KR20170054429A - 치료용 나노입자 및 관련 조성물, 방법, 및 시스템 - Google Patents

Abstract

본 발명은 관심 있는 생물활성제(bioactive agent)를 전달하기에 적합한 50 나노미터 미만의 나노입자(nanoparticle), 및 치료용 나노입자의 제조, 안정성(stability), 효능(efficacy) 및 다른 측면을 개선시키는 관련 조성물, 방법 및 시스템에 관한 것이다.

Description

치료용 나노입자 및 관련 조성물, 방법, 및 시스템{THERAPEUTIC NANOPARTICLES AND RELATED COMPOSITIONS, METHODS, AND SYSTEMS}

정부의 권리에 관한 진술

본 발명은 미국국립보건원(National Institutes of Health)에 의해 수여된 계약 번호 HHSN261201300030C에 따른 정부 지원으로 이루어졌다. 따라서 정부는 본 발명에 대한 일정 권리를 가진다.

서열 목록

본 출원은 ASCⅡ 형식으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하며, 이는 전부 참조로 포함된다. 2015년 9월 1일에 작성된 상기 ASCⅡ 사본은 0269.13PCT_SL.txt로 명명되고 크기는 9,822 바이트이다.

세포, 조직, 기관, 및 유기체에 대한 관심 물질의 효과적인 전달은 소정의 표적에 대해 다양한 크기 및 면적(dimension)의 분자를 전달하는 것이 바람직한 생물의학, 이미징 및 기타 분야에 있어 도전 과제였다. 병리학적 검사, 치료학적 치료 또는 근본적인 생물학 연구에 관계없이, 일반적으로 관심 있는 생물학적 및/또는 화학적 활성과 관련된 다양한 종류의 생체 재료(biomaterial) 및 생체분자(biomolecule)를 전달하기 위한 여러가지 방법이 알려져 있고 사용되고 있다. 화학적(chemical) 또는 생물학적 물질(agent)(예를 들어, 약물, 생물학적 제제, 치료제 또는 이미징제)로 사용하기에 적합한 분자의 수가 증가함에 따라, 복잡성, 크기 및 화학적 본질이 다양한 화합물(compound)과 함께 사용하기에 적합한 전달 시스템(delivery system)의 개발이 특히 도전해 볼 만하다.

나노입자는 다양한 전달 방법으로 물질을 전달하기 위한 담체(carrier)로서 유용한 구조이다. 특정 표적으로 물질을 패키징(packaging), 운반, 전달하기 위한 다수의 다양한 전략을 활용하는 여러가지 나노입자 전달 시스템이 있다. 그러나, 질병 치료를 개선하기 위한 치료 수준의 약물을 세포 및 분자 표적에 전달할 수 있는 나노입자 치료제 (및 이러한 나노입자의 제조방법)에 대한 필요성이 존재한다.

폴리뉴클레오타이드(polynucleotide)는 의학에서 중요한 치료적 적용점을 갖는다. 폴리뉴클레오타이드는 특정 질병의 원인이 되는 유전자의 발현을 조절 (증가 또는 감소) 하는데 사용될 수 있다. 유전자 사일런싱 기술(Gene silencing technology)은 표적 핵산에 혼성화하고 전사(transcription) 또는 번역(translation)과 같은 유전자 발현 활성 또는 기능을 조절하는 폴리뉴클레오타이드를 이용한다. 중요하게, 유전자-사일런싱 물질(gene-silencing agent)은 질병과 연관된 단백질의 기능을 억제하는 종래 작은 유기화합물(organic compounds)에 대한 전도유망한 대안이다. RNAseH(ribonuclease H), siRNAs(small interfering RNAs), miRNAs(microRNAs) 및 shRNAs(small hairpin RNAs)는 유전자 사일런싱에 의해 단백질 형성을 막는 유전자 사일런싱 화합물 및 메커니즘의 예이다.

질병 치료를 개선하기 위한 유전자 발현을 특이적으로 조절할 수 있는 전달 시스템 및 치료제에 대한 요구가 계속되고 있다.

본 발명은 소정의 표적을 포함하여, 다양한 크기(size), 면적(dimensions) 및 화학적 본질을 가지는 광범위한 분자를 운반 및 전달하기 위해 사용될 수 있는 비-바이러스성(non-viral) 나노입자 및 관련 조성물, 방법 및 시스템을 제공한다. 당업계에서 숙련된 통상의 기술자라면, 일단 개시된 것으로, 과도한 실험 없이, 상기 및 다른 용도로 비-바이러스성 나노입자를 확인, 제조 및 이용할 수 있을 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 원하는 표적에 치료제, 백신 및/또는 진단 물질을 전달하기 위한 시스템을 제공한다. 약학적으로 허용가능한 치료용 나노입자, 및 세슘으로 전처리된(pre-treated) 리튬 도펀트(dopant)를 제조 또는 개발하는 과정에서와 같이, 나노입자가 멸균 증류수로 제조될 때, 상당한 혜택(benefit) 및 예상치 못한 이점(advantage)이 달성된다. 이러한 상당한 혜택(benefit) 및 예상치 못한 이점(advantage)은, 이에 제한되지는 않으나, 다양한 현장에서 제조하는 것과 같이, 약물 개발에서 개시된 나노입자의 이용에 있어 나노입자의 신뢰성 있는 운송에 대한 증가된 능력, 보다 큰 유연성 및 효율을 포함하여, 나노입자의 보다 큰 안정성 및 당업계의 통상의 기술자에게 자명한 다른 장점을 포함한다.

본 발명에 개시된 조성물 및 방법은 선택된 리간드 및 카고를 성공적으로 수용하기 위한 본 발명의 나노 입자의 유연성을 입증한다. 일 실시예에서, 나노입자는 예를 들어, 선택적인 응집제와 함께, 예를 들어 약물, 백신 및/또는 진단 물질을 포함하는 생물활성제로 구성된 코어, 상기 코어를 실질적으로 둘러싸는 계면활성제가 코팅된 복합체(surfactant-coated complex)를 형성하는 계면활성제, 여기에서 상기 계면활성제는 약 6.0 유닛(unit) 미만의 HLB(hydrophile-lipophile balance; 친수성-친유성 평형치) 값을 가진다; 및 상기 계면활성제가 코팅된 복합체에 비공유 결합하고 실질적으로 둘러싸는 쉘(shell)을 포함한다. 상기 쉘은 표적 부위 (리간드)를 포함하며, 상기 쉘은 세슘으로 전처리된 리튬을 포함하는 양이온성 물질로 형성된다. 나노입자의 평균 직경은 약 50 나노미터 미만 (즉, 50 나노미터 미만의 입자)이다.

또한, 본 발명에는 최대 약 50개의 뉴클레오타이드 길이이며, 특이적으로 카제인 키나아제 2 알파(CK2 alpha)의 RNA 핵산 서열에 상응하여 혼성화될 수 있는 DNA/RNA 키메라 단일-가닥 폴리뉴클레오타이드(chimeric single-stranded polynucleotides) 및, 최대 약 50개의 뉴클레오타이드 길이이며, 특이적으로 카제인 키나아제 2 알파 프라임(CK2 alpha prime)의 RNA 핵산 서열에 상응하여 혼성화될 수 있는 DNA/RNA 키메라 단일-가닥 폴리뉴클레오타이드(chimeric single-stranded polynucleotides), 뿐만 아니라, CK2 알파 및 CK2 알파 프라임의 발현을 감소 또는 저해하고 고형 종양의 성장을 억제하기 위한 상이한 서열을 포함하는 상기 폴리뉴클레오타이드의 조합("혼합물"(mix))의 제조 및 사용 방법이 개시되어 있다. 이러한 폴리뉴클레오타이드의 비-제한적인 예는 CK2 알파(CK2 alpha)에 대한 서열번호 8 및 CK2 알파 프라임(CK2 alpha prime)에 대한 서열번호 9를 포함한다.

또한, 본 발명에는 2' O-메틸화된 (2' O-Me(methylated)) RNA 뉴클레오타이드의 5' 말단으로부터 2번째 위치를 치환하도록 변형된 주쇄(backbones)를 갖는 CK2-표적 폴리뉴클레오타이드(CK2-targeted polynucleotide)가 개시되어 있다. 이러한 주쇄-변형된 폴리뉴클레오타이드(backbone-modified polynucleotides)의 비-제한적인 예는 하기 표 2에 제공된다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 종양-표적화된(tumor-targeted) 50 나노미터 미만(sub-50 nanometer)의 캡슐(capsule)에 상기와 같이 변형된 CK2-표적 폴리뉴클레오타이드(CK2-targeted polynucleotide)의 혼합물(mix)을 결합 및 도입하는 것이 개체에 투여시 종양 성장, 종양 세포 증식, 및/또는 염증을 현저하게 감소시키거나 억제시키는 치료용 나노입자의 조성물이 된다.

따라서, 하나의 양태로서, 본 발명은 나노입자를 포함하는 조성물을 제공하며, 여기에서 상기 나노입자는 하나 이상의 생물활성제, 6.0 유닛 미만의 HLB 값을 갖는 계면활성제, 리간드, 및 Li⁺ 및 Cs⁺를 포함하여, 여기에서: ⅰ) 상기 하나 이상의 생물활성제 및 계면활성제는 계면활성제 마이셀(micelle) 코어(core)를 형성하고, ⅱ) 상기 리간드는 쉘(shell)을 형성하며, ⅲ) 상기 나노입자는 약 50 나노미터 미만의 평균 직경을 가진다. 일 실시예에서, 상기 리간드는 외부의 쉘(shell)을 형성한다. 또 다른 실시예에서, 상기 나노입자는 멸균 증류수를 사용하여 제조된다.

또 다른 실시예에서, 하나 이상의 생물활성제는 폴리뉴클레오타이드이다. 또 다른 실시예에서, 하나 이상의 생물활성제는 플라스미드 DNA이다. 또 다른 실시예에서, Li⁺은 Cs⁺로 전처리 된다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 하나 이상의 생물활성제(bioactive agent)를 표적에 전달하는 시스템을 제공하며, 상기 시스템은 하나 이상의 생물활성제(bioactive agent), 6.0 유닛(unit) 미만의 HLB 값을 갖는 계면활성제, 리간드(ligand), 및 Cs⁺으로 전처리된 Li⁺을 포함하여, 하나 이상의 생물활성제를 표적에 전달하는데 사용되는 나노입자로 조립된다. 일 실시예에서, 생물활성제는 폴리뉴클레오타이드이다. 또 다른 실시예에서, 표적은 포유동물의 신체 내의 세포이다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 개체에 하나 이상의 생물활성제를 투여하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명에 따른 나노입자를 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 것을 포함한다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 하나 이상의 생물활성제를 개체에 투여하기 위한 시스템을 제공하며, 상기 시스템은 하나 이상의 생물활성제, 6.0 유닛 미만의 HLB 값을 갖는 계면활성제, 및 리간드, 및 Cs⁺으로 전처리된 Li⁺을 포함하여, 개체에 투여되는 나노입자로 조립된다.

본 발명에 따른 조성물의 일 실시예에서, i): 상기 나노입자는 각각 3' RNA 부위(portion) 및 주로 5' DNA 부위를 포함하는 복수 개의 폴리뉴클레오타이드를 포함하되, 상기 각 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단으로부터 2번째 위치는 2'-OMe 변형 RNA(2'-OMe modified RNA)이고, 평균적으로 나노입자 조성물에 대한 상기 복수 개의 폴리뉴클레오타이드의 약 45% 내지 55%, 약 40% 내지 60%, 또는 약 30% 내지 70%의 서열은 서열번호 8을 포함하고, 상기 복수 개의 폴리뉴클레오타이드의 나머지 서열은 서열번호 9를 포함하며, ⅱ) 상기 리간드는 테나신 수용체(tenascin receptor)를 표적으로 하는 단백질이다. 또 다른 실시예에서, 상기 테나신 수용체(tenascin receptor)를 표적으로 하는 리간드는 텐피브겐(tenfibgen) 이다.

본 발명에서 사용된 용어 "나노입자를 포함하는 조성물" 또는 유사한 용어는, 투여량(dose), 시료(sample), 제제, 제조 로트(lot), 및 본 발명의 나노입자를 포함하는 물질의 다른 조성물을 제한 없이 나타낸다.

하나의 양태로서, 본 발명은 3' RNA 부위(portion) 및 주로 5' DNA 부위를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 제공하며, 상기 5' 말단으로부터 2번째 위치는 2'-OMe 변형 RNA(2'-OMe modified RNA)이고, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 11의 최대 약 50개의 연속적인 뉴클레오타이드를 포함하고, 서열번호 8의 적어도 8개의 연속적인 뉴클레오타이드의 부분을 포함한다. 다른 실시예에서, 폴리뉴클레오타이드는 약 20개의 뉴클레오타이드 길이이고 서열번호 8을 포함한다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 3' RNA 부위(portion) 및 주로 5' DNA 부위를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 제공하며, 상기 5' 말단으로부터 2번째 위치는 2'-OMe 변형 RNA(2'-OMe modified RNA)이고, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 12의 최대 약 50개의 연속적인 뉴클레오타이드를 포함하고, 서열번호 9의 적어도 8개의 연속적인 뉴클레오타이드의 부분을 포함한다. 다른 실시예에서, 폴리뉴클레오타이드는 약 20개의 뉴클레오타이드 길이이고 서열번호 9를 포함한다.

하나의 양태로서, 본 발명은 치료적 유효량의 본 발명에 따른 조성물을 고형 종양 암을 갖는 것으로 진단된 환자에 투여하는 것을 포함하는, 환자의 치료 방법을 제공한다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 고형 종양 암으로 진단된 환자의 치료 방법을 제공하며, 치료적 유효량의 본 발명에 따른 조성물을 상기 환자에 투여하는 것을 포함하며, 상기 나노입자는 복수 개의 폴리뉴클레오타이드를 포함하되, 상기 각각의 복수 개의 폴리뉴클레오타이드는 3' RNA 부위(portion) 및 주로 5' DNA 부위를 포함하며, 상기 각각의 복수 개의 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단으로부터 2번째 위치는 2'-OMe 변형 RNA(2'-OMe modified RNA)이고, 상기 복수 개의 폴리뉴클레오타이드의 서열은 서열번호 8 또는 서열번호 9를 포함하며, 상기 서열번호 8을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 나노입자의 퍼센테이지는 적어도 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80% 또는 약 90% 이며, 상기 나노입자의 나머지는 서열번호 9를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 리간드는 테나신 수용체(tenascin receptor)를 표적으로 하는 단백질이다.

일 실시예에서, 상기 퍼센테이지는 하나 또는 하나 이상의 개체로부터의 종양 조직에서 측정된 CK2 알파 효소(CK2 alpha enzyme) 및 CK2 알파 프라임 효소(CK2 alpha prime enzyme)의 상대적 수준을 기반으로 결정되며, 기준(reference) 조직 및/또는 세포 배양물(cell culture)에서 선택적으로 CK2 알파 및 CK2 알파 프라임 효소의 상대적 수준과 비교된다. 또 다른 실시예에서, 상기 퍼센테이지는 서열번호 8을 포함하는 약 50%의 나노입자 및 서열번호 9를 포함하는 약 50% 나노입자이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 본 발명에 따른 조성물을 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 i) 생물활성제와 응집제(condensing agent)를 복합시켜 응집된(condensed) 생물활성제를 형성하는 단계; ⅱ) 상기 응집된 생물활성제를 6.0 미만의 HLB 값을 갖는 계면활성제를 포함하는 수-혼화성 용매(water-miscible solvent)에 분산(dispersing)시켜 계면활성제 마이셀을 형성하는 단계; ⅲ) 상기 계면활성제 마이셀의 외부 표면(exterior surface)에 리간드를 흡착(adsorbing)시켜 리간드-안정화 입자(ligand-stabilized particle)(a.k.a., 리간드 입자)를 형성하는 단계; 및 ⅳ) 상기 리간드 입자와 Cs⁺ 및 멸균증류수로 전처리된 Li⁺을 혼합하고 인큐베이션(incubation)하여 조성물을 형성하는 단계;를 포함한다.

달리 정의되지 않는 한, 본 발명에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 해당 기술 분야의 숙련된 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 발명을 실시 또는 시험하기 위한 적합한 방법 및 재료가 하기에 제공되나, 당업자는 본 발명에 기술된 것과 유사하거나 동등한 다른 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있음을 인식할 것이다. 또한, 본 발명에서 반복되는 재료, 방법 및 실시예는 단지 예시적인 것이며 제한하려는 것은 아니다.

나노입자( Nanoparticles )

하나의 양태로서, 본 발명은 특정 조직 및 세포에 생물활성제(bioactive agents)를 표적으로 전달하기 위한 안정한 나노입자를 제공한다. 본 발명의 나노입자는 리간드 코팅 또는 쉘(shell), 및 50 나노미터 미만의 평균 직경을 가지며, 신체(body)의 생물학적 장벽(biologic barrier)을 통해 및/또는 관심 있는 세포 또는 조직으로 생물활성제의 전달을 가능하게 한다.

본 발명에서 사용한 "50 ㎚ 미만의 나노입자(sub-50 ㎚ nanoparticles)"는 일반적으로 나노입자의 조성물과 관련하여 언급되며, 상기 나노입자는 (i) 생물활성제 및 소수성 계면활성제를 포함하는 계면활성제 마이셀(micelle) 및 (ⅱ) 리간드를 포함하고, 약 50 나노미터 미만의 평균 직경을 갖는 쉘(shell)을 포함한다. 특정 실시예에서, 본 발명에 따른 조성물의 나노입자는 약 5 내지 약 50 나노미터, 약 5 내지 약 40 나노미터, 약 5 내지 약 30 나노미터, 약 5 내지 약 20 나노미터, 약 10 내지 40 나노미터, 약 10 내지 30 나노미터, 또는 약 10 내지 20 나노미터의 평균 직경을 가진다.

본 발명에서 사용한 용어 "쉘(shell)"은 일반적으로 나노입자의 외부 또는 외부 쉘을 지칭하며, 계면활성제 마이셀 코어(core)의 외부 표면의 적어도 일부를 둘러싸는 층(layer) 또는 코팅(coating) 또는 코로나(corona)를 포함한다. 일 실시예에서, 쉘은 하나 이상의 리간드를 포함한다. 주어진 나노입자의 제제(formulation) 또는 조성물(여기에서 상호교환적으로 사용된)의 경우, 예를 들어, TEM 또는 AFM 현미경사진(micrograph) 분석으로 확인한 바와 같이, 불충분한 중량의 리간드 도입(incorporation)은, 예를 들어, 불규칙한 약물-응집체(drug-aggregate) 또는 융합된 마이셀에 의해, 보통 비-균일(non-uniform)한 입자가 나타나는 결과를 초래할 것이며, 반면 과도한 중량의 리간드는, 예를 들어, 가늘고 긴(elongate) 구조에 의해, 보통 큰 덩어리(large mass) 또는 구형의 손실 또는 입방체 형태가 나타나는 결과를 초래할 것이다. 해당 기술 분야에서 숙련된 통상의 기술자라면, 과도한 실험 없이, 본 발명의 나노입자에 도입시키기 위한 리간드의 용도를 확인, 준비 및 이용할 수 있을 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 생물활성제를 함유하는 나노입자를 포함하는 조성물을 제공한다. 당업자는 "(특정 특징, 특성 등)을 포함하는 나노입자를 함유하는 조성물"이라는 용어는 특정 특징, 특성 등을 포함하는 조성물의 복수 개의 나노입자를 나타내는 것으로 이해할 것이다.

일 실시예에서, 나노입자는 멸균 증류수를 사용하여 제조되었다. "준비된(prepared)", "합성된(synthesized)", "만들어진(made)", "제조된(manufactured)" 등의 용어는 여기에서 상호교환적으로 사용되었다. 본 발명에서 사용한 용어 "멸균 증류수를 사용하여 제조된 나노입자"는 본 발명의 나노입자의 합성에 사용된 염 수용 용액(salt receiving solution)이 멸균 증류수로 제조된 것을 의미한다. 당업자는 최종 염 수용액의 제조에 있어 임의의 단계 또는 단계에서 첨가된 멸균 증류수 양(volume)은 최종 염 수용 용액의 총 증류수 양에 대해 적어도 총 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 99%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8% 또는 99.9%가 포함되는 것으로 이해할 것이다. 이와 관련하여, "최종 염 수용 용액(salt receiving solution)"은 리간드-안정화된(ligand-stabilized) 나노입자를 첨가하기 전의 용액을 의미한다. 이 체제(framework) 내에서, 예를 들어, 염 수용 용액에 첨가된 부형제(excipient) 원액(stock solution)과 같은, 다른 등급의 물을 사용할 수 있다. "멸균 증류수를 사용하여 제조된 나노입자" 및 "멸균 증류수를 포함하는 염 수용 용액"이라는 용어는 멸균 증류수가 최종 염 수용 용액의 총 증류수 양의 약 80% 내지 100%를 차지하는 것을 고려한 것으로 이해된다. "멸균 증류수를 사용하여 제조된 나노입자" 및 "멸균 증류수를 포함하는 염 수용 용액"과 관련하여 사용된 "멸균 증류수"는 하기 금속의 수준(level)이 총합에서 0.2ppm(parts per million) 이하인 증류수를 의미한다: 알루미늄(aluminum), 비소(arsenic), 바륨(barium), 카드뮴(cadmium), 크롬(chromium), 구리(copper), 철(iron), 납(lead), 망간(magnanese), 니켈(nickel), 루비늄(rubinium), 황(sulfur), 바나듐(vanadium) 및 아연(zinc). 일 실시예에서, "멸균 증류수"는 하기 금속의 수준(level)이 총합에서 0.1ppm(parts per million) 이하인 증류수를 의미한다: 알루미늄(aluminum), 비소(arsenic), 바륨(barium), 카드뮴(cadmium), 크롬(chromium), 구리(copper), 철(iron), 납(lead), 망간(magnanese), 니켈(nickel), 루비늄(rubinium), 황(sulfur), 바나듐(vanadium) 및 아연(zinc). 이 체제(framework) 내에서, 각 금속의 수준과 금속의 합은 MDL(Method Detection Limit)에 보고된 결과를 기반으로 한다. 금속 시험은, 예를 들어, 미국 환경 보건국(U.S. Environmental Protection Agency) 방법 6010 및 6020과 같은, 이용가능한 방법에 따라 수행될 수 있다.

몇몇 실시예에서, 멸균 증류수와 같은 고순도 증류수의 사용은 의약품에 대한 규제 기준에 부합하도록 요구되어진다. 몇몇 실시예에서, 멸균 증류수의 사용은, 예를 들어, 투과전자현미경(transmission electron microscopy, TEM) 또는 원자력현미경(atomic force microscopy, AFM)에 의해 확인될 수 있는, 크기, 형태, 안정성 및 기능성과 같은 나노입자의 특성을 변경시킬 수 있는 오염 물질의 수준을 감소시킴으로써 나노입자 제조의 규제를 개선하기에 바람직하다. 몇몇 실시예에서, 멸균 증류수의 사용은 크기, 형태, 안정성 및 기능성과 같은 나노입자의 특성을 향상시키기 위해 부형제와 같은 성분을 첨가할 수 있는 일관된 기반을 제공함으로써 나노입자 제조의 규제를 개선하기에 바람직하다. 당업계에 통상의 기술자는, 미국 약전(United States Pharmacopeia) 및 유사 기구(organization)에 의해 제작된 것과 같이, 증류수의 시험, 등급 및 사용에 대하여 이용할 수 있는 방법 및 가이드라인 또한 이해할 것이다.

