JPS6244171A - L−グルタミン酸生産性新規微生物 - Google Patents
L−グルタミン酸生産性新規微生物Info
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明はコリネバクテリウム属またはブレビバクテリウ
ム属に属し、リゾチームに感受性を有し、培地中に存在
する過剰のビオチンによってL−グルタミン酸の生産が
抑制されないし一グルタミン酸生産性新規微生物に関す
る。
ム属に属し、リゾチームに感受性を有し、培地中に存在
する過剰のビオチンによってL−グルタミン酸の生産が
抑制されないし一グルタミン酸生産性新規微生物に関す
る。
生育にビオチンを要求するし一グルタミン酸生産菌のし
一グルタミン酸生産性は培地中のビオチン濃度と極めて
密接な関係があり、生育に対して制限潰のビオチン濃度
のときはじめてL−グルタミン酸を生産できる。一方安
価な培地の粗原料として利用される廃糖蜜、殿粉加水分
解物などはビオチンを多量に含有している。これら粗原
料を含有する培地にL−グルタミン酸生産菌を培養する
方法としては特公昭37−1695号公報、特公昭38
−25288号公報などに記載されている方法が知られ
ているが、工業的にはさらに優れた方法が望まれている
。
一グルタミン酸生産性は培地中のビオチン濃度と極めて
密接な関係があり、生育に対して制限潰のビオチン濃度
のときはじめてL−グルタミン酸を生産できる。一方安
価な培地の粗原料として利用される廃糖蜜、殿粉加水分
解物などはビオチンを多量に含有している。これら粗原
料を含有する培地にL−グルタミン酸生産菌を培養する
方法としては特公昭37−1695号公報、特公昭38
−25288号公報などに記載されている方法が知られ
ているが、工業的にはさらに優れた方法が望まれている
。
本発明者らは、安価な粗原料を用い、過剰量のビオチン
の作用を回避してL−グルタミン酸を製造する方法につ
き研究した結果、従来のし一グルタミン酸生産菌を親株
として変異誘導したりゾチームに感受性を有する変異株
を用いれば、過剰のビオチン含有培地を用いても、ビオ
チンによる抑制を受けることなく高い収率でL−グルタ
ミン酸を生産できることを見出した。
の作用を回避してL−グルタミン酸を製造する方法につ
き研究した結果、従来のし一グルタミン酸生産菌を親株
として変異誘導したりゾチームに感受性を有する変異株
を用いれば、過剰のビオチン含有培地を用いても、ビオ
チンによる抑制を受けることなく高い収率でL−グルタ
ミン酸を生産できることを見出した。
以下本発明をさらに詳細に説明する。
本発明によればコリネバクテリウム属またはブレビバク
テリウム属に属し、リゾチームに感受性を有し、培地中
に存在する過剰のビオチンによってL−グルタミン酸の
生産が抑制されない性質を有する微生物を培地に培養す
れば培地中にL−グルタミン酸が蓄積するので、これを
採取することにより高収率にL−グルタミン酸が得られ
る。
テリウム属に属し、リゾチームに感受性を有し、培地中
に存在する過剰のビオチンによってL−グルタミン酸の
生産が抑制されない性質を有する微生物を培地に培養す
れば培地中にL−グルタミン酸が蓄積するので、これを
採取することにより高収率にL−グルタミン酸が得られ
る。
本発明に用いる微生物はコリネバクテリウム属またはブ
レビバクテリウム属に属し、リゾチームに感受性を有し
、培地中に存在する過剰のビオチンによってL−グルタ
ミン酸の生産が抑制されない性質を有する微生物であれ
ばいかなる菌株をも用いることができる。一般にはコリ
ネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属し、
L−グルタミン酸生産能を有する菌株を親株とし、これ
を変異誘導処理して得られた変異株からリゾチームに感
受性を有するものを選択し、これを用いる。
レビバクテリウム属に属し、リゾチームに感受性を有し
、培地中に存在する過剰のビオチンによってL−グルタ
ミン酸の生産が抑制されない性質を有する微生物であれ
ばいかなる菌株をも用いることができる。一般にはコリ
ネバクテリウム属またはブレビバクテリウム属に属し、
L−グルタミン酸生産能を有する菌株を親株とし、これ
を変異誘導処理して得られた変異株からリゾチームに感
受性を有するものを選択し、これを用いる。
