリン、プリン類似物、ピリミジン、およ びピリミジン類似物の構造を含んでいる。この構造は、２つまたは３つのいずれ かの水素結合を介して２選択されたポリヌクレオチド塩基とワトソン／クリック 塩基対を形成するように設計されている。°ポリマーの合成で用いられるサブユ ニットの基は、少なくとも２つの認識部分を含んでおり、この認識部分は、異な るポリヌクレオチド塩基に対し塩基特異的である。好ましくは、天然のＤＮＡヌ クレオチドまたはＲＮＡヌクレオチド中の４つの塩基のそれぞれに対し、１つま たはそれ以上の認識部分がある。また、以下でわかるように、認識部分の１つの 基Ｒユ（これは２つの水素結合を介してヌクレオチド塩基と塩基対になり得る） と、２番目の基Ｒｊ（これは３つの水素結合を介して同じ塩基と結合し得る）と を供給するのが望ましい。第１図に、典型的なプリン型の認識部分およびピリミ ジン型の認識部分を示す。このプリン構造１および２は、チミン塩基またはウラ シル塩基と結合するべく設計されており、構造３−６はグアニン塩基と、構造７ −９はシトシン塩基と、そして構造１０−１２はアデニン塩基と結合するべく設 計されている。構造１．４．５゜６．８および１０−１２は、２つの水素結合を 介して、対応する内部配列塩基と結合するように適合されたＲ、タイプの部分で ある。残りの構造は、Ｒｊタイプの部分であり、これは塩基対上に３つの水素結 合を形成する。以下でわかるように、プリンヌクレオシドおよびピリミジンヌク レオシドは、ポリマー合成での使用に適当な種々の他のサブユニットを合成する 際に有用である。これらのサブユニットは、必要ならアミン保護基で修飾される 。これらは、市販の原料から得られるがまたは公知方法（例えば、実施例１に記 述されているかまたはそれに関連した方法）に従って調製され得る。

多くのプリン類似物構造またはピリミジン類似物構造が第２図に示されている。

これらの構造内では、認識部分が環状炭素を介してバンクボーンと連結されてい る。これらの構造は、第１図に示される類似物構造の塩基対特異性や水素結合特 性と似かよった塩基対特異性や水素結合特性を有する。炭素で連結された認識部 分を含むポリマーの結合特性は、認識部分が窒素で結合されるポリマー（第１図 のような）の結合を含むサブユニットは、一般に、実施されたプリンおよびピリ ミジンを含むサブユニットよりも合成が困難である。しかしながら、あるサブユ ニットの合成９例えば、実施例１ｏに記述のアキラルな非環状のバレクボーンサ ブユニットの合成では、炭素で結合した認識部分が有用な出発物質を提供してい る。

Ｂ−！」じと弘二詠」」氷 各サブユニットのバックボーン部分は、一般式Ｎ＋−−−−ＥまたはＮｒ−−− −Ｎｔを有する。ここで、Ｎ１およびＮ２は核性基であり、Ｅは電子性基である 。以下で論じるように、得られるサブユニット間連鎖に必要な安定性およびサブ ユニット結合の容易性に基づくと、より好ましい核性基はアミノ基、水酸基およ びヒドラジノ基である。そして、より好ましい電子性基および／または電子性結 合試薬は、炭酸、チオ炭酸。

カルボン酸およびスルホン酸の誘導体である。

バックボーン部分は、環状構造または非環状構造のいずれかを有し得る。可能な バンクボーン部分の構造の全数は極めて多いものの、それにもかかわらず、多く の要因のために。

かなり限られた数の構造しか実際に実施するに値しない。都合のよいバンクボー ン部分を選択する最初の手順を次に示した。

第一の条件としては、これら環状のバックボーン部分だけは、デオキシリボース またはリボースからなるがまたはそこから容易に誘導され得ると考えられた。こ の制約は実際的な制約であり、これは、多数のキラル中心をもつ環構造を新生合 成することが困難であるうえにそれに対応してより多くの経費がかかることを反 映している。一般に、ポリマーに適当と思われる可能性のあるバック余−ン部分 およびサブユニット間連鎖は、以下の要因の１つまたはそれ以上に基づいて選択 された：公知の反応に基づく合成の実行可能性；入手可能な出発物質からの合成 の予期された容易性：構造の簡単さ；および最終的なバンクボーンの予期された 安定性。

都合のよいバックボーン部分およびサブユニット間連鎖の最初の選抜は、以下の ように行われた。Ｂ型のオリゴデオキシリボヌクレオチドおよびＡ型のオリゴヌ クレオチドのＸ線回折により決定されたパラメーターに従って、二重のＤＮＡお よびＲＮＡの空間−充填ＣＰＫ分子モデルが構成された。これら構成された各二 重構造において、２つの糖−リン酸塩バックボーンのうちの１つは除去された。

次いで、可能であれば。

この塩基形状における最初の糖−リン酸塩バックボーンが除かれた部位に、各可 能性のあるバックボーンが付加された。

得られた各ポリヌクレオチド／ポリマー二重構造は１次いで。

そのワトソン／クリック塩基対の同一平面性、可能性のあるポリマーバックボー ン中のねじれ歪みおよび角度歪み、この核酸鎖上で付与される歪みの程度、およ び鎖問および領内の非結合性相互作用について調べられた。各アミド基を含むバ ックボーンについて、そのアミド部分が平面的であるようなコンホーメーション を容易に採用し得るかどうかに、特に注目が払われた。このことは、アミドを平 面的でないコンホーメーションにするためには、かなりのエネルギー損失を要す ることから重要である。

これら初期の研究から１次のことが立証された。必要なユニットバックボーン長 （すなわち、　Ｎｔ−−−−Ｅ内のＮ、−−−−Ｅ間隔または活性化されたＮｔ −−−−Ｎｚ　Ｅサブユニット）は、デオキシリボースまたはリボース（環状バ ックボーン構造）を構成するか、またはそこから誘導されるバンクボーン部分に 対し、５−７原子であり、６原子長さが最適である。

上記モデル研究で受け入れ可能と判断されたサブユニット構造は９次いで１合成 の実行可能性および集められたポリマーバフクボーンの安定性に関して評価され た。（この合成の実行可能性は１文献で報告された主要な合成反応またはモデル 化合物に関して実施される反応に基づくか、および／またはこのサブユニットの 実際の合成を媒介としている。）（この集められたポリマーバフクボーンの安定 性では、一般に。

適当に連結されたモデル化合物またはサブユニットダイマーを用いて予備の安定 性研究が実行された。）これらのタイプの研究は、候補となるバックボーン構造 の数をさらに制限するべく用いられた。この制限された候補のプールから、より 好ましい構造として、第３図に示す環状バックボーン構造Ａ−Ｇが最終的に選択 された。

この図では、　Ｎ、−−−−Ｎｚタイプの環状バックボーン部分を含むサブユニ ットＡ−Ｄは　２１−デオキシリボヌクレオシド（構造Ａ）：５’位置および３ °位闇がアミノ基で置換された２゛−デオキシリポヌクレオシド（それぞれ、構 造ＢおよびＣ）；およびリボヌクレオシドのモルホリノ誘導体（構造Ｄ）を包含 している。Ｎｔ−−−−Ｅタイプのバックボーン部分を含むサブユニットは、こ れらの５°位置が１つまたは２つの炭素酸で置換された２°−デオキシリボヌク レオシド（それぞれ、構造ＥおよびＦ）；および、これらの５”位置がカルボン 酸で置換されたりボヌクレオシドのＮ−アミノモルホリノ誘導体（構造Ｇ）また はスルホン酸で置換されたりボヌクレオシドのＮ−アミノモルホリノ誘導体（構 造Ｈ）を包含している。

非環状（分岐していない鎖）のバンクボーン部分に適用される同じ分子モデルの 方法では、−末鎖ポリヌクレオチドに対する塩基対水素結合内のポリマーコンホ ーメーションに関して、４−６原子の範囲のユニットバックボーン長が受け入れ られ、５原子のバンクボーン長が最適であることが示された。これは、６原子の ユニットバックボーン長が最適である環状バンクボーンと対照的である。さらに 、このモデル化研究では、以下のことが示された。この環状の認識部分は、この 相補的な塩基の同一平面性を厳密に阻害することなり、シかもこの認識部分とバ ックボーンとの間の望ましくない相互作用を導入することなしでは、線状のバン クボーン部分に直接付加し得ない。この認識部分が１原子のスペーサーでこのバ ンクボーン部分と連結されると、結合歪みが最小となった。

２原子スペーサーは許容されるが、３原子スペーサーは許容され得ない。しかし 、この認識部分と線状のバックボーンとの間の自由度が増すと、２原子スペーサ ーでは標的塩基と誤って対になり得る。

第４図に示される非環状バックボーン部分の構造１−Ｎは。

すべてバンクボーン部分と認識部分との間に１原子のメチレンスペーサーを含ん でいる。この構造では、相補的なポリヌクレオチドに好ましい塩基対に対する良 好なモデルが得られると予測された。２つの炭素スペーサーを含む類（以構造は 受け入れ可能なことが示されたが、結合コンホーメーションは好ましくなかった 。図に示される構造および類似の２つの炭素スペーサー構造は、一般に合成が容 易なために、より好ましい非環状バンクボーン部分である。しかしながら、多く の他のバンクボーン部分もまた。一般に合成が容易でないかおよび／または合成 には安価ではないものの、まったく実行可能でありかつ適当であることに触れて おくべきである。

Ｃ，バックボーン／゛。　の′４ 上記に示されるように、このポリマーサブユニット内のバックボーンと認識部分 とを接続する連鎖またはスペーサーは。

ある設計規準に適杏するに違いない。この規準は、ポリヌクレオチド塩基と結合 する塩基対に対し、この認識部分を位置決めするのに効果的である。第３図に示 される環状バンクボーン部分の場合では、この認識部分が、リボース構造または リボース類似構造の１゛炭素に直接付加するときやモルホリノ構造の類似の１° 位置に直接付加するとき、このポリマー内の結合コンホーメーションが最も好ま しいことがモデル化研究により示される。すなわち、この部分は、正規の結合位 置において、ヌクレオシドのリボース基またはデオキシリボース基に対するプリ ン塩基またはピリミジン塩基の正しい立体異性化立体配置で付加している。非環 状の構造番壬関し、この認識部分を好ましい結合位置に置くためには、１つおよ び２つの炭素原子スペーサーが必要である。１原子スペーサーは。

上記に論じられるごとくより好ましい。

ポリヌクレオチド標的に対しこのポリマー分子が一定の結合親和性を得るのに要 する立体規則性ポリマーの立体配置を達成するためには、このバンクボーン／認 識部分の結合が。

すべて一定のキラリティーを有するかまたはアキラルかいずれかであることも必 要である。もし、各結合がこのすべてのポリマー分子のあるサブユニット位置に おいて、同じ立体異性化立体配置またはキラリティーを有するなら、ここでの定 義のために、この結合は一定のキラリティーを有すると考えられる。すなわち、 異なる配列位置でのサブユニットは、異なる内部の立体異性化立体配置（特定の 配列位置でのアキラリティーを含む）を有し得るけれども、このポリマー分子間 で与えられた配列位置における結合は、すべて同じ立体異性化立体配置を有する 。ふつうに定義されたキラリティーは。

すべてのサブユニットに同じ立体異性化立体配置を用いることにより、極めて容 易に達成される。

この環状のバックボーン部分に対し、第３図に示される天然のＤ型立体異性化立 体配置を有するヌクレオシド類似物では、最も好ましい結合が起こる。このタイ プのサブユニットもまた。以下に論じられるごとく、天然のＤ型ヌクレオシド出 発物質を用いて、容易に合成される。第４図に関して、構造■およびしたけが、 このバンクボーンと認識部分との間にキラルな連鎖を有することがわかる。こ・ れらのサブユニットは、記述のように、ホモキラルな出発物質を用いることによ り、ホモキラルな形状で容易に合成される。第４図に示される他の非環状構造の すべてに対し、バンクボーンの窒素原子にこの１原子鎖が付加され、それゆえア キラルとなる。もちろん、このメチレンスペーサーもまたそれ自体アキラルであ る。

■０課１］しｌ１略 このサブユニットの活性化および／またはカップリングに用いられる化合物がか なり高い反応性を有するために、この認識部分の環外にあって環に結合した窒素 を保護することが。

一般に望ましく、またしばしば必要である。これら保護基の選択は、まず第１に 、これらサブユニットから組立てられるポリマー内で用いるサブユニット間結合 のタイプにより決定される。２番目には、保護されるべき窒素の相対的な反応性 により決定される。

塩基保護されたヌクレオシドは、また、以下で述べられるような多くのサブユニ ット合成反応において、有用な出発試薬である。実施例１の極くありふれた多数 のりボヌクレオチ、ドおよびデオキシリボヌクレオチドを塩基保護する方法は。

実施例２に例示されている。この実施例に詳述されている方法は、一般に、アミ ン保護基をもったヌクレオシドの形成に通用できる。

用いられるサブユニット間連鎖が核剤、特に水酸化アンモニウムに相対的に安定 であると、核酸化学に用いられる一般の塩基保護基が通している。このような核 感度のないサブユニ７）間連鎖には、カルバミン酸塩連鎖、アミド連鎖およびス ルホンアミド連鎖が含まれる。この認識部分に対し。

対応する核感度のある保護基には、ＣのＮ４に対するベンゾイル基、ＡのＮ６に 対するベンゾイル基またはｐ−ニトロベンゾイル基、ＧのＮ２に対するアセチル 基またはイソブチリル基。

および２，６−ジアミツプリン残基に対するＮ２．　Ｎ６−ビスイソブチリル基 がある。ポリマー集合体の完成後において、水酸化アンモニウムで処理すること により、これらの基の除去が達成される。

対照的に、用いられるサブユニット間連鎖が水酸化アンモニウムのような核剤に 感度があると、適当な保護基は９強力な非求核性塩基により、β脱離機構を経て 除去され得る保護基である。このような核感度のあるサブユニット間連鎖には、 炭酸塩連鎖、エステル連鎖、およびより狭い範囲では。

トリカルバミン酸塩連鎖が含まれる。この認識部分に対し。

β脱離を経て除去可能な適当な保護基には、ＣのＮ４およびＡのＮ６の両方に対 する２−（４−ニトロフェニル）エトキシカルボニル基または２−（フェニルス ルホニル）エトキシカルボニル基、およびＧのＮ２および２．６−ジアミツプリ ン残基のＮ２およびＮ６に対する９−フルオレニルメトキシカルボニル基が包含 される。ポリマー集合体の完成後におけるこれらの基の除去は、厳しい無水条件 下での強力な非求核塩基１．８−ジアザビシクロ（５，４，０）ウンデク−７− エン（ＤＢＵ）の処理により達成される。

このバンクボーン部分（一般には上記構造のＮｌ）の一時的な核保護に関して、 一般的なポリマー集合戦略では、温和な酸により容易に取り除かれる選択された バックボーン保護基が用いられる。保護基の選択に関する１つの主要な規準は。

これらの基が充分に安定ではあるが、除去に要する条件が成長ポリマーを損なう ほど安定ではないことにある。環状のバンクボーン部分から集められたポリマー の場合のおもな問題点は、保護されたプリン残基をこれらバックボーン部分の０ １に連結させるグリコシド結合の著しい酸感度にある。このバックボーン保護基 の選択に関する第２の基準は、この保護基が容易に導入されるところにある。上 記に基づいて、以下のバックボーン保護基がより好ましい２１級水酸基に対する ジ（ｐ−メトキシ）トリチル基：１級アミン基に対するｐ−メトキシトリチル基 ；および２級アミン基（モルホリノタイプのバンクボーン部分中におけるような ）に対するフェニルイソプロポキシカルボニル基。これら保護基は、ジクロルメ タン中で０．２Ｍのジクロル酢酸の処理により、容易に除去されデオキシリボヌ クレオシドサブユニット構造（第３図の構造Ａ）を有するサブユニットは、市販 の原料から得られるがまたは実施例Ｉに記述のように２文献の方法により調製さ れ得る。このサブユニットは、以下のリボシドおよびデオキシリボシドを含んで おり、第１図で得られる認識部分の構造数に従って同定される：アデノシンおよ びデオキシアデノシン（構造１）；　２．６−ジアミツプリンリボシドおよびデ オキシリボシド（構造２）；シトシンおよびデオキシシトシン（構造３）；４− メトキシ−２−ピリミジノンデオキシリボシド（構造４）；２−ヒドロキシ−５ −メチルピリミジンデオキシリボシド（構造５）；２−ヒドロキシピリミジンリ ポシド（構造６）；グアノシンおよびデオキシグアノシン（構造７）；イノシン およびデオキシイノシン（構造８）；チオグアノシンおよびデオキシチオグアノ シン（構造９）；ウラジンおよびデオキシウリジン（構造３０）；チミジンおよ び５−メチルウリジン（構造１１）；および５−へロウリジンおよび５−ハロデ オキシウリジン（構造１２）。

この５”−アミノ−２′、５”−ジデオキシリボヌクレオシド（第３図の構造Ｂ ）は、実施例３に詳述の方法に従って調製される。簡単に言えば、この選択され たデオキシリボヌクレオシド（必要に応じて塩基で保護された）は、トリフェニ ルホスフィン、四臭化炭素およびリチウムアジドとの反応に供され、対応する５ ゛−アジドヌクｌ／オシドが形成される。これは。

次いで、炭素触媒上のパラジウム存在下にて水素化により還元される。このヌク レオシドは実施例１のように得られ、そして実施例２のように塩基保護され得る 。この反応物ヌクレオシドの立体化学は５−アミノヌクレオシド類似物を形成す る際に保存される。

他の還元方法は、実施例３．２に記述のように、５゛−アジド−５−ブロモウリ ジンのアジド基を還元する際に用いられる。

ここで、触媒なしの水素化は、環の臭素原子の分離を妨げるために必要である。

この５“−アミングアノシン化合物を形成する際に、実施例３．２に詳述のよう に、まずこの５′水酸基のトシル化９次いでアジドでの置換により、このアジド は５′位に配置される。

この３”−アミノ−２’、　３’−ジデオキシリボヌクレオシド（第３図の構造 Ｃ）は、実施例４に詳述の方法に従って調製される。簡単に言えば、５′位の水 酸基にて保護されるチミ゛ジンは、３”位の水酸基にてトシル化され２次いで、 ２オキシ塩基置換基により分子内置換される。得られた環はアジドによる処理に よりすぐに開環され、正確な立体異性形状のアジド類似物が生じる。この類似物 は、このアジド化合物と１選択されたプリン塩基またはピリミジン塩基との反応 により２選択された塩基類似物に転化され得る。この後者は、必要に応じて、以 下に記述のように、続いて起こるサブユニットカップリング反応に対し塩基保護 されてもよい。このチミジンま゛たは他のアジド類似物は２次いで還元され、所 望の３°−アミンヌクレオシドが生成する。このチミジン出発物質の立体化学は ９合成において保存される。

第３図の構造りに示されるこのモルホリノタイプのサブユニ７）誘導体の合成は １種々の異なる認識部分に対し、実施例５で詳述されている。簡単に言えば１選 択されたヌクレオシド（必要に応じて塩基保護された）は２重ホウ酸アンモニウ ムのようなアンモニウム塩に溶解され２次いで、過ヨウ素酸ナトリウムとの反応 に供されて、過渡的な２′、３°−ジアルデヒドが形成される。これは２次いで 、アンモニウムイオン上で閉環され、２′位および４”位に水酸基を有するモル ホリノ環が形成される。この化合物は２次いで、この環の水酸基を除去するべく 、シアノ水酸化ホウ素ナトリウムで処理される。

この環の窒素は、好ましくは、続いて起こるサブユニットカップリングに対し、 ２−フェニルイソプロピルカルバミン酸塩として保護される。このヌクレオシド 出発物質の立体化学は保持される。

５′位に酢酸基を有するデオキシリボースサブユニット構造（第３図の構造Ｆ） は、実施例６に記述の一般的な合成スキームに従って調製され得る。このスキー ムは、構造Ｆで示される５′位が酢酸の化合物の合成を詳述している。ここで、 ３′位が水酸基で保護されている選択されたデオキシリボヌクレオシドは、５′ 位にアルデヒドが転化され、続いて、不飽和な酢酸誘導体を与えるぺ（，２位に 炭素のあるウィツテイヒ試薬で処理される。この側鎖オレフィンの還元により、 ５′位が酢酸である所望の化合物が得られる。この反応は、出発ヌクレオシド物 質の立体化学を保存している。

この類似の５′位がギ酸塩の化合物（第３図の構造Ｅ）は。

上記５゛ヌクレオシドアルデヒドを１個の炭素のウィツテイヒ試薬で処理し、得 られたエノールを加水分解して対応するホルムアルデヒド誘導体（これは所望の 酸に酸化される）を形成することにより、形成される。この反応は、出発ヌクレ オシド物質の立体化学を保存する。

Ｂ、サブユニットＡ　−ジ環′バックボーン第４図の構造Ｉで示される５原子の 鎖状アミノ酸サブユニットは、実施例７−９で概説されている一般的な方法に従 って調製される。簡単に言えば、（Ｓ）−５−カルボキシピロリドンが、公知方 法により、立体化学的に純粋な対応する（Ｓ）　−５−トシルメチル−２−ピロ リドンに転化された。次いで。

これは２選択されたプリンまたはピリミジンとの反応とに供され、対応する（Ｓ ）−５−メチルプリン（またはメチルピリミジン）ピロリドンが形成される。こ の置換反応は最初の立体特異性を保持し、その結果、形成されるサブユニットは 。

