JPH11253162A

JPH11253162A - モノアミンオキシダーゼをコードするｄｎａ

Info

Publication number: JPH11253162A
Application number: JP10058654A
Authority: JP
Inventors: Miki Kobayashi; 幹小林; Hideaki Yugawa; 英明湯川; Hidehiko Kumagai; 英彦熊谷
Original assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Priority date: 1998-03-10
Filing date: 1998-03-10
Publication date: 1999-09-21

Abstract

(57)【要約】【課題】マイクロコッカス・ルテウス由来のモノアミ
ンオキシダーゼをコードするＤＮＡを提供する。【解決手段】マイクロコッカス・ルテウスの染色体Ｄ
ＮＡを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで部分分解して得られ、図
１により示される制限酵素地図を有し、ＢａｍＨＩ、Ｓ
ａｌＩＩ、ＫｐｎＩサイトにより各々２．６ｋｂと０．
２ｋｂ、１．７ｋｂと１．１ｋｂ、１．８ｋｂと１．０
ｋｂの大きさに分割される、大きさが約２．８ｋｂのＤ
ＮＡ断片を少なくとも含むＤＮＡ断片。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、モノアミンオキシ
ダーゼ（以下、モノアミンオキシダーゼタンパク質と略
記することがある）をコードするＤＮＡ（以下、モノア
ミンオキシダーゼ遺伝子と略記することがある）、該遺
伝子を含むＤＮＡ断片（以下、モノアミンオキシダーゼ
断片と略記することがある）、該遺伝子を含む組換えベ
クター、該遺伝子を保持する形質転換体及び該形質転換
体を用いた組換えモノアミンオキシダーゼの製造方法に
関する。

【０００２】

【従来の技術】モノアミンオキシダーゼ［ＥＣ１．４．
３．９］は、広く動物、植物、微生物に存在しており、
細胞内で強力な生理活性を持っているモノアミン類、す
なわち、チラミン（tyramine）、ドーパミン（dopamin
e）、アドレナリン（adrenaline）、ノルアドレナリン
（noradrenaline）などの生理活性アミン類のレベルを
調節する酵素として知られている。

【０００３】モノアミンオキシダーゼ（ＭＡＯ）は補酵
素によって銅含有ＭＡＯとＦＡＤ含有ＭＡＯに分類され
る。動物由来のＦＡＤ含有ＭＡＯはさらに基質と阻害剤
によってＡ型とＢ型に分類される。

【０００４】動物のＡ型ＦＡＤ含有ＭＡＯの構造遺伝子
の中でグルタミンがストップコドンに変異することが精
神薄弱などの病気と関連のあることが報告されている。
このようにＭＡＯは、神経伝達物質であるカテコールア
ミン類の代謝と関連して、動物や微生物起源のものがい
くつか研究されているが、その構造や触媒機構について
はほとんど明らかにされていない。

【０００５】モノアミンオキシダーゼ遺伝子について
は、微生物由来では、大腸菌（Escherichia coli）由来
の遺伝子［J. Ferment. Bioeng., 77, p315-319, 199
4］、カビ（Aspergillus niger）由来の遺伝子［Mol. G
en. Genet., 247, p430-438, 1995］が単離され、その
塩基配列が決定されているにすぎない。

【０００６】マイクロコッカス・ルテウス由来のＭＡＯ
は、動物由来の酵素とは性質がかなり異なっており［Me
th. Enzymol., 17B, p722-726, 1971参照］、これまで
遺伝子単離の報告はない。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】ＭＡＯの構造や触媒機
構などの解明及びその用途の開発のためには、様々な性
質を有する由来の異なるモノアミンオキシダーゼ遺伝子
の単離が望まれる。

【０００８】本発明は、モノアミンオキシダーゼ遺伝
子、及び該遺伝子を含むＤＮＡ断片の提供を主な目的と
してなされたものである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、遺伝子組み換えの
手法を駆使することにより、マイクロコッカス・ルテウ
スからモノアミンオキシダーゼ遺伝子が単離可能である
ことを見い出し、本発明を完成するに至った。

【００１０】すなわち、本発明は、マイクロコッカス・
ルテウスの染色体ＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで部分
分解して得られ、図１により示される制限酵素地図を有
し、ＢａｍＨＩ、ＳａｌＩＩ、ＫｐｎＩサイトにより各
々２．６ｋｂと０．２ｋｂ、１．７ｋｂと１．１ｋｂ、
１．８ｋｂと１．０ｋｂの大きさに分割される、大きさ
が約２．８ｋｂのＤＮＡ断片を少なくとも含むＤＮＡ断
片を提供する。

【００１１】マイクロコッカス・ルテウスは好ましくは
ＩＡＭ１０９９株である。また、本発明は、上記ＤＮＡ
断片に含まれるモノアミンオキシダーゼをコードするＤ
ＮＡを提供する。

【００１２】上記ＤＮＡとして、具体的には、配列番号
２記載のアミノ酸配列、または、配列番号２記載のアミ
ノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置
換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなるモノアミ
ンオキシダーゼをコードするＤＮＡ、及び、配列番号１
記載の塩基配列からなる、または、配列番号１記載の塩
基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイ
ブリダイズし、かつモノアミンオキシダーゼ活性を有す
るタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。

