CN111269856B

CN111269856B - 一种分离和/或富集结核分枝杆菌的方法

Info

Publication number: CN111269856B
Application number: CN202010101771.5A
Authority: CN
Inventors: 曹廷明; 孙照刚; 贾红彦; 李自慧; 杜凤娇; 戴广明; 褚洪迁; 张宗德
Original assignee: Beijing Chest Hospital; Beijing Tuberculosis and Thoracic Tumor Research Institute
Current assignee: Beijing Chest Hospital; Beijing Tuberculosis and Thoracic Tumor Research Institute
Priority date: 2020-02-19
Filing date: 2020-02-19
Publication date: 2021-11-30
Anticipated expiration: 2040-02-19
Also published as: CN111269856A

Abstract

本发明公开了一种分离和/或富集结核分枝杆菌的方法。本发明的发明人基于

Description

一种分离和/或富集结核分枝杆菌的方法

技术领域

本发明属于生物医学领域，具体涉及一种分离和/或富集结核分枝杆菌的方法。

背景技术

结核病是由细胞内细菌病原体结核分枝杆菌引起的慢性传染病。由于结核分枝杆菌其独特的致病特点及流行和传播方式，特别是近年来耐药结核分枝杆菌的产生以及与人类免疫缺陷症病毒(HIV)的交叉感染等原因导致结核病的流行再度呈现上升趋势。结核分枝杆菌是一种胞内感染菌，它是最成功的病原体之一，已经进化出适应宿主细胞和逃避免疫监视的各种策略。结核分枝杆菌经过呼吸道进入人体后，主要在巨噬细胞内寄生，并采用多种策略逃避宿主细胞的免疫杀伤作用，其可以在巨噬细胞内长期存活并缓慢增殖。当宿主免疫力低下时，休眠的结核分枝杆菌可以被重新活化，导致机体发展为活动性结核病。感染结核分枝杆菌后病原体能在宿主体内长期潜伏或造成持续性感染，为该疾病的治疗和预防造成了极大的障碍。此外，现阶段结核病的治疗难点还在于多重耐药性和广泛耐药性结核病。结核病新药的匮乏以及结核分枝杆菌相关基础研究的不足是耐药性结核病治愈率低下的主要原因。因此，迫切需要寻找新的药物靶点，开发新的抗结核病药物来治疗结结核病。

确定结核分枝杆菌自身蛋白间的蛋白质-蛋白质相互作用能够更深入的表征细菌在宿主体内存活和结核发病的分子机制，也将有助于寻找到新的抗结核药物靶点，开发出新的抗结核药物，以利于对结核病的治疗。Rv0577蛋白、Rv0949蛋白、Rv2098c蛋白、Rv3009c蛋白和Rv3803c蛋白是结核分枝杆菌的固有蛋白，通过检测待检标本中这些结核蛋白之中的任一蛋白即可鉴定病原菌-结核分枝杆菌的存在，因此可以借此来实现对结核感染或结核病的快速诊断。此外，已有转座子突变实验证实，Rv3009c蛋白为结核分枝杆菌体外生长必需基因，编码Rv3009c蛋白的基因被破坏时将导致体外H37Rv的生长缺陷(DeJesus M A，Gerrick E R，Xu W，Park S W，et al.Comprehensive Essentiality Analysis of theMycobacterium tuberculosis Genome via Saturating TransposonMutagenesis.MBio.2017Jan 17；8(1).pii:e02133-16.)。Rv3009c蛋白可能被作为新的抗结核药物靶点来开发新的抗结核药物，用于治疗结核病。

研究结核分枝杆菌自身蛋白之间的相互作用可以更深入的表征细菌在宿主体内存活和结核病发病的分子机制，也将有助于寻找到新的抗结核药物靶点。

发明内容

本发明的目的是检测结核分枝杆菌。

本发明首先保护Rv1875蛋白在制备结核分枝杆菌分离试剂、结核分枝杆菌富集试剂、结核分枝杆菌检测试剂、结核疫苗和抗结核药物中至少一种的应用。

上述应用中，所述结核分枝杆菌分离试剂、所述结核分枝杆菌富集试剂和所述结核分枝杆菌检测试剂均可通过Rv1875蛋白和结核分枝杆菌固有蛋白结合实现。所述结核分枝杆菌固有蛋白可为Rv0577蛋白、Rv0949蛋白、Rv2098c蛋白、Rv3009c蛋白和Rv3803c蛋白中的至少一种。

本发明还保护编码Rv1875蛋白的核酸分子在制备结核分枝杆菌分离试剂、结核分枝杆菌富集试剂、结核分枝杆菌检测试剂、结核疫苗和抗结核药物中至少一种的应用。

Rv1875蛋白或编码Rv1875蛋白的核酸分子在分离结核分枝杆菌和/或富集结核分枝杆菌和/或检测结核分枝杆菌中的应用也属于本发明的保护范围。

上述应用中，所述“分离结核分枝杆菌和/或富集结核分枝杆菌和/或检测结核分枝杆菌”均可通过Rv1875蛋白和结核分枝杆菌固有蛋白结合实现；所述结核分枝杆菌固有蛋白可为Rv0577蛋白、Rv0949蛋白、Rv2098c蛋白、Rv3009c蛋白和Rv3803c蛋白中的至少一种。

