JPH07107981A

JPH07107981A - 新規ｄｎａ断片

Info

Publication number: JPH07107981A
Application number: JP5253303A
Authority: JP
Inventors: Miki Kobayashi; 幹小林; Yoko Asai; 陽子浅井; Nobutake Honno; 信剛畚野; Hideaki Yugawa; 英明湯川
Original assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Priority date: 1993-10-08
Filing date: 1993-10-08
Publication date: 1995-04-25

Abstract

(57)【要約】【構成】ＳｅｃＡ蛋白質をコードするコリネ型細菌由
来の遺伝子を含むＤＮＡ断片。【効果】本発明のＤＮＡ断片を組み込んだ形質転換株
は、多種類の膜蛋白質および分泌蛋白質を生産し、多く
の有用物質生産に利用することが可能と期待される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、コリネ型細菌由来の蛋
白質のトランスロケーションに関与する遺伝子ＤＮＡに
関し、さらに詳しくは蛋白質のトランスロケーションに
関わる主要な遺伝子の１つであるセックエー（ｓｅｃ
Ａ）遺伝子に関する。

【０００２】ここで、トランスロケーションとは、膜蛋
白質及び分泌蛋白質各々が細胞膜に組み込まれる過程、
あるいは菌体外に分泌される過程のことである。ｓｅｃ
Ａ遺伝子は本過程において重要な役割を果たすＳｅｃＡ
蛋白質をコードしており、これはこれらの過程において
必要不可欠な蛋白質である〔薬学雑誌112, (6), 349,19
92 〕。従って、該遺伝子を高度に発現させることによ
り蛋白質のトランスロケーション効率が向上し、例えば
有用な膜蛋白質及び分泌蛋白質等の量的増加が図れ、物
質生産において、触媒能力が向上した微生物を作製する
ことが可能になると期待される。

【０００３】

【従来の技術】蛋白質のトランスロケーションに関する
機構は、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）にお
いてよく研究されており〔アニュアル・レビュー・オブ
・ジェネティックス（Ann. Rev. Genet.)24, 215-248,
1990；アニュアル・レビュー・オブ・バイオケミストリ
ー（Ann. Rev. Biochem.), 60, 101-124, 1991〕、蛋白
質のトランスロケーションに関する遺伝子として、ｓｅ
ｃＡ〔ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（J. Bacte
riol.), 150, 686-691, 1982〕、ｓｅｃＢ（J. Bacteri
ol., 154, 254-260, 1983)、ｓｅｃＤ（J. Bacteriol.,
169, 1286-1290,1987)、ｓｅｃＥ〔ジェネティックス
（Genetics), 118 , 571-579, 1988 〕、ｓｅｃＦ〔エン
ボ・ジャーナル（EMBO J.), 9, 3209-3216, 1990〕、ｓ
ｅｃＹ〔ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Nuc. Aci
ds Res.), 11, 2599-2616, 1983 〕等が知られている。
これらの中で、ｓｅｃＡ、Ｅ、Ｙ遺伝子は、各種変異株
を用いた研究により蛋白質のトランスロケーションに特
に重要な役割を演じていることが示されている。上記ｓ
ｅｃＡ遺伝子としては、エシェリヒア・コリ由来の遺伝
子（J. Bacteriol., 150, 686-691, 1982 参照）、バチ
ルス・サチルス（Bacillus subtilis ）由来の遺伝子
〔ジーン（Gene), 98, 101-105, 1991参照〕が単離され
ている。しかしながら、産業上重要な細菌であるコリネ
型細菌由来のｓｅｃＡ遺伝子については、従来の報告例
はない。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】蛋白質のトランスロケ
ーションマシナリー（トランスロケーションにおいて重
要な役割を担う装置）の利用の１つとして、例えば、分
泌型蛋白質の生産が考えられるが、コリネ型細菌由来の
トランスロケーションマシナリーについての知見がな
く、また、他種由来のトランスロケーションマシナリー
は、コリネ型細菌中で十分に機能しないと考えられるた
め〔モレキュラー・マイクロバイオロジー（Mol. Micro
biol.), 4, 305-314, 1990；フェブス・レター（FEBS L
etters), 273, 75-78, 1990 参照〕、工業的な応用が不
可能であった。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記問題
点を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、コリネ型細菌由
来のトランスロケーションマシナリーを構成する蛋白質
の１つであるＳｅｃＡ蛋白質をコードするｓｅｃＡ遺伝
子ＤＮＡを単離することに成功し、本発明を完成するに
至った。かくして本発明によれば、コリネ型細菌由来の
ＳｅｃＡ蛋白質をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片が
提供される。以下、本発明についてさらに詳細に説明す
る。