일 실시예에서, 사용된 멸균 증류수는 의약품 등급 증류수이다. 또 다른 실시예에서, 상기 멸균 증류수는 약학적으로 허용가능한 치료용 나노 입자를 제조하는데 사용된다. 본 발명에서 "약학적으로 허용가능한(pharmaceutically acceptable)"이란 정상적인 의학적 판단 범위 내에서, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 다른 문제 또는 합병증 유발 없이, 개체의 조직에 접촉하여 사용하기에 적절하며, 적정 효과/위험 비율이 적합한 화합물(compound), 물질(material), 조성물(composition), 및/또는 투여 형태를 나타내는 데 사용된다. 일 실시예에서, 멸균 증류수는 예를 들어, 염 수용 용액 제조에 사용된 시약 용액 준비 또는 염 수용 용액에 첨가하기 전에 나노입자의 하나 이상의 성분 준비와 같은, 나노입자 제조 공정의 다른 단계에서도 사용된다.

일 실시예에서, 나노입자는 이온 리튬 (Li⁺) 및 세슘 (Cs⁺)을 포함한다. 또 다른 실시예에서, 나노입자는 Cs⁺으로 전처리된 Li⁺을 포함한다. 본 발명에서 "Cs⁺으로 전처리된 Li⁺" 문구 및 이와 유사한 문구는 염 수용 용액을 준비하는데 사용되거나 사용될 멸균 증류수 양과 상기 전혼합 되거나 접촉된 이온이 결합되기 전에 Li⁺ 및 Cs⁺ 이온의 전혼합(pre-mixing) 또는 접촉을 나타내는 데 사용된다. 전처리 단계에서 Li⁺의 농도는 일반적으로 적어도 1M 이상이어야 한다. 일 실시예에서, 농도는 2M이다. 일 실시예에서, 농도는 3M이다. 일 실시예에서, 농도는 3M 내지 5M이다. 일 실시예에서, 농도는 4M이다. 일 실시예에서, 농도는 5M이다. 일 실시예에서, 나노입자를 형성하기 위해 사용된 염 수용 베스(bath)에 Li⁺을 첨가하기 전에 이온으로 Li⁺을 전처리하는 것은 이온 Cs⁺으로 제한된다. 상기 실시예에서, Cs⁺에 대한 전처리 이온의 제한은 특히 전혼합에 대해 첨가되는 다른 이온을 제외하는 것으로 고려되지만, Cs⁺으로 Li⁺을 전처리하는데 사용되는 증류수원(water source)에 존재할 수 있는 다른 이온을 제외하는 것으로 고려되지 않는 것으로 이해된다. 본 발명에 개시되고 고려된 목적을 위한, Li⁺ 및 Cs⁺ 이온의 전혼합 또는 접촉은 증류수, 예를 들어, 멸균 증류수에 원하는 농도의 이온을 단순히 혼합하는 것을 포함하여, 당업자에게 알려진 이온 및 유사한 분자를 결합하는 방법에 따라 용이하게 수행될 수 있다. 일 실시예에서, 50 ㎖ 튜브의 멸균 증류수에 약 4M Li⁺에 대해 약 0.1 ㎍/1 ㎖의 Cs⁺을 Li⁺에 대한 중량을 기준으로 약 2.5 ppb Cs⁺을 첨가하고, 약 2분 동안 회전시켰다. 당업자는 Li⁺에 대해 사용된 Cs⁺의 비율 및/또는, 예를 들어, 50 ㎖ 튜브의 멸균 증류수에서 결합된 이온의 농도는, 추후 생성된 나노입자의 형태 또는 안정성 또는 몇몇 다른 특성을 조정하고자, 통상적으로 다양하게 조절할 수 있는 것으로 이해할 것이다.

또 다른 실시예에서, Cs⁺은 약 0.1 내지 약 100 ppb(parts per billion)의 비(ratio)로 Li⁺과 전혼합 하였다. 또 다른 실시예에서, 전혼합 비는 약 0.1 내지 약 5 ppb이다. 또 다른 실시예에서, 전혼합 비는 약 1 내지 약 4 ppb이다. 이러한 각 범위에는 해당 범위 내에서 하위 범위가 포함된다. 예를 들어, 약 1 내지 약 4 ppb는 약 1.2 내지 약 2.5 ppb, 및 약 2 내지 약 4 ppb 등과 같은 범위를 포함한다. 놀랍게도, 멸균 증류수를 사용하여 제조된 나노입자의 경우, Li⁺에 Cs⁺을 전처리하여 만든 입자는 구형, 입방형 또는 타원형의 50 나노미터 미만의 나노입자가 형성되었으나, 반면, 전처리하지 않고 단순히 염 수용 용액에 혼합한 Cs⁺ 및 Li⁺으로 만든 입자는 대부분 풀어진 형태로 모양이 갖추어져 있지 않거나, 사용하기에 부적절한 긴 막대 모양(rod-like)의 조성물로 형성되었다. 해당 기술 분야에서 숙련된 통상의 기술자라면, 통상적인 실험을 통해, 표적으로 하는 나노입자를 위한 Cs⁺ 및 Li⁺ 전-혼합물(pre-mixture)의 용도를 확인, 제조 및 이용할 수 있을 것이다.

개시된 나노입자는 킬레이트화(chelating), 컨쥬게이팅(conjugating), 또는 나노입자의 표적 부위에 공유 결합시키는 단계 없이, 주어진 표적, 예를 들어, 주어진 조직 또는 세포 표적에 용이하게 합성될 수 있는 모듈식(modular)의 표적화(targeting) 성분을 제공한다. 해당 기술 분야에서 숙련된 통상의 기술자라면, 당업계에 공지되어 있는, 대상으로 하는 표적 및 방법 및 조성물을 기반으로 한 표적화 부위를 적절하게 선택함으로써, 본 발명의 나노입자가 미리 지정한 표적 조직 및 세포에 생물활성제를 전달할 수 있는 것으로 이해할 것이다.

일 실시예에서, 쉘(shell)은 리간드를 포함한다. 본 발명에서 사용된 용어 "리간드(ligand)"는, 표적 수용체(receptor)에 결합하는 물질(substance)을 의미한다. 몇몇 실시예에서, 리간드는 단백질(protein), 펩타이드(peptide), 폴리펩타이드(polypeptide), 탄수화물(carbohydrate), 폴리비닐피로리돈(polyvinylpyrrolidone, PVP), 항체(antibody), 또는 생체적합성(biocompatible) 폴리머(polymer), 또는 상기 단편(fragment), 또는 저분자(small molecule)를 포함한다. 일 실시예에서, 50 ㎚ 미만의 나노입자는 적어도 하나의 조직-특이적 또는 세포-특이적 리간드로 코팅된다. "코팅된 나노입자"는 리간드가 비공유 결합을 통해 계면활성제 마이셀 코어(core)에 결합되는 것인 나노입자를 의미한다. 본 발명의 나노입자를 위한 리간드 선택의 유연성(flexibility)은 킬레이트화(chelation), 컨쥬게이션(conjugation), 또는 공유 결합(covalent attachment)을 통해, 나노입자에 리간드를 부착(attaching) 시키는 것과 같은 복잡한 단계 대신에 소수성 마이셀 표면에 리간드를 흡착시키는 복잡하지 않은 단계를 사용하고, 이후에, 염 결정화 용액(salt crystallization solution)에서 표적화된 입자를 안정화시켜, 부분적으로, 복잡한 단계의 부재에 의해 가능해진다. 따라서, 예를 들어, 계면활성제 마이셀 코어(core)에 리간드의 흡착(adsorption) 시키는 것은, 코어 입자에 리간드가 컨쥬게이션 되거나 킬레이트화 된 나노입자보다 더 큰 리간드를 보다 효율적으로 도입할 수 있게 한다. 예를 들어, 텐피브겐(tenfibgen), 히알루로난(hyaluronan), 및 PVP와 같은 합성 폴리머를 포함하는 다양한 리간드가 본 발명의 Cs⁺-처리된 나노입자를 제조하는데 리간드로서 이용될 수 있다. 예를 들어, PVP를 포함하는 입자는 응축기(condenser)로서 4㎕의 25kD PEI, 마이셀 코어에 흡착된 리간드로서 3 ㎍의 10 kD PVP를 사용하고, 수용 베스(bath)를 1.5 nM Mg^{2 +} 및 1.88 nM Sr^{2 +}로 조정하는 것을 제외하고는, 5.5 kb 플라스미드에 대한 제제 J(Formula J, 하기 실시예)와 유사하게 제조될 수 있으며, 다른 모든 이온은 동일하다.

일 실시예에서, 리간드는 테나신 수용체를 가진 세포를 표적으로 한다. 또 다른 실시예에서, 리간드는 텐피브겐(tenfibgen)이다.

또 다른 실시예에서, 리간드는 히알루로난(hyaluronan)이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 생물활성제를 표적에 전달하거나 생물활성제를 개체에 투여하는 시스템을 제공한다. 일 실시예에서, 상기 시스템은 적어도 하나의 생물활성제를 표적에 전달하거나 적어도 하나의 생물활성제를 개체에 투여하는 데 사용되는 50 나노미터 미만의 나노입자 내에 조립될 수 있도록, 적어도 하나의 생물활성제, 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드, 6.0 유닛(unit) 미만의 HLB 값(value)을 갖는 계면활성제(surfactant), 리간드(ligand) 및, Li⁺과 Cs⁺를 포함한다. 본 발명에서 사용된 용어 "시스템"은 개체의 신체 내에 생물활성제의 도입을 가능하게 하고, 그 효능 또는 성능을 향상시키는 제제 또는 조성물을 의미한다.

일 실시예에서, 본 발명의 나노입자는 특정 유전자 산물 (예를 들어, 단백질 또는 RNA)의 생산을 증가 또는 감소시키기 위해 유전자 발현을 조절하는데 유용한 생물활성제 또는 작용 물질을 도입한다. 또 다른 실시예에서, 생물활성제 또는 작용 물질은 RNaseH, RNAi 및 dsRNA 효소와 같은 작용 메카니즘, 뿐만 아니라 표적 분해(target degradation) 또는 표적 선점(target occupancy)에 기초한 다른 조절 기작과 결합한다.

생물활성제( Bioactive agents)

본 발명의 Cs⁺ 처리된 나노입자는 표적화 된 조직 및 세포에 생물활성제를 운반 및 전달하는데 사용될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 "생물활성제(bioactive agent)" 또는 "생물활성제들(bioactive agents)"은, 세포, 조직 또는 유기체에 투여되거나 전달될 때, 세포, 조직 또는 유기체의 하나 이상의 생리학적, 생화학적, 또는 병리학적 과정을 모방, 변경 또는 조절하는 하나 또는 하나 이상의 작용 물질을 의미한다. 바람직하게, 변경(alteration) 또는 조절(modulation)은 의학적으로 바람직한 변경 또는 조절이다. 보다 구체적으로, 생물활성제는 이미징 또는 모니터링 또는 치료 또는 예방 용도를 포함하는 목적을 위한 다수의 상이한 화합물 또는 분자 중 임의의 하나 또는 하나 이상일 수 있으며, 이에 제한되지 않으나, 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide), 폴리뉴클레오타이드(polynucleotide), 플라스미드 DNA(plasmid DNA), 임의의 핵산-기반 분자(nucleic acid-based molecule)와 같은 생물활성제는 이에 제한되지 않으나, DNA, RNA, siRNA, mRNA, miRNA, shRNA, 앱타머(aptamers), 안티센스 분자(antisense molecules), 또는 리보자임(ribozymes), 뿐만 아니라 단백질(protein), 폴리펩타이드(polypeptide), 펩타이드(peptide), 탄수화물(carbohydrate), 항체(antibody) 또는 저분자(small molecule)를 포함한다.

이론에 구속되기를 바라는 것 없이, 생물활성제 선택의 유연성은, 부분적으로, 나노입자의 코어를 형성하는 소수성-계면활성제-코팅된 마이셀(hydrophobic-surfactant-coated micelle)의 분할(partitioning) 및 응집(condensing) 특성에 의해 가능해진다. 당업자는 DNA, RNA, siRNA, miRNA, shRNA, 앱타머(aptamers), 안티센스 분자(antisense molecules), 또는 리보자임(ribozymes), 단백질(protein), 폴리펩타이드(polypeptide), 펩타이드(peptide), 탄수화물(carbohydrate), 항체(antibody) 또는 다른 카고(cargos), 보다 바람직하게는, 이에 한정되는 것은 아니나, 친수성(hydrophilic) 및/또는 음전하 또는 대략 중성 전하를 띈 카고를 포함하는, 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide), 폴리뉴클레오타이드(polynucleotide), 플라스미드 DNA(plasmid DNA), 임의의 핵산-기반 분자(nucleic acid-based molecule)를 가진 본 발명의 나노입자 제조 목적을 위해 적합하고 기능적인 것으로서 이러한 특성을 인식할 것이다. 다양한 제제, 예를 들어, 10.5 kb 플라스미드 DNA 및 22.7 나노미터의 평균 직경과 -6.4 mev의 전하를 갖는 히알루로난(hyaluronan) 나노입자 쉘의 제제, 그리고 6800 달톤(dolton) 단일 가닥(single strand) 올리고뉴클레오타이드 및 19.5 나노미터의 평균 직경과 -5.8 mev의 전하를 갖는 텐피브겐(tenfibgen) 나노입자 쉘의 제제에 다양한 생물활성제를 도입시키기 위한 본 발명의 나노입자의 유연성이 입증되었다(실시예 참조).

따라서, 통상적인 실험을 통해 세슘-전처리된 나노입자에 다른 다양한 생물활성제를 도입시킬 수 있다. 예를 들어, 저분자인 에리스리톨(erythritol)(MW, 122)은 응축기(condenser)가 없는 500㎍의 에리스리톨이 8.75㎍의 계면활성제로 마이셀화되고, 5.5mcg의 TBG로 코팅되며, 6.25nM의 Mg2+ 및 9.38nM의 Sr2+로 조정된 수용 베스(bath)로 분무되는 것을 제외하고는, 제제 A(실시예)와 유사하게 제조될 수 있으며, 다른 모든 이온은 동일하다. 결과적으로 생성된 나노입자 크기는 직경이 약 25 ㎚이며, 표면 전하는 대략 -12 mev 정도이다.

본 발명에서 사용된 용어 "소수성 계면활성제-코팅된(hydrophobic surfatant-coated)"은 계면활성제 마이셀을 형성하는데 사용되는 소수성 계면활성제의 코팅 또는 층을 의미하며, 이는, 생물활성제 및 선택적인 응집제의 적어도 일부를 둘러싼다. 주어진 제제(formulation)의 경우, 예를 들어, TEM 또는 AFM 현미경사진(micrograph) 분석으로 확인한 바와 같이, 불충분한 계면활성제의 도입은 전형적으로 불규칙한 약물 응집체를 야기하는 반면, 과량의 계면활성제는 전형적으로 계면활성제 소구체(globules)를 생성하게 될 것이다. 특정 실시예에서, 생물활성제는 단일-가닥 키메라 올리고뉴클레오타이드(single-stranded chimeric oligonucleotide)이다. 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 생물활성제는 일반적으로 당업계에 공지된 기술을 사용하여 제조할 수 있으나, 상업적 제조업자로부터 수득 할 수도 있다.

일 실시예에서, 상기 생물활성제는 분자 표적에 대한 복수 개의 생물활성제이다. 또 다른 실시예에서, 상기 생물활성제는 상이한 분자 표적 및/또는 작용 메카니즘을 갖는 2 또는 2 이상의 혼합을 포함한다.

몇몇 실시예에서, 생물활성제는 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine), 폴리오르니틴(polyornithine), 폴리아르기닌(polyarginine), 스페르민(spermine), 또는 다른 양이온성 응집제(cationic condensing agent) 또는 당업계에 잘 공지된 물질을 포함하는 양이온성 응집제로 응집된다.

"특이적으로 혼성화 될 수 있는(Specifically hybridizable)" 및 "상보적인(complementary)"은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드와 표적 RNA 분자(RNA molecule) 사이에 안정하고 특이적인 결합이 일어나도록 충분한 정도의 상보성을 나타내는데 사용되는 용어이다. 당업계에서는 폴리뉴클레오타이드의 서열이 특이적으로 혼성화 될 수 있는 그의 표적 RNA 분자의 서열과 100% 상보적일 필요는 없다는 것이 이해된다. 당업계의 숙련된 통상의 기술자라면, 본 발명에서 제공되는 화합물(compound)이 표적 핵산에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100% 상보적임을 인식할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 (a) 폴리뉴클레오타이드의 표적 RNA 분자에 대한 결합이 표적 RNA 분자의 정상적인 기능을 저해하고, (b) 특이적인 결합이 요구되는 조건하에서, 즉, in vitro 분석이 수행되는 조건하에서 또는 in vivo 분석 또는 치료 용도의 생리학적 조건하에서, 폴리뉴클레오타이드의 표적 RNA 분자에 대한 결합이 고도로 선택적이고 폴리뉴클레오타이드의 비-표적(non-target) 서열에 대한 비특이적 결합을 크게 피하도록 충분한 상보성이 있는 경우 특이적으로 혼성화 될 수 있다. 본 발명에서 유용하기에 충분히 상보적인 올리고뉴클레오타이드를 디자인하는 방법의 예(example) 및 이러한 디자인 기술은 당업계의 숙련된 통상의 기술자라면 이해할 수 있을 것이다.

용어 "RNA" 또는 "RNA 분자(RNA molecule)" 또는 "리보핵산 분자(ribonucleic acid molecule)"는 리보뉴클레오타이드의 폴리머(polymer)를 의미한다. "표적 RNA(Target RNA)"는 본 발명의 충분히 상보적인 폴리뉴클레오타이드와 혼성화(hybridize) 할 수 있는 임의의 RNA를 의미한다. 표적 RNA는 pre-mRNA, pre-miRNA, pri-miRNA, mRNA, miRNA, snRNA(small nuclear RNAs) 또는 사이토졸릭 넌-코딩 조절 RNAs(cytosolic non-coding regulatory RNAs), 리보솜 RNA(ribosomal RNA), 운반 RNA(transfer RNAs), mRNA 프로세싱 경로의 어느 단계의 hnRNA(heterogenous nuclear RNA), 또는 미토콘드리아 RNA(mitochondrial RNAs)를 제한 없이 포함할 수 있다. "mRNA" 또는 "전령 RNA(messenger RNA)"는 하나 또는 하나 이상의 폴리펩타이드 사슬(chain)의 아미노산 서열을 명시하는 단일 가닥 RNA(single-stranded RNA)이다. 일 실시예에서, 본 발명의 표적 mRNA는 세포 단백질(cellular protein)(예를 들어, 핵(nuclear), 세포질(cytoplasmic), 미토콘드리아(mitochondrial), 막관통(transmembrane) 단백질 또는 막-결합 단백질(membrane-associated protein))의 아미노산 서열을 명시한다. 다른 실시예에서, 본 발명의 표적 mRNA는 세포외 단백질(extracellular protein)(예를 들어, 세포외 기질 단백질(extracellular matrix protein) 또는 분비 단백질(secreted protein))의 아미노산 서열을 명시한다. 용어 "DNA" 또는 "DNA 분자(DNA molecule)" 또는 "데옥시리보핵산 분자(deoxyribonucleic acid molecule)"는 데옥시리보뉴클레오타이드의 폴리머(polymer)를 의미한다.

용어 "핵산 분자(nucleic acid molecule)" 또는 "폴리뉴클레오타이드(polynucleotide)"는, 이에 제한되지는 않으나, 단일 사슬(single chain), 이중 사슬(duplex chain) 또는 다중 사슬(multiple chain) 어느 형태에서 1개 이상의 뉴클레오타이드의 DNA 및/또는 RNA를 포함하는 핵산-함유 분자(nucleic acid-containing molecule)를 의미한다. 상기 용어는 DNA 및 RNA의 공지된 어느 염기 유사체(analog)를 포함하는 서열을 포함한다. 용어 "폴리뉴클레오타이드"는 또한 2'-데옥시-D-리보스(2'-deoxy-D-ribose) 또는 이의 변형된 형태, RNA 및 퓨린(purine) 또는 피리미딘(pyrimidine) 염기(base)의 N-글리코시드(N-glycoside) 또는 C-글리코시드(C-glycoside)인 어느 다른 형태의 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 폴리데옥시리보뉴클레오타이드(polydeoxyribonucleotides), 또는 변형된 퓨린(purine) 또는 피리미딘(pyrimidine) 염기(base) 또는 염기성 뉴클레오타이드(basic nucleotide)를 포함하는 것을 의미한다. 몇몇 실시예에서, 폴리뉴클레오타이드는 프로모터 영역(promoter regions), 조절자 영역(operator regions), 구조적 영역(structural regions), 종결 영역(termination regions), 이들의 조합, 또는 염색질(chromatin) 또는 다른 폴리뉴클레오타이드(polynucleotides)를 조절하거나 변형시키는 유전적으로 관련 있는 어느 다른 물질을 암호화(coding)할 수 있다. 유사하게, 본 발명에 사용된 용어 "유전적(genetic)"은 유전자 발현을 변형시킬 수 있는 임의의 물질을 의미한다.

용어 "올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide)"는 짧은 길이의 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드 사슬(single-stranded polynucleotide chain)을 의미한다. 올리고뉴클레오타이드(Oligonucleotides)는 통상적으로 200 잔기(residues) 미만 길이(예를 들어, 약 8 내지 100)이다. 용어 "폴리뉴클레오타이드(polynucleotide)" 및 "올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide)"는 본 발명에서 상호교환적으로 사용된다.

본 발명에서 사용되는 "유전자 사일런싱(gene silencing)", "유전자 사일런싱 분자(gene silencing molecule)", "유전자 사일런싱 화합물(gene silencing compound)" 등은 적어도 그 일부가 혼성화(hyridization) 되는 표적 핵산에 적어도 부분적으로 상보적인 폴리뉴클레오타이드를 의미한다. 특정 실시예에서, 유전자 사일런싱 화합물은 표적 핵산의 발현 또는 양을 조절(예를 들어, 감소)한다. 특정 실시예에서, 유전자 사일런싱 화합물은 표적 pre-mRNA의 스플라이싱(splicing)을 변화시켜 다른 스플라이스 변이체(splice variant)를 생성한다. 특정 실시예에서, 안티센스 화합물(antisense compound)은 하나 또는 하나 이상의 상이한 표적 단백질의 발현을 조절한다. 본 발명에서 고려되는 유전자 사일런싱 메카니즘은, 이에 제한되지는 않으나, RNase H 메카니즘(RNase H mechanisms), RNAi 메카니즘(RNAi mechanisms), 스플라이싱 조절(splicing modulation), 번역 정지(translational arrest), RNA 프로세싱(RNA processing) 변경, microRNA 기능 억제, 및 microRNA 기능 모방(mimicking), 뿐만 아니라 본 발명에 개시된 내용을 읽는 당업자에 의해인식 가능한 추가적인 메카니즘을 포함한다.

용어 "작은 간섭 RNA(small interfering RNA)"("siRNA") (당업계에서 "짧은 간섭 RNA(short interfering RNAs)"로도 지칭된다)는 RNA 간섭을 유도하거나 조정할 수 있는 약 10-50 뉴클레오타이드 (또는 뉴클레오타이드 유사체)를 포함하는 RNA (또는 RNA 유사체)를 의미한다. 본 발명에서 사용된 용어 "RNA 간섭(RNA interference)"("RNAi")은 RNA의 선택적인 세포내 분해(intracellular degradation)를 의미한다. 몇몇 실시예에서, 생물활성제는 이중-가닥(double-stranded) siRNA 폴리 뉴클레오타드이다.

본 발명에서, "발현(expression)"은 유전자가 궁극적으로 단백질을 생성하는 과정을 의미한다. 발현은, 이에 제한되지는 않으나, 전사(transcription), 스플라이싱(splicing), 전사 후 변형(post-transcriptional modification), 및 번역(translation)을 포함한다.

용어 "유전자"는 폴리펩타이드(polypeptide), 전구체(precursor) 또는 RNA (예를 들어, rRNA, tRNA 및 다른 ncRNA)의 생산에 필요한 암호화(coding) 서열을 포함하는 핵산(예를 들어, DNA) 서열을 의미한다. 전장(full-length) 또는 단편(fragment)의 원하는 활성(activity) 또는 기능적 성질 (예를 들어, 효소 활성(enzymatic activity), 리간드 결합(ligand binding), 신호 전달(signal transduction), 면역원성(immunogenicity) 등)이 유지되는 한, 폴리펩타이드는 전장(full length) 암호화 서열 또는 암호화 서열의 임의의 부분에 의해 암호화 될 수 있다.