本发明还保护一种试剂，可包括b1)-b3)中的至少一种：

b1)Rv1875蛋白；

b2)编码Rv1875蛋白的核酸分子；

b3)含有编码Rv1875蛋白的核酸分子的重组菌；

所述试剂用于结核分枝杆菌分离和/或结核分枝杆菌富集或结核分枝杆菌检测。

所述试剂具体可由b1)-b3)中的至少一种组成；

b1)Rv1875蛋白；

b2)编码Rv1875蛋白的核酸分子；

b3)含有编码Rv1875蛋白的核酸分子的重组菌。

本发明还保护一种分离和/或富集结核分枝杆菌的方法，通过Rv1875蛋白和结核分枝杆菌固有蛋白结合实现；所述结核分枝杆菌固有蛋白可为Rv0577蛋白、Rv0949蛋白、Rv2098c蛋白、Rv3009c蛋白和Rv3803c蛋白中的至少一种。

本发明还保护一种检测待测样本是否存在结核分枝杆菌的方法，包括如下步骤：

(1)取待测样本的总蛋白，采用Rv1875蛋白进行分离和/或富集；

(2)完成步骤(1)后，进行如下判断：如果分离和/或富集的产物含有目标蛋白，则待测样本存在结核分枝杆菌；如果分离和/或富集的产物不含有所述目标蛋白，则待测样本不存在结核分枝杆菌；

所述目标蛋白可为Rv0577蛋白、Rv0949蛋白、Rv2098c蛋白、Rv3009c蛋白和Rv3803c蛋白中的至少一种。

上述任一所述Rv1875蛋白可为a1)或a2)或a3)或a4)：

a1)SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

a2)SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

a3)在SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：9所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

a4)将SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且与a1)所述蛋白质具有相同功能的蛋白质。

上述任一所述编码Rv1875蛋白的核酸分子可为c1)或c2)或c3)或c4)或c5)所示的DNA分子：

c1)编码区是SEQ ID NO：1所示的DNA分子；

c2)核苷酸序列是SEQ ID NO：1所示的DNA分子；

c3)核苷酸序列是SEQ ID NO：8所示的DNA分子；

c4)与c1)或c2)或c3)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，来源于结核分枝杆菌且编码上述任一所述Rv1875蛋白的DNA分子；

c5)在严格条件下与c1)或c2)或c3)限定的核苷酸序列杂交，来源于结核分枝杆菌且编码上述任一所述Rv1875蛋白的DNA分子。

上述任一所述Rv0577蛋白为SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

上述任一所述Rv0949蛋白为SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

上述任一所述Rv2098c蛋白为SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

上述任一所述Rv3009c蛋白为SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

上述任一所述Rv3803c蛋白为SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

本发明的发明人基于

结核分枝杆菌蛋白质组芯片的蛋白-蛋白互作实验筛选和鉴定与Rv1875蛋白互作的结核蛋白。结果表明，Rv1875蛋白可与Rv0577蛋白、Rv0949蛋白、Rv2098c蛋白、Rv3009c蛋白和Rv3803c蛋白中的任一个结合，即Rv1875蛋白可与Rv0577蛋白、Rv0949蛋白、Rv2098c蛋白、Rv3009c蛋白和Rv3803c蛋白中的任一个蛋白发生相互作用，可以结合或捕获其中的任一个蛋白。Rv0577蛋白、Rv0949蛋白、Rv2098c蛋白、Rv3009c蛋白和Rv3803c蛋白均为结核分枝杆菌固有蛋白。因此，Rv1875蛋白可以分离结核分枝杆菌和/或富集结核分枝杆菌和/或检测结核分枝杆菌。本发明具有重要的应用价值。

附图说明

图1为重组蛋白Rv1875样本的蛋白浓度的检测结果。

图2为芯片实验的流程示意图。

图3为部分芯片的扫描结果。

图4为Rv0577蛋白、Rv0949蛋白、Rv2098c蛋白、Rv3009c蛋白和Rv3803c蛋白的扫描结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

pET32a载体为默克密理博Novagen的产品，产品目录号为69030。

实施例1、重组蛋白Rv1875的表达和纯化

一、重组质粒pET32a-Rv1875的构建

Rv1875蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。编码Rv1875蛋白的基因(即Rv1875基因)的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

将pET32a载体的限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ之间的DNA小片段替换为SEQ ID NO：1所示的DNA分子，得到重组质粒pET32a-Rv1875。

重组质粒pET32a-Rv1875中，SEQ ID NO：1所示的DNA分子与载体骨架上的His-tag标签(由6个组氨酸残基组成)的编码序列融合，形成SEQ ID NO：8所示的融合基因，表达SEQID NO：9所示的具有His-tag标签的融合蛋白，即重组蛋白Rv1875。

二、重组蛋白Rv1875的表达

1、将重组质粒pET32a-Rv1875导入大肠杆菌BL21，得到重组菌，将该重组菌命名为BL21/pET32a-Rv1875。

2、将BL21/pET32a-Rv1875单克隆接种至5mL LB液体培养基，37℃、200rpm振荡培养过夜，得到培养菌液1。

3、将1-2μL培养菌液1接种至10mL LB液体培养基，37℃、200rpm振荡培养过夜，得到培养菌液2。

4、取培养菌液2，按体积比为1:50接种至500mL LB液体培养基，37℃、200rpm振荡培养至OD_600nm值为0.6～0.8；然后加入IPTG并使其在体系中的浓度为0.5mM，37℃、200rpm振荡培养至OD_600nm值为1.5左右，4℃、6000rpm离心5min，收集沉淀(即菌体)。