【０００６】本発明の「ＳｅｃＡ蛋白質をコードする遺
伝子」とは、蛋白質のトランスロケーションマシナリー
を構成する蛋白質の１つであるＳｅｃＡ蛋白質をコード
するｓｅｃＡ遺伝子ＤＮＡを意味するものである。本発
明のＳｅｃＡ蛋白質をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断
片（以下、これを「Ａ断片」と略称することがある）
は、その塩基配列が決定された後においては合成するこ
とも可能であるが、通常は微生物からクローニングさ
れ、その供給源となる微生物として、コリネ型細菌が使
用される。これらの供給源微生物からＡ断片を調製する
ための基本操作の一例を述べれば次のとおりである：Ａ
断片は、コリネ型細菌、例えばブレビバクテリウム・フ
ラバム（Brevibacterium flavum)ＭＪ−２３３（FERM B
P-1497）株の染色体上に存在し、この染色体の中から、
以下に述べる方法で分離・取得することができる。

【０００７】先ず、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ
−２３３株の培養物から染色体ＤＮＡを抽出する。この
染色体ＤＮＡを鋳型とし、エシェリヒア・コリ、バチル
ス・サチルス由来のｓｅｃＡ遺伝子の共通領域配列をプ
ライマーとして用いて、ＰＣＲ法（Polymerase Chain R
eaction 法）で該遺伝子断片を増幅する。ＰＣＲとは、
ＤＮＡポリメラーゼがプライマーを必要とすることを利
用した特定ＤＮＡ断片の増幅法である。その原理は、共
通領域の塩基配列部に設定した２つのプライマー（オリ
ゴヌクレオチド）と４つのデオキシヌクレオチド三リン
酸〔ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴ
ＴＰ）〕を用い、二本鎖ＤＮＡの一鎖を鋳型として、Ｄ
ＮＡポリメラーゼにより、２つのプライマーで挟まれた
部分の二本鎖が合成されるというものである。実際の方
法は、各至適温度および時間の条件下での、熱変性によ
るＤＮＡの一本鎖化（デナチュレーション）、プライマ
ーの鋳型ＤＮＡへのアニーリング、ＤＮＡポリメラーゼ
による相補鎖ＤＮＡの合成（エクステンション）を１サ
イクルとして、これを必要回数繰り返し、特定のＤＮＡ
断片を増幅する。本発明においては、ｓｅｃＡ遺伝子配
列の中から２２〜２７mer 、好ましくは２４mer のプラ
イマーを選択し合成する。プライマーの量は、反応当た
り０．０５〜０．５μM 、好ましくは０．２５μM を用
いる。ＰＣＲの条件は、デナチュレーション工程が９４
℃で３０〜６０秒、好ましくは６０秒、アニーリング工
程が５５℃で３０〜１２０秒、好ましくは５５℃で１２
０秒、エクステンション工程が７２℃で６０〜１８０
秒、好ましくは７２℃で１２０秒であり、これらの工程
を１サイクルとして、２５〜４０サイクル、好ましくは
３０サイクル行う。

【０００８】増幅されたＤＮＡ断片の検出法としては、
アガロースゲル電気泳動を用いる場合には、エシェリヒ
ア・コリのラムダファージ（λphage ）のＤＮＡを制限
酵素ＨｉｎｄIII で切断して得られる分子量既知のＤＮ
Ａ断片の同一アガロースゲル上での泳動距離で描かれる
標準線に基づき、また、ポリアクリルアミドゲル電気泳
動を用いる場合には、エシェリヒア・コリのファイ・エ
ックス１７４ファージ（φｘ１７４phage ）のＤＮＡを
制限酵素ＨａｅIII で切断して得られる分子量既知のＤ
ＮＡ断片の同一ポリアクリルアミドゲル上での泳動距離
で描かれる標準線に基づき、増幅ＤＮＡ断片の大きさを
算出する。なお、各ＤＮＡ断片の大きさの決定におい
て、１kb以上の断片の大きさについては、１％アガロー
スゲル電気泳動によって得られる結果を採用し、約０．
１kbから１kb未満の断片の大きさについては４％ポリア
クリルアミドゲル電気泳動によって得られる結果を採用
した。

【０００９】一方、上記のブレビバクテリウム・フラバ
ムＭＪ−２３３の染色体ＤＮＡをＰＣＲ法で増幅するこ
とにより得られる、大きさが約０．３kbのＤＮＡ断片に
ついては、その塩基配列をプラスミドｐＧＥＭ−Ｔベク
ター（PROMEGA 製）を用いるジデオキシヌクレオチド酵
素法〔dideoxy chain termination 法、Sanger, F. et
al.,プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンス・オブ・ユナイテッド・ステイツ
・オブ・アメリカ（Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 74 ,
5463, 1977 〕により決定することができる。このよう
にして決定した上記約０．３kbのＤＮＡ断片の塩基配列
は、後記配列表の配列番号１に示す配列を有するもので
あり、他種の微生物の遺伝子のアミノ酸配列との相同性
から推定された９４個のアミノ酸をコードする２８２の
塩基対から構成されるｓｅｃＡ遺伝子の部分断片であ
る。