【００１３】さらに、本発明は、上記ＤＮＡをベクター
に連結してなる組換えベクター、上記ＤＮＡが導入され
ることにより形質転換された形質転換体、及びこの形質
転換体を培養し、得られた培養物からモノアミンオキシ
ダーゼを採取することを特徴とする組換えモノアミンオ
キシダーゼの製造方法を提供する。

【００１４】

【発明の実施の形態】本発明のモノアミンオキシダーゼ
断片は、通常は、マイクロコッカス・ルテウス（Microc
occus luteus）（例えば、ＩＡＭ１０９９株等）の染色
体ＤＮＡをＳａｕ３ＡＩ等の制限酵素を用いて部分分解
することにより得られる。

【００１５】具体的には、下記(1)及び(2)の工程により
得ることができる。 (1) 上記マイクロコッカス・ルテウスＩＡＭ１０９９を
常法に従い培養し、培養物から菌体を集め、該菌体を破
砕処理した後、菌体抽出液より、硫安分画、ＤＥＡＥ−
セルロースカラムクロマトグラフィー、ハイドロキシア
パタイトカラムクロマトグラフィー、ゲルろ過の処理に
より、ＭＡＯ精製物を得る［Meth. Enzymol., 17B, p72
2-726, 1971参照］。

【００１６】(2) 本精製タンパク質のＮ末端アミノ酸配
列を決定し、これに対応するオリゴＤＮＡプローブによ
り、マイクロコッカス・ルテウス染色体ＤＮＡバンクを
スクリーニングすることにより、本発明のモノアミンオ
キシダーゼ断片を取得する。

【００１７】上記スクリーニングは以下のようにして行
うことができる。先ず、マイクロコッカス・ルテウスＩ
ＡＭ１０９９の培養物から染色体ＤＮＡを抽出する。こ
の染色体ＤＮＡを適当な制限酵素、例えばＳａｕ３ＡＩ
を用いて部分分解する。

【００１８】得られる様々なＤＮＡ断片をプラスミドベ
クター、例えばｐＵＣ１１８（宝酒造製）に挿入し、ラ
イブラリーを作成する。このプラスミドバンクを用いて
エシェリヒア・コリ、例えば、ＪＭ１０９（宝酒造製）
を形質転換させることによりコロニーを形成させる。次
いで、このコロニーよりプラスミドＤＮＡを抽出し、ア
ガロースゲルにて電気泳動した後、ニトロセルロース膜
に移し取り、モノアミンオキシダーゼのＮ末端配列（配
列番号３）に相当する合成オリゴヌクレオチド（例え
ば、配列番号４に示す塩基配列を有するもの）をプロー
ブとして用いた、サザンハイブリダイゼーションを行
う。こうして、挿入されたマイクロコッカス・ルテウス
ＩＡＭ１０９９の染色体由来のＭＡＯ遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片を確認することができる。

【００１９】本発明のモノアミンオキシダーゼ遺伝子
は、本発明においてその塩基配列の一つが配列番号１で
示されるように決定されたので、それに基づいて、”オ
リゴ１０００Ｍ”ＤＮＡ合成装置（ベックマン社製）等
の市販のＤＮＡ合成装置を用いて合成することが可能で
ある。また、マイクロコッカス・ルテウス（Micrococcu
s luteus）ＩＡＭ１０９９等の染色体ＤＮＡバンクから
上記に示した方法で得られるモノアミンオキシダーゼ断
片から、以下に述べる方法で得ることができる。

【００２０】まず、上記で得られるモノアミンオキシダ
ーゼ断片をＳａｕ３ＡＩのような適当な制限酵素を用い
て切り出し、得られたＤＮＡ断片を適当なクローニング
ベクター、例えば、ｐＵＣ１１８（宝酒造製）へサブク
ローニングし、エシェリヒア・コリＪＭ１０９株（宝酒
造製）を形質転換する。この形質転換株を適当な抗生物
質選択下で培養し、培養物から菌体を回収する。該菌体
から、アルカリ−ＳＤＳ法のような公知の方法によりプ
ラスミドを抽出し、このプラスミドに導入されたＤＮＡ
断片の塩基配列を決定することにより、本発明のモノア
ミンオキシダーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列が
決定される。このＤＮＡ断片の塩基配列決定法として
は、例えば、ジデオキヌクレオチド酵素法［Dideoxy ch
ain termination法；Sanger F., et al., Proc. Natil.
Acad. Sci. U.S.A., Vol. 74, p.5463(1977)］が挙げ
られる。このＤＮＡ断片の塩基配列中に存在するオープ
ンリーディングフレームから、モノアミンオキシダーゼ
遺伝子を特定できる。

【００２１】本発明のモノアミンオキシダーゼ遺伝子が
コードするモノアミンオキシダーゼタンパク質は、例え
ば配列番号２記載のアミノ酸配列からなり、またこれを
コードするＤＮＡは、例えば、配列番号１記載の塩基配
列中の１番目から１３２９番目までの塩基配列を有する
ものである。モノアミンオキシダーゼタンパク質のアミ
ノ酸配列には、マイクロコッカス・ルテウスの株間での
相違や個体間で自然突然変異などにより生じ得る相違が
あることが予想され、従って、このような同種変異体の
タンパク質をコードするＤＮＡも本発明に包含されるも
のである。