三、重组蛋白Rv1875的纯化

1、取步骤二中4收集的沉淀，用pH8.0、10mM的Tris-HCl缓冲液重悬(每300mL培养体系收集的沉淀加入20-30mLpH8.0、10mM的Tris-HCl缓冲液)，得到重悬液。

2、取步骤1得到的重悬液，超声破碎(超声波功率500W，循环程序为：破碎10s，停15s，共60次)，然后4℃、10000rpm离心10min，收集沉淀。

3、取步骤2收集的沉淀，用20-30mLpH8.0、10mM的Tris-HCl缓冲液重悬，静置10min，然后12000rpm离心10min，收集沉淀1。

4、取步骤3收集的沉淀1，用20-30mLpH8.0、10mM的Tris-HCl缓冲液重悬，静置10min，然后12000rpm离心10min，收集沉淀2。

5、取步骤4收集的沉淀2，先用少量的pH8.0、10mM的Tris-HCl缓冲液重悬，再用5-10mL含8M尿素的pH8.0、10mM的Tris-HCl缓冲液溶解蛋白。

6、完成步骤5后，12000rpm离心10min，收集上清液。该上清液即为重组蛋白Rv1875溶液。

实施例2、基于MTB结核分枝杆菌蛋白质组芯片的蛋白-蛋白互作实验筛选和鉴定与RV1875蛋白互作的结核蛋白

结核分枝杆菌蛋白质组芯片为广州博翀生物科技有限公司的产品。

结核分枝杆菌蛋白质组芯片包含4262个结核分枝杆菌重组蛋白质。在下文中，

结核分枝杆菌蛋白质组芯片简称芯片。

实验重复三次，每次重复的步骤如下：

1、通过SDS-PAGE初步检测重组蛋白Rv1875溶液的蛋白浓度和纯度

(1)取实施例1步骤三中6制备的重组蛋白Rv1875溶液，离心，然后进行SDS-PAGE。

(2)取不同浓度的BSA标准品溶液，进行SDS-PAGE(上样体积与步骤(1)中重组蛋白Rv1875溶液的上样体积相同)。

结果表明，重组蛋白Rv1875溶液的蛋白浓度约为30ng/μL(通过灰度值大致估算)，纯度大于90％。

2、蛋白标记及标记效率检测

(1)取实施例1步骤三中6制备的重组蛋白Rv1875溶液，透析脱盐。

(2)完成步骤(1)后，标记荧光Cy3(CyDye Protein LabellingCY3 MONO 5-PACK，GE，PA23001)。

(3)完成步骤(2)后，透析(目的为去除游离的甘氨酸等成分)，得到重组蛋白Rv1875样本。

(4)完成步骤(3)后，分别将梯度稀释的重组蛋白Rv1875样本、Cy3-BSA(作为阳性对照)和BSA(作为阴性对照)在NC膜上点样，通过Dot blot定性评价荧光标记效率。

结果表明，重组蛋白Rv1875样本的灵敏度小于1ng。由此可见，蛋白标记效率较好。

3、检测重组蛋白Rv1875样本的蛋白浓度

(1)取重组蛋白Rv1875样本，进行SDS-PAGE。

(2)取不同浓度的BSA标准品溶液，进行SDS-PAGE(上样体积与步骤(1)中重组蛋白Rv1875样本的上样体积相同)。

检测结果见图1(M为蛋白Marker，Rv1875为重组蛋白Rv1875样本)。结果表明，重组蛋白Rv1875样本的蛋白浓度约为40ng/μL(通过灰度值大致估算)。

4、芯片实验

封闭液由3mL 10％(m/v)BSA水溶液和7mL 1×PBS缓冲液混合而成。

孵育液由1mL 10％(m/v)BSA水溶液和9mL 1×PBST缓冲液混合而成。

清洗液为1×PBST缓冲液。

芯片实验的流程示意图见图2。

(1)取孵育盒，加入5mL封闭液；之后将芯片从-80℃取出，正面朝上置于孵育盒(芯片完全浸入封闭液)；再横向置于侧摆摇床，4℃、50-60rpm封闭3h。

(2)完成步骤(1)后，弃封闭液，迅速加入3mL含重组蛋白Rv1875的孵育液，置于侧摆摇床，4℃、20-30rpm孵育过夜。

含重组蛋白Rv1875的孵育液为将重组蛋白Rv1875样本溶解于孵育液获得。含重组蛋白Rv1875的孵育液中，重组蛋白Rv1875的蛋白浓度为4μg/mL。

(3)完成步骤(2)后，将所述芯片避光清洗4次，每次清洗的步骤为：将芯片置于装有清洗液的芯片清洗盒，置于水平摇床，60-70rpm振荡5min。

(4)完成步骤(3)后，将所述芯片用ddH₂O避光清洗2次，每次5min。

(5)完成步骤(4)后，将所述芯片置于芯片干燥机，离心干燥。

(6)完成步骤(5)后，用InnoScan 900芯片扫描仪在532nm激发的波长下进行芯片扫描(Cy3在532nm激发光下显示为红光)，保存扫描图片，获得芯片数据。

部分扫描结果见图3。

(7)完成步骤(6)后，对所述芯片数据进行如下分析：

(7-1)为消除同一张芯片内不同蛋白点之间由于背景值不一致导致的信号不均一的情况，通过背景归一化方法进行处理。实现方式为每个蛋白的前景值(即F532Median)与背景值(即B532 Median)比值，即F/B，并此基础上定义SNR(信噪比)，即两个重复蛋白的F/B的均值。