【００１０】次にこの部分断片をプローブとして用い
て、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３染色体
由来のＤＮＡバンクをハイブリダイゼーション法により
スクリーニングすることができる。まず、ブレビバクテ
リウム・フラバムＭＪ−２３３の培養物から染色体ＤＮ
Ａを抽出する。この染色体ＤＮＡを適当な制限酵素、例
えばＥｃｏＲＩを用いて染色体ＤＮＡを完全に消化す
る。得られるＤＮＡ断片をクローニングベクター、例え
ばｐＵＣ１１８（宝酒造製）に挿入し、このベクターを
用いてエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造製）を形
質転換し、形質転換体を取得する。得られる形質転換体
よりプラスミドＤＮＡを抽出し、上記部分ＤＮＡ断片を
プローブとして用いるハイブリダイゼーションにより、
挿入されたブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３
染色体由来のＡ断片を確認・取得することができる。

【００１１】このようにして得られるＡ断片としては、
上記ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株の染
色体ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩでの完全消化により切
断することによって得られる、大きさが約５．３kbのＤ
ＮＡ断片を挙げることができる。この約５．３kbのｓｅ
ｃＡ遺伝子を含むＤＮＡ断片（Ａ断片）を、各種の制限
酵素で切断したときの認識部位数および切断断片の大き
さを下記第１表に示す。

【００１２】

【表１】

【００１３】なお、各ＤＮＡ断片の大きさの決定におい
て、１kb以上の断片の大きさについては、１％アガロー
スゲル電気泳動によって得られる結果を採用し、約０．
１kbから１kb未満の断片の大きさについては４％ポリア
クリルアミドゲル電気泳動によって得られる結果を採用
した。

【００１４】上記ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−
２３３染色体を制限酵素ＥｃｏＲＩで完全消化して得ら
れる大きさが約５．３kbのＤＮＡ断片については、その
塩基配列をプラスミドｐＵＣ１１８またはｐＵＣ１１９
ベクター（宝酒造製）を用いるジデオキシヌクレオチド
酵素法（Sanger, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 74, 5463, 1977 ）により決定することができる。
このようにして決定した上記約５．３kbのＤＮＡ断片上
に、一個のオープンリーディングフレームが存在し、こ
のオープンリーディングフレームの存在からｓｅｃＡ遺
伝子は後期配列表の配列番号２で示される８４５個のア
ミノ酸をコードする２５３５塩基対より構成されること
が判明した。上記の塩基配列で示されるｓｅｃＡ遺伝子
ＤＮＡを包含する本発明のＡ断片は、全塩基配列が決定
されたあとにおいては、天然のコリネ型細菌染色体ＤＮ
Ａから分離されたもののみならず、通常用いられるＤＮ
Ａ合成装置、例えばアプライド・バイオシステムズ（Ap
plied Biosystems）社製３９４ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサ
イザーを用いて合成されたものであってもよい。

【００１５】また、前記の如くブレビバクテリウム・フ
ラバムＭＪ−２３３の染色体ＤＮＡから取得される本発
明のｓｅｃＡ遺伝子ＤＮＡは、該遺伝子ＤＮＡによって
コードされるＳｅｃＡ蛋白質の機能を実質的に損なうこ
とがない限り、塩基配列の一部の塩基が他の塩基と置換
されていてもよく又は削除されていてもよく、或いは新
たに塩基が挿入されていてもよく、さらに塩基配列の一
部が転位されているものであってもよく、これらの誘導
体のいずれもが、本発明のＳｅｃＡ蛋白質をコードする
遺伝子を含むＤＮＡ断片に包含されるものである。

【００１６】

【実施例】以上に本発明を説明してきたが、下記の実施
例によりさらに具体的に説明する。実施例１ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３由来のｓｅ
ｃＡ部分断片のクローン化（Ａ）ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３の全
ＤＮＡの抽出半合成培地Ａ培地〔組成：尿素２ｇ、（ＮＨ₄ )₂ＳＯ₄
７ｇ、Ｋ₂ ＨＰＯ₄ ０．５ｇ、ＫＨ₂ ＰＯ₄ ０．５ｇ、
ＭｇＳＯ₄ ０．５ｇ、ＦｅＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ６mg、Ｍｎ
ＳＯ₄ ・４〜６Ｈ₂ Ｏ６mg、酵母エキス２．５ｇ、カ
ザミノ酸５ｇ、ビオチン２００μg 、塩酸チアミン２０
０μg 、グルコース２０ｇ、蒸留水１L 〕１L に、ブレ
ビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３（ＦＥＲＭＢ
Ｐ−１４９７）を対数増殖期後期まで培養し、菌体を集
めた。得られた菌体を１０mg/ml のリゾチームを含む１
０mMＮａＣｌ−２０mMトリス緩衝液（pH８．０）−１mM
ＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液１５mlに懸濁した。次にプロテナ
ーゼＫを、最終濃度が１００μg/mlになるように添加
し、３７℃で１時間保温した。さらにドデシル硫酸ナト
リウムを最終濃度が０．５％になるように添加し、５０
℃で６時間保温して溶菌した。この溶菌液に、等量のフ
ェノール／クロロホルム溶液を添加し、室温で１０分間
ゆるやかに振盪した後、全量を遠心分離（５，０００×
ｇ、２０分間、１０〜１２℃）し、上清画分を分取し、
酢酸ナトリウムを０．３M となるように添加した後、２
倍量のエタノールをゆっくりと加えた。水層とエタノー
ル層の間に存在するＤＮＡをガラス棒でまきとり、７０
％エタノールで洗浄した後、風乾した。得られたＤＮＡ
に１０mMトリス緩衝液（pH７．５）−１mMＥＤＴＡ・２
Ｎａ溶液５mlを加え、４℃で一晩静置し、鋳型ＤＮＡと
してＰＣＲに使用した。

