UA48150C2

UA48150C2 - Похідні амінокислот або аміноспиртів, олігонуклеотид

Info

Publication number: UA48150C2
Application number: UA97041995A
Authority: UA
Inventors: Кандасамі Рамасамі; Гуанжі Ванг; Уілфрід Зайферт
Original assignee: Ай-Сі-Ен Фармасьютикалз
Priority date: 1994-11-02
Filing date: 1995-02-11
Publication date: 2002-08-15
Also published as: JPH10508312A; HU218086B; CN1171112A; PL185852B1; AU4234196A; RU2154638C2; MX9703188A; AU693622B2; SI9520112A; PL320084A1; KR100393336B1; EP0789707A1; EP0789707A4; HUT77435A; KR970707144A; WO1996014330A1; CA2202274A1

Abstract

Даним винаходом запропоновані різні нові аналоги олігонуклеотидів, що мають одну чи декілька якостей, що надають їм перевагу перед олігонуклеотидами, традиційно використовуваних у процесах, де потрібні олігонуклеотиди. Сполуки, запропоновані у цьому винаході, - це аналоги олігонуклеотидів, у котрих фуранозне кільце, що присутнє у природній нуклеїновій кислоті, заміщене амінокислотою або модифікованим аміноспиртовим залишком. Деякі з цих нових речовин, запропонованих цим винаходом, особливо корисні для антисмислового управління експресією генів. Сполуки, що відповідають цьому винаходу, можуть бути використаними як гібридизаційні зонди чи затравки.

Description

Опис винаходу

Настоящее изобретение относится к аналогам полинуклеотидов, в которьїх отсутствуют фуранознье кольца. 2 Олигонуклеотидьі, которье специфически связьшаются с комплементарньми последовательностями нуклеотидов (смьісловой нитью) водородньіми связями для подавления зкспрессии генов, обьічно назьіваются антисмьсловьми олигонуклеотидами. Зти синтетические Олигонуклеотидь! связьвшаются с мишенью (матричной РНК), тем самьїм подавляя трансляцию матричной РНК. Зтот антисмьісловой принцип (піІтапп, Е. еї а), Спет. КемІєму5, 1990, 90, 543 - 584; и 5їеіп, С.А. еї аЇ,, Сапсег Кевз., 1988, 48, 2659 - 2688) используется для управления зкспрессией генов в природе. Зтот антисмьісловой принцип бьіл использован в лабораториий не только для подавления, но и для активации зкспрессии генов. В 1978 году 7атеспік и

Зіерпепзоп впервье предложили применение синтетических олигонуклеотидов в терапевтических целях (бЇїерпепзоп М. Ї.; апа латеспік, Р. С., Ргос. Май. Асад. 5сіІ. ОБА, 1978, 75, 280 апа 285). Специфическое подавление антисмьсловьх полинуклеотидов основано на специфическом спариваний по Уотсону-Крику 12 (уУ/аївоп-СтіскК) между гетероциклическими основаниями антисмьслового олигонуклеотида и вирусной нуклеиновой кислоть. Процесс связьвания олигонуклеотидов с комплементарной нуклеийновой кислотой назьшаєтся гибридизацией. Олигомер, имеющий последовательность оснований, комплементарную последовательности оснований мРНК, кодирующей белок, которьій необходим для прогрессирования болезни, представляет особьій интерес. Специфическая гибридизация с мРНК может нарушить синтез белков, кодируемьїх зтой МРНК.

В прошедшем десятилетии центром внимания многих исследовательских коллективов бьіло приготовление немодифицированньїх олигонуклеотидов, т.е. олигонуклеотидов, имеющих структуру ДНК. В настоящее время найболее зффективньм способом приготовления фосфодизфирньїх олигонуклеотидов является синтез при помощи фосфорамидитов по Карутерсу (МеВгіде, ІЇ.). апа Сагциїпегв, М.Н., Теігапедгоп І ейв5., 1983, 24, 245), с 29 первоначально предложенньйй Летсингером (і еївзіІпдег, К.І..; апа І спвіога, МУ.В., у). Атег. Спет. 5ос., 1976, 98, Ге) 3655) как способ фосфит-тризфира. Когда обьічньсе, т.е. немодифицированньсе, олигонуклеотидь! используются как антисмьісловьіе олигонуклеотидьі, возникают проблемь!, связаннье с неустойчивостью по отношению к нуклеазам и недостаточной степенью проникновения сквозь мембрань». Для того, чтобьї антисмьісловне олигонуклеотидь! бьіли в состояний подавить трансляцию, необходимо, чтобьі они попадали внутрь клетки в о неизмененном виде. Олигонуклеотид-антисмьсловой ингибитор должен обладать следующими свойствами: (і) (3 устойчивостью по отношению к вне-и внутриклеточньм ферментам; (ії) способностью проникать сквозь клеточнье мембраньї и (ії) способностью к гибридизации с мишенью - ДНК или РНК (АдагмаїЇ, К.І... еї аї, МисіеЇїс --

Асідз Кев., 1979, 6, 3009; АдауаІ), 5. еї аїЇ.,, Ргос. Май. Асад. Зсі. ОБА, 1988, 85, 7079). Таким образом, с бьіло бьї полезно создать аналоги полинуклеотидов, свойства которьїх, необходимье для их использования в качестве антисмьсловьх единиц, затравок или гибридизационньх зондов, бьіли бьі более виіраженньми. М

В опрошлом бьли синтезированьь модифицированнье полинуклеотидь; в числе модификаций - метилфосфонать!, фосфоротисать, различнье амидатьі и сахарнье группьі в нуклеийновьх кислотах. Зти замещения в скелете обеспечивают некоторое повьшение стабильности, но привносят недостаток: « соединительньій фосфор оказьшваєтся в положении хирального центра, что приводит к образованию 2" -о 70 диастереоизомеров, где Н - зто число модифицированньїх дизфирньїх связей в олигомере. Присутствие с множества диастереоизомеров значительно ослабляет способность модифицированного олигонуклеотида з» гибридизоваться с последовательностями-мишенями. Некоторье из зтих замещений сохраняют также способность нести отрицательньй заряд, а присутствие заряженньїх групп ослабляет способность соединений проникать сквозь клеточнье мембрань. Зти модифицированнье связи имеют еще цельй ряд недостатков, определяемьїх природой каждой связи. е Бьіли синтезированьі некоторье аналоги олигонуклеотидов, содержащие модификации сахара. К о модификациям сахара, которне использовались для создания структур, считавшихся более совершенньми, особенно, структур, лучше усваийваемьїх клеткой, относятся о-ДНК, гомо-ДНК, морфолин- и тионуклеозидь и що лептиднье нуклеийновье кислотьї (ПНК). Общая схема синтеза таких аналогов предусматривает вовлечение 1 50 первичной гидроксильной группь! нуклеозида или его нуклеотида, связанного с полимерньмм носителем или с

З'і--нуклеотидом с атомом фосфора и определенной последовательностью, в пятивалентное или трехвалентное с окисление. Некоторье из зтих процедур соединения получили названия: фосфит-тризфир (фосфорамидит), фосфорньй дизфир и гидрофосфонат. Промьішленность производит необходимье для проведения таких процедур мономерь и связаннье с полимерньіми носителями мономерь! с защищенньіми основаниями (о, А, С, 59 Т, О и другими гетероциклами) и защищенньми атомами фосфора, что позволяет долго хранить мономерь и

ГФ) предупреждает неспецифические реакции в ходе реакции соединения. юю Видь! нуклеиновьіїх кислот, содержащие модифицированнье сахара, нейоннье скелетьії или нециклические полиамидь (РМА), обладают, в той или иной степени, одним или несколькими из следующих свойств, полезньх для управления генами: большей дуплексной стабильностью (зффективностью гибридизации), большей 60 специфичностью по отношению к мишени, устойчивостью по отношению к нуклеазам, хорошей усваиваемостьо в клетке и способностью содействовать нуклейновьм кислотам в важньх процессах (например,

Н-рибонуклеазной активностью, каталитической расщепляющей активностью, способностью прекращать гибридизацию и др.). Бніло предложено также использовать карбонат-дизфирьі. Однако, зти соединения очень неустойчивьі, и карбонат-дизфирная связь не удерживаєт тетраздрическую форму, свойственную фосфору в бо фосфодизфирах. Подобньї!м образом, карбаматньсе связи, хотя они не являются хиральньіми, дают треугольную симметрию, и, как оказалось, поли-й4Т с такими связями не гибридизуется с поли-дА достаточно сильно (СоціїЇ,

У.М. еї аї., Теггапеадгоп І ек5., 1987, 28, 745; ЗЙЦгспак, Е.Р. еї аї., У. Огу. Спет., 1987, 52, 4202).

Не так давно в литературе появились сообщения о нециклических сахарньїх аналогах (Ацдизіупв, К.А. еї аї.,

МисіеІс Асіаз Кев., 1991, 19, 2587 - 2593). Включение зтих нециклических нуклеозидов в олигонуклеотидь! привело к снижению температурь плавления, которое зависит от числа линкеров, встроенньіх в олигонуклеотидьі. Зти олигонуклеотидьі оказались устойчивьіми по отношению к ферментам и спаривались основаниями с комплементарной последовательностью. С учетом недостатков, присущих полинуклеотидам и известньїм аналогам полинуклеотидов, бьіло бьі полезно создать новьіе аналоги полинуклеотидов, которье 7/0 Можно бьіло бьі применять в ходе антисмьіслового ингибирования и других процессов, в которьїх используются олигомерні.

Попьїтки модифицировать и сахарнье, и скелетнье компонентьї порождают продукть!, которье как лекарственнье средства (и в других качествах) имеют определеннье недостатки. Следовательно, необходимо значительно их усовершенствовать, прежде чем будут полученьі зффективнье средства лечения и диагностики /5 ли аналитические реактиви. Таким образом, давно назрела необходимость создать усовершенствованнье олигомернье аналоги олигонуклеотидов для использования в качестве лекарственньх средств.

Настоящим изобретением предложеньі новьіе олигонуклеотидьі и их структурнье предшественники, более устойчивье к перевариванию нуклеазами, более стабильнье в физиологических условиях и способнье оставаться нейтральньми или нести положительньй заряд, что облегчаєт проникновение в клетку. Кроме того,

Нове олигонуклеотидьі, соответствующие настоящему изобретению, обладают более сильной способностью к гибридизации с нуклейновьіми кислотами-мишенями.

Олигомерьі, соответствующие настоящему изобретению, обьічно характеризуются тем, что содержат ряд ограниченньїх линкеров, или мономеров, способньїх связьшваться гетероциклическими основаниями со специфичной последовательностью нуклеийновой кислотьі-мишени. Ограниченнье линкерь), описаннье в с г настоящем документе, при включений в олигомерь обеспечивают силу связи, часто превосходящую силу одной водородной связи, способствуя образованию конформации, компетентной к связьіванию. о

Нуклеомономерьї, соответствующие настоящему изобретению, обьічно характеризуются как группь! или остатки, в которьіх фуранозное кольцо, присутствующее в природньїх нуклеотидах, замещено аминокислотой или модифицированньм остатком аминоспирта. Примерь мономеров и олигомеров, соответствующих о зо настоящему изобретению, представлень формулами 1 - 41, Включение зтих мономеров, описанньх в настоящем документе, в олигонуклеотидь! позволяет синтезировать соединения с улучшенньіми свойствами, к о которьім оотносятся: (і) большая липофильность, обусловленная устранением заряда, присущего «- фосфодизфирньм связям (ЮОаїде, 9У.М. еї аЇ., МисієЇїс Асідз Кев., 1991, 19, 1805) и (І) устойчивость к деградационному воздействию ферментов, таких как нуклеазьі. Олигомерьії, содержащие зти мономерь, могут со бьїть достаточно стабильньми для гибридизации с последовательностями-мишенями и по ряду свойств, «г превосходить немодифицированнье нуклеозидньсе остатки.

Сущность изобретения

Настоящим изобретением предложеньї различнье, нове аналоги олигонуклеотидов, обладающие одним или несколькими свойствами, дающими им преимущества перед олигонуклеотидами, традиционно « Мспользуемьми в процессах, где применяются олигонуклеотидь!. Соединения, предложеннье настоящим в с изобретением, - зто аналоги олигонуклеотидов, в которьїх фуранозное кольцо природной нуклейновой кислоть замещено аминокислотой или модифицированньім аминоспиртовьї!м остатком. Некоторье из новьїх соединений, з предложенньїх настоящим изобретением, особенно полезньії для антисмьслового управления зкспрессией генов. Соединения, соответствующие настоящему изобретению, таюже могут бьїть использованьї как гибридизационньсе зондь или как затравки. ї5» Еще один аспект настоящего изобретения - мономернье предшественники аналогов олигонуклеотидов, соответствующих настоящему изобретению. Зти мономернье предшественники могут бьіть использовань! для со синтеза аналогов полинуклеотидов, соответствующих настоящему изобретению. - Еще один аспект настоящего изобретения - препаратьї аналогов полинуклеотидов, соответствующих 5о настоящему изобретению, предназначеннье для лечения или профилактики патологических состояний. Еще о один аспект настоящего изобретения - способьї лечения или профилактики заболеваний, в частности, вирусньх о инфекций и нарушений роста клеток. Способьі лечения заболеваний, соответствующие настоящему изобретению, предусматривают введение зффективного количества аналогов полинуклеотидов, соответствующих настоящему изобретению, и применение их в качестве антисмьісловьїх ингибиторов. 5Б Краткие пояснения к иллюстративному материалу

Фиг. с 1 по 25 - зто схемьї химических реакций, при помощи которьїх можно синтезировать мономерь и

Ф) олигонуклеотидьі, сосоответствующие настоящему изобретению. В частности, ка Фиг. 1 - зто схема синтеза фосфорамидита тиминового мономера, соединенного с І -серинолом. Тимин и серинол соединеньї связью -СНь-СО-., во Фиг. 2 - зто схема синтеза фосфорамидита тиминового мономера, соединенного с І -серинолом. Тимин и серинол соединеньї связью -СНо-СНо-.

Фиг. З и 4 - схемьї синтеза замещенньх фосфорамидитов тиминового мономера, соединенного с

І-серинолом. Тимин и серинол соединеньї связью-СНь-СО-.

Фиг. 5 - зто схема синтеза димера Т-Т, в котором нуклеотидь! соединень! связью в 5 атомов длиной, в центре 65 которой находится гидроксиламин, а тимин и серинол соединеньї связью -СНо»-СО-.

Фиг. б - зто схема синтеза фосфорамидита тиминового мономера, в котором тимин соединен с

М-зтилгидроксиламином связью СНь-СО-.

Фиг. 7 - зто схема синтеза фосфорамидита тиминового мономера, соединенного с І-серинолом, в котором группа МН. І-серина соединена с 2-гидроксиацетиловой группой, а функциональная гидрокси-группа блокирована группой ЮОМТ (4,4'-диметокситритил). Зта строительная единица используется для соединения 2-5. На зтой иллюстрации также представлен синтез тиминового мономера, в котором группа МН» І1-серина соединена с 2'і-гидроксизтиловой функциональной группой.

Фиг. 8 - схема синтеза димера Т-Т, имеющего гидроксаматньій скелет со связью 2-5. В зтом димере одна строительная единица образована І-аспарагиновой кислотой и тимином, а другая - І-серином и тимином. В 7/0 скелете зтого димера присутствуют две дополнительнье амидньє связи.

Фиг. 9 - схема синтеза димера Т-Т, имеющего гидроксаматньій скелет со связью 2-5. В зтом димере одна строительная единица образована І-аспарагиновой кислотой и тимином, а другая - І-серином и тимином. В скелете зтого димера амидная связь между мономерами отсутствует.

Фиг. 10 - схема синтеза фосфорамидита тиминового мономера, соединенного с І-серинол-б-аланином. 7/5 Тимин и серинол связань! через посредство р-аланина.

Фиг. 11 - схема синтеза фосфорамидита тиминового мономера, соединенного с І-серинол-алкиламином.

Тимин и серинол связаньї через посредство алкиламина.

Фиг. 12 - схема синтеза димера Т-Т, имеющего гидроксаматньй скелет со связью 4-5. Димер образован двумя единицами І -аспарагиновой кислоть! и двумя единицами тимина; тимин и аспарагиновая кислота связань через посредство ацетила.

Фиг. 13 - схема синтеза димера Т-Т, имеющего гидроксаматньй скелет со связью 4-5. Димер образован двумя единицами І -аспарагиновой кислоть! и двумя единицами тимина; тимин и аспарагиновая кислота связань через посредство зтила.

Фиг. 14 - схема синтеза тиминовой строительной единиць, соединенной с М-гидроксиаминокислотой. с

Фиг. 15 - схема синтеза тиминовой строительной единицьі, соединенной с І-аспарагиновой кислотой.

Аспарагиновая кислота и тимин соединеньі! при помощи М-гидроксиламина. о

Фиг. 16 - схема синтеза димера Т-Т, имеющего гидроксаматньй скелет со связью 4-5. Здесь карбоксильная кислотная группа соединена с тиминовой стройительной единицей М-гидроксиламиновой связью.

Фиг. 17 - схема синтеза строительной единиць 150 (М-гидроксиаминокислота, замещенная тимидинуксусной (з Кислотой) и ее аналога 149. Зти мономернье строительнье единиць! полезньі для построения нуклеиновьх кислот с гидроксаматньіми скелетами. о

Фиг. 18 - схема синтеза гидроксиламина, замещенного тимидинуксусной кислотой, содержащего -ж аминокислотнье строительнье единиць 157 и 158. Зти мономерьї полезньі для конструирования нуклеиновьх кислот с амидньіми скелетами и гидроксиламиновьми функциональньми группами. со

Фиг. 19 - схема синтеза строительной единиць 166 (тимидин, соединенньй с І -серинолом), в которой между «ф тимином и серинолом находится гидроксиламиновая группа. Зта строительная единица полезна для построения нуклеиновьїх кислот с 4'-5'-связями.

Фиг. 20 - схема синтеза тимидинового мономера 174, соединенного с глутаминовой кислотой-глицином. Зта мономерная строительная единица полезна для создания нуклеийновьх кислот с амидньми скелетами и « связяМИи 2-5. шщ с Фиг. 21 - схема синтеза строительньїх единиц 181 и 182 (тимидин, соединенньій с глицинолом-глицином), в й которьїх между тимином и глицинолом находится гидроксиламиновая группа. Зти строительнье единиць "» полезньї для приготовления нуклеиновьїх кислот со связями 2-5.

Фиг. 22 - 24 - зто схемь! синтеза строительньх единиц 191, 199 и 207 (тимидин, соединенньій с рибозоаминокислотой). Зти строительнье единиць полезньь для приготовления олигонуклеотидов с ї» рибозоамидньми скелетами.

Фиг. 25 - схема твердофазного синтеза олигонуклеотида 211 с рибозоамидньї!м скелетом. бо Фиг. 26 - схема синтеза 1-0-(4,4-диметокситритил)-2-Ї - амин(тиминилацетил))|-І-пропан-3-О-(М,М-диизопропил)- р-цианзтилфосфорамидита.

Фиг. 27 - схема синтеза і-й 1-0-(4,4-диметокситритил)-2-(амин(тиминилацетил)|-О-пропан-3-О-(М,М-диизопропил)- ВД 62 -цианзтилфосфорамидита.

Фиг. 28 - схема синтеза 2-МК(В-(4, 4-диметокситритил)-О-ацетил)амин|-З-тиминил-ї - пропан-1-0О-(М,М-диизопропил)- ЗД-ціианзтилфосфорамидита. 22 Фиг. 29 - схема синтеза М-(тиминилацетил)-М-((2-изобутирил)окси|зтил|-О-бензилгидроксиламин.

Ге! Фиг. 0) - схема синтеза (2К,45)-1-(трет-бутилоксикарбонил)-2-|(М з-бензоил(тимин-1-ил)|метил-4-фталимид-пирролидина. ко Полное описание предпочтительньїх вариантов осуществления изобретения

А. Определения и сокращения бо При описаний настоящего изобретения мь будем пользоваться следующими терминами, которье определяем ниже.

В настоящем документе вьіражение "антисмьісловая" терапия обозначаєт введение или вьіработку Іп зи олигомеров ДНК или РНК или их аналогов, специфически связьвающихся с комплементарной последовательностью нуклейновой кислотьі-мишени. Связьивание может происходить по известному принципу б5 комплементарности пар оснований или за счет действия других механизмов, например, в случае связьвания с двухнитевьіми ДНК - за счет специфических взаимодействий в большой бороздке двойной спирали. В общем,

термин "антисмьісловой" относится к целому ряду технологий зтой области, основанньх на описанном принципе, и подходит к любому способу лечения, предусматривающему специфическое связьівание с олигонуклеотидньіми последовательностями. Технологии антисмьіслового управления генами хорошо известнь специалистам в области молекулярной биологии; примерь! антисмьслового управления генами можно найти, например, в патенте США 5107065, в патенте США 5166195, патенте США 5087617 и в СтооКе, Аппиа! Кеміем

РпагтасоЇоду Тохісоіоду 1992 32; 329-376.

Терминь "олигомер" и "олигонуклеотид" взаимозаменяемьї и обозначают как природнье соединения, такие как ДНК и РНК, так и их синтетические аналоги, в том числе соединения, предложеннье настоящим 70 изобретением. Если не указано иное, терминьі! "олигомер" и "олигонуклеотид" обозначают и ДНК/РНК, и их синтетические аналоги. Термин "олигомер" относится к соединениям, содержащим два или более нуклеомономеров, ковалентно связанньїх друг с другом фосфодизфирной связью или другой заместительной связью. Если не указано иное, термин "олигомер" не подразумеваєт каких-либо ограничений по длине. Так, олигомер может содержать всего два ковалентно связанньїх нуклеомономера (димер) или бьіть значительно /5 длиннее. Олигомер может бьіть компетентнь/м по связьванию, т.е. спариваться основаниями с однонитевьми и двухнитевьмми последовательностями нуклеийновой кислотьі. Олигомерь! (например, димерь-гексамерьї) также применимь! в качестве синтонов для более длинньїх олигомеров, как описано ь настоящем документе.

Олигомерь! могут содержать участки без оснований и псевдонуклеозидь!.

К олигомерам относятся олигонуклеотидьі, олигонуклеозидьі, полидезоксирибонуклеотидьі (содержащие 2"--дезокси-О-рибозу или ее модифицированнье формьї/), т.е. ДНК, полирибонуклеотидь! (содержащие Ю-рибозу или ее модифицированнье формьї), т.е. РНК и полинуклеотидьі любого другого типа, а зто М-гликозидь! или

С-гликозидьі пуриновьїх или пиримидиновьх оснований. В настоящем документе под олигомерами подразумеваются также соединения, в которьїх соседние нуклеомономерь соединеньі гидроксаматньми связями. Типичньіе для олигомеров злементь!, такие как фуранозное кольцо и/или фосфодизфирная связь, с г /Могут бьіть замененьї любьім подходящим функционально зквивалентньм злементом. Под термином "олигомер" подразумевается любая структура, служащая каркасом или носителем для оснований, которая обеспечивает і) специфическое связьивание с последовательностью нуклейновой кислотьі-мишени. Известнье в настоящее время олигомерь! можно разделить на четьіре группьї, характеризующиеся следующим образом: (ії) олигомерь! с фосфодизфирньми или аналогичньми (фосфоротисоатньми, метилфосфонатньми и т.д.) связями, ((ї) о зо олигомерьі с заместительньми связям, содержащими нефосфорньй центр стереоизомерии (рибоацеталь, формацеталь, карбамат и т.д.), (ії) олигомерь! с морфолиновьми остатками, карбоциклическими остатками или о другими фуранозньмми сахарами, такими как арабиноза или гексоза, вместо рибозьі или дезоксирибози и (ІМ) "пе олигомерьії, содержащие нуклеомономерь, связанньіе амидньіми связями, или нециклические нуклеомономерьї, связаннье любой подходящей заместительной связью. со

Термин "нуклеомономер" в настоящем документе обозначаєт группу, содержащую (1) основание, ковалентне «Е связанное с (2) второй группой. К нуклеомономерам относятся нуклеозидь), нуклеотидь! или основания, связаннье с аминоспиртом. Нуклеомономерьї можно соединять в олигомерь), которье специфически связьуваются с мишенью, или комплементарной последовательностью оснований нуклеиновой кислоть.

Вьіражение "вторая группа" обозначает здесь соединение, связанное с нуклеомономером, и относится к « аминокислотной/аминоспиртовой группе; обьічно зто серинол, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота, в с глицин и соединения, содержащие модифицированнье аминокислотнье группьї, например, где один или несколько атомов водорода замещеньі другими функциональньми группами (см. Формульї! 24 - 41) или одна из ;» карбоксильньїх групп превращена в спирт, амин, тисл, гидроксиламин и др. Данное здесь определение нуклеомономера охватьвает также основание, связанное с аминокислотой или аминоспиртом и/или аналогом аминокислотьаминоспирта, имеющим свободную карбоксильную/гидроксильную группу, и/или сих ї5» защищенньми формами.

Термин "нуклеозид" в настоящем документе обозначает аминокислотное и аминоспиртовое производное, со содержащее, как описано ниже, пуриновье, пиримидиновье или аналогичнье формьї, определеннье ниже, но - не содержащее соединительной группьї, такой как аналог фосфодизфира или модифицированная 5р Межнуклеозидная связь. Под "5"-нуклеозидом подразумевается нуклеозид, обеспечивающий линкеру точку о соединения на атоме углерода 5". "5"-конец линкера соединяется с 5'-позицией нуклеозида. "3"-конец линкера о соединяется с позицией 3' следующего нуклеозида. Если имеется модифицированньй нуклеозид, в котором нет

З и/или 5'-углерода, специалисть! поймут, что символь! "3" и "5" обозначают полярность нитей по аналогии с

ДНК или РНК. 5Б Термин "нуклеозид" в настоящем документе относится к основанию, ковалентно связанному с аналогом аминоспирта/"аминокислотьі. Между основанием и аминокислотой/(аминоспиртом содержится линкер. Под (Ф, термином "нуклеозид" обьічно подразумеваются рибонуклеозидьі, дезоксирибонуклеозидьі и любье другие ка нуклеозидьії, являющиеся М-гликозидами или С-гликозидами оснований.

В настоящем документе термин "нуклеотид" относится к нуклеозиду, содержащему фосфатную группу или 6о аналог фосфата (группа, в которой фосфор окислен в той же степени, что и в фосфате, например, тиофосфат, амидат).

Термин "основание" в настоящем документе обозначаєт разнообразнье нуклеозидньюе основания, в том числе пуриновье и пиримидиновье гетероцикль, а также их гетероциклические аналоги и таутомерьі. В число пуринов входят аденин, гуанин и ксантин; примером пуринового аналога может служить 8-оксо-М д-метиладенин 65 мли 7-деазаксантин. В число пиримидинов входят урацил и цитозин и их аналоги, такие как 5-метилцитозин, 5-(1-пропинилурацил), 5-(1-пропинилцитозин), 5-метилурацил и 4,4-зтанцитозин. Основания, присоединеннье к подходящему молекулярному каркасу, например, фосфодизфирному скелету, способньі к спариванию, которое происходит в двухнитевой ДНК или других двухнитевьїх нуклеиновьїх кислотах подобной структурьі. Основания могут бьіть способньіїми к спариванию и в тройньїх спиралях нуклеиновой кислоть.

Термин "модификация сахара" в настоящем документе обозначает любую аминокислотную или аминоспиртовую группу, отличную от 2'-дезоксирибозь!.

Термин "аминокислота/аминоспирт" в настоящем документе обозначает любую природную аминокислоту или аминоспирт в изомерной форме К или 5.

Термин "нуклеозидньсе связи" в настоящем документе обозначает связь, существующую внутри мономера. 70 Термин "связь" в настоящем документе обозначает группу, используемую для соединения основания с аминокислотой/аминоспиртом и их производньми.

Термин "межнуклеотиднье связи" в настоящем документе обозначаєт фосфодизфирную группу (-О-Р(0Х(0)-0-) или любую другую функционально зквивалентную группу, ковалентне связьівающую соседние нуклеомономерь!.

Термин "заместительнье связи" в настоящем документе обозначает любой аналог нативной группьі или любую подходящую группу, ковалентно связьивающую соседние нуклеомономерьі. К заместительньім связям относятся аналоги фосфодизфирной группьї, например, такие как фосфоротисат и метилфосфонат, и группнь, не содержащие фосфора, например, такие как амидь, гидроксамать, гидроксиламин. К заместительньім связям относятся не содержащие фосфора связи, предложеннье настоящим изобретением (связи 2,5, связи 3,5, связи 47,5).