(7-2)对于不同芯片，为消除样本及实验操作带来的系统性误差，故在数据比对前对SNR进行Z-score标准化处理。

(7-3)对归一化后数据，设置阳性cutoff阈值，通过阈值分别计算芯片上的阳性点个数；定义cutoff＝2，即归一化后mean+2SD(此值是根据芯片结果设定，非标准值)。在此标准下，筛选潜在的阳性蛋白。

重要的参数解释如下：

Block、column和Row依次指阵列、列和行的编号，即位置。

Name和ID依次指蛋白质名称和基因名称。

F532 Median：532nm通道下的信号前景值的中位数值，指每个信号点对应所有的像素点的强度中位值，用以表示信号强度。

B532 Median：532nm通道下的背景值的中位数值，指每个信号点周围背景一定范围内的像素点的强度中位值，用以表示背景值。

部分结果见图4和表1。结果表明，阳性蛋白为5个，分别为Rv0577蛋白、Rv0949蛋白、Rv2098c蛋白、Rv3009c蛋白和Rv3803c蛋白。

表1

	SNR
		Rv0577蛋白	11.96
Rv0949蛋白	2.37
		Rv2098c蛋白	2.04
Rv3009c蛋白	2.01
		Rv3803c蛋白	2.17

上述结果表明，重组蛋白Rv1875可以与Rv0577蛋白、Rv0949蛋白、Rv2098c蛋白、Rv3009c蛋白和Rv3803c蛋白中的任一个结合，即重组蛋白Rv1875可与Rv0577蛋白、Rv0949蛋白、Rv2098c蛋白、Rv3009c蛋白和Rv3803c蛋白中的任一个蛋白发生相互作用，可以结合或捕获其中的任一个蛋白。