【００２２】また、上記のようにして取得されるモノア
ミンオキシダーゼ遺伝子にコードされる天然型のモノア
ミンオキシダーゼタンパク質に、その機能を実質的に損
なうことがない限り、１若しくは数個の欠失、置換、付
加を導入するような変異を、ＰＣＲを用いた変異導入手
法、ＮＴＧやヒドロキシルアミン等の変異剤を用いる等
の方法でモノアミンオキシダーゼ遺伝子に導入すること
ができる。得られた改変型のモノアミンオキシダーゼタ
ンパク質の活性の確認は、変異型モノアミンオキシダー
ゼ遺伝子を用いて大腸菌モノアミンオキシダーゼ変異株
（ＳＴ２２２）を形質転換し、この形質転換株が適当な
抗生物質選択下で生育可能かどうか見ることで行うこと
ができる。これらの手法により得られるタンパク質をコ
ードするＤＮＡも、本発明におけるモノアミンオキシダ
ーゼ遺伝子に含まれるものである。

【００２３】また、本発明において、ストリンジェント
な条件でハイブリダイズする遺伝子とは、通常には、配
列番号１記載の塩基配列と７０％、好ましくは８０％の
相同性を有する塩基配列をいう。これらの塩基配列につ
いて、上記手法により、その塩基配列のコードするタン
パク質にモノアミンオキシダーゼ活性を確認できたもの
は、本発明におけるモノアミンオキシダーゼ遺伝子に含
まれるものである。

【００２４】本発明のモノアミンオキシダーゼ遺伝子ま
たはこれを含むモノアミンオキシダーゼ断片は、これら
を適当なベクターに連結して組換えベクターを調製し、
この組換えベクターで適当な宿主微生物を形質転換する
ことにより、発現させることができる。従って、本発明
は、モノアミンオキシダーゼ遺伝子をベクターに連結し
てなる組換えベクター及び同遺伝子が導入されることに
より形質転換された形質転換体も提供する。

【００２５】組換えベクターを調製する際には、通常、
モノアミンオキシダーゼ遺伝子を宿主微生物に適したプ
ロモーターとともに、このプロモーターの下流に該遺伝
子のコード領域の５’末端側が連結されるようにして、
ベクターに挿入する。あるいはプロモーターを含む発現
ベクターを用い、これにモノアミンオキシダーゼ遺伝子
を挿入してもよい。

【００２６】このような発現ベクターを用いた発現方法
の他に、プロモーターを連結したモノアミンオキシダー
ゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を、宿主微生物の染色体中に
直接導入する相同組換え技術［A.A.Vertes, et al., Bi
osci.Biotechnol.Biochem.,Vol.57, p.2036 (1993)、
等］、あるいはトランスポゾンや挿入配列等を用いて導
入する技術［A.A.Vertes et al., Molecular Microbio
l., Vol.11, p.739 (1994)、等］によっても発現させる
ことができる。

【００２７】発現ベクターとしては、宿主微生物内で複
製増殖可能であれば特に制限されるものではないが、プ
ラスミドベクター、ファージベクターのいずれかを用い
ることができる。具体的なプラスミドベクターとして
は、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＨＳＧ２９８、ｐＵ
Ｃ１１８、ｐＳＴＶ２８、ｐＴＷＶ２２８、ｐＨＹ３０
０ＰＬＫ（以上のプラスミドベクターは、例えば宝酒造
（株）から購入できる）、ｐＫＫ２２３−３、ｐＴｒｃ
９９Ａ（以上は、例えばファルマシア社から購入でき
る）、ｐＣＲＹ３１、ｐＣＲＹ３ＫＥ、ｐＣＲＹ３ＫＸ
（米国特許第５，１８５，２６２号）、あるいはこれら
の誘導体等を挙げることができる。

【００２８】また、ファージベクターとしては、（λＦ
ｉｘＩＩベクタ−（Stratagene社から購入できる）等を
挙げることができる。本発明のモノアミンオキシダーゼ
遺伝子を発現させるためのプロモーターは、宿主微生物
が保有するプロモーターを一般に用いることができる
が、それに限られるものではなく、モノアミンオキシダ
ーゼ遺伝子の転写を開始させるための原核生物由来の塩
基配列であればいかなるプロモーターであっても良い。
また、得られたモノアミンオキシダーゼ遺伝子固有のプ
ロモーターが機能可能な微生物を宿主として用いる場合
には、該プロモーターをそのまま使用してもよい。

【００２９】モノアミンオキシダーゼ遺伝子を導入する
宿主としては、特に限定されるものではないが、エシェ
リヒア（Escherichia）属細菌、バチルス（Bacillus）
属細菌、セラチア（Serratia）属細菌、シュードモナス
（Pseudomonas）属細菌、コリネバクテリウム（Coryneb
acterium）属細菌、ブレビバクテリウム（Brevibacteri
um）属細菌、ロドコッカス（Rhodococcus）属細菌、ラ
クトバチルス（Lactobacillus）属細菌、ストレプトマ
イセス（Streptomyces）属細菌、サーマス（Thermus）
属細菌、ストレプトコッカス（Streptococcus）属細菌
等を好適に用いることができる。上記宿主微生物への遺
伝子の導入法としては、公知の方法を用いることができ
る。