この認識部分の結合部位において、このパンクボーン炭素に対し、同一異性であ る。

サブユニット合成に用いられるプリンは、１位および３位の環窒素の反応性を減 するべ（、すなわち、環窒素にピロリドンがカンブリングすることを最小にする べ（、好ましくは６位に電子吸引性基を含んでいる。このピロリドンが誘渾され たプリンまたはピリミジンは１次いで、以下に記述の開環ステップ前に、アミン 誘導体に転化され、必要に応じて塩基保護されてもよい。実施例７．１および７ ．２はシトシンピロリドンおよびその塩基保護された誘導体の形成方法を詳述し ている。実施例７．３−７．５で形成されるアデノシンピロリドンは、出発物質 として６−クロロプリンを用いている。この対応するピロリドンは、記述のよう に、アジド形成を経て、アデノシン誘導体に転化される。このアデノシンは、実 施例７．６のように開環前に塩基保護される。実施例７．７−７．９に記述のよ うに、２−アミノ−６−クロロプリンから出発して、塩基保護されたグアニンピ ロリドンを生ずるべく、類似の方法が用いられる。２，６−ジアミツプリンピロ リドン、イノシンピロリドンおよび２−ヒドロキシピリミジンピロリドンの合成 にもまた。実施例７に詳述のように、類似の方法が用いられる。

このピロリドンは１次いで、ｔ−ＢＯＣで保護されたアミンを用いてピロリドン 環を開裂し、アミノ酸を形成する一連の反応を経て処理される。実施例８．１− ８：４は、多数の選択された認識部分を有するこのようなｔ−ＢＯＣアミノ酸の 合成を記述している。最終ステップ（実施例５）では、このｔ　−ＢＯＣ保護基 は、第４図の構造Ｉで示される対応するアミノ酸を形成するべく、除去されても よい。このアミノ酸は、以下の反応に従って、サブユニットカップリングに対し 直接用いられ得る。他方、このｔ−ＢＯＣで保護された化合物は、サブユニット カップリング反応で使用するために、その酸基において活性化され得る。

第４図の構造Ｊで示されるサブユニット形成方法は、それぞれシトシン類似物サ ブユニットおよびウリジン類似物サブユニットを形成するために、実施例１０． １と１０．２に概説される。

簡単に言うと、ピリミジンタイプのサブユニットを形成する際には、ピリミジン またはニコチン酸塩のような６員環の複素環が、バックボーンへの付加がうまく できる炭素環部位で。

反応性のあるメチレンを含むように修飾される。実施例１０．１に詳説されるよ うに、このシトシン類似物は、５−アミノ−５−ブロモピリミジンを反応させて 対応する５−位のカルボキシアルデ゛ヒトを形成することにより形成される。実 施例１２にあるように、このウリジン類似物は、６−ヒドロキシニコチン酸エス テルを対応するベンジリックアルコールに転化することにより、形成される。こ の化合物は、二酸化マンガン存在下の反応により、アルデヒドに転化される。

このアルデヒド化合物は９次いで、４−アミノ酪酸のような所望のアミノ酸との 反応に供される。安定なアミンサブユニット形成のために還元される不安定なイ ミンを生成するアミン基で反応がなされる。この２級アミンは、実施例１０．１ に記述のように、ｔ−ＢＯＣ基により、酸基の活性化を含むサブユニットカップ リングに対して保護され得る。バンクボーン窒素においてメチレンスペーサーを 通じて、バックボーンに塩基が付加され、このサブユニットがキラル中心を持た ず。

それゆえ立体規則的でないようにされる。

第４図のＫに示されるサブユニット構造を形成するために。

上記化合物のＣ−炭素バックボーン類似物が、３−アミノプロピオン酸を用いて 調製され、この化合物はさらに、酸化窒素で処理され、対応するＮ−ニトロソ化 合物が形成される。

この化合物は、鉄塩存在下でＨ２１Ｐｄにより、順に還元されて。

ヒドラジノ酸サブユニットが得られる。

（以下余白） ■、バークボーンカーブ１ング　・を 本発明のポリマー分子の形成に用いられるカップリング反応は、ひとつの選択さ れたサブユニットまたはサブユニット配列を、もうひとつの選択されたサブユニ ットまたはサブユニット配列に結合させる段階的反応である。この議論をするた め、このカンプリング反応は、一般に９選択された認識部分Ｒ３を有する単一の サブユニットＢ−Ｒ，が、同一または相異なる選択された認識部分Ｒ２を有する もう１つの単一のサブユニットＢ−Ｒ２とカンプリングして以下の形状の２量体 を形成することに関して記述されるだろう。

ここでＲ１およびＲ２は示された特異的配列を有する。

Ａ：並ブ三上１ユ９プＪ１］」ジシ」二二ｊ上士ｙ９も二Ｚ立止区！ Ｎｒ−−−−Ｎｚバックボーン立体配置を有するサブユニットのカップリングの 一般的な方法は、第５Ａ図および第５Ｂ図に例示される。上記第１節から想起さ れるように、Ｎ１およびＮ２は、水酸基やアミン基のような核性のバックボーン 基である。この基は請求電子基Ｅによって活性化され得、活性化されたＮ、−Ｅ バンクボーン基またはＮ、−Ｅバックボーン基が形成される。

これらの基は９次いで、第２のＮ、−−−−Ｎ２タイプのパンクボーン部分と反 応してＮＩ−−−−Ｎｚ　Ｅ　ＮＩ−−−−Ｎｚバックボーン結合された２量体 を形成する。このタイプのサブユニットバックボーンは、上記に特に記述されて おり、第３図の構造Ａ−Ｄの環状バックボーンである。構造ＡおよびＢでは、こ の活性化された請求核基が３′水酸基であり、構造Ｃでは５°水酸基。

そして、構造りでは構造Ｃの５量位の水酸基に相当する６量位の水酸基である。

第５Ａ図に例示されるより好ましいカップリング方法では。

選択された認識部分Ｒ，を有するサブユニットは請求電子基Ｅによって活性化さ れる。この認識部分の星印は、必要な塩基保護を示す。この図かられかるように 、この選択されたサブユニットは、請求核基で保護されており、　請求核基だけ が活性化される。および中）この活性化されたサブユニットは。

それ自体で重合し得ないことを保証している。第３図の構造Ａ、ＣおよびＤでは 、このパックポーン保護基が５”水酸基であり、この保護基は、好ましくはジメ トキシトリチル（ＤＭＴＯ）のような酸不安定基である。

（以下余白） ここでＸは、酸素または硫黄、そしてＣは請求核基（例えば。

水酸基の酸素かアミンの窒素）と反応しＹと置換して活性化されたサブユニット を形成し得る活性な電子基である。

活性化剤（例えば、ビス−ｐ−ニトロフェニルカーボネート）は、カルボニルで 活性化されたサブユニット（Ｘ　＝　Ｏ）を与え、カーボネートやカルバメート サブユニット連鎖を形成する際に使用される。同様に、チオカルボニル−ジー（ １，２゜４−トリアゾール）（Ｘ＝Ｓ）のような活性化剤は、チオカルバメート 連鎖を形成する際に使用される。

カルボニルで活性化されたサブユニットを含むサブユニット活性化反応は、第４ 図のＡで示される５゛位が保護された２゛−デオキシヌクレオシドに対し、実施 例１１に詳述されている；実施例１２では、第４図のＢで示される５゛位が保護 されたアミノヌクレオシド；実施例１３では、第４図のＤに示されるＮが保護さ れたモルホリノタイプのサブユニットについて詳述されている。これらの構造中 の水酸基の活性化に用いられる一般的な反応条件は、一般に通用可能である；チ オカルボニル活性化サブユニットを含むサブユニット活性化反応は、Ｂに示され る５゛−アミノヌクレオシドに関し実施例１４で、そして第３図のＤに示される モルホリノタイプのサブユニットは実施例１５に示した。

この活性化反応に続いて、シリカゲルクロマトグラフィーのような通常の方法に より、活性化複合体が精製される。次いで、これは２番目のサブユニットとの反 応に供される。このサブユニットの選択された認識部分Ｒ２は、完成したポリマ ー中の次の配列中の認識部分を形成する。このカップリング反応は、好ましくは 、活性基がバンクボーンのＮ２アミン基とは反応し得るがｒ　Ｎ＋水酸基とは反 応し得ないような、温和な条件下で実行される。それゆえ、この方法は、第４図 の構造Ｂ−Ｄに示されるタイプのサブユニットのカップリングには適しているが 、構造Ａのサブユニットには適さない。このカップリング方法の有利な点は、第 ２のサブユニット−これは、アミンＮ１の核基および水酸基Ｎ２の核基を含む− が。

最初に活性化されたサブユニットと、〜このＮ、アミンを介してのみカンプリン グし、それゆえＮ２バックボーン基を保護する必要がないことにある。従って、 得られる２量体サブユニットは１図に示されるように、ＮＺ−Ｅ−Ｎｌ結合を通 じてカンプリングされる。

（ａ）この第２のサブユニットの遊離の請求核基を活性化し。

活性化剤からこの活性化された種を分離し、そして活性化された化合物を、バン クボーンが保護されていない次の配列中のサブユニットとカンプリングさせると いう上記のステップをくり返すことにより、このオリゴマーが伸長され得る。こ の方法は、固相ブロックの集合に適した溶液法（下記で記述されている）によっ て、短いオリゴマーブロックを形成するのに特に使用される。

固相の連続的なサブユニット添加によってポリマーを形成するために、第５Ｂ図 に概説される第２のカップリング法が。

より好ましい。この第２の方法は、存在するサブユニットまたはポリマー鎖に、 活性化された過剰のサブユニットを付加することにより、ポリマーの成長が起こ る点で、最初の方法とは異なっている。むしろ最初の方法では、活性化されてい ないサブユニットを活性化された鎖に付加することにより。

ポリマーの成長が生じる。第５Ｂ図には、認識部分がＲ，（第６Ｂ図の２列め） のサブユニットにより、存在するサブユニットまたはサブユニット鎖が示される 。このサブユニットは、遊離の請求核基および請求ｉ基を有する。この請求核基 は、固体担体との比較的酸に安定な結合により、または固体担体と結合するサブ ユニット鎖に連結されることにより、保護されている。このようにＮ２が保護さ れた環状バンクボーンサブユニットを形成する方法は、一般的に実施例１２〜１ ５に述べられている。この最初のサブユニット（成長するポリマー中で最も最近 付加されたサブユニット）は、ポリマー中の次の配列内のサブユニットになる活 性化されたサブユニットとの反応にすぐに供される。この活性化されたサブユニ ットは、　ｌｌｈバフクボーン部位で活性化され、そして比較的酸に不安定な保 護基によってＮ１部位が保護されている。このサブユニットは、第６図に関連し て上記で述べた方法により調製される。

第５Ｂ図でわかるように、このカンプリング反応により、Ｎ２−活性化した第２ のサブユニットがｓ　ＮＳ−保護された第１のサブユニットに付加され、　Ｎ２ −Ｅ−Ｎ、結合を介して両者がカンプリングされ、そして遊離の請求核部位の両 方が保護された化合物が形成される。この化合物は２例えば酸と反応させること によりすぐに処理され、最後に付加されたサブユニット上の酸に不安定なＮ、保 護基が脱保護される。この手順は、所望の配列ポリマーを構築するべく繰り返さ れる。

上記のことから、このＮ２−活性化されたサブユニット（これは、最後の配列中 のサブユニットを形成する）は、そのＮｌｌバックボーン位で保護され、それに よりＮ２部位での選択的な活性化を可能にするとともに活性化された化合物の自 己重合を防止するに違いない。また、このＮ１−脱保護されたサブユニットは、 活性化サブユニットとカンプリングし得る。このサブユニットは＋　ＮＺ−活性 化されたサブユニットとその島部分との選択的な反応を可能にするべり、Ｎ２部 位が保護されるだろう。それゆえ、この反応するサブユニットは、１つのバック ボーン部位がともに保護されているので、この方法は。

ヌクレオシド（第４図の構造Ａ）のカンプリングだけでなく。

アミンと水酸基バックボーン求核基の両方を含んだ環状バックボーンを存するサ ブユニット（例えば、この図の構造Ｂ−Ｄ）のカンプリングにも適している。構 造Ａのサブユニットを、カーボネート結合を介してカンプリングするのに用いら れる反応方法は、実施例１２に詳述される。簡単に言うと、５゛位が保護された バックボーン部分を含むサブユニ７）が、３”位の水酸基にて活性化され、３′ 位の水酸基を保護した他のサブユニット（または成長鎖）との反応に供される。

このカンプリング反応は、Ｎ−メチルイミダゾールまたはＮ、Ｎ−ジメチルアミ ノピリジンのような、カーボネート結合を形成するのに必要な触媒の存在下で実 行される。構造Ｂ−Ｄの環状バンクボーンを含むサブユニットのカップリングに は、サブユニット間のカーバメート結合またはチオカーバメート結合が形成され る場合において、最初の方法に関して上に記述のようなより温和な、触媒のない カンプリング条件が適している。

この第２のカンプリング方法の、固相サブユニット添加によるポリマーの形成に 対する有利な点は、実質的に過剰のモル数の活性化されたサブユニットが、各ポ リマーの添加段階において、成長している担体結合ポリマーに加えられ、その結 果、非常に高い割合で担体結合ポリマーにカンプリングしているサブユニットが 得られる点にある。このことは、大部分の担体結合ポリマーが、所望のサブユニ ットの完全な配列を含むことを保証している。第１の方法と比較すると、この成 長しているポリマーが、最後に添加されたサブユニットで活性化される場合には 、サブユニット添加の効率は、活性化段階の効率によって制限される。

第６図は、第４図でＡ−ＡからＤ−Ｄまで示される環状バフクボーンサブユニッ トのカップリングにより形成される２量体構造を示す。この図の構造Ａ中のヌク レオシドサブユニットは、カーボネート（Ｙ＝Ｏ）により結合される。残った３ つの構造Ｂ−Ｄでは、このサブユニットは、カーバメート（Ｙ＝Ｏ）結合または チオカーバメート（Ｙ＝Ｓ）結合により連結される。この図かられかるように、 すべてのサブユニット連鎖は、荷電しておらずしかもアキラルである。すなわち キラル中心を含んでいない。添付に際し、この連鎖は、水系媒質中で安定である 。このことは、中性の水系溶液中において、長期間にわたって加水分解に耐性が あるというポリマーの性能から判断される。

本発明の他の重要な特徴によれば、この構造は、ポリマーを形成するべく結合さ れるとき、相補的なポリヌクレオチドとともに正しいワトソン／クリック塩基対 を示す。

最後に、もう１つの本発明の重要な特徴によれば、このサブユニットから形成さ れるポリマーは、立体規則性である。

これは、（ａ）天然のヌクレオシドまたはヌクレオシド誘導体または天然の立体 異性化立体配置を有する合成ヌクレオシドをサブユニットとして用いること、お よび（ｂ）アキラルなサブユニット間連鎖によりこのサブユニットを連結するこ と、により達成される。カンプリング方法の例は、実施例１１〜１５に詳Ｎ、− −−−Ｅバックボーン立体配置を有するサブユニットの一般的なカンプリング方 法は、第７Ａ図、第７Ｂ図および第７Ｃ図に例示される。上記第１節から想起さ れるようにｒ　Ｎｌは水酸基またはアミン基のような核性バンクボーン基であり 、Ｅは。

カルボキシル基またはスルホニル基のような電子基である。

このＮｌは、活性化されると、第２のＮ、−−−−Ｅタイプのバックボーンと反 応して、Ｎ１−一〜−Ｅ　−Ｎ、−−−−Ｅバックボーン結合２量体を形成し得 る。このタイプのサブユニットバックボーン。

特に上記に述べられるバックボーンは、第３図の環状バックポーン構造Ｅ−Ｈ， および第４図の非環状バンクボーン構造■〜Ｎである。この環状構造ＥおよびＦ において、この請求核基は、３゛位の水酸基であり、構造ＧおよびＨでは９モル ホリノ環上の３°位の窒素に付加されたアミンである。すべての環状構造におい て、このＥ基は、リボース環の５”位がまたはモルホリノ環の６゛位に付加した カルボキシル基または対応するスルホニル基である。第４図に示されるすべての 構造では。

このＮｌ基およびＥ基は、それぞれバンクボーンアミンまたはヒドラジンおよび バックボーン部分末端のカルボキシル基またはスルホン酸基である。

この第１のカップリング方法は、第７Ａ図に例示されており。

第５Ａ図に関連して上記に述べた方法と類似している。ここでは、第１ＯＮ、− 保護されたサブユニットが活性化され２次いで、バックボーン−非保護サブユニ ットと直接カップリングされる。このサブユニットは、成長しているポリマー中 の次の配列内のサブユニットを形成する。このサブユニットＮ、のＰ１保護基は 、好ましくは、固体担体に結合した開裂可能なリンカ−か、ｔ−ブトキシカルボ ニル基のような酸に不安定な保護基である。環状パックボーン構造のＮ、−保護 の方法は。

環状構造Ａ−Ｄに対し上記に述べた手順に類似している。同様の方法が、非環状 バンクボーン構造中のアミンの窒素の保護に効果的である。他方、もしこのポリ マーが固相の担体上で構成され得るなら、下記に述べるように、このバンクボー ンのＮ、部位は、成長ポリマーへのサブユニットの添加に伴うＮ１部の固体担体 への結合により保護され得る。この成長ポリマーは、最後に添加されるサブユニ ットの活性化された電子基Ｅにより生じる。

この活性化反応は、活性化された部分または鎖の末端部分が、　Ｎｌ−−−−Ｅ 　Ｘを形成するように設計される。ここで、Ｘは第６図に関連して上記に記述゛ されている。この活性化されたサブユニットは、請求核基に対して、以前に述べ た方法で活性化されたサブユニットと、はとんど同様の反応性を有する。すなわ ち、この活性化は、　Ｎ、−−−−Ｎ２タイプのバックボーンとほとんど同様の 活性化カップリング基を生成するべく設計されている。しかし、その場合、この 反応性のカルボニル基またはスルホニル基が、第６図に示される方法のように、 活性化試薬のカルボニル基またはスルホニル基よりむしろバックボーン自身によ り供給される。この活性化は。

バンクボーンの電子基がカルボニル基の場合−ｐ　＝ｌ−。

フェノールの存在下で、　Ｎ、−−−−Ｅタイプのサブユニットをカルボジイミ ドと反応させることにより、容易に達成され得る。

または、このバックボーンがスルホニルの場合には、イミダ−ゾール、　１．２ ．４−トリアゾールまたはテトラゾールの存在下でこのサブユニットをカルボジ イミドと反応させることにより達成され得る。請求電子基を含むサブユニット活 性化反応は、実施例１６および１７に詳述される。このＮ−アミノーモルフィリ ノ基および線状鎖バンクボーンのカルボニル基を活性化するのに用いられる一般 的な反応条件は、一般に、第３図および第４図に示される他のＮ、−−−−Ｅタ イプのバンクボーン構造にも適用できる。

この活性化反応につづいて、この活性化複合体は、シリカクロマトグラフィーの ような通常の方法により精製される。

または担体結合され活性化された鎖の場合には、単に洗浄される。次いで９選択 された認識部分Ｒ２が完全なポリマー中の配列内の次の認識部分を形成するよう な第２のサブユニ７）との反応に供される。このカップリング反応によって１図 に示されるような２量体が得られる。この２量体のサブユニットは、それゆえ、 　Ｅ−Ｎ、結合を介してカンプリングされている。

上記のように１両方のサブユニットは、活性化反応およびカンプリング反応の間 に、適切に塩基保護されなければならない。

このポリマーは、上記の段階をくり返して伸長し得る。この段階は、（ａ）第２ のサブユニット中の遊離の請求電子基を活性化すること、　（ｂ）この活性化剤 から活性化された種を分離すること、および（Ｃ）この活性化された化合物と１ 次の配列中のサブユニット（これは、バックボーンが保護されていない）とをカ ップリングさせることである。

この第２のカンプリング方法は、第７Ｂ図に例示される。この方法は、第５Ｂ図 に関連して上記に記述の方法と、直接的に類似している。ここでは、Ｅ−保護さ れたバックボーンを有する最初のサブユニットが、活性化されたＥ基および保護 された請求核基を有する第２のサブユニットとの反応に供され。

Ｅ−Ｎ、結合により連結されかつ両方の遊離したバンクボーン末端基が保護され た２量体が形成される。このポリマーが。

固相合成によって形成される場合には、このＰ２保護“基”は。

固体担体と酸安定性の連鎖を形成する。このＮ、−保護されたサブユニットは、 上記のように調製されそして活性化される。

カンプリングの条件は、一般辷、上記の環状サブユニットカップリング反応で用 いられる条件に従う。

第７Ｃ図に示される第３のカンプリング方法では、このｎ、　−保護されかつＥ −非保護のサブユニット（またはポリマーユニット）が、指示されるごとく、カ ルボジイミドのような適当なＥ−活性化試薬の存在下で、ともに反応に供される 。

第８図は、環状および非環状のバックボーンサブユニット（これらは、それぞれ 第３図および第４図のＥ−に、およびＥ−Ｅからに−にで示される）をカンブリ ングすることにより生成する２量体構造を示す。第３図の構造Ｆ−Ｆのヌクレオ シドサブユニットは、エステル結合で連結されている。環状バックボーン構造の ままで、このサブユニットＧ−Ｇは。

連結されている。Ｉ−１，Ｊ−Ｊおよびに−Ｋに示される非環状バックボーンサ ブユニットの全ては、アミド結合（Ｅ＝カルボニル）またはスルホンアミド結合 （Ｅ＝スルホニル）を介して連結されている。上記に述べられた環状バンクボー ンサブユニット構造におけるように、すべてのサブユニット連鎖は、エステル結 合、ヒドラジド結合およびアミド結合の溶液中での公知の安定性から推定される ように、水系媒質中にてかなり安定である。

本発明の他の重要な特徴によれば、この構造は、ポリマーを形成するべく連結さ れるとき、相補的ポリヌクレオチドと。

ワトソン／クリック塩基対を示す。

最後に、上に述べたＮ１−−−−Ｎ２バフクボーンサブユニツトとともに示され ているすべてのＮ、−−−−Ｅパンクポーン構造は立体規則性である。これは、 （ａ）認識部分のバンクボーン部分への付加のホモモラル（第３図のＥ−Ｈおよ び第４図のＩとＬ）な性質またはアキラル（第４図のＪ、に、ＭおよびＮ）な性 質、および（ｂ）アキラルなサブユニット連鎖による。