<110> 首都医科大学附属北京胸科医院北京市结核病胸部肿瘤研究所

<120> 一种分离和/或富集结核分枝杆菌的方法

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 444

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

atgacaacac tcaacgaagc cgcggcactg gcggcggcag aacgtgggct tgcggtggtt 60

tccaccgttc gtgccgacgg caccgtgcag gcgtcgctgg tcaacgttgg actgttgccg 120

catcctgtca gcggcgaacc atctctggga ttcaccacct atggcaaggt caaactcggc 180

aaccttaggg cgcgcccaca actggccgtc acgttccgca acggttggca gtgggcgacc 240

gtcgaaggcc gagcacaact tgtcggcccc gacgatccgc ggccgtggct ggtcgacggc 300

gagcgattgc ggctgctact ccgcgaggtc ttcactgcgg cgggtggcac gcacgacgac 360

tgggacgagt acgaccgggt gatggcgcag gagcagcgcg ccgtggtgct gatcacgccc 420

acccgcatct acagcaacgg ctga 444

<210> 2

<211> 147

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 2

Met Thr Thr Leu Asn Glu Ala Ala Ala Leu Ala Ala Ala Glu Arg Gly

1 5 10 15

Leu Ala Val Val Ser Thr Val Arg Ala Asp Gly Thr Val Gln Ala Ser

20 25 30

Leu Val Asn Val Gly Leu Leu Pro His Pro Val Ser Gly Glu Pro Ser

35 40 45

Leu Gly Phe Thr Thr Tyr Gly Lys Val Lys Leu Gly Asn Leu Arg Ala

50 55 60

Arg Pro Gln Leu Ala Val Thr Phe Arg Asn Gly Trp Gln Trp Ala Thr

65 70 75 80

Val Glu Gly Arg Ala Gln Leu Val Gly Pro Asp Asp Pro Arg Pro Trp

85 90 95

Leu Val Asp Gly Glu Arg Leu Arg Leu Leu Leu Arg Glu Val Phe Thr

100 105 110

Ala Ala Gly Gly Thr His Asp Asp Trp Asp Glu Tyr Asp Arg Val Met

115 120 125

Ala Gln Glu Gln Arg Ala Val Val Leu Ile Thr Pro Thr Arg Ile Tyr

130 135 140

Ser Asn Gly

145

<210> 3

<211> 261

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 3

Met Pro Lys Arg Ser Glu Tyr Arg Gln Gly Thr Pro Asn Trp Val Asp

1 5 10 15

Leu Gln Thr Thr Asp Gln Ser Ala Ala Lys Lys Phe Tyr Thr Ser Leu

20 25 30

Phe Gly Trp Gly Tyr Asp Asp Asn Pro Val Pro Gly Gly Gly Gly Val

35 40 45

Tyr Ser Met Ala Thr Leu Asn Gly Glu Ala Val Ala Ala Ile Ala Pro

50 55 60

Met Pro Pro Gly Ala Pro Glu Gly Met Pro Pro Ile Trp Asn Thr Tyr

65 70 75 80

Ile Ala Val Asp Asp Val Asp Ala Val Val Asp Lys Val Val Pro Gly

85 90 95

Gly Gly Gln Val Met Met Pro Ala Phe Asp Ile Gly Asp Ala Gly Arg

100 105 110

Met Ser Phe Ile Thr Asp Pro Thr Gly Ala Ala Val Gly Leu Trp Gln

115 120 125

Ala Asn Arg His Ile Gly Ala Thr Leu Val Asn Glu Thr Gly Thr Leu

130 135 140

Ile Trp Asn Glu Leu Leu Thr Asp Lys Pro Asp Leu Ala Leu Ala Phe

145 150 155 160

Tyr Glu Ala Val Val Gly Leu Thr His Ser Ser Met Glu Ile Ala Ala

165 170 175

Gly Gln Asn Tyr Arg Val Leu Lys Ala Gly Asp Ala Glu Val Gly Gly

180 185 190

Cys Met Glu Pro Pro Met Pro Gly Val Pro Asn His Trp His Val Tyr

195 200 205

Phe Ala Val Asp Asp Ala Asp Ala Thr Ala Ala Lys Ala Ala Ala Ala

210 215 220

Gly Gly Gln Val Ile Ala Glu Pro Ala Asp Ile Pro Ser Val Gly Arg

225 230 235 240

Phe Ala Val Leu Ser Asp Pro Gln Gly Ala Ile Phe Ser Val Leu Lys

245 250 255

Pro Ala Pro Gln Gln

260

<210> 4

<211> 771

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 4

Met Ser Val His Ala Thr Asp Ala Lys Pro Pro Gly Pro Ser Pro Ala

1 5 10 15

Asp Gln Leu Leu Asp Gly Leu Asn Pro Gln Gln Arg Gln Ala Val Val

20 25 30

His Glu Gly Ser Pro Leu Leu Ile Val Ala Gly Ala Gly Ser Gly Lys

35 40 45

Thr Ala Val Leu Thr Arg Arg Ile Ala Tyr Leu Met Ala Ala Arg Gly

50 55 60

Val Gly Val Gly Gln Ile Leu Ala Ile Thr Phe Thr Asn Lys Ala Ala

65 70 75 80

Ala Glu Met Arg Glu Arg Val Val Gly Leu Val Gly Glu Lys Ala Arg

85 90 95

Tyr Met Trp Val Ser Thr Phe His Ser Thr Cys Val Arg Ile Leu Arg

100 105 110

Asn Gln Ala Ala Leu Ile Glu Gly Leu Asn Ser Asn Phe Ser Ile Tyr

115 120 125

Asp Ala Asp Asp Ser Arg Arg Leu Leu Gln Met Val Gly Arg Asp Leu

130 135 140

Gly Leu Asp Ile Lys Arg Tyr Ser Pro Arg Leu Leu Ala Asn Ala Ile

145 150 155 160

Ser Asn Leu Lys Asn Glu Leu Ile Asp Pro His Gln Ala Leu Ala Gly

165 170 175

Leu Thr Glu Asp Ser Asp Asp Leu Ala Arg Ala Val Ala Ser Val Tyr

180 185 190

Asp Glu Tyr Gln Arg Arg Leu Arg Ala Ala Asn Ala Leu Asp Phe Asp

195 200 205

Asp Leu Ile Gly Glu Thr Val Ala Val Leu Gln Ala Phe Pro Gln Ile

210 215 220

Ala Gln Tyr Tyr Arg Arg Arg Phe Arg His Val Leu Val Asp Glu Tyr

225 230 235 240

Gln Asp Thr Asn His Ala Gln Tyr Val Leu Val Arg Glu Leu Val Gly

245 250 255

Arg Asp Ser Asn Asp Gly Ile Pro Pro Gly Glu Leu Cys Val Val Gly

260 265 270

Asp Ala Asp Gln Ser Ile Tyr Ala Phe Arg Gly Ala Thr Ile Arg Asn

275 280 285

Ile Glu Asp Phe Glu Arg Asp Tyr Pro Asp Thr Arg Thr Ile Leu Leu

290 295 300