용어 "유전자 발현(gene expression)"은 유전자의 "전사(transcription)"를 통해 (즉, RNA 중합효소(polymerase)의 효소적 작용을 통해), 유전자에 암호화된 유전자 정보를 RNA (예를 들어, mRNA, rRNA, tRNA 또는 snRNA)로 변환하는 과정을 의미하며, 단백질 암호화 유전자의 경우, mRNA의 "번역(translation)"을 통해 단백질로 변환된다. 유전자 발현은 상기 과정의 많은 단계에서 조절될 수 있다. "상향-조절(up-regulation)" 또는 "활성화(activation)"는 유전자 발현 산물 (즉, RNA 또는 단백질)의 생산을 증가시키는 조절을 의미하는 반면, "하향-조절(down-regulation)" 또는 "억제(repression)"는 생산을 감소시키는 조절을 의미한다. 상향-조절 또는 하향-조절에 관여하는 분자(예를 들어, 전사 인자(transcription factors))는 종종 각각 "활성제(activators)" 및 "억제제(repressors)"라고 불린다.

용어 "유전자 발현 억제(inhibition of gene expression)"는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드가 표적 RNA에 혼성화 되고 상기 유전자의 기능의 부분적 또는 완전한 손실을 제공하는 조건을 의미한다. 폴리뉴클레오타이드는 특이적으로 혼성화 될 수 있는 그의 표적 RNA 분자의 서열과 100% 상보적일 필요는 없다는 것이 이해된다. 특정 실시예에서, 적어도 약 10%, 25%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%에 달하는 표적 유전자 발현의 감소는 본 발명의 두 기능을 가진 키메라 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드(bifunctional chimeric single stranded polynucleotides)가 없을 때에 발현 수준에 비례하여 요구된다. 본 발명은 특정 유전자의 발현 억제에 제한되지 않는다.

용어 "뉴클레오시드(nucleoside)"는 리보스(ribose) 또는 데옥시리보스(deoxyribose) 당(sugar)에 공유 결합된 퓨린 또는 피리미딘 염기를 가지는 분자를 의미한다. 예시적으로 뉴클레오시드는 아데노신(adenosine), 구아노신(guanosine), 시티딘(cytidine), 우리딘(uridine) 및 티미딘(thymidine)을 포함한다. 용어 "뉴클레오타이드(nucleotide)"는 당 부위에 에스테르 결합으로 결합된 하나 또는 하나 이상의 인산기(phosphate groups)를 가지는 뉴클레오시드를 의미한다. 예시적으로 뉴클레오타이드는 뉴클레오시드 1인산염(monophosphates), 2인산염(diphosphates) 및 3인삼염(triphosphates)을 포함한다. 용어 "폴리뉴클레오타이드(polynucleotide)" 및 "핵산 분자(nucleic acid molecule)"는 본 발명에서 상호교환적으로 사용되고, 뉴클레오타이드의 폴리머를 의미하며, 본 발명의 일 실시예에서 당 부위(moiety)의 5' 및 3' 탄소 원자(carbon atoms) 사이의 포스포디에스테르(phosphodiester) 결합에 의해 함께 결합된다.

용어 "뉴클레오타이드 유사체(nucleotide analog)" 또는 "변경된 뉴클레오타이드(altered nucleotide)" 또는 "변형된 뉴클레오타이드(modified nucleotide)"는 자연적(natural) 및 비-자연적으로(non-naturally) 생기는 리보뉴클레오타이드(ribonucleotides) 또는 데옥시리보뉴클레오타이드(deoxyribonucleotides)를 포함하는 흔치 않게 생기는 뉴클레오타이드를 의미한다. 뉴클레오타이드 유사체는 뉴클레오타이드 유사체가 이의 의도된 기능을 수행할 수 있는 능력은 유지하되, 뉴클레오타이드의 특정 화학적 성질이 변화되도록 임의의 위치에서 변형될 수 있다. 뉴클레오타이드 유사체는 또한 뉴클레오타이드의 당 부위에 변형을 포함할 수 있다. 뉴클레오타이드의 인산기는 또한, 예를 들어, 인산기의 하나 또는 하나 이상의 산소를 황(예를 들어, 포스포로티오에이트(phosphorothioates))으로 치환하거나, 뉴클레오타이드가 이의 의도된 기능을 수행하게 하는 다른 치환을 함으로써 변형될 수 있다.

본 발명의 화합물의 뉴클레오시드 구조 서브유닛(subunits)을 제조하는데 사용하기 위해, 상기 뉴클레오시드 서브유닛에 도입하기에 적합한 핵산염기(nucleobases)는 아데닌(adenine), 구아닌(guanine), 시토신(cytosine), 우리딘(uridine), 및 티민(thymine)과 같은 퓨린(purines) 및 피리미딘(pyrimidines), 뿐만 아니라, 크산틴(xanthine), 하이포크산틴(hypoxanthine), 2-아미노아데닌(2-aminoadenine), 6-메틸(6-methyl) 및 기타 아데닌(adenine) 및 구아닌(guanine)의 알킬 유도체(alkyl derivatives), 2-프로필(2-propyl) 및 기타 아데닌(adenine) 및 구아닌(guanine)의 알킬 유도체(alkyl derivatives), 5-할로우라실(5-halouracil) 및 시토신(cytosine), 5-프로피닐 우라실(5-propynyl uracil) 및 시토신(cytosine), 6-azo uracil, 시토신(cytosine) 및 티민(thymine), 5-우라실(5-uracil)(슈도우라실(pseudouracil)), 4-티오우라실(4-thiouracil), 8-할로(8-halo), 아미노(amino), 티올(thiol), 티오알킬(thioalkyl), 하이드록실(hydroxyl) 및 기타 8-치환된(8-substituted) 아데닌(adenines) 및 구아닌(guanines), 5-트리플루오로메틸(5-trifluoromethyl) 및 기타 5-치환된(5-substituted) 우라실(uracils) 및 시토신(cytosines), 7-메틸구아닌(7-methylguanine)과 같은 기타 합성 및 자연적 핵산염기를 포함한다. 추가적인 퓨린 및 피리미딘은 미국등록특허 제3,687,808호에 개시된 것, Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990에 개시된 것, 및 Englisch, et al. 1991 Angewandte Chemie, International Edition 30:613에 의해 개시된 것들을 포함하며, 이들은 모두 본 발명에서 참조로서 포함된다.

"포스포디에스테르(phosphodiester)"는 연속적인 뉴클레오타이드를 연결하는 산소 원자를 가진 폴리뉴클레오타이드를 의미한다. "포스포로티오에이트(Phosphorothiate)"는 2개의 연속적인 뉴클레오타이드를 정상적으로 연결하는 산소 원자가 황으로 대체되고 세포 효소(cullular enzymes)에 의한 분해에 저항하는 폴리뉴클레오타이드를 의미한다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 포스포디에스테르(phosphodiester), 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 3'-(또는 -5')데옥시-3'-(또는 -5')티오-포스포로티오에이트(3'-(또는 -5')deoxy-3'-(또는 -5')thio-phosphorothioate), 포스포로디티오에이트(phosphorodithioate), 포스포로셀레네이트(phosphoroselenates), 3'-(또는 -5')데옥시 포스피네이트(3'-(또는 -5')deoxy phosphinates), 보라노 포스페이트(borano phosphates), 3'-(또는 -5')데옥시-3'-(또는 5'-) 아미노 포스포르아미데이트(3'-(또는 -5')deoxy-3'-(또는 5'-) amino phosphoramidates), 하이드로젠 포스포네이트(hydrogen phosphonates), 보라노 포스페이트 에스테르(borano phosphate esters), 포스포르아미데이트(phosphoramidates), 알킬(alkyl) 또는 아릴(aryl) 포스포네이트(phosphonates) 및 포스포트리에스테르(phosphotriester) 인 결합(phosphorus linkages)을 포함하는 목록(list)으로부터 인 결합(phosphorus linkages)에 의해 연결된 이들의 뉴클레오시드 서브유닛을 가진다. 증가된 안정성을 위해 뉴클레오시드 결합의 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 변형은 최소로 사일런싱 활성(silencing activity)을 나타내는 것으로 보고된 바 있다(2007 Nat Rev Mol Cell Biol 8:23-6). 일 실시예에서, PS/2-O-Me를 포함하는 주쇄(backbone)는 PO/2-O-Me가 제한적인 것으로 보이는 상황에서 중요할 수 있다.

용어 "인산화된(phosphorylated)"은 적어도 하나의 인산기(phosphate group)가 화학적 (예를 들어, 유기(organic)) 화합물에 부착되는 것을 의미한다. 인산기는, 예를 들어, 유리 하이드록실기(free hydroxyl group) + 포스페이트(phosphate) → 공여(donor) 포스페이트 에스테르 결합의 반응을 통해 단백질 또는 당 부위에 결합될 수 있다. 또한 자연계에서 발견되는 모노-(mono-), 디-(di-), 또는 트리포스페이트기(triphosphate group)와 동일하거나 유사한 방식으로 작용하는, 포스페이트기 유사체(phosphate group analogs)가 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 의도된다. 일 실시예에서, 본 발명에 개시된 키메라 폴리뉴클레오타이드(chimeric polynucleotides)는 외적인(extrinsic) 5' 인산화(phosphorylation)를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 본 발명에 개시된 키메라 폴리뉴클레오타이드(chimeric polynucleotides)는 외적인(extrinsic) 5' 인산화를 포함하지 않는다. 용어 "외적인 5' 인산화(extrinsic 5' phosphorylation)"은 일반적으로 자연적인 생물학적 과정이 아닌 합성 방법을 통해 수행되는 인산화를 의미한다.

"키메라(chimeric)"는, 이에 제한되지는 않으나, 뉴클레오타이드 또는 유사체가 의도된 기능을 유지할 수 있게 하는, 자연 발생 또는 포스포디에스테르(phosphodiester), 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 및/또는 다른 자연 발생 또는 합성 결합에 의해 결합된 뉴클레오티드 유사체인 RNA 및 DNA 부위(moiety) 양쪽 모두로 구성된 분자를 의미한다. 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 적어도 2개의 분절(segments)을 가지는 것으로 언급될 수 있다. 하나의 분절은 폴리뉴클레오타이드의 3' 말단(end)에서 시작되는 부분(portion)으로 정의되며 리보핵산(ribonucleic acid) 분절이고, 적어도 약 3개의 연속적인 리보뉴클레오타이드(ribonucleotide)를 포함해야 하며, 제2분절은 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단에서 끝나는 부분으로 정의되며, 주로 디옥시리보 핵산(deoxyribonucleic acid) 부분이고, 총 0개, 1개, 2개 또는 3개의 리보뉴클레오타이드(riboncucleotides)가 적어도 약 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 데옥시리보뉴클레오타이드(deoxyribonucleotides) 사이에 위치할 수 있는, 적어도 약 6개, 7개, 8개, 9개 또는 10개의 데옥시리보뉴클레오타이드(deoxyribonucleotides)를 포함한다. 일 실시예에서, 제2섹션(section)은 적어도 5개의 연속적인 데옥시리보뉴클레오타이드를 포함한다. 일 실시예에서, 5' 말단으로부터 2번째 위치는 2'-OMe 변형 RNA(2'-OMe modified RNA)이다.

본 발명에 따른 바람직한 단일 가닥 키메라 폴리뉴클레오타이드(single stranded chimeric polynucleotides)는 바람직하게는 약 8 내지 약 50개의 뉴클레오시드 서브유닛을 포함한다. 본 발명과 관련하여, 이는 8 내지 50개의 뉴클레오시드 서브유닛을 가지는, 상기 전술한 바와 같이, 비-자연적으로 생기는 올리고머(oligomer)를 포함하는 것으로 이해된다. 본 발명의 단일 가닥 키메라 폴리뉴클레오타이드는 보다 바람직하게는 약 15 내지 약 25개의 뉴클레오시드 서브유닛을 포함한다. 따라서, 단일 가닥 키메라 폴리뉴클레오타이드는 8개의 뉴클레오타이드 길이, 9개의 뉴클레오타이드 길이, 10개의 뉴클레오타이드 길이, 11개의 뉴클레오타이드 길이, 12개의 뉴클레오타이드 길이, 13개의 뉴클레오타이드 길이, 14개의 뉴클레오타이드 길이, 15개의 뉴클레오타이드 길이, 16개의 뉴클레오타이드 길이, 17개의 뉴클레오타이드 길이, 18개의 뉴클레오타이드 길이, 19개의 뉴클레오타이드 길이, 20개의 뉴클레오타이드 길이, 21개의 뉴클레오타이드 길이, 22개의 뉴클레오타이드 길이, 23개의 뉴클레오타이드 길이, 24개의 뉴클레오타이드 길이, 25개의 뉴클레오타이드 길이, 26개의 뉴클레오타이드 길이, 27개의 뉴클레오타이드 길이, 28개의 뉴클레오타이드 길이, 29개의 뉴클레오타이드 길이, 30개의 뉴클레오타이드 길이, 31개의 뉴클레오타이드 길이, 32개의 뉴클레오타이드 길이, 33개의 뉴클레오타이드 길이, 34개의 뉴클레오타이드 길이, 35개의 뉴클레오타이드 길이, 36개의 뉴클레오타이드 길이, 37개의 뉴클레오타이드 길이, 38개의 뉴클레오타이드 길이, 39개의 뉴클레오타이드 길이, 40개의 뉴클레오타이드 길이, 41개의 뉴클레오타이드 길이, 42개의 뉴클레오타이드 길이, 43개의 뉴클레오타이드 길이, 44개의 뉴클레오타이드 길이, 45개의 뉴클레오타이드 길이, 46개의 뉴클레오타이드 길이, 47개의 뉴클레오타이드 길이, 48개의 뉴클레오타이드 길이, 49개의 뉴클레오타이드 길이, 또는 50개의 뉴클레오타이드 길이 일 수 있다. 인식할 수 있는 바와 같이, "뉴클레오시드 서브유닛(nucleoside subunit)"은 올리고리보뉴클레오타이드(oligoribonucleotides)에서 인 결합(phosphorus linkages)을 통해 그리고 올리고리보뉴클레오시드(oligoribonucleosides)에서 비-인 결합(non-phosphorus linkages)을 통해 인접한 서브유닛에 적절하게 결합된 핵산염기(nucleobase) 및 당(sugar) 또는 당 대용물(sugar surrogate)의 조합이다. 상기 문맥에서, 용어 "뉴클레오시드 서브유닛(nucleoside subunit)"은 용어 "뉴클레오시드 유닛(nucleoside unit)" 또는 "뉴클레오시드(nucleoside)"로 상호교환적으로 사용된다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 키메라 올리고뉴클레오타이드(chimeric oligonucleotides)는 자연적으로 발생하는 포스포디에스테르 결합(phosphodiester linkages)에 의해 연결된 뉴클레오시드를 가지는 것이다.

특정 실시예에서, 생물활성제는 단일 가닥 폴리뉴클레오티드(single-stranded polynucleotide)이고, 폴리뉴클레오타이드는 표준 최적화(standard optimization) siRNA 기술로부터 얻은 가이드 가닥(guide strand)이다. 본 발명에서는 통상적인 siRNA 서열 선택에 대한 논의가 포함된다.

siRNA에 의해 유도된 표적 RNA 절단(cleavage) 반응은 고도로 서열-특이적이다. 일반적으로, 표적 유전자(target gene)의 염기 서열(nucleotide sequence) 또는 염기 서열의 일부와 동일한 염기 서열을 포함하는 siRNA가 억제(inhibition)에 바람직하다. 그러나, siRNA와 표적 유전자 사이의 100% 서열 상동성(sequence identity)은 본 발명을 실시하는데 요구되지 않는다. 따라서, 본 발명은 유전적 돌연변이(genetic mutation), 종 다형성(strain polymorphism) 또는 진화적 분기(elvolutionary divergence)로 인해 예상될 수 있는 서열 변이(sequence variations)를 허용할 수 있는 이점을 가진다. 예를 들어, 표적 서열(target sequence)에 대해 삽입(insertions), 결실(deletions) 및 단일 점 돌연변이(single point mutations)를 가진 siRNA 서열 또한 억제에 효과적인 것으로 밝혀졌다. 대안으로, 뉴클레오타이드 유사체 치환(substitutions) 또는 삽입(insertions)을 갖는 siRNA 서열은 억제에 효과적일 수 있다.

또한, siRNA의 모든 위치가 표적 인지(target recognition)에 동등하게 기여하는 것은 아니다. siRNA의 중심(center)에서의 불일치(mismatch)가 가장 중요하며, 본질적으로 표적 RNA 절단(cleavage)을 없앤다. 대조적으로, siRNA의 3' 뉴클레오타이드는 표적 인지의 특이성(specificity)에 유의하게 기여하지 않는다. 특히, 표적 RNA(target RNA) (예를 들어, 가이드 서열(guide sequence))에 상보적인 siRNA 서열의 3' 잔기는 표적 RNA 절단에 중요하지 않다.

서열 상동성(sequence identity)은 당업계에 공지된 서열 비교(sequence comparison) 및 정렬 알고리즘(alignment algorithms)에 의해 확인할 수 있다. 2개의 핵산 서열 (또는 2개의 아미노산 서열)의 상동성 %를 확인하기 위해, 서열은 최적의 비교 목적을 위해 정렬된다 (예를 들어, 갭(gap)은 최적 정렬을 위해 제1서열 또는 제2서열에 도입될 수 있다). 이어, 상응하는 뉴클레오타이드 (또는 아미노산) 위치의 뉴클레오타이드 (또는 아미노산 잔기)를 비교한다. 제1서열에서의 위치가 제2서열에서의 상응하는 위치와 동일한 잔기에 의해 점유될 때, 분자는 그 위치에서 동일하다. 두 서열 간의 상동성 %는 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이며 (즉, 상동성 % = 동일한 위치의 수/전체 위치 수 × 100), 도입된 갭(gap)의 수 및/또는 도입된 갭의 길이에 대한 점수를 선택적으로 부과한다.

서열의 비교 및 두 서열 간의 상동성 %의 확인은 수학적 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다. 일 실시예에서, 정렬은 낮은 정도의 상동성을 가지는 전체 부분이 아니나, 충분한 상동성을 가지는 정렬된 서열의 특정 부분에 걸쳐 생성된다 (즉, 국부 정렬(local alignment)). 서열의 비교를 위해 사용된 국부 정렬 알고리즘의 바람직한, 비-제한적인 예는 Karlin 및 Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77에서 변형된 Karlin 및 Altschul ((1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68의 알고리즘이며, 본 발명에서 참조로서 포함된다. 이러한 알고리즘은 Altschul, 등 (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10의 BLAST 프로그램 (버전 2.0)에 통합되어 있으며, 본 발명에서 참조로서 포함된다.

또 다른 실시예에서, 정렬은 적절한 갭(gap)을 도입함으로써 최적화되고, 상동성 %는 정렬된 서열의 전반에 걸쳐 확인되었다 (즉, 갭 정렬(gap alignment)). 비교 목적을 위해 갭 정렬을 얻기 위해, Gapped BLAST는 Altschul, 등, ((1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402)에 기재된 바와 같이 사용될 수 있다. 또 다른 실시예에서, 정렬은 적절한 갭을 도입함으로써 최적화되고, 상동성 %는 정렬된 서열의 전체 길이에 걸쳐 확인되었다 (즉, 포괄 정렬(global alignment)). 서열의 포괄 비교(global comparison)에 사용되는 수학적 알고리즘의 바람직한, 비-제한적인 예는 Myers 및 Miller, CABIOS (1989)의 알고리즘이다. 이러한 알고리즘은 GCG 서열 정렬 소프트웨어 패키지(GCG sequence alignment software package)의 일부인 ALIGN 프로그램 (버전 2.0)에 통합되어 있다. 아미노산 서열을 비교하기 위해 ALIGN 프로그램을 사용할 때, PAM120 중량 잔기 표(PAM120 weight residue table), 12의 갭 길이 페널티(penalty) 및 4의 갭 길이 페널티(penalty)가 사용될 수있다.

siRNA와 표적 유전자의 부분 간에 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 또는 약 100%의 서열 상동성이 바람직하다. 대안으로, siRNA는 표적 유전자 전사체(transcript)의 일부와 혼성화 될 수 있는 뉴클레오타이드 서열 (또는 올리고뉴클레오타이드 서열)로서 기능적으로 정의될 수 있다 (예를 들어, 400 mM NaCl, 40 mM PIPES pH 6.4, 1 mM EDTA, 12 내지 16시간 동안 50℃ 또는 70℃ 혼성화; 이후 세척). 추가의 예시적인 혼성화 조건은 1×SSC로 70℃에서 또는 1×SSC, 50% 포름아마이드(formamide)로 50℃에서 혼성화 한 후 0.3×SSC로 70℃에서 세척하거나, 4×SSC로 70℃에서 또는 4×SSC, 50% 포름아마이드(formamide)로 50℃에서 혼성화 한 후 1×SSC로 67℃에서 세척하는 것을 포함한다. 길이가 50개의 염기쌍(base pairs) 미만으로 예상되는 혼성체(hybrid)의 혼성화 온도는 혼성체의 용융 온도(melting temperature, Tm) 보다 5 내지 10℃ 낮아야 하며, 여기에서 Tm은 하기 식에 따라 결정된다. 길이가 18개의 염기쌍 미만인 혼성체의 경우, Tm(℃)=2(A+T 염기의 수)+4(G+C 염기의 수). 길이가 18 내지 49 염기쌍인 혼성체의 경우, Tm((℃)=81.5+16.6(log10[Na+])+0.41(% G+C)-(600/N)이며, 여기에서 N은 혼성체 염기의 수이고, [Na+]는 혼성화 버퍼(buffer)의 나트륨 이온의 농도이다 (1×SSC=0.165M에 대한 [Na+]). 폴리뉴클레오타이드 혼성화를 위한 엄격한 조건의 추가적인 예는 Sambrook, J., E. F. Fritsch, 및 T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., chapters 9 및 11, 및 Current Protocols in Molecular Biology, 1995, F. M. Ausubel 등, eds., John Wiley & Sons, Inc., sections 2.10 및 6.3-6.4에서 제공되며, 본 발명에서 참조로서 포함된다. 동일한 뉴클레오타이드 서열의 길이는 적어도 약 10개, 12개, 15개, 17개, 20개, 22개, 25개, 27개, 30개, 32개, 35개, 37개, 40개, 42개, 45개, 47개 또는 50개 염기를 포함할 수 있다.

치료 방법(Treatment methods)

하나의 양태로서, 본 발명은 고형 종양(solid tumor)에서 카제인 키나아제 2(casein kinase 2)의 발현을 억제하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 폴리뉴클레오타이드를 전달하는 표적화된 나노입자를 종양에 투여하는 것을 포함하며, 상기 폴리뉴클레오타이드는 카제인 키나아제 2 핵산 서열에 혼성화하고 이의 발현을 감소시키거나 저해한다.

하나의 양태로서, 본 발명은 고형 종양에서 카제인 키나아제 2의 하류 표적(downstream targets)의 활성을 조절하는 방법을 제공한다. 몇몇 실시예에서, 카제인 키나아제 2의 하류 표적은, 제한 없이, NF-kB p65, Cdc37 및 AKT를 포함한다. 본 발명의 방법은 폴리뉴클레오타이드를 전달하는 표적화된 나노입자를 종양에 투여하는 것을 포함하며, 상기 폴리뉴클레오타이드는 카제인 키나아제 2 핵산 서열에 혼성화하고, 예를 들어, Ki-67을 포함하는, 카제인 키나아제 2 활성의 하류 표적(downstream targets), 및/또는 하류 표지(downstream markers)의 활성을 감소시키거나 저해한다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 고형 종양의 크기를 감소시키거나 개체에서 고형 종양의 성장을 억제 또는 안정화시키는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 폴리뉴클레오타이드를 전달하는 표적화된 나노입자를 종양에 투여하는 것을 포함하며, 상기 폴리뉴클레오타이드는 카제인 키나아제 2 핵산 서열에 혼성화하고 이의 발현을 감소시키거나 저해한다. 특정 실시예에서, 폴리뉴클레오타이드를 종양에 전달하는 표적화된 나노입자는 결과적으로 고형 종양의 크기의 감소 또는 성장의 안정화 또는 억제를 야기한다.

