PT1517913E - Sequência codificante de mycobacterium turberculosis para expressão de proteínas heterólogas. - Google Patents

Description

SEQORHCXA CODIFICASTE DE MYCÕBAC EXPRESSÃO DE PROTEXHA3

;AMPC

lECNICC A pres ente invenção refere s •e, de um modo gerai sequências de ácidos nucleicos e de aminoácidos de polipéptido de fusão compreend endo um polipéptido Mycohãcteriui 7! tubercuiosis, e um polipéptido heterólogo cí um cie de interesse, setores de expressão e células ho spedeiras compreendendo esses ácidos nucleicos, e métodos para produzir esses poiipépt idos c ie fusão, , Em partici jlar, a invenção refere-se a materiais e métodos de utiliz ação de ssa sequência de M, tubercuiosis como um parceiro d< ? fusão para facilitar a expressão está1 vel e de P r o d u c a o elevada de poiipéptidos heterólogos ret ::ombinantes tanto de origem eueariótica como procariótica.

ANTECEDENTES DA INYENCAO 0 advento da te; enologia do ADN rv scombinante conduziu à clonagem molecular de um grande r iúmero de sequências codificantes ou genes de diver; SOS tipos de células „ De modo a estudar a função des' tes genes ou para produzir os produtos codificados por estas sequência .s, estes genes são inseridos em 1 vectores de expressão sob o controlo de sequências de regulação apropriadas. Esta transferência do vector de expressão para uma célula hospedeira eucariótica ou procariótica resulta geralmente na expressão do produto codificado que pode ser, subsequentemente, purificado. A produção em larga escala de muitos produtos génicos é particularmente importante nos casos em que esses produtos têm valor médico ou industrial.

Todavia, não obstante os avanços na expressão genica, certas sequências codificantes não produzem rapidamente os seus produtos de forma estável. Por exemplo, a expressão em. E, coli de proteínas recombinantes pode ser problemática, particularmente para proteínas com domínios transraembranares ou sequências hidrofóbicas extensas. Além disso, as proteínas recombinantes podem nâo conter os resíduos de aminoácidos N-terminais com os enviusam.enf.os de codoes apropriados. Assim, permanece uma necessidade para materiais e métodos melhorados para a expressão de proteínas recombinantes.

Os documentos WO99/42076 e W099/51718 revelam o antigénio Ral2 de M. tuberculosis e as proteínas de fusão que o contêm.

SUMÁRIO DA. INVENÇÃO A presente invenção proporciona, pela primeira vez, métodos de utilização de moléculas de ácido nucleico recombinante que codificam polipéptidos de fusão compreendendo um. polipéptído Ral2 e um polipéptído heterólogo, polipéptidos de fusão, vectores de expressão e células hospedeiras compreendendo as moléculas de ácido nucleico para produzir a expressão estável e de rendimento elevado de polipéptidos de fusão de interesse. 2

Num aspecto, a presente invenção proporciona um método para a expressão estável e rendimento elevado de um polinucleótido heterólogo recombinante, o método compreendendo a expressão, numa célula hospedeira, de uma molécula de ácido nucleíco recombinante que codifica um polipéptido cie fusão, compreendendo o polipéptido de fusão um polipéptido Rai2 e um polipéptido heterólogo, em que o polipéptido Ral2 é codificado por uma sequência do polinucleótido Rai2 que híbrida com uma sequência complementar a SEQ ID N°:3 em condições de restringência e em que a sequência do polinucleótido Ral2 está localizada a 5' da sequência do polinucleótido heterólogo que codifica o polipéptido heterólogo. Noutra forma de realização, as moléculas de ácido nucleíco recombinante compreendem ainda uma sequência polinucleotídica que codifica um péptido ligando entre a sequência de polinucleótido F.al2 e a sequência de polinucleótido heteróloga, em que o péptido ligando pode compreender um sítio de clivagem. Ainda noutra forma de realização, as moléculas de ácido nucleíco recombinante codificam um polipéptido de fusão compreendendo ainda uma marcação de afinidade. Ainda noutra forma de realização, as moléculas de ácido nucleíco reccmbinantes codificam um péptido de fusão compreendendo um DPPD, um WT1, uma mamaglobina, ou um polipéptido heterólogo H9-32A, Ainda noutra forma de realização, as moléculas de ácido nucleíco recombinante compreendem uma sequência de polinucleótido Ral2 compreendendo, peio menos, cerca de 30 nucleótidos, peio menos, cerca de 60 nucleótidos ou, pelo menos, cerca de 100 nucleótidos. Ainda noutra forma de realização, as moléculas de ácido nucleíco recombinante compreendem uma sequência de polinucleótido Ral2 como apresentada na SEQ ID N°:3. Ainda noutra forma de realização, as moléculas de ácido nucleíco recombinante compreendem uma sequência de 3

polinucleótido apresentado na Ra 12 q ue codif 3EQ ID í 4, SEQ polinucleótido 17 OU SEQ ID N°:

Ra 12 como

Numa forma de realização preferida, a célula hospedeira é F; t CO 7 I O

Numa forma de realização, pelo menos, cerca de .1. w aminoác: amino ácidos ou, pelo menos, cerc forma de r ealização, o p olipépt: como apres Antada na SEQ ID 1 SEQ I D N°: 18. Numa forma de real .izacão, purí f ícar | xriipéptidoi 5 de T. U S â 0 forma cie TÉr m 7 p p ϊ p\ r', método políp éptido de fusão t intre um pol heteróioao. pcf I i.pé ptl do Ra 12 compreer ide, dos, pe d.o me: nos, cerca de a d í\ r, cUTL inoáo: idos, Noi itra do Ra 11 p 0 s s u i UI na sequêr 1C .13. 0 0 r, SI 'jO ID I \[°: 17, ou o método compre ende ainda após a sua expres: são. Noutra compreende ainda crivar um ipéptido Ra 12 e um polipéptido invenção tornar-se-ão detalhada e desenhos

Estes e outros aspectos da presente óbvios era relação à seguinte descrição anexos,

DE SC

''A.0 DC

DESENHOS A Figura N°:I) e ΜΪΒ32Ά. 1 ilustra uma uma secruência sequência de nucleótidos (SEQ de aminoácidos (SEQ ID N°:2) de A Figura 2 K°:3) e uma ilustra uma sequência de nucleótidos (SEQ ID sequência de aminoácidos (SEQ ID N° :4) de Ral2. 4 A Figura 3 ilustra uma sequência de recom' binante compre* sndendo uma s equência (SEQ ID N0:5} e uma sequência de « iminoáci do do oolioéotido de fusão R.al2:-DPPD, ácido nucleíco de nucleótidos 5 íseo ID N° : 6) A Figura k recombrnante ilustra uma compreendendo sequência de uma sequêncic ácido nucleíco de nucleótidos (SEQ ID N0:/) e uma sequência de aminoáeidos do oolioéotido de fusão Ral2-WT1„ A Figura 5 ilustra uma sequência de ácido nucleíco recorabinante compreendendo uma sequência de nucleótidos (SEQ ID K°:9) e uma sequência de aminoácidos (SEQ ID N°:10) do poiipéptido de fusão Ral2-mamaglobina. A Figura 6 ilustra uma sequência de ácido nucleíco recombinante compreendendo uma sequência de nucleótidos (SEQ ID N°:1I) e uma sequência de aminoácidos (SEQ ID N°:12) do poiipéptido de fusão Ral.2-H9-.32A.,

Figur . 3. / íl .ust ra .•Λ po 1ipêptido Ra 12 (curto) (SEQ ID 0 :17) , que j pos 3 UÍ os ara: i.no ácidos 1-3 :0 de S EQ ID K°: S Figur :a 8 íl .ust ra •-Λ po 1ipêptido Ra 12 (longo) (SEQ ID 0 ti. 8 ) t que ] pos 8 U.Í os ara: i.no ácidos 1-1 28 de SEQ ID N° * â Eigur cl 9 íli ;str 3. T ama cc rnstrução de pol . inucleótd .do Ra 12 (curto) fundido com um gene da mamaalobina humana, 5 descrição detalhada da invenção

Como referido acima, a presente invenção proporciona, pela primeira vez, métodos para utilizar sequências de Ra 12 como ura parceiro de fusão, para facilitar a expressão estável e elevado rendimento de polipéptidos beterólogos recorabinantes, tanto de origem eucariótica como procariótioa, MTB32A é uma protease da serina de 32 RD de peso molecular codificada por um gene em estirpes virulentas e não virulentas de M. tuberculosis. A sequência de nucleótidos (SEQ II) Nc :1) e a sequência de aminoácidos (SEQ ID N°:2) completas de MTB32A são reveladas na Figura 1. Ver, também, Skeiky et ai., Infection and Imiun. (1999) 67:3998-4007. Esta proteína é segregada naturalmente para o sobrenadante das culturas bacterianas. A grelha de leitura aberta da sequência codificante contém sinais de secreção hidrofóbica N-terminais. Estimula as células moncnucleares do sangue periférico de dadores saudáveis positivos para derivado de proteína purificada (FDD), para proliferar e segregar interferão. Assim, MTB32A é um antigénio candidato para utilização no desenvolvimento de vacinas contra a tuberculose.

Surpreendentemente, foi descoberto pelos presentes requerentes que um fragmento C-terminal de 14 KD da sequência codificante de MTB32A se expressa a níveis elevados por si só e permanece como uma proteína solúvel ao longo do processo de purificação. Este fragmento C-terminal de 14 KD de MTB32A ê aqui referido como Ral2 (possuindo os resíduos de aminoácidos 192 a 323 de MTB32A). As sequências de ácidos nucleicos e de aminoácidos de Ra.12 nativo são apresentadas, e. g,, nas Figuras 2-6. Como descrito em detalhe abaixo, o termo "polipéptido Ra!2" 6 ου "polínucleótido Ral.2" como aqui utilizado refere-se as sequências de Ra 12 nativo (e. g., SEQ II) K°:3 ou SEQ ID N° : 4) , suas variantes, ou seus fragmentos (e. g\, SEQ II) N°:17 ou SEQ II) N°: 18) , A presente invenção utiliza estas propriedades do polipéptidos Ra12 e proporciona moléculas de ácido nucieico recombinante, vectores de expressão, células hospedeiras, e métodos para expressão estável e de rendimento elevado de polipéptidos de fusão compreendendo um polipéptido Ral2 e um polipéptido heterólogo de interesse. Os métodos da presente invenção são particularmente úteis na expressão de certos polipéptidos neteróiogos (e. g., DPPD) que outros métodos de expressão convencionais não conseguem, expressar numa quantidade substancial. Ácidos nucleicos de Fusão Recombinantes Ácidos nucleicos recombinantes, que codificam um polipéptido de fusão compreendendo um polipéptido Ra12 e um polipéptido heterólogo de interesse, podem ser rapidamente construídos através de técnicas de engenharia genética convencionais. Os ácidos nucleicos recombinantes são construídos de modo a que a sequência de pol inucieótido Ra .12 esteja localizada a 5' em relação a uma sequência de polinucleótidos heteról.oaa seleccionada .

Na presente invenção, qualquer polínucleótido heterólogo adequado de interesse pode ser seleccionado como um parceiro de fusão para ácidos nucleicos de Eal2 para produzir um polipéptido de fusão. Uma "sequência heteróloga" ou um "ácido nucieico heterólogo", como aqui utilizado, é um. que tem origem, numa fonte estranha para a célula hospedeira particular, ou, se for da 7 mesma fonte, é modificado da sna forma originai. Assim, um ácido nucleico beterólogo numa célula hospedeira procariótica inclui um ácido nucleico beterólogo que é endógeno para a célula hospedeira particular que foi modificada. A modificação da sequência heteróloga pede ocorrer, e, g,„ através do tratamento do ADN com uma enzima de restrição, para criar um fragmento de ADN que é capaz de ser ligado operacionalmente ao promotor. Técnicas, tais como mutagénese dirigida também são úteis na modificação de uma sequência heteróloga.

Um ácido nucleico beterólogo tanto de origem eucariótica como procariótica pede ser seleccionado como um parceiro de fusão. Estes ácidos nucleicos incluem, mas não estão limitados a, ácidos nucleicos que codificam antigénios patogénicos, antigénios bacterianos, antigénios virais, antigénios de cancro, antigénios tumorais e supressores tumorais. Exemplos de ácidos nucleicos heterólogos de interesse incluem ácidos nucleicos de DPPD, WTl, mamaglobina, H9-32.A e outros ácidos nucleicos de Mycobacterium tuberculosis (ver, e. g., Cole et al, Nature (1999) 393:537-544; http: / /ww. sanger .ac.uk; e http://www.pasteur.fr/mycdb/ para as sequências do genoma completo de M, tuberculosis; ver, também. os documentos WO98/53075 e WO98/53076, ambos publicados em 26 de Novembro de 1998 para as sequências de ácido nucleico que codificam proteínas de M. tuberculosis). Qualquer um dos ácidos nucleicos aqui revelados pode ser utilizado isoladamente ou em combinação como uni ácido nucleico beterólogo que pode ser seleccionado como um parceiro de fusão.

Adic.ionaim.ente, qualquer polinucleótido de P.al2 adequado (e, g.f polinucleótido Rai2 nativo possuindo SEQ ID K°:3, variantes ou fragmentes deste) pode ser utilizado na construção 8 de ácidos nucleicos de fusão recorabinantes da presente invenção, Polínucleótidos de Ral2 preferidos compreendem, peio menos. cerca de 1 5 mj: ] c. :óti do: 3 consecutivo Λ O -·; pi 1 --Λ rp mos, cer ca ΟΘ 's. a O w nu cl e óticos, pe lo menos, q > erca de c f\ O\J nucleót I.dOS, pelo men os. cerca de 1 00 nu .olí aótido 3 f F elo meno S t cerca de 200 núcleo it idos, ou p< 3.1o m enos, C erca de 300 nucl .eótidos. 0 '3 DO 1 mude óti 0.03 podem ser H c.. \. j.e.ía sii Ttp les ou C 5. '· dela dup : -L. α ; e pode ;m ser moléc ulas c Ie ADI I ( genóml .GO ' / ADNc ou s í r itéti co) ou de ARN. Numa form.a c ie reali za i O 3.0 ,, 3 q jfn quênela de p ol inucl eót ido Ra 12 é como apr esentada em. SEQ i í: ) K°:3. Nout ra for ma de reali Z cl Ç â 0 ; a se quênci .a c ie polinucl .eotido Ra 12 codifi ca. um polipéptide ) Ral 9 ΟΟΓΡΟ ap ΓΘ sentado em. SEQ ID N0 :4 . Em a .Igu mas forma S de rea I -i ; í 3 Ç 3 O y 3. sequênc ia de po'. i η r\ 11 m leótido p a 12 compr eende uma porção d S r. ;Q ID N°: , 9 ou. COdlf ica uma por cão de SEQ T :d N°: 4 , Pc ,)r exemp Io, F um poliu uei leótido I la 12 compree nde ndo 90 nucleótidos (e. g., nucleótidos 1-S0 de SEQ ID N°:3), ou ura polinucleótido Rai2 compreendendo 334 nucleótidos (e, g., nucleótidos 1.-384 de SEQ ID K° :3) pode ser utilizado como um parceiro de fusão, Ver Exeraplos 2 e 3 abaixo.

Os polínucleótidos podem compreender uraa sequência nativa (i, e., uma sequência endógena que codifica um poiipéptido Ral2 SEQ ID N°:3, ou uma porção desta) ou pode compreender uma variante dessa sequência. As variantes do polinucleótido podem conter uma ou mais substituições, adições, del.eções e/ou inserções, de modo a que a acti.v idade biológica do poiipéptido de fusão codificado não seja diminuída em relação a um poiipéptido de fusão compreendenc l.o um polipéptic Io Ra 12 nativo,

As variantes, de um modo preferido, apresentara, pelo menos, cerca de 70% de identidade, de um modo mais preferido, pelo menos, cerca de 80% de identidade e de um modo muito preferido, 9 pelo menos, cerca de 90% de identidade com uma sequência polinucleotídica que codifica ura poiipéptido Ra12 nativo (SEQ ID N° :4) ou uma porção deste. Opcionaimente, a identidade existe ao longe de uma região que é pelo menos, cerca de 25 até cerca de 50 arainoácidos ou nucleótidos de comprimento ou, opcionalmente, ao longo de uma região que tem. 75-100 aminoácidos ou nucleótidos de comprimento.

Duas sequências de polinucleótido ou poiipéptido dizem-se "idênticas" se a sequência de nucleótidos ou aminoácidos nas duas sequências é a mesma quando alinhadas para o máximo de correspondência, como descrito abaixo. As comparações entre as duas sequências são tipicamente realizadas comparando as sequências numa janela de comparação para identificar e comparar regiões locais de semelhança de sequências. Uma "janela de comparação", como aqui utilizado, refere-se a um segmento de, pelo menos, cerca de 20 posições contíguas, normalmente 30 até cerca de 75, e. g. 40 até cerca de 50, no qual a sequência pode ser comparada com uma sequência de referência do mesmo número de posições contíguas após as duas sequências serem alinhadas para um óptimo de identidade. O alinhamento óptimo de sequências para comparação pode ser realizado utilizando o programa Megalign no conjunto de software bioinformático Lasergene (DNASTAR, Inc., Madison, WI), utilizando os parâmetros por defeito. Este programa realiza vários esquemas de alinhamento descritos nas referências seguintes: Dayhoff, M.O. (1978) A model of evolutionary change ín proteins ··· Matrices for detectiag distant relationships. Em Dayhoff, M.O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure^ National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Supl. 3, pp. 345-358; Hem J. (1990) Unified Approach to 10

Alignment and Pkylogenes pp. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Tnc„, San Dlego, CA; Higgins, D.G. e Sharp, P.M. (1989) CABIQS 5:151-153; Myers, E.W. e Muller W. (1988) CABIOS 8:11-17; Robinson, E.D. (1971) Comb. Theor 11:105; Santou, S. Nes, M. (1987) Mol. BígI. Evol. 8:406-425; Sneath, PALA. e Sokal, R.R. (1973) Nume ri cal Taxonomy - the Principies and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA; Wilbur, W.J. e Liprrian, D,J, (1983) Proc. Natl. Acad., Sei . USA 80:726-730.

Al.ternativam.ente, o alinhamento óptimo de sequências para comparação pode ser realizado através do algoritmo de identidade local de Smith e Waterman (1981) Ãdd. APL. Ma th 2:482, através do algoritmo de alinhamento de identidade de Needleman e Wunsch (1970) j. Mol. Bioi . 48:443, através dos métodos de pesquisa de semelhança de Pearson e Lipnian (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:2444, através de implementações computorizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, e TFASTA. no Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575

Science Dr., Madíson, WI), ou por inspecção.

Exemplos preferidos de algoritmos que são adequados para determinar a percentagem de identidade de sequência e semelhança de sequências . são os algoritmos BLAST e BLAST 2.0, que são descritos em Altschul et ai. (1977) Nucl. Acids Res . 2 5:3389 — 34 02 e Al.tsi cnul et ai. (1990) J Mol. Biol. 215:403-410, respectivamente, Podem ser utilizados BLAST e BLAST 2.0, por exemplo com os parâmetros aqui descritos, para determinar a percentagem da identidade da. sequência para os polínucleótidos e polipéptidos da invenção. O software para realizar as análises BLAST está disponível ao público através do National Center for Biotechnology Information: Para as sequências de aminoácidos, 11 pode ser utilizada urna matriz de classificação para calcular a classificação cumulativa. A extensão dc número de semelhanças encontradas em cada direcçao são interrompidas quando: o valor de alinhamento cumulativo cai fora pela quantidade X do seu valor máximo alcançado; o valor cumulativo vai para zero ou abaixo, devido à acumulação de um ou mais alinhamentos de resíduos com. classificações negativas; ou é atingido o fim de qualquer uma das sequências. Os parâmetros W, T e X do algoritmo BLAST determinam a sensibilidade e a velocidade do alinhamento.

