JPS61282089A - 不飽和有機酸の微生物学的製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔３−１産業上の利用分野〕 本発明は、不飽和有機酸の微生物学的製造法に関する。

更に詳しくは、本発明はニトリルをアシネトバクタ−（
Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属に属する微生物の作用
による加水分解反応に付し、生成する不飽和有機酸を回
収することを含む不飽和有機酸の微生物学的製造法に関
する。不飽和ニトリルとしては、特にアクリロニトリル
及びメタクリロニトリルが重要であシ、生成物であるア
クリル酸又はメタクリル酸は、アクリル酸メチル及びメ
タクリル酸メチルの合成原料として、また、種々の高級
エステルの原料として有用である。これらの不飽和有機
酸は、繊維、ゴム、プラスチック等の原料として重要で
ある。本発明の微生物学的製造法は、これら有用な不飽
和有機酸を効率良く工業的に製造するため利用すること
ができる。

〔３−２従来の技術〕 アクリル酸又はメタクリル酸の製造法に関しては、プロ
ピレン又はインブチレンの２段階の気相酸化反応により
アクロレイン又はメタクロレインを経由して製造する方
法が公知であるが、反応温度が高く、触媒の劣化と共に
反応生成物の重合が大きな問題点として残されておシ、
更に、新規で工業的に有利な製造方法の開発が望まれて
いた。

この工業上の要望にそつた研究開発の結果、近年、微生
物を用いてニトリルを加水分解し、有機酸を製造する方
法が提案されている。たとえば、アクリロニトリルから
アクリル酸とアンモニアへ、アルスロバクタ−ｓｐ、　
１−９菌株を用いる反応（ジャーナルオブフアーメンテ
ーシ冒ンテクノロジー５７巻、８頁１９７９年）が提案
されている。本発明者らも、炭素数２〜４のニトリルか
ら対応する有機酸とアンそニアの微生物学的製造法とし
て、コリネバクテリウム属に属する微生物を用いる方法
（特願昭５９−１６２８６３　）を出願している。

〔３−３発明が解決しようとする問題点〕しかし、アル
スロバクタ−属及びコリネバクテリウム属に属する微生
物を用いる方法では、アクリロニトリル又はメタクリロ
ニトリルの加水分解反応活性及び生成したアクリル酸又
はメタクリル酸の蓄積濃度が、工業的に充分満足される
レベルには到達していない。

〔３−４問題点を解決する為の手段〕 本発明者らは、このような工業上の諸問題を解決するた
め、高反応活性で且つ生成物の高蓄積濃度に耐えうる微
生物の探索と培養及び反応条件の研究を鋭意行った結果
、アシネトバクタ−属に属する微生物の中に不飽和有機
酸とアンモニアの生産能の高い微生物を発見し本発明を
完成するに到った。即ち、本発明によれば、不飽和ニト
リルを微生物の作用による加水分解反応に付し対応する
有機酸を生成させ、該有機酸を反応混合物から回収する
ことを含む不飽和有機酸の製造方法において、該微生物
としてアシネトバクタ−（Ａｃｉｎｅｔｏｔｎｃｔｅｒ
）属に属し、ニトリルを加水分解する能力を有する微生
物を用いることを特徴とする不飽和有機酸の微生物学的
製造法が提供される。

本発明に用いられる微生物はアシネトバクタ−属に属す
る不飽和有機酸とアンモニアの生産菌であるが、具体的
な菌株の例を挙げれば、アシネトバクタ−ｓｐ、　ＡＫ
　２２６菌株（Ａ、　８ｐ、　ＡＫ　２２６）　（以下
ＡＫ　２２６と略称する）及び、アシネトバクタ−８ｐ
。

ＡＫ　２２７菌株（Ａ、　８ｐ、　ＡＫ　２２７）　（
以下ＡＫ　２２７と略称する）がある。これらの微生物
は、微工研菌寄第８２７１号及び第８２７２号として寄
託されており、菌学的性質は以下に示す通シである。