【００３０】本発明の組換えモノアミンオキシダーゼの
製造方法は、上記のようにして得られる形質転換体を培
養し、その培養物からモノアミンオキシダーゼを採取す
ることを特徴とする。ここで培養物とは、形質転換体の
菌体又は／及び培養後の培地（培養に液体培地を用いた
場合にはその培養上清）をいう。

【００３１】上記形質転換体の培養は、マイクロコッカ
ス・ルテウスの培養に通常に用いられる、炭素源、窒素
源、無機塩、各種ビタミン等を含む栄養培地で行うこと
ができる。その他の培養条件もマイクロコッカス・ルテ
ウスの培養に通常に用いられるものでよい。

【００３２】培養物からのモノアミンオキシダーゼの採
取は、Meth. Enzymol., 17B, p722-726,（1971）記載の
方法に従って行うことができる。

【００３３】

【実施例】以下、実施例によりさらに具体的に説明する
が、実施例は本発明の範囲を限定するものではない。

【００３４】（Ａ）マイクロコッカス・ルテウスからの
モノアミンオキシダーゼタンパク質の精製およびＮ末端
配列の決定 Meth. Enzymol., 17B, p722-726,（1971）記載の方法に
従って、マイクロコッカス・ルテウスＩＡＭ１０９９を
培養し、菌体を集め、該菌体を破砕処理した後、菌体抽
出液より、硫安分画、ＤＥＡＥ−セルロースカラムクロ
マトグラフィー、ハイドロキシアパタイトカラムクロマ
トグラフィー、ゲルろ過の処理により、ＭＡＯ精製物を
得た。

【００３５】精製物１０００ｐｍｏｌを用いてそのＮ末
端のアミノ酸配列を決定した。決定したＮ末端の配列に
基づき、対応するオリゴヌクレオチドを、アプライド・
バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製３９４型
ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーを用いて合成した。決定
したアミノ酸配列（配列番号３）及び合成した配列（配
列番号４）は以下の通りであった。 Asn Pro His Val Val Ile Val Gly Ala Gly Phe Ala Gly AA(T/C) CCI CA(T/C) GTI GTI ATI GTI GGI GCI GGI TT(T/C) GC

【００３６】（Ｂ）マイクロコッカス・ルテウス（Micr
ococcus luteus）の全ＤＮＡの抽出マイクロコッカス・ルテウスＩＡＭ１０９９を、ＬＢ培
地［組成：トリプトン１０ｇ，酵母エキス５ｇ、塩化
ナトリウム５ｇを蒸留水に溶解して１リットルとす
る］１リットル中で対数増殖期後期まで培養した後に菌
体を回収した。

【００３７】得られた菌体を、リゾチームを１０mg/ml
の濃度で含有する溶液［組成：１０ｍＭＮａＣｌ、２
０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍＭＥＤＴ
Ａ・２Ｎａ］１５ｍｌに懸濁した。該懸濁液にプロテナ
ーゼＫを１００μg/mlの最終濃度で添加し、これを３７
℃で１時間インキュベートした。次に、ドデシル硫酸ナ
トリウムを最終濃度が０．５％になるように添加し、５
０℃で６時間インキュベートして溶菌させた。得られた
溶菌液に等量のフェノール／クロロホルム溶液を添加し
て室温で１０分間穏やかに振盪した後、その全量を１０
〜１２℃で２０分間、５，０００×ｇの遠心分離に供
し、その上清画分を分取した。該上清画分中に酢酸ナト
リウムをその濃度が０．３Ｍとなるように添加し、次い
で２倍量のエタノールを穏やかに添加した。水層とエタ
ノール層の間に存在するＤＮＡをガラス棒で搦め取り、
これを７０％エタノールで洗浄して風乾した。得られ
たＤＮＡは、溶液［組成：１０ｍＭトリス緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）、１ｍＭＥＤＴＡ・２Ｎａ］５ｍｌを加え
て４℃で一晩静置した後、実験に供した。

【００３８】（Ｃ）モノアミンオキシダーゼ遺伝子を含
む染色体ＤＮＡのＳａｕ３ＡＩ部分分解断片の取得上記（Ｂ）で得られた染色体１μｇを制限酵素Ｓａｕ３
ＡＩを用いて部分分解した。

【００３９】それぞれ最終濃度が、５０ｍＭトリス−
塩酸緩衝液（ｐＨ７．９），１０ｍＭＭｇＣｌ₂，２
０ｍＭジチオスレイトール，１ｍＭＡＴＰ，Ｔ４Ｄ
ＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔ／５０μｌ，ｐＵＣ１１８ベ
クターＢａｍＨＩ分解脱リン酸化処理物（宝酒造製）
５０ｎｇ／５０μｌ，染色体Ｓａｕ３ＡＩ部分分解産物
２５０ｎｇ／５０μｌとなるように各成分を添加し、
１６℃で３時間反応させて、染色体Ｓａｕ３ＡＩ部分分
解産物を結合させた。

【００４０】ついで、常法［J. Mol. Biol., 53, 159(1
970)参照］に従って、得られた溶液を用いて大腸菌ＪＭ
１０９株（宝酒造製）を形質転換した。得られた形質転
換菌を選択培地［組成：トリプトン１０ｇ，酵母エキ
ス５ｇ，ＮａＣｌ５ｇ，寒天１５ｇ，アンピシリ
ン５０ｍｇを蒸留水に溶解して１リットルとする］に塗
抹し、４２℃で１６時間培養した。

