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KR960000479B1 - 핵산 정제,분리 및 혼성체 형성용 다가양이온성 지지체 - Google Patents

핵산 정제,분리 및 혼성체 형성용 다가양이온성 지지체 Download PDF

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KR960000479B1
KR960000479B1 KR1019880701387A KR880701387A KR960000479B1 KR 960000479 B1 KR960000479 B1 KR 960000479B1 KR 1019880701387 A KR1019880701387 A KR 1019880701387A KR 880701387 A KR880701387 A KR 880701387A KR 960000479 B1 KR960000479 B1 KR 960000479B1
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존 아놀드 주니어 라일
찰스 넬슨 노만
알란 레이놀즈 마크
애트킨슨 왈드로프 3세 알렉산더
Original Assignee
젠-프로우브 인코오퍼레이티드
다니엘 엘.카시안
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Abstract

내용 없음.

Description

핵산 정제, 분리 및 혼성체 형성용 다가양이온성 지지체
1. 발명의 분야
본 발명은 핵산의 정제, 혼성체 형성과정에 대한 핵산의 고정화, 및 혼성체 형성이 되지 않은 보다 작은 폴리누클레오티드 또는 올리고누클레오티드 프로브를 상당량 제거하지 않으면서 용액으로부터의 상대적으로 큰 혼성화된 폴리누클레오티드의 선택적 분리에 대한 다가양이온성 지지체와 그의 사용에 관한 것이다.
2. 선행기술의 설명
최근에, 폴리누클레오티드를 정제하기 위한 고안과 폴리누클레오티드중의 특이적 누클레오티드 서열을 검출하기 위하여 편리하게 수행되는 혼성체형성 반응이 눈부시게 증가되어 왔다. 이런 이유로, 폴리누클레오티드와 올리고누클레오티드 프로브를 사용하여 폴리누클레오티드와 그의 혼성체를 분리하고 폴리누클레오티드 중의 특이적 표적 누클레오티드 서열을 검출하는 많은 방법이 개발되었다.
폴리누클레오티드 정제 분야에서는, 혼성체 형성에 앞서 폴리누클레오티드를 정제하기 위한 또는 다양한 생화학 과정에 간섭할지도 모르는 생물학적 오염물질을 제거하기 위한 과정이 사용된다.
역사적으로, 페놀 추출, 에탄올 침전, 겔 전기연동, 겔투과 크로마토그래피, 및 밀도 구배 침강과 같은 여러 다른 방법이 사용되어 왔다.
(Gilham, 1964 ; Scott & Kuhns, Analytical Biochem., 47, 471-4780 [1971] ; Cox & Leoning-Cook et al., [1973] ; Shin & Matrin, Biochemistry, 13 : 3411-3418[1974] ; Enea & Zinder, Science, 190 : 584-586 [1975] ; Shin & Khoury, Biochemistry 15 : 487-493, [1976] ; Longacre & Mach, J. Biol. Chem.253 : 7500-7507 [1978] ; Goldberg et al., Methods in Enzymol., 68 : 206-242 [1979] ; Kreig et al., Analytical Biochem., 134 : 288-294 [1983] ; and Gautreau, et al., Analytical Biochem., 134 : 320-324 [1983]).
보다 최근에는, 고성능 액체 크로마토그래피가 단일 및 이중스트란드 폴리누클레오티드의 제조 규모 정제에 사용되어 왔다.
이 방법에 사용된 음이온 교환 컬럼으로는 RPC-5 (Pearson et al., Biochem. Biophys. Acta., 228, 770-774, [1971]이 있고, Kel-F(Shum and Crothers, Nucl. Acids Res., 5, 2297-2311, [1978]) 또는 실리콘 처리된 유리비드(Narihara et al., J. Chromatog., 236, 513-518, [1982])를 함입하는 다른 피복된 지지체 및 누클레오겐(Nucleogen ; 누클레오겐은 서독, 듀렌소재의 Macherey-Nagel의 등록상표이다)같은 디에틸아미노에틸-유도체 실리카가 있다(Colpan and Riesner, J. Chromatog., 296, 339-353, [1984] ; Hecker et al., J.Chromatog., 326, 251-261, [1985] ; and Muller, Eur.J.Biochem., 155, 203-212, [1986]).
더불어, 최근의 다른 정제방법은 특정지지체의 표면에서 폴리누클레오티드의 선택적 흡착(Johnson et al., Biotechniques, 4, 64-70 [1986], Guenther et al., Fed, Proc., 44, 1622 (abs. 7086) [1985])과 상보누클레오티드 서열에 의한 폴리누클레오티드의 고정화(Nanibhushan & Crothers, Eur.Pat.App.No.130,523 [1985] ; Ruth et al., Fed. Proc. 44, 1622(abs. 7088), 1985 ; Blakesley and Thompson, Int.Pat. App. No. PCT/US 84/00508[1985])가 있다.
그러나, 상기 언급된 정제방법은 특히 임상적 환경에 적용될 때 하나 또는 그 이상의 다음의 제한을 받는다. 이들 제한은 : 그것들은 시간 소모적이거나 또는 힘이들며 ; 정량적으로 소정 폴리누클레오티드를 회수하지 못하고 ; 임상샘플과 양립하지 못하며 ; 또는 자동시스템과 쉽게 공유영역을 가질 수 없다는 것이다.
폴리누클레오티드를 정제하는 것에 더불어, 혼성체형성되지 않은 폴리누클레오티드 또는 올리고누클레오티드 프로브로부터 폴리누클레오티드와 누클레오티드 프로브의 혼성체를 분리하기 위한 고체 지지체가 사용되어 왔다. 적합하게 표지된 폴리머 누클레오티드 프로브와 결합하는 폴리누클레오티드의 혼성체형성은 유일한 또는 잘못 발현된 폴리누클레오티드 표적 서열을 검출하기 위한 특이적이고 민감한 방법으로서 오랫동안 인지되어 왔다. 이 능력은 박테리아, 바이러스, 기생충 및 진균류같은 감염성 유기체 ; 낫세포 빈혈증과 같은 유전적 질병 ; 및 각종 암의 검출을 허용한다. 그러나, 혼성체형성이 되지 않은 폴리누클레오티드로부터 혼성체를 신속하게 편리하게 분리할 수 없는 것은 임상진단과 연구상황에서 혼성체형성 방법의 사용을 제한하였다.
20년 이상 동안, 연구자들은 혼성체형성을 사용하여“표적”폴리누클레오티드의 존재를 확인하기 위한 방법을 개발하기 위해 연구해 왔다. 이들 방법은 혼성체형성이 되지 않은 폴리누클레오티드 또는 올리고누클레오티드 프로브 분자로부터 폴리누클레오티드 혼성체를 분리하는 것에 크게 기초하고 있다. 1963년과 1964년에, 니가아드와 할은 니트로셀룰로스를 통과하는 여과에 의하여 DNA/RNA혼성체를 분리하는 방법을 보고하였다(Biochem. Biophys. Res. Commun. 12, 98 [1963] ; J. Mol. Biol., 9, 125[1964]).
이들 연구자들은 단일 및 이중스트란드 RNA가 니트로셀룰로스에 부착하지 못하지만, 단일스트란드 DNA 또는 RNA에 복합체 형성된 DNA는 니트로셀룰로스에 부착하였음을 발견하였다. 그러므로, 방사성 표지 RNA와 미표지 DNA사이의 반응은 필터에 보유되어 있는 방사능 량의 측정에 의하여 모니터될 수 있다.
이 방법은 단일스트란드 DNA가 니트로셀룰로스 필터상에 고정화 되어있고 방사성표지 RNA함유 용액과 혼성화되는 질레스피에와 스피에겔만에 의해 기재된 방법(J. Mol.Biol. 12, 829 [1965])을 따랐다. 잉여 RNA의 제거 후, 혼성체형성 정도를 필터상에 고정된 방사성표지량에 의해 측정하였다.
다음해에, 덴하르드트가 단일-스트란드 DNA가 니트로셀룰로스에 고정되고, 필터는 비-특이적 배경을 감소하기 위해“캡화(capped)”되며, 고정된 DNA는 적합한 방사성표지 DNA 프로브함유 용액과 혼성되는 유사한 시스템의 개발을 보고하였다(Biochem. Biophys. Res. Commun., 23, 641[1966]), 이것은 오늘날까지 바람직한 혼성체형성 방법들중 하나로 남아있다. 그러나, 이 방법은 힘이 들며 시간소모적이다 ; 정상적으로는 완료되기까지 1일 이상이 필요하다.
니트로셀룰로스에 더불어, 히드록시아파타이트가 단일스트란드와 이중 스트란드 폴리누클레오티드 종을 분리하기 위하여 사용되어 왔다. 예를들어, 브리튼과 콘은 혼성화되어 있지 않은 대장균 DNA단편으로부터, 혼성되어 있는 [32P]-표지 대장균 DNA를 분리하기 위하여 히드록시아파타이트를 사용하였다(Carnegie Inst. Washington Yearbook, 65, 78 [1966]). 이들 방법은 시험관에서 분리 수행하기 위하여 브렌너등에 의해 더욱 다듬어졌다(Anal.Biochem., 28, 447[1969]).
혼성체형성 반응을 위해 DNA와 RNA의 고정화를 더욱 개선하기 위한 노력중에 많은 방법이 개발되었다. 이들로는 염화시아누르-활성 페이퍼에의 DNA와 RNA의 고정(Hanger et al., Biochem. Biophys. Acta, 653, 344 [11981])과 아릴디아조늄 셀룰로스 페이퍼에의 DNA와 RNA의 고정(seed, Nucl.Acids, Res., 10, 1799 [1982])이 있다.
니트로셀룰로스상에 고정된 DNA 또는 RNA에 혼성체형성된 비-동위원소표지 비오티닐화 프로브를 볼 수 있는 방법이 기재되어 있다(Leary et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80, 4045[1983]). 그러나 이 과정은 추가의“캡핑(capping)”및 세척단계를 필요로 하기 때문에 방사성표지를 사용하는 선행 프로토콜보다 훨씬 더 힘이든다.
혼성체형성을 사용하여“표적”폴리누클레오티드의 검출을 개선하기 위한 노력중에, 이중(샌드위치)혼성체형성을 사용하는 많은 방법이 개발되었다. 통상 고정된 폴리누클레오티드는 표지된 제2폴리누클레오티드와의 혼성체형성이 이어지는 표적 폴리누클레오티드를 발견하기 위해 사용된다(Dunn & sambrook, Methods. Enzymol., 65, 466-478 [1980] ; Palva, Journal Clin. Micro., 18, 92-100 [1983] ; Virtanen et al., Lancet, 381-383 [1983] ; Ranki et al., Gene, 21, 77-85 [1983] ; Ranki & Soderland, U.S.P.N. 4,486,539 [1984] ; Polsky-Cynkin et al., Clin. Chem., 31, 1438-1443[1985] ; Ranki & Soderlund U.S.P.N. 4,563,419 [1986]).
샌드위치 측정방법은 하나의 적용에서, 두가지 혼성체형성 반응이 용액중에서 수행되어 비오틴 표지된 프로브를 사용하여 전체 폴리누클레오티드 샌드위치를 분리하는 고정된 스트랩트아비딘상에서의 분리가 이어진다(Hansen & Jones, E.P.P. 0 139 489 [1985]).
상술된 혼성체형성 시스템은 여전히 취급이 용이하지 않고 임상 상태에서 혼성체형성 측정과정을 광범위하게 유용하게 만드는 속도가 부족하다. 그것들은 일반적으로 시간 소모적이며, 힘이들고 민감성이 부족하다. 더불어 그것들중 많은 것은 생물학적 샘플에 함유된 제와 양립할 수 없으며 쉽게 자동화될 수 없다.
3. 정의
본 명세서에 사용된바, 다음 용어들은 다음과 같이 정의된다 :
누클레오티드 : 인산기, 5탄당 및 질소함유 염기로 이루어지는 핵산의 하위단위. RNA에서 5탄당은 리보스이다. DNA에서는 5탄당은 2-데옥시리보스이다.
누클레오티드 다중체 : 포스포디에스테르 결합에 의해 연결된 누클레오티드의 사슬 또는 바람직한 특성(예컨대 검출 가능하게 공유 연결된)을 부여하는 하나 또는 그 이상의 비-누클레오티드 요소가 군데군데 삽입된 그러한 사슬.
올리고누클레오티드 : 길이가 일반적으로 약 10 내지 약 100누클레오티드, 그러나 200 또는 그 이상의 누클레오티드일 수 있는 누클레오티드 다중체. 통상 누클레오티드 단량체로부터 합성되거나 효소적 수단에 의하여 얻어진다.
폴리누클레오티드 : 길이가 일반적으로 약 100누클레오티드 또는 그 이상인 누클레오티드 다중체.
누클레오티드 프로브 : 제2누클레오티드 다중체, 통상은 진단용 중요성을 가지는 폴리누클레오티드내에 함유된 표적핵산 서열과 상보하는 누클레오티드 서열을 가지는 누클레오티드 다중체, 통상 프로브는 표적서열과 완전히 상보하도록 선택된다. 그러나, 어떤 경우에는 프로브중의 하나 또는 그 이상의 누클레오티드가, 표적서열의 해당하는 염기에 상보하지 않는 것이 적절하거나 또는 바람직하기 까지 할 수 있다. 누클레오티드 프로브는 또한 통상 표적서열 함유 다중체보다 작은 다중체이다. 전형적으로 그것은 올리고누클레오티드이지만, 폴리누클레오티드일 수 있고 통상 예를들어 방사계, 비색계, 형광계, 화학발광 또는 다른 적당한 기법에 의하여 그의 검출을 허용하는 화학적 치환기로 표지된다.
분리용액 : 본원에 기술되는 바와같이 특정경우에, 보다 작은 폴리누클레오티드와 올리고누클레오티드를 포함하며 결합 오염물질 없이 양이온성 고체 지지체에의 누클레오티드 다중체, 통상은 폴리누클레오티드 또는 그의 혼성체의 고정을 허용하는 조성을 가진 용액. 프로브와 혼성된 폴리누클레오티드가 고정되는 경우, 분리용액은 유리 누클레오티드 프로브의 지지체에의 결합을 저해하는 추가의 성질을 갖는다.
세척용액 : 본원에 기술된 바와같이 양이온성 고체 지지체의 표면으로부터 상당량의 소정 누클레오티드 다중체, 통상은 폴리누클레오티드, 또는 소정 폴리누클레오티드 혼성체를 제거하지 않으면서 과잉 누클레오티드 프로브 또는 오염물질의 제거를 허용하는 조성의 용액. 세척용액의 조성은 어떤 경우에는 분리용액에서와 같을 수 있다.
용리용액 : 폴리누클레오티드, 혼성된 폴리누클레오티드, 또는 표지된 누클레오티드 프로브와 같은 누클레오티드 다중체 또는 특이적 표지를 양이온성 고체 지지체의 표면으로부터 벗어나게 하기 위하여 고안된 용액으로, 특이적 이탈은 고체 지지체로부터 회수되는 소정종류에 의존하게 된다.
혼성체형성 용액 : 소정 혼성체형성이 일어나는 것을 허용하도록 고안된 용액. 소정 혼성체형성은 폴리누클레오티드와 표적서열에 대한 프로브 사이에서가 전형적이다. 그러므로, 혼성체형성이 양이온성 고체 지지체상에 이미 고정된 폴리누클레오티드와 함께 일어나는 경우, 이 용액은 누클레오티드 프로브의 지지체에의 비-특이적 결합을 최소화하는 추가의 성질을 갖는다.
4. 발명의 개요
본 발명은 다가양이온성 고체 지지체가 보다 작은것 보다는 보다 타이트하게 지지체에 결합하게 되는 보다 큰 누클레오티드 다중체를 그들의 크기에 따라 선택적으로 흡착하기 위해 사용될 수 있다는 발견을 토대로 한다. 결합 상호반응은 최소한 부분적으로는 누클레오티드 다중체의 양성전하 지지체와 음성전하 당 인산 골격사이의 이온성 인력에 기초하는 것으로 믿어진다. 이들 성질은 폴리누클레오티드의 신속한 정제 및 복합 용액으로부터의 그의 혼성체의 분리 두가지에 대한 배치식 방법에 사용될 수 있다.
발명에 따르는 한 가지 방법은 저분자량의 다중체를 포함하며 다중체가 얻어지는 유기체의 각종 성분 함유 용액중에서, 소정 다중체의 다가양이온성 지지체에의 흡착에 의하여 누클레오티드 다중체의 정제를 허용한다. 임상용 샘플의 경우에는, 누클레오티드 다중체는 또한 다중체가 분리되어야 할 체액 및 조직의 다른 성분으로부터 제거된다. 용액으로부터의 고체 지지체의 분리후에, 다중체는 지지체로부터 용리될 수 있다.
상대적으로 긴 폴리누클레오티드와 보다 짧은 표지 누클레오티드 프로브를 검출하기 위한 혼성체형성 방법에 유용한 발명에 따르는 다른 방법에서, 다가양이온성 지지체는 혼성화되지 않은 프로브로부터 프로브와 폴리누클레오티드, 및 그의 혼성체를 분리하기 위해 사용될 수 있다. 이 방법의 현재 바람직한 구체예에서, 프로브는 폴리누클레오티드 함유 용액에 첨가되고 고정화에 앞서 혼성체형성이 일어난다. 프로브와의 혼성체형성 후에, 프로브와의 그의 어떠한 혼성체를 포함하여, 폴리누클레오티드를 흡착하기 위해 용액이 지지체와 접촉하게 된다. 현재 덜 바람직한 구체예에서 다가 양이온성 지지체는 프로브의 첨가전에 지지체 표면에 폴리누클레오티드를 흡착시키기 위하여 폴리누클레오티드를 함유하고 있는 용액에 첨가된다. 이 경우에, 혼성체형성은 지지체 표면상에 일어난다. 다른 구체예에서는 상대적으로 긴 폴리누클레오티드가 지지체의 양이온성 표명사이에서 음성전하의 폴리누클레오티드 골격과의 상호반응을 통해 지지체에 결합한다. 폴리누클레오티드에 결합하지 않은 프로브분자는 지지체에 결합하지 않고 용액중에 보유된다.