본 발명에서 사용된 용어, "개체(subject)"는 임의의 동물 (예를 들어, 포유류)을 의미하며, 이에 제한되지는 않으나, 인간, 비-인간 영장류(non-human primates), 척추동물(vertebrate animals), 설치류(rodents) 등을 포함하고, 특정 치료의 피험자(recipient)일 수 있다. 용어 "개체(subject)", "환자(patient)" 및 "개인(individual)"은 본 발명에서 상호교환적으로 사용된다.

몇몇 실시예에서, 표적은 시험관 내(in vitro) 조직 또는 세포와 같은 시험관 내(in vitro) 생물학적 시스템(biological system)이며, 상기 방법은 여기에서 기재한 나노입자와 표적을 접촉시키는 것을 포함한다.

일 실시예에서, 카제인 키나제 2에 결합하기 위한 올리고뉴클레오타이드는 서열번호 8 (카제인 키나아제 2 알파(casein kinase 2 alpha)가 표적인 경우) 또는 서열번호 9 (카제인 키나아제 2 알파 프라임(casein kinase 2 alpha prime)이 표적인 경우) 에 나타낸 서열을 가진다. 본 발명에 따른 나노입자 조성물의 일 실시예에서, 나노입자는 복수 개의 폴리뉴클레오타이드를 포함하며, 상기 서열번호 8을 포함하는 복수 개의 폴리뉴클레오타이드의 퍼센테이지는 평균적으로 약 1% 내지 약 100%, 약 30% 내지 70%, 약 40% 내지 약 60%, 약 45% 내지 약 55%, 약 48% 내지 약 52%, 약 49% 내지 약 51%, 또는 약 50% 이며, 상기 복수 개의 폴리뉴클레오타이드의 나머지는 서열번호 9를 포함한다. 각각의 폴리뉴클레오타이드 서열의 퍼센테이지에 영향을 미치는 요인은, 예를 들어, 나노입자를 제조할 때 도입된 각각의 폴리뉴클레오타이드의 상대적인 양(volume) 또는 각각의 폴리뉴클레오타이드의 상대적 캡슐화 퍼센테이지를 포함한다. 상기 조성물의 폴리뉴클레오타이드 구성은 혼성화 분석(hybridization assay) 및 기능적 세포 검정법(functional cell assay)과 같은 당업계에 공지된 샘플링 방법(sampling methods)을 사용하여 확인될 수 있다.

본 발명에 따른 나노입자 조성물의 일 실시예에서, 나노입자의 혼합물(mix)은 서열번호 8 또는 서열번호 9를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 본 발명에 따른 나노입자 조성물의 다른 실시예에서, 서열번호 8을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 나노입자의 퍼센테이지는 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80% 또는 약 90% 이며, 상기 조성물의 나노입자의 나머지는 서열번호 9를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.

본 발명의 방법에 의한 치료가 고려되는 대표적인 종양은 특정 암과 관련된 것들을 포함하며, 제한 없이, 유방암(breast cancer), 폐암(lung cancer) (비소세포성 폐암(non-small cell lung carcinoma) 포함), 전립선암(prostate cancer), 대장암(colorectal cancer), 뇌암(brain cancer), 식도암(esophageal cancer), 신장암(kidney cancer), 방광암(bladder cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 자궁경부암(cervical cancer), 두경부암(head and neck cancer), 피부암(skin cancers), 비인두암(nasopharyngeal carcinoma), 지방육종(liposarcoma), 상피암(epithelial carcinoma), 신세포암(renal cell carcinoma), 담낭 선암(gallbladder adenocarcinoma), 이하선 선암(parotid adenocarcinoma), 난소암(ovarian cancer), 흑색종(melanoma), 림프종(lymphoma), 신경교종(glioma), 및 자궁내막 육종(endometrial sarcoma)을 포함한다.

일 실시예에서, 본 발명의 방법에 의한 치료는 고형 종양 암(solid tumor cancer)으로 진단된 환자에 투여하는 것을 포함한다. 본 발명에서 사용된 "고형 종양(Solid tumor)"은 세포의 증식으로 인한 비정상적인 조직 덩어리를 의미한다. 고형 종양은 신체의 어느 부위에서나 발생할 수 있으며 양성 (암성(cancerous)이 아님) 또는 악성 (암성) 일 수 있다. 백혈병(leukemias) 이외의 대부분 유형의 암은 고형 종양을 형성할 수 있다. 고형 종양은 선암(adenocarcinomas), 암종(carcinomas), 혈관종(hemangiomas), 지방육종(liposarcomas), 림프종(lymphomas), 흑색종(melanomas) 및 육종(sarcomas)을 제한 없이 포함한다. 용어 "고형 종양"은 자궁내막증(endometriosis)과 같은 상태, 즉, 세포의 제어되지 않는 증식에 의해 야기되는 상태를 의미하는데 사용될 수도 있다.

테나신(Tenascin)은 고형 종양의 미세 환경(microenvironment)에서 과발현(overexpression) 되는 것으로 보여지는 큰 당단백질(glycoprotein)이다 (Brellier, 등, 2011 J Cell Molec Med 16: 32-40). 테나신에 대한 수용체(receptor)는 종양 세포에서 발견되며, 테나신-유도 리간드(tenascin-directed ligands)를 가진 치료용 나노입자를 사용하여 고형 종양 암 치료를 위한 매력적인 표적을 대표한다. 종양 세포에서 발견되는 테나신에 대한 수용체의 비-제한적인 예는 인테그린 알파 V(integrin alpha V), 알파 2(alpha 2), 베타 1(beta 1) 및 베타 3(beta 3)을 포함한다. 당업계에서 숙련된 통상의 기술자라면, 일단 개시된 것으로, 과도한 실험 없이, 고형 종양에 생물활성제를 표적화하고 전달하기 위한 목적으로, 고형 종양에 대한 테나신-유도 리간드(tenascin-directed ligand) 나노입자를 확인, 제조, 및 이용할 수 있을 것이다. 이러한 테나신-유도 리간드(tenascin-directed ligands)의 비-제한적 예로는, 이에 제한되지는 않으나, 텐피브겐(tenfibgen)을 포함하는, 테나신-C(tenascin-C), 테나신-W(tenascin-W) 및 이들의 단편(fragments)이 포함된다.

일 실시예에서, 본 발명의 나노입자 조성물은 표적 유전자의 발현 억제가 잠재적으로 사용되는 임의의 증상을 치료하는데 유용하다. 또 다른 실시예에서, 상기 조성물은 증식성 질환(proliferative disease)을 앓고 있는 개체를 치료하기 위해 사용될 수 있다. "증식성 질환(proliferative disease)"은 양성 또는 악성에 관계없이, 세포, 세포군(groups of cells), 또는 조직의 단일(single) 또는 다중(multiple) 국부적(local) 비정상 증식을 특징으로 하는 기관, 충치(cavities) 또는 신체 부위의 임의의 하나 또는 임의의 조합에 영향을 주는 임의의 인간 또는 동물 질환 또는 장애를 의미한다.

용어 "치료(treatment)", "치료하는(treating)" 등은 개체(subject)에서 원하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 얻거나 평가하기 위한 목적으로 하나 또는 하나 이상의 경우에 치료제, 백신을 투여하거나, 진단하는 것을 의미한다. 효과는 질환(disease) 또는 이의 증상(symptom)을 완전히 또는 부분적으로 예방하는 관점에서 예방적일 수 있고 및/또는 질환에 기인하는 질환 및/또는 부작용 (증상)에 대한 부분적 또는 완전한 치료의 관점에서 치료적일 수 있다. 본 발명에서 사용된 "치료(treatment)"는, 개체의 질환 치료 모두를 포함하며, 제한 없이, (a) 질환에 걸릴 수 있으나 아직 질환을 가진 것으로 진단되지 않은 개인에게 발생하는 질환 또는 상태를 예방하는 것; (b) 질환의 제거 또는 억제, (예를 들어, 질환의 발달 억제); 또는 (c) 질환 완화 (예를 들어, 질환과 관련된 증상을 감소시키거나 없애는 것);를 포함한다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 서열번호 8의 적어도 8개의 연속적인 뉴클레오타이드의 부분을 포함하는 최대 약 50개의 뉴클레오타이드 길이의 단일 가닥(single-stranded, ss) 올리고뉴클레오타이드를 제공하며, 상기 ss 올리고뉴클레오타이드는 인간 카제인 키나아제 2 알파(human casein kinase 2 alpha)의 발현을 억제한다. 또 다른 양태로서, 본 발명은 서열번호 9의 적어도 8개의 연속적인 뉴클레오타이드의 부분을 포함하는 최대 약 50개의 뉴클레오타이드 길이의 ss 올리고뉴클레오타이드를 제공하며, 상기 ss 올리고뉴클레오타이드는 인간 카제인 키나아제 2 알파 프라임(human casein kinase 2 alpha prime)의 발현을 억제한다.

투여(Administration)

본 발명의 치료용 조성물의 제제 및 이들의 후속 투여(subsequent administration)는 본 발명에 기재되어 있으며, 당업계의 숙련된 통상의 기술자에 의해 실시될 수 있다. 일반적으로, 치료법에 있어서, 치료를 필요로 하는 환자에게 본 발명에서 기재한 바와 같이 투여량(dosages) 및 신규 처방(regimen) 전략으로 본 발명에 따른 조성물이 제공된다. 본 발명의 몇몇 실시예에서, 투여는 치료되는 환자의 체중 또는 체표면적(surface area), 연령 및 질환(disease) 또는 장애(disorder)의 중증도(severity) 중 하나 또는 하나 이상에 기반하여 결정된다.

일 실시예에서, 개체는 적절한 제어(control)에 대한 표적 유전자의 발현을 감소, 안정화 또는 억제하기에 충분한 투여량(dose)/양으로, 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 나노입자 조성물로 처리된다. 또 다른 실시예에서, 개체는 적절한 제어(control)에 대한 표적 병변(lesion)을 감소, 안정화 또는 억제하기에 충분한 투여량(dose)/양으로 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드(single-stranded polynucleotide)로 치료된다. 또 다른 실시예에서, 생물활성제 (예를 들어, 폴리뉴클레오타이드) 투여량은 약 20 ㎎/㎏ 체중(body weight) 미만, 약 10 ㎎/㎏ 체중 미만, 또는 약 5 ㎎/㎏ 체중 미만이거나 동일하다. 다른 실시예에서, 생물활성제, 예를 들어, 단일 가닥 키메라 폴리뉴클레오타이드(single-stranded chimeric polynucleotide)는, 약 4 ㎎/㎏ 체중(body weight) 미만, 약 3 ㎎/㎏ 체중 미만, 약 2 ㎎/㎏ 체중 미만, 약 1 ㎎/㎏ 체중 미만, 약 100 ㎍/㎏ 체중 미만, 약 100 ng(nanogram)/㎏ 체중 미만, 약 10 ng/㎏ 체중 미만, 약 1 ng/㎏ 체중 미만, 약 100 pg(picogram)/㎏ 체중 미만, 약 10 pg/㎏ 체중 미만, 약 1 pg/㎏ 체중 미만, 약 100 fg(femtogram)/㎏ 체중 미만, 약 10 fg/㎏ 체중 미만, 약 1 fg/㎏ 체중 미만, 약 100 ag(attogram)/㎏ 체중 미만, 약 10 ag/㎏ 체중 미만, 또는 약 1 ag/㎏ 체중 미만의 투여량으로 전달된다. 유사한 투여량 범위가 개발될 수 있으며, 예를 들어 개체의 체표면적(body surface area)에 기반하여 사용될 수 있다.

치료 요법(treatment regimen)은 특정 질환의 특성, 중증도 및 환자의 전반적인 상태에 따라 변할 수 있는 기간 동안 지속될 수 있고, 1일 1회에서 30년마다 1회까지 연장될 수 있다. 치료 후, 환자는 자신의 상태 변화 및 질환 또는 장애 상태의 증상 경감에 대해 모니터링 될 수 있다. 생물활성제의 투여량은 환자가 현재 투여량 수준에 현저하게 반응하지 않는 경우에 증가될 수 있거나, 질환 또는 장애의 증상 경감이 관찰되거나 또는 질환 또는 장애가 제거된 경우 투여량이 감소될 수 있다.

투약(Dosing)은 치료되는 질환 상태의 중증도 및 반응성에 의존적이며, 치료 과정은 며칠에서 수개월까지 지속되거나, 완치(cure)가 이루어지거나 질환 또는 장애의 감소가 달성될 때까지 의존적이다. 최적의 투약 일정은, 예를 들어, 환자의 신체에서 생물활성제 축적의 측정으로부터 계산될 수 있다. 통상의 기술자는 최적의 투여량, 투약 방법 및 반복률(repetition rates)을 용이하게 결정할 수 있다. 최적의 투여량은 개별 화합물의 상대적 효능에 따라 달라질 수 있으며, 예를 들어, 시험관 내(in vitro) 및 생체 내(in vivo) 동물 모델에서 효과가 있는 것으로 밝혀진 EC50에 기초하여 일반적으로 추정될 수 있다. 투여량은, 예를 들어, 매일, 매주, 매달 또는 매년 1회 또는 1회 이상, 또는 심지어 2 내지 30 년마다 1회 투여될 수 있다.

몇몇 실시예에서, 본 발명의 방법은 값(value), 수준(level), 특징(feature), 특성(characteristic), 성질(property) 등을, 본 발명에서 "적합한 대조(appropriate control)"로 상호교환적으로 언급되는 "적절한 대조(suitbale control)"와 비교하는 것과 관련되는 단계를 포함한다. "적절한 대조(suitable control)" 또는 "적합한 대조(appropriate control)"는 비교 목적으로 유용한 당업계의 통상의 기술자에게 친숙한 임의의 대조(control) 또는 표준(standard)이다. 일 실시예에서, "적절한 대조(suitbale control)" 또는 "적합한 대조(appropriate control)"는 본 발명에서 기재된 바와 같이 나노입자의 조성물을 투여하기 전에 확인된 값(value), 수준(level), 특징(feature), 특성(characteristic), 성질(property) 등이다. 예를 들어, 본 발명의 나노입자의 조성물을 세포 또는 유기체 내로 도입하기 전에 전사율(transcription rate), mRNA 수준, 번역율(translation rate), 단백질 수준, 생물학적 활성(biological activity), 병변 크기(lesion size), 세포 특성(cellular characteristic) 또는 성질(property), 유전자형(genotype), 표현형(phenotype) 등을 확인할 수 있다. 또 다른 실시예에서, "적절한 대조(suitbale control)" 또는 "적합한 대조(appropriate control)"는 세포 또는 유기체에서, 예를 들어, 정상적인 형질(traits)을 나타내는 대조군 또는 정상 세포 또는 유기체에서 확인된 값(value), 수준(level), 특징(feature), 특성(characteristic), 성질(property) 등이다. 또 다른 실시예에서, "적절한 대조(suitbale control)" 또는 "적합한 대조(appropriate control)"는 미리 정의된 값(value), 수준(level), 특징(feature), 특성(characteristic), 성질(property) 등이다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따라 제조된 나노입자의 조성물에서 치료적 유효량의 생물활성제를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는 치료 방법을 제공한다. 예를 들어, 생물활성제의 "치료적 유효량"이란 용어는 질환 또는 장애 (또는 그러한 질환 또는 장애의 증상)의 안정화(stabilizing), 감속(slowing), 감소(reducing), 제거(eliminating) 또는 예방(preventing)과 같은 원하는 표현형(phenotype)을 얻거나 원하는 치료 기능을 수행할 수 있는 양을 의미한다. 필요한 정확한 양은 사용된 생물활성제, 개체(subject)의 상태 및 치료 요법의 매개 변수(parameters)와 같은 공지된 변수에 따라 달라질 것이다. 따라서 정확한 "치료적 유효량"을 명시할 필요는 없다. 오히려, 적절한 유효량은 통상적인 실험을 사용하여 당업계의 통상의 기술자에 의해 결정될 수 있다.

본 발명의 조성물은 국소(local) 또는 전신(systemic) 치료가 바람직한지의 여부 및 치료할 영역(area)에 따라 다수의 경로를 통해 투여될 수 있다. 투여는 국소 (안과(ophthalmic), 질(vaginal), 직장(rectal), 비강내(intranasal), 경피(transdermal) 포함), 경구 또는 비경구(parenteral) 일 수 있다. 비경구 투여는, 이에 제한되지는 않으나, 정맥 내(intravenous), 피하(subcutaneous), 복강 내(intraperitoneal) 또는 근육 내 주사(intramuscular injection), 종양 내(intratumoral) 또는 척수강 내(intrathecal) 또는 심실내(intraventricular) 투여를 포함한다. 이론에 구속되기를 바라는 것 없이, 입자 (조성물)의 투여 옵션(options)의 유연성은 세포 및 분자 표적에 도달하도록 입자 및 이의 약물 카고(cargo)가 생물학적 장벽(biologic barriers) 및 혈류 벽(bloodstream wall), 림프 채널(lymphatic channels) 및 피부와 같은 크기가 제한적인 구조(size-limited structures)를 통과하게 허용하여, 부분적으로, 본 발명의 조성물의 고도로 안정한 나노입자의 작은 크기 및 낮은 표면 전하에 의해 가능해진다.

본 발명의 조성물의 나노입자의 "낮은 표면 전하(low surface charge)"는 일반적으로 약 -20 내지 약 +4 밀리-전자 볼트(milli-electron volts, mev)의 평균 표면 전하를 의미하며, 당업계에서 숙련된 통상의 기술자라면, 본 발명의 나노입자가 상기 범위를 벗어나는 평균 표면 전하를 가지더라도, 나노입자가 구형(spherical shape) 또는 타원형(elliptical shape), 50 나노미터 미만의 크기 및 결정화된(crystallized) 형태를 유지한다면 여전히 치료 목적으로 이용될 수 있는 것으로 이해할 것이다.

일 실시예에서, 본 발명은 예를 들어, 제한 없이, 증식성 질환(proliferative disease), 예를 들어, 제한 없이, 암(cancer), 이러한 질환 또는 장애 (또는 그러한 질환 또는 장애의 증상)의 안정화(stabilizing), 감속(slowing), 감소(reducing) 또는 제거(eliminating)와 같은 원하는 표현형(phenotype)을 얻거나 원하는 기능을 수행하기 위한 목적으로, 질환 또는 장애의 치료를 위한 적합한 조건하에서 개체에 치료적 유효량의 나노입자 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 개체의 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공하며, 상기 나노입자는 서열번호 8 및 서열번호 9의 혼합물(mix)을 포함하는 생물활성제, 약 6.0 미만이거나 동일한 HLB 값을 가지는 계면활성제를 포함하는 마이셀 코어, 상기 마이셀 코어에 흡착된 쉘(shell)을 포함하며 텐피브겐(tenfibgen), Li⁺ 및 Cs⁺을 포함하고, 약 50 나노미터 미만의 평균 직경을 가지며, 상기 나노입자는 하나 또는 하나 이상의 전술한 경로를 통해 투여된다. 또 다른 실시예에서, 본 발명의 방법은 Cs⁺으로 Li⁺의 전처리(pre-treatment)를 포함한다. 일 실시예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 표적 세포 당 적어도 약 1개, 약 5개, 약 10개, 약 50개, 약 100개, 약 500개 또는 약 5000개의 폴리뉴클레오타이드의 전달을 허용하는 양으로 도입될 수 있다.

하기 실시예에 기재된 결과를 기반으로 본 발명의 몇몇 혜택(benefit) 및 이점(advantage)을 아래에 설명한다. 멸균 증류수와 Cs⁺으로 전처리된(pre-mixed) Li⁺으로 제조하고, 2R-변형 항-CK2(2R-modified anti-CK2)서열번호 8(SEQ ID NO: 8) 및 서열번호 9(SEQ ID NO: 9)를 포함하는 올리고뉴클레오타이드의 혼합물(mix)을 캡슐화(encapsulation)한, 안정한 텐피브겐-쉘-50 나노미터 미만의 나노입자(tenfibgen-shell sub-50 nanometer nanaparticle)는 30일 기간에 걸쳐 마우스에서 종양 성장을 현저하게 억제하였다(하기 표 3). 상기 혼합물이 처리된 종양의 분석 또한 세포 증식(cell proliferation) 마커(marker)인 Ki-67 및 염증(inflammation) 마커인 NF-kB의 현저한 억제를 나타내었다. 유사한 실험 조건하에서, 오로지 나노캡슐화된 2R-변형 서열번호 8(nanoencapsulated 2R-modified SEQ ID NO: 8)이 처리된 마우스는 대조군(control) 대비 종양 무게 및 NF-kB 감소를 나타내었지만, 변화는 유의하지 않았으며, 처리군(treated group)에 대한 Ki-67 지표(index)는 대조군 대비 증가하였다. 유사하게, 오로지 나노캡슐화되고, 변형되지 않은(unmodified) 올리고뉴클레오타이드 혼합물(mix) (서열번호 5 및 서열번호 6)이 처리된 마우스는 Ki-67 및 NF-kB의 작은 변화와 함께 종양 무게의 증가를 보였다.

나노입자 제조(Preparation of nanoparticles )

표적화된 50 미만(sub-50)의 나노입자를 제조하는데 사용될 수 있는 방법에 대한 하기의 설명은 오직 대표적인 것만을 의미하며 이에 제한되는 것은 아니다. 미국등록특허 제6,632,671호, 미국등록특허 제7,741,304호 및 미국특허공보 제2013/0267577호에는 변형되지 않은(unmodified) 나노입자 제조에 대해 개시되어 있으며, 본 발명에서 참조로서 포함된다. 간략하게, 예를 들어 종양 세포에 표적화되고 전달되는 핵산과 같은 음전하를 띤(negatively-charged) 생물활성제는 약 50 ㎚ 또는 미만으로 그 크기를 응집 또는 감소시키기 위해 양이온다중 폴리머(polycationic polymer)와 복합(complexed) 될 수 있다. 다수의 상이한 양이온다중 폴리머(polycationic polymer) ("응집성(condensing)" 물질 또는 단백질로도 공지된다)가 사용될 수 있고 당업계에 잘 공지되어 있다(Rolland 1998, Crit. Rev. Therapeutic Drug Carr. Syst., 15:143-198). 예를 들어, 충분한 양이온다중 응집 단백질(polycationic condensing protein)은 음전하를 띤(negatively-charged) 카고 모이어티(cargo moiety)와 복합되어 음전하를 띤 카고 모이어티의 적어도 약 75%(예를 들어, 약 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100%)를 중화(neutralization) 시킬 수 있는 핵산에 대해서는 에티디움 염료 배제(ethidium dye exclusion)에 의해 측정될 수 있다 (예를 들어, (1998, J. Controlled Release, 53:289-99) 참조). 간단히 한 예로서, 125 ㎍의 10 kD 폴리오르니틴(polyornithine)을 사용하여 20-머(20-mer) 올리고뉴클레오타이드 500 ㎍을 응집하거나, 87.5 ㎍의 스페르민(spermine)을 사용하여 250 ㎍의 14 kD siRNA 올리고(oligo) 응집할 수 있다. 음전하가 없거나 양전하를 띤 카고 모이어티의 경우, 응집성(condensing) 양이온다중 폴리머(polycationic polymer)가 필요하지 않을 수 있다.