Ｃ，サブユニットのカップリング；六　に荷６され；１されていないアキラルな 凍＄゛″ いくらかの応用において、ひとつかあるいはそれ以上の荷電されたアキラルなサ ブユニット連鎖をポリマー分子中に導入することが望ましい。以下でさらに記述 されるように、このバックボーンの電荷は、多くの溶液への適用に際しポリマー の硲房反を促進し、あるいはポリマーの標的結合正数を調整するために用いられ 得る。荷電されたアキラルなバンクボーン連鎖１例えば、２番目かあるいは３番 目のサブユニット間に規則的に配置したポリマーは、以下に述べるような新規な 診察システムに通している。現在議論している目的のために、アキラルな非荷電 連鎖によって内部に連結される２つかそれ以上のサブユニットから構成されるポ リマーユニットは。

荷電されたアキラルな連鎖により連結されうる。これらの非荷電ユニットは、上 記のＡ節およびＢ節に記述の方法の１つにより形成される。

連結されうる２量体サブユニットは次のように選択される。

ひとつの２量体の遊離したＮ２基が、もうひとつの２量体の遊離のＮ、基と、適 当に荷電されたアキラルな連鎖を介して、カンプリングされ得る。この望ましい 連鎖は、ひとつのサブユニットの遊離Ｎ２基と、もうひとつのサブユニットの遊 離のＮ。

基がともに水酸基であることを必要とするホスホジエステル結合である。第３図 を見ればわかるように、この条件では。

構造Ａおよび構造Ｂのいずれかのサブユニットから形成される２量体（その両方 は遊離のＮ２水酸基を存する）が、構造Ａ。

Ｃ９またはＤのサブユニットから形成された２量体（これらは、全て遊離のＮ、 水酸基を有する）と結合するならば適当である。

典型的なカンプリング方法では、Ｎ８位を保護した２量体Ａは、第９図に示され るように、ホスホエステル結合を介してＮ２水酸基と連結された反応性ホスホエ ステルカップリング種に誘導される一連の反応の間保たれる。より好ましいカン プリング方法は、米国特許出願“ポリヌクレオチド測定試薬と方法”連続番号７ １２．３９６（１９８５年３月１５日出願）に詳述されている。この方法は、塩 基保護されたヌクレオシドまたはヌクレオシド類似物サブユニット間にホスホジ エステル結合を形成するための文献方法に従う。この方法は＋ＮＩ−保護された 反応性のＮ２　（ｐ−クロロフェニル−２−シアノエチル）−ホスフェートを形 成することを包含する。この活性化された２量体は２次いで、第２の２量体との 反応に供され、非荷電で立体異性型の連鎖および荷電されたアキラルなサブユニ ット間連鎖により交互に連結される４量体を形成する。

このホスホジエステル連結方法は、アキラルではあるが荷電されていない連鎖を 含むポリマーのカンプリング反応に関し、上記に概説の一般手順に従って、溶液 タイプのポリマー合成方法または担体タイプのポリマー合成方法のいずれかが組 み合わされてもよい。

診断のためには、荷電された結合と非荷電のアキラルな結合とを交互に有するポ リマーが適当であるものの１診断用途および特に治療用途では、水系媒質中で充 分なポリマー溶解度を得るために必要な連鎖と同程度にほとんど荷電されていな い連鎖を導入することが、一般により好ましい。

この溶解性の促進は、一般に、約２０個のサブユニットのポリマーあたり１〜３ 個の荷電されたバックボーン連鎖、好ましくは、４個のサブユニットあたり約１ 個を越えない荷電された連鎖を用いて達成される。ここで限定されるように、ア キラルなバンクポーン連鎖は、２量体ユニットあたり約１個以下の荷電されたバ ンクポーン連鎖を含み、好ましくは、４量体ユニットあたり約１個かまたは２〜 ３個のバックボーン連鎖を含むなら、実質的に非荷電と考えられる。

本発明の非荷電のポリマーまたは実質的に非荷電のポリマーの重要な応用には、 ヌクレオチド分析物の存在および／またはその量の決定に用いる新規な固体担体 診断システムがある。この検定システムは、固体担体に連結されている多数のポ リヌクレオチド結合ポリマー（これは本発明に従って構成される）からなる固体 担体試薬を含む。このポリマーは、下記に詳述の標的戦略に従い９選択された融 解温度（Ｔｍ）で標的ポリヌクレオチド分析物に特異的に結合させるために構成 されている。このシステムは、また、ポリカチオン性レポーター分子を含んでい る。このレポーター分子は、完全に荷電された分析物バックボーンには結合する が、しかし、非荷電かあるいはごく一部しか荷電されていないポリマーバックボ ーンには結合しないように設計されている。各レポーター分子は、１つまたはそ れ以上のレポーター基を有し、各ポリヌクレオチドは、典型的には。

数千またはそれ以上のレポーター分子の結合を調節し得る。

それゆえ、このシステムは、結合された分析物分子あたりのレポーターシグナル によって、数オーダーまたは数マグニチュードの増幅要因を有する。この検定シ ステムおよびその実施方法は、共有の米国特許出願“ポリヌクレオチド検定試薬 およびその方法”、連続番号＆　７１２，３９６．　（１９８５年３月１５日出 願）、にさらに完全に記述されている。

アキラルで主として非荷電のサブユニット間連鎖を有する配列特異的なポリヌク レオチド結合ポリマーを診断上の応用に用いる特定の長所は、２つの要因から生 じる。１つには、これらの標的結合が相対的に塩に感度がなく、それゆえ、この ポリマー／標的アニーリング段階は、低塩条件下で実行され得る。ここで、この 標的と、溶液中の相補的な核酸配列との間には競争的”なアニーリングはない。

２番目には、このポリマーの還元された荷電または非荷電のバンクボーンにより 、上記レポーター分子（これは、標的分析物のポリアニオンバックボーンに対し 、高密度で設計されている）の使用が可能となる。

（以下余白） 診断試薬としての使用に対し２本発明に用いられるポリヌクレオチド結合ボリセ ーを調製する際に適用される設計上の考察は、標的分析物の性質およびこの分析 物が検定され得る反応条件に支配される。

最初の考察としては９選択された非単独重合性の標的塩基配列（これに対し、ポ リマーが指示されている）がある。この標的配列は、好ましくは、検定される分 析物に対して特有である。すなわち、この配列は、既知の多数の配列塩基を含む 検定混合物中にて、ある限定されたわずかの確率（例えば１％またはそれ以下） でのみ生じるべく算出される。既知のｎ−塩基標的配列の出現確率は、およそ１ ／４・である。すなわち、既知のｎ−塩基標的配列は、４量個の塩基を含むポリ マー中において、約１回出現すると推測されるだろう。それゆえ。

既知のｎ−塩基配列が、Ｎ個の特有の配列塩基全体を含むポリヌクレオチドで生 じる確率Ｐは、およそＰ　＝　Ｎ／４”である。

例示のために、９−塩基標的配列が２０キロベースのヌクレオチド内に見出され る確率Ｐは、約２０　ｘ　１０”／　２　ｘ　１０’すなわち０．０８であり、 １６−塩基標的配列が存在する確率は約２０Ｘ１０”／４．３　Ｘ　１０９すな わち０．０００００４７である。これらの計算から。

９〜１６個の一定の塩基標的配列に対し特異的な９〜１６個の認識部分を有する ポリマーは、ウィルス性ゲノムだけを含む検定混合物（この最大の複合体は、約 ４００にの特有の配列塩基に対応している）中の標的配列に対し、高い特異性を 有するべきことが見出されている。

類似のタイプの計算では、１２〜１６個のサブユニットポリマーが、ウィルス性 およびバクテリア性のゲノム物質（最大のゲノムサイズは約５０００キロベース ）だけを含む検定混合物中にて、ウィルス性またはバクテリア性の標的配列に対 し充分な特異性を提供し得ることが示されている。また、１６〜２２個のサブユ ニットポリマーは、動物性のゲノミックＤＮＡ物質（ゲノムサイズは、特有の配 列ＤＮＡの約５０億塩基対である）を含むポリヌクレオチド混合物中にて、標的 配列に対し充分な特異性を提供し得ることも示されている。

このポリマー／分析物の結合親和性、および特にこのポリマーが標的配列とうま く結合する温度（融解温度すなわちＴ、）は、（ａ）ポリマーの長さ、（ｂ）認 識部分とそれに対応する分析物の標的配列の配列内塩基との間に形成されうる水 素結合の数。

（Ｃ）パンクボーンの荷電密度、に゛よって選択的に変化させ得る。

モデルホモポリマー二本鎖における多くの研究から、オリゴヌクレオチド二本鎖 の融解温度は、１０〜２０ｂｐの範囲で、この相補的な塩基が水素結合を２つ形 成し得る場合には、添加される塩基対あたり、およそ３℃、この塩基が水素結合 を３つ形成し得る場合には、約６℃上昇する事が知られている。それゆえ、最初 にこのポリマーとの高い結合特異性を保証するべく選択された標的配列の長さは ２選択された検定条件での相補的な塩基ポリマーとの所望の融解温度を得るため に伸長されてもよい。また、上記に例示のように、このポリマーをなら、この標 的配列は、比較的高いポリマー／分析物の融解温度を達成するために、グアニン 塩基にシトシン塩基を加えた割合を高くように選択されてもよい。または、この 標的配列は、比較的低い融解温度を達成するために、アデニン塩基にチミン塩基 を加えた割合を高くするよう選択されてもよい。

このポリマーのバックボーンの荷電密度は、このポリヌクレオチド分析物の荷電 密度より実質的に低くなければならない。それは、レポーターのポリマーへの結 合がおこらない条件下で、ポリカチオン性レポーター分子を分析物に優先的に結 合させるためである。この必要条件は、ポリマーバックボーンの隣接する負電荷 の間隔が９分析物の隣接するホスホジエステル結合の負電荷の間隔の少なくとも ２倍あれば満たされる。このバックボーンの荷電密度もまた。ポリマー／分析物 の融解温度に重要な影響を与える。特に、塩濃度が低い条件では９分析物とポリ マーバックボーンとの電荷間の反発も。

２つがアニールできる温度を低下させるように作用し得る。

それゆえ、一般に、電荷のより少ないバンクボーンを有するポリマーは、（１） 分析物／ポリマーの融解温度がより高くなること、および（２）この融解温度の 塩濃度への依存がより低くなること、を示すと期待されるだろう。このような考 察に基づいて、非荷電のポリマー（例えば、すべてカルバミン酸塩で連結されて いるかまたはすべてアミドで連結されているポリマー）は９診断方法における分 析物／ポリマーアニーリング反応を、一部荷電されたポリマーにより広範囲の塩 濃度で実行可能にさせるだろう。ここで、この連鎖のい（つかは、アキラルでは あるが荷電されたホスホジエステル連鎖を構成する。

Ｂ０拍湧」コ哩龜里 な与　のための八 １、＊ｊｕＪＢし」（住 理想的な治療には２発病状態に特有の標的化構造は効果的に不活性化するが、患 者の正常な構造には有害な影響を及ぼさない治療がある。それゆえ、配列特異的 な遺伝子不活性化試薬は、標的化された遺伝子配列の不活性化にのみ効果がある べきである。この遺伝子配列は２発病状態に特有の標的配列を高確率で確保する ための充分な量の配列情報を含んでいる。例えば、標的配列の３つまたは４つの 連続的な塩基にのみ結合して標的の不活性化を生じ得る試薬ならば、正常な細胞 機能に要する多くのｍＲＮＡも常に攻撃するだろう。対照的には、標的の不活性 化を生じるために、３０またはそれ以上の塩基と結合する必要がある試薬では、 正常な細胞機能を含む非標的メンセンジャーを攻撃する確率も、非常に小さくな るだろう。

所望量の配列情報の正しい評価は、以下のように算出され得る。この配列情報は 、病気に特有のｍＲＮＡに対し遺伝子不活性化試薬が標的化するとき、この試薬 が認識するべき情報である。このヒトゲノムは、およそ５０億塩基対の特有な配 列ＤＮＡを含んでいる。しかしながら、この物質はすべて本質的に二本鎖状態で 存在し、そこで、一本領を指向するポリヌクレオチド結合試薬への結合にはあま り利用できない。それゆえ。

ポリマーの結合は、ゲノムＤＮＡのＲＮＡ転写に大きく制限される。このゲノム ＤＮＡのうち、１％のオーダーのいくらかは。

ある与えられた細胞タイプで転写される。さらに、患者の中のすべての細胞タイ プが考慮されるなら、完全なゲノムの４％以上の成分が、大人のヒト（すなわち 不定胚形成後）中で転写されることは起こりえない。それゆえ、大人のヒト中の すべてのＲＮＡ配列の配列の複雑性により、約２億を越えない塩基、およびたぶ んそれよりずっと少ない塩基が構成されるだろう。

特有の配列の遺伝性物質の２億の塩基の細胞プール中において、標的配列を認識 しなりことを予期するための遺伝子不活性試薬に対し、少なくともｎ個の塩基が 標的中で認識されるべきである。ここで、ｎは２Ｘ１０”＝４’として算出され 。

これは、最小の標的認識の必要条件としては、１４個の塩基を与える。このこと から、標的中において１４個を越える塩基を認識する遺伝子不活性化試薬は、正 常なＲＮＡの細胞プール内におそらく標的を有しないことが示唆される。明らか に、標的配列中で認識される塩基の総数はこの値より増えるので。

この試薬が固有の細胞ＲＮＡ配列を認識しない確率も増加する。

この標的中で認識される塩基の数が直線的に増加するとき。

この“安全要因”が指数関数的に増すことは、注目すべきである。例えば、以下 には、標的配列中で認識される塩基の数。

および特有配列の一本鎖遺伝子物質の２億の塩基プール中において、予期された 対応する標的数が表にされている：１８　．００２９ ２０．０００１８ 上記から、１つには以下のことが結論づけられ得る。診断上の応用に用いられる 予定の配列特異的な遺伝子不活性化試薬に対し、この試薬は、標的配列中におい て、少なくとも１４゜好ましくは１６〜２０の塩基を認識することが、おそらく 安全な考察として取り上げられる。

２、　ハの１′　ヒ　（ＭＩＬ　）の　今配列特異的な遺伝子不活性化試薬によ り実際に“認識され・る゛配列情報の量に関して、この点に有用な概念は、最小 不活性化長（ＭＩＬ　）の概念である。この概念は、インビボ中で遺伝子の不活 性化を達成するために試薬が結合すべき標的配列の連続的な塩基の最小数として 定義される。この試薬が塩基のより長い配列を結合させるかどうかに関係なく、 その試薬により“認識される”標的中の塩基数を決定するのはこのＭＩＬ値であ り、これは、試薬の配列特異的なレベルを順々に決定する。

この概念を例示するために、遺伝子不活性化試薬が１６のサブユニット長を有す ると仮定すれば、ＭＩＬ値は１０にすぎない。

このような試薬ならば、成分として１０の連続的な塩基の標的配列をすべて含む 遺伝子配列を全部不活性化すると予想されるだろう。特有配列の一本鎖遺伝子物 質の２億の塩基を含む細胞プール中では、およそ１０００のこのような標的配列 がある。

さらに、この試薬中の塩基対部分の数は、このＭＩＬ値より実質的に大きいので 、この試薬もまた。必要な１０の連続した塩基の標的配列さえない配列と１、一 部間違って対になった種々の複合体を形成することが予想されるだろう。これら 間違って対になった複合体のいくつかは、関連した標的でない遺伝子配列を不活 性化するのに、充分に安定である。

対照的に、長さが１６サブユニツトでＭＩＬ値が１６の試薬の場合には、定義に より、このような試薬は標的でない配列を不活性化できない。標的でない配列に 一部間違って対になったすべての複合体が、遺伝子の不活性化を達成するのに充 分な安定性を有さないからである。完全な１６の塩基対試薬／標的二重構造だけ が、遺伝子の不活性化を達成するのに充分な安定性を有するだろう。

実際のＭＩＬ値の決定に関連して、一連の遺伝子不活性化試薬（これらはすべて 同じ遺伝子配列に対して標的化されるが。

サブユニットの数は変えられる）が１機能している一本鎖標的配列を含むとわか っている生体細胞内で試験されるとき。

この標的化された遺伝子の活性は、この旧り値に対応するサブユニット長にて著 しい減少を示す。すなわち、このＦＩＩＬ値は、この標的化された遺伝子配列の 活性を妨げるのに充分な数のサブユニットに対応している。

さらに例示のために９選択されたバンクポーン連鎖タイプを有するポリヌクレオ チド結合ポリマーに対し、最小の不活性化の長さを決定するために、模範的な方 法が以下に記述される。

まず９選択されたバンクポーンタイプを有する一連の規則正しい結合ポリマーを 調製する。このポリマーはｍＲＮＡ　（５”ＧＵＧＣＡＵＣＵＧ［ＩＣＣＡＧＴ ＧＡＧＧＡＧＡＡＧ−３’　）中のウサギβ−グロビンの５７〜８０の範囲に標 的化され、その長さを５〜２４サブユニツトに変動させる。次に、　Ｂｌａｃｋ 　、　ＭｕｒａｋｉｍｉおよびＭｉｌｌｅｒ　（Ｂｉｏ−並堕鎚旦ム　釘：６１ ３２　（１９８５）　”）の詳細な手順に従って、　〔３５ｓ　）−メチオニン でラベルされた市販のウサギ網赤血球溶解物の調製物の分割された一部分に、こ れらポリマーの各々を加える。その後、ウサギグロビンｍＲＮＡを加え、３７℃ で１時間インキュベートする。各サンプルを’Ｊ−（Ｍして、ゲル電気泳動によ り分画し、上記のＢｌａｋｅらによる方法と同様にして。

β−グロビンに組み込まれた放射活性の量を測定する。この最小の不活性化の長 さは、新しいβ−グロビン合成を本質的に完全に妨害する最小のポリマーサブユ ニット長である。

この？ｌＩＬは標的配列に依存して少量で変えられるが、一般に、この相対的に 簡単な細胞外方法は、与えられたバンクボーンタイプに対し、細胞内ＭＩＬの全 く良好な近似を生ずるのに役立つことが再び強調されるべきである。選択された バンクポーンタイプに対しこのＭＩＬ値が一旦決定されると、　ＭＩＬ調整に対 し下記に記述の方法は９選択された標的配列に対するＭＩＬを最適化するために １合理的に適用され得る。

３、このＭＩＬを言。　するための゛Ｊ結果として、受容可能なＭＩＬ値を最終 的に得るために、相当の範囲で試薬の標的結合親和力を変えることがしばしば必 要とされる。この目的のために、試薬／標的二重構造の安定性を変えるべく２種 々の方法およびその組合せが使用可能である。これには、以下のことが包含され る。

（ｉ）この試薬中の塩基対部分の数を増加させるかまたは減少させること： （ｉｉ　）より大きなまたはより小さいスタッキング寄与を供給するような配列 を有する標的を選択すること（二重の安定性に関する塩基配列効果の詳細な分析 に対し、　Ｔｎｏｃｏら（３１）を調べよ）； （ｉｉｉ　）弱い結合塩基（ＡおよびＵまたはＴ）に対する強力な結合塩基（Ｇ およびＣ）の比率がより大きいがまたはより小さい標的配列を選択すること； （ｉｖ）１つまたはそれ以上の弱い結合塩基対部分を、同じワトソン／クリック 対特異性を有するより強力な結合部分で置換すること（例えば、２．６−ジアミ ツプリン部分は、この標的配列内のＵまたはＴと実質的により強力な結合を得る ために、アデニンに代えて用いられ得る；この標的配列内のＡと実質的により強 力な結合を得るには、ＵまたはＴに代えて５−ブロモウラシル部分が使用可能で ある；そして、この標的配列内のＧとある程度より強力な結合を得るには、シト シンに代えて５−ブロモシトシン部分が用いられ得る）：あるいはこの試薬の１ つまたはそれ以上の強力な結合塩基対部分を、同じＷ／Ｃ対特対性異性するより 弱い結合部分で置換すること（例えば、２−ピリミジノ部分は、この標的配列内 のＧと実質的により弱い結合を得るために、シトシンに代えて用いられ得る；そ して、この配列内のＣと実質的により弱い結合を得るには、６−チオグアニン部 分またはヒボキサンチン部分が使用可能である）；および （ｖ）この標的配列に対し、ワトソン／クリック対をある程度阻害するかまたは 増大させるために、バックボーン構造を選択すること。

上記方法のうち最初の３つ、には、標的選択手順が含まれ。

これに対して、後の２方法はこの試薬の合成中に行われることは、注目されるべ きである。

方法（ｉ）には、配列特異性の必要条件では、この試薬の長さを約１４サブユニ ツト以下にまで減少させることは除外されるという困難性がある。方法（ｉｉ） および（ｉｉｉ　）の困難な点は、他のより重要な標的化基準がこの最適の標的 領域をあまりに厳しく制限しているため、これら２つのＭＩＬ　ｍ整方法は、著 しい効果を得るにはほとんど許容範囲がないことにある。これらの制約のために 、はとんどのＭＩＬＩＩ整は３方法（ｉｖ）および（Ｖ）により好適に達成され る。

■、メユ１≧１１鍜腹略 第■節で考察される要因によれば、所望のポリマー長および認識部分の配列を選 択した後、上記に詳述の一般的なサブユニットカップリング手順を用いて、この ポリマーが集められる。ポリマーを集める一つの方法には、はじめに適当な一組 の２量体を調製し２選択された２量体を連結させて４量体を形成し、それらを連 結して８量体を形成するなど、が含まれる。この方法は溶液中で実行され、第５ Ａ図および第７Ａ図に関連して上記に記述される方法に実質的に従う。すべての カンプリングが必ずしも同じサイズのオリゴマーの間で行われる必要がない事に 注目すべきである。例えば、しばしば。

