JPS6192589A

JPS6192589A - ラミナリペンタオ−スの製造法

Info

Publication number: JPS6192589A
Application number: JP59212716A
Authority: JP
Inventors: Hideji Nishibashi; 秀治西橋; Tadashi Katabami; 方波見　忠; Mikio Ooyama; 幹男大山; Tadao Matsubayashi; 松林　忠男
Original assignee: Dainippon Ink and Chemicals Co Ltd
Current assignee: DIC Corp
Priority date: 1984-10-12
Filing date: 1984-10-12
Publication date: 1986-05-10
Also published as: JPH0437719B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ぐ産業上の利用分野ン本発明は、ストレプトマイセス属に属する微生物の生産
するβ−１，３糖分解酵素（β−１，３グルカナーゼ）
を用いてβ−１，３グルコシル糖化合物を分解して得ら
れたラミナリペンタオース（グルコースがβ−１，３の
位置で５個結合したものＧｓ　）を製造する方法に関す
るものである。

最近、デンプンを分解して得られるマルトオリゴｍ（ｃ
ｓ〜Ｇｏ　）の製造技術の開発が要望されておシ、これ
らは食品の甘味料、増量剤、賦形剤、包接剤として食品
、楽品、及び種々の工業製品に広く利用できると考えら
れている。

これと同様に新規なラミナリペンタオースはこれらの分
野への新たな用途を提供することができるものである。

また近年、抗腫瘍活性、抗細菌感染症作用、免疫系に及
ぼす作用等を持つ担子菌、子のり菌、不完全菌類等が江
生ずる多糖化合物の構造分析が精力的に検討され、活性
多循の基本骨格は３〜５個のβ−（１→３）−Ｄ・−グ
ルカン直鎖にβ−１，６モノグルコシル分岐鎖が結合し
たものであるという報告がなされている。〔水野卓；化
学と生物Ｖｏｌ。

２１、虎７．Ｐ４７３〜（１９８５）、水野卓；農芸化
学大会要旨集Ｐ１３（１９８４）、三崎旭；農芸化学大
会要旨集Ｐｉ　４（１９８４））そしてこれら活性多糖
化合物の化学合成が分岐グルコ四糖から試みられ、また
、農薬、抗生物質の生理作用を分子レベルで解明する為
、細胞表層グルカンの化学合成がマンノペンメオースを
出発原料として行なわれている。〔ともに小川智也；化
学と生物Ｖｏ）、２０゜＆１２Ｐ７８９　（１９８２）
）ラミナリペンタオースは、これらの化学合成の出発物
質として有用なものである。

（発明の構成）本発明者らはβ−１，３グルコシル糖化合物をラミナリ
ペンタオースに分解する値生物金鋭意検索の結果、スト
レプトマイセス域に属する一菌株が生産するβ−１，３
糖分解酵素（β−１，６グルカナーゼ）の一種がβ−１
，３グルコシル糖化合物を分解し、高収率でラミナリペ
ンタオーヌを生成することを見い出し本発明を完成する
に至った。

即ち、本発明はβ−１，３グルコシル糖化合物又はその
部分分解物金うミナリペンタオースに分解する能力を有
するストレプトマイセス域に属する微生物の生産するβ
−１，３糖分解酵素（β−１，６−グルカナーゼと称す
）をβ−１，６グルコシル糖化合物又はその部分分解物
に作用させて得られることを特徴とするラミナリペンタ
オースの製造法を提供するものである。

（従来技術） β−１，３１ｓ分解酵素は、これまで主として酵母細胞
壁の溶解あるいは、ビール工業における麦汁の粘度低下
を目的として利用されているにすぎず、分解生成糖を採
取することを目的とした報告は見あたらない。β−１，
３グルコシル糖化合物類を分解してラミナリペンタオー
スの生成を確認している報告はあるが他の菌株のもので
ある。