Термин "перекрестно-связьівающая группа" в настоящем документе обозначает группу в олигомере, которая образует ковалентную связь с нуклеиновой кислотой-мишенью. В число перекрестно-связььвающих групп входят группьї, ковалентно связьвающие олигомер с нуклейиновой кислотой-мишенью либо спонтанно (например,

М7,М"-зтанцитозин), либо под активирующим воздействием света (например, псорален) и др. с

Термин "блокирующие группь!" в настоящем документе обозначает заместительнье группь, отличньсе от Н, о ковалентно связаннье с олигомерами или нуклеомономерами в качестве протекторньїх групп, соединительньх групп для синтеза, ОРО»з.» или других традиционньїх коньюгатов, таких как твердая подложка, метка, антитело, моноклональное антитело или его фрагмент и др. В настоящем документе вьіражение "блокирующая группа" обозначает не только протекторную группу, как в жаргонном употреблениий, а относится также, например,к «2 соединительньм группам, таким как Н-фосфонат или фосфорамидит.

Термин "протекторная группа" в настоящем документе относится к любой группе, способной предохранить ю атом О-, 5 или М-, к которому она присоединена, от участия в реакции или образования связи. Протекторнье «- группьі для атомов М-, входящих в основание нуклеомономера, и способьі их применения известнь специалистам. Примерами подходящих протекторних групп могут служить следующие, но не исключительно со следующие: диизобутилформамидин, бензоил, силил и др. Подходящими для атомов О- и 5- являются, «І например, протекторнье группь ЮМТ, ММТ, ЕМОС или сложнье зфирь. В настоящем документе под "протекторной группой" подразумеваєтся любая группа, способная предохранить атом О-,5- или М-, к которому она присоединена, от вступления в реакцию или образования связи. Такие протекторнье группь! для атомов «

О-,5- и М-, входящих в состав нуклеомономеров, описаньі в литературе, и способьї их применения известнь специалистам. В число протекторньїх групп входят также любье группьі, способнье предупредить реакцим и 0 - с связьввание на карбоксилах, тиолах и т.д. а Термин "соединительная группа" в настоящем документе обозначает любую группу, подходящую для ,» образования связи или заместительной связи между нуклеомономерами, например, Н-фосфонат и фосфорамидит.

Термин "коньюгат" или "коньюгированная группа" в настоящем документе обозначает любую группу, т. присоединенную к олигомеру у его окончания или на другом участке. В число коньюгатов входят твердье со оснОовь, такие как силикагель, пористое стекло и ополистирол; метки, например, флуоресцентньє, хемилюминесцентнье, радиоактивнье атомь или молекуль,, ферментньюе группьі и "репортернье" группь; -й средства транспорта олигомеров, такие как поликатионь, сьівороточнье белки, гликопротейинь!ї, полимерь и др. сл 50 К коньюгатам также относятся О-холестерин, полизтиленгликоль (РЕС) (ПЗГ), аминокислоть, интеркаляторь, группьі вьівода полинуклеотидов, перекрестно-связьвающие группьі, липидьі, гидроксаматьії, алкилирующие «2 агентьи др.

Термин "синтон' в о настоящем документе обозначаєт структурную единицу в составе аналога олигонуклеотида, соответствующего настоящему изобретению.

Термин "трансфекция" в настоящем документе обозначает любой способ зффективной доставки олигомеров в клетки. о Термин "обьект" в настоящем документе обозначает растение или животное, в том числе млекопитающее, в іме) частности, человека.

Термин "производнье" олигомеров и их мономернье составляющие имеет обьічное для зтой области бо значение. Например, олигонуклеотидь! могут бьіть ковалентно связаньії с различньмми группами, такими как интеркаляторьії, соединения, взаимодействующие специфически с малой бороздкой двойной спирали ДНК, и другие произвольно взятьіе коньюгатьї, например, метки (радисактивнье, флуоресцентнье, ферментньє и т.д.)

Из зтих добавочньх групп могут бьть (но не обязательно) полученьй производнье при участии модифицированной скелетной связи; они могут стать частью собственно связи. Например, интеркаляторь, б5 такие как акридин, могут бьіть связаньі через К-СН 5-, присоединенньій любьм имеющимся -ОН или 5Н, например, в концевой 5-позиций РНК или ДНК, 2-позиций РНК.или ОН/ЗН, встроенньм в 5 позиции пиримидинов, например, вместо 5-метила в цитозине. Зто производное содержит -СНЬСНОСНоОН или -СнНЬСнНьЬСН»ОЗН в позиции 5. Может бьіть присоединен любой заместитель, в том числе такой, которьій связан обьічной связью. Следовательно, указаннье группьі ОН в олигомере, соответствующем формуле (1), могут бьіть Замещень! фосфонатньми группами, защищень! стандартньмми протекторньіми группами, активировань! для образования дополнительньїх связей с другими нуклеотидами или соединеньі! с коньюгатами. 5і-концевой ОН обьічно фосфорилируют; 2-ОН или заместители ОН на 3-конце также можно фосфорилировать. Гидроксиль! можно также перевести в стандартнье протекторньсе группь.

Термин "аналог фосфодизфира" в настоящем документе обозначаєт аналог обьічной фосфодизфирной 7/0 связи, а таюке другие группьі-связи. Зти другие группьі! включают, но не исключительно, варианть, когда О-Р(О)- заменено на Р (0)5, Р(ІО)МК», РІК, РІК, где К зто Н или алкил (1-7С) и В -зто алкил (1-7С). Аналоги фосфодизфира в одном олигомере не обязательно должнь! бьіть идентичньми; Кк ним предьявляется единственное требование: хотя бьі одна из зтих связей должна бьіть модифицированной межнуклеотидной связью. "Аналогичнье" формь! пуринов и пиримидинов - зто формьі, хорошо известнье специалистам, и многие из них используются в качестве химиотерапевтических средств. В неисчерпьівающий перечень примеров входят 4-ацетилцитозин, 8-гидрокси-МО-метиладенин, азиридинилцитозин, псевдоизоцитозин, 5-(карбоксигидроксиметил)уурацил, 5-фторурацил, 5-бромурацил, 5-карбоксиметиламинометил-2-тисурацил, 5-карбоксиметиламинометилурацил, дигидроурацил, инозин, Мр-изопентениладенин, 1-метиладенин, 1-метилпсевдоурацил, 1-метилгуанин, 1-метилинозин, 2,2-диметилгуанин, 2-метиладенин, 2-метилгуанин,

З-метилцитозин, 5-метилцитозин, Мо-метиладенин, 7-метиладенин, 7-метилгуанин, 5-метиламинометилурацил, 5-метоксиаминометил-2-тисурацил, бета-О-маннозилгуанозин, 5--метоксикарбонилметилурацил, 5-метоксиурацил, 2-метилтио-Ме-изопентениладенин, метиловьій зфир урацил-5-оксиуксусной кислоти, урацил-5-оксиуксусная кислота, оксибутоксозин, псевдоурацил, дцеовіпе, 2-тиоурацил, 4-тисурацил, с 5-метилурацил, метиловьй зфир М-урацил-5-оксиуксусной кислотьі, урацил-5-оксиуксусная кислота, о псевдоурацил, дцеовзіпе, 2-тиоцитозин и 2,6-диаминопурин. Особо предпочтительньмм аналогом является 5-метилцитозин (в настоящем документе сокращенно обозначенньй "Сте").

Термин "изостерический" в настоящем документе относится к пространственньм и ориентационньм свойствам межнуклеозидной связи и подразумеваеєт и то обстоятельство, что зти свойства настолько подобнь (ав) свойствам нативной фосфодизфирной связи, что модифицированньй олигонуклеотид, содержащий изостерическую связь, может заменить, заместить, имитировать нативньйй олигонуклеотид и/или ю гибридизоваться с ним. «-

Термин "рибозоамид" в настоящем документе обозначает межнуклеотидную связь, существующую между двумя нуклеотидньми основаниями. Рибозоамидная межнуклеотидная связь содержит сочетание со функциональньх групп рибозьі/(2'-дезокси) и аминокислоть. «І

В зтой заявке для обозначения функциональньїх групп и соединений использованьі различнье сокращения.

Специалисть! в области органической химии легко поймут зти сокращения. Например, "РИ" обозначаєет фенил, "Ме" обозначаєет метил, "(1-7С)3" означает, что данная цепочка содержит от 1 до 7 атомов углерода и т.д. «

Описание изобретения

Настоящим изобретением предложеньі новніе аналоги олигонуклеотидов, содержащие модифицированнье - с аминокислотнье/аминоспиртовье связи между основаниями и скелетами (фосфодизфир, фосфоротиосать и а другие, приведеннье в таблице 1), назьваемье также модифицированньми нуклеотидньми связями. ,» Модификации или их функциональнье зквиваленть!, состоящие в замене сахарной группьії, расположенной между скелетом и основанием, на производное аминокислотьі, представлень, например, формулой 24.

Настоящим изобретение также предложень! нове нуклеомономерь и способьі их включения в олигомерь, т. содержащие нуклеомономерьі!. со Настоящим изобретением предложеньі разнообразнье нуклеомономерь! со структурой, соответствующей формулам 1 - 23. - Основание

Фо Ар о й,

Мак ра: в,

Ф) 1 іме)

Основаниг

Кк ай

В, М-к нон

Кк, б5 2

Основание в

В, і ра

Кк,

З

70

Основание ве у

В, -

У- но он

А

Основание ва

В, У й с в А о 5

Основаниє о о ою

В. - ку-я в А г о) в « 2 б

Основание « в А -

З

- КО м-В :з» в А й ї» 7 бо Основание - 2 в

Зв

М

(9) в, Х «2 в

Кк, 8

Ф) Основаниє ко о) в; 60 пуф но в, а 65

Основанив

Е. км " пу фон но В, 70

Основание ми

З

БД А в Кк, 11 провеню с й в й о

У-он но є, 12 («в) ю

Основание «-- /д р х) (се) он но «

К, Кк, 13 «

Основание - -

В А т» 14 со Основание з А еще й

Фо Кк | і ОА

Я - о - в в, 15

Основание

Ай ко в Ї

М-А 60 в' 16 65

Основание а 9 А

В

Кк, Кк, 17

Основание ве 4 кун у М-В у. 4 но ІФ) 18

Основаниє в. і он ув но Кк і с о

Основание

М (ав) зо вх хх ю но 20 «- (ее)

Основание «І

КА ї

КЕ, Х нов 21 й - с ;» Основание

А ке

М т» уч (ее) в-х в, - 22 і-й Основание с Бу х ви о 23 ко

Олигомерьї, соответствующие настоящему изобретению, - зто полимерьі, содержащие одно или несколько во мономерньїх соединений, соответствующих настоящему изобретению, связанньїх таким образом, чтобь получился структурньій аналог ДНК или РНК. Олигомерь), соответствующие настоящему изобретению, содержат два или более нуклеомономеров и могут содержать практически любое количество нуклеомономеров, хотя удобнее синтезировать олигомерь! из 200 и менее нуклеомономеров. Соединения, описаннье формулами 1 - 23, можно соединять одно с другим через посредство связей 4-5, 3-5 и 2-5, как видно из формул 24 - А1. б5

І І о о о о. Основание Основание Основание о о н о о н

О-6-0 Огхр-О0 О-в-О0

Їй о Основаниє Основание Основаниє ' і но Н (о) Ї

І 24 24А 248

Нуклеотидньсе связи в соединениях, соответствующих настоящему изобретению, полученьі из аминокислот /5 серина и глицина или их производньїх. Олигонуклеотидь), соответствующие настоящему изобретению, стабильнь Іп мімо, устойчивь! по отношению к воздействию зндогенньїх нуклеаз и способнь! гибридизоваться с заданньми последовательностями нуклеотидов. Примерь соединений, соответствующих настоящему изобретению, представленьі формулами 24 - 41. Зти соединения конформационно более ограниченньі! по сравнению с фосфодизфирньми связями немодифицированньх ДНК или РНК. Зта конформационная ограниченность может бьіть одной из причин усиления способности зтих веществ, связьшваться с заданньми комплементарньми полинуклеотидньіми последовательностями; однако, применение настоящего изобретения не опирается на зту теорию усиления способности к связьіванию.

В другом воплощениий настоящего изобретения предложеньї модифицированнье олигонуклеотидьі или их производньюе, где фуранозная группа природного нуклеотида, например, ДНК или РНК, заменена сч аминокислотой/аминоспиртом и другими группами, в том числе аминокислотами с замещениями в определенньх позициях (формульї 25 - 41) . Межнуклеотиднье связи между соседними нуклеомономерами -зто (3 связи между позициями 4" и 5 соседних нуклеомономеров. Иньіми словами, фФфосфодизфирная межнуклеотидная связь или ее функциональньїй зквивалент соединяет 5'-позицию одного нуклеомономера с 4-позицией другого, как в соединениях, представленньїх формулами 24 - 33: о

І

9, ю ре -Основаниє у «- м о ко со

Онр-о ч о и «,Основание

Фе "4 й во ч 25А не с . ;» я

Основание м в К в

Овв-о (ее) 1 о - Основание о Го 258 м

КЕ, (Ф) Х Основание ко В. - у; 6о ос о в,

Основание

Кк, -

І т но б5 26А б в

Х Основание в. и

Н оо

В,

Основаниє

В, м б н 268 їх

Хо Основание ь н обо

Кк. Основание а ря 27А Га їі о рей Основание и

О дв, о-рно" о

І

КК», Основание - ни

І не с 278 «І

К,

Я, Основание кК У сновани « дво -

Ж с но-к и?» в Кк, в КУ, Основание

У нт ее; (ее) 28А -

Кк с 50 в в Основание м и й дв жк

НО в Кк, о В в Основаниє м ва !

Кк В, 60 288 65 ев,

Основание ке М 76

Кк в, В. фрееванне

В, р З в 29А ке, в |, Основание в; Кк, й

МА пд, в, р основоние

М

Я ів,

Кк 298 в, рі ), Основание се

М-ок , ' (о)

М т. нн

Ов, ос (ав) 296 ю ср «- о Кк, зе о Основание с /

Мн « охр-О Кк о в,

Х здоснование « х-М

ЩА з - с ЗОА ;» ме о Кк, у7Основанне х-М о Мт в «Основаниє со Х А

ХМ

-ь Х в с 50 о зав д повен

А ХМ

(Ф. /4 й в дк р 77 Основание / "в зос б5

В, дгоснованне

В; М х і в 95 о-р-о й ргоснованне

Кк, М

Кк то ЗА в ' о" Основание

В, М і в

Огр-О

І й о" Основание

В М

Кк зів в В, оду Основание 7. М Ге!

Ов (о)

НО-м в. в,

Основание е й о зо о в ю

З2А - в о Основание со й М «І х

А у, и но-м

За «

Основаниє

В, ай - с УА . "» 32в

Кк, ду ованне т- Ва м у в со Кк, Основание - ри с М, 1 В

ЗзЗА «2

Кк Основание / 59 в, М-к

М о В, Основание о ко /

В, М х їх бо зв б5 р ; ду снование хм

М п 9 вх ««Основаниє л

ХМ, к з3с

Где каждое "К" независимо от других - зто Н, ОН, 5Н, СМ, СНз, ОСНУз, ЗСНз3, ОМН», ОМН(СН»), РИ, -(СНо)х-Е; где "х"- зто 1 - 7 атомов углерода и "Е" - зто МН», 5Н, ОН, СООН, ОСНз3, ЗСНУ, РИ, МОН,

МОН(СНЗз), ЗМН»о, (О)МН», Б(ОХО)МН», СНз, РИ.

Где каждое "основание" независимо от других - зто нуклеозидное основание.

Где каждое "К/" независимо от других - зто Н, ОН, ЗН, СМ, СНз, ОСНз, ЗСНз3, ОМН»Ь, ОМН(СН»), РИ, -(СНо)х-Е; где "х"- зто 1 - 7 атомов углерода и "Е" - зто МН», 5Н, ОН, СООН, ОСНз3, ЗСНУ, РИ, МОН,

МОН(СНЗз), ЗМН»о, (О)МН», Б(ОХО)МН», СНз, РИ.

Где каждое "Ко" независимо от других - зто Н, ОН, ЗН, СМ, СНз, ОСНз, ЗСНз3, ОМН»Ь, ОМН(СН»), РИ, -(СНо)х-Е; где "х"- зто 1 - 7 атомов углерода и "Е" - зто МН», 5Н, ОН, СООН, ОСНз3, ЗСНУ, РИ, МОН, 20. МОонН(СНУ), 5МНо, Б(ОМН», Б(ОХОМН», СН, РА.

Где каждое "Ку" независимо от других - зто Н, ОН, ЗН, СМ, СНз, ОСНз3, ЗСНз3, ОМН»Ь, ОМН(СН»), РИ, -(СНо)х-Е; где "х"- зто 1 - 7 атомов углерода и "Е" - зто МН», 5Н, ОН, СООН, ОСНз3, ЗСНУ, РИ, МОН,

МОН(СНЗз), ЗМН»о, (О)МН», Б(ОХО)МН», СНз, РИ.

Где каждое "К/" независимо от других - зто Н, ОН, ЗН, СМ, СНз, ОСНз, ЗСНз3, ОМН»Ь, ОМН(СН»), РИ, с -(СНо)х-Е; где "х"- зто 1 - 7 атомов углерода и "Е" - зто МН», 5Н, ОН, СООН, ОСНз3, ЗСНУ, РИ, МОН, г)

МОН(СНЗ), ЗМН», (О)МН», Б(ОХО)МН»,; СНз, РА.

Где каждое "А" независимо от других - зто (СНо)х, СО, С5, 5, З(0), З3(0)(0), МН, МОН, МСН»з, МК» и зе, где "х"- зто 1 - 7 атомов углерода.

Где каждое "В" независимо от других - зто (СНо)х, СО, С5, 5, З(О), З(О) (0), МН, МОН, МОН», МК» и зе, где о "хи" - зто 1 - 7 атомов углерода. ю

Где каждое "Х" независимо от других - зто (СНо)х, СО, С5, 0, 5, З(О), 5(О) (0), МН, МОН, МОН», и МК», где "х"- зто 1 - 7 атомов углерода. --

Где каждое "7" независимо от других - зто (СНо)х, СО, С5, 5, З(0), З(О) (0), МН, МОН, МОН», и МК»б, где "х" со - зто 1 - 7 атомов углерода.

Зо Кв - зто Н, ОН, ОМе, СМ, МН, МОН, ОМСН», ОМН», зтил, пропил, низший алкил (1-73) , Ме, гетероалкил « (1-7С), арил(б-7С), -«СНО)ХЕ; где "х" -зто 1 - 7С и "Е" независимо от других - зто Н, ОН, ЗН, ОСН», СМ, ЗСН»,

ОМН», ОМН(СНз), ЗМН»о, Б(О)МН», Б(ОХООМН», СН»з, РИ.

Где каждое "М" независимо от других - зто аналог фосфодизфира, фосфоротисатьі, метилфосфонать, « фосфородитисать), борофосфонать), селенофосфонать, фосфорамидать, ацетамидат, оксиформамид, оксиацетамид, диизопропилсилил, карбамат, диметилен сульфид, диметилен сульфоксид, диметилен сульфон в) с и/или межнуклеозидная связь длиной в 2 - 4 атома из числа углерода, азота, кислорода, серьі и селена. "» Олигомер может осодержать от двух до двухсот мономеров, и даже больше. Предпочтительнье " модифицированнье межнуклеотидньсе связи "У" приведень в Таблице 1

Кроме того, соединения, описаннье зтими формулами, можно связать с одной или несколькими группами-коньюгатами. В число подходящих групп-коньюгатов входят О-холестерин, полизтиленгликоль, ве аминокислотьі, интеркаляторьї, расщепляющие группь! (например, имидазол), перекрестно-связьівающие о группь! (например, псорален), липидьї, пептидьї, алкилирующие агентьї, гидроксамать! и флуоресцентнье метки.

Группой-коньюгатом можно заместить независимо от других один из К, Ку, Ко, Кз, Ку и Кб. - Еще один вариант осуществления настоящего изобретения - зто олигомернье структурьі, представленнье (сло 50 формулами 34 - 36, и их производньеє: в, о г. -4 т Основание

Я (в;

Охр-О б В, е о ве 0 Основания юю па 6о т ЗА б5

І

"7 д--0 -Основене о) їхЯ о-р-о о

ЕЕ я Основание б Св ши

ЗАВ

Формула 34

Кк ут Основанив -к о

О-Р-о

Ов в- 7 Основание - ї зас ж се мМ (о)

Б; о м-- т Основанне ,'

Ге) (в; (ав) ! В, о

В, я фр ожкин - 4 о (ее)

ЗБА «І

Мо еВ Їх о їх 2 ю - снование З с Її в, ;» У. ве і --4Основание ру ї» г) Кк.

Я

(ее) з5В - в.

Мн Кз А Основание «2 /"

М

В

25 ХХ - Основание с ко зо бо

В соединениях, описанньїх формулами 34 - 36, связи между соседними нуклеомономерами - зто связи 3-5.

Где каждое "К" независимо от других - зто Н, ОН, 5Н, СМ, СНз, ОСНз, ЗСНз3, ОМН», ОМН(СН»), РИ, -(СНо)х-Е; где "х"- зто 1 - 7 атомов углерода и "Е" - зто МН», 5Н, ОН, СООН, ОСНз3, ЗСНУ, РИ, МОН,

МОН(СН»), МН», З(О)МН»о, З(ОХО)МН», СНз, РИ. 65 Где каждое "основание" независимо от других - зто нуклеозидное основание.

Где каждое "К/" независимо от других - зто Н, ОН, ЗН, СМ, СНз, ОСНз, ЗСНз3, ОМН»Ь, ОМН(СН»), РИ,

-(СНо)х-Е; где "х"- зто 1 - 7 атомов углерода и "Е" - зто МН», 5Н, ОН, СООН, ОСНз3, ЗСНУ, РИ, МОН,

МОН(СН»), МН», З(О)МН»о, З(ОХО)МН», СНз, РИ.

Где каждое "Ко" независимо от других - зто Н, ОН, 5Н, СМ, СНз, ОСНз, ЗСНЗ, ОМН», ОМН(СН»), РА, -(СНо)х-Е; где "х"- зто 1 - 7 атомов углерода и "Е" - зто МН», З5Н, "ОН, СООН, ОСН»з, 5СНз, РИ, МОН,

МОН(СН»), МН», З(О)МН»о, З(ОХО)МН», СНз, РИ.

МОН(СН»), МН», З(О)МН»о, З(ОХО)МН», СНз, РИ. 70 Где каждое "К/" независимо от других Н, ОН, ЗН, СМ, СНз, ОСН»з, ЗСНз, ОМН», ОМН(СН»), РИ, «СНао)х-Е; где "х" - зто 1 - 7 атомов углерода и "Е" - зто МН», ЗН, ОН, СООН, ОСН», СН», РИ, МОН, МОН(СН»), ЗМН»,

З(О)МН», (0) (О)МН», СНз, РА.

Где каждое "А" независимо от других - зто (СНо)х, СО, С5, 5, З3(0), (000), МН, МОН, МОН», МК» и зе, где "ж -зто 1-7.

Где каждое "В" независимо от других - зто (СНо)х, СО, С5, 5, 300), З(О)(0), МН, МОН, МОН», МК» и зе, где "ж -зто 1-7.

Где каждое "Х" независимо от других - зто (СНо)х, СО, С5, 0, 5, З(О), З(О) (0), МН, МОН, МОН», и МК», где "х" -зто 1-7.

Где каждое "у" независимо от других - зто (СНо)х, СО, С5, О, 5, З(О), З(О) (0), МН, МОН, МОН» и МК», где го 7х-зто1-.

Где каждое "7" независимо от других - зто (СНо)х, СО, С5, 5, З(О), З(О) (0), МН, МОН, МСН»з и МК, где "х" -3т01-7.

Кв - зто Н, ОН, ОМе, СМ, МН, МОН, ОМСН»з, ОМН», зтил, пропил, низший алкил (1-73), Ме, гетероалкил (1-7С), арил(б-7С), «СНО)ХЕ; где "х" -зто 1-7С и "Е" независимо от других - зто Н, ОН, 5Н, ОСН», СМ, ЗСН», сч дв ОМНо, ОМН(СНз), ЗМН», З(О)МНо, З(ОХО)МН», СН, РА.

Где каждое "М" независимо от других - зто аналог фосфодизфира, фосфоротисатьі, метилфосфонать, і) фосфородитисать!, борофосфонать!, селенофосфонать, фосфорамидать, и/или межнуклеозидная связь длиной в 2 - 4 атома из числа углерода, азота, кислорода, серьі и селена. Олигомер может содержать от двух до двухсот мономеров, и даже больше. Предпочтительнье модифицированнье межнуклеотиднье связи "М" о зо приведень! в Таблице 1.

Еще один вариант осуществления настоящего изобретения - зто олигомерьі, соответствующие формулам 37 о - 41, или их варианть. Зти олигомерьі содержат новье межнуклеотиднье связи - связи 2-5. Зти «- олигонуклеотидь! стабильнь! Іп мімо, более устойчивьі по отношению к воздействию зндогенньїх нуклеаз и способнь! гибридизоваться с заданньіми олигонуклеотидньіми последовательностями. со

Кк. - о снование

М

В -св ч в -

У с "еко . а

Кк,

Х каш б сю

Й Ге) ї» й і (ее) ЗА - 1 в, «2 )Є у

Основание

Кк, --

Кк Кк, 9, (Ф) / т АК, о о

Е во Х 7«Основание

КБ м

Кк Кк, 37 б5

КЕ,

Х о од -- снование в Кк,

Е, М ве то Ж "«Основание в Кк,

З8А

К,

В,

Основание

Е, М 7 Кк.

Кк, М

Кк,

В Основание с в" в. о з8в (ав) їх У Основание юю

В, ; ль -- с » вд; « оо з Основание к-ї ре х-М « 70 ЗОА щ - с з

Основание

ВА 2

М" т» Х- к

А їй « - У 2-- Основание с 20 В- р

Хх-М с Ж 398 в в -а«Основаниє 5) Кк ра

У

6о Ж в е,

М ут основане

М п 65 40А ж- Основание кое

ХМ

У ра

М

4 Основаниеє

В 77 х-ї 70 іі 408

В, а рих д

У в / Основание

М

Кк

АТА о се снование х р о х- М - Основаниеє зо | ра ою ке 418 -

Где каждое "К" независимо от других - зто Н, ОН, 5Н, СМ, СНз, ОСНз, ЗСНз, ОШ», ОБІН(СНЗ), РИ, «СНо)хХ-Е; 09 где "Х" - зто 1 - 7 атомов углерода и "Е" - зто МН», ЗН, ОН, СООН, ОСсН», СН», 5РИ, МОН, МОН(СН»), МН», «І

З(О)МН», (0) (О)МН», СНз, РА.

Где каждое "К/" независимо от других - зто Н, ОН, ЗН, СМ, СНз, ОСНз, ЗСНУ, ОШ», ОМН(СНЗ), РИ, « -(СНо)х-Е; где "Х" - зто 1 - 7 атомов углерода и "ЕЕ" - зто МН», ЗН, ОН, СООН, ОСН»5, 5СНз3, РИ, МОН,

МОНн(СН»), МН», Б(О)МН»Ь, Б(ОХО)МН», СНз, РА. - с Где каждое "Ко" независимо от других - зто Н, ОН, 5Н, СМ, СНз, ОСНз, ЗСНЗ, ОМН», ОМН(СН»), РА, а -(СНо)х-Е; где "Х" - зто 1 - 7 атомов углерода и "ЕЕ" - зто МН», ЗН, ОН, СООН, ОСН»5, 5СНз3, РИ, МОН, "» МОН(СН»), МН», З(О)МН», (0) (О)МН», СН», РИ.