Glu Gln Asn Tyr Arg Ser Thr Gln Asn Ile Leu Ser Ala Ala Asn Ser

305 310 315 320

Val Ile Ala Arg Asn Ala Gly Arg Arg Glu Lys Arg Leu Trp Thr Asp

325 330 335

Ala Gly Ala Gly Glu Leu Ile Val Gly Tyr Val Ala Asp Asn Glu His

340 345 350

Asp Glu Ala Arg Phe Val Ala Glu Glu Ile Asp Ala Leu Ala Glu Gly

355 360 365

Ser Glu Ile Thr Tyr Asn Asp Val Ala Val Phe Tyr Arg Thr Asn Asn

370 375 380

Ser Ser Arg Ser Leu Glu Glu Val Leu Ile Arg Ala Gly Ile Pro Tyr

385 390 395 400

Lys Val Val Gly Gly Val Arg Phe Tyr Glu Arg Lys Glu Ile Arg Asp

405 410 415

Ile Val Ala Tyr Leu Arg Val Leu Asp Asn Pro Gly Asp Ala Val Ser

420 425 430

Leu Arg Arg Ile Leu Asn Thr Pro Arg Arg Gly Ile Gly Asp Arg Ala

435 440 445

Glu Ala Cys Val Ala Val Tyr Ala Glu Asn Thr Gly Val Gly Phe Gly

450 455 460

Asp Ala Leu Val Ala Ala Ala Gln Gly Lys Val Pro Met Leu Asn Thr

465 470 475 480

Arg Ala Glu Lys Ala Ile Ala Gly Phe Val Glu Met Phe Asp Glu Leu

485 490 495

Arg Gly Arg Leu Asp Asp Asp Leu Gly Glu Leu Val Glu Ala Val Leu

500 505 510

Glu Arg Thr Gly Tyr Arg Arg Glu Leu Glu Ala Ser Thr Asp Pro Gln

515 520 525

Glu Leu Ala Arg Leu Asp Asn Leu Asn Glu Leu Val Ser Val Ala His

530 535 540

Glu Phe Ser Thr Asp Arg Glu Asn Ala Ala Ala Leu Gly Pro Asp Asp

545 550 555 560

Glu Asp Val Pro Asp Thr Gly Val Leu Ala Asp Phe Leu Glu Arg Val

565 570 575

Ser Leu Val Ala Asp Ala Asp Glu Ile Pro Glu His Gly Ala Gly Val

580 585 590

Val Thr Leu Met Thr Leu His Thr Ala Lys Gly Leu Glu Phe Pro Val

595 600 605

Val Phe Val Thr Gly Trp Glu Asp Gly Met Phe Pro His Met Arg Ala

610 615 620

Leu Asp Asn Pro Thr Glu Leu Ser Glu Glu Arg Arg Leu Ala Tyr Val

625 630 635 640

Gly Ile Thr Arg Ala Arg Gln Arg Leu Tyr Val Ser Arg Ala Ile Val

645 650 655

Arg Ser Ser Trp Gly Gln Pro Met Leu Asn Pro Glu Ser Arg Phe Leu

660 665 670

Arg Glu Ile Pro Gln Glu Leu Ile Asp Trp Arg Arg Thr Ala Pro Lys

675 680 685

Pro Ser Phe Ser Ala Pro Val Ser Gly Ala Gly Arg Phe Gly Ser Ala

690 695 700

Arg Pro Ser Pro Thr Arg Ser Gly Ala Ser Arg Arg Pro Leu Leu Val

705 710 715 720

Leu Gln Val Gly Asp Arg Val Thr His Asp Lys Tyr Gly Leu Gly Arg

725 730 735

Val Glu Glu Val Ser Gly Val Gly Glu Ser Ala Met Ser Leu Ile Asp

740 745 750

Phe Gly Ser Ser Gly Arg Val Lys Leu Met His Asn His Ala Pro Val

755 760 765

Thr Lys Leu

770

<210> 5

<211> 434

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 5

Gly Gln Ser Tyr Gln Ala Val Ser Ala Gln Ala Ala Ala Phe His Asp

1 5 10 15

Arg Phe Val Gln Leu Leu Asn Ala Gly Gly Gly Ser Tyr Ala Ser Ala

20 25 30

Glu Ile Ala Asn Ala Gln Gln Asn Leu Leu Asn Ala Val Asn Ala Pro

35 40 45

Thr Gln Thr Leu Leu Gly Arg Pro Leu Val Gly Asp Gly Ala Asp Gly

50 55 60

Ala Ser Gly Pro Val Gly Gln Pro Gly Gly Asp Gly Gly Ile Leu Trp

65 70 75 80

Gly Asn Gly Gly Asn Gly Gly Asp Ser Thr Ser Pro Gly Val Ala Gly

85 90 95

Gly Ala Gly Gly Ser Ala Gly Leu Ile Gly Asn Gly Gly Arg Gly Gly

100 105 110

Asn Gly Ala Pro Gly Gly Ala Gly Gly Asn Gly Gly Leu Gly Gly Leu

115 120 125

Leu Leu Gly Asn Gly Gly Ala Gly Gly Val Gly Gly Thr Gly Asp Asn

130 135 140

Gly Val Gly Asp Leu Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Asp Gly Gly Leu

145 150 155 160

Gly Gly Arg Ala Gly Leu Ile Gly His Gly Gly Ala Gly Gly Asn Gly

165 170 175

Gly Asp Gly Gly His Gly Gly Ser Gly Lys Ala Gly Gly Ser Gly Gly

180 185 190

Ser Gly Gly Phe Gly Gln Phe Gly Gly Ala Gly Gly Leu Leu Tyr Gly

195 200 205

Asn Gly Gly Ala Ala Gly Ser Gly Gly Asn Gly Gly Asp Ala Gly Thr

210 215 220

Gly Val Ser Ser Asp Gly Phe Ala Gly Leu Gly Gly Ser Gly Gly Arg

225 230 235 240

Gly Gly Asp Ala Gly Leu Ile Gly Val Gly Gly Gly Gly Gly Gly Asn

245 250 255

Gly Gly Asp Pro Gly Leu Gly Ala Arg Leu Phe Gln Val Gly Ser Arg

260 265 270

Gly Gly Asp Gly Gly Val Gly Gly Trp Leu Tyr Gly Asp Gly Gly Gly

275 280 285

Gly Gly Asp Gly Gly Asn Gly Gly Leu Pro Phe Ile Gly Ser Thr Asn

290 295 300

Ala Gly Asn Gly Gly Ser Ala Arg Leu Ile Gly Asn Gly Gly Ala Gly

305 310 315 320

Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ala Pro Gly Ser Val Ser Ser Gly Gly Val

325 330 335

Gly Gly Ala Gly Asn Pro Gly Gly Ser Gly Gly Asn Gly Gly Val Trp

340 345 350

Tyr Gly Asn Gly Gly Ala Gly Gly Ala Ala Gly Gln Gly Gly Pro Gly

355 360 365

Met Asn Thr Thr Ser Pro Gly Gly Pro Gly Gly Val Gly Gly His Gly

370 375 380

Gly Thr Ala Ile Leu Phe Gly Asp Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Ala

