JPH11502923A

JPH11502923A - Ｔ．ｃｒｕｚｉ感染検出用の化合物および方法

Info

Publication number: JPH11502923A
Application number: JP8528478A
Authority: JP
Inventors: ジー．リード，スティーブン; エル．ホートン，レイモンド
Original assignee: コリクサコーポレイション
Priority date: 1995-03-14
Filing date: 1996-03-12
Publication date: 1999-03-09
Also published as: ES2180754T3; WO1996029605A2; AU5362696A; EP0815450A2; US5756662A; BR9607531A; DK0815450T3; EP0815450B1; MX9707020A; US5942403A; WO1996029605A3; AR002282A1; DE69622385D1; ATE220797T1; DE69622385T2; CA2215104A1; PT815450E

Abstract

(57)【要約】 Trypanosoma cruzi感染を診断するための、またはT.curziもしくはLeishmania感染をスクリーニングするための化合物および方法を開示する。開示される化合物は、T.cruziタンパク質の１つまたはそれ以上の抗原性エピトープを含むポリペプチド、またはそれに対する抗体である。これらの化合物は、T.cruzi感染を検出するための種々の免疫アッセイにおいて有用である。これらのポリペプチド化合物は、さらに、T.cruziに曝された個体におけるChagas病を予防するワクチンおよび薬学的組成物において有用である。

Description

【発明の詳細な説明】 T.CRUZI 感染検出用の化合物および方法技術分野本発明は、一般に、T.cruzi感染およびリーシュマニア症の診断に関する。本発明は、より特定すれば、T.cruziに対する抗体の存在について個体および血液供給品をスクリーニングするための方法および診断キットにおける、１つまたはそれ以上のT.cruzi抗原性ペプチド、またはそれに対する抗体の使用に関する。本発明はまた、Chagas病を予防するために個体を免疫化するためのワクチン組成物に関する。発明の背景原生動物寄生体は、世界の多くの地域で健康に対して大きな脅威となっている。Trypanosoma cruzi(T.cruzi)は、主に、中央および南アメリカで数百万の個体に感染しているこのような寄生体の１つである。この寄生体の感染は、慢性の心臓病および種々の免疫系異常を生じ得るChagas病を引き起こし得る。ラテンアメリカでは、1800万の人々がT.cruziに感染していると推定されているが、この感染またはその臨床症状に対する決定的な処置はない。病気が風土病である地域では、伝染の最も顕著な経路は、感染したオオサシガメ(triatomid bug)との接触による。しかし、その他の地域では、輸血が伝染の最も優勢な手段である。このような地域でT.cruziの伝染を阻害するために、個体におけるT.cruzi感染を診断するため、および血液供給品をスクリーニングするための正確な方法を開発することが必要である。0.1%〜62%の試料が感染されている可能性があり、そしてこの寄生体が輸血によりしばしば伝染される南アメリカでは血液バンクのスクリーニングが特に重要である。また、特定の合衆国の都市における血液供給品が、T.cruzi寄生体で汚染されている可能性があることに関心が高まっている。 T.cruzi感染の診断は問題が多い。なぜなら、日常の使用に適切であるこの寄生体を検出する正確な方法が利用可能でないからである。数十年間継続し得る感染の急性期の間は、感染は鎮静期のままであり得、そして宿主は、無症候であり得る。その結果、T.cruzi感染に対する血清学的試験を最も信頼し得、そして最も一般に用いられ得る。しかし、このような診断は、この寄生体の複雑な生活環および宿主の多種多様な免疫応答により複雑である。寄生体は、昆虫ベクター中でエピマスティゴート期を、そして哺乳動物宿主中で２つの主要期を通過する。１つの宿主期は血液中に存在し(トリポマスティゴート期)、そして第２の宿主期は細胞内である(無べん毛型期)である。複数の期は、感染の間に寄生体により呈示される多種多様な抗原を生じる。さらに、原生動物感染に対する免疫応答は複雑であり、寄生体抗原のアレイに対する体液性および細胞媒介性応答の両者を含む。寄生体抗原に対する抗体を検出することは、臨床および無症状感染を診断する最も一般的かつ信頼し得る方法であるが、現行の試験は高価でかつ難しい。大部分の血清学的試験は、全T.cruziまたは溶解T.cruziを用い、そしてT.cruzi感染を正確に検出するために、補体結合、間接免疫蛍光、受動凝集反応またはELISA を含む３つの試験のうち２つについて陽性の結果を必要とする。このような試験のコストおよび困難性は、多くの風土病地域で血液または血清のスクリーニングを妨げていた。 T.cruzi感染を検出する改良された方法が、本明細書に参考として援用される米国特許第5,304,371号に開示された。この特許では、大部分の感染患者において、T.cruziに対する抗体、要するにこの寄生体による感染を検出した、T.cruzi の抗原性エピトープが開示された。しかし、この方法は、先行技術の方法に対する改良であるが、この技術の感度は約93%のみである(すなわち、感染の約93%のみが診断され得た)。同様の困難性がLeishmania感染の診断で起こっている。Leishmaniaの種々の種がヒトに感染し、内臓、皮膚または粘膜損傷により特徴付けられるヒトの病気を引き起こす。数百万のリーシュマニア症例が全世界に存在し、そして少なくとも 400,000の内臓リーシュマニア症(VL)の新たな症例が、毎年、診断されている。L eishmania種は、スナバエ(sand fly)に噛まれることにより、または汚染血液の輸血を通じてヒトおよびその他の哺乳動物に伝染する。 VLは、一般に、アフリカおよびインドではL.donovaniにより、南ヨーロッパではL.infantiumにより、またはラテンアメリカではL.chagasiにより引き起こされる。VLでは、高レベルの寄生体特異的抗体が、抗原特異的Ｔ細胞応答の検出に先立って観察される(Ghoseら、Clin.Exp.Immunol.40:318-326、1980)。この抗体応答は、L.chagasiおよびL.donovani感染の血清診断(通常、免疫蛍光法)に用いられている。これらの血清診断法は、代表的には全寄生体または溶解寄生体を用いてVLを診断するために現在利用可能である。このような方法は、不正確でかつ種々のその他の病気と交差反応しやすく、そして有効な処置を可能にするに十分な初期において、潜在的に致命的な病気のいくつかの場合を検出し得ない。従って、当該技術分野では、血液供給品および個体におけるT.cruziおよびLei shmania感染を検出するより特異的かつ高感度の方法の必要性が存在する。本発明は、これらの必要性を満たし、そしてさらに関連する他の利点を提供する。発明の要旨要約すれば、本発明は、個体および血液供給品におけるT.cruzi感染を検出および予防する化合物および方法、ならびに生物学的試料中のT.cruziおよびLeish mania感染をスクリーニングする化合物および方法を提供する。１つの局面では、本発明は、生物学的試料中のT.cruzi感染を検出する方法を提供し、この方法は、(a)生物学的試料を、配列番号１の残基137のリジンと残基247のアラニンとの間の部分の少なくとも７つの連続する残基、または保存的置換もしくは改変のみが異なるその抗原性改変体を含む第１のポリペプチドと接触させる工程、ただし、上記第１のポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸１とアミノ酸136との間の部分の５を超えない連続する残基を含む；および(b)上記生物学的試料中で上記ポリペプチドに結合する抗体の存在を検出し、それによってこの生物学的試料中のT.cruzi感染を検出する工程を包含する。関連する局面では、本発明は、生物学的試料のT.cruzi感染を検出する方法を提供し、この方法は、(a)生物学的試料を、アミノ酸配列Pro Ser Pro Phe Gly G ln Ala Ala Ala Gly Asp Lys、または保存的置換もしくは改変のみが異なるその抗原性改変体を含む第１のポリペプチドと接触させる工程；(b)生物学的試料を、Ala Glu Pro Lys Ser Ala Glu Pro Lys Pro Ala Glu Pro Lys Ser、または保存的置換もしくは改変のみが異なるその抗原性改変体、およびAla Glu Pro Ly s Pro Ala Glu Pro Lys Ser Ala Glu Pro Lys Pro、または保存的置換もしくは改変のみが異なるその抗原性改変体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドと接触させる工程；および(c)生物学的試料中で、上記第１または第２のポリペプチドに結合する抗体の存在を検出し、それによってこの生物学的試料のT.cruzi感染を検出する工程を包含する。本発明のなお別の関連する局面では、生物学的試料のT.cruzi感染を検出する方法が提供され、この方法は、(a)生物学的試料を、Pro Ser Pro Phe Gly Gln A la Ala Ala Gly Asp Lys、または保存的置換もしくは改変のみが異なるその抗原性改変体を含み、そしてさらにAla Glu Pro Lys Ser Ala Glu Pro Lys Pro Ala Glu Pro Lys Ser、または保存的置換もしくは改変のみが異なるその抗原性改変体、およびAla Glu Pro Lys Pro Ala Glu Pro Lys Ser Ala Glu Pro Lys Pro、または保存的置換もしくは改変のみが異なるその抗原性改変体からなる群から選択されるアミノ酸配列をさらに含むポリペプチドと接触させる工程；および(b) 生物学的試料中で、上記ポリペプチドに結合する抗体の存在を検出し、それによってこの生物学的試料のT.cruzi感染を検出する工程を包含する。本発明の別の局面では、配列番号１の残基137のリジンと残基247のアラニンとの間の部分の少なくとも７つの連続する残基、または保存的置換もしくは改変のみが異なるその抗原性改変体を含むポリペプチドが提供される。本発明の関連する局面では、(a)アミノ酸配列Pro Ser Pro Phe Gly Gln Ala A la Ala Gly Asp Lys、または保存的置換もしくは改変のみが異なるその抗原性改変体；および(b)Ala Glu Pro Lys Ser Ala Glu Pro Lys Pro Ala Glu Pro Lys S er、または保存的置換もしくは改変のみが異なるその抗原性改変体、およびAla Glu Pro Lys Pro Ala Glu Pro Lys Ser Ala Glu Pro Lys Pro、または保存的置換もしくは改変のみが異なるその抗原性改変体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される。関連する局面で、上記ポリペプチドをコードするDNA配列、これらのDNA配列を含む発現ベクターおよびこのような発現ベクターで形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞がまた提供される。別の局面では、本発明は、生物学的試料のT.cruzi感染を検出するための診断キットを提供し、このキットは、(a)配列番号１の残基137のリジンと残基247のアラニンとの間の部分の少なくとも７つの連続する残基、または保存的置換もしくは改変のみが異なるその抗原性改変体から本質的になる第１のポリペプチド；および(b)検出試薬を含む。関連する局面では、生物学的試料のT.cruzi感染を検出するための診断キットが提供され、このキットは、(a)アミノ酸配列Pro Ser Pro Phe Gly Gln Ala Ala Ala Gly Asp Lys、または保存的置換もしくは改変のみが異なるその抗原性改変体を含む第１のポリペプチド、ならびにAla Glu Pro Lys Ser Ala Glu Pro Lys Pro Ala Glu Pro Lys Ser、または保存的置換もしくは改変のみが異なるその抗原性改変体、およびAla Glu Pro Lys Pro Ala Glu Pro Lys Ser Ala Glu Pro Ly s Pro、または保存的置換もしくは改変のみが異なるその抗原性改変体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド；および(b)検出試薬を含む。なお別の関連する局面では、本発明は、生物学的試料のT.cruzi感染を検出するための診断キットが提供され、このキットは、(a)アミノ酸配列Pro Ser Pro P he Gly Gln Ala Ala Ala Gly Asp Lys、または保存的置換もしくは改変のみが異なるその抗原性改変体；ならびにAla Glu Pro Lys Ser Ala Glu Pro Lys Pro Al a Glu Pro Lys Ser、または保存的置換もしくは改変のみが異なるその抗原性改変体、およびAla Glu Pro Lys Pro Ala Glu Pro Lys Ser Ala Glu Pro Lys Pro 、または保存的置換もしくは改変のみが異なるその抗原性改変体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む組換えポリペプチド；および(b)検出試薬を含む。別の局面では、本発明は、生物学的試料のLeishmaniaまたはT.cruzi感染をスクリーニングする方法を提供し、この方法は、(a)生物学的試料を、配列番号１の残基１のアルギニンと143位のアラニンとの間の部分、または保存的置換もしくは改変のみが異なるその抗原性改変体を含むT.cruzi抗原と接触させる工程；および(b)生物学的試料中で、この抗原に結合する抗体の存在を検出し、それによって、この生物学的試料のLeishmaniaまたはT.cruzi感染を検出する工程を包含する。なお別の局面では、本発明は、リーシュマニア症またはT.cruzi感染を検出するための診断キットを提供し、このキットは、(a)配列表１のアミノ酸１〜143、または保存的置換もしくは改変のみが異なるその抗原性改変体を含むT.curzi抗原；および(b)検出試薬を含む。関連する局面で、上記のポリペプチドおよび生理学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物、ならびに上記ポリペプチドおよびアジュバントを含むワクチンがまた提供される。本発明の別の局面では、生物学的試料のT.cruzi感染の有無を検出する方法が提供され、この方法は、(a)生物学的試料を、配列番号１の残基137のリジンと残基247のアラニンとの間の部分の少なくとも７つの連続する残基、または保存的置換もしくは改変のみが異なるその抗原性改変体から本質的になるポリペプチドに結合するモノクローナル抗体と接触させる工程；および(b)上記生物学的試料中で上記モノクローナル抗体に結合するT.cruzi寄生体の存在を検出する工程を包含する。関連する局面では、本発明は、生物学的試料のT.cruzi感染の有無を検出する方法を提供し、この方法は、(a)生物学的試料を、Ala Glu Pro Lys Ser Ala Glu Pro Lys Pro Ala Glu Pro Lys Ser、または保存的置換もしくは改変のみが異なるその抗原性改変体、およびAla Glu Pro Lys Pro Ala Glu Pro Lys Ser Ala Gl u Pro Lys Pro、または保存的置換もしくは改変のみが異なるその抗原性改変体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合するモノクローナル抗体と接触させる工程；および(b)生物学的試料中で、このモノクローナル抗体に結合するT.cruzi奇生体の存在を検出する工程を包含する。なお別の関連する局面では、本発明は、生物学的試料のT.cruzi感染の有無を検出する方法を提供し、この方法は、(a)生物学的試料を、アミノ酸Gly Asp Lys Pro Ser Pro Phe Gly Gln Ala Ala Ala Gly Asp Lys Pro Ser Pro Phe Gly Glu Alaを含むポリペプチドに結合するモノクローナル抗体と接触させる工程；および(b)生物学的試料中で、このモノクローナル抗体に結合するT.cruzi寄生体の存在を検出する工程を包含する。本発明のこれらのおよびその他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照すれば明らかとなる。図面の簡単な説明図１は、TcE cDNAのDNA配列を示す。図２は、TcE cDNAの推定アミノ酸配列を、タンデムに並んだ７アミノ酸反復単位のコピーに下線を引いて図示する。図３は、TcEに存在する３つの縮重する７アミノ酸反復単位を含むポリペプチドである、TcErのアミノ酸配列を示す。図４は、TcDのアミノ酸配列を、抗原性TcDポリペプチド配列に下線を引いて図示する。図５は、REP2のアミノ酸配列を示す。図６は、T.cruzi(Tc)感染血清の、溶解液(Lys)、TcDおよびTcEとの反応性を比較するELISAの結果を図示する。内臓リーシュマニア症患者(AVL)由来の血清および非感染正常(N)血清のTcEとの反応性がまた示されている。図７は、５μgの合成コントロール(CON)またはTcErペプチドの非存在下(-)または存在下における、T.cruzi感染血清のTcEに対する競合ELISAの結果を図示する。図８は、溶解液(Lys)、TcDおよびTcErに対するT.cruzi(Tc)感染血清の反応性を評価するELISAの結果を図示する。内臓リーシュマニア症患者(AVL)、皮膚リーシュマニア症患者(CL)由来の血清、および非感染正常(N)コントロール血清のTcE rに対する反応性がまた示されている。発明の詳細な説明上記のように、本発明は、一般に、個体および血液供給品のT.cruzi感染を検出および予防する化合物および方法に関する。本発明の化合物は、一般に、１つまたはそれ以上のT.curziタンパク質の抗原性エピトープを含む。特に、真核生物リボソームタンパク質L19Eに対する35kDT.curzi同族体の抗原性エピトープを含むポリペプチドが開示される。35kDT.curzi同族体(本明細書ではTcEと呼ばれる)の配列は、図２および配列番号１に呈示される。本明細書で用いられる用語「ポリペプチド」は、任意の長さのアミノ酸鎖を包含し、ここでアミノ酸残基は、共有ペプチド結合により結合されている。診断の感度と特異性を増大するために、TcEのエピトープと組み合わせて、さらなるT.cruziタンパク質からの抗原性エピトープの使用もまた開示される。本発明の化合物および方法はまた、この抗原性ポリペプチドの抗原性改変体を包含する。本明細書で用いられる「抗原性改変体」は、列挙されたポリペプチドと、列挙されたポリペプチドの抗原性性質を保持するような保存的置換または改変においてのみ異なるポリペプチドである。「保存的置換」は、あるアミノ酸が、類似の性質を有する別のアミノ酸に、ペプチド化学の当業者がポリペプチドの二次構造およびヒドロパシー性質が実質的に変化しないと予期するように置換する置換である。一般に、以下の群のアミノ酸が保存的交換を代表する：ala、pro 、gly、glu、asp、gln、asn、ser、thr；cys、ser、tyr、thr；val、ile、leu、 met、ala、phe；lys、arg、his；およびphe、tyr、trp、his。好ましい置換は、バリン、トレオニンおよびアラニン間の交換、およびセリンとプロリンとの間の交換を含む。改変体はまた、あるいは、他の保存的改変を含み、これらは、ポリペプチドの抗原性性質、二次構造およびヒドロパシー性質に対して最小の影響を有するアミノ酸の欠失または付加を含み得る。例えば、ポリペプチドは、合成を容易にするために、または固体支持体へのポリペプチドの結合を増大するために、リンカーまたはその他の配列と結合され得る。本発明のある局面では、T.cruzi L19E同族体の抗原性エピトープを含むポリペプチドが提供される。この35kD L19E同族体は、T.cruzi発現ライブラリーを、以下の性質を有する抗原を発現するクローンについてスクリーニングすることにより単離され得る：(1)T.cruzi感染患者からの血清と強い反応性、(2)その感染が、TcD抗原の抗原性エピトープを用いて検出され得ないT.cruzi感染患者からの血清との反応性、および(3)正常および異種患者血清(すなわち、リーシュマニア症、らい病および結核のような、他の感染症を有する患者からの血清)との反応性の欠如。従って、T.cruziの無べん毛型cDNA発現ライブラリーは、最初に、T.cruzi 感染個体からのプールされた血清を用いてスクリーニングされ得る。次いで、プールされた血清と反応するタンパク質を発現するクローンは、その感染が、T.cr uzi TcD抗原の抗原性エピトープ由来の抗原性ポリペプチドを用いて検出され得ないT.cruzi感染個体からの血清を用いて第２のスクリーニングを受ける。最後に、初期の２つのスクリーニングで血清と反応するタンパク質を発現するクローンは、正常または異種患者血清を用いる第３のスクリーニングを受け得る。上記のスクリーニングのすべては、一般に、当業者に公知の方法を用いて、または本明細書に参考として援用される、Sambrookら、Molecular Cloning: A Lab oratory Manual．Cold Spring Harbor Laboratories，Cold Spring Harbor，N.Y .1989に記載のように実施され得る。簡単に述べれば、バクテリオファージライブラリーをプレートに生育させ、そしてフィルターに移し得る。次いで、このフィルターを血清および検出試薬とインキュベートし得る。本発明の文脈では、「検出試薬」は、抗体-抗原複合体に結合し得る任意の化合物であり、次いで、この複合体は、当業者に公知の任意の種々の手段により検出され得る。スクリーニング目的のための代表的な検出試薬は、リポーター基に結合した、プロテインＡ、プロテインＧ、IgGまたはレクチンのような「結合剤」を含む。好適なリポーター基は、酵素、基質、コファクター、インヒビター、色素、放射性核種、化学発光基、蛍光基およびビオチンを含むがこれらに限定されない。より好適には、リポーター基は、テトラメチルベンジジンまたは2,2'-アジノ-ジ-3-エチルベンズチアゾリンスルホン酸のような基質とのインキュベーションにより検出され得る西洋ワサビペルオキシダーゼである。血清中の抗体に結合するタンパク質を発現するcDNAを含むプラークは、当業者に公知の技術により単離および精製され得る。適切な方法は、例えば、Sambrookら、Molecular Cloning：A Laboratory Ma nualに見出され得る。上記のスクリーニングを用いて単離されたT.cruzi L19E同族体(例えばTcE)をコードするcDNAを図１に、そしてTcE cDNAの推定アミノ酸配列を図２に示す。Tc EのN末端部分(図２で下線を引いていない領域)は、真核生物リボソームタンパク質L19Eに相同である。