Где каждое "Ку" независимо от других - зто Н, ОН, ЗН, СМ, СНз, ОСНз3, ЗСНз3, ОМН»Ь, ОМН(СН»), РИ, -(СНо)Х-Е; где "Х" - зто 1 - 7 атомов углерода и "ЕЕ" - зто МН», ЗН, ОН, СООН, ОСНз, 5СНз3, РИ, МОН, т» МОН(СН»), МН», З(О)МН»о, З(ОХО)МН», СНз, РИ. бо Где каждое "К/" независимо от других Н, ОН, ЗН, СМ, СНз, ОСН»з, ЗСНз, ОМН», ОМН(СН»), РИ, «СНао)х-Е; где "Х" - зто 1 - 7 атомов углерода и "Е" - зто МН», ЗН, ОН, СООН, ОСсН», ЗОН», ЗРИ, МОН, МОН(СН»), ЗМН», - 5(0О)МН», (0) (О)МН», СН»з, РИ. сл 50 Где каждое "А" независимо от других - зто (СНо)х, СО, С5, 5, З(0), З3(0)(0), МН, МОН, МСН»з, МК» и зе, где "х"- зто 1 - 7 атомов углерода. «2 Где каждое "В" независимо от других - зто (СНо)х, СО, С5, 5, З(0), З(0(О), МН, МОН, МОН», МЕ» и зе, где "Х" - зто 1 - 7 атомов углерода.

Где каждое "Х" независимо от других - зто (СНо)х, СО, С5, 0, 5, З(О), З(О) (0), МН, МОН, МОН», и МК», где "ХХ" - зто 1 - 7 атомов углерода. о Где каждое "7" независимо от других - зто (СНо)х, СО, С5, 5, З(О), З(О) (0), МН, МОН, МОН», и МК», где "х" - зто 1 - 7 атомов углерода. іме) Кв - зто Н, ОН, ОМе, СМ, МН, МОН, ОМСН», ОМН», зтил, пропил, низший алкил (1-7С), Ме, гетероалкил (1-73), арил(б6-7С), «СНо)ХЕ; где "х" - зто 1 - 7С и "Е" независимо от других - зто Н, ОН, 5Н, ОСН», СМ, ЗСН», 6о ОМНн», ОМН(СНУз), МН», 5(О)МНо, З(ОХО)МН», СНз, РИ.

Где каждое "М" независимо от других - зто аналог фосфодизфира, фосфоротисатьі, метилфосфонать, фосфородитисать!, борофосфонатьї, селенофосфонать!, фосфорамидать! и/или межнуклеозидная связь длиной в 2 - 4 атома из числа углерода, азота, кислорода, серб и селена. Олигомер может содержать от двух до двухсот мономеров, и даже больше. Предпочтительнье модифицированнье межнуклеотиднье связи "М" 65 приведень в Таблице 1.

Другие вариантьь осуществления настоящего изобретения предусматривают создание олигомера,

соответствующего следующей формуле (формула 42), и его мономерньїх составляющих (формульї! 85 - 90).

М в у зна й к ї зу 42А ї ї в

Кк в-х

У: 1 що и в іх к-х тд 428 с х-в і) йн ві «в) зів -м ою г, - во с еу 426 чІ . х-В о 72 Ки «

М в у - с хв ц о и?» х Кі ь

Кк у ат т. 426 (ее) шк хв о тої ва с в т н-є хв в ї в о ч о 42Е 60 б5 хв

Ге) ї

У

Вк н-н т хз о ї х

Кк 70 я

ДЕ где

Х ввібирают из группьі, состоящей из (СНо), где п - 1 - 3, СО(СНо)в, где п - 0-2 и (СНо)3О», где п - 1-2, т У ввнібирают из группьї, состоящей из СН», СО, СООН, С5 и 50». "У ввнібирают из группьі, состоящей из СН», СО, СООН, С5 и 50». 7 внібирают из группьї, состоящей из О, 5, МН и СН».

К вьібирают из группьї, состоящей из СНООН, СНОМН»о, СНОМНСНО, СОМН» и СООН.

В - зто нуклеозидное основание. сон бу

М в Кк ц с 85 о у: в й 1 ув ю д о. ; -х

Н - 86 с « ще -в ві « ше т с 87 ;» у х -В о

Її г. н

М со кв -х 88 1 Є хів о зе у в нн н 89

Ф) н ко нки х-в о 60 ї

Кк у 90 где бо Х ввібирают из группьі, состоящей из (СНо), где п - 1 - 3, СО(СНо)в, где п - 0-2 и (СНо)в50», где п - 1-2,

У ввнібирают из группьї, состоящей из СН», СО, СООН, С5 и 50». "У ввнібирают из группьі, состоящей из СН», СО, СООН, С5 и 50». 7 внібирают из группьї, состоящей из О, 5, МН и СН».

В - зто нуклеозидное основание.

Другой аспект настоящего изобретения - зто способьі лечения заболеваний за счет присутствия нуклеотидной последовательности, предусматривающие введение обьекту, нуждающемуся в таком лечении, упомянутьїх вьше модифицированньїх олигонуклеотидов, способньх специфически связьмшваться с /о последовательностью нуклеотидов, в количестве, необходимом для инактивации зтой последовательности нуклеотидов.

В олигонуклеотидах, соответствующих настоящему изобретению, хотя бьі одна из фосфодизфирньх групп, обозначенньїх "М" в формулах 24 - 41, замещена модифицированной межнуклеозидной связью из числа описанньх в настоящем документе. Желательно заместить цельй ряд фосфодизфирньїх связей 7/5 немодифицированного олигонуклеотида модифицированной межнуклеозидной связью; при желаний зто могут бьіть различнье модифицированнье межнуклеотиднье связи. В предпочтительньїх вариантах осуществления настоящего изобретения зти заместительнье связи не являются хиральньми, что усиливает способность олигонуклеотида гибридизоваться с заданной мишенью; однако, среди полезньїх соединений, соответствующих настоящему изобретению, есть и такие, в которьїх присутствуют хиральньсе связи.

Предпочтительнье модифицированнье межнуклеотиднье связи, обозначеннье в формулах "У", приведень в Таблице 1.

Таблица 1 -0- сч -5- -5(0)- (8) -5(0)(0)- -6е2е- -51- -с(0)- | «в) -с15,)- -МН- ІФ) -Мон- - -МСНз- -НЕ5- со -СН»- « - . и? щ» (ее) - 1 (42) іме) 60 б5

-0-сС85- -сн-0- -0-СНо-СНо- -сНн;-сСнН»-о- -СсСН-0О-СНо- -0-сно-о- -5-СНо- -сн.-8- -8-снН.-СНі- -СН.-СНо-5- -снІ-8-СНо- -8-СНо-5- -0-сно-8- -8-снН-0- -510)-СН;- -Сно-5(0)- -510)-СНо-СНа- -снНо-СНо-5(0)- -сН»-810)-СНа- -510)-сСН»-5(0)- -0-сн5-5(0)- -510)-СНІ-О -5(0)(0)-СН;- -СН2-5(0) (0) - -5(0)(0)-СНо-СН»- -сн.-СНо-5(0)(0)- сч зв сно-5(0) (0) -СН5- -8(0) (0)-СсН»-5(0) (0)- (о) о-сно-5(03 (0)- -810) (0)-СН-0- -58-8- -8в(0)-50)- (ав) -510) (0)-510)-(0;)- -ве-СВо- юю -Сно-5е- - -8е-СН»-СНо- -сн.-СсНІ-5е- (ее) -СН»-5е-СНо- з5 -Бе-СНо-8Зе- - -0-сн.-Зе- -5е-сСн)-0- -8е(03-С8- -СНо-8е(0)- « дю -5е(03-СНо-СНо- з -сН»-СНо-5е(0)- с -СНо-5е(0)-СНо- "» -Ве(0)-СН»-5е(0)- " -0-сСНо-5е(0)- -Бе(0)-СН»-0- -Бе(0) (0)-СН- їз -СНо-5е(0) (03- -Бе(0)(0)3-СсНо-С8о- (о) -сно-СНо-бе (0) (0)- а -Сно-5е(0) (0)-СН85- -8е(0) (0)-СНо-5е(0) (0)- «сл 50 -е-58е- «2

Ф) ко бо 65

-Бе(0)-бе(0)- -Бе(0) (0)-5е(0)-(0)- -0-СНо-5е(0) (0)- -ве(0) (03-СН»-0- -8-СН;-бБе- -Бе-СН-5- -5(0)-Сн.-5е(0)- -5е(0)-СН-8(0)- -84103 (0) -СНа-бе (0) (0) -

Я -Бе(0) (0) -СН2-5(0) (0)- -58-8- -510)-5(0)- -510) (0)-510) (0)- -5е-8е- -бе(0)-58е(0)- -бе(0)0)-5е(0)(0)- -М(В5)-СНо- -сна.-М(В5)- -М(В5) -СН.-СНо- -СНО-СНО-М(БЕ5) - -СН.-М(В5)-СНІ- -МК(85)-0- -0-М(В5)- -М(В5)-0о-СН- -сн.-0о-М(В5)- -сно-М(В5)-0- в -0-М(В5)-СТЬ- сч -0-СНа-М(Е5) - -М(В5)-СН»-О- о -М(В5)-5- -5-М(В5)- -М(В5)-5-СНе- о зо -сн-8-М(В5)- -сн.-Щ(В5) -5- ою -8-М(В5)-СНо- -5-СНО.-М(В5)- -- -М(Б5)-СНь-8- -М(В5)-85(0)- со -510)-К(В5)- « -Щ(В5)-5(03-СНо- -СН.-510)-М(Е5)- -СНО-М(В5)-510)- -5(0)-М(В5) -СНо- « -8(0)-сНо-М(В5) - -М(Ве)-СНо-5(0)- - с -М(В5)-550) (0)- й -5810)(0)-М(В5)- ;2 -М(В5)-5(0) (0)-СН5- -сСН.-510) (0) -М(В5) - -СНо-М(В5)-5 (0) (0)- 15 -Б(0) (0)-М(В5)-СН- о -5(0) (0) -СНУ-М(В5) - о -М(Е5)-СНо-5(0) (0) - -0-Щ(В5)-5- - -5-М(В5)-0- -0-м(В5)-510)- сло о «2 (Ф) ко 60 65

-5(0)-М(В5)-0- -0-М(Е5)-5(0) (03- -5(0) (0)-М(В5)-0- й -0-8-0- -0-8(0)-0- -0-8(0) (0)-0- -М(В5)-5-М(Б5) - -М(Б5)-5(0)-М(В5) - -М(В5)-5(0) (0) -М(В5)- -сН;-5-0- -сн2-5:190) -0- -сн»-5(0) (0)-0- -сн.-с(0)-0- -сн.-с(5)-0- -СНІ-М(Б5)-С2(0)-0- -СН.-М/(В5)-С(5)-0- -М(Вє)-С(0)-0-СтЬ- -Мм(Вв5)-С(5)-0-СН5- -0-с(0)-М(В5)-0- -0-с(8)-М(В5)-0- -0-0(0)-М(ВЕ5) -СНо- -0-с(535-М(В5)-СНо- -0-с(0)-СНо-М(В5) - -0-с(5)-сНо-М(В5)- -0-с(0)-сн3-0-М(Е5)- -0-с(8)-сН-О-М(В5)- сч -0-с(0)-М(В5) -0-СНо- 29 -0-С(5)-М(В5)-0-СН- о -0-М(85)-С(0) -0-СНо- -0-М(85)-С(5) -0-СНо- -сСНо-0-С(0)-М (В) -0- -сні-0-Сс(5)-М(В5)-0- о зо -сСНо-0-С (0) -М(В5)-СНо- -СНь-0-С (5) -М (Б5) -СНо- ІС о) -сні-0-С(0)-СНо-М(В5) - -СнНі-о-с(5)-СНо-М(В5) - -- -СНо-0-С(0)-К(В5)- со -СН»-0-С(5)-М(В5)- -сн.-0-с(0)-М(В5)-0- « -сН»-о-С(8)-М(85)-0- -сн»-о-М(В5)-С(0)-0- -сн».-о-М(В5)-С(5)-0- -сн»-М(В5)-с(0)-5- « -сн»-М(В5)-С(58)-5- -К(В5)-С(0)-8-СН»- о) с -К(В5)-с(5)-5-С85- . -8-С2(0)-М(В5)-0- «» -0-с(53-М(В5)-5- -8-0(0)-М(В5)-СНо- -8-0(8)-М(В5)-СНо- 15 -8-с0(0)-СНо-М(В8)- ть -8-с(8)-СН»-М (Ве) - со -8-С(0)-СН»-О-М (Ве) - -0-с(8)-СН»-5-М (Ве) - - -0-с2(03-М(В5)-5-СНо- -8-С(8)-К(В5)-0-С- 1 «2

Ф) ко бо б5

-5-М(В5)-2(0)-0-СНІ- -0-М(В5)-С(5)-5-СНо- -СН;-5-С2(0)-М(НК5)-0- -сн.-0-с(5)-М(В5)-5- -СН-5-С2(0) -М(В5) -СНо- -СН;-5-С(5)-М (Кв) -СНаі- -снНа-5-2(0)-СН.-М(В5) - -сн;-8-02(5)-СНО-М(К5) - -СНІ-5-С2 (0) -М(В5) - -сН;.-5-С(5)-М(В5)- -сСн;-5-С2(0)-М(В5)-0- -сн.-8-с(5)-М(В5)-0- -СН»-5-М(В5)-С2(0)-0- -сН.-5-М(8В5)-С(5) -0- -СН».-Оо-С10)-М(ВБ5)-5- -СНо-0-С(5)-М(В5) -5- -сСН;-О-М(В5)-С2(0)-5- -СсН-0-М(В5)-С(5)-5- -М(В5)-М(В5) - -М(Б5)-М(В5)-СНа- -СНО.-М(К5) -М(К5) - -М-С МН») -М(К5)- -М(В5) -М-С (МН) - -8410)-СНе-О- -0-сн.-5(0)- -8-СН(В5)-0- Га -08-с8 (Е5)-5- -0-сно-сНеСн- і) -5Б-СсН.-СН-СН- -5-СНІ-С-с- -М(К5)-СН2-М (ВК) - -М(В5)-2(0)-М(В5)- (ав) -М(В5)-С(5)-М(В5) - ю -М(ВК5)-С(0)-5- -М(В5)-С(5)-5- «- -М(В5)-С(5)-0- -М(85)-С2(0)-0- с -0-2(0)-М(Б5)- -0-с(8)-М(В85)- З -5-0(0)-М(В5)- -8-06(5)-М(К5) -

Кв - зто Н, ОН, ОМе, СМ, МН, МОН, ОМСН»з, ОМН», зтил, пропил, низший алкил (1-73), Ме, гетероалкил « 40. (1-73), арил(б-7С), «СНО)ХЕ; где "х" -зто 1-7С и "Е" независимо от других - зто Н, ОН, 5Н, ОСН», СМ, СН», - с ОоМН», ОМН(СНУз), ЗМН», З(О)МН»о, (ОХО)МН»о, СНз, РИ. Кроме того, к связи можно присоединить одну или а несколько групп-коньюгатов, чтобьі получить олигомерньій коньюгат. В число подходящих групп-коньюгатов ,» входят О-холестерин, полизтиленгликоль, аминокислотьї, интеркаляторьї, расщепляющие группь! (например, имидазол), перекрестно-связьівающие группь! (например, псорален), липидьі, пептидьї, алкилирующие агенть, гидроксамать! и флуоресцентнье метки. т» В число особо предпочтительньїх связей 4" - 5' входят фосфодизфир, фосфоротисатьі, метилфосфонать, со карбоксамид, тиокарбоксамид, гидроксамат, сульфонамид, гидроксиламин и карбамат. Зти же модификации предпочтительнь и в качестве связей 2-5'йи 3 - 5. -й Олигомерьі, соответствующие настоящему изобретению, не обязательно являются олигомерами с сл 50 однотипньЬІМи связями, они могут содержать чередующиеся или произвольно распределеннье связи, в том числе связи типа 2, 5. Поскольку олигомерь, соответствующие настоящему изобретению, можно 62 синтезировать, каждьй раз добавляя по одному остатку нуклеомономера, каждую отдельную связь, заместительную связь и каждьй отдельньй заместитель типа "основание" можно подобрать независимо от других, чтобьії получить олигонуклеотид с заданной последовательностью нуклеотидов.

Олигомерьі, соответствующие настоящему изобретению, могут содержать любое требуемое количество о заместительньїх связей. Зти заместительнье связи могут бьіть одинаковьми или различньіми в зависимости от избранного "М", кроме того, они могут бьіть отличньіми от "М", предусмотренньїх настоящим изобретением. іме) Поскольку сборка олигомеров происходит последовательно, можно использовать любое чередование типов связей, заместительньїх связей, оснований и модификаций сахара. 60 В предпочтительньїх вариантах осуществления настоящего изобретения заместительнье связи, соответствующие настоящему изобретению, чередуются регулярно. Например, за одной заместительной связью следуют две фосфодизфирнье связи, за которьіми следует одна заместительная связь, соответствующая настоящему изобретению, и т.д. Кроме зтого, возможно, например, такое чередование, когда за заместительной связью следует аналог фосфодизфира (например, тиоат и т.д.), за которьім следует 65 заместительная связь, соответствующая настоящему изобретению, за которой следует аналог фосфодизфира и т.д. те. в олигомере, соответствующем настоящему изобретению, могут Через одну чередоваться заместительнье связи двух типов. В олигомерах, соответствующих настоящему изобретению, в которьх присутствуют связи более чем одного типа, можно использовать любой регулярньй порядок чередования связей различньїх типов, соединяющих субьединиць олигомера.

Модификацию сахара можно вьіполнить в одном или нескольких остатках нуклеомономеров олигомеров, соответствующих настоящему изобретению, однако, при включений таких модификаций желательно использовать нуклеотидньюе связи 4-5, 3 - 5 и 2 - 5 между остатками аминокислот. В зтом случає для представления последовательности оснований аналога олигонуклеотида можно использовать дальнейшее сокращение. Например, обьічнье ДНК или РНК принято представлять в виде последовательности только 70 оснований, например АТО СОС ТОА. Как правило, заранее указьівают, чему соответствует обозначение: ДНК или РНК. В настоящем документе для представления аналогов олигонуклеотидов с данной последовательностью оснований использована соответствующая система обозначений.

Дополнительнье модификации нуклеомономеров

Олигомерьї, соответствующие настоящему изобретению, помимо заместительньх связей, соответствующих /5 настоящему изобретению, могут содержать различнье модификации. К дополнительньмм модификациям относятся олигомерьі, в которьїх () один или несколько нуклеомономерньїх остатков модифицировань! в позициях 2", 3, 4 и 5, (ІІ) содержится одна или несколько ковалентньїх перекрестно-связьівающих групп, (ІП) присутствуют другие, не предусмотреннье настоящим изобретением, связи, (Ім) содержатся другие аналоги оснований, такие как 8-оксо-МО-метиладенин и (М) присутствуют коньюгать, такие как интеркаляторь! или полилизин, которне, соответственно, повнішают аффинность связьтвания с последовательностями нуклейновой кислотьі-мишени или усиливают связь олигомера с клеткой.

Способность олигомеров, соответствующих настоящему изобретению, к специфическому связьшванию с последовательностями в Полинуклеотидах одно- и двухнитевьіїх мишеней совместима с дополнительньми модификациями. Зти дополнительнье модификации могут сообщать олигомерам и другие полезнье свойства, су 5 такие как устойчивость по отношению к расщеплению нуклеазами (например, в домене олигомера, соответствующего настоящему изобретению, содержащем фосфодизфирнье связи) или повьшенная і) способность к проникновению сквозь клеточнье мембрань! и т.д.

Олигомерь, соответствующие настоящему изобретению, могут содержать одну или несколько заместительньхх связей, таких как сульфиднье или сульфоновье связи (Веппег, 5.А., Международная ав! публикация Мо М/О 89/12060), сульфаматньсе связи (Международная публикация Мо УУО 91/15500), карбаматнье или другие заместительнье связи в олигомерах с морфолиновьми связями (Зйгспак, Е.Р. еї а! МисіеЇс Асіав о

Кез. 1989, 17, 6129 - 6141; Зуттепоп, ., ех а международная публикация Мо 216860) и родственньсе связи. ч

Таким образом, в число примеров олигомеров, соответствующих настоящему изобретению, входят олигомерь, в которьх (1) имеется хотя бьі одна заместительная связь и аминокислота, связанная с соседним со мМономером, (2) имеется одна или несколько заместительньх связей, не относящихся к настоящему «І изобретению, которую вьібирают из группьі, включающей фосфоротиоат, метилфосфонат и тионометилфосфонат, и/или (3) имеется одна или несколько фосфодизфирньїх связей и/или (4) содержатся аналоги пуринов или пиримидинов, повьішающие аффинность связьвания с о комплементарньми « последовательностями-мишенями. В число других примеров входят: (1) олигомер с заместительньіми связями, соответствующими настоящему изобретению, на конце 3 и/или 5' и фосфоротисатньми связями в других частях с олигомера; (2) олигомерьі с заместительньми связями, соответствующими настоящему изобретению, и й стандартньми пуриновьіми или пиримидиневьми основаниями (например, аденином, гуанином, цитозином, "» тимином или урацилом); (3) олигомерьї с заместительньми связями, соответствующими настоящему изобретению, и одним или несколькими основаниями, повьшающими аффинность связьвания или проникающую способность олигомера (например, 5-метилцитозином, 5(1-пропинил)уурацилом, «» 5-(1-пропинил)цитозином). В число примеров также входят олигомерьі, содержащие нуклеомономерньєе остатки, связаннье гидроксаматами. со Синтез олигомеров - Олигомерьі), соответствующие настоящему изобретению, можно собрать только из нуклеомономеров, соответствующих настоящему изобретению, или использовать при зтом и обьічнье нуклеомономерьі. Синтез і-й можно проводить в соответствии со стандартньми твердофазньми (или гомогенньми) технологиями синтеза о олигомеров, которье в настоящее время являются промьшленньми. В общем, синтез олигомеров, соответствующих настоящему изобретению, можно вьполнить в соответствии со способом, предусматривающим синтез нуклеомономера или синтона олигомера с протекторной группой, основанием и Ссоединительной огруппой, способной соединиться с нуклеомономером или олигомером; соединение нуклеомономера или ссинтона олигомера с нуклеомономером-акцептором или олигомером-акцептором; о удаление протекторной группьі; повторение цикла требуемое количество раз, пока не будет синтезирован ко нужньй олигомер.

Олигомерьї, соответствующие настоящему изобретению, могут иметь любую длину, в том числе и более 40, бо 50, 100, 200 или 500 нуклеомономеров. В общем, предпочтительнье олигомерь содержат 2 - 30 нуклеомономеров. Длинь от 8 до 20 нуклеомономеров и более могут бьіть полезньіми для терапевтического и диагностического применения, при условии, что зти олигомерьі имеют соответствующую последовательность оснований. Короткие олигомерь, содержащие 2, 3, 4 или 5 нуклеомономеров, включень в настоящее изобретение особо и могут бьіть использовань как синтонь. 65 Олигомерь! со случайньми последовательностями, содержащие 6, 7 или 8 нуклеомономеров, могут бьть использованьі в качестве затравок в технологиях клонирования или амплификации, в которьїх используются затравки со случайньми последовательностями, при условии, что олигомер содержит на 3-конце 1 или 2 остатка, которье могут служить затравкой для полимераз или обратньїх транскриптаз и иньім образом с полимеразами не взаймодействуют.

Помимо связей, впервьіе описанньїх в настоящем документе, олигомерьі, соответствующие настоящему изобретению, могут содержать обьічнье фосфодизфирнье связи или, помимо заместительньїх связей, соответствующих настоящему изобретению, могут содержать другие заместительнье связи, такие как фосфорамидатнье связи. В нейсчерпьівающий перечень зтих заместительньїх связей входят варианть, где группа, описанная формулой -О-Р(ОХ5)-О- ("фосфоротиоат"), -О-Р(О) (МЕ 277)-Х2, -О-Р(О) (К"7)-0-, -О-Р(5) 70. (87)-О- ("тионоалкилфосфонат"), -Р. (0) (089)-Х2, -0-С(0)-Х? или -0О-С(О) (МЕВ»17)-Х2-, где В! - зто Н (или соль) или алкил (1 - 12 атомов углерода, в том числе метил и зтил), а К - зто алкил (1 - 9 атомов углерода), и связь соединеньі с соседними нуклеомономерами Через -О- или -5-, соединеннье с углеродом нуклеомономера, а Х2 - зто О или 5. Фосфоротиоатнье и фосфодизфирнье связи хорошо известнь!. К заместительньїм связям, особенно предпочтительньі!м для применения в олигомерах, предложенньїх настоящим изобретением, относятся фосфодизфирньеєе, фосфоротисатньеє, метилфосфонатнье и тионометилфосфонатнье заместительнье связи. Фосфоротисоатнье и метилфосфонатнье заместительнье связи придают олигомеру большую стабильность и должнь! бьіть одинаковьіми. Особо предпочтительнь олигомерь, содержащие одну или несколько фосфоротиоатньх или метилфосфонатньїх заместительньмх связей.

Олигомерьі, предложеннье настоящим изобретением, и их фрагментьії можно синтезировать при помощи способов, известньїх специалистам. Способь синтеза, принятье в отрасли и описаннье в настоящем документе, могут бьть примененьй для синтеза олигомеров, содержащих заместительнье связи, соответствующие настоящему изобретению, а также другие связи и заместительнье связи, известнье в отрасли, из соответствующим образом защищенньх нуклеомономеров. Способь синтеза олигомеров с СМ фосфорсодержащими связями можно найти, например, в Егоепіег, В., еї аї!., МисієвЇс Асідз Кез., 1986, 14, 5399 - о 5467; Мисіеіс Асідз Кез., 1988. 16, 4831 - 4839; Мисіеовзідез 5 МисієоНаевз, 1987, 6, 287 - 291; Егоепіег, В.,

Тегапедгоп І ейв., 1986, 27, 5575 - 5578; Сагцші(йегв, М.Н. в ОІПІдодеохуписіеоїПдез Апіізепзе ІппІірШопв ої

Сепе Ехргезвіоп, 1989. 9.5.Сопеп, еапйог, СКС Ргезз, Воса Каїоп, р/ - 24; Кеезе, С.В. еї а), Теігапедгоп

Їенв., 1985, 26, 2245 - 2248. Синтез олигомеров с метилфосфонатньми связями при помощи («в») метилфосфонамидитной химии также описан в Адгауа!Ї, 5. еї аЇ., Темапеадгоп І ейв., 1987, 28, 3539 - 3542; ю

Кіет, К.Е., ех ам, Международная публикация Мо УУО 92/07864).

Олигомерьі), содержащие связи, предложеннье настоящим изобретением, удобно синтезировать путем -- приготовления димерньїх или тримерньїх соединений в жидкой фазе с последующим преобразованием синтона со в производное, которое включается в олигомер при помощи твердофазньх или жидкофазньїх процедур. Типичнье синтоньі - зто производньюе З3'-фосфоната или фосфорамидата, блокированнье на 5-конце при Ж помощи ЮОМТ или ММТ, приготовленнье стандартньіми способами. (саїї, М.). ед., ОПдописіеой де Зупіпевів; А

Ргасіїса! Арргоасі 1984, ІК. Ргезв, Ожхгога).

В число синтонов, включеньх в обьем настоящего изобретения, входят димерьі, тримерьї, тетрамернь, « гексамерьі и более длиннье олигомерьі), синтезированнье в твердой или жидкой фазе. Тримерь и более длиннье синтоньі могут содержать связи более чем одного типа. Зти синтоньі могут содержать любье т с основания из числа описанньїх вьіше и в позициях 2, 3, 4 и 5 могут содержать группьї, такие как ОН, ЮОМТО, ч ММТО, О-аллил, фосфат, фосфонат или амидит, как сказано вьіше. ни Рибозоамиднье олигонуклеотидь! можно синтезировать при помощи стандартной технологии твердофазного синтеза пептидов (химия Етос) (фиг. 26).

Блокирующие группь!ї для синтеза соединений, предложенньїх настоящим изобретением - 1. Соединительньсе группь! о К подходящим соединительньм группам относятся, например, Н-фосфонат, метилфосфонамидит или фосфорамидит. К подходящим фосфорамидитам относятся Д-цианзтилфосфорамидить! (которне являются - предпочтительньмми). Также можно использовать метилфосфонамидить!ї, алкилфосфонамидить! (в том числе с 20 зтилфосфонамидить! и пропилфосфонамидить!). Примерьї фосфорамидитов приведень на фиг. 1 - 21.