最後のカンプリングでは、　２量量体を得るには、１６量体と４量体とを連結さ せること、あるいは２４量体を得るには１６量体と８量体とを連結させることが 望ましい。

この集合方法で特に有利な点は、それぞれのカンプリング生成物が、その前駆体 のおよそ２倍の質量をもつので、それぞれのカンプリング生成物の精製が簡単な 事である。下記の実施例１８では、８サブユニツトのカルバミン酸塩が連結され たポリマーのこの方法により形成される集合体について詳細ポリマー合成のため の一つの好ましい方法として、固体担体上での段階的な集合がある。ここでは、 ポリマー中の最初のサブユニットが、そのＮ２バフクボーン基を介して固体担体 に付加される。典型的には、開裂可能であり好ましくは酸に安定な長鎖のリンカ −によって誘導されたガラスピーズのような固体担体が、この担体材料として用 いられる。実施例１９で記述のごとく、この固体担体は、ヌクレオシドの５”水 酸基のような請求核基の付加のために調製される。このガラスピーズは、好まし くは酸に不安定なＮＩ保護基、および活性化されたＮ２基またはＥバックボーン 基を有するサブユニットと。

第■節に詳述のように反応に供される。種々のタイプのサブユニットのガラスピ ーズ担体へのカンプリングは、一般に。

実施例２０〜２２に記述されている。

この二番目のサブユニット（または、溶液中で集合されうるポリマーユニット） の担体へのカンプリングの後、すべての未反応の請求核基は、ｐ−ニトロフェニ ル酢酸塩のような適当なキャンピング試薬の付加により、キャンプされる。その 後、担体は洗浄され濾過される。このＮ１末端サブユニット上の保護基は、典型 的には酸処理により除去される。

中和の後、この担体は１次いで、遊離のＮ２バフクボーン部分で活性化される次 の配列中のサブユニット（またはポリマーユニット）の過剰量との反応に供され る。活性化された過剰のサブユニットにより、鎖を伸長されている多数の担体結 合サブユニットの数が最大になる。すなわち、この固体担体の集合方法の一つの 特徴は、各サブユニット付加段階において。

高いカップリング効率が必要なところにある。付加され活性化されたサブユニッ トの濃度は、この効率を最大にするように選択される。鎖の伸長は、各サブユニ ットの付加の後、不足配列のキャッピングとともに、所望の長さおよび配列のポ リマーが得られるまで続けられる。この一般的な方法は、１４サブユニ７）の炭 酸塩が連結されたポリマーの調製に対し実施例２０に、１９サブユニツトのカル バミン酸塩が連結されたポリマーの合成に対し実施例２１に、そして１９サブユ ニツトのアミドが連結されたポリマーの集合に対して実施例２２に示されている 。

この最後の配列中のサブユニットの付加の後、このポリマーは、末端のＮ、基に カップリングされている適当な荷電または非荷電の基とともにキャップされても よい。もしこのバックボーンの集合が非荷電のアキラルな連鎖ばかりで行われる なら、このキャンピング試薬は、好ましくはポリマーに末端の電荷を与える荷電 された一群である。ポリマーのキャッピングの後、このポリマーは、たとえば水 酸化アンモニウムのような核剤を用いた処理により切り離される。そして、この ポリマーは９例えば陰イオン交換クロマトグラフィーにより精製される。これら 集合後の操作は、カーボネートで連結されたポリマーの合成に関し実施例２３で 、カルバミン酸塩で連結されたポリマーの合成に関し実施例２５で、そしてアミ ドで連結されたポリマーの合成に関し実施例２７で記述されている。

結合されたポリマー分子とともに上記固体担体試薬を含む診断上の応用に対し、 この集められ精製されたポリマーは。

公知のカップリング方法（例えば、実施例２０に詳述される方法）により、セル ロース担体のような固体担体に付加される。

実施例２４．２６および２８は例証となる。

以下の実施例は３本発明に従って作成されそして使用される種々のサブユニット 合成スキーム、ポリマー構成方法および応用および組成物を例示している。これ らの実施例は１本発明の範囲を何ら限定するつもりはない。

（以下余白） 汰国ｌ吐１ リボヌクレオシドおよびデオキシリボヌクレオシドの調す次のヌクレオシドは、 　Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ’　Ｃｏ、、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ＋　１１０ から得られる：デオキシウリジン、デオキシグアノシン、チミジン、デオキシア デノシン、デオキシシチジン、５−ブロモデオキシウリジン、デオキシイノシン 、２．６−ジアミツー９−（２−デオキシ−β−り一エリスローペントフー７／ シル）９Ｈ−プリン（２，６−シアミツプリンデオキシリボシド）、ウリジン、 グアノシン、　５−メチルウリジン、アデノシン、シチジン、５−ブロモウリジ ン、イノシン。

２．６−ジアミツー９−（β−Ｄ−リボフラノシル）　−９Ｂ−プリン（２，６ −シアミツプリンリボシド）は、　Ｐｆａｌｔｚ　ａｎｄ　Ｂａｕｅｒ。

Ｉｎｃ、、　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ　ｏｆ　Ａｃｅｔｏ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、 、　Ｉｎｃ−＋　Ｗａｔｅｒｂｕｒｙ。

ＣＴから得られる。　− 次のヌクレオシドは１次に示す文献の方法で調製される＝１−（２−デオキシ− β−り一エリスローベントフラノシル−２−ピリミジノン（２−ヒドロキシピリ ミジンデオキシリボシド）は、　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　５ｏｎｓ＋　 Ｉｎｃ、のＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ並セ旦す；　Ｌ、　Ｂ、　Ｔｏｗｎｓｅｎ ｄ　ａｎｄ　Ｒ，Ｓ、　Ｔｉｐｓｏｎ、　ｅｄｓ　（１９７６）に記載されたＰ 、　Ｋｏｈｌｅｒ、　Ｅ、　Ｖｏｌｚ、　Ｕ、　５ｅｑｕｉｎおよびＣ，Ｔａｍ ｍの方法により調製される。

１−（２−デオキシ−β−Ｄ−エリスローペントフラノシル）−４−メトキシ− ２−ピリミジノンは１次の方法で調製される： １−　（３’、　５”−ジー０−ベンゾイル−２−デオキシ−β−Ｄ−エリスロ ーペントフラノシル−４−メチルチオ−２−ピリミジノン（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏ ｎ　ｏｆ　Ｃｚｅｃｈｏｓｌｏｖ　Ｃｈｅｍ　Ｃｏｍｍ　（１９７７）４２　： 　２２４６のり、　ＣｅｃｈおよびＡ、　Ｈｏ１ｙの方法により調製〕を。

０．２Ｍナトリウムメトキシド溶液２００ｍＬで処理する。処理後の溶液を一夜 室温に放置する。この溶液を次に、ダウエックス５０Ｘ　８　（Ｄｏｗｅｘ　５ ０Ｘ　８　；　Ｈ”型）で中和し、濾過する。残渣を水１００ｍＬに溶解し、エ ーテル２．５０ｍＬで抽出し、水相をエバボレートする。その残渣はアモルファ ス状の物質であり。

直接次の反応に用いられる。

２−アミノ−９−（２−デオキシ−β−り一エリスローベントフラノシル）　− １，９−ジヒドロ−６Ｈ−プリン−６−千オン（デオキシチオグアノシン）は、 　Ｊ　Ｍｅｄ　Ｃｈｅｍ　（１９６３）　６　：６８４のＲ，Ｈ，Ｉｗａｍｏｔ ｏ、　Ｅ−Ｍ、　Ａｃｔｏｎ、およびり、　Ｇｏｏｄｍａｎの方法により調製さ れる。

１−（β−Ｄ−リボフラノシル）−２−ピリミジノン（２−ヒドロキシピリミジ ンリボシド）は、　Ｌ叶り堕並（１９７４）３９　：　３６６８のＵ、　Ｎ１ｅ ｄｂａｌｌａおよびＨ，Ｖｏｒｂｒｕｇｇｅｎの方法により８周製される。

１−（２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−メトキシ−２−ピリミジ ノン（２−ヒドロキシピリミジンデオキシリボシド）は、　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏ ｎ　ｏｆ　Ｃｚｅｃｈｏｓｌｏｖ　Ｃｈｅｍ　Ｃｏｍｍ　（１９７３３８：　１ ３８１のＲ，Ｗｉｇｈｔｍａｎおよびり、　Ｈｏ１ｙの方法により調製される。

２−アミノ−９−（β−Ｄ−リボフラノシル）　−１，６−シヒドロー６Ｈ−プ リン−６−チオン（チオグアノシン）は、ＬＡｍｅｒ　Ｃｈｅｍ　Ｓｏｃ　（１ ９５８）　８０　：　１６６９のＪ、　Ｊ、　Ｆａｘ、　１．　Ｗ’ｅｍｐｅｎ 。

＾、　ＨａｍｐｔｏｎおよびＩ、　Ｌ、　Ｄｏｅｒｒの方法で調製される。

ジメトキシトリチルクロリド、　Ｎ−ベンゾイルアデノシン。

Ｎ−ベンゾイル−２”−デオキシアデノシン、Ｎ−ベンゾイルシチジン、Ｎ−ベ ンゾイル−２“−デオキシシチジンおよびＮ−イソブチリル−２”−デオキシグ アノシンは、　Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ＋Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　Ｍｉ ｓｓｏｕｒｉから得られる。９−フルオレニルメトキシカルボニルクロリド（Ｆ ＭＯＣクロリド）、トリメチルクロロシラン、無水イソ酪酸、　４−ニトロベン ゾイルクロリド。

および有機溶媒のすべて（反応およびクロマトグラフィー用）は、　Ａｌｄｒｉ ｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ′Ｃｏ、＋　Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、　Ｗｉｓｃｏｎｓｉ ｎから得られる。シリカゲルは、　ＥＭ　５ｃｉｅｎｃｅ、　Ｃｈｅｒｒｙ　） ｌｉｌＬ　Ｎｅｗ　ＪｅｒｓｅｙＮ−２９−フルオレニルメトキシカルボニル誘 導体は９次に示すヌクレオシドのアミノ基の保護の一般的な手法により調製され る： ）　グアノシン（１ｍｍｏｌ）をとリジン（５ｍＬ）に懸澗させ、トリメチルク ロロシラン（５ｍｍｏｌ）で処理する。この溶液を１５分間攪拌した後、９−フ ルオレニルメトキシカルポニルクロリド（５ｍｍｏｌ）を加え、この溶液を室温 に３時間保持する。

反応液を水浴中で冷却し、水（１ｍＬ）を加える。５分間攪拌後、濃アンモニア （１ｍＬ）を加え１反応液を１５分間撹拌する。

この溶液をほぼ乾固状態近くにまでエバポレートし、残渣をクロロホルム（１０ ｍＬ）に溶解させる。この溶液を重炭酸ナトリウム溶液（５ｍＬ、　１０％）で 洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、エバポレートする。残渣をトルエンとともに 数回エバボレートし、生成物をメチレンクロライド中メタノール勾配（０〜５０ ％）を用いてシリカゲルのクロマトグラフィーにかける。

Ｎ−イソブチリルグアノシンは、　Ｊ　Ａｍｅｒ　Ｃｈｅｍ　Ｓｏｃ　（１９６ ９）９１　：　３３５６のＬｅｔｓｉｎｇｅｒおよびＭｉｌｌｅｒの方法により 調製される。

Ｎ−アセチルグアノシイは、　Ｊ　Ｃｈｅｍ　Ｓｏｃ　Ｐｅｒｋｉｎ　Ｔｒａｎ ｓ　（１９７２）１　：　２９３７のＣ，Ｂ、　ＲｅｅｓｅおよびＲ，Ｓ、　５ ａｆｆｈｉｌｌの方法で得Ｃｈｅｍ　５ｃａｎｄ　（１９８３）　Ｂ　３７　： 　２６３のＪ、　Ｈｅ１ｋｋｌａおよびＪ、　Ｃｈａｔ−ｔｏｐａｄｈｙａｙａ の方法で調製される。

Ｎ−２アセチル誘導体は、Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｐｌｕｓ　Ｉｎｃ、ｓ　Ｂａｙｏ ｎｎｅ。

Ｎ、　Ｊ、から得られる。

２．３　ｆオキシアデノシン Ｎ−６２−（４−ニトロフェニル）エトキシカルボニル誘導体は、　Ｔｅｔｒａ ｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ　（１９８３）　２４　：　３５８３のＦ、　Ｈｉｍａ ＋ｅｌｓ−ｂａｃｈおよび−，Ｐｆｌｅｉｄｅｒｅｒの方法により調製される。

Ｎ−６４−ニトロベンゾイル−２′−デオキシアデノシンは。

ＦＭＯＣクロリドの代わりに４−ニトロベンゾイルクロリドを用いたこと以外は 上記ＦＭＯＣ−グアノシンの調製法により調製される。

Ｎ−６２−（フェニルスルホニル）エトキシカルボニル誘導体は、アシル化剤と して２−（フェニルスルホニル）−エチルクロロフォーメート（Ｔｅｔｒａｈｅ ｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ　（１９８１）　２２　：　３６６７のＮ、　Ｂａｌｇｏｂ ｉｎ、　Ｓ−ＪｏｓｅｐｈｓｏｎおよびＢ、　Ｃｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙａの 方法により得られる〕を用い、溶媒としてＮ−メチルイミダゾールまたはピリジ ンを用いたこと以外は、　ＦＭＯＣグアノシンの調製法により調製される。

２．４　アデノシン Ｎ−６２−（４−ニトロフェニル）−エトキシカルボニル誘導体は、　Ｔｅｔｒ ａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ　（１９８３）　２４　：　３５８３０Ｆ、　）Ｉｉ ｍｍｅｌｓ−ｂａｃｈおよびＷ、　Ｐｆｌｅｉｄｅｒｅｒの方法により調製され る。

Ｎ−６４−二トロペンゾイルアデノシンは、　ＦＭＯＣクロリドの代わりに４− ニトロベンゾイルクロリドを用いたこと以外はＦＭＯＣ−グアノシンの調製法に より調製される。

Ｎ−６２−（フェニルスルホニル）エトキシカルボニル誘導体は、アシル化剤と して２−（フェニルスルホニル）−エチルクロロフォーメート（Ｔｅｔｒａｈｅ ｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ　（１９８１）　２２　：　３６６７のＮ、　Ｂａｌｇｏｂ ｉｎ、　、５．　ＪｏｓｅｐｈｓｏｎおよびＢ、　Ｃｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙ ａの方法により得られる〕を用い、溶媒としてＮ−メチルイミダゾールまたはピ リジンを用いたこと以外は、　ＦＭＯＣグアノシンの調製法により調製される。

２．５　デオキシシチジン Ｎ−４２−（４−ニトロフェニル）−エトキシカルボニル誘導体は、　Ｔｅｔｒ ａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ　（１９８３）　２４　：　３５８３のＦ、）Ｉｉｍ ｍｅｌｓ−ｂａｃｈおよびＷ、　Ｐｆｌｅｉｄｅｒｅｒの方法により調製される 。

Ｎ−６２−（フェニルスルホニル）エトキシカルボニル誘導体は、アシル化剤と して２−（フェニルスルホニル）−エチルクロロフォーメート（Ｔｅｔｒａｈｅ ｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ　（１９８１）　２２　：　３６６７のＮ、　Ｂａ１４ｏｂ ｉｎ、　Ｓ、　ＪｏｓｅｐｈｓｏｎおよびＢ、　Ｃｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙａ の方法により得られる〕を用い、溶媒としてＮ−メチルイミダゾールまたはピリ ジンを用いたこと以外は、　ＦＭＯＣグアノシンの調製法により調製される。

２．６　シチジン Ｎ−４２−（４−ニトロフェニル）−エトキシカルボニル誘導体は、　Ｔｅｔｒ ａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ　（１９８３）　２４　：　３５８３のＦ、　Ｈｉｍ ｍｅｌｓ−ｂａｃｈおよびＷ、　Ｐｆｌｅｉｄｅｒｅｒの方法により調製される 。

Ｎ−６２−（フェニルスルホニル）エトキシカルボニル誘導体は、アシル化剤と して２−（フェニルスルホニル）−エチルクロロフォーメート（Ｔｅｔｒａｈｅ ｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ　（１９８１）　２２　：　３６６７のＮ、　Ｂａｌｇｏｂ ｉｎ、　Ｓ、　ＪｏｓｅｐｈｓｏｎおよびＢ、　Ｃｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙａ の方法により得られる〕を用い、溶媒としてＮ−メチルイミダゾールまたはピリ ジンを用いたこと以外は、　Ｆ？ＩＯＣグアノシンの調製法により調製される。

２．７　２．６−シアミツプリンリボシド２．６−シアミツプリンリボシドのＮ −２、Ｎ−６ビス（９−フルオレニルメトキシカルボニル）誘導体は、一般的な 手法で調製される。

Ｎ−２，Ｎ−６−ビス（イソブチリル）誘導体は９通常の手法により調製される 。

２．８２．６−シアミツプ１ンー２“−デオキシリボシド２．６−シアミツプリ ンー２”−デオキシリボシドのビスＮ−２、Ｎ−６−（９−フルオレニルメトキ シカルボニル）誘導体は９通常の手法により調製される。

２．９　チオグアノシン チオグアノシンのＮ−２９−フルオレニルメトキシカルボニル誘導体は通常の手 法により調製される。

２．１０　２’−デオキシチオグアノシン２”−デオキシチオグアノシンのＮ− ２９−フルオレニルメトキシカルボニル誘導体は１通常の手法により調製される 。

四臭化炭素、ナトリウムアジド、ｐ−）ルエンスルホニルクロリド（トシルクロ リド）、トリフェニルホスフィンおよび１０％パラジウム−炭は、　Ａｌｄｒｉ ｃｈ　ＣｈｅｍＣｏ、で購入される。

リチウムアジドは、　Ｋｏｄａｋ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ａｎｄ　５ｐｅｃｉ ａｌｔｙ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓで得られる。

３．１　二股約王迭 この実施例で用いられるヌクレオシドは、チミジン、Ｒ６−ペンゾイルー２°− デオキシアデノシン、　Ｎ４−ベンゾイル−２゛−デオキシシトシン、および２ ′−デオキシイノシン、２−ヒドロキシ−ピリミジン−２゛−デオキシリボシド および２，６−シアミツプリンー２”−デオキシリボシドのＮ２−　Ｒ６−ビス イソブチリル誘導体（実施例１参照）である。所望の乾燥したヌクレオシド（１ ｍｍｏｌ）　ヲＨ４ｉし、トリフェニルホスフィン（１，０１ｍｍｏｌ）および リチウムアジド（５ｍｍｏｌ）を入れた反応容器に添加する。固形物をＤＭＦに 懸濁させた後、四臭化炭素（１，０ｍｍｏｌ）を容器に加える。こｑ溶液を室温 で２４時間攪拌する。

反応をメタノールで止めた後、この溶液をエバポレートして乾固させる。残渣を シリカゲルクロマトグラフィーにかけ。

メタノール／クロロホルム混合液で溶出すると５所望の５゛−アジドー２’、　 ５’−デオキシヌクレオシドが得られる。

この５°−アジドヌクレオシド（１ｍｍｏｌ）をエタノールにン容解させる。触 媒量の１０％パラジウム−炭の存在下、水素圧３５ｐｓｉで１０時間にわたり水 素化を行う。この溶液を濾過し、減圧下でエバポレートすると粗固形物が得られ る。この固形分は適当な溶媒を加えてこねることにより精製される。

３．２　５’−アジドウリジン球 ５−ブロモ−２°−デオキシウリジンの５°−アジド誘導体は。

上記方法により調製される。５゛−アジド−ｔ−ブロモ−２゛−デオキシウリジ ン（１ｍｍｏｌ）は、トリフェニルホスフィン（１，５ｍｍｏｌ）とピリジン中 室温で２時間にわたり処理される。

この反応容器に濃アンモニア（１ｍＬ）を加える。１４時間後。

溶媒を真空下で除去する。残渣をＴＨＦに溶解させ、この溶液をヘキサンに加え る。沈澱物を集め、この固形成分を適当な溶剤でこねると、５′−アミノ−５− ブロモ−２”−デオキシウリジンが得られる。

３．５５”−アジドグアノシン ５°−アミノ−２゛、５”−ジデオキシグアノシンの他の調製法は、保護された ２゛−デオキシグアノシン（Ｎ−２−アセチルかＮ−２−ＦＭＯＣ誘導体で保護 されている）　（１ｍｍｏｌ）をピリジン中トシルクロリド（１，３ｍｍｏｌ） で０℃にて一夜処理することである。この溶液をエバポレートして乾固し、残渣 をクロロホルムに溶解させる。得られた溶液を重炭酸ナトリウム水溶液で洗浄し 、硫酸ナトリウムで乾燥する。この溶液をエバボレートシ、残渣をシリカゲルク ロマトグラフィーにかけメタノール／クロロホルム混合液で溶離する。得られた トシレート（１ｍｍｏｌ）は、ＤＭＦ中ナトナトリウムアジド６　ｍｍｏｌ　） で８０〜１００℃にて数時間処理する。溶媒をロータリーエバポレーターで除去 し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィーにかけクロロホルム／メタノール混合 溶媒で溶離する。このアジドは、上記手法を用いて目的とするアミンに還元され る。

２゛−デオキシシチジン、２°−デオキシアデノシン、２゛−デオキシグアノシ ン、および２，６−シアミツプリンデオキシリボシドの塩基窒素の保護基として は、２゛−デオキシシチジンおよび２゛−デオキシ７デノシンに対しては２−（ フェニルスルホニル）エトキシカルボニル基が、そして２゛−デオキシグアノシ ンおよび２．６−シアミツプリンデオキシリボシドを保護するためには９”−フ ルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＯＣ）基が、実施例２に示されるように、 使用される。