L19E相同性の領域の後に、図２で下線を引いたタンデムに並んだ７アミノ酸の反復の16コピーがある。 TcEの抗原性領域は、一般に、TcE配列の部分を含むポリペプチドを生成し、そしてこのポリペプチドの、T.cruzi感染個体からの血清との反応性を、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を用いて評価することにより決定され得る。T .cruzi感染血清との反応性を評価する適切なアッセイを以下により詳細に記載する。タンデム反復領域(すなわち図２の残基137-247)からの少なくとも７アミノ酸を含むTcEの部分は、一般に、抗原性であることが見出された。従って、TcEの残基137と247との間の配列の少なくとも７アミノ酸部分を含むポリペプチド、およびその抗原性改変体は、本発明の範囲内にある。好ましくは、この抗原性ポリペプチドは、残基137と247との間のTcE配列の少なくとも14のアミノ酸部分を、そしてより好ましくは少なくとも21のアミノ酸部分を含む。特定の実施態様では、L19Eに相同なTcEのN末端領域(すなわち残基1-136)は、抗原性ポリペプチドから実質的に排除され、抗リーシュマニア抗体との交差反応性を避ける。これらの実施態様では、ポリペプチドは、一般に、N末端領域からの約５を超えない連続するアミノ酸を含む。最も好ましくは、抗原性ポリペプチドは、３つの縮重７アミノ酸反復単位を含む21アミノ酸ペプチドであるTcErである。TcErの配列は図３に提供される。関連する局面では、複数のT.cruziペプチドの抗原性エピトープを含む組み合わせポリペプチドが開示される。「組み合わせポリペプチド」は、異なるT.cruz iペプチドまたはその抗原性改変体の抗原性エピトープが、ペプチド結合により単一のアミノ酸鎖に結合されているポリペプチドである。エピトープは直接結合され得るか(すなわち介在するアミノ酸がない)、またはエピトープの抗原性性質を有意に改変しないリンカー配列(例えば、Gly-Cys-Gly)により結合され得る。好適な実施態様では、組み合わせポリペプチドは、抗原性TcEエピトープを、T .cruzi TcD抗原由来の抗原性エピトープ(米国特許第5,304,371号に開示される) および/またはPEP2抗原性エピトープ(例えば、Peraltaら、J.Clin.Microbiol.32 :971-74、1994で論議されている)とともに含む。組み合わせペプチドにおける使用に好適なTcEエピトープは上記のものである。TcD抗原性エピトープは、好ましくは、アミノ酸配列Ala Glu Pro Lys Ser Ala Glu Pro Lys Pro Ala Glu Pr o Lys Serまたはアミノ酸配列Ala Glu Pro Lys Pro Ala Glu Pro Lys Ser Ala G lu Pro Lys Proを有し、そしてPEP2エピトープは、好ましくは、アミノ酸配列Gl y Asp Lys Pro Ser Pro Phe Gly Gln Ala Ala Ala Gly Asp Lys Pro Ser Pro Ph e Gly Gln Alaを有する(図５に提供される)。本発明の組み合わせポリペプチドはまた、PEP2と組み合わせてTcD抗原性エピトープを、TcEの抗原性エピトープとともにまたはともなわずして含み得る。組み合わせポリペプチドの一端にTcEエピトープが位置すると、固体支持体への優れた結合を提供することが見出された。従って、TcEエピトープを含むポリペプチドについて、このエピトープは、好ましくは、組み合わせポリペプチドのN末端またはC末端のいずれかに位置する。本発明のポリペプチドは、当業者に周知の技術を用いて生成され得る。約100 より少ないアミノ酸、そして、一般に、約50より少ないアミノ酸を有するポリペプチドは、例えば、伸長するアミノ酸鎖にアミノ酸が連続的に添加される、Merr ifieldの固相合成法を用いて合成され得る。Merrifield、J.Am.Chem.Soc.85:214 9-2146、1963を参照。ポリペプチドの自動合成用の装置は、Applied Biosystems .Inc.,Foster City,CAのような供給者から市販されている。従って、例えば、22 アミノ酸のPEP2ポリペプチド、またはその部分は、この方法により合成され得る。同様に、好ましくはTcEまたはTcDタンパク質の１〜３反復単位を含むTcEまたはTcDの抗原性エピトープは、自動合成器を用いて調製され得る。あるいは、本発明のポリペプチドは、培養した宿主細胞におけるこのポリペプチドをコードする組換えDNAの発現により調製され得る。好ましくは、宿主細胞は、E.coli、酵母、昆虫細胞株(SpodopteraまたはTrichoplusia)、または(これらに制限されないが)CHO、COSおよびNS-1を含む哺乳動物細胞株である。この方法で発現されたDNA配列は、TcEおよびTcDのような天然に存在するタンパク質、天然に存在するタンパク質の部分、またはこのようなタンパク質の抗原性改変体をコードし得る。本発明の発現されたポリペプチドは、一般に、実質的に純粋な形態で単離される。ポリペプチドは、好ましくは少なくとも80重量％の純度まで、より好ましくは少なくとも95重量％の純度まで、そして最も好ましくは少なくとも99重量％の純度まで単離される。一般に、このような精製は、例えば、硫酸アンモニウム分画、SDS-PAGE電気泳動、およびアフィニティークロマトグラフィーの標準的技術を用いて達成され得る。本発明の別の局面では、個体および血液供給品のT.cruzi感染を検出する方法が開示される。一般に、T.cruzi感染は、抗体を含む任意の生物学的試料中で検出され得る。好ましくは、試料は、血液、血清、血漿、唾液、脳脊髄液または尿である。より好ましくは、試料は、患者または血液供給品から得た血液または血清試料である。簡単に述べれば、T.cruzi感染は、上記で論議された任意のポリペプチドまたは組み合わせポリペプチド、またはその抗原性改変体を用いて検出され得る。より特定すれば、単数または複数のポリペプチドを用いて、予備決定したカットオフ値と比較して、試料中のこの単数または複数のポリペプチドに対する抗体の存在または不在を決定する。試料中の抗体を検出するために精製抗原を用いる当業者に公知の種々のアッセイフォーマットが存在する。例えば、本明細書に参考として援用される、Harlow およびLane，Antibodies: A Laboratory Mannual．Cold Spring Harbor Laborat ory，1988を参照のこと。好ましい実施態様では、このアッセイは、固体支持体上に固定化されたポリペプチドの使用を含み、試料から抗体を結合し、そして取り除く。次いで、結合した抗体は、抗体/ペプチド複合体に結合し、そして検出可能なリポーター基を含む検出試薬を用いて検出され得る。適切な検出試薬は、抗体/ペプチド複合体およびリポーター基で標識された遊離のポリペプチドに結合する抗体を含む(例えば、半競合アッセイにおいて)。あるいは、競合アッセイが利用され得、そこでは、ポリペプチドに結合する抗体がリポーター基で標識され、そして試料との抗原のインキュベーション後、固定化抗原に結合させる。試料の成分が、標識抗体のポリペプチドへの結合を阻害する程度は、試料の固定化ポリペプチドとの反応性の指標である。固体支持体は、抗原が結合し得る当業者に公知の任意の固体物質であり得る。例えば、固体支持体は、マイクロタイタープレート中の試験ウェル、またはニトロセルロース膜または他の適切な膜であり得る。あるいは、支持体は、ガラス、ファイバーガラス、ラテックス、またはプラスチック材料(ポリスチレンまたはポリビニルクロライドなど)のような、ビーズまたはディスクであり得る。支持体はまた、例えば、米国特許第5,359,681号に開示されるような、磁気粒子またはファイバー光学センサーであり得る。ポリペプチドは、特許および科学的文献に詳細に記載されている当業者に公知の種々の技術を用いて固体支持体に結合され得る。本発明の文脈では、用語「結合」は、吸着のような非共有結合的会合、および共有結合(これは、抗原と支持体上の官能基との間の直接結合であり得、または架橋剤による結合であり得る) の両者をいう。マイクロタイタープレート中のウェルまたは膜への吸着による結合が好ましい。このような場合、吸着は、適切な緩衝液中のポリペプチドを、適切な時間の間、固体支持体と接触させることにより達成され得る。接触時間は、温度により異なるが、代表的には、約１時間と１日との間である。一般に、プラスチックマイクロタイタープレート(ポリスチレンまたはポリビニルクロライドなど)のウェルを、約10ng〜約１μgの範囲の量(そして、好ましくは100ng)のポリペプチドと接触させれば、適切な量の抗原を結合するに十分である。ニトロセルロースは、cm³あたり約100μgのタンパク質を結合する。固体支持体へのポリペプチドの共有結合は、一般に、最初、支持体を、支持体およびポリペプチド上のヒドロキシル基またはアミノ基のような官能基の両方と反応する二官能性試薬と反応させることにより達成され得る。例えば、ポリペプチドは、適切なポリマーコーティングを有する支持体に、ベンゾキノンを用いてまたは支持体上のアルデヒド基のポリペプチド上のアミンおよび活性水素との縮合により結合され得る(例えば、Pierce Immunotechnology Catalog and Handboo k(1991)、A12-A13；Jerry March．Advanced Organic Chemistry(第２版、1977) 、820-823参照のこと)。特定の実施態様では、このアッセイは、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)である。このアッセイは、最初、通常はマイクロタイタープレートのウェルである固体支持体上に固定化されたポリペプチド抗原を、試料と、試料内のポリペプチドに対する抗体が、固定化ポリペプチドに結合されるように、接触させることにより実施され得る。次いで、非結合試料を、固定化ポリペプチドから除去し、そして固定化抗体-ポリペプチド複合体に結合し得る検出試薬が添加される。次いで、固体支持体に結合したままの検出試薬の量を、特定の検出試薬に適切な方法を用いて測定する。一旦、ポリペプチドが支持体上に固定化されれば、残存する支持体上のタンパク質結合部位は、代表的には、ブロックされる。任意の適切なブロッキング試薬が当業者に公知であり、ウシ血清アルブミンまたはTween 20^TM(Sigma Chemical Co.)などがある。次いで、固定化ポリペプチドを、試料とインキュベートし、そして(試料中に存在すれば)抗体を抗原に結合させる。試料は、インキュベーションの前に、リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)のような適切な希釈剤で希釈され得る。一般に、適切な接触時間(すなわちインキュベーション時間)は、T.cruzi感染試料内のT.cruzi抗体の存在を検出し得るに十分である時間である。好ましくは、接触時間は、結合抗体と非結合抗体との間の平衡で達成されるレベルの少なくとも95％である結合レベルを達成するに十分である。当業者は、平衡を達成するために必要な時間は、経時的に生じる結合のレベルをアッセイすることにより容易に決定され得ることを認識する。室温では、約30分のインキュベーション時間がほぼ十分である。次いで、非結合試料は、0.1％のTween20^TMを含むPBSのような適切な緩衝液で固体支持体を洗浄することにより除去され得る。次いで、検出試薬を固体支持体に添加し得る。適切な検出試薬は、固定化抗体-ポリペプチド複合体に結合し、しかも当業者に公知の任意の種々の手段により検出され得る任意の化合物である。