복합(complexed) 또는 복합되지 않은(uncomplexed) 카고 모이어티(cargo moiety)의 수용액(aqueous solution)은 인버티드(inverted) 또는 리버스(reverse) 마이셀의 제조에 적합한 생체적합성(biocompatible)의 불수용성(water-insoluble) 계면활성제 시스템(surfactant system)을 사용하여 생체적합성, 수-혼화성 용매(water-miscible solvent)에 카고 모이어티를 먼저 분산시킴으로써 캡슐화 될 수 있다. 적절한 계면활성제 시스템은 본질적으로 소수성(hydrophobic)이고 약 6 미만의 HLB(hydrophile-lipophile balance; 친수성-친유성 평형치), 약 200 μM 미만의 CMC(critical micelle concentration; 임계 마이셀 농도) 또는 1 보다 큰 임계 패킹 직경(critical packing diameter)을 특징으로 하는 친양매성(amphiphilic) 물질로서 제제 분야에서 잘 알려져 있다. 몇몇 실시예에서, 상기 HLB는 약 5 미만이다. 리버스(reverse) 마이셀을 제조하기에 적합한 소수성 계면활성제(Hydrophobic surfactants) 및 소수성(hydrophobic) 수-혼화성 용매(water-miscible solvent)는 Pashley & Karaman (2004, In Applied Colloid and Surface Chemistry, John Wiley, pp. 60-85), Rosen (2004, in Surfactants and Interfacial Phenomena, John Wiley), The Handbook of Industrial Surfactants (1993, Ash, ed., Gower Pub), 및 Perry's Chemical Engineer's Handbook (1997, Perry & Green, 7th Ed., McGraw-Hill Professional)에 개시되어 있으며, 본 발명에서 참조로서 포함된다.

몇몇 실시예에서, 계면활성제 성분은 2,4,7,9-테트라메틸-5-데신-4,7-디올(TM-디올)(2,4,7,9-tetramethyl-5-decyn-4,7-diol(TM-diol)), 2,4,7,9-테트라메틸-5-데신-4,7-디올(TM-디올)(2,4,7,9-tetramethyl-5-decyn-4,7-diol(TM-diol))의 블렌드(blend), 하나 또는 하나 이상의 아세틸렌 디올기(acetylenic diol groups), 세틸알코올(cetyl alcohol), 또는 이들의 임의의 조합(combination)을 갖는 분자일 수 있다. 몇몇 실시예에서, DMSO, DMF, 피마자유(castor oil) 또는 이들의 임의의 조합과 같은 식품 또는 USP 등급 오일을 포함하는 수-혼화성 용매(water-miscible solvent)가 사용될 수 있다. 일 실시예에서, 소수성 계면활성제는 계면활성제 마이셀 양(volumne)에 대한 중량을 기준으로 최대 약 0.5 중량%의 농도로 사용되는, SE-30 (Air Products)과 같은 2,4,7,9-테트라메틸-5-데신-4,7-디올(TM-디올)(2,4,7,9-tetramethyl-5-decyn-4,7-diol(TM-diol)) 또는 이의 조합 일 수 있으며, 수-혼화성 용매(water-miscible solvent) DMSO 일 수 있다. 선택된 계면활성제의 농도는 광학용 투명 나노에멀젼(optically clear nanoemulsion)을 제조하기에 충분해야 하나, 응집(aggregation)이 지나치게 큰 나노입자를 초래한 후 응집을 유도하지는 못한다.

카고 모이어티 (즉, 계면활성제 마이셀)를 담지하는 마이셀은 하나 또는 하나 이상의 표적 부분을 나노입자의 수성 희석제(aqueous dilution)와 혼합함으로써 종양 표적 부분 (예를 들어, 텐피브겐(tenfibgen))에 코팅될 수 있다. 몇몇 실시예에서, 표적 부분 및 나노입자가 용해되거나 분해되기를 원하는 속도(rate)를 포함하는 요인에 따라, 표적 부분은 표적 부분에 대한 생물활성제의 약 1:500 내지 약 10:1의 비(중량 기준)로 나노입자와 혼합될 수 있다. 일 실시예에서, 표적 부분에 대한 생물활성제의 중량비는 약 1:90 (즉, 1/90^th)이다. 일 실시예에서, 표적 부분에 대한 생물활성제의 중량비는 약 1:40 이다.

나노입자 리간드는 최종 나노입자 기능을 향상시키도록 고안된 공정에 의해 변형될 수 있다. 비-제한적인 예로서, 코팅 리간드는 공지된 수준의 중금속(heavey metal)으로 제조된 포화 황산암모늄 용액(saturated ammonium sulfate solutions)에서 단백질을 재침전(re-precipitation) 시킴으로써 약제학적으로 허용되는 중금속으로 용이하게 변형될 수 있다. 원심분리에 의해 금속-변형된 코팅 리간드(metal-modified coating ligand)를 회수하기 전에 포화 황산암모늄 용액(saturated ammonium sulfate solutions)과 약 0.1 내지 1 ㎎/㎖ 단백질 리간드 용액의 1:1의 비율로의 인큐베이션(incubation)이 약 4 내지 36시간 동안 가장 신속하게 수행된다. 초고순도 황산암모늄 중의 금속 농도는, 예를 들어, 1 ppt(part per thousand) 내지 1 ppm(part per trillion)의 범위일 수 있다. 추가의 비-제한적인 예로서, 산화 스트레스를 촉진 시키는 것으로 알려진 금속이 나노입자 제조에 앞서 코팅 리간드에 흡착되도록, 금속-함유 황산암모늄을 사용하여 테나신 폴리펩티드는 세포 배양 상등액으로부터 침전될 수 있다.

리간드-흡착된 나노입자(ligand-adsorbed nanoparticle)를 안정화시키기 위해, 하나 또는 하나 이상의 리간드로 코팅된 나노입자의 수성 현탁액(aqueous suspension)을 상기 코팅된 나노 입자와 침전(precipitating), 결정화(crystallizing) 또는 이온영동 교환(iontophoretic exchange) 할 수 있는 금속 이온의 수용액 (즉, "안정화 용액(stabilization solution)")에 혼합할 수 있다. 코팅된 나노입자를 형성하는데 사용될 수 있는 용질(solute)의 대표적인 비-제한적인 예는 주기율표(periodic table)에 열거된 원소로부터 유래된 이온 종(ionic species)을 포함한다. 이온은, 예를 들어, 약 0.1 ppt(part per trillion) 내지 1 M(Molar)의 범위로 수성 안정화 조성물(aqueous stabilization composition)에 포함될 수 있다. 코팅된 나노입자가 이온과 충분히 접촉되도록 충분한 양의 이온이 포함되어야 하나, 지나치게 큰 나노입자를 초래할 수 있는 응집(aggregation)이 일어나지는 못한다.

일 실시예에서, 안정화 (또는 결정화(crystallization) 또는 수용(receiving)) 용액은 약 10 mM(millimolar)의 Ca^{2 +} 및 약 126 mM의 Li⁺을 포함 할 수 있다. 초고순도(ultrapure) 시약이 안정화 용액에 사용되는 경우, 코팅된 나노 입자의 안정화를 최적화하기 위해 Ba, Fe, Mg, Sr, Pb 및 Zn과 같은 매우 소량 (예를 들어, 약 1 mM 미만)의 이온이 첨가될 수 있다. 일 실시예에서, 나노입자가 멸균 증류수로 제조될 때, 증가된 안정성을 위해 126 mM의 Li⁺은 2.5ppb의 CS⁺으로 전처리(pre-treated) 된다. 일 실시예에서, 안정화 용액은 10 mM Ca^{2 +}, 126 mM Li⁺(2.5 ppb Cs⁺과 전혼합(pre-mixd)), 14 nM Sr^{2 +}을 포함한 0.042 mM Ba^{2 +}, 6.25 nM Mg²⁺을 포함한다 (실험실 등급 증류수로 제조된 Sr^{2 +} 및 Mg^{2 +}을 제외하고, 멸균 증류수를 사용하여 모든 원액((stock solution)을 모두 초고순도(ultrapure)로 준비하고, 모든 금속(metal)은 염화물 염(chloride salts)으로서 사용되며, 총 베스 용량(volume)은 대략 30㎖ 이다). 시스템의 유연성은 여기에 설명된 것보다 약 10배 낮은 리튬 수준에서 합성된 높은 수준의 세포내 유입(cellular uptake)를 나타내는 나노입자에 의해 입증된다 (데이터는 나타내지 않았다). 당업자는 다양한 대응이온(counter-ions)이 염화물(chloride), 황산염(sulfate), 및 질산염(nitrate)과 같은 안정화 용액에서 상기 금속들과 함께 사용할 수 있다는 것을 이해할 것이다.

염(salts) 및 금속(metal)에 대해 사용된 용어 "초고순도(ultrapure)"는 약 99% 또는 약 99% 이상의 순수(pure) 또는 이용가능한 가장 높은 순도(purity)의 염 및 금속을 의미한다. 당업자는 초고순도 염(ultrapure slats)과 금속은 일반적으로 상업적으로 이용할 수 있으며, 필요하다면 나노입자 제제에 상기 초고순도 물질의 함량 변화의 영향을 변경하는 것은, 예를 들어, 이전의 제제에서 사용된 다른 염 및 금속의 기준치(baseline) 수준(level)을 조정함으로써, 과도한 실험 없이, 해결 될 수 있음을 이해할 것이다. 제제(formulation)에서 바륨(barium)의 수준(level)을 감소시키는 것은, 예를 들어, 제제화된 나노입자의 크기, 형태, 및/또는 기능을 유지하기 위해, 염화칼슘 2수화물(calcium chloride dihydrate) 내 불순물 수준의 증가를 상쇄시킬 수 있다. 본 발명에 사용된 "실험실 등급(laboratory grade)"의 염(salts) 및 금속(metals)은 초고순도가 아닌 염 및 금속을 의미한다. 주어진 제제의 라인(line)에서 나노입자의 크기, 모양 및/또는 기능의 일관성(consistency)을 유지하기 위해, 최종 염 수용 용액에 첨가된 염 및 금속의 총 중량의 25%, 20%, 15%, 10% 또는 5% 미만과 같은 실험실 등급의 염 및 금속의 사용을 최소화하는 것이 추천된다.

일 실시예에서, 세슘(Cesium, Cs)-전처리된 리튬(lithium) 나노입자는 Cs로 전처리 되지 않은 나노입자와 구별된 다형성 형태를 포함한다. 상기 구별은, 예를 들어, 하기 표 1에 제시된 Cs 및 비-CS(non-Cs) 나노입자 사이의 융점(melting point) 및 FTIR 스펙트럼(spectra)의 실질적인 차이에 의해 입증된다. 본 발명에 사용된, 용어 "다형체(polymorph)" 및 "다형성 형태(polymorphic form)"는 화합물(compound) 또는 복합체(complex)의 고체 결정형으로 배열된 형태(solid crystalline-ordered forms)를 의미한다.

나노입자와 같은 관심 있는 화합물의 하나 또는 하나 이상의 고체 상태 형태는 결정화(crystallization)에 의해 생성될 수 있다. 하나 또는 하나 이상의 고체 상태 형태는 또한 상이한 손분자(guest molecule) (즉, 결정 격자(crystal lattice)의 주성분이 아닌 성분)를 갖는 화학 물질의 공결정화(cocrystallization)에 의해 생성될 수 있다. 하나 또는 하나 이상의 고체 형태는 또한 새로운 초분자 어셈블리(supramolecular assembly)를 생성하기 위해 초분자 어셈블리에 성분(element) 또는 성분-조합(element-combination)을 포함 시키거나 새로운 성분 또는 성분-조합을 추가함으로써 생성될 수 있다.

결정화의 현상(phenomena) 중에는 핵형성(nucleation) 및 성장 과정이 있다. 결정 핵형성(Crystal nucleation)은 액체(liquid), 과포화 용액(supersaturated solutions), 포화 증기(saturated vapors) 또는 비정질상(amorphous phases)으로부터 배열된(ordered) 고체상(solid phase)의 형성이다. 성장은 기존 표면에 분자가 침적(deposition)에 기인한 결정체(crystals)의 확대이다. 핵형성(nucleation)은 "시드(seed)" 결정체의 존재에 의해 유도될 수 있다. 일부의 고체 입자는 촉매 효과(catalytic effect)를 제공하고 새로운 상(phase) 형성에 대한 에너지 장벽을 감소시키기 위해 존재한다. 결정체는, 예를 들어, 핵형성 위치(site)로서 작용하는 극미량의 이물질(foreign substance) (예를 들어, 용기(container) 벽(wall)의 불순물 또는 상처(scratches))에서 유래할 수 있다. 핵형성은 또한 결정화 환경(crystallization environment)을 교반(stirring) 하거나, 또는 초소형(ultra-small) 나노 규모(nanoscale)의 마이셀을 염 용액으로 분무화(atomizing)하는 공정에 의해 관찰될 수 있는 것과 같이 개시 표면(initiating surface)과 물리적 에너지(physical energy) 모두를 함께 적용함으로써, 외부(external) 또는 비화학적(nonchemical) 수단에 의해 촉진될 수 있다.

실제로, 나노입자와 같은 화합물의 다형성 및 신규한 형태는, 예를 들어, 화합물의 용해도(solubility), 안정성(stability), 유동성(flowability), 깨짐성(fracturability) 및 압축성(compressibility)에 영향을 미치는 제약 분야에 공지 되어있다 (Knapman, K. 2000 Modern Drug Discovery 3: 53-58). 따라서, 나노입자 약물의 신규한 다형체 또는 고도로-관련된(highly-related) 구조 형태(structural form)의 발견은 다양한 이점을 제공할 수 있다.

다형체는, 이에 제한되지는 않으나, 시차주사 열량측정법 (differential scanning calorimetry, DSC), 열 중량 분석 (thermogravimetry, TGA), X-선 분말 회절 분석 (X-ray powder diffractometry, XRPD), 단일 결정 X-선 회절 분석 (single crystal X-ray diffractometry), 진동 분광기(vibrational spectroscopy), 용액 열량측정법 (solution calorimetry), 고체핵자기공명 (solid state nuclear magnetic resonance, solid state NMR), 적외선분광법 (infrared(IR) spectroscopy), 푸리에-변환 적외선 분광법 (Fourier-transform infrared spectroscopy, FTIR), 라만 분광법(Raman spectroscopy), 핫 스테이지 광학 현미경검사 (hot stage optical microscopy), 전자주사현미경 (scanning electron microscopy, SEM), 투과전자현미경 (transmission electron microscopy, TEM), 전자결정학 (electron crystallography) 및 정량 분석, 입자 크기 분석 (particle size analysis, PSA), 표면적 분석 (surface area analysis), 용해도 및 용해 속도와 같은 공지된 기술을 사용하여 검출, 확인, 분류 및 특성화 될 수 있다.

본 발명에 사용된, 그래픽 형태(graphical form) (예를 들어, XRPD, IR, FTIR, 라만(Raman) 및 NMR 스펙트럼(spectra))로 원래 생성된 스펙트럼 또는 데이터와 관련하여, 달리 표시되어 있지 않은 한, 용어 "피크(peak)"는 당업계에서 숙련된 통상의 기술자가 배경 잡음(background noise)에 기인하지 않는 것으로 인식할 수 있는 피크 또는 다른 특별한 특징을 의미한다. 피크 위치 결정(positioning)의 해석(interperting) 또는 판독(reading)의 일부 제한된 분산(variance)은 피크 검출(detection)에서 기계(machine) 및/또는 알고리즘 가변성(algorithm variability)으로 인해 발생할 수 있다.

이론에 구속되기를 바라는 것 없이, 하기 표 1에 제시된 물질 과학 데이터는 놀랍게도 비-세슘(non-cesium) 나노입자와 비교하여 본 발명의 나노입자의 융점(melting point) 및 FTIR 스펙트럼(spectra)에서 현저한 변화를 유도한 미량의 세슘 (성분 조합의 형태, 즉, 세슘-처리된 리튬(cesium-treated lithium))의 첨가를 나타낸다. 융점의 변화는 물리적 상태의 변화에 부합하는 신규한 다형성 형태를 나타낸다. 하기 표 1에 제시된 데이터는, 개선된 운송 성능과 길어진 Burton-유래 시험관 내 (in vitro) 방출 시간에 의해 입증되는 바와 같이, 나노입자의 안정성의 증가와 융점의 측정된 변화와 관련된다.

본 발명에서 논의된 바와 같이, 세슘-처리된 리튬으로 제조된 나노입자는 크기 및 형태 (50 ㎚ 미만의 회전 타원체(spheroid), 장방형(cuboid) 또는 타원형(elliptical))에 대하여 적절한 나노입자를 형성하는 반면, 염 수용 베스(bath)에서 리튬과 단순히 혼합된 세슘으로 제조된 나노입자는 그렇지 못했다. 상기 관찰은 단순히 세슘의 첨가가 아니라, 성분 조합, 즉, 세슘-처리된 리튬의 도입을 뒷받침하며, 이는 전술한 융점의 현저한 변화 및 이에 따른 향상된 안정성을 유도했다.

일 실시예에서, 소수성 마이셀 코어, 리간드 쉘 및 캡슐화된 생물활성제를 가지는 Cs-전처리된 리튬 50 나노미터 미만의 나노입자는 겉보기 분자량(apparent molecular weight) 10,000 달톤 이상, 20,000 달톤 이상 또는 30,000 달톤 이상의 초분자 어셈블리(supramolecular assembly) (여기에서 Cs 다형체 나노입자로서 언급한다)의 신규한 다형성 형태를 포함한다. 당업자는 예를 들어, Yarra 3u SEC-2000, 30 ㎝×7.8 ㎜ 컬럼(column) 및 0.1M 인산염 버퍼(phosphate buffer), pH 7에 0.3M NaCl의 이동상(mobile phase)을 포함하여 UV 검출에 사용하여, 예를 들어, 초고분해능 수성 크기 배제 크로마토그래피(ultra high resolution aqueous size exclusion chromatography)와 같은 표준 방법(standard methods)으로 겉보기 분자량(apparent molecular weight)을 측정할 수 있다.

일 실시예에서, 세슘 및 리튬의 성분 조합은 수성 환경(aqueous environment)에서 형성, 사용 및/또는 저장될 수 있는 Cs 다형체 나노입자를 생성한다.

또 다른 실시예에서, Cs 다형체 나노입자의 리간드 쉘(shell)은 텐피브겐(tenfibgen)을 포함한다. 또 다른 실시예에서, Cs 다형체 나노입자의 리간드 쉘(shell)은 히알루로난(hyaluronan)을 포함한다.

바람직하게 가능한 한 중성(neutral)에 가깝거나 약간 음(negative)인, 낮은 표면 전하를 가지며, 및/또는 소형(compact) 또는 대략 회전 타원체(spheroid), 장방형(cuboid) 또는 타원형(elliptical)의 형태를 가지는 나노입자는 최적화된 안정성을 보여준다. 또한, 나노입자의 안정성을 증가시킬 수 있는 임의의 다른 성분이 안정화 용액의 일부로서 포함될 수 있어, 나노입자의 최종 평균 직경이, 예를 들어, 약 5 내지 50 ㎚의 범위 사이에 있게 된다. 특정 실시예에서, 본 발명에 따른 조성물의 나노입자는 약 5 내지 약 50 나노미터, 약 5 내지 약 40 나노미터, 약 5 내지 약 30 나노미터, 또는 약 5 내지 약 20 나노미터의 평균 직경을 가진다.

입자 크기는 예를 들어, 염 수용 용액에서 결정화한 후 인큐베이션 시간의 길이를 포함하는 일상적인 매개 변수(parameters) 변화를 통해 조작될 수 있다. 일 실시예에서, 나노입자는 원자력현미경(atomic force microscopy, AFM)에 의해 측정된다. 또 다른 실시예에서, 나노입자는 투과전자현미경(transmission electron microscopy, TEM)에 의해 측정된다. 또 다른 실시예에서, 나노입자는 동적광산란법(dynamic light scattering, DLS)에 의해 측정된다. 또 다른 실시예에서, 나노입자는 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography, SEC)에 의해 측정된다. 또 다른 실시예에서, 나노입자는 당업계에 공지된 방법에 의해 건조 상태에서 측정된다. 달리 언급하지 않는 한, 평균 직경은 건조 상태에서 측정된 바와 같이 나노입자의 장축(major axis) 및 단축(minor axis)의 평균으로서 여기에서 표현된다. 일반적으로, 약 10:1, 약 5:1 또는 약 3:1 이상의 평균 장축 대 단축 면적비(major-to-minor-dimension ratios)를 가지는 나노입자의 제제 또는 조성물은 본 발명에서 의도된 용도에 적합하지 않다.

보다 일관된 크기의 나노입자의 경우, 나노입자는 선택적으로 노즐(nozzle)을 통해 수용 용액에 분무화 될 수 있다. 분무화(atomization)는 딱딱한 응집체를 유발하는 정도까지의 힘은 주지 않으면서 응집시킨 응집체(aggregates)를 파괴할 수 있는 전단력(shear force)을 적용하기에는 충분해야 한다. 당업계의 숙련된 통상의 기술자라면, 특정 노즐 직경이 나노입자를 적합하고 일관된 크기로 분무화 하기에 적합한 공급 압력(feed pressures)의 범위를 이끈다는 것을 이해할 것이다. 일 실시예에서, 약 10 psi 미만의 공급 압력과 약 250 마이크론(micron) 보다 작은 노즐 직경은 적절한 나노입자를 생성한다.

안정화된 나노입자는 최종 용도로 입자 용해 또는 분해에 요구되는 또는 원하는 시간량에 따라 다양한 시간 및 온도에서 인큐베이션 될 수 있다. 인큐베이션 시간은 약 8 시간 내지 약 7 일까지 다양할 수 있다. 몇몇 실시예에서, 나노입자는 4℃에서 공칭 회전(nominal rotation) 시키며 36 내지 48시간 동안 라운드-버텀 튜브(round-bottomed tube) 내에서 인큐베이션 된다. 이론에 구속되기를 바라는 것 없이, 배양 시간이 길어지면 입자의 크기와 안정성이 모두 증가하는 결정화를 더 높인다. 안정화 용액에서 나노입자를 분무 및/또는 인큐베이션 한 후에, 나노입자는 여과되고, 원심분리되고 및/또는 분리된 별개의 50 ㎚ 미만의 나노입자를 포함하는 조성물을 얻기 위해 건조될 수 있다. 일 실시예에서, 나노입자는 2시간 동안 4℃에서 20,000xg로 원심분리되고 0.2 ㎛ 필터를 통해 멸균 여과된다. 생성된 나노입자는 약 -20℃에서 동결되거나 건조되고 나중에 사용하기 위해 재구성될 수 있다. 키메라 폴리뉴클레오타이드로서 제조된 서열은 선택적으로 프로필 3' 말단-블록된(propyl 3' end-blocked) 것이다.

일 실시예에서, 나노입자는 통상적으로 나노입자를 안정화시키는데 사용되는 폴리에틸렌 글리콜 (polyethylene glycol, PEG) 및 유사한 종류 없이 제조된다. 다른 실시예에서, 나노입자는 당업계에 공지된 표준 방법을 사용하여 동결건조되고 보다 낮거나 동일하거나 더 높은 농도로 재현탁 될 수 있다.

본 발명은 특히 다수의 실시예를 참조로 하여 나타내고 설명되더라도, 당업계의 숙련된 통상의 기술자라면, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 본 발명에 개시된 다양한 실시예에 대한 형태 및 세부 사항의 변화가 이루어질 수 있으며, 본 발명에 개시된 다양한 실시예는 청구 범위의 범위를 제한하고자 하는 것이 아니다라는 것이 이해된다.

본 발명은 하기 실시예에서 추가로 기술될 것이며, 이는 청구 범위에 기재된 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아니다.

실시예 1: 표적화된 치료용 나노입자의 제제

다양한 카고(cargo) 및 표적 부위를 포함하는 예시적인 나노입자는 하기와 같이 제조하였다.