【００１７】（Ｂ）プライマーの選択ｓｅｃＡ遺伝子はエシエリヒア・コリ、バチルス・サチ
ルス由来のものがよく研究されており、塩基配列が決定
されている。これら２種の微生物間で保存されている領
域、特にＤＮＡ塩基配列においても特に保存されている
領域を検討し、下記の１対のプライマーを選択し、アプ
ライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製
３９４ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザーを用いて合成し
た。（ａ−１） 5´-GCI YTN ACN GGN AAR GGN GT-3´ （ｂ−１） 5´-CCI GAI ATI ATI ARI GGI GT-3´ （配列中、ＲはＡ又はＧ、ＹはＣ又はＴを示し、Ａはア
デニン、Ｇはグアニン、Ｃはシトシン、Ｔはチミン、Ｉ
はデオキシイノシンを示す。）このプライマーを用いて上記（１）で調製した染色体Ｄ
ＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うと、ｓｅｃＡ遺伝子が存
在する限り、約０．３kbの反応産物が得られると期待さ
れる。

【００１８】（Ｃ）ＰＣＲ反応実際のＰＣＲ反応はパーキンエルマーシータス社製のＤ
ＮＡサーマルサイクラーを用いて下記の条件で行った。反応液：５０mM ＫＣｌ１０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．４）１．５mM ＭｇＣｌ₂ 鋳型ＤＮＡ５μl 上記（Ｂ）で作製したプライマー各々０．２５μM ｄＮＴＰｓ各々２００μM ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造製）２．５units 以上を混合し、１００μl とした。ＰＣＲサイクル：デナチュレーション過程：９４℃ ６０秒アニーリング過程：３７℃ １２０秒エクステンション過程：７２℃ １８０秒以上を１サイクルとし、３０サイクル行った。

【００１９】（Ｄ）反応物の検出上記（Ｃ）で生成した反応液１０μl を２％アガロース
ゲルにより電気泳動を行って約０．３kbの断片の検出を
行った。（Ｅ）増幅断片のクローン化上記（Ｃ）で得た反応液３μl とＰＣＲ産物クローニン
グベクターｐＧＥＭ−Ｔベクター（PROMEGA 社より市
販）１μl を混合し、５０mMトリス緩衝液（pH７．
６）、１０mMジチオスレイトール、１mMＡＴＰ、１０mM
ＭｇＣｌ₂ 及びＴ４ＤＮＡリガーゼ１unitの各成分を添
加し（各成分の濃度は最終濃度である）、４℃で１５時
間反応させ、結合させた。得られたプラスミド混液を用
い、塩化カルシウム法〔ジャーナル・オブ・モレキュラ
ー・バイオロジー（J. Mol. Biol.), 53, 159, 1970 〕
によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造製）を形
質転換し、アンピシリン５０mgを含む培地〔トリプトン
１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ５ｇ
及び寒天１６ｇを蒸留水１L に溶解〕に塗抹した。この
培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプ
ラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミドを制限酵素によ
り切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミド
ｐＴＡ１０００の長さ３．０kbのＤＮＡ断片に加え、長
さ約０．３kbの挿入断片が認められた。

【００２０】実施例２増幅断片の塩基配列の決定実施例１の（Ｅ）項で得られた長さが約０．３kbの増幅
断片について、その塩基配列をジデオキシヌクレオチド
酵素法により決定した。この配列を後期配列表の配列番
号１に示す。塩基配列決定の結果、該挿入断片はエシエ
リヒア・コリ、バチルス・サチルス由来のｓｅｃＡ断片
の一部（ＰＣＲに使用したプライマーによって挟まれる
領域）と高いホモロジーを示し、ブレビバクテリウム・
フラバム由来のｓｅｃＡ断片の一部をクローニングした
ことを確認した。

【００２１】実施例３ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３由来のｓｅ
ｃＡ遺伝子を含むＤＮＡ断片のクローン化（Ａ）組換え体の創製上記実施例（Ａ）項で得たブレビバクテリウム・フラバ
ムＭＪ−２３３の全ＤＮＡ溶液の９０μl を制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩ５０units を用い、３７℃で１時間反応させ
完全消化した。このＥｃｏＲＩ消化ＤＮＡに、クローニ
ングベクターｐＵＣ１１８（宝酒造より市販）を制限酵
素ＥｃｏＲＩで切断した後、脱リン酸化処理したものを
混合し、５０mMトリス緩衝液（pH７．６）、１０mMジチ
オスレイトール、１mMＡＴＰ、１０mMＭｇＣｌ₂ および
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１unitの各成分を添加し（各成分の
濃度は最終濃度である）、４℃で１５時間反応させ、結
合させた。上記で得られたプラスミド混液を用い、塩化
カルシウム法によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝
酒造製）を形質転換し、アンピシリン５０mgを含む培地
〔トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、Ｎ
ａＣｌ５ｇおよび寒天１６ｇを蒸留水１L に溶解〕に
塗抹した。