【００４１】この培地上の生育株を常法〔モレキュラー
・クローニング（Molecular cloning)、Cold Spring Ha
rbor Laboratory Press （1989）〕により液体培養し、
培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミド
を、制限酵素ＳａｌＩにより切断し、０．７％アガロー
スゲルを用いて電気泳動を行った。このアガロースゲル
よりＤＮＡをナイロン膜上に移し取り、上記（Ａ）で決
定したＭＡＯのＮ末端配列に基づいて合成したオリゴヌ
クレオチドプローブ（配列番号４）を末端ラベルを行っ
た後、プローブとして用いてサザンハイブリダイゼーシ
ョンを行った。

【００４２】末端ラベルは、合成した上記オリゴヌクレ
オチドプローブをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒
造製）を用いる手法で、５’末端リン酸基を〔γ-
³²Ｐ〕ＡＴＰでラジオアイソトープラベルすることによ
り行った〔アナリティカル・バイオケミストリー（Ana
l. Biochem., 158, 307〜315 (1986)〕。サザンハイブ
リダイゼーションは、常法〔モレキュラー・クローニン
グ（Molecular Cloning)、Cold Spring Harbor Laborat
ory Press (1989)〕に従って行った。

【００４３】この結果、制限酵素Ｓａｕ３ＡＩ部分分解
物の大きさが約２．８ｋｂのＤＮＡ断片を含むプラスミ
ドと上記プローブとがハイブリダイズすることが判明
し、該ＤＮＡ断片中にＭＡＯ遺伝子が含まれることが明
らかとなった。

【００４４】（Ｄ）モノアミンオキシダーゼ遺伝子を含
む染色体ＤＮＡのＳａｕ３ＡＩ２．８ｋｂ断片のマッ
プの作製上記実施例（Ｃ）で得られたプラスミドＤＮＡを制限酵
素ＢａｍＨＩ、ＫｐｎＩ、ＳａｌＩでそれぞれ分解し
た。これらを０．８％アガロースゲルにて電気泳動を行
うことにより、モノアミンオキシダーゼ断片を含む挿入
ＤＮＡ断片の大きさを決定した。

【００４５】切断ＤＮＡ断片の大きさは、大腸菌のラム
ダファージ（λｐｈａｇｅ）ＤＮＡを制限酵素Ｈｉｎｄ
ＩＩＩで切断して得られる分子量既知のＤＮＡ断片の同
一アガロースゲル上での泳動距離で描かれる標準線に基
づき算出した。

【００４６】制限酵素ＢａｍＨＩにより２．６ｋｂと
０．２ｋｂ、ＫｐｎＩにより１．８ｋｂと１．０ｋｂ、
ＳａｌＩにより１．７ｋｂと１．１ｋｂの大きさの断片
が生じた。これに基づき、マップを作製すると図１のよ
うになった。

【００４７】（Ｅ）モノアミンオキシダーゼ遺伝子の全
塩基配列の決定大きさが約２．８ｋｂのＳａｕ３ＡＩ部分分解断片を制
限酵素Ｓａｕ３ＡＩを用いて３７℃で処理して再度部分
分解した。また、ｐＵＣ１１８ベクター（宝酒造製）を
制限酵素ＢａｍＨＩで完全に分解した。得られたベクタ
ーＤＮＡ断片と部分分解ＤＮＡ断片とを混合し、この混
合液に、それぞれ最終濃度が、５０ｍＭトリス−塩酸緩
衝液（ｐＨ７．９），１０ｍＭＭｇＣｌ₂，２０ｍＭ
ジチオスレイトール，１ｍＭＡＴＰ，Ｔ４ＤＮＡリ
ガーゼ１ｕｎｉｔ／５０μｌとなるように各成分を添
加し、ベクターＤＮＡ断片と部分分解ＤＮＡ断片とを結
合させた。

【００４８】同様に大きさが約２．８ｋｂのＳａｕ３Ａ
Ｉ部分分解断片を制限酵素ＴａｑＩを用いて３７℃で処
理して部分分解した。また、ｐＵＣ１１８ベクター（宝
酒造製）を制限酵素ＡｃｃＩで完全に分解した。得られ
たベクターＤＮＡ断片と部分分解ＤＮＡ断片とを混合
し、この混合液に、それぞれ最終濃度が、５０ｍＭト
リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．９），１０ｍＭＭｇＣｌ
₂，２０ｍＭジチオスレイトール，１ｍＭＡＴＰ，
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔ／５０μｌとなるよう
に各成分を添加し、ベクターＤＮＡ断片と部分分解ＤＮ
Ａ断片とを結合させた。

【００４９】ついで、常法［J. Mol. Biol., 53, 159(1
970)参照］に従って、得られた溶液を各々用いて大腸菌
ＪＭ１０９（宝酒造製）を形質転換した。得られた形質
転換菌を選択培地［組成：トリプトン１０ｇ，酵母エ
キス５ｇ，ＮａＣｌ５ｇ，寒天１５ｇ，アンピシ
リン５０ｍｇを蒸留水に溶解して１リットルとする］に
塗抹し、４２℃で１６時間培養した。