３′−アミノ−２゛、３°−ジデオキシリボヌクレオシド　サブユニとヱ）Ｏｉ １ｍ裂 チミジンを５゛−Ｏ−アセチル−３゛−アジド−２′、３”−ジデオキシチミジ ンに変換し、これを−Ｊ　Ｏｒ　Ｃｈｅｍ　（１９７８）　４３　：３０４４の Ｍ、　ＩｍａｚａｕａおよびＦ、　Ｅｃｋｓｔｅｉｎの方法により３′−アジド −２゛、３°−ジデオキシアデノシンおよび３゛−アジド−２゛３゛−ジデオキ シグアノシンに変換する。３”−アジドアデノシンの塩基部分は、ベンゾイル誘 導体または２−（フェニルスルホニル）エトキシカルボニル誘導体（実施例１に 示す）として保護される。３′−アジドグアノシンのＮ−２は、アセチル誘導体 またはＦＭＯＣ誘導体〈実施例１参照）として保護される。これらの３゛−アジ ド基の３°−アミノ−２’−３’−ジデオキシリボヌクレオシドへの還元は実施 例３に示されるようになされる。

ス】１１足 リボヌクレオシドから沃　されるモルホリン刑すブユニット皇星製 重ホウ酸アンモニウム、　ｍ−過ヨウ素酸ナトリウム、ナトリウムシアノボロハ イドライド、ウリジン、　Ｎ４−ベンゾイルシチジン、およびＲ６−ペイジイル アデノシンは、　Ｓｉｇｍａ　ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ、で得られる。Ｎ２−イソ ブチリルグアノシンは、　ＬｅｔｓｉｎｇｅｒおよびＭｉｌｌｅｒ　Ｕ　Ａｍｅ ｒ　Ｃｈｅｍ　Ｓｏｃ　（１９６９）　９１　：　３３５６　）の−Ｃ的手法に より調製される。２−フェニル−２−プロパツールおよびビス（ｐ−ニトロフェ ニル）カーボネートは、　ＡｌｄｒｉｃｈＣｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、で得られる 。

ウリジンのモルフォリンＲ４体は、ウリジンｌ　Ｈｏｌと重ホウ酸アンモニウム 、（Ｎ）＋４）　Ｊｚ０７２　ｍｍｏｌとを水５ｒｎ！！に溶解させて調製され る。水浴下で撹拌し直射日光を避けながら、　ｍ　−過ヨウ素酸ナトリウム１． ２畦ｏ１を水５艷に溶解させた溶液を添加する。９０分後に１，２−プロパンジ オール０．２−を加え。

室温で１０分間攪拌を続ける。その後、換気の充分なフードの中で充分に攪拌し ながらナトリウムシアノボロハイドライド０．２５　ｇを水３−に溶解した溶液 を添加し、混合物を室温で４時間攪拌する。次に２反応混合物を温水浴中真空下 で濃縮してオイル状とし、これを最小量のメタノールで再分散してシリカゲルク ロマトグラフィーカラム上に積層し、メタノール／１％トリエチルアミンで溶離 する。モルフォリン型生成物はシャープなバンドでカラムから溶離される。この 生成物は。

ちとのりボヌクレオシドおよびその酸化生成物に比較してはるかにゆっくりと移 動する。このモルフォリン型生成物は。

もとのりボヌクレオシドとほとんど同一のｕｖスペクトルを有する。しかし、マ ススペクトルは、１７ダルトンだけ低い（高速原子衝撃活性化によるマススペク トル分析により決定）。

次に、生成物を２−フェニルイソプロピルフェニルカーボネートと反応させるこ とによりモルフォリンの窒素を保護する。所望の活性カーボネートを調製し、こ れを、ＩｎｔＪ上ｍ達坤工Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｅｓ　（１９７４）　６　：　１ １１のＳａｎｄｂｅｒｇ　ａｎｄ　Ｒａｇｍａｒｓｓｏｎの方法に基本的に従い １モルフォリン型サブユニットと反応させる。最終的に、必要に応じて（サブユ ニット　アセンブリーをポリマーへ組み込む方法に依存する）、もとの５゛に対 応する位置の水酸基は９次の方法により活性化され得る。その方法とは、Ｎ−保 護化サブユニットを最小容量の乾燥ジメチルホルムアミドに溶解させ、ビス（ｐ −ニトロフェニル）カーボネート２等量とトリエチルアミン、　Ｎ−メチルイミ ダゾール、またはＮ、Ｎ−ジメチルアミノピリジン０．２等量とを加えることで ある。室温で３時間保持した後１反応混合物を温浴中で真空上濃縮する。この濃 厚なシロップを受容量のジクロロメタンに再懸濁し、シリカゲルカラム上に積層 しｌＮｌＮ−ジメチルアニリンを０．２容量％の割合で含有するジクロロメタン ／エーテル（容量比１：１）混合物で溶離する。この溶媒系において、活性化生 成物は、ｐ−二トロフェノールおよびビス（ｐ−ニトロフェニル）カーボネート よりも実質的にゆっくりと移動するが、未反応の出発物質よりもはるかに速く移 動する。活性化された生成物は、アンモニアを噴霧することによりシリカゲル几 Ｃプレート上でＮ単に目視観察することができる。アンモニアの噴霧により、黄 色のニトロフェル−トイオンが１〜２分間で現れる。

他のりボヌクレオシド（必要に応じて実施例２のように塩基が保護されている） は、基本的には同様の手法で、対応するモルフォリン型誘導体に変換される。た だし、最初の過ヨウ素酸塩による酸化の段階の前の、保護されたりボヌクレオシ ドの溶解性に応じて、メタノールを適当量添加する必要がある。

モルフォリン型サブユニットがチオカーバメート結合を介して結合されるとき１ 通常の出発リボヌクレオシドに対する好適な塩基保護基は次のとおりである：シ チジンおよびアデノシンにはフェニルスルホニルエトキシカルボニル基、および グアノシンには９−フルオレニルメトキシカルボニル基。

災舅炭■ ５°−酢　−２’、　５’−ジデオキシリポヌクレオシド　サブユニーム上！ｊ ｌ説 トリエチルアミン、ピリジン／三酸化イオウ錯体、　ｐ−ニトロフェノール、ジ シクロへキシルカルボジイミド、および４０％ジメチルアミン水溶液はＡｌｄｒ ｉｃｈで得られる。

実施例１２．１で調製される３”−０−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−Ｎ− ２−（フェニルスルホニル）エトキシカルボニルアデノシン（１ｍｍｏｌ）をメ チレンクロリドおよびジメチルスルホキシド（１／１　、　ｖ／ｖ　；　１０ｍ Ｌ）に０℃で溶解させる。これに、トリエチルアミン（３ｍｍｏｌ）およびピリ ジン／三酸化イオウ錯体（３ｍｍｏｌ）を加える。この混合液をこの温度で１時 間攪拌し、水洗する。硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下でエバボレートする。残 渣を乾燥ピリジン（１０ｍＬ）に溶解させ。

ベンジルオキシカルボニルメチレントリフェニルホスホラン（１，５ｍｍｏｌ） と３７℃で２４時間処理する。この混合物を２次に。

減圧下でエバボレートして乾固し、残渣をメチレンクロリドに溶解させ、希）１ ｃＩでそして水で洗浄する。次に、有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減 圧下で留去する。残渣をクロロホルム中メタノール勾配（０〜２０％）を用いて シリカクロマトグラフィーにかける。

前段で得られる不飽和エステル（１ｍｍｏｌ）をシクロへキサジエン（５ｍＬ） および１０％パラジウム−炭（１００■）を含む酢酸エチル／エタノール（４０ ｍＬ、　１／１　、　ｖ／ｖ　）に溶解させ。

この懸濁液を窒素気流下５〜２４時間にわたり激しく攪拌する。

この混合物を濾過し、溶媒を減圧で留去する。残渣をクロロホルム中メタノール 勾配（５〜５０％）を用いてシリカゲルクロマトグラフィーにかける。

前段で得られる酸の０．２〜０．５Ｍ酢酸エチル（またはメチレンクロライド） 溶液にｐ−二トロフェノールを約２０％過剰に加える。この溶液に０℃でジシク ロへキシルカルボジイミドを計算量加える。０．５時間後に、この溶液を室温に 戻し。

１時間保持した。分離したジシクロヘキシル尿素を濾過し。

溶媒で洗浄する。濾液と洗液とを合わせたものを減圧下でエバボレートし乾固す る。このエステルはそのままカフブリング反応に使用され得、また、クロロホル ム中イソプロパツール勾配（０〜５０％）を用いて、シリカの短いカラムで精製 することもできる。

適切に保護された他の２′−デオキシヌクレオシドについても類似の一連の反応 を行うことができる。

この活性エステル（１ｍｍｏｌ）を、　４０％ジメチルアミン水溶液（２ｍｍｏ ｌ）とメタノール中で処理すると、Ｎ−保護化３′−〇−ｔｅｒｔ−ブチルジメ チルシリル−２’、　５’−ジデオキシアデノシン−５”−酢酸のＮ、Ｎ−ジメ チルアミドが生成する。溶媒を減圧下でエバボレートして除去し、残渣を２　Ｍ 　ＨＦ／　Ｉ　Ｍ　ｔｅｒｔ　−ブチルアンモニウムフルオライド（ＴＢＡＦ） 試薬を用いて脱シリル化する。このＴＢＡＦ試薬は、　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ 　Ｌｅｔｔ　（１９８２）　２３　：２２５７にＢ、　Ｌ、　Ｇａｆｆｎｅｙお よびＲ，Ａ、　Ｊｏｎｅｓにより記載されている。ピリジン中の２　Ｍ　ＨＦ／ 　Ｉ　Ｍ　ｔｅｒｔ−ブチルアンモニウムフルオライド（ＴＢＡＦ　１　ｍｍｏ ｌ）に、前段で得られる脱保護化ヌクレオシドを加える。２４時間攪拌後９反応 液をメチレンおよび重炭酸ナトリウム水溶液に分離する。有機層を水洗し、硫酸 ナトリウムで乾燥し、エバボレートし乾固する。残渣をメチレンクロライド中メ タノール勾配（５〜２５％）を用い、シリカクロマトグラフィーで精製する。

カリウムｔ−ブトキシド、アニソイルクロリド、６−クロロプリン、１０％パラ ジウム−炭、フタロイルクロリド、２−アミノ−６−クロロプリン、２０％テト ラエチルアンモニウムヒドロキシド水溶液、２５％トリメチルアミン水溶液、２ −ピリミジノン、　Ｎ−ブロモコハク酸イミド、トリフルオロ酢酸。

４−二トロフェノール、およびＮ、Ｎ−ジスクシイミジルカーボネートはＡｌｄ ｒｉｃｈで得られる。リチウムアジドはＥａｓ　ｔｍａｎＫｏｄａｋ、　Ｒｏｃ ｈｅｓｔｅｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ＋で得られる。Ｃ１８逆相シリカゲルは、　 Ｗｈａｔｍａｎ、　Ｈｉｌｌｓｂｏｒｏ、　Ｏｒｅｇｏｎ＋　で得られる。

７．１．　（Ｓ）−５−（（４−アミノ−２−オキソピリミジニル）−メチルゴ ーピロリドンのｆ制ｉＬ　シトシンピロリドン上山ｊｊＬ！欠Ｌ シトシン（２，２ｍｍｏｌ）を、カリウムｔｅｒｔ−ブトキシド（２ｍｍｏｌ） を含むジメチルスルホキシド（２ｍＬ）に溶解させる。

この溶液を（Ｓ）−５−（）シルオキシメチル）−２−ピロリドン（１ｍｍｏｌ ）を含むフラスコに加える。この（Ｓ）−５−（トシルオキシメチル）−２−ピ ロリドンは、　Ｅ、　ＨａｒｄｅｇｇｅｒおよびＨ，Ｏｔｔ、の方法（Ｈｅｌｖ 　Ｃｈｉｍ　Ａｃｔａ　（１９５５）　３８　：　３１２）により調製される。

溶解後、この混合物を２５℃で６時間攪拌する。この混合物を酢酸（２ｍｍｏｌ ）で中和し、減圧下でエバポレートする。残渣をジメチルホルムアミド（５ｍＬ ）中に取り。

減圧下でエバポレートする。この工程を３度繰り返す。

？、２．　Ｎ−４アニソイルシトシンピロリドンの１・制前段で得られる混合物 をピリジンまたはＮ−メチルイミダゾール（１抛Ｌ）に溶解させ、室温にてアニ ソイルクロリド（２，８ｍｍｏｌ）と処理する。２時間攪拌後、混合物を氷（０ ，５ｇ）で反応を止める。５分後、２９％アンモニア１ｍＬを加える。１５分間 室温に保持した後、その溶液を酢酸エチル（１５ｎ＋Ｌ）に溶解させ、塩水（１ ５ｍＬ）を用いて２度洗浄する。洗液を合併し。

酢酸エチル（２Ｘ　３０ｍＬ）で洗浄する。有機層を合併し、硫酸ナトリウムで 乾燥し、減圧下でエバポレートする。残渣はトルエンとともに数置エバポレート し、得られた残渣を、メチレンクロリド中メタノール勾配（０〜２０％）でシリ カゲルクロマトグラフィーにかける。

７．３．６−クロロプリンピロリドンの舌、制この化合物は、シトシンのアルキ ル化の方法により調製される。シトシンのアルキル化の条件と異なるのは、アル キル化は６−クロロプリンに対して行い、混合物を３５〜９５℃に数時間加熱す ることである。その混合物を室温に冷却し、酢酸（２ｍｍｏｌ）で中和し、減圧 下でエバポレートする。これを。

２０％メタノール／クロロホルムおよび１０％重炭酸ナトリウム混合物とともに 振盪する。水層をクロロホルムで洗浄し９合併した有機層を硫酸ナトリウムで乾 燥し、減圧下でエバポレートする。残渣を、クロロホルム中メタノール勾配（０ 〜２５％）を用いてシリカゲルクロマトグラフィーにかける。

ド（２ｍｍｏｌ）を含むジメチルスルホキシド（２＋ａＬ）中で３０〜１００℃ にて数時間処理する。処理後、この混合物を減圧下でエバポレートし、クロロホ ルムに溶解させる。１０％重炭酸ナトリウムで洗浄し、有機層を硫酸ナトリウム で乾燥し、減圧下で濃縮する。残渣を、クロロホルム中メタノール勾配（０〜２ ５％）を用いてシリカクロマトグラフィーにかける。

７．５．ヱヱム之２旦三丈工Ｚ色皿製 前記実施例で得られるアジドを水素化する。この水素化は。

該アジド（１ｍｍｏｌ）のパラジウム−炭（１００ｍｇ、　Ｐｄ　１０重景気） を含むエタノール（１０ｍＬ）　溶液に３０ボンドの水素圧をかけて２４時間振 盪することにより行われる。この溶液をセライトを用いて濾過し、濾液をエバポ レートする。残渣を直接次アデノシンピロリドン（１ｍｍｏｌ）をフタロイルク ロリド（１，４ｍｍｏｌ）でアシル化することによりＮ−６位にフタロイル基を 導入する。この反応は１反応液中にアンモニアを加えないこと以外は、上記シチ ジンのアニソイル化と同様の方法を用いて行われる。

７．７．２−アミノ−６−クロロプリンピロ１　トンの８．制ピロリドントシレ ートを、　６−クロロプリン誘導体の調製に示された方法で２−アミノ６−クロ ロプリンを用いてアル前段で得られるクロロプリンピロリドン（１ｍｍｏｌ　） をジグリム（１０＋ｎＬ）および２５％トリメチルアミン水溶液（２ｍＬ）中に 溶解させる。その溶液を室温で５時間攪拌し、水（１０ｍＬ）を加え、その混合 物を減圧下で１０ｍＬにまで濃縮する。酢酸（２ｍＬ）を加え、その混合液を減 圧下でエバポレートし、オイル状物を得た。酢酸四エチルアンモニウムを含む残 渣は、直接９次のステップに使用される。

７．９．　Ｎ−２アセチルグアニンピロリドンの調＋１前段で得られるグアニン ピロリドン（１ｍｍｏｌ）を無水酢酸（５ｍＬ）と、還流下で２時間反応させる 。その溶媒をエバポレートし、その残渣をジメチルホルムアミドと共にエバポレ ートする。その残渣を、０℃にてアンモニアで飽和させたエタノール（５ｍＬ） に溶解させ、溶液をこの温度で２時間攪拌する。その溶媒を減圧下でエバポレー トし、残渣をクロロホルム中メタノール勾配（５〜５０％）を用い、短いカラム のシリカクロマトグラフィーにより精製する。

７．１０．　２−アミノ−６−アジトプリンビロリドンの冨。制この化合物は、 実施例７．４．の手法を用い、２−アミノ−６−クロロプリンピロリドンから調 製される。実施例７．４．の方法と異なるのは９反応がより長い時間を必要とし 、かつより高い温度で行われることである。

７．１１．　２．６−シアミツプリンピロリドンの１゜制この化合物は、２−ア ミノ−６−アジド誘導体の還元により、アゾコシンピロリドンと同様に調製され る。

メタノール性アンモニア処理を８時間にわたって行うことを除き、上記Ｎ−２ア セチルグアニンピロリドンの調製と同様の方法により、アセチル基が導入される 。溶媒をエバボレートシ、残渣をアデノシン誘導体の場合と同様にフタロイル６ −クロロプリンピロリドン（１ｍｍｏｌ）は、グアニンピロリドン誘導体の調製 に用いられる方法によりイノシン誘導体に変換された。その化合物は、クロロホ ルム中メタノール勾配（５〜２５％）を用いて、シリカクロマトグラフィーによ って精製される。

７．１４．　２−ヒドロキシピリミジンピロ１　トンのＵこの化合物は、　６− クロロプリン誘導体の調製に用いられる手法により、　２−ピリミジノンのアル キル化により得られる。

天逼ｌ吐ｌ プリンおよびピリミジンＴ−ＢＯＣアミノ−の８周１１シトシンピロリドンの下 記一般的手法は、すべての適切に保護されたピロリドン誘導体に通用することが できる。ｔ−ＢＯＣ酸として言及されるその生成物は、ピロリドン環が開裂して 酸およびｔ−ＢＯＣアミンとなることにより形成される。

８．１．シトシンｔ−ＢＯＣの８．制 Ｎ−４−アニソイルシトシンピロリドン（１ｍｍｏｌ）　’ｃ、　’；　−ｔｅ ｒ　ｔ−ブチルジカーボネート（２ｍｍｏｌ）　、）リエチルアミン（１ｍｍｏ ｌ）　＃よびジメチルアミノピリジン（１ｍｍｏｌ）を含むメチレンクロライド に溶解させる（　０．５Ｍ溶液）。その溶液を、室温で１０時間攪拌する。揮発 性物質を除去し、残渣をクロロホルム中メタノール勾配（０〜２０％）を用いて 、シリカで精製する。その残渣をテトラヒドロフランに溶解させ（０，２Ｈ溶液 ）１次に、水酸化リチウムを加える（３ｍｍｏｌ、１Ｍ溶液として）。室温で５ 時間保持した後、その溶液を１０％酢酸（３ｍｍｏｌ）を添加することにより中 和し、溶媒を減圧下で除去する。その残渣を９Ｎアンニモアに溶解させ、室温で １〜１０時間攪拌した。その溶媒を減圧下で除去し、残渣を水およびメタノール （またはトリフルオロエタノール）の混合液を用いて、０１８逆相シリカゲルの クロマトグラフィーにより精製これは９次の操作によりシトシンｔ−ＢＯＣ酸か ら調製する：シトシンｔ−ＢＯＣ酸（１ｍｍｏｌ）を酢酸水溶液に溶解させ、亜 硫酸ナトリウム（１ｍｍｏｌ）と４℃で処理する。その混合物を１時間攪拌し、 減圧下エバボレート・乾固する。その生成物を、水およびメタノール（またはト リフルオロエタノール）混合液を用い、０１８逆相シリカゲルのクロマトグラフ ィーにより精製する。

８．３．５−プロモラーシルｔ−ＢＯＣの８゜制この化合物は次の手法により、 ウラシルｔ−ＢＯＣ酸から得る：ウラシルｔ−ＢＯＣ酸（１ｍｍｏｌ）をＤＭＦ 　１３　ｍｌ＞に溶解させ。

Ｎ−ブロモコハク酸イミド（１，２ｍｍｏｌ）で処理する。その溶液を、　１６ 時間室温で放置する。溶媒を減圧下で除去した後。

その生成物を、水およびメタノール（またはトリフルオロエタノール）混合液を 用い、０１８逆相シリカゲルのクロマトグラフィーにより精製する。

８．４．　Ｎ−ヒｔ−ＢＯＣのｉ、制 認識部分の環外のアミノ基をアシル化するためのこの一般的な手法もまた。アデ ノシン誘導体の保護に適用される。

前段で得られるシトシンｔ−ＢＯＣ酸（Ｉ　ｎ＋ｌＩ＋ｏｌ）をＮ−メチルイミ ダゾールあるいはピリジン（５ｍＬ）に溶解させて、クロロトリメチルシラン（ ５ｍｍｏｌ）で処理する。室温で１５分間保持した後、その溶液を２−（４−ニ トロフェニル）エチルクロロフオーメー）　３ｍｍｏｌ　（Ｆ、　Ｈｉｍｍｅｌ ｓｂａｃｈおよびＷ、　Ｐｆｌｅｉｄｅｒｅｒ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅ ｔｔ　（１９８３）　２４　：　３５８３　）の方法により得られる）で処理す る。その反応液を室温で８時間保持し９次に水浴で冷却し、そして水（１ｍＬ） を加えた。５分後、濃アンモニア１ｍＬを加えて、混合物を室温で１５分間攪拌 する。その反応液を次に、エバポレート・乾固し、その残渣を水に溶解させる。