지지체, 및 폴리누클레오티드와의 혼성체 같이 결합된 어느 누클레오티드 프로브는 경사(decantation), 원심분리 또는 여과에 의하여 용액으로부터 분리될 수 있다. 입자가 만약 자기성이면, 자기장 분리가 사용될 수 있다. 정제과정에서 누클레오티드 다중체는 용리기법의 사용에 의하여 고체 지지체로부터 회수될 수 있다. 프로브 측정법의 경우에, 고체상중의 또는 용액중의 표지의 존재는 측정될 수 있고 진단 유의의 정성 및 정량에 대한 샘플중의 폴리누클레오티드내에 함유된 표적 핵산 서열의 존재 및 양에 관련된다.
발명의 모든 구체예에서, 비-누클레오티드 물질로부터 누클레오티드 다중체를 분리하고 그들의 상대적인 길이를 토대로 누클레오티드 다중체의 혼합물을 분리하는 고도로 선택적인 방법이 제공된다. 따라서, 정성 및 정량과정을 포함하여 각종 정게 및 측정과정이 발명에 따라 수행될 수 있다.
5. 발명의 상세한 설명
핵산 혼성체형성의 공지된 기법은 적합한 조건하에서 상보 스트란드와 결합(혼성체형성)하는 단일스틀란드 누클레오티드 다중체의 능력을 이용한다. 본 발명은 누클레오티드 프로브와 혼성체를 형성한 폴리누클레오티드의 존재를 검출하기 위한 방법을 제공한다. 발명은 또한 누클레오티드 다중체와 그의 혼성체의 정제방법을 제공한다.
임상 샘플중의 누클레오티드 다중체의 정제 또는 폴리누클레오티드의 혼성체형성에 대한 어떠한 방법도 폴리누클레오티드의 분해를 촉진할 뿐만 아니라 분리를 간섭할 수 있는 생물학적 오염물질에 의해 나타나는 어려움을 극복해야만 한다. 예를들어 리보솜 RNA(“rRNA”)의 경우에, 정제는 rRNA가 정상적으로 복합체를 형성하는 rRNA로부터 각종 단백질을 제거하는 것을 필요로 한다. 더불어, 각종 누클레아제 및 다른 효소는 rRNA분해를 방지하기 위해 비활성화되어야 한다.
혼성체형성은 정상적으로 긴 표적 누클레오티드 분자, 특, 약 100 또는 그 이상의 누클레오티드(염기)로 이루어지는 단일스트란드 DNA 또는 RNA를 포함한다. 표적된 DNA 또는 RNA내의 특별한 염기서열(표적서열)의 존재 또는 부재를 측정하기 위하여, 누클레오티드 프로브분자는 호학적으로 합성되거나 기술분야에 공지된 각종 방법을 통하여 생물학적 DNA 또는 RNA로부터 단리된다. 누클레오티드 프로브는 표적의 소정 염기 서열에 상보하고 일반적으로는 검출가능한 약품종류로 표지된다. 그러나, 누클레오티드 프로브의 표지화는 혼성체가 다른 수단에 의하여 검출될 수 있다면 절대적으로 필요하지 않다. 전형적으로, 프로브는 길이가 수백 염기까지일 수 있긴 하지만, 15 내지 50염기 길이의 올리고누클레오티드이다. 표적 염기 서열이 존재하는 경우, 누클레오티드 프로브는 염기 짝짓기 상호반응을 통하여 표적에 결합한다.
일단 혼성체형성이 완료되면, 혼성체는 통상 혼성되지 않은 누클레오티드 프로브 분자를 함유하는 용액으로부터 분리된다. 그러나, 몇가지 적용에서는 그것은 가용성 및 불용성층을 예를들어 원심분리 또는 폴리누클레오티드 혼성체가 흡착되어 있는 배지로부터 지지체를 제거하지 않으면서 고정된 혼성체를 농축하는 다른 기법에 의하여 단순히 분리하기에 충분할 수 있다. 일단 혼성체가 혼성되지 않은 유리 프로브로 분리되면, 혼성체는 표준 방법에 의하여 검출된다. 직접 표지화 방법은 방사성 동위원소, 효소, 형광 및 화학발광분자를 포함한다. 그 자체 또는 홀로서는 검출할 수 없는 약품종류가 다른 복합체와 결합할 때 검출될 수 있는 간접표지가 또한 공지되어 있다. 간접 표지화의 실례로는 스트렙트 아비딘과 효소 사이의 포합체를 사용하는 비오틴-표지의 검출이 있다.
표지된 누클레오티드 프로브를 필요로하지 않는 다른 검출방법은 혼성체에 독특한 삽입물(intercalators), 혼성체에 특이적인 항체, 민감성 중량계 수단, 전자기 에너지의 반사의 변화, 또는 전기적 검출을 허용하게 되는 방법을 사용할 수 있다. 물론, 어떤 경우에는 혼성되지 않은 프로브를 측정하는 것이 바람직할 수 있고 그러한 방법은 또한 본 발명의 범주내에 있다.
본 발명의 방법에 따라 양이온성 고체 지지체와 적절한 분리용액이 사용되는 경우, 폴리누클레오티드 표적분자는 지지체에 결합하지만 결합하지 못한 누클레오티드 프로브는 상당량이 지지체에 결합하지 않는다. 이 현장의 정확한 이론적 설명이 완전히 분명하지 않고 발명자들은 어느 특정이론에 귀결되는 것을 바라지는 않지만 전하-전하 상보반응과 지지체 표면상의 양이온의 밀도에 관련되는 것은 의심할 수 없는 사실이다.
하나의 가능한 메카니즘은 중간정도의 완충액 조건하에 긴 폴리누클레오티드의 다중 대전영역이 양이온성 고체 지지체의 표면에 상호 협동적으로 도와서 결합한다는 것이다. 대조적으로, 보다 짧은 누클레오티드 프로브는 전하-전하 결합 영역의 동일한 다중성을 소유하지 않으며 그로써 지지체에 덜 강하게 결합될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 이들 지지체의 올리고누클레오티드 또는 폴리누클레오티드 이상의 긴 폴리누클레오티드에 선택적으로 결합하는 능력은 분명하다. 이것은 뒤에 이어지며 다양한 폴리누클레오티드 혼합물의 정제 및 분리에 대한 본 발명의 방법의 특별한 적합성을 지적하는 실시예에서 보여진다. 선행기술 기법과는 달리, 발명의 방법은 누클레오티드 다중체를 그의 길이 및 전하를 토대로 하여, 가장 주목할만하게는 혼성체형성 과정에서 신속한 분리를 허용한다.
인산골격에 저음성 전하를 가지는 종래 DNA 또는 RNA의 유사체를 프로브로서 사용하는 것 또한 본 발명의 범주내에 있다. 그러한 유사체중에서 밀러등이 Biochemistry, 25, 5092 [1986]에 기재한 메틸포스포네이트를 언급할 수 있다.
용액중의 상보 누클레오티드를 선택하기 위하여 자기성 소구체(magnetic microsphere)에 공유결합된 누클레오티드 프로브의 사용에 대하여 몇가지 제안이 이루어져 왔다. 그러나 고체 지지체에 누클레오티드 다중체가 직접 공유결합하는 것은 혼성체형성에 필요한 상보 스트란드 사이에 적절한 상호반응에 바람직하지 못한 입체적 상황을 만들어낼 수 있다. (Life Technologies,“핵산의 고정화”WO 85/04674 [10/24/85] 참조.) 이 점에 있어서 상세한 개시의 부재시에는 화이트헤드(Whitehead )에 의해 설명된 방법은 정제 및 혼성체형성에 부적당하다. 본 발명은 분리에 영향을 주기위한 이온상호 반응에 의존함으로써 공유결합에 대한 필요를 회피한다. 그러므로, 발명의 특히 바람직한 구체예에서, 다가양이온성 표면을 가지고 있는 자기 소구체는 상술된 각종 방법의 어느 것에서도 용액으로부터 누클레오티드 다중체와 그의 혼성체를 제거하는 데 사용된다.
본 발명의 방법은 두 가지 요소를 사용한다. 이들은 양이온성 고체 지지체와 누클레오티드 다중체의 정제 및 누클레오티드 프로브와 함께 혼성체의 형성에 기초한 폴리누클레오티드중의 표적서열의 측정에 대한 과정에 관련된 고정화, 분리, 세척 및 용리단계를 용이하게 하기 위하여 사용된 하나 또는 그 이상의 여러가지 접촉용액이다. 이들 용액은 폴리누클레오티드의 고정화, 폴리누클레오티드 혼성체와 누클레오티드 프로브의 분리, 고정된 폴리누클레오티드 (폴리누클레오티드와 누클레오티드 프로브 사이의 혼성체 포함)의 세척, 고정된 폴리누클레오티드(폴리누클레오티드와 누클레오티드 프로브 사이의 혼성체 포함)의 용리, 또는 폴리누클레오티드와 누클레오티드 프로브 사이의 고정된 혼성체의 존재와 상호관련이 있는 검출가능한 효소의 용리에 사용된다.
양이온성 고체 지지체의 조성과 접촉용액의 조성이 양이온성 고체 지지체의 조성에 의하여 및 그 역에 의하여 부분적으로 측정되는 그러한 접촉용액의 형상화 사이에는 상호작용이 존재한다.
더욱이, 하나의 그러한 용액의 성분이 방법의 다음 단계에 필요한 조성을 생성하기 위하여 시약을 첨가함으로써 이월되고 변형될 수 있기 때문에 많은 접촉용액간에 밀접한 상호작용이 있다.
이들 형상제의 사용을 분명히 하기 위하여, 그것들은 일반적으로 용도의 세 영역으로 나누어진다. 이들은 :
Ⅰ. 폴리누클레오티드 또는 누클레오티드 다중체의 정제.
Ⅱ. 폴리누클레오티드의 고정화와 전형적으로 이어지는 상기 폴리누클레오티드내에 함유된 유일한 누클레오티드 서열을 시험하기 위한 혼성체형성.
Ⅲ. 용액중에 형성된 폴리누클레오티드와 누클레오티드 프로브 사이의 혼성체의 분리 및 검출.
이들 방법중 수행하고자 하는 것에 따라 상이한 세트의 접촉용액이 필요할 수 있다. 일반적으로, 하나 또는 그 이상의 용액의 사용이 모든 경우에 필수적이지 않을 수도 있지만 이들 방법의 각각에 유용한 단계 및 용액은 다음과 같다 :
Ⅰ. 누클레오티드 다중체의 정제
(1) 분리용액의 존재하에서의 양이온성 고체 지지체상에서의 누클레오티드 다중체, 통상은 폴리누클레오티드의 고정화단계.
(2) 세척용액을 사용하는 오염물질의 제거와 양이온성 고체 지지체상과 용액층에서의 고정된 다중체의 분리단계.
(3) 용리용액을 사용하여 양이온성 고체 지지체의 표면으로부터의 다중체의 회수단계.
Ⅱ. 폴리누클레오티드의 고정화와 혼성체형성
(1) 분리용액의 존재하에 양이온성 고체 지지체 상에서의 폴리누클레오티드의 고정화단계.
(2) 세척용액을 사용하는 오염물질의 제거단계(선택적).
(3) 고정된 폴리누클레오티드와 혼성되지 않은 누클레오티드 프로브의 고정화를 최소화하기 위하여 고안된 누클레오티드 프로브와의 혼성체형성 용액중의 접촉단계.
(4) 혼성되지 않은 누클레오티드 프로브의 고정화를 최소화하는 세척용액을 사용하는 혼성되지 않은 프로브의 제거와 양이온성 지지체상과 용액층에서의 고정된 혼성체의 분리단계(선택적).
(5) 용리용액을 사용하여 고정된 혼성체의 존재와 상호관련이 있는 혼성체 또는 검출가능한 요소의 회수단계(선택적).
(6) 혼성체 또는 혼성체의 존재와 상호관련이 있는 혼성체와 결합된 검출가능한 요소, 또는 혼성되지 않은 누클레오티드 프로브의 검출 단계.
Ⅲ. 용액중에 형성된 혼성체의 분리와 검출
(1) 혼성체형성 용액의 존재하에 누클레오티드 프로브와 누클레오티드 프로브에 상보하는 염기 서열을 함유하는 폴리누클레오티드와의 혼성체형성단계.
(2) 형성된 어떠한 혼성체가 혼성되지 않은 누클레오티드 프로브의 상당량의 고정화를 허용하지 않으면서 양이온성 고체 지지체에 결합하는 것을 허용하기 위한 혼성체형성 혼합물과 양이온성 고체 지지체 및 분리 용액과의 접촉단계.
(3) 혼성되지 않은 누클레오티드 프로브의 고정화를 최소화하는 세척용액을 사용한 혼성되지 않은 프로브의 제거단계(선택적).
(4) 용리용액을 사용한 고정된 혼성체의 존재와 상호관련이 있는 혼성체 또는 검출가능한 요소의 회수단계(선택적).
(5) 단계(3)에서의 혼성체 또는 혼성되지 않은 누클레오티드 프로브의 존재와 상호관련이 있는 혼성체 또는 검출가능한 요소의 검출단계.
기술분야에 숙련된 사람들은 이 다가양이온성 지지체가 직접결합, 경합 및 프로브 대치 측정을 포함하여 다양한 특정형식에 사용될 수 있다는 것을 인식하게 될 것이다. 더불어, 표지는 직접 또는 간접표지의 어느 하나일 수 있다. 어떤 프로브 대치 측정형식에서 혼성체형성은 결합층과는 반대로 표지가 결합되지 않은 층에 나타나게 유발할 수 있었다. 상기 실시예는 누클레오티드 다중체를 감소시키는 양이온성 지지체의 한가지 특성을 예시하기 위해 단독으로 작용한다. 본 발명은 어느 특정한 측정형식에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 추가의 설명을 명확히 하기 위해서는 양이온성 고체 지지체의 조성과 관련있는 요소와 각종 접촉용액의 형상화로 분류될 것이다. 그러나, 기술분야에 숙련된 사람들은 발명의 실제 실시가 정제되거나 또는 프로브될 누클레오티드 다중체를 이탈시키기 위한 샘플수집 및 샘플처리 같은 단계에 의하여 진행될 것이라는 것을 인정하게 될 것이다. 예를들어, 세포용해를 수행할 필요성과 그렇게하기 위한 과정은 기술분야에 잘 공지되어 있으며 그러한 과정의 설명은 발명의 설명을 완전히 하기 위하여 불필요하다.
[양이온성 고체 지지체]
본 발명의 다가양이온성 지지체 매트릭스는 거기에 제한하는 것은 아니지만 금속산화물, 유리, 폴리아미드, 폴리에스테르, 폴리올레핀, 폴리삭카라이드, 폴리글리콜, 및 폴리아미노산을 포함하여 광범위의 각종 무기 및 유기물질로부터 선택될 수 있다. 기본적인 필요조건은 매트릭스 지지체가 사용하는 조건하에서 오염물질 또는 누클레오티드 프로브에 이중으로 흡착하지 않는다는 것이다.
바람직한 지지체는 필요한 물질의 양을 최소화하기 위하여 높은 표면대 부피비율을 가지는 것들이다. 그러한 비율은 입자, 특히 미크론 크기의 입자, 아가로스, 또는 단독으로 또는 필터 매트안에 배열된 소직경섬유와 같은 고다공성 물질을 사용함으로써 이루어질 수 있다. 작은, 미크론 크기입자의 사용이 바람직하다.
다음의 실시예에서, 매트릭스는 화이트헤드등에 의하여 기재된 바와 같이 (U.S.P.N. 4,554,088 ; Nov. 19, 1985)발명이 이들 물질에 한정되는 것은 아니지만, 자기반응성 산화철, 라텍스 소구체, 세파로스 비드, 또는 적당히 가능화된 막을 포함할 수 있음이 나타난다.
지지체는 염, 세제 및 온도의 적합한 조건하에 소정 폴리누클레오티드의 흡착을 가능하게 하는 충분한 전하밀도의 양이온적으로 변형된 표면을 가져야 한다. 전하밀도는 실험적으로 측정될 필요가 있을 수 있지만 일반적으로는 지지체의 밀리그램당 0.01 내지 10 미크론 당량범위이다.
전하는 거기에 한정하는 것은 아니지만 구아니딘 및 이민류 뿐만아니라 일차 아민, 이차 아민, 삼차 아민, 4차 아민을 포함하여 알킬 및 아릴 아민을 포함하는 양이온 범위로 도입될 수 있다.
그러한 부분의 실례로는 3-아미노프로필, 2-아미노에틸-3-아미노프로필트리스(2-아미노에틸)아민, 스페르민, 스페르미딘, 펜타메틸-2-아미노에틸-3-아미노프로필 기, 및 폴리리신, 폴리아르기닌, 폴리에틸렌이민, 및 폴리알릴아민 같은 아민 작용기가 있는 다중체가 있다. 일반적으로 지지체 표면상에 존재하는 작용기는 양이온 작용기를 함유하는 시약으로 쉽게 변형될 수 있다. 거의 모든 어느 매트릭스의 표면상에 기능기를 도입하는 많은 방법이 기술분야에 공지되어 있다.(예를들어, 포라스와 악센의 Methods in Enzymology, 44, 19-45(1976), 및 골드만등의“고체 지지체상의 반응의 생화학적 측면”중, G.R.Stark, ed.,Academic Press(1971)참조.)
부분적으로 양이온성 지지체의 형상화는 그의 용도에 의존하여 실험적으로 측정된다. 고체 지지체를 형상화하는 전형적인 프로토콜이 이어지지만, 다른 유사한 과정 또는 사용될 수 있다. 만약 양이온성 고체 지지체가 누클레오티드 다중체의 정제에 단독으로 사용되어야 한다면, 표적 다중체는 0.6M 이하의 인산나트륨, pH=6.8인 완충액중에서 지지체에 결합하는 능력에 대하여, 및 20mM 이상의 인산나트륨, pH=6.8에서 용리되는 능력에 대하여 시험된다. 만약 폴리누클레오티드가 0.6M 이하의 인산나트륨, pH=6.8에서 결합하지 않는다면 양이온 밀도가 증가되거나 또는 단일부착 부위에서의 양이온의 다중성이 증가된다(예를들어, 트리스(2-아미노에틸)아민으로의 3-아미노프로필기의 대치.) 다른 한편으로 만약 폴리누클레오티드가 20mM 이상이 인산나트륨, pH=6.8완충액에서 용리될 수 없다면, 양이온 밀도는 감소되거나 또는 단일부착 부위에서의 양이온의 다중성이 감소된다.