またストレプトマイセス域の放線菌が生産するβ−１，
３グルカナーゼは主に酵母細胞壁の溶解を目的としたも
のとして知られておシ、例えばストレプトマイセス　ア
ルビドフラバス（ｓｔ、　ａｌｂｉｄｏｆｌａｖｕｓ　
　；醗酵工学会誌第５９巻高１０　７６６頁〜（１９６
５））、ストレプトマイセス　エスピー（Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｍｙｃｅｓ　８Ｐ、　）　（Ａｑｒｌｃｕｌ。

Ｂｉｏｌｏｇ＊　Ｂｌｏｃｈｅｍ、第１１１巻、３５８
頁〜３６４頁、（１９６５））、ストレプトマイセス　
ムリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｅｅｓ　ｍｕｒｌｎｕｓ
　）　（醗酵工学会誌第５９巻ｓ＆６　５９９頁〜（１
９７Ｂ））等が報告されているが、いずれもラミナリペ
ンタオースを主生成物としたものではなく本願のβ−１
，３グルカナーゼとは異なるものである。

本発明で使用されるβ−１，６砧分解酵累は、ストレプ
トマイセス域に属する微生物により生産され、β−１，
３グルコシル権化合物又はでの部分分解物に作用し、ラ
ミナリペンタオースを主成分とする分解生成物を生ぜせ
しめる能力を有する０索であればいずれでも良いが、好
ましくはストレプトマイセス　マテンシヌ　ＤＩＣ−１
０８’！ｒ培ｄして得られるβ−１，３ｍ分解酵素（β
−１，３グルカナーゼＦｉｌと称す）である。

β−１，３−グルカナーゼにより生成するラミナリペン
タオースは、使用するβ−１，３グルコシル糖化合物の
種類や糖化時の反応条件（例えばβ−１，３グルコシル
、枯化合物の譲度、ＰＨｓ　１Ｍ１度、酵素濃度）によ
っても異なるが、通常β−１，３グルコシル糖化合物に
対して収率２０〜９０重量％の値の得られるβ−１，３
−グルカナーゼでるるととが望ましい。

本発明で好ｔＬ＜用いら１しるβ−１，６グルカナーゼ
Ｆｉｌの性質を次に示す。

ｆｉｌ　　作用；β−１，３グルコシル糖化合物、例え
ばカードラン、ラミナリン、パキマン、０母細胞壁、又
はその部分分解物などからラミナリペンタオースを主成
分とする楯分解物を生Ｊ反する。

（２）作用ｐＨ範聞及び最適作用ｐＨ；ｐＨ３〜９の範
囲に作用し、最適ｐＨは、６付近である。（第１図参照
）（３）作用温度範囲及び最適作用温度：約７０℃まで
作用し、最適作用温度は約６０℃である。（第２図参照
）（４）精製方法本酵素は培養口過液から硫安６５チ飽オロで沈澱物とし
て回収後、　ＤＥＡＥ−８ｅｐｈａｄｅｘ　Ａ−２５カ
ラムクロマトグラフイー（０，０１Ｍ　　Ｔｖｉｇ−Ｈ
ｅｌ緩衝液ｐ　Ｈ７，５で平衡化）を行い、その未吸着
区分を集める。次いで、ＣＭ−セファデックスＣ−２５
カラムクロマトグラフイー＜　ｏ、　ｏ　ｉ　Ｍ酢はバ
ッファーｐＨ６，０で平田化）を行い、Ｎａｃｌの０．
１Ｍ溶液で溶出される区分を集め、硫安５０〜７０％飽
和としてその沈澱物を回収する。その後、　５ａｐｈａ
ｄｅｘ　Ｇ−Ｉ　Ｄ。

（フマルマシア社製）ゲルクロマトグラフィー（０，０
１Ｍリン酸バッファー、ｐＨ７０で平衡化）を行うこと
により、クロマト的に単一酵素に精製できる。

（５）分子量；　５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−１００ゲルク
ロマトグラフィーによる分子量は約３１．０００と推定
できる。