Numa abordagem preferida, a "percentagem, de identidade de sequência'' ê determinada comparando duas sequências optimamente alinhadas ao longo de uma janela de comparação de pelo menos, 20 posições, em. que a porção da sequência de polipéptido na janela de comparação pode compreender adições ou deceções (í.. e., intervalos) de 20 porcento ou menos, normalmente 5 a 15 porcento, ou 10 a 12 porcento, ei m comparação com as s equêncías de referência (que não compreendem adições ou deleções) para alinhamento óptimo das duas sequências. A percentagem é calculada determinando o número de posições nas quais ocorre o resíduo de aminoácido idêntico em ambas as sequências para produzir o número de posições emparelhadas, dividindo o número de posições emparelhadas pelo número total de posições na. sequência de referência (i. e., o tamanho da janela) e multiplicando os resultados por 100 para produzir a percentagem de identidade de sequências.

As variantes também podem, ou alternat ivaraente, ser substancialmente homólogas a um polinucleótido Ral2 nativo (e. g., SEQ ID N°:3), ou uma porção ou complemento deste. Essas variantes de polinucleótido são capazes de hibridar em condições de restringência com uma sequência de ADN que ocorre 12 (ou uma naturalmente codificando ura polinucleótido Ral2 nativo sequência complementar). A frase "híbrida select ivaraente (ou especificaraente)com" refere-se à ligação, formação de duplexos, ou hibrldaçâo de uma molécula apenas cora uma sequência de nucleótidos particular era condições de hibrldaçâo de restringência quando essa sequência está presente numa mistura complexa (e. g,, ADN ou ARN celular total ou biblioteca). A frase ''condições de hibrldaçâo de restringência" refere-se a condições sob as quais uma sonda hibridará com a sua subsequência alvo, tipicamente numa mistura complexa de ácido nucleico, mas não com outras sequências. As condições restringentes são dependentes da sequência e serão diferentes em diferentes circunstâncias. Sequências ma is longas hibridam especificamente a temperaturas mais elevadas. Um guia extensivo para a hibrldaçâo de ácidos nucleicos encontra-se em Tijssen, Techniques in Bíochemístry and. Mol.ecul.az' Biology--Hybr.idi zaticn with Nucleic Probes, "OverView of pr2.ncíples of. Hybr.idiza.tion and the strategy of nucleic acid âssa.ys" (1993). Geralmente, as condições de restringência são seleccionadas para serem cerca de 5-10 °C mais baixas do que o ponto de fusão térmica (lá) para a sequência especifica a uma força fónica de pH definida. A Tm é a temperatura (sob força fónica definida, pH, e concentração nucleica) na qual. 50% das sondas complementares ao alvo hibridam com a sequência alvo no equilíbrio (como as sequências alvo estão presentes em excesso, a lá, 50% das sondas estão ocupadas no equilíbrio) . As condições de restringência serão aquelas em que a concentração de sal. é inferior a cerca de 1,0 M de ião sódio, tipicamente cerca de 0,01 a 1,0 M de concentração de ião sódio (ou outros sais) a pfí 7,0 até 8,3 e a temperatura é pelo 13 menos, cerca de 30°C para sondas curtas (e. cg., 10 até 50 nucleótidos) e pele menos, cerca de 60 °C para sendas longas (e, g., superior a 50 nucleótidos). As condições de restringência também podem, ser alcançadas com a adição de agentes desestabil.iza.nt.es,· tais como formamida, Para hibridação selectiva ou especifica, um sinal positivo é, pelo menos, duas vezes o fundo, de um modo preferido 10 vezes o fundo da híbr .i.O.clÇcÍO . Condições de Jnibr idaçâ· 0 c ie r estringência ex emplares pode m ser como se segue: t0% de for: ]TLcL]TL.1 rjq R - CQS p 1% SDS, incu bando a 42 °C, ou, tu < SSC --1 0 O i. :)3, incubando a 65 o o, com uma lavagem em 0,2x SSC, e ÍJ t % SDS cl 65 1 ' C „

Deve ser entendido pelos especialistas na técnica que, como resultado da degenerescência do código genético, existem muitas sequências de nucleótidos que codificara ura polipéptido P.ai2 como aqui descrito, Alguns destes polinucleótidos possuem hemoiogia mínima com a sequência de nucleótidos de qualquer gene nativo. No entanto, os polinucleótidos que variam devido as diferenças na utilização dos codões estão especificamente contemplados pela presente invenção. Além disso, os aleios dos genes que compreendem as sequências de polinucleótido aqui fornecidas estão dentro do âmbito da presente invenção. Os aleios são genes endógenos que são alterados como resultado de uma ou m.ais mutações, tais como deleções, adições e/eu substituições de nucleótidos. O ARNm e a proteína resultantes podem, mas não necessariamente, possuir uma estrutura o1 u função alterada. 0 3 aleios podem ser identificados utilizando técnicas convenciona 3 U.S (tais como hit um dação, ampli freação e/ου c o rnp a .a ação de sequências cora as bases de dados).

Assim, os termos tais como "poli nucleót ido Ral2" ou •sequência de polinucleótido", como aqui utilizados, referem-se 14 a sequências de polinucleótido Rai2 nativo (e. g., SEQ II) N°:3), fragmentos deste, ou quaisquer variantes deste. Funcionalmente, qualquer polir íucleótido Ra 12 possuí a capacidade p:3 r:3 p ] oodu zí r uma proteína de fusão, e a sua capa cidade para i. produz ir uma proteína de fi isão em células hospedei u t:as pode se. r auraent . 3 Gd. ou não carregada, em relação ao polinucle ótido Ra 12 nativo ! ;e. g- f q ip ç·- τη m o « q \ ou pode ser d.i .minu ida '·. sm menos de 50%, e de um modo preferido menos de 20%, era relaç ãc ao polin ucleótic l.o R a 1.2 nativo. Ácidos nucleícos que codificam pclipéptidos Ra .12 desta invenção podem ser preparados por qualquer método adequado conhecido na técnica. Métodos exemplares incluem clonagem e restrição de sequências apropriadas ou síntese química directa d q ravés de método 3 tais como o método de osfotrl .éster de h lar ano et a 1. í 19' 79) Meí th. . En zyríiol . 6 8:90-99. f 1 o método de fosfod.i .és ter de Brown e t ã.l . [1 .979) H/rt ί- . J C-· o- .u. , Enzymol . 68 :109-.15 O método da dí e t i1f o s fo ramidí Γ p de Be eu J>. '·_✓ d ' ·· ;:e et 3.1 (1981) T etra. 1. tet i- » ; 22 :185 9-18 6 , /' · c.\ ) V_. 0 método GO suporte > s 0. lido d a Patente ri • % N° 4 4 58 o 16 6. Numa forma. de : re ali za ção , um á c.í GO nu cie ico codi.fi .ca ndo MT B32A cu Ra 12 3 ISO) Lado atr :avés di n· mé todos de clonagc sm de ro C .1 I ί 3 » i-\ S sequênc .13 S de n .uci eótidos A le MT332A O: a Ral2, c orno aqui propoj rcionad as , sã o uti ra P roporci onar sonda 3 que hífca :id.am espe cificaraente com. outros ácidos nucleícos de MTB32A ou ] 2,a 12 r ruma araostra de ADN genóraico, ou c ora um ARNra de MTB32A ou ARNm de Ra12 numa amostra de ARK total (e, g., numa trar isferê .o. c -i. a de Soutber n ou de Northern) . Assim que os ácidos nuc.] .eícos alv o de MTB.32.Í ã. ou Ra 12 estejam identificados, podem ser isolados de acordo com. métodos convencionais conhecidos dos especialistas na técnica. 15

Os ácidos nucleicos desejados também podem ser dosados utilizando técnicas de amplificação bem conhecidas. Exemplos de protocolos suficientes para guiar pessoas especialistas através amplií :icaç ão ín vitrof incl: jindo B. r eacção da a de ia (pcr; a rea p r' .¾ o da liga se em CB .dera ÍLC R) , r repl .í cas e OS e 0’ atras téc; si cas me dl .adas ρ ela \RN encontr am-se í ;m Berge ν' Cl f ^ ambrook, ; Ausubel, tu 111. s et , ai. (19 87) Patente Li . S . 1 1° /] 683 2 02; . Guide to Methods 5a Applicã. tions (I nr ris et al. ress I: ic. San Diec JO, CA 1 1990) (Innu S ) ; Arnhei m. & Outubr o de 1990) C (y.. EN 36 4 7; The J ou. ΓΓ iãl Cf N1H 3:S1- 94; (Kwoh ... td L a 1 n i (1989 ) Froc .. 7\T .Lv: atl, Ac -^,a 90; Proc. Natl. A.cad, PCR Protocol bei. ubA ó o : j. .1. ' / bua. te .mm. et a -i. , \í..j

Barringer

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Os ácidos nucleicos de MTB32A ou Ral2 também podem ser cl o nad.G s de tectando /-· seu ba s eao.G s nas proprie -da. de s pr oteí na. er :pressa. Po T p 7 nu cleico de MTB32.A c ;u Ra 17 po lipépt ido codifica: do pele C· ros ou anticor po s po lipépt ido: s MTB32.A ou roduto expresso através de ensaios sicas, químicas, ou iraunológicas da pio, pode identificar-se um ácido rlonado através da capacidade de um .eido nucleico para se ligar a anti-:ificados produzidos contra os L2s aqui fornecidos, que também homólogos de MTB32A cu reconhece e se liga selectivamente aos Ra 12,

Em certas formas de realização, pode ser desejável modificar os ácidos nucleicos de MTB32A ou Ra .12 da invenção, Sequências de nucleótidos alteradas que podem ser utilizadas de acordo com a invenção incluem defeções, adições ou substituições de diferentes resíduos de nucleótidos resultando numa sequência que codifica o mesmo produto génico ou um funcionalraente equivalente. 0 próprio produto génico pode conter deleções, adições ou substituições de resíduos de aminoácidos, que resultam numa alteração silenciosa, produzindo assim um epítopo antigénico funcionalmente equivalente. Essas substituições de aminoácidos conservativas podem ser realizadas com base na semelhança em polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade, hidrofilicidade, e/ou a natureza antipática dos resíduos envolvidos. De um modo preferido, podem ser utilizados os ácidos nucleicos de Ral2 que são mais curtos em comprimento do que SEQ ID Nc:3 que codificam o parceiro de fusão biologicamente activo. Esses equivalentes funcionais mais pequenos de polipéptidos Ral2 podem ser desejáveis para aumentar a quantidade de recursos de célula hospedeira que estão disponíveis para a produção de polipéptidos heterólogo de interesse.

Um especialista reconhecerá muitas maneiras de criar alterações numa dada construção de ácido nucleico. Esses métodos bem conhecidos incluem mutagénese dirigida, amplificação por PCR utilizando oligonucleótidcs degenerados, exposição de células contendo o ácido nucleico a agentes mutagênicos ou radiação, síntese química de um oligonuol.eótide desejado (e. g.f em conjunção com ligação e/ou clonagem para criar ácidos nucleicos grandes) e outras técnicas bera conhecidas. Ver, e. g., Giliman e 17

Smith (19/9) Ge n e 8:81- 9 /, Roberts e t. ãl 328:731 -734 „ ί 19 8 7)

iVU CUZ

Os ácidos nucieicos recombinantes que codificam. um polipéptido de fusão compreendendo um polipéptido Ral2 e um polipéptido heterólogo seleccionado podem ser preparados de ilizando quaisquer métodos conhecidos na técnica. Como scrito acima, os ácidos nucieicos recombinantes são nstruídos de modo a que uma sequência de colínucleótido Ral2 teja localizada a 5' oe i .ima seauêncí a de polinucleótido

de term inação a 3' da sequência de pode ser substituído com. uma sequência de que pode proporcionar sitios de restri ^ iq o y ''J heterólogo seleccionado. As sequências de Ra 12 e polinucleótido heterólogo também podem ser modificadas para facilitar a sua fusão e subsequente expressão de polipéptidos de fusão. Por exemplo, o coda· e/ou sítios de clivagem. Os ácidos nucieicos recombinantes podem ainda compreender outras sequências de nncleótidos, tais como sequências que codificam etiquetas de afinidade para facilitar o protocolo de purificação da proteína.

Vectores de Expressão e Células Hospedeiras

Os ácidos nucieicos recombinantes, como aqui descrito podem C; p y unidos a uma variedade de outras sequên cias de núcleo tidos, utii 1. izando técnicas de A DK recombrnante estabel. ecidas Ror exer nplo, un a p o 1 i n u c 1 e ó t i d o pode ser cionado em qua iquer um de uma variedade de vectores de clonagem, i; icluindo plasm .ideos, fagemídeos, derivados de fago lambda e cosmideos, Vectores de particular interesse incluem ve< Stores de expressão, vectores de replicação, vectores de cria cão d e sonda e vectores de 18 sequencíação. Em geral, um vector conterá uma origem de replicação funcional em pelo menos, um organismo, sítios cie endonuclease cie restrição convenientes e um ou ma is marcadores de selecção. Outros elementos dependerão da utilização desejada, e serão óbvios para os especialistas na técnica.

As sequências de ADN que codificam os componentes polipeptidicos podem ser montados separadamente, e ligados num vector de expressão apropriado. A extremidade 3' da sequência de ADN que codifica um componente polipeptídico é ligado, com ou sem uma sequência polinucieotídica codificando um ligando peptídico, á extremidade 5' de uma sequência de ADN codificando o segundo componente polipeptídico de modo a que as grelhas de leitura das sequências estejam em fase. Isto permite a tradução numa única proteína de fusão que retém a actividade biológica de ambos os componentes polipeptidicos,

As sequências de ADN ligadas são ligadas operacionalmente a elementos de regulação de transcrição ou tradução adequados. Os elementos de regulação responsáveis pela expressão de ADN estão localizados apenas a 5' da sequência de ADN codificando os primeiros polipéptidos. De um modo semelhante, os codões de terminação necessários para terminar a tradução e os sinais de terminação de transcrição estão apenas presentes a 3' da sequência de ADN codificando o segundo polipéptido.

Dependendo do sistema hospedeiro/vector utilizado, qualquer um de um número de elementos adequados de transcrição e tradução, incluindo promotores constitutivos e indutíveis, pode ser utilizado no vector de expressão. Por exemplo, quando se clona em sistemas bacterianos, podem ser utilizados promotores indutíveis, tais como pL de bacteriófago λ, plac, ptrp, ptac 19 híbrido ptrp-lac; promotor de cit omegaloví ru s) e semelhantes; quando se clona em sistemas de células de -as, podem ser utí 1 ízados promotores tais como ADR O o promotor < do fa ctor a; quando se clona em si st s de ínsecto, ] podem ser utilizados promotores tais or de : poliedro de b; aculovírus; quando se clona em s PUO 5. '.s come si st em; de células vegetais, podem ser utilizados promotores derivados do qenoma de células vegetais (e, g,, oromotores de choque térm ic Γ\ e v-- f r~\ P romotor pci.Bci 3 subun idade r >equena da RuB.i. SCO; 0 prom ot Γ\ Y‘ pa ra a prote ína : j.e 1 igaçâo 5. olor ofila α/β) ou de vi ru s de p 1J. 8. rrt" as (e vr r·, prom tOtOí : do AI IN 3 0 S < de CaMV; o promotor da prot eí na. da r> apa de í MV) ; qua ndo se G: Lona em sistema: s de célu Ias de ma: mi fer os, , podem s e i : ui til i zac los p.rc imoto res d: erivados do gene ma de ΟΘ J. U J. 3. 3 de rr: :.amifer 03 (e /-v y - í e romotor da metalotionelna) ou de vírus de mamíferos (e. g., o promotor tardio de adenovírus; o promotor do vírus vaccinia de 7,5K); quando s & criam I inbas celulares que contêm cópias uma se quêr teia de anti· génio codi ficante, podem se vectore :S í à base de 3 V40-, BPV- e EBV- com um selecção apropriado ;temas de hospedeiro- rias codi ficantes da não esta o limitados g., x , coli, 3. proteína de fusão Ra12. Estes incluem, m a, microrqanísmos tais como bactérias (e. O ruí deo cont .end.o uma se quência codi '3 0 C-h \ pA romyces , Pichia) t ransformados p a i pq tedura recombina nte s contendo í S te n:i. as de células de insectos i xp Y C. '. 3 são de vírus re com .binant.es íe. de expressa· •-Λ de A. D pl asmídeo o U de AD car p p “ Ί O.’ ; Cj. ; l.ur< a s ( θ . om vectores de exprt ta sequência Γ' r v· ·. td.í f í c. ect adas com V< p Y ,p ~f ρ de ;u loví rus) 3 e í contendo 20 uma sequência codíficante; sistemas de células vegetais infectadas com vectores de expressão de vírus recorab.inant.es (e, g., vírus do mosaico da couve-flor, CaMV; vírus do mosaico do tabaco, TMV) ou transformadas com. vectores de expressão de plasmídeo recombinantes (e. g., plasmidec Ti) contendo uma. sequência codificante; ou sistemas de células de mamífero (e, g., células COS, CHO, BfíK, 293, 3T3) . Os elementos de expressão destes sistemas variam na sua força e especificidades. São preferidos os sistemas bacterianos para a expressão de polípéptidos de fusão Ra12. Sequências de controlo procarióticas normalmente utilizadas, que são aqui definidas para incluir promotores para iniciação de transcrição, opcionalmente com um operador, juntamente com sequências de sítio de ligação a ribossoma, incluem, os promotores normalmente utilizados, tais como os sistemas de promotor da beta-lactamase (penicilinase) e da lactose (iae) (Change et ai., Nature (1977) 198:1056), o sistema de promotor do triptofano (trp) (Goeddel et ai., Nucleic Acids Res. (1980) 8:4057), o promotor tac (DeBoer et ai., Proc. Natl. Acad, Sei. U.SA. (1933) 80:21-25); e o promotor PL derivado de lambda e sítio de ligação ao ribossoma do gene N (Shimatake et 3.1., Natvre (1981) 292:128). O sistema particular de promotor não é crítico para a. invenção; pode ser utilizado qualquer promotor disponível que funcione em procariotas.

Podem ser utilizados na presente invenção promotores constitutivos ou regulados. Os promotores regulados podem ser vantajosos porque as células hospedeiras podem ser cultivadas em densidades elevadas antes da expressão dos polípéptidos de fusão Ral2 ser induzida. A expressão de proteínas heterólogas em níveis elevados retarda o crescimento celular em algumas situações. Promotores regulados especialmente adequados para 21 utilização era E. coli íncluera o lambda, o promotor híbrido trp-la 25:167/ de Boer et ai., Proc. Natl promotor Pl do bacteriófago (Amann et al., Gene (1983) Acad. Sei. USA (1983) 80:21, e o promotor do bacteriólago T7 (Studier e

Mol. Biol.