지지체가 누클레오티드 프로브로부터의 폴리누클레오티드 혼성체 분리에 사용되어야 하는 경우에, 누클레오티드 프로브가 혼성체를 보유하는 조건하에서 상당히 결합되지 않아야 한다는 추가의 필요조건이 있다. 이들 조건은 폴리누클레오티드와 누클레오티드 프로브 두가지를 20mM과 0.6M 인산나트륨, pH=6.8 사이에서 모니터하고, 폴리누클레오티드의 누클레오티드 프로브에 대한 최대 결합 비율을 제공하는 완충농도를 선택함으로써 시험될 수 있다. 만약 만족할 만한 결합비율이 이루어질 수 없다면, 표면밀도 및 양이온의 다중성이 추가로 변형된다.
일반적으로 누클레오티드 프로브에 대한 폴리누클레오티드의 길이는 통상 양호한 분리를 위해서는 3대 1이상의 비율, 바람직하게는 5대 1이상의 비율이어야 한다는 것이 주지되어야 한다. 그러나, 프로브 골격중에서의 보다 낮은 음성전하를 가지는 DNA 또는 RNA 유사체의 사용은 이 범위의 완화를 허용할 수 있다. 그러나, 몇가지 프로브 대치 및 경합측정의 경우에 3대 1의 비율이 이루어져야 할 필요는 없으며, 실제로 프로브 구조는 표적보다 더 길 수 있다.
[접촉용액]
다가 양이온성 지지체에 더불어, 분리용액은 특히 중요하며 누클레오티드 다중체와 그들의 프로브 혼성체의 고정화를 용이하게 하고 분해를 방지하기 위해 조심스럽게 고안되어야 한다. 접촉용액은 다양한 완충액을 포함할 수 있으며, 그의 농도는 원하는 조작에 따라 변할 것이다. 용액의 성분과 용액중의 그들의 농도는 많은 인자 : 만약 있다면, 특히 임상샘플 중에서, 누클레아제를 비활성화하기 위한 필요성 : 원하는 폴리누클레오티드 분리 ; 및 분리후의 다른 소정단계에 따라 좌우된다. 예를들어 연속적인 효소검출 계획이 포함되어야 한다면, 단백질 변성 또는 저해제는 내인성 효소활성으로부터 배경을 최대로 감소시키기 위해 분리용액의 일부로서 필요하게 될 것이다.
선행과정 단계로부터 남아있는 성분 또한 고려되어야 한다. 예를들어, 대부분의 경우에 분리는 생물학적 물질 또는 혼성체 형성 반응액으로부터 폴리누클레오티드를 제거함으로써 행해질 것이다. 상기 폴리누클레오티드를 생물학적 샘플로부터 이탈시키기 위하여 또는 혼성체형성을 용이하게 하기 위해(즉, 가속된 혼성체 형성률) 사용되는 각종 성분 및 시약은 연속적인 분리용액의 성분으로서 남아있게 될 것이다.
접촉용액은 공통의 많은 성분을 가지며 몇가지 경우에 그들의 조성은 동일하기도 하다. 예를들어, 세척용액과 분리용액의 조성은 누클레아제 활성의 저해, 누클레오티드 프로브 결합의 방지, 및 혼성체형성률 가속화에 관련된 물질의 유해효과의 무효화에 관해서는 유사할 수 있다.
접촉용액형성의 첫번째 단계는 양이온성 고체 지지체의 소정용도에 따라 좌우한다. 다음 단계는 접촉용액을 형상화하는 것이다. 일반적으로 형상화에 대한 시약은 다음의 범주에서 선택된다.
효소-이들은 부분적으로 누클레아제를 분해하고 저해하기 위하여, 단백질/핵산 상호반응을 파괴하기 위하여, 및 어떤 경우에는 고정된 혼성체와 결합된 표지를 절단하기 위하여 사용된다. 그것들로서는 프로테아제, 디에스테라제, 누클레아제 및 펩티다제가 있다. 누클레아제 저해제-이들 제는 폴리누클레오티드 분자와 누클레오티드 프로브 두가지의 분해를 방지하기 위해 사용된다. 그것들로서는 프로테아제, 디에스테라제, 누클레아제 및 펩티다제가 있다. 프로브 두가지의 분해를 방지하기 위해 사용된다. 그것들로서는 바나딜 설페이트, 바나딜 리보시드 및 RNA GuardTM(사람태반 리보누클레아제 저해제, Pharmacia Fine Chemicals., Piscataway,NJ,USA)같은 리보누클레아제 저해제, 데옥시리보누클레아제 저해제, 및 일반적인 단백질 변성제인 도데실황산 나트륨 및 라우릴황산 나트륨 같은 세제가 있다.
착화제-이들 물질은 착화되지 않은 경우 각종 효소의 활성에 필수적인 각종 금속을 착화하기 위해 사용된다. 예를들어 많은 데옥시리보누클레아제는 활성에 Ca2+를 필요로 한다. 금속이온의 착화는 또한 Mn2+같은 금속이 혼성체형성에 간섭할 수 있기 때문에 혼성체형성 반응을 최적화하는데 중요하다. 착화제로는 에틸렌 디아민테트라아세트산(EDTA)과 에틸렌 글리콜비스(2-아미노에틸에테르)-N,N,N',N'-테트라아세트산(EGTA)이 있다.
세제-이들 물질은 과립물질의 용해, 누클레아제의 저해, 및 분리용액과 세제용액을 사용하여 양이온성 고체 지지체에의 오염물질과 누클레오티드 프로브의 원하지 않은 고정화 감소를 돕기 위하여 사용된다. 세제는 또한 혼성체형성 반응을 가속화하기 위하여 사용된다.(가속화된 속도시스템에 대한 특허가 계류중이다.) 어떤 상황에서는 한가지 세제가 혼합미셸을 형성함으로써 제2세제의 유해효과를 없애는데 사용될 수 있다. 세제범주에 포함되는 물질로는 도데실황산 나트륨, 라우릴황산 리튬, N-라우로일사르코신, 디이소부틸 술포숙신산 나트륨, 트리톤R×-100, 브리즈R, 트윈R-20 및 트윈R-80이 있다(트리톤R, 브리즈R, 및 트윈R은 ICI Americas의 등록상표이다).
완충염-이들 물질은 누클레오티드 다중체 안정성, 혼성체 안정성, 및 표지로서 사용된 제의 안정성과 양립하는 pH범위를 유지하기 위해 사용된다. 이들 물질은 또한 양이온성 고체 지지체상의 혼성체의 고정화와 용액중의 누클레오티드 프로브의 보유 사이에 분리용액을 사용하여 일차 평형을 정립하기 위해 사용된다. 더불어, 그것들은 혼성체형성 용액중의 긴축성을 정립하기 위해 사용된다. 다양한 염의 농도는 또한 지지체의 표면으로부터 혼성체 또는 혼성체와 결합된 누클레오티드 프로브의 용리를 보조하기 위하여 사용될 수 있다. 그러한 물질로는 (거기에 한정하는 것은 아니지만) 칼륨, 나트륨, 칼슘, 구아니딘, 염화물, 플루오르화물, 황산, 인산, 아세트산, 숙신산, 피트산, 및 트리폴리안신의 염이 있다.
유기용매-이들 용액은 각종 물질의 유화를 돕고, 혼성체형성 온도와 조건의 변경, 오염물질의 제거 및 누클레오티드 프로브와 혼성체의 제거에 있어서의 용리용액을 사용하는 원조를 위해 사용된다. 그러한 유기용매로는 메탄올, 에탄올, 이소프로필알코올, 포름아미드, 및 디메틸포름아미드가 있다.
다른 유기 및 무기물질-다른 물질이 각종 접촉용액중에서 소정 특성을 부여하기 위해 사용될 수 있다. 이들은 아세트산, 인산, 플루오르화수소, 황산, 및 질산같은 유기 및 무기산이다. 또한 용리용액을 사용하여 누클레오티드 프로브로부터 표지를 제거하기 위해 사용되기도 하는 무기물질도 포함된다. 이들 물질로서는 과요오드산, 아세트산 납 및 이산화망간이 있다. 특이한 경우에 사용될 수 있는 개별 접촉용액은 일반적으로 다음과 같이 형성화된다 : 혼성체형성 용액-일반적으로 염 완충제, 세제, 누클레아제 저해제 및 착화제와 함께 형상화된다. 형상화는 폴리누클레오티드와 누클레오티드 프로브 사이의 혼성체형성을 용이하게 하기 위하여 합성된다. 더불어, 폴리누클레오티드가 혼성체형성에 앞서 고정되는 경우 형상화는 양이온성 지지체에의 누클레오티드 프로브의 상당량의 결합을 방해하기 위해 선택된다.
분리용액-일반적으로 누클레오티드 프로브의 상당한 고정화를 허용하지 않으면서 혼성체의 고정화를 허용하기 위해 염 완충제, 세제, 및 누클레아제 저해제를 포함한다.
세척용액-일반적으로 오염물질과 혼성되지 않은 누클레오티드 프로브의 제거를 허용하면서 고정된 혼성체를 유지하기 위하여 염 완충제와 세제와 함께 형상화된다.
용리용액-일반적으로 지지체의 표면으로부터 폴리누클레오티드, 폴리누클레오티드 혼성체, 누클레오티드 프로브 또는 혼성체와 결합된 표지를 이탈시키기 위하여 염 완충제, 유기용매, 세제 및 다른 시약을 포함한다.
검출용액-특이적으로 혼성체 또는 특이적 표지를 검출하기 위해 형상화된다.
그의 조성은 검출수단에 따라 좌우되고 선행 기술방법에 따라 형상화된다.
예를들어, 만약 표지가 효소이면, 검출용액은 선택된 효소기질과 다른 시약을 함유할 것이다.
예를들어, 만약 표지가 효소이면, 검출용액은 선택된 효소기질과 다른 시약을 함유할 것이다.
기술분야에 숙련되고 전술한 일반적인 설명의 장점을 아는 사람들은 특이적 접촉용액의 성분을 숙련된 기술분야내에서 잘 갖춰진, 특히 다음의 실시예를 참고로 하여 광범위의 과정 및 조건에 맞출 수 있을 것이다.
다음의 실시예에서 사용되는 물질은 다음과 같다 : 자기성 아민 소구체는 어드밴스드 마그네틱스 인코오퍼레이티드(Cambridge, MA, USA ; Biomag M4100, 물중의 50mg/ml)로부터 얻었다 ; 라이소자임은 미합중국, 미조리주 세인트 루이스 소재의 시마그로부터의 Grade I이었다 ; 요소는 미합중국 매릴랜드주 베데스다 소재의 베데스다 리서치 랩으로부터의 효소급이었다 ; RNA GuardTM(사람태반 리보누클레아제 저해제)는 미합중국 뉴져어지주 피스카타웨이의 파마시아로부터 ; CytoscintTM(액체 신틸레이션 칵테일)은 미합중국 캘리포니아주 산디에고 소재의 웨스트켐으로부터 ; 폴리에틸렌 글리콜 8000은 미합중국 뉴욕주 로체스터소재의 이스트만-코닥으로부터 ; 술포숙신산 디이소부틸(DIBSS)은 미합중국 인디애나주 모나로부터 얻었고 젠-프로브 인코오퍼레이티드의 가속화된 속도시스템(특허 계류중)에 사용되었으며(실시예 7과 12 참조) ; 히드록시아파타이트(HAP)와 쯔비터젠트 3-14는 미합중국 캘리포니아주 라욜과 칼바이오켐 디비젼의 베링-디아그노스틱스로부터 ; 도데실 황산나트륨(SDS)은 트리즈마-염기(Tris)와 같이 미합중국 미조리주 세인트 루이스의 시그마로부터 ; 트리톤 X-100은 미합중국 뉴욕주 오렌지버그 소재의 피쉬 디아그노스틱스로부터 얻었으며 ; 스톡 [3H]-rRNA(대장균 리보좀의 16S와 23S)를 사용하였다. 16S 하위단위의 rRNA는 대략 1500 염기길이이고 ; 23S 하위단위는 대략 3000 염기이다.
모든 다른 시약은 시약등급이었다.
모든 인산 완충액(PB)은 다른 언급이 없는 한 나트륨 염, pH 6.8이었다.
모든 조작은 다른 언급이 없는 한 1.5ml 스크류-캡 폴리프로필렌 소형원심분리 튜브중에서 실온에서 수행하였다.
rRNA의 자기성 아민 소구체(Microsphere)로의 결합
rRNA 결합상에 대한 여러가지의 완충제 농도의 효과를 결정하기 위하여 자기적 아민 소구체 5μl, [3H]-rRNA 1μl(1㎍) 및 표 1에 적힌 시약 100 또는 150μl를 합하여 분리용 혼합물을 제조하였다.
시약은 완전한 측정원안에 사용되는 것들을 포함하여 rRNA 결합에 대한 그 효과를 결정하기 위하여 연구되었다.
혼합물을 2초간 가변게 와류시킨 다음 5 내지 10분간 방치하였다.
자기성 아민 소구체를 BioMag 분리기(Advanced Magnetics, Inc. catalon #M4101)를 사용하여 튜브의 바닥에 자기적으로 펠렛화하고 상청액(비결합)을 제거하였다.
자기성 아민 소구체를 100 또는 150μl의 결합이 일어난 완충액내에서 1 내지 2초간 와류시킨 다음 자기성 아민 소구체를 자기적으로 펠렛화하고 상청액을 제거하는 세척하였다(1회 또는 2회).
자기성 아민 소구체를 100 또는 150μl의 세척완충액의 재현탁시키고 20ml 폴리프로필렌 튜브내의 시토신트 15ml에 비결합 및 세척부분처럼 첨가하였다.
각 샘플내의 트리튬양을 뉴클리어 시카고 신틸레이션 카운터로 결정하였다.
하기 표 1에서 보듯이 자기성 아민 소구체에로의 흡착에 의한 rRNA의 제거는 완충제 농도의 변화에 민감하지만 완전한 측정 원안에 존재하는 다른 시약에는 심하게 영향받지 않는다.
보다 중요하게는 결합을 감소시키는 시약의 효과는 그 농도를 다양하게 하는 것 또는 용액내에 다른 시약을 첨가하는 것에 의하여 조작할 수 있다.
[표 1]
Figure kpo00001
* 1 ; 0.1M 트리스(pH 7.5), 1M NaCl, 2.5% 폴리에틸렌글리콜.
* 2 ; 7% 수크로스, 0.08M 글리신(pH 9.0 W/NaOH), 8mM EDTA, 25mM DTT, 2mg/ml 리소자임.
* 3 ; pH 4 W/5N NaOH로 조절된 HOAc. 최종 HOAc 농도=44%.
* 4 ; 중량 : 부피 술포숙신산 디이소부틸.
[실시예 2]
자기성 아민 소구체로의 DNA의 결합
본 연구는 다른 완충제 농도 및 타측정 시약이 자기성 아민 소구체에 대한 DNA 결합에 주는 효과를 결정하기 위하여 고안되었다.
실시예 1의 방법을 사용하되 미코플라스마 뉴모니아로부터 rRNA에 대한 [3H]-cDNA를 스톡 rRNA대신 사용하였다.
cDNA는 약 400 내지 1600인 크기 범위인 cDNA의 혼합이였다.
표2에서 보듯이 cDNA는 rRNA 만큼이나 자기성 아민 소구체에 결합하며 결합의 정도는 다른 시약의 첨가뿐 아니라 완충제 농도의 변화에 의해서도 조절될 수 있다.
[표 2]
Figure kpo00002
[실시예 3]
자기성 아민 소구체로부터 rRNA의 용리 및 혼성체 형성
본 실험에서는 [3H]-rRNA를 자기성 아민 소구체로부터 용리하여 혼성화하였다.
실시예1에 언급된 물질에 첨가하여 [32P]-ATP를 Amersham Corp.( Arlington Hts., IL, 미국)로부터 얻었고 T4 폴리누클레오티드 키나제를 Berthesda Research Labs, Inc.(Gaithersburg, MD, 미국)로부터 얻었다.
프로브는 Applied Biosystems, Inc. Model 380A DNA 합성기를 사용하여 합성하였다.
데옥시올리고누클레오티드는 표준 포스포르아미다이트 화학을 사용하여“5'-AGGACCGTTATAGT TAGGGCCGCCGT-3'”로 생산되었다. (이 서열은 대장균 리보솜의 23S 하위단위의 1901-1926 염기에 상보적이다)(프로브 서열에 대해 특허출원중.) 그 다음 올리고머는 5' 말단상에 [32P]-ATP와 T4 폴리누클레오티드 키나제를 사용하여 막삼과 길버트의 방법에 따라 표지화 하였다(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 74, 560(1977)).
[3H]-rRNA 고정, 용리 및 혼성체 형성 : [3H]-rRNA를 자기성 아민 소구체 10μl(50/ml3, 0.14M PB 100μl 및 [3H]-rRNA 3μl(1mg/ml)와 결합시켜 고정하였다.
혼합물을 가볍게 1 내지 2초간 와류시킨 다음 5 내지 10분간 방치하였다.
자기성 아민 소구체를 자기적으로 펠렛화하고 상청액(비결합)을 제거하였다. 그 다음 자기성 아민 소구체를 0.14M PB 100μl로 1회 세척하고 상청액을 제거하였다.
[3H]-rRNA를 용리하기 위하여 0.6M PB 50μl를 자기성 아민 소구체에 첨가하고 혼합물을 1 내지 2초간 와류시켰다.
5μl를 빼내어 방사능을 카운트하였다(실시예 1 참조).
용액의 나머지는 실온에서 15-30분간 방치하였다.
그 다음 자기성 아민 소구체를 자기적으로 펠렛화하고 상청액 5μl로 방사능을 카운트하였다.
또다른 상청액을 빼내어 다음과 같은 혼성체 형성 혼합물에 넣었다 : 0.6M PB(1.1pmol)내에 용리된 [3H]-rRNA 25μl, [32P]-DNA 프로브(.23pmol) 0.5μl, 1% SDS 1.5μl, 및 H2O 4μl, 총 32μl 용액.
대조표준 혼성체 형성 또는 동일양(방사능에 기초하여)의 스톡[3H]-rRNA : 1.8μl 스톡 [3H]-rRNA(1.1pmol), 0.5μl[32P]-DNA 프로브(.23pmol), 14.8μl 1.0M PB, 1.5μl 1% SDS 및 12.4μl H2O, 총 31μl 용액을 사용하여 수행하였다.
