JPH06237795A

JPH06237795A - １，５−アンヒドログルシトールの定量法

Info

Publication number: JPH06237795A
Application number: JP5048698A
Authority: JP
Inventors: Shigeru Tajima; 茂田島; Toshio Tanabe; 田辺　　敏雄; Reiko Machida; 礼子町田; Tomoko Takezawa; 智子竹澤; Minoru Masuda; 増田　　稔
Original assignee: Nippon Kayaku Co Ltd
Current assignee: Nippon Kayaku Co Ltd
Priority date: 1993-02-16
Filing date: 1993-02-16
Publication date: 1994-08-30

Abstract

(57)【要約】【構成】試料中の１，５−アンヒドログルシトールをピ
ラノースオキシダーゼまたはＬ−ソルボースオキシダー
ゼを用いて測定する際に、試料に予めグルコキナーゼ及
び／またはヘキソキナーゼと、アデノシン三リン酸、ホ
スフォグルコースイソメラーゼ、ホスフォフルクトキナ
ーゼを添加し処理することを特徴とする１，５−アンヒ
ドログルシトールの定量法。【効果】試料中の１，５−アンヒドログルシトールを迅
速で簡便な方法により精度良く定量することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は糖尿病の診断マーカーと
して用いられている１，５−アンヒドログルシトール
（以下１，５−ＡＧと略す）の正確、迅速でかつ自動分
析装置にも適用可能な測定方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】１，５−ＡＧは、グルコースと類似構造
を持つ環状ポリオールである。この１，５−ＡＧは、健
常人の血液中に、グルコースに次ぎ高濃度（個人毎に一
定値を持つ）で存在するが、糖尿病患者では、１，５−
ＡＧの濃度は特異的に低下し、かつその低下率が顕著で
あることから、糖尿病の診断に用いられる様になった。

【０００３】従来、１，５−ＡＧを測定するには、ガス
クロマトグラフィー、液体クロマトグラフィーなどの分
離分析法が用いられていたが、煩雑なため、実用化され
なかった。一方、最近になって、１，５−ＡＧを酸化す
る酵素（以下１，５−ＡＧ酸化酵素という）が見いださ
れ、これを応用した測定法（特公平３−２４２００号公
報）が開発された。また、１，５−ＡＧ酸化酵素ではあ
るが、基質特異性が厳密でないピラノースオキシダーゼ
又はＬ−ソルボースオキシダーゼを用い、これら酵素と
反応性を有する１，５−ＡＧ以外の糖類（以下、夾雑糖
類という）を選択的に除去するいくつかの方法のうちの
１つと組み合わせた測定法（特開昭６３−１８５３９７
号公報）が開発された。

【０００４】この特開昭６３−１８５３９７号公報に
は、夾雑糖類（ヒト血中では主としてグルコース）の除
去法として、（１）イオン交換樹脂（ミニカラム）で吸
着する方法、（２）塩酸で分解する方法、（３）水素化
ホウ素ナトリウムで還元する方法、（４）グルコースオ
キシダーゼで酸化する方法、（５）ヘキソキナーゼでリ
ン酸化する方法が開示されている。これらの方法のう
ち、（１）の方法が最も厳密かつ簡便であり、現在、こ
の方法を用いた用手法の１，５−ＡＧ測定キットが診断
薬として開発され、上市されている。しかしながら、多
忙な臨床現場を考えると、カラム操作を必要とする用手
法のキットでは、必ずしも簡便とは言えず、自動化法の
開発に強い期待がかけられている。