【００５０】選択培地上に生育した菌株を、アンピシリ
ンを最終濃度で５０μg/ml含有するＬＢ培養液［トリプ
トン１０ｇ，酵母エキス５ｇ，ＮａＣｌ５ｇを蒸
留水に溶解して１リットルとする］に植菌し、これを３
７℃で７時間培養した。培養液を４℃で１０分間、８，
０００×ｇの遠心分離にかけて菌体を回収した。回収し
た菌体からアルカリ−ＳＤＳ法［T. Maniatis, E. F. F
ritsch, J. Sambrook,Molecular Cloning, p.90-91(198
2)参照］によりプラスミドを抽出した。

【００５１】抽出したプラスミドＤＮＡを用いて、ベク
ターｐＵＣ１１８に挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列を
決定した。ｐＵＣ１１８に挿入されたＤＮＡ断片の塩基
配列の決定には、パーキン・エルマー社製のダイプライ
マーサイクルシーケンスキットを用いた。そして、これ
らの個々の配列の連結を、パーキン・エルマー社製のシ
ークエンス解析ソフトオートアッセンブラー（Autoas
sembler）を用いて行った。その結果、上記２．８ｋｂ
のＳａｕ３ＡＩで部分分解されたＤＮＡ断片は、既知の
カビ（Aspergillus niger）のモノアミンオキシダーゼ
タンパク質と２７．３％の相同性、エシェリヒア・コリ
のモノアミンオキシダーゼタンパク質と部分的に２６．
７％の相同性を持つタンパク質をコードする遺伝子（配
列番号１に記載するオープン・リーディング・フレー
ム）を含有していることが判明した（図１中、MAOと示
す）。また、明らかになったオープン・リーディング・
フレームのＮ末端は、上記（Ａ）において決定されたア
ミノ酸配列と完全に一致し、マイクロコッカス・ルテウ
ス由来のモノアミンオキシダーゼ遺伝子を含んでいるこ
とが確認された。

【００５２】

【発明の効果】本発明により提供されるモノアミンオキ
シダーゼ遺伝子、該遺伝子を含むＤＮＡ断片、及び組換
えモノアミンオキシダーゼタンパク質を用いて、該酵素
の諸性質を解析すること等により、バイオセンサーや物
質生産プロセスへの応用、病因解明による遺伝子診断、
治療等が可能になると考えられる。