그 다음 혼성체 형성 혼합액을 50℃에서 3시간 인큐베이트하였다.
각 혼합물을 7ml 폴리프로필렌 신틸레이션 바이알내의 2% 히드록시아파타이트 (HAP)함유 0.14M PB 5ml에 첨가하였다.
15초간 와류시킨 다음 50℃에서 5분간 인큐베이트하였다.
그 다음 HAP를 IEC테이블 탑 임상용 원심분리기(Needham Hts., MA, USA)를 사용하여 2000×G에서 2분간 원심분리하여 페렛화하였다.
상청액을 제거하고 0.14M PB 5ml를 첨가한 다음 혼합액을 15초간 와류시키고 상술한 바와같이 원심분리하였다.
상청액을 제거하고 혼성체 형성 퍼센트 즉 HAP에 결합된 프로브 관련 [32P] 카운트의 퍼센트를 결정하기 위하여 HAP, 비결합 및 세척용액의 세렌코프(Cerenkov) [32P] 활성을 측정하였다.
지지체에 결합된 [3H]-rRNA의 80%가 용리되었다.
용리된 rRNA 또는 스톡 rRNA와 DNA 프로브의 반응은 31%의 혼성체 형성을 하였다.
본 발명에 의한 폴리누클레오티드의 정제가 더이상의 혼성체 형성 및 여타의 연구를 위한 그것을 손상시키지 않음을 본 결과로서 알 수 있다.
[실시예 4]
소변내의 rRNA의 자기성 아민 소구체로의 결합
본 실험은 자기성 아민 소구체에 대한 rRNA 결합상에 소변의 효과를 결정하기 위하여 실시되었다.
실시예 3에 언급된 물질에 덧붙여 신선한 소변 견본을 지원자로부터 얻었다.
100μl의 신선한 소변에 1μl 스톡 [3H]-rRNA(1㎍) 및 5μl 자기성 아민 소구체뿐 아니라 50mM PB, 8M 요소 또는 HOAc, pH 4(빙초산에 HOAc 1ml당 10N NaOH 0.28ml를 첨가하여 pH 4로 조절하였다) 200μl를 첨가하였다.
실시예 1에 언급된 바와같이 혼합물을 조작하되 각각을 50mM PB 200μl로 세척하였다.
소변의 존재하에서는, 핵산을 분리하고 단백질을 변성시키기 위하여 생물학적 견본 및 핵산분해 효소와 함께 사용되는 요소가 [3H]-rRNA의 결합을 0.8%로 감소시킴을 알 수 있었다.
소변과 인산완충액만 있으면 단지 13%의 [3H]-rRNA만 지지체에 결합하였다.
단지 HOAc, pH 4와 결합된 경우에는 100%의 rRNA가 자기성 아민 소구체에 결합하였다.
[실시예 5]
타액내에 현탁된 rRNA의 자기성 아민 소구체에로의 결합
본 연구는 보다 복잡한 생물학적 견본내의 [3H]-rRNA에 결합하는데 필요한 완충제 및 시약의 적절한 결합과 농도를 결정하기 위하여 실시되었다.
실시예 4에서 언급한 물질을 공동출자된 냉동된 타액(각각은 몇사람의 환자의 타액을 포함)과 함께 여러 병원으로부터 얻었다.
타액견본에 1/10부피의 0.5M 디티오트레이톨(DTT)를 첨가하여 액화하고(사용직전에) 와류시킨 후 22℃에서 10-15분간 인큐베이트하였다.
여러시약을 액화도니 타액 100μl에 첨가하고 1μl의 스톡 [3H]-rRNA(1㎍)과 5μl의 자기성 아민 소구체를 첨가하였다.
22℃에서 5분간 인큐베이트한 다음 견본을 실시예1의 과정에 따라(각각을 200μl의 50mM PB로 세척하는 것은 예외로 한다)실시하여 [3H]-rRNA 결합정도를 결정하였다.
결과는 표3에 요약하였다.
[표 3]
Figure kpo00003
* 1 : 즉, 부분적으로 중화된 HOAc
* 2 : HOAc/요소, pH 5는 840μl pH 4 HOAc(실시예 4 참조)를 320mg 요소와 결합하여 만들었다(최종부피=1ml, [요소]=5.33M, 부분적으로 중화된 HOAc 66%).
[실시예 6]
타액으로부터 정제된 rRNA의 혼성체 형성
본 실험에서는 타액에서 빼내었고 지지체에 결합된 [3H]-rRNA를 용리하고 연구하여 본 발명에서 사용된 분리방법이 혼성체 형성능을 과도하게 감소시키는지의 여부를 결정하였다.
서열“5'-GGCCGTTACCCCACCTACTAGCTAAT-3'”(대장균 리보솜 16S의 염기 235-260에 상보되는)(프로브 서열에 대하여 특허 출원중)을 지닌 데옥시 누클레오티드 프로브를 합성하고 실시예2에서와 같이 [32P]로 표지화 하였다.
타액내의 [3H]-rRNA를 자기성 아민 소구체에 결합시키고 비결합부분(실시예 5 참조)을 제거한 다음 자기성 아민 소구체를 1M NaCl, 50mM PB로 1회 세척하였다.
상청액을 버리고 0.6M PB 50μl를 첨가한 다음 혼합액을 22℃에서 30분간 또는 72℃에서 15분간 가끔 저어주면서 인큐베이트하였다.
그 다음 자기성 아민 소구체를 자기적으로 펠렛화하고 용리된 [3H]-rRNA 퍼센트를 상청액부분의 방사능을 인큐베이션 전의 자기성 아민 소구체의 부분과 비교하여 결정하였다. (이하참조)
용리된 [3H]-rRNA가 상보적인 DNA-프로브에로 혼성화되는 능력은 용리된 rRNA의 혼성체 형성능을 표적과 프로브 둘다 과잉으로 존재하는 스톡 rRNA와 비교하여 결정한다.
다음 혼성체 형성 혼합물을 제조하였다 :
(1) 0.6M PB(.44pmol)내에 용리된 rRNA 30μl, 1μl의 DNA-프로브 (.07pmol), 4μl의 1% SDS 및 2.5μl의 물 총 37.5μl.
(2) 0.7μl 스톡 rRNA(.44pmol), 29.3μl의 0.6M PB, 1μl의 DNA-프로브 (.07pmol), 4μl의 1% SDS 및 1.6μl의 물, 총 36.6μl.
(3) 0.6M PB(.14pmol)내에 용리된 rRNA 9.35μl, 1μl의 DNA-프로브 (.7pmol) 및 1.34μl의 1% SDS 총 11.69μl.
(4) 0.22μl의 스톡 rRNA(.14pmol), 9.13μl의 0.6M PB, 1μl의 DNA-프로브(.7pmol) 및 1.06μl의 1% SDS 총 11.41μl.
그 다음 혼성체 형성 혼합물을 50℃에서 2시간 인큐베이트하고 실시예2에서 언급한 바와같이 HAP상의 혼성체를 분리하였다.
표적이 과잉인 경우 용리된 rRNA는 스톡 rRNA에 비교해서 67%의 혼성체 형성능을 보여주었다.
프로브가 과잉인 경우 용리된 rRNA는 스톡 rRNA와 비교해서 65%의 혼성체형성능을 보여주었다.
[실시예 7]
자기성 아민 소구체를 사용하여 완충용액에서 RNA/DNA 혼성체를 회수
본 실험은 용액에서 형성된 RNA/DNA 혼성체를 위한 분리 지지체로서 자기성 아민 소구체를 연구하기 위하여 고안되었다.
물질은 실시예3의 것과 동일하다.
덧붙여 레지오넬라(Legionella) 특정 DNA 프로브(평균길이 100 염기)를 사용하였다.
자기성 아민 소구체가 RNA/DNA 혼성체를 분리하는 능력을 두가지 시스템으로 연구하였다.
시스템 1:8μl스톡 [3H]-rRNA(pmol), 1μl 데옥시올리고누클레오티드 프로브(.5pmol), 10μl 0.28M PB 및 1μl 1% SDS를 혼합한 다음 50℃에서 1.5시간 인큐베이트하여 RNA/DNA 혼성체를 만들었다.
또한 대조혼합물을 표적 RNA 8μl를 물 8μl로 대체하는 것외에는 혼성체 혼합물과 똑같이 만들었다.
이러한 대조표준 혼합물 또한 50℃에서 1.5시간 인큐베이트하였다.
각각의 혼합물 1/2(10μl)을 0.14M PB내의 2% HAP 5ml에 첨가하고 실시예2와 같이 처리하였다.
각 혼합물의 나머지 반은 200μl의 0.14M PB+10μl 자기성 아민 소구체에 첨가하고 실시예1과 같이 처리하였다.(세척을 위해서는 0.14M PB 사용)
시스템 2:4μl 레지오넬라 rRNA(2.5fmol), 2μl의 레지오넬라 프로브( 1.3fmol) 및 DIBSS 44%, 30mM PB 및 SDS 3%를 함유하는 용액 196μl를 혼합하여 RNA/DNA 혼성체 혼합물을 만들었다.
대조표준 혼합물을 혼성체 혼합물과 동일하게 만들되 표적 RNA 4μl 대신 물 4μl를 사용하였다.
두가지 혼합물을 72℃에서 2시간 동안 인큐베이트하였다.
각 혼합물의 50μl 부분을 0.14M PB 내의 2% HAP 5ml에 첨가하고 실시예2에서처럼 처리하되 72℃에서 하고 2회 세척하였다.
각 혼합물의 또다른 50μl를 분리된 혼합물에 첨가하여 최종상태의 총부피가 150μl이고 18% DIBSS, 5% 트리톤 X-100, 0.1M PB 및 10μl 자기성 아민 소구체를 함유하도록 하였다.
자기성 아민 소구체를 실시예1에서와 같이 처리하되 72℃에서 하고 2회 세척하였다.(세척1은 18% DIBSS, 5% 트리톤 및 0.1M PB로 ; 세척 2는 5% 트리톤, 0.1M PB로 한다) 결과는 표4에 있다.
[표 4]
Figure kpo00004
이 결과로 자기성 아민 소구체가 완충용액으로부터 RNA/DNA 혼성체를 회수할 수 있는 반면 용액내에 혼성되지 않은 프로브는 남겨둠을 알 수 있다.
[실시예 8]
자기성 아민 소구체를 사용하여 용액으로부터 DNA/DNA 혼성체의 회수
본 실험은 용액내에 형성된 DNA/DNA 혼성체를 위한 분리 지지체로서의 자기성 소구체를 연구하기 위하여 실시하였다.
실시예2에서 언급한 물질에 첨가하여 실시예2에서 언급한 cDNA의 36-염기지역에 상보적인 합성의 36-염기 데옥시올리고누클레오티드 프로브를 사용하였다.
올리고누클레오티드는 실시예3에서와 같이 [32P]로 표지화되었다.
20μl cDNA 표적(약 20fmol), 1μl DNA 프로브(약 60fmol), 및 44% DIBSS, 30mM PB 및 3% SDS 함유 물 200μl를 혼합하여 DNA/DNA 혼성체 혼합물을 만들었다.
대조표준 혼합물을 혼성체 혼합물과 동일하게 만들되 20μl의 표적을 20μl의 물로 대체하였다.
두가지 혼합물을 60℃에서 2시간 인큐베이트하였다.
각 혼합물의 50μl 분량을 0.08M PB 내의 2% HAP 450μl 또는 45mM PB내의 5% 트리톤 및 10μl의 자기성 아민 소구체가 첨가된 것, 450μl에 첨가하였다.
각각의 분리된 혼합물을 실온에서 5분간 인큐베이트하고 HAP 또는 소구체를 전술한 예와같이 펠렛화 한 다음 상청액을 제거하였다.
펠렛을 실온에서 0.08M PB(HAP) 또는 5% 트리톤, 45mM PB(소구체) 500μl로 전술한 예와같이 1회 세척하였다.
모든 부분은 15ml 시토신트에 녹이고 전술한대로 방사능을 카운트하였다.
표5의 결과를 실시예7의 시스템2의 결과와 비교하면 혼성체의 결합이 전하의 영향을 받으며 표적이 RNA 또는 DNA 인지에는 영향받지 않음을 알 수 있다.
[표 5]
Figure kpo00005
[실시예 9]
자기성 아민 소구체에 결합된 핵산 혼성체와 연관된 표지화된 누클레오티드 프로브의 제거용 용리 완충액의 연구
자기성 아민 소구체에 결합된 DNA/RNA 혼성체와 관련된 표지화된 누클레오티드 프로브의 제거용인 다양한 가능성 있는 용리 완충액을 다음 방법에 의하여 증명하였다.
방법 1 : [125I]-표지화된 데옥시올리고누클레오티드 프로브(표준적 방법으로 제조된)를 0.5M PB, pH5(60℃에서 30분, 총부피 30μl)에서 표적 RNA에 혼성화하였다.
그 다음 0.25M PB, pH 5 1ml, 0.05% 트리톤 X-100 및 2.5mg의 자기성 아민 소구체를 첨가, 와류하고 60℃에서 5분간 인큐베이트하였다.
소구체를 0.25M PB, pH 5, 0.05% 트리톤 X-100으로 2회 씻었다.
자기성 아민 소구체 100μl분량(5%)을 첨가하고 60℃에서 5분간 인큐베이트하고, 소구체로부터 상청액을 분리하여 각 부분에 존재하는 [125I]양을 감마 카운터 (Iso-Data, Palatine, IL, USA, 모델20/20DM)로 측정하여 가능성 있는 용리시약을 시험하였다.
결과는 표6에 요약되어 있다.
[표 6]
Figure kpo00006
넓은 범위의 시약들이 소구체에 결합된 RNA/DNA 혼성체로부터 표지화된 누클레오티드 프로브를 제거할 수 있음을 상기 결과로 알 수 있다.
방법 2 : 다른 용리시약이 자기성 아민 소구체에 결합된 DNA/RNA 혼성체와 관련된 표지화된 누클레오티드 프로브를 제거할 수 있음을 증명하기 위하여 다음과 같은 원안으로 이러한 가능성 있는 용리시약을 시험하였다.
0.48M PB(pH 5)/0.1% SDS(총부피 150μl)중에서, 60℃에서 30분간 [32P] 표지화된 데옥시올리고누클레오티드 프로브(전술한 바와같이 제조, 상기 참조)를 표적 rRNA로 혼성화하였다.
그 다음 1ml의 0.15M PB(pH 6.8)/5.0% 트리톤 X-100 및 2.5mg의 아민 자기성 소구체를 첨가하고 와류 및 60℃에서 5분간 인큐베이트하였다.
소구체를 0.3M PB(pH 6.8)로 3회 세척하였다.
그다음 용리용액 300μl를 아민 자기성 소구체에 첨가하고 60℃에서 5분간 인큐베이션, 소구체로부터 상청액분리 및 신틸레이션 카운터(Delta 300 Scintillation System, Searle Analytical,Inc., Des Plaines, IL, USA)를 사용하여 각부분에 존재하는 [32P]의 양을 측정하는 것에 의하여 용리시약을 시험하였다.
결과는 표7에 요약되어 있다.
[표 7]
Figure kpo00007
폴리포스페이트가 자기성 아민 소구체로부터 핵산을 효과적으로 용리시킬 수 있음을 이 결과로부터 알 수 있다.
[실시예 10]
고체상 혼성체형성 지지체로서 자기성 아민 소구체의 사용
본 실험에서는 표적 rRNA를 자기성 아민 소구체에 결합시킨 다음 혼성화하였다.
자기성 아민 소구체 5μl에 0.14M PB 100μl와 스톡 [3H]-rRNA 2μl(2㎍, 1.26pmol)를 첨가하였다.
물질들은 실시예3의 것과 같다.
혼합물을 22℃에서 10분간 인큐베이트하고 자기성 아민 소구체를 자기적으로 펠렛화하고 상청액을 제거하였다.
자기성 아민 소구체에 0.14M PB 20μl와 프로브 0.5μl(.23pmol)을 첨가하였다.
대조표준으로서 스톡[3H]-rRNA 2μl, 프로브 0.5μl, 0.28M PB 5μl, 1% SDS 0.5μl 및 H2O 2μl의 용액에서 혼성체를 형성하였다.
양 혼성체 형성 혼합물을 40℃에서 3시간 인큐베이트하였다.
자기성 아민 소구체를 0.14M PB 100μl로 실시예1과 같이 3회 세척하였다.
프로브의 혼성체 형성율이 고정화된 rRNA의 경우에는 5%이며 용액(대조표준)내의 혼성체 형성율인 20%와 비교됨을 결과로부터 알 수 있다.
[실시예 11]
세포 용해물로부터의 핵산정제를 위한 자기성 아민 소구체의 사용
본 실험은 언급된 자기성 아민 소구체가 혼성체 형성능의 현격한 감소없이 조샘플로부터 RNA를 정제하기 위하여 사용될 수 있음을 보여주기 위하여 실시하였다.
rRNA 정제방법은 레지오넬라 뉴모필리아의 rRNA를 사용하여 연구하였다.
물질들은 실시예5의 것과 동일하였다.
또한 레지오넬라 특정 프로브 및 레지오넬라 뉴모필리아 유기체를 수득하였다. 샌 디에고, CA, USA.
세포용해 및 rRNA의 해제는 30μl물, 5μl 레지오넬라 뉴모필리아 현탁액 (5×105유기체) 및 5μl 24% SDS, .08M 트리스-염기, .08M EGTA 및 .08M, EDTA와 합하고, 72℃에서 30분간 인큐베이션하는 것으로 달성되었다.
샘플의 1/4(10μl)를 다음의 측정 혼합물을 사용하여 rRNA를 위하여 직접 측정하였다 : 10μl 샘플+114μl 5.9M PB+1μl DNA-프로브(가속되는 속도 시스템에 대하여 특허 출원중)+75μl 물. 혼합물을 72℃에서 30분간 인큐베이트하고 실시예2에 언급된대로 하되 HAP 결합단계를 50℃ 대신 72℃에서 하여 HAP 사용하는 혼성체형성에 대한 분석을 하였다.
샘플 10μl에는 30μl HOAc/요소(실시예5참조)를 첨가하고 혼합물을 5초간 와류시키고 자기성 아민 소구체 5μl를 첨가하고 혼합물을 가볍게 와류시켰다(약 3초).