В число подходящих "соединительньїх групп" в позициях 2 3, 4 или 5 для синтеза олигомеров по с принципам химии фосфорамидит тризфира, назьваємьм здесь "амидитной" химией, входят

М,М-диизопропиламин-р-цианзтоксифосфин, М,М-диизопропиламин-метоксифосфин,

М,М-дизтиламин-цианзтоксифосфин и (М-морфолин)-метоксифосфин (Мооге, М.Р. еї аії, У Огд Спет., 1985, 5920, 22 2019-2025; ОзпапекІ А.МУ., еї а!ї, Тейгайедгоп Іейз., 1987, 28, 3401 - 3404; Віегдагде, К., еї аї, Мисі Асідв

ГФ) Кез., 1991, 19, 5843 - 5850; Бані, 0. 5иМиг Керогів, 1991, 11, 167 - 192). Для приготовления метилфосфонатов также Можно использовать родственнье соединительнье группь, такие как ді М,М-диизопропиламин-метил-фосфин или М,М-дизтиламин-метил-фосфин. Метилфосфонатнье олигомерь удобно синтезировать при помощи соединительньх групп, таких как 60 М,М-диизопропиламин-метилфосфорамидит. Синтез нуклеомономерньх амидитов, соответствующих настоящему изобретению, можно вьіполнить стандартньми способами (например, Сгуагпому, 5.М., еї аї, Мисі

Асідз Кев., 1992, 20, 1879 - 1882; МіІпауак, К., еї аїЇ, Мисі Асідз Кез., 1992, 20, 1265 - 1269; 5іІпра, М.О., еї а, Мисі Асіаз ОКез., 1984, 12, 4539 - 4557 и другие ссьілки, приведенньєе здесь). 2. Протекторнье группь! бо Для предохранения зкзоциклического азота гетероциклов цитозина, аденина или гуанина можно использовать такие протекторнье группьі как диизобутилформамидин, бензоил, изобутирил, ЕМОС, диалкилформамидин, диалкилацетамидин или другие группьі, известнье специалистам. Цитидин можно непосредственно включать в олигомерь! без протекторной группьї на зкзоциклическом азоте в соответствий с описанньми способами (Сгуагпом, 5.М., ей аї, У Атег Спему. Бос., 1991, 113, 5876 - 5877; сгуагпом, 5.М., еї аї, Мисі Асіаз Кез., 1992, 20, 1879 - 1882; Кипа, Р.-Р. е( а), Темігапеадгоп І ек5., 1992, 33 , 5869 - 5872).

К подходящим протекторньім группам относятся ОМТ (диметокситритил), В2 (бензоил), Ви (изобутирил), феноксиацетил, ММТ (монометокситритил) или ЕМОС на 5-конце и/или Н-фосфонат, метилфосфорамидит, метилфосфонамидит, рд-цианзтилфосфорамидит, тво (трет-бутилдиметилсилил) или ТвВОРБ 70 (трет-бутилдифенилсилил) на 3'-конце.

Предпочтительньми являются протекторнье группьі В; (бензоийл), ЮОМТ (диметокситритил), ММТ (монометокситритил) или ЕМОС на 5-конце или в 5-позиции и/или ТВ5, Н-фосфонат, метилфосфорамидит, метилфосфонамидит, ВД-цианзтилфосфорамидит на 3'-конце. Однако, при необходимости позиции блокирующих групп можно изменить (например, присоединить фосфорамидит в позиции 5, а ОМТ в позиции 3). В общем, 75 производнье от олигомеров, соответствующих настоящему изобретению, и таких "бСлокирующих групп" можно получить известньіми в данной области способами, как видно из соответствующих формул.

Коньюгать!

Настоящее изобретение предусматривает и "коньюгать" к олигомерам, соответствующим настоящему изобретению. Коньюгатьй ок обьчньм олигомерам известньь специалистам. Например, олигомерь, соответствующие настоящему изобретению, можно соединить ковалентной связью с различньми группами, например, с интеркаляторами или соединениями, взаимодействующими специфически с малой бороздкой двойной спирали ДНК. Возможна коньюгация олигомеров и с другими группами, среди которьх метки (например, радисактивнье, флуоресцентнье, ферментньсе) или группьії, облегчающие соединение с клеткой за счет присутствия в них расщепляемьх линкеров, и т.д. К подходящим радисактивньм меткам Ге! относятся ЗР, 358, ЗН, 191) и 142; к подходящим флуоресцентньм меткам относятся флуоресцеин, резоруфин, о родамин, ВОСІРМ (Моіесціаг Ргобез) и техасский красньій; к подходящим ферментньм меткам относятся щелочная фосфатаза и пероксидаза из хрена. В качестве ковалентно присоединенньїх групп можно использовать и другие соединения: биотин, антитела или фрагментьй антител, асиалогликопротеийн, трансферрин и ТаЇ-белок ВИЧ. о

От зтих добавочньїх групп можно получить производнье при помощи любьїх подходящих групп. Например, ю интеркаляторьї, такие как акридин и псорален, можно связать с олигомерами, соответствующими настоящему изобретению, при помощи любого имеющегося -ОН или -ЗН, например, в 5'-конечной позиции олигомера, «- 2-позиции РНК, или через ОН, МН», СООН или 5Н, содержащиеся в 5-позиций пиримидинов. Удобнь! со производнье формьі, содержащие, например, СНЬСНЬСНЬОН или СНОСНЬСНОЗН, в 5 позиции пиримидинов. Коньюгать, в числе которьїх полилизин или лизин, приготовляемье описанньми способами, повьішают « аффинность связьівания олигомера с заданной последовательностью нуклеийновой кислоть! (І етайге, М. еї аї.,

Рос Маї! Асай 5сі. ОБА, 1987, 84, 648 - 652; І ета ге, М. еї аї., Мисіеовідез 8: МисіеоП дез, 1987, 6, 311 - 315).

Можно присоединять различнье заместители, в том числе те, что связань! связями или заместительньіми « связями. Группьі -ОН в олигомерах можно заместить фосфатньми группами, защитить стандартньми протекторньіми группами, соединить с соединительньіми группами для образования дополнительньїх связей с о, с другими нуклеомономерами или связать с коньюгированньм заместителем. Группу -ОН на 5-конце можно "» фосфорилировать; 2-ОН или заместители ОН на 3-конце также могут бьіть фосфорилировань. От гидроксилов " можно также получить производнье при помощи стандартньх протекторньїх групп. Олигомерь, соответствующие настоящему изобретению, можно связать ковалентной связью с группами, облегчающими соединение с клеткой за счет присутствия в них расщепляемьїх линкеров. В число подходящих коньюгатов ве входят также твердье подложки для синтеза олигомеров и облегчения определения последовательности о нуклеотидов в нуклейновой кислоте. Неисчерпьвающий перечень твердьїх подложек включаєт силикагель, пористое стекло, полистирол и магнитнье стекляннье шарики. - Модификации сахара с 50 Производньсе могут бьіть получень! за счет замещений на сахарах. В числе предпочтительньїх производньх олигомеров, соответствующих настоящему изобретению, 2-О-аллил и 3-аллил, которьше увеличивают «2 проникающую способность и устойчивость к воздействию нуклеаз, но не уменьшают аффинность олигомера к одно- или двухнитевьім мишеням. В частности, в олигонуклеотидь! с рибозоамидньіми скелетами можно вводить различнье функциональньсе группь! (в позиции 1", 2", 3,4 и 5 рибозьї) для улучшения фармакокинетических 2о свойств соответствующих олигонуклеотидов.

Ге! Заместительнье связи

Олигомерьї, предложеннье настоящим изобретением, помимо описанньїх в настоящем документе связей 2 - де 5,3 - 5 и 4 - 5, могут содержать одну или несколько "заместительньїх связей", известньїх специалистам. В число зтих "заместительньїх связей" входят фосфоротисоат, метилфосфонат, тионометилфосфонат, 60 фосфородитисат, алкилфосфонать!, морфолин сульфамид, боранофосфат (-0О-Р (ОСН») (ВНз)-О-), силоксан (0-81 (Х7) (ХУ) -0-); Х7 - зто алкил с 1 - б атомами углерода или фенил) и фосфорамидат (метоксизтиламин (-О-Р (ОСНЬСНЬОСН») (0)-0-) и т.д., которне синтезируются, как описано в общедоступной литературе, в том числе в следующих работах (Зосд, А., еї а 9). Ат. Спет. Зос., 1990, 112, 9000 - 9001; УМО 91/08213; МО 90/15065; УМО 91/15500; ЗйЦгспак, Е.Р. еїг аІ МисіеІіс Асід Кев., 1989, 17, 6129 - 6141; патент США 5034506, бо патент США 5142047; Нем/Ій, У.М. еї а, Мисіеозідев 8: Мисієой дев, 1992, 11, 1661 - 1666; Зцітепоп, у еї аї;

Международная публикация Мо 216860). К заместительньм связям, которье могут бьіть использовань! в олигомерах, описанньх в настоящем документе, также относятся сульфонамид (0-5О 2-МН), сульфид (-СнНо-5-СН»), сульфонат (-0-5О»-СН»о), карбамат (0-С(0)-МН-, -МН-С(0)-0-), диметилгидразин (-СНо-МСНз-) , сульфамат (-0-5(0)(0)-М-, -М-5(О0)(0)-М-), З-амин (-МН-СНо-) , М-метилгидроксиламин (-СНо-МСНз-О-) и 25і-связи (такие как 2,5 карбамат (2-М(Н)-С(0)-0-5), 5,2 карбамат (2-0-С(0)-М(Н)-5), 5,2 метилкарбамат (2-0-С (0)-М (СНз) -5) и 5,2 тиоформацеталь (2-0О-СН.О-5-5)00 Кроме того, в качестве заместительньїх связей приемлемь! амиднье связи, описаннье авторами Виспагаї, о. еї а), (Международная публикация Мо МО 92/20702), и Соок, Р.О. еї а! (Международная публикация Мо М/О 92/20822), Ое Мезтаекег, А. 7/0 еГаї., (Международная публикация Мо МО 92/20823 и в РСТ/О5З92/04294.

Если не указано иное, заместительньсе связи, такие как формацеталь -0О-СНо-О-, присоединяются к углероду 4, З или 2" нуклеомономера слева, а к углероду 5 нуклеономера справа. Обозначения 4", 3,2 или 5' можно соответствующим образом изменить, если к нуклеомономеру присоединяется структура, отличная от рибозь, дезоксирибозьії или арабинозь. К таким структурам относится ксилоза, гексоза, морфолиновое кольцо, 7/5 углеводородное кольцо (например, циклопентан) и др.

Применение карбаматньх, карбонатньх, сульфидньх, сульфоксидньх, сульфоновьїх,

М-метилгидроксиламиновьїх и диметилгидразиновьїх связей в синтонах или олигомерах бьіло описано (Магзечг, 9-9. еї аїЇ, 9У. Атег. Спет. Бос., 1992, 114, 4006 - 4007; М/о 89/12060; МивісКіІ, В. еї а), У Огд Спет., 1990, 55, 4231 - 4233; Кеупоїдв, К.С. еї аІ., У Огд Спет., 1992, 57, 2983 - 2985; Мепез, М.Р., еї а! ) Меа. Спет,., 1969, 12, 154 - 157; Мипоаї!Ї, М/.5., еї аії, 9 Огд Спет., 1977, 42, 703 - 706; 5йНгспак, ЕР. еї аЇ 9У Ога

Спет., 1987, 52, 4202 - 4206; УМУапо, Н., еї аЇ, Темйгапедгоп І ейв., 1991, 32, 7385 - 7388; Международная заявка Мо РСТ ОБО1/03680).

Заместительнье связи включают в олигомерьі для решения ряда задач: дальнейшего облегчения связьвания с комплементарной последовательностью нуклеийновой кислотьі-мишени и/или повьішения с об устойчивости олигомеров к воздействию нуклеаз.

Основания і)

В число оснований, которне можно использовать как основания нуклеотидов в соединениях, предложенньх настоящим изобретением, входят не только природнье пуриновье и пиримидиновье основания, но и аналоги затих гетероциклических оснований и их таутомерьі. К таким аналогам относятся алкилированнье пуринь! или о зо пиримидинь, ацилированнье пуриньї или пиримидинь или другие гетероцикль!. Зти "аналогичнье пуринам" или "аналогичнье пиримидинам" соединения, или аналоги пуринов или пиримидинов, хорошо известнь юю специалистам, а некоторье из них применяются в качестве лекарственньїх средств. Их нейсчерпьівающий «- перечень включаєет ММ" -зтанцитозин, 7-деазаксантозин, 7-деазагуанозин, 8-оксо-МУ-метиладенин, 4-ацетилцитозин, 5-(карбоксигидроксиметил)урацил, 5-фторурацил, 5-бромурацил, со

Б-карбоксиметиламинометил-2-тисурацил, инозин, М'У-изопентениладенин, 1-метиладенин, 2-метилгуанин, «Ф 5-метилцитозин, Мб-метиладенин, 7-метилгуанин, 5-метиламинометилурацил, 5-метоксиаминометил-2-тисурацил, 2-тисурацил, 4-тисурацил, 5-(1-пропинил)-4-тисурацил, 5-(1-пропинил)-2-тисурацил, 5-(1-пропинил)-2-т-иоцитозин, 2-тиоцитозин и 2,6-диаминопурин. Кроме зтих « аналогов оснований, в олигомерь, предложеннье настоящим изобретением, можно включать аналоги пиримидинов - к которьім относятся б-азацитозин, б6-азатимидин и 5-трифторметилурацил, описаннье у Соок, т с О.Р., еї аії, в международной публикации Мо УМО 92/02258, включенной в настоящий документ посредством в СсЬІЛКИ. -» Включение 4-тисуридина и 2-тиотимидина в олигомерь описано (МІКІОгоУ, Т.Т., еї аїЇ, Теігапеадгоп І ейв., 1992, 33., 2379 - 2382; СІміо, Р., ей аЇ, Тейапейгоп іейв., 1992, 33: 65 - 68; МіІКМОгомМ, Т.Т., еї аї, ТХемапедтоп І енв., 1991, 32: 2505 - 2508; Хи, У.7., ей аІ Тейгапедгоп І ейв.,, 1991, 32: 2817 - 2820; СІМІо, ї Р., еї аї, Тейапедгоп Іенв5в., 1992, 33: 69 - 72; СоппоПуУ, В.А., ей аЇ, МисіІ. Асійа Кев., 1989, 17, 4957 - о 4974). В число предпочтительньїх оснований входят: аденин, гуанин, тимин, урацил, цитозин, 5-метилцитозин, 5-(1-пропинил) урацил, 5-(1-пропинил)цитозин, 8-оксо-М5-метиладенин, 7-деаза-7-метилгуанин, - 7-деаза-7-метиладенин и 7-деазаксантозин. с 50 Ковалентне связьвающая группа

В некоторье олигомерьі, соответствующие настоящему изобретению, включаєется группа, способная о образовать хотя бьі одну ковалентную связь между олигомером и двойной нитью нуклеийновой кислоть.

Множественнье ковалентнье связи могут бьїть образованьй за счет включения ряда таких перекрестно связьвающих групп. В предпочтительном случаеє в ковалентной связи участвует остаток основания нити 22 мишени, но могут участвовать и другие ее фрагменть, например, сахаридьь или фосфодизфирь!.

Ф! Функциональньйй характер группьї, осуществляющей перекрестное связьивание, определяет и ее мишень в двойной нити. В число предпочтительньх перекрестно-связьівающих групп входят ацилирующие и о алкилирующие агенть, в частности, те, которье располагаются по отношению к части, обеспечивающей специфичность, таким образом, что не препятствуют реакции с мишенью в нити нуклеийновой кислоть. 60 Понятно, что гетероцикл - зто не обязательно пурин или пиримидин, а псевдооснование, к которому присоединяется функциональная группа, - совсем не обязательно гетероцикл. Приемлемо любое средство присоединения функциональной группьї, если ее расположение правильно.

Полярность олигомеров.

В самом общем виде символ 3'---5 обозначает олигомерную цепь, в которой все связи образованьі между бо гидроксилом позиции 5' аминокислотного остатка нуклеомономера слева и гидроксилом позиции 3' (позиции 2"

для олигомеров со связями 2 - 5 и «4 для олигомеров со связями 4 - 5) аминокислотного остатка нуклеомономера справа (те., область однородной полярности), а гидроксил 5-позиции аминокислотного остатка крайнего правого нуклеомономера остается свободньм для дальнейшего связьівания. Подобньм образом, символ 5---3 обозначает олигомерную цепь противоположной ориентации, где связи образовань между гидроксилом позиции 3 аминокислотного остатка левого нуклеомономера и гидроксилом позиции 5' аминокислотного остатка правого нуклеомономера, и гидроксил позиции 3 крайнего правого нуклеомономера остается свободньїм для дальнейшего связьвания. Зто верно и для олигомерньїх цепей 5'----4.

Фармацевтически приемлемьсе соли 70 Настоящее изобретение предусматриваєт также различнье соли всех соединений, описанньїх в настоящем документе, в том числе соли, приемлемье с фармацевтической точки зрения для введения животнь!м и людям.

Фармацевтически приемлемье соли и вещества, их образующие, хорошо известньії специалистам. В предпочтительном случае зто соли олигомеров, предложенньх настоящим изобретением, и аммония и металлов, например, щелочньїх или щелочноземельньїх металлов: натрия, калия, магния или кальция; легко 7/5 Кристаллизующиеся соли аммония, полученнье при реакции с аммиаком или органическими аминами, такими как моно-, ди- или три- низшие (алкил, циклоалкил или гидроксиалкил)-амидьі, низшие алкилендиаминь!ї или низшие (гидроксиалкил или арилалкил)-алюиламмонийнье основания, например, метиламин, дизтиламин, тризтиламин, дициклогексиламин, тризтаноламин, зтилендиамин, трис-(гидроксиметил)-аминометан или бензилтриметиламмония гидроксид. Олигомерь, соответствующие настоящему изобретению, могут Образовьвать соли и с кислотами; предпочтительно, зто соли терапевтически приемлемьїх неорганических и органических кислот, таких как сильнье неорганические кислотьії, например, гидрофильнье: соляная, бромистоводородная, серная, фосфорная, -алифатические или ароматические карбоновье или сульфоновье кислоть!: муравьиная, уксусная, пропионовая, янтарная, гликолевая, молочная, яблочная, винная, глюконовая, лимонная, аскорбиновая, малеиновая, фумариновая, гидроксималеиновая, пировиноградная, фенилуксусная, с бензойная, 4-аминобензойная, антраниловая, 4-гидроксибензойная, салициловая, 4-аминосалициловая, метансульфоновая, зтансульфоновая, гидроксизтансульфоновая, бензолсульфоновая, сульфаниловая или і) циклогексилсульфамовая и т.д.

Терапевтический зффект и применение

Поскольку олигомерь), предложеннье настоящим изобретением, обладают значительной связьівающей о зо активностью по отношению к одно- и двухнитевьім нуклейновьім кислотам-мишеням и образуют устойчивье двойнье, тройнье и другие структурь с природньми полинуклеотидами и их структурньми аналогами, о олигомерьі, предложеннье настоящим изобретением, могут бьїть использованьі в большинстве процессов, в «- которьїх используются обьічнье олигомерь!. Так, олигомерьі, соответствующие настоящему изобретению, могут бьїть использованьі, например, как зондь! гибридизации полинуклеотидов, затравки для полимеразной цепной со з5 реакции и подобньїх циклических реакций амплификации, затравки для секвенирования и др. Олигомерь, «г предложеннье настоящим изобретением, также могут бьть использованьь для диагностики и лечения заболеваний. Терапевтическое применение олигомеров, соответствующих настоящему изобретению, предусматриваєт специфическое подавление зкспрессии генов (или подавление трансляции последовательностей РНК, закодированньх зтими генами), связанньїх с возникновением и развитием « патоплогических состояний, при помощи антисмьісловьх олигомеров. Олигомерь!, соответствующие настоящему /- с изобретению, могут бьіть использовань! для опосредования антисмьіслового подавления целого ряда генньїх мишеней. Примерами генов или РНК, закодированньх зтими генами, которье могут бьть мишенями ;» антисмьслового подавления при помощи олигомеров, могут служить гень/РНК, кодирующие ферменти, гормоньії, сьівороточнье белки, трансмембраннье белки, адгезионнье молекуль! (ГЕА-1, (ЗРІЇБЛИа, ЕГАМ-1, 45. МАСМ-1, ІСАМ-1, Е-зеіесіоп и т.д.), молекуль! рецепторов, в том числе цитокиновьхх рецепторов, цитокинь! (1І--1, їх І/-2, 1-3, 1-4, 1/-6 и др.), онкогеньії, факторь! роста и интерлейкиньі. Зти геньії или РНК могут бьїть связань с любьми патологическими состояниями, вьізванньми воспалением, сердечно-сосудистьми заболеваниями, со иммунньїми реакциями, раком, вирусньіми инфекциями, бактериальньми инфекциями, грибковьіми инфекциями, - паразитарньіїми инвазиями и др.

Олигомерьі, предложеннье настоящим изобретением, пригоднь! для терапевтического применения как Іп о мімо, так и ех мімо. К показаниям для применения ех мімо относится необходимость обработки клеток, таких как о костНньІй мозг или периферийная кровь, при таких состояниях как лейкоз (хронический миелолейкоз, острьй лимфолейкоз) или вирусная инфекция. К генам или РНК, кодируемь!м зтими генами, которье могут служить мишенями при лечении рака, относятся онкогень!і, такие как газ, К-газ, рсІ-2, с-туб, рег, с-тус, с-абі, или в бверхсинтезированнье последовательности, такие как тата, онкостатин М, 1-6 (саркома Капоши), НЕК-2, и транслокации, такие как рег-арі. Подходящими мишенями являются также вируснье генньіе последовательности (Ф, или РНК, закодированнье соответствующими генами, такие как геньі полимераз или обратньїх транскриптаз ка герпетических вирусов, таких как цитомегаловирус и вирусь! простого герпеса 1 и 2; ретровирусов, таких как вирус человеческого Т-клеточного лейкоза-1, ВИЧ-1, ВИЧ-2; или других ДНК-или РНК-вирусов, таких как НВУ, бо НРМ, МАМ, вирус гриппа, аденовирусьі, флавивирусь, риновирус и др.

Специфически связьвающиеся оолигомерь могут бьть использованьь в сочетаний с другими терапевтическими средствами. К другим областям терапевтического применения олигомеров, предложенньх настоящим изобретением, относятся (1) модуляция воспалительньїх реакций за счет модуляции зкспрессий генов, таких как геньі рецептора 1-1, П-1ІСАМ или Е-Зеїесіоп, которье играют определенную роль в 65 опосредованиий воспаления (2) модуляция пролиферации клеток в таких состояниях как закупорка артерий (рестеноз) после ангиопластики за счет модуляции зкспреосии (а) факторов роста или деления клеток, таких как немьішечньій миозин, тус, ох, РОМА, РОСЕ или БОБ или их рецепторов или (Б) факторов пролиферации клеток, таких как с-тур. При лечений псориаза и других состояний мишенями могут служить другие факторь пролиферации или факторьі передачи сигналов, такие как ТОЕх, ІІ -6, дІМЕ, протеин киназа С, тирозин киназь! (такие как р210 и р190). Кроме того, при аутоиммунньїх заболеваниях мишенями могут служить аллели главного комплекса гистосовместимости, ТОРа или рецептора ЕСЕ.

Зффективность доставки олигомеров, предложенньїх настоящим изобретением, в клетки можно повьісить любьм подходящим способом, в том числе путем трансфекции при помощи о фосфата кальция, диметилсульфоксида, глицерина или декстрана, путем злектропорации или при помощи катионньх, анионньмх 7/0 Мімли нейтральньх липидньх соединений или липосом, как описано в международньх публикациях Мо УУО 90/14074, МО 91/16024, МО 91/17424 и в патенте США 4897355. Олигомерь! можно вводить в клетки в виде комплексов с катионньіми липидами, такими как СОТМА (которье могут образовьівать липосомь или не образовьшвать их); введенньй комплекс затем взаймодействуеєт с клеткой. В неийсчерпьвающий перечень приемлемьїх катионньїх липидов входят М-(2,3-ди(9-(7)-октадеценилоксил))-проп-1-ил-М,М,М-триметиламмоний 7/5 (БОТМА) и его соли, 1-О-олейл-2-О-олейл-3-диметиламинопропил-рД-гидроксизтиламмоний и его соли и 2,2-бис(олеилокси)-3--'триметиламмоний)пропан и его соли. Повьісить зффективность доставки олигомеров, предложенньїх настоящим изобретением, можно также при помощи (ї) вирусов, таких как вирус Сендай (Вагілаїй,

К., ВіІоїесппо! Аррі Віоспет., 1989, 11, 133 - 135) или аденовирус (У/адпег, Е. еї аЇ, Ргос Май! Асай 5сіІ. О5А, 1992, 89, 6099 - 6013); (ІЇ) полиаминньїх или поликатионньїх коньюгатов, таких как полилизин, протамин или Ма,

Мі2-впс(зтил)спермин (Ууадпег, Е. еї аіЇ, Ргос Май Асад зЗсі. ОА, 1991, 88, 4255 - 4259; гепке, М., еї аї,

Ргос Май Асай 5сі. ОБА, 1990, 87, 3655 - 3659; Спапк, В.К., еї аі, Віоспет Віорпуз Кез Соттип., 1988, 157, 264 - 270; Патент США 5138045); (Ії) липополиаминньїх комплексов с такими соединениями, как липоспермин (Вепг, 9.-Р. еї а), Ргос Май Асай сі. ОБА, 1989, 86, 6982 - 6986; ІоеШег, 9.Р., ей аї, 9. Меигоспет., 1990, 54, 1812 - 1815); (Ім) анионньїх, нейтральньїх или чувствительньїх к рН липидов, с использованием с Ссоединений, в число которьїх входят анионнь фосфолипидь!і, такие как фосфатидилглицерин, кардиолипин, фосфатидная кислота или фосфатидилотаноламин (І ее, К.-О. е( аі, Віоспет Віорпуз АСТА, 1992, 1103, 185 - і) 197; Спедааг, 0. еї аіЇ, Агспй Віоспет Віорпуз, 1992, 294, 188 - 192; МовзпІтига, Т., еї аЇ, Віоспет Іпі., 1990, 20, 697 - 706); (М) коньюгации с такими соединениями, как трансферрин или биотин, или (мі) коньюгации с белками (в том числе альбумином или антителами), гликопротеинами или полимерами (в том числе, «з полизтиленгликолем), которне улучшают фармакокинетические свойства олигомеров, о которьїх идет речь. В настоящем документе под трансфекцией подразумевается любой способ, приемлемьй для доставки о олигомеров в клетки. Любое вещество, такое как липид, или любой агент, такой как вирус, которьій может бьть - де использован для осуществления трансфекции, в общем случає мь! будем назьвать "агентом, повнішающим проникающую способность". Доставка олигомеров в клетки может бьть осуществлена посредством со Котрансфекции с другими нуклеийновьіми кислотами, такими как (ії) зкспрессируемье фрагменть ДНК, «ф кодирующие белок/белки или фрагмент белка, или (її) транслируемье РНК, кодирующие белок/белки или фрагменть! белка.

Таким образом, олигомерь, предложеннье настоящим изобретением, могут бьть включень в любой подходящий состав, повнішающий зффективность их доставки в клетки. К подходящим фармацевтическим « составам относятся также те, которніе обьічно используются, когда доставка соединения в клетки или ткани 8 с происходит за счет наружного применения состава. В препаратах для наружного применения, содержащих й олигомерь, могут бьть использованьь такие соединения как полизтиленгликоль, пропиленгликоль, азон, "» ноноксил-9, олеиновая кислота, диметилсульфоксид, полиаминь!ї или липополиаминь.

Олигомерьії, предложеннье настоящим изобретением, удобно использовать как реактивь! для анализа или приготовления соединений, когда необходимо подавление зкспрессии генов. В настоящее время существуєт ї» очень немного реактивов, которье за счет какого-либо механизма зффективно и специфично подавляли бьї зкспрессию заданного гена. Олигомерьі, о которьїх сособщали, что они подавляют зкспрессию заданного гена, бо часто давали неспецифические зффектьї и/или не подавляли зкспрессию заданного гена в достаточной степени - (до менее, чем 4095 от неингибированного уровня).

Таким образом, олигомерьї, описаннье в настоящем документе, представляют собой реактивь, которье і-й можно использовать для подавления зкспрессии определенного белка или белков в организме-обьекте или в о клетках, где белки кодируются последовательностями ДНК и транслируются с последовательностей РНК, в соответствии со способами, предусматривающими: введение олигомера, соответствующего настоящему изобретению, в клетки; создание условий, при которьіїх олигомер образует двойную или тройную структуру с

ДНК или РНК и тем самьм подавляєт зкспрессию белка или белков. Способь! и соединения, предложеннье настоящим изобретением, пригодньі для модуляции зкспрессии генов и в прокариотических, и в іФ) зукариотических клетках, таких как бактериальнье клетки, клетки грибковьїх паразитов, дрожжи и клетки ко млекопитающих.