385 390 395 400

Ala Gly Gly Pro Gly Thr Pro Asp Gly Ala Ala Gly Pro Gly Gly Ser

405 410 415

Gly Gly Thr Gly Gly Leu Leu Phe Gly Val Pro Gly Pro Ser Gly Pro

420 425 430

Asp Gly

<210> 6

<211> 286

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 6

Met Thr Val Ala Ala Gly Ala Ala Lys Ala Ala Gly Ala Glu Leu Leu

1 5 10 15

Asp Tyr Asp Glu Val Val Ala Arg Phe Gln Pro Val Leu Gly Leu Glu

20 25 30

Val His Val Glu Leu Ser Thr Ala Thr Lys Met Phe Cys Gly Cys Thr

35 40 45

Thr Thr Phe Gly Gly Glu Pro Asn Thr Gln Val Cys Pro Val Cys Leu

50 55 60

Gly Leu Pro Gly Ser Leu Pro Val Leu Asn Arg Ala Ala Val Glu Ser

65 70 75 80

Ala Ile Arg Ile Gly Leu Ala Leu Asn Cys Glu Ile Val Pro Trp Cys

85 90 95

Arg Phe Ala Arg Lys Asn Tyr Phe Tyr Pro Asp Met Pro Lys Asn Tyr

100 105 110

Gln Ile Ser Gln Tyr Asp Glu Pro Ile Ala Ile Asn Gly Tyr Leu Asp

115 120 125

Ala Pro Leu Glu Asp Gly Thr Thr Trp Arg Val Glu Ile Glu Arg Ala

130 135 140

His Met Glu Glu Asp Thr Gly Lys Leu Thr His Ile Gly Ser Glu Thr

145 150 155 160

Gly Arg Ile His Gly Ala Thr Gly Ser Leu Ile Asp Tyr Asn Arg Ala

165 170 175

Gly Val Pro Leu Ile Glu Ile Val Thr Lys Pro Ile Val Gly Ala Gly

180 185 190

Ala Arg Ala Pro Gln Ile Ala Arg Ser Tyr Val Thr Ala Leu Arg Asp

195 200 205

Leu Leu Arg Ala Leu Asp Val Ser Asp Val Arg Met Asp Gln Gly Ser

210 215 220

Met Arg Cys Asp Ala Asn Val Ser Leu Lys Pro Ala Gly Thr Thr Glu

225 230 235 240

Phe Gly Thr Arg Thr Glu Thr Lys Asn Val Asn Ser Leu Lys Ser Val

245 250 255

Glu Val Ala Val Arg Tyr Glu Met Gln Arg Gln Gly Ala Ile Leu Ala

260 265 270

Ser Gly Gly Arg Ile Thr Gln Glu Thr Arg His Phe His Glu

275 280 285

<210> 7

<211> 299

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 7

Met Lys Gly Arg Ser Ala Leu Leu Arg Ala Leu Trp Ile Ala Ala Leu

1 5 10 15

Ser Phe Gly Leu Gly Gly Val Ala Val Ala Ala Glu Pro Thr Ala Lys

20 25 30

Ala Ala Pro Tyr Glu Asn Leu Met Val Pro Ser Pro Ser Met Gly Arg

35 40 45

Asp Ile Pro Val Ala Phe Leu Ala Gly Gly Pro His Ala Val Tyr Leu

50 55 60

Leu Asp Ala Phe Asn Ala Gly Pro Asp Val Ser Asn Trp Val Thr Ala

65 70 75 80

Gly Asn Ala Met Asn Thr Leu Ala Gly Lys Gly Ile Ser Val Val Ala

85 90 95

Pro Ala Gly Gly Ala Tyr Ser Met Tyr Thr Asn Trp Glu Gln Asp Gly

100 105 110

Ser Lys Gln Trp Asp Thr Phe Leu Ser Ala Glu Leu Pro Asp Trp Leu

115 120 125

Ala Ala Asn Arg Gly Leu Ala Pro Gly Gly His Ala Ala Val Gly Ala

130 135 140

Ala Gln Gly Gly Tyr Gly Ala Met Ala Leu Ala Ala Phe His Pro Asp

145 150 155 160

Arg Phe Gly Phe Ala Gly Ser Met Ser Gly Phe Leu Tyr Pro Ser Asn

165 170 175

Thr Thr Thr Asn Gly Ala Ile Ala Ala Gly Met Gln Gln Phe Gly Gly

180 185 190

Val Asp Thr Asn Gly Met Trp Gly Ala Pro Gln Leu Gly Arg Trp Lys

195 200 205

Trp His Asp Pro Trp Val His Ala Ser Leu Leu Ala Gln Asn Asn Thr

210 215 220

Arg Val Trp Val Trp Ser Pro Thr Asn Pro Gly Ala Ser Asp Pro Ala

225 230 235 240

Ala Met Ile Gly Gln Ala Ala Glu Ala Met Gly Asn Ser Arg Met Phe

245 250 255

Tyr Asn Gln Tyr Arg Ser Val Gly Gly His Asn Gly His Phe Asp Phe

260 265 270

Pro Ala Ser Gly Asp Asn Gly Trp Gly Ser Trp Ala Pro Gln Leu Gly

275 280 285

Ala Met Ser Gly Asp Ile Val Gly Ala Ile Arg

290 295

<210> 8

<211> 945

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 8

atgagcgata aaattattca cctgactgac gacagttttg acacggatgt actcaaagcg 60

gacggggcga tcctcgtcga tttctgggca gagtggtgcg gtccgtgcaa aatgatcgcc 120

ccgattctgg atgaaatcgc tgacgaatat cagggcaaac tgaccgttgc aaaactgaac 180

atcgatcaaa accctggcac tgcgccgaaa tatggcatcc gtggtatccc gactctgctg 240

ctgttcaaaa acggtgaagt ggcggcaacc aaagtgggtg cactgtctaa aggtcagttg 300

aaagagttcc tcgacgctaa cctggccggt tctggttctg gccatatgca ccatcatcat 360