(1986); Tabor et al., (1985). Estes utilização são discutidos em Sambrook et Cloning: Ά Laboratory Manual, 2* Ed., V promotores e a sua al., (1989) Molecular d.s. 1-3, Cold Spring

Harbor Laboratory.

Para a expres: : a 0 de po lípéptidos pro. 2 ar ióti cas dífe; :ent :.es de E. coli, que func: ione na e íspéci e p T. 0 C 3. T. .1 pro: uot ores podem s θ Γ obtido is dos ger espéci e, c )u podem. ser utí] .izados pr exer tpl r' ^ f o promot :or híbr.i .do trp~L adicio naini< ente a E. co 11. U rp ítio de ]. i g a ç â o ao ríbe articular

Ti' c; σ μο o .L.iO funciona em Bac.il Iuí convenientemente nas cassetes de expressão da invenção. Um RBS em E. coli, por exemplo, consiste numa sequência de nucieótidos de 3-9 nucieótidos de comprimento localizada 3-11 nucieótidos a montante do codão de iniciação (Shine e Dalgarno, Nature (1975) 254:34; Steitz, In Biological regulation and development: Gene expression (ed. R. F. Goldberger), vol. 1, p. 349, 1979, Plenura Publishing, NY).

Quando se querem produzir grandes quantidades da proteína de fusão Ral2, podem ser desejáveis os vectores que dirigem a expressão de níveis elevados de produtos de proteína de fusão que são rapidamente purificados. Esses vectores incluem, mas não estão limitados a, o vector de expressão de E, coli pUR278 (Ruther et al. (1983) EMBO J. 2:1791), no qual uma sequência 22 codificante pode ser ligada ao vector em grelha oom a região codificante de lacZ de modo a que seja produzida uma proteína híbrida; vectores ρϊΝ (Inouye e ínouye (1985) Nvcleic Acids Res. 13:3101-3109; van Heeke e Schuster (1989) Ji Biol. Chern. 264:5503-5509); e semelhantes. Os vectores pGhX também podem ser utilizados para expressar polipéptidos estranhos como proteínas de fusão í som glutati ona S-transferase (GST). Em geral, essas proteínas P’ C-- Pa V.· .T. U S â 0 são solúveis e podem ser purificados faci l.mente de cé1υli I s ) !_ i. s a da s ρο r adsorçâo a esferas de de C i. IVa1 gem da tre >mb ina r', pol ip? spt.i .do de fu 330 da unida de de Y' rp i.jkJ » v er. Ç.\ a 1., Sc ien /’α í ! 19 1 ‘ / Ac, aá. 5 cí. Ul 3A ( ! í 9 7 9) «i o * r ^ ^ j. j. · L 3 1 , , /- γ O o .iti os de cl .IVa gem podem re·· combir ;.ant Θ S pai :a as glutationa-agarose seguido por eluiçào na presença de glutationa livre. Para certas aplicações, pode ser desejável clivar o polipéptido heterólogo de interesse do polipéptido de fusão Ral2 após purificação. Isto pode ser realizado por qualquer um de vários métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, os vectores pGEX são concebidos para incluir sitie ou protease de factor Xa de modo a q cio Π βΰι o de intere ;sse ; e. g., Sambrook et a 198 : 10 5 6; Goeode i r 76: 106 ; Na gai et ai., iVa t Acad , bCl . USA c; p y 0‘ onst: ruídos nos pro t: eí nas i de fusã o no

Polipéptidos de fusão

No c :ontexto da presente compr * c. '. vo pg e pelo menos, duas aqui des· crito, e um polipé; polip ?épti do de fusão, um prefe u: ido , fundi do, directam partes: um polipéptido Ral2, como >tido heterólogo de interesse. Num polipéptido Ra 12 ê, de um modo 23 amino de ura polipéptido heterólogo de interesse, embora a fusão ao terminal carboxilo do polipéptido heterólogo ou inserção do polipéptido heterólogo num sítio dentro de ura polipéptido Ra 12 também possa ser apropriado.

Qualquer polipéptido heterólogo de interesse, seja de origem eucariótica ou procariótica, pode ser sel.eccicnado como um parceiro de fusão a um polipéptido Ral2. Estes polipéptidos heterólogos incluem, mas não estão limitados a, antigénios patogénicos, antigénios bacterianos, antigénios virais, antigénios de cancro, antigénios tumorais, e supressores tumorais. Polipéptidos heterólogos exemplares incluem polipéptidos DPPD, WT1, mamagiobina, H9-32A, ou outras proteínas de M. tuberculosis, Qualquer um destes polipéptidos pode ser utilizado isoladamente ou em combinação como um polipéptido heterólogo que pode ser seleccionado como um parceiro de fusão.

Como referido acima, um polipéptido de fusão pode compreender um polipéptido Ral2 nativo (e. g., SEQ ID N°:4), uma variante deste, ou um fragmento deste. Uma "variante" de polipéptido, como aqui utilizado, é um polipéptido que difere de um polipéptido Ra 12 nativo em urna ou mais substituições, deleções, adições e/ou inserções, tais como a actividade biológica do p •olipéptido não é substanciaiment e diminuída. Por outras palavra s, a capacidade de uma variante para produzir polipéptido de fusão em. células hospedeiras pcd€ ? ser aumentada ou não alterada, em relação à proteína Ral.2 nativa, ou pode se diminuída em menos de 50%, e de um. modo preferido menos do que 20%, em rela cão à proteína ] la 12 nativa. Essas variantes podem geralmente sc rr identificadas modificando uma das sequências de polipéptido a cima e avaliando o nivel. de produção de polipéptido de fusão em células hospedeiras, tais como em B. coli. Variantes 24 exemplares incluem aquelas em que uma pequena porção (e. g., 1-30 aminoácidos, de um modo preferido 5-15 aminoácidos) foi removida do terminal N e/ου C dos polipéptidos Ral2 nativos. Numa forma de realização, as variantes do polipéptido Ra12 nativos compreendem pelo menos, cerca de 5 aminoácidos, pelo menos, cerca de 10 aminoácidos, pelo menos, cerca de 30 aminoácidos, pelo menos, cerca de 50 aminoácidos, ou pelo menos, cerca de 100 aminoácidos.

Numa forma de realização, a sequência de polipéptido Ral2 é como apresentada na SEQ 1D N°:4. Noutra forma de realização, a sequência do polipéptido Ral2 compreende uma porção da SEQ !D N°:4. Por exemplo, um polipéptido Ra 12 compreendendo 30 aminoácidos (e. g., aminoácidos 1-30 de SEQ ID N°:4) ou um polipéptido Ral2 compreendendo 128 aminoácidos Çe, g., aminoácidos 1-128 de SEQ ID N° : 4) podem ser utilizados como um parceiro de fusão. Ver Exemplos 2 e 3 abaixo.

As variantes de polipéptido apresentam, de um modo preferido, pelo menos, cerca de 70%, de um modo ma is preferido, pelo menos, cerca de 80% ou, pelo menos, cerca de 90%, e de um modo muito preferido, peio menos, cerca de 95% de identidade (determinado como descrito acima) com os polipéptidos identificados. Opcionalmente, a identidade existe numa região que é, pelo menos, cerca de 20 até cerca de 50 aminoácidos de comprimento ou, opcionalmente numa região que tem 75-100 aminoácidos de comprimento.

De um modo preferido, uma variante contém substituições conservativas. Uma "substituição conservativa'' é uma em. que um aminoácido é substituído por outro aminoácido que possui propriedades semelhantes, de modo a que um especialista na 25 estrutura técnica de química de péptidos esperaria que a secundária e a natureza hidropática do polipéptido fosse substancialmente não alterada. As substituições de aminoácido podem ser geralmente realizadas com base na semelhança era polaridade, carga, solubilidade, hidrofobicidade, hidrofilicidade e/ou a natureza anfipática dos resíduos. Por exemplo, aminoáeidos carregados negativamente incluem ácido aspártico e ácido glutâmico; amrnoácídos carregados positivament : inc] .uem lisina 0. arginina; e aminoácidos com abeça polar não cari regados possui ndo valores de ide s emeihantes inc.I uem leucina, isoleucina e valina; glicina e alanina; asparagina e glutamina; e serina, treonina, fenilalanina e tíresina. Outros grupos de aminoáciáos que podem representar cargas conservativas incluem: (1) ala, gly, gl.u, asp, gin, f a s ri f s θ r i thr; (2) n \ r q ^ y ° ? q y τ \; v- +“ h, v s ‘.sT, 1. } V >- / 1...f V8.i ; 1.10; l.GU/ πίθΐρ ala, phe; ( 4} lys, arg, h is; e (5) Phe, trp, his. Uma var iante pode também, ou alt :erna tivamente, er alterações não conservativa s, Kuma forma preferida de ização, os poiípépt idos variant es difej crem. de uma sequência va por substituição, - deteção ou adição de ern co aminoácidos ou menos. As variantes podem também (ou a11ernativamente) ser modificados por, por exemplo, a deteção ou adição de aminoácidos que possuem influência mínima na imunogenicidade, estrutura secundária e natureza hidropática do polipéptido. como "po.i .ipéptido Rc 1.12" ou. como a .quí uti li zados, Y' ip 0> em- o Ra 12 nativo s (e. g., SEQ 1D ·, SEC ) :r d N 0:17 ou 18) , ou. .onalme: nte, um polipépt: ido E a. 12 uma pi :oteí na de fusão, c.<. .q sua roteina i de f ; usão nas cé.lu ias l\ .s s .rm; os t· ermos, ta is "se quê I í C .1.3. de polipéptido Ra 1 2" C· 3. seque; ncias de polinu cie ótid' N° : 4) , f ra gmentos destes (e ç qua isq uer r rar iante s destes í ''u.n c.i pos suí 3. C 3. pacidade para p! roer jzi r cap ac.i dade para produzir um a p: 26 hospedeiras pode ser aumentada ου não carregada, em relação ao polipéptido Ral2 nativo (e. g., SEQ ID N° : 4) , ou pode ser diminuído em menos de 50%, e de um modo preferido menos de 20%, em. relação ao polipéptido Ral2 nativo.

Corao referido acima, os polipéptidos de fusão podem ser con j ugados a um ligar ido ou outra sequ ehcl .3 p3.h'3 t ac.í lida de de sínt ese, puri freação ou identificação do polrpépt ido ou para aume :ίΪ3.χ' 3 -i. ícaoáo do po.l . ipéptrdo a um suporte sólido Por exem pio, uma sequênci a de liaando oeo tídl co pode ser emr rregue para separar um políp· sptido Ra 12 e um poli péptido 1 ; μ-tl τ p y Q 1 p ;go de inte resse por uma d i s tâncic i suficiente par '3. 33 SG-Cí ué rar que cada polipéptido se dobra nas suas estruturas secundárias e terciárias. Uma tal sequência de ligando peptídico é incorporada na proteína de fusão utilizando técnicas convencionais bem conhecidas na técnica. Sequências de ligando peptídico adequadas podem ser escolhidas com base nos seguintes factores: (1) a sua capacidade para adoptar uma conformação flexível estendida; (2) a sua incapacidade para adoptar uma estrutura secundária que possa interactuar com epitopos funcionais no primeiro e segundo polipéptidos; e (3) a ausência de resíduos hidrofóbicos ou :om os epítopf λ c; funcíc na.í s do e re Τ’ P r> .3 r-l·.· o y v.. vP / as s< 3 quêi reias de •esí d U. 0 t? 3 ] v J: CJ. y / r rsn c.·. Ser o utros :ais como Thr e y 3 t ambém podem .1 ga ndo. A ,s se quên C .1 3. s de ues com uti lid* a de c orno líg 3 Π O.G S C.\ τ' ai ., Gene i 4 0:: 39-86, 1 9 8 S; 3 C ' .1 , USA 83 : 82 fr. q J -826: 3 198 6; Pate; rte U.S. í 1° 4 751 i r 1 r : a y. w t Λ :alme nte desde 1 até Γ' Γ\ ν' V_· J-. C3 de 50 sequ iênc ias de li ga ndo não são carregados que possam reagir polipéptido. Em certas formas ligando peptídico podem conter aminoácidos próximos do neutro, ser utilizados na sequência aminoácidos que podem ser empr incluem as reveladas em Marat Murphy et ai., Pr.oc, Natl. Ac Patente U.S. N° 4 935 233 í

sequência de ligando pode ser * aminoácidos de comprimento. A 27 necessárias regiões de utilizadas interferênc quando o primeiro e segundo poiipéptidos possuem aminoácidos não essenciais N-terminais que pedem ser para separar os domínios funcionais e prevenir ia estérica.

Numa forma de realização preferida, um ligando pode fornecer um sitio de clivagem especifico entre um polipéptido Ral2 e um polipéptido heterólogo de interesse. Um tal sítio de clivagem pode conter um alvo para enzima proteolítica que incluí, por exemplo, enteroclnase, Factor Xa, tripsina, col.agenase, trombina, hidrolase de ubíquitina; ou para agentes , tai c r* VU ·_/ orno, por semplo, brometo de .mina. de fi ,i S α 0 pode co; nter opc ionalmente uma que e stá . ligada 3.0 pol: ipépt: ido de fusão de cão cí 5 pCd ί ipépt: idos recombir ;antes pode ser mode simplificada. Por exemplo, resíduos múltiplos de histidina codificados pela etiqueta permitem a utilização de métodos de cromatografia de afinidade com quelato de metal para a purificação de poiipéptidos de fusão. Outros exemplos de moléculas de etiqueta de afinidade incluem, Strep-tag, PinPoint, proteína de V; ti y íTí rr x - 1 / ' ¥ · f gação á maltose, ]. 1. c k e P a s t e r n a k glutationa S-transferase, etc. (1999) Molecular Bíotecknology ΜΠ11 Cl Ό1 G 3 ADo.i ícatiom ot

Mibinant DMA. (-'.me: an ciety for Microbiologj jasn rnqton DC.

Os poiipéptidos de fusão podem ser preparados utilizando qualquer uma de uma variedade de técnicas bem conhecidas. Os poiipéptidos de fusão recombinantes codificados pelas sequências de ADN como descrito acima podem ser rapidamente preparados a partir das sequências de ADN utilizando qualquer um de uma 28 variedade de vectores de expressão conhecidos dos especialistas na técnica. A expressão pode ser alcançada em qualquer célula hospedeira apropriada que foi transformada ou transfectada com um. vector de expressão contendo uma molécula de ADN que codifica um polipéptido recombinante. Células hospedeiras adequadas incluem células de procariotas, levedura e eucariotas superiores, como descrito acima. De um. modo preferido, a célula hospedeira empregue ê E. coli. Os sobrenadantes de sistemas de hospedeiro/vector adequados que segregam proteína ou polipéptido recombinante no meio de cultura podem ser primeiro concentrados utilizando um. filtro comerci.alm.ente disponível, Após concentração, o concentrado pode ser aplicado a uma matriz de purificação adequada, tal como uma matriz de afinidade ou uma resina de permuta iónica. Finalmente, podem ser empregues um ou mais passos de HPLC de fase reversa para purificar ainda maís um po1ipéptido recombinante.

Porções e outras variantes possuindo menos do que cerca de 100 aminoácidos, e geralmente menos do que cerca de 50 aminoácidos, também podem ser criados por meios sintéticos, utilizando técnicas bem conhecidas dos especialistas na técnica. Por exemplo, esses polipéptidos podem ser sintetizados utilizando qualquer uma das técnicas de fase sólida comercialmente disponíveis, tais como o método de síntese de fase sólida de Merrifield, em que os aminoácidos são adicionados sequencialmente a uma cadeia de aminoácidos em crescimento. Ver Merrifield, J. Am. Ckem. Soc. 85:2149-2146, 1963. 0 equipamento para síntese automatizada de polipéptidos está comercialmente disponível em. fornecedores, tais como Perkin El.mer/Applied BioSystems Division (Póster City, CA.) , e pode ser operado de acordo com as instruções do fabricante. 29 iesm.o ou d e todos cs >e um modo preferido, de 90% pu: ros, de um s e de um modo muito Um ooiinu cleótido é

Em geral, os polipéptidos (incluindo proteínas de fusão) e polínucleótidos como aqui descritos são isolados. Um polipéptido ou polinucleòtido "isolado" é aquele que é removido do seu ambiente original. Por exemplo, uma proteína que ocorre naturalraente é isolada se for separada do materiais coexistentes no sistema natural, esses polipéptidos são, pelo menos, cerca modo preferido pelo menos, cerca de 95% pur preferido pelo menos, cerca de 99% puros, considerado como estando isolado se, por exemplo, for clonado num vector que não é uma parte do ambiente natural.

Adicionalmente a proporcionar expressão estável e rendimento elevado de polipéptidos de fusão de interesse, os ácidos nucleicos de fusão recombinante e os polipéptidos de fusão da invenção podem ser utilizados em vários outros métodos. Por exemplo, a sequência codificante do polipéptido de fusão da invenção pode ser utilizada para codificar um produto de proteína para utilização como um. antígénio para detectar anticorpos no soro. Por exemplo, a presença de anticorpos no soro contra antigéníos de M. tuberculosis num indivíduo Indica que o indivíduo está infectado com M. tuberculosis. Em testes de diagnóstico convencionais, os anticorpos do soro contra M. tuberculosis são detectados monitorizando a ligação de anticorpos do soro contra proteínas de M tuberculosis. Os polipéptidos de fusão da invenção são úteis como fontes de proteínas para monitorizar a ligação de anticorpos do soro a proteínas de fusão. AIternativamente, o polipéptido de fusão pode ser utilizado como um imunogénio para induzir e/ou aumentar respostas imunitárias. Essas seauêncras codificantes podem ser liaadas à 30 sequência codificante cie outra molécula, tal como um antigénio de M. tuberculosis, uma citocina ou um adjuvante. Esses polinucleótidos podem ser utilizados in vivo como uma vacina de ADN (Patentes U.S. 5 589 466; 5 679 647; e 5 703 055) . Alternativamente, polipéptidos de fusão purificados ou parcialmente purificados ou fragmentos podem ser utilizados como vacinas ou composições terapêuticas. Qualquer um de uma variedade de métodos conhecidos na técnica pode ser empregue para produzir vacinas ou composições terapêuticas compreendendo os polipéptidos de fusão da presente invenção.

Purificação e Preparações de Proteína

Assim que uma proteína recombinante é expressa, pode ser identificada através de ensaios baseados nas propriedades físicas ou funcionais do produto, incluindo marcação radioactiva do produto, seguido por análise através de eiectroforese em gel, radíoímunoensaio, ELISA, bioensaios, etc.

Assim gue a proteína codificada é identificada, pode ser isolada e purificada através de métodos convencionais incluindo cromatografia (e. g\, cromatografia líquida de elevado desempenho, permuta iónica, afinidade, e cromatografia em coluna de separação por tamanho), centrifugação, solubilidade diferencial, ou através de qualquer outra técnica convencional, para a purificação de proteínas. Ver, de um modo geral, R. Scopes, Protein Pvrificatíon, Springer-verlag, S.Y. (1982), Deutscner, Methods in Enzymology Vol. 182: Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc, N.Y. (1990). As condições actuaís utilizadas dependerão, em parte, de factores tais como carga líquida, h idrofobi ci dade, hidrofilicidade, etc., e serão 31 evi de rote Ci pa. ra os especiali; fun ci ou a. .13 P odem : ser avaira a de guado 3 o i\ c; propc : reda.de s funciona ava li a da. s ut-i . Irzand. o qualauer de ar ítl.C 0.1' po, induç ão da prol. da 10] rodi r> O C.·. rq p Aa\_. v·... 0C1113 ; tcLJ. ensaioí como IL2, IL-4 e IFN-y, Para a prática da presente invenção, é preferido que cada proteína de fusão seja peio menos, 80% purificada de outras proteínas, É ma is preferido que sejam, pelo menos, 90% purificadas, Para administração in vivo, é preferido que as proteínas sejam mais do aue 95% ourif.içadas.