제제 A(Formula A): 2㎖ 코니컬 튜브(conical tube)에서, 1㎎/㎖ 농도가 되도록 멸균 증류수(sterile water; HPLC 등급, Fisher)에 500㎍의 CK2(포스포디에스테르(phosphodiester) 3' 및 프로필기가 블록된(propylend blocked)-2'-OMe RNA 키메라, "LCK-6", (미국등록특허 제7,741,304호, 상기 등록특허는 여기에서 전부 참조로서 포함된다.))에 대한 키메라 올리고(chimeric oligo)(서열번호 5) 폴리뉴클레오타이드를 간단히 볼텍싱(vortexing) 하고, 이후, 200㎍의 10 kD 폴리오르니틴(polyornithine, Sigma)과 복합시켰으며, 불수용성 계면활성제 시스템(water-insoluble surfactant system)(TM-디올 블렌드(TM-diol blend)(SE-30, Air Product)), 10㎍ DMSO에 10㎍을 사용하여 150㎕의 멸균 증류수에 분산시켰다. 150㎕의 DMSO를 첨가하여 볼텍싱(vortexing)한 후, 5분 동안 베스(bath)형 소니케이터(sonicator)에 넣어 수용성(water-miscible) 용매(DMSO)로 유화(emulsification)시킨 후, 복합체(complex)를 인버팅(inverting) 하고 700㎕의 PBS를 첨가하여 희석시켰다.

상기 결과로 생성된 소수성(hydrophobic) 마이셀(micelle)은, 본 발명에서 기재한 바와 같이, 15분 동안 베스형 소니케이터에 넣고, 5㎖ 폴리프로필렌 튜브(polyproplene tube)로 옮겨 3㎖까지 PBS를 채워 희석한 후, 주로 Li⁺(126 mM Li⁺(Li⁺에 2.5 ppb Cs⁺ 전혼합(premix)), 10 mM Ca^{2 +}, 14 nM Sr^{2 +}을 포함한 0.042 mM Ba²⁺, 6.25 nM Mg^{2 +}을 함유하는 멸균 증류수의 염 수용 용액(salt receiving solution)으로 약 10 psi 미만의 공급 압력(feed pressure)을 지닌 약 250 ㎛ 직경의 오리피스(orifice)를 사용하여 수동식 엑추에이터(manual actuator)로 분무화(atomization) 하는, 변형시킨 Aukhill 등의 방법(J. Biol . Chem ., 268: 2542-53 (1993))에 의해 제조된 테나신(tjenascin)의 재조합 피브리노겐(fibrinogen) 단편(fragment)(TBG) 5.5㎍을 첨가하여 코팅(비공유) 하였다 (실험실 등급 증류수로 제조된 Sr^{2 +} 및 Mg^{2 +}을 제외하고, 멸균 증류수를 사용하여 모든 원액((stock solution)을 모두 초고순도(ultrapure)로 준비하고, 모든 금속(metal)은 염화물 염(chloride salts)으로서 사용되며, 총 베스 용량(volume)은 대략 30㎖ 이다). 총 반응 부피(total reaction volume)는 36㎖이었다. 안정화 용액(stabilization solution) 제조에 사용된 멸균 증류수로 테스트한 하기 금속의 수준(level)은 총합에서 0.1ppm(parts per million) 미만으로 측정되었다: 알루미늄(aluminum), 비소(arsenic), 바륨(barium), 카드뮴(cadmium), 크롬(chromium), 구리(copper), 철(iron), 납(lead), 망간(magnanese), 니켈(nickel), 루비늄(rubinium), 황(sulfur), 바나듐(vanadium) 및 아연(zinc).

상기 전혼합 단계(premixing step)는 50㎖ 튜브의 멸균 증류수에 약 4M Li⁺에 대해 약 0.1㎍/1㎖의 Cs⁺, Li⁺에 대한 중량을 기준으로 약 2.5 ppm Cs⁺을 첨가하고, 약 2분 동안 회전시키는 것을 포함한다. 염 용액(salt solution)에서 코팅된 마이셀을 보다 더 안정화시키고자, 48시간 동안 콜드룸(cold-room)(4℃)에서 40㎖ 라운드-버텀 튜브(round-bottomed tube)를 공칭 회전(nominal rotation) 시키며 인큐베이션(incubation)한 후, 2시간 동안 4℃에서 20,000xg로 원심분리(centrifugation)하여 50㎚ 미만의 나노입자를 회수하고, PBS + 10% 락티톨(lactitol)(1㎍/㎕의 농도로)로 재현탁(resuspension) 시켰으며, 2㎖ 코니컬 튜브로 옮겨 4℃에서 5분 동안 최대 속도(maximum speed)로 스핀다운(spin down) 시키고, PBS/10% 락티톨로 펠릿(pellet)을 재현탁하여 세척하고, 0.2 ㎛ 필터로 여과하여 멸균한 후 -20 ℃에서 동결시켰다.

본 발명의 실시예에 기재된 모든 제제에서, 소량(코팅 중량의 1%)의 시리안 햄스터 IgG(Syrian Hamster IgG)는 항-시리안 햄스터 항체(anti-Syrian Hamster antibody)에 의해 나노입자 유입(uptake)의 면역검출(immunodetection)이 가능하도록 리간드(ligand) 코트(coat)에 "스파이크(spiked)" 되었다. 운모 시트(mica sheet)에서 건조 시킨 시료(sample) 1 e^(-27) g/㎖의 타원형 직경(elliptical diameter)을 이용하여 태핑 모드(tapping mode) 원자력 현미경(atomic force microscopy, AFM)으로 측정한 평균 입자 크기는 50㎚ 미만이었다. 평균 입자 크기는 측정된 나노 입자의 주축(major axis)과 단축(minor axis)의 평균으로 표현하였다. AFM 측정은 1ng/㎖의 현탁액(suspension)이 카본 그리드(carbon grid)에 스파팅(spotting) 된 TEM 음성 염색(negative staining)에 의해 추가적으로 지원되었다. NIH 이미지 J(NIH Image J)는 평균 입자 직경을 계산하는 데 사용하였다. 가장 일반적으로, 평균 입자 크기는 약 8 나노미터 내지 약 30 나노미터 범위였다. 2㎍/㎖의 1 mM KCl에서의 측정 사이에 2분 휴지(pause)를 가지고, 20 볼트(volt)의 포텐셜(potential)에서 Zetasizer 4 DLS(Dynamic light scattering) 장치(device)로 측정된 바와 같이, 제제 A(Formula A)는 -2.4 ± 2.3 mev의 표면 전하(surface charge)를 갖는 TEM에 의해 16 ± 2.3 ㎚의 평균 입자 직경을 가지는 것으로 측정되었다.

테나신 -기반 리간드(Tenascin -based ligands): 테나신은 암 활성에 관련되어 있으며, 또한 평활근 세포(smooth muscle cells)에 특이적인 것으로 알려져 있다; 더욱이, 테나신의 펩타이드 도메인(peptidic domain)은, 예를 들어, 미국등록특허 제6,124,260호에 기술되어 있으며, 당업계에 공지되어 있다. 일 실시예에서, 본 발명에 적합한 테나신은 H. sapiens 테나신 C(tenascin C), Genbank Accession No. NM_002160이다. 또한, 테나신 펩타이드 및 특정 세포 유형과의 부착(adhesion)을 위한 도메인(domain) 뿐만 아니라 테나신의 기능적 및 구조적 측면이 개시되어 있고, 예를 들어, Aukhill, et al. 1993 J Biol Chem 268 : 2542-2553, 당업계에 공지되어 있다. 테나신 및/또는 이의 임의의 도메인은 본 발명의 리간드로서 적합하다. 일 실시예에서, 테나신의 피브리노겐 단편(fragment)(여기에서, 테나신-C 또는 텐피브겐(tenfibgen) 또는 TBG의 Fbg-L 도메인으로도 언급하였다; 본 발명의 일 실시예에서 사용된 텐피브겐(tenfibgen)의 뉴클레오타이드 서열은 하기와 같다(atgattggactcctgtaccccttccccaaggactgctcccaagcaatgctgaatggagacacgacctctggcctctacaccatttatctgaatggtgataaggctcaggcgctggaagtcttctgtgacatgacctctgatgggggtggatggattgtgttcctgagacgcaaaaacggacgcgagaacttctaccaaaactggaaggcatatgctgctggatttggggaccgcagagaagaattctggcttgggctggacaacctgaacaaaatcacagcccaggggcagtacgagctccgggtggacctgcgggaccatggggagacagcctttgctgtctatgacaagttcagcgtgggagatgccaagactcgctacaagctgaaggtggaggggtacagtgggacagcaggtgactccatggcctaccacaatggcagatccttctccacctttgacaaggacacagattcagccatcaccaactgtgctctgtcctacaaaggggctttctggtacaggaactgtcaccgtgtcaacctgatggggagatatggggacaataaccacagtcagggcgttaactggttccactggaagggccacgaacactcaatccagtttgctgagatgaagctgagaccaagcaacttcagaaatcttgaaggcaggcgtaagcgggcataa) (서열번호 10)이 리간드로서 사용되었다. 테나신, 이의 서브도메인(subdomains), 또는 임의의 다른 생체적합성(biocompatible) 폴리머(polymer) 리간드는 당업계에 공지된 방법 또는 통상의 기술자가 쉽게 적응할 수 있는 방법에 의해 발현시키거나 제조할 수 있다. 예시를 위해, TBG를 제조하는 방법은 하기에 제공된다.

텐피브겐 ( tenfibgen , TBG ) 제조: 모든 TBG 제제(formula)에 대하여, 달리 명시되지 않는 한, TBG는 변형시킨 Aukhil (J Biol Chem (268): 2542-2553 (1993))의 방법에 의해 제조되었고, 즉, TBG는 2M 요소(urea)를 포함하는 용해 버퍼(lysis buffer; 50 mM Tris-HCl, 1.0 mM EDTA, 0.1 M NaCl, 0.2 ㎎/㎖ lysozyme, 0.1% Triton X-100, 0.1 mM PMSF, pH 8.0)로 불용성(insoluble) 펠릿(pellet)을 1회 세척하여 균체 용해물(bacterial lysate)로부터 분리하고 리폴딩(refolding)하였으며, 4M GuCL, 5 mM DTT가 포함된 0.02M Tris-HCl(pH 8.0)로 재현탁 하였다. 추가 원심분리 후, 최종 OD280 값이 약 1이 되도록 정제된 TBG 용액(solution)을 2M Guanidine-HCl, 20mM Tris-HCl, pH 8.0으로 희석하였으며, 밤새(overnight) 교반(strring) 인큐베이션(incubation)(4℃) 하는 동안, 드롭와이즈(dropwise) 방식으로 N₂-주입(sparged), 20 mM Tris-HCl, 0.2 M NaCl, 0.5 M Arginine-HCl에 약 10배 희석하였다. 약 4-5 배의 농도 감소 및 0.45 ㎛ 여과(filtration) 된 20 mM Tris-HCl, pH 8.0에 대해 희석여과(diafiltration) 한 후, 최종 정제는 NaCl 농도가 0.6M이 되도록 용출하면서 20 mM Tris-HCl, pH 8.0 내 헤파란 세파로오스(heparan sepharose)로 수행하였다. 균체 내독소(endotoxin)는 20mM NaH₂CO₃, 0.2M NaCl, pH=10.5로 평형화(equilibration) 된 Q 패스트 플로우 레진(Q Fast Flow resin)에 pH 10.5 텐피브겐(tenfibgen)을 적용하여 음이온 교환 크로마토그래피(anion exchange chromatography) 단계에서 제거하였으며, 이후 최종 0.2 ㎛ 여과(filteration) 전에 H₃PO₄로 pH를 7로 재조정하였다. 치료용 종양 표적 제제에 있어서, TBG는 약 16시간 동안 250 ppb As⁺³, 25 ppm Se⁺⁴, 2.5 ppm Hg⁺² 및 25 ppm Mo⁺⁵를 함유한 초고순도(ultra-pure)의 40% 황산암모늄(ammonium sulfate)로 재침전(reprecipitation)시켰다.

제제 B(Formula B): TBG로 코팅된 50 ㎚ 미만의 나노입자는 6.3 mcg의 TBG를 500 mcg의 2R-변형 키메라 올리고(2R-modified chimeric oligo; 서열번호 8)에 첨가하고, 125 mcg의 10 kD 폴리오르니틴(polyornithine, Sigma)으로 응집시킨 것 이외에는 상기 제제 A(Formula A)에서 기술한 바와 같이 제조하였다. 이러한 나노입자를 제조할 때, TBG-코팅된 마이셀(TBG-coated micelle)은 하기에 따르는 농도 변경을 제외하고는 상기 제제 A의 염 수용 용액(salt receiving solution)으로 분무하였다: 4.5 nM Sr^{2 +}, 2.25 nM Mg^{2 +}. 2㎍/㎖의 1 mM KCl에서의 측정 사이에 2분 휴지(pause)를 가지고, 20 볼트(volt)의 포텐셜(potential)에서 Zetasizer 4 DLS(Dynamic light scattering) 장치(device)로 측정한 것과 같이, -7.7 ± 4.2 mev의 표면 전하(surface charge)를 가진, 카본 그리드(carbon grid)에 스파팅(spotting) 된 1ng/㎖ 시료의 타원형 직경(elliptical diameter)을 이용한 TEM 음성 염색(negative staining)에 의해 측정된 평균 입자 직경은 50 ㎚(17.8 ± 3.1 ㎚) 미만이었다.

제제 C(Formula C): TBG로 코팅된 50 ㎚ 미만의 나노입자는 2.6 mcg의 TBG를 250 mcg의 키메라 올리고(chimeric oligo; 서열번호 5 및 6, 1:1 중량비)에 첨가하고, 100 mcg의 10 kD 폴리오르니틴(polyornithine, Sigma)으로 응집시키며, 7.5㎍의 계면활성제를 사용하여 마이셀화(micellization) 한 것 이외에는 상기 제제 A(Formula A)에서 기술한 바와 같이 제조하였다. 이러한 나노입자를 제조할 때, TBG-코팅된 마이셀(TBG-coated micelle)은 하기에 따르는 농도로 변경된 상기 제제 A의 염 수용 용액(salt receiving solution)으로 분무하였다: 3.75 nM Sr^{2 +}, 4.68 nM Mg^{2 +}. 2㎍/㎖의 1 mM KCl에서의 측정 사이에 2분 휴지(pause)를 가지고, 20 볼트(volt)의 포텐셜(potential)에서 Zetasizer 4 DLS(Dynamic light scattering) 장치(device)로 측정한 것과 같이, -12.3 ± 3.5 mev의 표면 전하(surface charge)를 가진, 카본 그리드(carbon grid)에 스파팅(spotting) 된 1ng/㎖ 시료의 타원형 직경(elliptical diameter)을 이용한 TEM 음성 염색(negative staining)에 의해 측정된 평균 입자 직경은 50 ㎚(17.8 ± 1.5 ㎚) 미만이었다.

제제 D(Formula D): TBG로 코팅된 50 ㎚ 미만의 나노입자는 서열번호 5 및 7 (1:1 중량비)로 이루어진 올리고뉴클레오타이드가 혼합(mix)된 것 이외에는 상기 제제 C(Formula C)에서 기술한 바와 같이 제조하였다. 2㎍/㎖의 1 mM KCl에서의 측정 사이에 2분 휴지(pause)를 가지고, 20 볼트(volt)의 포텐셜(potential)에서 Zetasizer 4 DLS(Dynamic light scattering) 장치(device)로 측정한 것과 같이, -7.1 ± 5.4 mev의 표면 전하(surface charge)를 가진, 카본 그리드(carbon grid)에 스파팅(spotting) 된 1ng/㎖ 시료의 타원형 직경(elliptical diameter)을 이용한 TEM 음성 염색(negative staining)에 의해 측정된 평균 입자 직경은 50 ㎚(17.0 ± 1.6 ㎚) 미만이었다.

제제 E(Formula E): TBG로 코팅된 50 ㎚ 미만의 나노입자는 3.1 mcg의 TBG를 250 mcg의 2R-변형 키메라 올리고(2R-modified chimeric oligo; 서열번호 8 및 9, 1:1 중량비)에 첨가하고, 62.5 mcg의 10 kD 폴리오르니틴(polyornithine, Sigma)으로 응집시키며, 7.5㎍의 TM-디올(TM-diol)을 사용하여 마이셀화(micellization) 한 것 이외에는 상기 제제 A(Formula A)에서 기술한 바와 같이 제조하였다. 이러한 나노입자를 제조할 때, TBG-코팅된 마이셀(TBG-coated micelle)은 하기에 따르는 농도로 변경된 상기 제제 A의 염 수용 용액(salt receiving solution)으로 분무하였다: 2.5 nM Sr^{2 +}, 0.25 nM Mg^{2 +}. 2㎍/㎖의 1 mM KCl에서의 측정 사이에 2분 휴지(pause)를 가지고, 20 볼트(volt)의 포텐셜(potential)에서 Zetasizer 4 DLS(Dynamic light scattering) 장치(device)로 측정한 것과 같이, -5.8 ± 3.9 mev의 표면 전하(surface charge)를 가진, 카본 그리드(carbon grid)에 스파팅(spotting) 된 1ng/㎖ 시료의 타원형 직경(elliptical diameter)을 이용한 TEM 음성 염색(negative staining)에 의해 측정된 평균 입자 직경은 50 ㎚(19.5 ± 1.5 ㎚) 미만이었다. 리튬(lithium) 함량은 ICP-AES에 의해 ㎍의 올리고(oligo) 당 5.39 ng의 Li⁺으로 측정되었다. (유사한 제제(analogous formulation)의 경우, 292 pg/㎍의 올리고(oligo)의 리튬 함량은 더 민감한 ICP-MS 방법으로 측정하였다.)

제제 F(Formula F): TBG로 코팅된 50 ㎚ 미만의 나노입자는 6.3 mcg의 TBG를 500 mcg의 2R-변형 키메라 올리고(2R-modified chimeric oligo)(Akinc, et al. 2008 Nat Biotechnol 26:5(561-9)에 보고된 바와 같이, 항-응고인자 Ⅶ(anti-coagulation Factor Ⅶ)에 첨가하고, 125 mcg의 10 kD 폴리오르니틴(polyornithine, Sigma)으로 응집시키며, 5㎍의 TM-디올(TM-diol)을 사용하여 마이셀화(micellization) 한 것 이외에는 상기 제제 A(Formula A)에서 기술한 바와 같이 제조하였다. 이러한 나노입자를 제조할 때, TBG-코팅된 마이셀(TBG-coated micelle)은 하기에 따르는 농도로 변경된 상기 제제 A의 염 수용 용액(salt receiving solution)으로 분무하였다: 1.17 nM Sr^{2 +}, 4.68 nM Mg^{2 +}. 2㎍/㎖의 1 mM KCl에서의 측정 사이에 2분 휴지(pause)를 가지고, 20 볼트(volt)의 포텐셜(potential)에서 Zetasizer 4 DLS(Dynamic light scattering) 장치(device)로 측정한 것과 같이, -7.6 ± 2.4 mev의 표면 전하(surface charge)를 가진, 카본 그리드(carbon grid)에 스파팅(spotting) 된 1ng/㎖ 시료의 타원형 직경(elliptical diameter)을 이용한 TEM 음성 염색(negative staining)에 의해 측정된 평균 입자 직경은 50 ㎚(24.7 ± 3.0 ㎚) 미만이었다.

제제 G(Formula G): TBG로 코팅된 50 ㎚ 미만의 나노입자는 안정화 용액(stabilization solution)이 비-멸균(non-sterile) 된 실험실 등급 증류수를 포함하고, 염화리튬 원료(Lithium Chloride stock)가 세슘(cesium) 또는 다른 이온(ion)으로 전처리(pretreatment) 되지 않은 것 이외에는 상기 제제 A(Formula A)에서 기술한 바와 같이 제조하였다. 안정화 용액(stabilization solution) 제조에 사용된 증류수로 테스트한 하기 금속의 수준(level)은 총합에서 약 0.9ppm(parts per million)으로 측정되었다: 알루미늄(aluminum), 비소(arsenic), 바륨(barium), 카드뮴(cadmium), 크롬(chromium), 구리(copper), 철(iron), 납(lead), 망간(magnanese), 니켈(nickel), 루비늄(rubinium), 황(sulfur), 바나듐(vanadium) 및 아연(zinc). 나노입자는 원심분리한 후, PBS + 10% 락티톨(lactitol)로 재현탁 시켰다. 2㎍/㎖의 1 mM KCl에서의 측정 사이에 2분 휴지(pause)를 가지고, 20 볼트(volt)의 포텐셜(potential)에서 Zetasizer 4 DLS(Dynamic light scattering) 장치(device)로 측정한 것과 같이, -9.6 ± 3.8 mev의 표면 전하(surface charge)를 가진, 카본 그리드(carbon grid)에 스파팅(spotting) 된 1ng/㎖ 시료의 타원형 직경(elliptical diameter)을 이용한 TEM 음성 염색(negative staining)에 의해 측정된 평균 입자 직경은 50 ㎚(21.8 ± 4.0 ㎚) 미만이었다.

제제 H(Formula H): TBG로 코팅된 50 ㎚ 미만의 나노입자는 동일한 LCK 올리고(oligo)를 사용한 것 이외에는 상기 제제 A(Formula A)에서 기술한 바와 같이 제조하였다. 이러한 나노입자를 제조할 때, TBG-코팅된 마이셀(TBG-coated micelle)은 염화리튬(Lithium Chloride) 대신 질산리튬(Lithium Nitrate)을 기반으로 하고 하기에 따르는 농도로 변경된 상기 제제 A의 염 수용 용액(salt receiving solution)으로 분무하였다: 7.5 nM Sr^{2 +}, 5.0 nM Mg^{2 +}. 2㎍/㎖의 1 mM KCl에서의 측정 사이에 2분 휴지(pause)를 가지고, 20 볼트(volt)의 포텐셜(potential)에서 Zetasizer 4 DLS(Dynamic light scattering) 장치(device)로 측정한 것과 같이, -12.4 ± 4.0 mev의 표면 전하(surface charge)를 가진, 카본 그리드(carbon grid)에 스파팅(spotting) 된 1ng/㎖ 시료의 타원형 직경(elliptical diameter)을 이용한 TEM 음성 염색(negative staining)에 의해 측정된 평균 입자 직경은 50 ㎚(21.5 ± 2.0 ㎚) 미만이었다.

제제 I(Formula I): 20 kD MW 히알루로난(hyaluronan)(HPLC 등급 증류수로 재현탁된 히알론산 나트륨 분말(sodium hyaluronate powder), Lifecore Biomedical, Lha, 저분자량(low molecular-weight) 히알루로난)으로 코팅된 50 ㎚ 미만의 나노입자는 3.1 mcg의 HA(TBG를 대신하는)를 125 mcg의 플라스미드(plasmid) DNA(pVivoβgal, Invivogen Corp., 10.5 kb)(올리고뉴클레오타이드를 대신하는)에 첨가하고, 먼저, 분지형 양이온성 폴리머(branched cationic polymer)인, 19.4㎍의 25 kDa 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine, PEI; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)과 복합시키며, 이후 6.25㎍의 TM-디올(TM-diol)로 마이셀화(micellization) 한 것 이외에는 상기 제제 G(Formula G)에서 기술한 바와 같이 제조하였다. 이러한 나노입자를 제조할 때, Lha-코팅된 마이셀(Lha-coated micelle)은 하기에 따르는 농도 및 첨가제(additions)로 변경된 상기 제제 G의 염 수용 용액(salt receiving solution)으로 분무하였다: 2 nM Sr^{2 +}, 0.5 nM Mg^{2 +}, 0.54 μM Bi^{2 +} 및 0.40 mM Ni^{2 +}(초고순도, 총 부피 40 ㎖ 기준)의 첨가. 2㎍/㎖의 1 mM KCl에서의 측정 사이에 2분 휴지(pause)를 가지고, 20 볼트(volt)의 포텐셜(potential)에서 Zetasizer 4 DLS(Dynamic light scattering) 장치(device)로 측정한 것과 같이, -8.1 ± 4.7 mev의 표면 전하(surface charge)를 가진, 카본 그리드(carbon grid)에 스파팅(spotting) 된 1ng/㎖ 시료의 타원형 직경(elliptical diameter)을 이용한 TEM 음성 염색(negative staining)에 의해 측정된 평균 입자 직경은 50 ㎚(20.4 ± 2.0 ㎚) 미만이었다.