【００２２】この培地上の生育株を常法により液体培養
し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、該プラスミ
ドをナイロンメンブレン上に移しとり、上記ｓｅｃＡ部
分断片（配列番号１）をプローブとしてハイブリダイゼ
ーションを行った。プローブは、ランダムラベリングキ
ット（宝酒造より市販）を用いて作製した。サザンハイ
ブリダイゼーションは、常法〔「モレキュラー・クロー
ニング」（Molecular Cloning), Cold Spring Harbor L
aboratory Press(1989) 〕の通り行った。この結果、陽
性のクローンを選択することができ、プラスミドｐＵＣ
１１８の長さ３．２kbのＤＮＡ断片に加え、長さ約５．
３kbの挿入断片が認められた。長さ約５．３kbのＤＮＡ
断片を各種の制限酵素で切断したときの認識部位数およ
び切断断片の大きさは前記第１表に示したと同様であっ
た。このＤＮＡ断片の制限酵素切断点地図を図１に示
す。また、上記で得たプラスミドを各種制限酵素で切断
して得られる切断断片の大きさを測定した。その結果を
下記の第２表に示す。

【００２３】

【表２】

【００２４】実施例４ｓｅｃＡ遺伝子配列の決定実施例３で得られた長さが約５．３kbのＤＮＡ断片上に
存在するｓｅｃＡ遺伝子の存在部位を特定するために、
その塩基配列をｐＵＣ１１８またはｐＵＣ１１９（宝酒
造製）を用いるジデオキシヌクレオチド法により図１に
示した戦略図に従って決定した。その塩基配列中のオー
プンリーディングフレームの存在から、ｓｅｃＡ遺伝子
ＤＮＡは後期配列表の配列番号２に示す塩基配列を有す
る８４５個のアミノ酸をコードする２５３５塩基対より
構成されることが明らかとなった。この結果、エシェリ
ヒア・コリ、バチルス・サチルス由来のＳｅｃＡ蛋白質
と各々高い相同性を有する配列を見いだすことができ、
長さが約５．３kbの本ＤＮＡ断片上にＳｅｃＡ蛋白質を
コードするｓｅｃＡ遺伝子の全長が存在していることが
判明した。

【００２５】

【発明の効果】本発明により、コリネ型細菌由来の蛋白
質のトランスロケーションマシナリーを構成するＳｅｃ
Ａ蛋白質をコードする新規な遺伝子が提供される。この
ｓｅｃＡ遺伝子を組み込んだ形質転換株は、多種類の膜
蛋白質および分泌蛋白質を生産し、多くの有用物質生産
に利用することが可能と期待される。

【００２６】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：２８２配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 起源生物名：ブレビバクテリウムフラバム株名：MJ233 配列の特徴特徴を表す記号：ＣＤＳ存在位置：1-282 特徴を決定した方法：Ｅ配列 CAC GTT GTG ACC GTC AAC GAT TAC CTA GCG AAA CGT GAC GCC GAA ATG 48 His Val Val Thr Val Asn Asp Tyr Leu Ala Lys Arg Asp Ala Glu Met 1 5 10 15 GTC GGT CGT GTC CAC CGC TAC CTG GGC CTC GAA GTG GGA GTC ATC CTC 96 Val Gly Arg Val His Arg Tyr Leu Gly Leu Glu Val Gly Val Ile Leu 20 25 30 TCC GAC ATG CGC CCA GAC GAG CGT CGC AAG GCC TAC ACC GCC GAC ATC 144 Ser Asp Met Arg Pro Asp Glu Arg Arg Lys Ala Tyr Thr Ala Asp Ile 35 40 45 ACC TAC GGC ACC AAC AAC GAA CTC GGC TTC GAC TAC CTG CGC GAC AAC 192 Thr Tyr Gly Thr Asn Asn Glu Leu Gly Phe Asp Tyr Leu Arg Asp Asn 50 55 60 ATG GCA CGC TCC TTA AGC GAC CTC GTG CAG CGC GGC CAC AAC TAC GCC 240 Met Ala Arg Ser Leu Ser Asp Leu Val Gln Arg Gly His Asn Tyr Ala 65 70 75 80 ATC GTC GAC GAA GTG GAC TCC ATC CTC ATC GAC GAA GCC CGC 282 Ile Val Asp Glu Val Asp Ser Ile Leu Ile Asp Glu Ala Arg 85 90 94