22℃에서 5분간 인큐베이트한 다음 1M NaCl, 50mM PB 150μl로 22℃에서 세척하고 결합된 rRNA를 0.6M PB(실시예2에 상세히 언급됨) 50μl로 용리하였다. 50μl 견본, 109μl 5.94M PB, 1μl DNA-프로브 및 40μl 물을 혼합하고 혼합물을 72℃에서 30분간 인큐베이트한 다음 HAP(실시예 2 참조)를 사용하여 혼성체 형성을 분석하여 rRNA에 대하여 용리액을 측정하였다.
결과는 표8에 요약되어 있다.
[표 8]
Figure kpo00008
[실시예 12]
자기성 아민 소구체로 타액으로부터 핵산의 정제
본 실험에서는, 타액으로부터 레지오넬라 뉴모필리아 rRNA의 정제 및 상기 rRNA의 혼성체형성을 위한 자기성 아민 소구체의 사용을 제시하였다.
물질들은 실시예7의 것과 동일하였다.
모아진 타액 견본을 실시예5에서와 같이 액화하였다.
이러한 타액견본의 30μl 분량 또는 물 30μl 분량에 레니오넬라 뉴모필라 현탁액 5μl(5μl당 2×66, 2×105또는 2×104세포)를 첨가하였다.
실시예 11과 동일방법으로 세포를 용해하고 각 샘플의 1/2을 직접 혼성화하고(여기서는 20μl 샘플과 65μl 물사용) 1/2은 자기성 아민 소구체를 사용한 rRNA 정제(여기서는 20μl 샘플과 60μl HOAc/요소 사용)후 혼성화하였다.
혼성체 형성은 HAP로 분석하였다(실시예 2 참조).
결과는 표9에 있다.
[표 9]
Figure kpo00009
[실시예 13]
자기성 아민 소구체상의 혼성체의 분리로 레지오넬라 뉴모필리아로부터 rRNA의 가속화된 용액 혼성체형성(가속화된 속도 시스템에 대하여 특허 출원중).
본 실험에서는 타액내의 레지오넬라 뉴모필리아 rRNA의 검색을 위한 자기성 아민 소구체의 사용을 가속화된 용액 혼성체형성으로 증명하였다.
물질들은 실시예 11의 것과 동일하되 각각의 타액을 모아진 타액대신 사용하였다.
또한 5ml 스크류-캡트 튜브는 Vanguard(스웨덴)으로부터 ; 글래스 비드(0.2 -0.3mm)는 Glen Mills, Inc.(Maywood, NJ, 미국)으로부터 ; 초음파 클리너는 Branson Equipment Co.(Shelton, CT, 미국)(Model 1200)으로부터 ; 코닝 자기적 분리기 랙크는 Advanced Magnetics Inc.(카탈로그 #M4700)으로부터 구매하였다.
각각의 타액을 실시예 5의 모아진 타액에서와 같이 액화하였다.
액화된 타액에 0.1ml당 104유기체를 함유하도록 레지오넬라 뉴모필라를 시드하였다(실시예 10 참조).
100μl 글래스 비드(산 세척된), 100μl 용해 완충액(20% SDS, 10mM EDTA, 10mM EGTA, 50mM Tris, pH 8.0) 및 0.1ml 시드된 타액 또는 0.1ml 음성 대조표준(0.1% SDS내의 송아지 흉선 DNA 1mg/ml)을 5ml 튜브에 넣었다.
이것을 3벌 만들었다.
72℃에서 15분간 샘플에 음파 충돌시키고 2ml 프로브용액(44%, DIBSS, 50mM PB, pH 6.8, 2ml당 10,000 cpm 레지오넬라 특정 DNA 프로브)을 첨가하고 혼합액을 와류시킨 다음 72℃에서 1시간 인큐베이트하였다.
그다음 혼성체를 다음 과정중 한가지로 분리하였다(모두 3회씩) :
1. HAP, 원심분리-분리용액(0.26M PB내의 5%, HAP, pH 6.8, .02% SDS) 2ml를 각 튜브에 첨가하고, 튜브를 5회 반전한 다음 5분간 72℃에서 인큐베이트, 반전 20회, 2분간 2000Xg에서 원심분리하였다. 상청액을 조용히 따라 버리고 세척용액 (0.14M PB, pH 6.8, .02% SDS) 4.5ml을 첨가하고, 각 튜브를 20초간 와류시킨 다음 HAP를 펠렛화하여 상청액을 위와 같이 버린다. 각 튜브에 대한 방사능을 버트홀드 감마카운터(Berthold gammacounter)로 측정하였다.
2. 자기성 아민 소구체, 원심분리-자기성 분리용액(용액 2.75ml당 9.5% 트리톤, 0.15M PB, pH 6.8, 150μl 자기성 아민 소구체) 2.75ml를 각 튜브에 넣고 과정 1과 같이 처리하되 다음 사항은 예외로 한다 : 세척용액은 18% DIBSS, 5% 트리톤, 0.1M PB ; 세척용액 첨가후 튜브를 반전시켜서 자기성 아민 소구체를 재혼합한다.
3. 자기성 아민 소구체, 자기적 분리-이 과정은 과정2와 동일하되 원심분리를 코닝 자기적 분리기 랙크를 사용하는 자기성 분리로 대체한다.
결과는 표 10에 있다.
[표 10]
Figure kpo00010
방법 1=HAP, 원심분리
방법 2=자기성 아민 소구체, 원심분리
방법 3=자기성 아민 소구체, 자기적 분리
대조표준값은 평균 4개의 분리된 결정을 나타내며 각각은 3회 실시하였다.
혼성체 값은 평균 30개의 분리된 결정(30개의 각각의 타액)을 나타낸다.
각각을 3회 실시하였다.
[실시예 14]
rRNA를 분리하기 위한 자기성 프로필아민 소구체의 사용
본 발명의 방법이 지지체 표면으로서 단일 형태의 자기성 양이온 소구체의 특성을 제한되는 것이 아니고, 다른 양이온도 포함함을 보여주기 위하여, 규정된 완충액으로부터 [3H]-rRNA를 자기성 프로필아민 소구체로 제거하였다.
물질들은 실시예1에서 규정한 것과 같되 소구체는 N-3-아미노프로필실란 자기성 소구체(Advanced Magnetics, Inc., 특수주문)였다.
[3H]-rRNA를 제거하기 위하여 여기서 사용한 방법은 실시예1의 것과 동일하되 자기성 아민 소구체 대신 자기성 프로필아민 소구체를 사용하였다.
140mM PB내에서 93%의 rRNA가 소구체에 결합하였다.
100mM PB+1M NaCl 용액에서는 83%가 결합하였다.
[실시예 15]
rRNA 분리를 위한 자기성 사차암모늄 소구체의 사용
자기성 사차암모늄 소구체를 합성하여 다른 다가 양이온 지지체로 본 발명의 방법을 더욱 연구하였다.
자기성 아민 소구체(BioMag M41000)는 Advanced Magnetics, Inc.에서 구매하였다.
요오드화 메탄은 Aldrich Chemical Co.,(Milwaukee, WI, USA)에서 2,6-루티딘은 Sigma Chemical Co.(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였고 다른 물질들은 시약 품질이었다.
자기성 아민 소구체(250mg, 5.0ml)를 10ml의 물에 희석시켰다.
소구체를 자기적으로 분리하고 50%(v/v)에탄올/물 20ml에 현탁시켜 세척하고 자기적 분리하였다.
이 세척과정을 절대 에탄올 20ml로 2회 반복하였다.
세척된 소구체를 20ml 절대 에탄올에 다시 현탁시켰다.
요오드화메탄(250μl, 4mmol)과 2,6-루티딘(24.5μl,210μmol)을 교반하 첨가하고 실온에서 일야간 계속 교반하였다.
소구체를 자기적으로 제거하고 20ml의 물로 상술한 바와같이 4회 세척하고 다시 5ml 물에 현탁시켜 4℃에 보관하였다.
자기성 사차 아민 소구체를 사용하여 규정된 완충액으로부터 [3H]-rRNA 및 [32P]데옥시올리고누클레오티드를 제거하여 용액내의 DNA 올리고누클레오티드로부터 RNA 폴리누클레오티드를 구별하는 지지체의 능력을 연구하였다.
데옥시올리고누클레오티드는 실시예8에서 언급된 36mer이었다.
모든 다른 물질은 실시예1의 것과 동일하였다.
실시예1의 과정에 따라 결합을 결정하였으며 결과는 표 11에 있다.
[표 11]
Figure kpo00011
[실시예 16]
rRNA 분리를 위하여 자기성 폴리-D-리신 기능화된 소구체의 사용
실시예 14와 15에 언급된 양이온성 유도체에 덧붙여 자기성 소구체를 폴리-D-리신으로 유도체화 하였다.
물질 : 카르복실 말단 자기성 소구체는 Advanced Magnetics, Inc. (Biomag M4125, 그램당 카르복실기를 약 250uequiv 함유)에서 구입하였다.
평균 중합도가 68 단량체단위인 폴리-D-리신은 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.
N,N'-디시클로헥실 카로보디이미드(DCC)는 Pierce Chemical Co. (Rockford, IL. USA)에서, N-히드록시숙신이미드(NHS)는 Eastman-Kodak Co. (Rochester, NY, USA)로부터 구입하였다.
카르복시 말단 자기성 소구체 20mg/ml 현탁액 10밀리미터를 유리테프론 라인드 스크류 캡 테스트 튜브로 옮겼다.
소구체를 자기적으로 분리하고 0.1N NaOH(10ml), 0.1M EDTA(10ml,pH 7), 물(2×10ml), 50% 디옥산/물(10ml) 및 건조 디옥산(3×10ml)로 차례대로 세척하였다.
그다음 소구체를 NHS(250mg)를 함유한 건조 디옥산(10ml)에 재현탁시켰다. 그다음 DCC를 첨가하고(400mg) ; 튜브를 호일로 감싸서 빛을 차단하고 ; 현탁액을 15시간 동안 회전시켜 혼합하였다.
자기적 분리후 NHS-변형된 소구체를 디옥산(3×10ml), 메탄올(3×10ml) 및 건조디옥산(3×10ml)으로 순서대로 세척하고 건조디옥산(10ml)에 재현탁하였다.
NHS-변형된 소구체의 결과된 현탁액 1ml를 자기적으로 분리하고 묽은 HCl 수용액(pH 4.3)으로 씻고 폴리-D-리신(7mg)을 함유하는 0.2M NaHCO3/0.4M NaCl/0.05% NaN3용액 0.5ml에 재현탁하였다.
2시간 후 1M 에탄올아민 HCl 용액일부(pH 8.4 100μl)를 첨가하여 반응하지 않은 NHS 에스테르기를 포획하였다.
소구체를 자기적 분리하고 물(2×1ml)로 세척한 다음 물(0.5ml)에 재현탁시켰다.
폴리-D-리신 기능화된 자기성 소구체는 rRNA와 합성 올리고누클레오티드 (26mer)간의 현저한 결합을 다음과 같이 보여주었다 : 대장균으로부터의 [3H]-표지화된 rRNA와 [32P]-말단 표지화된 합성올리고누클레오티드를 만들었다.
스크류캡 1.5ml 폴리프로필렌 튜브에 폴리-D-리신 기능화된 소구체(5μl)와 완충액(0.1M 인산나트륨, pH 6.8/0.75M NaCl, 0.5ml)을 첨가하고, [3H]-rRNA 용액 또는 [32P]-올리고누클레오티드용액을 첨가하였다. 결과된 현탁액을 10분간 와류시켜 혼합하였다.
상청액을 자기적 분리에 의해 제거하고 신틸레이션 유체(5ml,BetagelTMcocktail)을 함유하는 바이알로 옮겼다.
시틸레이션 카운팅에 의해 방사능을 정량측정하였다 :
소구체의 결합된 [32P]-올리고누클레오티드 : 0-3%
소구체에 결합된 [3H]-rRNA : 78-82%
[실시예 17]
화학발광(Chemiluminescent) 비동위원소적 측정에서의 자기성 아민 소구체의 사용
비방사성 측정시스템의 분리 지지체로서 사용되는 자기성 아민 소구체의 성능을 증명하기 위하여 화학발광 아크리디늄 에스테르로 표지화된 합성 데옥시올리고누클레오티드 프로브를 사용하여 형성된 혼성체의 분리를 연구하였다.
실시예1에 열거된 물질에 첨가하여 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis) rRNA 특정의 데옥시올리고누클레오티드 프로브(33-mer)를 합성하고 화학발광 아크리디늄 에스테르(AE)에 의해 명칭이“아크리디늄 에스테르 표지화 및 누클레오티드 프로브의 정제”이고 1987. 10. 2일에 아놀드등에 의하여 출원된 미국 특허출원번호 105,080에 언급된대로 표지화되었으며 클라미디아 트라코마티스 rRNA를 사용하였고 측정 튜브는 12×75mm 폴리스티렌 튜브였다.
모든 다른 성분은 시약 품질이었다. AE-표지화된 프로브를 다음 과정에 따라서 그것의 표적 RNA로(이 경우에는 클라미디아 트라코마티스) 혼성화하였다.
혼성체 형성 혼합물.
200μl 혼합체 형성 완충액(0.1M 숙신산리튬, pH 5.2, 10% 도데실 술폰산리튬, 2mM EDTA, 2mM EGTA) 1μl RNA(10-3㎍) 1μl AE-프로브(0.125pmol).
대조표준 혼합물은 혼성체형성 혼합물과 동일하되 그것은 RNA 대신 물을 함유하였다.
혼합물은 60℃에서 30분간 인큐베이트하고 0.4M PB, pH 6.0, 5%(v/v) 트리톤 X-100, 8%(wt/v)DIBSS 및 2.5mg 자기성 아민 소구체(BioMag M4100)을 함유하는 분리용액 2ml를 첨가하였다.
혼합물을 와류시키고 60℃에서 5분간 인큐베이트하였다.
그다음 자기성 아민 소구체를 자기적으로 튜브의 측면으로 끌어당기고 상청액을 버린 다음 자기성 아민 소구체를 0.4M PB, pH 6.0, 60℃(세척용 완충액 첨가, 와류, 자기적 분리, 조용히 따라 버림) 2ml로 3회 세척하였다. 그다음 0.2M PB, pH 6.0, 50% 포름아미드 함유한 용리 완충액 300μl 첨가, 와류, 60℃에서 5분간 인큐베이트하여 결합된 프로브를 용리하였다. 자기성 아민 소구체를 자기적으로 튜브측면으로 끌고, 용액을 새로운 측정 튜브로 이동시킨다.
화학 발광을 Berthold Chinilumat Model LB 9502(Wildbed, 서독)으로 측정하되 200μl의 0.25N HNO3, 0.1% H2O2를 자동 주입하고 1초 지체후 200μl의 1N NaOH 주입, 그리고 5초간 화학발광을 읽었다(결과는“상대적 광단위”또는 rlu로 주어진다).
결과 : 대조표준-160rlu
10-3㎍ rRNA-3929 rlu
이러한 결과로서, 자기성 아민 소구체가 비방사성 표지화를 사용하는 측정시스템에서 혼성화되지 않은 프로브로부터 혼성화된 것을 깨끗이 분리할 수 있음을 알 수 있었다.
여기서 우리는 매우 낮은 배그라운드(주입 rlu 0.01% 미만)를 보았으며 비록 표적 RNA의 농도가 매우 낮아도(10-3㎍) 매우 현저한 시그날을 보았다.
[실시예 18]
임상적 견본을 지닌 화학발광 비동위원소적 측정에서의 자기성 아민 소구체의 사용
임상적 견본이 존재하는 비동위원소적 측정계에서 자기성 아민 소구체가 분리 지지체로서 사용될 수 있는 능력을 증명하기 위하여, 실시예 17에서 언급한 AE-프로브를 사용하여 임상적 매질내의 표적 rRNA의 희석 시리즈를 검색하였다.
실시예 17에 나열된 물질에 첨가하여, 인후 분비물을 자발자로부터 얻었으며 3% 도데실황산리듐, 30mM PB(pH 6.8), 1mM EDTA 및 EGTA에 배치하였다(이하 간단히“인후분비물”이라 칭함).
AE 프로브를 다음 방법에 따라 인후분비물내에서 혼성화하여 그것의 표적 rRNA(이 경우 클라미디아 트라코마티스)의 양을 감소시켰다 :
인후 분비물 50μl
4.8M PB(pH 4.7) 6μl
AE-프로브(1pmole) 2μl
RNA(3×10-3, 3×10-2, 3×10-1㎍) 2μl
대조표준 혼합물은 혼성체 형성 혼합물과 동일하되 그것은 RNA 대신 물을 함유하였다.
혼합물은 60℃에서 60분간 인큐베이트하였고 각각의 1/3을 실시예 17과 같이 분리, 세척, 용리하였다.
결과 : 대조표준, 4,049 rlu
10-3㎍ rRNA 9,500 rlu
10-2㎍ rRNA 61,000 rlu
10-2㎍ rRNA 657,000 rlu
이 결과는, 자기성 아민 소구체가 비동위원소적 표지화를 사용하는 측정시스템에서 임상적 견본의 존재하에 혼성화되지 않은 프로브로부터 혼성화된 것을 깨끗이 분리할 수 있음을 증명한다.
여기에서의 대조표준은 본 샘플에 사용한 프로브의 양이 많으므로 적어도 일부분에서는 실시예 17의 그것보다 더 높다.
[실시예 19]
첨부적인 다가 양이온성 지지체의 합성
다음의 지지체는 혼성체 분리에 있어서 양이온성 지지체의 이용을 증명하기 위하여 합성되었다.
(a) 스페르민 라텍스 소구체 : 스페르민은 그 양이온이 폴리누클레오티드 음이온에 대응하게 놓여진 폴리아민이므로 본 실시예에서 채택되었다.
라텍스 아민 소구체(2.5% 고체, 1μ 평균직경, 0.125mequiv./g)는 Polys-ciences, Inc.(Warringyton, PA, USA)로부터 구매하였다.
1,4-부탄디올, 디글리시딜에테르 및 스페르민은 Aldrich Chemical Co. (Milw-aukee, WI, USA)로부터 구매하였다.
Millititer 96 여과 유니트와 0.22μ 듀라포르 R(Durapore R)여과기는 Millipore Filter Corporation(Bedford, MA, USA)로부터 증정받았다.