以上の菌学的性質をパーグーの細菌分類書（Ｂｅｒｇｙ
＋ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖ
ｅ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ第８版（１９７４））に
基づいて分類するとＡＫ　２２６及びＡＫ　２２７は、
好気性、グラム陰性、カタラーゼ陽性、オキシダーゼ陰
性、運動性の無い桿菌で、初期に短稈菌状であるが、後
に球状となることから、アシネトバクタ−属に属する細
菌であると決定した。

ＡＫ　２２６とＡＫ　２２７は、生育条件、糖から酸の
生成及びニトリル資化能などで差異がある。

この微生物は、工業技術院微生物工業技術研究所に下記
の番号で寄託されている。

菌株　　寄託番号　　寄託臼 ＡＸ−２２６微工研菌寄第８２７１号　　昭和６０年５
月２８日ＡＫ−２２７微工研菌寄第８２７２号　　昭和
６０年５月２８日次に本発明の一般的実施態様について
説明する。

本発明で加水分解の対象となる不飽和ニトリルとしては
、たとえば、アクリロニトリル、メタクリロニトリル及
びクロトノニトリルである。

本発明に使用される微生物の培養には、グルコース、デ
キストリン、マルトース等の炭素源、硫酸アンモニウム
、硝酸アンモニウム等の窒累源、酵母エキス、麦芽エキ
ス、ペプトン、肉エキス等の有機栄養源及びリン酸塩、
ナトリウム、カリウム、鉄、マグネシウム、マンガン、
亜鉛等の無機栄養源等を適宜含有する通常の培地が用い
られる。

培地の声は１通常５〜９、好ましくは−６〜８、温度は
通常２０〜４５℃、好ましくは２５〜３２℃で１〜２日
間好気的に培養を行なう。

更に１本発明に使用される微生物の培養において、上記
通常の培地に、アセトニ）　ＩＪル、インブチロニトリ
ル等のニトリルを添加した培地を用い培養するか、もし
くは、上記通常の培地で培養し得られた菌体を更にリン
酸塩、ナトリウム、カリウム、鉄、マグネシウム、マン
ガン、亜鉛等の無機栄養源にアセトニトリル、イソブチ
ロニトリル等のニトリルを添加した培地を用い培養し、
単位菌体あたシの加水分解反応活性を増大させることが
可能である。本発明で［不飽和二）　ＩＪルを微生物の
作用によシ加水分解して対応する不飽和有機酸を生成さ
せる」ということは二）　ＩＪルの存在下又は不存在下
に微生物を培養する場合、ならびに微生物培養後の菌体
培養物、そこから採取した菌体または菌体処理物（たと
えば、菌体の破砕物または菌体破砕物よ膜分離した酵素
）とニトリルとを接触させる場合、のいずれをも包含す
るものとする。また、菌体または菌体から分離抽出され
た酵素を固定化して反応に利用する場合をも包含するも
のである。菌体培養物からの菌体の採取は遠心分離法等
の公知の方法で行なうことができ、菌体の破砕は機械的
に又は超音波などを用いて行なうことができる。菌体破
砕物からの酵素の分離はグルクロマトグラフィー法等を
用いて行なうことができる。

本発明においては、上述のように、菌体培養物をそのま
ま用いることができる。または、該培養物から上述の方
法で分離した菌体及び菌体処理物を水又はリン酸バッフ
ァー（たとえばＰＨ６〜９）などの緩衝液に憑濁し、こ
れに不飽和ニトリルを共存させれば、速やかに加水分解
反応が進行し、対応する有機酸とアンモニアに転換する
ことができる。すなわち、通常、前記微生物菌体又は菌
体処理物を、たとえば０．１〜５重量％、及び不飽和ニ
トリルをたとえば、０．２〜３０重量％含む水性懸濁液
を、温度をたとえば０〜３０℃、−をたとえば５〜１０
の条件を用いて、反応時間をたとえ　゛ば、１０分ない
し２４時間反応させれば良い。

