JP2819310B2

JP2819310B2 - 新規エキソ―β―Ｄ―グルコサミニダーゼ及びその製造法

Info

Publication number: JP2819310B2
Application number: JP16790089A
Authority: JP
Inventors: 亮介勝見; 文雄南条; 和男坂井; 正人石川
Original assignee: Yaizu Suisan Kagaku Kogyo Co Ltd
Current assignee: Yaizu Suisan Kagaku Kogyo Co Ltd
Priority date: 1989-06-29
Filing date: 1989-06-29
Publication date: 1998-10-30
Anticipated expiration: 2013-10-30
Also published as: JPH0330671A

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、キトサンオリゴ糖やキトサンに作用し、こ
れを加水分解してグルコサミンを生じる、新規なエキソ
−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ及びその製造法に関する
ものである。

〔従来の技術及び問題点〕

キトサンは、グルコサミンがβ−1,4結合した直鎖状
の多糖であり、キチンを脱アセチル化することによって
得られるほか、天然には接合菌類の細胞壁などに存在し
ている。近年の研究により、キトサンの抗菌作用やキト
サンオリゴ糖のエリシター活性などの生理活性が見出さ
れ、その構造と機能に関する研究が進められている。こ
れら構造と機能の関連を研究する手段として、キトサン
オリゴ糖やキトサンを分解する特異性の高い酵素が要求
されている。

従来、このキトサンを分解する酵素として数種のキト
サナーゼが知られているが、これらはすべてエンド型キ
トサナーゼで主としてオリゴ糖を生成し、単糖であるグ
ルコサミンを生成する酵素は見出されていなかった。

そこで、本発明者らはグルコサミン生産型のキトサン
分解酵素を見出すべく鋭意研究を重ねた結果、ノカルデ
ィア属に属する放線菌の培養物中から、新規な酵素（エ
キソ−β−Ｄ−グルコサミニダーゼと命名）を採取する
ことに成功し、本発明を完成するに至った。

〔発明の構成〕

本発明のエキソ−β−Ｄ−グルコサミニダーゼは、次
の理化学的性質を有する。

（ａ）作用：キトサンオリゴ糖とキトサンの分解
作用。

（ｂ）基質特異性：キトサンオリゴ糖やキトサンに作用
し、これを加水分解してグルコサミンを生じる。

（ｃ）至適pH :pH5.0〜6.0。

（ｄ）pH安定性 :4℃、96時間の処理において、pH3.0
〜10.0で安定。

（ｅ）至適温度 :60℃付近。

（ｆ）熱安定性 :pH5.5、15分間の処理において、50℃
以下で安定。

（ｇ）分子量:97,000（SDS−ポリアクリルアミド電
気泳動）。

（ｈ）等電点:pH9.1付近。

本発明に使用する微生物は、ノカルディア属に属する
エキソ−β−Ｄ−グルコサミニダーゼの生産菌であれば
いずれのものでも良い。例えば、ノカルディア・オリエ
ンタリス（No−cardia orientalis）〔新分類名:Amycol
at−opsis orientalis〕が挙げられ、具体的には、Amyc
olatopsis orientalis IFO 12360,IFO 12361,IFO 1236
2,IFO 12806,JCM 3128,JCM 4235,JCM 4600などである。
上記IFOナンバーの株は、財団法人醗酵研究所のリスト
・オブ・カルチャーズ1988年第８版（Instit−ute for
Fermentation,Osaka,List of Cultures,1988,8th Editi
on）に記載されている。また、JCMナンバーの株は、理
化学研究所微生物系統保存施設のカタログ・オブ・スト
レインズ、1986年第３版（Japan Collection of Microo
rganisms,Catalogue of Strains,1986,3rd Edition）に
記載されている。

本発明に使用する微生物は、培養液中に高単位のエキ
ソ−β−Ｄ−グルコサミニダーゼを生産するものであ
り、その培養には炭素源として、エキソ−β−Ｄ−グル
コサミニダーゼの誘導基質であるキトサンを加えること
が好ましく、また窒素源としては、ペプトン、肉エキス
などの有機物、また微量のビタミン類、成長促進因子
（例えばイースト・エキスなど）、無機金属類等を添加
すると良い。培養に当たっては、液体培地、固体倍地の
どちらを使用してよもいが、高単位のエキソ−β−Ｄ−
グルコサミニダーゼを得るには液体培地を用い、振盪な
いし通気撹拌培養を行うのが好ましい。培養条件は培地
の組成や菌株の種類によって異なるが、通常20〜35℃
で、２〜５日程度の培養で目的のエキソ−β−Ｄ−グル
コサミニダーゼを得ることができる。

本酵素は菌体外に生産されるので、公知の分離・精製
法が適用できる。例えば、培養液を濾過あるいは遠心分
離によって培養濾液および菌体に分ける。次に培養濾液
から硫安塩析法・溶剤沈澱法などにより粗酵素標品を
得、さらにこれをイオン交換、ゲル濾過、アフィニティ
ー等の各種クロマトグラフィを適宜組み合わせることに
よって精製を行うことができる。

以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、
かかる説明によって本発明が何ら限定されるものではな
い。

〔実施例〕

グルコース１％、ペプトン１％、酵母エキス0.5％、
リン酸２水素カリウム0.03％、リン酸水素２カリウム0.
07％と硫酸マグネシウム・７水和物0.05％を含む前培養
培地（pH7.0）500mlを500ml容三角フラスコ５本に100ml
ずつ入れ、これにノカルディア・オリエンタリスIFO 12
806株を２白金耳ずつ接種し、30℃で２日間振盪して前
培養を行った。