모든 다른 물질은 시약품질이었다.
소구체는 우선 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르로 활성화시켰다 : 라텍스 아민 소구체 25㎍(1ml)을 0.22μ 듀라포르 R 여과기로 여과하였다. 그다음 소구체를 2㎍/ml NaBH4함유한 0.6N NaOH 150μl에 재현탁시키고 슬러리를 유리 시험관에 이동시키고 흔들면서 1,4-부탄디올 글리시딜 에테르(150μl)를 서서히 첨가하였다.
혼합물을 1시간 동안 매 10분마다 짧게 와류시키고 물 1ml를 첨가하였다.
소구체를 상술한 바와같이 여과하고 물(2ml)로 세척하였다.
그다음 활성화된 소구체를 스페르민과 반응시켰다.
상기 반응으로부터 에폭사이드 변화된 소구체를 Na2CO30.1M, pH=11.6인 용액 1ml에 현탁시키고 스페르민 75μl(50℃로 가열된)를 혼합하에 첨가하였다.
실온에서 12시간 반응시킨 후 소구체를 여과하고 물(2ml)로 세척한 다음 물(800μl)내에 재현탁시켰다.
(b) 트리스(2-아미노에틸)아민 라텍스 소구체(“트리스-라텍스”)의 합성 :
트리스(2-아미노에틸)아민은 Aldrich Chemical Co.(Milwaukee, WI, USA)로부터 구입하였다.
이 화합물의 양이온들이 폴리누클레오티드 음이온들과 대강 동일 간격으로 떨어져 있으므로 채택하였다.
본 실시예의 (a)에 언급된 방법에 따라서 트리스-(2-아미노에틸) 아민(50μl )을 활성화된 소구체에 첨가하였다.
(c) 트리스(2-아미노에틸)아민 세파로스 4B(“트리스-세파로스”)의 합성 :
트레실-활성화된 세파로스 4B는 Pharmacia Fine Chemical AB(Uppsala, Sweden)에서 구매하였다.
냉동건조된 트레실-활성화된 세파로스 4B(1g)를 0.22μ 듀라포르 R (Millipore Corp., Bedford, MA, USA) 여과기상에서 1mM HCl(200ml)로 45분에 걸쳐서 세척하였다.
0.1M NaHCO3(pH 8)/0.5M NaCl 5ml와 트리스(2-아미노에틸) 아민 200μl를 함유하는 15ml 폴리프로필렌 스크류-캡 튜브로 겔을 옮겼다.
실온에서 2시간 동안 천천히 교반하여 반응시켰다.
여과하여 겔을 회수하고 0.1M NaHCO3(pH 8)/0.5M NaCl 10ml로 씻고, 0.1M Tris(pH 8) 50ml로 씻었다.
그다음 유도체화된 겔을 15ml 스크류-캡 튜브로 옮기고 0.1M 트리스(pH 8) 10ml로 4시간에 걸쳐 회전시키면서 세척하였다.
겔을 여과하여 0.1M 아세트산 나트륨(pH 4)/0.5M NaCl 10ml로, 그다음 0.1M 트리스(pH 8)/0.5M NaCl 10ml로 세척하였다.
이러한 세척사이클을 2회 반복하였다. 그다음 겔을 0.1M 트리스(pH 8)/0.5M NaCl 0.02% 아지드화 나트륨 5ml에 현탁시켜서 4℃에서 보관하였다.
(d) 트리스(2-아미노에틸) 아민 아크릴성 소구체(“트리스-아크릴성 소구체”)의 합성 :
물질 : 토실-활성화된 아크릴성 소구체는 Kirkegaard & Perry Labs, Inc. (Gaithersburg, MD, USA)로부터 구입(평균입자크기 3μ).
활성화된 소구체(10% 현탁액) 1ml를 스크류-캡 1.5ml 폴리프로필렌 튜브로 옮겼다.
Tomy-Seiko 소형 원심분리기(모델 MR-15A, Tokyo, Japan)로 5분간 10,000rpm에서 원심분리하여 소구체를 분리하였다.
상청액을 제거하였다.
그다음 0.1M NaHCO3(0.9ml), 트리스-(2-아미노에틸) 아민(0.1ml)을 첨가하였다.
와류시켜서 소구체를 재현탁시켰다.
튜브의 내용물을 16시간 회전시켜 혼합하였다.
아민-변형된 소구체를 원심분리로 빼내고 물로 세척한 다음(5×1ml), 0.02% NaN3함유 20mM 인산나트륨 완충액 염수(1ml)에 재현탁시켰다.
(e) 트리스-(2-아미노에틸) 아민과 폴리-D-리신에 의한 친수성 폴리우레탄 기본막의 기능화(“트리스-폴리우레탄막”및“폴리-D-리신 폴리우레탄 막”) :
HPI 친화막(친수성 폴리우레탄 기본)은 Amicon Corp.(Danvers, MA, USA)부터 얻었다.
이 막의 대강의 기공 크기 및 두께는 각각 1.2미크론과 12/1000인치였다.
2-플루오로-1-메틸피리디늄 포스페이트(FMP)는 Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, WI, USA)로부터, 폴리-D-리신(분자당 평균 단량체수 68)은 Sigma Chemical Co.(St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다.
막상의 유용한 수산화기는 T.T. Ngo(Biotechnolohy, 4, 134(1986)에 의해 발표된 방법의 수정방법에 의해 FMP로 활성화되었다.
1×1cm 막을 15ml용인 바닥이 평평한 스크류캡 바이알에 옮겨 담고 건조 아세토니트릴(5ml)로 2회 세척하였다.
사각막을 재증류한 트리에틸아민(80μl)을 함유하는 건조 아세토니트릴(4ml)에 현탁시키고 흔들면서 트리에틸아민(100μl)을 함유하는 건조 아세토니트릴(10ml)내의 FMP(200mg)의 용액을 적가하였다.
바이알의 내용물을 회전 플랫폼상에서 한시간 동안 흔들고나서 용액을 제거하고 막 조각을 아세토니트릴(2×5ml), 아세톤(5ml), 50 : 50 아세톤/5mM HCL 수용액(5ml) 및 5mM HCL 수용액(5ml)으로 차례대로 세척하였다.
FMP 활성화된 사각형 막을 두개의 유리 바이알로 분배하고 트리스-(2-아미노에틸) 아민(100μl) 또는 폴리-D-리신(50mg)을 함유하는 0.5M NaHCO35ml로 처리하였다.
각 바이알의 내용물을 회전 플랫폼상에서 15시간 혼합하였다.
마지막으로 아민-유도된 막 조각을 1M NaCl(3×5ml), 0.1M 인산나트륨 완충제(pH 7)(3×5ml)와 물(3×5ml)로 차례대로 세척한 다음, 3MM 페이퍼시트 (Whatman Ltd, Maidstone, England)상에서 블롯트 건조하고 실온에서 건조상태로 보관하였다.
[실시예 20]
스페르민 라텍스 소구체와 핵산의 분리
스페르민 라텍스 소구체를 실시예 19에 언급된대로 제조하였다.
스톡 [3H] rRNA는 전술한대로 대장균에서 얻고 [γ-32P] ATP는 New England Nuclear Research Products, Inc.(Boston, MA, USA)에서 얻었고 : T4 폴리누클레오티드 키나제는 Bethesda Research Labs, Inc.(Gaithersburg, MD, USA)로부터 얻었다.
베타겔 TM(Betagel TM, liquid scintillation Cocktail)은 WestChem (Sandiego, CA)로부터 얻었다.
프로브합성 및 표지화 : 서열“5'-GGCCGTTACCCCACCTACTAGCTAAT -3'”을 지닌 데옥시누클레오티드는 Applied Biosystems, Inc. Model 380A DNA 합성기(Foster City, CA. USA)를 사용하여 표준 포스포르아미데이트 화학을 사용하여 합성하였다(프로브서열은 특허출원중)(이 서열은 대장균의 리보솜의 23S 하위단위의 염기 235-260에 상보적이다).
이러한 올리고머는 [γ-32P] ATP와 T4-폴리누클레오티드 키나제를 사용하여 막삼과 길버트의 방법(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 74, 560(1977))에 따라서 5'-말단상에 표지화되었다.
[3H]-rRNA와 [32P]-DNA 고정화 : 시험완충액 0.5ml, 스페르민 라텍스 소구체 20μl, [3H]-rRNA(14,000 CPM) 또는 [32P] DNA 올리고머(15,000 CPM) 0.5μl를 혼합하고 50℃에서 5분간 인큐베이트하였다.
13,000 RPM에서 2분간 Tomy Seiko Model MR-15A 소형 원심분리기(일본, 도꾜)로 원심분리하여 펠렛화 하였다.
상청액을 제거하고 20ml용 폴리프로필렌 튜브내의 베타겔TM15ml에 첨가하였다.
각 샘플내의 [3H] 또는 [32P] 양은 뉴클리어시기고 신틸레이션 카운터(Nuclear Chicago Scintillation Counter)를 사용하여 결정하였다.
결과는 표 12에 있다.
200mM 내지 400mM PB 농도에서 스페르민 라텍스 소구체는 최대로 표적 폴리누클레오티드를 빼내고 프로브 올리고폴리누클레오티드에는 최소로 결합되었다.
바람직한 선택은 더 높은 완충제 농도에서도 계속되었다.
[표 12]
Figure kpo00012
[실시예 21]
핵산과 트리스-라텍스 소구체의 분리
트리스 라텍스 소구체는 실시예 19에 언급된대로 제조하였다.
다른 물질은 실시예 20에서 언급되었다.
스페르민 라텍스 소구체 대신 트리스-라텍스 소구체를 사용하여 언급한대로 조작하였다.
결과는 표 13에 있다.
스페르민 라텍스에서와 같이, 트리스-라텍스 소구체는 200mM 내지 400mM PB에서 올리고누클레오티드 프로브에서 폴리누클레오티드 표적을 최적으로 분리하는 것으로 보였다.
[표 13]
Figure kpo00013
[실시예 22]
핵산과 트리스-세파로스의 분리
트리스-세파로스는 실시예 19에서와 같이 제조되었다.
다른 물질은 실시예 20에 언급된 바와같다.
0.3M PB 0.5ml와 [3H]-rRNA 또는 [32P]DNA-올리고머 0.5ml에 트리스-세파로스(100μl)를 첨가하였다.
그것을 60℃에서 15분간 빈번히 흔들면서 인큐베이트하여 겔을 현탁시켰다.
13,000 RPM으로 30초간 원심분리하여 겔을 펠렛화하고 상청액을 제거한 다음 베타겔TM15ml를 함유한 20ml용 폴리프로필렌바이알로 이전하였다.
겔을 0.3M PB 0.5ml로 2회 세척하였다 ; 상술한 바와 같이 세척액은 원심분리로 분리하고 베타겔TM을 함유하는 폴리프로필렌바이알로 이전하였다.
마지막으로 겔을 0.3M PB 0.5ml에 현탁시키고 베타겔TM15ml 함유 폴리프로필렌바이알로 이전시켰다.
각 샘플내의 [3H] 또는 [32P]의 양은 전술한 바와 같은 신틸레이션 카운팅으로 결정하였다.
표 14내의 결과로 DNA 올리고누클레오티드상의 RNA 폴리누클레오티드의 바람직한 결합을 보여준다.
[표 14]
Figure kpo00014
[실시예 23]
핵산과 트리스-아크릴성 소구체의 분리
트리스-(2-아미노에틸)아민 유도된 아크릴성 소구체(실시예 19 참조)의 rRNA 대 합성올리고누클레오티드의 결합의 구별을 증명하였다.
대장균의 [3H]-rRNA와 [32P]말단 표지된 올리고누클레오티드(26mer)는 실시예 20에 언급되었다. 1.5ml 스크류캡 폴리프로필렌튜브에 트리스-(2-아미노에틸)아민 변형된 소구체 현탁액(7μl), 인산나트륨 완충액(pH 6.8, 200μl, 0.1 내지 0.4M 범위), [3H]-rRNA 용액 또는 [32P]-표지된 올리고누클레오티드(1μl) 용액을 첨가하였다. 현탁액을 50℃에서 10분간 가열한 다음 마이크로타이터 여과 매니폴드(0.22μl 기공크기, Millipore, Inc., Bedford, MA, USA)로 이전시켰다. 진공으로 하고 소구체를 필터상에서 동일완충액(200μl)으로 세척하였다.
진공해제하고 소구체를 20mM 인산나트륨 완충액 염수(200μl)에 재현탁시키고 신틸레이션 칵테일(10ml 베타겔TM)함유 바이알로 이동시켰다.
소구체에 붙어 있는 방사성을 신틸레이션 카운팅으로 정량화하였다.
결과는 표 15에 있다.
[표 15]
Figure kpo00015
[실시예 24]
핵산과 폴리-D-리신 폴리우레탄 막 및 트리스-폴리우레탄막의 분리 실시예 19에서 언급된 바와 같은 폴리-D-리신 변형된 막 조각으로 rRNA 대 합성올리고누클레오티드(19mer)에 대한 결합의 구별을 이미 언급한 바와 같이 보았다.
대장균의 [3H]-rRNA와 [32P]말단 표시된 올리고누클레오티드(19mer)를 사용하였다.
아민 변형된 막 조각을 슬로트 블롯팅 장치(J.M.Specialty Parts, San Diego, CA, USA)내의 3MM 용지(Whatman, Ltd., Maidstone, 영국)3장의 위에 놓았다.
[3H]-rRNA 또는 [32P]-표시된 올리고누클레오티드의 1μl 분량을 완충제 A(0.1M 인산나트륨(pH 6.8)/0.15M NaCl/0.02% SDS/0.1% 트리톤 X-100) 또는 완충제 B(0.1M 인산나트륨(pH 6.8)/0.45M NaCl/0.02% SDS/0.1% 트리톤 X-100) 200μl로 희석시켰다.
결과 용액을 적절한 웰의 슬로트 블롯터에 부하하고 아민 변형된 막 조각을 통하여 모세관 작용으로 통과시켰다.
그 다음 막조각을 슬로트 블롯터로부터 띄어내고 동일 완충액(완충제 A 또는 B2×2ml)으로 세척하고 신틸레이션 칵테일(베타겔TM) 5ml 함유 바이알로 옮겼다.
막 조각에 결합된 반사능을 신틸레이션 카운팅으로 정량화하였다.
결과는 표 16에 있다.
[표 16]
Figure kpo00016
[실시예 25]
비색측정에 있어서 비오틴화된 DNA-프로브와 함께 트리스-라텍스 소구체의 사용
비색 혼성체 형성 측정을 위한 본 발명의 방법의 용이성을 결정하기 위하여 트리스 라텍스 소구체를 비오틴 표지화된 DNA 프로브와 함께 미코플라스마 뉴모니아 (Mycoplasma pneumoniae) rRNA에 사용하였다.
(a) 미코플라스마 뉴모니아 rRNA의 지역에 상보적인 비오틴 표지화된 DNA 올리고머의 합성 :
물질 : 비오티닐-E-아미노카프로산 N-히드록시숙신이미드 에스테르(비오틴 -X-NHS)는 Calbiochem Behring Corp.(San Diego, CA, USA)에서 구매하였다.
5-알릴아민 UTP, 말단 데옥시누클레오티드 전달효소 및 5x 테일링 완충액은 Bethesda Research Laboratories(Gaithersburg, MD, USA)의 상품이다.
바이오-겔 P-60(100-100 메쉬)는 Bio-Rad Laboratories(Richmond, CA, USA)에서 ; 세파덱스 G-25(매질)은 Pharmacia Fine Chemicals(Piscataway, NJ)로부터 생산된다.
사용된 다른 물질은 실시예 19 및 20에서 언급하였다.
데옥시리보누클레오티드 프로브 36 누클레오티드는 길이에 있어서 미코플라스마 뉴모니아로부터의 rRNA의 16S 하위 단위에 존재하는 서열에 상보적이다.
이러한 올리고머는 실시예 20에 언급된 것처럼 [32P]로 5'-말단에 표시되었다.
알릴아민 UTP로 테일링(tailing)반응 : [32P]-올리고머의 9pmol을 알릴아민 UTP 0.1mM 및 1x 테일링 완충액 50μl내의 40 단위의 말단 데옥시누클레오티드 전달효소와 37℃에서 1시간 반응시켰다.
테일드(tailed)올리고머는 바이오-겔 P-60 컬럼(0.7×10cm)상에서 0.1M PB/2mM EDTA로 용출하여 정제하였다.
그다음 올리고머를 Sephadex G-25 컬럼을 통해서 0.2M 탄산트리에틸암모늄 (TEAB,pH 8)으로 용출하여 염제거하였다.
비오틴-X-NHS와의 반응 : 0.1M NaHCO3(pH 8.8)/0.02% SDS 150μl에 녹인 알릴아민 UTP 테일드 올리고머를 비오틴-X-NHS(DMSO내의 스톡 30mM) 10μl로 60분 간격으로 4시간 처리하였다.
비오틴화된 올리고머를 세파텍스 G-25 컬럼(0.7×10cm)상에서 0.1M PB/2mM EDTA/0.02% SDS로 용출하여 정제하였다.
(b) 비오틴화된 DNA 프로브-rRNA 혼성체의“트리스-라텍스”상의 고정 : 미코플라스마 뉴모니아로부터의 rRNA의 스톡용액(1ug/ul)을 사용하였다.
트리스-라텍스의 현탁액은 실시예 19에서와 같이 제조하였다.
다른 물질은 시약 품질이였다.
혼성체 형성 반응 혼합물은 다음과 같다.
혼성체 : 1μl rRNA(1㎍), 10μl 비오틴화된 DNA 프로브(0.1pmol), 0.4μl 1% SDS, 2.4μl 1M PB 및 6.2μl H2O, 총 20μl.
프로브 대조표준 : 10μl 비오틴화된 DNA 프로브(0.1pmol), 0.4μl 1% SDS, 2.4μl 1M PB 및 7.2μl H2O, 총 20μl.
혼성체 형성 혼합물을 60℃에서 1시간 인큐베이트하고 10μl의 트리스 -라텍스(수성현탁액)와 0.5ml의 0.4M PB/0.02% SDS/1.0% 트리톤 X-100을 첨가하였다.
내용물을 혼합하고 60℃에서 5분간 인큐베이트하였다.
트리스-라텍스 소구체를 13,000 RPM에서 2분간 원심분리하여 펠렛화 하였다.