本発明の酵素は、上記β−１，３グルカナーゼが好まし
く用いられるが、この酵素はストレプトマイセス属の菌
株、好ましくは、ストレプトマイセス　マテンシス　Ｄ
　Ｉ　Ｃ−１０８よシ得られる。

又、こうしたβ−１，３−グルカナーゼは、特異的にラ
ミナリペンタオース全生成させる為、β−１，３グルカ
ンの構造解析用の手段となシうるものである。また他の
好ましいものとしてこれらの菌株を人工的に変異処理即
ち化学的、物理的手段による変異−発処理を行うことに
より得られる人為的突然変異株、あるいは自然変異株も
全て含まれ　　（２）る。

本発明で好ましく使用される前述の菌株の菌学的性質は
特開昭５９−１７９９６号公報にも示されているが次の
とおりである。

〔ストレプトミセス・マテンシス　ＤＩＣ−１０８の菌
学的性質〕（１１形態的特徴使用した培地（ＩＳＰ培地を含むン上での栄養菌糸の生
育は優れておシ、デンプン無機塩、オートミール寒天、
イースト麦芽寒天培地上で豊富な気菌糸を形成する。　
　１胞子形成気菌糸は直状又は直状又は直曲状である。

胞子は楕円体で大きさは、短径×長径０．７〜０．８μ
ＸｔＯ〜１２μである。走査型電子顧倣鏡による観察で
は胞子の表面構造はイボ状（Ｗａｒｔｙ）である。

各種培地における生育状態１）シュクロース硝酸塩寒天培地（３７℃）薄茶色の基
生菌糸状に灰色の気菌糸を形成し、ｆ６解性色素はみと
められない。

２）グルコース・アスパラギン寒天培地（３７℃）薄黄
白色の生育で気菌糸の形成はみとめられない。

また溶解性色素はみとめられない。

５）グリセリン・アスパラギン寒天培地（ＩＳＰ培地−
７１＆５３７１℃）薄黄色の生育で気菌糸の着生はみとめられない。又、溶
解性色素はみとめられない。

４）ヌターチ・無機塩寒天培地（ｒｓｐ培地　３７”Ｃ
）無色の発ａ上に緑灰色の気菌糸全着生し、溶解性色素
はみとめられない。

５）チロシン寒天培地（ＩＳＰ培地−７，６７℃）薄茶
色の発Ｈ上に培養７日月では気菌糸は着生せず、１４日
目で白灰色の気菌糸を着生する。溶解性色素はみとめら
れない。

６）栄誉寒天培地（３７℃９緑灰黒色の発胃上に薄縁灰色の気菌糸を着生し、溶解性
色素はみとめられない。

７）イースト麦芽寒天培地（ＩＳＰ培地−２，３７℃）
薄茶色の生育上に薄縁灰色の気菌糸を着生する。水溶性
色素の生成はみとめられない。

８）オートミール４天培地（ＩＳＰ培地−３，３７℃ン
無色の生育上’に緑茶灰色の気菌糸全着生し、水溶性色
素の生成はみとめられない。

（３）生理的性質１）生育温度範四酵母エキス・麦芽エキス液体培地による生育試験では、
３０℃〜５０℃で生育するが、至適温度Ｆｉ３７℃〜４
５℃である。

２）ゼラチンの液化：陰性６）脱脂乳の凝固及び脱脂乳のペプトン化：陰性４）メラニン色素の生成（ペプトン・イースト・妖寒天
培地、ＩＳＰ培地６）：陰性５）デンプンの分解性：陽性（分解ゾーンに白いリング
を形成）６）炭素源の利用性（プリド・・ム、ゴドリープ外大培
地−９，３７℃）Ｄ−グルコース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロース、
Ｄ−フルクトース、イノシトール、Ｌ−ラムノース、　
Ｄ　−マンニトール、ガラクトースをよく利用して生育
し、シュクロース、ラフィノース、サリシンは利用しな
い。