As proteínas purificadas podem ser ainda processadas antes da utilização. Por exemplo, as proteínas podem ser digeridas com uma enzima específica para separar o polipéptido Ra 12 do jp ,·-λ ]_ ] jp jp ti O O ]% 0 c.\ j··r) ] r\ qj r\

Um eí cia íista r< econheceria que podem ser T. Θa.1 -1 7.· 3.0.3. aos ácidos n u c: 1 ei c o s r e c: omb i n a n t e s 0 polipéptido a diminuir a. sua actividade foiol ..óqí ca, Alguma podem, ser ar a clonagem expressão, ou incorporação da molécula de etiqueta num polipéptido de fusão. Fssas modificações são bem conhecidas dos especialistas na técnica e incluem, por exemplo, uma rn.etion.ina adicionada ao terminar amimo para proporcionar um sítio de iniciação, ou aminoácidos adicionais (e. g., poli Hi .s) colocados em. qual que r dos terminais rara cri ar sítios de : restrição ou codões de terminação ou sequências O c-· VA V. purificação localizados convenientemente. 32

Os seguintes Exemplos sâo oferecidos a título de ilustração & não como meio d.& limitação.

EXEMPLOS ;e ilustram são estável js exemplos Ra12 podem

Os exemplos seguintes descrevem experiências qi que as construções de fusão de RaJ.2 produziram expies e de rendimento elevado dos polipéptidos de fusão. ( seguintes também ilustram que várias sequências de ser utilizadas como um parceiro de fusão.

EXEMPLO N°

^omo um A Sequência cie Ra Paí rcerro de FUSâO

Comprimen onstrucao o Total (SEQ ID ^ IV / Ç Q ι: ';Ρ Εχρ ressa o

As sequências codífícantes de anti génios d( M tubOTCUj-OS' ' 13 foram modificadas por PCR de modc ~) ·~* facilita: r a S U 3 T. U S ã 0 e subsequente expressão de proteína de rusâo - (. ) Ví ector pET 1 7 b (Novagen) foi modificado para in cluii : RaI2, um fragmento de 14 kDa C-terminal do anticénio da prot ease de ser ina MTB32A de M. tuberculosis, 0 codâo de terminação de 3f da sequência Ra 12 foi substituído com um sítio EcoKL em grelha e a extremidade N-terminal foi construída para codificar seis resíduos de eti oueta [lis imediatamente após o iniciador Met para facilitar um protocolo de purificação simples de um p. asse das proteínas ombinantes de Ra 12 por cromatografia de afà ..nidade ae longo da mat riz Ki-NTA. génio MTB32A onvencionais

rspeciticamente, e fragmento C-terminal do an amplificado através de métodos de PCR 33 utilizando os iniciadores oligonucleotídicos 5' GAA TTA CAT ATG CAT CAC CAT CAC ACG Γ^Γ ΨΓΓ GAT A AC TT C (SEQ ID IA : .1 3) e a s equencia olígonucl .eotídíca 3' é 5'-CTA. AI GGC GÓG r Γ'Ρ r: :cc ctc ; ~nr- l\ 'Q RO 1D N 0 :14) . 0 produto de; 4 5 0 pb foi digerido com Nde. I e AcoRI e clonado nc i vector de expressão PET 17b de ur n modo s emelhante digerido com as mesmas enzimas, A expr essão da proteí na Ra12 recombinante foi reali zada após :romat 0 Cf 1. 3. t .1.3. de a tinid; ide num sol ui /T0.J. 3p0 3 Oí.í ã .J. ise em 1 x PB 3 -1. C 3. dei obtida foi, de ro tina, n transformação nas células hospedeiras de E„ coli BL-21 ípLysE) (Novagen) e indução com IPTG. Após a lise das células de E. coli e centrifugação a 10K rpm, o Ra .12 recombinante foi encontrado na fraeção solúvel do sobrenadante. A proteína do sobrenadante solúvel foi purificada por coluna de Ní-NTA que permanec A quantidade de proteína pur gama de 60 a 100 mg por litro.

A sequência de DPPD foi construída para expressão como uma proteína de fusão com Ral2 concebendo iniciadores oligonucleotídicos para amplificar especificamente a forma madura segregada, O oiigonucleótido 5' contendo um sitio de reconhecimento da enterocinase (DDDK) possui as sequências GAA TTC GAC GA.C GAC GAC AAG GAT CCA CGT GAC CCG CAT /qy.T' T p. t, OÍ.'vi L· 5- CAA T TA GAA I-J-I π sequência de oligonucleótidc produto amplificado por PCR resultante foi digerido com EcoRI e subclonado no sítio EcóBI do vector pET-Ral2. Após a transformação na estirpe hospedeira de E. coli (XLl-blue;

Stratagene), os cie nes contendo a inserção de tamanho corre cto foram submetido s a sequenciação de modo a identificar a que ! ÇTi O que estavam em grei' ha com a fusão Ral2, Sub sequentemente, o ADN de interesse (F ig. 3) foi transformado no h .osoedeiro bacteri ano 34 BL-21 (pLysE) e a proteína de fusão foi expressa após indução da cultura com IPTG. J:í , zxvressâo e -o de Proteínas de Fusão

A proteína de fusão recombinante (His-etíqueta) Ral2-DPPD foi purificada a partir de culturas descontínuas de 500 mL induzidas com IPTG do sobrenadante solúvel por cromatcgrafia de afinidade utilizando a matriz de um passo QIAexpress Ni-KTA

Ag arose matrix : (QIAGEN , Cbatswc a: th, Ci λ Ί ' / Π3. lOTG ‘sença d C.\ 8 M de ui: eia. Resumidamente, 2 0 mL de : um; r. r :u l.t ura de um di 3 içar, a o ou Τ' T·"/-'-', — i Sei tu .330.3 > ae BL21 contendo 3 cons t T ti Ç 3 O pE 1 m ] J. foi a d icionada a 500 mL de me i o 2xYT coi utendo 50 p.g, imL de amo: - /> “ 1 p. 3 4 μα í/mL de ei .oranfenicoi, eu.lt.ív ado a 37 °C com agu. tação. As cu l.tu.ra s bacteri anas f oram i ndi uzidas com IPTG a 2 mM a te uma !')('} 560 de 0,3 e cuitrv ada d ura: ate ; mai. s h (IX I) .1,3 a. 1, 9) . ;-\ O Γ' lulas T --n -y pj rp γ·; acolhid as a par ti r de o·1 aturas descoir trnuas de 50 0 mu por centritugaç Q p Ύ' Γ-'λ Q SUSP1 ens· 3. S em. 2 0 mL de tarr ipão de li gaçào (fosfato de sc dio a o, 1 M, P P Cl - *-!') :: is-HCl 3 10 mM, pH 8,0) contendo PMSF a 2 m? \/j ;ti 20 pg/ mL de reupeptina • t A coli Ί- --Λ i lis ada adiei .onando ]. 5 :m ç d.i soz ima e agi. .tando e m. ; sistema de va iv em Gurant e 30 mi í. n a 4 ° C S.pO S £ ;oni cação (4 x 30 se ;g) . A s n 3 lulas lisadas foram centra fugadas a 12 k rpm durante p f'\ mi. n e -p -"Λ 1 a d icionada ui: eia directam .ente 3. •—\ sobrem adante pai .'.3 um.a concentração tinal de 8 M.

0 sobrenadante foi .1 .içado CiQ modo descontínuo a resina de Ni-KTA agarose (5 mL de r íti σ i p por induções de 500 ml i) agitando em. vaivém à temperatura ambie nte durante 1 h e a matriz for passada por uma coluna. 0 fluxo de passagem foi pa ssado duas vezes pela mesma coluna, se cu ida oor três lavagens com 30 mL 35 cada de tampão de lavagem (fosfato de sódio a 0,1 M e Tris-HCi a 10 raM, pH 6,3} também, contendo ureia a 8 Μ. A proteína ligada foi eiuída com 30 mL de imidazole a 100 mM em tampão de lavagem e foram recolhidas fracçôes de 5 mL, As fracções contendo o antigénio recombinante foram reunidas, dialisadas contra Tris- HCl. - 1 Ά ct -L w mM. (pH 8,0) Ί ~·, np n: :ais uma ve z a matr iz Ki-N’: eluí da s e dia.' 1.1. s a das e: m IxPi 3 ,j (pi u Tris- HCl a 10 mM (pH 7,8) , 0 rendiment -Λ d. a P-rote: í.na d C- VA V. • fusão : recombi nante purificada esta va em !. 50 a. 7 mg por 1 .itr· de cultu ira bacteriar ia induz; i. da c o γρ ma f s de ift d. e pi sresa, re pr esentand. o uma banda. única. M O prot ei nas rec ombi .n ante s for ’ a itl e: 1S 3.1.α da S pa ra contaminacão de endo toxin, a ut .11.12 no.o o ei nsai .0 de Ld.m aius i íBioWhittaker) e demo nstra. raia c :onte.r < 1. 0 u . /mc í í < 1. na L PS/ma). C. Criação de Anii-sor*. e emulsificado com 1 PBí incompleto; múltiplos ..os s.c. em i. cada (100 y.g) foi misturada , reco nstituido até 1 mi: com mL de adjuvan r p 1F'A (Fre Ά emulsão foi injectada alhos fêmeas 1 lew Zealand m a dm; i.nistrados ao coelho le ant: i.génio em 1FA) a 6 sem ::om de distância e uma injecção final i.v. com 100 yg da proteína recombinante administrada novamente após 6 semanas. Uma. semana após o reforço finai, o coelho toi sacrificado e recolhido e armazenado a -20 °C. 36 D, Análise de Imuno transferência

Lisado total de M. tvberculcsis (estirpe H37Rv) ou PPD (2,5 ug cada) e 25 ng da proteí . .0. S de fusão recombinante purifi c. a d a Ra 12 ··· D P J ?D foram separados por <t: | rese era géis de SDS-PAGE a 16% e transferidos ca: ra n ífroceluloF ;e utilizando um. dispositivo de transfe rência semi-seco (Bio Ra d) M C tra nsferéncras, e :m. dup.1 içado, foram bloqueadas durante um. r mínimo de 1. h com PBS/1: íween _ A Ί O, Cl W ^ J. "C e rastreados cora sonda com sores policlonais do mesmo coelho antes da imunização ou pós imunização com. a proteína de fusão recombinante purificada (diluída 1:500 em PBS/Tween 20 a 0,1%). A reactividade foi avaliada como anteriormente utilizando [;zbI]-proteína A, seguido p o r a u t o r r a d i o grafia. E. Resu.i.taclo:

Santa Ciarita, CA.) ou 2) )'RT3/A (Novagen, ÍMadí son, .sca.ta.wi ivf NJ) . Em. todos ficado muito i IOUCO, ou. codifí cante de Da.Pb tor mo. vect or de ex pressão e

Foram inicialmente avaliados vários sistemas de expressão para a expressão de DPPD em E. coli. Isto incluiu a sub-clonagem da sequência codificante de DPPD como construções de não fusão em. 1) pET 17b (Novagen) e pQ30 (Qiagen, como construções de fusão utilizando j WI) ou pGEX-2T (Pharmacia Biotedh, P: esses sistemas, foi expresso e pur; nenhum, DPPD.

Em contraste, quando a sequência mseriaa a d da sequência de Ra12 transformada em E. coli, foi produzida uma grande quantidade de proteína de fusão Ral.2-DPPD. A sequência de nucleótidos {SEQ ID N°:5) e sequência de aminoácidos (SEQ ID K°:6) de Ral2-DPPD são 37 reveladas na Figura 3, A imunogenicidade de DPPD foi mantida como evidenciado peia capacidade do anti-soro para reagir com a proteína purificada em análise de imunotransferência. Adicionalmente, três outras proteínas de origem eucariótica ou procariótica (ver Figuras 3-6} foram também expressas com sucesso pelas construções de fusão de Ral2. Assim, a sequência codífícante de Ra .12 é útil como um. parceiro de fusão numa. construção de expressão para facilitar a expressão de uma sequência heteróloga. EXEMPLO 2: Polípéptido de Ral2 Curto (SEQ 1D N°:17) como um Parceiro de Fusão

Neste exemplo, um polípéptido Ral2 compreendendo os aminoácidos 1-30 de SEQ ID K° foi utilizado como um parceiro de fusão pata ligação com o gene de comprimento total da mamaglobina humana. Esta forma curta de polípéptido R.al2 possui a sequência de aminoácidos apresentada, em SEQ ID N°:17, e é aqui referido como "Ra12 (curto)".

Como apresentado na Figura 9, a extremidade 3' da sequência de Ra 12 (curto) é fundida com o gene de comprimento total da mamaglobina humana. Especificamente, o gene da mamaglobina humana foi amplificado por métodos de PCR. convencionais utilizando os seguintes iniciadores oligonucleotidicos: o iniciador 5', sítio Hindlll: 5'-gcgaagcttATGAAGTTGCTGATGGTCCTCATGC-3' (SEQ ID N°:19); o iniciador 3', sítio XhoI: 5'-- c gg c t c g a gT T A AA AT A A A? C A.C A.AA.G AC T G C T GT C - 3' (SEQ ID N°:20). Os sítios 5' Hindlll e 3f Xhol foram adicionados para auxiliar a subclonagem num vector. A extremidade N-terminal da construção 38 de fusão foi construída para codificar seis resíduos His-etiqueta imediatamente após a Met para facilitar os protocolos de purificação. A expressão da construção de fusão foi realizada após a transformação em E. coli utilizando processos semelhantes aos descritos no Exemplo 1, Comparado com uma construção sem uma sequência de Ral2 (curto), a construção de fusão com uma sequência de Ral2 (curto) aumentou substancialmente a expressão da proteína de fusão Ral2 (curto)-mamaglobina. EXEMPLO 3: polipéptido Ral um. Parceiro de Fusão ma is Longm N°

Neste exemplo, um polipéptido Ral 2 compreendendo os iminoácidos 1-128 de 5EQ ID N° Ά foi utilizado como um parceiro comprimento total d< de fusão para ligação com o gene mamaglobina humana. Esta forma longa de polipéptido Ral2 possui a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID N°:18, e é aqui referida como "Ral.2 (longo)'", Foram utilizados processos de clonagem e expressão semelhantes aos descritos no Exemplo. Em comparação com uma construção sem. uma. sequência de Ra 12 (longa.) , a construção de fusão com uma sequência de Ra .12 (longa) aumentou substancialmente a expressão da proteína de fusão Ra 12 (longa)-mamaglobina. presente invenção não deve ser limitada no âmbito pelas formas de realização exempli ficadas que pretendem ser ilustrações de aspectos da ir u/enção, e quaisquer clones. nucleótidos ou sequências de amir ioácidos que são funcionalruente equivalentes estão dentro do ám; oito da inve nçâ o. N a verdade, várias modificações da invenção, adicionalmente aquelas aqui 39 descr itas, tc ma se ão ób\ 'ias ' para o espeoialí sta na te O o Çu Çu parti r da d esc r i. ção ante r ιοί e dos desenho s acompar ihantes. També m de_\ ser t sntí andido que O o os taman hos em p,: ares de bases apr ese nts do s para nuclí íótidos são ap: í:ox amados o são utili zados PS ra P -b eit os de descr ição. LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Corixa Corporation <120> Métodos de Utilização de uma Sequência Codificante de Mycobacterium Tuberculosis para facilitar a Expressão Estável e de Elevado rendimento de Proteínas Heterólogas <130> AHB/FP6050272 <140> EP 00970619.3 <141> 2000-10-06 <150> PCT/US00/27652 <151> 2060-10-06 <150> US 60/158 585 <151> 1999-10-07 <160> 22 <170> Patentin Ver. 2.1 <210> 1 40

<211> 1872 <212> ADN <213> Mycobacterium tuberculosis <220>

<223> protease de serina MTB32A de 32 KD <220>

<221> CDS <222> (89) .. (1156)

<223> MTB32A <220> <221> sig_péptido <222> (89) . . (184) <223> sequência de sinal de secreção hidrofóbica N-terminal <220> <221> mat_péptido <222> (185) .. (1153) <4 00> 1 41 gactacgttg. gtgtagaaaa atcctgccgc ccggaccctt aaggctggga caatttctga 60 tagctacccc gacacaggag gttacggg atg age aat teg ege ege ege tea 112

Met Ser Astt Ser Arg Arg Arg Ser -30 -25 etc agg tgg tea tgg ttg ctg age gtg ctg gct gee gtc ggg ctg ggc 160 Leu Arg Trp Ser Trp Leu Leu ser val Leu Ala Ala val Gly Leu Gly -20 -15 -10 ctg gee acg gcg ccg gee cag gcg gee ccg ccg gee ttg teg cag gac 208 Leu Ala Thr Ala Pro Ala Gin Ala Ala Pro Pro Ala Leu Ser Gin Asp -5 -1 1 S cgg ttc, gee gac ttc ecc gcg ctg cec etc gac ccg tcc gcg atg gtc 256 Arg Phe fila Asp Phe Pro Ala Leu Pro Leu Asp Pro ser Alâ Met val 10 15 20 gee cas gtg ggg eea câf gtg gtc áac stc aae acc saa ctg ggc tac 304 Ala Gin Vai eiy Pro Gin Vai Val Asm lie Asa Thr tys Leu Gly Tyr 25 30 35 40 aae a⣠gee gtg gge gee ggq acc ate gtc ate g®t ccc aac ggt 3S2 Asm Asm Ala Vai 01y Ala õíy Thr Gly Ile Val Ile Asp 5ro Asn Gly 4.5 50 5$ ftc gtg ctg acc aac aae CSC gtg ate gcg ggc gee acc gac ate aat 400 Vai Val Leu Thr Ase Asm Sis Val Ila Ala Gly Ais Thr Asp Ile Asm 60 65 70 gcg ttc age gtc ggc tcc ggc eaá acc tac S9C gtc §at gtg gtc 999 440 Ai a Phe Ser Val Gly Ser 6ly Gin Thr Tyr Giy Vai ASp val Val Gly 75 80 05 fcafc gac ege acc eag gafc gtc gcg gtg ctg cag ctg ege ggt gee est 4 96 Tyr Asp Arg Thr Gin Asp Val Ala val Leu Gin Leu Arg Gly AiS Gly 90 ss 100 42 ggc etg ccg teg gcg geg ate ggt ggc ggç gtc g«3 gfet ggt 983 ece 564 Gly leu Pxo Ser AJLâ Ala Ile Gly Gly Gly val Ala val Gly O Au Pro 105 1.10 115 120 gtc etc gcg atg aac age ssffc sgs cag ggc gga acg çee cgt geg 552 Val Vai Alâ Met Gly Asn Sez Gly Gly Gin Gly Gly Thr Fro Arg Ala 125 130 135 gtg cct gge agg gtg gtc gcg etc ggc tââ ace 9tg cag g«s teg gat 640 vai ργο Gly Arg val val Ma l>eu Gly Gin Thr val Glõ Ala Ser Asp 14 0 145 ISO tcg efcg aec 331 gee gaa gag aca ttg aae 939 trg ate cag ete gat 635 Ser tí. '.: tbr Gly Ai Λ Gin ela Thr Gea Asn Gly Leu Ile Gin Fhe Asp 1S$ 160 165 gce gee ate cag ccc gg£ gat teg gge 933 eec gtc gtc aac sgc eta 736 Ala Ala Ile úln Pr o Gly kap Ser GVy Oly Pto Val Val Asn Gly i»eu 170 1?S 1.80 gga ea« gtg gtc atg aac acg gee gcg tcc gat áae ttc cag ctg 7H Gly Gin vai val Gly Met Asn Thr Ale Ala ser Aso Asn Phe Gin Leu 165 150 íSS 200 tcc cag sei ggg cag 99» ttc gee att ccg ate 993 eag seg atg gcg 832 Ser Gin Gly Gly Gin Gly Phe Ala Ile Aro Ile Gly Gin Ala Het Ala 205 210 215 ate gerg ggc cag ate cga teg ggt ggç 399 tea tcc acc gtc cae ate aso Ile Ala Gly Gin Ue Arg Ser Gly Gly Gly Ser Pro Thr Val Kís Ile 230 22S 230 99« cct acs gee t-tc etc ggc fctg ggt gtt gtc gaç aac aac 93t aac 528 Gly Pva Thr Ala phe r.eu Gly Leu Gly val Val ASp Asn Asn Gly Asn 235 240 245 ggç gca cg* gre caa ege gfcg gee ggg age 9« eeg gcg çea agt ctc 576 Gly Ala Arg Val Gin Arg val Val Gíy Ssr Ala Pro Ala Ale Ser Leu 250 2SS 260 43 fgs ate r.cr âcc §gc gac @tg ate acc gee gtc gac ggc gct eeg ate 1024

