JPH11514217A

JPH11514217A - 結核の診断のための化合物および方法

Info

Publication number: JPH11514217A
Application number: JP9511465A
Authority: JP
Inventors: ジー．リード，スティーブン; エイ．ダブリュー．スキーキー，イェイサー; シー．ディロン，デイヴィン; カンポス−ネト，アントニオ; ホートン，レイモンド; エイチ．ヴェドヴィック，トーマス; アール．トワードズィック，ダニエル
Original assignee: コリクサコーポレイション
Priority date: 1995-09-01
Filing date: 1996-08-30
Publication date: 1999-12-07
Also published as: ATE324445T1; WO1997009429A3; CN1200146A; EP2154248B1; EP0850305B1; AU7158796A; DE69636075D1; CY2618B2; ATE530671T1; CA2230927A1; CN1154730C; EP0850305A2; MX9801687A; DK2154248T3; PT2154248E; ES2378051T3; CN1554664A; EP2154248A1; WO1997009429A2

Abstract

(57)【要約】結核を診断するための化合物および方法を開示する。提供される化合物は、１つ以上のM.tuberculosisの分泌または非分泌タンパク質の少なくとも１つの抗原性部分を含有するポリペプチド、およびこのようなポリペプチドをコードするDNA配列を含む。このようなポリペプチドまたはDNA配列および適切な検出試薬を含む診断キットは、患者および生物学的サンプルにおけるM.tuberculosis感染の検出のために使用され得る。このようなポリペプチドに対する抗体もまた提供される。

Description

【発明の詳細な説明】結核の診断のための化合物および方法技術分野本発明は、一般に、Mycobacterium tuberculosis感染の検出に関する。本発明は、より詳細には、Mycobacterium tuberculosis抗原、またはその部分もしくは変異体を含むポリペプチド、およびMycobacterium tuberculosis感染の血清診断のためのこのようなポリペプチドの使用に関する。発明の背景結核は、慢性の、感染性疾患であり、一般にMycobacterium tuberculosisの感染により生じる。結核は発展途上国で主要な疾患であり、そして世界中の先進地域で問題が増大しており、毎年約８百万人が新たに発病し、そして３百万人が死亡する。感染はかなりの期間無症候性であり得るが、この疾患は、最も一般的には、発熱および空咳を生じる肺の急性炎症として発現する。処置しないでおくと、典型的には、重篤な合併症および死をもたらす。結核は、一般には広範な抗生物質治療を用いて制御され得るが、このような処置はこの疾患の蔓延を妨げるには十分でない。感染した個体は無症候性であり得るが、かなり長い間、伝染性である。さらに、処置レジメに従うことが重要であるが、患者の行動を監視することは困難である。何人かの患者は処置過程を完了せず、これは効果のない処置および薬物耐性の発達に通じ得る。結核の蔓延を阻害するためには、有効なワクチン接種および疾患の正確な初期診断が必要である。現在、生細菌を用いるワクチン接種は、防御免疫を誘導するために最も有効な方法である。この目的のための最も一般的なMycobacteriumは、Mycobacterium bovisの無発病性株である、Bacillus Calmette-Guerin(BCG)である。しかし、BCGの安全性および効力は論争の源であり、そしてアメリカ合衆国のようないくつかの国は、一般大衆にワクチン接種をおこなわない。診断は、一般に、皮膚試験を用いて達成される。皮膚試験は、ツベルクリンPPD（精製されたタンパク質の誘導体）に対する皮内曝露に関与する。抗原特異的Ｔ細胞応答は、注射後48〜72時間で注射部位に測定可能な潜伏を生じ、これはMycobacterium の抗原への曝露を示す。しかし、感度および特異性はこのテストでは問題があり、そしてBCGをワクチン接種された個体は感染した個体と区別され得ない。マクロファージはM.tuberculosis免疫性の主要なエフェクターとして作用することが示されたとはいえ、Ｔ細胞はこのような免疫性の優勢なインデューサーである。M.tuberculosis感染に対する防御におけるＴ細胞の本質的な役割は、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)の感染に関連するCD4 Ｔ細胞の涸渇に起因する、AIDS患者におけるM.tuberculosisの頻繁な発生により例示される。Mycobacterium応答性CD4 Ｔ細胞はγ-インターフェロン(IFN-γ)の強力なプロデューサーであることが示されており、これは、次に、マウスにおいてマクロファージの抗マイコバクテリア効果を誘発することも示された。ヒトにおけるIFN-γの役割はそれほど明らかでないが、研究により、1,25-ジヒドロキシ-ビタミンD3単独またはこれと IFN-γまたは腫瘍壊死因子-αとの組み合わせのいずれかが、ヒトマクロファージを活性化してM.tuberculosis感染を阻害することが示された。さらに、IFN-γ がヒトマクロファージを刺激して1,25-ジヒドロキシ-ビタミンD3を生じることが知られる。同様に、IL-12はM.tuberculosis感染に対する耐性を刺激するのに役割を果たすことが示された。M.tuberculosis感染の免疫学の総説については、Ch anおよびKaufmann、Tuberculosis：Pathogenesis、Protection and Control，Bl oom（編）、ASM Press、Washington，DC、1994を参照のこと。従って、当該分野において結核を検出するための改善された診断方法についての要求が存在する。本発明は、この要求を満たし、そしてさらに他の関連する利点を提供する。発明の要旨簡潔に述べると、本発明は結核を診断するための組成物および方法を提供する。１つの局面において、可溶性M.tuberculosis抗原、または保存的置換および／もしくは改変のみが異なるこのような抗原の変異体の抗原性部分を含むポリペプチドが提供される。この局面の１つの実施態様において、可溶性抗原は以下のＮ末端配列の１つを有する：ここで、Xaaは任意のアミノ酸であり得る。関連する局面では、M.tuberculosis抗原または保存的置換および／もしくは改変のみが異なるこのような抗原の変異体の免疫原性部分を含むポリペプチドが提供され、この抗原は以下のＮ末端配列の１つを有する：ここで、Xaaは任意のアミノ酸であり得る。別の実施態様では、抗原は、配列番号１、２、４〜10、13〜25、52、94および 96に列挙される配列から成る群から選択されるDNA配列、この配列の相補物、ならびに配列番号１、２、４〜10、13〜25、52、94および96に列挙される配列またはそれらの相補物に中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDN A配列によりコードされるアミノ酸配列を含む。関連する局面では、ポリペプチドは、M.tuberculosis抗原または保存的置換および／もしくは改変のみが異なるこのような抗原の変異体の抗原性部分を含む。ここで、抗原は配列番号26〜51に列挙される配列から成る群から選択されるDNA 配列、これらの配列の相補物、および配列番号26〜51またはそれらの相補物に中程度にストリンジェントな条件下で列挙される配列にハイブリダイズするDNA配列によりコードされるアミノ酸配列を含む。関連する局面では、上記のポリペプチドをコードするDNA配列、これらのDNA配列を含む組換え発現ベクター、およびこのような発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞もまた提供される。別の局面では、本発明は第１および第２の発明となるポリペプチド、あるいは、発明となるポリペプチドおよび公知のM.tuberculosis抗原を含む融合タンパク質を提供する。本発明のさらなる局面では、患者における結核を検出するための方法および診断キットが提供される。この方法は：(a)上記のポリペプチドの少なくとも１つと生物学的サンプルとを接触させる工程；および(b)このポリペプチド（単数または複数）に結合する抗体の存在をサンプル中で検出することにより、生物学的サンプル中のM.tuberculosis感染を検出する工程を包含する。適切な生物学的サンプルは、全血、喀痰、血清、血漿、唾液、脳脊髄液および尿を含む。診断キットは、検出試薬と組み合わせた１以上の上記のポリペプチドを含む。本発明はまた、M.tuberculosis感染を検出するための方法を提供する。この方法は、(a)患者から生物学的サンプルを得る工程；(b)ポリメラーゼ連鎖反応で、サンプルと第１および第２のオリゴヌクレオチドプライマーとを接触させる工程であって、第１および第２のオリゴヌクレオチドプライマーは上記のポリペプチドをコードするDNA配列の少なくとも約10個の連続するヌクレオチドを含む工程；および(c)第１および第２のオリゴヌクレオチドプライマーの存在下で増幅するDNA配列をサンプル中で検出する工程を包含する。さらなる局面では、本発明は患者におけるM.tuberculosis感染を検出するための方法を提供する。この方法は、(a)患者から生物学的サンプルを得る工程；(b) ポリメラーゼ連鎖反応で、サンプルと、上記のポリペプチドをコードするDNA配列の少なくとも約15個の連続するヌクレオチドを含む第１および第２のオリゴヌクレオチドプローブとを接触させる工程；および(c)オリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズするDNA配列をサンプル中で検出する工程を包含する。さらに別の局面では、本発明は、上述のポリペプチドに結合するポリクローナルおよびモノクローナルの両方の抗体、ならびにM.tuberculosis感染の検出でのそれらの使用のための方法を提供する。本発明のこれらおよび他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照すれば明らかになる。本明細書中に開示されるすべての文献は、この結果、各々が個々に組み込まれたかのように、その全体が本明細書中に参照として援用される。図面の簡単な説明および配列の識別名図1AおよびＢは、それぞれ、実施例１に記載の14Kd、20Kd、および26Kdの抗原による、第１および第２のM.tuberculosis免疫ドナー由来のＴ細胞での増殖およびインターフェロン-γ産生の刺激を例示する。図２は、細菌溶解物の反応性と比較した場合の、M.tuberculosisで感染した個体および感染していない個体由来の血清との２つの代表的なポリペプチドの反応性を例示する。図３は、38kD抗原の反応性と比較した場合の、M.tuberculosisで感染した個体および感染していない個体由来の血清との４つの代表的なポリペプチドの反応性を示す。図４は、M.tuberculosis患者、PPD陽性ドナー、および正常ドナー由来の血清との組換え38kD抗原および組換えTbRa11抗原の反応性を示す。図５は、38kD陰性血清での抗原TbRa2Aの反応性を示す。図６は、M.tuberculosis患者および正常ドナー由来の血清との配列番号60の抗原の反応性を示す。配列番号１は、TbRa１のDNA配列である。配列番号２は、TbRa10のDNA配列である。配列番号３は、TbRa11のDNA配列である。配列番号４は、TbRa12のDNA配列である。配列番号５は、TbRa13のDNA配列である。配列番号６は、TbRa16のDNA配列である。配列番号７は、TbRa17のDNA配列である。配列番号８は、TbRa18のDNA配列である。配列番号９は、TbRa19のDNA配列である。配列番号１０は、TbRa24のDNA配列である。配列番号１１は、TbRa26のDNA配列である。配列番号１２は、TbRa28のDNA配列である。配列番号１３は、TbRa29のDNA配列である。配列番号１４は、TbRa2AのDNA配列である。配列番号１５は、TbRa3のDNA配列である。配列番号１６は、TbRa32のDNA配列である。配列番号１７は、TbRa35のDNA配列である。配列番号１８は、TbRa36のDNA配列である。配列番号１９は、TbRa４のDNA配列である。配列番号２０は、TbRa９のDNA配列である。配列番号２１は、TbRaＢのDNA配列である。配列番号２２は、TbRaＣのDNA配列である。配列番号２３は、TbRaＤのDNA配列である。配列番号２４は、YYWCPGのDNA配列である。配列番号２５は、AAMKのDNA配列である。配列番号２６は、TbL-23のDNA配列である。配列番号２７は、TbL-24のDNA配列である。配列番号２８は、TbL-25のDNA配列である。