また、本発明に用いる微生物の場合には、驚くべきこと
に基質として用いる不飽和ニトリルの濃度が飽和溶解度
においズも反応阻害を殆んど受けないことから、不飽和
ニトリルを飽和溶解度以上すなわち油水二層状態での反
応が可能であシ、工業的に有利な反応条件を選択するこ
とができる。

かくして、不飽和ニトリル化合物は、副生物であるアミ
ド化合物の生成なしに、はぼ１００％のモル収率で対応
する有機酸とアンモニアに転換し、有機酸アンモニウム
塩の高濃度水溶液として生成蓄積させることができる。

不飽和有機酸アンモニウムを含有した反応液からの不飽
和有機酸の回収は、合目的な任意の方法に従って行なう
ことができる。すなわち、たとえば、反応液から菌体を
遠心分離、膜分離等によって除き、酸処理等によってア
ンモニアを除去后、抽出、蒸留等によシネ飽和有機酸を
回収することができる。

〔３−５発明の効果〕 本発明は、ニトリルの加水分解活性を有するアシネトバ
クタ−属に属する微生物を用いることを特徴とし、本発
明によれば不飽和ニトリルから対応する有機酸とアンモ
ニアを生成せしめるに際し、反応活性及び生成物蓄積濃
度が極めて高い上に、有機酸への選択性が１００％であ
シ、工業的に充分満足される不飽和有機酸の製造法が提
供される。

一般には、反応温度を下げると酵素の寿命が長くなるが
反応速度が低下する。よって、反応活性の高い微生物を
用いる事によシ、所定の反応速度を得る場合、反応温度
を下げることができ、“結果として酵素寿命を長く出来
、微生物又は酵素を取扱い易くなりコストが安く出来る
。

〔３−６実施例〕 次に、本発明を実施例により更に詳細に説明するが、本
発明の範囲は実施例に限定されるものではない。

実施例１ （１）　　培養 ＡＫ２２６を、下記の条件で培養した。

１）培地 グルコース　　　　　　　　１．０　　　重量％肉エキ
ス　　　　　　　　１．０〃 ペプトン　　　　　　　　１．Ｏｔｔ 食　　　塩　　　　　　　　　　　　０．ＩＮリン酸第
−カリウム　　　　　０．１　　　　１硫酸マグネシウ
ム　　　　　　０．０５　　　　ｐ硫酸第一鉄　　　　
　　　０．００５　　ｔｔ硫酸マンガン　　　　　　０
−００５　　＃硫酸アンモニウム　　　　　　０．１＃
硝酸カリウム　　　　　　０．１〃 ｐＨ７，０ ２）培養条件 ３０℃／１日 （２）ニトリルの加水分解 菌体は、得られた培養液から遠心分離によ勺集菌し、生
理食塩水にて、洗浄したものを反応に供した。すなわち
、乾燥菌体量として０．５重量％、基質の二）　ＩＪル
２．０重量％、蒸留水（ＰＨ７，０＞９７．５重！−％
の反応液を調合し、３０℃にて反応を開始した。反応開
始後１５分ごとに反応液をガスクロマトグラフを用いて
分析し、生成した有機酸及びアミドの定量を行った。生
成したアンモニアについては、反応終了后、ネスラー法
により定量し、ガスクロマトグラフ法で分析した有機酸
と化学量論的であることを確認した。

反応結果は、第１表に示す通シである。

第　　　１　　　表 率１有機酸アンモニウム生成活性 生成有機酸アンモニウムミ１７モル数／乾燥菌体グラム
数・時間Ｈｒ ＊２アミド副生率 副生アミドモル数／供試ニトリルモル数比較例１ （１）培養 アルスロパクタースベシース（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅ
ｒ　ｓｐ、）Ｊ−１株を下記の条件で培養した。