Gly Ile Ser Th* Oly Asp V*1 He Thr Ala Wal Asp Giy Ala Pro Il« 265 270 275 280 AAg teg gee acc «cg atg gcg gac gcg cfct aac @gg cat cat cee ggt 1072

Asn Sse Ala Thr Ala Met Ala Asp Ala Lea Asb Gly Hls His Pro Gly 28S 2SS 295 gac gtc ate teg gtg acc tgg eaa acc aag teg <jgc gge acg egt aca 1120

Asp vai He Ser Vai Thr Trp Gin Thr Lys Ser Gly Gly Thr Arg Thr 300 305 310 ggg aac gtg aca ttg gee gag gga ccc ceg gee tga tttcgtcgcg 1160

Gly Asn Vai Thr Leu Ala Glu Gly Pro Pro Ala 315 320 gafcaceaccc gccggccggc caattggatt ggegccagec gtgattgccg cgtgagcecc 1226 egagttccgt ctecegtgeg egtggcatcg tggsageaat g.aaegaggc» gsacacagcg 1206 tegageaece tcccgfcgcag ggeagfccaeg tegaaggcgg tgtggtcgag eatccggatg 1346 ccaaggactt eggeagcgeç gccgceetgc ccgccgatec gacetggttc aageaegeeg 1406 tcttctacga ggtgctggtc cgggcgttet fccgacgeeag cgeggacggt tecggcgatc 1466 Cgcgrggacc eatçgafcçgc etcgactacc tgCágtggct tggeatcgac tgcatctggt 1526 egccgccgtt otacgactcg ccgetgcgçg aeggeggeta cgaeãfctcgç gacttctaea 1506 aggegctgcc egaattcgge aeegtegaeg atttcgtcgc- cctggtcgãe gccgeteaee XS46 ggcgaggtat ccgcatcatc accgacccgg tgatgaa tea cacctcggag tcgeaccect 1706 ggtfctcagga gtcecgccgc gacccagacg gaccgtacgg tgaetatt.se gfcgtggageg 17 66 acaccagcga gcgctacace gacgcccgga fecatcttcgt cgacacegaa gagtcgasct 1826 ggtcattega tcctgt-ccgc cgacagttct aetggeaccg afctcfct 1S72

<210> 2 <211> 355 <212> PRT

<213> Mycobacterium tuberculosis <223> protease de serina MTB32A de 32 KD <400> 2 44

Ket Ser Aso Ser Arg Arg Arg $er Leu Arg Trp Ser Trp Leu Leu Ser 1 5 IS 15 Vai Leu Ala Ala Vai Gly Leu Gly Al.â Thr Ala Pré Ala Gin Ale 20 2S 30 ma Pro Pro Ala Leu Ser Gin ASp Arg Phe Ala Asp Phê Pró Ala Leu 15 40 45 Pro Leu Asp Pro Ser Ala Jtefc Val Ala Gin val Gly Pro Gin Vãl Val 50 5S 60 Aéh tio ftsn Thr Lys Leu Gly Tyx Asfí AOn. Ala Val Gly Ala Glv Thr S5 79 75 80 Gly lio Vai ile Asp Pro Asm Gly Va i Val Leu Thr Aso Asa Vâl Sã 30 9$ Xle Alá Giyf Ais Thr Asp Xle Ass Ala Phé Ser Val Qly Ser Gly Qlá 100 105 no Thr Tyr Oiy Vai Asp val Val Gly Tyr Asp Arg Thr GItí Asp Val Ale 115 120 125 vai Leu Gin Leu A;rg Gly Ai δ Gly Gly Leu Pro ser Aiâ. Ala Ilâ Qly 130 135 140 Qly Gly Vai Ala. Vai Giy aiu Pro Val Val «et Gly Aen Ser Gly 14 5 ISO 155 150 Gly Gin Gly Gly Thr Pro Ars & Val Fr o Gly Arg Vai Vai Ala Leu 1SS 170 175 Cl y Gin Thr Vai Gin Ala ser Asp Ser Leu Thr Gly Ala GiU Glu Thr im 185 190 Leu Asa Gly Leu Xle Gin Pha Asp Aii â âXs n* Gin Pro Gly Asp Ser 198 200 205 y Qly Pro Vai Vai Asn Gly Leu Gly Gl» Val Vâl Gly M6fc Asm Thr 210 215 220 Ala 3V3i-3 Sor Aap ASn phe Gin Leu Ser Gin Gly Gly Gin Gly Phe Ala 22Í 230 235 240 11* Pro Xle GXy Gin Alá Ket Ala Xle Ala Gly Glii l!e &rg ser Gly 245 250 2SS Gly Gly Ser Pro Thr Val His Tle Gly pro Thr A.ta Phe Leu Gly Leu 2M SS5 270 «Xy Vai Vai Aep Asn AjSXI Gly Asm Gly Ala Arg Val. Gin Arg Val Val 275 2S0 aes Gly Ser ,AXet Pro Ala Ala Ser Léu Gly xle Ser Thr Gly Asp Val II s .230 295 300 Thr Ma Vai Asp Gly Ala. pro n* Asn ser AXiàt Thr Ala Met. Ala Asp 20» 310 31$ 320 Ala Leu Asm Gly Bis Bis Pro Gly Asp Val Xle Ser Val Thr Trp Gin 323 3.3 8 335 Thr tys Ser fiily £3 s.y 340 Thr Arg Thr Gly Asn 348 Val Thr Léu Ala 350 Slu Gly

Pro Pro Ais 353

<210> 3 <211> 396 <212> ADN <213> Mycobacterium tuberculosis 45 <2 2 Ο >

<223> fragmento do terminal C de MTB32A Ral2 de 14 KD <220> <221> CDS <222> ((1)..(396) <223> Ral2 <4 0 0> acg cec gcg tcc gat aac ttc eag ctg tcc s*9 ggt 999 c»3 39* tte 48 Thr Ala Ala Ser Asp Asπ Phe Gin Leu Ser Gin Gly Gly Gin Gly Phe 1 ií 10 15 gcc stfc ceg a&c ggg çag gcg atg geg ate gcg ggc çag ate cga teg 90 AISl 11« Pto Ue Gly :GXn Ala Met Ala 13s Ala Gly Gin 11 e ftrg ser 20 25 30 SfSr* 993 993 tés ccc acc gtt cat ate 999 cefc acc gee ttc etc 144 Gly Gly Gly Ser Fr© Thr Vãl His Ile Gly Pro Thr Ala Phe leu Gly 35 40 45 ttg ggfc gtfc. gtc gac ase ase ggc ase ggc gea cga gtc caa ege gtg 1B2 Leu Gly Vai Vai Asp &sn Aso Gly Asa Gly Ala Arg Vai Gin Arg vai 50 SS 60 gtc SS9 agç 3« ecg geg gea age ccc ggc ate tcc acc ggc goc gtg 240 vai Giy ser Ala Pro Ala Ala ser Leu siy Ile ser Thr Gly Asp vai íiS 70 75 so ate açc 9cg gte gac ggc gcfc ecg ate aae fccg gee acc gcg atg 9Gg 2S8 Ilê Thr Ala Vai Agp Gly Ala Pro Ile Asa Ser Ala Thr Ala Hat Ala 85 30 05 9ey et t aac ggg cat cate ccc ggfc gac gte ate teg gfcg acc tgg 336 Asp Ala Leu Asm Gly His llis Pro Gly Asp Vai Ile Ser Vai Thr Trp XOO 105 110 ca a acc aag tcg ggc ggc scg cgt a ca §33 asc gtg aca fetg gee gag 384 Gin Thr Lya Ser Gly Gly Thr Atg Thr Gly Asn Vai Thr Leu Ala Glu US 120 125 gga esc ccg gce 306

Gly Pro Fro Ala 130 46

<210> 4 <211> 132 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <223> fragmento do terminal C de MTB32A Ral2 de 14 KD <400> 4

Thr 1: Ala Ala Ser Asp 5 Asn Phe Gin leu Ser 01« Gly Gly 10 Glh Gly Phe 15 Ala II® ΡΓΟ H® 20 Gly Ola Ala Hat Ala 25 ile Ala Gly Glft xu 30 Arg Ser Gly Gly Gly 35 Se r Pro Thr vai His 40 He Gly Pro Thr Ala 45 Fhe heu. Gly L£U Õly 50 V.al Val Assp Ase Asn SS Gly Asn oly Ala Arg val ú sl« Arg Vai Vai «5 Gly Ser Ala Pro Ala Ala Per Lao Gly He Ser Thr Gly Val so lie Thr Ala vai Aep :S5 Gly Ala Pro He Asa Ser 90 Ala Thr Ala Hat Ala SS Asp Alâ' .Leu Asa 100 0.1 y His His Pro GXy Í05 Asp Vai He Ser Val 110 Thr Trp Gin Sly Thr Pro 130 !>y§ 11:3 Pre Ser Ala 01 y Gly Thr Arg 120 Thr Gly ASO Val Thr 125 teu Ma GlV

<210> 5 <211> 702 <212> ADN <213> Sequência Artificial <2 2 0 > <221> CDS <222> (4)..(696) <223> polipéptido de fusão Ral2-DPPD <220>

<223> Descrição da Sequência Artificial: polipéptido de fusão Ral2-DPPD 47 <4Ο0> 5 cst atg est cac cat cac eafc CSC seg gee ceg tcc gat ase ttc oag 4 {5 ttet Sis sis HiS Sis His Hia Thr Alâ Ala Ser Asp Asn: Phe Gin 1 S 10 15 çtg tcc cag 93* 999 cag gga ttc gee atfe ceg ate SS9 cag ®e® atg PS IfÊU ser Gin Gly Gly Gin oly Phe Ala. Ile Pro lie Gly Gin Ala Met 20 25 30 gcg ate gcg 99 c «ag ate cga teg ggt 999 933 tea ccc acç 9tt cat 144 Ala Xle Ais Gly Gin Xle Arg Ser Gly Gly Gly Ser Pro Thr Vai Hls 35 40 4S .ate 99® cct ace gee ttc ctc gg c ttg ggfc gtt gtc gac aae aac 192 ti· Gly tro Thr ilA Phe Leu Gly Gly Vai Vai ksp A&n Asn Gly 50 55 m aae ggc gea ega gtc ege gtg gtc 999 age gct ecg gcg gea agt 340 As» Oly Ala Arg Vai Gin Axg Vai Vai Gly Ser Ala Pro Ala Ala Ser •6 S 70· 75 ctc 9Ψ- ate tcc; zcc 99C gac 8*9 ate aee geg gtc gac ggc gct ceg 369 Leu Oly n« Ser Thr Gly AíSp vai Xle Thr Ala Val Asp Gly Am Pro 60 85 90 9S ate aac teg gee acc 9-9 atg 309 gac 9P9 ctc SflO 999 cac cat ccc 336 Xle Asa Ser Ala Thr Ais Mac Ais Asp Ala Lea ASõ Gly MS His Pro .100 105 no S9t gac : eee ate teg 3¾ acc *99 c&a acc aaç teg S3C ggc «cg cgfc 304 Gly Agp Vai 'Xis. Ser Vai Thr Trp Gin Thr Lys ser Gly Gly Thr Arg US 220 133 aos 999 ase gtg aca fcfeg gee gsg gga cce ceg gc« gãã tta gac gac 432 Thr Gly ftsn vai Tfer Leu Ala Glu Gly Pro Pro Ala Glu Phe Αερ Asp 130 13 S 140 9·« gae aag gat CCS cce gac ccg cat cag eeg gac atg açg aaa ege 400 A:S.p Asp Lys Asp F Χ’ϋ Pro Asp FXO Mis Gin Pro ASp Met Tb.r Lye Gly 145 ISO 155 tat tgc ccg ggt ggc ega t m ggt ttt ggc gae ttg 0ce gtg tgc gac 526 Tyr Cys Pro Gly Gly Arg Trp Gly Fhe Gly Asp Leu Ala Vai Cys Asp 160 165 170 275 gge ms **S fcae ccc gac 9«c tes ttt *99 cac cag 693 atg caa acg 576 Gly Glu X>ys Tyr Pro Asp Gly Ser Phê Trp His Gl» Trp íiet Gin Thr ISO 105 190 *99 ttt see mc ecs cag tfct esc fctç gat tgfc gtc age ggc mt S«9 634 ττρ Phe Thr Gly Pro Gin phe Tyr Phe Asp Cys Vai Ser Gly Gly Glu iss 200 305 cce etc ccc ggc ccg ceg eca ccg 99* 99* tgc ggt 999 gea att ccg 672 Pro Leu Pto Gly Fro Pro pro Pro Gly Gly cye Gly Gly Ala 11o Pro 48 ηα

2 IS cfgcf cag CCC gct ççç. fcga gastte 702

Ser Ciu Gin Pro Aso Aí a Fr® 225 230

<210> 6 <211> 230 <212> PRT <213> Sequência Artificial

<223> Descrição da Sequência Artificial: polipéptido de fusão Ral2-DPPD <400> 6

Bis Bis Bis HÍS Bis His Thr Ala Ala Ser Asp Asn Phe 61 n Leu 1 5 10 15 Ser Glrv Civ- Gly «y Λ Gin Gly Phe Ala He 5« Pro He Cly Gin Ala **rt Met Ala Ufc Al.s Cl-/ * íí Oln Πδ Axg Ser cly ,*•3 Cly Gly Ser Pro Thr £ y vai His Ile 35 40 45 6iy Pr o Thr Ala Phe Leu Gly teu Gly ia.! Vai Asp Asn Asn Gly Asn 50 5S SC Cly Ala A.rg Vai niv Arg Vai vai Cly ser Ala Pro Ala Ala ser Leu. 65 70 75 00 Cly n% Ser Thr aly Asp vai Ile Thr Ala Vai Asp Cly Ala Pro n« as W ss Aeft. Set' Alh Thr Ala Mae. Ala Asp Ala Leu Asn Gly Bis Bi 3 Pro Gly 100 105 110 Asp Vai lie Ser vai Thr Trp Cio, i ·+% ή Thr Lys Ser Gly Cly 12 5 Thr Arg Thr ciy Asn 1 V& X Thr L«tt Ala Giu Cly Pro Pro Ala Glu Phe Asp Asp Asp 130 13 S 14 0 Asp Lys Asp Pro Pr© Asp •τ £ rt &XQ Bis CJií Prc Aísp •s ΠΚ Het Thr Lys Gly Tyr I sn Cys Pro Gly Gly Arg Trp Cly Phe Cly Asp A .PV Leu Ala Vai Cys .Asp .i. y y Cly ies 170 17? Cltt oys Pro hsp Cly Ser Phe Trp Ris Gin Trp M®t Gin Thr Trp ISO 1S5 ISO Thr 6ly Fro Sln Phe Tvr Pfce Mp Cys Vai Ser Gly Gly Glu Pro 135 200 205 Leu Pro Cly Pro Pro Pro Pro Gly Cly cys cly Gly A«*s He Pro Ser 210 215 220 61a Gin Pro ASti Ala Pro 225 230 49 <210> 7

<211> 1746 <212> ADN <213> Sequência Artificial <2 2 0> <223> Descrição da Sequência Artificial: fusão Ral2-WT1 <220>