その溶液を２Ｍ塩酸で酸性にして、クロロホルムで抽出する。合併した有機抽出 物を硫酸ナトリウムで乾燥し。

減圧下でエバポレートする。その残渣をクロロホルム中メタノール勾配（５〜５ ０％）を用いてシリカクロマトグラフィーにより精製する。

グアニンおよび２，６−シアミツプリン誘導体の保護のために、上の操作を改変 し１反応をピリジン中で行い、アシル化試薬を９−フルオレニルメチルクロロフ ォーメイトとした。

叉施開ニ プリンおよびピリミジンアミノ　の舌。１次の手法は、すべての誘導体に適用さ れる。それはｔ−ＢＯＣ基を取り除き、バンクボーンの第一アミノ基をフリーに する。

ｔ−ＢＯＣ酸（１ｍｍｏｌ）を２０％のトリフルオロ酢酸を含むメチレンクロラ イド５ｍＬに溶解させ、室温で３０分間攪拌した。トルエン（３ｍＬ）を加え、 溶媒を減圧下でエバポレートすると。

アミノ酸トリフルオロ酢酸塩が得られる。これを直接、カップリング反応に用い る。

災施±旦 アキラルな非環゛ポリヌクレオチド　゛　のｔ立てのためのサブユニットの調１ １ １０．１シチジン頻り　の８゜制 水素化ホウ素リチウム、ジーｔｅｒ　ｔ−ブチルジカーボネートおよびビス（ト リフェニルホスフィン）パラジウム■クロライドは、　Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅ ｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、　Ｗｌ、から得た。

２−アミノ−５−ブロモピリミジンは、　Ｔ、　ＮｉＮ１５ｈｉｋａ　（Ｃｈｅ ＋＋＋。

Ｐｈａｒｍ、　Ｂｕｌｌ、９　：　３８　（１９６１）　）の方法により調製さ れる。

２−アミノ−５−ブロモピリミジンは、ベンゾイルクロライドを用いる実施例２ の一般的手法により、環外のアミノ基がベンゾイル化される。生成物のベンズア ミド（２５＋ｎｍｏｌ）を。

トリエチルアミン（１０ｍＬ）　、ベンゼン（１０ｍＬ）およびビス（トリフェ ニルホスフィン）パラジウム■クロライド（０，３７５ｍａ＋ｏｌ）を含む４５ ｍＬの耐圧容器に加える。その容器にアルゴンを吹き込み、密閉し、そして、− 酸化炭素で６００ｐｓ　ｉに加圧し９次に、水素で１２００ｐｓｉにまで加圧す る。攪拌しながらその反応容器を油浴中１４５℃に加熱する。気体の吸収がすべ て終わった後、その反応物を冷却し、気体をゆっくりと排気する。無水エーテル の添加後、その反応混合物を濾過し真空下でエバポレートする。次に、その生成 物を、メチレンクロライド中イソプロパツール勾配（０〜２０％）を用いて、シ リカゲルクロマトグラフィーで単離した。

前段で得られる２−ベンズアミドピリミジン−５−カルボキシアルデヒド（１ｍ ｍｏｌ）をエタノール（５ｍＬ）に溶解させ。

４−アミノ酪酸（１ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（１ｍｍｏりで処理する 。１時間攪拌後、その混合物を１０％パラジウム−炭（１００■）を用いて３０ ｐｓ　ｉで水素化する。水素の吸収が終わった後、その反応液を濾過し、溶媒を 減圧下で除去する。

その残渣を０℃にてアンモニアで飽和したメタノールに溶解させ、室温で１０時 間攪拌する。溶媒をエバポレートした後。

その残渣を酢酸アンモニウム（０，２Ｍ　）でｐＨ７に緩衝化したメタノール− 水混合液を用い、ｃ１８シリカゲルのクロマトグラフィーにより精製する。

前段で得られるアミノ酸（１ｍｍｏｌ）をジーｔｅｒｔ−ブチルジカーボネート （１ｍｍｏｌ）を含むエタノール（３ｍＬ）に溶解させる。トリエチルアミン（ １，５ｏ＋ｍｏｌ）を室温でゆっくりと加える。二酸化炭素の発生が終わった後 、その溶媒を真空下で除去し、そして残渣を直接次の反応に用いる。

前段で得られるｔ−ＢＯＣアミノ酸の環外のアミノ基を、　２−（フェニルスル ホニルーエトキシカルポニルクロライドヲ用いる実施例２の一般的手法により、 アシル化する。その生成物は、クロロホルム中メタノール勾配（０〜５０％）を 用い。

シリカゲルクロマトグラフィーによって精製され得る。

前段で得られる２−（フェニルスルホニル）−エトキシカルボニル−保護化ＢＯ Ｃアミノ酸を、実施例１１．３および１１．４中の手法により、　ｐ−ニトロフ ェニルまたはＮ−ヒドロキシサヘ クシイミドイル−活性エステルへ変換した。

１０．２．ウリジ］物ノテ、倦１１ ６−ヒドロキシニコチン酸エチルを、　Ｈ，Ｇａｕｌｔ、　Ｊ、　Ｇ１１ｂｅｒ ｔ。

およびり、　Ｂｒ１ａｕｃｏｕｒｔ　（Ｃ，Ｒ，Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　Ｐａ ｒｉｓ、　Ｓｅｔ、　Ｃ。

２６６　：　１３１　（１９６８））の方法により調製する。水素化ホウ素リチ ウムはＡｌｄｒｉｃｈから得られる。二酸化マンガンは、　Ｖｅｒｅｓｈｃｈａ −ｇｉｎら（Ｚｈｕｒｎａｌ　Ａｒ　ａｎｉｃｈｅｓｋｏｉ　Ｋｈｉｍｉｌ、　 ８　：　１１２９　（１９７２）　）の方法により調製する。Ｄｏｗｅｘ樹脂は 、Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ。

Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、　ＣＡから得られる。

６−ヒドロキシニコチン酸エチル（４９ｍｍｏｌ　）のテトラヒドロフラン（１ ０ｍＬ）溶液を、窒素雰囲気下、室温で水素化ホウ素リチウム（１００ｍｍｏｌ ）のテトラヒドロフラン（ＴＨＦ　）　（７５１１１）　懸濁液へ滴下する。こ の粘性の混合物を２５℃で１６時間攪拌する。次に、２０％酢酸６ｏ−を、冷却 したその懸濁液に加える。ＴＨＦを減圧下でエバポレートし、残留した水性溶液 を。

リチウムイオンを取り除（ために、イオン交換カラム（Ｄｏｗｅｘ−５０Ｗ−Ｘ ８）にかける。カラムを注意深＜　２５０ｍＬの水で洗浄し。

次にエバポレートする。メタノールと共に繰り返しエバポレートすることによっ て、得られた残渣からホウ酸が除去される。生成物を減圧下で蒸留することによ り精製する。

前段で調製されたベンジリックアルコール（６６ｍｍｏｌ）をエーテル（２５０ ｍＬ）に溶解させ、二酸化マンガン（５４ｇ）のエーテル（１００ｍｆ）スラリ ーで、ゆっくりと処理（発熱を伴う）する。室温で１２時間保持した後、その混 合物を濾過し、減圧下で溶媒を除去し、その残渣を真空で蒸留すると、６−ヒト ロキシニコチンアルデヒドを得る。

前段で得られるアルデヒドを、実施例１１．１のシチジン類似物の調製と同様に 、　４−アミノ酪酸と反応させる。

前段で得られるアミノ酸を、実施例１０．１のシチジン類似物の調製と同様に、 対応するＢＯＣ−誘導体へ変換した。

前段で得られるＢＯＣ−アミノ酸は、実施例１１．３および１１．４中の手法に より、　ｐ−ニトロフェニルまたは、　Ｎ−ヒドロキシサクシイミドイル活性エ ステルへ変換する。

大庭且Ｕ ５”−−ヒ、３’　−’ｒ　ヒ２゛−デオキシヌクレオシドのｉ０制御、１．２ ’−デオキシヌクレオシド５°−Ｏ−ジメトキシトリチ上誘導生 ２゛−デオキシヌクレオシド５゛−〇−ジメトキシトリチル誘導体の調製には９ 次の手法が一般的である。

Ｎ−２９−フルオレニルメトキシカルボニル−２゛−デオキシグアノシン（１ｍ ｍｏｌ）を無水ピリジン（２ｍＬ）に溶解させ。

０℃に保つ。ジメトキシトリチルクロリド（１，２ｍｍｏｌ）を０．１５ｍｍｏ ｌずつ８時間にわたり添加する。さらに２時間後、メタノール（０，５ｍＬ）を 加え、溶液を減圧下で濃縮する。残渣を重炭酸ナトリウム（２ｍＬ、０．５％） および塩化メチレン（５ｍＬ）の混合液で処理する。

水層を塩化メチレン（２Ｘ５ｍＬ）で抽出し２合併した有機層を硫酸ナトリウム で乾燥し、エバポレートする。残渣をトルエンとともに数回エバポレートし、生 成物を塩化メチレン中メタノール勾配（０〜１０％）を用い、シリカゲルクロマ トグラフィーで精製する。

５°−０−ジメトキシトリチル−２−デオキシシチジン３′−〇−（４−ニトロ フェニル）カーボネートの調製法は、　４−ニトロフェニルカーボネートの一般 的調製法である以下の操作法の中に記載されている。ビス（４−ニトロフェニル ）カーボネートおよびＮ、Ｎ−ジメチルアミノピリジンはＳｉｇｍａより得られ る。

５“−〇−ジメトキシトリチルーＮ−２−（４−ニトロフェニル）−エトキシカ ルボニル−２゛−デオキシシチジン（１ｍｍｏｌ）を、無水ジメチルホルムアミ ド（５ｍＬ）に室温で溶解させ。

ビス（４−ニトロフェニル）カーボネー）　（２ｍｍｏｌ）で処理し１次に、減 圧下でエバポレートする。残渣をジメチルホルムアミド（５ｍＬ）に溶解させ、 Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノピリジン（０，１ｍｍｏｌ）を加える。黄色の溶液をエ バポレートし、１時間反応させる。反応混合物をクロロホルム（１０ｍＬ）に溶 かし、塩酸水溶液（５ｍＬ、０．１Ｍ　）で洗浄する。有機層を水酸化ナトリウ ム水溶液（５ｍＬ、０．１Ｍ　）　、水（２ｍＬ）で２度洗浄し、硫酸ナトリウ ムで乾燥し、エバポレートする。残渣をシリカゲルカラムにかけ、クロロホルム 中イソプロパツール勾配（０〜１０％）で溶離させる。生成物を含む分画を集め 。

エバポレートし、クロロホルム（１０ｍＬ）に溶かし、痕跡量の４−二トロフェ ノールを除くために水酸化ナトリウム水溶液での洗浄を繰り返す。この有機層を 水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥しエバポレートする。生成物は、ＴＬＣによ れば均一であり、三量化カーボネートの調製に直接用いられる。

ＦＭＯＣ５を含むヌクレオシドのカーボネートの調製には、　Ｎ、Ｎ−ジメチル アミノピリジンよりもむしろ、　Ｎ−メチルイミダシームを触媒として使用する のが時として優れている。

１１．３．　Ｎ−催ヒｔ−ＢＯＣ−ニトロフェニルエステルサブユニット結合用 の活性化エステルは、以下の２つの操作法により調製される。これは、すべての ｔ−Ｂｏｃａ＝導体において一般的なものである。

実施例８．４．で得られるｔ−ＢＯＣ酸の０．２〜０．５Ｍ酢酸エチル（または 塩化メチレン）溶液にｐ−二トロフェノールを約２０％過剰量だけ加える。０° Ｃにおいて、ジシクロへキシルカルボジイミドを計算量だけその溶液に加える。

０．５時間後、混合物を室温にもどし、１時間保持する。分離したジシクロヘキ シル尿素を濾過し、溶媒で洗う。濾液と洗浄液とを合併し。

減圧下でエバポレートし乾固する。このエステルはカップリング反応に直接使用 され得る。または、シリカの短いカラムされ得る。

実施例８．４．で得られるｔ−ＢＯＣ酸（１ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（５ｍ Ｌ）？容液に、ピリジン（１ｍｍｏｌ）およびＮ、　Ｎ’−ジスクシイミジルカ ーボネートロｍｍｏｌ）を加える。この溶液を室温で３時間攪拌する。溶媒を減 圧下で除き、残渣をクロロホルムに溶解する。有機相を０．１Ｍ　ＨＣＩおよび 水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、エバポレートして乾固する。このエステ ルは、直接使用し得るだけ充分に純粋なものである。

（以下余白） スｌ糺Ｕ カーボネートノ　ヨサフ゛ユニットｌ七人の？、シチジニルー（３’−５’）− シチジンカーボネートの調製法は９次の操作法の中で記載されている。これは、 カーボネート分子間サブユニットの形成およびオリゴカーボネートの脱保護にお いて一般的な操作法である。塩基を保護している基は、２−（４−ニトロフェニ ル）エトキシカルボニル、２−（フェニルスルホニル）エトキシカルボニル、ま たはＦＭＯＣでなければならないことに注意されたい。ｔｅｒ　ｔ−ブチルジメ チルシリルクロライドはＡｌｄｒｉｃｈから得られる。

１２．１　２°−デオキシヌクレオシド３′−〇−ｔｅｒｔ−プチルジメチルシ リルチ１　の計制 ３’　−０−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−Ｎ−２−（４−ニトロフェニル ）エトキシカルボニル−２゛−デオキシシチジンの調製法を以下に示す。これは 、２”−デオキシヌクレオシド−３’　−０−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル 銹導体の調製のための一般的操作法である。

乾燥ジメチルホルムアミドまたはテトラヒドロフラン１０ｍＬに５゛−０−ジメ トキシトリチル−Ｎ４（４−ニトロフェニル）−エトキシカルボニル−２゛−デ オキシシチジン（１ｍｍｏｌ）とイミダゾール（３，５ｍｍｏｌ）とを溶かした 溶液に、攪拌しなからｔｅｒ　ｔ−ブチルジメチルシリルクロライド（３ｍｍｏ ｌ）の乾燥叶Ｆ　（１０ｍＬ）溶液を滴下する。反応液を１時間攪拌した後。

氷で反応を止め、塩化メチレンで抽出する。水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥 する。有ｆｌＡＮを減圧下でエバポレート乾固し、シリカゲルクロマトグラフィ ーで塩化メチレンを溶離剤として精製する。

前段で得られる５°−〇−ジメトキシトリチル誘導体（１ｍｍｏｌ）の塩化メチ レン（５ｍｍｏｌ）溶液に、臭化亜鉛のメタノール（１５％ｖ／ｖ）含有塩化メ チレン（１０ｍＬ、ＬＭ　）　溶液を加える。反応混合物を３０分間攪拌し、氷 で反応を止め、塩化メチレンで抽出する。有機層を水で洗浄し、硫酸ナトリウム で乾燥し。

減圧下でエバポレート乾固する。生成物を、塩化メチレン中メタノール勾配（０ 〜１０％）を用いシリカゲルクロマトグラフィーで精製する。

５’　−０−ジメトキシトリチル−Ｎ−２−（４−ニトロフェニル）エトキシカ ルボニル−２”−デオキシシチジン−３’　−０−（４−ニトロフェニル）カー ボネート（１，５ｍｍｏｌ）および３゛−０−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル −Ｎ−４−（４−ニトロフェニル）エトキシカルボニル−２゛−デオキシシチジ ン（１ｍ＋ｎｏｌ）をジメチルホルムアミド（５ｍＬ）に溶かし、減圧下で溶媒 を除去する。これを２度繰り返す。残渣を再びジメチルホルムアミド（５ｍＬ） に溶かし、　Ｎ、　Ｎ’−ジメチルアミノピリジン（０，５ｍｍｏｌ）またはＮ −メチルイミダゾール（１ｍｍｏｌ）で処理する。溶媒を減圧下でエバポレート することにより除去し。

反応物を室温にて終夜放置する。残渣をクロロホルム（２０ｍＬ）に溶かし、　 ＨＣＩ水溶液（２ｍＬ、　０．１Ｍ）　、水（２ｍＬ）　、　ＮａＯＨナトリウ ム水溶液（２Ｘ　２ｍＬ、　０．２１１）　、水（２ｍＬ）で洗浄し。

有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、エバボレートする。この残漬を、クロロホル ム中イソプロパツール勾配（０〜３０％）を用いてシリカゲルで精製する。単離 した生成物は、ＴＬＣ（および４００ＭＨｚのＮＭＲにおいて均一である。

残渣を、　Ｂ、　Ｌ、　ＧａｆｆｎｅｙおよびＲ，Ａ、　Ｊｏｎｅｓ　（Ｔｅｔ ｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ　（１９８２）　２３　：　２２５７　）の記述に従 い、針旺／１１１　ｔｅｒｔ　−ブチルアンモニウムフルオライド（ＴＢＡＦ） 試薬を用いて脱シリル化する。この２Ｍ　ＢＦ／１９　ｔｅｒｔ−ブチルアンモ ニウムフルオライドを含むピリジン（ＴＢＡＦ　１ｍｍｏｌ）に、前段で得られ る脱保護化ヌクレオシドを加える。２４時間攪拌後１反応液を塩化メチレンと重 炭酸ナトリウム水溶液との間で分配する。その有機層を水洗し、硫酸ナトリウム で乾燥し、エバボレートし乾固する。残渣を塩化メチレン中メタノール勾配（５ 〜２５％）を用い、シリカクロマトグラフィーで精製する。

３′−ヒドロキシジヌクレオシドカーボネートを、実施例１１の方法により３’ −（４−ニトロフェニ７ＬＡ）−カーボネートに変換する。これらの誘導体は、 ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオシドカーボネートの５゛−水酸基と反応し、 より高級のオリゴヌクレオシドカーボネートが調製され得る。

ス見±Ｕ カーバメート＼　日すブユニット濾へのヅビス（ｐ−ニトロフェニル）カーボネ ート、ｐ−アニソイルジフェニルメチルクロライド、　Ｎ、　Ｎ−ジメチルアニ リン（ＤＭＡ）　、およびトリエチルアミンは、　Ａｌｄｒｉ（，１１（ｈｅｍ ｉｃａｌ　Ｃｏ、で得られる。

上記実施例３で調製される目的とする５゛−アミノ−２゛、５”−ジデオキシリ ボヌクレオシド（必要に応じて塩基の保護のためにアセチル基またはベンゾイル 基を使用する）を、ピリジン中でｐ−アニソイルジフェニルメチルクロライド（ １，２ｍｍｏｌ）と処理する。１２時間後、溶媒をエバボレートし、残渣を再び クロロホルムに溶解させる。この溶液をＮａＨＣＯ，水溶液と水とで各々１回洗 浄し、　ＮａｚＳＯ４で乾燥する。溶媒をエバボレートシ、残渣をシリカゲルク ロマトグラフィーにかけてクロロホルム／メタノ−シフ１％トリエチルアミン混 合液で溶出させる。

５゛−トリチル化アミノヌクレオシド（１ｍｍｏりをＤＭＦから２度エバポレー トする。次に、溶媒としてＤＭＦを使用し、トリエチルアミン（またはＮ、　Ｎ −ジメチルアミノピリジン、またはＮ−メチルイミダゾール）の触媒量の存在下 でビス（ｐ　−ニトロフェニル）カーポネー）　（２ｍｍｏｌ）と処理する。３ 時間後、溶媒をエバポレートシ、残渣をクロロホルムに溶解させる。この溶液を ０．０ＩＮ水酸化ナトリウム水溶液で２度洗浄し、水で１度洗浄し２次いで％ａ ２ＳＯ，で乾燥する。この溶媒をロータリーエバポレーターで除去する。残渣を シリカゲルクロマトグラフィーにかけ、まず、クロロホルム１０．１％ＤＭＡ混 合液で溶出させ１次いで、クロロホルム／メタノール１０．１％ＤｉＡ溶媒系で 溶離させる。適当な分画を集め、エバボレート・乾固させる。残渣を最小量のＴ ＨＦに溶かし、この溶液を濾過して集め、真空下で乾燥する。

目的とする５゛−アミノヌクレオシド（１，１ｍｍｏｌ）は、上記実施例３のよ うに、　Ｄ！ＩＦで２度エバポレートする。活性化ヌクレオシド（１ｍｍｏｌ） を反応器に加え、固形物をＤＭＦに溶解させる。溶液を小容量に濃縮し、−晩装 置する。溶媒を真空下で完全に除去し、残渣をクロロホルムに溶解させる。この 溶液を０．０ＩＮ水酸化ナトリウム水溶液で２度洗浄し、水で１度洗浄し２次に 、固体の硫酸ナトリウムで乾燥する。溶媒をロータリーエバポレーターで除去し 、残渣をシリカゲルのクロマトグラフィーにかけ、適当なメタノール／クロロホ ルム７１％トリエチルアミン溶媒系で溶出する。二量体のヌクレオシドを含む分 画を合併し、エバボレート・乾固する。残渣を最小量のＴＨＦに溶解し、この溶 液をヘキサンに加える。沈澱物を集め、真空下で乾燥させる。

大庭拠旦 チオカーバメートサブユニット日′入の３ｆＮ、　Ｎ−ジメチルアミノピリジン （ＤＭＡＰ）は、　Ａｌｄｒｉｃｈ　ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ、で購入する。