変異誘導の方法としては、紫外線照射、放射線照射、変
異誘起剤処理等の通常の方法が用いられる。
異誘起剤処理等の通常の方法が用いられる。
変異誘導された変異株からリゾチームに感受性を有する
菌株を選択するには、親株が生育可能な濃度のりゾチー
ムを含有する培地で生育できなくて、リゾチーム無添加
培地では親株と同様に生育できるものを選べばよい。従
って、ここでリゾチームに感受性であるとは、リゾチー
ムに対する最小阻止濃度が親株より低いことを意味する
。また培地中に存在する過剰のビオチンによってL−グ
ルタミン酸の生産が抑制されないとは、培地中に存在す
る過剰のビオチンによるし一グルタミン酸生産の抑制が
実質的に無視できる程度のものであることを意味する。
菌株を選択するには、親株が生育可能な濃度のりゾチー
ムを含有する培地で生育できなくて、リゾチーム無添加
培地では親株と同様に生育できるものを選べばよい。従
って、ここでリゾチームに感受性であるとは、リゾチー
ムに対する最小阻止濃度が親株より低いことを意味する
。また培地中に存在する過剰のビオチンによってL−グ
ルタミン酸の生産が抑制されないとは、培地中に存在す
る過剰のビオチンによるし一グルタミン酸生産の抑制が
実質的に無視できる程度のものであることを意味する。
具体的には前記のごとき粗原料を用いた場合でも過剰の
ビオチンによる影響をうけることなくし一グルタミン酸
の生産ができることを意味する。
ビオチンによる影響をうけることなくし一グルタミン酸
の生産ができることを意味する。
本発明に用いる具体的に好適な菌株の一例としては、コ
リネバクテリウム・グルタミクムATCC13032を
親株として得られたコリネバクテリウム・グルタミクム
KY9703(微工研菌寄第4412号、NRRLI
1271)、コリネバクテリウム・グルタミクムKY9
705(微工研菌寄第4413号、NRRL11272
)およびブレビバクテリウム・フラブムΔTCC140
67を親株として得られたブレビバクテリウム・フラブ
ムKY9733(微工研菌寄第4414号、NRRL1
1273)があげられる。
リネバクテリウム・グルタミクムATCC13032を
親株として得られたコリネバクテリウム・グルタミクム
KY9703(微工研菌寄第4412号、NRRLI
1271)、コリネバクテリウム・グルタミクムKY9
705(微工研菌寄第4413号、NRRL11272
)およびブレビバクテリウム・フラブムΔTCC140
67を親株として得られたブレビバクテリウム・フラブ
ムKY9733(微工研菌寄第4414号、NRRL1
1273)があげられる。
コリネバクテリウム・グルタミクムATCC13032
を親株としてリゾチーム感受性変異株を取得する方法に
ついて以下具体的に説明する。
を親株としてリゾチーム感受性変異株を取得する方法に
ついて以下具体的に説明する。
該親株を粉末ブイヨン(極東製薬社製)20g/lおよ
び酵母エキス5g/j2の組成を有する培地(殺菌前p
H7,2、以下C培地という)に植菌し30℃で振盪培
養する。中期対数期で培養を中止し、集菌し、生理食塩
水で洗浄後、M /20 ) IJ、ス・マレート緩衝
液<pH6,0’) l;l: 5 XIO’細胞/細
胞7汀lニうに懸濁する。この懸濁液に最終濃度500
Jig/mlになるようにニトロソグアニジンを加え、
25℃で30分間放置し、遠心分離により菌体を集め、
同一緩衝液で菌体を洗浄後、生理食塩水に懸濁し、適宜
生理食塩水で希釈してC培地にさらに2g/aの寒天を
含む固体培地(以下CA培地という)に塗りつける。こ
れを30℃で2日間培養し、生じたコルニー(約6.
OOO)を次の3種類の固体培地にレプリカ法により塗
りつける。
び酵母エキス5g/j2の組成を有する培地(殺菌前p
H7,2、以下C培地という)に植菌し30℃で振盪培
養する。中期対数期で培養を中止し、集菌し、生理食塩
水で洗浄後、M /20 ) IJ、ス・マレート緩衝
液<pH6,0’) l;l: 5 XIO’細胞/細
胞7汀lニうに懸濁する。この懸濁液に最終濃度500
Jig/mlになるようにニトロソグアニジンを加え、
25℃で30分間放置し、遠心分離により菌体を集め、
同一緩衝液で菌体を洗浄後、生理食塩水に懸濁し、適宜
生理食塩水で希釈してC培地にさらに2g/aの寒天を
含む固体培地(以下CA培地という)に塗りつける。こ
れを30℃で2日間培養し、生じたコルニー(約6.