<221> CDS <222> (4) .. (1740) <223> polipéptido de fusão Ral2-WT1 <400> 7 est «BC- 3- cãfc Bis C#C Cát His HÍS eae Hís 5 <sat RÍS cac Sis ãeg fcc The Ala gcg tçç Ala ser 10 «ae Asp ase ttc Phe cãg Gin 15 48 «tg tce esg ggt gfg eag gga ttc gee sfct ceg ato SiS eag: gcg àtg M Ser ais <My aiy 20 91« Gly Pfcc Ala Ue 25 Pr o He Gly tUn Ala 3« Het ge§ »tc gcg gge cag ãfce cfâ teg ggt 999 999 ecá cec aee gfet. cat 144 Ala He Alá Gly 91n 35 He &rg Ser Gly Qly 40 Gly Ser Pro Thr 45 V«i Mis «tc eet acc $CC tte ctc gçe ttg ggt gfcfc gtc gsc &&Ç ase gge 1S2 n« ely PtO ss ΤΪΪΧ Alá Pfre Leu eiy 5S Le« Gly Vai Vai Asp 60 ksn As» Gly aac 99c gea cqa gtç Sãã ege 9«Sf gtc ggg age gct ceg a«s gea agt 240 Asm «ly ala Arç> vai Ql« Ajrg 20 Vai Vál Oiy Ser Ala 75 Pró ÃXâ Alá Ser etc aae ate tcc acc «9* gae gtg άιΐί'ΐΐ 'âCÍSj! geg gtc gac 99= gct. ccg 366 Leu ΘΟ Cly Ile Ser Thr Oiy as Asp Vai n« xhx Ala Vai 50 Asp Gly Ala Pro ss ate teg gee ícc gcg atg g cg 9AC «cg ett aae 999 eat éãt CSC 31« lie ftSli ser Ala Thr 100 jftXs. Met Asp Ale 1SS5 Leu P.sn Gly Sis HÍ£í UD Pre 99= <3iy gac gte ate teg gtg aec ¢99 Cá* aee aac teg ggc ggc aeg egt 304 R&p Vt&l 11« sor U5 vai Thr Trp Gin Thr ISO l*ys Ser 9.1 y Gly 125 Thr Arg 50 432 aca ggg -aac gfcg aea ttg 9cc gag gga ecc ccg gee gsá tte ceg ctg Thr Gly Asn vai fhr Leu Alá Slu Gly Pr» Pr» Ala Glu Phe Pxq teu 13 0 13$ Í40 gtg ccg egc ggc ag<? ccg •afcg ggc tcc gac gtt cgg gac ctg sa c gea val Pcq Arg oiy ser Pro Met Gly Ser Asp Vai Arg Asp Lee Mn Ala HS ISO 1SS etg ctg ccg gcã gtt eeg tee ctg ggt. ggt ggfc 39t ggo tgc gea ctg Le« tett PtO Ala Vai Pro Ser Leu Sly Gly Gly Gly Gly Cys Ala Leu ISO 1δ5 1? 0 17S eeg gtt age cgt. gea gea aag: teu gct ccg gtt ctg gac tte gea cee Pro Vai Ser Gly Alã Ala Gin. Trp Ala Pro Vai Lsu Aap Phe Ala Pse 180 185 130 ccg ggt gc® tee §ea feae ggt tcc etg ggt ggt ccg gea ccg ccg ccg PTO Gly Ala Ser Ala Tyr Gly Sar Seu Gly Gly Pte Ala pre Pro Pr o m 200 SOS gc« ccg ccg ccg ccg ccg ccg ces reg ccg eac tcc tte ate aaa Cag Ala Pr* Pr» Pr O Pr o 210 Pro Pre Pr O 2:15 Pro Pra Hlo Set Phe xle 220 Lya Gin gas ccg age ígg ggt cot aS3í gca gaa ccg esc gaa gaa cag fcgc etg âgc Glu ím Ser Trp Gly Gly Ala G.lu Pr*, file Glu Glh Gin Cys Leu Ser 225 230' 23S gea tte are gtt cac tte tcc ggc eag tte act ggc aca ccc gga gee Ala Phe Thr Vai His phe Ser Gly C»íp Phe Thr Gly Thr Ala Gly Ala 240 245 250 25$ ígt rgc tac ggç ccc tte sgt ect ect ccg eee sgc cag geg t.ea tcc Cys Arg Tyx Giy Pro ph® Gly Pro Pro Pro Pro Sor ôl» Ala Ser Sar 260 345 27« ggc cag gee agg atg ttt eçfc a ao gcg ccc tac ctg ccc age tgc çtc 01y Gin Ala &rg Met phe Pr cs Asn Al a Prs> Tyr Leu Pr* Ser Cys Leu 2Ú 200 285 gag sge eag ccg gct att ege ssfc cag ggt tac age a cg gfce acc tte Glu Ser Gin Pro Ala 11« &rg hsíi ©Xs Gly Tyx Ser Thr Val Thr Phe 230 295 300 gac ggg acg ccc age tac ggt CáS: âCg ecc tçg caç eat geg um cag Asp Gly Thr Pm Ser Tyr Gly 8is The ΡϊΌ Sei' Hl® Kis Ala Ala Gin 305 310 315 tte eee aae cac tea tte aag eáfc. gag gat ccc atg ggc cag esg ggc Phe Pra Asse Ris Ser Phe Lys Hl 3 Glu Aep Prc mt Gly Gin Gin Gly 320 32S 330 335 teg cfcg ggt gag çag c&g tac fecg gtg ccg ecc ccg gte tat ggc tge Sex teu Gly clu Gin fâln Tyr Ser Vai Pro Prc Pm Val Tyr Gly Cys 340 343 350 cac acc CCC açc g&c age tgc &CC gfc age esc gct tftg ctg flEg agg His Thr Pr» Thr Asp Se?: Cys Thr Gly Ser gik Al» Leu Leu Lsu Arg 355 na 3SS 4 Μ $2@ 5?£ S24 672 720 7SS β$4 $12 3S0 1056 1! ΰ4 sis moa 51 SCg CC£f tíití age »g£ gae aát tta tac eaa atg aca tec cag ett gua 1152 Thr P«© Tyr 316 Ser Ser Asp Asn Leu Tyr sla tíet Thr Gl» Levt 01« :5?S 3S0 tge atg aee *99 a«.t esg arg aae ria 39* gee acc tta sag ggv CSC 1200 Cys wefc Thr T*F As π GÍís Het Aaa Leu Gly Ala Thr Le« Lys Gly Hís 3SS ara 999 tse 3*3 age 390 gat aaç cae aça *çg 19S ccc àCC etc tgc 33a 124 6 age Ser Thr Gly Tyr elu Ser ASp ASfi Sis Thr Thr Vro lie Leu Cys Gly 400 4Õ5 416 415 gce cas tsc *ga ata eac acg cac 39* gtc ttc aga ggc atfc cag 9*t 129« Ala 01« Tyr Arg lie Sis thr Sis Oly Vai Pha Arg Sly n« Gin Asp 426 426 410 9*3 ega cgt 9*9 ccfc 3ga gta gee ecg 3Ct ctt gta çqg *«9 9«* tet 2344 vai ftxg Arg Vai Pr© Gly Vai Ala pró Thr Leu Val Arg Ser Ala Ser 435 446 445 mg acc agt 9®§ aaa «9« CSC ttc atg tgt gct taç toa 39« Egç aat 1392 01« Thr Ser G.lw Lys Arg Pm Phe Set Cys Ala Tyr Ser Gly Cys As» 45-0 455 460 aag aga fcat fctt aag etg CSC eae tta eag atg câe age ag« aag cac 1440 Arg Tyr Phç Lys Leu. Ser His leu Glh •Met. 8ia Ser Arg Lys His 455 470 4?S act 93* gag etiiÈi cea t«c cág tgt gac ttc aag gac tgt 9*â cga *99 1485 Tbx Gly SXa Lye Pra Tyr Gin. Cys Aap Phe Lys Asp cys GXtt ATS Arg 4« 4SS •490 495 Cfct tfcfc egt tea gac £.$.% etc aaa aga esc ca a *99 ága eafc AC* 99* 1536 Pbe Phe Arg Ser Asp slíi Lfiíl Ly* Arg Hls 01« Arg Arg Hís Thr Gly soo SOS aio gtg <·ι«λ Ç'C«t ttc ca.g tgt çi.SSâ •set tgt esg çoá. •aag ttc tec Cgf tec 1584 Vai Lys Pr o Phe Gin Cys Lys Thr CVS - Gin. Aro Lys Phe Ser Arg ser 515 536 525 gj»e CSC ctg aag ace. CSC aec *39 aet cat aca f§* §m aag ccc etc 1.632 Asp H.is LííU Lyê Thr Kis Thr Ari Thr Bis Thr Gly GXu Lys Pare Phe 53·« SIS 540 age tgt «93 *93' eça agt tgt cag ssa ttt gee ege te: a 3* * gáã 16&0 Sêr Cys Arg Trp Pro Ser Cys Gm Lys Lys Phe Ala Arg Ser ASp Giu 545 550 555 ttà gfce ege cat eac aac atg çat cag aga aac afcg acc aaa ctc C39 1728 Leu Vai Arg Mis KÍB ítótt Mec Mia Gin Arg Asn. J4et Thr Lys Leu Gin 360 565 570 575 etg gcg qtfc tga gaat ic 1746 Leu Ala leu 52 <210> 8 <211> 578 <212> Sequência Artificial <223> Descrição da Sequência Artificial: polipéptido de fusão Ral2-WT1 <400> 8 fcet Ris Hisí Mis Pt is tiís Sis Thr Ala Ala ser Asp Asn Phe Gin Leu 1 $ 1® 15 Ser Glr. 01 y Giy Gls Gly Phe Ala i:le Pro lie Giy Qlsi Ala M£t Ala 20 25 3® Ile Ala Gly Gin Ue Arg Ser Gly Gly Gly Ser Pro Thr Vai His Xle Giy Pro .3 3' Thr Ala Phe Leu Gly * '•y Leu G.ly vai V8l ASp Asa Asn Giy Asn $£> 55 5® »iy Ala Arg vai Gin Ari Vai Vai 01 y Ser Ala Pro Ala Ala Ser Leu 70 75 éo Gly Ue Ser Thr Gly Asp Vai n« Thr Alá. Vai Asp oly Ala Pr© Ile 85 5® 05 Asn Ser ÍV1& Thr Alá Mét &lã .AJ&p· Ala teu Asn Gly Si a Ria Pr© Gly 300 105 UO ASp Vai 11 e Ser vai Thr Trp Gin Thr lys Ss.r Gly Gly Thr Arg Thr 115 120 125 01 y Asn Vai Thr Leu. Ala Glu Gly Pr© Pr© Ala Gin Phe Pr© Leu Vai 130 135 14® Pro Axf Gly Ser Pr© Het Giy Ser Asp Vai Arg Asp í*eu Asn Ala Leu UB ISO X35 14® Leu Pr© Ais Vai Pr© Ser Leu Gly Gly Gly Gly Gly Cya Ala Leu Pr© l.SS 170 17$ Vai Ser Gly A-Xês Ala Tip Ala Pro Vai Leu Asp Phe Ais Pro Pro 180 18S 15® Gly Ala Ser Ala Tyr Gly Ser Leu Gly Oly Pro Ala Pr© Pr© Pr© Ala 145 200 205 Fr o Fr© Fr© Pr© Pr© Pr© Pr© Pr© Pr© His Ser Phe l.le Lys Gin Glu 210 21§ 226 Pr© ser Trp Gly Gly Ala Glv Pr© His Glu GlU sln Cys Leu Ser Ala 225 230 235 246 Phe Thr Vai Hís Phe Ser Gly Gin Phe Thr Gly Thr Ala Giy Ala Cys 24:5 25® 255 Arg Tyr Gly Pro p.he Gly Pr© Pr© Pro Pr© Ser Gin Ala Ser Ser Gly 260 255 270 Gin Ala Ar.xj K«t Phe Pro ASn Ais Pro Tvr Leu Pr© Ser Cys Leu Gly 235 280 285 Ser Olrt Fr© Alá Ue Arg ÂSB Gin Gly Tyr Ser Thr Vai Thr Phe Asp 290 255 3C6 Cly Thr Pr© Ser Tyr Gly Hlé Thr Pr© Ser Sis Kis Ala Ala •CSXft Phe 305 310 315 320 Pro As© R.iS Ser Phe Lys His 61U Asp Pr© M8fc Giy Gin Gin Gly Ser 325 330 335 Leu Gly Glu Gin Gin Tyr Ser Vai pro Fr© Pr© vai Tyr Giy Cys Ris 340 345 350 Thr Pro Thr ÀÍSg Sei' Cya Thr Gly Ser Gin Ala Leu Leu Leu Arg Thr 355 M® 365 53

Pro Tyr Ser s«r Asp Asn Leu Tyr Gira Het Thr' Ser Gira Léu Giu Cys 370 375 380 Héfc Thr Trp Asra Gin Met Asra Leu Gly Ala Thr Léu Lys His SêJj 38$ 350 355 400 Thr Gly Tyr Qltt Ser Asp Asn HiS Thr Thr Pro Ué Leu Cys Gly Ala 405 410 415 Gira Ty.r Arg Xlé Mn Thr' li 8 Gly Vai Phe Arg Gly Ik Gira Asp Vai 420 425 4.30 &rg· Arg 71.1 pro Gly vai Ala PrO Thr Leu Vai Arg Ser Ala Ser Glu 43 5 440 445 Thr Ser Glii Lys Arg Pro Phe mt Cys Ala Tyr Ser Gly Cys Ases Lys 4.55 46Θ ftrg Tyr The Lys Léu Ser Mis Leu Gira Set His Ser Arg Lys His Thr 4 ÉS 470 475 480 ôiy Glu Lys Pro Tyr Gin Cys Asp The Lys Asp Cys Glu Arg A.rg 4 Phs P'he Arg Ser Asp Leu Lys Arg Jtis Gira Arg Arg His Thr Gly Vrál 5ÒÓ SOS 510 Lys Fto The cys Lys Thr cys Gin Arg Lys Phe Ser Arg Ser Asp sis 520 52 5 His PftU Lys Thr Sis Thr Arg Thr lis Thr Gly Giu Lys Pro The ser 53.0 S3S 540· Cy:s Arg Trp Pró Ser Cys Gira Lys Lys Phe Ala Arg Ser Asp Giu Leu S4$ SS0 SSS 560 Vai Arg 'Mis Sis Asn Met KÍ:S Gin Arg Asm «et. Thr Lys Lea Gin Leu 56S 570 575

Ala Lew

<210> 9 <211> 672 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220>

Ral2- <223> Descrição da Sequência Artificial: fusão de mamaglobina humana <220> <221> CDS <222> (4) . . (666) <223> polipéptido de fusão Ral2-mamaglobina humana < 4 0 0 > 9 54 cat »fcg- c«t cae êát cac cat eac açg gtc gog tee gat aae tte eag 45 Met His His Ris His Hi® His Thr Al.ã Aia Ser Asp Mo Phe Gin 1 s 20 15 ctg fccc cag ggt 339 esg 39» ttc gee att ceg ate «gg eag geg atg 9« Leu ser Gin Gly Gly Gla Giy ?he Ala lie Pro Ile Gly Gin Ala Met 20 35 30 gcg ate geg sgo cag ate ega teg 3$t $m ggg tc» ccc acc gtt cat 144 ÃXa lie Ai a Si y Gin lis Arg Ser Gly Gly Gly Ser Prô Thr Vai His 35 40 4:5 ate geg ççt ssce gea ttc etc gge ttç sgt gtt gtc §ac áac aac ggc 102 lie QXy Pr© Thr Ala Phã Leu Sly Lau «iy Vai Vai Asp Asií Asn Gly se 55 m aa.e ggc gea cg a gtc Cisa ege gfcg gtc gyg age gct ccg 9cg gça ogt 240 Asa. Gly Ais Arg Vai Gin Arg vai Vai eiy Ser Ala Pro Ala A λ a sor 65 70 75 cte 99 c ate fccc &cc ggc gac 9*9 ate aec ftg gtc gac ggc gcfc ccg 2SS Leu Gly n« Ser Thr Gly Àsp Vftl lis Thr Aía Vai Asp Giy Ala Pro 80 SS $ϋ 05 ate aae teg gee acc gcg *tg gcg gae geg ctt aac cat eat ccc 226 He AjSH Ser Ala Thr Ala Hat Ala Aep Ala L«u Asm Gly His His Pro 100 105 210 9St gee gtc ate teg gtg aee tgg eaa aec aag tCf ggc ifc a cg cgfc 384 «ly Αβρ vai Ile Ser Vai Thr Trp Gin Thr Lys Ser Oly Giy Thr Arg Π5 120 12 S BCâ gqq a&e §’i aea ££q: gee gag 33» ccc ccg gee gaa ttc ate gag %32 Thr tSly Asa 130 vai t:n· Leu AI& elu 13 S Gly ?rç P£P hl A Oiu 14 0 Ph« Hó Glu qga agg 9<|£ tet. ggc fcgC eec tfca ttg gag aat 9 &9 att fecc aag aça 4G0 61 y Arg Úy Ser Gly eyg Pro Leu Leu Glu As» v&i rie Ser Lya Thr .145 150 1S5 ate asfc CCS eaa gtg tet aag aefc gaa t.ac aaa gaa ctt ctfc caa 94g 520 Ile AS» Pm Gin Vai Ser Lys Thr Glu Tyr Lys 01 u Leu Leu 61» Giu 160 165 100 175 ttc ata gae gac aat gee dCt asa aat gee ata gat çaa ttg áag gaa §76 Phe ik ASO A^jp· Asn Alá Thr Thr Acfí- Αϊδ Ile Aap Glo Leu Lyb Glu 180 1U 150 tgt ttt ctt aac eaa acg gat goa act etg age aat gtt 9ag 9tg ttt 624 Cys £%e Leu Ase Gin Thr ASp 81.U Thr Leu Sor Α9Π V.si Glu Vai Phe 2Sâ 200 205 âhã eãâ tta ata tàfc SâC *gc agt ctt tgt gat tra ttt taa gaatte £72 M«fc Q.ln Leu .Ue Tyr A*p Ser Ser Leu Cys Aep Leu í%<3 210 21S 220 55

<210 > 10 <211> 220 <212> PRT <213> Sequência Artificial fusão <223> Descrição da Sequência Artificial: polipéptido de Ral2-mamaglobina humana <400> 10

Met Bi o His Mis Kis Ki® Ki» Thr Ala Ala Ser Asp Asa. The Gin Leu X S 1¾ 15 Ser GX» Cly Gly ε^Χϊϊ Gly Phe A.U Os Pro 11« Gly Gin AI-& «et Ala 20 25 30 lie Ala Gly Xle Ãrg Ser Gly Gly Gly Ser Pro Thr Vai 5$ is Ile 35 40 45 Gly Thr ÁI.-3. mm Leu Gly Leu Gly Va.l Vai Asp Asn Asn Gly Aon se SS 60 Gly Ala Arçf Val Gin A*Sf Vai Vâl Gly Ser Pro Ala Ala Ser Leu IS 70 75 80 Gly He Ser Thr Gly Asp vai He Thr Ala Vai Asp Gly Ala pro ile IS se 95 &sn Ser' Ala Thr Ala ííefc A3.5. Aep Ala Leu Ase Gly lis lis Pro Gly 100 105 no ASp 'Vai He ser Vai Thr Trp Gin Thr Lys Ser Gly Gly Thr Arg Thr U5 1¾¾ 125 Gly Asn Vai Thr Leu Ailst Gl» Gly Pro Pro Ala Giu The Ile Clu Gly ISO 135 140 Arg GXy Ser Gly Cys Pr o Leu Leu Glu As rf vai Ile Ser Lys Thr ile us ISO 155 160 Asn Pro Gin. Vãl Ser t.ys Thr GÍ.U Tyr Lys Glu Leu Leu Gin Glu Pbe 165 170 175 Ile Asp Asp Aêií Ala Thr Thr Asn Ala Ile Asp Giu Leu Lyis 6lu Cys 180 165 150 Phe Leu Asa dl IS. Thr Asp Glu Thr Leu Ser Ase Vai Giu Vai. Phe Met 195 200 2 0 S JL Γΐ Leu Ile Tyr A$p Ser Ser Leu cys Asp Leu The 210 215 220

<210> 11 <2ll> 2191 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> 56

H9-32A <223> Descrição da Sequência Artificial: fusão Ral2-(fusão Ral2-MTB39-MTB32A(N-ter)) <220>