実施例３で調製した５゛−アミノヌクレオシドのサブユニット間結合のチオカル バメートの生成は、上記の実施例１３に記載したのと同様の方法で行なわれる。

操作法において異なる点は次のとおりである。用いられた５″−アミノヌクレオ シドは塩基保護部分として、２−（フェニルスルホニル）エトキ用）または９− ＦＭＯＣ（グアノシンおよび２．６−シアミツ−２°−ジオキシリポミド用）基 を有する。これらの分子の調製法は上記（実施例３）に記載されている。５”− トリチルアミノヌクレオシド（ｌ　ｍｍｏｌ）の活性化は、　ＤＭＦ中、トリエ チルアミン（２ｍａ＋ｏｌ）およびＤＭＡＰ　（触媒量）の存在下でｐ−ニトロ フェニルクロロチオフォーメート（Ｍｏｎａｔｓｂｅｒ　Ｄｅｕｔ　Ａｋａｄ　 ＷｉｓｓＢｅｒｌｉｎ　（１９６４）　６　：　８９７のＧ　Ｈｉｌｇｅｔａｇ およびｒ、　Ｐｈ１ｌｌｉｐｐｓｏｎの方法により調製）によりなされる。カッ プリングステップでは、この活性化モノマー（１ｍｍｏｌ）と所望の５゛−アミ ノヌクレオシド（１，１ｍｍｏｌ）とを用いる。触媒としてはＤ？ＩＡＰまたは Ｎ−メチルイミダゾールを、そして、溶媒としてはＤＭＦを使用する。このステ ップでの水性の処理物において、　０．０ＩＮ水酸化ナトリウム水溶液による洗 浄は省き水で洗浄を行う。

Ｎ−メチルイミダゾールはＡｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅ＋ｎ１ｃａｌ　Ｃｏ、から購 入する。

実施例５で調製した目的とする乾燥Ｎ゛−保護化、５゛−フリーアルコールモル フォリン型のヌクレオシド（必要に応じて塩基保護のためにアセチル基またはベ ンゾイル基を使用）を。

無水条件下でＤＭＦ中のビス−（ｐ−ニトロフェニル）カーボネートおよびトリ エチルアミン（またはＤＭＡＰまたはＮ−メチルイミダゾール）（触媒量）で処 理する。この溶液を３時間撹拌し１次にエバボレートし乾固する。残渣をクロロ ホルムに溶かし、その溶液を０．０ＩＮ水酸化ナトリウム水溶液で２度、水で１ 度洗浄し１次にＮａ２ＳＯ２で乾燥する。溶媒をロータリーエバポレーターで除 去し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィーにかけ、適当なりロロホルム／イソ プロパツール７０．１％ＤＨＡ混合液で溶出する。目的とする活性化ヌクレオシ ドを含む分画をあわせて、エバボレートし、得られた固形物を最小量のＴＨＦに 溶解させる。このＴＨＦ溶液を過剰量のヘキサンに加え、得られた沈澱物を採取 して乾燥する。

ＤＭＦで２度エバポレートした後、目的とする５゛−フリーヒドロキシ　Ｎｌ− フリーモルフォリン型ヌクレオシド（この実施例の中で挙げたのと同一の塩基保 護基を使用）　（１，１ｍｍｏｌ）ヲ、５’−（ｐ−ニトロフェノキシカルボニ ル）モルフォリンサブユニッ）　（１ｍｍｏｌ）のＤＭＦ溶液で処理する。反応 溶液の容量を真空下で減じ、小容量とする。必要であれば、Ｎ−メチルイミダゾ ールまたはトルエチルアミンを触媒量反応容器中へ加える。得られた溶液を室温 で終夜放置する。残留した溶媒をエバボレートし、残渣をクロロホルムに溶かす 。クロロホルム溶液を０．０ＩＮ水酸化ナトリウム水溶液で２度、水で１度洗浄 し、そしてＮａ２ＳＯ２で乾燥する。この溶媒をロータリーエバポレーターで除 去し、残渣でシリカゲルクロマトグラフィーにかけ、クロロホルム／メタノール の混合溶媒で溶出させる。目的とするダイマーを含む分画をあわせ、エバポレー ト乾固する。残渣を最小量のＴ旺に溶かし、この溶液を過剰量のヘキサンに加え る。沈澱物を集め、真空下で乾燥する。

チオカーバメート部分により結合したモルフォリンサブユニットは、上記この実 施例に関連して１次のように操作を変更して調製する。塩基の保護基は、１−（ フェニルスルホニ。

ル）エトキシカルボニル基（デオキシシチジンおよびデオキシアデノシン用）、 または９−ＦＭＯＣ基（デオキシグアノシンおよび２，６−ジアミツー２゛−デ オキシリボシド用）である。

これらの分子の調製は、上記（実施例５）に記載されている。

Ｎ−保護化モルフォリンヌクレオシド（１ｍｍｏｌ）は、　ＤＭＦ中で、トリエ チルアミン（２ｍｍｏｌ）とＤＭＡＰまたはＮ−メチルイミダゾール（触媒量） との存在下、ｐ−ニトロフェニルクロロチオフォーメート（１，２ｍｍｏｌ）で 活性化される。カップリングステップには、この活性モノマー（１ｍｍｏｌ）お よび所望のＮ′−フリーモルフォリンヌクレオシド（１，１ｍｍｏｌ）を用いる 。触媒としてＤＭＡＰまたはＮ−メチルイミダゾールを、そして、溶媒としてＤ ＭＦを用い、溶液を３５〜４０℃に加温して行う。

これらのステップの水性の処理物においては、　０．ＯＩＮ　ＮａＯＨ水溶液に よる洗浄を省き、水で洗浄する方法を採用する。

ス見侃用 エステルサブユニット　人の８１．剖 Ｎ、　Ｎ−ジメチルアミノピリジンおよびＮ−メチルイミダゾールはＡｌｄｒｉ ｃｈから得られる。

２つのサブユニー／　）の結合は、５”−Ｎ、　Ｎ−アセトアミド−３”−ヒド ロキシ誘導体と３′−シリル化−５゛−活性化エステルとの反応により行う。こ れらは実施例６と同様に調製される。

その試薬（各１ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミドと数回にわたり共にエバボレ ートし９次に、ジメチルホルムアミド（５ｍＬ）に溶かし、　Ｎ、　Ｎ−ジメチ ルアミノピリジン（０，２ｍｍｏｌ）またはＮ−メチルイミダゾール（１ｍｍｏ ｌ）で処理する。溶媒を減圧下で除き９反応物を室温で２時間放置する。残渣を クロロホルムに溶かし、希ＨＣＩ、水で洗浄し、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥 し、そして、溶媒を減圧下でエバボレートする。

残渣をクロロホルム中メタノール勾配を用いてシリカゲルクロマトグラフィーに より精製する。

その鎖は実施例６のように脱シリル化し、そして、前段に示すように得られた３ ゛−フリーヒドロキシ化合物を活性化エステルで処理することにより伸長させて もよい。

尖施拠Ｕ ｔ−ＢＯＣアミド七人ダイマーのノ 完全に保護されたｔ−ＢＯＣＮ−ヒドロキシスフシイミドイルエステルまたはｐ −ニトロフェニルエステル（１ｍｍｏｌ）　ヲ。

実施例１１．３および１１．４に従って調製し、乾燥ジメチルホルムアミドで数 回、共にエバボレートし乾燥させる。実施例９で調製した保護化アミノ酸トリフ ルオロ酢酸塩（１ｍｍｏｌ）を同様に処理する。この２つの成分を、別々に乾燥 ジメチルホルムアミド（２ｍＬ）に溶解させ、混合し、そして、ジイソプロピル エチルアミン（１，０ｍｍｏｌ）で処理する。この溶液を室温で１時間攪拌し１ 次に溶媒を減圧下でエバボレートすることにより除去する。この残渣をクロロホ ルムに溶解させ、希塩酸で洗浄する。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下 でエバボレート・乾固する。この残渣をクロロホルム中メタノール勾配（１５〜 ５０％）を用いてシリカゲルクロマトグラフィーにより精製する。ｔ−ＢＯＣダ イマー酸を水−メタノール（トリフルオロエタノール）混合液を用いてＣ１８逆 相クロマトグラフィーにより精製することもできる。

１７．１　ｔ−ＢＯＣダイマー活・　ヒエステルの円側前段で得られた酸を、実 施例１１．３および１１．４の一般的手法を用いてＮ−ヒドロキシスフシイミド イルエステルまたはｐ−ニトロフェニルエステルに変換スる。

１７．２　ｔ−ＢＯＣ゛イマーアミノ休ト１体ルオロ−馳口のＬ―″実施例９の 一般的操作法により　ｔ−ＢＯＣダイマー酸をトリフルオロ酢酸塩で処理する。

１７．３　ｔ−ＢＯＣテトラマー枳の８゜制ｔ−ＢＯＣダイマー活性化エステル およびダイマー酸トリフルオロ酢酸塩を一般的操作法により結合させ、　ｔ−Ｂ ＯＣテトラマー酸を得る。精製については、Ｃ１８逆相シリカゲルクロマトグラ フィーで、水およびメタノール（またはトリフルオロエタノール）混合液をトリ エチルアンモニウムアセテートによりｐ）ｌを７．０に調整したものを用いて溶 出させる方法が、最も効果的である。このようにして、活性化エステルとフリー のアミン成分とを結合させることによりどのような長さの鎖も調製され得る。

叉五拠用 ８−サブユニフトカーポネート結人ポリマーのＩ　・祖み）よ りＥＡＥセルロースはＳｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、から購入する。調 製ＴＬＣプレートはＥＭ　５ｃｉｅｎｃｅの製品であり、　ＶＷＲ５ｃｉｅｎｔ ｉｆｉｃから購入する。）ＩＰＬＣ装置、カラムおよび供給装置は、　Ｂｅｃｋ ｍａｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、　Ｉｎｃ、で得られる。

実施例１２に記載した方法で調製した所望のカーバメート結合ダイマー（０，２ ｍｍｏｌ）を、メタノール／ＴＨＦ　／氷酢酸（１：１：１）の混合液４ｍＬで 室温にて１２時間で処理する。溶媒を真空下で除き、残渣を最小量のＴＨＦに溶 解させる。このＴｔｌＦ溶液を大容量のヘキサンに加え、得られた沈澱物を採取 し乾燥する。この酢酸塩をＴ）ＩＰ　／エタノール（４／１）混合物に溶解させ 、　ＤＥＡＥセルロース（塩基０．８ｍｍｏｌ）をこの容器に加える。２０分間 攪拌後、不均一な混合物を濾過し、濾液をエバボレート・乾固する。残渣を最小 量のＴＩ（Ｆ　／エタノール（４：１）に溶かし、この溶液をヘキサンに加える 。固形物を採取し乾燥する。沈澱操作をもう一度繰りかえす。

所望のＮ　５゛）リチルダイマー（０，１ｍｍｏｌ）　（実施例１２で調製され る）をＤＭＦで２度エバポレートし１次いで、　ＤＭＦを溶媒とし、トリエチル アミン（またはＤＭＡＰまたはＮ−メチルイミダゾール）（触媒量）の存在下で 、ビス（ｐ−ニトロフェニル）カーボーネート（２ｍｍｏｌ）で処理する。３時 間後、溶媒をエバボレートし、残渣をクロロホルムに溶解させる。この溶液を０ ．ＯＩＮ水酸化ナトリウム水溶液で２度、水で１度洗浄し２次に、　Ｎａ２５Ｏ ａで乾燥する。溶媒をロータリーエバポレーターで除去し、残渣をシリカゲルク ロマトグラフィーにかけ、クロロホルム／イソプロパツールまたはメタノール１ ０・１％ＤＭＡ混合液で溶出させる。適当な分画を合併し、エバボレート・乾固 する。この残渣を最小量のＴ）ＩＦに溶解させ、そしてこの溶液を過剰量のへキ サンに加える。沈澱した活性化ダイマーを濾過して集め、真空下で乾燥させる。

上言己調製した５′−アミノダイマーヌクレオシド（０，１１ｍｍｏｌ）をＤＭ Ｆで２度エバボレートする。この活性化ダイマー（０、１ｍｍｏ　１　）を反応 容器に加え、固形物をＤｌ’ｌＦに溶解させる。溶液を小容量に濃縮し、終夜放 置する。溶媒を真空下で完全に除去し。

得られた残渣をクロロホルムに溶解させる。この溶液を０．０１Ｎ水酸化ナトリ ウム水溶液で２度、水で１度洗浄し２次に硫酸ナトリウムで乾燥する。溶媒をロ ータリーエバポレーターで除去し、残渣を調製几Ｃプレートにかけて適当なメタ ノール／クロロホルム／１％トリエチルアミン溶媒系で溶出させる。テトラマー ヌクレオシドを含むバンドを溶離させ、溶媒をエバボレートする。残渣を最小量 のＴＨＦに溶かし、この溶液をヘキサンに加える。沈澱を集め真空下で乾燥させ る。

この実施例の中で挙げた操作法を用い１次のような転換を行う。所望のＮ５”− トリチルエトラマーヌクレオシド（０，０６ｍｍｏｌ）を９丁ＨＦ／メタノール ／氷酢ｈ　（１／　１　／　１　）で処理し精製して５゛−アミノテトラマーヌ クレオシド（０，０５ｍｍｏｌ）を得る。他のＮ−５’−）リチルテトラマーヌ クレオシド（０，０５ｍｍｏｌ）をビス（ｐ−ニトロフェニル）カーボーネート で活性化し２次いで精製する。この２つのテトラマーを結合させ。

処理し、さらに調製ＴＬＣプレートまたは）ＩＰＬｃクロマトグラフィーにより 精製する。クロマトグラフィーで得られる物質を固形物として単離し、最小量の ＴＨＦにとかし、ヘキサンにより沈澱させる。そのオクタマー（８量体）ヌクレ オシドを集め、乾燥させる。

オクタマーを以下で使用するために１次のように形成する。

Ｎ−５’−１−リチルオクタマーヌクレオシドをＴＨＦ／メタノール／氷酢ｅ　 （１／　１　／　１　）で処理し５上に挙げた条件で精製する。５゛−アミノオ クタマーヌクレオシド（０，０１ｍｍｏｌ）をピリジン中無水コハクａ　（０， ０２ｍｍｏｌ）で室温にて２時間処理する。溶媒をロータリーエバポレーターで 除去し、残渣をエタノールで数回エバポレートする。残渣をＴＨＦ／エタノール （３／１）に熔かし、ヘキサン／ベンゼン混合液（２／１）に加える。固形物を 集め乾燥させる。Ｎ−５゛−スクシニル化オクタマーヌクレオシド（０，０１ｍ ｍｏ＋）をピリジン／濃アンモニア（１／１）（１ｍＬ）で処理する。終夜放置 後、溶媒をロータリーエバポレーターで除去し、残渣をエタノールで数回エバボ レートする。粗固形物を逆相（ＲＰ−１８）　ＨＰＬＣを用い精製する。溶出物 をエバポレートシ、残渣をＤＭＳＯに加え、ヘキサン／ベンゼン（１／１）溶液 で沈澱させる。固形物を採取し、乾燥させる。

ヌ新１引１ 長鎖アルキルアミン誘導体化制御細孔グラス（Ｃａｔ、　Ｎｃｉ２４８７．ｉ） は、　Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、から得られる。２，２−スルホ ニルジェタノールおよびジシクロヘキシルカルボジイミドＣｈｅｍｉｃａｌ　Ｃ ｏ．から得られる。

グラス担体のアミノ基（担体１ｇあたり約４０ｍｍｏｌ）を、実質的にＭａｔｔ ｅｕｃｃｉおよびＣａｒｕｔｈｅｒｓ（Ｊ　Ａｍｅｒ　Ｃｈｅｍ　Ｓｏｃ（１９ ８１）１０３　、　３１８５）の方法により，無水コハク酸と反応させ，フリー のカルボン酸末端を得る。２．２−スルホニルジェタノール（６０重量％水溶液 ）　１／１０ｍｏｌを次のようにして乾燥させる。

まず、３倍容のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）と混合し，温水浴中で真空上濃 縮して濃いシロップとする。次に同容量のＤＭＦを加えて濃縮し，濃いシロップ とし，さらにこの操作をもう１度繰り返す。次に，乾燥り肝を加え，最終的に針 のスルホニルジェタノールを得る。スルホニルジェタノールｌｒｎ１およびジシ クロへキシルカルボジイミド０．２ｇの混合液を，カルボン酸残基をもつ乾燥制 御多孔グラス担体１ｇに加え，スラリーを前後左右に動揺させて（攪拌しない） 室温で終夜混合する。その後，グラス担体をメタノールで充分に洗浄し乾燥する 。

爽施拠別 エイズ（ＡＩＤＳ）ウィルス汎色　にお番る　された配■に、する１４−サフ゛ ユニットカーボーネート士人ポリマーのｕ’古　担　上でのＰｌ・な　立て：＃ ′１サブユニットの・　■おスｌ亘■陣長 Ｎ−メチルイミダゾール、４−　（Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノ）ピリジン（Ｄ！Ｉ ＡＰ）　、および１．８−ジアザビシクロ（５，４，０）ウンデク−７−エン（ ＤＢＵ）は、　Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、で得られる。メチル ｐ−ニトロフェニルカーボーネートは、メチルクロロフォーメートとｐ−二トロ フェノールとから調製される。

実施例４．２で調製される２゛−デオキシシチジン　サブユニット（Ｎ４はｐ− ニトロフェネトキシカルボニル部分を、５′酸素はジ（ｐ−メトキシ）トリチル 部分（ＤＭＴ）を、そして３”酸素はｐ−ニトロフェノキシカルボニル部分を有 する）　（０，１ｍｍｏｌ）を、最小容量の乾燥テトラヒドロフラン（ＴＨＦ　 ’）またはジメチルホルムアミドに溶解させ、実施例１９で調製される充分に乾 燥した制御多孔グラス担体（開裂可能なリンカ−を有する）０．５ｇに加える。

触媒（１ｍｍｏｌ　Ｎ−メチルイミダゾールまたは０．１ｍｍｏｌ　ＤＭＡＰの いずれか）を加え、このスラリーを前後左右に動揺させて（攪拌しない）２時間 にわたり混合する。

次にこのスラリーを濾過し、固形物をＴＩＩＰで洗浄する。

１Ｍのメチルｐ−ニトロフェニルカーボーネートと０．５ｈのＤＭＡＰて混合す る。次にスラリーを濾過し、固形物をＴＨＦで充分にとを含むＴＨＦ　２−を加 えて２０分間室温で混合することにより。

未反応の水酸基をキャップする。その後、グラス担体をＴＩＰで洗浄し、濾過す る。

ジクロロメタンで担体を洗浄して５”末端のジメトキシトリチルを除き２次に、 　０．２Ｍジクロロ酢酸ジクロロメタン溶液５−で室温にて５分間処理する。次 にグラス担体をジクロロメタンで洗い濾過する。

次に５実施例１で調製され実施例２で活性化したサブユニットを同様にして９次 の順序で加える：　Ｇ、Ａ、Ｔ、Ａ、Ａ、Ｃ，Ａ、Ｔ、Ｔ。

Ｔ、Ｔ、Ｔ、Ｃ，（ＧはＦＭＯＣ部分で保護され、ＡおよびＣはｐ−ニトロフェ ネトキシカルボニル部分で保護されている）。

大施拠■ エイズウィルス汎色　における　された配置に、″″る１９−サフ゛ユニットカ ーバメート′吉人ポリマーの８．ＷＩ′−吉　日　上における第１ゴマ−ブロッ クの　１・　み）て：　１サブユニツトの・　ｎおよび言゛′の１０ 実施例３で調製した５”−アミノ−２″、５”−ジデオキシシチジン　サブユニ ット（０，２ｍｍｏｌ）　（ここでＮ４はベンゾイル部分を有し、５゛−アミン は、ｐ−メトキシトリチル部分を有し、３”酸素は、ｐ−ニトロフェノキシカル ボニル部分を有する）を最小量の乾燥ＴＨＦに溶かし、実施例１９で調製した開 裂可能なリンカ−を有する乾燥制御細孔グラス担体０．５ｇに加える。触媒（ｌ 　ｍｍｏｌのＮ−メチルイミダゾールまたはＱ、ｌＩＩｉｍｏｌのＤＭＡＰ）を 加え、このスラリーを前後左右に２時間揺動させ部分で保護されている）を同様 にして１次の順序で加える：洗浄する。

モノ−ｐ−メトキシトリチルをジクロロメタンで洗浄して除き、続いて、０．２ Ｍジクロロ酢酸のジクロロメタン溶液５−で室温にて１分間処理する。次に、担 体をジクロロメタンで洗浄し、濾過する。１％容量のジイソプロピルエチルアミ ンを含むＴＨＦ　３　ｍｆｆで簡単に洗浄し、５′−アミノ末端をフリーのアミ ンに変換する。これをＴ肝で洗浄し、濾過する。

５’　−Ａ　−Ｇ−３’配列をもつ３′−ｐ−ニトロフェノキシカル　゛ボニル ー活性化ダイマー（実施例１３で調製される）　０．１ｍｍｏｌ（グアニンＮ２ は、アセチル部分で保護され、アデニンＮ６はベンゾイルまたはｐ−ニトロベン ゾイル部分で保護されている）を最小量の乾燥ＴＨＦに溶かし、ガラス担体に加 え、混合を２時間にわたり行う　（この反応および次のカンプリングステップに は触媒を加えない）。次に、スラリーをＴＨＦで洗浄し濾過する。

ｐ−ニトロフェニル酢酸２門を含むＴＨＦを２−加えて２０分間室温で混合する ことにより未反応のアミン部分をキャンプする。その後、ガラス担体をＴ肝で洗 い、濾過する。

５゛−末端のモノ−メトキシトリチルを、前述のようにジクロロ酢酸−より除去 する。

実施例１７で調製される活性化２量体サブユニット（ここでシトシンの環外の窒 素はベンゾイル部分で保護されており５Ａの環外の窒素はベンゾイルまたは、ｐ −ニトロベンゾイルＡ−Ｔ、　Ｃ−Ａ、　Ｔ−Ａ、　Ｔ−Ｔ、　Ｔ−Ｔ、　Ａ− Ｃ，Ａ−Ｃ，Ｃ−Ａ　（５’から３゛）。

強い非求核塩基（例えば、ＡおよびＣにはｐ−ニトロフェネトキシカルボニルま たはフェニルスルホニルエトキシカルボニルそしてＧにはＦ！１０Ｃ）により除 去され得る環外の塩基性窒素保護基を存するサブユニットも、上記操作法により ポリマーを組み立てるために使用され得る。しかし、これらのどちらか一方の保 護基を有するポリマーは１通常、水酸化アンモニウムで処理するよりもＤＢｔｉ で処理することによって脱保護される。