【０００５】そこで、カラム操作が不要であり、生化学
検査用に市販されている汎用の自動分析装置へも応用可
能な（５）の夾雑糖類（主としてグルコース）の酵素に
よるリン酸化法が注目され、特開平１−３２０９９８号
公報、特開平２−１０４２９８号公報、特開平３−２７
２９９号公報にその改良法が提案されている。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】ところで、血液中では
グルコースは空腹時で８００〜１，２００mg/L、食後で
も１，４００mg/L程度の量にコントロールされている。
ところが糖尿病になるとこれ以上に上昇し、３，０００
から４，０００mg/Lに上がることもまれではなく、１
０，０００mg/Lに上昇することも有り得る。一方、１，
５−ＡＧの量は０〜５０mg/Lの範囲に分布しており、健
常者で平均２３〜２５mg/L（グルコースのおよそ１／４
０）、糖尿病患者ではずっと少なくなって平均４〜７mg
/Lであり、１mg/L以下（グルコースの数千分に１）とな
ることも有る。従って、１０，０００mg/Lのグルコース
を完全に除去できる方法でないと、１，５−ＡＧを充分
精度良く測定できる方法とは言えない。すなわち、グル
コース濃度が１０，０００mg/Lの糖尿病患者の血液で
は、グルコースの９９．９９％が除去できても１mg/Lの
グルコースが残存し、１，５−ＡＧの測定値は上昇し、
正確に測定できない。

【０００７】従って、１，５−ＡＧの特異性が悪く、む
しろグルコースと強く反応する様なピラノースオキシダ
ーゼ又はＬ−ソルボースオキシダーゼを用い、汎用の生
化学分析装置で測定可能な１，５−ＡＧ自動測定法を開
発するためには、カラム処理を用いることなくグルコー
スを主とする夾雑糖類を完全に除去する方法が必要とな
る。

【０００８】しかし、特開昭６３−１８５３９７号公報
の前記（５）の方法、即ち、グルコースの除去の為にヘ
キソキナーゼを用い、残存する１，５−ＡＧをピラノー
スオキシダーゼで測定する方法では、ヘキソキナーゼで
完全にグルコースを除去できなかったり、ピラノースオ
キシダーゼの反応時間が長く、正確な定量を迅速に行う
ことが出来ないなどの問題点がある。

【０００９】また、特開平１−３２０９９８号公報及び
特開平３−２７２９９号公報では、グルコースの処理
に、グルコース６位リン酸化酵素（グルコキナーゼ又は
ヘキソキナーゼ）を用い、さらにこの反応を完結させる
ため、グルコース−６−リン酸脱水素酵素を組み合わ
せ、グルコースのリン酸化反応の平衡を完全にグルコー
ス−６−リン酸に向かわせる工夫がなされている。しか
しながら、これらの方法でヒト血清又は血漿中の１，５
−ＡＧの測定を行なった場合、共存する血清タンパク質
によって干渉が起こるため、あらかじめ煩雑な除タンパ
ク操作が必要となり、自動化法に向かないなどの問題点
がある。

【００１０】また、特開平２−１０４２９８号公報にお
いては、グルコースを主とする夾雑糖類の処理にグルコ
キナーゼ又はヘキソキナーゼを用い、さらにＡＴＰ供給
系としてピルビン酸キナーゼとその基質であるホスフォ
エノールピルビン酸を作用させる方法が提案されてお
り、これにより、グルコースの６位リン酸化に必要なＡ
ＴＰ（アデノシン三リン酸）の濃度をさげ、１，５−Ａ
Ｇのピラノースオキシダーゼによる酸化反応への過剰Ａ
ＴＰによる阻害を回避でき、かつ、汎用の自動分析装置
にフィット可能な短時間処理が可能になったとしてい
る。しかし、ガスクロマトグラフィーと対比した検体で
の測定精度を見ると、臨床応用にはいまだ不十分である
という問題点がある。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、簡便で実
用的な１，５−ＡＧの測定方法、即ち、汎用の自動分析
装置にも応用可能な方法を検討し、本発明を完成した。
即ち本発明は、試料中の１，５−アンヒドログルシトー
ルをピラノースオキシダーゼまたはＬ−ソルボースオキ
シダーゼを用いて測定する際に、試料に予めグルコキナ
ーゼ及び／またはヘキソキナーゼと、アデノシン三リン
酸、ホスフォグルコースイソメラーゼ、ホスフォフルク
トキナーゼ、を添加し処理することを特徴とする１，５
−アンヒドログルシトールの定量法、に関する。