Мспользование заместительньїх связей, предложенньїх настоящим изобретением, позволяет легко бо конструировать олигомерь, "компетентнье" и "некомпетентнье" по отношению к рибонуклеазе Н. Компетентнье по отношению к рибонуклеазе Н олигомерь! могут содержать один или несколько компетентньїх по отношению к рибонуклеазе Н доменов, состоящих из связанньїх друг с другом нуклеомономеров, компетентньїх по отношению к рибонуклеазе Н. Олигомерьї, содержащие модификации, такие как 2і--замещения (2"--О-аллил и т.д.) или незаряженнье связи (метилфосфонат, фосфорамидат и т.п.), обьічно некомпетентнь! как субстрат для б5 рибонуклеази Н, которьй бьї она распознавала и на которьй бь воздействовала. Компетенция по отношению к рибонуклеазе Н может усилить антисмьсловое действие олигомера за счет деградаций РНК-мишени в структуре РНК-олигомер (Юадіе, 9У.М. ей аї, Мисі Асійз Кев., 1990, 18, 4751 - 4757; МУаїдег, 9.А. еї аї,

Международная публикация Мо УУО 89/05358). Фермент расщепляет РНК в двойньїх структурах РНК-ДНК.

Для сохранения компетенции по отношению к рибонуклеазе Н необходимо, чтобь! в олигомере содержался Компетентньй по отношению к рибонуклеазе Н домен, состоящий из трех или более связанньїх друг с другом компетентньїх нуклеомономеров (Сцапіп, К.5., ей аі, Мисі Асіаз Кев., 1989, 17, 7253 - 7262). В структуре олигомеров, устойчивьіїх к перевариванию нуклеазами, должнь! присутствовать концевье связи и модификации

Сахаров и/или оснований, обеспечивающие устойчивость к нуклеазам. Так, можно сконструировать олигомернь, содержащие модифицированнье нуклеомономерньсе остатки на одном из концов 5 или 3 или на обоих концах и 7/0 Компетентньй по отношению к рибонуклеазе Н домен в середине. Примерами олигомеров, у которьх сохранилась компетенция по отношению к рибонуклеазе Н, как правило, служат олигомерь! с однородной полярностью и 2 - 12 нуклеомономерами на 5'-конце и на 3'і-конце, придающими им устойчивость по отношению к воздействию нуклеаз, и З - 26 нуклеомономерами, образующими компетентньій по отношению к рибонуклеазе

Н домен и расположенньми между некомпетентньми в отношений рибонуклеазь! Н концами 3 и 5. Возможнь! /5 разновидности таких олигомеров, содержащие (1) более короткий компетентньй в отношений рибонуклеазь! Н домен, содержащий 1 - 2 компетентнье в отношений рибонуклеазьії Н связи или заместительнье связи, (2) более длинньій некомпетентньй в отношений рибонуклеазь Н домен, содержащий 1 - 20 и более заместительньїх связей или нуклеомономеров, (3) более длинньій компетентньійй в отношений рибонуклеазь! Н домен, содержащий 30 - 40 и более связей, (4) единственньій некомпетентньій в отношений рибонуклеазь! Н домен на конце 3 или на конце 5.

Олигомерьі), содержащие до 8 нуклеомономеров, могут бьіть использованьї для подавления зкспрессийи заданного белка (белков) за счет их способности образовьввать двойнье или тройнье структурь! с заданньіми последовательностями нуклеиновьх кислот. Однако, в предпочтительном случаеє линейнье олигомерь, используемье для подавления зкспрессии заданного белка за счет образования двойньїх или тройньїхх структур, с ов Ддолжнь! содержать от 10 до 20 нуклеомономерньх остатков.

Олигомерам, содержащим заместительнье связи, предложеннье настоящим изобретением, можно придать і) кольцевую форму, как описано в (Международная публикация Мо МО 92/19732; КООЇ, Е.Т. У Ат Спет Зос., 1991, 113, 6265 - 6266; Ргакази, 0. еї а), У Ат Спет 5ос., 1992, 114, 3523 - 3527). Такие олигомерь! пригоднь для связьвания с однонитевьми или двухнитевьми нуклеийновьіми кислотами-мишенями. Размерь о зо закольцованньїх олигомеров могут бьіть различньмми. Можно приготовить такие олигомерь! длиной в 22 - 50 нуклеомономеров. Кольцевье олигомерь! могут содержать в области замьжкания кольца от трех до шести юю нуклеомономерньїхх остатков, разделяющих связьвающие домень! олигомера, как описано у (Ргакавзі, там же). «-

Закольцевать олигомерьі можно при помощи ферментов (воздействовать лигазой на оконечньій фосфат) или химически - за счет связьівания 5'- и 3- конечньїх Сахаров и/или оснований. со

Олигомерь могут бьть использованьь для модуляции зкспрессии заданньх сгенов как ингибиторь «г взаймодействия белков, связьвающихся с нуклейновьми кислотами и ответственньх за управление транскрипцией (Манпег, /.., еї аіЇ, Зсіепсе, 1989, 245, 725 - 730) или трансляцией. Таким образом, олигомерь! приемлемь! в качестве агентов, специфичньїх по отношению к последовательности, конкурирующих с белками, связь вающими нуклеийновье кислотьі (в том числе, рибосомами, РНК полимеразами, ДНК полимеразами, « Мнициаторами трансляции, факторами, ускоряющими или подавляющими транскрипцию, в с белково-гормональнььмми факторами транскрипции и т.п.)00 Следовательно, соответствующим образом сконструированнье олигомерь! могут бьіть использованьь для усиления синтеза заданного белка за счет ;» связьвания управляющего участка (или его окрестности), которьій факторь! транскрипции используют для подавления зкспрессии, или за счет подавления зкспрессии самого белка-репрессора.

Олигомерь, предложеннье настоящим изобретениегм и содержащие дополнительнье модификации, ї5» которье повьішают аффинность связьшвания, могут бьїть сконструировань так, что в них будут входить вторичнье или третичнье структурьї, такие как псевдоузль! или псевдополуузль (ЕскКег, Ю..). еї аІЇ, 5сіепсе, 1992, со 257, 958 - 961). Такие структурьі могут иметь более устойчивую вторичную или третичную структуру, чем - соответствующие немодифицированнье олигомерьі. Повьішенная устойчивость таких структур обьясняется поввішением аффинности связьшания между комплементарньми участками одного олигомера или о комплементарньми участками двух и более олигомеров, образующих данную структуру. Такие структурь! могут о бьіть использованьі для имитации структур, таких как структура ТАК вируса иммунодефицита человека, чтобь помешать ее связьіванию с Таі-белком ВИЧ (белок, связьівающийся с ТАК). Подобньій подход можно применить к другим транскрипционньмм или трансляционньмм факторам, распознающим вьісшие структурь! нуклеиновьсмх ов кислот, такие как ствольі, петли, шпильки, узльі и т.п. Кроме того, олигомерьі, предложеннье настоящим изобретением, могут бьіть использовань! для: (1) разрушения или (2)связьувания таких структур, чтобьі (1) (Ф, препятствовать или (2) способствовать связьіванию белков со структурами нуклеиновьїх кислот. Олигомерь, ка предложеннье настоящим изобретением, могут бьіть использованьї не только как средства антисмьісловой или трехспиральной терапии, но и как лечебнье и диагностические средства, действующие за счет бо непосредственного вьітеснения одной из нитей двухнитевой нуклеиновой кислоть!. Вьітеснить одну из нитей природной двухнитевой нуклейновой кислоть, такой как хромосомная ДНК или двойная вирусная ДНК, РНК или гибрид РНК/ДНК могут олигомерь с вьісокой аффинностью связьшвания, так как комплементарная им последовательность недостаточно велика для зффективного вьтеснения нити ДНК или РНК из двойной структурьі. Терапевтическая зффективность олигомеров, действующих за счет О-петель, происходит от вьІсОкКой ве аффинности связьивания с комплементарной последовательностью и обеспечивает модуляцию нормальной биологической функции, связанной с зтой нуклейновой кислотой. Неисчерпьвающий перечень типов нуклеиновьїх кислот, которне могут служить мишенями, включаєт: (ії) геннье последовательности, в том числе зкзоньі, интроньії, сочленения зкзонов с нитронами, промоторнье/знхансернье участки и 5- или 3- концевне нетранслируемьсе участки, (ії) участки нуклеиновой кислотьії, на которьіх функционируют вторичнье структурь (например, стволово-петлевой злемент ТАК ВИЧ или тРНК), (ії) нуклеийновье кислотьіІ, вьіполняющие структурнье или другие функции, например, теломерь, центромерь или источники репликации (вирусь, бактериий и т.п.) и (м) любой другой двухнитевой участок. Ясно, что можно синтезировать олигомерь! с дискретньми функциональньми доменами, такие, что один участок олигомера связьншваєется с мишенью путем образования О-летель, а соседний участок связьівает молекулу-мишень, скажем, за счет образования тройной 7/0 спирали или связьшаєтся с белком как аптамер. Кроме того, олигомер, образующий О-петли, может связьшваться с каждой нитью двухнитевой структурьі, переключая нить, с которой он связьівается (т.е. один участок олигомера связьівается с одной нитью, а другой участок - с комплементарной нитью). Управляющие злементьі, диктующие характер связьивания (тройная спираль или О-петля), - зто последовательность олигомера и встроенная в него аффинность. Правила распознавания оснований при связьіваний в двойную 7/5 Структуру по Уотсону-Крику отличаются от правил управляемого связьівания в тройную структуру по Хогстену (Ноодзівееп). Позтому последовательность оснований олигомера может бьїть использована для определения типа правил связьшвания, по которьім будет действовать олигомер. В природе О-петлевье структурь образуются в ходе процессов, опосредованньїх ферментами (Наїгтізв, І.О. еї аї!., У Віої Спет., 1987, 262, 9285 - 9292), или связаньї с участками, где происходит репликация ДНК дасобв, Н.Т. еї аі., Мисі Асіаз Кез., 1989, 17, 2о 8949 - 8966). О-петли, образующиеся при связьиваний олигомеров, образуются в результате одно- или двухступенчатьхх процессов. Непосредственное вьітеснение нити-мишени приводит к образованию Ю-петли в один зтап. Однако, образование О-петель может происходить и в ходе образования тройной спирали, которое облегчает виітеснение нити, приводящее к образованию О-петли.

Для конструирования форм с измененньми характеристиками могут бьіть сконструировань! рибозимь, с г бодержащие заместительнье связи, предложеннье настоящим изобретением. Описань рибозимь, расщепляющие однонитевье РНК или ДНК (КорБбегізоп, О.Ї., еї аЇ., Майшге, 1990, 344, 467 - 468). Имеются (8) предложения применять рибозимь! в терапевтических целях (Загмег, М. еї аІ., Зсіепсе, 1990, 247, 1222 - 1225;

Международная публикация Мо УУО 91/04319). Вторичнье или третичнье структурьї, необходимье для функционирования рибозимов, могут бьіть созданьі путем конструирования соответствующих олигомерньх о зо последовательностей. Например, рибозимь), содержащие устойчивье к воздействию нуклеаз нацеливаемьсе доменьі, в которьїх присутствуют заместительнье связи, предложеннье настоящим изобретением, обладают юю более вьісокой аффинностью, не теряя специфичности спаривания основаниями (с «- последовательностью-мишенью. Благодаря вьісокой аффинности и/или устойчивости заместительньїх связей, предложенньх настоящим изобретением, к воздействию нуклеаз/ домен распознавания в рибозиме может бьть со з5 Короче (удобство приготовления), а зто приведет к более благоприятному метаболизму субстрата (достоинство «г функционирования рибозима).

В качестве лекарственньїх средств олигомерь, предложеннье настоящим изобретением, могут бьть примененьі! различньми способами, подходящими для лечения различньїх состояний за счет подавления зкспрессии соответствующих генов-мишеней. Для зтого олигомерь могут бьть приготовленьй в виде « препаратов, применяемьх различньми способами, в том числе препаратов для системного, наружного или в с местного применения. Состав препаратов и технологии приготовления можно найти в последнем изданий

Кетіпдіоп'є Рпаптасешіса! Зсіепсез. Мегск РибіїзпІпу Со., Еавіоп, РА, Іаїеві еаШоп. Активное вещество - ;» олигомер - обьчно соединяют с носителем, таким как разбавитель или наполнитель, например, сухой наполнитель, вяжущее средство, увлажнитель, диспергирующее средство, поверхностно-активное вещество йли смазьвающее вещество, в зависимости от способа введения и лекарственной формь. К типичньм ї5» лекарственньім формам относятся таблетки, порошки, жидкие формьі, в том числе суспензии, змульсий и растворь; грануль, капсуль! и суппозитории, а также жидкие препарать! для иньекций, в том числе липосомнье со препарать!. - Предпочтительньм способом системного применения являются иньекции, в том числе внутримьішечньє, ВНутривенньюе, внутрибрюшиннье и подкожнье. Для иньекций олигомерь, предложеннье настоящим о изобретением, готовят в виде жидких растворов, предпочтительно, в физиологически приемлемьїх буферах, о таких как раствор Хзнкса (Напкв) или Рингера (Кіпдег). Кроме того, олигомерь можно приготовить в виде твердого вещества, растворяемого или взвешиваемого непосредственно перед применением. Возможнь и лиофилизированнье формьі. Предпочтительньми для системного применения являются дозь! в пределах от дво ОКОЛО 0,01 мг/кг до 5Омг/кг один или два раза в день. Однако, можно применять различнье схемь! дозировки в зависимости от (ії) степени подавления данньім олигомером активности ДНК или РНК-мишени, (ІІ) тяжести или (Ф, степени развития патологического состояния, связанного с данньм геном, или (І) фармакокинетических ка свойств данного олигомера.

При системном примененийи возможно введение препарата через слизистье оболочки, кожу или внутрь. При бр введений через кожу и слизистье оболочки в препаратах используются вещества, способствующие проникновению. Их вьібор зависит от барьера, сквозь которьій необходимо проникнуть. Зти вещества известнь специалистам. К ним относятся, например, соли желчньїх кислот и производнье фузидовой кислоть! - для введения через слизистье оболочки. Кроме того, для увеличения пенетрантности используются детергенть.

Введение через слизистье оболочки можно осуществлять при помощи азрозолей для носа или, например, 65 Суппозиториев. Для приема внутрь олигомерь! готовят в виде традиционньїх лекарственньїх форм для приема внутрь, например, капсул, таблеток и микстур.

Для наружного применения олигомерьі, предложеннье настоящим изобретением, готовят в виде мазей, гелей или кремов известньми специалистам способами. Препаратьії на основе олигомеров, предложенньх настоящим изобретением, для введения в глаза, например, при вирусньїх инфекциях, готовят в соответствии с технологиями, принятьми в отрасли.

Олигомерьі, предложенньюе настоящим изобретением, могут бьїть использованьі не только как лечебнье средства, но и как диагностические препаратьі, при помощи которьїх определяется присутствие или отсутствие заданньїх последовательностей нуклеийновьх кислот, с которьіми олигомерьї специфически связьіваются.

Повьшенная аффинность связьівания, присущая олигомерам, предложенньм настоящим изобретением, 7/0 является их преимуществом при использованиий их в качестве затравок и зондов. Диагностические тесть проводят посредством гибридизации с образованием двойной или тройной спирали, которую затем исследуют традиционньми способами. Например, олигомерьї можно пометить радисоактивньми, флуоресцентньми или хромогенньми метками и определить присутствие меток, связанньїх с твердой подложкой. Кроме того, присутствие двойной или тройной спирали можно определить при помощи антител, которнше специфически /5 распознают зти формь!. Средства проведения анализа с использованием таких олигомеров в качестве зондов известньі! специалистам.

Мспользование олигомеров с заместительньми связями, предложенньми настоящим изобретением, в качестве диагностических препаратов, действующих за счет образования тройной спирали, удобно, так как тройнье спирали образуются в мягких условиях, и анализ можно проводить, не помещая анализируемье 2о Ообразцьй в жесткие условия. Диагностические тесть, основаннье на обнаружений РНК для вьіявления последовательностей, характерньїх для бактерий, грибков и простейших, часто требуют вьіделения РНК из образцов или организмов, виіращенньїх в лаборатории, что очень сложно и отнимает много времени, так как

РНК крайне чувствительна к вездесущим нуклеазам.

Олигомерньсе зондь! могут содержать дополнительнье модификации, такие как модификации Сахаров и/или с г Заместительнье связи, которне делают олигомерь! особенно устойчивьми по отношению к нуклеазам, и тогда они будут полезньмми для тестов, проводимьїх в присутствиий клеточньїх или тканевьїх зкстрактов, где обьічно і) присутствует нуклеазная активность. Олигомерь, содержащие концевье модификации, часто сохраняют способность связьшваться с комплементарньмми последовательностями, не теряя специфичности (піпхапп еї аі., СПпетіса! Кеміемуз5, 1990, 90, 543 - 584). Как сказано вьше, в зондах, предложенньх настоящим о зо Мзобретением, могут содержаться линкерьі, обеспечивающие специфическое связьівание с обеими нитями ДНК (Егоепіег, В.С. еї аі., ВіІоспетівігу, 1992, 31, 1603 - 1609; Ноте еї аі., У Ат Спет 5ос., 1990, 112, 2435 - 2437). що)

Включение аналогов оснований, предложенньїх настоящим изобретением, в зондьі, содержащие также «- группьї, образующие ковалентнье перекрестнье связи, может повьісить чувствительность и снизить фон в диагностических тестах или тестах на обнаружение. Кроме того, применение перекрестно-связьиівающих агентов со

Зз5 связано с изменением техники анализа: (1) перекрестная связь повьішаєт дискриминацию зонда, (2) для «г снижения фона проводится денатурирующее промьвание, (3) гибридизация и перекрестное связьвание проводится при температуре, близкой к температуре плавления гибрида для ослабления вторичной структурь мишени и для повьішения специфичности зонда. Изменение условий гибридизации описано у (Сатрег еї аї.,

Мисіеїс Асідз Кез., 1986, 14, 9943). «

Олигомерьі, предложеннье настоящим изобретением, пригодньії для использования в диагностических в с тестах, проводимьїх в соответствии со способами, согласно которьім либо олигомер, либо нуклеиновая кислота, которую следует обнаружить, ковалентно связаньй с твердой подложкой (патент США Мо 4775619). Зти ;» олигомерьі также пригодньі для применения в диагностических тестах, основанньх на технике цепной полимеразной реакции, амплифицирующей последовательности-мишени, как описано в Европейской патентной публикации Мо 0393744. Олигомерьі, предложеннье настоящим изобретением, имеющие 3-конец, которьй ї5» может служить затравкой, совместимь! с полимеразами, используемьіми в цепньїх полимеразньїх реакциях, такими как полимеразьї Тад или Мепітм (Мем/ Епдіапа Віоіар5). Таким образом, олигомерьі, предложеннье бо настоящим изобретением, можно использовать в качестве затравок в протоколах цепньїх полимеразньх - реакций. Олигомерь, предложеннье настоящим изобретением, могут бьть использовань! как затравки, 5р представляющие собой дискретную последовательность, или как затравки со случайной последовательностью. і-й Затравки со случайной последовательностью обьічно имеют длину 6, 7 или 8 нуклеомономеров. Такие затравки о можно использовать в различньїх схемах амплификации нуклеийновьїх кислот (полимеразньїх или лигазньїх цепньїх реакциях и т.д.) или в процедурах клонирования. Заместительнье связи, предложеннье настоящим изобретением, обьчно не ослабляют способность олигомера функционировать в качестве затравки. Олигомерьі), предложеннье настоящим изобретением, имеющие 2'--модификации на участках, отличньїх от 3-конечного остатка, и другие модификации, придающие им некомпетентность по отношению к рибонуклеазе Н іФ) или другого рода невосприимчивость к действию нуклеаз, удобно использовать в качестве зондов или затравок ко для последовательностей РНК или ДНК в клеточньїх зкстрактах или других растворах, содержащих нуклеазь.

Так, олигомерьі можно использовать в процедурах амплификации нуклеиновьх кислот в образце путем бо смешивания олигомера с ообразцом, содержащим заданную о нуклейновую кислоту, с последующей гибридизацией олигомера с заданной нуклейновой кислотой и амплификацией заданной нуклейновой кислоть! при помощи полимеразньмх или лигазньїх цепньїх реакций или других подходящих способов.

Производнье от олигомеров и хелатирующих агентов, таких как ЗДТА (ЕОТА), дизтилентриаминпентауксусная кислота (ОТРА) или аналоги 1,2-диаминциклогексан уксусной кислоть!, могут 65 бьїть использованьі в различньїх диагностических тестах Іп мо, как описано в патентах США МоМо 4772548, 4707440 и 4707352. Кроме того, от олигомеров, предложенньїх настоящим изобретением, можно получить производнье при помощи перекрестно-связьиівающих агентов, таких как 5-(З3-йодацетамидопроп-1-ил)2-дезоксиуридин или / 5-(3--4-бромбутирамид)проп-1-ил)-2-дезоксиуридин, и использовать в различньїх аналитических наборах и способах, как описано в международной публикации Мо МО

З0/14353.

В дополнение к сказанному вьіше, способность олигомеров подавлять зкспрессию генов может бьть проверена в системах Іп міго путем измерения уровней зкспрессии в клетках, а в рекомбинантньїх системах - любьім подходящим способом (Сгаеззтапп, М еї аї, Мисіеїс Асідз Кез., 1991, 19, 53 - 59).

Вьше приведено описание изобретения, а для того, чтобьі лучше разьяснить его, предлагаем 7/0 нижеследующие примерьі. Примерь! дань! в качестве иллюстрации к настоящему изобретению, и не следует толковать их как ограничение обьема изобретения.

Примерь!

Коротко о синтезе нуклеомономерньїх синтонов и олигомеров

Олигомерьї, предложеннье настоящим изобретением, могут бьіть синтезировань в ходе реакций, известньсх /5 бпециалистам в области синтеза производньїх олигонуклеотидов. Смотри, напр., Ріапдог, ) апа Мат, 5.У.,

Тейгапедгоп І ейв., 1990, 31, 597 - 600; Майвоп, К.)., еї аі,, У Огд Спет., 1990, 55, 2552 - 2554; Спипа,

СК. егаІ., У Огд Спет., 1989, 54, 2767 - 2769.

Как видно из Таблицьі 1, в которой приведень! разнообразнье заместительнье связи, заместительнье связи, предложеннье настоящим изобретением, могут бьіть весьма разнообразньми и содержать один или 2о несколько атомов азота, серьі и/или кислорода. Позиция зтих атомов в заместительной связи может бьть 5--концевой, "серединной" или 2-, 3'-или 4-концевой. Зтот раздел снабжен схемами ряда характерньїх реакций синтеза, указьівающими "путь" к различньм расположениям и сочетаниям атомов азота и кислорода в заместительньх связях.

Процедурь! синтеза, проиллюстрированнье фиг. 1 - 25, можно видоизменить, как известно специалистам в с области химии олигонуклеотидов. Например, защита оснований не всегда обозначена на схемах синтеза, но она может потребоваться, и тогда ее можно осуществить с использованием реактивов и технологий, известньх і) специалистам. См. напр. РгоїесПме Сгоцрз Іп Огдапіс Зупіпезів (Теодога МУ. Сгеепе, допп УМПеу апа 5опв, 1981). Подобньїм образом, в некоторьїх случаях, использование протекторньїх групп отражено на схемах, но оно не всегда необходимо при синтезе олигомеров, предложенньїх настоящим изобретением. о зо Пример 1

Первье пять зтапов, изображеннье на фиг. 1, относятся к приготовлению аминоспирта серинола, юю защищенного изобутирилом. Шестой и последующие зтапь! направлень! на получениє строительной единиць!- - де тимин фосфорамидита, замещенного серинолом.

На зтапе 1 по фиг. 1 аминогруппу аминокислотьї серина защдищают посредством реакции соединения 1 с со ди-трет-бутилдикарбонатом, дающей соединение 2. Можно использовать другие зквивалентнье прожекторнье «г группьі. На следующем зтапе р-гидроксильную группу соединения 2 блокируют дигидропираном и получают полностью защищенную аминокисолоту 3. Затем проводят реакцию аминокислотьі З с комплексом диборан-диметилсульфид и получают спирт 4, которьй, взаймодействуя с изобутирил хлоридом, дает соединение 5. Зта реакция восстановления может бьіть проведена с использованием изобутилхлорформата и « натрия борогидрида (К. Катазату, К.К. ОІвеп апа Т. Етегу Зупіпевів, 1982, 42). Реакция соединения 5 с шщ с трифторуксусной кислотой, проводимая в течение ЗО минут, с последующим промьіванием Мансоа, дает й соединение 6. «» Тиминуксусную кислоту 7 готовили, как описано в литературе (І. КозупКіІпа, МУ. МУапд апа Т.С. ШПапо,

Тегапедгоп І ейв5., 1994, 35, 5173). Соединение веществ / и б по принципу смешанного ангидрида дало 8. Диметокситритилирование соединения 8 при помощи ЮОМТСІ дало соединение 9, которое после гидролиза «їз» основанием дало 10. Фосфитилирование 10 при стандартньїх условиях дало строительную единицу 11 - тимин, соединенньй с серинолом. Зтот синтон можно добавить к наращиваемому олигомеру стандартньіми способами. бо Для связьввания мономеров или димеров способом, аналогичньім описанному вьіше, может бьіть использована - любая химия синтеза ДНК, например, фосфорамидатная или фосфонатная.

Пример 2 о Как видно она фиго 2, о тиминацетальдегид 13 получили посредством обработки тимина о бромацетальдегид-диметилацеталем с последующим гидролизом 12 при помощи водной трифторуксусной кислотьі. Затем соединили альдегид 13 и амин 6 и преобразовали соответствующий промежуточньїй продукт в фосфорамидитную строительную единицу 17 способом, аналогичньїм зтапам фиг. 1.

Пример З

Исходньім материалом для реакции, изображенной на фиг. З, является р-замещенная аминокислота 18. і) Замещенную аминокислоту можно преобразовать в фосфорамидитную строительную единицу 27, в ко соответствий с процедурой, изображенной на фиг. 1 и 2.

Пример 4 60 Согласно фиг. 4, исходньій аминоспирт 21 окисляют смесью СгО з/пиридин и получают альдегид 28. Зтот альдегид при реакции с алкил галогенидом в присутствий основания дает соединение 29. Аминоспирт 29 можно преобразовать в строительную единицу 35 способом, аналогичньім изображенному на фиг. 1 и 2.

Пример 5

Первне четьіре зтапа, изображеннье на фиг. 5, в основном те же, что и изображеннье на фиг. 1, но вместо 65 серина используется аспарагиновая кислота. Метиловьій зфир аспарагиновой кислоть! 3б дал полностью защищенньій спирт 40, которьій после избирательной депротекций при помощи уксусной кислоть! дал 41.

Окисление 41 смесью СгОз/пиридин дало соответствующий альдегид 42. Восстановительное аминирование альдегида 42 О-бензилгидроксиламином в присутствиий натрия триацетоксиборогидрида должно давать 43 (см.

Т. Коїаза апа М. у. МІШег, У Огд Сеїа., 1990, 55, 1711). Затем спирт 39 преобразуют в альдегид 46, в ОсНнОоВНОМ, в тех же условиях, что и описанньсе вьіше, но с аллиловой протекторной группой для гидроксильной функциональной группьі 39. Соединение альдегида 46 с гидроксиламином 43 в присутствии натрия триацетоксиборогидрида с последующим удалением аминопротекторньїх групп должно дать бисамин 48.

Бисамин 48 можно преобразовать в димер 53 в соответствии с процедурой, изображенной на фиг. 1.

Пример 6 70 Согласно фиг. б, соединение спирта 54 с О-бензилгидроксиламином 55 в условиях реакций Мицунобу (Міївиповри) (см: О. Міївиповри, Зупіпезів, 1981, 1) дает соединение 56. Промежуточное соединение 56 после гидрогенизации и ацетилирования дает 57. Обработка 57 трифторуксусной кислотой снимаєет протекторную группу ""ТВОМ5БІ" и дает 58. Соединение 58 и 7 с последующим диметокситритилированием дает 60.