【００２７】配列番号：２配列の長さ：２５３５配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 起源生物名：ブレビバクテリウムフラバム株名：MJ233 配列の特徴特徴を表す記号：ＣＤＳ存在位置：1-2535 特徴を決定した方法：Ｅ配列 GTG TTT GGA TTG TCC AAA GGT CTC CGC GTC GGC GAA GGC CGT GCC GTG 48 Val Phe Gly Leu Ser Lys Gly Leu Arg Val Gly Glu Gly Arg Ala Val 1 5 10 15 AAG CGA CTT CAC AAG ATC GCT GAC CAG GTT ATC GCG CTT GAA GAA AAA 96 Lys Arg Leu His Lys Ile Ala Asp Gln Val Ile Ala Leu Glu Glu Lys 20 25 30 TTC GCC AAC CTG ACC GAT GAG GAG CTC AAG GCA AAA ACA GCC GAG TTC 144 Phe Ala Asn Leu Thr Asp Glu Glu Leu Lys Ala Lys Thr Ala Glu Phe 35 40 45 AAA GAA CGC ATC GCT GGC GGT GAA GGC CTC GAC GAA ATC TTC CTC GAA 192 Lys Glu Arg Ile Ala Gly Gly Glu Gly Leu Asp Glu Ile Phe Leu Glu 50 55 60 GCA TTC GCA ACG GCC CGC GAA GAT CCT TGG CGT GTG CTC GGC CAA AAG 240 Ala Phe Ala Thr Ala Arg Glu Asp Pro Trp Arg Val Leu Gly Gln Lys 65 70 75 80 CAC TAC CGA GTA CAA ATC ATG GGT GGC GCA GCA CTG CAC TTC GGC AAC 288 His Tyr Arg Val Gln Ile Met Gly Gly Ala Ala Leu His Phe Gly Asn 85 90 95 GTT GCC GAA ATG CGC ACC GGT GAA GGC AAA ACC CTC ACC TGC GTG CTG 336 Val Ala Glu Met Arg Thr Gly Glu Gly Lys Thr Leu Thr Cys Val Leu 100 105 110 CCC GCA TAT TTG AAC GCA CTT GAA GGT AAA GGC GTC CAC GTT GTC ACC 384 Pro Ala Tyr Leu Asn Ala Leu Glu Gly Lys Gly Val His Val Val Thr 115 120 125 GTC AAC GAT TAC CTA GCG AAA CGT GAC GCC GAA ATG GTC GGT CGT GTC 432 Val Asn Asp Tyr Leu Ala Lys Arg Asp Ala Glu Met Val Gly Arg Val 130 135 140 CAC CGC TAC CTG GGC CTC GAA GTG GGA GTC ATC CTC TCC GAC ATG CGC 480 His Arg Tyr Leu Gly Leu Glu Val Gly Val Ile Leu Ser Asp Met Arg 145 150 155 160 CCA GAC GAG CGT CGC AAG GCC TAC ACC GCC GAC ATC ACC TAC GGC ACC 528 Pro Asp Glu Arg Arg Lys Ala Tyr Thr Ala Asp Ile Thr Tyr Gly Thr 165 170 175 AAC AAC GAA CTC GGC TTC GAC TAC CTG CGC GAC AAC ATG GCA CGC TCC 576 Asn Asn Glu Leu Gly Phe Asp Tyr Leu Arg Asp Asn Met Ala Arg Ser 180 185 190 TTA AGC GAC CTC GTG CAG CGC GGC CAC AAC TAC GCC ATC GTC GAC GAA 624 Leu Ser Asp Leu Val Gln Arg Gly His Asn Tyr Ala Ile Val Asp Glu 195 200 205 GTG GAC TCC ATC CTC ATC GAC GAA GCC CGC ACC CCA CTG ATC ATC TCC 672 Val Asp Ser Ile Leu Ile Asp Glu Ala Arg Thr Pro Leu Ile Ile Ser 210 215 220 GGA CCA GTA GAC GGC ACA TCG CAG TTC TAC AAT GTC TTC GCA CAG ATC 720 Gly Pro Val Asp Gly Thr Ser Gln Phe Tyr Asn Val Phe Ala Gln Ile 225 230 235 240 GTC CCA CGC ATG ACC AAG GAC GTT CAC TAC GAA GTC GAC GAA CGT AAA 768 Val Pro Arg Met Thr Lys Asp Val His Tyr Glu Val Asp Glu Arg Lys 245 250 255 AAG ACC GTC GGT GTG AAA GAA GAA GGC GTC GAA TAC GTC GAA GAC CAA 816 Lys Thr Val Gly Val Lys Glu Glu Gly Val Glu Tyr Val Glu Asp Gln 260 265 270 CTC GGC ATC GAC AAC CTC TAC GCA CCT GAG CAC TCA CAG CTG GTC AGC 864 Leu Gly Ile Asp Asn Leu Tyr Ala Pro Glu His Ser Gln Leu Val Ser 275 280 285 TAC CTG AAC AAC GCC ATC AAG GCA CAG GAA CTG TTC ACC CGC GAC AAG 912 Tyr Leu Asn Asn Ala Ile Lys Ala Gln Glu Leu Phe Thr Arg Asp Lys 290 295 300 GAC TAC ATC GTC CGC AAC GGC GAA GTT ATG ATC GTC GAC GGC TTC ACC 960 Asp Tyr Ile Val Arg Asn Gly Glu Val Met Ile Val Asp Gly Phe Thr 305 310 315 320 GGC CGA GTC CTT GCC GGC CGC CGA TAC AAC GAA GGC ATG CAC CAG GCG 1008 Gly Arg Val Leu Ala Gly Arg Arg Tyr Asn Glu Gly Met His Gln Ala 325 330 335 ATC GAA GCC AAA GAG CGC GTA GAG ATC AAA AAC GAG AAC CAG ACC CTG 1056 Ile Glu Ala Lys Glu Arg Val Glu Ile Lys Asn Glu Asn Gln Thr Leu 340 345 350 GCG ACC GTT ACC CTC CAG AAC TAC TTC CGC CTC TAC ACC AAA CTC GCC 1104 Ala Thr Val Thr Leu Gln Asn Tyr Phe Arg Leu Tyr Thr Lys Leu Ala 355 360 365 GGC ATG ACC GGT ACT GCA GAG ACC GAA GCA GCA GAG CTC AAC CAG ATC 1152 Gly Met Thr Gly Thr Ala Glu Thr Glu Ala Ala Glu Leu Asn Gln Ile 370 375 380 TAC AAG CTC GAC GTC ATC GCG ATC CCA ACC AAC CGA CCA AAC CAG CGC 1200 Tyr Lys Leu Asp Val Ile Ala Ile Pro Thr Asn Arg Pro Asn Gln Arg 385 390 395 400 GAA GAC TTG ACC GAC TTG GTG TAC AAA ACC CAA GAG GCT AAG TTC GCA 1248 Glu Asp Leu Thr Asp Leu Val Tyr Lys Thr Gln Glu Ala Lys Phe Ala 405 410 415 GCA GTC GTC