【００１２】以下、本発明の１，５−ＡＧ定量法につい
て詳細に説明する。本発明においては、試料中の１，５
−ＡＧをピラノースオキシダーゼ又はＬ−ソルボースオ
キシダーゼを用いて測定する前に、試料に、（ａ）グル
コキナーゼ及び／又はヘキソキナーゼ、（ｂ）アデノシ
ン三リン酸（ＡＴＰ）、（ｃ）ホスフォグルコースイソ
メラーゼ及び、（ｄ）ホスフォフルクトキナーゼを添加
し処理する。

【００１３】試料としては種々のものが使用でき、１，
５−ＡＧを定量したいものならとくに制限はなく、例え
ば髄液、血漿、血清、尿等の体液や植物、動物組織など
の抽出物および、それらの除蛋白物が挙げられる。グル
コキナーゼ、ヘキソキナーゼ、ホスフォグルコースイソ
メラーゼ、ホスフォフルクトキナーゼはＩＵＰＡＣ−Ｉ
ＵＢの命名法で、それぞれＥＣ２．７．１．２、ＥＣ
２．７．１．１、ＥＣ５．３．１．９、ＥＣ２．７．
１．１１に分類しうるものであれば、特に制限はなく、
市販のものを使用しうる。

【００１４】各酵素及び試薬の使用量は試料中のグルコ
ース量等により異なるが、通常は次のとおりである。グルコキナーゼ及び／叉はヘキソキナーゼ：０．１〜２
０Ｕ／mL ＡＴＰ：０．１〜１００mM ホスフォグルコースイソメラーゼ：０．１〜５０Ｕ／mL ホスフォフルクトキナーゼ：０．１〜５０Ｕ／mL これら酵素及び試薬は同時に添加してもよく、又、任意
の順序で添加してもよい。

【００１５】試料に上記酵素及び試薬を添加することに
より、これらが試料に作用し、グルコキナーゼ及び／又
はヘキソキナーゼにより、例えばグルコースはグルコー
ス−６−リン酸に変換され、同時にＡＴＰはＡＤＰに変
換される。又、ホスフォグルコースイソメラーゼによ
り、グルコース−６−リン酸はフルクトース−６−リン
酸に変換される。さらに、ホスフォフルクトキナーゼに
より、フルクトース−６−リン酸はフルクトース−１，
６−二リン酸に変換され、同時にＡＴＰはＡＤＰに変換
されるという反応系が確立され、試料中の夾雑グルコー
スの消去が行われる。

【００１６】特開平２−１０４２９８号公報には、ＡＴ
Ｐ供給系としてピルビン酸キナーゼと、その基質である
ホスフォエノールピルビン酸を作用させる方法が提案さ
れているが、この方法の場合、グルコース−６−リン酸
が蓄積する事で、反応が阻害され、完全には試料中の夾
雑グルコースを除去しきれなかった。本発明によれば、
グルコース−６−リン酸はホスフォグルコースイソメラ
ーゼにより、フルクトース−６−リン酸に変換され、さ
らにホスフォフルクトキナーゼにより、フルクトース−
１，６−二リン酸に変換される。従って、グルコキナー
ゼによるグルコースのグルコース−６−リン酸への変換
を阻害するグルコース−６−リン酸、フルクトース−６
−リン酸が効率よく除去され、平衡がグルコース−６−
リン酸生成の方向にずれるため、試料中の夾雑グルコー
スの消去が完全に行われる。

【００１７】又、ホスフォエノールピルビン酸を用いた
試薬の場合、グルコース２０００mg/dL では１，５−Ａ
Ｇの測定が不能になったが、本発明によれば、正常に測
定することができる。