Законченную строительную единицу 62 получают из 60 при помощи основного гидролиза с последующим 75 фосфитилированием.

Пример 7

Согласно фиг. 7, серинол 4 преобразуют в галогенид 59 и алкилируют с тимином, получая 63. С соединения 63 удаляют протекторньсе группьї, соединяют его с оксиуксусной кислотой, защищенной ЮОМТ, фосфитилируют и получают 66.

Пример 8

Согласно фиг. 8, спирт 64 соединяют с М-гидроксиламинпропановой кислотой 69 и получают 70.

Алкилирование тимина с галогенидом 7З дает 74, которое после удаления протекторних групп, соединения с 76 и гидролиза дает 78. Конденсация 78 с 70 с последующим фосфитилированием должна давать гидроксаматньй димер 80. сч

Пример 9

Согласно фиг. 9, М-гидроксиламинпропановьйй альдегид 81 соединяют со спиртом 64. Димер 88 получают из і) 83 и 86 в соответствий с процедурой, изображенной на фиг. 8.

Пример 10

Согласно фиг. 10, алкилирование (см. Т. Коїаза апа М. у). МіПег, У Огу Спет.ї 1990, 55, 4246) метилового су зо Зфира о-бром-р-аминопропановой кислотьі 89 с тимином дает 90. Промежуточное соединение 90 после гидролиза гидроксидом натрия дает кислоту 91, которую соединяют с б и получают 92. Затем соединение 92 юю преобразуют в фосферамидитную строительную единицу 95 в соответствии с зтапами, изображенньми на фиг. - де 1.

Пример 11 со

Согласно фиг. 11, тимин алкилируют с алкиламин галогенидом 96 (о приготовлений аминоалкилгалогенидов /-«ф см.: К.К.ОїЇІвеп, К.Катазату апа Т. Етегу У. Огд. Спет., 1984, 49, 3527 апа Івіат еї аї., 9. Мед. Спет., 1994, 37, 293 - 304) и получают 97. Обработка соединения 97 трифторуксусной кислотой с последующим алкилированием дает 100. Строительную единицу 103 получают из 100 посредством диметокситритилирования, гидролиза и фосфитилирования. «

Пример 12 шщ с Фиг. 12 иллюстрирует альтернативньй способ получения димера 111 с гидроксаматньм скелетом из й М-гидроксиламина 43 и альдегида 107, которьйй, в свою очередь, получают из аспарагиновой кислоть. «» Пример 13

Как видно на фиг. 13, димер 115 получают из промежуточного соединения 108 и 13 в соответствии с процедурой, изображенной на фиг. 2. «їз» Пример 14

Согласно фиг. 14, готовят М-гидроксилтимин (Кігп, С. О., еї аіЇ., Тейапедгоп І ев. 1992, 33, 25 - 28) со и, соединяя его с М-гидроксифталимидом, получают 117, которое при обработке гидразином в зтаноле даєт 118. - Обработка соединения 118 глицерин зпоксидом 119, защищенньм ОМТ, дает 120. Затем промежуточное 5р соединение 120 преобразуют в фосфорамидит 121 в соответствии со стандартной процедурой. В ходе второго і-й процесса соединение 118 соединяют с аминоальдегидом 122 в условиях восстановительного аминирования и о получают 123. Защита вторичной функциональной аминогруппьь при помощи ЕМОССІ с последующим гидролизом дает 125.

Пример 15

Согласно фиг. 15, 1,2-дигидроксипропановую кислоту 126 соединяют с М-гидроксиламин-тимином 118 и получают 127, которое преобразуют в фосфорамидитньй синтон 129 в стандартньїх условиях. Соединение 118 іФ) также соединяют с адипиновой кислотой и преобразуют в строительную единицу 133 нуклеийновой кислоть. ко Пример 16

Согласно фиг. 16, сначала синтезируют строительную единицу 136 из 118 и 134, подобно тому, как показано бо на фиг. 1. Соеєдинение 139 и 118 дает 140. Обработка 137 при помощи 118 дает 138, которое после конденсации со 140 даєет димер 141.

Пример 17

Согласно фиг. 17, альдегид 142 соединяют с бензиловьім зфиром глицина и получают 143. Обработка соединения 143 соединением 7 дает 145, которое, взаймодействуя с уксусной кислотой, дает 148. 65 Алкилирование 148 в условиях реакции Мицунобу (Міїгиповби) с Вос-МН-О-ацетилгидроксиламином дает 147, из которого посредством гидрогенизации можно получить строительную единицу 150. Аналогичное соединение

143 с 13 и вьішеупомянутье реакции дают синтон 149.

Пример 18

Как видно на фиг. 18, восстановительное аминирование альдегида 142 Вос-МН-О-бензилгидроксиламином дало 151. Гидрогенизация 151 с последующим алкилированием 152 гликолевой кислотой 153 (В. С. Вогег апа о.

С. Ваїодн, Тейгапейдгоп І ейв., 1991, 32, 1039) дает 154. За счет обработки 154 трифторуксусной кислотой удаляют протекторную группу Вос, затем проводят соединение и получают 155. Гидроксильную протекторную группу соединения 155 можно удалить при помощи уксусной кислотьї и получить 156. Соединение 156 преобразуют в строительную единицу 157 при помощи стандартньїх реакций. Подобньім образом, строительную 7/0 единицу 158 получают путем соединения 154 и 13 с последующим вьіполнением процедур, необходимьх для получения 157.

Пример 19

Согласно фиг. 19, алкилирование тимин-М-гидроксиламина 160 спиртом 162 дает 163. Соединение 163 может бьіть преобразовано в фосфорамидитную строительную единицу 166 посредством процедур, /5 представленньх на фиг. 1.

Пример 20

Как видно на фиг. 20, сначала в стандартньїх условиях из глутаминовой кислоть! синтезируют промежуточное соединение 169. Алкилирование тимина при помощи 169 дает 170, которое при обработке трифторуксусной кислотой дает 171. Промежуточное соединение 171 можно соединить с Вос-глицином и 2о получить 173, которое при гидролизе дает мономерньїй синтон 174. Подобньм образом можно получить 172: посредством соединения 118 с Вос-аминоуксусньм альдегидом с последующим гидролизом бензилового зфира.

Пример 21

Согласно фиг. 21, в стандартньх условиях готовят промежуточное соединение 177 из сч

Вос-МН-О-бензилгидроксиламина и 175. Гидрогенизация 177 с последующим соединением с

М-гидрокситимином 116 дает 178. Удаление протекторной группьї ТНР со последующим і) диметокситритилированием и фосфитилированием дает синтон 181. Следуя описанньмм вьіше процедурам, но используя ТНР-оксиуксусньій альдегид вместо ТНР-оксиуксусной кислоть!, можно получить 182.

Пример 22 о зо Как видно на фиг. 22, строительную единицу 191 можно получить из известного исходного материала 183, следуя условиям реакций, приведенньїм в нижней части фиг.22. юю

Пример 23 «-

Как видно на фиг. 23, синтез строительной единиць 199 можно осуществить, используя исходньій материал 183 и следуя условиям реакций, приведенньїм в нижней части фиг. 23. со

Пример 2 4 «Е

Согласно фиг. 24, исходньій материал 200 преобразуют в строительную единицу 207, следуя условиям реакций, приведенньїм в нижней части фиг. 24.

Пример 25

Соединения, использованньсе и полученньсе в зтом примере, показань! на фиг. 1. «

Серии (1): тимин (37,8г, ЗОбммоль) растворили в растворе гидроксида калия (64,5г, 1150ммоль) в 200мл з с водьі. Зтот раствор подогревали на водяной бане в 40"С в течение 1 часа и за зто время добавили к нему раствор бромуксусной кислоть! (62,5г, 450ммоль) в 100мл водьі. Реакционную смесь перемешивали при зтой ;» температуре еще в течение часа. Затем ее оставили остьивать при комнатной температуре и, когда смесь остьіла, при помощи концентрированной НСІ довели рН до 5,5. Затем смесь охлаждали в холодильнике в

Течение 2 часов. Образовавшийся осадок (непрореагировавший тимин) удалили посредством фильтрации. їх Затем рН смеси довели до 2 при помощи концентрированной НСІ и поместили смесь в холодильник на 2 часа.

Посредством фильтрации собрали бельїй осадок, коториій сушили в вакуумном сушильном шкафу при 40"С в со течение 6 часов. Вьіїход составил 44г (8896). - Метиловьій зфир М-Вос-І-серина (2): метиловьій зфир іІ-серина (15,66г, 7ООммоль) взвесили в 5р тетрагидрофуране/М,М-диметилформамиде (ТНЕР/ОМЕ) (по 100мл каждого) при комнатной температуре. К зтой о смеси при перемешиваний добавили тризтиламин (11,13г, 110ммоль), затем ди-трет-бутил дикарбонат (24,0Ог, о 110ммоль) и продолжали перемешивание при комнатной температуре в течение 30 минут. Добавили воду (20мл) и перемешивали смесь в течение 8 часов при комнатной температуре. Смесь вьіпарили досуха. Остаток взвесили в зтилацатате (250мл) и обработали гидросульфатом калия (0,25 М, 100мл). Продукт немедленно ов Зкстрагировали раствором зтилацетата. Органический зкстракт промьіли водой (100мл), соляньім раствором (100мл) и вьісушили над безводньм сульфатом натрия. Вьіпаривание органического растворителя дало

Ф) маслянистьй остаток в 26бг (9095). ка Метиловьій зфир М-Вос-І -серина (ОТНР)(З3): соединение 2 (15г, 68,49ммоль) растворили в сухом СНоСі» (100мл) и обработали 3,4-дигидро-2Н-пираном (8,4г, 100ммоль) и р-толуол сульфоновой кислотой в количестве, бо достаточном для каталитического действия (100мг), при комнатной температуре. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 12 часов, затем вьіпарили досуха. Остаток растворили в зтилацетате (200мл), промьіли 595 раствором МансСоО»з (100мл), водой (5Омл) и соляньім раствором (5Омл).

Органический зкстракт внісушили над безводньім Ма»5О) и вьіпарили досуха. Остаток бьіл достаточно чисть!м и бьл использован на следующем зтапе в таком виде. Вьіход: 15Гг(7290). 65 М-Вос-І-серин (ОТНР) (4): метиловьй зфир серина (ОТНР) (10г, ЗЗммоль) растворили в сухом тетрагидрофуране (100мл) и охладили до 0"С на ледяной бане в аргоновой атмосфере. К зтому холодному раствору при перемешиваний в течение 1 часа при 0"С добавляли комплекс боран-метилсульфид (2 М раствор в тетрагидрофуране, 100мл, 200ммоль). После добавления борана реакционную смесь нагрели до комнатной температурьі и в течение б часов держали при температуре 40"С. Реакционную смесь охладили до 0"С, нейтрализовали при помощи водь и уксусной кислотьі до рН Об - 7 и зкстрагировали зфиром (3 х 100мл).

Зфирньій зкстракт промьіли водой (2 х 100мл) и соляньмм раствором (100мл), вьісушили над безводньм

Ма»5ЗО,, вніпарили досуха и получили сьірой продукт в виде масла. Очистка масла на испарительной колонке с силикагелем и гексаном - » ацетоном в качестве злюента дала 8г (88905) чистого продукта.

М-Вос-І -серин (ОТНР) О1ІБ(5): при перемешиваний и при 0"С к раствору соединения 4 (8г, 29,09ммоль) в 7/0 вухом СНосіІ» (100мл) добавили ТЕА (3,54г, Збммоль), затем изобутирил хлорид (3,71г, Збммоль) за 30 минут.

Затем реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 4 часов, после чего вьіпарили досуха. Остаток растворили в зтилацетате (Е(Ас) (200 мл), промьіли 596 раствором МансСоОз (5Омл), водой (БОмл) и соляньмм раствором (5Омл). Органический зкстракт вьісушили над безводньім Ма 2504, вьсушили досуха и получили сьірой продукт в виде масла. Очистка масла на испарительной колонке с силикагелем и /5 Гексаном - » ацетоном в качестве злюента дала 7,9г (7995) чистого продукта.

І-серинол (ОБ) (б): соединение 5 (10г, 28,98ммоль) растворили в СНоСі» (100мл), в течение 1 часа перемешивали при комнатной температуре с трифторуксусной кислотой (5Омл), затем вьшпарили досуха.

Остаток растворили в метаноле (5Омл) и снова вьіпарили. Остаток растворили в СНоСі»ь (200мл), промьіли насььщенньм раствором МансСоОз (2 х 100мл), водой (100мл) и соляньім раствором (50мл). Органический Зкстракт вьісушили над безводньім Ма»ЗО,, вьіпарили досуха и получили 4,5г (96905) продукта в виде масла.

М-(тиминилацетил)-І -серинол (016) (8): тиминуксусную кислоту 7 (7,3г, 40ммоль) и М-метилморфолин (4,4мл, 4Оммоль) растворили в 100мл М,М-диметилформамида. Раствор охладили до -207"С в аргоновой атмосфере. К зтому холодному раствору при перемешиваний в один прием добавили изобутил хлорформат (5,2мл, 40ммоль).

Через 15 минут добавили раствор соединения 6 (6,44г, 4О0ммоль) в ЗОмл М,М-диметилформамида (охлажденньй сч ов ДО той же температурь)). Реакционную смесь перемешивали при -20"С в течение 30 минут, затем нагрели до комнатной температурь! и продолжали перемешивание в течение 1 часа. Реакционную смесь вьіпарили досуха, і) а остаток растворили в СНоСі» (200мл). Органический раствор промьіли 595 раствором Мансо» (100мл), водой (100мл) и соляньім раствором (5Омл). Органический зкстракт вьісушили над безводньм Ма»50О), вьіпарили досуха и получили сьірой продукт в виде пень. Сьрой продукт очистили на испарительной колонке с (су зр биликагелем и СНоСі»; - » ацетоном в качестве злюента и получили 12г (92795) чистого продукта. 4,4-диметокситритил-М-(тиминилацетил)-І-серинол (ОІВБ)(9У): соединение 8 (10г, 30,58ммоль) вьіпарили о вместе с сухим пиридином (З х 50мл) и растворили в сухом пиридине (100Омл). К зтому раствору добавили ТЕА (у р (3,54г, ЗбБммоль), затем ЮМТСІ (11,83г, ЗбБммоль) при комнатной температуре в аргоновой атмосфере.

Реакционную смесь перемешивали в течение 12 часов, погасили метанолом (20мл) и перемешивали в течение со

ЗО минут. Раствор вьіпарили досуха и растворили в СНоСі» (200мл). Органический зкстракт промьіли 590 «г раствором Мансо» (100мл), водой (100мл) и соляньім раствором (5Омл). Слой СНьЬСі» внісушили над безводньім

Ма»ЗО), вьіпарили досуха и получили сьірой продукт в виде пеньі. Сьірой продукт очистили на испарительной колонке с силикагелем и СН»оСі» - » ацетоном в качестве злюента и получили 17г (8890) чистого продукта. 1-0-(4,47.. -димешокситришил)-2--амин (тиминилацетил)| -І-пропан-1,3-диол (10): соединение 9 (10Гг, « 15,89ммоль) растворили в метаноле (20мл). К зтому раствору при 0'С добавили 1М раствор Ман (20мл, пт») с 20ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 1 часа, затем погасили уксусной кислотой, доведя рн до 7. Раствор зкстрагировали ЕТАс (2 х 100мл). Органический зкстракт промьли 595 раствором МансСоОз ;» (100мл), водой (100мл) и соляньіїм раствором (50Омл). Слой ЕЮАс вьісушили над безводньім Ма»ЗО), вьіпарили досуха и получили сьрой продукт в виде пень. Сьрой продукт очистили на испарительной колонке с биликагелем и СНоСі» -» ацетоном в качестве злюента и получили 8,2г (92795) чистого продукта. їх 1-0-(4,4-диметокситритил)-2--(амин (тиминилацетил))|-І-пропан-3'-0-(М,М-диизопропил)-В-цианзтилфосфорамидит (11): соединение 10 (8,00Гг,

Ме 14,31ммоль) вьіпарили вместе с сухим пиридином (З х 5Омл) и сушили над твердьм Маон в вакууме в течение - ночи. Сухой материал растворили в сухом СНьоСі» (100мл) и охладили до 0"С в аргоновой атмосфере. К зтому

Холодному раствору в аргоновой атмосфере добавили М,М-диизопропилзтиламин (5,23г, 25ммоль), затем і-й 2-цианзтил-М,М-диизопропилхлорфосфорамидит (4,72г, 20,00ммоль). Реакционную смесь перемешивали в с течение 1 часа при 0"С и в течение 1 часа при комнатной температуре. Реакционную смесь разбавили СН»оСі»о (100мл). Раствор в СНЬСІ» промьіли 595 раствором Мансо» (100мл), водой (100мл) и соляньіїм раствором (5Омл) - Слой СНЬСІ2 вьісушили над безводньмм Ма2504, вьіпарили досуха и получили сьірой продукт в виде пень. Свьірой продукт очистили на испарительной колонке с силикагелем, с СНоСі» - » ацетоном, содержащим 195 ТЕА, в качестве злюента и получили 10г (х95) чистого продукта. Массу внісушивали над твердьім Маон в вакууме в о течение ночи. Массу растворили в СНоСі» (15мл) и в течение часа в аргоновой атмосфере каплями добавляли в ко перемешиваемьй раствор сухих гексанов (2000мл). После добавления растворенной в СН 25Сі» массь образовался осадок, которьій перемешивали еще в течение часа, затем отфильтровали, промьли сухими бо гексанами (200мл) ив течение ночи сушили над твердьім Маон. Вньіход: 9,5г (87905).

Пример 26 (смотри фиг. 26)

М-(трет-бутилоксикарбонил)-О-бензил-І! -серин (2): О-бензил-І-серин 1 (10г, 51,28ммоль) взвесили в тетрагидрофуране/Н2О (8 : 2, 100мл) при комнатной температуре. К зтой смеси при перемешиваний добавили тризтиламин (6,06г, бОммоль), затем ди-трет-бутил дикарбонат (13,08г, ббммоль) и продолжали перемешивание 65 в течение ночи при комнатной температуре. Гомогенньй раствор вьіпарили досуха и растворили остаток в зтилацетате (З0Омл). Органический зкстракт промьіли 0,5М раствором гидросульфата калия (100мл), водой

(100мл) и соляньмм раствором (5Омл). Зкстракт в зтилацетате вьісушили над безводньм сульфатом натрия, вьіпарили досуха и получили 14г (9395) маслянистого остатка.

М-(трет-бутайлоксикарбонил)-О-бензил-І-серинол (3): М-(трет-бутилоксикарбонил)-О-бензил-І-серин (2) (бог, 20,34ммоль) растворили в сухом тетрагидрофуране и охладили до -20"С в аргоновой атмосфере. К зтому холодному раствору при перемешивании добавили ТЕА (2,32г, 2З3ммоль) и изобутил хлорформат (3,13Гг, 2Зммоль). Перемешивание продолжали в течение 30 минут при -207"С в аргоновой атмосфере. Реакционную смесь немедленно профильтровали под покровом аргона, а осадок промьіли сухим тетрагидрофураном (5Омл).

Соединенньй фильтрат медленно добавили в холодньй (07) раствор МавнН; (7,4г, 200Оммоль) в 7/0 тетрагидрофуране/воде (80 : 20, 200мл) в течение 10 минут. После зтого реакционную смесь перемешивали в течение 2 часов при 0"С, затем при помощи уксусной кислотьі рН довели до 7. Раствор вьіпарили досуха, разделили между зтилацетатом/водой (300:150 мл) и зкстрагировали зтилацетатом. Органический зкстракт промьіли соляньім раствором (100Омл), вниісушили над безводньім сульфатом натрия и вьіпарили досуха. Сьрой продукт очистили на испарительной хроматографической колонке с силикагелем, с СНоСі» - »5 ЕІЮАсС в качестве 75 злюента. Чистьій продукт обьединили, вьшпарили досуха и получили 4,7г (8295) чистого продукта в виде масла. "Н ЯМР (СОСІ 3) :5 1,41 (в, 9Н, Вос), 3,60 - 3,70 (т, 4Н), 3,82 (4, 2Н), 4,53 (5, 2Н, ОСНОРІ), 5,20 (бБв, 1Н,

МН) и 7,30 - 7,40 (т, 5Н, РП).

М- (трет-бутилоксикарбонил)-О-бензил-і -серинол-О-1р (4): Кк вьсушенному раствору

М-(трет-бутилоксикарбонил)-О-бензил-І -серинола З (4,3г, 14,3ммоль) в сухом пиридине (5Омл) добавили ТЕА (2,02г, 20ммоль) при комнатной температуре. К зтому раствору при перемешивании добавили изомасляньй ангидрид (3,16г, 2оммоль) и продолжали перемешивание в течение ночи в аргоновой атмосфере. Реакционную смесь вьшпарили досуха, разделили между ЕЮАс (100мл) и МансСоО»з (595 раствор, 10Омл) и зкстрагировали

ЕЮАс. Органический зксракт промьіли водой (100мл), соляньім раствором (5Омл) и вьісушили над безводньм

Ма»зО). Вьісушенньй раствор вьіпарили досуха и получили сьірой остаток. Остаток очистили посредством су испарительной хроматографии на силикагеле с гексаном - » ЕЮдАс в качестве злюента. Очищеннье фракции о соединили, вьіпарили и получили маслянистьій продукт в количестве 4,5г (8495). "Н ЯМР (СОСІ5): 6 1,04 (а,

ЄН, ІСНУ»), 1,39 (в, 9Н, Вос), 2,46 (т, 1Н, ІБСН), 3,40 (т, 2Н), 3,92 (т, 2Н), 4,12 (т, 1Н), 4,46 (в, 2Н, ОСНОРІ), 6,84 (й, 1Н, МН) и 7,24 - 7,40 (т, 5Н, РІ).

М-(тиминилацетил)-О-бензил-І -серинол-О-ІБ (6): М-(трет-бутилоксикарбонил)-О-бензил-І-серинол-О-ІБ 4 (З (4,3г, 12,25ммоль) перемешивали при комнатной температуре в трифторуксусной кислоте (2О0мл) и СНьоСі» ю (20мл) в течение 30 минут. Реакционную смесь вьіпарили досуха, растворили в сухом СНЗОН (1Омл) и снова вьіпарили досуха. Остаток сушили над твердьм КОН в вакууме в течение 12 часов. Вьісушенньй остаток (/ж7 использовали в зтом виде, без исследования, в последующих реакциях. со

Тиминуксусную кислоту 5 (2,76бг, 15ммоль) растворили в сухом М,М-диметилформамиде (75мл) и охладили до -20"С в аргоне. К зтому холодному раствору при перемешиваний добавили М-метилморфолин (1,72г, Ж 17ммоль), затем изобутил хлорформат (2,31г, 17ммоль). После 15-минутного перемешивания раствор вьішеупомянутой соли трифторуксусной кислотьі в сухом М,М-диметилформамиде (5Омл) нейтрализовали

М-метилморфолином (1,72г, 17ммоль) и сразу же добавили в холодньй перемешиваєемьй раствор « тиминуксусной кислотьі. Реакционную смесь перемешивали при -20"С в течение 1 часа, нагрели до комнатной температурь! и продолжали перемешивание в течение ночи. Раствор вьіпарили досуха, а остаток растворили в о, с СНьЬСІ» (250мл) и воде (100мл) и зкстрагировали СНьЬСІ»- Органический зкстракт промьіли 595 раствором "» Мансо» (100мл), водой (100мл) и соляньіїм раствором (5Омл) . Зкстракт в СНЬСІ» вьісушили, вьіпарили досуха и " получили сьірой продукт. Сьірой продукт очистили посредством испарительной хроматографии на силикагеле с

СНоСІ» - » ацетоном в качестве злюента. Необходимье фракции собрали, вьіпарили и получили 4,8г (94905) чистого продукта. те Чистьїй продукт кристаллизовали из СНьоСіо/гексана, точка плавления 122 - 12476. Ти яЯМР (СОСІ5): 6 1,04 о (0, ЄН, ТЬСН»), 1,72 (в, ЗН, СНУ), 2,44 (т, 1Н, ІБСН), 3,42 (т, 2Н), 4,06 (т, 2Н), 4,18 (т, 1Н), 4,30 (в, 2Н), 4,46 (в, 2Н, ОСНОРНИ), 7,24 - 7,40 (т, 6Н, СеН и РІ), 8,22 (д, ІН, МН) и 11,22 (в, 1Н, МН). - М-(тиминилацетоїл)-І -серинол-О-ІвБ (7): М-(тиминилацетил)-О-бензил-І| -серинол-О-Ір б (2,08г, Бммоль) сл 20 растворили в зтаноле (5Омл). К зтому раствору при комнатной температуре добавили РаЯ(ОН)» (0,6г) и циклогексен (5мл). Реакционную смесь в течение 12 часов подогревали до 70"С. Катализатор отфильтровали, с промьіли метанолом (20мл). Фильтрат вьіпарили досуха и получили белое твердое вещество. Белое твердое вещество растворили в минимальном количестве МеоОН и охладили до комнатной температурьі. Продукт вьікристаллизовался в виде мелкого порошка, точка плавления 196 - 19870. Вьіход: 1,48г (91906). ТН яЯМР (Ме,зО-йв) :5 1,04 (а, 6Н, ІЬСН»), 1,72 (в, ЗН, СН»), 2,42 (т, 1Н, ІБСН), 3,40 (т, 2Н), 3,94 (т, 2Н), 4,06 (т, (Ф) 1Н), 4,28 (5, 2Н), 4,90 (ї, 1Н, ОН), 7,20 (в, 1Н, СеН), 8,12 (а, 1Н, МН) и 11,22 (8, 1Н, МН). г 4,4-диметокситритил-М-(тиминилацетил)-І-серинол-О-ІЮ (8): М-(тиминилацетил)-І-серинол-О-ІБ 7 (1,48г, 4,5ммоль) растворили в сухом пиридине (5Омл) в аргоновой атмосфере. К зтому раствору при перемешиваний во добавили ТЕА (0,51г, БбБммоль) и М,М-диметиламин-пиридин (0,10г). Через 10 минут добавили 4,4-диметокситритилхлорид (1,69г, бммоль) и продолжали перемешивание при комнатной температуре в аргоновой атмосфере в течение ночи. Реакционную смесь погасили Меон (10мл), перемешивали 10 минут и вьшарили досуха. Остаток растворили в ЕАс (200мл), промьли 595 раствором Мансо»з (100мл), водой (100мл) и соляньім раствором (5Омл). Органический зкстракт виісушили над безводньм Ма»5ЗО) и вьіпарили дь / Досуха. Сьрой продукт очистили посредством испарительной хроматографии на колонке с силикагелем, с

СНЬ»СІ» - » ЕІОАс в качестве злюента. Чистье фракции соединили, вьіпарили и получили 2,5г (8896) пень. "Н

ЯМР (СОСІ»): 5 1,04 (а, 6Н, ІСНУ»), 1,72 (8, ЗН, СН»), 2,40 (т, 1Н, ІБСН), 3,38 (т, 2Н), 3,72 (в, Б6Н, 2,0СНУз), 4,12 (т, 2Н), 4,20 (т, 1Н), 4,32 (4, 2Н), 6,84 (т, 4Н, РІ), 7,20 - 7,40 (т, 12Н, СеН и РІ), 8,30 (д, 1Н, МН) и 11,28 (в, 1Н, МН). 1-0-(4,4-димеоюксишритил)-2-(амин (тиминилацешил)|-І-пролан-1,3-диол (9): 4,4-диметокситритил-М-(тиминилацетил)-І -серинол-О-ІВ 8 (34г, 5,41ммоль) растворили в Меон (ЗОмл) и охладили до 0"С на ледяной бане. К зтому холодному раствору при перемешиваний добавили 2М Ммаон (10мл, 20ммоль) и продолжали перемешивание в течение 30 минут при 07С. При помощи уксусной кислоть! рН смеси довели до 7 и вьшпарили смесь досуха. Остаток разделили между водой (5Омл) и СНоСіІ» (150мл) и 7/0 Зкстрагировали СНоСі». Водньй слой также зкстрагировали СНьСі» (5Омл). Соединенньій органический зкстракт промьіли соляньм раствором (5Омл), вьсушили и вьшпарили досуха. Остаток очистили посредством испарительной хроматографии на колонке с силикагелем, с СНоСіо - » ацетоном в качестве злюента. ВьІіход:

З,Ог (9996). "Н ЯМР (СОСІз): 1,72 (в, ЗН, СНУ), 3,0 (т, 2Н), 3,42 (т, 2Н), 3,72 (в, 6Н, 2,0СНа), 3,94 (т, 1Н),, 4,32 (д, 2Н), 4,68 (т, ІН, ОН), 6,84 (т, 4Н, РІ), 7,20 - 7,40 (т, 12Н, СеН и РП), 8,06 (а, 1Н, МН) и 11,28 (ре, 1Н, МН). 1-0-(44-димеоюкситритил)-2-(амин (огиминилацешил))-І-лролан-3-О-(М,М-диизопролил)- рД-цианзтилфосфорамидит (10): 1-0-(4,4-диметокситритил)-2--дамині(тиминилацетил))|-І -пропан-1,3-диол 9 (З3,1г, 5,55ммоль) сушили над твердьм

Маон в вакууме в течение ночи, затем растворили в сухом СНьЬСіІ» (10О0мл). Раствор охладили до 0"С в аргоновой атмосфере. К зтому холодному раствору при перемешиваниий добавили М,М-диизопропилзтиламин (1,29г, 1Оммоль), затем 2-цианзтил-М,М-диизопропилхлорфосфорамидит (1,96г, 8,3ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 1 часа при 0"С и в течение 2 часов при комнатной температуре. Реакционную смесь разбавили СНЬСІ» (100мл) и промьіли органический слой 596 раствором МансСоО»з (100мл), водой (100мл) и соляньім раствором (5Омл) . Зкстракт в СНоСіІ» внісушили, вьіпарили досуха и получили маслянистьй остаток.