OOO)を次の3種類の固体培地にレプリカ法により塗
りつける。
■ CA培地
■ CLΔ培地:CA培地を加熱殺菌後、冷却して培地
の温度が45℃まで下がってから200■/1になるよ
うにリゾチームを添加した培地。
の温度が45℃まで下がってから200■/1になるよ
うにリゾチームを添加した培地。
■ MA培地ニゲルコース10g/1SNH,CA4g
7ft、尿素2g/1SK)(2PO41g/(1,に
2HPO43g/β、FaSOs・7H2010mg/
j!、Mg5O<・7H20400mg/jl!S M
nC62・4 H2O2mg/j!S ZnSO4’
78200.9mg/CCuS○*・5H200,4I
IIg/12゜Na2B<Ot・1OH200,09m
g#、(NH4)sMOt○24’4H200,04m
g/7!、ビオチン30犀/β、サイアミン塩酸塩1+
ng/J、システィン塩酸塩20mg/βおよび寒天2
0g/I2の組成を有する培地(殺菌前p H7,0)
。
7ft、尿素2g/1SK)(2PO41g/(1,に
2HPO43g/β、FaSOs・7H2010mg/
j!、Mg5O<・7H20400mg/jl!S M
nC62・4 H2O2mg/j!S ZnSO4’
78200.9mg/CCuS○*・5H200,4I
IIg/12゜Na2B<Ot・1OH200,09m
g#、(NH4)sMOt○24’4H200,04m
g/7!、ビオチン30犀/β、サイアミン塩酸塩1+
ng/J、システィン塩酸塩20mg/βおよび寒天2
0g/I2の組成を有する培地(殺菌前p H7,0)
。
30℃で2日間培養後、CA培地で生育し、CLA培地
で生育しない菌をリゾチーム感受性変異株として得る。
で生育しない菌をリゾチーム感受性変異株として得る。
MA培地で親株と同様に生育する自己栄養性でリゾチー
ムに対して感受性の変異株は試験した6、000コロニ
ーの中に110株得られた。
ムに対して感受性の変異株は試験した6、000コロニ
ーの中に110株得られた。
この110株中1了株がビオチン過剰培地でも多量のL
−グルタミン酸を生育する能力を有していた。コリネバ
クテリウム・グルタミクムKY9703およびK Y9
705はかくして得られた変異株の一例である。
−グルタミン酸を生育する能力を有していた。コリネバ
クテリウム・グルタミクムKY9703およびK Y9
705はかくして得られた変異株の一例である。
ブレビバクテリウム・フラブムATCC14067を親
株とする変異誘導も上記と同様に行って、ブレビバクテ
リウム・フラブムKY9733を得た。
株とする変異誘導も上記と同様に行って、ブレビバクテ
リウム・フラブムKY9733を得た。
上記例示の変異株のMA培地、CA培地、CLA培地で
の生育およびリゾチーム感受性度について親株と比較し
た結果を第1表に示す。3種類の固体培地上での生育は
レプリカ法で塗りつけ、30℃で2日間培養後判定した
。表中生育欄の+は菌の生育が観察されたものを、−は
生育が観察されなかったものを示す。また表中リゾチー
ム感受性は次のように試験した。すなわちC培地にて2
4時間30℃液体振盪培養した菌を集菌後、生理食塩水
にて適当に希釈して菌体の懸濁液をつくる。
の生育およびリゾチーム感受性度について親株と比較し
た結果を第1表に示す。3種類の固体培地上での生育は
レプリカ法で塗りつけ、30℃で2日間培養後判定した
。表中生育欄の+は菌の生育が観察されたものを、−は
生育が観察されなかったものを示す。また表中リゾチー
ム感受性は次のように試験した。すなわちC培地にて2
4時間30℃液体振盪培養した菌を集菌後、生理食塩水
にて適当に希釈して菌体の懸濁液をつくる。
この懸濁液10′細胞相当を倍々系列の濃度のリゾチー
ムを含有するCA培地に滴下接種し、30℃で2日間培
養する。菌の生育がまったくみとめられない最小のリゾ
チーム濃度を菌のりゾチーム感受性値(最小生育阻止濃
度)とした。
ムを含有するCA培地に滴下接種し、30℃で2日間培
養する。菌の生育がまったくみとめられない最小のリゾ
チーム濃度を菌のりゾチーム感受性値(最小生育阻止濃
度)とした。
第 1 表
本発明の微生物を培養するための培地は、炭素源、窒素
源、無機化合物、その他の栄養素を適当に含む培地なら
ば、通常L−グルタミン酸生産に用いられる天然培地、
合成培地のいずれも使用できる。たとえば炭素源として
は蔗糖、ブドウ糖、糖蜜などの糖質および殿粉糖化液な
どが、窒素源としてはアンモニア、硫酸アンモニウム、
塩酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、燐酸アンモニウ
ム、炭酸アンモニウム、水酸化アンモニウム、クエン酸
アンモニウム、酒石酸アンモニウム、酢酸アンモニウム
、尿素などの有機無機窒素化合物、ペプトン、肉エキス
、コーンスチーブリカーなどの天然栄養源などが、無機
化合物としては燐酸第一カリ、燐酸第二カリ、硫酸カリ
、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、硫酸第一鉄、
塩化第二鉄、硫酸マンガン、塩化マンガンなどが、その
他の栄養源としてはビオチン、サイアミンなどが用いら
れる。
