JPS60176600A - グアナ−ゼ活性測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、グアナーゼ活性の正確、迅速かつ簡易な定量
方法に関する。

肝疾患の診断指標として、ＨＢＳ抗原、グルタミン酸ピ
ルビン酸トランヌアミナーゼ（Ｇ　Ｐ　’ｒ’　）、グ
ルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧｏＴ）
等の検査が行なわれている。しかし、これらの検査項目
は、ヒ）Ａ型、Ｂ型肝炎の診断指標として有効ではある
が、非−Ａ型、非−Ｂ型肝炎の診断には役立たないもの
であり、輸血後に発症する非−Ａ型、非−Ｂ型肝炎は発
症率が高いにもかかわらず、未だその対策は確立されて
いない。

近時、この非−Ａ型、非−Ｂ型、肝炎の有効な診断指標
としてグアナーゼ活性の測定が注目され、各種の測定法
が提案されている。

グアナーゼは、生体内のヌクレオシド′代謝系において
グアニンをキサンチンに変換する化学反応を触媒する酵
素であり、このものは前記（］０１”やＧ　Ｐ　ｉ’が
多く含まれている骨格筋、心筋、膵などには殆んど含ま
れていない。直情中グアナーゼ活性は００’ｌ”、ＧＰ
’ｒよりも肝に特異的であるため、心筋梗塞、多発生筋
炎との鑑別等に利用できる点でもそのｔ１１１定意義は
高い。

現在知られているグアナーゼ活性ｉ’ｌｌｌ＋定法とし
てラウシュ・−ノリス法ＣＡｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、
　２　ｇ　。

１２４〜１２９（１９５０））、カルツカ−法（Ｊ、Ｂ
ｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、１　６７．４２９〜４４４．４４５
〜４５９（１９５７））、アンモニア定量法（Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ、　Ｍｅｄ、　５．８８０〜８９１（１９７２）
〕、伊藤らの方法〔臨床病理２３．７３３〜７３６（１
９７５）：］、過酸化水素測定法（Ｅｎｚｙｍｅ　２４
．２４７−２５４（１９７９）：］、杉浦らの方法〔日
本薬学金網、生体成分の分析化学シンポジウム構演要旨
集４１〜４４　（４９７９））、オクタらの方法（：　
Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１３０．２９５〜３０
１（１９８３）：］などがある。これらの泪り定法は、
いづれも操作性や正確性の点で問題が多く、−膜検査法
として利用し得るものは１、伊藤らの方法、オクタらの
方法、杉浦らの方法に限られる。しかし、伊藤らの方法
〔グアニンを基質とする反応により生成したアンモニア
量を、インドフェノール反応を利用して測定する方法〕
にして収３ステップの操作を必要とするため、一般の市
販自動分析装置に適用することは多くの場合不可能であ
り、しかも低グアナーゼ活性域ではブランクの測定値が
検体血清の測定値よりも高くなることかしばしばみられ
る。捷だ杉浦らの方法およびオクタらの方法〔キサンチ
ンが尿酸に変換する際に副成する過酸化水素をパーオキ
シダーゼの存在下に３−メチ／ｌ／−２−ベンゾチアソ
リノンヒドラゾンおよびジノチルアニリンと反応さぜ、
生成するインダミン色素の特性吸収帯の吸光度を７１１
す定する方法〕においても、３種の試薬を用いる３段階
の反応操作を必要とするので、自動分析装置への適用は
殆んど不可能である。

本発明は上記実情に対処するためになされたものである
。

本発明のグアナーゼ活性測定法は、グアニンを基質とし
て、これをグアナーゼによりキサンチンに変化さぜ、こ
のキサンチンをキサンチンオキシダーゼの存在下に尿酸
に変化させ、その変換反応に伴って生成するスーパーオ
ギサイドアニオン（０２）により酸化型テトラゾリウム
を還元型テトラゾリウム（ホルマザン）に還元し、生成
したホルマザンの特注吸収帯の吸光度から体液試料中の
グアナーゼ活性をめるものである。この反応過程を図式
的に示すと次のとおりである。

１ Ｈ 本発明方法によれば、グアニン、酸化型テトラゾリウム
またはそのハロゲン化物、キサンチンオキシダーゼを含
む■）Ｈ６〜９の緩衝液を測定試薬とし、これに体腋試
判を加えて上記反応を生起させ、生成するホルマザンの
特性吸収における吸光度から体液試料中のグアナーゼ活
性かめられる。