７）細胞壁組成ｌ５ＰＫ記載されている糖組成ＴｙｐｅとしてはＴｙｐ
　ｅ　ｌに属する。

る。

本発明による酵素生産の為の培養は、通常の固体培地又
は液体培地が使用され、液体培養の為の培地の炭素源と
しては、β−１，３グルコシル糖化合物であれば利用で
きる。

例えば、カードラン、パキマン、ラミナリン、リケナン
、酵母細胞壁又はその部分分解物、リュウコシン、カロ
ース、パラミロン等が挙げられ、又窒素源としては硫安
、塩安、リン安、硝酸ナトリウム、尿素、ペプトン、カ
ゼイン等、有機窒素、無機窒素、いずれも利用できる。

天然栄餐諒としては、例えば各種糖蜜、コーンステイー
プリカー、オートミール、味液、魚粉、肉エキス、酵母
、酵母ニーＩＰヌ、ポテトエキス、麦芽エキス等があげ
られる。

無機物としては、例えばリン酸二カリウム、リンば−ナ
トリウム、’ａＨマグネシウム、＃、量全金属類どが挙
げられる。その他、必要に応じてビタミン類等を添加す
ることもできる。これらの使用濃度としては、０．１〜
４０重量係重量−られる。また醗酵中の発泡を抑制する
ため、ｏ、ｏｏｏｉ−１ｏ憲量膚の消泡剤を添加しても
よい。消泡剤としては、シリコーン、大豆油など通常の
消泡剤を用いる。

培養方法は、振とう培養、通気培養などの好気的液体培
寮が適しておシ、ｐ　Ｈ５，０〜８．０、培養温度２．
０℃〜５０”Ｃで１〜６日、望ましくはｐＨ６，５〜７
．５．３５〜４０℃で２日前後培養する。

β−１，６グルカナーゼは、菌体外に生産する酵素であ
るので、培養終了後、口過又は遠心分離して除菌し、上
清液を回収する。そして必要に応じて濃縮し、硫安、硫
酸ナトリウムによるム析、又はアセトン、エタノール、
メタノール、イソプロパツールなどの有機溶剤を加え、
酵素を沈澱物として取得し、乾燥、保存する。

本発明のラミナリペンタオースはβ−１，３楯分解酵素
を水又は緩衝液に懸濁させた前述のβ−１，３グルコシ
ル錆化合物の１〜１０重量％溶液に対し１４〜１５μ／
ｉＩｇの本酵素を５０〜１０００単位／ｌ加え、ｐＨ４
〜８．５、好ましくは５〜Ｚ５、反応温度３０〜７０、
好ましくは４０〜６０℃の反応条件で３０分〜２４時間
、好ましくは１０〜２０時間反応させることによって得
られる。

本発明のラミナリペンタオースは、賞品の甘味料、増量
剤、賦形剤、包括剤として賞品、医系品等種々の工業製
品に利用可能であシ、又抗腫瘍活性、仇細菌ｔ％染症作
用、免疫系に及ぼす作用等を有する医業品の中間原体と
して有用なものである。