源、無機化合物、その他の栄養素を適当に含む培地なら
ば、通常L−グルタミン酸生産に用いられる天然培地、
合成培地のいずれも使用できる。たとえば炭素源として
は蔗糖、ブドウ糖、糖蜜などの糖質および殿粉糖化液な
どが、窒素源としてはアンモニア、硫酸アンモニウム、
塩酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、燐酸アンモニウ
ム、炭酸アンモニウム、水酸化アンモニウム、クエン酸
アンモニウム、酒石酸アンモニウム、酢酸アンモニウム
、尿素などの有機無機窒素化合物、ペプトン、肉エキス
、コーンスチーブリカーなどの天然栄養源などが、無機
化合物としては燐酸第一カリ、燐酸第二カリ、硫酸カリ
、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、硫酸第一鉄、
塩化第二鉄、硫酸マンガン、塩化マンガンなどが、その
他の栄養源としてはビオチン、サイアミンなどが用いら
れる。
培養は振盪培養、通気攪拌培養などの好気的条件で行い
、培養温度は24〜37℃とくに28〜33℃が好適で
ある。培養中は適当な中和剤を用いてpHを6〜9に調
整するのが好ましい。培養は1〜3日間行えば培養液中
に著量のL−グルタミン酸が生成蓄積する。培養液から
のし一グルタミン酸の採取は、菌体を除去した上清液か
ら、イオン交換樹脂による吸脱着法、濃縮晶析法、等電
点晶析法など、従来のし一グルタミン酸の製造において
常用される諸方法を適宜使用して行うことができる。
、培養温度は24〜37℃とくに28〜33℃が好適で
ある。培養中は適当な中和剤を用いてpHを6〜9に調
整するのが好ましい。培養は1〜3日間行えば培養液中
に著量のL−グルタミン酸が生成蓄積する。培養液から
のし一グルタミン酸の採取は、菌体を除去した上清液か
ら、イオン交換樹脂による吸脱着法、濃縮晶析法、等電
点晶析法など、従来のし一グルタミン酸の製造において
常用される諸方法を適宜使用して行うことができる。
以下に本発明の実施例を示す。
実施例1.−
グルコース40g/l、(N)(4)2SO42g/l
!、MgSO3・7H200,5g#!5K82P0゜
0.5g/j!、K2HPO41g/j!、Fe50+
・7 H202mg/ j!、Mn5CL’4Hz0
2mg/j!−サイアミン塩酸塩 1mg/β、フェノ
ールレッド10mg/j!およびビオチン2 Jig/
lあるいは1100a/βの組成を有する培地を調製
し、p)lを7.0に調整した後、3Qmlずつ30
Qml容の枝材フラスコに入れ、115℃で15分間加
熱殺菌した。冷却後、別に加熱殺菌した尿素液を2g/
βになるように添加した。この培地に第2表に示した菌
を接種し30℃で振盪培養を行った。培養中培養液をp
H6,5〜8.0に保つため12時間目と20時間目
の2回尿素液を4g/(lになるように添加し、32時
間で培養を終了した。かくして培養液中に蓄積したし一
グルタミン酸量は、第2表に示す通りである。培養液1
βから菌体を除去し、a縮し、塩酸でp H3,2に調
整し、冷却してL−グルタミン酸の粗結晶を得た。粗結
晶の量(g)を括弧内に示す。
!、MgSO3・7H200,5g#!5K82P0゜
0.5g/j!、K2HPO41g/j!、Fe50+
・7 H202mg/ j!、Mn5CL’4Hz0
2mg/j!−サイアミン塩酸塩 1mg/β、フェノ
ールレッド10mg/j!およびビオチン2 Jig/
lあるいは1100a/βの組成を有する培地を調製
し、p)lを7.0に調整した後、3Qmlずつ30
Qml容の枝材フラスコに入れ、115℃で15分間加
熱殺菌した。冷却後、別に加熱殺菌した尿素液を2g/
βになるように添加した。この培地に第2表に示した菌
を接種し30℃で振盪培養を行った。培養中培養液をp
H6,5〜8.0に保つため12時間目と20時間目
の2回尿素液を4g/(lになるように添加し、32時
間で培養を終了した。かくして培養液中に蓄積したし一
グルタミン酸量は、第2表に示す通りである。培養液1
βから菌体を除去し、a縮し、塩酸でp H3,2に調
整し、冷却してL−グルタミン酸の粗結晶を得た。粗結
晶の量(g)を括弧内に示す。
第 2 表
実施例2゜
実施例1で用いた培地中グルコースを甘蔗廃糖蜜(グル
コースとして40 g/l相当量)に換え、加熱殺菌後
の培地をp H7,0に再調整する以外は実施例1と同
様に行った。培養液中に蓄積したし−グルタミン酸量を
第3表に示す。
コースとして40 g/l相当量)に換え、加熱殺菌後
の培地をp H7,0に再調整する以外は実施例1と同
様に行った。培養液中に蓄積したし−グルタミン酸量を
第3表に示す。
Claims (3)
- (1)コリネバクテリウム属またはブレビバクテリウム
属に属し、リゾチームに感受性を有し、培地中に存在す
る過剰のビオチンによってL−グルタミン酸の生産が抑
制されない性質を有する微生物。 - (2)該微生物がコリネバクテリウム・グルタミクムま
たはブレビバクテリウム・フラブムに属する菌株から選
ばれる特許請求の範囲1の微生物。 - (3)該微生物がコリネバクテリウム・グルタミクムK
Y9703(微工研菌寄第4412、NRRL1127