소구체에 결합되어 남아있는 [32P]의 양은 세렌코프 방사물(Ceren-kov radiation)을 사용하는 신틸레이션 카운팅으로 결정하였다.
혼성체 실험에 있어서, 총 방사능의 61%가 트리스 라텍스에 결합된 반면 프로브 대조표준에는 단지 5%만이 결합되었다.
이것은 전실험에서의 56% 혼성체 형성을 반영한다.
(c) 비오틴화된 DNA 프로브-rRNA 혼성체는 트리스-라텍스상에서 비-동위원소적으로 검사된다.
아비딘-알칼리성 포스파타제 복합물의 제조를 위한 시약은 Vector Laboratories(Burlingame, LA. USA)에서 구입하였다.
소의 혈청 알부민(BSA), 니트로 청색 테트라졸륨염(NBT), 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 포스페이트(BCIP) 및 트윈-20은 Sigma Chemical Co.(St. Louis, Mo. USA)의 상품이다.
다른 물질은 실시예 19와 20에 언급되었다.
비오틴화된 DNA 프로브/rRNA 혼성체 또는 비오틴화된 DNA 프로브와 인큐베이트(본 실시예에 언급된대로)된 트리스-라텍스의 2개의 샘플은 듀라포르 R( Millipore Corp., Bedford, MA, USA)여과기를 사용하는 Millititer 96 여과장치로 여과하였다.
여과된 고체의 각 샘플을 0.1M 트리스(pH 7.5)/0.1M NaCl/3mM MgCl2/0.05 % 트윈 20내의 3% BSA 200μl에 재현탁시키고 1.5ml 스크류-캡 폴리에틸렌 튜브로 이전하고, 44℃에서 1시간 동안 인큐베이트하였다.
샘플을 상술한대로 여과하고 여과된 고체를 스트렙트아비딘-알칼리성 포스파타제 복합체(제조업자의 조언에 따라서 인산염 완충액 염수에서 제조) 200μl에 재현탁시켰다.
10분후 견본을 여과하고 0.1M 트리스(pH 7.5)/0.1M NaCl/3mM MgCl2/0.05 % 트윈-20 200μl로 2회 세척하고 0.1M 트리스(pH 9.5)/0.1M NaCl/50mM MgCl2200μl로 1회 세척하였다.
여과된 고체를 0.33mg/ml(NBT)와 0.17mg/ml(BCIP)를 함유하는 0.1M 트리스(pH 9.5)/0.1M NaCl/50mM MgCl2200μl에 재현탁시켰다.
색조 발현을 10분간 어둡게 하여 진행하였다. 라텍스 입자를 여과분리하고 0.1M NaCl 3mM MgCl2/0.05% 트윈-20으로 2회 세척하였다.
트리스-라텍스 소구체의 표면에 부착된 청색 침전물은 2분이내에 혼성체 샘플을 위하여 쉽게 보였다. 이것은 비오티화된 프로브만 지닌 샘플에서 관찰되는 매우 희미한 색조 발현과 명확히 구별되었다.
[실시예 26]
비색적 비-동위원소적 측정에 있어서 비오틴화된 프로브와 함께 트리스-세파로스의 사용
실시예 25의 혼성체 형성 시스템을 트리스-라텍스 소구체대신 트리스 세파로스 겔과 함께 사용하였다.
(a) 혼성화된 비오틴화된 프로브를 트리스-세파로스상에 고정화 하였다.
0.1ml의 트리스-세파로스(실시예 19에서 제조된)를 함유하는 소형 컬럼을 1cc의 투베르쿨린 실린지를 사용하여 제조하였다.
혼성체 형성혼합물(실시예 25(b)에서 언급한 바와 같이 제조한)을 0.25M PB/0.02% SDS/1.0% 트리톤 X-100 0.5ml에 녹이고 트리스-세파로스 컬럼을 통하여 5분에 걸쳐 적가통과시켰다.
그다음 컬럼을 동일완충액 0.5ml로 2회 세척하였다.
컬럼에 결합되어 남아있는 [32P]의 양을 실시예 25(b)에 언급된대로 신틸레이션 카운팅으로 결정하였다.
트리스-세파로스는 프로브상의 혼성체의 선택을 특히 분명하게 나타내었다.
혼성체중 81%는 트리스 세파로스에 결합된 반면 프로브 대조표준에서는 0.0%가 결합되었다(프로브 대조표준에 결합되어 남아있는 [32P]의 양은 백그라운드 상에서 측정할 수 없었다.
(b) 비오틴화된 프로브는 비-동위원소적으로 검출되었다.
물질들은 실시예 21(c)에서 언급된 바와 같았다.
트리스-세파로스의 소형 컬럼은 본 실시예에 언급된대로 제조되었고 혼성체 형성반응 혼합물로 처리되었다.
아비딘-알칼리성 포스파타제 복합물(0.5ml, 실시예 25(c)에서 언급된 바와 같이 제조)을 컬럼을 통해 적가 통과시켰다.
10분후 남아있는 아비딘-알칼리성 포스파타제 용액을 약한 가압으로 배출시켰다.
겔을 0.1M 트리스(pH 7.5)/0.1M NaCl/3mM MgCl20.5ml로 2번, 0.1M 트리스(pH 7.5)/0.1M NaCl/50mM MgCl21번 세척하였다.
NBT/BCIP 염료 시약(0.5ml, 실시예 25 참조)을 겔을 통해 서서히 통과시켰다.
10분후 남아있는 시약을 배출시키고 겔을 0.1M 트리스(pH 7.5)/0.1M NaCl/3mM MgCl20.5ml로 2회 세척하였다.
혼성체 샘플은 약 2분이내에 청색 발현을 보여주었다.
이것은 10분의 색조발현시간후에도 단지 흐린 청색인 프로브만 지닌 견본과 쉽게 구별되었다.
주 : 이러한 지지체는 전술한 지지체(실시예 25(c))에서 요구되는 바와 같이 3% BSA로“캡팅”단계를 요구하지 않는다.
[실시예 27]
비색측정에 있어서 알칼리성 포스파타제 표지화된 DNA와 함께 트리스-세파로스의 사용 실시예 19에서 언급한 양이온성 지지체의 유용도는 알칼리성 포스파타제/데옥시올리고누클레오티드 프로브 포합체를 사용하는 비색 혼성체 형성측정에서 증명된다.
물질 : 대장균의 rRNA(이하“표적 rRNA”로 언급된다)에 상보적인 알칼리성-포스파타제 표지화된 합성올리고누클레오티드(26mer)는 E. 자블론스키등 (E.Jablonski et al., Nucl. Acids Res., Vol.14, P.6115(1986))에 의하여 언급된 과정의 수정법에 의하여 제조되었다.
올리고누클레오티드 서열은 칸디다 알비칸스의 rRNA(이하“비-표적 rRNA”로 칭한다)에 최소 교차 혼성체 형성을 나타내도록 선택되었다.
표적 및 비-표적 rRNA는 분리 및 정제되었다.
NBT 및 BCIP 염료는 실시예 25를 참조하였다.
다른 물질은 시약 품질이었다.
혼성체 형성 칵테일은 올리고누클레오티드-알칼리성 포스파타제 포합체 (10μl, 1pmol), 표적 또는 비표적 rRNA의 희석용액(1μl, 1-0.0001㎍), 4.8M 인산나트륨 완충액(2μl, pH 6.8), 도데실 황산나트륨(0.4μl, 1% 용액 v/v) 및 살균수(13.6μl) : 총부피 20μl를 1.5ml용 폴리프로필렌 소형 원심분리튜브에 첨가하여 제조하였다.
이러한 칵테일을 50℃에서 30분간 혼성체 형성시켰다.
그 다음 0.3M 인산나트륨(0.5ml, pH 6.8) 및 트리스-세파로스(약 30μl 베드부피)를 첨가하고 내용물을 50℃ 물-배스(Water/bath)에서 10분간 흔들어서 혼합하였다.
그다음 튜브를 소형 원심분리기로 잠깐 돌리고 상청액을 파스퇴르 피펫으로 빼내어 버렸다.
트리스-세파로스 펠렛을 0.3M 인산나트륨 완충액(3×0.5ml), 그다음 50mM 트리스 HCl(pH 8)/0.1M NaCl/1mM MgCl2/0.1mM ZnCl2(2×0.5ml)로 차례대로 세척하였다.
그다음 펠렛을 NBT(0.33mg/ml)와 BCIP(0.25mg/ml)을 함유하는 0.1M 트리스 HCl(pH 9.5)/0.1M NaCl/50mM MgCl2용액 300μl에 재현탁시키고 42℃에서 4시간 동안 인큐베이트하였다.
0.001㎍만큼 적은 량의 표적 rRNA에도 혼성체 형성 반응으로부터 결과되는 트리스-세파로스 펠렛상에 청보라색 발색이 나타났다.
0.1㎍ 정도로 많은 비-표적 rRNA를 지닌 대조표준에서도 트리스-세파로스 펠렛상에 발색이 나타나지 않았다.
[실시예 28]
비색 측정에서의 알칼리성 포스파타제 표지화된 DNA 프로브와 함께 -D-리신 폴리우레탄 막의 사용
본 실험에서는 비색 측정에서의 분리 지지체로서의 양이온성 막의 유용도를 증명하였다.
혼성체 형성반응을 실시예 27과 같이 수행하였다.
이 반응에는 희석완충액(0.1M 인산나트륨(pH 6.8)/0.45M NaCl/0.02% SDS/ 0.1% 트리톤 X-100) 300μl를 첨가하였다.
결과된 용액을 실시예 24에서 언급된 슬로트 블롯터 장치를 사용하여 모세관 작용에 의해 폴리-D-리신막 조작을 통과시켰다.
막 조각을 슬로트 블롯터에서 띄어내고 희석 완충액(2×2ml)과 측정용 완충액(2-아미노-2-메틸 프로판디올 HCl(pH 10.2)/0.1M NaCl(2×4ml)으로 세척하였다. 그다음 막 조각을 NBT(0.33mg/ml)와 BCIP(0.25mg/ml)를 함유한 측정용 완충액(10ml)에 담갔다.
10분후 표적 rRNA 1㎍을 함유하는 혼성체 형성 반응처리된 슬로트는 어두운 청보라색 발색을 나타내었다.
반면 비-표적 rRNA 1㎍ 함유 대조표준은 색조를 나타내지 않았다.
이러한 비색측 층은 슬로트-블롯트 측정에 전형적으로 연관되는 전(Pre) 혼성체 형성, 고정화, 블록킹 단계를 필요로 하지 않으므로 기존 기술에 비하여 현저히 개선된 것이다.
[실시예 29]
화학발광 비-동위원소적 측정에서의 폴리-D-리신 폴리우레탄 막의 사용
실시예 19에서 언급한 양이온성 막분리 지지체의 유용성을 아크리디늄 에스테르(AE) 표지화된 DNA 프로브를 사용하는 화학발광 비-동위원소적 혼성체 형성 측정으로 증명하였다.
화학발광성 아크리디늄 에스테르 표지화된 올리고누클레오티드 프로브의 생성 및 검사방법은 본원에 참조로 삽입된 1987년 10월 2일에 출원된“아크리디늄 에스테르 표지화 및 누클레오티드 프로브의 정제”라는 제목의 미국 특허출원 105,080호에 따라 수행되었다.
대장균의 rRNA 서열에 상보적인 아크리디늄 에스테르(AE) 표지화된 올리고누클레오티드(26mer)를 프로브 분자당 단일 아크리디늄 에스테르를 삽입하여 제조하였다.
여타의 물질 및 시약은 실시예 19와 27에 언급되었다.
혼성체 형성 칵테일은 1.5ml용 폴리프로필렌 소형 원심분리튜브에서 제조하였다 : AE-표지화된 프로브(2μl, 1.5×106상대적 광단위,“RLU's”), 1% SDS(v/v, 1μl), 1M 인산나트륨 완충액(pH 4.9, 5μl, 및 표적 또는 비-표적 rRNA(1㎍/μl, 1μl), 총부피 9μl였다. 각 튜브의 내용물을 60℃에서 30분간 인큐베이트하였다.
분리용 완충액(0.6ml, 0.1M 인산나트륨 pH 6.8/0.15M NACl/0.02% SDS/0.1% 트리톤 X-100)을 첨가하고 결과된 용액을 전술한대로 슬로트 블롯터장치를 사용하여 폴리-D-리신 변형된 막 조각상에 모세관 작용으로 이동시켰다. 각 슬롯트밑의 막 조각을 각각 분리용 완충액(3×2ml)으로 세척한 다음 0.25㎠조각으로 지르고 물 200μl를 함유하는 12×75mm 폴리프로필렌 튜브(Sarsted, 서독)로 이전하였다.
각 튜브의 내용물을 전술한 바에 따라서 상대적 화합발광도를 정량 측정하였다. 특히 두개의 주입 사이클을 지닌 CliniLumat 모델 LB 9502 발광측정계를 사용하였다(Berthold, Wildbad, 서독) : 주입 #1-0.25M HNO3/0.1% H2O2(200μl) , 주입 #2-2M 인산칼륨 완충액(pH 13.2, 200μl) 결과는 표 17에 있다.
[표 17]
Figure kpo00017
[실시예 30]
화학발광 비-동위원소적 혼성체 형성 측정에서의 트리스-세파로스의 사용
아크리디늄 에스테르 표지화된 올리고누클레오티드 프로브/rRNA 혼성체 형성 반응을 실시예 29에서와 같이 실시하였다.
이러한 반응으로부터의 일부분을 깨끗한 1.5ml 폴리프로필렌 마이크로퓨즈 튜브로 옮기고 0.3M 인산나트륨 완충액(pH 6.8, 0.5ml)에 현탁시켰다.
그다음, 트리스-세파로제(30μl 베드부피, 실시예 19에서 제조됨)를 첨가하고, 내용물을 실온에서 10분간 가볍게 와류시켜 혼합하였다.
소형 원심분리기에서 가볍게 돌린 후 상청액을 제거하고 트리스-세파로스 펠렛을 0.3M 인산나트륨(pH 6.8, 2×0.5ml)으로 씻은 다음 0.3M 인산나트륨(pH 6.8, 0.5ml)에 현탁시켰다. 결과된 현탁액 일부분(0.4ml)을 12×75mm 폴리프로필렌 튜브로 옮기고 30% 과산화-수소를 첨가하였다(0.5μl) 화학발광도를 실시예 29와 같이 측정하되 2N NaOH(200μl)의 1회 주입을 화학발광반응의 개시를 위하여 사용하였다.
결과는 표 18에 있다.
[표 18]
Figure kpo00018
본 분야의 숙련자들은 상술된 방법 및 조성물이 핵산을 정제하고, 박테리아, 바이러스 및 곰팡이와 같은 감염물 ; 암세포 ; 낫세포 증후군과 같은 유전병에 대한 정보를 제공할 수 있는 세포등을 포함한 다양한 원천으로부터 유도되는 DNA 및 RNA의 표적 누클레오티드 서열을 검사하기 위하여 사용될 수 있음을 파악할 것이다.
따라서 본 발명의 범위는 단지 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 것이다.

Claims (83)

  1. 다음 단계로 구성되는, 순수하지 않은 생물학적 샘플에 존재하는 누클레오티드 다중체를 정제하는 방법 : (a) 비-공유적으로 상기 다중체에 결합하는 다수의 양이온을 함유하는 고체지지체와 상기의 생물학적 샘플을 접촉시키는 단계 ; 및 (b) 상기의 샘플에 존재하는 하나 이상의 오염물질로부터 상기 지지체와 결합된 다중체를 분리하는 단계(여기서, 상기 지지체는 하이드록시아파타이트가 아니다).
  2. 제1항에 있어서, 상기의 순수하지 않은 생물학적 샘플은 길이가 10 내지 100 누클레오티드인 올리고누클레오티드를 함유하고, 상기의 누클레오티드 다중체는 폴리누클레오티드이고, 상기 지지체는 암모늄, 임모늄 및 구아니디늄 이온으로 구성되는 군으로부터 선택되는 다수의 양이온을 함유하고, 상기 폴리누클레오티드는 상기 지지체에 결합하고 상기 올리고누클레오티드는 상기 지지체에 결합하지 않도록 상기 폴리누클레오티드는 상기 올리고누클레오티드와 길이 및 전하가 충분히 다른 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 지지체는 자기성 아민 고체지지체, 자기성 프로필아민 고체지지체, 자기성 제4암모늄 고체지지체, 자기성 폴리-D-리신 기능화된 고체지지체, 폴리-D-리신 기능화된 폴리우레탄 고체지지체, 스페르민 라텍스 고체지지체, 트리스 (2-아미노에틸)아민라텍스, 고체지지체, 트리스(2-아미노에틸) 아민 비드 아가로스 고체지지체, 트리스(2-아미노에틸)-아크릴지지체, 및 트리스(2-아미노에틸)폴리우레탄 아민 고체지지체로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항중 어느 한항에 있어서, 상기 단계는 배치방식으로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항 내지 제3항중 어느 한항에 있어서, 상기 누클레오티드 다중체 또는 상기 폴리누클레오티드가 상기 지지체에 결합되지 못하게 하지 않는 이온성 세정제의 존재를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항 내지 제3항중 어느 한항에 있어서, 상기 고체지지체를 상기 단계(b)후에 세척하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항 내지 제3항중 어느 한항에 있어서, 상기 단계(b)후에 상기 누클레오티드 다중체 또는 상기 폴리누클레오티드를 회수하도록 상기의 고체지지체를 처리하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항 내지 제3항중 어느 한항에 있어서, 상기 지지체를 용리용액으로 처리하여 상기 누클레오티드 다중체 또는 상기 폴리누클레오티드를 탈착시키고 그 다음 상기 지지체로부터 상기의 용리용액을 분리하는 것을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기의 용리용액은 인산염 용액, 피로인산염 용액, 트리폴리인산염 용액, 피트산 용액 및 50% 포름아미드로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 누클레오티드 다중체 또는 상기의 폴리누클레오티드를 상기의 용리용액으로부터 회수하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제1항 내지 제3항중 어느 한항에 있어서, 상기의 생물학적 샘플은 임상표본인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기의 임상표본은 체액과 조직으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기의 임상표본은 소변표본, 타액표본 및 면봉표본으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제1항 내지 제3항중 어느 한항에 있어서, 상기 지지체는 입자로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 입자는 약 1미크론의 크기를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제14항에 있어서, 자석의 사용에 의해 용액으로부터 상기 입자의 분리를 가능하게 하는 자기장내에서 상기 입자의 이동을 가능하게 하거나 이동을 야기하는데 충분한 방식으로 상기 입자들이 자기적으로 끌어당겨지는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제1항 내지 제3항중 어느 한항에 있어서, 상기 지지체는 섬유로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 지지체는 막인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제1항 내지 제3항중 어느 한항에 있어서, 상기 지지체는 산화금속, 유리, 라텍스, 폴리아미드, 폴리에스테르, 폴리올레핀, 폴리삭카라이드, 폴리글리콜, 및 폴리아미노산으로 구성되는 군으로부터 선택되는 물질로부터 형성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 다음 단계로 구성되는 순수하지 않은 생물학적 샘플내의 폴리누클레오티드상에 존재하는 표적서열을 검출하는 측정방법 : (a) 상기 표적서열에 혼성체 형성할 수 있는 표지화된 올리고누클레오티드 프로브와 상기 생물학적 샘플을 접촉시켜서 혼성체를 형성하는 단계 ; (b) 상기 혼성체는 상기 고체지지체에 결합하여 결합성을 형성하고 비혼성체 형성된 올리고누클레오티드는 상기 고체지지체에 결합하지 않아서 자유상을 형성하는 조건하에서 다수의 양이온을 함유하는 고체지지체와 상기 혼성체를 접촉시키는 단계(여기서 상기의 고체지지체는 하이드록시아파타이트가 아니다) ; 및 (c) 상기 결합상 또는 자유상에 존재하는 표지를 정량적 또는 정성적 측정함으로써 상기 표적서열의 존재를 검출하는 단계.