以下に実施例によシ本発明の詳細な説明するが、文中「
部」及び「チ」は重量基準であるものとする。

実施例１ ■　β−１，３グルカナーゼＦｉｌの調製５００″ｑ容
の坂ロフラスコ１０本に、ポリペプトン（牛乳カセイン
の酵素分解物、和光純系工業株式会社販売）Ｑ、２９ｊ
、酵母エキス（和光純薬工業株式会社販売）α２凱に、
ＨＰＯ，０，２４１Ｍ＃Ｓ０４・７Ｈ，００，１係から
なる成体培地（ｐ　Ｈ７，０）　を各々に１００ｄづつ
分注した。常法による殺菌後、ストレプトマイセス・マ
テンシスＤＩＣ−１０８（微工研菌寄第６５９６号ンを
接種し、３５℃で３日間振盪培養した。培女後、ブフナ
ーで口過を行って除菌し、得られた上清液ｔ−６５％の
飽和硫安として沈澱を回収した。これｉｏ、０１Ｍのリ
ン酸緩衝液ｐ　Ｈ７，０で溶解して得られた粗酵素中に
は、ラミナリペンタオースを分解するβ−１，３グルカ
ナーゼが存在する為、α０１　Ｍ　トＩＪス緩輌液で平
衡化したＤＥＡＥ−セファデックスＡ−２５カラムに吸
着させ、その未吸着部分全回収することにより、β−１
，３グルカナーゼＦｉ　ｌｉ得た。得られた活性は１４
．７単位／叩タンパク（５９６，９単位（２７１１９）
）であった。

■　分解反応カードラン（ｎ＝５５０．和光純薬工業株式会社製品〕
０．２５ｇに、該酵素ン改２．２単位を添加して全量を
５−とし、４５℃で２４時間反応させた。その結果ラミ
ナリペントースは１８８■得られ、収率は７５．２１で
あった。そして得１られたカードラン砧化物中の糖組成
ヲ、高速７ば体クロマトグラフィー（充てん剤；Ｌｉｃ
ｈｒｏｓｏｒｂ　　ＮＨ２５μ’Ｒ（メルク社製）、溶
出液；アセトニトリル７０ｑｂ１水５０係））で分離定
ｉｔ−行った結果、７７係が水浴性オリゴ循となり、そ
の内１尺はラミナリペンタオース７５．２％で残９１、
８　％はラミナリトリオース、ラミナリテトラオーヌ、
ラミナリヘキサオース、ラミナリヘプタオース、ラミナ
リオクタオースであった。（第５図参照）〔酵素力価の決定〕０．０１Ｍの酢はバッファー（ｐＨ６，０）に、カード
ラン１係を懸濁させ、それに適量の酵素を加えて、水で
５．０ｄとし、４５℃で反応させる。この条件で１時間
にｉｘ９のグルコースに相当する還元力を生成する酵素
ｆｔｔ−１単位とする。

実施例２実施例１で用いたカード２ンの代わシに酵母細胞壁（Ｃ
ａｎｄｉｄａ属）不溶性ラミナリン、パキマン、各々α
２ｙに、実施例１で得られた酵素液２２単位を添加して
全量を５−とし、４５℃で２４時間反応させた。

そして得られた酵母細胞壁ラミナリン、及びパキマンの
糖化液中の砧組成金実施例１と同様の方法にて分離定量
を行った。結果を表−１に示した。

表　　−１

【図面の簡単な説明】

第１図はβ−１，３グルカナーゼＦｉＩのｐＨと活性の
関係を示し、第２図はβ−１，５グルカナーゼＦｉＩの
温度と活性の関係を示し、第３図は、β−１，５グルカ
ナーゼにより分解されたカードランの分解物全高速成体
クロマトグラフィーで分析したチャート１−示し、数字
は、各々１ラミナリトリオース、２ラミナリテトラオー
ス、４ラミナリヘキサオース、５ラミナリヘプタオース
、６ラミナリオクタオースを示すものである。代理人　弁理士　高　橋　勝　利第１図ｐＨ富２０温度　℃ 第３図

Claims

【特許請求の範囲】１、β−１，３グルコシル糖化合物又はその部分分解物
をラミナリペンタオースに分解する能力を有するストレ
プトマイセス属に属する微生物の生産するβ−１，３糖
分解酵素をβ−１，３グルコシル糖化合物又はその部分
分解物に作用させて得られることを特徴とするラミナリ
ペンタオースの製造法。２、β−１，３グルコシル糖化合物が、カードラン、パ
キマン、ラミナリンであることを特徴とする特許請求の
範囲第１項記載のラミナリペンタオースの製造法。