제제 J(Formula J): 20 kD MW 히알루로난(hyaluronan)(HPLC 등급 증류수로 재현탁된 히알론산 나트륨 분말(sodium hyaluronate powder), Lifecore Biomedical, Lha, 저분자량(low molecular-weight) 히알루로난)으로 코팅된 50 ㎚ 미만의 나노입자는 3.1 mcg의 HA(TBG를 대신하는)를 125 mcg의 플라스미드(plasmid) DNA(pVivoβgal, Invivogen Corp., 10.5 kb)(올리고뉴클레오타이드를 대신하는)에 첨가하고, 먼저, 분지형 양이온성 폴리머(branched cationic polymer)인, 19.4㎍의 25 kDa 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine, PEI; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)과 복합시키며, 이후 6.25㎍의 TM-디올(TM-diol)로 마이셀화(micellization) 한 것 이외에는 상기 제제 A(Formula A)에서 기술한 바와 같이 제조하였다. 이러한 나노입자를 제조할 때, Lha-코팅된 마이셀(Lha-coated micelle)은 하기에 따르는 농도 및 첨가제(additions)로 변경된 상기 제제 A의 염 수용 용액(salt receiving solution)으로 분무하였다: 2 nM Sr^{2 +}, 0.5 nM Mg^{2 +}, 0.54 μM Bi^{2 +} 및 0.40 mM Ni^{2 +}(초고순도, 총 부피 40 ㎖ 기준)의 첨가. 2㎍/㎖의 1 mM KCl에서의 측정 사이에 2분 휴지(pause)를 가지고, 20 볼트(volt)의 포텐셜(potential)에서 Zetasizer 4 DLS(Dynamic light scattering) 장치(device)로 측정한 것과 같이, -6.4 ± 4.2 mev의 표면 전하(surface charge)를 가진, 카본 그리드(carbon grid)에 스파팅(spotting) 된 1ng/㎖ 시료의 타원형 직경(elliptical diameter)을 이용한 TEM 음성 염색(negative staining)에 의해 측정된 평균 입자 직경은 50 ㎚(22.7 ± 5.0 ㎚) 미만이었다. 8.1 ~ 13.1 ng/㎍의 플라스미드(plasmid) Li⁺ 함량은 유사한 제제에서 ICP에 의해 측정되었다(데이터는 나타내지 않았다). 일상적 특성화(routine characterization) 및 TEM에 의해, 제제 I 및 J의 플라스미드 50개의 입자는 물리적 성질(physical properties) 및 비교할 수 있는 TEM의 관점에서 제제 A 내지 H의 TBG로 코팅된 올리고 입자(TBG-coated oligo particles)와 유사한 것으로 판명되었다. 예를 들어, 핵산 카고(nucleic acid cargo)에 상관없이, Burton의 변형된 방법 (Kren, et al. 2009 JCI 119 :2086-99)에 의해 확인된 바와 같이, 본 발명에 기술된 제제에 대한 나노입자 캡슐화(encapsulation) 수율(yield)은 95% 이상이었다(데이터는 나타내지 않았다). 올리고뉴클레오타이드 생물활성제(bioactive agent) 및 단백질(protein) 쉘(shell)을 포함하는 나노입자와 플라스미드 DNA 생물활성제 및 탄수화물(carbohydrate) 쉘(shell)을 포함하는 나노입자 간의 이러한 유사성은 상이한 생물활성제, 폴리머 및 리간드 부위를 수용하기 위한 나노입자 제제 공정 및 결과적으로 생성된 나노입자 조성물의 유연성(flexibility)을 입증한다.

실시예 2: 나노입자 합성에서 리튬 이온의 세슘 변형은 안정성을 향상시킨다.

효과적일 뿐만 아니라, 나노입자 투여 형태는 규제 기관 및 기타 기관으로부터 의약품 제조 요건 및 제품 요건을 준수해야 한다. 예를 들어, 나노입자의 물리적 안정성은 규제 승인, 제제, 제조 및 저장 프로토콜에 영향을 미치는 주요 구성요소이다. 놀랍게도, 나노입자 합성에 있어 세슘의 극소량 첨가를 멸균 증류수로 수행할 시, 향상된 운송 성능 및 Burton-유래 안정성 측정에 의해 명시된 바와 같이, 결과적으로 물리적 안정성이 개선됨을 발견했다.

매우 예상외로, 리간드-안정화된 마이셀(ligand-stabilized micelles)이 첨가된 수용 용액을 조립하기 전에 리튬의 2.5 ppb 세슘 전처리(pre-treatment)는 올리고뉴클레오타이드(oliogonucleotides) 또는 플라스미드 DNA(plasmid DNA)를 갖는 나노입자가 항공 화물에 의해 -4℃에서 액체 제제로서 운송될 수 있는 농도를 4배로 만들어야 한다는 것이 발견되었다. 상기 관찰 결과는 하기 표 1에 요약하였다. 이러한 항공 운송 테스트에서, 나노입자 현탁물(suspension)은 동결건조에 의해 농축되었으며, 운송된 후 TEM 현미경 관찰(microscopy)로 항공 운송 도전에 따른 입자 직경의 변화가 있는지 시험을 실시하였다. TEM에서, 본 발명의 나노입자는 표적 리간드(targeting ligand)로 구성된 가시적(visible)이지만 굴절성(refractive)이 약한 코로나(corona)에 둘러싸인 입방체(cubic) 또는 프랙탈(fractal) 초분자 어셈블리(supramolecular assembly)로 나타난다 (데이터는 나타내지 않았다). 예를 들어, 20㎎/㎖의 현탁물의 농도는 저전력 (1 ㎽) 동적광산란법(dynamic light scattering, DLS)으로 나노입자 (직경 약 25 나노미터 크기)에 대한 광산란(light scattering) 데이터를 얻는데(즉, 검출하는데) 필요하다. 대조적으로, 세슘-처리된 리튬 염 수용 용액에 인큐베이션(incubation) 하기 전에 리간드-코팅된(ligand-coated) 마이셀은 유사하게 작은 크기 (28 ㎚ 직경, 표 1)이나, 유사한 DLS 조건하에 약 1㎎/㎖의 농도에서 쉽게 검출되어, 인큐베이션(incubation)/안정화(stabilization) 단계 동안 나노입자 초분자 어셈블리의 유의한 변화가 발생한다는 것을 알 수 있다 (데이터는 나타내지 않았다).

운송 및 대조 시료에서, 입자 직경은 TEM 현미경 사진으로부터 입자에 맞추어진 타원형 축의 평균으로서 NIH 이미지 J(NIH Image J)에서 이미지 분석에 의해 정량화되었다. 올리고(제제 G)를 함유하는 변형되지 않은(non-modified) 세슘 제제의 경우, 평균 입자 직경이 3m㎎/㎖의 항공-운송된 동일한 제제에 대한 대조 제제로부터 161% 증가함을 보여주는 결과는 표 1에 요약하였다. 작은 면이 있는, 복굴절성(birefringent) 입자를 둘러싼 단백질 코로나에서의 부수적인 손실 또한 운송 후 관찰되었다 (데이터는 나타내지 않았다). 대조적으로, 유사한(analogous) 세슘-변형된 제제 (제제 A)는 4㎎/㎖에서 형태 및 코로나가 유지되었다 (표 1, 데이터는 나타내지 않았다).

상업적인 리포터 유전자 플라스미드(reporter gene plasmid)를 갖는 한 쌍의 제제에 대해 동일한 분석이 수행되었으며, 유사한 결과를 갖는 히알루로난(hyaluronan)으로 코팅하였다. 수용 베스(bath)에서 리튬의 세슘 전처리(pre-treatment)로 제조된 제제 J의 경우, 입자는 세슘 전처리없이 제조된 제제 I에 비해 입자의 직경이 15% 미만으로 증가하여 8배 증가한 농도(2 대비(vs.) 0.25 ㎎/㎖)로 운송될 수 있었다. 리간드 코로나에서의 손실은 비-세슘(non-cesium) 전처리된 입자에서 운송 농도 또한 증가하여 관찰되었다 (데이터는 나타내지 않았다). 염화리튬(Lithium Chloride)보다는 질산리튬(Lithium Nitrate)으로 제조된, 제제 H로 입증된 운송 농도의 향상은 리튬의 여러 염이 나노입자 합성에 사용될 수 있음을 나타낸다. 염 수용 용액에 첨가하기 전에 세슘 및 리튬을 전혼합(premix) 하는 것이 적절한 구형(spherical) 또는 장방형(cuboid) 초소형 (LTE 50 ㎚ 건조 직경) 형태(morphology)의 나노입자를 생성하는 반면, 염 수용 용액에 혼합되지 않은(unmixed) 세슘 및 리튬을 첨가한 것은 아니었다 (데이터는 나타내지 않았다).

주석: * = p <0.5, 1) 입자 직경은 0.1 ng/㎖ 건조한 후 x271,000에서 TEM 음성 염색(negative staining)에 의해 평균 타원형의 직경으로 측정되었다. 분석 당 15-20 회 측정으로 평균 ± 표준오차(SE)로 나타내었다. 로트(lots)는 운송 연구에 사용하기 전에 3-D 배양으로 성장한 종양 세포로 실질적으로 시험관 내(in vitro) 세포내 유입(cellular uptake)이 되는지 확인되었다. 2) 시험관 내(in vitro) 방출은 표준 곡선을 사용하여 색도계(colorimetric), 변형된 Burton 분석법(Burton assay)에 의한 DNA 혼성으로 측정되었다. 방출은 주위의 100% 평균 Burton 수율로 나중 시점으로부터 보간된(interpolated) 시점으로서 기록된다. 3) 열 전이(Thermal transitions)는 시차주사 열량측정법 (differential scanning calorimetry, DSC)에 의해 생성된 온도 기록도(thermogram)로부터 확인되었다. 현탁액(suspensions)을 건조시켜 분석용 분말을 제조하고, 1-2 ㎎을 권축(crimped) 알루미늄 팬에서 실온(room temperature) 내지 약 400℃로 20℃/분으로 스캐닝하였다. 약어, gt, 유리 전이(glass transition); et, 흡열(endothermic); vs, 매우 작은(very small). 4) TM-디올(TM-Diol)은 배합되지 않은(unformulated) 소수성 계면활성제이며 분석 기준으로 제시된다. 리간드-코팅된 마이셀은 제제 E에 따라 제제 된 마이셀이나, 염 수용 용액에서 인큐베이션 하기 전에 스캐닝하였다. 5) 히알루로난(hyaluronan)-코팅된 리간드 입자는 운송 시료와 유사한 제제이나 10.5 kb 리포터 플라스미드(repoter plasmid)보다는 8.5 kb 리포터 유전자 플라스미드를 포함하였다. 6) 상기 형태의 분석법에서 약 120시간 후에는, 표준 곡선에서 색이 분해되기 시작하였으며, 여기에서 분석의 조기 종료가 필요하다. 7) FTIR 스펙트럼(spectra)은 ATR 어테치먼트(attachment), 소스 여기원(excitation source)으로서 중간-적외선원(mid-infrared source) 및 DTGS 검출기(detector)가 장착된 Perkin Elmer Spectrum 65를 사용하여 기록되었다. 스펙트럼은 4 ㎝^-1의 분해능(resolution)으로 32회의 스캔(scans)으로 수집되었다. 현탁액 시료는 잔류 계면활성제를 제거하기 위해 3:1 (v/v)의 이소부틸(isobutyl)과 이소아밀 알코올(isoamyl alcohol)로 4℃에서 추출하였으며, 건조 분말은 분석을 위해 제출되었다. 약어, v, 매우(very); s, 작은(small); md, 보통의(moderate); str, 강한(strong); brd, 광대한(broad).

수용 용액의 어셈블리(assembly) 이전에 입자 안정성에 대한 리튬의 세슘 전처리의 영향을 시험관 내(in vitro) 방출을 위한 제제를 시험하여 추가로 조사하였다. 시험관 내(in vitro) 방출은 변형된 색도계(colorimetric) Burton 분석법에 기초한 입자 분해로 평가되었다 (Kren, et al. 2009 JCI 119:2086-99). 이 분석에서, 입자는 6M 수산화나트륨(NaOH)이 아닌 1M 수산화나트륨으로 56℃에서 오버나이트(overnight) 인큐베이션 하였다. 나노입자를 중성화(neutralization) 시킨 후, 방출된 DNA와 반응하여 청색 신호(blue signal)를 생성하기 위해 Burton 시약을 첨가하였다. 퍼센트(percent) 수율은 표준 곡선으로부터 이론값(theoretical value)에 비례하여 표현되므로, 나노입자가 완전히 분해되어 내용물을 방출할 때 100% 수율에 도달한다. 이후, 시험관 내(in vitro) 방출은 주위의 100% 수율 시점으로부터 보간된(interpolated) 종료점(endpoint)로서 표현된다. 따라서, 시험관 내 방출 시간은 나노입자의 분해 저항성(resistance)에 대한 척도(measure)이며, 세슘-전처리(Cs-pre-treatment)에 따른 증가는 올리고 및 플라스미드 시리즈(series) 모두에 대한 세슘-처리된(Cs-treated) 대비 세슘-처리되지 않은(non-Cs-treated) 나노입자에 대해 관찰된 운송 안정성의 증가와 부합한다 (표 1 시험관 내 방출 시간; Cs 대비(vs.) 비-Cs 올리고(non-Cs oligo), 104 시간 대비(vs.) 62 시간; Cs 대비(vs.) 비-Cs 플라스미드 DNA(non-Cs plasmid DNA, >120 시간 대비(vs.) 117시간).

나노입자 조성물의 차이가 물리적 (방출) 및 기능적 (운송) 수준에서 본 발명의 나노입자에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지를 조사하기 위해, 올리고 및 플라스미드-함유 나노입자의 건조 및 분쇄된 분말의 써멀 프로파일(thermal profiles)을 약 25℃ 내지 약 400℃의 범위에 걸쳐 분당 10℃에서 시차주사 열량측정법 (differential scanning calorimetry, DSC)으로 특성 전이(characteristic transitions)의 잠재적 변화에 대해 시험하였다 (상기 표 1에 요약하였다). 다중 실행에서, 158℃에서 작은 전이(transition), 뒤이어 180℃에서 천저(nadir)와의 강한, 광대한 흡열 (172-200℃)은, 세슘-변형되지 않은(non-Cs-modified) 제제 G에서 관찰된 반면, 형태학적 상태의 변화를 나타내는, 세슘-변형된(Cs-modified) 제제 A에 대해서는 275℃에서 오로지 하나의 강한 흡열이 관찰되었다. 유사하게, 8.5 kb 리포터 유전자 플라스미드를 갖는 히알루로난(hyaluronan) 나노입자의 경우, 세슘-변형되지 않은 화합물(non-Cs-modified compound) (제제 Ⅰ에 해당한다)에서, 158℃에서의 작은 전이(transition), 뒤이어 178℃ (174-227)에서 천저(nadir)와의 강하고 광대한 흡열이 관찰되었으며, 형태학적 상태의 변화를 다시 나타내는, 세슘-변형된 화합물(Cs-modified compound) (제제 J에 해당한다)과 비교하여 150℃에서 매우 작은 전이와 193, 206 및 227℃에서 강하고 매우 예리한 흡열이 관찰되었다. 대조적으로, 비-환원당(non-reducing sugar)인 PBS + 10% 락티톨(lactitol) 희석액(diluent)의 스캔(scan)은 약 160℃에서 매우 작은 전이와 약 186℃에서 강하고 예리한 흡열과 약 310℃를 중심으로 한 분해 흡열(degradation endotherm)을 보였다. 모든 나노입자 화합물은 307-313℃를 중심으로 흡열을 보였다. 분무화(atomization) 및 주로 리튬 염 용액 ("리간드-코팅된(ligand-coated) 마이셀")에서의 후속 인큐베이션(subsequent incubation) 전에 TBG-코팅된(TBG-coated) 마이셀의 써멀 스캔(thermal scan)은 100℃를 중심으로 하는 피크 (98, 105℃)를 갖는 광대한 흡열을 나타냈다. 상기 온도 기록도(thermogram)가 세슘-처리된 리튬 용액에서 인큐베이션 후 스캔된 나노입자와 두드러지게 다른 관찰은 세슘-처리된 리튬 용액이 안정된 마이셀과 나노입자에 순서 및 재배열을 부여하여 시간이 지남에 따라 고유한 초분자 어셈블리를 생성한다는 진술을 뒷받침한다.

안정화 베스(bath) 내로 리튬의 세슘-전처리를 도입할 때의 화합물의 차이를 FTIR 분광법(FITR spectroscopy)으로 추가로 조사하였다. 세슘이 포함되지 않은(non-Cs) 제제 G 및 세슘이 포함된(Cs-containing) 제제 A의 FTIR 스펙트럼은 600-4000 ㎝^-1에서 판독되었다. 구성 요소 및 라이브러리 스캔에서 유래된 피크 할당(peak assignment)을 기반으로 한 캡슐(capsule) 스캔은 일반적으로 3390 ㎝^-1에서 증류수(water)의 O-H 스트레칭(stretching) 진동(vibration)을 나타내는 약 3300의 넓고 집중적인(intensive) 밴드(band), 계면활성제 (4: 약 2956-2832 ㎝^-1에서, 3: 약 1449-1260 ㎝^-1 에서)에 기인하는 밴드 그룹(group) 및 약 1100-1110 ㎝^-1에서 Li-O 및 Li-OH 진동에 기인하는 강하고 집중적인 밴드로 특징지어진다. 안정화 베스(bath) (제제 G 대비 제제 A)의 세슘-전처리 시 관찰된 주요 피크 차이는 : 1) 약 1647 ㎝^-1에서 넓은 피크가 약 1740, 1640에서 피크로 좁아지고; 2) 약 2952-2839에서 가능한 계면활성제-유래 사중선(surfactant-derived quadruplet)을 약 2952-2853에서 삼중선(triplet)으로 변형되고; 3) 약 3329에서 3377 ㎝^-1로 증류수(water) 진동 밴드가 이동한 것이다.

흡광도 이동(shift)의 관점에서, 세슘 전처리는 재구성된(reorganized) 캡슐 어셈블리 내에 포획된 증류수 양(amount)의 가능한 감소와 일치되게, 증류수 흡광도 크기(magnitude)의 50% 이상이 감소 되었다. 주목할 것은, 소수성 계면활성제는 이 영역에서 흡광도가 전혀 없다. 또한, 리튬 영역에 가장 근접한 약 1260 및 795 ㎝^-1에서 계면활성제에 기인하는 밴드(band)의 흡광도가 50% 이상 증가하여, 어셈블리의 주요 구성 요소 간의 상호작용에 가능한 변화가 있음을 나타낸다. 리간드-코팅된 마이셀을 세슘-처리된 리튬으로 이루어진 수용 베스(bath) 내로 분무화(atomization) 한 후에, 이들 성분은 반응이 정지되기 전에 얼마간의 시간 동안 밀접하게 접촉된다.

열전이(thermal transitions) 및 IR 스펙트럼(spectra)의 현저한 변화는 결정질 화합물(crystalline compound), 약제학적 화합물(pharmaceutical compound), 및 상이한 형태학적 상태에서 중요한 물리적 및 기능적 변화를 겪는 것으로 알려진 나노스케일(nanoscale) 초분자 어셈블리의 다형성 변화의 중요한 지표(indicator)이다. 이론에 구속되기를 바라는 것 없이, 변형되지 않은(unmodified) 나노입자와 비교하여 세슘-변형된(Cs-modified) 나노입자의 형태학적 상태에서 나타난 차이(표 1)는 잠재적으로 세슘-변형된(Cs-modified) 나노입자에 대해 관찰된 향상된 운송 안정성 및 확장된 Burton-유도된 시험관 내 안정성을 뒷받침하는 중요한 메커니즘을 제공한다.

상기 실시예는 본 발명의 나노입자가 다양한 카고(cargo) 및 나노입자 다형체(polymorph)에 대한 운송 농도 및 Burton-유도 안정성(Burton-derived stability)을 실질적으로 증가시킨다는 것을 나타낸다.

실시예 3: 변형된 키메라 폴리뉴클레오타이드 혼합물은 마우스 종양 모델에서 놀라운 효능을 입증한다.

TBG 리간드 및 항-CK2 키메라 폴리뉴클레오타이드(anti-CK2 chimeric polynucleotide) 생물활성제를 포함하는 세슘-변형된 나노입자는 종양 및 종양 기질 세포(stromal cells)에서 나노입자 전달 시스템의 TBG 리간드가 입자 및 올리고 카고를 두 조직 유형으로 유도함에 따라, 카제인 키나아제 2 알파 (Csnk2a1) 및 카제인 키나아제 2 알파프라임 (Csnk2a2) 단백질의 수준을 조작하도록 유도한다. 카제인 키나아제 2 (CK2)는 종양 세포가 다양한 경로로 생존을 촉진하기 위해 과도하게 사용되는 유비쿼터스 효소(ubiquitous enzyme)로, 스트레스 및 종양 조건하에서 세포핵(cell nuclei)에 축적된다. 핵 구획(nuclear compartment)으로부터 CK2의 셔틀링(shuttling)은 세포사멸(apoptosis)보다 우선하며, 핵의 CK2를 유지하기 위한 종양 세포의 무능(inability)은 종양 죽음(death)보다 우선한다. 암치료(oncology therapeutics)는 종종 면역력이 약화된(immunocompromised) 마우스 (이종이식(xenograft) 모델)에서 성장한 인간 종양으로 평가된다. 하기 표 2에 아우트라인(outline)된 바와 같이, Ago2 및 RNAseH에 관여하는 이작용성(bifunctional) 올리고(oligo)로 표적화된 유전자의 영역에서(미국특허 공개 공보 제2013/0267577호, 본 발명에서 이의 전체가 참조로서 포함된다), 인간 및 마우스 사이에 최대 3개의 불일치(mismatch)가 존재할 수 있다 (hu Csnk2a1과 mu Csnk2a2 사이에 3개). hu Csnk2a1의 불일치는 음영처리 및 볼드체의 밑줄, 아우트라인(outline) 또는 특대형 문자로 강조 표시된다.

본 발명에 기재된 단일-가닥 올리고(single-strand oligo) 디자인 (서열번호 8), 뿐만 아니라 Csnk2a2에 대한 신규한 단일-가닥 올리고 디자인 (서열번호 9)에 단일-뉴클레오티드(single-nucleotide) 변형을 도입하고, CK2 항암 치료용 혼합물(mix)을 형성하기 위한 TBG-코팅된(TBG-coated) 50개의 입자에 상기 단일-가닥 올리고(single-strand oligo)를 결합한 것은, 종양 성장, 세포 증식 및 염증 억제에 관한 중요한 결과가 종양을 가진 마우스에서 달성되었다. 2R 주쇄(backbone) 변형은 2' O-메틸-변형된 (2' O-methyl-modified) RNA 뉴클레오타이드의 5' 말단으로부터 2번째 위치의 DNA 뉴클레오타이드-단일 뉴클레오타이드를 변화시키는 것으로 구성된다. 상기 올리고(oligos)의 모든 주쇄 링키지(linkage)는 포스포디에스테르(phosphodiester)이다. 본 실험에서, 유사하지 않은 쥐(murine) 표적 영역(region)의 영향을 평가하기 위한 노력이 또한 이루어졌다. 하기 표 2는 본 실시예에서 사용되거나 언급된 서열을 기술한다.

주석: 1) 모든 뉴클레오타이드 링키지(linkage)는 포스포디에스테르이다. 2) DNA 표적 서열의 이탤릭체 = 해당하는 키메라 약물 올리고의 3' 말단의 2'O-메틸 RNA(2'O-Methyl RNA) 영역. 3) Hu Csnk2a1에 대한 불일치는 음영처리되고 음영처리 된 밑줄, 박스 또는 대형 밑줄 문자를 포함한다. 4) 올리고(Oligos)와 변형된 올리고(Modified Oligos)의 경우, 대문자는 DNA를 나타내고, 소문자는 RNA를 나타내며, 모든 RNA 뉴클레오타이드는 2'O-Me 변형된(2'O-Me modified) 것이다.