  21. 제20항에 있어서, 상기의 다수의 양이온은 암모늄, 임모늄 및 구아니디늄 이온으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 고체지지체는 자기성 아민 고체지지체, 자기성 프로필아민 고체지지체, 자기성 제4암모늄 고체지지체, 자기성 폴리-D-리신 기능화된 고체지지체, 폴리-D-리신 기능화된 폴리우레탄 고체지지체, 스페르민 라텍스 고체지지체, 트리스(2-아미노에틸)아민라텍스 고체지지체, 트리스(2-아미노에틸) 아민 비드 아가로스 고체지지체, 트리스(2-아미노에틸)-아크릴지지체, 및 트리스(2-아미노에틸)폴리우레탄 아민 고체지지체로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제20항 내지 제22항중 어느 한항에 있어서, 상기 단계는 배치방식으로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제20항 내지 제22항중 어느 한항에 있어서, 상기 자유상으로부터 상기 결합상을 분리하고 그후 상기 결합상을 세척하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제20항 내지 제22항중 어느 한항에 있어서, 상기 조건은 상기 폴리누클레오티드가 상기 고체지지체에 결합되지 못하게 하지 않는 이온성 세정제의 존재를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제20항 내지 제22항중 어느 한항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 임상표본인 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기의 임상표본은 체액 및 조직으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제26항에 있어서, 상기의 임상표본은 소변표본, 타액표본 및 면봉표본으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제20항 내지 제22항중 한항에 있어서, 상기의 고체지지체는 입자로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 자석의 사용에 의해 용액으로부터 상기 입자의 분리를 가능하게 하는 자기장내에서 상기 입자의 이동을 가능하게 하거나 이동을 야기하는데 충분한 방식으로 상기 입자들이 자기적으로 끌어당겨지는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제20항 내지 제22항중 어느 한항에 있어서, 상기의 고체지지체는 산화금속, 유리, 라텍스, 폴리아미드, 폴리에스테르, 폴리올레핀, 폴리삭카라이드, 폴리글리콜, 및 폴리아미노산으로 구성되는 군으로부터 선택된 물질로부터 형성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제20항 내지 제22항중 어느 한항에 있어서, 상기 올리고누클레오티드 프로브는 DNA 또는 RNA의 유사체이고, 상기 유사체는 알킬포스포네이트 및 아릴포스포네이트로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 유사체는 메틸포스포네이트인 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제20항 내지 제22항중 어느 한항에 있어서, 상기 폴리누클레오티드는 상기 올리고누클레오티드 프로브보다 적어도 3배 더 큰 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기의 폴리누클레오티드는 상기의 올리고누클레오티드 프로브보다 적어도 5배 더 큰 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 다음 단계로 이루어지는 순수하지 않은 생물학적 샘플내의 폴리누클레오티드상에 존재하는 표적서열을 검출하는 측정방법 : (a) 상기 표적서열에 혼성체 형성할 수 있는 올리고누클레오티드 프로브와 상기의 생물학적 샘플을 접촉시켜서 혼성체를 형성하는 단계 ; (b) 상기의 혼성체는 상기의 고체지지체에 결합하고 비혼성체 형성된 올리고누클레오티드 프로브는 상기의 고체지지체에 결합하지 않는 조건하에서 다수의 양이온을 함유하는 고체지지체와 상기의 혼성체를 접촉시키는 단계(여기서 상기의 고체지지체는 하이드록시아파타이트가 아니다) ; (c) 상기의 비혼성체 형성된 올리고누클레오티드 프로브로부터 상기의 고체지지체를 분리하는 단계 ; 및 (d) 상기 혼성체로서 상기 고체지지체에 결합되는 상기의 표지화된 올리고누클레오티드 프로브 또는 혼성체 형성되지 않는 상기의 프로브를 정량적 또는 정성적 측정함으로써 상기 표적서열의 존재를 검출하는 단계.
  37. 제36항에 있어서, 상기의 다수의 양이온은 암모늄, 임모늄 및 구아니디늄 이온으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기의 고체지지체는 자기성 아민 고체지지체, 자기성 프로필아민 고체지지체, 자기성 제4암모늄 고체지지체, 자기성 폴리-D-리신 기능화된 고체지지체, 폴리-D-리신 기능화된 폴리우레탄 고체지지체, 스페르민 라텍스 고체지지체, 트리스(2-아미노에틸)아민 라텍스 고체지지체, 트리스(2-아미노에틸) 아민 비드 아가로스 고체지지체, 트리스(2-아미노에틸)-아크릴 지지체, 및 트리스(2-아미노에틸)폴리우레탄 아민 고체지지체로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제36항 내지 제38항중 어느 한항에 있어서, 상기 혼성체로서 상기 고체지지체에 결합된 상기의 표지화된 올리고누클레오티드 프로브는 용리용액을 이용하여 상기의 표지화된 올리고누클레오티드 프로브로부터 상기의 혼성체, 상기의 표지화된 올리고누클레오티드 프로브 또는 표지를 용출시키고, 상기 고체지지체로부터 용출된 상기 혼성체, 상기의 표지화된 올리고누클레오티드 또는 상기 표지를 정량적 또는 정성적 측정함으로써 검출되는 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 제39항에 있어서, 상기의 용리용액은 50% 포름아미드, 인산염 용액, 피로인산염 용액, 트리폴리인산염 용액, 및 피트산 용액으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 제36항 내지 제38항중 어느 한항에 있어서, 상기 단계는 배치방식으로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 제36항 내지 제38항중 어느 한항에 있어서, 상기 조건은 상기 폴리누클레오티드가 상기 고체지지체에 결합되지 못하게 하지 않는 이온성 세정제의 존재를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 제36항 내지 제38항중 어느 한항에 있어서, 상기의 생물학적 샘플은 임상표본인 것을 특징으로 하는 방법.
  44. 제43항에 있어서, 상기의 임상표본은 체액 및 조직으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  45. 제43항에 있어서, 상기의 임상표본은 소변표본, 타액표본 및 면봉표본으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  46. 제36항 내지 제38항중 어느 한항에 있어서, 상기 고체지지체는 자석의 사용에 의해 용액으로부터 입자의 분리를 가능하게 하도록 자기장내에서의 입자의 이동을 가능하게 하거나 또는 이동을 야기하는데 충분한 방식으로 자기적으로 끌어당겨지는 입자들을 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
  47. 제36항 내지 제38항중 어느 한항에 있어서, 상기의 고체지지체는 산화금속, 유리, 라텍스, 폴리아미드, 폴리에스테르, 폴리올레핀, 폴리삭카라이드, 폴리글리콜 및 폴리아미노산으로 구성되는 군으로부터 선택된 물질로부터 형성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  48. 제36항 내지 제38항중 어느 한항에 있어서, 상기 올리고누클레오티드 프로브는 알킬포스포네이트 및 아릴포스포네이트로 구성되는 군으로부터 선택된 DNA 또는 RNA 유사체인 것을 특징으로 하는 방법.
  49. 제36항 내지 제38항중 어느 한항에 있어서, 상기 폴리누클레오티드는 상기 올리고누클레오티드 프로브보다 적어도 3배 더 큰 것을 특징으로 하는 방법.
  50. 제49항에 있어서, 상기 폴리누클레오티드는 상기 올리고누클레오티드 프로브보다 적어도 5배 더 큰 것을 특징으로 하는 방법.
  51. 다음 단계로 이루어지는 순수하지 않은 생물학적 샘플내의 폴리누클레오티드상에 존재하는 표적서열을 검출하는 측정방법 : (a) 상기 폴리누클레오티드는 상기의 고체지지체에 결합하여 결합된 폴리누클레오티드를 형성하고 상기 폴리누클레오티드보다 더 작은 크기를 갖는 올리고누클레오티드는 상기의 고체지지체에 결합하지 않는 조건하에서 다수의 양이온을 함유하는 고체지지체와 상기의 생물학적 샘플을 접촉시키는 단계(여기서, 상기 지지체는 하이드록시아파타이트가 아니다) ; (b) 상기 표적서열에 혼성체 형성할 수 있는 표지화된 올리고누클레오티드 프로브를 상기의 결합된 폴리누클레오티드에 제공하여 상기 고체지지체에 의해 결합된 혼성체를 형성하는 단계, 여기서 혼성체 형성되지 않는 상기의 올리고누클레오티드 프로브는 상기 고체지지체에 결합되지 않는다 ; (c) 혼성체 형성되지 않은 올리고누클레오티드 프로브로부터 상기의 고체지지체를 분리하는 단계 ; 및 (d) 상기의 혼성체로서 상기의 고체지지체에 결합된 상기의 올리고누클레오티드 프로브 또는 혼성체 형성되지 않은 상기 프로브를 정량적 또는 정성적 측정함으로써 상기 표적서열의 존재를 검출하는 단계.
  52. 제51항에 있어서, 상기의 다수의 양이온은 암모늄, 임모늄 및 구아니디늄이온으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  53. 제52항에 있어서, 상기의 고체지지체는 자기성 아민 고체지지체, 자기성 프로필 아민 고체지지체, 자기성 제4암모늄 고체지지체, 자기성 폴리-D-리신 기능화된 고체지지체, 폴리-D-리신 기능화된 폴리우레탄 고체지지체, 스페르민 라텍스 고체지지체, 트리스(2-아미노에틸)아민 라텍스 고체지지체, 트리스(2-아미노에틸) 아민 비드 아가로스 고체지지체, 트리스(2-아미노에틸)-아크릴 지지체, 및 트리스(2-아미노에틸)폴리우레탄 아민 고체지지체로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  54. 제51항 내지 제53항중 어느 한항에 있어서, 상기 혼성체로서 상기 고체지지체에 결합된 올리고누클레오티드는 용리용액을 이용하여 상기의 표지화된 올리고누클레오티드 프로브로부터 상기의 혼성체, 상기의 표지화된 올리고누클레오티드 프로브 또는 표지를 용출시키고, 상기 고체지지체로부터 용출된 상기의 혼성체, 상기의 표지화된 올리고누클레오티드 또는 상기의 표지를 정량적 또는 정성적 측정함으로써 검출되는 것을 특징으로 하는 방법.
  55. 제54항에 있어서, 상기의 용리용액은 50% 포름아미드, 인산염 용액, 피로인산염 용액, 트리폴리인산염 용액 및 피트산 용액으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  56. 제51항 내지 제53항중 어느 한항에 있어서, 상기의 단계는 배치방식으로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  57. 제51항 내지 제53항중 어느 한항에 있어서, 상기 조건은 상기 폴리누클레오티드가 상기 고체지지체에 결합되지 못하게 하지 않는 이온성 세정제의 존재를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  58. 제51항 내지 제53항중 어느 한항에 있어서, 상기의 생물학적 샘플은 임상표본인 것을 특징으로 하는 방법.
  59. 제58항에 있어서, 상기의 임상표본은 체액 및 조직으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  60. 제58항에 있어서, 상기의 임상표본은 소변표본, 타액표본 및 면봉표본으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  61. 제51항 내지 제53항중 어느 한항에 있어서, 상기의 고체지지체는 산화금속, 유리, 라텍스, 폴리아미드, 폴리에스테르, 폴리올레핀, 폴리삭카라이드, 폴리글리콜 및 폴리아미노산으로 구성되는 군으로부터 선택되는 물질로부터 형성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  62. 제61항에 있어서, 상기의 고체지지체는 자석의 사용에 의하여 용액으로부터 입자의 분리를 가능하게 하도록 자기장내에서 상기 입자의 이동을 가능하게 하거나 이동을 야기하는데 충분한 방식으로 자기적으로 끌어당겨지는 입자들을 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
  63. 제51항 내지 제53항중 어느 한항에 있어서, 상기의 올리고누클레오티드 프로브는 알킬포스포네이트 및 아릴포스포네이트로 구성되는 군으로부터 선택된 DNA 또는 RNA 유사체인 것을 특징으로 하는 방법.
  64. 제51항 내지 제53항중 어느 한항에 있어서, 상기의 폴리누클레오티드는 상기의 올리고누클레오티드 프로브보다 적어도 3배 더 큰 것을 특징으로 하는 방법.
  65. 제64항에 있어서, 상기의 폴리누클레오티드는 상기의 올리고누클레오티드 프로브보다 적어도 5배 더 큰 것을 특징으로 하는 방법.
  66. 다음으로 이루어지는 순수하지 않은 생물학적 샘플내의 폴리누클레오티드상에 존재할 수 있는 표적서열을 검출하는 키트 : (a) 상기 표적서열과 혼성체를 형성할 수 있는 올리고누클레오티드 프로브 ; 및 (b) 상기의 올리고누클레오티드는 고체지지체에 결합하지 않는 조건하에서 상기의 혼성체에 결합할 수 있는 다수의 양이온을 함유하는 고체지지체(여기서 상기 지지체는 하이드록시아파타이트가 아니다.)
  67. 제66항에 있어서, 상기의 다수의 양이온은 암모늄, 임모늄 및 구아니디늄 이온으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 키트.
  68. 제67항에 있어서, 상기의 고체지지체는 자기성 아민 고체지지체, 자기성 프로필아민 고체지지체, 자기성 제4암모늄 고체지지체, 자기성 폴리-D-리신 기능화된 고체지지체, 폴리-D-리신 기능화된 폴리우레탄 고체지지체, 스페르민 라텍스 고체지지체, 트리스(2-아미노에틸)아민 라텍스 고체지지체, 트리스(2-아미노에틸) 아민 비드 아가로스 고체지지체, 트리스(2-아미노에틸)-아크릴 지지체, 및 트리스(2-아미노에틸)폴리우레탄 아민 고체지지체로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 키트.
  69. 제66항 내지 제68항중 어느 한항에 있어서, 상기의 환경조건하에서 상기의 폴리누클레오티드가 상기의 고체지지체에 결합하지 못하게 하지 않는 이온성 세정제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  70. 제66항 내지 제68항중 어느 한항에 있어서, 상기 고체지지체에 결합되는 상기 혼성체를 용출시킬 수 있는 용리용액을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  71. 제70항에 있어서, 상기의 용리용액은 인산염 용액, 피로인산염 용액, 트리폴리인산염 용액, 피트산 용액 및 50% 포름아미드로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 키트.
  72. 제66항 내지 제68항중 어느 한항에 있어서, 상기의 올리고누클레오티드 프로브는 검출을 촉진하도록 표지화되는 것을 특징으로 하는 키트.
  73. 제66항 내지 제68항중 어느 한항에 있어서, 상기의 올리고누클레오티드 프로브는 알킬포스포네이트 및 아릴포스포네이트로 구성되는 군으로부터 선택된 DNA 또는 RNA 유사체인 것을 특징으로 하는 키트.
  74. 제66항 내지 제68항중 어느 한항에 있어서, 상기의 고체지지체는 입자로 이루어진 것을 특징으로 하는 키트.
  75. 제74항에 있어서, 상기 입자는 약 1미크론의 크기를 갖는 것을 특징으로 하는 키트.
  76. 제66항 내지 제68항중 어느 한항에 있어서, 상기의 고체지지체는 섬유로 이루어진 것을 특징으로 하는 키트.
  77. 제66항 내지 제68항중 어느 한항에 있어서, 상기의 고체지지체는 막인 것을 특징으로 하는 키트.
  78. 제74항에 있어서, 자석의 사용에 의하여 어떤 용액으로부터 입자의 분리를 가능하게 하도록 자기장내에서 상기 입자의 이동을 가능하게 하거나 이동을 야기하는데 충분한 방식으로 상기 입자들이 자기적으로 끌어당겨지는 것을 특징으로 하는 키트.
  79. 제66항 내지 제68항중 어느 한항에 있어서, 상기의 고체지지체는 산화금속, 유리, 라텍스, 폴리아미드, 폴리에스테르, 폴리올레핀, 폴리삭카라이드, 폴리글리콜, 및 폴리아미노산으로 구성되는 군으로부터 선택된 물질로부터 형성되는 것을 특징으로 하는 키트.
  80. 제66항 내지 제68항중 어느 한항에 있어서, 상기의 폴리누클레오티드는 상기의 올리고누클레오티드 프로브보다 적어도 3배 더 큰 것을 특징으로 하는 키트.
  81. 제80항에 있어서, 상기의 폴리누클레오티드는 상기의 올리고누클레오티드보다 적어도 5배 더 큰 것을 특징으로 하는 키트.
  82. 제2항에 있어서, 상기 폴리누클레오티드는 상기 올리고누클레오티드보다 적어도 3배 더 큰 것을 특징으로 하는 방법.
  83. 제82항에 있어서, 상기 폴리누클레오티드는 상기 올리고누클레오티드보다 적어도 5배 더 큰 것을 특징으로 하는 방법.
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