ス去ｌ引招 エイズウィルス染色水における　子された配置に、−る１９−サブユニットアミ ド結合ポリマーの円側。古　１旦　上にお番るオリゴマーブロックの　１・組み 立て：′″″１サブユニットの・加および鎖の 実施例１１．３と同様に調製されるシトシン含有卵環状バンクボーンサブユニッ ト（ここで、シトシンのＮ４は２　（ｐ−ニトロフェニル）エトキシカルボニル 部分を有し、バックボーンのアミンはｔ−ブトキシカルボニル部分を有し、そし て。

カルボキシルは、ｐ−ニトロフェニルエステルの形態である）を最小容量の乾燥 Ｔ旺に溶解させる。これを、実施例１９で調製され、開裂可能なリンカ−を有す る乾燥制御細孔グラス担体０．５　ｇに加える。触媒（ｌ　ｍｍｏｌのＮ−メチ ルイミダゾールまたは０．１ｍｍｏｌのＤＭＡＰ　）を加え、担体を２時間にわ たり混合し、濾過し、固形物をＴＨＦで充分に洗浄する。

担体をジクロロメタンで洗浄し、続いて、　２０％のトリフルオロ酢酸を含む塩 化メチレン５−で室温にて３０分間処理することによりｔ−ＢＯＣを除去する。

担体をジクロロメタンで洗浄し、濾過する。担体に結合しているアミノ末端を、 １容量％ジイソプロピルエチルアミンを含むＴＩ（Ｆ　３　ｄで簡単に洗浄しフ リーのアミンに変換し、さらにＴＨＦで洗浄する。

実施例１７で調製される（アミノ末端）　−Ｇ−Ａ　（カルボキシ末端）の配列 を有する活性化２量体サブユニット（ここでグアニンのＮ２はＦｌ’ＩＯＣ部分 を有し、アデニンのＮ６はｐ−ニトロフェノキシカルボニル部分を有し、バフク ーポンのアミノ末端はｔ−ＢＯＣ部分を有し、そして、カルボキシ末端は。

ｐ−ニトロフェニルエステルの形態である）　０．１ｍｍｏｌをＪｉｔ小容量の 乾燥ＴＨＦに溶かしてグラス担体に加え、混合を２時間にわたり行う（この反応 および続くカンプリングステップでは触媒を加えない）。その担体をＴ肝で洗浄 する。

２Ｍ　ｐ−ニトロフェニルアセテートを含むＴ）ＩＰ　２　ｍｌを加え。

室温で２０分間混合することにより未反応のアミン部分のいずれをもキャップす る。その後、グラス担体をＴＨＦで洗浄する。

上記のように、末端ｔ−ＢＯＣ部分をＴＦＡで除去し、そして担体を中和する。

続いて、実施例１７で調製される２量体サブユニットを次の順序で加える：　（ Ｃ，ｉ；Ｅ端）　Ｔ−Ａ、　Ａ−Ｃ，Ａ−Ｔ、　Ｔ−Ｔ、　Ｔ−Ｔ、　Ｃ−Ａ。

Ｃ−Ａ、　Ａ−Ｃ（Ｎ末端）。

環外窒素の保護基〔その保護基は、適切な核試薬（例えば、Ｃに対してはベンゾ イル、Ａに対してはベンゾイルまたはニトロベンゾイル、そしてＧに対してはア セチルまたはイソブチルにより除去されうる〕を有するサブユニットも、上の操 作法によりポリマーを組み立てるために使用され得る。

しかし、これらのいずれかの保護基を有するポリマーは２通常、　［）Ｂｕｔで 処理するよりもむしろ水酸化アンモニウムで処理することにより脱保護される。

災立例刹 １２００カーボネート結ムポリマーの？　（溶゛への゛　）実施例２０の担体結 合ポリマーの５′酸素は、ｌｌ’ｌの無水コハク酸およびＤＭＡＰ　０．ＩＭを 含むＴＨＦ溶液５−で１０分間室温にて処理し、　ＴＨＦで洗浄し、濾過するこ とにより、スクシニル化される。次に、ポリマーを両者とも担体から遊離させ、 その認識部分を脱保護化する。この脱保護化は、　ＤＢＵ　Ｏ，３ｇを含む乾燥 ＤＭＳＯ３−で室温にて１２時間処理することにより行われる。無水エーテルで 沈澱させ無水Ｄ？’ＩＳＯに再懸濁させる工程を２度繰り返すことにより、ポリ マーをＤＢＵから遊離させる。その後、このポリマーをＤＭＳＯ水溶液に再懸濁 させ、陰イオン交換クロマトグラフィーにより精製する。上記ＤＭＳＯ水溶液に は、残留するＤＢＵを中和するために痕跡量のｐＨ７，５の緩衝液が加えられて いる。

１豊拠Ｈ ２０のカーボネート′古人ポリマーのタ　（古　への゛　）６−アミノカプロン 酸をＳａｎｄｂｅｒｇおよびＲｅｇｍａｒｓｓｏｎの方法（Ｉｎｔ　Ｊ　Ｐｅ　 ｔｉｄｅ　Ｐｒｏｔ　Ｒｅｓ　（１９７４）β−：　１１１　）により２−フェ ニルイソプロピルフェニルカーボネートと反応させる。

このＮ−保護化生成物（ｌｏｍｍｏｌ）を２次に、最小容量のＤＭＦ中でＤＣＣ ２０ｍｍｏｌおよびｐ−ニトロフェノール５０ｍｏ＋ｏ　ｌと反応させることに より活性化させる。得られた生成物をシリカゲルを用いエーテルで展開して精製 する。

実施例２０の担体結合ポリマーを、上記アミノカプロン酸生成物１ｍｍｏｌおよ びＤＭＡＰ　０．１ｍｍｏｌとＴＨＦ（２ｍｆｆ）中で、室温にて２時間反応さ せる。次に、グラス担体をＴＨＦで洗浄し、濾過する。ポリマーを両者とも担体 から遊離させ、その認識部位を脱保護化する。この脱保護化は、ＤＢＩＩ　０． ３ｇを含む乾燥ＤＭＳ０３ｙｄと室温で１２時間処理することによりなされる。

無水エーテルで沈澱させ無水Ｄ？ＩＳＯに再懸濁させる工程を２度繰り返すこと により、ポリマーをＤＢＵから遊離させる。

８０％酢酸水溶液を添加し室温で２時間インキュベートすることにより、フェニ ルイソプロポキシカルボニル基が除去される。この脱保護化ポリマーをエーテル で沈澱させ、　ＤＭＳＯ水溶液に再懸濁させ９次いで陽イオン交換クロマトグラ フィーにより精製する。

セルロース（タイプ２０．　Ｃａｔ、　Ｎｏ、３５０４．平均粒径２０ミクロン 、　Ｓｉｇｎ＋ａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）　１　ｇ＋　ビス（ｐ−ニトロ フェニル）カーボネートＩｇ、およびトリエチルアミン０．２−をＤＰＩＦ　５ −に加え、室温にて一夜攪拌する。このスラリーを濾過し。

ＤＭＦ　１０−で１度洗浄し１次にメタノール５０−で洗浄し、そして真空下で 乾燥する。このような操作法による活性化のレベルは、１ｇのセルロースあたり ｐ−ニトロフェノキシカルボニル部分が２３μｍｏｌ結合したものがその典型的 なものである。

この活性化セルロース（０，５ｇ）をＤＭＳＯで洗浄し、濾過し。

ポリマー１０μｍｏｌ　（ＤＭＳＯ１−中）を加え、さらにジイソプロビレチル アミン３０μｍｏｌを加える。この混合物を密封容器内で穏やかに一夜攪拌し、 濾過し、　ＤＭＳＯで洗浄する。次に。

担体をピリジン水溶液で洗浄し、メタノールで洗浄し、乾燥する。

洟ｌｌホ臣 Ｊ２１のカーバメート士人ポリマーのＵ　への肛 担体に結合したカーバメート結合ポリマー（実施例２１）の５°アミノ部分をス クシニル化する。このスクシニル化は、１ｈの無水コハク酸および１ｈのジイソ プロビレチルアミンを含むＴＨＦ　Ｓ−と室温で１０分間反応させ、　Ｔ）ＩＦ で洗浄することによりなされる。

ＤＢＵ　Ｏ，３ｇを含有するＤＭＦ　３−で処理することにより、ポリマーが担 体から遊離する。無水エーテルで沈澱させ無水ＤＭＦに再懸濁させる工程を２度 繰り返すことにより、ポリマーをＤＢＵから遊離させる。

エーテルでポリマーを沈澱させ、ＤＭＳＯ１−に再懸濁させ。

濃アンモニア水１−を添加することにより、保護基が認識部位から除去される。

通常、アデニンの保護基がベンゾイル部分であるときには、脱保護化は密封容器 中、３０℃で１２時間行われる。他方、アデニンの保護基がニトロベンゾイルで あり。

グアニンの保護基がアセチル部分である場合には、脱保護化は、室温で６時間行 われる。揮発性成分は真空条件下で除去され、ポリマー）容液はｐｉ（７，５の 緩衝液で中和される。最後に。

ポリマーをＤＭＳＯ水溶液に希釈し、陰イオン交換クロマトグラフィーで精製す る。

失範闇酋 ２０のカーバメート士人ポリマーの３　（固　への：　）実施例２３の活性化６ −アミノカプロン酸試薬（１ｍｍｏｌ）　（ＴＨＦ　３−中）を、担体に結合し たカーバメート結合ポリマー（実施例２１）と、室温で２００分間反応せる。こ の担体をＴＨＦで洗浄し、濾過する。この末端のフェニルイソプロポキシカルボ ニル部分を除去する。フェニルイソプロポキシカルボニル部分の除去は、ジクロ ロメタンで洗浄し１次にトリフルオロ酢酸の０．５％ジクロロメタン溶液５−と 室温にて１５分間反応させ、　ＴＨＦで洗浄し、そして濾過する工程により行わ れる。

このポリマーは、実施例２５に従い、担体から遊離され、そして認識部分の保護 基が除去される。実施例２５と異なるのは。

最後の精製が１不土工交換カラムクロマトグラフイーで行われることである。

精製されたポリマーは、実施例２０と同様にしてセルロース担体に結合゛させる 。

実ｊｆＮんユ 方　２２のアミド結ムポリマーのノ　（溶′　への゛　）担体に結合したアミド 結合ポリマー（実施例２２）は、実施例２４のようにスクシニル化される。

実施例２４に従い、このポリマーを担体から遊離させ、認識部位の保護基を除去 し、そして精製する。

尖旌炭胆 ２２のアミド結合ポリマーの・　（開目への用）担体に結合したアミド結合ポリ マー（実施例２２）を、実施例２４のように、活性化アミノカプロン酸と反応さ せ、フェニルイソプロポキシカルボニル部分を除去する。

実質的に実施例２４に従い、このポリマーを担体から遊離させ、認識部位の保護 基を除去し、精製し、そして次にセルロース担体に結合させる。

本発明の好適な実施態様がここに開示されているが、この発明の内容から離れる ことなく種々の修飾および変更がなされうろことが当業者にとって明らかである 。

ＦＩＧ、５Ａ ＦＩＧ、　５Ｂ 詩人０３６２−５０２３３８　（３５）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．塩基の標的配列を含む一本鎖ポリヌクレオチドに選択された結合親和性をも って結合するのに効果的なポリマー組成物であって，該組成物は次の構造の非単 独重合性で実質的に立体規則性ポリマー分子を有する： Ｒ１Ｒ２Ｒ３Ｒｎ Ｂ〜Ｂ　Ｂ〜・・・Ｂ， ここで， （ａ）Ｒ１〜Ｒｎは，標的配列の対応内部配列塩基に，ワトソン／クリック対に より結合するのに効果的なプリン，プリン類似，ピリミジンおよびピリミジン類 似の複素環物から選択された認識部分であり， （ｂ）ｎは、ポリマー分子と標的配列との間で形成されるワトソン／クリック水 素結合の総数であり少なくとも約１５である，（ｃ）Ｂ〜Ｂは化学的に安定，実 質的に非荷電でかつ優先的なアキラル連鎖により優先的に連結されたバックボー ン部分であり， （ｄ）該バックボーン部分が環状構造であるときバックボーン部分の長さは５か ら７原子の範囲であり，そして該バックボーン部分が非環状構造であるとき４か ら６原子の範囲であり，そして （ｅ）該バックボーン部分は認識部分と標的配列の対応する内部配列塩基との間 でワトソン／クリック塩基対をなしうる位置で認識部分を支持する。 ２．請求の範囲第１項に記載の組成物であって，前記認識部分が次の基から選択 される： １．▲数式、化学式、表等があります▼２．▲数式、化学式、表等があります▼ ３．▲数式、化学式、表等があります▼４．▲数式、化学式、表等があります▼ ５．▲数式、化学式、表等があります▼６．▲数式、化学式、表等があります▼ ７．▲数式、化学式、表等があります▼８．▲数式、化学式、表等があります▼ ９．▲数式、化学式、表等があります▼１０．▲数式、化学式、表等があります ▼１１．▲数式、化学式、表等があります▼１２．▲数式、化学式、表等があり ます▼ここで，Ｘはフッ素，塩素，臭素もしくはヨウ素である。 ３．請求の範囲第１項に記載の組成物であって，前記認識部分が次の基から選択 される： １．▲数式、化学式、表等があります▼２．▲数式、化学式、表等があります▼ ３．▲数式、化学式、表等があります▼４．▲数式、化学式、表等があります▼ ５．▲数式、化学式、表等があります▼６．▲数式、化学式、表等があります▼ ７．▲数式、化学式、表等があります▼８．▲数式、化学式、表等があります▼ ４．請求の範囲第１項に記載の組成物であって，Ｂが環状バックボーン部分であ り，そしてＢ〜Ｂが次の構造のうちの一つを有する： ▲数式、化学式、表等があります▼Ａ−Ａ．▲数式、化学式、表等があります▼ Ｂ−Ｂ．▲数式、化学式、表等があります▼Ｃ−Ｃ．▲数式、化学式、表等があ ります▼Ｄ−Ｄ．▲数式、化学式、表等があります▼Ｆ−Ｆ．▲数式、化学式、 表等があります▼Ｇ−Ｇ．ここでＹはＯ，Ｓ，そしてＥは▲数式、化学式、表等 があります▼もしくは▲数式、化学式、表等があります▼である。 ５．請求の範囲第４項に記載の組成物であって，Ｂ〜Ｂが次の構造のうちの一つ を有する： ▲数式、化学式、表等があります▼Ａ−Ａ．▲数式、化学式、表等があります▼ Ｂ−Ｂ．▲数式、化学式、表等があります▼Ｃ−Ｃ．▲数式、化学式、表等があ ります▼Ｄ−Ｄ．ここで，ＹはＳ，０である。 ６．請求の範囲第１項に記載の組成物であって，Ｂが非環状バックボーン部分で あり．そしてＢ〜Ｂが次の構造のうちの一つを有する： ▲数式、化学式、表等があります▼Ｉ−Ｉ，Ｌ−Ｌ▲数式、化学式、表等があり ます▼Ｊ−Ｊ，Ｍ−Ｍ▲数式、化学式、表等があります▼Ｋ−Ｋ，Ｎ−Ｎ７．細 胞内標的配列への結合に用いられる請求の範囲第１項に記載の組成物であって， 前記ポリマー分子がせいぜい１〜３のイオン電荷を含み，かつ４つのサブユニッ ト当り約１つの電荷よりも多くない電荷を含む。 ８．請求の範囲第７項に記載の組成物であって，前記ポリマー分子が一方もしく は両方の分子末端において荷電された基を含有する。 ９．特異的に，そして実質的に均一な結合親和性をもって一本鎖ポリヌクレオチ ドに結合するのに効果的な実質的に非荷電のポリマー組成物を調製する方法であ って，該方法は，（１）該ポリヌクレオチドの塩基の特異的配列を選択すること ，なお，該配列は標的配列を構成している；（２）次の構造の一群のサブユニッ トを準備すること；Ｂ−Ｒｉ，およびＢ−Ｒｊ，ここで， （ａ）ＲｉおよびＲｊは，２つおよび３つの水素結合を含むワトソン／クリック 対により．該選択された標的特異配列中の対応塩基に，結合するのに効果的なプ リン，プリン類似，ピリミジン，およびピリミジン類似の複素現物から選択され た認識部分であり， （ｂ）Ｂは，バックボーン部分であり，これは化学的に安定で非荷電のアキラル 連鎖により別のバックボーン部分に連結され得， （ｃ）連結したとき隣接バックボーン部分間の間隔が，もし該バックボーン部分 が環状構造ならば，６原子であり，そしてもしこれらバックボーン部分が非環状 構造を有するならば４〜６原子であり，そして （ｄ）連結したときこれらバックボーン／部分が，該認識部分と該標的配列の対 応内部配列塩基との間にワトソン／クリック塩基対を生じさせうる位置において ，該認識部分を支持するバックボーンを形成し；および （３）該標的特異配列における塩基の配列に対応する特定の配列において該サブ ユニットを連結すること，を包含する。 １０．請求の範囲第９項に記載の方法であって，該方法はさらに両ＲｉおよびＲ ｊ認識部分を前記標的特異配列における少なくとも一つの塩基に供給すること， およびＲｉ／Ｒｊ比を減少させることにより該標的配列用組成物の結合親和性を 調整し該結合親和性を増大することそして該比を増大させて該結合親和性を減少 させることを包含する。 １１．請求の範囲第９項に記載の方法であって，該方法は，さらに，前記ポリマ ー分子の一方もしくは両方の末端にて，イオン電荷を有するかあるいは中性に近 い基を導入し水性媒質中の該ポリマーの溶解度を増大させることを包含する。 １２．請求の範囲第９項に記載の方法であって，Ｒｉが次の基から選択される： １．▲数式、化学式、表等があります▼４．▲数式、化学式、表等があります▼ ５．▲数式、化学式、表等があります▼６．▲数式、化学式、表等があります▼ ８．▲数式、化学式、表等があります▼１０．▲数式、化学式、表等があります ▼１１．▲数式、化学式、表等があります▼１２．▲数式、化学式、表等があり ます▼そしてＲｊが次の基から選択される： ２．▲数式、化学式、表等があります▼３．▲数式、化学式、表等があります▼ ７．▲数式、化学式、表等があります▼９．▲数式、化学式、表等があります▼ ここで，Ｘはフッ素，塩素，臭素，もしくはヨウ素である。 １３．請求の範囲第９項に記載の方法であって，Ｂが環状バックボーン部分であ り，そして共に連結されたときの隣接バックボーン部分は次の構造のうちの１つ を有する。 ▲数式、化学式、表等があります▼Ａ−Ａ．▲数式、化学式、表等があります▼ Ｂ−Ｂ．▲数式、化学式、表等があります▼Ｃ−Ｃ．▲数式、化学式、表等があ ります▼Ｄ−Ｄ．▲数式、化学式、表等があります▼Ｆ−Ｆ．▲数式、化学式、 表等があります▼Ｇ−Ｇ．ここでＹはＯ，Ｓ．そしてＥは▲数式、化学式、表等 があります▼もしくは▲数式、化学式、表等があります▼である。 １４．請求の範囲第９項に記載の方法であって，Ｂが非環状バックボーン部分で あり，そして共に連結されたときの隣接バックボーン部分が次の構造のうちの１ つを有する：▲数式、化学式、表等があります▼Ｉ−Ｉ，Ｌ−Ｌ▲数式、化学式 、表等があります▼Ｊ−Ｊ，Ｍ−Ｍ▲数式、化学式、表等があります▼Ｋ−Ｋ， Ｎ−Ｎここで，Ｅは▲数式、化学式、表等があります▼もしくは▲数式、化学式 、表等があります▼である。 １５．選択された活性が発現される系においで含まれる一本鎖ポリヌクレオチド の発現を阻害する方法であって，該方法は， （１）該発現に必要な該ポリヌクレオチドにおける標的配列を選択すること， （２）構造Ｂ−Ｒｉの一群のサブユニットを準備すること，ここで （ａ）Ｒｉは，２つもしくは３つの水素結合を含むワトソン／クリック対により ，該選択された標的配列において含まれる対応塩基に結合するのに有効なプリン ，プリン類似，ピリミジン，およびピリミジン類似の複素環物から選択された認 識部分であり， （ｂ）Ｂは一つのバックボーン部分であり，これは化学的に安定で非荷電のアキ ラル連鎖により別のバックボーン部分に連結され得， （ｃ）連結されたときバックボーン部分の単位長はもしこれらバックボーン部分 が環状構造を有するならば５〜７原子であり，そしてもしこれらバックボーン部 分が非環状構造を有するならば４〜６原子であり，そして （ｄ）これらバックボーン部分が連結されたとき，該認識部分と該標的配列の対 応内部配列塩基との間にワトソン／クリック塩基対を生じさせうる位置において 該認識部分を支持するバックボーンを形成し； （３）特定の配列において該サブユニットを連結して該標的配列に特異的に結合 するよう設計された優先的に非荷電で立体異体のポリマーを形成すること， （４）該ポリマーを該系に加えそして該ポリヌクレオチド発現の阻害の程度を観 察すること， 観察されるポリヌクレオチド発現の阻害の程度に依存して次の工程の一つもしく は両方により該標的配列用の該ポリマーの結合親和性を調整すること，該工程は （ａ）該標的配列の長さおよび対応ポリマー長を変化させること（ｂ）対応内部 配列ポリヌクレオチド塩基でもって３つおよび２つの水素結合を形成する認識部 分の比を変化させること；および該調整により，ポリマーを生成すること，該ポ リマーの結合親和性はポリヌクレオチド発現の該阻害をもたらすのに必要な実質 的に最低親和性である。