GAC GAC ATC GCA GAA CGC ACC GAA AAG GGC CAA CCA GTC 1296 Ala Val Val Asp Asp Ile Ala Glu Arg Thr Glu Lys Gly Gln Pro Val 420 425 430 CTC GTC GGT ACC GTC TCC GTC GAG CGC TCC GAA TAC CTC TCC CAG CTG 1344 Leu Val Gly Thr Val Ser Val Glu Arg Ser Glu Tyr Leu Ser Gln Leu 435 440 445 TTG ACC AAA CGA GGC ATC AAG CAC AAC GTC CTC AAT GCG AAG CAC CAC 1392 Leu Thr Lys Arg Gly Ile Lys His Asn Val Leu Asn Ala Lys His His 450 455 460 GAG CAG GAA GCA CAG ATC GTT GCT CAG GCA GGT CTT CCA GGC GCC GTC 1440 Glu Gln Glu Ala Gln Ile Val Ala Gln Ala Gly Leu Pro Gly Ala Val 465 470 475 480 ACC GTT GCC ACC AAC ATG GCG GGC CGT GGA ACC GAC ATC GTG CTC GGC 1488 Thr Val Ala Thr Asn Met Ala Gly Arg Gly Thr Asp Ile Val Leu Gly 485 490 495 GGA AAC CCA GAA ATC CTC CTC GAC ATC AAA CTC CGC GAA CGT GGA CTT 1536 Gly Asn Pro Glu Ile Leu Leu Asp Ile Lys Leu Arg Glu Arg Gly Leu 500 505 510 GAT CCT TTC GAA GAC GAA GAA AGC TAC CAG GAA GCC TGG GAC GCT GAA 1584 Asp Pro Phe Glu Asp Glu Glu Ser Tyr Gln Glu Ala Trp Asp Ala Glu 515 520 525 CTT CCA GCA ATG AAG CAG CGA TGC GAA GAA CGC GGC GAC AAA GTC CGC 1632 Leu Pro Ala Met Lys Gln Arg Cys Glu Glu Arg Gly Asp Lys Val Arg 530 535 540 GAA GCC GGA GGA CTC TAC GTC CTT GGC ACC GAA CGC CAC GAA TCC CGA 1680 Glu Ala Gly Gly Leu Tyr Val Leu Gly Thr Glu Arg His Glu Ser Arg 545 550 555 560 CGC ATC GAT AAC CAG CTG CGC GGT CGT TCT GCA CGT CAG GGC GAC CCA 1728 Arg Ile Asp Asn Gln Leu Arg Gly Arg Ser Ala Arg Gln Gly Asp Pro 565 570 575 GGA TCC ACC CGC TTC TAT CTC TCT ATG CGC GAC GAC CTG ATG GTT CGC 1776 Gly Ser Thr Arg Phe Tyr Leu Ser Met Arg Asp Asp Leu Met Val Arg 580 585 590 TTC GTC GGC CCA ACC ATG GAA AAC ATG ATG AAC AGG CTC AAC GTC CCA 1824 Phe Val Gly Pro Thr Met Glu Asn Met Met Asn Arg Leu Asn Val Pro 595 600 605 GAC GAT GTG CCC ATC GAA TCC AAA ACC GTC ACC AAC TCC ATC AAG GGC 1872 Asp Asp Val Pro Ile Glu Ser Lys Thr Val Thr Asn Ser Ile Lys Gly 610 615 620 GCC CAA GCT CAG GTG GAG AAC CAG AAC TTC GAA ATG CGT AAG AAC GTT 1920 Ala Gln Ala Gln Val Glu Asn Gln Asn Phe Glu Met Arg Lys Asn Val 625 630 635 640 CTG AAG TAC GAC GAA GTA ATG AAC GAA CAG CGC AAG GTT ATC TAT AGC 1968 Leu Lys Tyr Asp Glu Val Met Asn Glu Gln Arg Lys Val Ile Tyr Ser 645 650 655 GAG CGA CGC GAA ATC CTC GAA TCC GCA GAC ATC TCC CGC TAC ATC CAA 2016 Glu Arg Arg Glu Ile Leu Glu Ser Ala Asp Ile Ser Arg Tyr Ile Gln 660 665 670 AAC ATG ATC GAA GAA ACA GTC AGC GCA TAC GTC GAC GGC GCC ACC GCC 2064 Asn Met Ile Glu Glu Thr Val Ser Ala Tyr Val Asp Gly Ala Thr Ala 675 680 685 AAC GGC TAC GTC GAA GAC TGG GAC CTC GAC AAA CTC TGG AAC GCC CTC 2112 Asn Gly Tyr Val Glu Asp Trp Asp Leu Asp Lys Leu Trp Asn Ala Leu 690 695 700 GAA GCC CTC TAC GAC CCA TCG ATC AAC TGG ACC GAC CTC GTC GAA GGC 2160 Glu Ala Leu Tyr Asp Pro Ser Ile Asn Trp Thr Asp Leu Val Glu Gly 705 710 715 720 AGC GAA TAC GGC AAA CCA GGG GAG CTG TCC GCC GAA GAT CTA CGC ACC 2208 Ser Glu Tyr Gly Lys Pro Gly Glu Leu Ser Ala Glu Asp Leu Arg Thr 725 730 735 GCA CTC GTC AAC GAC GCC CAC GCC GAA TAC GCA AAA CTC GAA GAA GCC 2256 Ala Leu Val Asn Asp Ala His Ala Glu Tyr Ala Lys Leu Glu Glu Ala 740 745 750 GTA TCC GCA ATC GGC GGC GAA GCA CAG ATC CGC AAC ATC GAA CGA ATG 2304 Val Ser Ala Ile Gly Gly Glu Ala Gln Ile Arg Asn Ile Glu Arg Met 755 760 765 GTG CTC ATG CCA GTC ATC GAC ACC AAA TGG CGC GAA CAC CTC TAC GAA 2352 Val Leu Met Pro Val Ile Asp Thr Lys Trp Arg Glu His Leu Tyr Glu 770 775 780 ATG GAC TAC CTG AAA GAA GGC ATC GGC CTG CGC GCA ATG GCA CAG CGC 2400 Met Asp Tyr Leu Lys Glu Gly Ile Gly Leu Arg Ala Met Ala Gln Arg 785 790 795 800 GAC CCA CTG GTC GAA TAC CAA AAA GAA GGC GGC GAC ATG TTC AAC GGC 2448 Asp Pro Leu Val Glu Tyr Gln Lys Glu Gly Gly Asp Met Phe Asn Gly 805 810 815 ATG AAA GAC GGC ATC AAG GAA GAA ACC GTC CGC CAG CTC TTC CTC CTC 2496 Met Lys Asp Gly Ile Lys Glu Glu Thr Val Arg Gln Leu Phe Leu Leu 820 825 830 CGC AAG CAG TTC ATC AAG CAA GAC GCG GAA GTC GCT GAC TAA 2538 Arg Lys Gln Phe Ile Lys Gln Asp Ala Glu Val Ala Asp Stop 835 840 845