配列番号２９は、TbL-28のDNA配列である。配列番号３０は、TbL-29のDNA配列である。配列番号３１は、TbH-5のDNA配列である。配列番号３２は、TbH-8のDNA配列である。配列番号３３は、TbH-9のDNA配列である。配列番号３４は、TbM-1のDNA配列である。配列番号３５は、TbM-3のDNA配列である。配列番号３６は、TbM-6のDNA配列である。配列番号３７は、TbM-7のDNA配列である。配列番号３８は、TbM-9のDNA配列である。配列番号３９は、TbM-12のDNA配列である。配列番号４０は、TbM-13のDNA配列である。配列番号４１は、TbM-14のDNA配列である。配列番号４２は、TbM-15のDNA配列である。配列番号４３は、TbH-4のDNA配列である。配列番号４４は、TbH-4-FWDのDNA配列である。配列番号４５は、TbH-12のDNA配列である。配列番号４６は、Tb38-1のDNA配列である。配列番号４７は、Tb38-4のDNA配列である。配列番号４８は、TbL-17のDNA配列である。配列番号４９は、TbL-20のDNA配列である。配列番号５０は、TbL-21のDNA配列である。配列番号５１は、TbH-16のDNA配列である。配列番号５２は、DPEPのDNA配列である。配列番号５３は、DPEPの推定アミノ酸配列である。配列番号５４は、DVP Ｎ末端抗原のタンパク質配列である。配列番号５５は、AVGS Ｎ末端抗原のタンパク質配列である。配列番号５６は、AAMK Ｎ末端抗原のタンパク質配列である。配列番号５７は、YYWC Ｎ末端抗原のタンパク質配列である。配列番号５８は、DIGS Ｎ末端抗原のタンパク質配列である。配列番号５９は、AEES Ｎ末端抗原のタンパク質配列である。配列番号６０は、DPEP Ｎ末端抗原のタンパク質配列である。配列番号６１は、APKT Ｎ末端抗原のタンパク質配列である。配列番号６２は、DPAS Ｎ末端抗原のタンパク質配列である。配列番号６３は、TbM-1ペプチドの推定アミノ酸配列である。配列番号６４は、TbRa１の推定アミノ酸配列である。配列番号６５は、TbRa10の推定アミノ酸配列である。配列番号６６は、TbRa11の推定アミノ酸配列である。配列番号６７は、TbRa12の推定アミノ酸配列である。配列番号６８は、TbRa13の推定アミノ酸配列である。配列番号６９は、TbRa16の推定アミノ酸配列である。配列番号７０は、TbRa17の推定アミノ酸配列である。配列番号７１は、TbRa18の推定アミノ酸配列である。配列番号７２は、TbRa19の推定アミノ酸配列である。配列番号７３は、TbRa24の推定アミノ酸配列である。配列番号７４は、TbRa26の推定アミノ酸配列である。配列番号７５は、TbRa28の推定アミノ酸配列である。配列番号７６は、TbRa29の推定アミノ酸配列である。配列番号７７は、TbRa2Aの推定アミノ酸配列である。配列番号７８は、TbRa3の推定アミノ酸配列である。配列番号７９は、TbRa32の推定アミノ酸配列である。配列番号８０は、TbRa35の推定アミノ酸配列である。配列番号８１は、TbRa36の推定アミノ酸配列である。配列番号８２は、TbRa4の推定アミノ酸配列である。配列番号８３は、TbRa9の推定アミノ酸配列である。配列番号８４は、TbRaＢの推定アミノ酸配列である。配列番号８５は、TbRaＣの推定アミノ酸配列である。配列番号８６は、TbRaＤの推定アミノ酸配列である。配列番号８７は、YYWCPGの推定アミノ酸配列である。配列番号８８は、TbAAMKの推定アミノ酸配列である。配列番号８９は、Tb38-1の推定アミノ酸配列である。配列番号９０は、TbH-4の推定アミノ酸配列である。配列番号９１は、TbH-8の推定アミノ酸配列である。配列番号９２は、TbH-9の推定アミノ酸配列である。配列番号９３は、TbH-12の推定アミノ酸配列である。配列番号９４は、DPASのDNA配列である。配列番号９５は、DPASの推定アミノ酸配列である。配列番号９６は、DPVのDNA配列である。配列番号９７は、DPVの推定アミノ酸配列である。配列番号９８は、ESAT-6のDNA配列である。配列番号９９は、ESAT-6の推定アミノ酸配列である。配列番号１００は、TbH-8-2のDNA配列である。配列番号１０１は、TbH-9FLのDNA配列である。配列番号１０２は、TbH-9FLの推定アミノ酸配列である。配列番号１０３は、TbH-9-1のDNA配列である。配列番号１０４は、TbH-9-1の推定アミノ酸配列である。配列番号１０５は、TbH-9-4のDNA配列である。配列番号１０６は、TbH-9-4の推定アミノ酸配列である。配列番号１０７は、Tb38-1F2 INのDNA配列である。配列番号１０８は、Tb38-1F2 RPのDNA配列である。配列番号１０９は、Tb37-FLの推定アミノ酸配列である。配列番号１１０は、Tb38-INの推定アミノ酸配列である。配列番号１１１は、Tb38-1F3のDNA配列である。配列番号１１２は、Tb38-1F3の推定アミノ酸配列である。配列番号１１３は、Tb38-1F5のDNA配列である。配列番号１１４は、Tb38-1F6のDNA配列である。配列番号１１５は、DPVの推定Ｎ末端アミノ酸配列である。配列番号１１６は、AVGSの推定Ｎ末端アミノ酸配列である。配列番号１１７は、AAMKの推定Ｎ末端アミノ酸配列である。配列番号１１８は、YYWCの推定Ｎ末端アミノ酸配列である。配列番号１１９は、DIGSの推定Ｎ末端アミノ酸配列である。配列番号１２０は、AAESの推定Ｎ末端アミノ酸配列である。配列番号１２１は、DPEPの推定Ｎ末端アミノ酸配列である。配列番号１２２は、APKTの推定Ｎ末端アミノ酸配列である。配列番号１２３は、DPASの推定Ｎ末端アミノ酸配列である。配列番号１２４は、DPPD N末端抗原のタンパク質配列である。配列番号１２５〜１２８は、４つのDPPD臭化シアンフラグメントのタンパク質配列である。配列番号１２９は、XDS抗原のＮ末端タンパク質配列である。配列番号１３０は、AGD抗原のＮ末端タンパク質配列である。配列番号１３１は、APE抗原のＮ末端タンパク質配列である。配列番号１３２は、XYI抗原のＮ末端タンパク質配列である。発明の詳細な説明上記のように、本発明は、一般に、結核を診断するための組成物および方法に関する。本発明の組成物は、M.tuberculosis抗原、または保存的置換および／または改変でのみ異なるこのような抗原の変異体の、少なくとも１つの抗原性部分を含むポリペプチドを含む。本発明の範囲内のポリペプチドとしては、可溶性M. tuberculosis抗原が挙げられるが、これらに限定されない。「可溶性M.tubercul osis抗原」は、M.tuberculosis培養濾液中に存在するM.tuberculosis起源のタンパク質である。本明細書で使用する用語「ポリペプチド」は、全長タンパク質( すなわち、抗原)を含む、任意の長さのアミノ酸鎖を包含し、ここで、アミノ酸残基は共有ペプチド結合によって連結されている。従って、上記の抗原の１つの抗原性部分を含むポリペプチドは、全体が抗原性部分からなり得るか、またはさらなる配列を含み得る。さらなる配列は、天然のM.tuberculosis抗原に由来し得るか、または異種のものであり得、そしてこのような配列は、抗原性であり得る (そうである必要はない)。抗原の「抗原性部分」(可溶性であってもそうでなくても良い)は、M.tubercul osis感染個体から得られる血清と反応し得る部分である(すなわち、本明細書中に記載する代表的なELISAアッセイにおいて、感染個体由来の血清で、感染していない個体由来の血清で得られる吸光度より少なくとも３標準偏差上回る吸光度の読みとり値をもたらす)。「M.tuberculosis感染個体」は、M.tuberculosisに感染しているヒトである(例えば、少なくとも直径0.5cmのPPDに対する皮内皮膚試験応答を有する)。感染個体は、結核の症候を示し得るか、または疾患症候を示さないこともある。本明細書中に記載する１つ以上のM.tuberculosis抗原の少なくとも抗原性部分を含むポリペプチドが、一般に、単独または組合せで、患者の結核を検出するために使用され得る。本発明の組成物および方法はまた、上記のポリペプチドの変異体を包含する。本明細書で使用する「変異体」は、保存的置換および／または改変のみが天然の抗原と異なり、その結果、ポリペプチドの抗原性特性が保持されているポリペプチドである。このような変異体は、一般に、例えば本明細書中に記載する代表的な手順を使用して、上記のポリペプチド配列の１つを改変し、そして改変ポリペプチドの抗原性特性を評価することによって、同定され得る。「保存的置換」は、ペプチド化学の当業者がこのポリペプチドの２次構造およびヒドロパシー性質が実質的に変化していないことを予測するように、アミノ酸を類似する特性を有する別のアミノ酸で置換する置換である。一般に、以下の群のアミノ酸は、保存的変化を示す：(1)ala、pro、gly、glu、asp、gln、asn、se r、thr；(2)cys、ser、tyr、thr；(3)val、ile、leu、met、ala、phe；(4)lys、 arg、his；および(5)phe、tyr、trp、his。変異体はまた(またはあるいは)、例えば、ポリペプチドの抗原性特性、２次構造、およびヒドロパシー性質に最小の影響しか及ぼさないアミノ酸の欠失または付加によって改変され得る。例えば、ポリペプチドは、翻訳と同時にまたは翻訳後にタンパク質の転移を導くタンパク質のＮ末端でシグナル(またはリーダー)配列に結合され得る。このポリペプチドはまた、ポリペプチド(例えば、ポリ-His) の合成、精製、または同定を容易にするために、または固体支持体へのこのポリペプチドの結合を増強するために、リンカーまたは他の配列に結合され得る。例えば、ポリペプチドは、免疫グロブリンFc領域に結合され得る。関連する局面において、組合せポリペプチドが開示される。「組合せポリペプチド」は、少なくとも１つの上記の抗原性部分および１つ以上のさらなる抗原性 M.tuberculosis配列を含むポリペプチドであり、これは、ペプチド結合によって単一のアミノ酸鎖に接合されている。この配列は、直接接合される(すなわち、介入アミノ酸なしに)か、または成分ポリペプチドの抗原性特性を顕著に消失させないリンカー配列(例えば、Gly-Cys-Gly)によって接合され得る。一般に、M.tuberculosis抗原、およびこのような抗原をコードするDNA配列は、任意の種々の手順を使用して調製され得る。例えば、可溶性抗原を、当業者に公知の手順(陰イオン交換クロマトグラフィーおよび逆相クロマトグラフィーを含む)によってM.tuberculosis培養濾液から単離し得る。次いで、精製された抗原を、所望の特性(例えば、M.tuberculosis感染個体から得られた血清と反応する能力)について評価し得る。このようなスクリーニングは、本明細書中に記載の代表的な方法を用いて実施され得る。次いで、抗原を、例えば伝統的なエドマン化学を使用して部分的に配列決定し得る。EdmanおよびBerg，Eur．J．Biochem ．80:116-132，1967を参照のこと。抗原はまた、この抗原をコードするDNA配列を使用して組換え的に産生され得る。このDNA配列は発現ベクターに挿入され、そして適切な宿主内で発現される。可溶性抗原をコードするDNA分子を、可溶性M.tuberculosis抗原に対して特異的に惹起された抗血清(例えば、ウサギ)を用いて、適切なM.tuberculosis発現ライブラリーをスクリーニングすることによって単離し得る。可溶性であるかもしれないしそうでないかもしれない抗原をコードするDNA配列を、M.tuberculosis に感染した患者から得られた血清を用いて、適切なM.tuberculosisゲノムDNAまたはcDNA発現ライブラリーをスクリーニングすることによって同定し得る。このようなスクリーニングは、一般に、当該分野で周知の技術(例えば、Sambrookら、M olecular Cloning: A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratories， Cold Spring Harbor，NY，1989に記載される技術)を使用して行われ得る。可溶性抗原をコードするDNA配列はまた、単離された可溶性抗原の部分アミノ酸配列に由来する縮重オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするDNA配列について、適切なM.tuberculosis cDNAまたはゲノムDNAライブラリーをスクリーニングすることによって得られ得る。このようなスクリーニングで使用するための縮重オリゴヌクレオチド配列を設計および合成し得、そしてスクリーニングは、(例えば)Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual，Cold Spring Har bor Laboratories，Cold Spring Harbor，NY(および本明細書中で援用された参考文献)に記載されるように行い得る。