catcattctt ctggtctggt gccacgcggt tctggtatga aagaaaccgc tgctgctaaa 420

ttcgaacgcc agcacatgga cagcccagat ctgggtaccg acgacgacga caaggccatg 480

gctgatatcg gatccgaatt catgacaaca ctcaacgaag ccgcggcact ggcggcggca 540

gaacgtgggc ttgcggtggt ttccaccgtt cgtgccgacg gcaccgtgca ggcgtcgctg 600

gtcaacgttg gactgttgcc gcatcctgtc agcggcgaac catctctggg attcaccacc 660

tatggcaagg tcaaactcgg caaccttagg gcgcgcccac aactggccgt cacgttccgc 720

aacggttggc agtgggcgac cgtcgaaggc cgagcacaac ttgtcggccc cgacgatccg 780

cggccgtggc tggtcgacgg cgagcgattg cggctgctac tccgcgaggt cttcactgcg 840

gcgggtggca cgcacgacga ctgggacgag tacgaccggg tgatggcgca ggagcagcgc 900

gccgtggtgc tgatcacgcc cacccgcatc tacagcaacg gctga 945

<210> 9

<211> 314

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 9

Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp

1 5 10 15

Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp

20 25 30

Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp

35 40 45

Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn

50 55 60

Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu

65 70 75 80

Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser

85 90 95

Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly

100 105 110

Ser Gly His Met His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

115 120 125

Arg Gly Ser Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln

130 135 140

His Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ala Met

145 150 155 160

Ala Asp Ile Gly Ser Glu Phe Met Thr Thr Leu Asn Glu Ala Ala Ala

165 170 175

Leu Ala Ala Ala Glu Arg Gly Leu Ala Val Val Ser Thr Val Arg Ala

180 185 190

Asp Gly Thr Val Gln Ala Ser Leu Val Asn Val Gly Leu Leu Pro His

195 200 205

Pro Val Ser Gly Glu Pro Ser Leu Gly Phe Thr Thr Tyr Gly Lys Val

210 215 220

Lys Leu Gly Asn Leu Arg Ala Arg Pro Gln Leu Ala Val Thr Phe Arg

225 230 235 240

Asn Gly Trp Gln Trp Ala Thr Val Glu Gly Arg Ala Gln Leu Val Gly

245 250 255

Pro Asp Asp Pro Arg Pro Trp Leu Val Asp Gly Glu Arg Leu Arg Leu

260 265 270

Leu Leu Arg Glu Val Phe Thr Ala Ala Gly Gly Thr His Asp Asp Trp

275 280 285

Asp Glu Tyr Asp Arg Val Met Ala Gln Glu Gln Arg Ala Val Val Leu

290 295 300

Ile Thr Pro Thr Arg Ile Tyr Ser Asn Gly

305 310

Claims

1. Rv1875蛋白在制备结核分枝杆菌分离试剂、结核分枝杆菌富集试剂、结核分枝杆菌检测试剂、结核疫苗和抗结核药物中至少一种的应用；

所述Rv1875蛋白为a1）或a2）或a3）：

a1）SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

a2）SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

a3）在SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：9所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。

2.编码Rv1875蛋白的核酸分子在制备结核分枝杆菌分离试剂、结核分枝杆菌富集试剂、结核分枝杆菌检测试剂、结核疫苗和抗结核药物中至少一种的应用；

所述编码Rv1875蛋白的核酸分子为c2）或c3）所示的DNA分子：

c2）核苷酸序列是SEQ ID NO：1所示的DNA分子；

c3）核苷酸序列是SEQ ID NO：8所示的DNA分子。

3.权利要求1中所述Rv1875蛋白或权利要求2中所述编码Rv1875蛋白的核酸分子在分离结核分枝杆菌和/或富集结核分枝杆菌中的应用。

4.一种分离和/或富集结核分枝杆菌的方法，通过权利要求1中所述Rv1875蛋白和结核分枝杆菌固有蛋白结合实现；

所述结核分枝杆菌固有蛋白为Rv0577蛋白、Rv0949蛋白、Rv2098c蛋白、Rv3009c蛋白和Rv3803c蛋白中的至少一种；

所述Rv0577蛋白为SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

所述Rv0949蛋白为SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

所述Rv2098c蛋白为SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

所述Rv3009c蛋白为SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

所述Rv3803c蛋白为SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

5.一种检测待测样本是否存在结核分枝杆菌的方法，包括如下步骤：

（1）取待测样本的总蛋白，采用权利要求1中所述Rv1875蛋白进行分离和/或富集；

（2）完成步骤（1）后，进行如下判断：如果分离和/或富集的产物含有目标蛋白，则待测样本存在结核分枝杆菌；如果分离和/或富集的产物不含有所述目标蛋白，则待测样本不存在结核分枝杆菌；

所述目标蛋白为Rv0577蛋白、Rv0949蛋白、Rv2098c蛋白、Rv3009c蛋白和Rv3803c蛋白中的至少一种；

所述Rv0577蛋白为SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

所述Rv0949蛋白为SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

所述Rv3803c蛋白为SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

所述方法用于非疾病的诊断。