【００１８】前記反応( 本発明における前記処理）は通
常、１〜４００mM、ｐＨ５〜１０のバッファー中で、１
０〜６０℃で１〜６０分程度行なわれる。バッファーと
してはリン酸バッファー、クエン酸バッファー、クエン
酸リン酸バッファー、酢酸バッファー、トリス−塩酸バ
ッファー、グッドのバッファー、イミダゾールバッファ
ー、トリエタノールアミンバッファー等が挙げられる。
反応の際、塩類を共存させるのが好ましく、塩類として
は塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム等のマグネシウ
ム塩、塩化カリウム、硫酸カリウム等のカリウム塩、塩
化カルシウム等のカルシウム塩等が挙げられる。これら
の塩は、０．１〜１００mM程度用いるのが好ましいが、
特に限定はされない。

【００１９】上記反応により試料中の夾雑グルコースを
消去した後、１，５−ＡＧをピラノースオキシダーゼ又
はＬ−ソルボースオキシダーゼを用いて定量する。この
１，５−ＡＧの定量法は公知であり、特開平３−２４２
００号、特開昭６３−１８５３９７号、特開平１−３２
０９９８号公報等に記載された方法に従って行うことが
できる。

【００２０】例えば次のようにして行うことができる。
即ち、試料に予めグルコキナーゼ及び／またはヘキソキ
ナーゼと、アデノシン三リン酸、ホスフォグルコースイ
ソメラーゼ、ホスフォフルクトキナーゼを添加し、これ
らの作用により試料中の夾雑グルコースを消去した後、
これにピラノースオキシダーゼ又はＬ−ソルボースオキ
シダーゼを添加し、酸素等の電子受容体の存在下、４〜
５０℃好ましくは２５〜４０℃で、３０秒〜３時間、好
ましくは２分〜１時間インキュベートし、次いで生成す
る過酸化水素等の電子受容体の還元体等を測定し、別に
作製した検量線から１，５−ＡＧ量を求めれば良い。

【００２１】ピラノースオキシダーゼ及びＬ−ソルボー
スオキシダーゼはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢの命名法でそれぞ
れＥＣ１．１．３．１０及びＥＣ１．１．３．１１に分
類しうるものであれば、特に制限はなく、市販のものを
使用しうる。これら酵素は、通常０．５〜５００Ｕ／mL
好ましくは１〜５０Ｕ／mL使用される。

【００２２】具体例を示すとつぎのとおりである。例え
ば、電子受容体の還元体が過酸化水素の場合、過酸化水
素を検出する方法としては、高感度に検出できる方法で
あればいずれであっても良く、数多くの方法が利用でき
る。これらのうちで最も一般的に用いられている方法
は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を
触媒酵素として、各種のＨＲＰ基質を過酸化水素で酸化
するものであり、酸化反応の結果生成した色素、ケイ光
物質や化学発光をそれぞれ吸光度測定、ケイ光測定及び
発光測定すれば良い。

【００２３】色素を生成するＨＲＰの基質としては２，
２’−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−
スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、ｏ−フェニレンジアミン
（ＯＰＤ）、５−アミノサリチル酸（５−ＡＳ）、３，
３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、
Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’
−ビス（ジメチルアミノ）−ジフェニルアミンナトリウ
ム塩（ＤＡ−６４）、４−アミノアンチピリンとフェノ
ール類、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−ｍ−トルイ
ジンあるいはＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−
スルホプロピル）−ｍ−トルイジン（ＴＯＯＳ）等の組
み合わせによるいわゆるトリンダー系発色剤などがあ
る。ケイ光物質を生成するＨＲＰの基質としては、ｐ−
ヒドロキシフェニル酢酸、３−（ｐ−ヒドロキシフェニ
ル）プロピオン酸（ＨＰＰＡ）などがある。また、化学
発光するＨＲＰの基質としては、ルミノール、イソルミ
ノールなどが知られている。

【００２４】ＨＲＰなしに化学発光で検出する方法もい
くつか知られている。たとえば、フェリシアンイオン存
在下に過酸化水素でルミノールを発光させる方法、金属
イオン存在下に過酸化水素でルシゲニンを発光させる方
法、ビス（２，４，６−トリクロルフェニル）オギザレ
ートの様なアリルシュウ酸エステル類の化合物をケイ光
物質存在下に過酸化水素と反応させ、シュウ酸エステル
の分解エネルギーでケイ光物質を励起させ発光させる方
法などが知られている。さらに過酸化水素を直接検出す
る方法として、過酸化水素電極を用いても良い。