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)もまた、当該分野で周知の方法において上記のオリゴヌクレオチドを使用して、cDNAまたはゲノムライブラリーから核酸プローブを単離するために用い得る。次いで、ライブラリースクリーニングを、単離されたプローブを使用して行い得る。調製の方法に関わらず、本明細書中に記載する抗原は「抗原性」である。より詳細には、抗原は、M.tuberculosis感染個体から得られた血清と反応する能力を有する。反応性は、例えば本明細書中に記載する代表的ELISAアッセイを使用して評価し得、ここで、感染個体由来の血清での、感染していない個体由来の血清で得られた吸光度を少なくとも３標準偏差上回る吸光度の読みとり値を陽性であると考える。 M.tuberculosis抗原の抗原性部分は、周知技術(例えば、Paul，Fundamental I mmunology，第３版、Raven Press，1993，243-247頁および本明細書中で援用された参考文献に要約された技術)を使用して調製および同定し得る。このような技術には、天然の抗原のポリペプチド部分を抗原性特性についてスクリーニングすることが含まれる。本明細書中に記載する代表的ELISAが、一般に、これらのスクリーニングにおいて用いられ得る。ポリペプチドの抗原性部分は、このような代表的アッセイの範囲内で、このようなアッセイにおいて全長抗原が生じるシグナルに実質的に類似しているシグナルを生じる部分である。言い換えれば、M. tuberculosis抗原の抗原性部分は、本明細書中に記載するモデルELISAにおいて、全長抗原によって誘導されるシグナルの少なくとも約20％、そして好ましくは約100％を生じる。 M.tuberculosis抗原の部分および他の変異体は、合成手段または組換え手段により生成され得る。約100より少ないアミノ酸、および一般には約50より少ないアミノ酸を有する合成ポリペプチドを、当該分野で周知の技術を用いて生成し得る。例えば、このようなポリペプチドを、伸長するアミノ酸鎖にアミノ酸が連続的に添加される、Merrifield固相合成法のような、任意の市販の固相技術を用いて合成し得る。Merrifield、J．Am．Chem．Soc．85：2149-2146、1963を参照のこと。ポリペプチドの自動合成のための装置は、Applied BioSystems，Inc.，Fo ster City，CAのような供給者から市販されており、そしてこれを製造者の指示に従って操作し得る。天然の抗原の変異体を、一般に、オリゴヌクレオチド指定部位特異的変異誘発のような、標準的な変異誘発技術を用いて調製し得る。DNA 配列の断片もまた、短縮型のポリペプチドの調製を可能にする標準的な技術を用いて取り除き得る。天然の抗原の部分および／または変異体を含む組換えポリペプチドを、当業者に周知の種々の技術を用いてポリペプチドをコードするDNA配列から容易に調製し得る。例えば、培地に組換えタンパク質を分泌する適切な宿主／ベクター系からの上清を、市販のフィルターを用いて最初に濃縮し得る。濃縮の後、濃縮物を、アフィニティーマトリックスまたはイオン交換樹脂のような適切な精製マトリクスに適用し得る。最後に、１以上の逆相HPLC工程を用いて組換えタンパク質をさらに精製し得る。当業者に公知の任意の種々の発現ベクターを用いて、本発明の記載される組換えタンパク質を発現し得る。発現を、組換えポリペプチドをコードするDNA分子を含む発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた任意の適切な宿主細胞で達成し得る。適切な宿主細胞は、原核生物、酵母および高等真核生物の細胞を含む。好ましくは、使用される宿主細胞は、E．coli、酵母またはCOSもしくはCHOのような哺乳動物細胞株である。この様式で発現されるDNA配列は、天然に存在する抗原、天然に存在する抗原の部分、またはそれらの他の変異体をコードし得る。一般に、調製方法によらず、本明細書中に開示されるポリペプチドは実質的に純粋な形態で調製される。好ましくは、ポリペプチドは少なくとも約80％純粋であり、より好ましくは少なくとも約90％純粋であり、そして最も好ましくは少なくとも約99％純粋である。しかし、本明細書中に記載される方法での使用について、このような実質的に純粋なポリペプチドが組み合わされ得る。ある特定の実施態様では、本発明は、可溶性のM.tuberculosis抗原（またはこのような抗原の変異体）の少なくとも抗原性部分を含むポリペプチドを開示する。ここでこの抗原は以下のＮ末端配列の１つを有する：ここで、Xaaは任意のアミノ酸であり得、好ましくはシステイン残基である。上記の(g)として同定された抗原をコードするDNA配列を配列番号52に提供し、この推定のアミノ酸配列を配列番号53に提供する。上記の(a)として同定された抗原をコードするDNA配列を配列番号96に提供する；その推定のアミノ酸配列を配列番号97に提供する。上記の抗原(d)に対応するDNA配列を配列番号24に提供し、抗原(c)に対応するDNA配列を配列番号25に提供し、そして抗原(I)に対応するDNA 配列を配列番号94に開示し、そしてその推定のアミノ酸配列を配列番号95に提供する。さらなる特定の実施態様では、本発明は、以下のＮ末端配列の１つを有するM. tuberculosis抗原の少なくとも１つの免疫原性部分、または保存的置換および／または改変のみが異なるその変異体を含むポリペプチドを開示する。ここで、Xaaは任意のアミノ酸であり得、好ましくはシステイン残基である。他の特定の実施態様では、本発明は、(a)配列番号１、２、４〜10、13〜25、5 2、94および96のDNA配列、(b)このようなDNA配列の相補物、あるいは(c)(a)または(b)の配列に実質的に相同なDNA配列によりコードされる１以上のアミノ酸配列を含む、可溶性M.tuberculosis抗原（またはこのような抗原の変異体）の少なくとも免疫原性部分を含むポリペプチドを開示する。さらなる特定の実施態様では、本発明は、(a)配列番号26〜51のDNA配列、(b) このようなDNA配列の相補物あるいは(c)(a)または(b)の配列に実質的に相同なDN A配列によりコードされる１以上のアミノ酸配列を含む、可溶性であり得るかまたは可溶性でなくてもよい、M.tuberculosis抗原（またはこのような抗原の変異体）の少なくとも免疫原性部分を含むポリペプチドを開示する。上述の特定の実施態様では、M.tuberculosis抗原は、特に本明細書中に列挙される１以上のDNA配列に実質的に相同なDNA配列によりコードされる変異体を含む。本明細書中で使用される「実質的な相同性」は、中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得るDNA配列を言う。適切な中程度にストリンジェントな条件は、５×SSC、0.5％SDS、1.0 mM EDTA(pH 8.0)の溶液での予備洗浄；50 ℃〜65℃での、５×SSC、一晩、または0.5×SSCを用いる45℃での交差-種相同性の事象におけるハイブリダイズ；続く0.1％SDSを含む２×、0.5×および0.2×SS Cの各々を用いる65℃での20分間の２回の洗浄を含む。このようなハイブリダイズするDNA配列はまた本発明の範囲内であり、コードの縮重のため、ハイブリダイズするDNA配列によりコードされる免疫原性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列も同様である。関連する局面では、本発明は、第１と第２の本発明のポリペプチドまたは、あるいは、本発明のポリペプチドと上述の38kDの抗原またはESAT-6（配列番号98および99）のような公知のM.tuberculosis抗原とを含む融合タンパク質を、このような融合タンパク質の変異体とともに提供する。本発明の融合タンパク質はまた、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとの間にリンカーペプチドを含み得る。本発明の融合タンパク質をコードするDNA配列を、公知の組換えDNA技術を用いて構築して、第１および第２のポリペプチドをコードする別々のDNA配列を、適切な発現ベクターに集める。第１のポリペプチドをコードするDNA配列の３'末端をペプチドリンカーを用いてまたは用いずに第２のポリペプチドをコードするDN A配列の５'末端に連結し、その結果配列のリーディングフレームは、第１および第２の両方のポリペプチドの生物学的活性を保持する単一の融合タンパク質へ２つのDNA配列のmRNA翻訳を許容する相中に存在する。ペプチドリンカー配列を用いて、各々のポリペプチドをその二次構造および三次構造に折り畳むことを確実にするのに十分な間隔を置いて第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとを分離し得る。このようなペプチドリンカー配列を、当該分野で周知の標準的な技術を用いて融合タンパク質に組み込む。適切なペプチドリンカー配列を以下の要因に基づいて選択し得る：(1)可撓性の伸長した構造を採用するそれらの能力；(2)第１および第２のポリペプチド上の機能的なエピトープと相互作用し得る二次構造を採用するそれらの能力のなさ；および(3)ポリペプチドの機能的なエピトープと反応し得る疎水性残基または荷電残基の欠失。好ましいペプチドリンカー配列は、Gly，AsnおよびSer残基を含む。Thrおよび Alaのような、他の中性に近いアミノ酸をまたリンカー配列で用い得る。リンカーとして通常に用いられ得るアミノ酸配列は、Marateaら、Gene 40：39-46、198 5；Murphyら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 83：8258-8262、1986；米国特許第4 ,935,233号および米国特許第4,751,180号に開示されるものを含む。リンカー配列は、１〜約50アミノ酸長であり得る。ペプチドリンカー配列は、第１および第２のポリペプチドが、機能的ドメインを分離しかつ立体障害を妨げるために使用され得る非必須Ｎ末端アミノ酸領域を有する場合には必要でない。別の局面では、本発明は、結核を診断するための上述のポリペプチドを使用する方法を提供する。この局面では、１以上の上記のポリペプチドを、単独でまたは組み合わせて用いる、生物学的試料中のM.tuberculosis感染を検出する方法を提供する。複数のポリペプチドを使用する実施態様では、AndersenおよびHansen 、Infect．Immun．57：2481-2488、1989に記載される38 kD抗原のような、本明細書中に特に記載されるポリペプチド以外のポリペプチドが含まれ得る。本明細書中で使用される「生物学的試料」は、患者から得た任意の抗体含有試料である。好ましくは、この試料は、全血、喀痰、血清、血漿、唾液、髄液または尿である。より好ましくは、この試料は、患者または血液供給者から得た血液、血清または血漿試料である。ポリペプチドは、予め決定されたカットオフ値に対する、試料中のポリペプチドに対する抗体の存在または非存在を決定するための、以下に記載されるようなアッセイで用いられる。このような抗体の存在は、結核を示し得るマイコバクテリア抗原に対する先の感作を示す。１つより多いポリペプチドが用いられる実施態様において、使用されるポリペプチドは、好ましくは、相補的である（すなわち、１つのポリペプチド成分は、別のポリペプチド成分によっては感染が検出されないサンプル中の感染を検出する傾向がある）。相補的なポリペプチドは、一般に、各ポリペプチドを個々に用いてM.tuberculosisに感染したことがわかっている一連の患者から得られる血清サンプルを評価することにより同定され得る。各ポリペプチドを用いてどのサンプルが陽性であるかを（以下に記載）決定した後、２つ以上のポリペプチドの組み合わせが処方され得る。この組み合わせは、ほとんどまたはすべての試験されるサンプルの感染を検出し得る。このようなポリペプチドは相補的である。例えば、ほぼ25〜30％の結核感染個体由来の血清は、任意の単一のタンパク質（例えば、上記の38kD抗原）に対する抗体については陰性である。それゆえ、相補的なポリペプチドは、診断試験の感度を改良するために38kD抗原と組み合わせて使用され得る。サンプル中の抗体を検出するために１つ以上のポリペプチドを用いるための、当業者に公知の種々のアッセイ形式が存在する。例えば、HarlowおよびLane、An tibodies: A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1988を参照のこと。これは、本願明細書中において参考として援用される。好ましい実施態様において、アッセイは、サンプルからの抗体を結合させるための、およびサンプルから抗体を除去するための、固相支持体上に固定されたポリペプチドの使用を含む。次いで、結合した抗体は、レポーター基を含む検出試薬を用いて検出され得る。適切な検出試薬には、抗体／ポリペプチド複合体に結合する抗体、およびレポーター基で標識された遊離のポリペプチドが含まれる（例えば、半競合アッセイにおいて）。あるいは、競合アッセイが用いられ得る。