１）培地 アセトニトリ＃　　　　　　　　０．７７　　容量チ水
　　　　　　　　　　　　９９．２３　　　＃２）培養
条件 ２８℃７３日間 （２）　　アクリロニトリルの加水分解得られた培養液
から菌体を分離して水洗し、乾燥菌体量としＣ２００〜
を０．１Ｍリン酸バッファー（−７，４）２ｏｙに加え
休止菌体分散液を調製した。この液にアクリロニトリル
を１０６ｒｖ添加し、３０℃で好気的に反応を行なった
ところ、反応開始後３時間で、未反応アクリロニトリル
が殆ど無くなシ、アクリル酸とアンモニアがほぼ定量的
に生成していた。

このもののアクリル酸生成活性は３．３　ｍｍｏｌｐ−
Ｈｒである。

実施例２ （１）培養 ＡＸ２２６を、実施例１と同様の方法で培養し、得られ
た培養液から遠心分離により集菌したものを、更に下記
の条件で培養した。

１）培地 アセトニトリル　　　　　　　　０．５　　　　重：！
１チリン酸第−カリウム　　　　　０．１　　　　　ｚ
硫酸マグネシウム　　　　　　０．０５　　　　＃硫酸
第一鉄　　　　　　　０．００５　　＃硫酸マンガン　
　　　　　０．００５　　ｐ硫酸アンモニウム　　　　
　　０．ＩＮ硝酸カリウム　　　　　　０．１１ ｐ８　　　　　　　　　７．０ ２）培養条件 ３０℃７３日間 （２）　　メタクリロニトリルの加水分解菌体は、得ら
れた培養液から実施例１と同様の方法で取得し反応に供
した。すなわち、実施例１と同一の反応条件にて、基質
としてメタクリロニトリルを用い、反応を開始した。反
応開始１５分後に、反応液をガスクロマトグラフによシ
分析したところ、２．５重ｉｔｓのメタクリル酸を含み
、未反応のメタクリロニトリル、メタクリルアミド及び
その他の副生物は殆ど含まれず、反応はほぼ定量的に進
行し完結していた。

実施例３ （１）　　培養 ＡＫ　２２７を、実施例２と同様の方法で培養した。

（２）　　メタクリロニトリルの加水分解得られた培養
液から、実施例２と同様の方法で菌体を取得し、実施例
２と同一の反応条件にて反応を開始した。反応開始１０
０分後に、反応液をガスクロマトグラフによシ分析した
ところ、２．４重量％のメタクリル酸を含み、未反応の
メタクリロニトリル、メタクリルアミド及びその他の副
生物は殆ど含まれず、反応はほぼ定量的に進行し完結し
ていた。

実施例４ （１）培養 ＡＫ　２２６を、実施例１と同様の方法で培養した。

（２）　　アクリロニトリルの加水分解菌体は、得られ
た培養液から、実施例１と同様の方法で取得し、乾燥菌
体重量として１ｇを、　０．０５Ｍリン酸バッファー（
ｐｉ（７，０）　１００ｄに加え、休止菌体分散液を調
製した。この液にアクリロニトリルを２５ｐ添加し、３
０℃で反応を行なったところ、反応開始後２時間で、は
ぼ直線的に５０．０１／ｌ−バッファーのアクリル酸ア
ンモニウムが生産された。反応はまだ十分に進行するよ
うであったが、この時点で反応液が粘稠となったので反
応を停止した。アクリル酸アンモニウム収率はほぼ１０
０％であり、副生物としてのアクリルアミドは添加した
アクリロニトリルに対しＯ１１チ程度にすぎなかった。

比較例２ （１）培養 コリネバクテリウムニトリロフィラス （Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｎ１ｔｒｉｌｏｐ
ｈｙｌｕｓ）　ＡＴＣＣ２１４１９株を下記の条件で培
養した。