Остаток очистили посредством испарительной хроматографии на силикагеле с СНоСіІ» -» ЕЮОАс, содержащим «М 0,195 ТЕА, в качестве злюента. Чистьіе фракции соединили, вьіпарили и получили пену. Пену сушили в течение (5) ночи над твердьім Масон в вакууме. Вьісушенную пену растворили в сухом СНоСі» (20мл) и каплями добавляли в перемешиваемьй сухой гексан (2000мл) в течение часа в аргоновой атмосфере. После зтого образовавшийся осадок перемешивали еще в течение часа, затем отфильтровали, промьіли сухим гексаном (100мл) и сушили твердое вещество над твердьмм Маон в вакууме в течение 4 часов. Вьіход: 3,5г (83905). (ав)

Пример 27 (смотри фиг. 27) ю

М-(трет-бутилоксикарбонил)-О-бензил-ЮО-серии (12): О-бензил-О-серин 11 (5г, 25,64ммоль) взвесили в тетрагидрофуране/воде (8 : 2, 70 мл) при комнатной температуре. К зтой смеси при перемешивании добавили «2: тризтиламин (4,04г, 4Оммоль), затем ди-трет-бутил дикарбонат (6,54г, ЗОммоль) и продолжали перемешивание со в течение ночи при комнатной температуре. Гомогенньій раствор вьіпарили досуха и растворили остаток в зтилацетате (150мл). Органический зкстракт промьіли 0,5М раствором гидросульфата калия (100мл), водой Й (100мл) и соляньмм раствором (5Омл). Зкстракт в зтилацетате вьісушили над безводньмм сульфатом натрия, вьіпарили досуха и получили 7,56г (10095) маслянистого остатка.

М-(трет-бутилоксикарбонил)-О-бензил-ЮО-серинол (13): М-(трет-бутилоксикарбонил)-О-бензил-ЮО-серин (10) « (7,56г, 25,63ммоль) растворили в сухом тетрагидрофуране и охладили до -207С в аргоновой атмосфере. К зтому холодному раствору при перемешиваний добавили ТЕА (3,03г, ЗОммоль) и изобутил хлорформат (4,08Гг, - с ЗОммоль). Перемешивание продолжали в течение 30 минут при -20"С в аргоновой атмосфере. Затем "з реакционную смесь профильтровали под покровом аргона, а осадок промьли сухим тетрагидрофураном (5Омл). и Соединенньй фильтрат медленно добавили в холодньй (07) раствор МавнН; (7,4г, 200Оммоль) в тетрагидрофуране/воде (80 : 20, 200мл) в течение 10 минут. После зтого реакционную смесь перемешивали в течение 2 часов при 0"С, затем при помощи уксусной кислотьі довели рН до 7. Смесь вьшпарили досуха, т» разделили между зтилацетатом/водой (300 : 150мл) и зкстрагировали зтилацетатом. Органический зкстракт со промьіли соляньіїм раствором (100мл), вьісушили над безводньім сульфатом натрия и вьіпарили досуха. Сьрой продукт очистили посредством испарительной хроматографии на колонке с силикагелем, с СНоСі» - »5 ЕЮАс в - качестве злюента. Чистьій продукт соединили, вьіпарили досуха и получили 6,68г (9295) чистого продукта в виде с 50 масла. "Н ЯМР (СОСІз): 5 1,41 (в, 9Н, Вос), 3,60 - 3,70 (т, 4Н), 3,82 (д, 2Н), 4,53 (в, 2Н, ОСНОРІ), 5,20 (Бе, 1Н,

МН) и 7,30 - 7,40 (т, 5Н, РП). с М-(трет-бутилоксикарбонил)-О-бензил-О-серинол-О-1р (14): Кк вьсушенному раствору

М-(трет-бутилоксикарбонил)-О-бензил-О-серинола 13 (6,6бг, 23,5ммоль) в сухом пиридине (5Омл) добавили ТЕА (3,03г, ЗОммоль) при комнатной температуре. К зтому раствору при перемешиваниий добавили изомасляньй 25 ангидрид (4,74г, ЗОммоль) и продолжали перемешивание в течение ночи в аргоновой атмосфере. Реакционную

ГФ) смесь вьшпарили досуха, разделили между ЕЮАс (200мл) и МансСоО»з (595 раствор, 10Омл) и зкстрагировали

ЕЮАс. Органический зкстракт промьіли водой (100мл), соляньім раствором (5Омл) и вьісушили над безводньм де Маазо,). Вьсушенньй раствор вьіпарили досуха и получили сьірой остаток. Остаток очистили посредством испарительной хроматографии на силикагеле с гексаном - » ЕОАс в качестве злюента. Чистье фракции 60 соединили, вьіпарили и получили маслянистьй продукт в количестве 8,0г (9795). "Н ЯМР (СОСІв) :5 1,04. (а,

ЄМ, ІвСН»), 1,39 (в, 9Н, Вос), 2,46 (т, 1Н, ІССН) 3,40 (т, 2Н), 3,92 (т, 2Н), 4,12 (т, 1Н), 4,46 (в, 2Н, ОСНОРІ), 6,84 (й, 1Н, МН) и 7,24 - 7,40 (т, 5Н, РІ).

М-(тиминилацетил)-О-бензил-О-серинол-О-Ір (15): М-(трет-бутилоксикарбонил)-О-бензил-О-серинол-О-Ір 14 (5,0г, 14,25ммоль) перемешивали при комнатной температуре в трифторуксусной кислоте (20мл) и СНоСі» бо (20мл) в течение 30 минут. Реакционную смесь вьіпарили досуха, растворили в сухом СНЗОН (1Омл) и снова вьіпарили досуха. Остаток растворили в СНьЬСі» (150мл), при помощи 595 раствора МансСоО» рН довели до 7 и зкстрагировали раствор СНоСі». Органический слой промьіли водой (5Омл) и соляньм раствором (5Омл).

Зкстракт в СНЬСІ» вьісушили и вьіпарили досуха. Полученньій остаток сушили в вакууме над твердьм КОН в Течение 12 часов. Вьісушенньй остаток в зтом виде, без исследования, бьіл использован в последующих реакциях.

Тиминуксусную кислоту 5 (2,57г, 14ммоль) растворили в сухом М,М-диметилформамиде (5Омл) и охладили до -20"С в аргоновой атмосфере. К зтому холодному раствору при перемешиваний добавили М-метилморфолин (1,52г, 15ммоль), затем изобутил хлорформат (2,04г, 15ммоль). После 15-минутного перемешивания в холодньй 7/0 перемешиваемьй раствор тиминуксусной кислоть! сразу же добавили раствор виішеупомянутого амина в сухом

М,М-диметилформамиде (5Омл). Реакционную смесь перемешивали при -20"С в течение 1 часа, нагрели до комнатной температурьї и продолжали перемешивание в течение ночи. Раствор вьшпарили досуха, а остаток растворили в СНоСіІ» (250мл) и воде (100мл) и зкстрагировали СНЬСІ2- Органический зкстракт промьіли 595 раствором МансСоО»з (100мл), водой (10О0мл) и соляньмм раствором (5Омл). Зкстракт в СН 2Сі»ь вьісушили, /5 Віпарили досуха и получили сьрой продукт. Сьрой продукт очистили посредством испарительной хроматографии на силикагеле с СНоСіІ» - » ацетоном в качестве злюента. Необходимье фракции собрали, вьіпарили и получили 2,8г (5495) чистого продукта "Н ЯМР (СОСІз): 5 1,04 (й, ЄМ, ІБСН»У), 1,72 (в, ЗН, СН), 2,44 (т, 1Н, ІБСН), 3,42 (т, 2Н), 4,06 (т, 2Н), 4,18 (т, 1Н), 4,30 (в, 2Н), 4,46 (в, 2Н, ОСНОРІ), 7,24 - 7,40 (т, 6Н, СеН и

РИ), 8,22 (8, 1Н, МН) и 11,22 (8, 1Н, МН).

Вещество, указанное в заголовке, приготовили также в соответствии со способом, описанньм в связи с приготовлением І-изомера. Использовали следующие реактивь: тиминуксусную кислоту (2,2г, 12ммоль), изобутил хлорформат (1,77г, 1Зммоль), М-метилморфолин (1,52г, 15ммоль), соль трифторуксусной кислоть (3,65г,10ммоль); М-метилморфолин (1,5г, 15ммоль) и сухой М,М-диметилформамид (10Омл). Вьіход: 3,5г (84905).

М-(тиминилацетил)-О-серинол-О-Ір (16): М-(тиминилацетил)-О-бензил-О-серинол-О-Ір 15 (3,5г, 8,3Уммоль) с растворили в зтаноле (5О0мл). К зтому раствору при комнатной температуре добавили РаЯА(ОН)» (1,00г) и о циклогексен (1Омл). Реакционную смесь в течение 12 часов подогревали до 70"С. Катализатор отфильтровали и промьіли метанолом (20мл). Фильтрат вьіпарили досуха и получили белое твердое вещество. Вьіход: 2,7г (98965). "ІН ЯМР (Ме»5О-йв): 5 1,04 (8, 6Н, ІСНУ»), 1,72 (8, ЗН, СН»), 2,42 (т, 1Н, ІБСН), 3,40 (т, 2Н), 3,94 (т, 2Н), 4,06 (т, 1Н), 4,28 (8, 2Н), 4,90 (Її, 1Н, ОН), 7,20 (в, 1Н, СеН), 8,12 (а, 1Н, МН) и 11,22 (в, 1Н, МН). о 4,4-диметоксишритил-М-(тиминилацетил)-О-серинол-О-Ір (17): М-(тиминилацетил)-ЮО-серинол-О-Ір 16 (2,7г, ю 8,2бммоль) растворили в сухом пиридине (5Омл) в аргоновой атмосфере. К зтому раствору при перемешиваний добавили ТЕА (1,01г, 7Оммоль), затем 4,4-диметокситритилхлорид (3,38г, ТОммоль) и продолжали ьо перемешивание в течение ночи при комнатной температуре в аргоновой атмосфере. Реакционную смесь со погасили Меон (1Омл), затем перемешивали в течение 10 минут и вьіпарили досуха. Остаток растворили в

Ас (250мл), промьіли 595 раствором МансСоОз (100мл), водой (100мл) и соляньм раствором (5О0мл). «

Органический зкстракт вьсушили над безводньм Ма»5О4 и вьіпарили досуха. Сьрой продукт очистили посредством испарительной хроматографии на колонке с силикагелем, с СНоСі» - »5 ЕІЮАсС в качестве злюента.

Чистье фракции соединили, вьіпарили и получили 5,0г (9696) пеньі. "Н ЯМР (СОСІ»): 5 1,04 (а, ЄМ, ІСНУ), 1,72 « (85, ЗН, СНУ), 2,40 (т, 1Н, ІБСН), 3,38 (т, 2Н), 3,72 (в, 6Н, 2.0СН»У), 4,12 (т, 2Н), 4,20 (т, 1Н), 4,32 (а, 2Н), З 740 в,84(т, АН, РІ), 7,20 - 7,40 (т, 12Н, СеН и РИ), 8,30 (й, 1Н, МН) и 11,28 (в, 1Н, МН). с 1-0-(4 4-димеоюкситритил)-2-4(амин (тиминилацетил)|-О-пропан-1,3-диол (18):

Із» 4,4-диметокситритил-М-(тиминилацетил)-О-серинол-О-ІБ 17 (5,0г, 7,95ммоль) растворили в Меон (ЗОмл) и охладили до 0"С на ледяной бане. К зтому холодному раствору при перемешиваний добавили 2М Ммаон (10мл, 20ммоль) и продолжали перемешивание в течение 30 минут при 07С о. При помощи уксусной кислоть! рН смеси 49 довели до 7 и вьшарили смесь досуха. Остаток разделили между водой (5О0мл) и СНоСіІ» (250мл) и шк зкстрагировали СНоСі». Водньїй слой также зкстрагировали СНьСІ» (5Омл). Соединенньїй органический зкстракт о промьіли соляньм раствором (5Омл), вьсушили и вьшпарили досуха. Остаток очистили посредством щщ испарительной хроматографии на колонке с силикагелем, с СНоСіо» - » ацетоном в качестве злюента. ВьІіход: 4,0г (9095). "Н ЯМР (СОСІз):1,72 (з, ЗН, СНУ), 3,0 (т, 2Н), 3,42 (т, 2Н), 3,72 (в, ЄН, 2.0СНУ), 3,94 (т, 1Н), 4,32 1 20 (а, 2Н), 4,68 (т, 1Н, ОН), 6,84 (т, 4Н, РИ), 7,20 - 7,40 (т, 12Н, СеН и РІ), 8,06 (й, 1Н, МН) и 11,28 (бз, 1Н, МН). о 1-0-(4,4-диметокситритил)-2-(амин (тиминилацесгил)|-О-пропан-3-0-(М,М-диизопропил)- Д-цианзтилфосфорамидит (19): 1-0-(4,4-диметокситритил)-2--амин (тиминилацетил)|-О-пропан-1,3-диол 18 (2,79г, 5Оммоль) сушили над вв твердьм Маон в вакууме в течение ночи, затем растворили в сухом СНьСі» (100мл). Раствор охладили до 0"С в аргоновой атмосфере. К зтому холодному раствору при перемешиваниий добавили М,М-диизопропилзтиламин (Ф) (1,29г, ТОммоль), затем 2-цианзтил-М,М-диизопропилхлорфосфорамидит (1,96г, 8,Зммоль). Реакционную смесь г перемешивали в течение 1 часа при 0"С и в течение 2 часов при комнатной температуре. Реакционную смесь разбавили СНЬСІ» (100мл) и промьіли органический слой 596 раствором МансСо» (100мл), водой (100мл) и бр боляньм раствором (5Омл). Зкстракт в СНоСі» вьісушили, вьіпарили досуха и получили маслянистьй остаток.

Остаток очистили посредством испарительной хроматографии на силикагеле с СНьоСі» - »5 ЕЮАс, содержащим 0,195 ТЕА, в качестве злюента. Чистье фракции соединили, вьіпарили и получили пену. Пену сушили в течение ночи над твердьім Масон в вакууме. Вьісушенную пену растворили в сухом СНоСі» (20мл) и каплями добавляли в перемешиваемьй сухой гексан (2000мл) в течение часа в аргоновой атмосфере. После зтого образовавшийся бе садок перемешивали еще в течение часа, затем отфильтровали, промьіли сухим гексаном (100мл) и сушили твердое вещество над твердьім Маон в вакууме в течение 4 часов. Вьіход: З,Зг (87905).

Пример 2 8 (смотри фиг. 28) 1-О-бензил-2-Ктрет-бутилоксикарбонил) амин|-3-(Мз-бензоил (тиминил)-І-пропанол (21): к перемешиваемому раствору М3-бензоилтимина 20 (5,75г, 25ммоль) в сухом тетрагидрофуране (200мл) в аргоновой атмосфере при комнатной температуре добавили трифенилфосфин (10,48г, дОммоль) и

Маг-о-трет-бутилоксикарбонил- р-бензилокси-І -серинол З (5,3г, 18,8бммоль). Через 15 минут медленно (в течение

ЗО минут) добавили дизтилазодикарбоксилат (6,96г, 40ммоль). Реакционную смесь накрьли алюминиевой фольгой и перемешивали при комнатной температуре в аргоновой атмосфере в течение 24 часов.

Растворитель вьіпарили досуха, а остаток растворили в ЕЮАс (З0Омл). Органический зкстракт промьіли 595 70 раствором МансСоО»з (100мл), водой (100мл) и соляньім раствором (100мл), затем вьісушили над безводньм

Ма»ЗО,). Внісушенньй зкстракт в ЕЮАс вьіпарили досуха и получили оранжевое масло. Сьірой продукт очистили посредством испарительной хроматографии на силикагеле с гексаном - » Е(Ас в качестве злюента. Фракцию, содержащую требуемьй продукт, соединили и вьпарили. Получили бледно-розовое масло. Вьход: 8,0г (8695). "Н ЯМР (СОСІз): 1,41 (в, 9Н, Вос), 1,72 (8, ЗН, СН3з), 3,56 (т, 2Н), 4,20 (т, 2Н), 4,32 (т, 1Н), 4,52 (а, 75. 2Н, ОСНОРІ), 5,20 (а, 1Н, МН), 7,06 (в, 1Н, СеН) и 7,20 - 7,60 (т, 1ОН, РІ). 2-Ктрет-бутилоксикарбонил) амин!і-3- ІМз-бензоил (тиминил)-І -пропан-1-ол (22): 1-О-бензил-2-Ктрет-бутилоксикарбонил) амині-3-ІМа-бензоил (тиминил)|І-|-пропанол 21 (4,93 г, 1Оммоль) растворили в Меон (100мл) и обработали Ра/с (10905, 1г). Реакционную смесь гидрогенизировали при 344,7кПа (давление водорода) в течение 12 часов. Катализатор отфильтровали, промьили МеонН (5Омл), а фильтрат ввіпарили досуха. Остаток кристаллизовали из ацетона/гексана и получили 3З,70г (9295) чистого продукта, точка плавления 156 - 15920. "Н ЯМР (СОСІз): 1,42 (в, 9Н, Вос), 1,94 (в, ЗН, СН), 3,64 (т, 4Н), 3,84 (т, 1Н), 4,14 (т, 1Н), 5,22 (д, ІН, МН), 7,18 (в, 1Н, Сен), 7,48 (Її, 2Н, РІ), 7,62 (І, ІН, РІ) и 7,98 (9, 2Н, РІ). 1-О-изобутирил-2-Ктрет-бутилоксикарбонил) амині-3-(Мз-бензоил (тиминил)-І -пропанол (23): 2-Ктрет-бутилоксикарбонил)амині-3-|М з-бензоил(тиминил)-І -пропан-1-ол 22 (1,60г, 3,97ммоль) растворили в СМ сухом пиридине (ЗОмл) и перемешивали при комнатной температуре в аргоновой атмосфере. К зтому раствору о при перемешиваний добавили ТЕА (0,51г, 5ммоль) и изомасляньй ангидрид (0,79г, Зммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 12 часов, затем вьіпарили досуха. Остаток растворили в

ЕЮАс (150мл) и промьли 595 раствором МансСоО»з (100мл), водой (100мл) и соляньм раствором (5Омл).

Органический зкстракт вьсушили и вьпарили досуха. Остаток очистили посредством йиспарительной (2

Хроматографии на колонке с силикагелем, с СНоСіо - » ЕІЮАс в качестве злюента. Чистье фракции соединили, ю вьшпарили и получили 1,6бг (8595) пеньі. Чистьій продукт кристаллизовали из ацетона/гексана, точка плавления 165 - 167"С. "Н ЯМР (СОСІ»): 1,16 (а, ЄН, ІБСсН»З), 1,42 (8, 9Н, Вос), 1,94 (в, ЗН, СН»), 2,52 (т, 1Н), 3,64 (т, 7 4Н), 3,84 (т, 1Н), 4,14 (т, 1Н), 5,22 (9, 1Н, МН), 7,18 (в, ІН, СеН), 7,48(Ь 2Н, РН), 7,62 (Б 1Н, Рі) и 7,98(4,2Н, РИ). со 1-О-изобутирил-2-(р-гидроксиацетил) амині-3-(Мз-бензоил (тайминил)-І -пропанол (24):

Зо 1-О-изобутирил-2-Ктрет-бутилоксикарбонил)амин|-3-ІМ 3з-бензоил (тиминил)-І-пропанол 23 (1,6г, З,З38ммоль) М перемешивали в смеси трифторуксусной кислоть (5мл) и СНоСі» (1Омл) при комнатной температуре в в течение 30 минут, затем вьіпарили досуха. Остаток растворили в сухом Меон (10мл) и снова вьіпарили. Полученньй остаток сушили в течение ночи над твердьмм Маон в вакууме. Вньісушенньїй материал использовали в зтом виде « для последующих реакций. З 70 К перемешиваемому раствору гликолевой кислоть (0,53г, 7ммоль) в сухом и М,М-диметилформамиде (50мл) с добавили 1-гидроксибензотриазол (0,67г, бммоль) и /1-зтил-3--3-диметиламинопропил)-карбодиийимид "з гидрохлорид (ЕОС) (1,91г, 1бммоль) После 15-минутного перемешивания при комнатной температуре добавили " ТЕА (1,01г, тТОммоль) и вьішеупомянутую соль трифторуксусной кислоть! в М,М-диметилформамиде (2Омл).

Реакционную смесь перемешивали в течение 12 часов, затем вьіпарили досуха. Остаток разделили между

СНьоСІ» (150мл) и водой (100мл) и зкстрагировали СНьЬСі». Органический зкстракт промьіли соляньім раствором е (БОмл), вьісушили и вьшарили досуха. Остаток очистили посредством испарительной хроматографии на о силикагеле с СНоСі»о - » ацетоном в качестве злюента. Фракции, содержащие требуемьй продукт, собрали, - вьіпарили и получили 1,35г (92905) пень. ІН ЯМР (СОСІ5): 1,16 (а, 6Н, ІСНУ»), 1,94 (в, ЗН, СН»), 2,52 (т, 1Н), 3,20 (рев, 1Н), 3,80 - 4,30 (т, 6Н), 4,56 (т, 1Н), 7,14 (а, 2Н, СеН и МН), 7,50 (ї, 2Н, РИ), 7,64 (ї, 1Н, РІ) и 7,94 ся 70 (д,2нН, Р). о 1-О-изобутирил-2-((р-(4,4'-диметокситритил)-О-ацетил) амин)| -3- |Мз-бензоил (тиминил)-І-пропанол (25): 1-О-изобутирил-2-(Кр-гидроксиацетил) /амині-3-(Мз-бензомл (тиминил)-І-пропанол 24 (1,2г, 2,78ммоль) растворили в сухом пиридине (5Омл) и перемешивали при комнатной температуре в аргоновой атмосфере. К вв Зтому раствору при перемешиваний добавили ТЕА (0,35г, З,5ммоль) и 4,4"-диметокситритил хлорид (1,18Гг,

З,Бммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 12 часов, погасили при

Ф) помощи Меон (ТОмл) и вьшпарили досуха. Остаток растворили в Е(Ас (150мл) и промьіли 595 раствором

ГІ Мансо» (100мл), водой (100мл) и соляньмм раствором (5Омл). Органический зкстракт вьісушили над Ма»зО, и вьшарили досуха. Остаток очистили посредством испарительной хроматографии на силикагеле с СНьоСі» - » бо ЕЮБдс в качестве злюента. Чистье фракции соединили, вьіпарили и получили 1,7г (83795) чистого продукта. тн

ЯМР (СОСІ»з): 1,16 (9, ЄН, ІСНУ»), 1,94 (в, ЗН, СН»), 2,52 (т, 1Н), 3,74 (в, 6Н, 2,0СН»), 3,80 - 4,30 (т, 6Н), 4,56 (т, 1Н), 6,82 (9, 4Н, РИ), 7,14 (а, 2Н, СеН и МН) и 7,26 - 8,00 (т, 14Н, РІ). 2-І(8-(4,4-диметокситритил)-О-ацетил)амин|-З-тиминил-Ї - пропанол (26): 1-О-изобутирил-2-|(В-(4,4'диметокситритил)-О-ацетил)амині-3-|М з-бензоил(тиминил)-І -пропанол 25 (1,55г, 65 2,05ммоль) растворили в Меон (20мл) и охладили до 0"С на ледяной бане. К зтому холодному раствору при перемешиваний добавили 2М Маон (5мл, ТОммоль) и продолжали перемешивание при 0"С в течение 30 минут.

При помощи уксусной кислоть! рН смеси довели до 7 и вьіпарили смесь досуха. Остаток разделили между водой (Ббмл) и СНьЬСІ» (15О0мл) и зкстрагировали СНоСі». Водньй слой также зкстрагировали СНьоСіо (5Омл).

Соединенньій органический зкстракт промьіли соляньм раствором (5Омл), вьісушили и вьіпарили досуха.

Остаток очистили посредством испарительной хроматографии на колонке с силикагелем, с СНоСіо - » ацетоном в качестве злюента. Вьіход: 1,0г (9990). ІН ЯМ (СОСІ5): 1,94 (в, ЗН, СНУ»), 3,74 (в, 6Н, 2,0СН»У), 3,80 - 4,30 (т, 6Н), 4,56 (т, 1Н), 6,82 (а, 4Н, РИ), 7,14 (9, 2Н, СеН и МН) и 7,26 - 8,00 (т, 14Н, РІ). 2-І(Д-(4,4-диметокситритил)-О-ацетил)амин|-З-тиминил-І -пропан-1-0-(М,М-диизопропил) -В-цианзтилфосфорамидит (27): 2-((8-(4,4-диметокситритил)-О-ацетил) амин|-З-тиминил-І -пропанол 26 (1,0ОГг, 70 2,09ммоль) сушили в течение ночи в вакууме над твердьм Маон, затем растворили в сухом СНоСі» (50мл).

Раствор охладили до 0"С в аргоновой атмосфере. К зтому холодному раствору при перемешиваниий добавили

М,М-диизопропилзтиламин (0,54г, 4,2ммоль), затем 2-цианзтил-М,М-диизопропилхлорфосфорамидит (0,7ЗГг,

З, ммоль). Реакционную смесь перемешивали в течение 1 часа при 0"С и в течение 2 часов при комнатной температуре. Реакционную смесь разбавили СНоСі» (100мл) и промьли органический слой 595 раствором 75 Мансо)» (100мл), водой (100мл) и соляньім раствором (5Омл). Зкстракт в СНьЬСІ» внісушили, вьіпарили досуха и получили маслянистьй остаток. Остаток очистили посредством испарительной хроматографии на силикагеле с

СНьЬСІ» - » ЕЮЗАс, содержащим 0,195 ТЕА, в качестве злюента. Чистье фракции соединили, вьіпарили и получили пену. Пену сушили в течений ночи над твердьм МасОН в вакууме. Вьісушенную пену растворили в сухом СНоСіІ» (1О0мл) и каплями в течение ЗО минут добавляли в перемешиваемьй сухой гексан (800мл) в аргоновой атмосфере. После зтого образовавшийся осадок перемешивали еще в течение 30 минут, затем отфильтровали, промьіли сухим гексаном (100мл) и сушили полученное твердое вещество в вакууме над твердьм Маосон в течение 4 часов. Вьіход: 1,3г (82905).