競合アッセイでは、ポリペプチドに結合する抗体はレポーター基で標識され、そして抗原をサンプルとともにインキュベーションした後、固定された抗原に結合し得る。サンプルの成分が標識された抗体のポリペプチドへの結合を阻害する程度は、サンプルの固定されたポリペプチドとの反応性の指標である。固相支持体は、当業者に公知の、抗原を結合し得る任意の固体材料であり得る。例えば、固相支持体は、マイクロタイタープレート中のテストウェルまたはニトロセルロースまたは他の適切な膜であり得る。あるいは、支持体は、ビーズもしくはディスク（例えば、ガラス）、ガラス繊維、ラテックス、またはプラスチック材料（例えば、ポリスチレンまたはポリビニルクロリド）であり得る。支持体はまた、磁性粒子または繊維状の光学センサー（例えば、米国特許第5,359,68 1 号に開示されるような）であり得る。ポリペプチドは、当業者に公知の種々の技術を用いて固相支持体に結合され得る。この技術は、特許および科学文献中に詳細に記載される。本発明の状況において、用語「結合」は、吸着のような非共有的会合および共有結合の両方をいう（これは、抗原と支持体上の官能基との間の直接的な結合であり得るか、または架橋剤による結合であり得る）。吸着による、マイクロタイタープレート中のウェルまたは膜への結合が好ましい。このような場合、吸着は、ポリペプチドを、固相支持体と、適切な緩衝液中で適切な時間接触させることにより達成され得る。接触時間は温度により変化するが、代表的には、約１時間と１日との間である。一般的には、プラスチックマイクロタイタープレート（例えば、ポリスチレンまたはポリビニルクロリド）のウエルと、約10ng〜約１μgの範囲の量、および好ましくは約100ngの量のポリペプチドとの接触は、適切な量の抗原を結合させるに十分である。ポリペプチドの固相支持体への共有結合は、一般に、最初に支持体を、支持体およびポリペプチド上の官能基（例えば、ヒドロキシル基またはアミノ基）の両方と反応する二官能性試薬と反応させることにより達成され得る。例えば、ポリペプチドは、適切なポリマーコーティングを有する支持体に、ベンゾキノンを用いて、またはアミンを有する支持体上のアルデヒド基とポリペプチド上の活性水素との縮合により結合され得る（例えば、Pierce Immunotechnology Catalog an d Handbook，1991 A12-A13を参照のこと）。特定の実施態様において、アッセイは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）である。このアッセイは、固相支持体（通常、マイクロタイタープレートのウェル）上に固定されたポリペプチド抗原をサンプルと最初に接触させることにより行われ得、その結果、サンプル中のポリペプチドに対する抗体が固定されたポリペプチドに結合することが可能になる。次いで、結合しなかったサンプルが固定されたポリペプチドから除去され、そして固定抗体-ポリペプチド複合体に結合し得る検出試薬が添加される。次いで、固相支持体に結合したままの検出試薬の量を、特定の検出試薬に適切な方法を用いて決定する。より詳細には、一旦、ポリペプチドが上記のように支持体に固定されると、支持体上の残留しているタンパク質結合部位が、代表的には、ブロックされる。当業者に公知の任意の適切なブロッキング試薬（例えば、ウシ血清アルブミンまたはTween 20^TM(Sigma Chemical Co.，St．Louis，MO)）が用いられ得る。固定されたポリペプチドは、次いで、サンプルとともにインキュベートされ、そして抗体を抗原に結合させる。サンプルは、インキュベーション前に適切な希釈剤（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)）により希釈され得る。一般には、適切な接触時間（すなわち、インキュベーション時間）は、M.tuberculosis感染サンプル中の抗体の存在を検出するに十分な時間の期間である。好ましくは、接触時間は、結合した抗体と結合していない抗体との間の平衡で達成されるレベルの少なくとも95％のレベルの結合に達するに十分な時間である。当業者は、平衡に達するに必要な時間は、結合が生じるレベルを所定の時間にわたってアッセイすることにより容易に決定し得ることを認識する。室温では、約30分のインキュベーション時間は、一般に、十分である。次いで、結合していないサンプルは、固相支持体を適切な緩衝液（例えば、0. 1％ Tween 20^TMを含むPBS）で洗浄することにより除去される。次いで、検出試薬が、固相支持体に添加され得る。適切な検出試薬は、固定された抗体-ポリペプチド複合体に結合し、そして当該分野に公知の任意の種々の手段により検出され得る任意の化合物である。好ましくは、検出試薬は、レポーター基に結合する結合因子（例えば、Protein A、Protein G、免疫グロブリン、レクチン、または遊離の抗原）を含む。好ましいレポーター基には、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）、基質、補因子、阻害剤、色素、放射性核種、発光性基、蛍光性基、およびビオチンが含まれる。結合因子のレポーター基への結合は、当業者に公知の標準的な方法を用いて達成され得る。また、種々のレポーター基に結合している通常の結合因子を、多くの商業的供給源（例えば、Zymed Laboratories ，San Francisco，CA、およびPierce，Rockford，IL）から購入し得る。次いで、検出試薬は、固定された抗体-ポリペプチド複合体とともに、結合した抗体を検出するに十分な時間、インキュベートされる。適切な時間は、一般に、製造者の指示から、または所定の時間にわたって生じる結合のレベルをアッセイすることにより、決定され得る。次いで、結合していない検出試薬が除去され、そして結合した検出試薬がレポーター基を用いて検出される。レポーター基の検出のために用いられる方法は、レポーター基の性質に依存する。放射活性基については、シンチレーション計測またはオートラジオグラフ的方法が、一般に適切である。色素、発光性基、および蛍光性基を検出するためには、分光方法が使用され得る。ビオチンは、異なるレポーター基（通常、放射活性基または蛍光性基または酵素）に結合したアビジンを用いて検出され得る。酵素レポーター基は、一般には、基質を添加し（一般には、特定の時間の間）、続いて反応生成物を分光分析または他の分析をすることによって検出され得る。サンプル中の抗M.tuberculosis抗体の存在および非存在を決定するために、固相支持体に結合したままのレポーター基からのシグナルは、一般に、予め決定したカットオフ値に対応するシグナルと比較される。１つの好ましい実施態様において、カットオフ値は、固定された抗原が非感染患者由来のサンプルとともにインキュベートされる場合に得られる平均値のシグナルである。一般には、上記の予め決定したカットオフ値を３標準偏差を上回るシグナルを生じるサンプルは、結核について陽性であると考えられる。別の好ましい実施態様において、カットオフ値は、Receiver Operator Curve（Sackettら、Clinical Epidemiology: A B asic Science for Clinical Medicine，Little Brown and Co.，1985，106〜107 頁の方法に従う）を用いて決定される。簡潔には、この実施態様において、カットオフ値は、真の陽性の割合（すなわち、感受性）および偽陽性割合（100％− 感受性）（これらは診断試験結果についてそれぞれ可能なカットオフ値に対応する）の組のプロットから決定され得る。上部左隅に最も近いプロット上のカットオフ値（すなわち、最も広い領域を包含する値）は最も正確なカットオフ値であり、そしてこの方法により決定されるカットオフ値よりも高いシグナルを生じるサンプルは陽性であると考えられ得る。あるいは、カットオフ値は、偽陽性の割合を最小にするためにプロットに沿って左にシフトされ得るか、または偽陰性の割合を最小にするするために右にシフトされ得る。一般には、この方法により決定されるカットオフ値よりも高いシグナルを生じるサンプルは、結核について陽性であると考えられる。関連する実施態様において、このアッセイは、高速フロースルー（rapid flow -through）試験またはストリップ（strip）試験形式で行われる。この形式では、抗原がニトロセルロースのような膜上に固定されている。フロースルー試験において、サンプルが膜を通過する際に、サンプル中の抗体は固定されたポリペプチドに結合する。次いで、検出試薬（例えば、Protein A-コロイド状の金）は、検出試薬を含む溶液が膜を通過する際に、抗体-ポリペプチド複合体に結合する。結合した検出試薬の検出は、次いで、上記のように行われ得る。ストリップ試験形式において、ポリペプチドが結合した膜の一方の面が、サンプルを含む溶液中に浸漬される。サンプルは、検出試薬を含む領域を通って膜に沿って移動し、そして固定されたポリペプチドの領域まで移動する。ポリペプチドの検出試薬の濃度から、サンプル中の抗M.tuberculosis抗体の存在が示される。代表的には、その部位での検出試薬の濃度は、線のような視覚的に読み取り得るパターンを生じる。このようなパターンが存在しなければ、結果は陰性であることが示される。一般には、膜上に固定されたポリペプチドの量は、生物学的サンプルが上記の ELISAにおいて陽性シグナルを生じるに十分であるレベルの抗体を含む場合、視覚的に認識し得るパターンを生じるように選択される。好ましくは、膜上に固定されたポリペプチドの量は、約25ngから約１μgで、およびより好ましくは、約5 0ngから約500ngで変化する。このような試験は、代表的には、非常に少量（例えば、一滴）の患者の血清または血液により行われ得る。もちろん、本発明のポリペプチドを用いた使用に適切な、多くの他のアッセイプロトコルが存在する。上記の記載は、例示にすぎないことを意図する。なお別の局面において、本発明は、本発明のポリペプチドに対する抗体を提供する。抗体は、当業者に公知の任意の種々の技術により調製され得る。例えば、 HarlowおよびLane,Antibodies:A Loboratory Manual,Cold Spring Harbor Labor atory,1988を参照のこと。１つのこのような技術において、抗原性ポリペプチドを含む免疫原は、最初に、任意の広範な種々の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、およびヤギ）に注入される。この工程において、本発明のポリペプチドは、改変することなく免疫原として作用し得る。あるいは、特に比較的短いポリペプチドについて、このポリペプチドがキャリアタンパク質（例えば、ウシ血清アルブミンまたはキーホールリンペットヘモシアニン）に結合される場合、優れた免疫応答が誘発され得る。免疫原は、好ましくは、１つ以上の追加免疫化を組み込む所定のスケジュールに従って動物宿主に注入され、そして動物は周期的に採血される。次いで、ポリペプチドに特異的なポリクローナル抗体は、例えば、適切な固体支持体に結合したポリペプチドを用いるアフィニティクロマトグラフィーにより、このような抗血清から精製され得る。目的の抗原性ポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体は、例えば、Kohler およびMilstein,Eur.J.Immunol.6:511-519,1976の技術およびその改良を用いて調製され得る。簡単には、これらの方法は、所望の特異性（すなわち、目的のポリペプチドとの反応性）を有する抗体を産生し得る不死細胞株の調製を包含する。このような細胞株は、例えば、上記のように免疫化された動物から得られた脾臓細胞から産生され得る。次いで、脾臓細胞は、例えば、ミエローマ細胞融合パートナー、好ましくは免疫化動物と同系であるものとの融合により不死化される。種々の融合技術が使用され得る。例えば、脾臓細胞およびミエローマ細胞は、数分間非イオン性界面活性剤と一緒にされ、次いで、ハイブリッド細胞の増殖を支持するが、ミエローマ細胞の増殖を支持しない選択培地に低密度でプレーティングされ得る。好ましい選択技術は、HAT(ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン)選択を使用する。十分な時間、通常約１〜２週間の後、ハイブリッドのコロニーを観察する。単一のコロニーを選択し、そしてポリペプチドに対する結合活性について試験する。高い反応性および特異性を有するハイブリドーマが好ましい。モノクローナル抗体は、増殖しているハイブリドーマコロニーの上清から単離され得る。さらに、種々の技術が、収量を増強するために使用され得る。例えば、ハイブリドーマ細胞株を適切な脊椎動物宿主（例えば、マウス）の腹腔に注入する。次いで、モノクローナル抗体は、腹水または血液から採集され得る。夾雑物は、従来の技術（例えば、クロマトグラフィー、ゲル濾過、沈澱、および抽出）により抗体から取り除かれ得る。本発明のポリペプチドは、例えば、アフィニティクロマトグラフィー工程における精製工程で使用され得る。