次に、コロイダルキトサン1.0％、酵母エキス0.01
％，リン酸２水素カリウム0.03％、リン酸水素２カリウ
ム0.07％と硫酸マグネシウム・７水和物0.05％（pH7.
0）の組成の本培養培地4.5を含むジャーファーメンタ
ーに、前記のようにして得られた前培養液を接種し、30
℃で４日間通気撹拌培養した。

培養終了後、培養液５を10,000rpm,20分間,4℃で遠
心分離して菌体を除去し、得られた上清液に80％飽和と
なるように固形硫安を加え、冷蔵庫中に一夜静置した。
生じた沈澱物を10,000rpm,15分間,4℃で遠心分離して集
め、これを少量の25mM酢酸緩衝液（pH4.5）に溶解後、
同緩衝液で平衡化したセファデックスＧ−25のカラム
（2.2×84cm）に展開して脱塩し、粗酵素液を得た。

この粗酵素液を25mM酢酸緩衝液（pH4.5）で平衡化し
たCM−セファデックスＣ−50カラム（1.8×25cm）に展
開しイオン交換クロマトグラフィーを行った。カラムを
上記緩衝液で洗浄後、蛋白質を０から0.6M塩化ナトリウ
ムを含む同緩衝液による直線濃度勾配により、流速80ml
/時で溶出した。エキソ−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ
活性を有する画分を集め、硫安塩析（80％飽和）により
蛋白質を沈澱させた。次に、遠心分離により集めた沈澱
を少量の50mM酢酸緩衝液（pH5.5）に溶解し、同緩衝液
で平衡化したトヨパールHW55Sカラム（2.7×78cm）に展
開し、ゲル濾過を行った。溶出は同緩衝液を用いて、流
速20ml/時で行った。活性画分を集め、そのうち半分を
上記緩衝液で平衡化したキトトリイトール−セファロー
スCL−4Bカラム（2.2×84cm）に展開し、アフィニティ
ークロマトグラフィーを行った。カラムを同緩衝液で洗
浄後、蛋白質を2mMキトトリイトールを含む同緩衝液に
より流速160ml/時で溶出した。残り半分も同様に行い、
活性画分を集め硫安塩析（80％飽和）により蛋白質を沈
澱させた。沈澱を少量の50mMホウ酸緩衝液（pH9.0）に
溶解し同緩衝液500ml中で５時間透析した。この透析液
を上記緩衝液で平衡化したDEAE−セファデックスＡ−50
カラム（1.8×9.5cm）に展開し、同緩衝液を30ml/時で
流して蛋白質を溶出した。活性画分を集め硫安塩析（80
％飽和）により蛋白質を沈澱させた。沈澱を少量の50mM
酢酸緩衝液（pH5.5）に溶解し、同緩衝液中で透析して
精製酵素標品を得た。

以上の精製操作によって得られたエキソ−β−Ｄ−グ
ルコサミニダーゼ標品は、ポリアクリルアミドスラブゲ
ル電気泳動で均一であった。

本酵素の精製の要約を表に示す。

〔コロイダルキトサンの調製〕キトサンの塩酸溶液を希水酸化ナトリウム溶液で中和
後、不溶化したキトサンをミキサーで粉砕してコロイダ
ルキトサンを得た。

〔キトトリイトールの調製〕

キトトリオース（グルコサミン３量体）をNABH₄で還
元し、Dowex 50W−X4イオン交換樹脂を用いて脱塩後、
メタノール−アセトン系で結晶化させた。この結晶を濾
取し、真空乾燥してキトトリイトールを得た。

〔アフィニティ吸着体の調製〕

AH−セファロースCL−4Bをグルタルアルデヒドで活性
化後、キトトリオースを結合させ、NaBH₄で還元してキ
トトリイトール−セファロースCL−4Bを得た。

〔酵素活性測定法〕

エキソ−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ活性は、下記の
方法で測定した。

2mMキトトリイトールを含む0.1M酢酸緩衝液（pH5.5）
1.0mlに、酵素液を加えて40℃で５分間反応させる。こ
の反応溶液にシャール試薬3.0mlを加え、沸騰湯浴中で1
5分間加熱する。冷却後、分光光度計で420nmの吸光度を
測定し生じたグルコサミンを定量する。

酵素活性1Uは、１分間に１μmoleのグルコサミンを生
成する酵素量と定義した。

以上のようにして得られたエキソ−β−Ｄ−グルコサ
ミニダーゼ標品を、キトサンオリゴ糖とキトサンに作用
させ、その分解物を薄層クロマトグラフィーにより分析
した。その結果、図に示すように、本酵素はキトサンオ
リゴ糖とキトサンに作用して、グルコサミンを生じてい
ることがわかる。

【図面の簡単な説明】

図面はエキソ−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ標品を、キ
トサンオリゴ糖とキトサンに作用させた分解物の分析結
果を示したものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12N 9/42 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】次の理化学的性質を有するエキソ−β−Ｄ
−グルコサミニダーゼ（ａ）作用：キトサンオリゴ糖とキトサンの分解
作用。（ｂ）基質特異性：キトサンオリゴ糖やキトサンに作用
し、これを加水分解してグルコサミンを生じる。（ｃ）至適pH :pH5.0〜6.0。（ｄ）pH安定性 :4℃、96時間の処理において、pH3.0
〜10.0で安定。（ｅ）至適温度 :60℃付近。（ｆ）熱安定性 :pH5.5、15分間の処理において、50℃
以下で安定。（ｇ）分子量 :97,000（SDS−ポリアクリルアミド電
気泳動）。（ｈ）等電点 :pH9.1付近。
【請求項２】ノカルディア属に属し、エキソ−β−Ｄ−
グルコサミニダーゼを生産する能力を有する微生物を培
養し、培養物よりエキソ−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ
を採取することを特徴とする請求項１記載のエキソ−β
−Ｄ−グルコサミニダーゼの製造方法。