好ましくは、検出試薬は、リポーター基に結合した結合剤(例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、免疫グロブリン、レクチンまたは遊離の抗原など)を含む。好適なリポーター基は、酵素(西洋ワサビペルオキシダーゼなど)、基質、コファクター、インヒビター、色素、放射性核種、化学発光基、蛍光基およびビオチンを含む。結合剤のリポーター基への結合は、当業者に公知の標準的な方法を用いて達成され得る。一般的な結合剤はまた、多くの供給元(例えば、Zymed Labor atories.San Francisco.CAおよびPierce.Rockford.IL)から、種々のリポーター基に結合して購買し得る。次いで、検出試薬を、固定化抗体-ポリペプチド複合体と、結合抗体を検出するに十分な時間インキュベートする。適切な時間は、一般に、製造者の指示から、または経時的に生じる結合のレベルをアッセイすることにより決定され得る。次いで、非結合検出試薬を除去し、そして結合検出試薬をリポーター基を用いて検出する。リポーター基を検出するために用いる方法は、リポーター基の性質に依存する。放射活性基には、シンチレーションカウンティングまたはオートラジオグラフ法が一般に適切である。分光学的方法を用いて、色素、化学発光基および蛍光基を検出し得る。ビオチンは、異なるリポーター基(通常、放射活性または蛍光基または酵素)に結合したアビジンを用いて検出され得る。酵素リポーター基は、一般に、基質を添加し(一般に特定の時間で)、その後反応生成物の分光学的分析またはその他の分析により検出され得る。試料中のT.cruzi抗体の存在または非存在を測定するために、固体支持体に結合したままのリポーター基から検出される信号を、一般には、予備決定したカットオフ値に対応する信号と比較する。好ましくは、このカットオフ値は、固定化抗原を、非感染患者からの試料とインキュベートしたときに得られる平均中間信号である。一般に、予備決定したカットオフ値を超えて３標準偏差である信号を生成する試料を、T.cruzi抗体およびT.cruzi感染について陽性であると考える。関連する実施態様では、アッセイは、フロースルーまたは細片試験フォーマットで実施され、そこでは、抗原は、ニトロセルロースのような膜上に固定化される。フロースルー試験では、試料内の抗体は、試料が膜を通過するにつれて固定化ポリペチドに結合する。次いで、検出試薬(例えば、プロテインＡ-コロイド金 )が、検出試薬を含む溶液が膜を通過して流れるにつれ、抗体-ポリペプチド複合体に結合する。次いで、結合した検出試薬の検出を上記のように実施し得る。細片試験フォーマットでは、ポリペプチドが結合する膜の一端を試料を含む溶液中に浸漬する。試料が膜に沿って検出試薬を含む領域を通って固定化ポリペプチドの領域まで移動する。ポリペプチドにおける検出試薬の濃度は、試料中のT.cruz i抗体の存在を示す。このような試験は、代表的には、極微量(例えば一滴)の患者血清または血液を用いて実施され得る。勿論、本発明のポリペプチドとの使用に適切である多くの他のアッセイプロトコルが存在する。上記の記載は例示のみであることが意図される。上記で論議されたアッセイの１つの実施態様では、抗体は、TcEの残基137と残基247との間の配列の少なくとも７アミノ酸部分、好ましくは14アミノ酸部分、そしてより好ましくは少なくとも21アミノ酸部分を含むポリペプチド、またはその抗原性改変体を用いて検出される。一般に、L19Eに相同であるTcEのN末端領域 (すなわち残基１-136)は、抗原性ポリペプチドから実質的に排除され、抗リーシュマニア症抗体との交差反応性を避ける。最も好ましくは、抗原性ポリペプチドはTcErである。さらなる実施態様では、上記のアッセイの感度を増大する方法が開示される。一般に、感度は、１つまたはそれ以上のさらなるT.cruzi抗原を、TcEエピトープと組み合わせて用いることにより顕著に改善され得る。特に、上記で提供される TcDおよび/またはPEP2(またはその抗原性改変体)からの抗原性エピトープは、Tc Eポリペプチドと混合され得る。あるいは、TcD抗原性エピトープは、TcE抗原の非存在下で、PEP2と組み合わされ得る。これらのアッセイは、別個のポリペプチドのセットを用いて実施され得る。ある２-ポリペプチド実施態様では、ポリペプチドの１つがTcEの抗原性エピトープを含み、そして他がTcDの抗原性エピトープを含む。別のこのような実施態様では、ポリペプチドの１つがTcEの抗原性エピトープを含み、そして他がPEP2またはその抗原性部分を含む。第３のこのような実施態様では、ポリペプチドの１つがPEP2抗原性エピトープを含み、そして他がTcDのエピトープを含む。アッセイはまた、１つがTcEエピトープを含み、１つがTcDエピトープを含み、そして第３番目がPEP2エピトープを含む３つのポリペプチドを用いて実施し得る。好ましくは、抗原性ポリペプチドは、上記のように、マイクロタイタープレートのウェルまたは膜のような固体支持体上に吸着により固定化され、ほぼ同量のポリペプチドの各々が支持体と接触し、そして支持体と接触するポリペプチドの総量は、約10ng〜約100μgの範囲である。残りの工程は、一般に、上記のように実施され得る。別の実施態様では、組み合わせポリペプチドが用いられる。上記で論議されたように、組み合わせポリペプチドは、異なるT.cruziペプチドの抗原性エピトープが、１つまたはそれ以上のペプチド結合により、単一のアミノ酸鎖に結合されているポリペプチドである。任意の上記の抗原性エピトープまたはその抗原性改変体が、組み合わせポリペプチド中に組み込まれ得る。従って、組み合わせポリペプチドは、TcDエピトープに結合したTcEエピトープ；PEP2に結合されたTcEエピトープ；PEP2に結合されたTcDエピトープ；または同じポリペプチド内に一緒に結合されたTcEエピトープ、TcDエピトープおよびPEP2を含み得る。本発明の別の局面では、T.cruziおよび/またはLeishmania種について生物学的試料をスクリーニングするための方法が提供される。これらの方法では、生物学的試料は、TcEに対する抗体、またはその特定の部分について分析される。一般に、アッセイは、図２で表されるような、TcEのアミノ酸１〜143を含むポリペプチドが用いられる点を除いて、上記のように実施され得る。この抗原のN末端部分(アミノ酸１-136)は、Leishmaniaに対する抗体と反応することが見出された。 L.major、L.tropica、L.chagasi、L.donovani、L.infantum、L.guyanesis、L.br aziliensis、L.amazonensisおよびL.panamensisを含む、Leishmaniaの任意の種は、この配列を用いて検出され得る。TcEのタンデム反復部分からのアミノ酸配列を含むことは、同様にT.cruziに特異的な抗体の検出を可能にする。アミノ酸1 45とカルボキシ末端との間のTcE部分からのさらなるアミノ酸もまた含まれ得る。好適な実施態様では、T.cruziおよびLeishmania両者のスクリーニングにおいて用いられる抗原は、図２で示される完全長のTcEタンパク質である。少なくともアミノ酸１〜136および反復単位を含むTcEの抗原性改変体またはその部分もまた用いられ得る。 T.cruziおよび/またはLeishmaniaに対する上記スクリーニングの後、寄生体は、T.cruziまたはLeishmaniaのいずれかに特異的な方法を用いて同定され得る。例えば、上記の任意の方法を用いて、試料中のT.cruziの存在を検出し得る。当業者に公知の任意の方法を用いてLeishmaniaを検出し得る。本発明のなお別の局面では、TcE、TcDおよびPEP2の１つまたはそれ以上のエピトープを含むポリペプチドに対する単一特異的な抗体に(これはポリクローナルまたはモノクローナルであり得る)を用いて、生物学的試料中のT.cruziを検出する方法が提供される。好適なエピトープは、上記で列挙されたエピトープおよびその抗原性改変体である。これらの精製または合成ポリペプチドに対する抗体は、当業者に公知の種々の任意の技術により調製され得る。例えば、Harlowおよび Land，Antibodies:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory,1988 を参照のこと。１つのこのような技術では、抗原性ポリペプチドを含む免疫原を、最初、広範な哺乳動物(例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジおよびヤギ) のいずれかに注射する。この工程では、本発明のポリペプチドを、改変なしで免疫原として供し得る。あるいは、特に相対的に短いポリペプチドには、ポリペプチドが、ウシ血清アルブミンまたはキーホールリンペットヘモシアニンのようなキャリアタンパク質に結合されたとき、良好な免疫応答が惹起され得る。免疫原は、動物宿主中に、好ましくは、１つまたはそれ以上の追加免疫を取り入れた予備決定したスケジュールに従って注入され、そして動物から定期的に採血する。次いで、ポリペプチドに特異的なポリクローナル抗体が、例えば、適切な固体支持体に結合したポリペプチドを用いるアフィニティクロマトグラフィーにより、このような抗血清から精製され得る。目的の抗原性ポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体は、例えば、Kohler およびMilstein，Eur.J.Immunol.6:511-519、1976の技術、およびそれに対する改良を用いて調製され得る。要約すれば、これらの方法は、所望の特異性(すなわち、目的のポリペプチドとの反応性)を有する抗体を生成し得る不死化細胞株の調製を含む。このような細胞株は、例えば、上記のように免疫化された動物から得た脾臓細胞から生成され得る。次いで、脾臓細胞は、例えば、ミエローマ細胞融合パートナー(好ましくは、免疫化された動物と同系であるパートナー)との融合により不死化される。種々の融合技術が用いられ得る。例えば、脾臓細胞およびミエローマ細胞は、数分間非イオン性界面活性剤を用いて結合され得、次いで、ハイブリッド細胞(ミエローマ細胞ではない)の増殖を支持する選択培地上に低密度でまかれる。好適な選択技術は、HAT(ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン)選択を用いる。十分な時間の後(通常１〜２週間)、ハイブリッドのコロニーが観察される。単一のコロニーを選択し、そしてポリペプチドに対する結合活性を試験する。高い反応性および特異性を有するハイブリドーマが好ましい。モノクローナル抗体が、増殖するハイブリドーマコロニーの上清から単離され得る。さらに、種々の技術（例えば、マウスのような適切な脊椎動物宿主の腹膜腔中へのハイブリドーマ細胞株の注射）を用いて、収率を増大し得る。次いで、モノクローナル抗体を腹水または血液から回収し得る。混入物は、クロマトグラフィー、ゲル濾過、沈殿、および抽出のような従来技術により、抗体から除去され得る。 TcE、TcDおよびPEP2の１つまたはそれ以上のエピトープを含むポリペプチドに対する単一特異性の抗体を使用して、直接または競合的であり得る、種々の免疫アッセイの１つを用いて、生物学的試料のT.cruzi感染を検出し得る。簡単に述べれば、１つの直接アッセイフォーマットでは、単一特異性の抗体は、(上記のような)固体支持体上に固定化され、そして試験される試料と接触され得る。非結合試料を除去した後、リポーター基で標識された第２の単一特異的抗体を添加し、そして結合抗原を検出するために用い得る。例示の競合アッセイでは、試料は、適切なリポーター基で標識されたモノクローナルまたはポリクローナル抗体と組み合わせられ得る。次いで、試料と抗体の混合物は、適切な固体支持体上に固定化されたポリペプチド抗原と組み合わせられ得る。