抗体を診断試験に使用して、上記に詳述されるアッセイに類似したアッセイおよび当業者に周知の他の技術を用いて、M.tuberculosis抗原の存在を検出し得、これにより患者のM.tuberculosis感染を検出する方法を提供する。本発明の診断試薬はまた、上記のポリペプチドの１つ以上、またはその１つ以上の部分をコードするDNA配列を含み得る。例えば、本発明のDNA配列の少なくとも10個の連続したオリゴヌクレオチドを含むプライマーが、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)に基づく試験において使用され得る。同様に、本発明のDNA配列の少なくとも15個の連続したオリゴヌクレオチドプローブが、特定の配列にハイブリダイズするために使用され得る。PCRに基づく試験およびハイブリダイゼーション試験の両方のための技術は当該分野で周知である。従って、プライマーまたはプローブを使用して、生物学的サンプル、好ましくは、喀痰、血液、血清、唾液、脳脊髄液または尿中のM.tuberculosis感染を検出し得る。上記のオリゴヌクレオチド配列を含むDNAプローブまたはプライマーは、単独で、または互いを組合わせて、あるいは上記の38kD抗原のような以前に同定された配列と共に使用され得る。以下の実施例は、例示のために提供され、そして限定のために提供されない。実施例実施例１ M.tuberculosis 培養濾過物由来のポリペプチドの精製および特徴付け本実施例は、培養濾過物からのM.tuberculosis可溶性ポリペプチドの調製を例示する。他に言及されない限り、以下の実施例における全てのパーセントは、容量あたりの重量である。 M.tuberculosis(H37Ra,ATCC No.25177、またはH37Rv,ATCC No.25618のいずれか)を、滅菌GAS培地で37℃で14日間培養した。次いで、培地を、0.45μフィルターに通して吸引濾過して（大部分の細胞を残す）滅菌2.5Lボトルに入れた。次いで、培地を、0.2μフィルターに通して濾過して滅菌４Lボトルに入れた。次いで、NaN₃を培養濾過物に0.04％の濃度に添加した。次いで、ボトルを４℃の低温室に置いた。濾過物をオートクレーブした12Lリザーバーに入れ、エタノールでリンスし、1 0,000kDa MWCO膜を含む400ml Amicon stir cellに、濾過物を送り込むことより、培養濾過物を濃縮した。圧力を、窒素ガスを用いて60psiで維持した。この手順により、12L容量を約50mlに減少させた。次いで、培養濾過物を、重炭酸アンモニウム溶液を２回交換して、8,000kDa M WCOセルロースエステル膜を用いて0.1％重炭酸アンモニウム中に透析した。次いで、タンパク質濃度を、市販のBCAアッセイ(Pierce,Rockford,IL)により決定した。次いで、透析した培養濾過物を凍結乾燥し、そしてポリペプチドを蒸留水に再懸濁した。次いで、ポリペプチドを、陰イオン交換クロマトグラフィーの初期条件である、0.01mM 1,3ビス[トリス(ヒドロキシメチル)-メチルアミノ]プロパン、pH7.5(Bis-Trisプロパン緩衝液)に対して透析した。分画を、0.01mM Bis-Tris プロパン緩衝液(pH7.5)で平衡化したPOROS 146 II Q/M陰イオン交換カラム4.6mm ×100mm(Perseptive BioSystems,Framingham,MA)で、ゲルプロフュージョンクロマトグラフィーを用いて行った。ポリペプチドを、上記の緩衝液系での線形０〜 0.5M NaClグラジエントで溶出した。カラムの溶出液を220nmの波長でモニターした。イオン交換カラムから溶出したポリペプチドのプールを、蒸留水に対して透析し、そして凍結乾燥した。得られた物質を、0.1％トリフルオロ酢酸(TFA)pH1.9 を含む水に溶解し、そしてポリペプチドを、Delta-Pak C18カラム(Waters,Milfo rd,MA)300オングストローム孔サイズ、５ミクロン粒子サイズ(3.9×150mm)で精製した。ポリペプチドを、０〜60％希釈緩衝液（アセトニトリル中の0.1％TFA）の直線勾配を用いてカラムから溶出した。流速は0.75ml/分であり、そしてHPLC 溶出液を214nmでモニターした。溶出されたポリペプチドを含む画分を回収し、個々のサンプルの純度を最大にした。約200個の精製されたポリペプチドを得た。次いで、精製ポリペプチドを、PBMC調製物においてＴ細胞増殖を誘導する能力についてスクリーニングした。PPD皮膚試験陽性であることが知られ、そしてそのＴ細胞がPPDおよびMTB由来の粗可溶性タンパク質に応答して増殖することが知られているドナー由来のPBMCを、10％プールヒト血清および50μg/mlゲンタマイシンを補充したRPMI 1640を含む培地で培養した。精製ポリペプチドを、0.5〜10 μg/mLの濃度で２連で添加した。200μlの容量の96ウェル丸底プレート中で６日間培養した後、培地の50μlを、以下の記載のようにIFN-γレベルの決定のために各ウェルから取り出した。次いで、プレートを、さらに18時間トリチウム化チミジンの１μCi/ウェルでパルスし、採集し、そしてトリチウムの取り込みをガスシンチレーションカウンターを用いて決定した。両方のレプリカで、培地のみで培養された細胞において観察された増殖よりも３倍大きい増殖をもたらす画分を、陽性とみなした。 IFN-γを、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を用いて測定した。ELISAプレートを、室温で４時間、PBS中のヒトIFN-γ(Chemicon)に対するマウスモノクローナル抗体でコートした。次いで、ウェルを、室温で１時間、５％(W/V)脱脂粉乳を含むPBSでブロックした。次いで、プレートを、PBS/0.2％ TWEEN-20中で６回洗浄し、そしてELISAプレート中で培養培地で1:2に希釈したサンプルを、室温で一晩インキュベートした。プレートを再度洗浄し、そしてPBS/10％正常ヤギ血清で1:3000に希釈したポリクローナルウサギ抗ヒトIFN-γ血清を各ウェルに添加した。次いで、プレートを室温で２時間インキュベートし、洗浄し、そして西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗ウサギIgG(Jackson Labs.)を、PBS/５％脱脂粉乳中の1:2000希釈で添加した。室温でさらなる２時間のインキュベーションの後、プレートを洗浄し、そしてTMB基質を添加した。反応を、1N硫酸で20分後に停止させた。光学密度を、参照波長として570nmを用いて450nmで決定した。両方のレプリカで、培地のみで培養した細胞からの平均ODよりも２倍大きなOD＋３標準偏差を示す画分を、陽性とみなした。配列決定のために、ポリペプチドを個々に、Biobrene^TM(Perkin Elmer/Applie d BioSystems Division,Foster City,CA)処理したガラスファイバーフィルター上で乾燥した。ポリペプチドを有するフィルターを、Perkin Elmer/Applied Bio Systems Division Procise 492 タンパク質配列決定機にロードした。ポリペプチドをアミノ末端から、従来のEdman化学を使用して配列決定した。アミノ酸配列を、適切なPTH誘導体標準に対するPTHアミノ酸誘導体の保持時間を比較することより、各ポリペプチドについて決定した。上記の手順を用いて、以下のＮ末端配列を有する抗原が単離された： (a) Asp-Pro-Val-Asp-Ala-Val-Ile-Asn-Thr-Thr-Xaa-Asn-Tyr-Gly-Gln-Val-V al-Ala-Ala-Leu(配列番号54)； (b) Ala-Val-Glu-Ser-Gly-Met-Leu-Ala-Leu-Gly-Thr-Pro-Ala-Pro-Ser(配列番号55)； (c) Ala-Ala-Met-Lys-Pro-Arg-Thr-Gly-Asp-Gly-Pro-Leu-Glu-Ala-Ala-Lys-G lu-Gly-Arg(配列番号56)； (d) Tyr-Tyr-Trp-Cys-Pro-Gly-Gln-Pro-Phe-Asp-Pro-Ala-Trp-Gly-Pro(配列番号57)； (e) Asp-Ile-Gly-Ser-Glu-Ser-Thr-Glu-Asp-Gln-Gln-Xaa-Ala-Val(配列番号5 8)； (f) Ala-Glu-Glu-Ser-Ile-Ser-Thr-Xaa-Glu-Xaa-Ile-Val-Pro(配列番号59)； (g) Asp-Pro-Glu-Pro-Ala-Pro-Pro-Val-Pro-Thr-Ala-Ala-Ala-Ala-Pro-Pro-A la(配列番号60)；および (h) Ala-Pro-Lys-Thr-Tyr-Xaa-Glu-Glu-Leu-Lys-Gly-Thr-Asp-Thr-Gly(配列番号61)；ここでXaaは任意のアミノ酸であり得る。さらなる抗原を、上記の手順に加えて、微細孔HPLC精製工程を用いて単離した。詳細には、上記のクロマトグラフィーの精製工程による抗原の混合物を含む20 μlの画分を、Perkin Elmer/Applied Biosystems Division Model 172 HPLCにおいて、７ミクロンの孔サイズ、カラムサイズ１mm×100mmを有するAquapore C18 カラム（Perkin Elmer/Applied Biosystems Division，Foster City，CA）上で精製した。画分を、水（0.05％ TFA）中のアセトニトリル（0.05％ TFAを含む）の１％／分の直線勾配を用いて、80μl／分の流速でカラムから溶出した。溶出液を250nmでモニターした。元の画分を、４つの主要なピークと他の小さな成分とに分離し、そして12.054Kdの分子量（質量スペクトル測定による）および以下のＮ末端配列を有することが示されたポリペプチドを得た： (i)Asp-Pro-Ala-Ser-Ala-Pro-Asp-Val-Pro-Thr-Ala-Ala-Gln-Gln-Thr-Ser-Leu -Leu-Asn-Asn-Leu-Ala-Asp-Pro-Asp-Val-Ser-Phe- Ala-Asp（配列番号62）このポリペプチドは、上記のアッセイを用いるPBMC調製物において増殖およびIF N-γ産生の誘発を示した。さらなる可溶性抗原を、M.tuberculosis培養濾過物から以下のように単離した。M.tuberculosis培養濾過物を上記のように調製した。Bis-Trisプロパン緩衝液（pH5.5）に対する透析後、Bis-Trisプロパン緩衝液（pH5.5）で平衡化したPoro s QEカラム4.6×100mm（Perseptive Biosystems）での陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて分画を行った。ポリペプチドを、10ml／分の流速で、先の緩衝液系中での０〜1.5MのNaCl直線勾配を用いて溶出した。カラム溶出液を214nmの波長でモニターした。イオン交換カラムから溶出した画分をプールし、そしてPoros R2カラム4.6×1 00mm（Perseptive Biosystems）を用いる逆相クロマトグラフィーに供した。ポリペプチドを、５ml／分の流速で、０〜100％のアセトニトリル（0.1％ TFA）の直線勾配を用いて、カラムから溶出した。溶出液を214nmでモニターした。溶出したポリペプチドを含む画分を凍結乾燥し、そして80μlの水性の0.1％の TFAに再懸濁し、そしてさらに２ml／分の流速で、０〜100％のアセトニトリル（ 0.1％のTFA）の直線勾配を用いて、Vydac C4カラム4.6×150mm（Western Analyt ical，Temecula，CA）での逆相クロマトグラフィーに供した。溶出液を214nmでモニターした。生物学的活性を有する画分を、１つの主要なピークと他の小さな成分に分離した。PVDF膜上でのこのピークのウェスタンブロットは、分子量14Kd、20Kd、および26Kdの３つの主要なバンドを明らかにした。これらのポリペプチドが、それぞれ以下のＮ末端配列を有することを決定した： (j)Xaa-Asp-Ser-Glu-Lys-Ser-Ala-Thr-Ile-Lys-Val-Thr-Asp-Ala-Ser;（配列番号129） (k)Ala-Gly-Asp-Thr-Xaa-Ile-Tyr-Ile-Val-Gly-Asn-Leu-Thr-Ala-Asp;（配列番号130）、および (l)Ala-Pro-Glu-Ser-Gly-Ala-Gly-Leu-Gly-Gly-Thr-Val-Gln-Ala-Gly;（配列番号131）、ここでXaaは任意のアミノ酸であり得る。上記のアッセイを用いて、これらのポリペプチドがPBMC調製物において増殖およびIFN-γ産生を誘発することを示した。図1AおよびＢは、それぞれ、最初の、および２番目のドナー由来のPBMC調製物を用いるこのようなアッセイの結果を示す。上記の(a)、(c)、(d)、および(g)と称される抗原をコードするDNA配列を、Ｎ末端配列に対応し、そしてM．tuberculosisコドン偏向を含む³²P末端標識された変性オリゴヌクレオチドを用いて、M．tuberculosisゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって得た。配列番号96で提供される配列を有するクローンを先に同定した抗原(a)に対応するプローブを用いてスクリーニングを行った。配列番号96によりコードされるポリペプチドは配列番号97に提供される。配列番号52で提供される配列を有するクローンを先に同定した抗原(g)に対応するプローブを用いてスクリーニングを行った。配列番号52によりコードされるポリペプチドは配列番号53に提供される。配列番号24に提供される配列を有するクローンを先に同定した抗原(d)に対応するプローブを用いてスクリーニングを行い、そして配列番号25に提供される配列を有するクローンを先に同定した抗原(c)に対応するプローブを用いてスクリーニングを行った。先のアミノ酸配列を、DNA STARシステムを用いて遺伝子バンク中の公知のアミノ酸配列と比較した。検索したデータベースは約173,000タンパク質を含み、そしてこれは、翻訳されたタンパク質配列とSwiss，PIRデータベースの組み合わせである（Version 87）。抗原(a)〜(h)および(l)についてのアミノ酸配列との有意な相同性がないことを検出した。抗原(i)のアミノ酸配列は、M．leprae由来の配列に相同であることを見出した。全長のM．leprae配列を、GENBANKから得られた配列を用いてゲノムDNAから増幅した。次いで、この配列を用いてM．tuberculosisライブラリーをスクリーニングし、そしてM．tuberculosisホモログの全長のコピーを得た（配列番号94）。抗原(j)のアミノ酸配列は、DNA配列から翻訳された既知のM．tuberculosisタンパク質に対して相同であることを見出した。本発明者らの知識の限りでは、このタンパク質がＴ細胞刺激活性を有することは、これまでに示されていなかった。抗原(k)のアミノ酸配列が、M．leprae由来の配列に関連することを見出した。上記の、３つのPPD陽性ドナーを用いる、増殖およびIFN-γアッセイにおいて、先に提供された代表的な抗原についての結果を表１に示す：表１において、２から４の間の刺激指標（SI）（培地のみで培養した細胞と比較した）を与える応答を、＋で評点をつけ、１μg以下の濃度で４〜８または２〜４のSIを＋＋で評点をつけ、そして８より大きいSIを＋＋＋で評点をつけた。配列(i)の抗原は、増殖およびIFN-γアッセイの両方において、１つのドナーについては高いSI（＋＋＋）、および２つの他のドナーについては低いSI（＋＋および＋）を有することを見出した。これらの結果は、これらの抗原が増殖および／またはインターフェロン-γ産生を誘発し得ることを示す。実施例２ M．tuberculosis抗原の単離のための患者の血清の使用この実施例は、M．tuberculosis感染個体由来の血清を用いてスクリーニングすることにより、M．tuberculosis溶解物から抗原を単離することを説明する。乾燥させたM．tuberculosis H37Ra（Difco Laboratories）を２％ NP40溶液に添加し、そしてあるいは、３回ホモジネートおよび超音波処理した。得られた懸濁物を微量遠心チューブで13,000rpmで遠心分離し、そして上清を0.2ミクロンのシリンジフィルターに通した。濾液をMacro Prep DEAEビーズ（BioRad，Hercule s，CA）に結合させた。ビーズを20mMのTris（pH7.5）で大規模に洗浄し、そして結合したタンパク質を１MのNaClを用いて溶出した。NaCl溶出液を10mMのTris（p H7.5）に対して一晩透析した。透析した溶液を、DNaseおよびRNaseを用いて、0. 05mg/mlで30分間室温で処理し、ついでα-D-マンノシダーゼ 0.5U／mgを用いてp H4.5で３〜４時間室温で処理した。pH7.5に戻した後、材料をFPLCで、Bio Scale -Q-20カラム（BioRad）を通して分画した。画分を９つのプールと組み合わせ、C entriprep 10（Amicon，Beverley，MA）で濃縮し、そして本発明の他の抗原と免疫反応性でないM．tuberculosis感染患者由来の血清プールを用いて、血清学的活性についてウェスタンブロットによりスクリーニングした。ほとんどの反応性画分をSDS-PAGEで泳動し、そしてPVDFに転移させた。以下の配列を生じる約85Kdのバンドを切り出した： (m)Xaa-Tyr-Ile-Ala-Tyr-Xaa-Thr-Thr-Ala-Gly-Ile-Val-Pro-Gly-Lys-Ile-Asn -Val-His-Leu-Val;（配列番号132）、ここで、Xaaは任意のアミノ酸であり得る。上記のようなこの配列と遺伝子バンクの配列との比較は、既知の配列に対して有意な相同性がないことを明らかにした。実施例３ M ．tuberculosis抗原をコードするDNA配列の調製この実施例は、M．tuberculosisで感染させた患者から得た血清、またはM．tu berculosis抗原に対して惹起した抗血清を用いてM．tuberculosis発現ライブラリーをスクリーニングすることによる、M．tuberculosis抗原をコードするDNA配列の調製を説明する。Ａ．ウサギ抗血清を用いるM．tuberculosis可溶性抗原の調製ゲノムDNAをM．tuberculosis株H37Raから単離した。DNAをランダムに分け、そしてLambda ZAP発現系（Stratagene，La Jolla，CA）を用いて発現ライブラリーを構築した。ウサギ抗血清を、M．tuberculosis培養物の濃縮した上清でウサギを免疫することにより、M．tuberculosis株H37Ra、H37Rv、およびErdmanの分泌タンパク質に対して生成させた。詳細には、最初にウサギを、100μgのムラミルジペプチド（Calbiochem，La Jolla，CA）および１mlの不完全フロイントアジュバントを含む２mlの全容量中の200μgのタンパク質抗原で皮下免疫した。４週間後、ウサギを不完全フロイントアジュバント中の100μgの抗原で皮下的に追加免疫した。最後に、ウサギを、４週間後に50μgのタンパク質抗原で静脈内免疫した。抗血清を用いて、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual， Cold Spring Harbor Laboratories，Cold Spring Harbor，NY，1989に記載のように発現ライブラリーをスクリーニングした。免疫反応性抗原を発現するバクテリオファージプラークを精製した。プラーク由来のファージミドをレスキューし、そしてM．tuberculosisクローンのヌクレオチド配列を推定した。 32個のクローンを精製した。これらのうち25個がM．tuberculosisにおいて以前に同定されていない配列を示した。Skeikyら、J．Exp．Med．181: 1527-1537 ，1995に記載のように、タンパク質をIPTGにより誘導し、そしてゲル溶出により精製した。このスクリーニングで同定されたDNA分子の代表的な部分的配列を配列番号１〜25に提供する。対応する推定アミノ酸配列を、配列番号64〜88に示す。上記のデータベースを用いる遺伝子バンク中の既知の配列とこれらの配列との比較において、TbRA2A、TbRA16、TbRA18、およびTbRA29（配列番号77、69、71、 76）として本明細書中以下で参照されるクローンが、Mycobacterium lepraeの既に同定された配列に対していくらかの相同性を示したが、M．tuberculosisにおいては示さなかったことを見出した。TbRA11、TbRA26、TbRA28、およびTbDPEP（配列番号66、74、75、53）は、M．tuberculosisにおいて以前に同定された配列であった。TbRA1、TbRA3、TbRA4、TbRA9、TbRA10、TbRA13、TbRA17、TbRA19、Tb RA29、TbRA32、TbRA36、ならびにオーバーラップするクローンTbRA35およびTbRA 12（それぞれ、配列番号64、78、82、83、65、68、76、72、76、79、81、80、67 ）に対して有意な相同性がないことを見出した。クローンTbRa24はクローンTbRa 29とオーバーラップしている。Ｂ．M.tuberculosis 抗原をコードするDNA配列を同定するための患者血清の使用上記のゲノムDNAライブラリー、およびさらなるH37Rvライブラリーを、進行性の結核の患者から得た血清プールを用いてスクリーニングした。H37Rvライブラリーを調製するために、M.tuberculosis H37Rv株のゲノムDNAを単離し、部分的なSau3A消化にかけ、そしてこれを用いて、ラムダZap発現系（Stratagene，La J olla，Ca）を用いて発現ライブラリーを構築した。３つの異なる血清プール（それぞれ、進行性の肺疾患または胸膜疾患の３個体から得た血清を含有する）を、発現スクリーニングにおいて用いた。プールをTbL、TbM、およびTbHと称し、ELI SAおよび免疫ブロットフォーマットの両方におけるH37Ra溶解物との相対的反応性（すなわち、TbL＝低反応性、TbM＝中反応性、およびTbH＝高反応性）に注目した。７人の進行性肺結核の患者由来の第４の血清プールもまた用いた。どの血清にも、組換え38kD M.tuberculosis H37Raリン酸結合タンパク質との増大した反応性はなかった。全プールをE.coli溶解物に予め吸着させ、そしてこれを用いて、Sambrookら、 Molecular Cloning: A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratories ，Cold Spring Harbor，NY，1989に記載のようにH37Raおよび有37Rv発現ライブラリーをスクリーニングした。免疫反応性抗原を発現するバクテリオファージプラークを精製した。プラーク由来のファージミドをレスキューし、そしてM.tube rculosisクローンのヌクレオチド配列を推定した。 32個のクローンを精製した。これらのうち31個が、ヒトM.tuberculosisにおいて以前に同定されていない配列を示した。同定したDNA分子の代表的な配列を、配列番号26〜51および100に提供する。これらのうち、TbH-8およびTbH-8-2（配列番号100）が、同一のクローン由来の連続していないDNA配列であり、そしてTb H-4（配列番号43）およびTbH-4-FWD（配列番号44）が、同一のクローン由来の連続していない配列である。本明細書中以降でTb38-1、TbH-4、TbH-8、TbH-9、およびTbH-12と同定した抗原のアミノ酸配列を配列番号89〜93に示す。先に特定したデータベースを用いた、これらの配列と遺伝子バンクにおける既知の配列との比較は、TbH-4、TbH-8、TbH-9、およびTbM-3に対して有意な相同性がないことを明らかにした。一方、弱い相同性をTbH-9に対して見出した。TbH-12が、M.parat uberculosis（受託番号第S28515号）において以前に同定された34kD抗原性タンパク質に対して相同であることを見出した。Tb38-1が、M.bovis（受託番号第U34 848号）およびM.tuberculosis（Sorensenら、Infec．Immun．63:1710-1717，199 5）において以前に同定された抗原ESAT-6のオープンリーディングフレームの34 塩基対上流に位置することを見出した。 Tb38-1およびTbH-9（ともにH37Raライブラリーから単離された）由来のプローブを用いて、H37Rvライブラリーにおいてクローンを同定した。Tb38-1は、Tb38- 1-1F2、Tb38-1F3、Tb38-1F5およびTb38-1F6（配列番号107、108、111、113、および114）にハイブリダイズした。（配列番号107および108は、クローンTb38-1F 2由来の連続していない配列である）。Tb38-1F2において、２つのオープンリーディングフレームを推定した；１つは、Tb37FL（配列番号109）に相当し、２番目の配列（部分配列）は、Tb38-1のホモログであり得、そしてTb38-1N（配列番号110）と呼ぶ。Tb38-1F3の推定アミノ酸配列を配列番号112に示す。TbH-9プローブは、H37Rvライブラリーにおいて３つのクローンを同定した：TbH-9-FL（配列番号101）、これは、TbH-9（R37Ra）のホモログであり得る、TbH-9-1（配列番号103）、およびTbH-9-4（配列番号105）、これらの全ては、TbH-9に対して高度に関連した配列である。これらの３つのクローンの推定アミノ酸配列を、配列番号102、104、および106に示す。実施例４ツベルクリン精製タンパク質誘導体由来のポリペプチドの精製および特徴付け M.tuberculosisポリペプチドを、ツベルクリン精製タンパク質誘導体(PPD)から以下のように単離した。 PPDを、いくらかの改変を加えて公開されたとおりに調製した（Seibert，F.