１）培地 Ａ培地　グルコース　　　　　１．０　　　重量％肉エ
キス　　　　　１．０　　　Ｉ ペプトン　　　　　０・３　　″ 食　　　塩　　　　　　　　０．１〃 ＰＨ７，０ Ｂ培地　イソブチロニトリル　　　０．５　　　重量膚
リン酸第−カリウム　　０．１　　　１硫酸マグネシウ
ム　　　０．０５　　　ｔｔ硫酸第一鉄　　　　　０．
００５　１ 硫酸マンガン　　　　０．００５　　ｚ硫酸アンモニウ
ム　　　０．１１ 硝酸カリウム　　　　　０．１〃 Ｐ８　　　　　　　７．０ ２）培養条件 Ａ培地にて３０℃／２４時間培養後、遠心分離によシ集
菌し、更にＢ培地にて３０℃７２４時間培養した。

（２）　　メタクリロニトリルの加水分解得られた培養
液から菌体を分離して水洗し、乾燥菌体量として２，０
重量％となるようにＰＨ６，０の蒸留水に懸濁した。こ
れにメタクリロニトリルを３時間に２重量−の割合で連
続的に滴下し、３０℃で反応させた。１２時間反応させ
た後、更にメタクリロニトリルを２重量％添加し、３時
間後に分析すると、未反応メタクリロニトリルが１．６
重ｆｆｉ％残存しており、反応速度が大巾に低下してい
た。反応液中メタクリル酸濃度を定量したところ９．８
重量％の含有率であった。

実施例５ （１）　　培養 ハ２２６を、実施例１と同様の方法で培養した。

（２）　　メタクリロニトリルの加水分解菌体は、得ら
れた培養液から、実施例１と同様の方法で取得し、実施
例４と同一の休止菌体分散液を調製した。この液にメタ
クリロニトリル２５ｇを添加し、３０℃で反応を行なっ
たところ、反応開始５時間でほぼ直線的に、４３．８Ｗ
ｌ−バッファーのメタクリル酸アンモニウムが生産され
た。反応はまだ進行するようであったが、この時点で反
応液が粘稠となったので、反応を停止した。メタクリル
酸アンモニウム収率はほぼ１００％であシ、副生物とし
てのメタクリルアミドは、添加したメタクリロニトリル
に対し、０．０５％程度にすぎなかった。

実施例６ （１）培養 ＡＫ　２２６を、実施例１と同様の方法で培養した。

（２）　　メタクリロニトリルの加水分解菌体は、得ら
れた培養液から、実施例１と同様の方法で取得し、乾燥
菌体量として１．０重量％、メタクリロートリル１５．
０重ｊｔ％、０．０５Ｍリン酸バッファー（ｐｉ−１７
，０）　８４．０重量−の反応液を調合し、３０℃にて
４時間反応させたところ、メタクリル酸アンモニウム２
３．０重量％含有した反応液が得られた。こうして得ら
れた反応液から、遠心分離法により菌体を回収し、再び
同一組成の反応液を調合し、３０℃にて４時間反応を行
なった。このような操作を合計５回縁υ返し反応液とし
たところ第２表の成績を得た。

第　　　２　　　表 出願人　　　旭化成工業株式金社 手続補正書（自発） 昭和６０年６月２８日

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）不飽和ニトリルを微生物の作用による加水分解反
   応に付し対応する有機酸を生成させ、該有機酸を反応混
   合物から回収することを含む不飽和有機酸の製造方法に
   おいて該微生物として、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅ
   ｔｏｂａｃｔｅｒ）属に属しニトリルを加水分解する能
   力を有する微生物を用いることを特徴とする不飽和有機
   酸の微生物学的製造方法。
2. （２）該微生物がアシネトバクターｓｐ．ＡＫ２２６菌
   株（微工研菌寄第８２７１号）又はアシネトバクターｓ
   ｐ．ＡＫ２２７菌株（微工研菌寄第８２７２号）である
   ことを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の方法。
3. （３）該不飽和ニトリルが、アクリロニトリル、メタク
   リロニトリル及びクロトノニトリルから選ばれることを
   特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の方法。