<221> CDS <222> (1) .. (2190) <223> polipéptido de fusão Ral2-H9-32A (Ral2-MTH32A(N-ter)) <400> 11

atg eat eac eat cac eat câe aeg: geC gcg tee gat aac tte eag ctg M*t MiS MiS MÍS His BiS Bis Thr Ala Ala ser Aap Asa phe Gin X<eti X 5 10 15 tcc cag ggt ggg *«9 ss* tte gee att çcg ate ggg Cag gcg **f gcg Sar Gin Gly Cly Gla Gly Phe Ala llé Prô íle 01 y Gla Ala «et Ma 20 25 30 ate 9CS SSC tag ate cga teg ggfc ggg ggg tc* ccc ace gtt cafe ate ile Alâ dXy ·5ΐ.ΐΐ. rle àrg Ser Giy Gly Gly Ser Pro Thr Vâl His Ile 3S 40 4S 939 cet aee gee tte etc mc '-'a ggt gtfc etc gae aac ggc aac fâly Pr© Thr Ala PH© Leu Gly Lsu Gly vai vai Asp Ase. Asa Giy Asn so ss gge 9C8 ega gtc eaa ege gtg gte ggg age get ccg gcg gea agt etc Oly Ala. &rg Vai Gin Arg Vai vai Gly ser Ala. Pro Ala Ala Ser Leu ss 7» 75: 80 99c ate tcc aeC ggc gac gtg ate aec gcg gte gae ggc gcfc erg ate «ly 11 e Ser Thr Gly Asj> vai Ufi Tkt“ Ala. Va.I Asp Giy Ala Pr© 11a as so 85 aae teg gee ace geg atg gcg gsc gcg cfct. aac ggg eat cat tcc ggfc Asn Ser Alã Thr Ala Met Ala Aep· Ala Lee Asn. Gly His His Pr© Gly ICC 105 110 gae etc ate teg gteg scc tgg eaa acc aag teg ggg fie acg cgt aea Atp Vai liê Ser Vai Thr Trp Gla Thr hysí Ser 0'íy Gly Thr Arg Thr XIS 1» 125 SâC <3*9 SCS ttg gçe gag gga çee eeg gee g«*. tte atq gtg gat. G.ly vai th* l»eu Ala Gltt Gly Pre Pr* Ala Gle Phe «et Vai Asp 130 135 14 S 48

OS 144 192 240 288

3.3 S 334 57 432 fcfce ssss fcfca cca ceg gag ate ase tee gcg sgg atg tae gee 99« 4 ao Pb»* Gly Ala teu Prs &*© Gltó 11 e Asn Ser .Ala Ara Met Tyr Ais Gly 145 ISO 1:55 im ccg 99» *«9 gcc fcçg etg Sfcg fCC: gcf gct; cag atg tgg gac age gtg .526 Fr© 61y Ser Ala Ser Leu Vai Aí a. Ala Ala ata Mefe Tlrp Aep Ser Vel 165 170 175 gcg a«t. 9** ctg tt.t t«9 gee 909 teg g«g ttt cag 9*9 gtc tgg S'76 Ala ser Aep Leu Ptee Ser Ala Ala Ser Ala Fhe GÍB Ser Vai Vai Txp ISO 105 i m ggt ©tg s. cg gtg SS® teg tgg ara ggt teg teg gcg ggt ctg atg gt.g 524 eiy teu Thx Vai Gly Ser Trp lie siy Ser ser Ala Gly L«a «et Val 195 200 205 geg 9C8 gcc tcg ecg tat gtg gcg tgg atg ag« gtc aee ««3 999 cag 673 Ma :M% Ala Ser Pr© fyr vai Ma Trp «et ser Vai Tfer Ala Gly aio 210 ais 220 »e» ga#· efcg ace gec gee: sãg gtc e«s gtr. gct. gcg se® g©c fcae 720 Ai* Mu Leu TM: Ala Ala. Gin Vai Arg Vai Ala Ala Ala Ale Tyr oitt 225 23C 335 240 aeg S<-9 tfit fSS ctg aeg gtg eee: ceg sts etc ge:ç 969 aac egte 1S$ Tbr Ala Tyr Gly L«u TM Vai fro Fra í>re Vai lie Ala Glu Asm Arg 245 2SC 255 gct etg Mg ate etg ata 9 cg scc &aC: «te fctg ggg esa aae icc 516 Ma Mu Lau Hat Me teu ílfi Aís Thr A*n ieu Leu Gly Sln A*tt Thr ISO 2SS 270 çcg 9cg *te §m gte aac gag gee gaa t*e gge gag atg t®9 g«c das 864 ftro Alá Jie Ala Vai Asm Giu Al-a Gltt Tyr «iy Qi« Wet Trp Ala Gla 275 zm ns 58 g ac Asp gee Ala 290 gee Ala gcg Ala atg Met ttt Phe 93'e Gly 295 tac Tyr gee Ala gcg Ala gcg Ala acg Thr 300 gcg Ala acg Thr gcg Ala acg Thr 912 gcg Ala 305 acg Thr ttg teu ctg teu ccg Pro ttc Phe 310 gag Glu 9*9 Glu gcg Ala ccg Pro gag Glu 315 atg Met aee Thr age Ser gcg Ala ggt Gly 320 960 999 etc Gly Leu etc teu gag Glu cag Gin 325 gee Ala gee Ala gcg Ala gtc gag Val Glu 330 9*3 Glu gee Ala tcc ser gac Asp aee Thr 33S gee Ala 1008 gcg Ala gcg Ala aac Asn cag Gin 340 ttg teu atg Met aac Asn aafc Asn gtg Val 345 cee pro cag Gin acg Ala ctg Leu caa Gin 350 cag Gin ctg Leu 1056 gee Ala caq, Gin ccc Pro 355 acg Thr cag Gin ggc Gly aee Thr acg Thr 360 cct Pro tet Ser ccc Ser aag Lys ctg Leu 365 ggt Gly ggc Gly ctg Leu 1104 «99 Trp aag Lys 370 acg Thr gtc Vai teg Ser ccg Pro cat His 375 egg Arg teg Ser ceg Pro ©te Ile age Ser 380 aac Asn atg Met gtg Val «cg Ser 1152 atg Met 385 gee Al a aac Asn aac Asn cac Mis atg Met 390 teg Ser atg Met aee Thr aac Asn teg Ser 395 991 Gly gtg Val teg Ser a«9 Met aee Thr 400 1200 aac Asn aee Thr ttg teu age Ser teg Ser 405 atg Met ttg Leu aag Lys S9C Gly ttt Phe 410 gct Ala ccg Pro gcg Alá gcg Ala gee Ala 415 gee Ala 124 8 c*9 Gin gee Ala gtg vai caa Gin 420 aee Thr gcg Ala gcg Ala caa Gin aac ggg Asn Gly 425 gtc val egg Arg gcg Ala atg Met 430 age Ser teg Ser 1296 ct.g ggc teu Gly age Ser 435 teg Ser ctg Leu 99ft Gly tet Ser teg Ser 440 ggt ctg Gly Leu ggc Gly ggt Gly ggs Gly 445 gtg val gee Ala gee Ala 1344 aac Asn ttg Leu 450 ggt Gly egg Arg Seg Ala gee Ala teg Ser 455 qtC Val ggt teg Gly Ser ttg Leu teg Ser 460 gtg Val ccg Pro cag Gin gee Ala 1392 «99 Trp 465 gee Ala gcg Ala gee Ala aac Asn cag Gin 47 0 gea Ala gtc val açq Thr ccg Pro gcg Ala 475 gcg Ala egg Arg gcg Ala Ctg Leu ccg Pro 480 1440 etg teu aee Thr age Ser ctg Leu aee Thr 405 age Ser gee Ala gcg Ala gaa Glu aga Arg 490 399 Gly ccc Pro 399 Gly cag Gin Met 455 ctg Leu 1488 ggc ggg ctg Sly Gly teu ccg Pro 500 Stg Val 993 Gly cag Gin atg Met ggc gee Gly Ala 505 agg Arg gee Ala ggt Gly 99« Gly 510 999 Gly cte Leu 1S36 age Ser ggt gtg Gly Vai 515 ctg teu cgt Arg gtt Val ccg Pro ccg Pro 520 cga Arg ccc Pro tat Tyr gtg Val atg Met 525 ccg Pro cat His tet Ser 1584 59 ccg gea gcc ggc gat ate gcc ccg ccg gcc ttg teg cag gac cgg ttc 1632 Pro Ala Ala Gly Asp He Ala Pro Pro Ala Leu Ser Gin Asp Arg Phe 530 535 540 gcc gac ttc cec gcg ctg ccc etc gac ccg tcc gcg ata gtc gcc caa 1680 Ala Asp Phe Pro Ala Leu Pro Leu Asp Pro Ser Ala Mefc Val Ala Gin 545 $50 555 560 gtg ggg oca cag gtg gtc aac ate aac acc aaa ctg ggc tac aac aac 1728 Val Gly Pro Gin val Val Asn He Asn Thr Lys Leu Gly Tyr Asn Asn 565 57 0 575 gcc gtg ggc gcc agg acc ggc ate gtc ate gat ccc aac ggt gtc gtg 1776 Ala Val Gly Ala Gly Thr Gly Ile Val Ile Asp Pro Aen Gly val Val 580 585 590 ctg acc aac aac cac gtg ate gcg ggc gcc acc gac ate aat gcg ttc 1824 Leu Thr Asrx Asn Bis Val 11« Ala Gly Ala Thr Asp Ile Asn Ala Phe 595 600 605 age gtc ggc tcc ggc caa acc fcae ggc gtc gat gtg gtc ggg tafc gac 1872 Ser Val Gly Ser Gly Gin Thr Tyr Gly Val Asp Val Val Gly Tyr Asp 6X0 615 620 ege acc cag gat gtc gcg gtg ctg cag ctg ege ggt gcc ggt ggc ctg 1920 Ara Thr Gin Asp Val Ala Val Leu Gin Leu Arg Gly Ala Gly Gly Leu 62 5 630 €35 640 ccg teg gcg gcg ate ggt ggc ggc gtc gcg gtt ggt gag ccc gtc gtc 1568 Pro Ser Ala Ala He Gly Gly Gly Val Ala Val Gly Glu Pro Val Val 64 5 65 0 655 gcg atg gge aac age ggt 999 cag ggc gga acg ccc cgt gcg gtg ccfc 2015 Alâ Mefc Gly Asn Ser Gly Gly Gin Gly Gly Thr Pro Arg Ala val Pro 660 665 670 ggc agg gtg gfcc gcg etc ggc caa acc gtg cag gtg teg gat teg ctg 2064 01 y Arg Val Val Ala Leu Gly Gin Thr Val Gin Ala Ser Asp Ser Leu 675 680 685 acc ggt gcc gaa gag aca ttg aac 539 ttg ate cag ttc gat gcc gcg 2112 Thr Gly Ala Glu Glu Thr Leu Asn Gly Leu lie Gin Phe Asp Ala Ala 690 695 700 abc cag cec ggt gat teg ggc 999 ccc gtc gtc aac gge cta 99a cag 2160 lie Gin Pro Gly Asp Ser eiy Gly Pro Val Val Asn Gly Leu Gly Gin 705 7X0 715 720 gtg gtc ggt atg aac acg gcc 9cg tcc tag 9 2191 Vai Val Gly «et Asn Thr Ala Ala Ser 725 73 £5 60

<210 > 12 <211> 729 <212> PRT <213> Sequência Artificial <223> Descrição da Sequência Artificial: polipéptido de fusão Ral2-H9-32A (polipéptido de fusão Ral2-MTB39-MTB32A(N-ter)) <400> 12

Met 1 His His His His 5 His His Thr Ala Ala 10 Ser Asp Asn Phe Gin 15 Leu Ser Gin Gly Gly 20 Gin Gly Phe Ala Ile 25 Pro Ile Gly Gin Ala 30 Met Ala Ile Ala Gly 35 Gin Ile Arg Ser Gly 40 Gly Gly Ser Pro Thr 45 Val His Ile Gly Pro 50 Thr Ala Phe Leu Gly 55 Leu Gly Val Val Asp 60 Asn Asn Gly Asn Gly 65 Ala Arg Vai Gin Arg 70 Val Val Gly Ser Ala 75 Pro Ala Ala Ser Leu 80 Gly Ile Ser Thr Gly 85 Asp Val Ile Thr Ala 90 val Asp Gly Ala Pro 95 tle Asn Ser Ala Thr 100 Ala Met Ala Asp Ala 105 Leu Asn Gly His His 110 Pro Gly Asp Vai Ile 115 Ser Val Thr Trp Gin 120 Thr Lys Ser Gly Gly 12S Thr Arg Thr Gly Asm 130 Vai Thr Leu Ala Glu 135 Gly Pro Pro Ala Glu 140 Phe Met Val Asp Phe 145 Gly Ala Leu Pro Pro 1.50 Glu lie Asn Ser Ala 155 Arg Met Tyr Ala Gly 160 Pro Gly Ser Ala Ser 165 Leu val Ala Ala Ala 17 0 Gin Met Trp ASp Ser 175 Val Ala Ser Asp Leu ISO Phe Ser Ala ai a Ser 185 Ala Phe Gin ser vai 190 val Trp Gly Leu Thr 195 val Gly ser Trp Ile 200 Gly Ser Ser Ala Gly 205 Leu Met val Ala Ala 210 Ala Ser Pro Tyr Val 215 Ala Trp Met Ser Val 220 Thr Ala Gly Gin Ala 225 Glu Leu Thr Ala Ala 230 Gin Val Arg Val Ala 235 Ala Ala Ala Tyr Glu 240 Thr Ala Tyr Gly Leu 24S Thr Val Pro Pro Pro 250 Val Ile Ala Glu Asn 255 Arg Ala Glu Leu Met 260 Ile Leu Ile Ala Thr 265 Asn Leu Leu Gly Gin 270 Asn Thr Pro Ala Ile 275 Ala Val Asn Glu Ala 280 Glu Tyr Gly Glu Met 285 Trp Ala Gin Asp Ala 290 Ala Ala Met Phe Gly 295 Tyr Ala Ala Ala Thr 300 Ala Thr Ala Thr Ala 305 Thr Leu Leu Pro Phe 310 Glu Glu Ala Pro Glu 315 Met Thr Ser Ala Gly 320 Gly Leu Leu Glu Gin 325 Ala Ala Ala Val Glu 330 Glu Ala Ser Asp Thr 335 Ala 61 Aía Ala Asn Gin Leu Met Asn Asn Val Pro Gin Ala Leu Gin Gin Leu 340 345 350 Ala Gin. Pro Thr Gin Gly Thr Thr Pro Ser Ser Lys Leu Gly € »iy Leu 3-55 360 365 Trp Lys Thr Vai Ser Pro His Arg Ser Pro Ile Ser . Asn Met Val Ser 370 375 330 Met Ala ASn Asn His Met Ser Met Thr Asn Ser Gly val ser Met Thr 385 390 395 400 Asn Thr Leu Ser Ser Met Leu Lys Gly Phe Ala Pro Ala Ala Ala Ala 405 410 415 Gin Ala vai Gin Thr Ala Ala Gin Asn Gly Val Arg Ala Met ser Ser 420 425 430 Leu Gly Ser Ser Leu Gly Ser Ser Gly Leu Gly Gly Gly ' Val Ala Ala 435 440 445 Asn Leu Gly Arg Ala Ala Ser Val Gly Ser Leu Ser Val ! Pro Gin Ala 450 455 460 Trp Ala Ala. Ala Asn Gin Ala Val Thr Pro Ala Ala Arg Ala Leu Pro 465 470 475 460 Leu Thr Ser Leu Thr Ser Ala Ala Glu Arg Gly Pro Gly Gin Met Leu 465 490 495 Gly Gly Leu Pro val Gly Gin Met Gly Ala Arg Ala Gly Gly Gly Leu 500 505 510 Ser Gly Vai Leu Arg Val Pro Pro Arg Pro Tyr val Met Pro His Ser 515 520 525 Pro Ala Ala Gly Asp Ile Ala Pro Pro Ala Leu Ser Gin Asp Arg Phe 530 535 540 Ala Asp Phe Pro Ala Leu Pro Leu Asp Pro Ser Ala Met Val Ala Gin 545 550 555 560 Vai Gly Pro Gin Val Val Asn Ile Asn Thr Lys Leu Gly Tyr Asn Asn 565 570 575 Ala Vai Gly Ala Gly Thr Gly Ile Val Ile Asp Pro Asn Gly val val 500 585 590 Leu Thr Asn Asn His Val Ile Ala Gly Ala Thr Asp Ile Asn Ala Phe 595 600 605 Ser Vai Gly Ser Gly Gin Thr Tyr Gly Val Asp Val Val Gly Tyr Asp 610 615 620 Arg Thr Gin Asp Val Ala Val Leu Gin Leu Arg Gly Ala Gly Gly Leu 625 630 635 640 Pro Ser Ala Ala íle Gly Gly Gly Val Ala Val Gly Glu Pro Val Val 645 650 655 Ala Met Gly Asn Ser Gly Gly Gin Giy Gly Thr Pro Arg Ala Val Pro 660 66 5 670 Gly Arg Vai Vai Ala Leu Gly Gin Thr Val Gin Ala Ser Asp Ser Leu 675 680 685 Thr Gly Ala Glu Glu Thr Leu Asn Gly Leu He Gin Phe Asp Ala Ala sso 695 700 lie Gin Pro Gly Asp Ser Gly Gly Pro Val Val Asn Giy Leu Gly Glu 705 710 71S 720 Vai Vai Gly Met Asn Thr Ala Ala Ser 725 62 <210 > 13

<211> 51 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador de

oligonucleótido para amplificação por PCR do fragmento do terminal C de MTB32A <400> 13 caattacata tgcatcacca tcaccatcac acggccgcgt ccgataactt c 51

<210> 14 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador de oligonucleótido 3' para amplificação por PCR do fragmento do terminal C Ral2-C de MTB32A < 4 0 0 > 14 33 ctaatcgaat tcggccgggg gtccctcggc caa

<210> 15 <211> 48 <212> ADN <213> Sequência Artificial 63 <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador de

oligonucleótido 5' contendo o sitio de reconhecimento da enterocinase para amplificação por PCR da forma segregada madura de DPPD <400> 15 caattagaat tcgacgacga cgacaaggat ccacctgacc cgcatcag 48 <210> 16 <211> 33

<212> ADN <213> Sequência Artificial <2 2 0 > <2 2 3> Descrição da Sequência Artificial: iniciador de

oligonucleótido 3' contendo o sitio de reconhecimento da enterocinase para amplificação por PCR da forma segregada madura de DPPD < 4 0 0 > 16 caattagaat tctcagggag cgttgggctg ctc 33

<210> 17 <211> 30 <212> PRT <213> Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Descrição da Sequência Artificial: polipéptido Ral2(curto) 64 <4 Ο 0> 17

Thr Ala Ala Ser Αερ Asn Phe Gin 1 5 Ala Xle Pro Ile Gly Gin Ala Met 20

Leu Ser Gin Gly Gly 10 Ala Ile Ala Gly Gin 25

Gin

Ile 30

Gly Phe 15

<210 > 18 <211> 128 <212> PRT <213> Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Descrição da Sequência Artificial: polipéptido Ral2(longo) < 4 0 0 > 18

Thr Ala Ala Ser Asp Asn Phe Gin. Leu Ser Gin Gly Gly Gin Gly Phe 1 5 10 15 Ala Ile Pro Ile Gly Gin Ala Met Ala Ile Ala Gly Gin lie Lys Leu 20 25 30 Pro Thr Vai His Ile Gly Pro Thr Ala Phe Leu Gly Leu Gly Val Val 35 40 45 Asp Asn Asn Gly Asn Gly Ala Arg Vai Gin Arg Vai Vai Gly Ser Ala so 55 60 Pro Ala Ala Ser Leu Gly Ile Ser Thr Gly Asp Val Xle Thr Ala Val ¢5 70 75 eo Asp Gly Ala Pro Ile Asn Ser Ala Thr Ala Met Ala Asp Ala Leu Asn 85 90 55 Gly His His Pro Gly Asp Vai Ile Ser Vai Thr Trp Gin Thr Lys Ser 100 105 110 Gly Gly Thr Arg Thr Gly Asn Vai Thr Leu Ala Glu Gly Pro Pro Ala 115 120 125 65 <210 > 19