ら、Tuberculin purified protein derivative．Preparation and analyses of a large quantity for standard．The American Review of Tuberculosis 44:9-25 ，1941）。M.tuberculosis Rv株をローラーボトル中で合成培地において37℃で６週間増殖させた。次いで、増殖させた細菌を含むボトルを、３時間、水蒸気中で100℃まで加熱した。培養物を0.22μフィルターを用いて滅菌濾過し、そして液相を3kDカットオフメンブレンを用いて20回濃縮した。タンパク質を、50％硫酸アンモニウム溶液で１回および25％硫酸アンモニウム溶液で８回、沈澱させた。得られたタンパタ質（PPD）を、Biocad HPLCシステム（Perseptive Biosystem s， Framingham，MA）においてC18カラム（7.8×300mM；Waters，Milford，MA）を用いる逆相液体クロマトグラフィー（RP-HPLC）により分画した。画分を、０〜100 ％緩衝液（アセトニトリル中0.1％ TFA）からの直線勾配を用いてカラムから溶出した。流速は10ml／分であり、そして溶出液を214nmおよび280nmでモニターした。６つの画分を採集し、乾燥し、PBS中に懸濁し、そしてM.tuberculosis感染モルモットにおいて、遅延型過敏(DTH)反応の誘発について個々に試験した。１つの画分が、強いDTH反応を誘発することを見出し、そしてこれを、Perkin Elmer/ Applied Biosystems Division Model 172 HPLCの微細孔Vydac C18カラム（カタログ番号218TP5115）においてさらにRP-HPLCにより続けて分画した。画分を、80 μl／分の流速を有する５〜100％緩衝液（アセトニトリル中0.05％ TFA）からの直線勾配を用いて溶出した。溶出液を215nmでモニターした。８つの画分を採集し、そしてM.tuberculosis感染モルモットにおいてDTHの誘発について試験した。１つの画分が、約16mmの硬結の強いDTHを誘発することが見出された。他の画分は、検出可能なDTHを誘導しなかった。陽性画分をSDS-PAGEゲル電気泳動にかけ、そして約12kD分子量の単一のタンパク質バンドを含有することを見出した。このポリペプチド（本明細書中以降でDPPDと称する）を、上記のようにPerkin Elmer/Applied Biosystems Division Procise 492タンパク質配列決定装置を用いてアミノ末端から配列決定し、そしてこれは、配列番号124に示すＮ末端配列を有することを見出した。上記のような、この配列と遺伝子バンクにおける既知の配列との比較は、公知の相同性がないことを明らかにした。DPPDの４つの臭化シアンフラグメントを単離し、そしてこれは、配列番号125〜128に示す配列を有することを見出した。実施例５合成ポリペプチドの合成ポリペプチドを、HPTU（O-ベンゾトリアゾール-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）活性化と共にFMOC化学を用いて、Millipor e 9050ペプチド合成機で合成し得る。Gly-Cys-Gly配列をペプチドのアミノ末端に結合して、ペプチドの結合または標識化の方法を提供し得る。固体支持体からのペプチドの開裂を、以下の開裂混合物を用いて実施し得る：トリフルオロ酢酸：エタンジチオール：チオアニソール：水：フェノール（40：１：２：２：３）。２時間の開裂後、ペプチドを冷メチル-t-ブチル-エーテル中で沈殿させ得る。次いで、ペプチドペレットを、Ｃ18逆相HPLCによる精製の前に、0.1％トリフルオロ酢酸（TFA）を含有する水中に溶解し、そして凍結乾燥し得る。水（0.1％TF Aを含有する）中の０〜60％アセトニトリル（0.1％TFAを含有する）のグラジエントを用いて、ペプチドを溶出し得る。純画分の凍結乾燥後、ペプチドをエレクトロスプレー質量分析法を用いて、およびアミノ酸分析により特徴付け得る。この手順を用いて、TbM-1配列の１個半の反復を含むTbM-1ペプチドを合成した。TbM-1ペプチドは、配列GCGDRSGGNLDQIRLRRDRSGGNL（配列番号63）を有する。実施例６結核の血清診断のための代表的な抗原の使用本実施例は、いくつかの代表的な抗原の診断特性を説明する。図１および２は、代表的な抗原のM.tuberculosis感染個体および非感染個体由来の血清との反応性を、細菌溶解物および38kD抗原の反応性との比較として示す。アッセイを、炭酸被覆緩衝液（pH9.6）中に50μLに希釈した200ngの抗原でコートした96ウェルプレートにおいて行った。ウェルを、４℃で一晩（または37℃ で２時間）コートした。次いで、プレートの中身を取り除き、そしてウェルを20 0μLのPBS/１％BSAで２時間ブロックした。ブロック工程後、ウェルを、PBS/0.1 ％Tween 20^TMで５回洗浄した。次いで、PBS/0.1％Tween 20^TM/0.1％BSA中で1:10 0希釈した50μLの血清を各ウェルに添加し、そして室温で30分間インキュベートした。次いでプレートを、PBS/0.1％Tween 20^TMで５回再度洗浄した。次いで、酵素結合体（西洋ワサビペルオキシダーゼ−Protein A、Zymed、San Francisco、CA）をPBS/0.1％ Tween20^TM/0.1％ BSA中で1:10,000に希釈し、そして50μlのこの希釈された結合体を各ウェルに添加し、そして室温で30分間インキュベートした。インキュベーションの後、PBS/0.1％ Tween20^TMでウェルを５回洗浄した。100μlのテトラメチルベンジジンペルオキシダーゼ（TMB）基質（K irkegaard and Perry Laboratories、Galthersburg、MD）を添加し、希釈せず、そして約15分間インキュベートした。反応を、100μLの１Ｎ H₂SO₄を各ウエルに添加して止め、そしてプレートを450nmで読んだ。図２は、実施例３の方法Ａを用いて単離された２つの組換え抗原（TbRa3およびTbRa9）のM.tuberculosis陽性患者および陰性患者からの血清とのELISA反応性を示す。これらの抗原の反応性を、M.tuberculosis株H37Ra（Difco、Detroit、M I）から単離された細菌溶解物の反応性と比較した。両方の場合において、組換え抗原は、陽性血清と陰性血清を区別した。レシーバー-オペレーター曲線から得られたカットオフ値に基づいて、TbRa3は、87の陽性血清から56を検出し、そしてTbRa9は、165の陽性血清から111を検出した。図３は、実施例３の方法Ｂを用いて単離された代表的抗原のELISA反応性を例示する。組換え抗原TbH4、TbH12、Tb38-1およびペプチドTbM-1（実施例４に記載）の反応性を、AndersenおよびHansen、Infect．Immun．57:2481-2488，1989によって記載される38kD抗原の反応性と比較した。再び、試験されたポリペプチドの全てが陽性血清と陰性血清とを区別した。レシーバー-オペレーター曲線から得られたカットオフ値に基づいて、TbH4は、126の陽性血清から67を検出し、TbH 12は、125の陽性血清から50を検出し、38-1は、101の陽性血清から61を検出し、そしてTbM-1ペプチドは30の陽性血清から25を検出した。４つの抗原（TbRa3、TbRa9、TbH14およびTbH12）の、喀痰の抗酸性染色（Smit hwickおよびDavid、Tubercle 52:226，1971）において異なる反応性を有するM.t uberculosis感染患者の群に由来する血清との反応性もまた検査し、そしてM.tub erculosis溶解物および38kD抗原の反応性と比較した。結果を以下の表２に示す：レシーバー-オペレーター曲線から得られたカットオフ値に基づき、TbRa3は、 27の陽性血清から23を検出し、TbRa9は、27から22を検出し、TbH4は、27から18 を検出し、そしてTbH12は、27から15を検出した。組合せで用いられると、これら４つの抗原は27のうち27の理論的感受性を有し、これはこれらの抗原が、M.tu berculosis感染の血清学的検出において、互いに相補し合うはずであることを示す。さらに、組換え抗原のいくつかが、38kD抗原を用いては検出されなかった陽性の血清を検出し、これはこれらの抗原が38kD抗原に相補的であり得ることを示す。組換え抗原TbRa11の、38kD抗原について陰性と示されたM.tuberculosis患者由来の血清、ならびにPPD陽性および正常ドナー由来の血清との反応性を、ELISAにより上記のように決定した。結果を図４に示す。これは、TbRa11が、PPD陽性および正常ドナー由来の血清について陰性である一方で、38kD抗原について陰性であった血清を検出したことを示す。試験された13の38kDの陰性血清のうち、９つは、TbRa11について陽性であった。これは、この抗原が38kD抗原の陰性血清のサブグループと反応しているかもしれないことを示す。対照的に、TbRa11が反応性であった38kDの陽性血清の群においては、TbRa11の平均OD450が、38kD抗原のそれよりも低かった。このデータは、TbRa11活性の存在と38kD陽性の存在との間の逆数関係を示す。抗原TbRa2Aを、最初に50μlの1:100希釈の血清を室温で30分間用いて、その後 PBS Tween中で洗浄し、そして1:10,000希釈のビオチン化したProtein A（Zymed 、San Francisco、CA）とともに30分間インキュベートし、間接的ELISAにおいて試験した。洗浄の後、1:10,000希釈のストレプトアビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼ（Zymed）の50μlを添加し、そしてこの混合物を30分間インキュベートした。洗浄の後、アッセイをTMB基質で上記のように進行させた。TbRa2AのM.tub erculosis患者および正常ドナー由来の血清との反応性を表３に示す。TbRa2AのM .tuberculosis患者由来の血清との反応性の平均値は、0.444で標準偏差0.309であった。正常ドナー由来の血清との反応性の平均値は、0.109で標準偏差は0.029 であった。38kD陰性血清の試験（図５）はまた、TbRa2A抗原がこの分類の血清を検出し得ることを示した。組換え抗原（g）（配列番号60）のM.tuberculosis患者および正常ドナー由来の血清との反応性を、ELISAにより上記のように決定した。図６は、抗原（g）の４つのM.tuberculosis陽性血清（これらは全て、38kD抗原および４つのドナー血清と反応性である）での滴定の結果を示す。全ての４つの陽性血清は抗原（g）と反応性であった。上記から、本発明の特定の実施態様が、例示の目的で本明細書中に記載されているが、種々の改変が本発明の精神および範囲から逸脱することなく可能であることが理解される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ０７Ｋ 19/00 Ｃ０７Ｋ 19/00 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 15/00 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 21/08 21/08 Ｃ１２Ｑ 1/68 ＡＣ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/50 ＪＧ０１Ｎ 33/50 33/569 Ｆ 33/569 33/577 Ｂ 33/577 Ａ６１Ｋ 31/00 ６３１Ｃ // Ａ６１Ｋ 31/00 ６３１ 39/04 39/04 Ｃ１２Ｎ 15/00 (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:32） (31)優先権主張番号０８／６２０，２８０ (32)優先日 1996年３月22日 (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号０８／６５８，８００ (32)優先日 1996年６月５日 (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号０８／６８０，５７３ (32)優先日 1996年７月12日 (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者スキーキー，イェイサーエイ．ダブリュー. アメリカ合衆国ワシントン 98117，シアトル，25ティーエイチアベニューエヌ．ダブリュー．8327 (72)発明者ディロン，デイヴィンシー. アメリカ合衆国ワシントン 98053，レッドモンド，エヌ．イー．24ティーエイチストリート 21607 (72)発明者カンポス−ネト，アントニオアメリカ合衆国ワシントン 98110．ベインブリッジアイランド，エヌ．イー. ミッドシップコート 9308 (72)発明者ホートン，レイモンドアメリカ合衆国ワシントン 98021，ボーセル，242エヌディープレイスエス. イー．2636 (72)発明者ヴェドヴィック，トーマスエイチ. アメリカ合衆国ワシントン 98104，シアトル，スプリングストリート 1301 (72)発明者トワードズィック，ダニエルアール. アメリカ合衆国ワシントン 98110，ベインブリッジアイランド，サウスビーチドライブ 10195