【００５３】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：1329 鎖の数：二本鎖配列の型：核酸トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 起源：生物名：マイクロコッカス・ルテウス（Micrococcus lu
teus）株名：ＩＡＭ１０９９配列の特徴：特徴を表す記号：ＣＤＳ存在位置：1..1329 特徴を決定した方法：Ｅ配列 GTG AGC AAC CCG CAT GTC GTG ATC GTC GGA GCC GGC TTC GCC GGC CTG 48 Val Ser Asn Pro His Val Val Ile Val Gly Ala Gly Phe Ala Gly Leu 1 5 10 15 GTG GCC GCC CGT GAA CTG CAG ATG GCA GGC GTG GAC GTG GAG ATC GTG 96 Val Ala Ala Arg Glu Leu Gln MET Ala Gly Val Asp Val Glu Ile Val 20 25 30 GAG GCC CGC GAC CGC GTG GGC GGC CGC GCC TGG ACC GAG GAG CGC ATG 144 Glu Ala Arg Asp Arg Val Gly Gly Arg Ala Trp Thr Glu Glu Arg Met 35 40 45 GGC CGT CCC CTG GAA CTG GGC GCC ACG TGG GTG CAC TGG ATG CAG CCG 192 Gly Arg Pro Leu Glu Leu Gly Ala Thr Trp Val His Trp Met Gln Pro 50 55 60 CAC GTG TGG AGC GAG ATC ACC CGC TAC GAC CAG AGC ATC TAC CCC AGC 240 His Val Trp Ser Glu Ile Thr Arg Tyr Asp Gln Ser Ile Tyr Pro Ser 65 70 75 80 CCG TTC TGC GAC GAC GCC TAC TGG ATC ACC GGG GGC CGG GTG GAG CAC 288 Pro Phe Cys Asp Asp Ala Tyr Trp Ile Thr Gly Gly Arg Val Glu His 85 90 95 GGC ACC GAG GCG GAC CTG GAT GCC GCT CTG GCC CGC CCC ATG GCC AAG 336 Gly Thr Glu Ala Asp Leu Asp Ala Ala Leu Ala Arg Pro Met Ala Lys 100 105 110 ATC TTC GAG GAC TCG CGG GAG TTC TTC CCG TAC CCG TAC GAG CCC CTG 384 Ile Phe Glu Asp Ser Arg Glu Phe Phe Pro Tyr Pro Tyr Glu Pro Leu 115 120 125 CAC GTG CTG GAC GAG AGC AGC GGC AGC ACC CCC GAG CTG CGG GAG CGC 432 His Val Leu Asp Glu Ser Ser Gly Ser Thr Pro Glu Leu Arg Glu Arg 130 135 140 TTC CGC GCG GCG GAC CAG GGC AGT GTC CTG GAC TGC CTC AAG GGC GGC 480 Phe Arg Ala Ala Asp Gln Gly Ser Val Leu Asp Cys Leu Lys Gly Gly 145 150 155 160 GAC TTC ACC CAG GAG GAG CGG GAC CTG TGC GAC GCG TAC TGG TCC GCC 528 Asp Phe Thr Gln Glu Glu Arg Asp Leu Cys Asp Ala Tyr Trp Ser Ala 165 170 175 GCG TAC ATC GGG GAC CCG CAC CAG GGG TCA CCG CTC ATG GCC AAG CAG 576 Ala Tyr Ile Gly Asp Pro His Gln Gly Ser Pro Leu Met Ala Lys Gln 180 185 190 TGG GCG GCG CTG TCC GAC CAC CGG TTG AGC CTG GTG GAC GAG CAG ACC 624 Trp Ala Ala Leu Ser Asp His Arg Leu Ser Leu Val Asp Glu Gln Thr 195 200 205 CTG CGC TTC AAG CTC ACC CAC GGC ATG CGG GGA CTG TAC GAG AAC ATC 672 Leu Arg Phe Lys Leu Thr His Gly Met Arg Gly Leu Tyr Glu Asn Ile 210 215 220 GCC GCG GAC CTG CGC TGC CCC ATC CGC CTG AAC ACC CCG GTC ACG GCG 720 Ala Ala Asp Leu Arg Cys Pro Ile Arg Leu Asn Thr Pro Val Thr Ala 225 230 235 240 GTC GAC CAC CGC TCC GAC GGC GCC ACG GTC ACC CTG GGC ACC GGC GAG 768 Val Asp His Arg Ser Asp Gly Ala Thr Val Thr Leu Gly Thr Gly Glu 245 250 255 AAG ATC TCG TGC GAC AGC GTG ATC GTC ACG GTG CCG GTG GGG GCG CTG 816 Lys Ile Ser Cys Asp Ser Val Ile Val Thr Val Pro Val Gly Ala Leu 260 265 270 CCA ACC ATC GAG TTC ACC CCG GGC CTG CCC TCG GGG ATG CGC ACC GTG 864 Pro Thr Ile Glu Phe Thr Pro Gly Leu Pro Ser Gly Met Arg Thr Val 275 280 285 ATC GAC CAG CGC TGG AAC TCC ACG GGC TGC AAG ATC TGG GTC AAG GTC 912 Ile Asp Gln Arg Trp Asn Ser Thr Gly Cys Lys Ile Trp Val Lys Val 290 295 300 AAG GGC CAC CAC AGC ATC CTG GGC TAC GCC CCC ACC CCT CAC AAG GCC 960 Lys Gly His His Ser Ile Leu Gly Tyr Ala Pro Thr Pro His Lys Ala 305 310 315 320 GCC GTG TTC CGC AGC GAG TTC TTC ATG GAC GAC GAC ACC ACC ATC TGC 1008 Ala Val Phe Arg Ser Glu Phe Phe Met Asp Asp Asp Thr Thr Ile Cys 325 330 335 GTG GGC TTC GGC TCC CAC CAC GAC GCC GTG GAC CTC ACC GAC CCG CGG 1056 Val Gly Phe Gly Ser His His Asp Ala Val Asp Leu Thr Asp Pro Arg 340 345 350 GAC GCC CAG GCA ATC GTG GAC CAG TGG CGC CCC GAC CTT GAG GTC GTG 1104 Asp Ala Gln Ala Ile Val Asp Gln Trp Arg Pro Asp Leu Glu Val Val 355 360 365 GAC TGC ACG GGC CAC GAC TGG GTG GCG GAC AGG TGG AGC GGT CAG GCG 1152 Asp Cys Thr Gly His Asp Trp Val Ala Asp Arg Trp Ser Gly Gln Ala 370 375 380 TGG GCC ACG CTG CGC TCA GGG CAG TTC ACC AAC GGC TGG CAC CAC TTC 1200 Trp Ala Thr Leu Arg Ser Gly Gln Phe Thr Asn Gly Trp His His Phe 385 390 395 400 CGC TCC ACC GAC TCG CGG CTG CGC TTC GCC GGG GCG GAC TGG GCG CGC 1248 Arg Ser Thr Asp Ser Arg Leu Arg Phe Ala Gly Ala Asp Trp Ala Arg 405 410 415 GGC TGG CGC GGC GTG GTG GTG GAC GGC GCC ATC GAG ACG GGC CTG TCC 1296 Gly Trp Arg Gly Val Val Val Asp Gly Ala Ile Glu Thr Gly Leu Ser 420 425 430 ACC GCC CGG GAC GTC CTC CGG GAC ATC CGC GCC 1329 Thr Ala Arg Asp Val Leu Arg Asp Ile Arg Ala 435 440