2종 계통의 누드 마우스 (FoxN, Balb/CaNCR (BN)) 및 하나의 종양 라인 (FaDu, 하인두(hypopharyngeal))을 사용하여, 마우스에 50% 매트리겔(Matrigel)에 2e⁶ (FoxN) 또는 2e⁵ (BN) 종양 세포를 피내(intradermal) 주사하고, 7일 후 피하(subcutaneous) 치료를 시작하였다. 치료 시작시 평균 종양 크기는 약 69 - 86 cu ㎜. 이었다. 5마리의 집단(Cohorts)을 10 ㎍/㎏으로 주 2회 처리하였다. 어떤 경우, 약 10일간 치료한 후에, 처리군에서 2마리의 마우스를 희생시켰다. 처리 30일 후 (D30), 그룹당 나머지 3-5 마리의 동물을 희생시키고, 나머지 생존한 종양의 무게를 측정했다.

분자 변화를 평가하기 위해, 각 마우스로부터의 생존한 종양 영역으로부터의 동결절편(cryosection)을 현미경에 의해 Ki-67 및 p65 NF-kB 수준에 대해 분석하고, NIH 이미지 J(NIH Image J)를 사용하여 백그라운드 대조(backgroud control)에 대해 역치된(thresholded) 신호 면적 분율(signal area fraction)로서 정량화하였다. 모든 D30 마우스를 대표하는 생존한 종양 절편으로부터 중복된 대표 필드(field)를 수집하였다. Ki-67은 종양 증식률의 일반적인 임상 지표이며 생존 세포핵 영역의 분율(fraction) 또는 백분율(percentage)로 표시되며, p65 NF-kB는 염증의 주요 신호 및 조절 단백질이며 CK2의 중요한 하류 표적(downstream targets)이다. NF-kB는 비정상적으로 활성화되고, NF-kB의 억제는 두경부 편평세포암종(head and neck squamous cell carcinomas, HNSCC)에서 세포 죽음(death)을 유도하고 종양 형성(tumorigenesis)을 억제한다 (Yu, 등. 2006 Cancer Research 66:6722-6731). 따라서 당업자는 종양 모델에서 효력(potency)을 높이 평가하고 항-CK2(anti-CK2) 전략의 많은 결과가 항-NF-kB(anti-NF-kB) 활성의 관점에서 이해될 수 있다. 세포 생물학 관점에서, p65 NF-kB (CK2와 유사한)는 염증 조건 및 스트레스 조건하에서 세포핵에 배치되며, 염증의 감소가 증가함에 따라 세포질(cytoplasmic) 또는 적게 탐지될 수 있다. 표 3은 세가지 분석을 위한 치료 및 결과를 요약한다.

마우스 Fadu 종양 모델에서 치료 시작 후 30일째의 결과

처리 (Treatment)	SEQ ID NO:	제제 No. (Formula No. 5 )	Tumor Weight (g)	% △	Ki -67 Index (signal area/ nuclear area)	% △	NF - kB Index (signal/tissue area)	% △
실험 E1(Experiment E1) - FoxN 마우스 모델에서 단일-가닥 올리고(single-stranded oligo) 개시(starting)에 대한 2R 변형(modification)의 효과
대조 (Control)			1.03 ± 0.04		0.8 ± 00.13		0.87 ± 0.06
2RLCK	8	B	0.58 ± 0.19	-43.7	0.87 ± 0.09	+9	0.69 ± 0.06	-20.4
LCK	5	A	1.043 ± 0.22	0	1.1 ± 0.32	+44	0.8 ± 0.1	-7.5
실험 E2(Experiment E2) - BN 마우스 모델에서 2R 변형(modification) 없이 완전 일치하는(perfect match) 올리고 혼합물(mix)의 처리 방법(approach)의 효과
대조 (Control)			0.634 ± 0.17		0.96 ± 0.05		0.78 ± 0.01
muMix	5 + 7	D	0.8 ± 0.07	+26.2	0.85 ± 0.33	-11	0.31 ± 0.05	-59.7*
huMix	5 + 6	C	0.85 ± 0.06	+34.1*	0.89 ± 0.42	-6.5	0.82 ± 0.12	+5.1
LCK	5	A	1.0 ± 0.39	+57.7	1 ± 0.16	+5.5	0.74 ± 0.01	-5.3
실험 E3(Experiment E3) - BN 마우스 모델에서 결합된(combined) 2R 변형(modification) 및 올리고 혼합물(mix) 처리 방법(approach)의 효과
대조 (Control)			0.68 ± 0.24		0.89 ± 0.11		0.89 ± 0.09
2R huMix	8 + 9	E	0.29 ± 0.04	-56.1*#	0.24 ± 0.1	-73*	0.0029 ± 0.002	-99.7*

주석: 1) 5마리를 가진 huMㅑㅌfmf 제외하고, N = 그룹당 3 마리. 2) 값은 평균 ± 표준오차(SE)로 기록된다. 3) * = p <0.05, Student's t-test. 4) # = p <0.05, Student's t-test, 전체 BN 대조군 풀(control pool)에 대한 유의성, 0.66 ± 0.11g. 5) 실시예 1에 열거되고 기재되어 있는 바와 같이 TBG 나노캡슐화된(nanocapsulated) 서열에 대한 제제 번호.

주목할 것은, 실험군의 올리고뉴클레오타이드 성분 사이의 제한된 차이에도 불구하고, 치료 시작 30일 후에 대조군 대비 TBG-캡슐화된 2R huMix 올리고(TBG-encapsulated 2R huMix oligo)는 종양 무게, 세포 증식 (Ki-67), 및 염증 지수 (NF-kB) 3가지 범주 모두에서 유의적인 감소를 나타내는 유일한 처리 방법이었다 (표 2, E3 실험, 제제 E). 캡슐화된 단일-뉴클레오타이드 2R 변형(encapsulated single-nucleotide 2R modification) (E1 실험, 제제 B) 또는 캡슐화된 huMix (encapsulated huMix) 처리 방법 (E2 실험, 제제 C)은 처리 후(post-treatment) 30일에 종양 무게의 유의한 감소를 나타내지 않았다. 실제로, huMix-처리군(huMix-treated group) (제제 C)은 대조군에 비해 종양 무게에서 34%의 유의한 증가를 보였다. 반대로, 나노캡슐화된 2RhuMix(nanoencapsulated 2RhuMix) (제제 E)로 처리된 마우스의 종양은 세포 증식 및 염증 지수의 상당하고 극적인 감소에 부합하는 통합된(pooled) BN 대조군 종양에 비해 종양 무게에서 56%의 유의한 감소를 보였다 (-73% Ki-67 지수, -99.7% p65 NF-kB 신호 분율(signal fraction), p <0.05). 다른 치료군은 대조군에 비해 세포 증식 지수 및 p65 NF-kB 신호 모두에서 유의한 감소를 보이지 않았으며, 이러한 두 척도(measure) 및 종양 무게는 훨씬 적었다. E2 실험에서 muMix 처리는 대조군에 비해 NF-kB 신호 면적 분율(signal area fraction)에서 59.7%의 유의한 감소를 보였으나, 대조군에 비해 종양 무게가 26.2% 증가하여 분명히 원하지 않은 결과를 수반하였다. 추가의 사항 중, E3 실험에서 대조군에 비해 2R huMix 집단(cohort)에서 p65 NF-kB 신호의 유의한 감소 (99.7%)가 있었으며, 반면 쥐(murine) 서열에 대한 불일치(mismatch)가 2R huMix 서열과 동일한, E2 실험에서는 huMix 집단(cohort)의 p65 NF-kB 신호 변화가 거의 없었다 (상기 표 2).

E3 실험에서 마우스에 대한 CK2 알파(CK2 alpha) 및 CK2 알파 프라임(CK2 alpha prime) 단백질 수준의 변화를 현미경으로 평가하였다. 수축(shrinkage), 증식(proliferation) 및 염증(inflammation) 지수의 현저한 감소와 일관 되게, 대조군(control)에 비해 처리된 마우스의 생존 종양 절편에서 CK2 알파(CK2 alpha) 및 CK2 알파 프라임(CK2 alpha prime) 신호 수준 (각각 ~ 52% 및 -45%)의 현저한 감소 (p < 0.05)가 관찰되었다 (데이터는 나타내지 않았다). 실험 E1 및 E2의 다른 모든 치료에서 CK2 알파와 CK2 알파 프라임 신호 분율(fraction)의 유의한 변화는 관찰되지 않았다.

E3 실험에서 처리된 마우스는 30일 관찰 기간 동안 현저한 체중 감소 또는 부작용을 나타내지 않았다는 것이 주목된다 (데이터는 나타내지 않았다). 종합하면, 관찰된 결과는 올리고뉴클레오타이드 주쇄(backbone) 및 서열에서의 제한된 변형의 조합이 종양을 가진 마우스에서 표현형(phenotypic) 및 분자 마커(marker)에 있어 유의하고 놀랄만한 변화를 야기한다는 것을 보여준다.

실시예 4: 변형된 키메라 폴리뉴클레오티드 혼합물은 공격적인 이종이식(xenograft) 마우스 종양 모델에서 놀라운 효능을 입증한다.

다른 모델에서, 나노입자의 Cs-변형을 포함하여, 올리고뉴클레오타이드 주쇄(boackbone) 및 서열의 제한된 변형의 효과를 확인하기 위해, 인간 종양 라인(human tumor line) (HPV-(+) 혀 조직으로부터 유래된 UM-SCC-47)을 포함하는 이종이식(xenograft) 종양 모델 및 NIH 이계 교배(outbred) 시킨 흉선 제거 누드 마우스로 실험하였다. 이 실험에서는, 매일 100 ㎍/㎏으로 SQ 처리를 시작하기 전에, 누드 마우스에 2e⁶ 세포를 피하(subcutaneously)로 접종(inoculation) 하고 종양이 60-80 cu. ㎜. 으로 성장하는 동안 2주간 방치하였다. 종양은 치료 14일 후에 수집하였으며, 전술한 FaDu 실험에서와 같이 유사하게 실험하였다. 결과는 하기 표 4에 요약 되어있다.

이 실시예는, 실시예 3과 유사하고 동일한 방법을 사용하여, Cs-변형되고, TBG-캡슐화된 2R huMix 올리고는 치료 시작 후 14일 (30일 보다는)에 대조군(control)에 비해 종양 중량, 세포 증식 (Ki-67) 및 염증 지표(index) (p65 NF-kB)의 3가지 범주 모두에서 가장 큰 감소를 야기하였다 (표 4, 제제 E). 종양 성장 반응에 대한 비-특이적인 중재적 스트레스(interventional stress)의 부정적인 영향을 설명하기 위해 추가 대조군, 즉, 대조 올리고(control oligo) 및 당 카고(sugar cargo)를 가진 Cs-변형된 나노입자가 포함되었다. 마우스 및 세포주(cell line)의 조합에서, 종양은 제제 E로 처리된 것이 아닌 모든 마우스에서 림프절(lymph nodes)로 즉시 전이되고, 복막강(peritoneal cavity)에 심하게 침범되는 것이 관찰되었다 (데이터는 나타내지 않았다). 따라서, 종양 무게는 복막 확장(peritoneal extension) 및 주요 림프절과 함께 원발성 종양(primary tumor)의 조합으로서 기록된다. 종합하면, 실시예 3 및 4는 다른 종양 라인(tumor lines) 및 마우스 모델에 걸쳐 신규한 2R 변형(2R modification) 및 Csnk2a1 및 Csnk2a2 서열의 유리한 효능을 나타낸다.

이종이식(xenograft) UM-SCC-47 종양 모델에서 치료 시작 후 14일째의 결과

처리 (Treatment)	SEQ ID NOS:	제제 No. (Formula No. 4 )	Tumor Burden 5 (g)	% △ from control	Ki -67 Index (signal area/ nuclear area)	% △ from control	NF - kB Index (signal/tissue area)	% △ from control
실험 E1(Experiment E1) - NIH 흉선 제거 누드 마우스 모델(Athymic nude mouse model)에서 결합된(combined) 2R 변형(modification) 및 올리고 혼합물(mix) 처리 방법(approach)의 효과
대조 (Control)			1.27 ± 0.28	-----	0.58 ± 0.08	-----	0.71 ± 0.13	-----
대조 올리고 (Control oligo)	2RF76	F	1.78 ± 0.51	+ 40	0.66 ± 0.19	+13.8	0.49 ± 0.06	- 31
당 카고 (Sugar cargo)	None7		1.55 ± 0.3	+ 22	0.67 ± 0.06	+15.5	0.66 ± 0.06	- 7
LCK	5	A	1.38 ± 0.23	+ 9	0.70 ± 0.07	+20.7	0.54 ± 0.09	- 24
2RLCK	5	B	1.235 ± 0.09	- 2	0.42 ± 0.02	- 27.5	0.66 ± 0.04	- 7
2R huMix	8 + 9	E	0.89 ± 0.25	- 30	0.07 ± 0.01*	- 89*	0.18 ± 0.03	- 75*

주석 : 1) 그룹당 N = 3 마리. 2) 값은 평균 ± 표준오차(SE)로 기록된다. 3) * = p <0.05, Student's t-test, 4) 실시예 1에 열거되고 기재되어 있는 바와 같이 나노캡슐화된(nanocapsulated) 서열에 대한 제제 번호. 5) 종양 부담(tumor burden)은 복막 확장(peritoneal extension), 상완(brachial), 하악골(mandibular) 및 서혜부 림프절(inguinal lymph nodes)이 있는 원발성 종양(primary tumor)의 누적 중량으로 기록된다. 현미경 관찰(microscopy)을 위해 원발성 및 GI 종양을 균일하게 샘플링하였다. 6) 추가적인 나노캡슐화된 대조(control) 올리고(oligo)의 서열은 Akinc, 등 2008 Nat Biotechnol 26(5):561-9 의 항-응고 인자 Ⅶ(anti-coagulation Factor Ⅶ)이다. 7) 에리스리톨을 함유하는 Cs-변형된 나노입자 제제를 포함하고, 응축기(condenser)가 없는 500㎍의 에리스리톨이 8.75㎍의 계면활성제로 마이셀화되고, 5.5mcg의 TBG로 코팅되며, 6.25nM의 Mg^{2 +} 및 9.38nM의 Sr^{2 +}로 조정된 수용 베스(bath)로 분무되는 것을 제외하고는, 제제 A와 유사하게 제조될 수 있으며, 다른 모든 이온은 동일하다. 입자 직경은 -12 ± 7.8 mev의 표면 전하를 가지는 24 ± 2 ㎚ 이었다.

서열(Sequences)

CK2 알파(CK2 alpha) (호모 사피엔스 염색체(Homo sapiens chromosome) 20, GRCh38 프라이머리 어셈블리(Primary Assembly); NCBI 참조 서열(reference sequence): NC_000020.11; 염기(base) 473322에서 543838까지의 70.52kb 영역; Intl HuGeomeome Seq Consort; 2004 Nature 431(7011):931-945)

CK2 알파 프라임(CK2 alpha prime) (호모 사피엔스 염색체(Homo sapiens chromosome) 16, 프라이머리 어셈블리(Primary Assembly); NCBI 참조 서열(reference sequence): NC_000016.10; 염기(base) 58157907에서 58197878까지의 39.97kb 영역, Martin 등, 2004 Nature 432(7011):988-994)

NM_001896; CK2 알파 프라임(CK2 alpha prime)의 mRNA 서열에 대한 cDNA 서열; 호모 사피엔스 카제인 키나아제 2(Homo sapiens casein kinase 2), 알파 프라임 폴리펩타이드 (CSNK2A2), mRNA (2008년 3월 17일) (서열번호 11)

NM_177560; CK2 알파(CK2 alpha)의 mRNA 서열에 대한 cDNA 서열; 호모 사피엔스 카제인 키나아제 2(Homo sapiens casein kinase 2), 알파 1 폴리펩타이드 (CSNK2A1), 전사 변이체(transcript variant) 3, mRNA (2008년 3월 12일) (서열번호 12)

SEQUENCE LISTING <110> GENESEGUES, INC. <120> THERAPEUTIC NANOPARTICLES AND RELATED COMPOSITIONS, METHODS, AND SYSTEMS <130> 0269.13/PCT <140> <141> <150> 62/045,519 <151> 2014-09-03 <160> 12 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 1 atgtggagtt tgggttgtat 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 2 atgtggagtt tgggctgtat 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 3 atgtggagct tgggttgtat 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide" <400> 4 atgtggagct tgggctgcat 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence 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gtatgcagaa tgttgttggt tactgttgct ccccgagccc 1500 ctcaactcgt cccgtggccg cctgtttttc cagcaaacca cgctaactag ctgaccacag 1560 actccacagt ggggggacgg gcgcagtatg tggcatggcg gcagttacat attattattt 1620 taaaagtata tattattgaa taaaaggttt taaaagaaaa aaaaaaaaaa aaaa 1674 <210> 12 <211> 2522 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 cccgcctcct ggtaggaggg ggtttccgct tccggcagca gcggctgcag cctcgctctg 60 gtccctgcgg ctggcggccg agccgtgtgt ctcctcctcc atcgccgcca tattgtctgt 120 gtgagcagag gggagagcgg ccgccgccgc tgccgcttcc accacagaaa tcaagatgac 180 taccagctgg ttcgaaaatt aggccgaggt aaatacagtg aagtatttga agccatcaac 240 atcacaaata atgaaaaagt tgttgttaaa attctcaagc cagtaaaaaa gaagaaaatt 300 aagcgtgaaa taaagatttt ggagaatttg agaggaggtc ccaacatcat cacactggca 360 gacattgtaa aagaccctgt gtcacgaacc cccgccttgg tttttgaaca cgtaaacaac 420 acagacttca agcaattgta ccagacgtta acagactatg atattcgatt ttacatgtat 480 gagattctga aggccctgga ttattgtcac agcatgggaa ttatgcacag agatgtcaag 540 ccccataatg tcatgattga tcatgagcac agaaagctac gactaataga 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1440 gaacttttca taactcaggg gattccctga aaaattacct gcaggtggaa tatttcatgg 1500 acaaattttt ttttctcccc tcccaaattt agttcctcat cacaaaagaa caaagataaa 1560 ccagcctcaa tcccggctgc tgcatttagg tggagacttc ttcccattcc caccattgtt 1620 cctccaccgt cccacacttt agggggttgg tatctcgtgc tcttctccag agattacaaa 1680 aatgtagctt ctcaggggag gcaggaagaa aggaaggaag gaaagaagga agggaggacc 1740 caatctatag gagcagtgga ctgcttgctg gtcgcttaca tcactttact ccataagcgc 1800 ttcagtgggg ttatcctagt ggctcttgtg gaagtgtgtc ttagttacat caagatgttg 1860 aaaatctacc caaaatgcag acagatacta aaaacttctg ttcagtaaga atcatgtctt 1920 actgatctaa ccctaaatcc aactcattta tacttttatt tttagttcag tttaaaatgt 1980 tgataccttc cctcccaggc tccttacctt ggtcttttcc ctgttcatct cccaacatgc 2040 tgtgctccat agctggtagg agagggaagg caaaatcttt cttagttttc tttgtcttgg 2100 ccattttgaa ttcatttagt tactgggcat aacttactgc tttttacaaa agaaacaaac 2160 attgtctgta caggtttcat gctagagcta atgggagatg tggccacact gacttccatt 2220 ttaagctttc taccttcttt tcctccgacc gtccccttcc ctcacatgcc atccagtgag 2280 aagacctgct cctcagtctt gtaaatgtat cttgagaggt aggagcagag ccactatctc 2340 cattgaagct gaaatggtag acctgtaatt gtgggaaaac tataaactct cttgttacag 2400 ccccgccacc ccttgctgtg tgtatatata taatactttg tccttcatat gtgaaagatc 2460 cagtgttgga attctttggt gtaaataaac gtttggtttt atttatcaaa aaaaaaaaaa 2520 aa 2522

Claims (8)

1. 하나 이상의 생물활성제(bioactive agent), 6.0 유닛(unit) 미만의 HLB 값(value)을 갖는 계면활성제(surfactant), 리간드(ligand) 및, Li⁺과 Cs⁺를 포함하는 나노입자(nanoparticle)를 포함하며,
   ⅰ) 상기 하나 이상의 생물활성제 및 계면활성제는 계면활성제 마이셀(micelle) 코어(core)를 형성하고;
   ⅱ) 상기 리간드는 쉘(shell)을 형성하며;
   ⅲ) 상기 Li⁺은 Cs⁺으로 전처리되고;
   ⅳ) 상기 나노입자는 약 50 나노미터 미만의 평균 직경을 가지는 것인 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 나노입자는 멸균 증류수(sterile water)를 사용하여 제조하는 것인 조성물.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 생물활성제(bioactive agent)는 폴리뉴클레오타이드(polynucleotide) 또는 플라스미드 DNA(plasmind DNA)인 조성물.
   
4. 제1항에 있어서,
   ⅰ) 상기 하나 이상의 생물활성제는 각각 3' RNA 부위(portion) 및 주로 5' DNA 부위를 포함하는 복수 개의 폴리뉴클레오타이드를 포함하되, 상기 각 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단으로부터 2번째 위치는 2'-OMe 변형 RNA(2'-OMe modified RNA)이고, 평균적으로 상기 복수 개의 폴리뉴클레오타이드의 약 40% 내지 60%의 서열은 서열번호 8을 포함하고, 평균적으로 상기 복수 개의 폴리뉴클레오타이드의 나머지 서열은 서열번호 9를 포함하며;
   ⅱ) 상기 리간드는 테나신 수용체(tenascin receptor)를 표적으로 하는 단백질인 조성물.
   
5. 제4항에 있어서, 상기 단백질은 텐피브겐(tenfibgen)인 조성물.
   
6. 제1항의 조성물을 개체에 투여하는 것을 포함하는, 개체에 하나 이상의 생물활성제를 투여하는 방법.
   
7. 치료적 유효량의 제1항의 조성물을 환자에 투여하는 것을 포함하는, 고형 종양암(solid tumor cancer) 환자의 치료 방법:
   여기에서, ⅰ) 상기 하나 이상의 생물활성제는 각각 3' RNA 부위(portion) 및 주로 5' DNA 부위를 포함하는 복수 개의 폴리뉴클레오타이드를 포함하되, 상기 각 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단으로부터 2번째 위치는 2'-OMe 변형 RNA(2'-OMe modified RNA)이고, 평균적으로 상기 복수 개의 폴리뉴클레오타이드의 약 40% 내지 60%의 서열은 서열번호 8을 포함하고, 평균적으로 상기 복수 개의 폴리뉴클레오타이드의 나머지 서열은 서열번호 9를 포함하며;
   ⅱ) 상기 리간드는 테나신 수용체(tenascin receptor)를 표적으로 하는 단백질인 치료 방법.
   
8. ⅰ) 하나 이상의 생물활성제와 응집제(condensing agent)를 복합시켜 응집된(condensed) 생물활성제를 형성하는 단계;
   ⅱ) 상기 응집된 생물활성제를 6.0 미만의 HLB 값을 갖는 계면활성제를 포함하는 수-혼화성 용매(water-miscible solvent)에 분산(dispersing)시켜 계면활성제 마이셀을 형성하는 단계;
   ⅲ) 상기 계면활성제 마이셀의 외부 표면(exterior surface)에 리간드를 흡착(adsorbing)시켜 리간드 입자(ligand particle)를 형성하는 단계; 및
   ⅳ) 상기 리간드 입자와 Cs⁺ 및 멸균증류수로 전처리된 Li⁺을 혼합하고 인큐베이션(incubation)하여 조성물을 형성하는 단계;를 포함하는, 제1항의 조성물을 제조하는 방법.