Claims

【特許請求の範囲】１．可溶性M.tuberculosis抗原の抗原性部分、あるいは保存的置換および／または改変でのみ異なる該抗原の変異体を含有するポリペプチドであって、該抗原は、以下からなる群から選択されるＮ末端配列を有する、ポリペプチド：ここで、Ｘaaは任意のアミノ酸であり得る。２．M.tuberculosis抗原の免疫原性部分、あるいは保存的置換および／または改変でのみ異なる該抗原の変異体を含有するポリペプチドであって、該抗原は、以下からなる群から選択されるＮ末端配列を有する、ポリペプチド：ここで、Ｘaaは任意のアミノ酸であり得る。３．可溶性M.tuberculosis抗原の抗原性部分、あるいは保存的置換および／または改変でのみ異なる該抗原の変異体を含有するポリペプチドであって、該抗原は、配列番号１、２、４−１０、１３−２５、５２、９４および９６に記載の配列、該配列の相補体、および配列番号１、２、４−１０、１３−２５、５２、９４および９６に記載の配列またはその相補体に適度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA配列からなる群から選択されるDNA配列によりコードされるアミノ酸配列を含有する、ポリペプチド。４．M.tuberculosis抗原の抗原性部分、あるいは保存的置換および／または改変でのみ異なる該抗原の変異体を含有するポリペプチドであって、該抗原は、配列番号２６−５１に記載の配列、該配列の相補体、ならびに配列番号２６−５１に記載の配列またはその相補体に適度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA配列からなる群から選択されるDNA配列によりコードされるアミノ酸配列を含有する、ポリペプチド。５．請求項１から４のいずれか１つに記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有するDNA分子。６．請求項５に記載のDNA分子を含有する組換え発現ベクター。７．請求項６に記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。８．前記宿主細胞が、E.coli、酵母、および哺乳動物細胞からなる群から選択される、請求項７に記載の宿主細胞。９．生物学的サンプルにおけるM.tuberculosis感染を検出するための方法であって、以下の工程： (a)生物学的サンプルを請求項１から４のいずれか１つに記載の１つ以上のポリペプチドと接触させる工程；および (b)該サンプルにおいて少なくとも１つの該ポリペプチドに結合する抗体の存在を検出し、それにより該生物学的サンプルにおけるM.tuberculosis感染を検出する工程を包含する、方法。１０．生物学的サンプルにおけるM.tuberculosis感染を検出するための方法であって、以下の工程： (a)生物学的サンプルを、配列番号１２９および１３０で提供される配列からなる群から選択されるＮ末端配列を有するポリペプチドと接触させる工程；および (b)該サンプルにおいて少なくとも１つの該ポリペプチドに結合する抗体の存在を検出し、それにより該生物学的サンプルにおけるM.tuberculosis感染を検出する工程を包含する、方法。１１．生物学的サンプルにおけるM.tuberculosis感染を検出するための方法であって、以下の工程： (a)生物学的サンプルを、配列番号３、１１および１２、該配列の相補体、ならびに配列番号３、１１および１２に記載の配列にハイブリダイズするDNA配列からなる群から選択されるDNA配列によりコードされる１つ以上のポリペプチドと接触させる工程；および (b)該サンプルにおいて少なくとも１つの該ポリペプチドに結合する抗体の存在を検出し、それにより該生物学的サンプルにおけるM.tuberculosis感染を検出する工程を包含する、方法。１２．工程(a)が、前記生物学的サンプルを38kDのM.tuberculosis抗原と接触させる工程をさらに包含し、工程(b)が、該サンプルにおいて該38kD M.tuberculos is抗原に結合する抗体の存在を検出する工程をさらに包含する、請求項９から１１のいずれか１つに記載の方法。１３．前記ポリペプチドが、固体支持体に結合している、請求項９から１１のいずれか１つに記載の方法。１４．前記固体支持体が、ニトロセルロース、ラテックス、またはプラスチック材料を含む、請求項１３に記載の方法。１５．前記生物学的サンプルが、全血、血清、血漿、唾液、脳脊髄液および尿からなる群から選択される、請求項９から１１のいずれか１つに記載の方法。１６．前記生物学的サンプルが、全血または血清である、請求項１５に記載の方法。１７．生物学的サンプルにおけるM.tuberculosis感染を検出するための方法であって、以下の工程： (a)該サンプルを、ポリメラーゼ連鎖反応で第１のオリゴヌクレオチドプライマーおよび第２のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させる工程であって、該第１および該第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、請求項５に記載のDNA分子の少なくとも約１０個の連続するヌクレオチドを含有する、工程；および (b)該サンプルにおいて、該第１および第２のオリゴヌクレオチドプライマーの存在下で増幅するDNA配列を検出し、それによりM.tuberculosis感染を検出する工程を包含する、方法。１８．生物学的サンプルにおけるM.tuberculosis感染を検出するための方法であって、以下の工程： (a)該サンプルを、ポリメラーゼ連鎖反応で第１のオリゴヌクレオチドプライマーおよび第２のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させる工程であって、該第１および該第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号３、１１および１２からなる群から選択されるDNA配列の少なくとも約１０個の連続するヌクレオチドを含有する、工程；および (b)該サンプルにおいて、該第１および第２のオリゴヌクレオチドプライマーの存在下で増幅するDNA配列を検出し、それによりM.tuberculosis感染を検出する工程を包含する、方法。１９．前記生物学的サンプルが、全血、喀痰、血清、血漿、唾液、脳脊髄液および尿からなる群から選択される、請求項１７または1８に記載の方法。２０．生物学的サンプルにおけるM.tuberculosis感染を検出するための方法であって、以下の工程： (a)該サンプルを、請求項５に記載のDNA分子の少なくとも約１５個の連続するヌクレオチドを含有する１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブと接触させる工程；および (b)該サンプルにおいて、該オリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズするD NA配列を検出し、それによりM.tuberculosis感染を検出する工程を包含する、方法。２１．生物学的サンプルにおけるM.tuberculosis感染を検出するための方法であって、以下の工程： (a)該サンプルを、配列番号３、１１および１２からなる群から選択されるDNA配列の少なくとも約１５個の連続するヌクレオチドを含有する１つ以上のオリゴヌクレオチドプローブと接触させる工程；および (b)該サンプルにおいて、該オリゴヌクレオチドプローブにハイブリダイズするD NA配列を検出し、それによりM.tuberculosis感染を検出する工程を包含する、方法。２２．前記生物学的サンプルが、全血、喀痰、血清、血漿、唾液、脳脊髄液および尿からなる群から選択される、請求項２０または２１に記載の方法。２３．生物学的サンプルにおけるM.tuberculosis感染を検出するための方法であって、以下の工程： (a)該生物学的サンプルを、請求項１から４のいずれか１つに記載のポリペプチドに結合し得る結合因子と接触させる工程；および (b)該サンプルにおいて、該結合因子に結合するタンパク質またはポリペプチドを検出し、それにより該生物学的サンプルでのM.tuberculosis感染を検出する工程を包含する、方法。２４．生物学的サンプルにおけるM.tuberculosis感染を検出するための方法であって、以下の工程： (a)該生物学的サンプルを、配列番号１２９および１３０で提供される配列からなる群から選択されるＮ末端配列を有するポリペプチドに結合し得る結合因子と接触させる工程；および (b)該サンプルにおいて、該結合因子に結合するタンパク質またはポリペプチドを検出し、それにより該生物学的サンプルでのM.tuberculosis感染を検出する工程を包含する、方法。２５．生物学的サンプルにおけるM.tuberculosis感染を検出するための方法であって、以下の工程： (a)該生物学的サンプルを、配列番号３、１１および１２、該配列の相補体、ならびに配列番号３、１１および１２に記載の配列にハイブリダイズするDNA配列からなる群から選択されるDNA配列によりコードされるポリペプチドに結合し得る結合因子と接触させる工程；および (b)該サンプルにおいて、該結合因子に結合するタンパク質またはポリペプチドを検出し、それにより該生物学的サンプルでのM.tuberculosis感染を検出する工程を包含する、方法。２６．前記結合因子がモノクローナル抗体である、請求項２３から２５のいずれか１つに記載の方法。２７．前記結合因子がポリクローナル抗体である、請求項２３から２５のいずれか１つに記載の方法。２８．以下を含む診断キット： (a)請求項１〜４のいずれかに記載の１つ以上のポリペプチド；および (b)検出試薬。２９．以下を含む診断キット： (a)配列番号１２９および１３０で提供される配列からなる群から選択されるＮ末端配列を有する１つ以上のポリペプチド；および (b)検出試薬。３０．以下を含む診断キット： (a)配列番号３、１１および１２、該配列の相補体、ならびに配列番号３、１１および１２に記載の配列にハイブリダイズするDNA配列からなる群から選択されるDNA配列によりコードされる１つ以上のポリペプチド；および (b)検出試薬。３１．前記ポリペプチドが固体支持体に固定化されている、請求項２８から３０のいずれかに１つに記載のキット。３２．前記固体支持体が、ニトロセルロース、ラテックス、またはプラスチック材料を含む、請求項３１に記載のキット。３３．前記検出試薬が、結合因子に結合したレポーター基を含有する、請求項２８から３０のいずれかに１つに記載のキット。３４．前記結合因子が、抗イムノグロブリン、プロテインＧ、プロテインＡおよびレクチンからなる群から選択される、請求項３３に記載のキット。３５．前記レポーター基が、放射性同位体、蛍光性基、発光性基、酵素、ビオチンおよび色素粒子からなる群から選択される、請求項３３に記載のキット。３６．第１のポリメラーゼ連鎖反応プライマーおよび第２のポリメラーゼ連鎖反応プライマーを含有する診断キットであって、該第１および第２のプライマーのそれぞれは、請求項５に記載のDNA分子の少なくとも約１０個の連続するヌクレオチドを含む、キット。３７．第１のポリメラーゼ連鎖反応プライマーおよび第２のポリメラーゼ連鎖反応プライマーを含有する診断キットであって、該第１および第２のプライマーのそれぞれは、配列番号３、１１および１２からなる群から選択されるDNA配列の少なくとも約１０個の連続するヌクレオチドを含む、キット。３８．少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブを含有する診断キットであって、該オリゴヌクレオチドプローブは、請求項５に記載のDNA分子の少なくとも約１５個の連続するヌクレオチドを含有する、キット。３９．少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプローブを含有する診断キットであって、該オリゴヌクレオチドプローブは、配列番号３、１１および１２からなる群から選択されるDNA配列の少なくとも約１５個の連続するヌクレオチドを含有する、キット。４０．請求項１〜４のいずれかに記載のポリペプチドに結合するモノクローナル抗体。４１．請求項１〜４のいずれかに記載のポリペプチドに結合するポリクローナル抗体。４２．請求項１〜４のいずれか１つに記載の２つ以上のポリペプチドを含む融合タンパク質。４３．請求項１〜４のいずれか１つに記載の１つ以上のポリペプチド、およびES AT-6（配列番号９９）を含む融合タンパク質。４４．配列番号１２９および１３０で提供される配列の群から選択されるＮ末端配列を有するポリペプチドを含む融合タンパク質。