【００５４】配列番号：２配列の長さ：443 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列 Val Ser Asn Pro His Val Val Ile Val Gly Ala Gly Phe Ala Gly Leu 1 5 10 15 Val Ala Ala Arg Glu Leu Gln MET Ala Gly Val Asp Val Glu Ile Val 20 25 30 Glu Ala Arg Asp Arg Val Gly Gly Arg Ala Trp Thr Glu Glu Arg Met 35 40 45 Gly Arg Pro Leu Glu Leu Gly Ala Thr Trp Val His Trp Met Gln Pro 50 55 60 His Val Trp Ser Glu Ile Thr Arg Tyr Asp Gln Ser Ile Tyr Pro Ser 65 70 75 80 Pro Phe Cys Asp Asp Ala Tyr Trp Ile Thr Gly Gly Arg Val Glu His 85 90 95 Gly Thr Glu Ala Asp Leu Asp Ala Ala Leu Ala Arg Pro Met Ala Lys 100 105 110 Ile Phe Glu Asp Ser Arg Glu Phe Phe Pro Tyr Pro Tyr Glu Pro Leu 115 120 125 His Val Leu Asp Glu Ser Ser Gly Ser Thr Pro Glu Leu Arg Glu Arg 130 135 140 Phe Arg Ala Ala Asp Gln Gly Ser Val Leu Asp Cys Leu Lys Gly Gly 145 150 155 160 Asp Phe Thr Gln Glu Glu Arg Asp Leu Cys Asp Ala Tyr Trp Ser Ala 165 170 175 Ala Tyr Ile Gly Asp Pro His Gln Gly Ser Pro Leu Met Ala Lys Gln 180 185 190 Trp Ala Ala Leu Ser Asp His Arg Leu Ser Leu Val Asp Glu Gln Thr 195 200 205 Leu Arg Phe Lys Leu Thr His Gly Met Arg Gly Leu Tyr Glu Asn Ile 210 215 220 Ala Ala Asp Leu Arg Cys Pro Ile Arg Leu Asn Thr Pro Val Thr Ala 225 230 235 240 Val Asp His Arg Ser Asp Gly Ala Thr Val Thr Leu Gly Thr Gly Glu 245 250 255 Lys Ile Ser Cys Asp Ser Val Ile Val Thr Val Pro Val Gly Ala Leu 260 265 270 Pro Thr Ile Glu Phe Thr Pro Gly Leu Pro Ser Gly Met Arg Thr Val 275 280 285 Ile Asp Gln Arg Trp Asn Ser Thr Gly Cys Lys Ile Trp Val Lys Val 290 295 300 Lys Gly His His Ser Ile Leu Gly Tyr Ala Pro Thr Pro His Lys Ala 305 310 315 320 Ala Val Phe Arg Ser Glu Phe Phe Met Asp Asp Asp Thr Thr Ile Cys 325 330 335 Val Gly Phe Gly Ser His His Asp Ala Val Asp Leu Thr Asp Pro Arg 340 345 350 Asp Ala Gln Ala Ile Val Asp Gln Trp Arg Pro Asp Leu Glu Val Val 355 360 365 Asp Cys Thr Gly His Asp Trp Val Ala Asp Arg Trp Ser Gly Gln Ala 370 375 380 Trp Ala Thr Leu Arg Ser Gly Gln Phe Thr Asn Gly Trp His His Phe 385 390 395 400 Arg Ser Thr Asp Ser Arg Leu Arg Phe Ala Gly Ala Asp Trp Ala Arg 405 410 415 Gly Trp Arg Gly Val Val Val Asp Gly Ala Ile Glu Thr Gly Leu Ser 420 425 430 Thr Ala Arg Asp Val Leu Arg Asp Ile Arg Ala 435 440

【００５５】配列番号：３配列の長さ：13 配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Asn Pro His Val Val Ile Val Gly Ala Gly Phe Ala Gly 1 5 10

【００５６】配列番号：４配列の長さ：25 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸（合成ヌクレオチド）配列の特徴存在位置：6, 12, 15, 18, 21, 24, 27, 30 他の情報：N=I 配列 AAYCCNCAYG TNGTNATNGT NGGNGCNGGN TTYGC 25

【図面の簡単な説明】

【図１】モノアミンオキシダーゼ遺伝子を含むＤＮＡ
断片の制限酵素地図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/06 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】マイクロコッカス・ルテウスの染色体Ｄ
ＮＡを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで部分分解して得られ、図
１により示される制限酵素地図を有し、ＢａｍＨＩ、Ｓ
ａｌＩＩ、ＫｐｎＩサイトにより各々２．６ｋｂと０．
２ｋｂ、１．７ｋｂと１．１ｋｂ、１．８ｋｂと１．０
ｋｂの大きさに分割される、大きさが約２．８ｋｂのＤ
ＮＡ断片を少なくとも含むＤＮＡ断片。
【請求項２】マイクロコッカス・ルテウスがＩＡＭ１
０９９株である、請求項１記載のＤＮＡ断片。
【請求項３】請求項１または２記載のＤＮＡ断片に含
まれるモノアミンオキシダーゼをコードするＤＮＡ。
【請求項４】配列番号２記載のアミノ酸配列、また
は、配列番号２記載のアミノ酸配列において１若しくは
数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミ
ノ酸配列からなるモノアミンオキシダーゼをコードする
ＤＮＡ。
【請求項５】配列番号１記載の塩基配列からなる、ま
たは、配列番号１記載の塩基配列からなるＤＮＡとスト
リンジェントな条件でハイブリダイズし、かつモノアミ
ンオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤ
ＮＡ。
【請求項６】請求項３〜５のいずれかに記載のＤＮＡ
をベクターに連結してなる組換えベクター。
【請求項７】請求項３〜５のいずれかに記載のＤＮＡ
が導入されることにより形質転換された形質転換体。
【請求項８】請求項７に記載の形質転換体を培養し、
得られた培養物からモノアミンオキシダーゼを採取する
ことを特徴とする組換えモノアミンオキシダーゼの製造
方法。