【００２５】本発明によれば、ピラノースオキシダーゼ
又はＬ−ソルボースオキシダーゼを用いて１，５−ＡＧ
を定量する際、測定を妨害するグルコースをグルコース
−６−リン酸、フルクトース−６リン酸を経てフルクト
ース−１，６−二リン酸へ変換することにより、ほぼ完
全に除去することができるため、１，５−ＡＧの定量を
高い精度で行うことができる。更に、特開平２−１０４
２９８号公報に記載の方法に比べて、グルコースの処理
能力が高く、より精度の高い測定結果が得られる。この
ように、本発明によれば、迅速で簡便な方法により、
１，５−ＡＧを精度良く定量することが可能であり、汎
用の生化学分析装置により自動測定が可能である。

【００２６】

【実施例】以下、比較例、参考例及び実施例により本発
明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定
されるものではない。

【００２７】比較例１（ホスフォエノールピルビン酸−
ピルビン酸キナーゼ系）１，５−ＡＧ標準液を蒸留水及び１０，０００mg/L濃度
のグルコース水溶液で倍々希釈し、１，５−ＡＧ濃度と
して０，１．５，３．１，６．３，１２．５，２５，５
０mg/Lの標準液の希釈系列を作製した。これらの検体
０．０５mLにグルコキナーゼ２Ｕ／mL、ＡＴＰ１mM、ホ
スフォエノールピルビン酸４mM、ピルビン酸キナーゼ３
Ｕ／mL、４−アミノアンチピリン１．２mM、Ｎ−エチル
−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−ｍ−
トルイジン（以下、ＴＯＯＳと略す）１．２mM、ホース
ラディッシュペルオキシダーゼ（以下ＨＲＰと略す）５
Ｕ／mL、ＭｇＣｌ₂を３０mM、ＫＣｌを７５mM含む５０
mMイミダゾール緩衝液（ｐＨ７．８）１．１５mLを加え
３０℃で３０分間反応させた。

【００２８】さらに、この反応液に１００Ｕ／mL濃度の
ピラノースオキシダーゼ（以下ＰＲＯＤと略す）溶液５
０μＬを加え、３０℃でさらに３０分間反応させた後、
５５０nmにおける吸光度を測定した。１０，０００mg/L
グルコース水溶液を含有する系の検量線とグルコースを
含有しない系の検量線の結果を図１に示した。

【００２９】参考例１（本発明による検量線）比較例１と同様にして作製した１，５−ＡＧ濃度０，
１．５，３．１，６．３，１２．５，２５，５０mg/Lの
標準液の希釈系列０．０５mLにグルコキナーゼ５Ｕ／m
L、ＡＴＰ１mM、ホスフォグルコースイソメラーゼ３．
５Ｕ／mL、ホスフォフルクトキナーゼ５Ｕ／mL、４−ア
ミノアンチピリン１．５mM、ＴＯＯＳ１．２mM、ＨＲＰ
５Ｕ／mL、ＭｇＣｌ₂を１０mM、ＫＣｌを２５mM、Ｃａ
Ｃｌ₂を2mM含むＨＥＰＥＳ（２−［４−（２−ヒドロ
キシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸）
緩衝液（ｐＨ８．０）１．１５mLを加え３０℃で３０分
間反応させた。

【００３０】さらに、この反応液に１００Ｕ／mL濃度の
ＰＲＯＤ溶液５０μＬを加え、３０℃でさらに３０分間
反応させた後、５５０nmにおける吸光度を測定した。１
０，０００mg/Lグルコース水溶液を含有する系の検量線
とグルコースを含有しない系の検量線の結果を図２に示
した。