Пример 29 (фиг. 29)

Маз-трет-бутилоксикарбонил-О-бензилгадроксиламин (28): О-бензил-гидроксиламин огидрохлорид (15,9г, «М

О0ммоль) взвесили в смеси тетрагидрофурана (15Омл) и водь! (5Омл). К зтому раствору при перемешиваний (5) добавили ТЕА (15,15г, 150ммоль), затем ди-трет-бутилдикарбонат (23,98г, 110ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 12 часов, затем вьіпарили досуха. Остаток разделили между ЕАс (250мл) и водой (200мл) и зкстрагировали ЕАс. Зкстракт в ЕЮДАс промьіли гидросульфатом калия (10Омл) и соляньім раствором (1О0Омл), вьісушили, вьіпарили досуха и получили 15г (9195) прозрачного (ав) масла. ою 1-хлор-2-(тетрагидропиранил)окси-зтан (29): 1-хлор-зтанол (8,0бг, 100ммоль) растворили в сухом СНьоСі» (100мл) и охладили до 0"С на ледяной бане в аргоновой атмосфере. К зтому раствору при перемешиваний - добавили дигидропиран (12,б6г, 15О0ммоль), затем пиридиний-р-толуол-4-сульфонат (1,25г, бммоль) и со продолжали перемешивание в течение ночи. Реакционную смесь вьіпарили досуха и растворили в ЕЮАс (200мл). Зкстракт в ЕЮАс промьли 595 раствором МансСОз (100мл), водой (100мл) и соляньм раствором «І (100мл). Органический зкстракт вьісушили и вьшпарили досуха. Сьрой материал очистили посредством испарительной хроматографии на силикагеле с гексаном - » СНоСі» в качестве злюента. Чистье фракции собрали, вьіпарили и получили 1г (6795) чистого продукта. «

М-трет-бутилоксикарбонил-М-((тетрагидропиранил)окси|зтил-О-бензилгидроксиламин (30). КК раствору

М3-трет-бутилоксикарбонил-О-бензилгидроксиламина 28 (5,79г, 25,96бммоль) в сухом М,М-диметилформамиде - с (5Омл) при перемешиваний медленно, в течение 15 минут, при 0"С в аргоновой атмосфере добавили Ман (60960, и 1,2г, ЗОоммоль). Реакционную смесь перемешивали при 0"С в течение 30 минут и при комнатной температуре в є» течение часа. Добавили 1-хлор-2-(тетрагидропиранил) окси-зтан 29 (4,95г, ЗОммоль) и подогревали реакционную смесь до 80"С в течение 12 часов. Реакционную смесь охладили и вьіпарили досуха. Остаток взвесили в воде (5О0мл), довели рН раствора до 7 и зкстрагировали его Е(ЮДАс (150мл). Зкстракт в ЕЮАс т» промьіли водой и соляньм раствором, вьісушили и вьпарили досуха. Остаток очистили посредством со испарительной хроматографии на силикагеле с гексаном - » СНоСі» в качестве злюента. Требуемье фракции соединили, вьіпарили и получили 6,0г (6695) маслянистого продукта. "Н ЯМР (СОСІ»з) :5 1,48 (5, 9М, Вос), 1,49 - - 1,84 (т, 6Н, 3.СН»), 3,48 - 3,70 (т, 4Н, 2.СН»5), 3,86 (т, 2Н, СН»), 4,60 (ї, ІН, СН), 4,84 (5, 2Н, СНоРІ) и 7,32 - с 20 7,А2 (т, БН, РІ).

М-трет-бугрилоксикарбонил-М-|((2-гидрокси) зтил|-О-бензилгидроксиламин (31): раствор с М-трет-бутилоксикарбонил-М-(тетрагидропиранил)окси|зтил-О-бензилгидроксиламина 30 (3,51г, 1Оммоль) в тетрагидрофуране:воде"АсОнН (1 : 1 : 1, 100мл) при перемешиваниий подогревали до 70"С в течение З часов.

Реакционную смесь охладили до 0"С и довели рН смеси до 7 при помощи твердого БіансСоОз. Реакционную 22 смесь зкстрагировали в ЕАс (2 х 7Бмл). Соединенньй органический зкстракт промьли водой (100мл) и

ГФ! соляньм раствором (100мл), вьісушили и вьіпарили досуха. Остаток очистили посредством испарительной хроматографии на силикагеле с СНоСі» - » ЕЮАс в качестве злюента. Чистье фракции соединили, вьіпарили и о получили 2,5г (9490) пень. 18. ЯМР (СОСІ5) 85 1,48 (в, 9Н, Вос), 3,60 (ї, 2Н, СН»), 3,74 (т, 2Н, СН»), 4,84 (в, 2Н, СНР) и 7,32 - 7,42 (т, 5Н, РІ). 60 М-трет-бутилоксикарбонил-М-((2-изобутирил) окси| зтил|-О-бензилгидроксиламин (32): Кк раствору

М-трет-бутилоксикарбонил-М-((2-гидрокси)зтил|-О-бензилгидроксиламина 31 (4,2г, 16,бммоль) в сухом пиридине (5Омл) при перемешиваний добавили ТЕА (2,02г, 20ммоль), затем изомасляньй ангидрид (3,16г, 20ммоль) при комнатной температуре в аргоновой атмосфере. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 12 часов, затем вьіпарили досуха. Остаток растворили Е(Ас (200Омл) промьіли 590 бо раствором Мансо» (100Омл), водой и соляньмм раствором (50Омл). Органический зкстракт вьісушили и вьіпарили досуха. Остаток очистили посредством испарительной хроматографии на силикагеле с СНоСі» в качестве злюента. Чистье фракции соединили, вьіпарили и получили 4,5г (80965) чистого соединения. "Н ЯМР (СОСІз) :5 1,04 (а, ЄМ, ІССН»), 1,48 (5, 9Н, Вос), 2,44 (т, 1Н, ІБСН), 3,60 (І, 2Н, СН»), 3,74 (т, 2Н, СН»), 4,84 (в, 2Н, СНоОРІ) и 507,32 - 7,42 (т, 5Н, РІ).

М-(тиминилацетил)-М-І|(2-изобутирил)окси|зтил|-О-бензилгидроксиламин (33):

М-трет-бутилоксикарбонил-М-|(2-изобутирил) окси| зтил|І-О-бензилгидроксиламин 32 (5,0г, 14,84ммоль) растворили в СНоСі» (1Омл) и перемешивали в трифторуксусной кислоте (12мл) в течение 30 минут.

Реакционную смесь вьіпарили досуха и растворили в сухом метаноле (1Омл). Смесь снова вьіпарили досуха-и 70 сушили в течение ночи в вакууме над твердьім Маон. Вьісушенньй материал в зтом же виде, без исследования, использовали в следующей реакции.

Тиминуксусную кислоту 5 (3,13г, 1/ммоль) растворили в сухом М,М-диметилформамиде (75мл) и охладили до -20"С в аргоновой атмосфере. К зтому холодному раствору при перемешиваний добавили М-метилморфолин (2,02г, 20ммоль), затем изобутил хлорформат (2,72г, 20ммоль). После 15-минутного перемешивания раствор 75 упомянутой соли трифторуксусной кислотьі в сухом М,М-димєтилформамиде (5Омл) нейтрализовали

М-метилморфолином (2,02г, 20ммоль) и немедленно, в один прием, добавили к холодному перемешиваемому раствору тиминуксусной кислотьі. Реакционную смесь перемешивали при -20"С в течение 1 часа, нагрели до комнатной температурьї и продолжали перемешивание в течение ночи. Раствор вьшпарили досуха, а остаток растворили в СНоСіІ» (250мл) и воде (100мл) и зкстрагировали СНЬСІ»-Органический зкстракт промьіли 590 раствором МансСоОз (100мл), водой (100мл) и'соляньмм раствором (5Омл). Зкстракт в СН 25Сі» вьсушили, вьішпарили досуха и получили 4,0г (7095) чистого продукта. Чистьій продукт кристаллизовали из СНоСіо/гексана, точка плавления 185 - 1882. "Н ЯМР (Ме»5О-йв) :5 1,00 (а, ЄМ, ІБСНЗ), 1,74 (8, ЗН, СН), 2,44 (т, 1Н, ІБСН), 3,92 (т, 2Н), 4,18 (ї, 2Н), 4,68 (ре, 2Н), 4,98 (в, 2Н), 7,34 (8, 1Н, СеН), 7,40 - 7,50 (т, 5Н, РІ) и 11,32 (рве, 1Н, МН).

Пример 30 (фиг. 30) с (2к, 4кК)-2-карбометокси-4-гидроксипирролидин (35): сухой метанол (40мл) поместили в колбу с кругльм о дном емкостью 250мл, снабженную магнитной мешалкой и парциальньім конденсатором горячего орошения, и охладили на ледяной бане в аргоновой атмосфере. К зтому раствору при перемешиваний добавили ацетилхлорид (4,32г, 55ммоль), затем цис-4-гидрокси-О-пролин 34 (5,00г, 38,17ммоль). Полученньій раствор кипятили в течение 7 - 8 часов, затем охладили до комнатной температурь. Раствор разбавили зфиром, о полученное белое твердое вещество отобрали посредством отсасьмшвания, промьіли зфиром и вьісушили в ю вакууме над твердьм Маон. Вьїход: 6,9г (10090). ІН яЯМР (СОСІ3): 2,09 (2 аа, 1н), 2,34 (т, 1Н), 3,49 - 3,73 (т, ЗН), 3,79 (8, ЗН, СН»), 4,34 (т, 2Н). - (2к,4кК)-1-(трет-буотилоксикарбонил)-2-карбомеаюкси-4-гидроксипирролидин (36): к раствору (2К, 4К) о -2-карбометокси-4-гидроксипирролидина 35 (6,9г, 38,12ммоль) в тетрагидрофуране/воде (8 : 2, 15О0мл) при 32 Пперемешиваний добавили ТЕА (10,1г, 10Оммоль), затем ди-трет-бутилдикарбонат (10,9г, БОммоль) при - комнатной температуре. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение б часов, затем вьіпарили досуха. Остаток растворили в ЕЮАс (200мл) и промьіли 0,5М гидросульфатом калия (5Омл), водой (100мл) и соляньім раствором (50мл). Органический зкстракт вьісушили над Ма»зО,), вьіпарили досуха и « получили 7,8г (84956) маслянистого продукта. Из маслянистого продукта после вьісушивания получили 50 бесцветное твердоеє вещество, точка плавления 75 - 7770. ІН яЯМР (СОСІ5): 1,45 (в, 9Н, Вос), 2,09 (2 аа, З с 1Н), 2,34 (т, 1Н), 3,49 - 3,73 (т, ЗН), 3,79 (в, ЗН, СН»), 4,34 (т, 2Н). ; з» (2к,4кК)-1-(трет-бутилоксикарбонил)-2-гилроксимеотил-4-гидроксипирролидин (37): (2, 4к)-1-(трет-бутилоксикарбонил)-2-карбометокси-4-гидроксипирролидин 36 (7,0г, 28,6ммоль) растворили в сухом тетрагидрофуране (100мл) и охладили на ледяной соляной бане в аргоновой атмосфере. К зтому холодному раствору добавили борогидрид лития (1,88г, 85,9ммоль) мальми порциями в течение 15 минут. После т добавления борогидрида лития реакционную смесь перемешивали при 0"С в течение 1 часа, затем при (оо) комнатной температуре в течение 15 часов в аргоновой атмосфере. Смесь охладили до "С и разбавили водой (5Омл), затем при помощи АсОН довели рН до 6. Реакционную смесь вьіпарили досуха и растворили в ЕЮАс - (200мл), промьіли водой (1О0Омл) и соляньіїм раствором (10Омл). Зкстракт в ЕЮАс вьісушили и вьіпарили досуха. с 20 Остаток очистили посредством испарительной хроматографии на колонке с силикагелем, с СНоСі»о - » ЕЮАс в о качестве злюента. Чистье фракции собрали и вьіпарили досуха. Получили 5,00г (8190) прозрачного масла.

Маслу дали постоять и получили бесцветноє твердое вещество, температура плавления 95 - 9770. "Н ЯМР (СОСІ»): 1,45 (5, 9Н, Вое), 1,90 (аа, 1Н), 2,34 (т, 1Н), 3,40 - 3,62 (т, ЗН), 4,00 (т, 2Н), 4,28 (Б, 1Н), 4,44 (т, 1Н). (2к,4К)-1-(трет-бутилоксикарбонил)-2-(4,4-диметокситритил)оксиметил-4-гидроксипирролидин (38): 59 (2к,4К)-1-(трет-бутилоксикарбонил)-2-гидроксиметил-4-гидроксипирролидин 37 (4,4г, 20,28ммоль) растворили в

ГФ) сухом пиридине(бОмл) и перемешивали в аргоновой атмосфере. К зтому раствору при перемешиваний

ГФ добавили ТЕА (2,53г, 25ммоль), затем 4,4"-диметокситритил хлорид (7,45г, 22ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 12 часов, затем погасили МеонН (1Омл). Раствор во вьшпарили досуха и растворили в ЕІАс (200мл). Слой ЕЮАс промьіли 595 раствором МансСо»з (100мл), водой (100мл) и соляньм раствором. Органический зкстракт вьісушили над безводньм Ма»СО,) и вьіпарили досуха.

Остаток очистили посредством испарительной хроматографии на силикагеле с гексаном - » Е(Ас в качестве злюента. Требуемье фракции соединили, вьіпарили досуха и получили 8,09г (10095) оранжевой пень. "Н ЯМР (СОСІ»): 1,45 (в, 9Н, Вос), 1,90 (да, 1), 2,34 (т, 1Н), 3,40 - 3,62 (т, ЗН), 3,74 (в, 6Н, 2.0СН»У), 4,00 (т, 2Н), 4,28 65 (р5, 1Н), 4,44 (т, 1Н), 6,82 (9, 4Н, РІ) и 7,26 - 8,00 (т, 9Н, РП). (2Кк, 4К)-1-(трет-бутилоксикарбонил)-2-(4,4-диметокситритил) оксиметил-4-Кр-толуолсульфонил) -окси)

пирролидин (39): (2К,4К)-1-(трет-бутилоксикарбонил)-2-(4,4-диметокситритил)оксиметил-4-гидроксипирролидин 38 (8,09г, 20,27ммоль) растворили в сухом пиридине/СНоСі» (2 : 1, 200мл) и охладили на ледяной бане в аргоновой атмосфере. К зтому холодному раствору добавили ТЕА (3,03г, ЗОммоль), затем р-толуолсульфонил Ххпорид (5,77, ЗОммоль). Реакционную смесь перемешивали при 0"С в течение З часов и при температуре до

З0"С в течение 8 часов. Реакционную смесь вьіпарили досуха, разделили между Е(ЮАс (200мл) и 590 раствором

Мансо»з (100мл) и зкстрагировали в ЕЮАс. Зкстракт ЕЮАс промьли водой (100мл) и соляньім раствором (100мл), внісушили и вьіпарили досуха. Сьірой продукт очистили посредством испарительной хроматографии на силикагеле с гексаном - » Е(ЮАс в качестве злюента. Чистье фракции соединили, вьіпарили и получили 12,2г 70 (89905) оранжевого масла. "ІН ЯМ (СОСІ5): 1,45 (в, 9Н, Вос), 1,90 (аа, 1Н), 2,34 (т, 1Н), 2,40 (5, ЗН, СН»), 3,40 - 3,62 (т, ЗН), 3,74 (в, ЄН, 2.0СН»), 4,00 (т, 2Н), 4,28 (рев, 1Н), 4,44 (т, 1Н), 6,82 (й, 4Н, РІ) и 7,26 - 8,00 (т, 1ЗН, РІ). (2К, 45) -1- (трет-бутилоксикарбонил)-2-(4,4'-диметокситритил)оксиметил-4-азил-пирролидин (40): (2К, 4к)-1-(трет-бутилоксикарбонил)-2-(4,4-диметокситритил)оксиметил-4-(р-толуолсульфонил) окси| пирролидин 39 75. (5/1, 7,58ммоль) растворили в диметилформамиде (5Омл) и разбавили водой (бмл). К зтому раствору при перемешиваний добавили азид натрия (0,65г, їОммоль) и в течение 8 часов подогревали до 80"С. Смесь охладили и вьшарили досуха. Остаток разделили между СНоСі» (200мл) и водой (100мл) и зкстрагировали

СНоСІ». Органический зкстракт промьіли соляньіїм раствором (5Омл), вьісушили над Ма»5зО,) и вьіпарили досуха.

Сьрой продукт очистили посредством испарительной хроматографии на силикагеле с гексаном - » ЕЮАс в качестве злюента. Чистье фракции соєдинили, вьіпарили и получили 3,8г (92965) прозрачного масла. "Н ЯМР (СОСІ»): 1,45 (в, 9Н, Вос), 1,90 (да, 1), 2,34 (т, 1Н), 3,40 - 3,62 (т, ЗН), 3,74 (в, 6Н, 2.0СН»У), 4,00 (т, 2Н), 4,28 (р5, 1Н), 4,44 (т, 1Н), 6,82 (9, 4Н, РІ) и 7,26 - 7,80 (т, 9Н, РІ). (2к,45)-1-(трет-бутилоксикарбонил)-2-гидроксиметил-4-амин-пирролидин (41): (2кК,45)-1-(трет-бутилоксикарбонил)-2-(4,4"-диметокситритил)оксиметил-4-азид-пирролидин 40 (2,72г, бммоль) в. СМ метаноле (75мл) гидрогенизировали в присутствий 1095 палладированного угля (0,3г) при комнатной (5) температуре под давлением в 5 атмосфер. Через 12 часов катализатор отфильтровали, промьли метанолом (20мл) и удалили растворитель в вакууме. Вьіход: 1,0г (9395). "Н ЯМР (СОСІз): 1,45 (в, 9Н, Вос), 1,90 (ав, 1Н), 2,34 (т, 1Н), 3,40 - 3,62 (т, ЗН), 4,00 (т, 2Н), 4,28 (рев, 1Н) и 4,44 (т, 1Н). (2к,45)-1-(трет-бутилоксикарбонил)-2-гидроксиметил-4-фталимид-пирролидин (42): («в») (2кК,45)-1-(трет-бутилоксикарбонил)-2-гидроксиметил-4-амин-пирролидин 41 (1,00г, 4,63ммоль) растворили в ю сухом метаноле (20мл) и обработали М-зтоксикарбонил фталимидом (1,09г, бммоль) при комнатной температуре. Реакционную смесь перемешивали в течение б часов и вьшарили досуха. Остаток очистили ж- посредством испарительной хроматографии на силикагеле с СНоСі» - » ЕЮДАс в качестве злюента. Чистье со фракции соединили, вьіпарили и получили 1,5г (9495) чистого продукта в виде пень. "Н ЯМР (СОСІ5): 1,45 (в, 39 ОН, Вое), 1,90 (аа, 1Н), 2,34 (т, 1Н), 3,40 - 3,62 (т, ЗН), 4,00 (т, 2Н), 4,28 (рев, 1Н), 4,44 (т, 1Н) и 7,3 - - 7,6 (т, 4Н, РІ). (2кК,45)-1-(трет-бутилоксикарбонил) -2- |Мз-бензоил (тимин-1-ил) |метил-4-фталимид-пирролидин (43): к перемешиваемому раствору Ма-бензоилтимина 20 (1,15г, бммоль) в сухом тетрагидрофуране (7Омл) в « аргоновой атмосфере при комнатной температуре добавили трифенилфосфин (2,62г, л1Оммоль) и 40. (28,45)-1-(трет-бутилоксикарбонил)-2-гидроксиметил-4-фталимид-пирролидин (1,4г, 4,05ммоль). Через 15 минут З с медленно, в течение 10 минут, добавили дизтилазодикарбоксилат (1,74г, 1їОммоль). Реакционную смесь "» накрьли алюминиевой фольгой и перемешивали при комнатной температуре в аргоновой атмосфере в течение " 24 часов. Растворитель вьпарили досуха, а остаток растворили в ЕАс (150мл). Органический зкстракт промьіли 595 раствором КансСоОз (100мл), водой (100мл) и соляньім раствором (100мл), затем вьісушили над безводньм Ма»5О). Вьісушенньй зкстракт в ЕОАс вьіпарили досуха и получили оранжевоє масло. Сьрой те продукт очистили посредством испарительной хроматографии на силикагеле с гексаном - » ЕАс в качестве о злюента. Фракцию, содержащую требуемьй продукт, соединили и вьіпарили. Получили бледно-розовое масло. з Вьїход: 2,0г (8995). "Н ЯМР (СОСІЗз): 1,41 (в, 9Н, Вос), 1,72 (в, ЗН, СН), 1,90 (ад, 1Н), 2,34 (т, 1Н), 3,40 - 3,62 (т, ЗН), 4,00 (т, 2Н), 4,28 (Б5, 1Н), 4,44 (т, 1Н), 7,06 (в, 1ТН, СеН) и 7,20 - 7,60 (т, 9Н, РІ). 4! 250 Пример 31

Синтез олигонуклеотидов: Олигонуклеотидьі, содержащие модифицированнье аминонуклеиновьсе скелеть, с бьли синтезированьї в автоматическом синтезаторе ДНК (Арріїей Віозузіетв, модель 394) по принципам стандартной фосфорамидитной о химии. Бета-цианзтил-фосфорамидить, реактивьі для синтеза и полистироловьіе колонки СРО бьіли приобретеньі в компании Арріїеа Віозувіетв (Ровіег СПУ, СА). Для синтеза 25 фосфоротиоатньїх олигонуклеотидов стандартную окислительную колбу заменили тетразтилтиурам

ГФ) дисульфидом/ацетонитрилом, а для позтапного тиатирования фосфатньїх связей применили стандартную фосфоротисатную программу АВІ. После расщепления на колонке из пористого стекла протекторнье группь! по удаляли посредством обработки олигонуклеотидов концентрированньм гидроксидом аммония в течение 8 часов при 55"С. Очистку олигонуклеотидов (с группами ОМТ) проводили посредством жидкостной 60 хроматографии вьісокого разрешения на полупрепаративной обращенно-фазной колонке Се (АВІ) с линейнь!м градиентом 595 ацетонитрила в 0,1М тризтиламмония ацетате (буфер А) и ацетонитрила (буфер В).

Протекторнье группьї ОМТ расщепляли посредством обработки 8095 уксусной кислотой, а продукт осаждали при помощи зтанола. Чистоту соединений проверяли при помощи жидкостной хроматографии вьсокого разрешения на аналитической колонке Св (Весктап). Аминонуклеийновье мономерь! присоединяли к 3'-концам, бо 5-концам и в середине последовательностей ДНК со 10095-ной зффективностью присоединения. Без затруднений приготовили также гомополимер, содержащий 16 модифицированньїх аминокислотами тиминов.

Пример 32

Анализ гибридизации: Способность олигонуклеотидов, модифицированньїх аминокислотами, предложенньх настоящим изобретением, гибридизоваться с комплементарньми им последовательностями РНК и ДНК определяется посредством теплового анализа. РНК-комплемент синтезирован компанией (зепзеї! (І а доїІа, СА) и очищен посредством денатурирующего злектрофореза в полиакриламидном геле с мочевиной. К РНК- и

ДНК-комплементам для образования двойньх гибридньх структур добавляли в стехиометрических концентрациях природнье антисмьсловье олигонуклеотидьі или олигонуклеотидь, содержащие 7/0 функциональньсе группь! в определенньїх местах. Зависимость оптической плотности (26бО0нм) и гиперхромизма от температурьі при переходе от двойной структурь к случайной спирали измеряли при помощи ультрафиолетового спектрофотометра Магіап Сагу ІЕ ОМ-МіІзІбіе. Измерения производились в буфере из 10ММ фосфата натрия, рН 7,4, 01мММ ЗДТА и Масі, обеспечивающем ийонную силу либо 0,1М, либо 1,0М. Анализ данньїх проводили посредством графического представления 1/Гпл относительно Іп(СО, где Сі - общая 7/5 Концентрация олигонуклеотидов. Зтот анализ позволил определить термодинамические параметрь!. На оснований данньїх об устойчивости образовавшихся дуплексов или гетеродуплексов оценивали влияние присутствующего в олигонуклеотидах модифицированного пиримидина на устойчивость спирали.

Модификациям, значительно изменяющим устойчивость гибрида, соответствует уменьшение или увеличение свободной знергии (дельта С), и на оснований зтого принимаєется решение об их использований в го антисмьісловьх олигонуклеотидах.

Анализ гибридизации проводился с олигонуклеотидами, содержащими аминонуклеиновье скелеть! на 3-концах, а также на 5-концах. Предварительньй анализ показал, что модифицированнье олигонуклеотидь! образуют дуплексь! с комплементарньмми им последовательностями РНК и ДНК, как и немодифицированнье олигонуклеотидь. с

Пример 33

Устойчивость по отношению к нуклеазам: Устойчивость природньїх, фосфоротисатньїх и модифицированньх і) олигонуклеотидов, предложенньх настоящим изобретением, по отношению Кк сьівороточньмм нуклеазам оценивали посредством инкубации олигонуклеотидов в средах, содержащих фетальную телячью сьіворотку или сьіворотку взрослого человека в различньїх концентрациях. Меченье олигонуклеотидь вьідерживают в средах су зо различное время, обрабатьвают протеазой К и анализируют посредством злектрофореза на 2095 полиакриламид-мочевинньїх денатурирующих гелях с последующей авторадиографией или люминофорной юю визуализацией. Количественную оценку авторадиограмм проводят посредством лазерной денситометрии. Зная «- положение модификации и длину олигонуклеотида, можно определить влияние той или иной модификации на деградацию под действием нуклеаз. Для зкспериментов с цитоплазматическими нуклеазами бьіла использована со

Зв Клеточная линия НІ 60. Пост-митохондриальньй супернатант готовят посредством дифференциального «Е центрифугирования; меченье олигонуклеотидьі вьідерживают в зтом супернатанте в течение различного времени. Затем деградацию олигонуклеотидов оценивают, как и деградацию под действием сьівороточньх нуклеаз. Проводится количественная оценка результатов авторадиографии для сравнения немодифицированньх, т.е. фосфоротисатньїх, олигонуклеотидов с модифицированньми. «

Предварительньій анализ олигонуклеотидов, модифицированньх амонокислотами, показал, что они пт») с устойчивьі к воздействию фосфодизстеразь из змеиного яда.

Включение посредством ссьІілки ;» Все патентьії, патентнье заявки и публикации, упомянутье в настоящем документе, включаются в него посредством ссьлки.

Зквиваленть ї5» Приведенное вьше описание считается достаточньм, чтобьі специалист мог внедрить изобретение в практику. Различнье модификации описанного вьіше изобретения, очевиднье для специалистов в области со молекулярной биологии, органической химии или в родственньх областях, включаются в обьем - нижеследующей формуль! изобретения. с 50

Claims

Формула винаходу

1. Производнье аминокислот или аминоспиртов формуль; | в любой из групп |, ЇЇ У х І ' о МА, з 1 где М обозначает азот, бо Группа Х обозначает СНКООН, где К» обозначает Н, (низший алкил)амин или (низший алкил)имидазол; М обозначаєт Вазе-(СНо)., где Вазе обозначает негалогенизированное вариабельное нуклеозидное основание, где п - 1 - 7; А обозначаєт карбонил; б5 У У У 7 обозначает Н или ОК», где Кз обозначает Н, низший алкил, (низший алкил)іуамин или (низший алкил)

имидазол; М обозначает СНАДОН, где Ку обозначает Н, (низший алкил) амин или (низший алкил) имидазол; Группа ІЇ А обозначаєт карбонил; Х обозначаєт Вазе-(СНо)., где Вазе обозначает негалогенизированное вариабельное нуклеозидное основание, где п- 1 - З; М обозначаєт -СНЬОН; М обозначает -СНоОН; 70 7 обозначаєт Н.

2. Олигонуклеотид, в состав которого включень! соединения по п. 1 таким образом, что межнуклеотиднье связи находятся между М и Х в группеїЇ, М и У в группе ІІ.

З. Олигонуклеотид по п. 2, где межнуклеотидная связь содержит фосфодизфир.

4. Олигонуклеотид по п. 2, где межнуклеотидная связь содержит фосфоротиоат.

5. Олигонуклеотид по п. 2, где межнуклеотидная связь содержит фосфорамидат.

6. Олигонуклеотид по п. 2, где межнуклеотидная связь содержит гидроксамат.

7. Олигонуклеотид по п. 2, в котором различимо множество мономеров, где по меньшей мере один из мономеров содержит 2'-дезоксирибозньй нуклеозид, и дополнительно содержит по меньшей мере две различньїх межнуклеотидньх связи из группьі, состоящей из фосфодизфира, фосфортиоата, фосфорамидата и 2о гидроксамата.

8. Олигонуклеотид по п. 7, которьій имеет 2'-дезоксирибознонуклеозидное пентафуранозильное кольцо, в котором кольцевой кислород заменен одной из групп 5, СНо или МК, где Ко является ацетилом, низшим алкилом, карбонилом, карбонил(низший алкил)амином или карбонил(низший алкил)уимидазолом. с щі 6) «в) ІФ) «- (ее) «

- . и? щ» (ее) - 1 (42) іме) 60 б5 -БО0-