1)、コリネバクテリウム・グルタミクムKY9705
(微工研菌寄第4413、NRRL11272)、およ
びブレビバクテリウム・フラブムKY9733(微工研
菌寄第4414、NRRL11273)から選ばれる特
許請求の範囲2の微生物。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP18606186A JPS6244171A (ja) | 1986-08-07 | 1986-08-07 | L−グルタミン酸生産性新規微生物 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP18606186A JPS6244171A (ja) | 1986-08-07 | 1986-08-07 | L−グルタミン酸生産性新規微生物 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2882178A Division JPS54122794A (en) | 1978-03-14 | 1978-03-14 | Preparation of l-glutamic acid |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS6244171A true JPS6244171A (ja) | 1987-02-26 |
JPH0354550B2 JPH0354550B2 (ja) | 1991-08-20 |
Family
ID=16181705
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP18606186A Granted JPS6244171A (ja) | 1986-08-07 | 1986-08-07 | L−グルタミン酸生産性新規微生物 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS6244171A (ja) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1996006180A1 (fr) * | 1994-08-19 | 1996-02-29 | Ajinomoto Co., Inc. | Procede de production de l-lysine et d'acide l-glutamique par fermentation |
WO2000014241A1 (fr) * | 1998-09-04 | 2000-03-16 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Nouveau gene |
CN115135759A (zh) * | 2021-01-27 | 2022-09-30 | Cj第一制糖株式会社 | 新型葡萄糖胺-6-磷酸脱氨酶变体及使用其生产l-谷氨酸的方法 |
-
1986
- 1986-08-07 JP JP18606186A patent/JPS6244171A/ja active Granted
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1996006180A1 (fr) * | 1994-08-19 | 1996-02-29 | Ajinomoto Co., Inc. | Procede de production de l-lysine et d'acide l-glutamique par fermentation |
WO2000014241A1 (fr) * | 1998-09-04 | 2000-03-16 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Nouveau gene |
US6855516B1 (en) | 1998-09-04 | 2005-02-15 | Kyowa Hakko Kogyo, Co., Ltd. | Gene conferring lysozyme insensitivity to corynebacterium |
US7223587B2 (en) * | 1998-09-04 | 2007-05-29 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Gene conferring lysozyme insensitivity to Corynebacterium |
CN115135759A (zh) * | 2021-01-27 | 2022-09-30 | Cj第一制糖株式会社 | 新型葡萄糖胺-6-磷酸脱氨酶变体及使用其生产l-谷氨酸的方法 |
CN115135759B (zh) * | 2021-01-27 | 2023-01-31 | Cj第一制糖株式会社 | 新型葡萄糖胺-6-磷酸脱氨酶变体及使用其生产l-谷氨酸的方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH0354550B2 (ja) | 1991-08-20 |
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