【００３１】図１と図２の比較から明かなように、酵素
試薬調製直後のグルコースの消去の効率はホスホエノー
ルピルビン酸−ピルビン酸キナーゼの系よりも本発明の
方法によるホスフォグルコースイソメラーゼ、ホスフォ
フルクトキナーゼの系の方が良かった。

【００３２】実施例１（血清中の１，５−ＡＧの測
定）（１）グルコースのリン酸化酵素としてグルコキナーゼを用いた場合試薬Ｒ−１４−アミノアンチピリン１．５ｍＭＭｇＣｌ₂ １０ｍＭＫＣｌ２５ｍＭＣａＣｌ₂ ２ｍＭＡＴＰ１５ｍＭＨＲＰ３．７５Ｕ／mL グルコキナーゼ３．５Ｕ／mL アスコルビン酸オキシダーゼ５Ｕ／mL ホスフォグルコースイソメラーゼ３．５Ｕ／mL ホスフォフルクトキナーゼ５Ｕ／mL ＨＥＰＥＳ緩衝液５０ｍＭ（ｐＨ８．０）試薬Ｒ−２ＴＯＯＳ４．５ｍＭピラノースオキシダーゼ１００Ｕ／mL ＨＥＰＥＳ緩衝液５０ｍＭ（ｐＨ８．０）

【００３３】ヒト血清０．０５mLに試薬Ｒ−１１．３
mLを添加し、３７℃で５分間反応させた。その後試薬Ｒ
−２を０．６５mL添加し、５分後の５５０nmでの吸光度
を測定した。なお、同時にヒト血清の代わりに精製水を
用いたブランクも測定した。あらかじめ作製した１，５
−ＡＧの検量線を用いて、血清中１，５−ＡＧ濃度を測
定すると１９．６mg/Lであった。

【００３４】（２）グルコースのリン酸化酵素としてヘ
キソキナーゼを用いた場合グルコキナーゼの代わりに２０Ｕ／mLのヘキソキナーゼ
を使用した以外は（１）と同様に操作した。血清中の
１，５−ＡＧ濃度は１９．１mg/Lであった。

【００３５】実施例２（グルコースのイオン交換樹脂
による吸着除去法と、本発明の方法との比較）ヒト血清３０検体について、従来より行われているイオ
ン交換樹脂を用いるミニカラム法（ラナＡＧキット：日
本化薬製）と実施例１（１）の方法を用いて１，５−Ａ
Ｇ濃度を測定した。実施例１（１）の測定は、日立７１
５０型自動分析装置を用い、検体１０μＬに試薬Ｒ−１
を２６０μＬ添加して３７℃５分間反応させ、さらに試
薬Ｒ−２を１３０μＬ添加して、３７℃５分間反応後、
主波長５４６ｎｍ、副波長７００ｎｍで吸光度の変化を
測定した。

【００３６】イオン交換樹脂を用いるミニカラム法と本
発明の方法による結果の相関図を図３に示す。相関係数
は０．９９で、両測定法間には、高い相関性が認められ
た。

【００３９】

【発明の効果】本発明によれば試料中の１，５−ＡＧを
迅速で簡便な方法により精度良く、夾雑糖類の影響を受
ける事なしに定量することができ自動分析装置での測定
が可能である。

【図面の簡単な説明】

【図１】１，５−ＡＧ検量線（グルコース処理をホスフ
ォエノールピルビン酸−ピルビン酸キナーゼ系で行った
もの）

【図２】１，５−ＡＧ検量線（グルコース処理を本発明
の方法で行ったもの）

【図３】ミニカラム法と本発明の方法による１，５−Ａ
Ｇ定量結果の相関図

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】試料中の１，５−アンヒドログルシトール
をピラノースオキシダーゼまたはＬ−ソルボースオキシ
ダーゼを用いて測定する際に、試料に予めグルコキナー
ゼ及び／またはヘキソキナーゼと、アデノシン三リン
酸、ホスフォグルコースイソメラーゼ、ホスフォフルク
トキナーゼを添加し処理することを特徴とする１，５−
アンヒドログルシトールの定量法。