試料中の抗原に結合しなかった抗体を固定化抗原に結合させ、そして残りの試料および抗体を除去する。固体支持体に結合した抗体のレベルは、試料中の抗原レベルに反比例する。従って、固体支持体に結合した抗体のより低いレベルは、試料中のT.cruziの存在を示す。ELISAにおいて上記で論議した任意のリポーター基を用いて、単一特異性の抗体を標識し得、そして結合は用いたリポーター基に適切である種々の任意の技術により検出され得る。試料中のT.cruziを検出するために単一特異性抗体を用いる他のフォーマットは、当業者に明らかであり、そして上記のフォーマットは例示目的にのみ提供される。本発明の別の局面では、ワクチンおよび薬学的組成物が、哺乳動物におけるT. cruzi感染およびその合併症の予防のために提供される。薬学的組成物は、一般に、１つまたはそれ以上の、T.cruziタンパク質の抗原性エピトープを含む１つまたはそれ以上のポリペプチド、および生理学的に受容可能なキャリアを含む。ワクチンは、免疫応答の増大のために、１つまたはそれ以上の上記ポリペプチドおよびアジュバントを含む。投与およびポリペプチド用量の経路および頻度は、個体により変化し、そして他の原生動物感染に対する免疫化で現在用いられているそれらに準じ得る。一般に、薬学的組成物およびワクチンは、注射(例えば、筋肉内、静脈内または皮下) 、鼻腔内(例えば吸入)または経口により投与され得る。１〜４倍の投与量が２〜６週間の間に投与され得る。好ましくは、２倍の投与量が、第１回目より２〜４週間後の第２回目投与量とともに投与される。適切な投与量は、所定の期間T.cruz i感染から哺乳動物を保護するに十分である、処置動物で抗体を惹起するために有効であるポリペプチドの量である。一般に、投与量に存在するポリペプチドの量は、宿主kgあたり約１pg〜約100mg、代表的には、約10pg〜約１mg、そして好ましくは、約100pg〜約１μgの範囲である。適切な投与量サイズは、動物のサイズとともに変化するが、代表的には、10〜60kgの動物について、約0.01mL〜約５ mLの範囲である。本発明の薬学的組成物に当業者に公知の任意の適切なキャリアが用いられ得るが、キャリアのタイプは、投与様式に依存して変化する。皮下注射のような非経口投与では、好ましくは、キャリアは、水、生理食塩水、アルコール、脂質、ワックス、または緩衝液を含む。経口投与では、上記のキャリアまたは固体キャリア(マンニトール、ラクトース、スターチ、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、スクロース、および炭酸マグネシウムなど)のいずれかが用いられ得る。生分解性のマイクロスフェア(例えば、ポリ乳酸ガラクチド)もまた、本発明の薬学的組成物用のキャリアとして用いられ得る。種々のアジュバントのいずれかを、本発明のワクチンで使用し、免疫応答を非特異的に増大し得る。大部分のアジュバントは、急速な異化作用から抗原を保護するために設計された基質(水酸化アルミニウムまたは鉱物油、およびリピドＡ、Bordella pertussisまたはMycobacterium tuberculosisのような免疫応答の非特異的刺激剤など)を含む。このようなアジュバントは、例えば、フロイントの不完全アジュバントおよび完全アジュバント(Difco Laboratories，Detroit．MI )ならびにMerck Adjuvant 65(Merck and Company,Inc.，Rahway，NJ)のように市販されている。以下の実施例は例示のみ提供され、制限する意図はない。実施例実施例１ TcE の調製本実施例は、TcEをコードするcDNAの単離およびcDNAを用いるTcEの調製を例示する。総RNAを、無べん毛型期のT.cruzi MHOM/CH/00/Tulahuen株から、酸グアニジウムイソチオシアネート法を用いて単離した。このRNAから、非増幅cDNA発現ライブラリーを、ZAP-cDNA単方向性クローニングキット(Stratagene，Inc.，La Joll a，CA)を用いて調製した。簡単に述べれば、最初のcDNAを、XhoIアダプターを有するオリゴdTプライマーを用いて構築した。第２鎖を合成した後、EcoRIアダプターを添加し、そして二本鎖cDNAを、XhoIで消化し、そしてEcoRIとXhoIで予め消化した単一ザップのラムダファージ中に結合した。ライブラリーの免疫スクリーニングには、５人のT.cruzi感染個体からの血清試料をプールした。抗E.coli反応性を、吸着によるスクリーニングの前に血清から除去した。60,000pfuの非増幅ライブラリーを、血清プールを用いてスクリーニングし、そして血清と反応するタンパク質を発現するプラークを、プロテインＡ-西洋ワサビペルオキシダーゼ(ABTS基質とともに)を用いて検出し、単離した。pBSK(-)ファージミド(Stratagene，Inc.，La Jolla，CA)の切除を製造者のプロトコルに従って実施した。重複クローンを、エキソヌクレアーゼIII消化により生成し、そして一本鎖テンプレートを、VCSM 13ヘルパーファージを用いた感染後に単離した。DNAを、ジデオキシ鎖ターミネーション法により、またはTaqジターミネーター系により、Applied Biosystem自動化シークエンサー、モデル373 Ａを用いて配列決定した。次いで、血清と反応したタンパク質を発現した42のクローンをこのスクリーニングから単離した。単離されたクローンのうち、患者血清と強くまたは非常に強く反応した33を精製し、そして配列決定した。これらクローンの12(約35％)が、高度に免疫原性であるT.cruziＰプロテインファミリーのメンバーであった。１つのクローンは、ヒートショック抗原遺伝子に対応した。２つのクローンは、T.cruziユビキチン遺伝子と同一の配列を示した。残りの18のクローンは、新規なT.cruzi遺伝子であった。これらのうち６つは、真核生物リボソームタンパク質(L19E、S8およびS 期特異的)と配列類似性を有し、そして12は、GenBank中の配列に相同でない遺伝子であった。単離されたクローンを、Leishmania感染個体からの異なる患者血清を用いて上記の手順によりさらにスクリーニングした。Ｐプロテインファミリーのメンバーは、異なる血清と交差反応性を示し、そしてさらに追求されなかった。次いで、残りのクローンを、T.cruziに感染しているが、その感染がTcDの抗原性エピトープを用いて検出され得なかった個体からの血清を用いてスクリーニングした。真核生物リボソームタンパク質と配列類似性を有していたクローンは、TcD陰性血清と強く反応した。これらのクローンのうち、L19E同族体は、真核生物リボソームタンパク質に対するその相同性がタンパク質のN末端部分に限られていた点で独特であった。この同族体(TcE)は、試験血清と特別に反応性であった。TcEをコードするcDNAの配列を図１に示し、そして推定アミノ酸配列を図２に示す。完全長TcEを生成し、そしてTcEをコードするcDNA挿入片を含む発現ベクターを用いて形質転換したE.coliから精製した。形質転換した細菌コロニーを用いて20 mlのLB-ブロスに接種し、そして37℃で１晩増殖させた。次いで、500ml培養物を、非誘導１晩培養物とともに50:1希釈で接種した。この培養物を、37℃で、A560 が約0.4〜0.5になるまで増殖させ、次いでIPTGを、最終濃度２mMに添加し、培養物を４時間増殖させた。細胞を、遠心分離により回収し、溶菌し、そしてペレットおよび可溶性成分に分画した。可溶性上清中に残ったTcEを、連続的な硫酸アンモニウム沈澱により分画した。均質にいたる精製は、調製SDS-PAGE電気泳動、次いで組換え抗原の切除および電気溶出により達成した。実施例２ TcEr の調製本実施例は、TcEの抗原性エピトープを含むポリペプチドの調製を例示する。T cEの抗原性エピトープを示す最小配列は、１つの７アミノ酸反復であるが、３つの縮重反復を有するペプチド配列を、反応性を最大にするための研究に選択した。TcErポリペプチドを、ABI 430Aペプチド合成機上で、HPTU(O-ベンゾトリアゾール-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート)活性化を用いるFMOC化学を用いて合成した。Gly-Cys-Gly配列をペプチドのアミノ末端に結合し、ペプチドの結合または標識の方法を提供した。固体支持体からのペプチドの切断は、以下の切断混合物を用いて行った：トリフルオロ酢酸：エタンジチオール:チオアニソール：水：フェノール(40：１：２：２：３)。２時間の切断後、ペプチドを、冷メチル-t-ブチル-エーテル中で沈澱させた。次いで、ペプチドペレットを、0.1%トリフルオロ酢酸(TFA)を含む水に溶解し、そしてC18逆相HPLC による精製に先だって凍結乾燥した。水(0.1%TFAを含む)中の０%〜60%アセトニトリル(0.1%TFAを含む)グラジエントを用いてペプチドを溶出した。純粋画分の凍結乾燥後、ペプチドを、電子スプレーマススペクトル法を用いて、およびアミノ酸分析により特徴付けた。この合成ペプチド(TcEr)は図３に示す配列を有する。実施例３血清中のT.cruzi感染の検出本実施例は、本発明の化合物および方法を用いるT.cruzi感染の検出を例示する。以下に記載するアッセイは、ELISAフォーマットで実施した。Ａ．TcE TcE抗原を、ELISAによる患者血清の血清学的評価のために、上記のように誘導 E.coli抽出物から精製した。ELISAアッセイは以下のように実施した。マイクロタイタープレートを、４℃で１晩、ウェルあたり50μlのコーティング緩衝液中2 5ngの組換えTcEでコートした。PBS/0.1%Tween^TM20(PBS-T)で洗浄した後、50μl の血清(1：100希釈)を添加し、そして室温で30分間インキュベートした。PBS-T を用いてさらなる洗浄工程を実施した。プロテインＡ-西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体をPBS-T中１：10,000に希釈し、そして50μlの希釈結合体を各ウェルに添加し、そして室温で30分間インキュベートした。PBS-Tを用いる洗浄工程を再び繰り返し、そしてウェルあたり100μlの基質(ABTS/H₂O₂、Zymed Kit、Catal og No.00-2011)を添加し、光を少なくして室温で30分間インキュベートした。比色反応を、100μlの５%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)で終結し、吸光度を405nm で読みとった。最初に試験した36のT.cruzi感染血清のうち、35(97.2%)が、TcEを用いて、0.2 5〜2.0より大きい範囲の吸光度値で陽性と試験された。平均の吸光度値が図６に示され、それはまた、TcEの反応性を、TcDおよび溶解液の反応性と比較している。特に重要なことに、TcDに対して陰性または低い抗体力価のいずれかを有していた８つの患者血清のすべてが、TcEと比較的強く反応した。これらの結果を以下の表１に示す。 TcEとは低い吸光度値を有していたいくつかの患者血清が、TcDと反応性であったことがまた見出された。従って、TcEは、TcDを相補し、それによって診断感度を増加する能力を有する。 TcEの特異性を、Leishmania感染個体からの血清および正常血清を用いてさらに評価した。Leishmania感染個体(AVL)からの血清との交差反応性が、図６に示されるように観察された。従って、完全長TcE抗原を用いて、T.cruziまたはLeis hmania感染のいずれかの存在について患者をスクリーニングし得る。しかし、Tc Eを用いる陽性結果の後、この２つの寄生体を区別するために、T.cruziまたはLe ishmaniaのいずれかに特異的なさらなる試験を実施する必要がある。