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の大きさが約５．３kbのＤＮＡ断片の制
限酵素切断点地図および該ＤＮＡ断片の塩基配列決定の
ための戦略図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:13）Ｃ１２Ｒ 1:13） (72)発明者湯川英明茨城県稲敷郡阿見町中央８丁目３番１号三菱油化株式会社筑波総合研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】コリネ型細菌由来のＳｅｃＡ蛋白質をコ
ードする遺伝子を含むＤＮＡ断片。
【請求項２】前記コリネ型細菌がブレビバクテリウム
・フラバム（Brevibacterium flavum)ＭＪ−２３３であ
る、請求項１に記載のＤＮＡ断片。
【請求項３】制限酵素ＥｃｏＲＩ認識部位を両端に有
し、下記制限酵素により下記制限酵素認識部位数で下記
の大きさの切断断片に切断される、請求項１または２に
記載のＤＮＡ断片。制限酵素認識部位数切断断片の大きさ（kb）ＢａｍＨＩ１３．６，１．７ＰｓｔＩ２２．６，２．３，０．４ＳｐｈＩ１２．９，２．４ＳｔｕＩ２２．９，２．１，０．３ＨｉｎｄIII １４．６，０．７
【請求項４】配列表の配列番号２のアミノ酸配列で示
されるＳｅｃＡ蛋白質をコードする遺伝子ＤＮＡ断片。
【請求項５】配列表の配列番号２の塩基配列で示され
るＳｅｃＡ蛋白質をコードする遺伝子ＤＮＡ断片。