<211> 33 <212> ADN <213> Sequência Artificial <2 2 0> <22 3> Descrição da Sequência Artificial: iniciador de oligonucleótido 5', sitio HindIII, para amplificação por PCR da mamoglobina humana < 4 0 0 > 19 gcgaagctta tgaagttgct gatggtcctc atgc 34

<210> 20 <211> 36 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: iniciador de oligonucleótido 3', sítio Xhol, para amplificação por PCR da mamoglobina humana <400> 20 cggctcgagt taaaataaat cacaaagact gctgtc 36

<210> 21 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência Artificial 66 <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: Met-His tag 6aa < 4 0 0 > 21

Hat His His HiS His His His I 5

<210> 22 <211> 4 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: sitio de reconhecimento de enterocinase <400> 22

Asp Asp Asp Lys 1

Lisboa, 16 de Maio de 2007 67

Claims (8)

1. REIVINDICAÇÕES Método para. a expressão estável e rendimento elevado de um polipéptido heterólogo recombinante, o método compreendendo expressar, numa célula hospedeira, uma molécula de ácido nucleico recombinante que codifica um polipéptido de fusão, compreendendo o polipéptido de fusão um polipéptido Ral2 e um polipéptido heterólogo, em que o polipéptido Ra .12 é codificado por uma sequência de polinucleótido Ral2 que híbrida com uma sequência complementar à SEQ II) N° :3 em condições de restringência e em que a sequência de polinucleótido Ral2 está localizada a 5' da sequência do polinucleótido heterólogo que codifica o polipéptido heterólogo, Método de acordo com a reivindicação 1, em que o polipéptido de fusão compreende ainda uma etiqueta de afinidade que está ligada ao polipéptido de fusão. Método de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, em que o polipéptido de fusão é purificado a partir da célula hospedeira. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que a célula hospedeira έ E. coli. Método de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4, em que a molécula de ácido nucleico recombinante compreende ainda uma sequência de polinucleótido que codifica, um péptido ligando entre a sequência de polinucleótido Ral2 e a sequência de polinucleótido heterólogo. 1
2. 6, Método de acordo com a reivindicação c, em que c 5 péptidO ligando co: mpreende um sítio de clivagem. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a sequência de ácido nu cl ei co heterólogo codifica um DPPD, um. WT1, uma mamoçlobina ou um polipéptido B9-32A. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que a sequência de polinucleótido Ra 12 compreende peio menos, 30 nucleótidos. Método de acordo com a reivindicação 8, em que a sequência de polinucleótido Ra 12 compreende, peio menos, 60 nucleótidos,
3. 10, Método de acordo com a reivindicação 8, em que a sequênc! de polinucleótido Ra 12 compreende, pelo menos, 10 nucleótidos, 11. :V;f- tod.O de 5. •V Γ\ rdo com qu alque: 10 , em o;n e 3. sequênc: ia de po po 1 ipép 3 o Ra 1.2 como apr :esent 12. |V;3 todo de 3. p Γ\ rdo com qu alque: 10 , em. qu e 3. sequênc: ia de po po I ipép 3 o Ra 1.2 como apr :esent 13. ]V'!' c.'. todo de 3 p Γ'χ rdo com qu alque: 10 , em c [ue a sequê: P r ~\ a de ap resen 3 o na r\ τη 1 JJ N° : 3, r uma das reivindicações 1 a linucleótido Ra.12 codifica um ado em SEQ ID N°:17. t uma das reivindicações 1 a linucleótido Ra.12 codifica um ado em SEQ ID N°:18. r uma das reivindicações 1 a oolinucleótido R.al2 é como 2
4. 14, Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, em. que a sequência de polinucleótido Ral2 codifica um polipéptido Ra 12 como apresentado em SEQ ID N° :4 ou uma variante possuindo, pelo menos, 30% de identidade de sequência de aminoácidos com esta,
5. 15, Método de acordo com a reivindicação 14, em que a sequência de polinucleótido Ral2 codifica um polipéptido Ra .12 como apresentado em SEQ ID N° :4 ou uma variante possuindo, pelo menos, 35% de identidade de sequência de aminoácidos com esta „
6. 16, Método de acordo cora qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que o polipéptido Ra!2 compreende, pelo menos, 10 aminoácidos,
7. 17, Método de acordo com a reivindicação 16, em que o polipéptido Ra12 compreende, pelo raenos, 30 aminoácidos.
8. 18, Método de acordo com a reivindicação 1.6, em que o polipéptido Ra12 compreende, pelo raenos, 100 aminoácidos. 1.9, Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em qut s o polipéptido Ra 12 possui uma sequência como apresentado na SH!0 ID N°mL 20, Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em quç s o polipéptido Ra 12 . . .1 . . ,Ί --· .-s -.-1-. i Λ -! <“» possui uma sequência como apresentado na SiQ Π) N°:17, 3 Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que o poiipèptído Ral2 possui uma sequência como apresentado na SiQ Π) N°:18, Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21 f compreendendo ainda o método clivar o polipéptido de fusão entre o polipéptido Ral2 e o polipéptido heteróiogo. Utilização de uma sequência de polinuoleótido Ral.2 que híbrida com uma sequência complementar à SEQ II) N°:3 em condições de restringência, num método para a expressão estável e rendimento elevado de um polipéptido heteróiogo recorabinante, compreendendo o método expressar, numa célula hospedeira, uma molécula de ácido nucleico recombínante que codifica um polipéptido de fusão, compreendendo o polipéptido de fusão um polipéptido Ral2 codificado pelo referido polinuoleótido Ral2 e um polipéptido heteróiogo, em que a referida sequência de polinucleótido Ral2 está localizada a 5' da sequência de polinucleótido heteróiogo que codifica o polipéptido heteróiogo. Lisboa, 16 de Maio de 2007 4 1/12 5ftCTlkCGtí6CTOTASAAAftATCCTS0CSCCCGGRCCCTTAA0GCTSGGRCAATTTCTSATAClCTRCCCC5ACRCftGGBGGTTftCCKiGATGAGCA I J.-SO-Í f------ M S 95 ATTCSCCCCaCCeCTCftCTCAGGTGeTm-Ge?fGCTÕRGC5TCCTGSCTGCCG?CGGGC?GGCCCTGCCCAC5‘5C5CCGSCCCÃ35CSeCCCCG ___________,»T„-v____SEQUÊNCIA SINAL ---------—--------------PTB32A HSRRaSLR*S»Í.I,SV3<AftVSI,51ATA?RQftAí l 90 ÇCGC^CTITGTCecAGCsACC^rrC^CCSKCTTCCCCGCeCTGCCCCrCGACCCStCÇGCGATGGíCGCCCSAGTGGGeCCACfeGGXGCírCAACM· -— ------— -------------------------MT9322A—......—........—.... e A L SQOSfAOFPALPiO^SAMVACVGPQVVRI CAACACCSftACTGGSCTACAAC/ACGCCGTSGGCSCCGSGftCCGGCAtCGTCATC-GAírCCCftSCSGTCtCGTGCrSACCAACRSCCACGTGATCG ----—------------—-.............ΚΪΒ322Α——--------------------------——— B T K t G Ϊ S N A V 6 S G T G I V 7 D ? 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CCGGGCGWCTTCGACGCCAGCGCGGACGGITCCGGCGATCTGCGÇGGACtCAfCGMÍCflCCTCCiACTACCTGCAGTGGCTTStSCATCiytCTGCA TCTGGTTGCCGCCGTTCTACGACTCCCCGCTGCGCGACGGCGGTTACGRCATTCGCGACTTCTACAAGGTGCTGCCCGAATTCGGCACCGTCSAÇ GATWCGTCGCCCTGGKGACGCCGCTCACCGGCGAGG?ftTGCGCATCATCACC6ACC!fGG?6A?GAATCACACCTCGGAGTCECACGCCTSGTT TCReeAeKCCGCCCCGACCCAGACGGACCGtACeeTaAÇTATTACWreteSAGCGACACCAGCGAGCGCTACACCGACGCCCGGATCATCXTCG Ta^CACCCH^AGTOTMCTeetCATTCSATCCTGTCCeCCCACAGTTCÇACSGeCACCGATCCTT 855 950 1045 1143 123^ 1330 1425 1520 1615 1710 1805 1372 FÍG, 1B. 3/12 ÃCGSCCGCGTCCGfiTSACTTCCASCTtjTCCCAÇGSTÇÇÇÇAÇGâfiTTCOCCATTCCâATCSGGCAGGCSATGGCGfl ^TAftSDSFQLSQGGQGFA I F I G G & Μ A TCGCGGGCCAGftTOCGAtCGSGTGeGGSGÍCACCCACCSITCATATCGGGCCTACCSCCnCCTCGGCTTGSOTGTTGIJCGACAACAACGGCAACGGCGC Ϊ A G Q I RSGG GSFt V Η I G 9 1 k ΐ h G l G V V D S H G H G A ACGÃGTCCAACSCGTGGTCGGGReCSCTCCíàGCGGCAAGTCrCGGCAfCTCCACCSGCGACGTGAIXÍRCCGCGGTCGACGSCGCTCCGATCAACTCGGCC R V Ç R V V GSAFAASÍ.G2STSDVITAVDGAPÍ S S A ACCSCGATGGCGOACGCCXITTAACGGeCATCRTCCCGSTGACGTCArCTCGGTSflCCYGGCSAACCAAGTCGGGCGGCACGCGFACAGGGAACGTííACAT T Á a a D A L N G Η Η P G 0 V I S tf T » Q ? 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GCGTACAGSGASCGTGACAJTGGCCGAGGGACCCCCGGCCSAATTCCCGCTGGTGCCGCQCSGCAGCCCGATGGGCXCCKACGTTCSGSACCTGA 475 -----------------------------------------Hal2—-jpEcciSl·-----------------------—KT1-------—- ----------— RTGPVXl-ASGPPASFPLVPRGSPMGSOVRDIN ACCtfiCKiCrGCCGGCAGTtCCGTCCCTGGSTGGTGGtGC.ÍGGTÍGCGCÍlCTGCCSGTÍAeCGGMCSGCACASTGGGCScCGÇTTÇTC-GACTTC 570 -------------„---------------------------—--------------WT1---------------------------------------------------------- KAlLPAVPStGGGeôCAtPVSôAAeWAPVLDF GCACCGCCGGGTSCA.TCCGCãTACGGTTCCCTGGSTGGTCCGGCACCGCCGCCGGCACCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCCGCAÇTCCTTCR? 665 ------------------------------------------------------------------------------------------ A P P G A S A Ϊ G S Γ.· G G P A 1? S P A P P p p 9 P P P p H S F 1 FIG. 4A 6/12 CÃRÃCSGGAACCGftGCTGGCiGÍGGTOCAGARC.CGCACGftAGftACAGTGCCTGAGCGCATrCÃCCGTICftCyíCTCCGGCCÍiC.TTCACTGGCftCAG 760 ..................................................................ί«χ--------------------------------------------- fCOSPSKGGAEPHEEQCLSAFTVHFSSCFTGT CCGG&GCCTGTC6CTAC5GC'CCCTTCG6TCC?CCTCCGCCCAGCCA8GCSTCftrcCG3Ce&3SCC&GG&?GTTTCCTMC6CGCeC7ftCCTSCCC 855 A6ACRY5PFG??PP8QASSGQ-A8HÍ' PNAfílP AGCTGCCICGAGAGCCftGCCCeCTATTCGCAATCAGGGTXftCAGCACGGTCACCyTCGACGSGACGCCCAGCTftCGeTCACACGCCCICGCACCfi. 350 ------------------------------------------—----S5T1--------— -------—--------------—— ---- sclesqpairsíqsystvtfpgtfsyçktfshh TGCGGCGCAGTTCCCCMCCACTCATTCAAGCATGAGGATCCCATGGGCCAGCAGSGCTCGCTÍãGffEGAeCAGCAGTACTCGGTGCCGCCCCCGG 1045 AAQF?MHSFKHEDPMG-ÔGSXiGB{íQySVFPP TCTATGGCKCCACACCCCCACCGACAGCTGCACCGGCAGCCAGGCTTTGCTGCTMGGACGCCCTBCAGCAGtCACAAOTATACCAAATGÃCA 13.40 ------------------------------------------------HT1—--------------------------------------------------- VYGCHTPTBSCTGSOAÍL Ϊ, BTPYSS. aSLYQM ΐ TCCCftGCTTGAàTGCATGACCTGGAATCAGATGAACXTAGGAeCÇBCCTr.W.GGGÇCACftGCACAGGGTACG.WAGCGATAACCACACAACSCC 1235 ---------------------------------------------------6ÍT1------------------------------------------—-----— SOIiECMTWNQKNLGATLKGHSTOYESDHHTTP CÃl'CCTCTCCGGAGCCCMt&CAG&ATACACACGCACGGXGlClTCAGRGÇCATTCRGGATGXGCMCGTGTGCÇ»GGAG?ASCCÇC6ACFCTT5 1330 ----------------------------------------------------KT1----------------------------------------------- ILÇGAQYRI. 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BA, 76!) 10/12 AGAft^CGTGCTOA.^CTGaTCfttYCTGATAGCGACCAACCTCTTGGGGCfÃfiAC&CCCCGGCGATCGCGGTCAACefiGGCCGAATACGSCCAGAIS 3S5 ------------------ ----------——-------------ΒΪΒ39-----------------—-----------------— ENRAELMILÍATS ILGQBYPAIAVNSAEYGEM fSGSCCCAAGACGCCGCCGCGATGTTTGGCTACGCCSCSGCGACGGCGACGGCGACGGCGACGTTGCTGCCGTTCGftGGAGGCGCCGGAGATGflC 950 —-----------------------------------------------htb39._„„------—--------------------------- NAQDAAAíIESYAAATATATATAGPFEEAPSMT CAGCGCGGGTGGGCTCCTCGA3CAGGCCGCCGCGGTCGAGGAGGCCTCC5ACACCGCCGCGSCGAACCSG'?TGATGSACM?GTGCCCCAGGCGC 1045 -----------„------------------------------------^_„__„|st339.----------------------------------------- S Λ G G L L E Q A A & V S E A S D ? A A A S Q 1 Η « K V P Q A TCCMCAGCTGSCCCAGCCCACGCAGGGCACCACGCCTTCTTCCAAGCfGGGTCGCCTGTGGAAGACGGTCTCGCCGCaTCGGTCGCCGATCAGC 1148 -----------------------------------HTS39---------------------------------------------— L Q Q L A Q P T Q C T Ϊ P S S K L G G L K K T V S ? H R S í? I S AACATGGTGTCGATGGCCAACMCCACAtGtCGAT.GACCAACTCGGGTGTGTCGArGACCAACACCTTGAGCTCGATGTTGAAGGGCTTTGCTCC 1235 N»VSNftRBKMSMTBSSVSlíT8TiSj3HLKfiFA? GGCGGCGGCCGCCCAGGCCGTGCAMCCGCGGCGCflAAACGGGGTCCGGGCGRTGAGCTCGCTGGGCA&aCGCTGGGTTCTTCGGGTCTGGGCG 1330 ....................————————--------MTB39---------------------------------------------------- A A A ft Q à V Q T A A Q M G V R A M S S 1 G S í? L G S 3 G L G GTGGGGTfiGCCGCCAACtTG6$TCGç6CGCCCtCG6ÍC06TTCGTTGTCGCT6CCSCAG6CÇTS65CCO>CSSCCARCCAGGCASTCRCCCCG©Ce 1425 ------------------------------------------------HTB39--------------------------------------------------- GGVRANEGRAASVGSt.SVPQAWAAAHQAVTPA 1520 GCCtCGGGCGCTGCCGCTGACCAGCCTGACCftGCSCCGCSGAAAGAGGGCCCGGGCAGATGCTSGGCGGGCTGCCGGTGGGÇCAGATGGGCGCCAG —----------------------------------------------------—STB39----------------------------------------------------------- A R A L P L ? S L T S A A ε R G P G Ç> Μ l G G L p V G & M C5 A R FIG. GB 11/12 GECCGGTGGTGGGCTCAGTÍÍGTCTSCTGCQTCTTCCGCÇGCGftCCCTRTGTGATÍSCCGCATTCTCCGGCAGCCÇGCSATSTCGCCCCGtrGGCCT 1615 -------------------------------------------------------------------8TS.13—------------------------jj Eco |------------- A Q <5 S R V P P ft P 'ÍVNPHSPAAGDIAPPA TGTCGCAGGACCGGTTCGCCGACTTCCCCGCGCTGCCCCTCGACCCGTCCGCGATGGTCSCCCAAGTGGQGCCACAGGWGTCAACATCAACACC 1710 .....------------------------------------------------------MT632A JS-ter)·.......-----------------..... ISODSFADPPALPLDPSASíVAOVGPQVVNIfi? aaactgggctacaacsacgccgtgggcgccgggaccggcatcgtcatcgatcccaacggtgtcgtgctgaccaacaaccacgtgstcgcgggcgc 180S —.......---------------------------------------ΪΊΤΒ32Α (Ei-ter J-------1---------— --------— ------ K I> G ϊ K N S VGAGtGIVIO ? N Ο V V L Τ H ti Η V I A 6 A CACÇ3ACATCAAIGCGTÍ CAGCGTCGG C TCCG TDrSAFSVGS GCCAAACCTACGGCGTCGA?GT86TCG6GIATGftCCGCACCCAGGATGTCGC6GTGCTGCAGC 1900 -----------------MTB32A (fi-ter)------------------............... S Q T Ϊ 3 V D V V G ? D 8 T Q Ο V A V & Q TGCGCGGTGCCGGTGGCCTGCCGTCGGCSGCGAKGGTGGCGSCGTCGCGSTTGGTGAGCCCGTCGTCGCGATGGC-CAACAGCGGTGGGCAGGGC 3.995 —.................................ΜΤΒ32Α {H-ter}------------——------------------ kRGAGGIiPSAAXGGGVAVGSPVVftKGMSGGQG GGAACGCCCCGTGCGGTGCCtGGCAGGGTGGTCQCGCTCGGCCASACCGTGCAGGCGTCÈGATTCSCTGACCWjTGCCClAAGAGACATÍGAACGG 2090 ---------------..-g?832ft {K-rer)---------------------------------- GTPRAVPGRVVALSQTVQSSDSiTGAESlTLBG GTTGATCCAGI' L 1 Q saTGCCGCGATCCAGCCCGGTGATTCGSeCGGGCCCGtCGTavACGGCCXAGGaCAGGTGGTCC«tATCAACACC6CCGC«C ------»n—-----.—.—MT832A OJ-te*)- — ---------------------- OAAIQPGDSGGFVVBGíGQVVGSMTAA 2185 CCTAGG *8 S 2191 FIG. 6C. 12/12 polipéptido Ral2(curto) (SEQ ID N°:17) TAASDNFQLSQGGQGFAIPIGQAMAIAGQI FIG. 7. polipéptido Ral2(longo) (SEQ ID N°:18) TAASDNFQLSQGGQGFAIPIGQAMAIAGQIKLPTVHIGPTAFLGLGWDNNGNGARV QRVVGSAPAASLGISTGDVITAVDGAPINSATAMADALNGHHPGDVISVTWQTKSG GTRTGNVTLAEGPPA FIG. 8. Mamaglobina humana h3n - Met Histag6aa Ral2(curto)30aa Hindm 2aa (comprimento total) 93aa FIG. 9.