酸化テトラゾリウムとしては、例えばニトロブルーテト
ラゾリウム ーインドフエニｚｕ−３−ニトロフェニル−５−フが゛ エニルテトラゾリウムクロライト゛など好捷しく用△ いられる。曲者を使用した場合に生成するホルマザンの
特１１．吸収帯は５３０〜５　８Ｑ　ｒ＋ｒｎであり、
後者の使用により生成するホルマザンの特性吸収帯は４
８０　〜５１０ｎｍである。

本発明に使用される４１１１定試薬は、例えば、グアニ
ン：　０．０　０　１　〜０．　１　２　５　ｍ　１ｒ
ｌｔＪ／ｌ　酸化型テトラツリウム（塩）：１０〜２　
０　０　ｍ（？／　ｅｌ　キサンチンオキシダーゼ：５
〜７　０　Ｌｌ　／　ｌを含むｐ■−＋’６〜９の緩ｒ
ＩＩｔｒ　液＜　ＩＪン酸緩衝液、クツ１−゛緩衝液、
トリス綾線１１４そなと）である。

ホルマザンの特性吸収の吸光度によるグアナーゼ活性の
定量は、反応を希塩酸などで停止１ニさせるエンドポイ
ント法により、反応前後の吸光度の増加量からめること
ができ、あるいはホ／Ｌ／マザン生成反応過程における
ホルマザンの特性吸収の吸光度の変化率（単位時間当り
の吸光度の増加量〕が、グアナーゼ活性量に比例するよ
うな反応条件下に反応を行なわしめ、その反応過程での
吸光度の変化率を測定するシー１−アッセイ法によりグ
アナーセ活性をめることもできる。

次に、本発明のクアナーゼ活性測定方法について実施例
により具体的に説明する、 実施例１ 〔１〕試薬処方（１，１ヌケールの調製）グア＝ン：　
０．０１〜１．２５ｍ　ｍｏｌ酸化型テトラゾリウム塩
（２、２−ｄｉ　−Ｐ　−ニトロフェニル−５、５’−
ジフェニル−３、３’−シメ’＋・キシ−４，４′−ジ
フェニレン）ンテトラゾリウムクロライ＋”）　：　１
ｏ　ｏｍｑ、キザンチンオキシターゼ：５〜２０ｕ 上記成分を含むｐＨ６〜９のリン酸緩衝溶液〔２〕訓定
操作 丘記反応試薬２ｍｌに検体血清１０〜１．００　ｍｌ！
を加え、３７℃で３０分間反応し、５００〜６００ｎｍ
において吸光度を測定する。クアナーゼ活性既知の標準
血清についても上記と同じ操作を行い、５００〜６００
　ｎｍにおける吸光度を測定し、下式により検体血清の
グアナーゼ活性をめる。

上記測定結果を第１図に示す。図示のように、クアナー
ゼ活性鎖約３ｏ工Ｕ／ｅまで直線的に測定可能であるこ
とがわかる。

実施例２ 市販の遊離アンモニア比色法用試薬〔（株）フッモト・
タイアクノスティックヌ製〕を使用した用手法による血
清クアナービ活性ｌＩ！ＩＩ定ｆ的と本発明による測定
値（用手法）との相関々係を第２図に示す。１月し、Ｖ
＝　１．００７　Ｘ＋ｏ、ｏ　０１、ｆ　＝０．９７８
８、ｎ−５０、である。

両測定１］６は良好な相関性を有することがわかる。

以上のように、本発明によれば、ｆｆｔ’ｉ車な測定操
により、従来のアンモニア比色法と同等の」「確な測定
値を得ることができる。特に、本発明の６１１１定法は
１試薬測定系であり、１段階の操作で測定することがで
きるので、従来の各種方法に比し、自動分析装着への通
用が容易である。捷だ、感度、正確性の点でもすぐれて
いる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明によるクアナーゼ活性１則定結果を示す
グラフ、第２図は本発明方法および従来法（アンモニア
比色法）によるグアナーゼｆｆｉ性？ｌ１ｌＩ　定値の
相関性を示すグラフである。 代理人弁理士宮崎新八部 第１ａａ

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）・　グアニンを基質とし、これを体液試料中のグ
   アナーゼによりキサンチンに変化させ、このキサンチン
   をキサンチンオギシダーゼの存在下に尿酸に変換し、そ
   の変換反応に伴って生成するスーパーオキサイド−アニ
   オン（Ｏｉ）にて酸化型テトラゾリウム化合物を還元型
   テトラゾリウム化合物（ホルマザン）に還元し、生成す
   るホルマザンの特性吸収帯の吸光度から体液試料中のグ
   アナーゼ活性をめることを特徴とするグアナーゼ活性測
   定方法。　・