Ｂ．TcEr TcErの反応性を評価するために、阻害試験においてこのペプチドを用い、TcE に対するT.cruzi感染血清の結合について競合するその能力を測定した。競合ELI SAを、以下のように実施した。マイクロタイタープレートを、４℃で１晩、ウェルあたり50μlのコーティング緩衝液中25ngの組換えTcEを用いてコートした。PB S-Tを用いて洗浄した後、T.cruzi感染個体から得た50μlの血清(1：100に希釈し、そして５μgのペプチドと室温で１時間プレインキュベートした)を添加し、そして室温で30分間インキュベートした。結合した抗体を、プロテインＡ-西洋ワサビペルオキシダーゼをABTS基質とともに用い、そして吸光度を405nmで読みとることにより検出した。試験した７つの個々のT.cruzi感染血清では、TcErは、6 2%〜90%の範囲の阻害値で、TcEに対する血清結合の競合に有効であった。TcEの非コード読みとり枠由来のアミノ酸残基を有するコントロールペプチドは、同じ競合アッセイで最小の効果を有していた。これらの結果を図７に示す。従って、 TcErは、TcEの免疫優性Ｂ細胞エピトープを示す。 TcEr反応性の特異性もまた、溶解液およびTcDと比較した血清反応性とともに評価した。これらの実験ではELISAが実施され、そこでは、マイクロタイタープレートを４℃で１晩、ウェルあたり50μlのコーティング緩衝液中100ngのT.cruz i溶解液、ウェルあたり250ngの組換えTcDペプチド(すなわち、アミノ末端にGly- Cys-Gly配列が結合した図４で下線をひいた15アミノ酸配列を有するポリペプチド)、またはウェルあたり25ngの合成TcErペプチドでコートした。PBS-Tで洗浄した後、T.cruzi感染個体からの50μlの血清(１：100希釈)を添加し、そして室温で30分間インキュベートした。結合した抗体を、プロテインＡ-西洋ワサビペルオキシダーゼを用いて検出し、そして吸光度を405nmで測定して検出した。この実験からの結果を、図８に示す。患者血清を陽性として評価するための基準として、正常血清の平均中間を超える３標準偏差を用い、TcErを用いて試験したとき、69のT.cruzi感染血清試料のうち66(95.6%)が陽性であり、そして1.16の平均吸光度値を有していた。図８はまた、TcErと、内臓リーシュマニア症患者(AVL)、皮膚リーシュマニア症(CL)、および非感染正常(N)コントロール血清からの血清との反応性を示す。完全長TcE抗原に対して陽性であった16のAVL感染血清のすべては、アッセイをTc Erを用いて実施したとき陰性であった。従って、異種Leishmania感染血清のTcE との交差反応性は、非反復L19E相同ドメインに対して向けられた。本発明者らはまた、皮膚リーシュマニア症(CL)の個体からの患者血清のTcErとの反応性を試験した。39のCL患者血清のすべては、アッセイをTcErを用いて実施したとき陰性であった。これらの結果は、TcErが、T.cruzi感染個体からの血清とではTcD同様に反応性であり、しかもTcErがT.cruziの検出に高度に特異的であることを示している。従って、TcErは、T.cruzi感染に感受性で特異的な診断抗原としての要求を満たしている。Ｃ．多重抗原性ポリペプチド上記のアッセイの感度を増大するために、各々が異なるT.cruzi抗原からのエピトープを含む複数のポリペプチドを用いてアッセイを繰り返した。特に、TcD とPEP2ポリペプチドのように、TcDとTcEポリペプチドを組み合わせた。これらの実験のすべてにおいて、PEP2ポリペプチドは、アミノ末端にGly-Cys-Gly配列が結合した図５に示された22のアミノ酸配列からなり、そしてTcDペプチドは上記のようであった。これらの組み合わせの反応性は、ELISAフォーマットを用いて評価し、そして個々にポリペプチドの各々の反応性と比較した。 ELISAアッセイは以下のように実施した。プラスチックの96ウェルプレート(Co rning Easy Wash High Binding．Corning Laboratories．Corning．NY)を、50μ lのペプチドまたはペプチドの混合物でコートした。これらのアッセイで用いたT cDペプチドは、配列Ala Glu Pro Lys Ser Ala Glu Pro Lys Pro Ala Glu Pro Ly s Serを有し、そして50μl中に10μg/mlの濃度で存在した。PEP2配列は、図５に示す22のアミノ酸配列であり、そしてこのペプチドは、50μl中に2.5μl/mlの濃度で存在した。TcErポリペプチドは、図３に示す配列を有し、そして50μl中に2 5ng存在した。ペプチドは、0.05M炭酸緩衝液(pH9.6)中で希釈した。プレートを3 7℃で１時間インキュベートし、そして使用するまで４℃で１ケ月までの間維持した。使用には、感作ウェルを、0.3%Tween 20を含む0.01Mリン酸緩衝化生理食塩水(pH7.2)(PBS/T)を用いて洗浄した。陽性コントロール、陰性コントロールおよび未知の血清試料を、0.5%ウシ血清アルブミンを含むPBS/T中で１：20希釈し、そして各ウェルに50μlを添加した。室温で30分間インキュベートした後、ウェルをPBS/Tで６回洗浄した。PBS/T-ウシ血清アルブミン中で希釈した50μlのプロテインＡペルオキシダーゼ(Zymed Laboratories，San Francisco，CA)を添加し、そしてプレートを上記のようにインキュベートした。ウェルをPBS/Tで８回洗浄し、そして100μlの2,2'-アジノ-ジ-3-エチルベンゼチアゾリンスルホン酸(AB TS)基質溶液(50μlの50×ABTS、50μlの1.5%H₂O₂、2.5mlの0.1Mクエン酸緩衝液( pH4.1)、Zymed Laboratrories，San Francisco，CA)を添加した。室温で15分後、酵素反応を、100μlの10%ドデシル硫酸ナトリウムを添加することにより停止した。Ａ₄₀₅値を、ELISAリーダー(Titertek Multiskan,Flow Laboratories,McLe an，VA)を用いて測定した。各試験には、５つの陰性コントロール血清試料および２つの陽性Chagas患者試料を含めた。試験結果は、陰性コントロール血清が0. 2を超える吸光度値を有し、そして陽性コントロール血清が0.6〜0.8(低い陽性) または1.2〜1.4(高い陽性)の吸光度を有していたときのみ、受容可能と考えられた。カットオフは、試験の各々について、陰性血清の平均＋３標準偏差を計算することにより決定した。初期の実験で、Chagas病が風土病である地域で生活する260人の個体からの血清を、上記のT.cruzi感染についてアッセイした。臨床知見および従来の血清学的試験(間接免疫蛍光アッセイ、間接血球凝集、およびELISA)に従って特徴付けた179の陽性血清試料および81の陰性血清試料をアッセイした。このアッセイでは、TcDペプチドは93%感受性であり、そしてPEP2ペプチドは91%感受性であったことが見出された。しかし、１つの陽性血清試料のみがいずれのペプチドとも反応しなかった。これらの結果を以下の表２に示す。従って、PEP2とTcDペプチドの混合物を用いたELISA試験は、99%より大きい感受性を有していた。TcD/PEP2試験の特異性を、陰性のT.cruzi血清学的性状を有していたChagas病の風土病地域で生活する個体からの血清および他の病気を有する患者からの血清を用いて評価した。これらの試料では、81のアッセイ中の２つが陽性であったが、他の病気を有する個体からの37の血清試料で擬陽性結果はなかった。この試験で示された他の病気は、皮膚リーシュマニア、内臓リーシュマニア、らい病および結核であった。全ての皮膚および内臓リーシュマニア血清試料は、混合ペプチドアッセイで陰性であった。同様の実験で、TcErの反応性を、単独またはTcDペプチドとの組み合わせで評価し、そしてT.cruzi溶解液、TcDペプチド、PEP2、およびTcD/PEP2混合物の反応性と比較した。慢性のChagas病の個体から得た69の血清試料を、上記の抗原の各々を用いて上記のようにアッセイした。比較のために、同様のアッセイを、急性の内臓リーシュマニアの個体からの16の血清試料および非感染個体からの33の血清試料を用いて行った。感染および非感染試料について平均中間吸光度を、異なる抗原の各々について測定し、そして以下の表３に標準偏差とともに示す。従って、TcDポリペプチドおよびPEP2またはTcErのいずれかを含む混合物は、これらのアッセイで、個々のペプチドのいずれよりもより感受性で特異的であった。これは、これらのポリペプチドが相補的反応性を示すという事実に起因した。以下の表４に示すように、TcDに対して陰性であるか、または低い抗体力価を有していた患者血清の多くは、PEP2および/またはTcEと比較的強く反応した。これらの結果は、PEP2および/またはTcEの組み合わせが、TcD単独で得られた感受性を上回るアッセイの感受性を顕著に増大することを示す。第３番目の実験では、TcDを、PEP2またはPEP2の断片と混合した。より詳細には、残基２〜12または残基２〜15を含むPEP2の断片を用いた。各場合において、 PEP2の部分は、単独またはTcDと混合したときのいずれかで反応性であったが、2 2アミノ酸のPEP2配列が優れた反応性を示した。従って、22アミノ酸のPEP2配列を用いる混合物は、より短い配列を用いる混合物よりT.cruzi感染についてより感受性である。Ｄ．組み合わせポリペプチド上記の実験を、組み合わせポリペプチドを用いて繰り返した。最初、T.cruzi に感染した12人の患者からの血清を、Gly-Cys-GlyリンカーによりPEP2配列に結合されたTcDペプチドからなる組み合わせポリペプチドD/2を用いてアッセイした。さらに、15人のT.cruzi陰性個体からの血清を、組み合わせポリペプチドD/2を用いてアッセイした。この実験では、吸光度を、450nmで測定した。なぜなら、基質が、ABTSではなく、テトラメチルベンジジン(TMB)であったからである。T.c ruzi感染個体からの血清の12のアッセイのすべてが陽性(100%)であり、そしてT. cruzi陰性個体からの血清のいずれも陽性結果を生じなかった。従って、D/2ポリペプチドは、T.cruzi感染について高度に特異的で感受性である。別の実験では、Gly-Cys-Glyリンカーにより結合されたTcDペプチドおよびTcEr 配列を含む組み合わせポリペプチドD/Eを、単独およびペプチドD/2との組み合わせで評価した。T.cruzi感染個体からの44の血清試料を、ブラジルの風土病地域の臨床的に正常な個体からの24試料および合衆国の臨床的に正常な個体からの24 試料とともにアッセイした。上記の血清試料について実施したアッセイの各々の結果を以下の表５に示す。従って、ペプチドD/Eは、44のうち41(93%)の陽性試料を検出し、そしてペプチドD/EとD/2の混合物は、44の陽性血清試料のすべて(100%)を検出した。いずれのペプチドも、合衆国からの臨床的に正常な血清試料のアッセイで陽性の結果を生じなかった。「風土病的に正常な」試料は、臨床的に正常であるのみなので(すなわち、血清学的診断アッセイを実施した)、ペプチドD/EとD/2の混合物により得られた陽性結果は、診断されなかった感染を示し得る。Ｅ．トリペプチド混合物上記のアッセイを、TcDペプチド、TcEr、およびPEP2の混合物を用いて繰り返した。上記のセクションＤで記載される、T.cruzi感染個体からの44試料を、臨床的に正常な個体からの48試料(合衆国からの24および風土病地域からの24)とともに、各々が上記のエピトープの１つを含む３つの別々のポリペプチドの混合物を用いてアッセイした。この実験では、44のT.cruzi陽性血清試料のすべては、平均中間を超えて３標準偏差より大きい450nmの吸光度を生じ、そして合衆国からの正常血清試料はいずれも陽性結果を生じなかった。ブラジルの風土病地域からの２つの陰性試料が陽性結果を生じたが、再度、これは診断されなかった感染の結果であり得る。従って、トリペプチド混合物は、陽性血清試料の100%を検出し、そして高い特異性を示した。先行する記載から、例示の目的に本発明の特定の実施態様が記載されているが、種々の改変が、本発明の思想および範囲を逸脱することなくなされ得る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＧ０１Ｎ 33/577 ＢＧ０１Ｎ 33/569 Ｃ１２Ｐ 21/08 33/577 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ // Ｃ１２Ｐ 21/08 5/00 Ｂ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．生物学的試料のT.cruzi感染を検出する方法であって、以下の工程： (a)生物学的試料を、配列番号１の残基137のリジンと残基247のアラニンとの間の部分の少なくとも７つの連続する残基、または保存的置換もしくは改変のみが異なるその抗原性改変体を含む第１のポリペプチドと接触させる工程、ただし、該第１のポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸１とアミノ酸136との間の部分の５を超えない連続する残基を含む；および (b)該生物学的試料中で該ポリペプチドに結合する抗体の存在を検出し、それによって該生物学的試料のT.cruzi感染を検出する工程を包含する、方法。２．前記第１のポリペプチドが、アミノ酸配列Lys Ala Ala Ile Ala Pro Ala Lys Ala Ala Ala Ala Pro Ala Lys Ala Ala Thr Ala Pro Ala、または保存的置換もしくは改変のみが異なるその抗原性改変体を含む、請求項１に記載の方法。３．前記試料を、Ala Glu Pro Lys Ser Ala Glu Pro Lys Pro Ala Glu Pro Ly s Ser、または保存的置換もしくは改変のみが異なるその抗原性改変体、およびA la Glu Pro Lys Pro Ala Glu Pro Lys Ser Ala Glu Pro Lys Pro、または保存的置換もしくは改変のみが異なるその抗原性改変体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドと接触させる工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。４．前記試料を、アミノ酸配列Pro Ser Pro Phe Gly Gln Ala Ala Ala Gly As p Lys、または保存的置換もしくは改変のみが異なるその抗原性改変体を含む第３のポリペプチドと接触させる工程をさらに含む、請求項１または３のいずれかに記載の方法。５．前記第３のポリペプチドが、アミノ酸配列Gly Asp Lys Pro Ser ProPhe Gly Gln Ala Ala Ala Gly Asp Lys Pro Ser Pro Phe Gly Gln Alaを含む、請求項４に記載の方法。６．前記第１のポリペプチドが、Ala Glu Pro Lys Ser Ala Glu Pro Lys Pro Ala Glu Pro Lys Ser、または保存的置換もしくは改変のみが異なるその抗原性改変体、およびAla Glu Pro Lys Pro Ala Glu Pro Lys Ser Ala Glu Pro Lys Pr o、または保存的置換もしくは改変のみが異なるその抗原性改変体からなる群から選択されるアミノ酸配列をさらに含む、請求項１に記載の方法。７．前記第１のポリペプチドが、アミノ酸配列Pro Ser Pro Phe Gly Gln Ala Ala Ala Gly Asp Lys、または保存的置換もしくは改変のみが異なるその抗原性改変体をさらに含む、請求項１または６のいずれかに記載の方法。８．前記第１のポリペプチドが、アミノ酸配列Gly Asp Lys Pro Ser Pro Phe Gly Gln Ala Ala Ala Gly Asp Lys Pro Ser Pro Phe Gly Gln Ala、または保存的置換もしくは改変のみが異なるその抗原性改変体をさらに含む、を含む、請求項７に記載の方法。９．前記生物学的試料が、血液、血清、血漿、唾液、脳脊髄液および尿からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。１０．前記第１のポリペプチドが固体支持体に結合している、請求項１に記載の方法。１１．前記検出する工程が、以下の工程： (a)非結合試料を前記固体支持体から除去する工程； (b)検出試薬を該固体支持体に添加する工程；および (c)該固体支持体に結合した検出試薬のレベルを予備決定したカットオフ値に対して測定し、それにより前記生物学的試料のT.cruzi感染を検出する工程を包含する、請求項１０に記載の方法。１２．前記検出試薬が、結合剤に結合したリポーター基を含む、請求項１１に記載の方法。１３．配列番号１の残基137のリジンと残基247のアラニンとの間の部分の少なくとも７つの連続する残基、または保存的置換もしくは改変のみが異なるその抗原性改変体を含むポリペプチドであって、配列番号１のアミノ酸１とアミノ酸13 6との間の部分の５を超えない連続する残基を含む、ポリペプチド。１４．アミノ酸配列Lys Ala Ala Ile Ala Pro Ala Lys Ala Ala Ala Ala Pro Ala Lys Ala Ala Thr Ala Pro Ala、または保存的置換もしくは改変のみが異なるその抗原性改変体をさらに含む、請求項１３に記載のポリペプチド。１５．配列番号１の残基137のリジンと残基247のアラニンとの間の部分の少なくとも７つの連続する残基、または保存的置換もしくは改変のみが異なるその抗原性改変体を含むポリペプチドであって、該ポリペプチドが、Ala Glu Pro Lys Ser Ala Glu ProLys Pro Ala Glu Pro Lys Ser、または保存的置換もしくは改変のみが異なるその抗原性改変体、およびアミノ酸配列Ala Glu Pro Lys Pro Ala Glu Pro Lys Ser Ala Glu Pro Lys Pro、または保存的置換もしくは改変のみが異なるその抗原性改変体からなる群から選択されるアミノ酸配列をさらに含む、ポリペプチド。１６．配列番号１の残基137のリジンと残基247のアラニンとの間の部分の少なくとも７つの連続する残基、または保存的置換もしくは改変のみが異なるその抗原性改変体を含むポリペプチドであって、該ポリペプチドが、アミノ酸配列Pro Ser Pro Phe Gly Gln Ala Ala Ala Gly Asp Lys、または保存的置換もしくは改変のみが異なるその抗原性改変体をさらに含む、ポリペプチド。１７．アミノ酸配列Gly Asp Lys Pro Ser Pro Phe Gly Gln Ala Ala Ala Gly Asp Lys Pro Ser Pro Phe Gly Gln Ala、または保存的置換もしくは改変のみが異なるその抗原性改変体をさらに含む、請求項１６に記載のポリペプチド。１８．アミノ酸配列Pro Ser Pro Phe Gly Gln Ala Ala Ala Gly Asp Lys、または保存的置換もしくは改変のみが異なるその抗原性改変体をさらに含む、請求項１５に記載のポリペプチド。１９．生物学的試料のT.cruzi感染を検出するための診断キットであって、以下： (a)配列番号１の残基137のリジンと残基247のアラニンとの間の部分の少なくとも７つの連続する残基、または保存的置換もしくは改変のみが異なるその抗原性改変体を含む第１のポリペプチドであって、配列番号１のアミノ酸１とアミノ酸 136との間の部分の５を超えない連続する残基を含む第１のポリペプチド；および (b)検出試薬を含む、キット。２０．前記第１のポリペプチドが、アミノ酸配列Lys Ala Ala Ile Ala Pro Al a Lys Ala Ala Ala Ala Pro Ala Lys Ala Ala Thr Ala Pro Ala、または保存的置換もしくは改変のみが異なるその抗原性改変体を含む、請求項１９に記載のキット。２１．Ala Glu Pro Lys Ser Ala Glu Pro Lys Pro Ala Glu Pro Lys Ser、または保存的置換もしくは改変のみが異なるその抗原性改変体、およびAla Glu Pr o Lys Pro Ala Glu Pro Lys Ser Ala Glu Pro Lys Pro、または保存的置換もしくは改変のみが異なるその抗原性改変体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドをさらに含む、請求項１９に記載のキット。２２．アミノ酸配列Pro Ser Pro Phe Gly Gln Ala Ala Ala Gly Asp Lys、または保存的置換もしくは改変のみが異なるその抗原性改変体を含む第３のポリペプチドをさらに含む、請求項２１に記載のキット。２３．前記第３のポリペプチドが、アミノ酸配列Gly Asp Lys Pro Ser Pro Ph e Gly Gln Ala Ala Ala Gly Asp Lys Pro Ser Pro Phe Gly Gln Ala、または保存的置換もしくは改変のみが異なるその抗原性改変体を含む、請求項２２に記載のキット。２４．前記第１のポリペプチドが、Ala Glu Pro Lys Ser Ala Glu Pro Lys Pr o Ala Glu Pro Lys Ser、または保存的置換もしくは改変のみが異なるその抗原性改変体、およびAla Glu Pro Lys Pro Ala Glu Pro Lys Ser Ala Glu Pro Lys Pro、または保存的置換もしくは改変のみが異なるその抗原性改変体からなる群から選択されるアミノ酸配列をさらに含む、請求項１９に記載のキット。２５．前記第１のポリペプチドが、アミノ酸配列Pro Ser Pro Phe Gly Gln Al a Ala Ala Gly Asp Lys、または保存的置換もしくは改変のみが異なるその抗原性改変体をさらに含む、請求項１９または２４のいずれかに記載のキット。２６．前記第１のポリペプチドが固体支持体に結合している、請求項１９に記載のキット。２７．生物学的試料のT.cruzi感染を検出する方法であって、以下の工程： (a)生物学的試料を、アミノ酸配列Pro Ser Pro Phe Gly Gln Ala Ala Ala Gly A sp Lys、または保存的置換もしくは改変のみが異なるその抗原性改変体を含み、そしてAla Glu Pro Lys Ser Ala Glu Pro Lys Pro Ala Glu Pro Lys Ser、または保存的置換もしくは改変のみが異なるその抗原性改変体、およびAla Glu Pro Lys Pro Ala Glu Pro Lys Ser Ala Glu Pro Lys Pro、または保存的置換もしくは改変のみが異なるその抗原性改変体からなる群から選択されるアミノ酸配列をさらに含むポリペプチドと接触させる工程；および (b)該生物学的試料中で該ポリペプチドに結合する抗体の存在を検出し、それによって該生物学的試料のT.cruzi感染を検出する工程を包含する、方法。２８．前記ポリペプチドがアミノ酸配列Gly Asp Lys Pro Ser Pro Phe Gly Gl n Ala Ala Ala Gly Asp Lys Pro Ser Pro Phe Gly Gln Ala、または保存的置換もしくは改変のみが異なるその抗原性改変体をさらに含む、請求項２７に記載の方法。２９．前記ポリペプチドが固体支持体に結合している、請求項２７に記載の方法。３０．前記検出する工程が、以下の工程： (a)非結合試料を前記固体支持体から除去する工程； (b)検出試薬を該固体支持体に添加する工程；および (c)該固体支持体に結合した検出試薬のレベルを予備決定したカットオフ値に対して測定し、それにより前記生物学的試料中のT.cruzi感染を検出する工程を包含する、請求項２９に記載の方法。３１．前記検出試薬が、結合剤に結合したリポーター基を含む、請求項３０に記載の方法。３２．前記生物学的試料が、血液、血清、血漿、唾液、脳脊髄液および尿からなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。３３．ポリペプチドであって、以下： (a)アミノ酸配列Pro Ser Pro Phe Gly Gln Ala Ala Ala Gly Asp Lys、または保存的置換もしくは改変のみが異なるその抗原性改変体；および (b)Ala Glu Pro Lys Ser Ala Glu Pro Lys Pro Ala Glu Pro Lys Ser、または保存的置換もしくは改変のみが異なるその抗原性改変体、およびAla Glu Pro Lys Pro Ala Glu Pro Lys Ser Ala Glu Pro Lys Pro、または保存的置換もしくは改変のみが異なるその抗原性改変体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。３４．アミノ酸配列Gly Asp Lys Pro Ser Pro Phe Gly Gln Ala Ala Ala Gly Asp Lys Pro Ser Pro Phe Gly Gln Ala、または保存的置換もしくは改変のみが異なるその抗原性改変体をさらに含む、請求項３３に記載のポリペプチド。３５．生物学的試料のT.cruzi感染を検出するための診断キットであって、以下： (a)請求項３３に記載の組換えポリペプチド；および (b)検出試薬を含む、キット。３６．前記組換えポリペプチドが固体支持体に結合している、請求項３５に記載のキット。３７．生物学的試料のLeishmaniaまたはT.cruzi感染をスクリーニングするための方法であって、以下の工程： (a)生物学的試料を、配列番号１の残基１のアルギニンと143位のアラニンとの間の部分、または保存的置換もしくは改変のみが異なるその抗原性改変体を含むポリペプチドと接触させる工程；および (b)該生物学的試料中で該ポリペプチドに結合する抗体の存在を検出し、それによって該生物学的試料のLeishmaniaまたはT.cruzi感染を検出する工程を包含する、方法。３８．前記ポリペプチドが固体支持体に結合している、請求項３７に記載の方法。３９．前記検出する工程が、以下の工程： (a)非結合試料を前記固体支持体から除去する工程； (b)検出試薬を該固体支持体に添加する工程；および (c)該固体支持体に結合した検出試薬のレベルを予備決定したカットオフ値に対して測定し、それにより該生物学的試料のLeishmaniaまたはT.cruzi感染をスクリーニングする工程を包含する、請求項３８に記載の方法。４０．前記検出試薬が、結合剤に結合したリポーター基を含む、請求項３９に記載の方法。４１．前記生物学的試料が、血液、血清、血漿、唾液、脳脊髄液および尿からなる群から選択される、請求項３９に記載の方法。４２．LeishmaniaまたはT.cruzi感染を検出するための診断キットであって、以下： (a)配列番号１のアミノ酸１〜143、または保存的置換もしくは改変のみが異なるその抗原性改変体を含むポリペプチド；および (b)検出試薬を含む、キット。４３．前記検出試薬が、結合剤に結合したリポーター基を含む、請求項４２に記載のキット。４４．請求項１３〜１８、３３または３４のいずれか１つに記載のポリペプチドをコードする、単離したDNA配列。４５．請求項４４に記載のDNA配列を含む、組換え発現ベクター。４６．請求項４５に記載の発現ベクターで形質転換した、宿主細胞。４７．前記宿主細胞が、E.coli、酵母、昆虫細胞株および哺乳動物細胞株からなる群から選択される、請求項４６に記載の宿主細胞。４８．請求項１３〜１８、３３または３４のいずれかに記載の組換えポリペプチドおよび生理学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。４９．薬学的組成物であって、以下： (a)配列番号１の残基137のリジンと残基143のアラニンとの間の部分の少なくとも７つの連続する残基、または保存的置換もしくは改変のみが異なるその抗原性改変体を含む第１のポリペプチド； (b)Ala Glu Pro Lys Ser Ala Glu Pro Lys Pro Ala Glu Pro Lys Ser、または保存的置換もしくは改変のみが異なるその抗原性改変体、およびAla Glu Pro Lys Pro Ala Glu Pro Lys Ser Ala Glu Pro Lys Pro、または保存的置換もしくは改変のみが異なるその抗原性改変体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド；および (c)生理学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。５０．アミノ酸配列Pro Ser Pro Phe Gly Gln Ala Ala Ala Gly Asp Lys、または保存的置換もしくは改変のみが異なるその抗原性改変体を含む第３のポリペプチドをさらに含む、請求項４９に記載の薬学的組成物。５１．前記第３のポリペプチドが、アミノ酸配列Gly Asp Lys Pro Ser Pro Ph e Gly Gln Ala Ala Ala Gly Asp Lys Pro Ser Pro Phe Gly Gln Ala、または保存的置換もしくは改変のみが異なるその抗原性改変体をさらに含む、請求項５０に記載の薬学的組成物。５２．薬学的組成物であって、以下： (a)配列番号１の残基137のリジンと残基143のアラニンとの間の部分の少なくとも７つの連続する残基、または保存的置換もしくは改変のみが異なるその抗原性改変体を含む第１のポリペプチド； (b)アミノ酸配列Pro Ser Pro Phe Gly Gln Ala Ala Ala Gly Asp Lys、または保存的置換もしくは改変のみが異なるその抗原性改変体を含む第２のポリペプチド ;および (c)生理学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。５３．前記第２のポリペプチドが、アミノ酸配列Gly Asp Lys Pro Ser Pro Ph e Gly Gln Ala Ala Ala Gly Asp Lys Pro Ser Pro Phe Gly Gln Ala、または保存的置換もしくは改変のみが異なるその抗原性改変体をさらに含む、請求項５２に記載の薬学的組成物。５４．薬学的組成物であって、以下： (a)アミノ酸配列Pro Ser Pro Phe Gly Gln Ala Ala Ala Gly Asp Lys、または保存的置換もしくは改変のみが異なるその抗原性改変体を含む第１のポリペプチド ; (b)Ala Glu Pro Lys Ser Ala Glu Pro Lys Pro Ala Glu Pro Lys Ser、または保存的置換もしくは改変のみが異なるその抗原性改変体、およびAla Glu Pro Lys Pro Ala Glu Pro Lys Ser Ala Glu Pro Lys Pro、または保存的置換もしくは改変のみが異なるその抗原性改変体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド；および (c)生理学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。５５．前記第１のポリペプチドが、アミノ酸配列Gly Asp Lys Pro Ser Pro Ph e Gly Gln Ala Gly Asp Lys Pro Ser Pro Phe Gly Gln Ala、または保存的置換もしくは改変のみが異なるその抗原性改変体をさらに含む、請求項５４に記載の薬学的組成物。５６．請求項１３〜１８、３３または３４のいずれか１つに記載の組換えポリペプチドおよびアジュバントを含む、T.curziに結合する抗体の産生を刺激するためのワクチン。５７．請求項４９〜５５のいずれか１つに記載の薬学的組成物およびアジュバントを含む、T.cruziに結合する抗体の産生を刺激するためのワクチン。５８．生物学的試料のT.cruzi感染を検出する方法であって、以下の工程： (a)生物学的試料を、配列番号１の残基137のリジンと残基247のアラニンとの間の部分の少なくとも７つの連続する残基または保存的置換もしくは改変のみが異なるその抗原性改変体から本質的になる第１のポリペプチドと接触させる工程；および (b)該生物学的試料中で該ポリペプチドに結合する抗体の存在を検出し、それによって該生物学的試料のT.cruzi感染を検出する工程を包含する、方法。５９．生物学的試料のT.cruzi感染の有無を検出する方法であって、以下の工程： (a)生物学的試料を、配列番号１の残基137位のリジンと残基247のアラニンとの間の部分の少なくとも７つの連続する残基、または保存的置換もしくは改変のみが異なるその抗原性改変体から本質的になるポリペプチドに結合するモノクローナル抗体と接触させる工程；および (b)該生物学的試料中で該モノクローナル抗体に結合するT.cruzi寄生体の存在を検出する工程を包含する、方法。６０．生物学的試料のT.cruzi感染の有無を検出する方法であって、以下の工程： (a)生物学的試料を、Ala Glu Pro Lys Ser Ala Glu Pro Lys Pro Ala Glu Pro L ys Ser、または保存的置換もしくは改変のみが異なるその抗原性改変体、および Ala Glu Pro Lys Pro Ala Glu Pro Lys Ser Ala Glu Pro Lys Pro、または保存的置換もしくは改変のみが異なるその抗原性改変体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合するモノクローナル抗体と接触させる工程；および (b)該生物学的試料中で該モノクローナル抗体に結合するT.cruzi寄生体の存在を検出する工程を包含する、方法。６１．生物学的試料のT.cruzi感染の有無を検出する方法であって、以下の工程： (a)生物学的試料を、アミノ酸配列Gly Asp Lys Pro Ser Pro Phe Gly Gln Ala A la Ala Gly Asp Lys Pro Ser Pro Phe Gly Glu Alaを含むポリペプチドに結合するモノクローナル抗体と接触させる工程；および (b)該生物学的試料中で該モノクローナル抗体に結合するT.cruzi寄生体の存在を検出する工程を包含する、方法。６２．前記モノクローナル抗体が固体支持体に結合している、請求項５９〜６１のいずれかに記載の方法。６３．前記検出する工程が、以下の工程： (a)非結合試料を前記固体支持体から除去する工程； (b)検出試薬を該固体支持体に添加する工程；および (c)該固体支持体に結合した検出試薬のレベルを予備決定したカットオフ値に対して測定し、それにより該生物学的試料のT.cruzi感染を検出する工程を包含する、請求項６２に記載の方法。６４．前記検出試薬が、抗体に結合したリポーター基を含む、請求項６３に記載の方法。